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Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln Institut für Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. R. Büttner Molekularpathologische Charakterisierung von MET- und HGFAlterationen als potentielle prädiktive Biomarker in Weichgewebstumoren und gastrointestinalen Stromatumoren Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Katja Schmitz aus Bonn – Bad Godesberg promoviert am 22. April 2015 Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2015 Dekanin/Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin/Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. R. Büttner 2. Berichterstatterin/Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. T. Goeser Erklärung: Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, 29.09.2014 __________________________________ Katja Schmitz Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir mit Unterstützung von Herrn Prof. Dr. med. Reinhard Büttner, Herrn Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Schildhaus, Frau Dr. rer. nat. Jana Fassunke, Frau Privatdozentin Dr. rer. nat. Sabine MerkelbachBruse, Frau Helen Künstlinger, Dipl.-Mol.Biomed., Frau Michaela A Ihle, Dipl. Biol., Frau Carina Heydt, M.Sc. HID, Frau Prof. Dr. med. Eva Wardelmann, Herrn Hartmut Koeppen, MD und Herrn Prof. Dr. med. Josef Rüschoff sowie den biologischtechnischen und medizinisch-technischen Assistentinnen Elke Binot, Ellen Paggen, Marion Müller, Magdalene Fielenbach und Wiebke Jeske durchgeführt worden. Danksagung Herrn Prof. Dr. med. Reinhard Büttner danke ich dafür, dass er mir die Möglichkeit gab diese Arbeit im Institut für Pathologie der Uniklinik Köln durchzuführen. Herrn Prof. Dr. med. Hans-Ulrich Schildhaus danke ich in erster Linie für die tolle Einarbeitung in die FISH und die Überlassung dieses interessanten Themas. Die FISH wird immer ein wichtiger und geliebter Bestandteil meines Pathologen-Daseins darstellen, dafür werde ich dir immer dankbar sein. Es ist halt doch nicht nur grüne und rote Punkte zählen. Danke für die vielen Stunden, die du dir genommen hast, um mir bei diesem Projekt zu helfen. Frau Dr. Jana Fassunke möchte ich für die Planung meiner Arbeit aus biologischer Sicht und für die nette Zeit danken, die wir zusammen im Labor unter RNAse-freien Bedingungen verbracht haben. Frau Privatdozentin Dr. Sabine Merkelbach-Bruse danke ich dafür, dass Sie mich so in die Molekularpathologie aufgenommen hat und mir dieses schöne Arbeitsumfeld geschaffen hat. Außerdem hattest du immer den Überblick. Frau Prof. Dr. med. Eva Wardelmann möchte ich dafür danken, dass Sie mir Zutritt zu dem kostbaren Tumormaterial des Sarkom- und GIST-Archivs gewährt hat. In diesem Rahmen möchte ich mich auch bei dem Forschungsverbund KO.SAR – Kompetenznetz Sarkome – für die Bereitstellung des Materials bedanken. Herrn Hartmut Koeppen danke ich für die Einarbeitung in das Auswerteschema der Immunhistochemie und die Färbung der Tumorproben in San Francisco. Herrn Prof. Dr. med. Josef Rüschoff danke ich für die in Kassel durchgeführten Färbungen. Den Doktorandinnen der Molekularpathologie Köln, Helen Künstlinger, Michaela Ihle und Carina Heydt, danke ich für die Anleitung bei der Durchführung und Auswertung der RT-qPCR. Ihr habt mir geholfen, als Jana leider verhindert war. Den technischen Assistentinnen danke ich für die ganze Unterstützung im Labor. Elke Binot und Ellen Paggen danke ich für die Hilfe mit und bei der FISH. Danke, dass ihr meine FISH zum Leuchten gebracht habt. Marion Müller danke ich für die immunhistochemischen Färbungen. Magdalene Fielenbach und Wiebke Jeske für die Hilfe mit dem Sarkom- und GIST-Archiv. Für Meine Familie, Insbesondere meinen geliebten Ehemann und meine Tochter. Inhaltverzeichnis Abkürzungsverzeichnis................................................................................................ IV 1 Einleitung .............................................................................................................. 1 1.1 1.1.1 Epidemiologie ......................................................................................... 1 1.1.2 Lokalisation, Geschlechts- und Altersverteilung ...................................... 1 1.1.3 Klassifikation von Sarkomen ................................................................... 2 1.1.4 Klassifikation von gastrointestinalen Stromatumoren .............................. 4 1.1.5 Diagnostik und Molekularpathologie ........................................................ 5 1.1.6 Klinik und Therapie ................................................................................. 6 1.2 MET und HGF ................................................................................................ 9 1.2.1 MET - Struktur und Lokalisation .............................................................. 9 1.2.2 HGF/Scatter Factor ............................................................................... 10 1.2.3 HGF/MET-Signalweg ............................................................................ 10 1.2.4 Physiologie des HGF/MET-Signalwegs ................................................. 11 1.2.5 MET in malignen Tumoren .................................................................... 11 1.2.6 HGF in malignen Tumoren .................................................................... 12 1.2.7 Koexpression von MET und HGF in malignen Tumoren ........................ 13 1.2.8 MET als Prognosefaktor ........................................................................ 13 1.2.9 MET-Transkriptionsregulierung ............................................................. 13 1.3 HGF/MET in der Krebstherapie .................................................................... 14 1.3.1 Blockade der Liganden/Rezeptor-Interaktion ......................................... 15 1.3.2 Inhibierung der MET-Tyrosinkinase ....................................................... 16 1.3.3 Inhibierung der Signaltransduktion ........................................................ 17 1.3.4 Weitere Mechanismen der MET-Inhibition ............................................. 18 1.4 2 Sarkome......................................................................................................... 1 Zielsetzung ................................................................................................... 19 Material und Methoden ....................................................................................... 20 2.1 Material ........................................................................................................ 20 2.1.1 Probenkollektiv ...................................................................................... 20 2.1.2 Sarkomentitäten .................................................................................... 20 2.1.3 Vorkommen genetischer Veränderungen – unspezifisch und tumorspezifisch................................................................................................... 20 2.1.4 Tumorgraduierung ................................................................................. 21 2.1.5 Radiogen induzierte Angiosarkome und MYC-Amplifikation .................. 21 2.1.6 Histologische Typen der Synovialsarkome ............................................ 22 2.2 I Methoden ..................................................................................................... 23 3 2.2.1 Gewebeblöcke ...................................................................................... 23 2.2.2 Immunhistochemie ................................................................................ 24 2.2.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung ......................................................... 26 2.2.4 Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion ........... 28 Ergebnisse ......................................................................................................... 34 3.1 Immunhistochemische Expressionsmuster ................................................... 34 3.1.1 MET-Immunhistochemie des Ventana SP44 Antikörpers ...................... 34 3.1.2 MET-Immunhistochemie des Santa Cruz C-28 Antikörpers ................... 36 3.1.3 Phospho-MET-Immunhistochemie ........................................................ 38 3.1.4 HGF-Immunhistochemie ....................................................................... 40 3.2 Korrelation der Ergebnisse der verschiedenen immunhistochemischen Marker ..................................................................................................................... 43 3.2.1 Korrelation der beiden MET-Antikörper SP44 (Ventana) und C-28 (Santa Cruz Biotechnologies)......................................................................................... 43 3.2.2 Korrelation der MET-(SP44)- und phospho-MET-Immunhistochemie .... 43 3.2.3 Korrelation der MET-(SP44)- und HGF-Immunhistochemie ................... 44 3.2.4 Korrelation der MET-(C-28)- und phospho-MET-Immunhistochemie ..... 44 3.2.5 Korrelation der MET-(C-28)- und HGF-Immunhistochemie .................... 45 3.2.6 Korrelation der phospho-MET- und HGF-Immunhistochemie ................ 45 3.3 Immunhistochemische Expression in Bezug auf verschiedene klinische und pathologische Parameter ........................................................................................ 47 3.3.1 Immunhistochemische Expression und tumorspezifische und unspezifische genetische Aberrationen............................................................... 47 3.3.2 Immunhistochemische Expression und Tumorgrad nach FNCLCC ....... 47 3.3.3 Krankheitsprogressions- und Rezidivrisiko gastrointestinaler Stromatumoren ................................................................................................... 48 3.4 Ergebnisse der Fluoreszenz in situ Hybridisierung ....................................... 49 3.5 Korrelation der MET-FISH-Ergebnisse und Immunhistochemie .................... 52 3.5.1 Korrelation MET-FISH und MET-(SP44)-Immunhistochemie ................. 52 3.5.2 Korrelation MET-FISH und MET-(C-28)-Immunhistochemie .................. 52 3.5.3 Korrelation MET-FISH und phospho-MET-Immunhistochemie .............. 53 3.6 Korrelation der MET-FISH und klinischen und pathologischen Parametern .. 54 3.7 Ergebnisse der reversen Transkriptase-quantitativen Polymerase- Kettenreaktion ........................................................................................................ 55 3.7.1 RNA-Qualität ............................................................................................ 55 3.7.2 Ergebnisse der MET-RNA-Expression ...................................................... 55 3.7.2.1 MET-RNA in alle Tumorentitäten ....................................................... 55 II 3.7.2.2 MET-RNA in dedifferenzierte Liposarkomen ...................................... 56 3.7.2.3 MET-RNA in Angiosarkomen ............................................................. 56 3.7.2.4 MET-RNA in Leiomyosarkomen......................................................... 57 3.7.2.5 MET-RNA in malignen peripheren Nervenscheidentumoren .............. 57 3.8 Ergebniszusammenfassung nach Tumorentitäten ........................................ 58 3.8.1 Atypische lipomatöse Tumoren (ALT) ................................................... 58 3.8.2 Dedifferenzierte Liposarkome (DDLS) ................................................... 58 3.8.3 Myxoide Liposarkome (MLS) ................................................................. 58 3.8.4 Pleomorphe Liposarkome (PLS) ........................................................... 59 3.8.5 Leiomyosarkome (LMS) ........................................................................ 59 3.8.6 Angiosarkome (ASA) ............................................................................. 59 3.8.7 Synovialsarkome (SS) ........................................................................... 60 3.8.8 Maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNST) .......................... 60 3.8.9 Undifferenzierte pleomorphe Sarkome (UPS) ....................................... 60 3.8.10 Klarzellensarkome (CCS) ...................................................................... 60 3.8.11 Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) .............................................. 61 4 Diskussion .......................................................................................................... 62 5 Zusammenfassung ............................................................................................. 72 6 Literaturverzeichnis............................................................................................. 74 7 Vorabveröffentlichung von Ergebnissen.............................................................. 85 8 Anhang ............................................................................................................... 86 8.1 Protokoll der immunhistochemischen Färbung ............................................. 86 8.2 Protokoll der Fluoreszenz in situ Hybridisierung ........................................... 87 8.3 Protokoll der RNA-Extraktion........................................................................ 89 8.4 Tabelle der Parameter der FISH-positiven Fälle ........................................... 91 8.5 Tabelle der ausführlichen Darstellung der Korrelation zwischen MET-FISH und MET-(SP44)-Immunhistochemie ...................................................................... 92 8.6 Tabelle der Ergebnisse der RT-qPCR (CP-Werte) ........................................ 94 8.7 Tabelle der Zusammenfassung der aktuellen klinischen Studien von MET- und HGF-Inhibitoren für solide Tumoren................................................................. 96 8.8 III Tabelle der Ergebnisse klinischer MET-Studien ......................................... 