Die Rolle der humanen Polyomaviren Merkelzell
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Ruhr Universität Bochum Prof. Dr. med. Alexander Kreuter Dienstort: Helios St. Elisabeth Klinik Oberhausen Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie Die Rolle der humanen Polyomaviren Merkelzell-Polyomavirus, humanes Polyomavirus 6 und 7, und Trichodysplasia-spinulosa-assoziiertes Polyomavirus in der Pathogenese kutaner B- und T-Zell-Lymphome Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Monia Vanessa Dewan aus Essen 2013 Dekan: Prof. Dr. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. med. A. Kreuter Korreferent: Jun.- Prof. Dr. rer. nat M. Tenbusch Tag der Mündlichen Prüfung: 27.05.2014 Inhaltsverzeichnis 1.Einleitung ................................................................................................................. 9 1.1. Einführung .......................................................................................................... 9 1.2. Primär kutane Lymphome ................................................................................ 12 1.2.1.Kutane T-Zell-Lymphome............................................................................ 13 1.2.2. Kutane B-Zell-Lymphome .......................................................................... 18 1.3. Humane Polyomaviren ..................................................................................... 20 1.3.1. Geschichte und Taxonomie ....................................................................... 20 1.3.2. Aufbau der Polyomaviren ........................................................................... 22 1.3.3. Lebenszyklus ............................................................................................. 24 1.3.4. Rolle der Polyomaviren als humanes Pathogen ......................................... 25 1.3.4.1.Prävalenz ............................................................................................. 25 1.3.4.2. Virale Transmission ............................................................................. 25 1.3.4.3.Polyomavirus-assoziierte Erkrankungen ............................................... 26 1.3.5. Merkelzell-Karzinom .................................................................................. 29 1.3.5.1. Epidemiologie und Klinik ..................................................................... 29 1.3.5.2. Diagnostik und Stadieneinteilung......................................................... 30 1.3.5.3. Therapie .............................................................................................. 32 1.3.5.4. Rolle des Merkelzellpolyomavirus in der Onkogenese des Merkelzellkarzinoms ......................................................................................... 33 1.3.6. Trichodysplasia spinulosa .......................................................................... 35 2. Zielsetzung ............................................................................................................ 37 3.Methoden................................................................................................................ 38 3.1. Patientenauswahl und Untersuchungsprobenmaterial ...................................... 38 3.2. Real-Time PCR im Überblick ............................................................................ 40 3.2.1.Versuchsmaterialien ................................................................................... 41 3.2.2. Methoden-Durchführung ............................................................................ 42 3.2.3. Ablauf der PCR .......................................................................................... 44 3.2.4. Auswertung: Fluoreszenz-basierte Quantifizierung in Echtzeit und Crossingpoint basierte Evaluation der Fluoreszenz ........................................................... 45 3.3. Analyse der Proben mittels MCPyV-nested PCR.............................................. 48 3.3.1. Durchführung der nested PCR ................................................................... 48 3.3.2. Auswertung der nested PCR ...................................................................... 51 1 3.4. Immunhistochemischer Nachweis der large T-Antigen-Expression in MCPyVpositiven Hautproben .............................................................................................. 51 4. Ergebnisse ............................................................................................................ 54 4.1. Auswertung der real time PCR ......................................................................... 54 4.2. Ergebnisse der MCPyV-nested PCR ................................................................ 59 4.3. Expression des large T-Antigens in MCPyV-positiven Proben .......................... 60 5. Diskussion ............................................................................................................ 61 5.1. Rolle der Polyomaviren in der Pathogenese kutaner Lymphome und anderer Hauttumoren ........................................................................................................... 61 5.2. Polyomavirus-assoziierte Krebserkrankungen .................................................. 63 5.3. MCPyV als Ursache des Merkelzellkarzinoms .................................................. 64 5.4. Rolle einer Infektion in der Entstehung kutaner Lymphome .............................. 66 5.5. Diskussion des Studiendesigns ........................................................................ 69 5.6. Fazit ................................................................................................................. 71 6.Zusammenfassung ................................................................................................ 74 7. Literaturverzeichnis .............................................................................................. 76 Danksagung Lebenslauf 2 Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Bedeutung ATL Adulte T-Zell-Leukämie BCNU Bis-Chloroethylnitrosourea BKV B.K.-Virus (Initialen des Patienten, bei welchem BKV erstmalig isoliert wurde CHOP CyclophosphamidHydroxydaunorubicinVincristin (Oncovin®)-Prednison CK Zytokeratin CL Kutanes Lymphom CLL Chronisch lymphatische Leukämie CMV Zytomegalie Virus DNA Desoxyribonukleinsäure EBV Ebstein-Barr Virus ECP Extrakorporale Photophorese eIF1 4E Eukaryotischer Elongationsfaktor 4E 4 E-BP1 Eukaryotischer Elongationsfaktor 4EBindungsprotein fMF Follikuläre Mykosis fungoides HBV Hepatitis B HCC Hepatozelluläres Karzinom HDAC Histon-Deacetylase HHV-8 Humanes Herpes Virus 8 HPV Humanes Papillomavirus hPyV Humanes Polyomavirus hPyV6 Humanes Polyomavirus 6 hPyV7 Humanes Polyomavirus 7 HTLV-I Humanes T-Lymphotropes Virus 1 IFN-α Interferon α JCV J.C.-Virus (Initialen des Patienten, bei welchem JCV erstmalig isoliert wurde) 3 Abkürzung Bedeutung KIV Karolinska Institute-Virus KMGP-TCL Klein- bis mittelgroßzelliges pleomorphes T-Zell-Lymphom KZL Keimzentrums-Lymphom LP Lymphomatoide Retikulose LPV Lymphotropes Polyomavirus LTA Large T-Antigen MCC Merkelzell-Karzinom MCPyV Merkelzell-Polyomavirus MF Mycosis fungoides mRNA Messenger Ribonukleinsäure miRNA Micro Ribonukleinsäure MPyV Murines Polyomavirus mTOR Mammalian target of rapamycin MWPyV Malawi-Polyomavirus NHL Non-Hodgkin-Lymphom NKG2D Natural Killer Group 2, Member D PCAGL Primär kutanes anaplastisch großzelliges Lymphom PCBL Primär kutanes B-Zell-Lymphom PCDGBCL-l Primär kutanes diffus-großzelliges BZell-Lymphom, leg type PCDGBCL-a Primär kutanes diffus-großzelliges TZell-Lymphom, andere Typen PCP-TCL, u Primär kutanes peripheres T-ZellLymphom, unspezifisch PCR Polymerase-Ketten-Reaktion PCTL Primär kutanes T-Zell-Lymphom PCZ-TCL Primär kutanes zytotoxisches CD8+T-Zell-Lymphom PML Progressive multifokale Leukenzephalitis 4 Abkürzung Bedeutung PR Pagetoides Retikulose PVAN Polyomavirus assoziierte Nephropathie RT Radiotherapie SAHA Suberoylanilide hydroxamic acid S.aureus Staphylokoccus aureus SP-TCL Subkutanes pannikulitis ähnliches TZell-Lymphom SS Sézary Syndrom sTA Small T-Antigen SV40 Simian-Virus 40 TCL T-Zell-Lymphom TA T-Antigen TSP Trichodysplasia spinulosa TSPyV Trichodysplasia spinulosaassoziiertes Polyomavirus VP1-4 Virus-like Particle 1-4 WHO-EORTC World health organisation-European organisation of research and treatment of cancer WUV Washington University-Virus 5 Tabellenverzeichnis: Seite Tabelle 1: 15 WHO-EORTC-Klassifikation (Willemze et al. 2005) Tabelle 2: 17 Therapieempfehlungen bei MF und MF-Sonderformen Tabelle 3: 18 Therapieempfehlungen beim Sézary Syndrom Tabelle 4 18 WHO-EORTC-Klassifikation der PCBL Tabelle 5: 31 Stadieneinteilung des Merkelzellkarzinoms Tabelle 6: 39 Anzahl der in der Studie untersuchten Hautproben und deren Zuordnung zu den verschiedenen kutanen T- und B-Zelllymphomen. 41 Tabelle 7: Die in der hPyV-PCR verwendete Primer 42 Tabelle 8: Die in der PCR verwendeten LNA-Sonden, stammend aus dem Universal Probe Library System (Roche) Tabelle 9: 49 Vor- und Rückwärtsprimer der externen PCR 6 Seite Tabelle 10: 49 Vor- und Rückwärtsprimer der internen PCR Tabelle 11: 56 Ergebnisse der MCPyV-PCR Tabelle 12: 57 Ergebnisse der hPyV6-PCR Tabelle 13: 58 Ergebnisse der hPyV7 und TSPyV-PCR 7 Abbildungsverzeichnis: Seite Abbildung 1: 46 Repräsentative Kurvenverläufe der Real time PCRim Light Cycler (Roche) Abbildung 2: 59 Laufbanden einer repräsentativen MCPyV-nested PCR Abbildung. 3: 60 Immunhistochemische Darstellung repräsentativer large T-Antigen positiver und negativer Hautproben nach Einsatz des Antikörpers CM2B4 8 1.Einleitung 1.1. Einführung Primär kutane Lymphome sind die zweithäufigsten extranodalen NonHodgkin-Lymphome. Sie entstehen in der Haut ohne Nachweis einer extrakutanen Organbeteiligung zum Zeitpunkt der Diagnosestellung. Abzugrenzen sind sie von sekundär kutanen Lymphomen, die durch kutan metastasierte primär nodale Lymphome oder Leukämien entstehen. Primär kutane Lymphome bieten bezüglich ihrer Klinik und ihrer histologischen und immunphänotypischen Eigenschaften ein sehr heterogenes Bild. Der Verlauf kann bei indolenten Formen über Jahre hinweg asymptomatisch sein. Aggressive, sekundär disseminierte Formen hingegen können in kürzester Zeit zum Tode führen. Unter Berücksichtigung dieser Unterschiede werden gemäß der WHO-EORTC-Klassifikation zwei große Gruppen mit ihren Subtypen unterschieden: Die primär kutanen T-und B-Zell-Lymphome (Willemze et al., 2005). Die Ätiologie der PCBL und PCTL ist bisher unbekannt. Als kausaler Faktor werden unter anderem Viren diskutiert. Seit der Entdeckung des EBV-assoziierten Burkitt-Lymphoms wurde der Verdacht, dass Viren Krebs beim Menschen verursachen können, bestätigt (Burkitt et al., 1952). Auch andere Viren werden mit der Pathogenese von Krebs beim Menschen assoziiert: Das hepatozelluläre Karzinom kann durch eine chronische Infektion mit HBV oder HCV entstehen (Colombo et al., 1989). Die adulte T-Zell-Leukämie ist assoziiert mit dem HTLV-I. Und während HPV an der Entstehung anogenitaler Neoplasien beteiligt ist, ist das HHV-8 mit der des Kaposi-Sarkoms assoziiert (Uchiyama et al., 1977, zur Hausen,1976; Krebsarten auch Ganem, weltweit Bakterien und 2006). infektiös Geschätzt bedingt Parasiten in wird, sind. Frage dass Neben (Parkin 15-20% Viren et al., aller kommen 2005). Man unterscheidet sowohl direkte als auch indirekte Mechanismen, die im Rahmen einer chronischen Virusinfektion zu einer malignen Entartung führen. 9 Eine direkte Schädigung erfolgt einerseits durch die Expression von Onkogenen, andererseits durch die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen. Onkogene werden unter Ausnutzung des Proteinbiosytheseapparats des Wirts exprimiert (Butel, 2000). Indirekt führt eine virale Infektion zu einer Zelltransformation durch die Induktion einer chronischen Entzündung. Eine Aktivierung des Immunsystems führt dann über die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren zu einem vermehrten Zelluntergang und einer der Regeneration dienenden, vermehrten Zellproliferation. Daraus resultiert eine Genominstabilität, die die Grundlage für die Entwicklung und Akkumulation von Mutationen bildet. Auch die Entstehung des HBV induzierten HCC basiert auf diesem Mechanismus (Chisari et al.,1995, Butel, 2000). Ob eine virale Infektion auch für die Entstehung kutaner Lymphome verantwortlich ist, ist noch nicht geklärt. Für die Beteiligung eines infektiösen Agens spricht, dass kutane Lymphome vermehrt im fortgeschrittenen Alter und unter Immunsuppression auftreten. Denn ein geschwächter Organismus ist empfänglicher für die Entstehung entarteter Zellen und kann diese weniger effektiv mit Hilfe des Immunsystems überwachen. Ein Zusammenhang zwischen der Entstehung des PCTL und dem Retrovirus HTLV-I wurde aufgrund klinischer und histopathologischer Ähnlichkeiten zwischen PCTL und der HTLV-I-assoziierten adulten T-Zell Leukämie bereits vermutet. Dieser Verdacht konnte jedoch nicht bestätigt werden. Ebenso erbrachten Untersuchungen an verschiedenen Herpesviren wie EBV und CMV keine eindeutige Assoziation mit CL (Courgnaud et al., 2009, Ballanger et al., 2009, Novelli et al., 2009). Seit der Entdeckung des MCPyV in 80% der MCC ist bekannt, dass auch humane Polyomaviren an der Krebsentstehung beim Menschen beteiligt sind (Feng et al., 2008). Vorher waren hPyV vornehmlich mit nicht-neoplastischen Erkrankungen bei älteren oder immunsupprimierten Menschen assoziiert, wie z.B. mit der durch BKV verursachten Nephropathie oder der durch JCV verursachten PML. Van der Meijden et al. publizierte 2010 eine weitere mit humanen Polymaviren assoziierte Erkrankung: die Trichodysplasia spinolosa, eine vom 10 Haarfollikelepithel ausgehende Dysplasie. Das damit assoziierte Virus wurde als Trichodysplasia spinulosa assoziiertes Polyomavirus bezeichnet (van der Meijden et al., 2010) Zwei Faktoren führten zu einem zunehmenden Interesse an der Erforschung Polyomavirus-assoziierter Erkrankungen: 1. die Erkenntnisse über die Rolle des MCPyV als humanes Kanzerogen, 2. die Zunahme der Anzahl immunsupprimierter Menschen und die damit einhergehende steigende Bedeutung Polyomavirus-assoziierter Erkrankungen. Während über 40 Jahre lang nur zwei humane Polyomaviren bekannt waren, sind in der Zeit zwischen 2007 und 2012 acht weitere entdeckt worden. Welche Rolle die steigende Anzahl neu entdeckter humaner Polyomaviren in der Krebsentstehung spielt, ist bereits Gegenstand der Forschung. Für die Entstehung eines MCC scheinen hämatolymphoide Erkrankungen, wie NHL und hier insbesondere die CLL, einen Risikofaktor darzustellen, und umgekehrt. Aus diesem Grund wird vermutet, dass es sich beim MCPy um ein lymphotropes Virus handelt. Erhärtet wird dieser Verdacht durch die Zirkulation weniger Kopien viraler DNA im peripheren Blut gesunder Personen und durch die nahe Verwandschaft zwischen dem MCPyV und dem lymphotropen Polyomavirus der westlichen Grünmeerkatze. Dieses infiziert hauptsächlich B-Lymphozyten (Quaglino et al., 1997, Shuda et al., 2009). Deshalb soll in folgender Studie untersucht werden, ob das MCPyV auch an der Pathogenese kutaner Lymphome beteiligt ist. Dazu wird ein großes Kollektiv PCBL und PCTL auf das Vorliegen von MCPyV-DNA und der Expression des LT-Antigens untersucht. Ebenso soll dieses Kollektiv auf das Vorkommen von hPyV6-, hPyV7- und TSPyV-DNA analysiert werden. 11 1.2. Primär kutane Lymphome Primär kutane Lymphome werden den Non-Hodgkin Lymphomen zugeordnet und machen einen Anteil von ca. 1% aus. Sie sind nach den gastrointestinalen Lymphomen die zweithäufigsten extranodalen Lymphome. Während sekundär kutane Lymphome durch die Disseminierung primär nodaler Lymphome oder Leukämien in der Haut entstehen, manifestieren sich kutane Lymphome per definitionem zum Zeitpunkt der Erstdiagnose ausschließlich auf der Haut. Eine sekundäre Beteiligung extrakutaner Organe ist jedoch möglich. Mit einer Inzidenz von ca. 1/100 000 Einwohner pro Jahr in Europa sind CL selten (Groves et al., 2000). Klassifiziert werden CL seit 2005 nach der WHO-EORTC-Klassifikation. Hierbei handelt es sich um einen Zusammenschluss zweier unabhängiger Klassifikationssysteme, nämlich dem der World Health Organisation (WHO) und dem der European Organisation of Research and Treatment of Cancer (EORTC). Ziel dieses im Konsensus beider Organisationen getroffenen Zusammenschlusses war es, die durch die bestehenden Unterschiede beider Klassifikationsysteme entstehenden Unklarheiten zu beseitigen, und somit eine Vereinheitlichung und Vereinfachung der Klassifizierung zu ermöglichen. Nach klinischen, histologischen, und immunphänotypischen Kriterien unterscheidet die WHO-EORTC-Klassifikation zwischen den beiden großen Gruppen der T- und B-Zell-Lymphome, denen wiederum mehrere Subtypen untergeordnet sind. Die T-Zell-Lymphome haben einen Anteil von 65% und die B-Zell-Lymphome einen von 25% an den kutanen Lymphomen. 10% der Lymphome weisen unspezifische Charakteristika auf, sodass hier bisher keine Zuordnung erfolgen konnte (Willemze et al., 2005). 12 1.2.1.Kutane T-Zell-Lymphome Kutane T-Zell-Lymphome (PCTL) sind die häufigsten malignen kutanen Lymphome. Sie entstehen durch eine monoklonale Proliferation entarteter, primär in der Haut lokalisierter T-Lymphozyten. Innerhalb der Gruppe der T-Zell-Lymphome werden verschiedene Subtypen differenziert. Diese bieten ein sehr heterogenes Bild. Sie unterscheiden sich sowohl hinsichtlich des klinischen Erscheinungsbildes und des Krankheitsverlaufes, als auch bezüglich histopathologischer und genetischer Merkmale. Das Erkrankungsalter liegt i.d.R. jenseits des 50. Lebensjahres. Männer sind zweimal häufiger betroffen als Frauen. Neben dem fortgeschrittenen Alter scheint eine Immunsuppression die Entstehung zu begünstigen. Patienten, die PCTL nach einer Organtransplantation entwickelten, wurden beschrieben (Al Ajroush, 2012). Die Ätiologie des PCTL ist unbekannt. Diskutiert wird eine persistierende Stimulation der T-Lymphozyten durch ein Antigen, welches über eine chronische Entzündung zur Entartung führt. Eine daraus resultierende Resistenz gegenüber extrinsischer Apoptose-Mechanismen scheint die Tumorgenese zu begünstigen. Welches Antigen die chronische Entzündung verursacht, ist bisher unklar. U.a. konnte ein vermehrtes Auftreten PCTL bei Arbeitern in der Papierindustrie gefunden werden, sodass entsprechend dieses Befundes eine Exposition gegenüber Antigenen aus der Umwelt als Ursache nahe liegt (Morales-Suárez-Varela et al., 2004). Eine weitere Hypothese postuliert eine durch bakterielle Superantigene verursachte Onkogenese. Untersucht wurde u.a. S.aureus. Es wurde festgestellt, dass Betroffene in fortgeschrittenen Stadien eine erhöhte Kolonisierungsrate mit S. aureus aufwiesen. Nach Jackow et al. finden sich bei 75% der an einem PCTL erkrankten S.aureuspositive Kulturen aus Haut und Blut (Jackow et al.,1997). Da hohe Kolonisationsrate nicht in frühen Stadien des PCTL bestätigt werden konnten, scheint S.aureus eher eine Rolle in der Exazerbation zu spielen und nicht in der Entstehung (Talpur et al., 2008). Die hohe Besiedlung lässt sich durch die verringerte Immunbarriere der Haut in späten Stadien des PCTL erklären. Auch der Verdacht, dass Borrelia burgdorferi und Chlamydia trachomatis als pathogenetische Faktoren fungierten, konnte nicht bestätigt werden (Tothova et al., 2006, Abrams, 2001). 13 Der Einfluss viraler Infektionen wurde ebenfalls untersucht. Zunächst vermutete man aufgrund klinischer und pathologischer Ähnlichkeiten zwischen dem PCTL und der HTLV-I-assoziierten ATL, dass das Retrovirus HTLV-I die Ursache für die Entstehung PCTL wäre. Die Studienergebnisse sind allerdings nicht eindeutig, wobei der Großteil der durchgeführten Studien HTLV-I nicht in den PCTL nachweisen konnte (Courgnaud et al., 2009). Der Verdacht, dass die mit der Entstehung lymphoproliferativer Erkrankungen in Verbindung stehenden Viren EBV, CMV und andere Herpesviren an der Pathogenese des PCTL beteiligt sind, wurde ebenfalls nicht bestätigt. Der Nachweis von EBV-DNA scheint allerdings mit einer schlechteren Prognose assoziiert zu sein (Ballanger et al., 2009, Novelli et al., 2009). Die häufigste Form des PCTL ist die Mycosis fungoides mit einem Anteil von >70%. Der Name lehnt sich an die Ähnlichkeit der Läsionen mit denen im Rahmen einer Pilzerkrankung an. Der Verlauf der klassischen MF lässt sich in verschiedene Stadien unterteilen. Zu Beginn äußert sie sich durch wenige erythematöse Maculae. Diese gehen im weiteren Verlauf in Plaques und Tumoren über. Lymphknotenbeteiligung und eine extrakutane Manifestation mit Beteiligung von Milz, Leber oder Lunge können hinzukommen. Diese Stadien können auch parallel verlaufen. Die Prognose der MF hängt vom Stadium ab. Während die 5-JahresÜberlebensrate in frühen Stadien bei bis zu 97% liegt, beträgt die durchschnittliche 5-Jahres-Überlebensrate etwa 68%. Nach 30 Jahren leben noch ca.17%. Das Sézary Syndrom ist mit einem Anteil von etwa 2,5% das zweithäufigste PCTL. Es wird auch als leukämische Variante der MF bezeichnet. Das SS kennzeichnet sich durch die Trias Erythrodermie mit Pruritus, generalisierte Lymphadenopathie, und Leukozytose mit atypischen Lymphozyten, den sog. Sézary-Zellen. Fakultative Symptome sind die diffuse Alopezie, Hyperkeratosen an Palmae und Plantae und eine Onychodystrophie. Auch eine Knochenmarksmetastasierung ist möglich. Die Prognose ist schlecht bei einer Überlebenszeit von 2-4 Jahre nach Diagnosestellung (Dummer et al., 2005). 14 Neben der MF und dem SS sind auch die weiteren Vertreter des PCTL in WHO-EORTC-Klassifikation zu finden. Dabei unterscheidet man zwischen indolenten und aggressiven Subtypen. Diese sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: WHO-EORTC-Klassifikation PCTL (Willemze et al., 2005). Indolente PCTL Aggressive PCTL -Mycosis fungoides -Sézary Syndrom (SS), Follikulotrope MF -NK/T-Zell-Lymphom, Pagetoide Retikulose -Adulte T-Zell-Leukämie/Lymphom Elastolytische PCTL -Zytotoxisches PCTL (CD8+) Lymphom -Zytotoxisches gamma-delta positives TCL - Subkutanes pannikulitisähnliches TCL - Primär kutane CD30-positive (CD30+) - Lymphprolifrativen Erkrankungen Lymphomatoide Papulose Primär kutanes anaplastisches großzelliges Lymphom -Klein- bis mittel großzelliges pleomorphes TCL (CD4+) 15 Die Therapie der PCTL soll stadiengerecht und in frühen Stadien zurückhaltend erfolgen. Während In frühen Stadien lokale Behandlungsmaßnahmen im Vordergrund stehen, ist in fortgeschrittenen Stadien eine systemische Therapie notwendig. Die Hauptsäule der Therapie des PCTL stellt derzeit die sog. PUVA-Therapie dar. Hierbei handelt es sich um die kombinierte Applikation von UVAStrahlung und Psoralen. Die Gabe des hier eingesetzten 8-Methoxypsoralen (8-MOP), das die Haut für UV-Strahlung sensibilisiert, kann oral oder lokal in Form eines Bads oder einer Creme erfolgen. Eine Kombination mit Interferon- α oder Retinoiden ist in fortgeschrittenen Stadien zu empfehlen. Auch eine UVB-Bestrahlungstherapie stellt eine Option dar, wobei die Wirksamkeit auf Maculae beschränkt zu sein scheint, während die PUVA Therapie auch bei Plaques wirksam ist. Therapie der ersten Wahl beim Sézary Syndrom ist die extrakorporale Photophorese, die mit IFNα, Retinoiden oder MTX bei unzureichender Wirksamkeit kombiniert werden kann. Der Einsatz einer Chemotherapie, z.B. nach CHOP-Schema wird in palliativer Situation eingesetzt. Die Stammzelltransplantation ist ebenfalls den fortgeschrittenen Stadien vorbehalten und findet derzeit nur in Studien statt (Dummer et al., 2000, Wollina, 2012) Die Tabellen 2 und 3 beinhalten die Therapieempfehlungen gemäß der Leitlinie im Auftrag der Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Onkologie (ADO), der Deutschen Krebsgesellschaft und der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft (Stadler et al., 2008). 16 Tabelle 2: Therapieempfehlungen bei MF und MF-Sonderformen aus der Kurz-Leitlinie Kutane Lymphome, (Stadler et al., 2008). Stadien IA Uniläsionale MF, pagetoide Retikulose IB-IIA IIB III IVA IVB Empfohlene Therapie- First line Beobachten, PUVA, Steroide Klasse III-IV, HN2/BCNU lokal, UVB/UVB narrow band Radiotherapie (Röntgenweichstrahltherapie oder schnelle Elektronen, Gesamtdosis 2040 Gy) PUVA HN2/BCNU lokal PUVA + IFNalpha und RT für Tumoren, HN2/BCNU lokal PUVA, Photophorese, Eventuell kombiniert mit IFNalpha oder MTX PUVA + IFNalpha PUVA + IFNalpha, Chlorambucil/Steroid, Anthrazykline, z. B. Liposomales Doxorubicin, RT für Tumoren Empfohlene TherapieSecond line Bexaroten Gel, Kommentar PUVA in Europa bevorzugt Hexadecyphosphocoline Lösung PUVA lokal, IFN-alpha intraläsional, Steroide Klasse III–IV PUVA + Interferonalpha Low-dose MTX, Orales Bexaroten, Anthrazykline, Doxorubicin, Ganzhaut-MEVBestrahlung, Vorinostat (SAHA, HADAC-Inhibitor), Denileukin diftitox, Gemcitabin Low-dose MTX, Orales Bexaroten, Cladribin, Ganzhaut-schnelle Elektronen, Chlorambucil /Steroid, Röntgenfernbestrahlung Low-dose MTX, Orales Bexaroten, Ganzhaut-schnelle Elektronen Chlorambucil/Steroid Gemcitabin Röntgenfernbestrahlung Orales Bexaroten, Gemcitabin, Cladribin CHOP, Polychemotherapie, Denileukin diftitox, Alemtuzumab, Vorinostat (SAHA, HADAC-Inhibitor) 17 Diese Krankheitsbilder sind als besondere Präsentationsformen der MF im Stadium IA zu werten. Eventuell Erhaltungstherapie mit PUVA+IFN alpha bei Erreichen einer Remission Tabelle 3: Therapieempfehlung beim Sézary-Syndrom aus der Kurz-Leitlinie Kutane Lymphome, (Stadler et al., 2008). Therapie der 1. Wahl PUVA, Extrakorporale Photophorese (ECP), PUVA + IFN-alpha, ECP + IFN-alpha, PUVA + IFN-alpha + ECP Therapie der 2.Wahl Bexaroten, Chlorambucil/Steroid (Winkelmann), Low-dose Methotrexat, CHOP-Polychemotherapie, Denileukin diftitox, Ganzhaut-schnelle Elektronen, Alemtuzumab (anti-CD52), Vorinostat (SAHA, HDAC-Inhibitor) 1.2.2. Kutane B-Zell-Lymphome Bei kutanen B-Zell-Lymphomen handelt es sich um eine sich primär an der Haut manifestierenden Neoplasie des lymphatischen Gewebes, die sich durch die Prädominanz entarteter B-Zellen kennzeichnet. Die Ätio-logie ist unbekannt. Ähnlich wie bei den PCTL vermutet man, dass eine chronische Infektion die Entstehung eines PCBL triggern kann. Häufig ist eine BorrelienInfektion beim Marginalzonenlymphom nachweisbar (Dummer et al., 2000).Nach der WHO-EORTC-Klassifikation werden ebenfalls verschiedene Subtypen, differenziert. Sie unterscheiden sich durch ihren klinischen Verlauf. Die einzelnen Subtypen sind Tabelle 4 zu entnehmen. Tabelle 4: WHO-EORTC-Klassifikation der PCBL (Willemze et al., 2005). Indolentes klinisches Verhalten Intermediäres klinisches Verhalten - Primär kutanes Marginalzonenlym- - Großzelliges, diffuses B-Zell-Lymphom phom des Beines (leg type) - Primär kutanes Keimzentrumslym- - Großzelliges, diffuses B-Zell-Lymphom phom andere Typen - Intravaskuläres, großzelliges B-ZellLymphom der Haut Nach der WHO-EORTC-Klassifikation werden ebenfalls verschiedene Subtypen nach klinischen Verhalten differenziert: ein indolentes klinisches Verhalten weisen das kutane Marginalzonenlymphom und das kutane Keimzentrumslymphom auf. Durch ein intermediäres klinisches Verhalten 18 kennzeichnen sich das großzellige, diffuse B-Zell-Lymphom des Beines, das großzellige, diffuse B-Zell-Lymphom anderer Lokalisation und das Intravaskuläre, großzellige B-Zell-Lymphom der Haut (Willemze et al., 2005). Bei den Betroffenen äußert sich das PCBL durch das Auftreten symptomloser roter, rot-livider oder rot-brauner Papeln, Plaques oder Knoten. Meistens sind diese am Kopf oder Stamm lokalisiert,wobei das diffuse B.Zell-Lymphom des Beines eine Ausnahme darstellt. Auch die Entwicklung von Ekzemen oder einer Erythrodermie wird in einigen Fällen beobachtet. In Spätstadien können sich Ulzerationen entwickeln. Lymphknotenschwellungen und Splenomegalie sind ebenfalls möglich, sowie in seltenen Fällen eine sekundäre extrakutane Manifestation in Lunge, Leber, Magen und Knochenmark (Dummer et al., 2000). Die Prognose ist bei ausschließlich kutaner Manifestation, wie es in 2/3 der Betroffenen der Fall ist, ausgezeichnet. Dieses trifft insbesondere auf das kutane Marginalzonenlymphom und das kutanen Keimzentrumslymphom mit einer 5-Jahres-Überlebenszeit von jeweils >90% zu. Eine weitaus schlechtere Prognose weist das großzellige, diffuse B-Zell-Lymphom des Beines auf mit einer 5-Jahres-Überlebenszeit von etwa 52%. Die Therapie der PCBL richtete sich nach dem Ausmaß der Malignität. Han delt es sich um eine indolente Form, können einzelne Läsionen zunächst primär exzidiert werden. Der Nachweis infektiöser Partikel indiziert zunächst eine breite antibiotische Therapie. Die Radiosensibilität der PCBL erlaubt zudem den Einsatz strahlentherapeutischer Verfahren (Willemze et al., 2005). Therapieoption der zweiten Wahl stellt die Intraläsionale Applikation von IFN-α, Steroiden und die Applikation des CD20-Antikörpers Rituximab dar. Intermediäre Formen können im Fall von Einzelläsionen ebenfalls primär exzidiert oder radiotherapeutisch behandelt werden. Die Mono- bzw. Polychemotherapie, z.B. nach CHOP-Schema, ist eine Option bei Krankheitsprogression oder schweren Verläufen (Dummer et al., 2005). 19 1.3. Humane Polyomaviren 1.3.1. Geschichte und Taxonomie Die Familie der Polyomaviridae umfasst 45-55 nm große, unbehüllte Viren. Ihr Genom ist zirkulär angeordnet und besteht aus doppelsträngiger DNA (Imperiale and Major, 2007). Da auch Papillomaviren diese Eigenschaften besitzen, wurden diese zunächst mit den Polyomaviren in der Familie der Papovaviren zusammengefasst. Aufgrund zunehmender Erkenntnis über Unterschiede bezüglich der Genomorganisation, Replikation und Molekularbiologie erschien diese Bezeichnung bald obsolet, sodass seit dem siebten Report des International Committee on Taxonomy of Viruses zwei eigenständige Virusfamilien entstanden waren: die Familie der Papilloma- und die der Polyomaviridae (Van Regenmortel et al., 1999). Das erste Polyomavirus wurde 1953 von L. Gross bei der Maus beschrieben. Bei dem Versuch Zellextrakte von leukämischen Mäusen auf gesunde zu übertragen, entdeckte er, dass diese multizentrische Speicheldrüsentumoren und in wenigen Fällen andere Tumoren, wie z.B. subkutane Sarkome oder Mammakarzinome, entwickelten. Das daraufhin isolierte PyV wurde als murines Polyomavirus bezeichnet (Gross, 1953). Das onkogene Potenzial dieses Virus konnte durch nachfolgende Arbeitsgruppen bestätigt werden (Eddy, B. E. et al., 1958, a)) Nach Isolation des Virus konnten sowohl bei beimpften neugeborenen Mäusen als auch bei Hamstern und Ratten die Entwicklung unterschiedlicher Tumore wie Speicheldrüsentumoren, Mesotheliome, Thymome und Mammakarzinome beobachet werden (Steward et al., 1958, Eddy, B. E. et al., 1958, b), Eddy et al., 1959). In Folge dieser Eigenschaft erhielt das Virus auch seinen Namen Polyoma, was aus dem griechischen hergeleitet „viele Tumoren“ bedeutet. Neben dem murinen sind mittlerweile weitere PyV entdeckt worden. Diese infizieren sowohl Vögel als auch unterschiedliche Säugetierarten, wie Affen, Fledermäuse, Kaninchen und andere Nagetiere. Die ersten humanen PyV wurden 1971 durch zwei unabhängige Forschungsgruppen isoliert: BKV und JCV. 20 BKV wurde im Urin eines nierentransplantierten Patienten mit Ureterstenose detektiert. Das Virus wurde hier in Form von „Decoy Zellen“ gefunden. Dabei handelt es sich um Epithelzellen der Sammelrohre und anderer Tubulusabschnitte mit nukleären Einschlusskörpern (Gardner et al., 1971). Das JCVirus wurde aus dem Gehirngewebe eines Patienten isoliert, der im Rahmen eines Hodgkin Lymphoms eine progressive multifokale Leukenzephalopathie entwickelte (Padgett, et al., 1971). Die Namen der Viren entsprechen den Initialen dieser Patienten. Fast vierzig Jahre lang waren BKV und JCV die einzig bekannten humanpathogenen Polyomaviren. Dieses änderte sich erst 2007 mit der Entdeckung von KIV und das WUV, welche beide aus Sekreten des Respirationstrakts symptomatischer pädiatrischer Patienten isoliert wurden. Sie wurden nach den Institutionen, in denen sie entdeckt worden sind, benannt: Washington University und Karolinska Institute (Allander et al., 2007, Gaynor et al., 2007). In kürzester Zeit kamen weitere hPyV hinzu. Feng et al. isolierten 2008 das MCPyV in etwa 80% der MCC (Feng et al., 2008). HPyV6 und hPyV7 wurden durch Schowalter et al. in der Haut gesunder Personen entdeckt (Schowalter et al., 2010). Weitere hPyV sind das TSPyV, welchem eine kausale Rolle in der Entstehung der Trichodysplasia spinulosa zugeschrieben wird, und hPyV9, das aus dem Serum eines immunsupprimierten Nierentransplantierten isoliert wurde (van der Meijden et al., 2010, Scuda et al., 2011). Kürzlich entdeckt wurden MWPyV im Stuhl eines gesunden Kindes aus Malawi und hPyV10 aus Kondylomen eines an dem Warzen-HypogammaglobulinämieImmundefizienz-Myelokathexis-Syndrom (WHIM-Syndrom) lerkrankten Patienten (Erica et al., 2012, Buck et al., 2012). Diskutiert wird zudem, ob die Primaten-spezifischen Polyomaviren SV40 und LPV den Menschen infizieren können. Der natürliche Wirt des SV40 ist der Rhesusaffe. Ca. 2% der Bevölkerung weisen Antikörper gegen SV40 auf (Kean et al., 2009). 