108 Abkürzungsverzeichnis AJCC ALK ALT ARP ASA ASPS ATF1 ATP AZ BLAST CA cat CCS CDC42 CEN cDNA CP CR CRC CREB CRKL CTC DAB DAG DAPI DDLS DEPC DNA DOCK DP EDTA EGFR ETS EWS FAK FFPE FGFR FISH FNCLCC FRET G Gab1 American Joint Committee on Cancer anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase atypischer lipomatöser Tumor actin-related protein Angiosarkom alveolar soft part sarcoma (alveoläres Weichteilsarkom) cyclic AMP-dependent transcription factor 1 Adenosintriphosphat Arizona basic local alignment search tool California (Kalifornien) Catenin clear cell sarcoma (Klarzellensarkom) cell division control protein 42 centromere (Zentromer) complementary deoxyribonucleic acid (komplementäre Desoxyribonukleinsäure) crossing points complete response (komplette Remission) colorectal cancer (kolorektales Karzinom) cAMP response element-binding protein CRK-like protein circulating tumor cells (zirkulierenden Tumorzellen) Diaminobenzidin 1,2-Diacylglycerol 4′,6-Diamidin-2-phenylindol dedifferentiertes Liposarkom Diethylpyrocarbonat deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dedicator of cytokinesis disease progression (Krankheitsprogression) Ethylendiamintetraacetat epidermal growth factor receptor E26 transformation-specific Ewingsarkom focal adhesion kinase formalin-fixed, paraffin-embedded (Formalin-fixiert und in Paraffin eingebettet) fibroblast growth factor receptor Fluoreszenz in situ Hybridisierung French Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer grading (Tumorgrad) GRB2-associated-binding protein 1 IV GEJ GIST Grb2 HCC HE Her2 HGF/HGFR HIF-1 HPF IHC IP3 IPO8 IVD K k.A. kDa IMFT LCLC LMS M MAPK MiTF MIQE MLS MPNST mTOR n N n.a. NF-κB NOS NSCLC NWASP ORR OS PAK PDGFR/ PDGFRA PECom PFS PI3K PIP2 PLC PLS PPIA PR R V gastro-esophageal junction (gastroösophageale Übergang) gastrointestinaler Stromatumor growth factor receptor-bound protein 2 hepatocellular carcinoma (hepatozelluläres Karzinom) Hämatoxylin-Eosin human epidermal growth factor receptor 2 hepatocyte growth factor/hepatocyte growth factor receptor hypoxia-inducible factor-1 high power field (hochauflösendes Gesichtsfeld) Immunhistochemie Inositol-1,4,5-trisphosphat importin 8 in vitro Diagnostik Kringle-Domäne keine Angabe Kilodalton inflammatorischer myofibroblastischer Tumor large cell lung cancer (großzelliges Lungenkarzinom) Leiomyosarkom Metastase mitogen-activated protein kinase microphthalmia-associated transcription factor minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments myxoides Liposarkom maligner peripherer Nervenscheidentumor mechanistic target of rapamycin Anzahl nodus (Lymphknoten) nicht auswertbar nuclear factor-κB not otherwise specified (nicht anderweitig spezifiziert) non-small cell lung cancer (nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom) neural Wiskott–Aldrich syndrome protein overall response rate (Gesamtansprechrate) overall survival (Gesamtüberleben) p21-activated kinase platelet derived growth factor receptor/platelet derived growth factor receptor alpha perivasculärer epitheloiderzelliger Tumor progression free survival (progressionsfreies Überleben) Phosphoinositid-3-Kinase Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat Phospholipase C pleomorphes Liposarkom Peptidylprolyl Isomerase A partial response (partielle Remission) Resektionsstatus RAC1 RAS RCC REST RNA rpm RT RT-PCR RT-qPCR SCLC SD Ser SF SHC SHIP-1 SHP2 sMET SOS SPH SS SSC STAT T TaqPolymerase TKI TMA TPR Tyr UICC UPS VEGFR WDLS WHO WTS ZNS Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 rat sarcoma renal cell carcinoma (Nierenzellkarzinom) relative expression software tool ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) Raumtemperatur reverse transcription polymerase chain reaction (reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion) reverse transcription-quantative polymerase chain reaction (reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion) small cell lung cancer (kleinzelliges Lungenkarzinom) stable disease (Krankheitsstabilisierung) Serin scatter factor SRC homology domain c-terminal adaptor homolog SH2 containing inositol phosphatase SRC homology 2 domain-containing phosphatase 2 soluble MET (lösliches MET) son of sevenless serine proteinase homology Synovialsarkom saline sodium citrate signal transducer and activator of transcription Tumor Thermus aquaticus-Polymerase Tyrosinkinaseinhibitor tissue microarray (Multiblock) translocated promotor region Tyrosin Union for International Cancer Control undifferentiertes pleomorphes Sarkom vascular endothelial growth factor receptor well differentiated liposarcoma (hochdifferenziertes Liposarkom) World Health Organization (Weltgesundheitsorganisation) Weichteilsarkom zentrales Nervensystem VI Einleitung 1 Einleitung 1.1 Sarkome Weichteilsarkome (WTS) sind maligne Neoplasien des nicht-epithelialen, mesenchymalen Gewebes, das sich in der Embryonalphase aus dem mittleren Keimblatt, dem Mesoderm, entwickelt. Unter anderem gehören hierzu das Fett-, Binde-, und Muskelgewebe sowie Gefäße. Auch Malignome des neuroektodermalen Gewebes des autonomen und peripheren Nervensystems werden zu den WTS gezählt. Nicht zu dieser Tumorentität gehören Tumoren des retikuloendothelialen Systems, Glias und Stützgewebes parenchymatöser Organe sowie des Makrophagen-, hämato- und lymphopoetischen Systems (156). Die Ätiologie der Weichteilsarkome ist überwiegend unbekannt. Man geht davon aus, dass die Mehrheit de novo entsteht. In einigen Fällen scheinen genetische und umweltbedingte Faktoren, wie Bestrahlung, Virusinfektionen und Immunsuppression eine Rolle zu spielen. Vereinzelt wurde die Entstehung von Tumoren in Narbenarealen beschrieben (38). 1.1.1 Epidemiologie Weichteilsarkome sind eine seltene Tumorentität, mit einer klinischen Prävalenz von ca. 1 % aller malignen Neoplasien im Erwachsenenalter. Im Kindesalter machen WTS etwa 7 % aller malignen Tumoren aus. Die Inzidenz liegt bei ca. 2-3/100.000 Einwohnern, so dass in Deutschland jährlich ungefähr 1500-2500 Neuerkrankungen diagnostiziert werden (133). Somit sind WTS relativ selten, doch sie enden häufig letal, die 5-Jahres-Überlebensrate ist abhängig vom histologischen Subtyp, Differenzierungsgrad, Tumorgröße, Lokalisation, Resektionsstatus und Tumorstadium (22). Todesursache ist häufig die Entstehung von Metastasen, besonders in der Lunge und in Lymphknoten. Auch ausgedehntes lokales Tumorwachstum und Lokalrezidive können zum Tode führen (121). 1.1.2 Lokalisation, Geschlechts- und Altersverteilung Weichteilsarkome können in allen Körperregionen entstehen, ca. 75 % der WTS sind jedoch an den Extremitäten, 10 % retroperitoneal und 10 % am Körperstamm lokalisiert. Männer sind etwas häufiger betroffen als Frauen. Die Erkrankungshäufigkeit steigt mit zunehmendem Alter, das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 65 Jahren (38). 1 Einleitung 1.1.3 Klassifikation von Sarkomen Weichteilsarkome stellen eine sehr heterogene Gruppe von Tumoren dar. Aktuell gibt die World Health Organization (WHO) 50 verschiedenen Subtypen an. Sarkome werden nach der vorherrschenden zellulären Differenzierung, also nach der Ähnlichkeit des Tumorgewebes zu einem Normalgewebe klassifiziert (Typing). Eine histogenetische Einteilung nach dem Gewebe aus dem sich ein Tumor ableitet ist bei WTS nicht sinnvoll (58). Die WHO teilt Weichgewebstumoren derzeit in folgende Tumorzelldifferenzierungen ein: adipozytisch, fibroblastisch/myofibroblastisch, sog. fibrohistiozytisch, glatt- und skelettmuskulär, perizytisch und vaskulär. Bei einigen WTS ist die Liniendifferenzierung unbekannt, diese werden einer Gruppe mit ungewisser Differenzierung zugeordnet (38). Seit kurzem werden die Tumoren der peripheren Nerven ebenfalls zu den Weichgewebstumoren gezählt (119). Weichteiltumoren werden in benigne, intermediär maligne und maligne unterteilt. Die Zwischenkategorie der intermediären Malignität wird weiter unterteilt in lokal aggressiv, aber ohne Metastasierung, und in Tumoren, die sehr selten, in < 2 % der Fälle, metastasieren (38). Die Stadieneinteilung (Staging) der Weichteilsarkome erfolgt gemäß dem American Joint Committee on Cancer (AJCC) nach dem TNM-System der WHO (Union for International Cancer Control - UICC). Die TNM-Klassifikation beschreibt die Tumorausbreitung, den Lymphknotenstatus und die Mitbeteiligung anderer Organe (Tabelle 1). Retroperitoneale, mediastinale und pelvine Weichteilsarkome werden als tiefe Tumoren klassifiziert (158). In Europa wird für Weichteilsarkome das Malignitätsgraduierungssystem (Grading) der French Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer (FNCLCC) angewandt (22). Dieses System basiert auf der Vergabe von Punkten, die anschließend summiert werden und somit den Malignitätsgrad definieren. Punkte oder Scores werden vergeben für die Tumordifferenzierung, also die Ähnlichkeit zum Normalgewebe, die Mitoserate in 10 hochauflösenden Gesichtsfeldern (high power field – HPF) und die Ausdehnung von Nekrosen (Tabelle 2). Einige Sarkomentitäten haben definitionsgemäß festgelegte Malignitätsgrade (Tabelle 3). Das Grading gibt Aufschluss über das Risiko der Entstehung von Metastasen und die Überlebenswahrscheinlichkeit. 2 Einleitung Tabelle 1: TNM-Klassifikation der malignen Weichteiltumoren (158) Primärtumor TX Primärtumor nicht beurteilbar T0 Kein Hinweis auf Primärtumor T1 Tumor < 5 cm in größter Ausdehnung T1a oberflächlicher Tumor T1b tiefer Tumor T2 Tumor > 5 cm in größter Ausdehnung Nodalstatus Nx Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen N1 Regionäre Lymphknotenmetastasen Fernmetstasen M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen Tabelle 2: Malignitätsgraduierung nach FNCLCC (22) Tumordifferenzierung Nekrosen Grad 1 gut Score 0 keine Nekrosen Score 1 0-9/10 HPF Grad 2 mäßig Score 1 < 50 % Nekrosen Score 2 10-19/10 HPF Grad 3 schlecht Score 2 > 50 % Nekrosen Score 3 ≥ 20/10 HPF Malignitätsgrad Grad 1 Score-Summe 2 oder 3 Grad 2 Score-Summe 4 oder 5 Grad 3 Score-Summe 6, 7 oder 8 3 Mitosen Einleitung Tabelle 3: Weichteilsarkome mit festgelegtem Malignitätsgrad nach FNCLCC (22) Histologischer Typ FNCLCC-Grad Liposarkom, gut differenziert 1 Liposarkom, myxoid 2 Liposarkom, myxoid, high-grade 3 Liposarkom, rundzellig 3 Liposarkom, pleomorph 3 Liposarkom, dedifferenziert 3 Fibrosarkom, hoch differenziert 1 Fibrosarkom, konventionell 2 Fibrosarkom, schlecht differenziert 3 Pleomorphes Sarkom, pleomorpher Typ 3 Pleomorphes Sarkom, storiformer Typ 2 Pleomorphes Sarkom, inflammatorisch 3 Myxofibrosarkom (pleomorphes Sarkom, myxoider Typ) 2 Leiomyosarkom, gut differenziert 1 Leiomyosarkom, konventionell 2 Leiomyosarkom, schlecht differenziert 3 Rhabdomyosarkom, pleomorph 3 Rhabdomyosarkom, embryonal 3 Rhabdomyosarkom, alveolär 3 Ewing-Sarkom, Primitiver neuroektodermaler Tumor 3 Synovialsarkom 3 1.1.4 Klassifikation von gastrointestinalen Stromatumoren Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) gehören ebenfalls zu den mesenchymalen Tumoren. Sie haben eine eigene Klassifikation und werden nach ihrem Progressionsrisiko, also dem Metastasierungs- und Rezidivrisiko, eingeteilt. Diese Einteilung bezieht sich auf den Mitoseindex in 50 HPF und die Tumorgröße (39), siehe Tabelle 4. In der detaillierteren Miettinen-Klassifikation wird zusätzlich zu den o.g. Parametern das Organ in dem der GIST lokalisiert ist berücksichtigt (siehe Tabelle 5: Miettinen Klassifikation der GIST) (83). 4 Einleitung Tabelle 4: Kriterien zur Beurteilung der Aggressivität von GIST (39) Risikogruppe Tumorgröße Anzahl Mitosen Sehr niedriges Risiko < 2 cm < 5/50 HPF Niedriges Risiko 2–5 cm < 5/50 HPF Intermediäres Risiko < 5 cm 5–10 cm 6–10/50 HPF < 5/50 HPF Hohes Risiko > 5 cm > 10 cm jede Größe > 5/50 HPF jede Zahl > 10/50 HPF Tabelle 5: Miettinen Klassifikation der GIST (83) Tumorparameter Risiko einer Krankheitsprogression (%) Gruppe Größe Mitoseindex Magen Jejunum/Ileum Duodenum Rektum 1 ≤ 2 cm ≤ 5 per 50 HPF 0 % keines 0% keines 0 % keines 0 % keines 8,3 % niedrig 4,3 % niedrig 8,5 % niedrig 2 > 2 ≤ 5 cm ≤ 5 per 50 HPF 1,9 % sehr niedrig 3a > 5 ≤10 cm ≤ 5 per 50 HPF 3,6 % niedrig 34 % hoch 3b > 10 cm ≤ 5 per 50 HPF 10 % moderat 4 ≤ 2 cm > 5 per 50 HPF 0% keines > 2 ≤ 5 cm > 5 per 50 HPF 16 % moderat 6a > 5 ≤ 10 cm > 5 per 50 HPF 55 % hoch > 10 cm Legende: 1 > 5 per 50 HPF 2 - 50 % hoch 1 54 % hoch 50 % hoch 73 % hoch 52 % hoch 86 % hoch 6b 57 % hoch 52 % hoch 1 5 24 % moderat 2 85 % hoch 2 71 % hoch 86 % hoch 2 90 % hoch Tumorkategorien mit wenigen untersuchten Fällen; 2 aufgrund kleiner Fallzahlen sind die Gruppen 3a/b und 6a/b in GIST des Duodenums und des Rektums zusammengefasst worden; - Tumoren aus dieser Gruppe befanden sich nicht in dem Studienkollektiv. 1.1.5 Diagnostik und Molekularpathologie Die Diagnose eines Weichteilsarkoms wird in erster Linie an Hämatoxylin-Eosin-(HE)Schnittpräparaten gestellt. Zum Erkennen einer Liniendifferenzierung immunhistochemische Zusatzuntersuchungen angeschlossen (51). 5 werden Einleitung Ergänzend können molekularpathologische Verfahren, die sich in den letzten 20 Jahren entwickelt haben, angewandt werden. WTS können gemäß ihrer chromosomalen Aberrationen in zwei Gruppen eingeteilt werden, Tumoren mit i) tumorspezifischen Genläsionen und ii) komplexen karyotypischen Veränderungen (20). Die häufigsten in WTS nachgewiesenen spezifischen Mutationen sind i) chromosomale Translokationen - Austausch von genetischem Material zwischen zwei nichthomologen Chromosomen, ii) Amplifikationen - Vorhandensein zahlreicher Kopien eines strukturell normalen Gens, iii) Punktmutationen - Austausch einer Base durch eine andere (97). Seltener kommen Deletionen - Verlust von Basen - und Insertionen Zugewinn von Basen - vor (143). Diese spezifischen molekularen Anomalien lassen sich für einige Entitäten zur Diagnosesicherung nutzen und können Hinweise auf die Prognose geben (4, 96). Translokationen können in der Routinediagnostik mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH), die den Chromosomenstrangbruch oder die Fusion nachweist, oder durch eine reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die das Genfusionsprodukt nachweist, diagnostiziert werden. Genamplifikationen können ebenfalls mit der FISH-Technik, mittels derer die Genkopienzahl bestimmt werden kann, erfasst werden. Weiterhin gibt es indirekte Methoden, die gegebenenfalls auf eine Genamplifikation schließen lassen, die reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) zur Messung der mRNA-Menge und die Immunhistochemie zum Proteinnachweis. Beide Methoden sind jedoch nicht spezifisch für eine zugrundeliegende Genamplifikation, da die Ergebnisse auch anderen Einflussfaktoren unterliegen. Mutationsanalysen werden routinemäßig mit der Sanger-Sequenzierung oder Pyrosequenzierung durchgeführt (20, 81). 