1960 wurde das Virus als Kontaminante des in Nierenzellen des Rhesusaffen gezüchteten Polioimpfstoffes entdeckt (Sweet und Hilleman, 1960). Anscheinend kam es auf diese Weise zur Infektion des Menschen. Allerdings weisen auch Menschen ohne Impfung oder Kontakt zum Rhesusaffen spezi21 fische Antikörper gegen das SV40 oder SV40 DNA auf (Van Ghelue, 2012). Erkrankungen durch SV40 sind jedoch nicht bekannt. Aufgrund der niedrigen Seroprävalenz scheint es eine untergeordnete Rolle zu spielen. Das LPV wurde 1979 erstmals aus Lymphoblasten der westlichen Grünmeerkatze isoliert (zur Hausen und Gissmann, 1979). Seroepidemiologische Untersuchungen ergaben, dass 15-25% der humanen Sera Antikörper gegen das LPV aufweisen. Durch LPV verursachte Erkrankungen sind bisher ebenfalls nicht bekannt (Kean et al., 2009). Zudem lässt sich neuen Erkenntnissen zur Folge die hohe Seroprävalenz größtenteils auf eine Kreuzreaktivität zwischen LPV und hPyV9 zurückführen, da eine Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz von 87% vorliegt (Scuda et al., 2011). Drei Gattungen werden innerhalb der Familie der Polyomaviridae unterschieden: Wukipolyomavirus, Orthopolyomavirus und Avipolyomavirus. Diese Einteilung erfolgte nach Vorschlag der Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses im Oktober 2010. Sie berücksichtigt phylogenetische, strukturelle und biologische Unterschiede der einzelnen PyV. Zu den Wukipolyomaviren zählen WUV, KIV, HPyV6 und HPyV7, während BKV, JCV, MCPyV und TSPyV den Orthopolyomaviren zugeordnet werden. Die Gattung der Avipolyomaviren umfasst PyV, deren natürlicher Wirt der Vogel ist. Bei einigen PyV, wie hPyV9 und MWPyV ist noch keine Zuteilung erfolgt (Johne et al., 2011). 1.3.2. Aufbau der Polyomaviren Ein Polyomavirus-Partikel hat einen Durchmesser von ca. 40-45 nm und eine ikosaedrische Symmetrie. Es besitzt keine Hüllmembran. Das Kapsid eines Partikels setzt sich aus 72 Kapsomeren zusammen. Jedes Kapsomer wird durch fünf Kapsidproteine VP1 gebildet. Um die Stabilität zu erhöhen, umgibt je ein VP1-Pentamer entweder ein VP2- oder ein VP3-Kapsidprotein. VP1 macht 70% des Kapsids aus (Imperiale and Major, 2007). Das Kapsid umgibt das Genom. Dieses ist zirkulär angeordnet und besteht aus 5,0-5,3 kb (Groenewoud et al., 2010, Gjoerup und Chang, 2010). Die DNA ist doppelsträngig und bildet einen chromatinähnlichen Komplex mit den HistonProteinen H2a, H2b, H3 und H4 der Wirtszelle (Johne et al., 2011). 22 Das Genom der PyV besitzt charakteristischerweise 3 Regionen: Eine nicht kodierende Kontrollregion und eine sog. frühe und späte Region. Die Kontrollregion beinhaltet die viralen Promotoren und den „origin of replication“. Hiervon ausgehend werden bidirektional die Gene der frühen und späten Region transkribiert (Scuda et al., 2011). Die durch die frühe Region kodierten Proteine sind an der ZellzyklusRegulation beteiligt und spielen eine entscheidende Rolle in der Zelltransformation und Tumorgenese. Durch differentielles Splicing entstehen hier das LTA und sTA. Sie werden direkt nach Infizierung der Wirtszelle und dem Uncoating transkribiert. Beim SV40 und dem murinen Polyomaviren wird zudem ein middle T-Antigen exprimiert. (Cheng et al., 2009) Die späte Region kodiert hauptsächlich für die durch differentielles Splicing entstehenden Strukturproteine VP1, VP2 und VP3. (Liddington et al.,1991, Imperiale et al., 2007, Johne et al., 2011). Beim SV40 wurde zudem das VP4 entdeckt. Dieses besteht aus den 125 C-Terminalen Aminosäuren des VP3 und scheint an der Lyse der Wirtszelle beteiligt zu sein (Daniels et al., 2007). Bei den Polyomaviren BKV und JVC kodiert die späte Region zusätzlich für das Agnoprotein. Dieses scheint die Replikation und Reifung des Virions zu fördern. (Jay et al., 1981, Saribas et al., 2012, Suzuki et al., 2012). Zudem soll es als Viroporin fungieren (Suzuki T., et al. 2010). Bei einigen PyV scheinen miRNAs die Genregulation zu beeinflussen. MiRNAs sind nicht-kodierende RNA-Moleküle, die aus etwa 22 Nukleotiden bestehen und nicht immunogen sind. Sie binden nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung eine Vielzahl noch unbekannter transkibierter Gene und führen somit zu deren Downregulation (Bartel, 2004). Gefunden wurden miRNAs u.a. bei SV40, BKV, JCV und MCPyV. Bei SV40 werden sie durch die späte Region kodiert und sind komplementär zu den Transkripten der frühen Region, welche dadurch vermindert exprimiert werden. MiRNAs werden zunehmend in der späten Phase der Infektion gebildet und sind notwendig für die Persistenz des Virus im Wirt: Die Downregulation der Expression der T-Antigene führt zu einer verminderten Replikation des Virus, wodurch eine Aktivierung des Immunsystems-insbesondere die der 23 zytotoxischer T-Zellen, reduziert wird (Sullivan et al., 2005, Seo et al., 2008, Seo et al., 2009). Ein weiterer Mechanismus der Immunsuppression wurde bei BKV und JCV entdeckt: Sie besitzen miRNA, die sich gegen die mRNA des stressinduzierten Proteins ULBP3 richtet. Da ULBP3 ein Ligand des T-Killer-ZellRezeptors NKG2D ist, führt auch hier eine Inaktivierung durch miRNA zu einer verminderten Aktivierung des Immunsystems (Bauman und Mandelboim, 2011). 1.3.3. Lebenszyklus Da es sich bei Polyomaviren um unbehüllte Viren handelt, erfolgt die Aufnahme durch die Wirtzelle nicht durch Fusion der Virushülle mit der Zellmembran des Wirts, sondern über rezeptorvermittelte Endozytose. Das Kapsidprotein VP1 scheint als Ligand dieses Prozesses zu fungieren, indem es an unterschiedlichen Oberflächenrezeptoren der Wirtszelle bindet. Bekannt ist, dass die Ganglioside GD1a and GT1b die Rezeptoren des murinen PyV, und das Gangliosid GM1 als Rezeptor des SV40 sind (Tsai et al., 2003). JCV benutzt sowohl den Gangliosidrezeptor GT1b als auch den Serotoninrezeptor 5HT2AR (Elphick et al., 2004). Die Ganglioside GD1B und GT1B scheinen BKV als Rezeptoren zu dienen (Low et al., 2006). GT1b wird als Rezeptor des MCPyV vermutet (Erickson et al., 2009). Daraufhin erfolgt der Transport über Caveolae durch das endoplasmatische Retikulum zum Zellkern, wo das Uncoating erfolgt und die Gene der frühen Region - darunter das LTA- transkribiert werden. Die Translation der entstehenden mRNA erfolgt im Zytoplasma. Nachdem LTA synthetisiert wurde, initiiert dieses die Replikation des Genoms durch Bindung des „origin of replication“, welcher sich in der nicht-codierenden Region befindet. Durch die Helikase-Aktivität des LTA entsteht lokal eine Replikationsblase. Die darauf folgende DNA-Synthese erfolgt durch die DNA-Polymerase α der Wirtszelle (Modrow et al., 2010). Nachdem das Genom repliziert wurde, initiiert LTA die Synthese der Gene der späten Region. Als erstes entsteht VP1, welches Pentamere bildet. Diese komplexieren jeweils mit einem VP2 oder VP3. 24 Die Komplexe werden zurück in den Nucleus transportiert, wo der Zusammenbau und die Reifung der Viruspartikel erfolgen. Zudem wird VP4 synthetisiert. Da die Menge an VP2 und VP3 die von VP1 übertrifft, akkumulieren diese und VP3, und vermutlich auch VP2, bilden Oligomere mit VP4. Diese Komplexe werden in die Wirtszellmembran integriert und initiieren die Lyse der Wirtszelle, was zur Freisetzung der Viruspartikel führt (Daniels et al., 2007). 1.3.4. Rolle der Polyomaviren als humanes Pathogen 1.3.4.1.Prävalenz Aus seroepidemiologischen Studien geht eine hohe Prävalenz der hPyV in der Bevölkerung hervor. Der Infektionszeitpunkt scheint bereits in der frühen Kindheit zu liegen. Kean et al. untersuchten 1501 Sera gesunder Erwachsener im Alter über 21 Jahre und 721 Sera von Kindern unter 21 Jahre. Mittels ELISA wurde die antikörpervermittelte Reaktivität gegenüber rekombinanter VP1 Kapsomere verschiedener PyV untersucht. Die Ergebnisse für die erwachsene Bevölkerung zeigen folgende Seroprävalenzen: BKV 82%, JCV 39%, KIV 55%, WUV 69%, MCV Isolat 350 25% und MCV Isolat 339 42%. 15% der untersuchten Bevölkerung waren seropositiv für LPV und nur 2% für SV40, sodass, entgegen jeglicher Vermutung, Infektionen mit diesem nicht humanen PyV eine untergeordnete Rolle zu spielen scheinen. Die Seroprävalenz innerhalb der pädiatrischen Bevölkerung war ebenfalls hoch, was die Annahme, dass der Infektionszeitpunkt bereits in der frühen Kindheit erfolgt, bestätigt. Hier die Seroprävalenz in der pädiatrischen Bevölkerung: BKV 73%, JCV 21%, KIV 56%, WUV 54%, MCV Isolat 350 23% und MCV Isolat 339 34%, LPV 14% und SV40 9% (Kean et. al., 2009) . 1.3.4.2. Virale Transmission Untersuchungen von Gewässern und Abwässern in Europa, Afrika und den USA ergaben eine hohe, durch Ausscheidungen verursachte Kontamination durch JCV und BKV. 25 Die Ingestion von kontaminierten Wasser, Gemüse oder Meeresfrüchten führt zu einer Infektion des Darmepithels. Auch die Aufnahme der VirusPartikel oder -DNA über die M-Zellen der Peyer Plaques ist möglich (BofillMas et al., 2001). Wie bereits im Tierversuch an der Maus beschrieben, erfolgt von dort aus der Transport im Rahmen einer Virämie in unterschiedliche Organe. Zielorgane sind u.a. die Niere, das Gehirn und periphere Leukozyten, in welchen in Abhängigkeit vom Immunstatus des Infizierten eine latente oder lytische Infektion etabliert wird (Schubbert et al., 1997). Auch KIV, WUV und MCV scheinen fäkal-oral aufgenommen zu werden (Babakir-Minal et al., 2009 a, Loyo et al., 2009). Daneben wird der Aerodigestivtrakt als Eintrittspforte diskutiert. Darauf weist der Nachweis von KIV, WUV und JCV in Stromazellen und Lymphozyten der Tonsillen, sowie das hohe Ausmaß an MCV im Speichel hin (Babakir-Minal et al. 2009 b, Monaco et al. 1998, Loyo et al. 2009). Hinweisend auf eine vertikale Transmission ist die Anwesenheit von BKV DNA im Autopsiematerial der Plazenta abgestorbener Feten. Auch der Nachweis eines transienten IgM-Anstiegs in den Sera Neugeborener seropositiver Mütter unterstützt diese Hypothese (Pietropaolo et al., 1998., Boldorini et al., 2011). 1.3.4.3.Polyomavirus-assoziierte Erkrankungen Im Gegensatz zur hohen Prävalenz in der Bevölkerung sind durch Polyomaviren verursachte Krankheiten selten. Bei Immunkompetenz verlaufen die Infektionen, die meist bereits in der Kindheit erfolgen, asymptomatisch bzw. symptomarm. Sie persistieren lebenslang. Im Rahmen einer Immunsuppression können humane Polyomaviren jedoch in Folge einer Reaktivierung zu schwerwiegenden Erkrankungen führen. Die BKV Reaktivierung erfolgt vornehmlich im Rahmen einer der Transplantatabstoßung entgegen wirkenden Immunsuppression nach Transplantation. Während sie sich nach einer Nierentransplantation typischerweise durch eine Virämie oder eine Polyomavirus assoziierte interstitielle Nephropathie (PVAN) kennzeichnet, äußert sie sich nach allogener hämatopoertischer 26 Stammzelltransplantation typischerweise in Form eine Hämaturie und Nephropathie (O’Donnell et al., 2009). Die PVAN, die neben BKV auch mit JVC und SV40 assoziiert ist, betrifft bis zu 10% der Nierentransplantierten und führt in bis zu 80% dieser Fälle zur Transplantatabstoßung. Sie tritt meistens innerhalb des ersten Jahres nach Nierentransplantation auf. Ein Risiko für die Entwicklung der PVAN stellt die Virurie, Virämie und die Ausscheidung von sog. „Decoy-Zellen“ dar. Die entgültige Diagnose erfolgt über den histopathologischen Nachweis charakteristischer zytopathischer Effekte in den Glomeruli und Tubuli der Niere. Ergänzend sollte ein immunhistochemischer Nachweis des LTA durchgeführt werden. Nach der Diagnose stellt sich die Frage der Therapie. Obwohl es gegen Polyomaviren in-vitro wirksame Medikamente wie Cidofovir, Leflunomid und Chinolon-Antibiotika gibt, ist derzeit die Reduktion immunsupprimierender Medikamente Therapie der Wahl, oft in Kombination mit den o.g. Medikamenten. Daraus ergibt sich allerdings ein erhöhtes Abstoßungsrisiko. Dieses kann durch Früherkennung der PVAN reduziert werden, weshalb ein BKV Screening bei Risikopatienten zu empfehlen ist. Sind alle konservativen Möglichkeiten ausgeschöpft, muss eine Re-Transplantation in Erwägung gezogen werden (Hirsch et al., 2006). Ein Zusammenhang zwischen BKV und Autoimmunerkrankungen bzw. Krebs ist umstritten (Hirsch und Snydman, 2005). Die Reaktivierung des in den Nieren und im lymphatischen Gewebe persistierenden JCV ist mit der progressiven multifokalen Leukenzephalitis (PML) assoziiert. Bei der PML handelt es sich um eine tödlich verlaufende, lytische Infektion der Oligodentrozyten, die eine Demyelinisierung der Axone im ZNS zur Folge hat. Sie wurde erstmals 1958 durch Aström, Mancall, und Richardon bei einem Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie und einem Patienten mit Non Hodgkin Lymphom diagnostiziert, bevor 1971 der Zusammenhang mit einer JCV Infektion aufgedeckt wurde (Padgett, et al., 1971). Die PML tritt fast ausschließlich im Rahmen einer Immunsuppression auf, v.a. bei eingeschränkter T-Zell-vermittelter Abwehr, wie sie bei HIVInfektionen, hämatologischen Erkrankungen oder unter immunsuppressiver 27 Medikation der vorliegt. Allerdings wurden auch Fälle der PML bei Immunkompetenten beschrieben (Vaklavas et al., 2010). Natalizumab ist ein humaner monoklonaler Antikörper gegen α4-Integrin und wird in der Therapie der Multiplen Sklerose, des M.Crohn und rheumatologischer Erkrankungen eingesetzt. Auch unter Langzeittherapie mit diesem Medikament kann eine PML entstehen. Denn aufgrund der Antikörpervermittelten Neutralisierung der α4β1- und α4β7-Integrine, wird die durch sie vermittelte Adhäsion verschiedener Zellen, darunter Zellen des Immunsystems, an Endothelzellen verhindert. Dadurch wird die Diapedese der Lymphozyten über die Blutgefäße in das Gehirnparenchym eingeschränkt und eine JCV-Reaktivierung kann nicht mehr durch das Immunsystem kontrolliert werden (Kleinschmidt-DeMasters und Kenneth, 2005). Die Symptome der PML sind abhängig von der Lokalisation der Schädigung. Betroffene weisen fokal neurologische Defizite auf, die sowohl die Sensorik, Motorik, Psyche und Kognition mit einschließen können. Die Diagnose erfolgt mittels PCR über den Nachweis von JCV-DNA aus dem Liquor. Wegweisend sind zudem MRT-Befunde, die im Mark liegende, T2hyperintense Entmarkungsherde aufzeigen. Die sicherste Diagnose erfolgt post mortem durch eine Biopsie des Hirngewebes. Eine spezifische Therapie gibt es nicht, sodass nach Diagnose eine durchschnittliche Lebenserwartung von 3-20 Monaten besteht. Neben der PML sind weitere JCV assoziierte neurologische Erkrankungen beschrieben: Die JCV Meningitis, Enzephalopathie und die Granule cell neuropathy (GCN), eine die Körnerzellschicht betreffende lytische Infektion, die zu einer Atrophie des Kleinhirns führt (Tan und Koralnik, 2010). Untersuchungen an KIV und WUF konnten trotz der Assoziation mit respiratorischen Infekten und vermehrten Auftreten in Sekreten Immunsupprimierter im Sinne einer Reaktivierung keine Kausalität zwischen Symptomen und den Viren herstellen (Kuypers et al., 2012). Auch der Verdacht, dass die zur gesunden Hautflora zählenden hPyV6 und hPyV7 an der Entstehung von Merkelzellkarzinomen und anderen Hauttumoren beteiligt sind, wurde nicht bestätigt (Duncavage und Pfeifer, 2011). Bisher sind weder Krankheiten mit den kürzlich entdeckten hPyV9, noch mit dem PyV10 oder MWPyV assoziiert. 