1.1.6 Klinik und Therapie Weichteilsarkome werden häufig erst in weit fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert, da sie relativ symptomarm und meist schmerzlos sind. Bei einer Tumorlokalisation in tiefen Gewebeschichten treten Symptome oft erst bei sehr großen Tumorvolumina auf. Daher werden zum Zeitpunkt der Diagnosestellung in ca. 10-25 % der Fälle hämatogene Fernmetastasen nachgewiesen, meist in Lunge (33 %), Knochen (23 %) oder Leber (15 %) (156). Die Therapie der WTS ist abhängig vom histologischen Tumortyp, vom Tumorstadium und dem Differenzierungsgrad. Bei Tumoren im lokalisierten Stadium ist die Tumorresektion im Gesunden (R0) die Standardtherapie aller adulten WTS. Der erforderliche Sicherheitsabstand ist abhängig von mehreren Faktoren, wie histologischem Subtyp, präoperativer Therapie und vorhandenen anatomischen 6 Einleitung Grenzen. Tiefe, > 5 cm durchmessende, hochmaligne (G2, G3) WTS werden postoperativ oft bestrahlt. Verbliebener Resttumor (R1-, R2-Resektion) kann nachoperiert oder bestrahlt werden. Nicht resezierbare Tumoren werden mit Chemooder Strahlentherapie behandelt. Je nach Lokalisation kommt auch eine HyperthermieBehandlung oder eine Extremitätenperfusion in Betracht. Aufgrund der widersprüchlichen Daten klinischer Studien gehört die Chemotherapie nicht zur Standardtherapie von WTS, kann jedoch bei Hochrisikopatienten (tiefe, > 5 cm durchmessende, hochmaligne (G2, G3) Tumoren) diskutiert werden. Im fortgeschrittenen Stadium gilt die Chemotherapie als Standard. Wenn möglich kann eine Resektion der Metastasen erfolgen. Palliativ kann die Strahlentherapie zum Einsatz kommen (50). Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) stellen, was die Therapie angeht, eine Besonderheit dar. Zwar ist auch hier die Standardtherapie in erster Linie eine vollständige operative Tumorresektion, jedoch gelten GIST auch als Vorreiter der molekular-zielgerichteten Therapie im Bereich der Weichteilsarkome. GIST gehören zu der Gruppe der Sarkome, die tumorspezifische genetische Veränderungen vom Typ der Mutationen aufweisen. Ca. 90 % aller GIST weisen aktivierenden Mutationen im Kit- oder PDGFRA-Gen auf (38). GIST mit derartigen aktivierenden Mutationen zeigen ein gutes Ansprechen auf den Tyrosinkinaseinhibitor Imatinib (Glivec®, Novartis, Basel, Schweiz). Der zugrundeliegende Mutationstyp kann Aufschluss über die Wirksamkeit und die optimale Dosierung geben. Imatinib wird im lokalen Stadium bei Patienten mit Rezidivrisiko adjuvant für drei Jahre in einer Dosierung von 400 mg täglich eingesetzt. Patienten mit Nachweis einer PDGFRA D842V-Mutation gelten als Imatinib-resistent und werden daher nicht damit behandelt. Eine Kit Exon 9 Mutation erforderte eine höhere Dosierung von 800 mg täglich. Eine weitere Imatinib-Indikation ist eine intraoperative Tumorruptur, die mit einem erhöhten Risiko peritonealer Metastasen einhergeht. Initial nicht operable GIST können neoadjuvant mit Imatinib behandelt werden, um eine operable Situation zu erlangen. Im fortgeschrittenen Stadium oder bei irresektablen Tumoren bekommen Patienten standardmäßig 400 mg Imatinib täglich lebenslang (zusammengefasst in (49)). Unter einer Therapie kommt es in ca. 10 % der Patienten zu einer primären ImatinibResistenz mit Tumorprogression. Dies wird häufig in Kit und PDGFRA Wildtyp-GIST, und den oben genannten Kit Exon 9 und PDGFRA p.D842V mutierten GIST beobachtet. Weitere 40-50 % der Patienten entwickeln in den ersten zwei Jahren nach initialem Therapieansprechen eine Resistenz, sie gelten als sekundär resistent. Diese werden durch sekundäre Mutation im Kit- oder PDGFRA-Gen verursacht (48), für die jedoch zumindest partiell ebenfalls molekular-zielgerichtete Therapien verfügbar sind. 7 Einleitung Eine ähnlich erfolgsversprechende Therapie wäre für viele Sarkompatienten wünschenswert. Die zum Teil nur unzureichende Wirksamkeit der derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten erfordert die Entwicklung neuer Therapieansätze. Durch die molekularpathologische Charakterisierung der einzelnen Weichteilsarkome können Hinweise auf eine mögliche Wirksamkeit zielgerichteter Medikamente, sog. molecular targeted therapy, erlangt werden. Dies würde eine deutliche Verbesserung der Therapie bedeuten, denn Patienten könnten eine speziell gegen ihre Tumorentität wirksame Therapie erhalten (personalisierte Medizin oder auch precision medicine genannt). Auch in WTS mit komplexen genetischen Aberrationen könnte diese Art von Therapie zukünftig eine Rolle spielen. Das Konzept der oncogene addiction lässt in einigen Tumoren auf eine Abhängigkeit des Überlebens der Zellen und der Proliferation von einem Gen schließen. Dadurch könnte eine targeted therapy, trotz Ansammlung mehrerer Mutationen wirksam sein (155). Die bislang identifizierten tumorspezifischen Genaberrationen sind jedoch derzeit, bis auf bei GIST, nur selten therapeutisch nutzbar. Daher ist es derweil sinnvoll nach weiteren molekularen Markern zu suchen. Präklinische Daten konnten bisher in einzelnen Sarkomentitäten ein Ansprechen molekularer Wirkstoffe zeigen, mTOR-Inhibitoren in perivasculären epitheloiden ZellTumor (PECom), myofibroblastischen Crizotinib Tumoren in (IMFT), ALK-translozierten Sunitinib und inflammatorischen Cediranib in alveolären Weichteilsarkomen und solitären fibrösen Tumoren (zusammengefasst in (50)). 8 Einleitung 1.2 MET und HGF 1.2.1 MET - Struktur und Lokalisation MET wurde als aktiviertes Onkogen in humanen Osteosarkom-Zellzelllinien, chemischen Karzinogen entdeckt. dieser In die mit behandelt Zelllinie einem wurden, fand man eine Translokation zwischen der Translocated Promotor Region (TPR) lokalisiert auf Chromosom 1q31.1 und MET auf Chromosom 7q31.2, sowie das daraus resultierende Fusionsprotein TPR-MET (23). MET ist ein Protoonkogen, das den Hepatocyte Growth Factor Receptor (HGFR) kodiert, ein transmembranärer Tyrosinkinaserezeptor bestehend aus einer 50 kDa α-Kette und einer 140 kDa β-Kette, verbunden durch Dilsulfidbrücken (Abbildung 1). Das MET-Gen liegt auf Chromosom 7q31.2 und ist 120 Kilobasen lang. Es enthält 21 MET- Exons und 20 Introns (72). Die α-Kette des Abbildung Proteins liegt vollständig extrazellulär. Die β-Kette Proteinstruktur (42) hat einen extrazellulären, einen transmembranären Legende: Ser, Serin; Tyr, Tyrosin. 1: und einen zytoplasmatischen Teil. Der Letztere enthält die Tyrosinkinasedomäne und das für die Signaltransduktion essentielle Carboxy-Ende. In der zytoplasmatischen Region finden sich fünf Phosphorylierungsstellen (77). Juxtamembranär liegen Serin 985 und Tyrosin 1003. Serin 985 führt nach Phosphorylierung zu einer Herunterregulierung der Rezeptorkinaseaktivität (42). Die Phosphorylierung von Tyrosin 1003 führt zum Abbau von MET. In der Tyrosinkinasedomäne finden sich die Tyrosine 1234 und 1235, die nach der Rezeptoraktivierung transphosphorylieren. Das Carboxy-Ende enthält Tyrosin 1349 und 1356, welche im phosphorylierten Zustand Substrate wie growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2), GRB2-associated-binding protein 1 (Gab1), Phosphoinositid-3-Kinasen (PI3K) und andere binden. Gab1 scheint das wichtigste Substrat in der MET-Signalkaskade zu sein (10). MET wir überwiegend von epithelialen Zellen expremiert (27, 140) und konnte ebenfalls in Fibroblasten (89), Endothelzellen (116), Glattmuskelzellen und Perizyten (113) nachgewiesen werden. 9 Einleitung 1.2.2 HGF/Scatter Factor Der einzige bekannte Ligand für MET ist der Hepatocyte Growth Factor (HGF), ein Heterodimer bestehend aus einer 62 kDa α-Untereinheit und einer 34 kDa βUntereinheit (44). Das HGF-kodierende Gen liegt auf Chromosom 7q21.1 und besteht aus 18 Exons und 17 Introns (129). HGF wurde ursprünglich als Mitogen für Hepatozyten entdeckt. Der Scatter Factor (SF) wurde unabhängig davon in Fibroblasten und Glattmuskelzellen nachgewiesen und initiiert eine Zelldissoziation (cell scattering). Später fand man heraus, dass es sich um dasselbe Protein handelt (89). HGF wird von mesenchymalen Zellen als inaktives einzelsträngiges Glycoprotein synthetisiert und anschließend extrazellulär durch Proteolyse in ein aktives zweikettiges Heterodimer umgewandelt (73). Es besteht aus einer amino-terminalen Domäne, vier Kringle-Domänen (K1-K4) und einer serine proteinase homology (SPH) Domäne. 1.2.3 HGF/MET-Signalweg Die Bindung des Liganden HGF an den Tyrosinkinaserezeptor MET initiiert eine Rezeptorhomodimerisierung und Aktivierung der Tyrosinkinase durch Phosphorylierung der Tyrosine 1234 und 1235 der Kinasedomäne. Dies führt zu einer Autophosphorylierung des Carboxy-Endes an Tyrosin 1349 und 1356. Verschiedene zytoplasmatische Effektorproteine, wie Grb2, Gab1, Phospholipase C (PLC) und SRC werden an diese Stelle rekrutiert und ebenfalls phosphoryliert. Phosphoryliertes Gab1 kann Substrate, wie SRC, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) und SRC homology 2 domain-containing phosphatase 2 (SHP2) heranziehen und so verschiedene Signalkaskaden aktivieren. Die Aktivierung der Signalwege Ras (rat sarcoma) - MAPK (mitogen-activated protein kinase) und PI3K-AKT hat intranukleäre Auswirkungen auf die Genexpression und den Zellzyklus. Zytoplasmatische Signalkaskaden die über RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) – cell division control protein 42 (CDC42) und p21-activated kinase (PAK) laufen, führen zu Veränderungen des Zytoskeletts und kontrollieren Cadherine und Integrine der Zellmembran und beeinflussen die Zellmotilität/-Migration (43) (Abbildung 2). 10 Einleitung Abbildung 2: HGF/MET-Signalweg (43) Legende: α-cat, α-catenin; β-cat, β-catenin; ARP, actin-related protein; CRKL, CRK-like protein; DAG, diacylglycerol; DOCK, dedicator of cytokinesis; FAK, focal adhesion kinase; IP3, inositol trisphosphate; NF-κB, nuclear factor-κB; NWASP, neural Wiskott–Aldrich syndrome protein; PIP2, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. 1.2.4 Physiologie des HGF/MET-Signalwegs MET und HGF wirken physiologisch über einen parakrinen Mechanismus (57). Der HGF/MET-Signalweg steigert die Zellproliferation, Zellmotilität/-migration und Angiogenese. Physiologisch spielen diese Funktionen während der Embryogenese, Geweberegeneration, Wundheilung und morphogenen Differenzierung von Geweben eine wichtige Rolle (5). 1.2.5 MET in malignen Tumoren MET ist ein Protoonkogen, was bedeutet, dass eine regelrechte Expression des Wildtypallels eine physiologische Bedeutung hat, eine inadäquate Funktionssteigerung jedoch zu einer 11 malignen Transformation des Gewebes führen kann. Die Einleitung physiologischen Funktionen von MET wie Proliferation, Motilität und Angiogenese können bei fehlerhafter Aktivierung die Tumorgenese, Tumorangiogenese und Metastasierung maligner Tumoren fördern. Im Allgemeinen können der aberranten Aktivierung einer Tyrosinkinase verschiedene Mechanismen zu Grunde liegen, autokrine oder parakrine Ligandenaktivierung, ligandenunabhängige Mechanismen wie Rezeptorüberexpression mit Autoaktivierung, aktivierende Mutationen oder Genamplifikation. Weitere Mechanismen sind eine fehlerhafte Aktivierungen im Bereich der Signaltransduktionskette oder eine Hochregulierung der Transkription (5, 114). Mutationen im MET-Gen konnten in hereditären und sporadischen papillären Nierenzellkarzinomen (125), hepatozellulären Karzinomen im Kindesalter (102), Magenkarzinomen (69), Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich (29) und hereditären kolorektalen Karzinomen (92) nachgewiesen werden. Eine Überexpression des MET-Proteins wurde in Mammakarzinomen (17), kolorektalen Karzinomen (70), Magenkarzinomen (67), hepatozellulären Karzinomen (141), malignen Pleuramesotheliomen (145), Melanomen (90), nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen (71, 95), kleinzelligen Bronchialkarzinomen (122), Ovarialkarzinomen (28), Pankreaskarzinomen (32), Prostatakarzinomen (105) und follikulären Schilddrüsenkarzinomen (30) gezeigt. Eine MET-Gen-Amplifikation wurde in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen (74), kolorektalen Karzinomen (150), Magenkarzinomen (66), klarzelligen Ovarialkarzinomen (162), Cholangiokarzinomen (84) und Glioblastomen (85, 115) nachgewiesen. Auch in einigen Sarkomentitäten konnte eine Überexpression des MET-Proteins nachgewiesen werden, in Synovialsarkomen (65, 94), Osteosarkomen (37, 128), Leiomyosarkomen, Liposarkomen, Fibrosarkomen, Rhabdomyosarkomen (111), Klarzellensarkomen (26), alveolären Weichteilsarkomen (148), malignen peripheren Nervenscheidentumoren (107), myxoiden Liposarkomen (91), Kaposi-Sarkomen (75), undifferenzierten pleomorphen high-grade Sarkomen (12) und Sarkomen die mit dem Li-Fraumeni Syndrom assoziiert sind (110). 1.2.6 HGF in malignen Tumoren Eine HGF-Überexpression konnte in malignen Pleuramesotheliomen (145), nichtkleinzelligen Bronchialkarzinomen (95, 142), Magenkarzinomen (161), kolorektalen Karzinomen (98), Harnblasenkarzinomen Pankreaskarzinomen (46) und (32), Glioblastomen Prostatakarzinomen (85) nachgewiesen (164), werden. Eine vermehrte HGF-Expression konnte auch in pleomorphen high-grade Sarkomen, 12 Einleitung Osteosarkomen (37, 40), malignen peripheren Nervenscheidentumoren (107), Synovialsarkomen (65, 94) und Klarzellensarkomen (26) gefunden werden. 1.2.7 Koexpression von MET und HGF in malignen Tumoren Eine Überexpression des Liganden HGF in MET-positiven Tumorzellen, also eine Koexpression, kann Zeichen einer autokrinen Aktivierung sein. Eine Tumorzelle produziert gleichzeitig den Liganden und den entsprechenden Rezeptor und ist somit in der Lage sich selbst zu stimulieren. Eine Koexpression von MET und HGF fand sich in Mammakarzinomen Synovialsarkome (149), (87), in der vereinzelt in epithelialen high-grade Komponente pleomorphen biphasischer Sarkomen und Osteosarkomen (40). 1.2.8 MET als Prognosefaktor In einigen Tumoren korreliert die Überexpression von MET bzw. die Koexpression von MET und HGF mit einer schlechteren Prognose, in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen (55, 142), Glioblastomen (62), Cholangiokarzinomen (84), klarzelligen Ovarialkarzinomen (162) und Magenkarzinomen (31). 1.2.9 MET-Transkriptionsregulierung Der MET-Promotor spricht auf Stimulation durch HGF und weitere Wachstumsfaktoren an. In verschiedenen Tumorentitäten wurde eine MET-Überexpression ohne den Nachweis von Mutationen in der Gensequenz nachgewiesen. Eine Erklärung für die Überexpression von MET könnte eine vermehrte Rezeptortranskription aufgrund von vorgelagerten Mutationen sein. Aktivierte Onkogene, wir Ras (Rat sarcoma) und Ret (ret proto-oncogene), können zu einer MET-Überexpression führen (35, 56). Der METPromotor hat vier Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren der ETS-Familie (E26 transformation-specific) (132). Interessanterweise führt auch eine Hypoxie zu einer vermehrten MET-Expression, durch Bindung von Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) an den Promotor (103). 13 Einleitung 1.3 HGF/MET in der Krebstherapie Aufgrund der Relevanz des HGF/MET-Signalwegs in der Tumorgenese, Tumorprogression, Invasion und Metastasierung stellt die Inhibierung dieses Signalwegs einen interessanten Aspekt in der modernen Krebstherapie dar und wird daher derzeit intensiv beforscht. Es gibt verschiedene Ansätze diesen Signalweg in vivo zu inhibieren: Antagonisierung der Liganden/Rezeptor-Interaktion, der Tyrosinkinase und der Signaltransduktion (10) (Abbildung 3). Abbildung 3: Möglichkeit der Inhibierung des HGF/MET-Signalwegs (34) Legende: GRB2, growth factor receptor-bound protein 2; GAB1, Grb2-associated adaptor protein 1; PI3K, phosphatidylinositol 3-kinase; SOS, son of sevenless; RAS, rat sarcoma oncogene homolog; MAPK, mitogen-activated protein kinase; STAT 3/5 signal transducer and activator of transcription 3/5; SHP2, SRC homology protein tyrosine phosphatase 2; SHC, SRC homology domain c-terminal adaptor homolog; PLC, phospholipase c-g; RAC1, Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1; PAK, p21-activated kinase; FAK, focal adhesion kinase; mTOR, mammalian target of rapamycin; EGFR, epidermal growth factor receptor. 14 Einleitung 1.3.1 Blockade der Liganden/Rezeptor-Interaktion 1.3.1.1 HGF-Antikörper: HGF-Antikörper binden und neutralisieren HGF und verhindert somit die HGFinduzierte Aktivierung von MET und die damit verbundenen biologischen Funktionen. Polyklonale Kaninchen-Antikörper können HGF neutralisieren (64, 111). Die ersten monoklonalen HGF-Antikörper waren nur in einer Kombination aus mindestens drei Antikörpern wirksam (18). 2006 entwickelten zwei Arbeitsgruppen effektive einzeln wirksame monoklonale HGF-Antikörper. Diese HGF-Antikörper inhibieren die Signaltransduktion, Proliferation, Zellinvasion/-dissoziation und Zellvitalität mit Anstieg der Zellapoptosen in vitro in verschiedenen Tumorzelllinien. In Xenograft- Mausmodellen mit subkutan implantierten Gliomen zeigte sich nach systemischer Gabe eines HGF-Antikörpers eine signifikante Inhibition des Tumorwachstums. In einem dieser Mausmodelle ließ sich sogar eine Tumorregression nachweisen. In einem weiteren Mausmodell mit intrakraniellen Glioblastomen war der HGF-Antikörper wirksam und reduzierte das Tumorwachstum (13, 59). In Lungenkarzinomzelllinien konnte eine Inhibition der HGF-induzierten Funktionen, wie Zellinvasion und Wundheilung nachgewiesen werden. In einem transgenen Mausmodell konnte die Tumorzellproliferation gehemmt und die Apoptoserate gesteigert werden (139). Auch in Zelllinien und einem Xenograft-Mausmodell von Leiomyosarkomen wurde die Wirksamkeit von HGF-Antikörpern belegt. Die Inhibierung der MET-Aktivierung wurde durch eine Verringerung der MET-Phosphorylierung nachgewiesen. In der Leiomyosarkomzelllinie zeigte sich eine Inhibierung der Zelldissoziation, Invasion und Proliferation. In dem Tumorwachstums Mausmodell nachgewiesen wurde (41). eine Diese signifikante Art der Reduktion Therapie des scheint nebenwirkungsarm zu sein, bis auf eine gestörte Wundheilung (139). Einzelne klinische Studien konnten eine Wirkung des HGF-Antikörpers Rilotumumab (AMG 102) verzeichnen. In metastasierten Nierenzellkarzinomen führte es zu einer partiellen Remission, in weitere Nierenzellkarzinompatienten (127) und Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren konnte eine Krankheitsprogression verhindert werden (47, 118). In metastasierten kastrationsresistenten Prostatakarzinomen (120), Glioblastomen und Gliosarkomen konnte keine signifikanten Krankheitsverbesserung erlangt werden (157). 15 Einleitung 1.3.1.2 HGF-Antagonisten: HGF-Antagonist sind eine weiter Option die Interaktion zwischen HGF und MET zu blockieren. NK4, ein HGF-Antagonist, ist ein Fragment bestehend aus dem AminoEnde und der Vier-Kringelregion von HGF. Es bindet an den MET-Rezeptor und konkurriert mit HGF um die Bindung an MET und kann dadurch die Aktivierung durch HGF verhindern. In Xenograft-Mausmodellen zeigte sich eine signifikante Inhibition des humanen Tumorwachstums (1, 25, 82). Ein weiterer HGF Antagonist ist ein inaktives Vorläufermolekül von HGF (pro-HGF/pro-SF), das mit hoher Affinität an MET bindet. Es konnte eine Inhibierung des invasiven Tumorwachstums und der Metastasierung in Xenograft-Mausmodellen gezeigt werden (78). Klinische Daten liegen zu HGFAntagonisten bislang nicht vor. 1.3.1.3 MET-Antikörper: Monoklonale Antikörper gegen MET binden die extrazelluläre Rezeptorregion und verhindern dadurch eine Aktivierung der Tyrosinkinase. Ein in einer Studie erprobter MET-Antikörper ist MetMAb (Onartuzumab), ein monovalenter monoklonaler Antikörper gegen humanes MET (80). MetMAb lieferte präklinisch und in frühen klinischen Studien vielversprechende Resultate. Eine MetMAb-Monotherapie führte bei einer Patientin mit metastasiertem Magenkarzinom, das eine MET-Amplifikation sowie eine MET- und HGF-Überexpression aufwies, zu einer vollständigen Tumorregression (19). In einer Phase 2 Studie konnte MetMab in Kombination mit dem EGFR-Inhibitor Erlotinib in Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinomen mit einer deutlichen METÜberexpression oder MET-Amplifikation eine Verlängerung des progressionsfreien Überlebens im Vergleich zu einer Monotherapie mit Erlotinib bewirken (137). Eine später durchgeführte randomisierte Phase 3 Studie musste allerdings vorzeitig unterbrochen werden, da Onartuzumab bei Patienten mit MET-immunpositiven nichtkleinzelligen Bronchialkarzinomen (NSCLC) zu einer Verschlechterung des progressionsfreien und des gesamten Überlebens führte (134). 1.3.2 Inhibierung der MET-Tyrosinkinase Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) sind kleine Moleküle, die die Bindung von ATP an MET verhindern und somit die MET-Signalkaskade blockieren. TKI werden in METspezifische- und Multikinaseinhibitoren, welche auch andere Tyrosinkinasen, wie VEGFR und PDGFR inhibieren, unterteilt. Verschiedene MET-TKI wiesen präklinisch gute Ergebnisse auf. SU11274 inhibierte die Zellviabilität in Lungenkarzinomzellen 16 Einleitung (21), das Wachstum von Melanomzelllinien bei gleichzeitiger Apoptoseinduktion (106). Auch in papillären Nierenzellkarzinomen mit aktivierenden MET-Mutationen zeigte SU11274 eine Inhibition der MET-Funktion (8). Crizotinib (PF-2341066) ist ein METKinaseinhibitor und kombinierter ALK-Inhibitor. Durch Verhinderung der METPhosphorylierung wurde in vitro die Zellproliferation, Migration und Invasion gehemmt (165). ARQ197 ist ein nicht-ATP kompetitiver MET-Inhibitor. In einem Mausmodell mit ossär-metastasiertem Mammakarzinom zeigte sich eine Reduktion der Metastasierung (3). Mittlerweile haben zahlreiche TKI mit anti-MET-Aktivität Einzug in klinische Studien erhalten. Bereits zahlreiche verschiedene Tumorentitäten sprachen erfolgreich auf MET-TKI an. Die Ergebnisse reichten von einer Krankheitsstabilisierung, über partielle bis hin zu einer vollständigen Remission. Auch das progressionsfreie und gesamte Überleben konnte verbessert werden. Zu den zuvor erwähnten Tumorentitäten zählen neuroendokrine, Prostata-, Hoden-, adenoid-zystische, Blasen-, endometriale Adeno-, Pankreas-, papilläre Schilddrüsen-, Rektum-, undifferentierte kleinzellige, und Nierenzellkarzinome, Melanome, (117), metastasierte Magenkarzinome (131, 163), Merkelzellkarzinome (163), nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome (99, 117, 130), papilläre Nierenzell-, und medulläre Schilddrüsenkarzinome (33). Auch Weichteiltumoren wie Angiomyolipome, Liposarkome und nicht näher spezifizierte Sarkome konnten erfolgreich behandelt werden (117). Einige dieser Tumoren waren MET- oder HGF-immunpositiv (117), amplifiziert (99, 130, 131) oder mutiert (163). 1.3.3 Inhibierung der Signaltransduktion Die aberrante Aktivierung der MET-Kinase, ob durch Ligandenbindung oder aktivierende Mutationen, führt zu einer ungeregelten Signaltransduktion, wobei das Carboxy-Ende von MET verschiedene Substrate, wie Grb2, Gab1, SHC, STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), SHIP-1 (SH2 containing inositol phosphatase) und SRC binden kann, welche als mögliche Angriffspunkte für eine METInhibition dienen könnten (144). Grb2-Antagonisten inhibieren die Tumorzellmigration in Magenkarzinomzelllinien und die Invasion einer Leiomyosarkomzelllinie, die als in vivo Modell für HGF-abhängige Metastasierung dient (7). 17 Einleitung 1.3.4 Weitere Mechanismen der MET-Inhibition Herunterregulierung der MET Expression: Das Antibiotikum Geldanamycin vermindert die Expression von MET und inhibieren die HGF induzierte Aktivierung der Plasmin-Proteinase (154). Decoy-MET, lösliches, trunkiertes MET kann die Ligandenbindung und die Rezeptordimerisierung und somit die Funktionen von MET in präklinischen Versuchen blockieren (82). 18 Einleitung 1.4 Zielsetzung Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob es klinisch relevante Sarkomentitäten gibt, die eine MET-Amplifikation oder eine Überexpression von MET oder HGF aufweisen. Dies soll dazu dienen Patienten zu identifizieren, die potentiell von einer anti-METoder anti-HGF-Therapie profitieren würden und deshalb in klinische Studien eingeschlossen werden sollten. Zu diesem Zweck wurde eine umfassende Untersuchung der HGF/MET-Achse in Sarkomen des Erwachsenenalters durchgeführt. Es wurden unterschiedliche Methoden verwendet um verschiedene Ebenen des HGF/MET-Signalwegs zu untersucht. Die Auswertungsstrategien, -kriterien und Schwellenwerte wurden wenn möglich aus der aktuellen Literatur entnommen. Auf DNA-Ebene wurde die MET-Genkopienzahl mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung analysiert, die MET-RNA-Expression wurde mit Hilfe der RT-qPCR gemessen und die Proteinexpression des gesamten und des phosphorylierten MET anhand immunhistochemischer Färbungen nachgewiesen. Zur Identifizierung des am besten für die MET-Immunhistochemie geeigneten Antikörpers wurden mehrere kommerziell erhältliche Assays ausgetestet. Weiterhin wurde die HGF-Proteinexpression mit Immunhistochemie untersucht. Anschließend wurden die Ergebnisse der unterschiedlichen Untersuchungen miteinander sowie mit pathologischen und klinischen Parametern korreliert. Aus den Ergebnissen dieser Analysen können hoffentlich Rückschlüsse hinsichtlich einer anti-MET- oder anti-HGFTherapie bei Sarkomen gezogen werden. 19 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Probenkollektiv In dieser Arbeit wurden insgesamt 484 Weichgewebstumoren des Erwachsenenalters aus dem Archiv des GIST und Sarkomregisters Köln/Bonn untersucht. Die Tumorproben wurden zwischen 1992 und 2011 im Institut für Pathologie der Uniklinik Bonn sowie der Uniklinik Köln aufgearbeitet oder im Rahmen konsiliarpathologischer Untersuchungen des Referenzzentrums für Sarkompathologie befundet. Die Diagnosen, die klinischen und pathologischen Angaben wurden dem Befundsystem PathoPro (ifms GmbH, Saarbrücken, Deutschland) des jeweiligen Institutes entnommen. Die Diagnosen wurden von Pathologen mit Erfahrung in der Sarkomdiagnostik gestellt. 2.1.2 Sarkomentitäten Das Studienkollektiv bestand aus Sarkomen 11 verschiedener Subtypen (siehe Tabelle 6) und wurde gezielt so zusammengestellt, dass i) die häufigsten Entitäten (LMS, ALT, DDLS), ii) Entitäten mit bekannten tumorspezifischen genetischen Aberrationen (Translokationen: MLS, CCS; Amplifikationen: ALT, DDLS; aktivierenden Mutationen: GIST) sowie mit komplexen Karyotypen (UPS, MPNST), iii) und Entitäten bei denen MET-Alterationen laut Literaturrecherche eine Rolle spielen könnten (CCS (26), SS (65, 94)) vorhanden waren. 2.1.3 Vorkommen genetischer Veränderungen – unspezifisch und tumorspezifisch Die 484 Tumoren wurden in zwei Kategorien unterteilt, die mit tumorspezifischen und die mit unspezifischen/komplexen genetischen Veränderungen. Zu der ersten Gruppe mit spezifischen Aberrationen gehörten ALT, DDLS, MLS, SS, CCS und GIST. Insgesamt waren dies 304 Fälle. Zu der zweiten Gruppe mit unspezifischen, komplexen Veränderungen gehörten PLS, LMS, ASA, MPNST und UPS mit insgesamt 180 Tumoren. 20 Material und Methoden Tabelle 6: Probenkollektiv Tumortyp Fallzahl atypische lipomatöse Tumoren (ALT) 43 dedifferenzierte Liposarkome (DDLS) 70 myxoide Liposarkome (MLS) 30 pleomorphe Liposarkome (PLS) 10 Leiomyosarkome (LMS) 69 Angiosarkome (ASA) 41 Synovialsarkome (SS) 15 maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNST) 24 undifferenzierte pleomorphe Sarkome (UPS) 36 Klarzellensarkome (CCS – clear cell sarcoma) 13 gastrointestinale Stromatumoren (GIST) 133 Gesamt 484 2.1.4 Tumorgraduierung In diesem Studienkollektiv fanden sich gemäß dem Schema der FNCLCC für die Beurteilung des Malignitätsgrades bei Weichgewebstumoren 60 gut differenzierte (G1), 68 mittelgradig differenzierte (G2) und 176 gering differenzierte (G3) Tumoren (Tabelle 7). 47 Tumoren hatten keine Angaben zum Malignitätsgrad. GIST sind von diesem Beurteilungsschema ausgeschlossen und werden nach Miettinen und Lasota in verschiedene Gruppen nach ihrem Krankheitsprogression- und -rezidivrisiko eingeteilt (Tabelle 5). In diesem Kollektiv sah die Verteilung folgendermaßen aus: siehe Tabelle 8. 2.1.5 Radiogen induzierte Angiosarkome und MYC-Amplifikation Bei neun der 41 untersuchten Angiosarkome war anamnestisch eine Strahlentherapie in der entsprechenden Lokalisation vorausgegangen, so dass hier davon ausgegangen werden konnte, dass es sich um sekundäre, radiogen-induzierte Angiosarkome handelt. Eine FISH-Analyse zum Nachweis einer Amplifikation des MYC-Gens auf Chromosom 8q24 war im Voraus bei 23 der Angiosarkome durchgeführt worden. 