28 Das onkogene Potential der PyV ist seit der Entdeckung des murinen Polyomavirus durch Gross im Jahre 1953 bekannt (Gross, 1953). Trotz der Befunde aus Tierversuchen, fehlte lange Zeit der Nachweis kanzerogener Eigenschaften beim Menschen. Das änderte sich durch den Nachweis des MCPyV in durchschnittlich 80% der MCC. Eine ebenfalls mit Polyomaviren assoziierte Hauterkrankung ist die Trichodysplasia spinulosa. Beide Erkrankungen werden im Folgenden erläutert. 1.3.5. Merkelzell-Karzinom 1.3.5.1. Epidemiologie und Klinik Das Merkelzellkarzinom ist ein hochmaligner, aggressiv wachsender, neuroendokriner Hauttumor. Beim fortgeschrittenen MCC beträgt die Überlebenszeit bei 50% der Betroffenen nicht länger als 9 Monate (Feng et al., 2008). Die Letalität ist etwa doppelt so hoch wie die des malignen Melanoms (Houben et al. 2010). Es wurde erstmals 1972 durch Toker beschrieben und aufgrund mikroskopischen Eigenschaften als trabekuläres Karzinom der Haut bezeichnet (Toker, 1972). Die spätere Bezeichnung als MCC erfolgte aufgrund des elektronenmikroskopischen Nachweises neurosekretorischer Granula in den Tumorzellen, welche charakteristisch für die Merkelzellen der Haut siind. Merkelzellen sind neuroendokrine Zellen, die als Mechanorezeptoren der Haut fungieren (Winkelmann und Breathnach, 1973). Die Inzidenz dieses seltenen Tumors beträgt 0,1-0,3 pro 100 000 Einwohner und Jahr. Das Durchschnittserkrankungsalter beträgt 70 Jahre, wobei Männer und Frauen gleich häufig betroffen sind. Eine medikamentöse oder krankheitsbedingte Immunsuppression stellt einen Risikofaktor dar, wobei das Erkrankungsalter in solchen Fällen bei etwa 50 Jahren liegt. Das MCC ist meistens indolent. Lokalisiert ist es hauptsächlich an sonnenexponierten Hautarealen, wie dem Gesicht und dem Hals (40-60%), seltener am Stamm (30%) und an den Extremitäten (10-20%). Deshalb wird angenommen, dass eine UV-Exposition die MCC-Entstehung begünstigt (Hauschild und Garbe, 2005). 29 Zusammenfassend lassen sich Charakteristika des MCC durch das Akronym AEIOU beschreiben: Asymptomatisch, schnelle Ausbreitung (Expanding rapidly), Immunsuppression, älter als 50 Jahre (Older than 50 years), und Ultraviolettstrahlung als Risikofaktor (Heath, 2008). 1.3.5.2. Diagnostik und Stadieneinteilung Die Diagnostik des MCC beginnt mit der Inspektion: hier stellt es sich charakteristischerweise als ein solitärer, exophytisch wachsender, hautfarbener bis rötlicher, glatter, halbkugeliger Tumor dar. Auch flache Tumoren sind möglich. Differentialdiagnostisch sind hier u.a. das Basalzellkarzinom, das SCC, maligne Lymphome, amelanoblastische Melanome, Hautmetastasen und Angiome abzugrenzen (Altmeyer, 2010 a). Aus diesem Grund ist die Anfertigung einer Histologie unerlässlich. 90% der Tumoren befinden sich intradermal, während 10% in der Epidermis gelegen sind. Eine Ausbreitung über das subkutane Fettgewebe hinaus bis in die Muskulatur ist möglich. Von hier aus erfolgt eine rasche lymphogene Metastasierung. Die prognostisch relevante histologische Einteilung des MCC erfolgt abhängig von der Zellmorphologie und -anordnung in einen trabekulären, intermediären und kleinzelligen Typen. Die beste Prognose hat der gut differenzierte trabekuläre Typ mit einem Anteil von 10%. Mit einem Anteil von 80% ist der intermediäre Typ der häufigste und nimmt hinsichtlich der Prognose eine Mittelstellung zwischen dem trabekulären und kleinzelligen Typen ein. Die schlechteste Prognose weist der wenig differenzierte kleinzellige Typ auf, welcher einen Anteil von 10% ausmacht (Hauschild und Garbe, 1998; Becker, 2010). Die Sicherung der Diagnose erfolgt über den immunhistochemischen Nachweis verschiedener epithelialer und neuroendokriner Marker. Als epitheliale Marker fungieren Zytokeratine (CK). Dabei handelt es sich um Intermediärfilamente, welche einen wichtigen Bestandteil des Zytoskeletts darstellen. CK 8,18,19 und 20 werden in der Diagnostik des MCC verwendet. CK20 ist hier von größter Bedeutung, auch wenn 5-20% der MCC CK-20 negativ sind. 30 Allerdings ist CK20 kein MCC-spezifischer Marker, sondern wird auch in der Diagnostik gastrointestinaler Adenokarzinome, wie dem kolorektalen Karzinom, eingesetzt (Miettinen, 1995). Ein weiterer epithelialer Marker ist der thyroid transciption factor 1 (ttf-1), welcher zwar nicht im MCC nachweisbar ist, allerdings der differentialdiagnostischen Abgrenzung zum kleinzelligen Bronchialkarzinom dient (ByrdGloster et al., 2000). Neuroendokrine Marker in der MCC Diagnostik sind die Neuronen-spezifische Enolase, CD65, das neuronale Zell-Adhäsions Molekül (NCAM) und Chromogranin A (Kurokawa et al., 2003, Gallego, 1995). Zudem scheint nach Liu et al. das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 (MAPS-2) als neuroendokriner Marker dem Nachweis des MCC zu dienen (Liu et al., 2003). Nach Diagnosestellung erfolgt ein Staging zur Detektion von Lymphknotenmetastasen, die etwa bei der Hälfte der Patienten zu finden sind, und zur Detektion von Fernmetastasen, die im Verlauf bei 30% der Betroffenen auftreten. Diese sind am häufigsten in Lunge, Leber und Knochen lokalisiert. Neben der histologischen Beurteilung klinisch auffälliger Lymphknoten, wird auch bei klinisch unauffälligen eine Sentinel-Lymphknoten-Biopsie empfohlen (Altmeyer, 2010 a). Die vom Grad der Metastasierung abhängige Stadieneinteilung erfolgt üblicherweise nach der in Tabelle 5 dargestellten Einteilung. Tabelle. 5: Stadieneinteilung des Merkelzellkarzinoms (Garbe, 1996). Stadium IA Primärtumor, <2cm Stadium IB Primärtumor, >2cm Stadium II lokoregionäre Metastasen im Lymphabstromgebiet oder lokale Lymphknotenmetastasen Stadium III Fernmetastasen 31 1.3.5.3. Therapie Die chirurgische Exzision erfolgt unter Einhaltung eines Sicherheitsabstandes von etwa 3cm unter Berücksichtigung kosmetischer Aspekte. Zudem erfolgt zum Ausschluss von Mikrometastasen eine Wächterlymphknotenbiopsie. Ist der Wächterlymphknoten frei von Mikrometastasen, wird eine adjuvante Bestrahlung der Narbenumgebung und der dazugehörigen Lymphknotenstationen empfohlen. Wenn der Sicherheitsabstand nicht einzuhalten ist, ist die mikrographische Chirurgie indiziert, die ebenfalls in Kombination mit einer adjuvanten Bestrahlung erfolgt. Der Nachweis einer Metastasierung in den Wächterlymphknoten indiziert eine radikale Lymphadenektomie. Ob danach eine adjuvante Bestrahlung eine Prognoseverbesserung zu erreichen ist, ist nicht belegt. (Hauschild und Garbe, 2005). Auch bei nicht operablen Tumoren oder bei Patienten, die aufgrund ihres Allgemeinzustandes nicht operierbar sind, stellt in Anbetracht der Radiosensibilität des MCC die primäre Radiotherapie eine Behandlungsalternative dar. Hier wird i.d.R. eine Strahlendosis zwischen 45-70 Gy eingesetzt (Meeuwissen et al.,1995, Rao et al., 2010) Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von Somatostatinananaloga, deren Wirksamkeit bereits in einigen Studien untersucht und belegt worden ist (Salavati A, et al 2012). Fakiha et al. beschrieben eine komplette Remission eines inoperablen MCC und seiner Metastasen bei einer 87-jährigen Patientin unter Einsatz des Somatostatinanalogons Lanreotid (Fakiha et al., 2010). Bei der Therapie von in-transit Metastasen stehen mehrere Optionen zur Verfügung. Neben der chirurgischen Exzision bzw. bei ausgedehnten Befunden der Amputation, der Strahlen- und Chemotherapie, zeigt die Perfusionshyperthermie unter Applikation mit Melphalan gute Ergebnisse. Der Einsatz von Chemotherapeutika stellt die Behandlung der Wahl beim Vorliegen von Fernmetastasen dar. Beim Einsatz von Platin-haltigen Komponenten, wie Cis- oder Carboplatin, in Kombination mit Etoposid oder Doxorubicin wurden in Studien Ansprechraten von 40%-60% erreicht, Allerdings war die Remission nur von kurzer Dauer (Duprat , 2011). 32 1.3.5.4. Rolle des Merkelzellpolyomavirus in der Onkogenese des Merkelzellkarzinoms Die Tatsache dass, das MCC überwiegend ältere und immunsupprimierte Menschen betrifft, lässt ein infektiöses Agens als Ursache dieses Tumors vermuten. Aus diesem Grund untersuchten Feng et al. 2008 Proben von Merkelzell-Karzinomen mittels digitaler Transkriptom-Substraktion auf virale Sequenzen. Hierbei wurde ein Fusionstranskript zwischen dem humanen Tyrosin Phosphatase Rezeptor und einem bisher nicht bekannten viralen TA gefunden. Nach DNA-Sequenzanalysen konnte man dieses TA einem bisher unbekannten Virus der Familie der Polyomaviridae zuordnen. Es wurde MCPyV genannt. Das Vorliegen einer Assoziation zwischen MCC und MCPyV wurde daraufhin an MCC-Läsionen von 10 Patienten, die an einem MCC erkrankt waren, untersucht. Davon waren 80% (8 von 10) MCVpositiv. Sechs der acht MCV positiven Proben wiesen klonale Sequenzen auf. Dagegen waren in der ersten Kontrollgruppe, in der 59 Proben unterschiedlicher Gewebe untersucht wurden, nur 8% (5 von 59) MCPyV positiv und in der zweiten Kontrollgruppe, in der Hautproben von nicht an MCC erkrankten Immunkompetenten und Immunsupprimierten untersucht wurden, 16% (4 von 25) MCPyV positiv (Feng et al., 2008). Darauf folgende Studien bestätigten diese Assoziation (Kassem et al., 2008). Als potentieller Auslöser des MCC, stellt sich die Frage, durch welche Mechanismen MCV zur Entstehung des Tumors führt. Eine wichtige Rolle in der Pathogenese des MCC scheinen Mutationen im TA zu spielen. Diese finden sich vor allem am 3´Ende des TA. Sie sind charakteristisch für Tumorzellen, nicht aber für den Wild Typen. Sie führen zu Funktionsänderungen in den Genprodukten, wie dem LTA und sTA. Die Rolle des LTA und des sTA wurden u.a. von Shuda et al. untersucht. Demzufolge führen die im MCC vorkommenden Mutationen im LTA zu einem verkürzten Protein, wodurch es zu einem Verlust der Helikase-Aktivität kommt. Durch diesen Verlust kommt es zu einer Störung der Virusreplikation. Da i.d.R. nur DNA von sich replizierenden Viren in ein Wirtsgenom integriert wird, ist es wahrscheinlich, dass MCV schon vor der Entstehung eines Tumors im Genom der Wirtszelle integriert ist, und nicht erst sekundär. 33 Die Unfähigkeit zur Replikation ist zudem eine wichtige Voraussetzung für das Überleben des Virus. Denn die Replikation integrierter viraler DNA, wi sie durch den Wild-Typ LTA initiiert wird, führt zu einer Kollision innerhalb der Replikationsgabel zwischen dem Replikationsapparat des Wirts und des Virus. Dadurch kommt es zur Zerstörung der DNA, einer Aktivierung des Immunsystems und folglich zur Elimination des Virus. Neben der Frage nach den Auswirkungen der Mutationen im LTA, beschäftigten sich Shuda et al. auch mit der Frage, ob UV-Strahlen-wie angenommen- diese verursacht haben könnten. Allerdings handelte es sich bei den vorliegenden Mutationen nicht um die für UV-Strahlung typischen ThyminDimere, sondern um eine hohe Anzahl an Pyrimidin-Dimeren. Dieser Befund ist dennoch kongruent mit der Annahme, dass UV-Strahlung eine Rolle in der Pathogenese des MCC spielt (Shuda et al., 2008). Die Bedeutung des LTA in der Onkogenese des MCC untersuchten auch Houben et al. 2010, indem sie das LTA in Zelllinien MCV positiver MCC mittels RNA-Vektoren ausschalteten und somit ein Wachstumsstillstand bzw. einen Zelltod induzierten, was zeigt, dass das LTA für die Aufrechterhaltung des Tumorwachstums notwendig zu seien scheint. Dieses war nicht der Fall bei den Zelllinien MCV negativer MCC (Houben et al., 2010). Auch das sTA scheint als Onkogen in der Pathogenese des MCC zu fungieren, indem es in den Akt-mTor Signalweg eingreift. Dieser ist essentiell für die Initiation der Translation. sTA führt zu einer Aufrechterhaltung der Hyperphosphorylierung der an diesem Signalweg beteiligten Substrate, wie dem 4E-BP1 und dem S6K. Auf welchen Weg die Hyperphosphorylierung durch sTA konstant gehalten wird, ist unklar. Fakt ist, dass die durch mTor erfolgende Hyperphosphorylierung des 4E-BP1 die Proliferation der Tumorzellen fördert. Denn im dephosphorylierten Zustand bindet 4E-BP1 den eukaryontischen Initiationsfaktor 4E. Dadurch wird verhindert, dass eIF-4E am 5´cap-Ende der mRNA bindet und durch die dadurch erfolgte Bindung an die Ribosomen eine Translation initiiert werden kann (Shuda et al., 2011). 34 1.3.6. Trichodysplasia spinulosa Trichodysplasia spinulosa ist eine seltene Hauterkrankung, die unter Immunsuppression auftritt. Menschen erkranken in jedem Alter, wobei insbesondere Kinder betroffen sind. Erstmalig beschrieben wurde die TSP bei Immunsupprimierten von Haycox et al., 1999. Bereits damals vermutete man entsprechend der elektronenmikroskopischen Beobachtung intrazellulärer Viruspartikel in für die TSP charakteristischen Läsionen, dass eine virale Infektion die Hauterkrankung verursacht. Aufgrund der ikosahedralen Form der Viruspartikel, wurden sie den Papovaviren zugeordnet (Haycox et al. 1999). Etwa zehn Jahre später gelang es van der Meijden et al., virale DNA aus den Läsionen eines an TSP erkrankten zu isolieren. Sowohl die Größe als auch die Organisation des Genoms ließen eine Zuordnung zur Familie der Polyomaviridae zu. Das Virus wurde als Trichodysplasia spinulosa assoziiertes Polyomavirus bezeichnet (van der Meijden et al. 2010). Die TSP kennzeichnet sich durch eine Keratinisierungsstörung im Bereich der Haarfollikel. Diese weisen vergrößerte, abnormal gereifte Matrixzellen und erweiterte Infundibulae auf. Eine übermäßige Produktion an Trichohyalin liegt vor. Die ca. 1,3 mm, spikeartig die Follikeloberfläche überragenden Hornmassen zeigen sich an der Haut in Form von rot bzw. rot-braunen Papeln und Plaques. Diese sind typischerweise im Gesicht, und hier insbesondere an der Nase, den Ohren und den Augenbrauen lokalisiert. Eine optische Entstellung ist oftmals die Folge. Auch andere Körperteile können betroffen sein. Insgesamt führt die TSP zu einer Verdickung der Haut, oft begleitet durch einen Haarverlust im Bereich der Wimpern, der Augenbrauen und des Kapilitiums (Altmeyer, 2010 b, van der Meijden et al., 2010). Die Therapie besteht aus einer Reduktion der Immunsuppression. Zudem wurde eine Verbesserung des klinischen Erscheinungsbildes und eine Reduktion der Viruslast unter Virostatika wie Valganciclovir und Cidofovir beobachtet (Holzer and Hughey, 2008, van der Meijden et al., 2010). 35 Bisherigen Erkenntnissen zur Folge wurde TSPyV als dermatotropes Virus betrachtet. Allerdings scheint sich das Virus auch extrakutan zu manifestieren: Bei einem an TSP erkrankten Nierentransplantierten wurde TSPyV DNA im Gewebe der allogenen Spenderniere gefunden (Fischer et al., 2010). 