7 ASA waren MYC-amplifiziert, 15 MYC-negativ und 1 ASA aus technischen Gründen nicht auswertbar. Alle MYC-amplifizierten ASA gehörten in die Gruppe der strahleninduzierten Tumoren. 21 Material und Methoden Tabelle 7: Verteilung des FNCLCC-Grads in der Sarkomkohorte FNCLCC-Grad Tumortyp n G1 G2 G3 k.A. ALT 43 43 0 0 0 DDLS 70 0 0 70 0 MLS 30 0 30 0 0 PLS 10 0 0 10 0 LMS 69 13 26 22 8 ASA 41 4 5 16 16 SS 15 0 0 15 0 MPNST 24 0 5 6 13 UPS 36 0 0 36 0 CCS 13 0 2 1 10 Gesamt 351 60 68 176 47 Legende: k.A., keine Angabe; n, Anzahl. Das Grading der DDLS wurde aus systematischen Gründen nach dem FNCLCC-Schema vorgenommen, auch wenn von einigen Autoren dem DDLS eher der Grad 2 zugeordnet wird. Tabelle 8: Progressions- und Rezidivrisiko gastrointestinaler Stromatumoren im Studienkollektiv (nach Miettinen) Risiko für eine Tumorprogression Anzahl Ohne nennenswertes Risiko 4 (3,0 %) Sehr geringes Risiko 22 (16,5 %) Geringes Risiko 29 (21,8 %) Moderates Risiko 16 (12,0 %) Hohes Risiko 35 (26,3 %) Klassifikation unbekannt 27 (20,3 %) Gesamt 133 2.1.6 Histologische Typen der Synovialsarkome Die Mehrzahl, 11 Tumoren, der 15 Synovialsarkome wies eine monophasischspindelzellige und 4 Tumoren eine biphasische, gemischt spindelzellige und epitheloide Histologie auf. 22 Material und Methoden 2.2 Methoden 2.2.1 Gewebeblöcke Die in dieser Arbeit untersuchten Tumoren lagen allesamt als Formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes (FFPE) Gewebe vor. Von der Mehrzahl der Tumoren wurden zuvor Multiblöcke, sog. Tissue Microarrays (TMA) hergestellt (Abbildung 4). Dabei wurden aus Paraffinblöcken, sog. Spender- bzw. Donorblöcken, je zwei 1 mm durchmessende und 3-4 mm lange Stanzzylinder von Tumor- und Kontrollgewebe gewonnen. Diese wurden nach einem bestimmten Schema bzw. Lageplan in einen neuen, leeren Paraffinblock, den sog. Empfängerblock, eingebracht. Von dem Empfängerblock können dann wie von jedem anderen Paraffinblock histologische Schnittpräparate hergestellt werden, welche dann sowohl in der Immunhistochemie als auch in der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) verwendet werden können. Die Verwendung von TMA ermöglicht die Untersuchung mehrerer Tumoren auf einem Objektträger und ist somit zeit- und kostengünstiger, da in einem Untersuchungsgang viele Tumoren gleichzeitig bearbeitet und Reagenzien eingespart werden können (63). Da jedoch nicht alle unserer Tumoren als TMA vorlagen wurden von mehreren Fällen, 14 Angiosarkome und alle 13 Klarzellensarkome, konventionelle 4 µm dicke Paraffinschnitten untersucht. Abbildung 4: (A) TMA-Paraffinblöcke, links vor und rechts nach dem Anschneiden; (B) HE-gefärbtes Schnittpräparat eines TMA 23 Material und Methoden 2.2.2 Immunhistochemie Die Immunhistochemie ist eine Methode zum Nachweis bestimmter Antigene in einem histologischen Schnittpräparat. Das zu untersuchenden Antigen wird an einem Epitop durch einen spezifischen Antikörper (Primärantikörper) gebunden. Es gibt zwei Methoden diesen Antigen-/Antikörper-Komplex sichtbar zu machen, entweder ist der Primärantikörper direkt mit einem Enzym oder Fluorophor gekoppelt (direkte Methode) oder ein zweiter Antikörper (Sekundärantikörper), der spezifisch den Antigen-/Primärantikörper-Komplex erkennt, wird eingesetzt und ist mit einem Enzym oder Fluorophor markiert (indirekte Methode Methode). geht mit Diese einer zweite stärkeren Signalintensität einher. Die Färbungen hier wurden nach der indirekten AvidinBiotin-Methode durchgeführt (Abbildung Abbildung 5: Schematische Darstellung 5) (Färbeprotokoll im Anhang 8.1) (16, der Avidin-Biotin-Methode (88) 147). Die gesamten Färbevorgänge wurden unter standardisierten Automatenbedingungen durchgeführt. Die Färbungen wurden in drei Instituten angefertigt, da für die unterschiedlichen Färbungen andere Geräte benutzt werden mussten. Im Institut für Pathologie der Uniklinik Köln, wurden das BrightVision Ultimate Plus System und ein entsprechender Immunostainer (Medac GmbH, Hamburg, Deutschland) verwendet. Weitere Färbungen wurden bei Genentech Inc. (South San Francisco, CA, USA) und bei Targos Molecular GmbH (Kassel, Deutschland) durchgeführt. Dort wurde jeweils ein Färbeautomat Ventana Benchmark XT (Roche Diagnostics, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) mit dem vom Hersteller vorgefertigten Ventana Basic DAB Detection Kit durchgeführt. Die Weichgewebssarkome wurden immunhistochemisch unter Verwendung der AvidinBiotin-Methode bezüglich ihrer Expression von MET, phosphoryliertem MET (phosphoMET) und HGF untersucht (Tabelle 9). Für die MET-Untersuchungen wurden initial in Köln mehrere MET-Antikörper unterschiedlicher Hersteller ausgetestet, bis sich zeigte, dass der polyklonale Kaninchenantikörper von Santa Cruz (MET (C-28: sc-161), Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) (nachfolgend MET-(C-28) genannt) gute Färbeergebnisse lieferte, 24 Material und Methoden wohingegen mit den Antikörpern der Hersteller Novocastra™ (mouse monoclonal antibody c-Met (HGFR), Klon 8F11), Invitrogen™ (mouse anti-c-Met, Klon 3D4) und Acris (monoclonal antibody to HGF receptor paired Thr1003, Klon SP59) keine reproduzierbaren Färbungen erzielt wurden. Spätere Literurrecherchen zeigten, dass ein weiterer anti-MET-Antikörper (CONFIRM anti-Total c-MET (SP44), Rabbit Monoclonal Primary Antibody, Ventana, Tucson, AZ, USA) erhältlich war (60). Für diesen Antikörper lagen Validierungsstudien vor, die die immunhistochemischen Färbeergebnisse mittels Western blot überprüft haben und eine gute Korrelation zwischen beiden Methoden fanden. Auch wurde dieser Antikörper zur Patientenstratifizierung in klinischen Phase 2 und 3 Studien von Onartuzumab (MetMAb) eingesetzt (135, 137). Derartige Daten fehlen für alle anderen gefärbten Antikörper. Daher wurden die Tumoren letztendlich mit den beiden MET-Antikörpern, MET-(C-28) und MET-(SP44) gefärbt, auch um anschließend die Ergebnisse der beiden MET-Antiköper miteinander korrelieren zu können. Der eingesetzte phospho-MET-Antikörper (MET Phospho (pY1349), Epitomics, Burlingame, CA, USA), ein monoklonaler Kaninchenantikörper, der im MET-Protein das phosphorylierte Tyrosin 1349 detektiert. Der Antikörper anti-HGF-α (Zytomed, Berlin, Deutschland) ist ein polyklonaler Kaninchenantikörper und gegen das N-terminale Ende von der HGF-α-Untereinheit gerichtet. Die MET-(SP44)-Färbungen wurden bei Genentech Inc. und Targos Molecular GmbH, alle anderen Färbungen im Institut für Pathologie der Uniklinik Köln hergestellt. Tabelle 9: Antikörper-Liste Antikörper Spezies Verdünnung MET: Klon C-28 Kaninchen 1:100 MET: Klon SP44 Kaninchen p-MET (pY1349) Kaninchen 1:50 HGF-α Kaninchen 1:50 25 PolyVorKontrollgewebe /Monoklonal behandlung polyklonal EDTA Mammakarzinom EDTA Mammakarzinom -Zelllinien monoklonal Citrat Mammakarzinom polyklonal Citrat Dickdarmmukosa ready to use monoklonal Material und Methoden 2.2.2.1 Auswertung der Immunhistochemie Die immunhistochemischen Färbungen wurden an einem Lichtmikroskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen) ausgewertet. Die vier verschiedenen Antikörper wurden alle nach dem gleichen Schema beurteilt. Es handelte sich dabei um ein vierstufiges System, welches einer leichten Abwandlung des Auswerteschemas von Koeppen entsprach(60), angewendet in der Validierungsstudie des auch hier verwendeten CONFIRM anti-Total c-MET (SP44)-Antikörpers (Ventana). Grad 0 (keine): keine Färbung oder Färbereaktionen aller Intensitäten in < 10 % der Tumorzellen Grad 1 (schwach): schwache Färbung in ≥ 10 % der Tumorzellen Grad 2 (mäßig): mäßige/mittelgradige Färbung in ≥ 10 % der Tumorzellen Grad 3 (stark): starke Färbung in ≥ 10 % der Tumorzellen. Als immunhistochemisch positiv wurden ausschließlich Fälle mit einer mittelgradigen (Grad 2) oder starken (Grad 3) zytoplasmatischen und/oder membranären Immunreaktion gewertet. Die Bedeutung der schwachen Immunfärbung (Grad 1) ist bislang noch unklar, deshalb wurden sie hier zusammen mit Grad 0 als negativ gewertet. Fälle galten als nicht auswertbar wenn das Gewebe abgeschwommen, ausschließlich nekrotisches oder kein eindeutiges Tumorgewebe vorhanden war. 2.2.3 Fluoreszenz in situ Hybridisierung Bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung handelt es sich um eine Methode zur Darstellung von DNA direkt auf einem histologischen Schnittpräparat, also in situ (24). Durch spezielle Vorbehandlungen wird die in dem Gewebe enthaltene Nukleinsäure denaturiert, sodass die tertiären Strukturen aufgebrochen werden und die DNA in Einzelsträngen vorliegt. Abbildung 6: Schematische Darstellung Eine der FISH (52) künstlich einzelsträngige hergestellte, ebenfalls Nukleinsäuresequenz (Sonde), markiert mit einem Fluoreszenzfarbstoff, bindet an die einzelsträngige, komplementäre Nukleinsäuren (Zielsequenz) im Gewebe, sog. Hybridisierung (Abbildung 6). Mit dieser Methode lassen sich numerische (Aneuploidie) und strukturelle Chromosomenaberrationen (z.B. Translokation, Fusion) sowie Lokus-spezifische Veränderungen (Genamplifikation, 26 Material und Methoden Gendeletion) nachweisen. Meist sind die kommerziell erhältlichen Sonden zweifarbig, eine der Sonden markiert das Zielgen, die andere dient als Referenzsonde und bindet an eine stabile Region, z.B. im Bereich des Zentromers. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops, ausgestattet mit unterschiedlichen Filtern, sichtbar gemacht. In dieser Arbeit wurde für die FISH die kommerziell erhältliche Sonde ZytoLight SPEC MET/CEN 7 Dual Color Probe (ZytoVision, Bremerhaven, Deutschland) verwendet (FISH Protokoll im Anhang 8.2). Sie ist eine zweifarbige Lokus-spezifische Sonde zur Detektion des MET-Gens auf Chromosom 7q31 und der alpha-Satelliten Region des Zentromers von Chromosom 7. Die MET-Sonden sind mit einem grünen, die Zentromer-Sonden mit einem orangenen Fluorochrom markiert. Mit Hilfe dieser Sonden können die Anzahlen der Genkopien von MET und Zentromer 7 (CEN 7) ermittelt werden wobei gleichzeitig das Verhältnis von MET zu CEN 7 bestimmt werden kann, die Ratio. In einem normalen, disomen Interphasenukleus findet man zwei grün und zwei orange Signale. Monosome Zellen besitzen nur ein CEN 7-Signal. Bei einem polyploiden Chromosomensatz liegen mindestens drei CEN 7-Signale vor. Veränderungen in der Anzahl der MET-Signale werden als Genverlust oder -gewinn bezeichnet. 2.2.3.1 FISH Auswertung Die Auswertung der FISH wurde an einem Epifluoreszenz-Mikroskop (DM5500 B TL (BF) + Fluo Mikroskop, Leica, Wetzlar, Deutschland) unter Verwendung der Filter grün (S-Green), orange (S-Orange), DAPI (A4) und einem grün/orange Mischfilter (FI/RH) mit einem 63x bzw. einem 100x Objektiv durchgeführt. Pro Tumor wurden in drei verschiedenen Tumorarealen in je 20 Interphasezellkernen, also insgesamt 60 Zellkernen, die grünen MET-Signale und orangenen CEN 7-Signale gezählt. Das Beurteilungsschema bestand aus vier Kategorien, basierend auf dem System das Schildhaus einer MET-FISH-Analyse von Lungenkarzinomen angewendet haben (124). Dieses Graduierungssystem verwendet allgemein anerkannte Positivitätskriterien, die bei den FISH-Analysen anderer Gene, wie Her2 (159), FGFR1 (123) und EGFR (151), Anwendung finden. Die vier Kategorien wurden wie folgt definiert: i. Hohes Amplifikationslevel wurde definiert als a. MET/CEN 7 Ratio ≥ 2,0 oder b. eine durchschnittliche MET-Genkopienzahl pro Zelle von ≥ 6,0 oder c. ≥ 10 % der Tumorzellen haben ≥ 15 MET-Signale. 27 Material und Methoden ii. Mittelgradiges MET-Level wurde definiert als a. ≥ 50% der Zellen haben ≥ 5 MET-Signale und b. die Kriterien für ein hohes Amplifikationslevel sind nicht erfüllt iii. Niedriges MET-Level wurde definiert als a. ≥ 40 % der Tumorzellen haben ≥ 4 MET-Signale und b. die Kriterien für ein hohes Amplifikationslevel oder ein mittelgradiges MET-Level sind nicht erfüllt iv. Alle anderen Tumoren wurden als negativ klassifiziert. 2.2.4 Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion Zum Nachweise der quantitativen Expression eines bestimmten Gens wird die entsprechende mRNA mittels einer reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion quantifizieren. Zunächst wird dazu aus dem zu untersuchenden Gewebe und aus Kontrollgewebe die Gesamt-RNA extrahiert. Da in der PCR DNA- Polymerasen zur Amplifikation eingesetzt werden muss zunächst eine reverse Transkription der RNA in cDNA erfolgen. Dabei synthetisiert eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, sog. reverse Transkriptase, aus RNA cDNA. Dies kann mit unspezifischen Primern für die Gesamt-RNA oder Primern für nur mit spezifischen ausgewählte Gene erfolgen. Die cDNA dient dann als Template für die RT-qPCR (14). Eine Möglichkeit die cDNA-Menge zu messen Abbildung 7: Taq-Man-Sondendesign (6) ist der Einsatz von „Taq-Man“- oder Hydrolyse-Sonden. Diese „Taq-Man“-Sonden lagern sich während der Anlagerungsphase hinter den genspezifischen PCR-Primer an. Sie sind so aufgebaut, dass sie an ihrem einen Ende ein Reporter-Fluorochrom und am anderen Ende ein 28 Material und Methoden Akzeptor-Fluorochrom, auch Quencher genannt, tragen. Ist die Sonde intakt, wird aufgrund der räumlichen Nähe des Reporters zum Quencher bei Anregung der Fluoreszenz mit einer spezifischen Wellenlänge die Fluoreszenz des Reporters durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) unterdrückt. Während der PCR wird die Sonde von der Polymerase verdrängt und hydrolysiert, wodurch sich Reporter und Quencher voneinander entfernen und die Reporterfluoreszenz messbar wird (siehe Abbildung 7). Daher steigt die Fluoreszenz proportional zu der Menge des RTqPCR-Produkts an (45). In dieser Arbeit wurde die mRNA-Menge von MET mit der der Referenzgene IPO8 und PPIA verglichen. Referenzgene gelten allgemein als ubiquitär vorkommend und konstant expremiert, unabhängig vom Gewebetyp, da sie keinen regulatorischen Einflüssen unterliegen. Die Spezifität der Primer für das jeweilige Gen wurde zuvor mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) überprüft (2). Mit der Online-Datenbank Ensemble wurde kontrolliert, dass die Primersequenz für jedes Gen das Intron überspannt, damit keine genomische, sondern ausschließlich cDNA amplifiziert wird (11). Die RT-qPCR wurde nur an ausgewählten Tumorentitäten nach den Protokollangaben des Herstellers durchgeführt (Protokoll der RNA-Extraktion im Anhang 8.3). Aus der Gruppe der DDLS, LMS, ASA und MPNST wurden einige Tumoren mit folgenden Befundkonstellationen in der MET-Immunhistochemie und FISH ausgewählt und eine RT-qPCR durchgeführt. Befundkonstellationen (siehe auch Tabelle 10): MET-FISH-positiv, MET-(C-28)-positiv, MET-(SP44)-positiv MET-FISH-positiv, MET-(C-28)-positiv, MET-(SP44)-negativ MET-FISH-positiv, MET-(C-28)-negativ, MET-(SP44)-positiv MET-FISH-positiv, MET-(C-28)-negativ, MET-(SP44) nicht auswertbar MET-FISH-negativ, MET-(C-28)-positiv, MET-(SP44)-positiv MET-FISH-negativ, MET-(C-28)-negativ, MET-(SP44)-positiv MET-FISH-negativ, MET-(C-28)-positiv, MET-(SP44)-negativ MET-FISH-negativ, MET-(C-28)-negativ, MET-(SP44)-negativ MET-FISH-negativ, MET-(C-28)-negativ, MET-(SP44) nicht auswertbar Als Kontrolle wurde FFPE-Gewebe von pathologisch unauffälliger Kolonwand gewählt. 29 Material und Methoden 2.2.4.1 Quantitative Nukleinsäureanalyse Mit dem NanoDrop®-ND-1000-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies, Erlangen, Deutschland) wurde nach Abschluss der RNA-Extraktion die Konzentration der Gesamt-RNA in 1 μl der gewonnen Flüssigkeit gemessen. Tabelle 10: Proben für RT-qPCR Befundkonstellationen für FISH und Immunhistochemie MET-FISH-positiv/ MET-(C-28)-positive/MET-(SP44)-positiv MET-FISH-positiv/ MET-(C-28)-positive/MET-(SP44)-negativ MET-FISH-positiv/ MET-(C-28)-negativ/MET-(SP44)-negativ MET-FISH-positiv/ MET-(C-28)-negativ/MET-(SP44) na MET-FISH-negativ/ MET-(C-28)-positiv/MET-(SP44)-negativ MET-FISH-negativ/ MET-(C-28)-negative/MET-(SP44)-positiv MET-FISH-negativ/ MET-(C-28)-negative/MET-(SP44)-negativ MET-FISH-negativ/ MET-(C-28)-negative/MET-(SP44) na Gesamt 2.2.4.2 Tumorentität DDLS LMS ASA MPNST 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 3 4 2 4 0 0 2 0 11 10 8 14 0 0 10 0 16 15 26 18 Protokoll für Reverse Transkription (cDNA-Synthese) Von jeder RNA-Probe wurde zweimal, an unterschiedlichen Tagen, cDNA synthetisiert (+RT). Die cDNA-Synthese aus den zuvor extrahierten RNA-Proben wurde mit Hilfe des High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems) wie unten beschrieben durchgeführt, siehe Tabelle 11. Von jeder Tumorprobe wurden 500 ng RNA eingesetzt. Für jede einzelne Probe musste das Volumen errechnet werden, welches 500 ng RNA enthielt. Die Reagenzien, RT Puffer und RT Enzymmix, wurden auf Eis aufgetaut und anschließend 15 Sek. bei 8.000 Umdrehungen/Minute (rpm) zentrifugieren. Als negative Kontrolle (-RT) wurde ein Ansatz ohne RT Enzymmix hergestellt. 30 Material und Methoden Tabelle 11: Ansatz eines 20 µl Reaktionsgemischs für cDNA-Synthese Volumen/Reaktion (µl) Komponenten + RT - RT 2xRT Puffer 10,0 10,0 20x RT Enzymmix 1,0 - RNA-Probe Volumen entsprechend 500 ng RNA Volumen entsprechend 500 ng RNA Nuklease-freies H2O auf 20 µl auffüllen auf 20 µl auffüllen Gesamtvolumen/Reaktion 20,0 20,0 Die reverse Transkription erfolgt im Thermocycler t3000 (Biometra, Göttingen, Deutschland) in drei Schritten: 60 Min. bei 37 °C 5 Min. bei 95 °C Abkühlen auf 10 °C Die Proben wurden bei -80 °C gelagert. 2.2.4.3 Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion Die reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion wurde mit dem TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) in dem Roche LightCycler 480 System mit der dazugehörigen Software Roche LightCycler 480 Basic Sofware, Version 1.5 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Es wurden 96-well Platten (Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white) mit jeweils 20 µl Ansätzen pro Vertiefung verwendet. Auf jeder Platte fanden sich 14 Tumorproben und zur Kontrolle eine Probe mit Nuklease-freiem H2O statt einer cDNA-Probe und eine -RT-Kontrolle aus der cDNA-Synthese, bei der keine cDNA synthetisiert wurde (Tabelle 12). Für jede Probe wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Das MET-Gen jeder Probe wurde mit den Referenzgenen IPO8 und PPIA verglichen. In Voruntersuchungen der Arbeitsgruppe hatte sich gezeigt, dass diese Gene – unter mehreren getesteten Kandidaten – eine besonders stabile Expression in mesenchymalen Tumoren und im Referenzgewebe 31 Material und Methoden aufweisen. Bei den drei verwendeten TaqMan-Sonden handelte es sich um 20 x TaqMan® Gene Expression Assay für MET, IPO8 und PPIA. Tabelle 12: RT-qPCR Belegungsplan einer Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96 MET IPO8 PPIA MET IPO8 PPIA MET IPO8 PPIA MET IPO8 PPIA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA1 A MET-1 DNA1 IPO8-1 DNA1 PPIA-1 DNA2 MET-1 DNA2 IPO8-1 DNA2 PPIA-1 DNA3 MET-1 DNA3 IPO8-1 DNA3 PPIA-1 DNA4 MET-1 DNA4 IPO8-1 DNA4 PPIA-1 DNA1 B MET-2 DNA1 IPO8-2 DNA1 PPIA-2 DNA2 MET-2 DNA2 IPO8-2 DNA2 PPIA-2 DNA3 MET-2 DNA3 IPO8-2 DNA3 PPIA-2 DNA4 MET-2 DNA4 IPO8-2 DNA4 PPIA-2 DNA5 C MET-1 DNA5 IPO8-1 DNA5 PPIA-1 DNA6 MET-1 DNA6 IPO8-1 DNA6 PPIA-1 DNA7 MET-1 DNA7 IPO8-1 DNA7 PPIA-1 DNA8 MET-1 DNA8 IPO8-1 DNA8 PPIA-1 D DNA5 MET-2 DNA5 IPO8-2 DNA5 PPIA-2 DNA6 MET-2 DNA6 IPO8-2 DNA6 PPIA-2 DNA7 MET-2 DNA7 IPO8-2 DNA7 PPIA-2 DNA8 MET-2 DNA8 IPO8-2 DNA8 PPIA-2 E DNA9 MET-1 DNA9 IPO8-1 DNA9 PPIA-1 DNA10 MET-1 DNA10 IPO8-1 DNA10 PPIA-1 DNA11 MET-1 DNA11 IPO8-1 DNA11 PPIA-1 DNA12 MET-1 DNA12 IPO8-1 DNA12 PPIA-1 F DNA9 MET-2 DNA9 IPO8-2 DNA9 PPIA-2 DNA10 MET-2 DNA10 IPO8-2 DNA10 PPIA-2 DNA11 MET-2 DNA11 IPO8-2 DNA11 PPIA-2 DNA12 MET-2 DNA12 DNA12 IPO8-2 PPIA-2 DNA13 G MET-1 DNA13 IPO8-1 DNA13 PPIA-1 DNA14 DNA14 MET-1 IPO8-1 DNA14 PPIA-1 -RT-1 MET-1 -RT-1 IPO8-1 -RT-1 PPIA-1 H2O MET-1 H2O IPO8-1 H2O PPIA-1 DNA13 H MET-2 DNA13 IPO8-2 DNA13 PPIA-2 DNA14 MET-2 DNA14 PPIA-2 -RT-1 MET-2 -RT-1 IPO8-2 -RT-1 PPIA-2 H2O MET-2 H2O IPO8-2 H2O PPIA-2 DNA14 IPO8-2 Legende: -RT: Negativkontrolle der RNA-Extraktion, ohne RNA. Die Ansätze wurden wir folgt hergestellt: Poolen der beiden cDNA-Proben jeder zu untersuchenden Probe 10 µl der gepoolten cDNA-Probe mit 20 µl Nuklease-freiem H2O verdünnen Herstellung des Reaktionsgemischs für die RT-qPCR (siehe Tabelle 13) Tabelle 13: Ansatz eines 20 µl Reaktionsgemischs für RT-qPCR PCR Reaktionsmix Volumen pro 20 µl Reaktion (µl) 1 Reaktion 20x TaqMan® Gene Expression Assay 1,0 2x TaqMan® Gene Expression Master Mix 10,0 cDNA-Probe 4,0 Nuklease-freies H2O 5,0 . 32 Material und Methoden Herstellen eines Ansatzes für jeden der drei 20 x TaqMan® Gene Expression Assays (MET, IPO8, PPIA) mit 2 x TaqMan® Gene Expression Master Mix und Nuklease-freiem Wasser für 20 Proben, cDNA wird in einem separaten Schritt hinzugefügt Durchmischen des Ansatzes Pipettieren von 16 µl der zuvor beschriebenen Ansätze ohne cDNA in Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white nach dem Belegplan Anschließend Zugabe von 4 µl der entsprechenden cDNA Verschließen der Platten mit einer Folie Zentrifugieren in einer Plattenzentrifuge Einsetzen der Platte in das Roche LightCycler 480 Gerät Programmieren des Experiments mit der Roche LightCycler 480 Basic Software, Version 1.5 (Tabelle 14) Tabelle 14: RT-qPCR-Programm Schritt Temperatur (°C) Dauer (Min:Sek) Anzahl der Zyklen Programmstart 50 02:00 1 DNA-PolymeraseAktivierung 95 10:00 1 Denaturierung 95 00:15 50 Anlagerung/Extension Quantifizierung 60 01:00 50 Roche LightCycler 480 Basic Software, Version 1.5 liefert am Ende der RT-qPCR für jede Probe die Zykluszahl an der das Fluoreszenzsignal der Probe aus dem Hintergrundrauschen heraustritt, daher werden diese Werte crossing points oder CP-Werte genannt. Der CP-Wert einer Probe korreliert umgekehrt proportional zur Konzentration der enthaltenen cDNA und ist abhängig von der PCR-Effizienz, diese wird hier bei 1,8 angenommen. Die Software hat zwei Methoden der CP-WertBerechnung. Hier wurde die Abs Quant/2nd Derivative Max-Methode gewählt. Die Auswertung der CP-Werte erfolgt mit Hilfe des Relative expression software tool (REST). Die CP-Werte für MET wurden gegen die der Referenzgene normalisiert. Die Software errechnet dann die relative Expression des MET-Gens im Tumorgewebe im Verhältnis zum Kontrollgewebe (ΔCTKontrolle-Tumorprobe) (104). 33 Ergebnisse 3 Ergebnisse 484 Sarkome 11 verschiedener Sarkomentitäten wurden immunhistochemisch auf ihre MET-, phospho-MET- und HGF-Expression sowie mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung auf ihre MET-Genkopienzahl untersucht. Die MET-Immunhistochemie wurde mit zwei verschiedenen Antikörpern durchgeführt. In einigen ausgewählten Tumoren wurde durch eine RT-qPCR eine quantitative MET-RNA-Bestimmung durchgeführt. 3.1 Immunhistochemische Expressionsmuster 3.1.1 MET-Immunhistochemie des Ventana SP44 Antikörpers 413 Tumoren aus dem Gesamtkollektiv von 484 Tumoren konnten mit dem Ventana SP44 MET-Antikörper gefärbt werden. Auswertbar waren 388 Färbungen (Tabelle 15). Insgesamt positiv waren 10 Sarkome (3 %), die eine mittelgradige Färbeintensität (Grad 2) aufwiesen. Eine starke Färbung war in keinem Tumor nachweisbar. Die Grad 3-Färbeintensität wurde an einer Zelllinie, die als Kontrollgewebe diente, definiert (Abbildung 8 und Abbildung 9). Diese 10 positiven Fälle fanden sich ausschließlich in den Entitäten der Angiosarkome und undifferenzierten pleomorphen Sarkome. Keine andere Entität wies positive Fälle auf (Abbildung 10). Die Angiosarkome waren in 5/29 Tumoren (17 %) und die undifferenzierten pleomorphen Sarkome in 5/36 Tumoren (14 %) positiv. Die 378 MET-negativen Tumoren zeigten in 20 Fällen eine schwache Färbung (Grad 1) und in 358 Fällen keine Färbung (Grad 0). Grad 1-Färbungen fand sich in den Entitäten DDLS (3/70), LMS (2/69), ASA (5/29), SS (1/14), MPNST (3/24) und UPS (6/36). Komplett negativ waren ALT, MLS, PLS und GIST. Abbildung 8: Laufkontrollen der MET-(SP44)-Immunhistochemie verschiedener Färbeintensitäten an Mammakarzinomzelllinien. 34 Ergebnisse Abbildung 9: Kontrollen MET-(SP44)-Immunhistochemie. On-slide Kontrollen der MET-(SP44)-Immunhistochemie. (A) MET-(SP44)-positives Gefäßendothel als interne Kontrolle. (B) MET-(SP44)-positives Kolonkarzinom als externe on-slide Kontrolle. Abbildung 10: Immunhistochemische Färbeintensitäten von MET-(SP44) in verschiedenen Sarkomen (A-F) (126). (A, B) Grad 0, (C, D) Grad 1, (E, F) Grad 2. Undifferenzierte pleomorphe Sarkome (A, C), Angiosarkome (B, D, E, F). 35 Ergebnisse Tabelle 15: MET-Immunhistochemie des Ventana SP44 Antikörpers MET-(SP44)-Färbeintensität Tumorsubtyp Anzahl der Fälle Grad 0 Grad 1 Grad 2 n.a. ALT 43 42 0 0 1 DDLS 70 65 3 0 2 MLS 30 21 0 0 9 PLS 10 10 0 0 0 LMS 69 67 2 0 0 ASA 41 19 5 5 12 SS 15 13 1 0 1 MPNST 24 21 3 0 0 UPS 36 25 6 5 0 CCS 13 0 0 0 13 GIST 133 75 0 0 58 Gesamt 484 358 20 10 96 Legende: n.a., nicht auswertbar. 3.1.2 MET-Immunhistochemie des Santa Cruz C-28 Antikörpers Von den untersuchten 484 Sarkomen waren in der MET-(C-28)-Immunhistochemie 472 Tumoren auswertbar. Färbekontrollen wurden mitgeführt (Abbildung 11). 7 % der Sarkome (34/472) waren immunhistochemisch MET-positiv und 93 % (438/472) negativ. 65 Tumoren wiesen eine schwache bis mäßige nukleäre Färbung auf, diese wurde jedoch nicht als positiv beurteilt. Die genaue Verteilung der Färbungen entsprechend der Entitäten findet sich in Tabelle 16. Von den 34 positiven Fällen zeigte ein Tumor eine starke (Grad 3) und 33 Tumoren eine mäßige (Grad 2) MET-(C-28)-Expression (Abbildung 12). Besonders auffällig war die Häufigkeit der positiven MET-(C-28)-Färbungen in den Entitäten Synovialsarkome in 20 % (3/15), Angiosarkome 17 % (7/41) und MPNST 17 % (4/24). Auch wiesen Leiomyosarkome in 9 % (6/69), GIST in 8 % (10/128) und dedifferenzierte Liposarkome in 6 % (4/70) positive MET-Färbung auf. Von den 438 negativen Fällen zeigten 90 Sarkome eine schwache (Grad 1) und 348 Sarkome keine (Grad 0) Färbung. 36 Ergebnisse Abbildung 11: Kontrollen MET-(C-28)-Immunhistochemie. On-slide Kontrollen der MET-(C-28)-Immunhistochemie. (A) MET-(C-28)-positives Drüsengewebe als interne Kontrolle. (B) MET-(C-28)-positives Mammakarzinom als externe on-slide Kontrolle. Abbildung 12: Immunhistochemische Färbeintensität von MET-(C-28) in verschiedenen Sarkomen (A-H). (A, B) Grad 0, (C, D) Grad 1, (E, F) Grad 2, (G, H) Grad 3. Leiomyosarkome (A, C, G, H) und Angiosarkome (B, D, E, F). 37 Ergebnisse Tabelle 16: MET-Immunhistochemie des Santa Cruz C-28 Antikörpers MET-(C-28)-Färbeintensität Tumorsubtyp Anzahl der Fälle Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 3 n.a. ALT 43 42 1 0 0 0 DDLS 70 57 9 4 0 0 MLS 30 23 0 0 0 7 PLS 10 6 4 0 0 0 LMS 69 50 13 5 1 0 ASA 41 24 10 7 0 0 SS 15 10 2 3 0 0 MPNST 24 10 10 4 0 0 UPS 36 26 10 0 0 0 CCS 13 11 2 0 0 0 GIST 133 89 29 10 0 5 Gesamt 484 348 90 33 1 12 Legende: n.a., nicht auswertbar. 3.1.3 Phospho-MET-Immunhistochemie Von 484 untersuchten Sarkomen waren in der phospho-MET-Immunhistochemie 23 Fälle nicht auswertbar. Kontrollgewebe wurden mitgeführt (Abbildung 13). Von den 461 analysierbaren Proben waren 50 (11 %) positiv für phospho-MET. Hiervon zeigen 10 Tumoren eine starke (Grad 3) und 40 eine mäßige (Grad 2) Färbereaktion, siehe auch Tabelle 17 und Abbildung 14. Von den 411 negativen Fällen zeigen 71 eine schwache und 340 keine phospho-MET Färbung. Besonders häufig waren phospho-MET-positive Fälle bei Angiosarkomen mit einer Positivitätsrate von 42 % (17/41) und Klarzellensarkome mit 39 % (5/13) zu finden. Seltener wiesen auch andere Entitäten positive Fälle auf: MPNST 21 % (5/24), PLS 20 % (2/10), UPS 14 % (5/36), LMS 10 % (7/68), DDLS 9 % (6/66) und GIST 2 % (3/129). 38 Ergebnisse Abbildung 13: Kontrollen phospho-MET-Immunhistochemie. On-slide Kontrollen der phospho-MET-Immunhistochemie. (A) Phospho-MET-positives Gefäßendothel als interne Kontrolle. (B) Phospho-MET-positives Mammakarzinom als externe on-slide Kontrolle. Abbildung 14: Immunhistochemische Färbeintensitäten von phospho-MET in verschiedenen Sarkomen (A-H). (A, B) Grad 0, (C, D) Grad 1, (E, F) Grad 2, (G, H) Grad 3. Undifferenziertes pleomorphes Sarkom (A, E, F), Angiosarkom (B, C, D, G, H). 39 Ergebnisse Tabelle 17: Phospho-MET-Immunhistochemie Phospho-MET Färbeintensität Tumorsubtyp Anzahl der Fälle Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 3 n.a. ALT 43 36 0 0 0 7 DDLS 70 53 7 6 0 4 MLS 30 19 4 0 0 7 PLS 10 8 0 2 0 0 LMS 69 46 15 7 0 1 ASA 41 19 5 11 6 0 SS 15 10 5 0 0 0 MPNST 24 18 1 3 2 0 UPS 36 23 8 4 1 0 CCS 13 2 6 4 1 0 GIST 133 106 20 3 0 4 Gesamt 484 340 71 40 10 23 Legende: n.a., nicht auswertbar. 