36 2. Zielsetzung Mit dieser Studie soll der Zusammenhang zwischen einer PolyomavirusInfektion und der Entstehung des PCBL und PCTL untersucht werden. Hierzu wurden Proben aus den entsprechenden Läsionen eines an PCBL und PCTL erkrankten Patientenkollektivs auf das Vorliegen von DNA folgender hPyV analysiert: MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV. Der Nachweis der Viruslast erfolgte qualitativ und quantitativ mittels real-time PCR unter Verwendung Virus-spezifischer Primer. Die Viruslast wurde als Anzahl an viralen DNA-Kopien pro ß-Globin-Gen-Kopie angegeben. Zur Erhöhung der Sensitivität und Spezifität wurden die Hautproben zusätzlich unter dem Einsatz spezifischer externer und interner Primer mittels MCPyV-nested-PCR analysiert. Hierbei erfolgte der qualitative DNA-Nachweis des internen PCR-Produktes mittels Agarose Gelelektrophorese und photodokumentierter visueller Auswertung. Daneben wurde ein immunhistochemischer Nachweis der LTA Expression unter dem Einsatz des monoklonalen Maus-Antikörpers CM2B4 bei MCPyV positiven Proben durchgeführt (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA). 37 3.Methoden 3.1. Patientenauswahl und Untersuchungsprobenmaterial In dieser Studie wurden 130 in Paraffin-eingebettete Hautproben von insgesamt 83 an PCBL und PCTL erkrankten Patienten untersucht, welche zwischen Januar 1999 und Dezember 2010 in der Abteilung für Dermatologie der Ruhr Universität Bochum behandelt wurden. Die Diagnose wurde histopathologisch gesichert. Die histologische Beurteilung, Diagnosestellung, und Klassifizierung erfolgte gemäß der aktuellen WHO-EORTC Klassifikation für kutane Lymphome (Willemze R., et al., 2005). Bei den 83 Patienten handelte es sich um 48 Männer und 35 Frauen. Die Entnahmestelle der Hautproben richtete sich nach der Lokalisation und Ausprägung des Lymphoms an der Haut des Patienten. Folgende Tabelle zeigt die in der Studie untersuchten T- und B-ZellLymphome. 38 Tabelle 6: Anzahl der in der Studie auf MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV untersuchten Hautproben und Patienten, und deren Zuordnung zu den verschiedenen kutanen T- und B-Zelllymphomen. Tumor-Gruppe Männlich Weiblich 37 20 17 8 6 2 4 PR 2 2 2 0 Sézary Syndrom SS 13 9 6 3 CD30+ kutane PCAGL 17 10 6 4 LP 3 3 1 2 KMGP-TCL 8 5 4 1 PCP-TCL, u 2 2 2 0 PCZ-TCL 1 1 1 0 SP-TCL 1 1 0 1 KZT 9 5 3 2 PCDGBCL-l 3 1 1 0 PCDGBCL- 2 1 0 1 130 83 48 35 Klassische MF Tumor Proben Patienten -Typ -anzahl -anzahl MF 61 fMF und MF-Subtypen lymphoproliferative Erkrankungen Seltene kutane TZellLymphome Kutane B-ZellTumore a Summe Abkürzungen: MF: Mykosis fungoides; fMF: Follikuläre MF, PR: Pagetoide Retikulose; SS: Sézary Syndrom; PCAGL: Primär kutanes anaplastisch großzelliges Lymphom; LP: Lymphomatoide Retikulose; KMGP-TCL: Kleinbis mittelzellgroßes pleomorphes TCL; PCP-TCL,u.: Primär kutanes peripheres TCL, unspezifisch; PCZ-TCL: Primär kutanes zytotoxisches TCL; SP-TCL: Subkutanes pannikulitis-ähnliches TCL; KZT: Keimzentrumslymphom; PCDGBCL-l: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, leg type; PCDGBCL-a:: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, andere Typen 39 Wie in Tabelle 6 ersichtlich wird, waren von den 130 Proben 116 Proben (89,23%) PCTL und 14 Proben PCBL (10,77%). 71 Proben der klassischen MF-Typen und MF-Subtypen standen der Untersuchung zur Verfügung, wobei es sich hier um 61 MF (46,92%), 8 fMF (6,15%) und 2 PR (1,54%) handelte. 13 Hautproben entsprachen einem SS (10%). Von den CD30+ lymphoproliferativen Erkrankungen wurden 20 Proben untersucht: 17 PCAGL (13,08%), und 3 LP (2,31%). Auch seltene PCTL konnten analysiert werden: 8 KMGP-TCL (6,15%), 2 PCP-TCL-u (1,54%), 1 PCZ-TCL und 1 SP-TCL (jeweils 0,77%. In der Gruppe der PCBL standen 9 KZT (6,92%), 3 PCDGBCL-l (2,31%) und 2 PCDGBCL-a (1,54%) zu Verfügung. Die Untersuchung der archivierten Hautproben auf die Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und das TSPyV erfolgte in Einverständnis mit der Ethikkomission der Ruhr Universität Bochum. 3.2. Real-Time PCR im Überblick Um einen möglichen Zusammenhang zwischen den Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV und der Entstehung von kutanen PCBL und PCTL aufzudecken, mussten zunächst Marker gefunden werden, die das Vorhandensein der Viren in den Proben aufzeigten. Als Marker sollte ein für jeden der vier Virustypen spezifischer DNA-Abschnitt dienen, der mittels spezifischer Primer in einer PCR vervielfältigt und quantifiziert wurde. Die PCR wurde mit dem LightCycler® 480 Real-Time PCR System der Firma Roche nach Herstellerangaben im Institut für Virologie der Universität Köln unter der Leitung von Prof. Dr. med. Ulrike Wieland und Dr. rer. nat. Steffi Silling durchgeführt. Die simultane relative Quantifizierung wurde durch den Einsatz fluoreszenzmarkierter LNA-Sonden ermöglicht (Roche, Mannheim, Deutschland). Die absolute Quantifizierung der Viruslast wurde mittels Verdünnungsreihen durchgeführt. Die Angabe der Viruslast erfolgte im Verhältnis zur jeweiligen ß-Globin-Menge, welche im Rahmen der internen Qualitätssicherung in einer parallel durchgeführten humanen ß-Globin-Gen-PCR erfasst wurde. Sie diente dem Nachweis humaner DNA in den Hautproben- und dem Ausschluss PCR störender Faktoren. 40 3.2.1.Versuchsmaterialien Als Startpunkt für die DNA-Polymerase dienten Primer, die jeweils für einen bestimmten DNA-Abschnitt im Genom der Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPV spezifisch waren. Die Zielsequenz der Primer lag beim MCPyV in dem large T-Antigen-DNA-Abschnitt (Sihto et al., 2009) und bei den hPyV6, dem hPyV7 und dem TSPV im VP1-DNA-Abschnitt (Scola et al., 2012). Die verwendeten Vor- und Rückwärtsprimer sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7: Die in der MCPyV-, hPyV6, hPyV7 und TSPyV- PCR verwendeten spezifischen Primer (Sitho et al., 2009, Scola et al., 2012). Virus Sequenz Ampliconlänge 23 27 LT3 LC f LT3 LC r 5´-GCATCTGCACCTTTTCTAGACTC-3´ 5´-TTTTGCCTTATAGACTTTTCCATATCT-3´ hPyV6 VP1 f hPyV6 VP1 r 5`-GGAGCCCCCTACACCTTTAC -3` 5`-ACAACAGCCAGGGTATAACACA -3` 20 22 hPyV7 VP1 f hPyV7 VP1 r 5´-CAAGCCCTCAGAAAGCAAGTA-3´ 5´-GGATCTGCAACCCAGAGC-3´ 21 18 TSV VP1 f TSV VP1 r 5´TGGTAAATGTTCATATGGCTAAAA-3´ 5´-CCCACTGCAAACATATGGAA-3 27 20 Die fluoreszensmarkierten LNA-Sonden stammten aus dem Universal Probe Library System der Firma Roche. Die passende Sonde wurde mittels Probe Finder (Roche) ausgewählt (Roche Diagnostics GmbH, 2009). Die im Versuch verwendeten LNA-Proben sind in Tabelle 8 aufgezeigt. 41 Tabelle 8: Die in der PCR verwendeten LNA-Sonden, stammend aus dem Universal Probe Library System (Roche). Polyomavirus LNA-Sonde Sequenz MCPyV LNA Probe #6 TTCCTCTG hPyV6 LNA Probe #89 GGATGCTG hPyV7 LNA Probe #48 TTCCCAGT TSPyV LNA Probe #48 TTCCCAGT Außerdem wurde der LightCycler 480 Probes Master Mix, (Roche, #04707494001) eingesetzt, welcher sowohl FastStart Taq DNA Polymerase für eine hot start PCR, als auch Desoxyribonukleosidtriphosphate beinhaltete. Die Reagenzien der ß Globin-PCR waren das LightCycler Control Kit (Roche # 12158833001), die PlatinumTaq DNA Polymerase (Invitrogen, # 10966-034) und Desoxyribonukleosidtriphosphate (Fermentas, # EP 0072). 3.2.2. Methoden-Durchführung Als erstes erfolgte die DNA-Extraktion aus den in Paraffin-eingebetteten Patientenproben durch den Einsatz des High Pure Viral NA Extraction Kit (Roche#11858874001). Die Polyomaviren-PCR wurden in 18 µl-Ansätzen durchgeführt, welche sich wie folgt zusammensetzten: 1. 7,0 µl Wasser, 2. 10 µl LightCycler 480 Probes Master Mix 3. 0,4 µl des spezifischen Vorwärtsprimers 4. 0,4 µl des spezifischen Rückwärtsprimers 5. 0,2 µl der jewiligen LNA-Proben Bei einer jeweiligen Ausgangskonzentration von 10,0 µmol betrug die Endkonzentration der Primer 0,2 µmol, während die der LNA-Proben 0,1 µmol betrug. 42 Auch die ß-Globin-PCR erfolgte in 18 µl Ansätzen (Ausgangskonzentration in Klammern): 1. 9,75 µl Wasser, 2. 2,0 µl ß-Globin Primer Mix 3. 2,0 µl ß-Globin HybProbe Mix 4. 0,4 µl dNTP (10 µM) 5. 1,6 µl MgCl2 (50 mM), 6. 0,25 µl PlatinumTaq (5 U/µl) 7. 2,0 µl Puffer. Die 18 µl-Ansätze für die PyV-PCR bzw. ß-Globin-PCR wurden in die entsprechende Anzahl an Kavitäten der 96-well-LC-Platte des LightCycler 480 II pipettiert und je 2µl Kontrolle, Standard bzw. Patientenmaterial hinzugefügt. Pro PyV-PCR liefen je acht Referenzen mit, darunter sechs Standards mit 10 bis 1 Millionen Kopien in 10er- Verdünnungsschritten zur Quantifizierung der Virus-DNA Kopien, eine Positivkontrolle mit 100 Kopien eines serotypenspezifischen Plasmids und eine Negativkontrolle, die Zellmaterial aus einer Kultur enthielt. Die Positiv- und Negativkontrolle dienten der internen Qualitätskontrolle. Während der ß-Globin-PCR liefen jeweils 6 Kontrollen mit. Dabei handelte es sich um 4 Standards von 10 bis 10 000 Kopien in 10er Verdünnungsschritten, um eine positive Aufarbeitungskontrolle und eine negative Reagenzienkontrolle. Nachdem die 96-well-LC-Platte mit der dazugehörigen Abdeckfolie verschlossen wurde, wurden die Proben in den Amplifikations- und Detektionsbereich überführt. Bevor das Programm zur Durchführung der LT3q-, PyV6 VP1-, PyV7VP1-, TSV VP1- bzw. ß-Globin-PCR gestartet wurde, wurde die 96-well-LC-Platte 10 sec. bei 2000 UpM zentrifugiert und in den „multiwell plate loader“ gestellt. 43 3.2.3. Ablauf der PCR Das Programm des LightCycler 480 II zur PCR-Durchführung erfolgte in drei Schritten: 1. Aktivierung des hot start Enzyms, 2. Amplifikation in 45 Zyklen, jeweils bestehend aus Denaturierung, Hybridisierung und Elongation, 3. Kühlung. 1. Aktivierung des hot start Enzyms durch Erhitzung der Proben auf 95°C für 10 min bei 4,4°C Temperaturerhöhung/Sec. 2. Amplifikation der Virus-DNA mit simultaner Quantifizierung der DNA. Dazu mussten die DNA-Doppelstränge zunächst denaturiert werden. Dieses erfolgte bei 95°C über einen Zeitraum von 10 Sec. bei einer Temperaturerhöhungsrate von 4,4°C/Sec. Es folgte eine Abkühlung auf 60°C für weitere 30 Sec. bei einer Temperaturerniedrigung von 2,2 °C/Sec. Bei dieser Temperatur fand die Primer-Hybridisierung statt. Durch eine weitere Erhöhung der Temperatur auf 72°C für 0,5 Sec. bei einer Temperaturerhöhung von 4,4°C/sec. wurde die Elongation der DNA-Stränge eingeleitet. Die Amplifikation verlief in 45 Zyklen. 3. Nach Abschluss der 45 Zyklen erfolgte der letzte Schritt, die Kühlung, auf 40 °C für 30 Sec. bei 1,5°C Temperaturerniedrigung/Sec. Die ß Globin-PCR verlief nach dem gleichen Prinzip wie die Virus-DNA-PCR: 1. Aktivierung des hot start Enzyms durch Erhitzung der Proben um 4,4°C/Min. auf 95°C über 1 Min. 2. Daraufhin folgten 45 Amplifikationszyklen, bestehend aus drei Schritten: Erhitzung der Proben auf 95°C über 10 Sec. bei einer Temperaturerhöhungsrate von 4,4°C, gefolgt durch eine Kühlung der Proben um 2,2°C/Sec. auf 55°C über weitere 10 Sec. Zum Schluss erfolgte eine weitere Temperaturerhöhung um 4,4°C/Sec. auf 72 °C über 0,5 Sec. 3. Im letzten Schritt wurden die Proben auf 40°C für 30 Sec. gekühlt. 44 3.2.4. Auswertung: Fluoreszenz-basierte Quantifizierung in Echtzeit und Crossing-point basierte Evaluation der Fluoreszenz Die Detektion und zeitgleiche relative Quantifizierung des PCR-Produkts erfolgte mittels Fluoreszenzmessung. Die Intensität der Fluoreszenz korrelierte mit der Zunahme der Menge komplementärer DNA im Verlauf der PCRZyklen. Die Fluoreszenzmessung wurde durch den Einsatz von LNA- Sonden ermöglicht, welche spezifisch für jedes Virus ausgewählt wurden. Die 8-9 Nukleotid-langen Hybridisierungssonden sind am 5´ Ende mit dem ReporterFarbstoff Fluorescin (FAM) und am 3´Ende mit einem QuencherFluoreszensfarbstoff markiert. Wenn die LNA-Sonden die DNA in der Annealing Phase der PCR nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung zwischen den spezifischen Primern binden, wird der Reporter mit Licht einer spezifischen Wellenlänge angeregt. Die dadurch entstehenden Signale werden jedoch aufgrund der räumlichen Nähe zwischen Quencher und Reporter unterdrückt. Erst in der Elongationsphase erfolgt aufgrund der 5´-3´Exonuklease-Aktivität der eingesetzten TaqPolymerase eine Trennung von Reporter und Quencher. Dadurch wird das Fluoreszenssignal nicht mehr unterdrückt. Es ist umso stärker, je höher die DNA-Menge und die damit einhergehenden Bindungsstellen der LNA-Proben sind (Holzapfel und Wickert, 2007). Die Zunahme der Fluoreszenz wurde graphisch über die dazugehörige Software dargestellt, indem die PCR-Zyklenanzahl gegen die gemessene Fluoreszenz aufgetragen wird. Repräsentative Kurvenverläufe sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Kurvenverlauf lässt sich in drei Abschnitte gliedern: Die erste Phase wird als Hintergrundphase bezeichnet, in welcher eine Hintergrundfluoreszenz zu messen ist. Diese ist größer als die Fluoreszenz des PCR-Produktes. Nach einer bestimmten Anzahl an Zyklen nehmen das PCR-Produkt und folglich auch dessen Fluoreszenzsignal zu. Der Punkt, an dem das Fluoreszenzsignal des PCR-Produkts erstmals signifikant das des Hintergrunds übertrifft, wird als Crossing Point (CP) bezeichnet. Er initiiert die Log-Phase, welche sich durch exponentielles Wachstum des PCR-Produkts kennzeichnet. 45 Abbildung 1: Repräsentative Kurvenverläufe der real time PCR mit dem LightCycler (Roche). Auf der x-Achse werden die PCR-Zyklen gegen die Fluoreszenz der y-Achse aufgetragen. Die unterschiedlichen Farben der Kurven kennzeichnen die Negativkontrolle, die der Quantifizierung dienenden Standards und die zu untersuchenden Proben. Die Hintergrundaktivität wird durch den konstant verlaufenden Graphen repräsentiert. Die übrigen Graphen lassen sich in drei Abschnitte gliedern: Hintergrundphase, log- und Plateauphase. Am Crossing Point übersteigt die Fluoreszenz des PCR-Produktes die Hintergrundaktivität. Mit Abnahme der Reaktionseffizienz geht die log-Phase in eine PlateauPhase über. Je mehr Ausgangsmaterial der Ziel-DNA vorlag, desto weniger Zyklen bis zum Erreichen des CP wurden benötigt. Durch den Vergleich der benötigten PCR-Zyklen bis zum Erreichen des CP verschiedener Proben konnte die Ziel-DNA im Ausgangsmaterial realtiv quantifiziert werden. Die Fluoreszensmessung erfolgte durch den Einsatz von Fluorimeter-Kanälen. 46 Als positiv wurden Proben gewertet bei Signalen im Fluorimeter Kanal 483533nm nach <45 Zyklen (CP<45). Fraglich positiv waren Proben beim Auftreten von Signalen zwischen 40 und 45 PCR-Zyklen (CP 40-45) im Kanal F1. Hier erfolgte eine Überprüfung der Plausibilität bzw. eine Wiederholung der PCR. Als negativ bewertet wurden Proben bei fehlenden Signal bzw. bei Signalen nach >45 Zyklen im FAM Kanal, der bei einer emittierten Wellenlänge von 483-533 nm angeregt wird. Die auf ß-Globin-DNA untersuchten Proben wurden als positiv gewertet, wenn nach <45 PCR-Zyklen (CP<45) Signale im RED640 Fluorimeter Kanal, der bei einer Wellenlänge zwischen 498-640 nm angeregt wird, auftraten. Eine Reevaluation des Ergebnisses bzw. eine Wiederholung der PCR erfolgte bei Signalen zwischen 40 und 45 (CP 40-45) im Kanal F1. Ein ß-Globin-DNA negativer Befund ergab sich bei Signalen nach >45 PCR Zyklen (CP>45) im Red640 Kanal. In einem solchen Fall wurde die Probe erneut aufgearbeitet und die PCR wiederholt. Die positiven Proben wurden mittels mit gelaufener Standardproben in 10erVerdünnnungsschritten von 10 bis 1 Millionen DNA-Kopien des untersuchten Virus quantifiziert. Die Menge der quantifizierten Virus-DNA wurde angegeben in DNA-Kopien/ß-Globin-Kopie. Zusätzlich zur real time PCR wurde eine nested MCPyV-PCR und eine immunhistochemische Evaluation der Expression des large T-Antigens mit dem murinen Antikörper CM2B4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA) durchgeführt. . 