3.1.4 HGF-Immunhistochemie Von den 484 Sarkomen die gegen den MET-Liganden HGF gefärbt wurden waren 466 Fälle auswertbar, in 18 Fällen war eine Auswertung nicht möglich. Kontrollfärbungen wurden mitgeführt (Abbildung 15). 6% aller Sarkome (29/466) waren immunhistochemisch positiv für HGF, sämtlich mit einer mäßigen (Grad 2) Färbeintensität, siehe auch Tabelle 18 und Abbildung 17. Eine Grad 3-Färbung wurden nicht in Tumor- sondern ausschließlich im Kontrollgewebe eines Mammakarzinoms gesehen (Abbildung 16). Von den 437 negativen Tumoren zeigen 112 eine schwache (Grad 1) und 325 Fälle keine Reaktion (Grad 0). Überwiegend ließ sich eine zytoplasmatische, in 36 Fällen auch eine schwache bis starke nukleäre Färbung nachweisen. Besonders häufig waren HGF-positive Fälle bei den undifferenzierten pleomorphen Sarkomen 33 % (12/36), Angiosarkomen 15 % (6/39), Klarzellensarkomen 15 % (2/13), malignen peripheren Nervenscheidentumoren 13 % (3/24). Weiterhin waren 7 % der Leiomyosarkome (5/68) und ein gastrointestinaler Stromatumor (1 %, 1/126) HGF-positiv. Ausschließlich negative Fälle fanden sich in den ALT, DDLS, PLS, MLS und Synovialsarkomen. Die Färbungen der konventionellen Paraffinschnitte der Angiosarkome und Klarzellensarkome waren in 85 % der Fälle homogen mit ebenmäßigem Immunscore in allen Tumorzellen. 40 Ergebnisse Abbildung 15: Kontrollen HGF-Immunhistochemie. On-slide Kontrollen der HGFImmunhistochemie. (A) HGF-positives Drüsengewebe als interne Kontrolle. (B) HGFpositives Kolonkarzinom als externe on-slide Kontrolle. Abbildung 16: HGF-Immunhistochemie Grad 3-Kontrolle. Mammakarzinom der onslide Kontrolle mit Grad 3-Färbeintensität. 41 Ergebnisse Abbildung 17: Immunhistochemische Färbeintensitäten von HGF in verschiedenen Sarkomen (A-F) (126). (A, B) Grad 0, (C, D) Grad 1, (E, F) Grad 2. Leiomyosarkome (A, D, F), dedifferenziertes Liposarkom (B), Angiosarkom (C), undifferenziertes pleomorphes Sarkom (E). Tabelle 18: HGF-Immunhistochemie HGF-Färbeintensität Tumorsubtyp Anzahl der Fälle Grad 0 Grad 1 Grad 2 n.a. ALT 43 42 0 0 1 DDLS 70 61 9 0 0 MLS 30 22 0 0 8 PLS 10 10 0 0 0 LMS 69 35 28 5 1 ASA 41 22 11 6 2 SS 15 9 6 0 0 MPNST 24 12 9 3 0 UPS 36 8 16 12 0 CCS 13 1 10 2 0 GIST 133 103 23 1 6 Gesamt 484 325 112 29 18 Legende: n.a., nicht auswertbar. 42 Ergebnisse 3.2 Korrelation der Ergebnisse der verschiedenen immunhistochemischen Marker 3.2.1 Korrelation der beiden MET-Antikörper SP44 (Ventana) und C-28 (Santa Cruz Biotechnologies) Insgesamt wurden 413 Sarkome 10 verschiedener Entitäten mit den beiden verschiedenen MET-Antikörpern, SP44 (Ventana) und C-28 (Santa Cruz Biotechnologies) gefärbt. Von den Klarzellensarkomen, 12 Angiosarkomen und 46 GIST war kein Gewebe mehr für die MET-(SP44)-Färbung verfügbar. Von den 413 gefärbten Sarkomen waren 388 für beide Marker auswertbar. Mit dem SP44-Antikörper waren 10 dieser Tumoren MET-positiv, mit dem C-28-Antikörper 28 Tumoren (Tabelle 19). Jedoch waren nur 3 Tumoren in beiden Färbungen positiv, alle den Angiosarkomen zugehörig. 353 Tumoren waren mit beiden Markern negativ. Die Korrelation war statistisch signifikant, p = 0,019 (Chi-Quadrat nach Pearson). Tabelle 19: Korrelation SP44- und C-28-MET-Antikörper MET-(SP44)-Immunhistochemie MET-(C-28)Immunhistochemie Negativ Positiv Positiv Gesamt Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 0 269 10 6 285 Grad 1 66 8 1 75 Grad 2 22 2 3 27 Grad 3 1 0 0 1 358 20 10 388 Gesamt 3.2.2 Negativ Korrelation der MET-(SP44)- und phospho-MET-Immunhistochemie Von 413 gegen MET-(SP44)- und phospho-MET gefärbten Tumoren waren 376 Fälle auswertbar. Eine Negativität beider Färbungen lag in 330 Fällen (88 %) vor. Zwei Sarkome zeigten eine Koexpression von MET-(SP44)- und phospho-MET, beides Angiosarkome. Die Korrelation zwischen den Immungraden (Grad 0-3) war statistisch signifikant, p < 0,001 (Chi-Quadrat nach Pearson), zwischen den Klassifizierungen positive und negative immunhistochemische Ergebnisse lag jedoch keine signifikante Korrelation vor (p = 0,293, Chi-Quadrat; p = 0,268, exakter Test nach Fisher) (Tabelle 20). 43 Ergebnisse Tabelle 20: Korrelation der MET-(SP44)- und phospho-MET-Immunhistochemie MET-(SP44)-Immunhistochemie Phospho-METImmunhistochemie Negativ Positiv Positiv Gesamt Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 0 266 7 5 278 Grad 1 52 5 3 60 Grad 2 24 5 2 31 Grad 3 5 2 0 7 347 19 10 376 Gesamt 3.2.3 Negativ Korrelation der MET-(SP44)- und HGF-Immunhistochemie 382 der 413 gegen MET-(SP44) und HGF gefärbten Sarkome waren analysierbar. 373 Fälle (98 %) waren für beide Marker negativ. 6 Sarkome (1,6 %) zeigten eine Koexpression von MET-(SP44) und HGF (Tabelle 21). Dies war in 3/5 MET-(SP44)positiven undifferenzierten pleomorphen Sarkomen und 3/4 MET-(SP44)-positiven Angiosarkomen der Fall. Statistisch war die Korrelation zwischen der MET-(SP44)- und HGF-Immunhistochemie signifikant, p < 0,001 (Chi-Quadrat nach Pearson). Tabelle 21: Korrelation der MET-(SP44)- und HGF-Immunhistochemie MET-(SP44)-Immunhistochemie HGFImmunhistochemie Negativ Positiv Positiv Gesamt Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 0 262 9 0 271 Grad 1 77 4 3 84 Grad 2 15 6 6 27 354 19 9 382 Gesamt 3.2.4 Negativ Korrelation der MET-(C-28)- und phospho-MET-Immunhistochemie In Tabelle 22 ist die Korrelation der MET-(C-28)- und phospho-MET-Immunhistochemie dargestellt. Die Färbungen beider Antikörper waren in 458 Tumoren der insgesamt 484 gefärbten Sarkome auswertbar. Eine Negativität für beide Antikörper zeigte sich in 378 (83 %) Tumoren. Von den 458 Tumoren waren insgesamt drei Sarkome positiv für beide Marker. Diese drei Sarkome mit einer Koexpression von MET-(C-28) und phospho-MET stammen aus zwei verschiedenen Entitäten, ASA (2/41) und MPNST (1/24). Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der MET-(C-28)- und phosphoMET-Expression gab es nicht, p = 0,771 (Chi-Quadrat nach Pearson). 44 Ergebnisse Tabelle 22: Korrelation C-28-MET- und phospho-MET-Antikörper MET-(C-28)-Immunhistochemie Phospho-METImmunhistochemie Negativ Positiv Positiv Gesamt Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 3 Grad 0 254 58 24 1 337 Grad 1 47 19 5 0 71 Grad 2 28 10 2 0 40 Grad 3 6 3 1 0 10 335 90 32 1 458 Gesamt 3.2.5 Negativ Korrelation der MET-(C-28)- und HGF-Immunhistochemie Die Analysen der MET-(C-28)- und HGF-Immunhistochemie konnten erfolgreich in 465 der 484 Sarkome durchgeführt werden, siehe Tabelle 23. Der überwiegende Teil der Tumoren (406/460, 87 %) war MET-(C-28)- und HGF-negativ. Drei Tumoren zeigen eine Positivität beider Antigene. Die drei Sarkome mit einer Koexpression von MET(C-28) und HGF stammten aus zwei verschiedenen Entitäten, ASA (2/39) und GIST (1/127). Die Korrelation war zwischen den Immungraden (Grad 0-3) statistisch signifikant, p < 0,001 (Chi-Quadrat nach Pearson), zwischen positiven und negativen Ergebnissen nicht signifikant (p = 0,482, Chi-Quadrat; p = 0,450, exakter Test nach Fisher). Tabelle 23: Korrelation der MET-(C-28)- und HGF-Immunhistochemie MET-(C-28)-Immunhistochemie HGFImmunhistochemie Negativ Positiv Positiv Gesamt Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 3 Grad 0 260 49 14 1 324 Grad 1 66 31 15 0 112 Grad 2 17 9 3 0 29 343 89 32 1 465 Gesamt 3.2.6 Negativ Korrelation der phospho-MET- und HGF-Immunhistochemie Von 484 Tumoren waren in der phospho-MET- und HGF-Immunhistochemie 455 auswertbar. 383 Tumoren (84 %) waren in der phospho-MET- und HGF-Färbung negativ, 7 Tumoren (1,5 %) waren in beiden Färbungen positiv (Tabelle 24). Eine phospho-MET- und HGF-Koexpression war in drei Entitäten zu finden, UPS (3/36), ASA (2/39) und MPNST (2/24). Die Korrelation zwischen der phospho-MET- und HGF45 Ergebnisse Expression war statistisch signifikant, zwischen Immunpositivität und -negativität (p = 0,019, Chi-Quadrat nach Pearson; p = 0,029, exakter Test nach Fisher) und zwischen den Immungraden (Grad 0-3) (p = 0,001, Chi-Quadrat nach Pearson). Tabelle 24: Korrelation der phospho-MET- und HGF-Immunhistochemie Phospho-MET-Immunhistochemie HGFImmunhistochemie Negativ Positiv Negativ Positiv Gesamt Grad 0 Grad 1 Grad 2 Grad 3 Grad 0 250 43 17 5 315 Grad 1 69 21 18 3 111 Grad 2 16 6 5 2 29 335 70 40 10 455 Gesamt 46 Ergebnisse 3.3 Immunhistochemische Expression in Bezug auf verschiedene klinische und pathologische Parameter Es wurde statistisch die Korrelation der klinischen und pathologischen Parameter der tumorspezifischen und unspezifischen genetischen Aberrationen, Tumorgrad nach FNCLCC, bei Angiosarkomen Ätiologie – radiogen-induziert und spontan, sowie Vorliegen einer MYC-Amplifikation, histologischer Subtyp von Synovialsarkomen, und Progressions- und Rezidivrisiko der gastrointestinalen Stromatumoren mit den einzelnen immunhistochemischen Markern MET-(SP44), MET-(C-28), phospho-Met und HGF berechnet. Die signifikanten Korrelationen sind nachfolgend aufgeführt. 3.3.1 Immunhistochemische Expression und tumorspezifische und unspezifische genetische Aberrationen Die genetischen Aberrationen der Tumorsubtypen korrelierten signifikant mit der Expression von allen vier Immunmarkern. Alle 10 MET-(SP44)-positiven Fälle waren vom Karyotyp mit unspezifischen Aberrationen (p < 0,001, Chi-Quadrat). Eine stärkere MET-(C-28)-Färbung war in Tumoren mit unspezifischen Aberrationen häufiger als in Tumoren mit typspezifischen Aberrationen, p = 0,003 (Chi-Quadrat), zwischen MET(C-28)-positiv/negativ und Aberration war die Korrelation nicht signifikant (p = 0,139, Chi-Quadrat; p = 0,147, exakter Test nach Fisher). Eine phospho-MET-Positivität war häufiger in Entitäten mit unspezifischen genetischen Veränderungen nachzuweisen (p < 0,001, Chi-Quadrat). Häufiger waren HGF-positive Fälle in Tumorentitäten mit unspezifischen Veränderungen zu sehen (p < 0,001, Chi-Quadrat). 3.3.2 Immunhistochemische Expression und Tumorgrad nach FNCLCC Der Tumorgrad nach FNCLCC korreliert für alle vier Immunmarker signifikant mit der Expression. MET-(SP44): Eine MET-(SP44)-Positivität war in 4 % (7/164) der FNCLCC Grad 3Tumoren, 2 % (1/55) der Grad 2-Tumoren und 0 % (0/59) der Grad 1-Tumoren nachweisbar. Je höher der FNCLCC-Grad war, desto stärker die MET-(SP44)Färbung, p = 0,016 (Chi-Quadrat). Nahm man als Berechnungsgrundlage nicht den MET-(SP44)-Färbegrad, sondern Immunpositivität und -negativität, war die Korrelation nicht statistisch signifikant (p = 0,212, Chi-Quadrat). MET-(C-28): 8 % (14/176) der FNCLCC Grad 3-Tumoren, 3 % (2/61) der Grad 2Tumoren und 0 % (0/60) der Grad 1-Tumoren waren MET-(C-28)-positiv. Je höher der 47 Ergebnisse FNCLCC-Grad, desto stärker die MET-(C-28)-Färbung (p = 0,01, Chi-Quadrat). MET(C-28)-positive Tumoren haben einen signifikant höheren FNCLCC-Grad als negative Tumoren (p = 0,045, Chi-Quadrat). Phospho-MET: 15 % (26/172) der Grad 3-Tumoren, 15 % (9/61) der Grad 2-Tumoren und 2 % (1/53) der Grad 1-Tumoren waren phospho-MET-positiv. Je höher der FNCLCC-Grad, desto mehr Fälle waren positiv. Die Korrelation zwischen der phosphoMET-Immunhistochemie und dem FNCLCC-Grad war statistisch signifikant, wenn positive und negative Immunhistochemie als Berechnungsgrundlage dienten (p = 0,034, Chi-Quadrat) und nicht signifikant, wenn der Färbegrad (Grad 0-3) genommen wurden (p = 0,113, Chi-Quadrat). HGF: 9 % (16/175) der Grad 3-Tumoren, 7 % (4/60) der Grad 2-Tumoren und 0 % (0/58) der Grad 1-Tumoren waren HGF-positiv. Somit ergab sich eine signifikante Korrelation zwischen der HGF-Expression und dem Tumorgrad, denn Tumoren mit einem höheren Malignitätsgrad exprimierten signifikant häufiger HGF, p = 0,005 (ChiQuadrat). Die Signifikanz wurde bei HGF-positiven und -negativen Tumoren nicht erreicht (p = 0,057, Chi-Quadrat). 3.3.3 Krankheitsprogressions- und Rezidivrisiko gastrointestinaler Stromatumoren Die Korrelation zwischen der phospho-MET-Immunhistochemie und dem Krankheitsprogressions- und Rezidivrisiko bei GIST war statistisch signifikant, p = 0,027 (Chi-Quadrat). Ergebnisse lagen für 103 der Fälle vor. Tumoren mit höherem Risiko waren statistisch signifikant häufiger phospho-MET-positiv als die ohne oder mit niedrigem Risiko. Die Korrelation war nicht signifikant wenn man phospho-METPositivität und -Negativität nahm (p = 0,839, Chi-Quadrat). 48 Ergebnisse 3.4 Ergebnisse der Fluoreszenz in situ Hybridisierung Die MET-FISH konnte erfolgreich in 413 von 484 Sarkomproben durchgeführt werden (siehe Tabelle 25, Abbildung 18). 71 Fälle waren nicht auswertbar, da entweder das Gewebe abgeschwommen war, kein vitales Tumorgewebe vorhanden oder keine Fluoreszenzsignale sichtbar waren. Von allen auswertbaren Sarkomen waren 4 % (15/413) MET-FISH-positiv (Details zu den einzelnen Fälle bitte Tabelle 30 im Anhang entnehmen). Ein hohes Amplifikationslevel fand sich dabei in 0,48 % der Sarkome (2/413), ein Sarkom hatte ein mittelgradiges (0,24 %, 1/413) und 12/413 Sarkome hatten ein niedriges MET-Level (2,9 %). Bei den beiden hoch amplifizierten Tumoren (hohes Amplifikationslevel: MET/CEN 7 Ratio ≥ 2,0 oder durchschnittliche MET-Genkopienzahl pro Zelle von ≥ 6,0 oder ≥ 15 MET-Kopien/Zellkern in ≥ 10 % der Tumorzellen) handelte es sich um undifferenzierte pleomorphe Sarkome. Einer dieser beiden Tumoren wies in 32 von 60 ausgezählten Zellkernen (53 %) kolokalisierte MET/CEN 7-Cluster mit ≥ 15 METSignalen auf. Die MET-Signalzahl lag durchschnittlich bei 15 Signalen/Zellkern, die CEN 7-Signalzahl bei durchschnittlich 12 Signalen/Zellkern. Die MET/CEN 7-Ratio lag bei 1,29. Das zweite amplifizierte UPS hatte in 12 von 60 Zellkernen (20 %) kolokalisierte MET/CEN 7-Cluster mit ≥ 15 MET-Signalen. Die durchschnittliche Signalzahl lag hier für MET bei 8 Signalen/Zellkern und für CEN 7 bei 5 Signalen/Zellkern. Die Ratio betrug 1,62. Der Tumor mit dem mittelgradigen MET-Level (mittelgradiges MET-Level: ≥ 5,0 MET-Signale/Zellkern in ≥ 50 % der Tumorzellen) war ein weiteres UPS und 51,67 % der Tumorzellen hatten ≥ 5,0 MET Signale/Zellkern. Die Ratio lag bei 1,95. Unter den 12 anderen FISH-positiven Tumoren mit niedrigem METLevel (niedriges MET-Level ≥ 4,0 MET-Signale/Zellkern in ≥ 40 % der Tumorzellen), waren drei weitere UPS (9 %, 3/32) sowie folgende Entitäten zu finden: ASA (11 %, 4/36), PLS (10 %, 1/10), MLS (4 %, 1/27), DDLS (3 %, 2/68) und LMS (2 %, 1/65). Der Anteil der Tumorzellen mit ≥ 4,0 MET-Signale/Zellkern lag zwischen 40-60 %. Die Ratio betrug 0,9-1,6. Auch in den Tumoren mit mittelgradigem und niedrigem METLevel fanden sich eingestreut Tumorzellen mit Clusteramplifikationen, jedoch in < 10 % der Zellkerne, so dass das Kriterium einer hohen Amplifikation nicht erfüllt wurde. Betroffen waren PLS, UPS, MPNST, DDLS, LMS und ASA (Tabelle 25). In den ganzflächigen, konventionellen Tumorschnitten der Angiosarkome und Klarzellensarkome war kein heterogenes Verteilungsmuster der MET-Signale, im Sinne einer Fokalität, zu sehen, sondern entweder ein homogenes Bild oder wie zuvor erwähnt diffuse eingestreute Tumorzellen mit einer erhöhten Genkopienzahl. Das 49 Ergebnisse Ergebnis der FISH korrelierte statistisch signifikant mit dem Tumortyp, p = 0,006 (ChiQuadrat). Tabelle 25: MET Fluoreszenz in situ Hybridisierung MET-FISH Tumortyp Anzahl der Fälle Negativ Positiv n.a. Niedrig Mittelgradig Hoch ALT 43 34 0 0 0 9 DDLS 70 65 2 0 0 3 MLS 30 26 1 0 0 3 PLS 10 9 1 0 0 0 LMS 69 64 1 0 0 4 ASA 41 33 4 0 0 4 SS 15 12 0 0 0 3 MPNST 24 20 0 0 0 4 UPS 36 26 3 1 2 4 CCS 13 11 0 0 0 2 GIST 133 98 0 0 0 35 Gesamt 484 398 12 1 2 71 Legende: n.a., nicht auswertbar. 