47 3.3. Analyse der Proben mittels MCPyV-nested PCR Zur Bestätigung der Ergebnisse der real time PCR wurde eine MCPyVnested PCR durchgeführt. Dabei wurde MCPyV-DNA mit Hilfe spezifi-scher externer und interner Primer amplifiziert. Der qualitative Nach-weis des internen PCR-Produktes erfolgte mittels Agarose Gelelektrophorese und photo-dokumentierter visueller Auswertung. Parallel wurde eine ß-Globin-PCR zum Nachweis humaner DNA und zum Ausschluss PCR-hemmender Substanzen durchgeführt. Der internen Qualitätskontrolle dienten eine MCPyVPositivkontrolle, welche aus dem pMCV-L-Plasmid bestand, und eine Negativkontrolle aus zellulärer DNA. 3.3.1. Durchführung der nested PCR Nach DNA-Extraktion mit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Nr. 51306) und Bereitstellung der erforderlichen Anzahl an Reaktiongefäßen für das Patientenmaterial, wurden jeweils ein 50 µl Ansatz für eine externe PCR (MCPyV Pool I) und eine interne PCR (MCPyV Pool II) angefertigt. Der MCPyV Pool I für die externe PCR enthielt (Ausgangskonzentration in Klammern): 1. 5 µl Puffer, ohne MgCl2, 2. 1,5 µl MgCl2 (50 mM), 3. 1 µl dNTP-Mix (10 mM), Fermentas, Nr. RO 192, 4. 32 µl Ampuwa, Fresenius, Nr. 0605251/1, 5. 0,5 µl Platinum Taq-Polymerase (5 U/µl), Invitrogen, Nr. 10966-034 6. 2,5 µl des externen Vorwärtsprimers und 7. 2,5 µl des Rückwärtsprimers 48 Die Sequenz der Primer ist in folgender Tabelle aufgeführt. Tabelle 9: Vorwärts- und Rückwärtsprimer der externen PCR (Sharp et al., 2009). Primer Sequenz vorwärts 5´- GGCAACATCCCTCTGATGAAAGC -3´ rückwärts 5´- CCACCAGTCAAAACTTTCCCAAGTAGG -3´ Der MCPyV Pool II der internen PCR setzte sich zusammen aus (Ausgangskonzentration in Klammern): 1. 5 µl Puffer (ohne MgCl2), 2. 1,5 µl MgCl2 (50 mM), 3. 1 µl dNTP-Mix (10 mM) (Fermentas, Nr. RO 192), 4. 34 µl Ampuwa (Fresenius, Nr. 0605251/1), 5. 0,5 µl Platinum Taq-Polymerase (5 U/µl) (Invitrogen, Nr. 10966-034) 6. 2,5 µl des internen Vorwärtsprimers und 7. 2,5 µl des Rückwärtsprimers Im Folgenden die Primersequenzen: Tabelle 10: Vor- und Rückwärtsprimer der internen PCR (Sharp et al., 2009) Primer Sequenz vorwärts 5´- CTTAAAGCATCACCCTGATAAAGG -3´ rückwärts 5´ - AAACCAAAGAATAAAGCACTGATAGCA-3´ In den 45 µl externen PCR-Ansatz (Pool I) wurden jeweils 5 µl der extrahierten DNA hinzugefügt und die 50 µl Ansätze im PCR Thermocycler (T3 Biometra) nach dem Programm „MCPyV“ amplifiziert. 49 Der erste Schritt der PCR beinhaltete eine Erhitzung der Probe auf 95°C für 5 Min. Daraufhin folgten 31 Zyklen, die jeweils aus drei Schritten bestanden: 1. Erhitzung auf 95°C für 45 Sec. zur Denaturierung der DNA-Stränge, 2. Abkühlung auf 55°C für 45 Sec. zur Primer Hybridisierung, 3. erneute Erhitzung auf 72°C für 1 Min. zur Elongation. Zum Schluss verblieben die Proben für 15 Min. bei einer Temperatur von 72°C. In einem letzten Schritt erfolgte die Abkühlung auf 4°C. Aus Pool I wurden anschließend 3 µl des PCR-Produktes zu den 47 µl des Pools II pipettiert. Mit diesen 50 µl-Ansätzen wurde eine PCR im Thermocycler nach demselben Programm durchgeführt Nach der Amplifikation erfolgte die Analyse von je 10 µl des internen PCRProduktes aus Pool II mittels Agarosegelelektrophorese. Die Bestandteile der Gelelektrophorese waren: 1. der Elektrophorese-Laufpuffer (auf pH 8,0 einstellen), aus 242g Trisbase (Merck, Nr.1.08382.2500), 57,1 ml Eisessig (Merck, Nr.100063.2511) und 37,2g EDTA (Gibco, Nr. 15575-012 ), 2. der als Längenmarker dienende 100 bp-DNA-Leiter (Fermentas, Nr. SM0241), 3. die DNA-Typing Grade Agarose (Gibco, Nr.14610-018). Das Gel wurde für 10 Min. in Ethidiumbromidlösung (Sigma, Nr: E-1510) eingelegt und anschließend mittels 50 Gelphotographie analysiert. 3.3.2. Auswertung der nested PCR Die Analyse der entstandenen Banden erfolgte mittels Kontrolllaufbande. Die 358 bp-Bande fungierte als Positivkontrolle. Im Falle einer MCPyV-positiven Patientenprobe wurde eine klare Bande auf Höhe der Positiv-Kontrolle bei 358 bp sichtbar. Eine MCPy-negative Probe ergab keine Bande auf dieser Höhe im Gel. 3.4. Immunhistochemischer Nachweis der large T-Antigen-Expression in MCPyV- positiven Hautproben Die Durchführung der Immunhistochemie zum Nachweis des large TAntigens in MCPyV-positiven Hautproben erfolgte in der Dermatopathologie der Abteilung für Dermatologie der Ruhr Universität Bochum unter Anleitung der dort arbeitenden medizinisch-technischen Assistenten. Um das large T-Antigen in den MCPyV-positiven Hautproben nachzuweisen, wurde der monoklonale Maus-Antikörper CM2B4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA) verwendet. Dieser richtet sich hochspezifisch gegen das Epitop, das durch die Sequenz des Exon 2 des large T- Antigens-Gens und dessen Isoformen kodiert wird (Shuda et al., 2009). Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben mit dem Dako REAL TM Detection System, Alkaline Phosphatase/RED, Rabbit/Mouse. Der Einsatz des primären Antikörpers CM2B4 erfolgte nach Protokoll des Herstellers Santa Cruz Biotechnology. Zunächst wurden die in Paraffin-eingebetteten Gewebsproben mit dem Mikrotom in 4µm dicke Schichten geschnitten und auf silanisierte Objektträger fixiert. Es folgte eine Lagerung in der Feuchtkammer bei 60°C für 30 Min. Die Entparaffinierung erfolgte mittels Xylen über 2x10 Min. Daraufhin wurden die Proben mit 100%, 96%-, 70%-, und 50 %-igen Alkohol über jeweils 5 Min. gewaschen und anschließend mit destilliertem Wasser rehydriert. Eine hitzeinduzierte Epitopendemaskierung erfolgte durch Waschung mit Target Retrieval Lösung (Dako, Hamburg, Deutschland) und einem darauf folgenden Wasserbad bei 96°C für 20 Min. und einem pH=6. Danach wurden die Proben für 30 Min. mit 3%igen Wasserstoffperoxid bedeckt und anschließend 15 Min. lang mit Peroxidase (DAKO) inkubiert. 51 Im nächsten Schritt wurden die Proben mit 200 µg des bei Antikörpers CM2B4 in einer Verdünnung von 1:100 über Nacht bei 37°C inkubiert. Um gebundene primäre Antikörper zu detektieren, wurde ein indirektes Streptavidin-Biotin-Verfahren angewendet, welches sich die hohe Affinität von Biotin zum Streptavidin zunutze macht. Hierzu wurden die Proben für weitere 15 Min. mit dem 7-fach biotinyilierten sekundären Ziege-Anti-MausImmunglobulin AB2 (Dako REAL) nach Herstellerangaben inkubiert. Aus den mehrfach mit Biotin markierten Antikörper resultiert eine erhöhte Sensitivität, Phosphtase Moleküle da (Dako dadurch REAL) mehrere an einem Streptavidin-Alkaline AB2 Immunglobulin binden können. Nach zehn Spülungen mit Wasch-Puffer (DAKO) für je 2 Min. wurden die Proben für weitere 15 Min. mit Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Dako REAL) inkubiert. Als Substratsystem der konjugierten alkalischen Phosphatase dienten die Chromogene RED 1, 2 und 3 (Dako REAL), jeweils zu 30 µl angesetzt in 750 µl AP Substrate Buffer (Dako REAL). Durch Hydrolyse der Farbstoffe durch die Phosphatase entsteht am Ort, an dem ein primärer Antikörper gebunden hat, eine intensive Rotfärbung. Eine Gegenfärbung erfolgte mit Hämatoxylin (Dako REAL), wodurch die Zellkerne blau dargestellt wurden. Zur internen Qualitätskontrolle wurde bei jedem Färbedurchlauf eine als positiv bekannte Kontrollprobe und eine Negativkontrolle, die durch Weglassen des Primärantikörpers entstand, mitgeführt. Eine mikroskopische Begutachtung erfolgte nach Fixierung der Deckgläser mit Hilfe von Mowiol (Roche). Die Ergebnisse der in dieser Studie angewandten Methoden sind im Archives of Dermatology veröffentlicht worden (Kreuter et al., 2011). Die Auswahl der für die Studie geeigneten Hautproben und deren Zuordnung gemäß WHO-EORTC-Klassifikation erfolgten durch die Autorin der vorliegenden Dissertation. Hierzu wurden die Daten von Patienten, die zwischen Januar 1999 und Dezember 2010 mit dem Verdacht auf das Vorliegen eines kutanen Lymphoms in der Abteilung für Dermatologie der Ruhr Universität Bochum vorstellig waren, analysiert. Einschlusskriterium war die durch die Pathologie gesicherte Diagnose eines primär kutanen Lymphoms. Es erfolgte eine Zuordnung der Proben gemäß der aktuellen WHO-EORTC Klassifikati52 on für kutane Lymphome (Willemze R., et al., 2005). Die Bereitstellung der in Paraffin-eingebetteten Hautproben durch die Autorin aus dem Archiv der Abteilung für Dermatologie der Ruhr Universität Bochum erfolgte für die anschließende Durchführung der PCR im Institut für Virologie der Universität Köln. 53 4. Ergebnisse 4.1. Auswertung der real time PCR Die Analyse der 130 archivierten PCBL und PCTL erfolgte mittels real time PCR unter dem Einsatz Virus-spezifischer Primer zum qualitativen und quantitativen DNA-Nachweis der Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV. Die Angabe der Viruslast erfolgte als virale DNA pro ß-Globin. Virus-DNAnegative Proben konnten dementsprechend nicht ausgewertet werden (Abkürzung: n.v.). Die Ergebnisse der einzelnen PCRs sind in den Tabellen 1113 dargestellt. Ein PyV-Nachweis erfolgte in 37 der 130 untersuchten Proben (28,5%). Davon waren 25,4% PCTL und 3,1 % der PCBL positiv. Männer und Frauen waren in einem Verhältnis von 2:1 betroffen. Das MCPyV konnte in insgesamt 30 Proben (23.1%) nachgewiesen werden.14 der 71 (19,7%) Proben der MF und ihrer Subtypen waren MCPyVDNA positiv (13% der klassischen MF, 75% der fMF, keine der PR). In 4 der 13 (31%) SS-Proben erfolgte ebenfalls ein MCPyV-DNA-Nachweis. Bei den CD30+ kutanen lymphoproliferativen Erkrankungen und bei den seltenen kutanen T-Zell-Lymphome waren jeweils 25% positiv. Die PCBL waren in 4 von 14 Fälle (28,6%) positiv, wobei es sich hier ausschließlich um KZL handelte. Die virale DNA pro ß-Globin-Last war in den meisten Fällen <1. Sie variierte zwischen 0,000- 12,467. Der mittlere Wert der DNA Ladung pro ßGlobin lag bei 0,009 (Tab.11). Das hPyV6-DNA konnte in 6 der 130 Proben nachgewiesen werden (4,6%), wobei 3 der 71 (4,2%) untersuchten MF und MF-Varianten positiv waren: 2 der 61 (3%) untersuchten klassischen MF und eine der 8 (13%) untersuchten fMF. Zudem waren 3 der seltenen kutanen T-Zell-Lymphome positiv (25%). Die DNA-Ladung pro ß-Globin war ebenfalls niedrig und lag bei einem Mittelwert von 0,034 zwischen 0,000-0,145 (Tab.12). Nur in einem der 130 Fälle konnte das hPyV7 nachgewiesen werden (0,77%). Hierbei handelte es sich um eine fMF. Die DNA-Ladung war aufgrund einer zu geringen Menge 54 nicht messbar. (Tab.13) TSPyV-DNA konnte in keiner der untersuchten Proben nachgewiesen werden (Tab.13). 55 Tabelle 11: Ergebnis der MCPyV-PCR. Absoluter und prozentualer Nachweis von MCPyV-DNA in verschiedenen Tumor-Typen. Die durchschnittliche MCPyV-DNALast ist definiert als virale DNA-Kopie pro ß-Globin-Gen-Kopie. Die Angabe einer Virus-Last ist nicht verfügbar (n.v.), wenn kein DNA-Nachweis in der PCR erfolgt ist. Tumor-Gruppe Tumor-Typ Proben(n) MCPyV+ Mittlere n (%) MCPyV-DNA Last (Bereich) Klassische MF MF 61 8 (13) und 0,129 (0,000-4,118) MF-Subtypen fMF 8 6 (75) 0,626 (0,002-12,467) Sézary Syndrom PR 2 0 n.v. SS 13 4 (31) 0,096 (0,078- 0,571) CD30+ kutane PKAGL 17 5 (29) lymphoproliferative 0,004 (0,000- 0,011) Erkrankungen Seltene PCTL Kutane B-Zell- LP 3 0 n.v. KMGPTCL 8 1 (13) 0,000 PKPTZL, u 2 1 (50) 0,000 PKZTZL 1 1 (100) 0,001 SPTZL 1 0 n.v. KZT 9 4 (44) 0,000 Tumore Summe (0,000-0,001) PKDGBZL-l 3 0 n.v. PKDGBZL-a 2 0 n.v. 130 30 (23,1) 0,009 (0,000-12,467) Abkürzungen: MF: Mykosis fungoides; fMF: Follikuläre MF, PR: Pagetoide Retikulose; SS: Sézary Syndrom; PCAGL: Primär kutanes anaplastisch großzelliges Lymphom; LP: Lymphomatoide Retikulose; KMGP-TCL: Kleinbis mittelzellgroßes pleomorphes TCL; PCP-TCL,u.: Primär kutanes peripheres TCL, unspezifisch; PCZ-TCL: Primär kutanes zytotoxisches TCL; SP-TCL: Subkutanes pannikulitis-ähnliches TCL; KZT: Keimzentrumslymphom; PCDGBCL-l: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, leg type; PCDGBCL-a:: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, andere Typen 56 Tabelle 12: Ergebnis der hPyV6-PCR. Die Tabelle zeigt an, in wie vielen Proben bezogen auf einen Tumor-Typ hPyV6-DNA absolut und prozentual nachweisbar war. Die durchschnittliche hPyV6-DNA-Last ist definiert als virale DNA-Kopie pro ßGlobin-Gen-Kopie. Die Angabe einer Virus-Last ist nicht verfügbar (n.v.), wenn kein DNA-Nachweis in der PCR erfolgt ist. Tumor-Gruppe Tumor-Typ Proben(n) hPyV6+ Mittlere hPyV6- n (%) DNA Last (Bereich) Klassische MF MF 61 2 (3) und MF-Subtypen 0,33 (0,000-0,067) fMF 8 1 (13) 0.000 PR 2 0 n.v. Sézary Syndrom SS 13 0 n.v CD30+ kutane PCAGL 17 0 n.v. LP 3 0 n.v. KMGPTCL 8 3 (38) 0,103 lymphoproliferative Erkrankungen PCTL (0,000-0,0145) PCBL Summe PKPTZL, u 2 0 n.v. PKZTZL 1 0 n.v. SPTZL 1 0 n.v. KZT 9 0 n.v. PKDGBCL-l 3 0 n.v. PKDG-BCL-a 2 0 n.v. 130 6 (4,6) 0,034 (0,000-0,145) Abkürzungen: MF: Mykosis fungoides; fMF: Follikuläre MF, PR: Pagetoide Retikulose; SS: Sézary Syndrom; PCAGL: Primär kutanes anaplastisch großzelliges Lymphom; LP: Lymphomatoide Retikulose; KMGP-TCL: Kleinbis mittelzellgroßes pleomorphes TCL; PCP-TCL,u.: Primär kutanes peripheres TCL, unspezifisch; PCZ-TCL: Primär kutanes zytotoxisches TCL; SP-TCL: Subkutanes pannikulitis-ähnliches TCL; KZT: Keimzentrumslymphom; PCDGBCL-l: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, leg type; PCDGBCL-a:: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, andere Typen 57 Tabelle 13: Ergebnis der hPyV7- und TSPyV-PCR. Absoluter und prozentualer Nachweis der jeweiligen DNA in verschiedenen Tumot-Typen. Die durchschnittliche DNA-Last ist definiert als virale DNA-Kopie pro ß-Globin-Gen-Kopie. Die Angabe einer Virus-Last ist nicht verfügbar (n.v.), wenn kein DNA-Nachweis in der PCR erfolgt ist. Tumor-Gruppe Tumor-Typ Proben(n) hPyV7+ n (%) Mittlere hPyV7 DNA Last (Bereich) n.v. TSPyV Anzahl MF 61 0 fMF 8 1(13) 0,000 0 PR 2 0 n.v. 0 Sézary Syndrom SS 13 0 n.v. 0 CD30+ kutane PKAGL 17 0 n.v 0 LP 3 0 n.v. 0 KMGP-TCL 8 0 n.v. 0 PCP-TCL, u 2 0 n.v. 0 PCZ-TCL 1 0 n.v. 0 SP-TCL 1 0 n.v. 0 KZT 9 0 n.v. 0 PCDGBCL-l 3 0 n.v. 0 PKDGBCL-a 2 0 n.v. 0 130 1 (0,8) 0,000 0 Klassische MF 0 und MF-Subtypen lymphoproliferative Erkrankungen Seltene PCTL PCBL Summe Abkürzungen: MF: Mykosis fungoides; fMF: Follikuläre MF, PR: Pagetoide Retikulose; SS: Sézary Syndrom; PCAGL: Primär kutanes anaplastisch großzelliges Lymphom; LP: Lymphomatoide Retikulose; KMGP-TCL: Kleinbis mittelzellgroßes pleomorphes TCL; PCP-TCL,u.: Primär kutanes peripheres TCL, unspezifisch; PCZ-TCL: Primär kutanes zytotoxisches TCL; SP-TCL: Subkutanes pannikulitis-ähnliches TCL; KZT: Keimzentrumslymphom; PCDGBCL-l: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, leg type; PCDGBCL-a:: Primär kutanes diffus großzelliges BCL, andere Typen 58 4.2. Ergebnisse der MCPyV-nested PCR Die Auswertung der nested PCR erfolgte durch den qualitativen Nachweis des internen Produktes mittels Agarose Gelelektrophorese und photodokumentierter visueller Auswertung. In Abbildung 3 ist eine Positivprobe auf Höhe der 358 bp-Bande dargestellt, und eine Negativprobe, die nicht auf dieser Höhe liegt. Als Längenmarker diente der 100 bp-Leiter. In der durchgeführten Studie zeigten 13 der 130 Proben (10%) in der MCPyV-nested PCR eine Bande auf Höhe der 358 bp-Bande. Diese 13 Proben waren auch in der real time PCR positiv. Positiv waren 4 der 61 Proben MF, 6 der 8 fMF und jeweils eine Probe der 13 SS, der 8 KMGP-TCL und der 9 KZL. Demnach konnten 17 der in real time PCR positiven Proben nicht bestätigt werden. Abbildung 2: Laufbanden a)-t) von links nach rechts einer repräsentativen MCPyV-nested PCR. a) Postivprobe auf Höhe der 358 Bande. b) Negativprobe. c) 100bp-Leiter. e),l),s) positive, sich auch Höhe der Positivkontrolle befindende Proben. Die übrigen Proben sind negativ. 59 4.3. Expression des large T-Antigens in MCPyV-positiven Proben Dem Nachweis des LTA in den 30 MCPyV positiven Proben diente der murine monoklonale Antikörper CM2B4. Zellen, in denen das LTA exprimiert wurde, waren durch eine intensive Rotfärbung in der mikroskopischen Begutachtung entsprechend der Positivprobe gekennzeichnet (Abb.4a). In unserer Studie exprimierte jedoch keine der 30 positiven MCPyV-Proben das large T-Antigen, was durch eine fehlende Rotfärbung gekennzeichnet war (Abb.4b). a) b) b) Abbildung 3: Immunhistochemische Darstellung repräsentativer large TAntigen positiver und negativer Hautproben nach Einsatz des Antikörpers CM2B4. a) Hier wird die intensive Rotfärbung von Zellen, die das large TAntigen innerhalb eines Merkelzellkarzinoms exprimieren deutlich. Eine solche positive Hautprobe diente in der Durchführung der Immunhistochemie als Kontrollprobe (Hämatoxylin, 200fache Vergrößerung). b) Keine Rotfärbung der MCPyV-DNA positiven Probe sichtbar. Auch in dieser Studie exprimierte keine der 30 MCPyV-positiven Proben das large T-Antigen (Hämatoxylin, 200fache Vergrößerung) (Kreuter et al., 2011). 60 5. Diskussion 5.1. Rolle der Polyomaviren in der Pathogenese kutaner Lymphome und anderer Hauttumoren Mit der vorliegenden Studie sollte die Rolle der Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV in der Pathogenese der PCBL und PCTL analysiert werden. Hierzu wurden Proben aus Tumorläsionen eines Patientenkollektivs auf das Vorliegen von DNA der entsprechenden Polyomaviren analysiert. Der qualitative und quantitative DNA-Nachweis erfolgte mittels real-time PCR unter Verwendung Virus-spezifischer Primer. Zur Erhöhung der Sensitivität und Spezifität erfolgte zudem eine nested MCPyV-PCR. Ein immunhistochemischer Nachweis der LTA-Expression wurde unter dem Einsatz des monoklonalen Maus-Antikörpers CM2B4 durchgeführt (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA). Entsprechend der Ergebnisse dieser Studie ist ein Zusammenhang zwischen einer Infektion mit den untersuchten Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV nicht wahrscheinlich. In 28,5% der 130 untersuchten Fälle konnte PyV-DNA nachgewiesen werden, darunter in 25,4% der PCTL und 3,1 % der PCBL. In der durchgeführten nested PCR konnten nur 13 der 30 in der real time PCR MCPyV-positiven Proben bestätigt werden, sodass hier ein MCPyV-Nachweis in 10% der 130 Proben erfolgte. Der immunhistochemische Nachweis des LTA war in allen 30 MCPyV positiven Proben negativ. Die DNA-Last, angegeben als Anzahl an DNA-Kopien pro ß-Globin-GenKopie, war in der Mehrzahl der Fälle <1, und demnach gering. Hervorzuheben ist, dass 75% der fMF positiv waren, was darauf zurückzuführen ist, dass insbesondere in den Haarfollikeln Merkelzellen konzentriert sind und demnach empfänglich für die Infektion sind (Narisawa et al., 1997). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stimmen mit denen anderer Studien überein: Andres et al. analysierte 23 Hautproben verschiedener kutaner Lymphome, darunter 17 PCTL und 5 PCBL, auf das Vorkommen von MCPyV-DNA. Zusätzlich wurden lymphozytenreiche Gewebe untersucht: 13 Gewebsproben von 12 Patienten mit kutanen Pseudolymphomen und 25 Gewebsproben verschiedener entzündlicher Hautläsionen. 61 Nur 17,4% der kutanen Lymphome, sowie 15,4% der Pseudolymphome und 8% der entzündlichen Hautläsionen waren MCPyV-positiv. Folglich konnte keine signifikante Assoziation zwischen einer MCPyV-Infektion und den untersuchten Erkrankungen, wie den kutanen Lymphomen, festgestellt werden (Andres et al., 2010). Auch Shuda et al. fanden keinen Zusammenhang zwischen einer MCPyV-Infektion und verschiedener hämatolymphoider Erkrankungen. Sie analysierten 325 Proben hämatoonkologischer Erkrankungen mittels qPCR auf MCPyV-DNA. Mitunter wurden 11 MF-Proben untersucht. Insgesamt waren 7,2% positiv, wobei die MF-Proben alle negativ waren (Shuda et.al., 2009). Auch die Ergebnisse von Mirvish et al. sprachen gegen eine Assoziation: in keiner der vier MF Läsionen, die sie mit dem Antikörper CM2B4 auf das Vorliegen einer LTA-Expression untersucht haben, konnte LTA nachgewiesen werden (Mirvish et al., 2011). Zu beachten ist, dass das MCPyV eine ohnehin hohe Prävalenz in der Bevölkerung aufweist. Während Foulogne et al. in Übereinstimmung mit vorherigen Studien in 78% der MCC MCPyV-DNA detektierte, waren Läsionen anderer Hauterkrankungen in 28% und gesunde Haut in 17% der Fälle MCPyVpositiv. Die Seroprävalenz in der erwachsenen Bevölkerung wird zwischen 60% und 80% angegeben. Dennoch fungiert das MCPyV nur selten als Pathogen. Wenn doch, dann lassen sich in solchen Fällen höhere DNALadungen nachweisen (Foulogne et al., 2010, Carter et al., 2009, Duncavage et al. 2009.). Diese Befunde sind ebenfalls im Einklang mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie: nicht nur die Anzahl positiver Proben entspricht mit 28,5 % etwa der anderer Hauterkrankungen, sondern auch die niedrigen DNA-Lasten sprechen gegen eine kausale Rolle des MCPyV in der Pathogenese der CL. Über einen möglichen Zusammenhang zwischen einer hPyV6- und hPyV7Infektion und der Entstehung von Hauttumoren wird spekuliert, da diese Viren ähnlich dem MCPyV einen natürlichen Bestandteil der Hautflora darstellen. Auch Schrama et al. untersuchten das Vorkommen von hPyV6 und hPyV7 in verschiedenen Hauttumoren, darunter 12 PCTL und 17 PCBL. 62 Die Ergebnisse dieser Studie bestätigten den aus der vorliegenden Studie hervorgehenden fehlenden Zusammenhang zwischen einer Infektion mit humanen Polyomaviren und der Pathogenese CL (Schrama et al. 2012). Duncavage und Pfeifer vermuteten eine Beteiligung von hPyV6 und hPyV7 an der Pathogenese MCPyV negativer MCC. In einer Studie, in der sie 28 MCPyV-negative MCC-Proben untersuchten, bestätigte sich diese Hypothese nicht. Auch Untersuchungen an Basalzellkarzinomen, aktinischen Keratosen, Plattenepithel-Karzinomen, Keratokanthome, mikrozystisches Adnexkarzinom und atypischen Fibroxanthomen gaben keinen Hinweis auf eine Assoziation mit einer HPyV6- oder hPyV7-Infektion. Ein Zusammenhang mit einer TSPyV- Infektion und den o.g. Hauterkrankungen ist nach den Ergebnissen derselben Studie ebenfalls unwahrscheinlich (Scola et al., 2012). Bisher scheint TSPyV nur an der Pathogenese der Trichodyplasia spinulosa beteiligt zu sein. Veröffentlichungen, die das Vorkommen des TSPyV in PCBL und PCTL untersucht haben, gibt es nach besten Wissen der Autorin nicht (van der Meijden et al., 2010, Matthews et al., 2011, Elaba Z et al., 2012). Auch SV40 stand bereits im Verdacht eine Rolle in der Pathogenese kutaner Lymphome zu spielen. Folglich untersuchten Yazdi et al. 2003 Proben verschiedener kutaner Lymphome, darunter 12 PCBL und 15 PCTL, mittels PCR. Mit Ausnahme eines Pseudolymphoms waren alle Proben negativ (Yazdi et al., 2003). In Anbetracht der bisherigen Studienlage gibt es also keinen Hinweis auf eine Assoziation zwischen einer PyV-Infektion und der Entstehung eines PCBL und PCTL. Ob die bisher nicht untersuchten PyV, wie BKV und JVC oder das neu entdeckte MWPy, an der Pathogenese beteiligt sind, muss in weiteren Studien evaluiert werden. 5.2. Polyomavirus-assoziierte Krebserkrankungen Seitdem das MCPyV in 80% der durch Feng et al. 2008 untersuchten MCC detektiert wurde, stellt sich die Frage, welche Rolle PyV in der Pathogenese von Krebs beim Menschen spielen. Demnach ist das Interesse an der Erforschung weiterer PyV-assoziierter Tumoren gestiegen. 63 U.a. analysierten Bluemn et al. die Rolle des MCPyV in der Entstehung des Prostata-Karzinoms und konnten keinen Zusammenhang aufdecken (Bluemn et al., 2009). Auch der Nachweis von 4,7% MCPyV-positiven kleinzelligen Bronchialkarzinomen war nicht signifikant (Gheit et al., 2012). Eine durch Campello et al. durchgeführte Fall-Kontroll-Studie zur Detektion von MCPyVDNA in Kolon-Karzinomen ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Fällen mit 6,3% und den Kontrollen mit 8,8% (Campello et al. 2011). Aus der vorliegenden Studie geht die fehlende Assoziation zwischen der Entstehung kutaner Lymphome und einer Infektion mit den hPyV MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV hervor. Auch die Rolle des JCV als onkogenes Virus ist kontrovers. Im Tierversuch und in Zellkultur hat sich das onkogene Potential bereits bestätigt. Zudem weist JCV Onkogene wie das T-Antigen auf. Eine Assoziation besteht zwischen JCV und Bronchialkarzinomen, unterschiedlichen Tumoren des ZNS, und des Gastrointestinaltrakts. Studien, die diese Zusammenhänge untersucht haben, erbrachten bisher keine eindeutigen Ergebnisse, was teilweise auf die ohnehin hohe Durchseuchungsrate mit JCV in der Bevölkerung zurückzuführen ist. U.a. detektierten Enam et al. in 22 von 27 Tumorproben aus dem GI JCV-Sequenzen, während bei Ricciardiello et al. auch 75.8% der untersuchten gesunden Gewebe JCV-positiv waren (Enam et al. 2002, Ricciardiello et al. 2000). Demnach bleibt das MCC das bisher einzige PyV-assoziierte Karzinom. Die Frage nach der Bedeutung der PyV in der Pathogenese weiterer Tumoren ist zu diesem Zeitpunkt nicht zu beantworten. Einerseits wurden viele Krebserkrankungen noch nicht auf eine Assoziation hin untersucht, andererseits nimmt das Wissen über und die Anzahl an humanen PyV seit 2008 rapide zu. Die Integration dieser neuen Erkenntnisse in zukünftige Studien zu PyVassoziierten Tumoren ist notwendig. 5.3. MCPyV als Ursache des Merkelzellkarzinoms Seit der Entdeckung des ersten PyV durch Gross ist das onkogene Potential dieser Viren aufgrund der Befunde aus Tierversuchen und der Zellkultur bekannt (Gross, L.1953). 64 Erst die Entdeckung des MCPyV-assoziierten MCC forcierte die Annahme, dass Polyomaviren auch beim Menschen Krebs verursachen können. Doch bestätigt diese Assoziation tatsächlich einen kausalen Zusammenhang zwischen der Infektion und der Entstehung des MCC? Eine Kausalität wäre wahrscheinlich, wenn unterschiedliche Befunde in gesunden Hautproben und MCC-Läsionen vorlägen: In der Studie von Feng et al. waren 80% der MCC MCPyV-positiv. Im Gegensatz dazu waren 8% (5 von 59) in der 1.Kontrollgruppe, in der 59 Proben unterschiedlicher Gewebe untersucht wurden positiv und 16% (4 von 25) in der 2.Kontrollgruppe. Hier wurden Hautproben von nicht an MCC erkrankten Immunkompetenten und Immunsupprimierten untersucht (Feng et al., 2008). Dieser Befund konnte durch weitere Studien bestätigt werden (Kassem et al., 2008, Becker et al., 2008). Hier stellt sich allerdings die Frage nach der Pathogenese der 20% MCPyV-negativen MCC. Eine im Gegensatz zum MCPyV-positiven MCC verminderte RB1-Expression weist auf eine unterschiedliche Tumorgenese hin (Harms et al., 2012). Zudem sind MCPyV-positive MCC im Gegensatz zu MCPyV-negativen bevorzugt an Sonnen-exponierten Hautstellen lokalisiert. Trotz vermutlich unterschiedlicher Ätiologie scheinen der klinische Verlauf und die Prognose ähnlich zu sein (Schrama et al. 2011). Hinzuzufügen ist, dass aktuelle Studien unter der kombinierten Verwendung der monoklonalen Antikörper CM2B4 und CM5E, welcher sich gegen das sTA richtet, einen Antigennachweis in 92% der Fälle erzielten, im Gegensatz zu 75% unter alleinigen Einsatz von CM2B4 (Shuda et al. 2011). Unter dem Gebrauch des monoklonalen Antikörpers Ab3 erfolgte sogar in 97% der Fälle ein Antigennachweis, sodass die Anzahl MCPyV-negativer MCC auch auf eine verminderte Sensitivität der Vorläuferstudien zurückzuführen sein könnte (Rodig et al., 2012). Dass bei Feng et al. auch nicht-MCC im geringeren Ausmaß MCPyV-positiv waren, könnte darauf hinweisen, dass eine MCPyV-Infektion zwar einen Risikofaktor darstellt, allerdings noch weitere Faktoren, wie z.B. durch UVStrahlung verursachte Mutationen, zur Entartung notwendig sind, was durch den Fakt, dass MCC bevorzugt an UV-exponierten Hautstellen entstehen, bestärkt wird (Shuda et al., 2008). 65 Einen weiteren Hinweis auf eine Kausalität zwischen Infektion und Tumorgenese stellen die für das MCPyV-positive MCC charakteristischen Mutationen am 3´ Ende des T-Antigens dar. Im LTA führen diese Mutationen zu einem verkürzten Protein, wodurch es zu einem Verlust der Helikase-Aktivität kommt. Dadurch wird die Replikation des Virus verhindert, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Aktivierung des Immunsystems reduziert und die Viruspersistenz begünstigt wird. Somit fungiert das LTA als sog. Onkogen. Die Tatsache, dass das LTA für das Wachstum MCPyV-positiver MCC notwendig ist, zeigten Houben et al. indem sie die Expression in MCPyV-positiven MCC ausschalteten und somit den Zelltod induzierten bzw. das Wachstum inhibierten (Houben et al., 2010). Zudem weist die monoklonale Integration der MCPyV-DNA im Genom der Wirtzelle darauf hin, dass das MCPyV-Genom bereits zu Beginn der Karzinogenese im Genom der Wirtszelle integriert wurde, und nicht erst in der Phase der Tumorexpansion (Feng et al., 2008). Demnach scheint eine Kausalität zwischen einer MCPyV-Infektion und der Entstehung des MCC wahrscheinlich. Diese Erkenntnis bringt neue Einblicke in viral-induzierte Mechanismen der Krebsentstehung, was die Grundlage für die Erforschung weiterer durch Viren verursachte Krebserkrankungen bildet. Sie ist Voraussetzung für die Entwicklung von Methoden zur Vorsorge, Früherkennung, Therapie und Nachsorge von Krebserkrankungen im Allgemeinen, und des MCC im Speziellen. 5.4. Rolle einer Infektion in der Entstehung kutaner Lymphome Die Ätiologie des PCBL und PCTL ist unbekannt. Die Frage nach einem infektiösen Agens als Ursache für die Entstehung kutaner Lymphome war bereits Gegenstand einiger Studien. Weder Retroviren, noch Herpesviren wie CMV und EBV, scheinen eine Rolle in der Pathogenese zu spielen (Courgnaud et al., 2009, Ballanger et al., 2009, Novelli et al., 2009). Auch die Ergebnisse der vorliegende Studie sprechen gegen Assoziation zwischen den PCBL und PCTL und einer Infektion mit den Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV. Festgestellt wurde, dass eine erhöhte Besiedlung durch S.aureus in fortgeschrittenen Stadien des PCTL vorliegt. Dennoch scheint diese eher zur 66 Exazerbation der Erkrankung beizutragen und nicht zu ihrer Entstehung (Jackow et al.1997, Talpur et al. 2008). Auch B.burgdorferi scheint in Endemiegebieten die Progression CL zu fördern. Über Fälle, in denen unter antibiotischer Therapie mit Ceftriaxon i.v. oder Amoxicillin oral eine Regression des CL eintrat, wurde bereits berichtet. In nicht-Endemiegebieten besteht keine Assoziation (Ponzoni et al., 2011). Keine Studie konnte bisher eine Kausalität zwischen der Entstehung PCTL und PCBL und einer Infektion bestätigen. Ist eine infektiös-bedingte Pathogenese dennoch wahrscheinlich? Welche Rolle spielen nicht-infektiöse Ursachen in der Entstehung? Hinweisend auf eine Infektions-assoziierte Entstehung sind epidemiologische Beobachtungen: Betroffene sind vorwiegend >50 Jahre alt und eine Immunsuppression scheint einen Risikofaktor darzustellen. Nach Organtransplantation entstehen Lymphome meistens innerhalb von 6 Jahren (Hoppe et al.,1990). Über die Entstehung einer MF unter Therapie mit dem Immunmodulator Infliximab, einem TNF-alpha-Blocker, wurde berichtet (Sanli et al., 2007). Zudem werden besonders schwere Verläufe bei HIV-infizierten beobachtet (Saggini et al., 2012). Einen weiteren Hinweis auf eine Infektions-assoziierte Entstehung der CL geben die Ergebnisse von Rabenhorst et al.: Sie berichteten über eine erhöhte Anzahl an Mastzellen in der Umgebung PCTL und PCBL. Das Ausmaß der Infiltration mit Mastzellen korrelierte positiv mit der Krankheitsprogression, wohingegen transgene Mäuse mit Mastzelldefizienz ein verlangsamtes Tumorwachstum aufwiesen. Aufgrund der Tatsache, dass Mastzellen als Komponente des Immunsystems im Rahmen einer allergischen Reaktion auch durch Pathogene aktiviert werden, wird die Hypothese einer infektiösgetriggerten Erkrankung unterstützt (Rabenhorst et al., 2012). Criscione et al. untersuchten 2007 mit Hilfe des „cancer registries of the Surveillance, Epidemiology, and End Results“ (SEER) Daten von an PCTL Erkrankten in den USA. Der Erkrankungszeitraum lag zwischen 1973 und 2002. Bezüglich der Inzidenz fanden sie sowohl geschlechtliche, als auch ethnische, geographische und sozioökonomische Unterschiede. Nach den Ergebnissen der Studie sind Männer häufiger als Frauen betroffen. Zudem 67 erkrankt die afro-amerikanische Bevölkerung häufiger als die nicht afroamerikanische. Wilson et al. bestätigten das Vorliegen ethnischer Unterschiede. Nach ihnen kennzeichnete sich die nicht-weiße Bevölkerung durch ein früheres Erkrankungsalter und ein höheres T-Stadium bei Erstdiagnose. (Wilson et al., 2012). Die geographischen Unterschiede in der Inzidenz korrelierten positiv mit dem Familieneinkommen, der Bildung und der Ärztedichte im jeweiligen Gebiet. Dementsprechend könnten die geographischen Unterschiede darauf zurückzuführen sein, dass der Zugang zum Gesundheitssystem in den verschieden Regionen variiert (Criscione et al. 2007). Auch ortsspezifische chemische, physikalische oder infektiöse Faktoren könnten diese Unterschiede verursachen. Dass auch Umweltfaktoren mit der Entstehung PCTL und PCBL assoziiert sind, lässt sich anhand der Anamnese Betroffenen erkennen. Nach Fischmann et al. lässt sich häufig eine Exposition gegenüber Chemikalien der Luft (39%), Pestizide (36%), Lösungsmittel und giftige Dämpfe (30%) feststellen. Auch der Konsum von Drogen, wie Tabak (86%), Analgetika (20%) oder Tranquillizer (18%) findet sich häufig in der Anamnese und ist mit einem schwereren Verlauf gekoppelt (Fischmann et al., 1997). Auch die Befunde von Emadi et al. betonen den Umwelteinfluss auf die Entstehung von PCTL: Sie berichteten über einen Patienten, der 15 Jahre nach Senfgasexposition ein SS entwickelte (Emadi et al., 2012). Ob der Entstehung PCTL und PCBL eine Infektion zugrunde liegt, kann nach aktuellen Erkenntnissen weder bestätigt noch widerlegt werden. Es gibt sowohl Hinweise, die eine infektiös-bedingte Pathogenese unterstützen, als auch welche, die für eine chemisch-physikalisch-bedingte Ursache sprechen. Die Hypothese, dass eine chronische Antigenstimulation zur Entwicklung CL führt, schließt keine der genannten Faktoren aus. Es ist denkbar, dass nur ein Teil der Tumoren durch einen Virus verursacht wird, wie es beim MCC der Fall sein könnte. Auch die Frage nach ethnischen Unterschieden in der Inzidenz bleibt unbeantwortet. Vielleicht ist neben exogenen Einflüssen der Entstehung CL eine bestimmte genetische Disposition vorausgesetzt. 68 5.5. Diskussion des Studiendesigns Die Interpretation der Ergebnisse dieser Studie muss unter Berücksichtigung des Studiendesigns und der damit verbundenen Limitationen erfolgen. Untersucht wurden in dieser Studie 130 in Paraffin-eingebettete Biopsien von 83 Patienten mit PCBL und PCTL, die in der Zeit zwischen Januar 1999 und Dezember 2010 in der Abteilung für Dermatologie der Ruhr Universität Bochum behandelt wurden. Da es sich bei kutanen Lymphomen bei einer Inzidenz von 1:100 000 um eine seltene Erkrankung handelt, ist es schwierig ein großes Kollektiv zu finden. Dieses gilt v.a. für seltene Formen der CL, wie dem PKAETZL oder dem SPTZL. Hier stand jeweils nur eine Probe zur Verfügung. Dennoch ist das der vorliegenden Studie im Vergleich zu Vorläuferstudien verhältnismäßig groß. Während die Studie von Andres et al. zum Nachweis von MCPyV-DNA 23 Hautproben verschiedener kutaner Lymphome umfasste, untersuchten Mirvish et al. nur 4 Probe mittels Antikörper CM2B4 (Andres et al. 2010, Mirvish et al.2011). Feng et al. analysierten zum Nachweis von MCPyV-DNA in MCC 10 Proben, während Sitho et al. 114 Proben von 207 Patienten untersuchte (Feng et al. 2008, Sitho et al. 2009). Die Geschlechtsverteilung entspricht in dieser Studie bei einem Verhältnis von 1,5:1 zwischen Männern und Frauen etwa der der Bevölkerung. Bezüglich des Verhältnisses zwischen PCBL und PCTL sind letztere mit 95% leicht überrepräsentiert. Allerdings ist wie in der Bevölkerung die MF mit 54% das am häufigsten in dieser Studie untersuchte CL, gefolgt vom großzelligen CD30-TCL und dem SS mit 10%, welches auch in der Bevölkerung der zweithäufigste Vertreter der CL ist. Da es sich in der vorliegenden Studie um Formalin-fixierte Proben handelte, ist nicht auszuschließen, dass durch den Fixierungsprozess und die teilweise lange Lagerung, der Detektionsgrad von viraler DNA reduziert wurde. Aus bereits durchgeführten Studien geht allerdings hervor, dass der Einfluss der Fixierung gering zu sein scheint. Während Sitho et al. in ihrer Studie zum MCC Formalin-fixierte Proben, die in der Zeit zwischen 1979 und 2004 entnommen wurden, auf MCPyV-DNA analysierten, untersuchten Feng et al. frisch entnommene Proben. Dennoch sind die Ergebnisse beider Studien mit 69 einem Nachweis von MCPyV in ca. 80% der Fälle ähnlich. Zudem variierte die Anzahl an eingesetzten Primerpaaren. Bei Feng et al. wurden 3 Primerpaare eingesetzt, von welchen sich zwei gegen den large T-Locus richteten und einer gegen den VP1 Locus. Kassem et al. setzten ebenso wie Rodig et al. insgesamt 5 Primerpaare ein und erzielten einen MCPyV-Nachweis in 77% bzw. 80% der untersuchten MCC- Proben. Sowohl Sitho et al. als auch Becker et al. gebrauchten ein Primerpaar. In der vorliegenden Studie wurden die Proben ebenfalls mit jeweils einem Virus-spezifischen Primerpaar untersucht. Durch die durchgeführte MCPyV nested PCR konnte das Ergebnis der mit diesem Primerpaar durchgeführten real time PCR überprüft werden. Da nur 13 der 30 in der qPCR MCPyV-positiven bestätigt werden konnten und alle in der qPCR negativen Proben hier ebenfalls negativ waren, weist dies auf eine hohe Sensitivität des Primers im Vergleich zur Spezifität hin. Zur Bestätigung MCPyV-positiver Proben wurde der monoklonale MausAntikörper CM2B4 eingesetzt. Die Sensitivität und Spezifität dieses Antikörpers ist bei Vorliegen einer hohen Anzahl an Gen-Kopien hoch. Jedoch war in dieser Studie die Anzahl an DNA-Kopien pro ß-Globin-Gen-Kopie der 30 MCPyV-positiven Proben in der Mehrzahl der Fälle <1. Für zukünftige Studien ist anzumerken, dass eine erhöhte Sensitivität durch den kombinierten Einsatz der Antikörper CM2B4 und CM5E1 erreicht werden kann. Letzterer richtet sich gegen das small T Antigen. Auch der sich ebenfalls gegen das large T Antigen richtende Antikörper Ab3 scheint sensitiver zu sein: während in einer Studie von Scott et al. 80% der untersuchten MCC unter dem Einsatz von CM2B4 positiv waren, waren es unter dem Einsatz von Ab3 97% (Shuda et al. 2011, Rodig et al. 2012). Hinzuzufügen ist, dass in der vorliegenden Studie ausschließlich Proben erkrankter Personen untersucht wurden und folglich keine gesunde Vergleichsgruppe zur Verfügung 70 stand. 5.6. Fazit Die vorliegende Studie ging der Frage nach, ob die humanen Polyomaviren MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV einen kausalen Faktor in der Pathogenese PCBL und PCTL darstellen. Dieses war nach bestem Wissen der Autorin die erste Studie, die hPyV6, hPyV7 und TSPyV im Hinblick auf diese Fragestellung mit einbezogen hat. Die Ergebnisse dieser Studie sprechen jedoch gegen einen vorliegenden Zusammenhang. Demnach bleibt die Frage offen, ob und durch welche Pathogene CL verursacht werden. Weiterhin bleibt unklar welche Rolle hPyV in der Entstehung von Krebs beim Menschen spielen. Seit der Detektion des MCPyV in ca. 80% der MCC sind viele neue Erkenntnisse über die molekularbiologischen Grundlagen der Pathogenese des MCC erlangt worden. Die klonale Integration der Virus-DNA im Genom der Wirtszelle spricht für eine Kausalität zwischen Infektion und Krebsentstehung und gegen eine sekundäre Infektion des MCC mit MCPyV. Die typischen Mutationen im LTA, die über ein verkürztes Protein zu einem Verlust der HelikaseAktivität führen, schützen das Virus vor einer Elimination durch das Immunsystem (Shuda et al. 2008), wohingegen ein Knock-out des LTAs in MCC zu einer Tumorregression führt bzw. den Zelltod induziert (Houben et al. 2010). Auf der Basis des LTA wurden die in der Immunhistochemie eingesetzten Antikörper entwickelt: sowohl CM2B4 als auch AB3 richten sich gegen dieses. Die Weiterentwicklung dieser Antikörper hat zu einer erhöhten Sensitivität in der immunhistochemischen Diagnostik geführt, sodass durch den Einsatz des Antikörpers AB3 in >90% der MCC MCPyV nachgewiesen werden konnte. Der gegen sTA gerichtete Antikörpers CM5E1 wird ebenfalls eingesetzt (Shuda et al., 2009, Rodig et al., 2012). Diese bisher in der Immunhistochemie eingesetzten Antikörper könnten zukünftig auch in der Diagnostik eine Bedeutung bekommen, z.B. im Rahmen eines Screenings auf das mutierte LTA bei V.a. MCC oder einen Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien darstellen (Shuda et al., 2008). Zeng et al. entwickelten bereits eine LTA-codierende DNA-Vakzine. Geimpfte Mäuse entwickelten LT-spezifische CD4+ T-Zellen, deren Aktivierung antitumoröse Effekte zeigten. Zudem wiesen diese Mäuse im Vergleich zu nicht mit LTA-DNA geimpften Mäusen ein signifikant geringeres Tumorvolumen auf und überlebten länger. (Zeng et al. 2012). 71 Weitere Studien müssen folgen mit dem Ziel, solche Vakzine auch beim Menschen einsetzbar zu machen. Der HPV-Impfstoff ist der bisher einzige zur Vorbeugung von Krebs. Er richtet sich gegen die Hochrisiko-Serotypen 6, 11, 16 und 18, entweder in Form eines quadrivalenten oder bivalenten Impfstoffes, der ausschließlich eine Immunität gegen HPV 16 und 18 hervorrufen soll. Während HPV 6 und 11 hauptsächlich für die Entstehung von Genitalwarzen verantwortlich ist, sind HPV 16 und 18 in >70% der Zervixkarzinome nachweisbar. Weitere HPV-assoziierte Tumoren sind das Vulva- und Vaginalkarzinom, das Analkarzinom und das Oropharynxkarzinom. Der Impfstoff enthält rekombinantes L1-Protein der jeweiligen Serotypen, sodass sich eine körpereigene Immunität gegen dieses entwickelt (Zur Hausen, 2008). Die Wirksamkeit geht aus randomisierten klinischen Studien hervor, in denen eine Effektivität zwischen 77,5% und 100% in der Prävention des Zervixkarzinoms, seiner Vorstufen und ans HPV-assoziierten genitale Neoplasien (FUTURE II Study group ,2007, Paavonen et al., 2009, Palefsky et al., 2011). Diese Erkenntnisse zeigen, welche Möglichkeiten die Identifizierung weiterer viral-bedingter Neoplasien im Hinblick auf die Krebsforschung eröffnet, und welche Konsequenzen für Prävention, Diagnostik und Therapie von Krebserkrankungen daraus resultieren, zumal 15-20% aller Krebsarten infektiös bedingt sind (Parkin et al. 2005). Ihre Bedeutung wird aufgrund des demographischen Wandels und der Zunahme Immunsupprimierter Menschen zunehmen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der Ursache der PCBL und PCTL unerlässlich, zumal epidemiologische Befunde wie fortgeschrittenes Alter und Immunsuppression als Risikofaktoren für die Entstehung CL auf eine infektiöse Genese hinweisen. Einen Beitrag dazu sollte die vorliegende Studie leisten. Jedoch konnte diese Studie, wie auch andere Studien bisher kein kausales Pathogen nachweisen. Dennoch kann derzeit nicht ausgeschlossen werden, dass Viren-darunter auch Polyomaviren- eine kausale Komponente in der Pathogenese der CL spielen. Denn auch die Ursache für das MCC war lange Zeit unbekannt, zumal das MCPyV erst 2008 entdeckt wurde. 72 Erst nach dessen Identifizierung konnten spezifische Primer entwickelt werden, die letztendlich zur Detektion des bereits 1978 durch Toker entdeckten MCC führten. 73 6.Zusammenfassung Primär kutane B- und T-Zell-Lymphome sind die zweithäufigsten nonHodgkin-Lymphome, welche durch die monoklonale Proliferation von Lymphozyten in der Haut entstehen. Eingeteilt werden sie entsprechend klinischer, histologischer und immunphänotypischer Kriterien nach der WHOEORTC-Klassifikation. Die Ätiologie ist unbekannt. Risikofaktoren für die Entstehung kutaner Lymphome sind hohes Alter und eine Immunsuppression. Dieses sind Hinweise auf eine infektions-assoziierte Pathogenese. Seit der Entdeckung des MCPyV assoziierten MCC ist das Interesse an Polyomaviren und ihrer Rolle in der Pathogenese von Krebs beim Menschen gestiegen. Auch in der vorliegenden Studie sollte untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen PCBL und PCTL und den hPy MCPyV, hPyV6, hPyV7 und TSPyV besteht. Hierzu wurden 130 archivierte in Paraffineingebettete Hautproben von 83 an PCBL und PCTL erkrankten Patienten mittels real-time PCR unter dem Einsatz spezifischer Primer analysiert. Zur Erhöhung der Sensitivität und Spezifität wurde eine MCPyV-nested PCR durchgeführt. Die Expression des LTA wurde unter dem Einsatz des monoklonalen Maus-Antikörpers CM2B4 überprüft. Entsprechend der Ergebnisse dieser Studie besteht keine Assoziation zwischen CL und den untersuchten PyV. PyV-DNA wurde nur in etwa einem Viertel der Proben nachgewiesen. Im Falle eines DNA-Nachweises war die Viruslast, angegeben in DNA-Kopien pro ß-Globin-Gen-Kopie, gering, d.h. <1. In keinen der MCPyV-positiven Proben wurde das LTA nachgewiesen. Welche Ursache der Entstehung der PCTL und PCBL zugrunde liegt, bleibt weiterhin ungeklärt. Neben infektiösen, scheinen chemische und physikalische Faktoren ebenfalls eine Rolle zu spielen. Auch wenn die derzeitige Studienlage gegen die Beteiligung hPyV spricht, muss beachtet werden, dass insbesondere zur Untersuchung seltener Lymphomtypen bisher keine großen Kollektive zur Verfügung standen. Möglich ist auch eine Assoziation mit den bisher noch nicht untersuchten PyV MWPyV oder hPy10. In Anbetracht der zahlreichen neu entdeckten PyV, ist es wahrscheinlich, dass in Zukunft wei- 74 tere hinzukommen. Damit wächst auch die Zahl potentieller Onkoviren, deren Rolle in der Pathogenese CL 75 überprüft werden muss. 7. Literaturverzeichnis Abrams, J.T., Balin, B.J., Vonderheid, E.C., Ann, N.Y. (2001). Association between Sézary T cell-activating factor, Chlamydia pneumoniae, and cutaneous T cell lymphoma. Acad. Sci. 941, 69-85 Al Ajroush, N., Rafique Sheikh, K., Kadry, R., Almutawa, A., Alfadley A.(2012). T-cell lymphoma/Sézary syndrome in a liver transplant recipient. J. Cutan. Med. 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Zudem möchte ich die erfolgreiche Kooperation mit dem Institut für Virologie der Universität Köln hervorheben, und hier insbesondere Frau Prof.Dr. med. Wieland danken, die durch ihre Expertise auf dem Gebiet der Polyomaviren diese Studie erst möglich gemacht hat. Mein besonderer Dank gilt Frau Dr.rer.nat.Steffi Silling für die Betreuung der Virus-PCR und für die Hilfe bei der Erarbeitung des Studienprotokolls. Frau Richter möchte ich herzlich für die Unterstützung im immunhistochemischen Teil der Arbeit danken. Mein größter Dank gebührt meiner Mutter Doris Dewan und meinem Vater Kamal Dewan, die mich nicht nur jetzt, sonderi in jeder Lebenslage unterstützt haben und mir somit ermöglicht haben, meine Ziele zu erreichen und meine Träume zu verwirklichen- ich bin sehr stolz auf euch! Farjana, Sneha und Raphael-schön, dass ihr da seid. Schließlich möchte ich mich bei Manuel bedanken, der mich mit meinen Computerfragen nie allein gelassen hat- vielen Dank für all deine Unterstütung, Motivation und Geduld. Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Monia Vanessa Dewan Geburtsdatum: 26.01.1988 Geburtsort: Essen Schulausbildung 1994-1998 Christinenschule, Essen (Grundschule) 1998-2007 B.M.V.-Schule, Essen (staatlich anerkannntes Mädchengymnasium) 2007 Abitur Hochschulausbildung: seit 10/2007 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 08/2009 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung 08/2012-07/2013 Praktisches Jahr -Medizinische und kardiologische Klinik des Marien-Hospitals Witten -Klinik für Chirurgie des MarienHospitals Witten -Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des Marien-Hospitals Witten 10-12/2013 voraussichtlich Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung und Approbation