50 Ergebnisse Abbildung 18: Fluoreszenz in situ Hybridisierung (126). Verschiedene Kategorien der MET-Genkopienzahl in Sarkomen. MET-Signale grün, CEN 7-Signale orange. (A) MET-negativ, (B, C) niedriges MET-Level, (D) mittelgradiges MET-Level, (E, F) hohe Amplifikation. (A) Klarzellensarkom, (B, C) Angiosarkome, (D, E, F) undifferenzierte pleomorphe Sarkome. 51 Ergebnisse 3.5 Korrelation der und MET-FISH-Ergebnisse Immunhistochemie 3.5.1 Korrelation MET-FISH und MET-(SP44)-Immunhistochemie Für die Untersuchungsmethoden MET-FISH und MET-(SP44)-Immunhistochemie lagen die Ergebnisse in 341 Fällen vor, darunter 10 FISH-positive. Insgesamt waren 320 Tumoren (94 %) negativ für beide Marker. Von den 10 FISH-positiven Sarkomen waren zwei Sarkome MET-(SP44)-positiv, das mittelgradig MET-Level-positive UPS und ein niedrig MET-Level ASA. Somit waren von allen 328 FISH-negativen Sarkomen acht MET-(SP44)-positiv (Tabelle 26, ausführlich dargestellt im Anhang Tabelle 31). Die Korrelation zwischen FISH und MET-(SP44)-Immunhistochemie war statistisch signifikant, p < 0,001 (Chi-Quadrat). Tabelle 26: Korrelation MET-FISH und MET-(SP44)-Immunhistochemie MET-FISH MET-(SP44)Immunhistochemie 3.5.2 Negativ Positiv Niedrig Mittelgradig Hoch Gesamt Negativ 320 9 0 2 331 Positiv 8 1 1 0 10 Gesamt 328 10 1 2 341 Korrelation MET-FISH und MET-(C-28)-Immunhistochemie In der FISH und der MET-(C-28)-Immunhistochemie waren 409 von 484 Proben auswertbar. Die Mehrzahl der Tumoren (368/409, 90 %) war MET-negativ, sowohl in der FISH, als auch in der MET-(C-28)-Immunhistochemie. Vier Tumoren (1 %) waren mit beiden Untersuchungsmethoden MET-positiv (Tabelle 27). Bei diesen Tumoren handelt es sich um folgende Entitäten: DDLS, LMS und ASA. Die Korrelation der Immunhistochemie und FISH war statistisch signifikant, p = 0,003 (Chi-Quadrat). Die beiden hoch amplifizierten UPS sowie das mittelgradige UPS waren MET-(C-28)negativ. Von den 11 Tumoren mit einem niedrigen MET-Level waren vier Tumoren immunpositiv und sieben negativ. Von allen 395 FISH-negativen Tumoren waren 27 immunhistochemisch positiv. 52 Ergebnisse Tabelle 27: Korrelation MET-FISH und MET-(C-28)-Immunhistochemie MET-FISH MET-(C-28)Immunhistochemie 3.5.3 Negativ Positiv Niedrig Mittelgradig Hoch Gesamt Negativ 368 7 1 2 378 Positiv 27 4 0 0 31 Gesamt 395 11 1 2 409 Korrelation MET-FISH und phospho-MET-Immunhistochemie Für 402 Sarkome lagen die Ergebnisse der MET-FISH und phospho-METImmunhistochemie vor, siehe Tabelle 28. 86 % (347/402) dieser Tumoren waren negativ in der FISH und der phospho-MET-Immunhistochemie. Insgesamt waren drei der 402 Tumoren (1 %) FISH-positiv und expremierten phospho-MET. Die beiden UPS mit hoher MET-Amplifikation zeigten eine unterschiedliche phosphoMET-Expression, ein Tumor war stark positiv, der andere zeigte eine schwache Färbung und war somit negativ. Der mittelgradig amplifizierte Tumor war phosphoMET-negativ. Die 10 niedrig amplifizierten Tumoren waren zu 20 % (2/10) phosphoMET-positiv. Von den FISH-negativen Tumoren wiesen 42 eine phospho-METExpression auf. Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der MET-FISH und phospho-MET-Immunhistochemie lag nicht vor, p = 0,167 (Chi-Quadrat). Tabelle 28: Korrelation MET-FISH und phospho-MET-Immunhistochemie MET-FISH phospho-METImmunhistochemie 53 Negativ Positiv Niedrig Mittelgradig Hoch Gesamt Negativ 347 8 1 1 357 Positiv 42 2 0 1 45 Gesamt 389 10 1 2 402 Ergebnisse 3.6 Korrelation der MET-FISH und klinischen und pathologischen Parametern Eine statistisch signifikante Korrelation lag zwischen MET-FISH und Karyotyp vor. Es lag keine signifikante Korrelation zwischen dem Ergebnis der MET-FISH und den klinischen Parametern FNCLCC-Grad (p = 0,617), MYC-Amplifikationsstatus (p = 0,517, Chi-Quadrat; p = 1,0, exakter Test nach Fisher) und Strahleninduktion in Angiosarkomen (p = 0,257, Chi-Quadrat; p = 0,555, exakter Test nach Fisher) vor. Da alle Synovialsarkome und GIST FISH-negativ waren war eine Berechnung der Korrelation mit dem histologischen Subtyp der SS und dem Krankheitsprogressionsund Rezidivrisiko der GIST nicht möglich. 3.6.1 Korrelation MET-FISH und tumorspezifischer Karyotyp Von den 413 Sarkomen waren 7 % (12/164) der Tumoren der Entitäten die mit einem komplexem Karyotyp einhergehen und von den Tumorentitäten mit spezifischen genetischen Veränderungen 1 % (3/249) MET-FISH-positiv (Tabelle 29). Die Korrelation zwischen MET-FISH und Karyotyp war statistisch signifikant, p = 0,011 (Chi-Quadrat). Tabelle 29: Korrelation MET-FISH und tumorspezifischer Karyotyp MET-FISH Tumorspezifische genetische Aberration Negativ Ja Positiv Gesamt Niedrig Mittelgradig Hoch 246 3 0 0 249 Nein 152 9 1 2 164 Gesamt 398 12 1 2 413 54 Ergebnisse 3.7 Ergebnisse der reversen Transkriptase-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion 3.7.1 RNA-Qualität Die RNA Qualität wurde mit dem NanoDrop®-ND-1000-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies, Erlangen, Deutschland) gemessen. Konzentration und Reinheit wurden mit der A260/280 Ratio angegeben und lag durchschnittlich bei 1,95. Dies sprach für reine und Protein-freie RNA. 3.7.2 Ergebnisse der MET-RNA-Expression Es wurde RNA von insgesamt 75 Tumoren, 16 DDLS, 26 ASA, 15 LMS und 17 MPNST sowie Kontrollgewebe von 21 Darmwandproben extrahiert. Von 71 Tumoren und allen Darmwandproben konnte eine ausreichende RNA-Menge gewonnen werden um sie mittels RT-qPCR zu untersuchen. Die Extrakte von vier ASA enthielten zu wenig RNA. Von den Proben mit ausreichender RNA-Menge wurden für die drei Gene MET, IPO8 und PPIA Doppelbestimmungen durchgeführt. CP-Werte für alle drei Gene lagen für 18 Darmwandproben, 15 DDLS, 22 ASA, 12 LMS und 17 MPNST vor. Aus den beiden durch die Doppelbestimmung erhaltenen CP-Werten wurde für jeden Primer der Mittelwert berechnet (Tabelle 32). Bei zehn Proben war jeweils eine Bestimmung des CP-Wertes fehlerhaft und es wurde der Wert der zweiten Probe verwendet. Die REST 2002 Software (104) wurde für die Standardisierung der CP-Werte des Targetgens MET gegen die Referenzgene IPO8 und PPIA verwendet und errechnete eine Expressionsratio im Vergleich zum Kontrollgewebe. Für jede Tumorentität wurden folgende Konstellationen berechnet: i) alle Tumoren und die einzelnen Entitäten im Vergleich zum Kontrollgewebe Darmwand, ii) FISH-positive Tumoren im Vergleich zu FISH-negativen, iii) MET-(C-28)-positiv im Vergleich zu MET-(C-28)-negativ, iv) HGFpositiv im Vergleich zu HGF-negativ, v) und bei den Angiosarkomen MET-(SP44)positiv im Vergleich zu MET-(SP44)-negativ. 3.7.2.1 MET-RNA in alle Tumorentitäten Verglich man die MET-Expression der vier Tumorentitäten mit dem Darmgewebe als Referenzgewebe, normalisiert gegen das Referenzgen PPIA, war MET signifikant runterreguliert (p = 0,001, Faktor = 1,488). Bei einer Normalisierung gegen IPO8 war MET nicht signifikant hochreguliert (p = 0,782, Faktor = 1,012). In FISH-positiven 55 Ergebnisse Tumoren war MET im Vergleich zu MET-negativen Tumoren runterreguliert, jedoch nicht signifikant (Referenzgen IPO8: p = 0,509, Faktor = 3,804; Referenzgen PPIA: p = 3,934, Faktor = 0,505). MET-(SP44)-positive Tumoren haben eine nicht signifikante Hochregulierung der MET-Expression (Referenzgen IPO8: p = 0,519, Faktor = 1,391; Referenzgen PPIA: p = 1,823, Faktor = 0,512). MET-(C-28)-positive Tumoren haben im Gegensatz zu MET-(C-28)-negativen Tumoren eine signifikante Runterregulierung von MET bei einer Normalisierung gegen IPO8 (Referenzgen IPO8: p = 0,001, Faktor = 1,169; Referenzgen PPIA: p = 0,465, Faktor = 1,823). In HGF-positiven Tumoren war MET hochreguliert, dies ist jedoch nicht signifikant (Referenzgen IPO8: p = 0,8955, Faktor = 1,297; Referenzgen PPIA: p = 0,912, Faktor = 1,447). 3.7.2.2 MET-RNA in dedifferenzierte Liposarkomen Betrachtete man die gesamte Gruppe der in der RT-qPCR untersuchten dedifferenzierten Liposarkome zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der Expression von MET und den beiden Referenzgenen IPO8 und PPIA zwischen Tumorund Darmwandgewebe. Es war auch kein signifikanter Unterschied in der METExpression zwischen FISH-positiven und FISH-negativen oder immunhistochemischpositiven und -negativen Tumoren nachweisbar. Alle DDLS waren HGF-negativ. 3.7.2.3 MET-RNA in Angiosarkomen Angiosarkome waren die einzigen in der RT-qPCR untersuchten Tumoren, die auch zum Teil MET-(SP44)-positiv waren. MET war in ASA im Vergleich zu Darmwand signifikant herunterreguliert (Referenzgen IPO8: p = 0,001, Faktor = 1,334; Referenzgen PPIA: p = 0,001, Faktor = 1,196). Die Subgruppe der FISH-positiven, MET-(SP44)- und MET-(C-28)-positiven ASA hatte im Vergleich zur Darmwand ein signifikant hochreguliertes MET (Referenzgen IPO8: p = 0,001, Faktor = 1,776; Referenzgen PPIA: p = 0,001, Faktor = 6,999). In den FISH-positiven und MET-(C-28)negativen Tumoren, bei denen MET-(SP44) nicht auswertbar war, war MET hochreguliert (signifikant: Referenzgen PPIA: p = 0,001, Faktor = 1,04; nicht signifikant: Referenzgen IPO8: p = 0,656, Faktor = 1,089). Hochreguliert, aber nicht signifikant, war MET in MET-(SP44)-positiven Tumoren die FISH und MET-(C-28)-negativ waren (Referenzgen IPO8: p = 0,656, Faktor = 1,089; Referenzgen PPIA: p = 0,3415, Faktor = 1,497). FISH-positive Tumoren hatten ein nicht signifikant hochreguliertes MET im Vergleich zu FISH-negativen Tumoren (Referenzgen IPO8: p = 0,7115, Faktor = 1,36). MET-(SP44)-positive Tumoren hatten ein nicht signifikant hochreguliertes MET im 56 Ergebnisse Vergleich zu MET-(SP44)-negativen (Referenzgen IPO8: p = 0,133, Faktor = 3,511; Referenzgen PPIA: p = 0,1075, Faktor = 3,865). HGF-positive ASA hatten ein nicht signifikant erhöhtes MET im Vergleich zu HGF-negativen ASA (Referenzgen PPIA: p = 0,2715, Faktor = 1,982). 3.7.2.4 MET-RNA in Leiomyosarkomen In LMS war MET im Vergleich zu Darmwand signifikant herunterreguliert (Referenzgen IPO8: p = 0,001, Faktor = 6,427; Referenzgen PPIA: p = 0,001, Faktor = 1,667). MET war im Verhältnis zum Referenzgen PPIA in Tumoren die FISH und MET-(C-28)-positiv waren signifikant hochreguliert (p = 0,001, Faktor = 1,062). Verglich man MET-FISHpositive mit -negativen Tumoren war MET in den positiven Tumoren hochreguliert, dies war nicht signifikant (Referenzgen IPO8: p = 0,6785, Faktor = 1,884; Referenzgen PPIA: p = 0,353, Faktor = 1,865). Verglich man MET-(C-28)-positive mit -negativen Tumoren war MET in den immunpositiven Tumoren hochreguliert, dies war nicht signifikant (Referenzgen IPO8: p = 0,8315, Faktor = 1,139; Referenzgen PPIA: p = 0,511, Faktor = 1,945). In HGF-positiven LMS war MET im Vergleich zu HGFnegativen LMS hochreguliert, nicht signifikant (Referenzgen IPO8: p = 0,6965, Faktor = 1,383; Referenzgen PPIA: p = 0,863, Faktor = 1,249). 3.7.2.5 MET-RNA in malignen peripheren Nervenscheidentumoren In MPNST war MET im Vergleich zu Darmwand signifikant herunterreguliert (Referenzgen IPO8: p = 0,001, Faktor = 2,94; Referenzgen PPIA: p = 0,001, Faktor = 1,475). Verglich man MET-(C-28)-positive mit -negativen Tumoren war MET in den immunpositiven Tumoren hochreguliert, dies war nicht signifikant (Referenzgen IPO8: p = 0,611, Faktor = 1,708; Referenzgen PPIA: p = 0,353, Faktor = 2,862). In HGFpositiven MPNST war MET im Vergleich zu HGF-negativen MPNST hochreguliert, nicht signifikant (Referenzgen IPO8: p = 0,5925, Faktor = 2,831). 57 Ergebnisse 3.8 Ergebniszusammenfassung nach Tumorentitäten Um eine genauere Übersicht aller Ergebnisse der Immunhistochemie- und FISHAnalysen für die einzelnen Sarkomentitäten zu erhalten, wurden im Folgenden die Daten nach Entitäten zusammengefasst und auf Besonderheiten einzelner Tumoren eingegangen. Übersichtstabellen wurden zuvor gezeigt (Tabelle 15, Tabelle 16, Tabelle 17, Tabelle 18, Tabelle 25). 3.8.1 Atypische lipomatöse Tumoren (ALT) Alle auswertbaren ALT-Fälle waren negativ für MET-(SP44) (42/43), MET-(C-28) (43/43), phospho-MET (36/43) und HGF (42/43). In den FISH-Analysen waren alle ALT negativ. 3.8.2 Dedifferenzierte Liposarkome (DDLS) 68/70 DDLS waren in der MET-(SP44)-Färbung auswertbar und sämtlich negativ. In der MET-(C-28)-Immunhistochemie waren 4/70 DDLS (6 %) positiv. Die phospho-METImmunhistochemie verlief in 6/66 auswertbaren DDLS positiv. Alle in der HGF-Färbung auswertbaren DDLS waren negativ. Von den vier MET-(C-28)-positiven Tumoren waren alle HGF und phospho-MET-negativ. In der FISH waren 2/67 auswertbaren DDLS positiv mit niedrigem MET-Level und 65 Fälle negativ. Von den beiden FISH-positiven Fällen war einer MET-(C-28)-positiv. Die Färbungen mit den MET-(SP44)- und HGF-Antikörpern verliefen negativ mit einer jeweils schwachen Färbeintensität. Die phospho-MET-Färbung war nicht auswertbar. Der andere Fall war für alle immunhistochemischen Marker negativ. 3.8.3 Myxoide Liposarkome (MLS) Alle auswertbaren MLS waren mit allen vier Antikörpern negativ (SP44 (21/30), C-28 (23/30), phospho-MET (23/30) und HGF (22/30)). In der FISH war ein Tumor positiv, er wies ein niedriges MET-Level auf. Dieser Fall war in keiner der immunhistochemischen Färbungen auswertbar. 58 Ergebnisse 3.8.4 Pleomorphe Liposarkome (PLS) PLS wiesen eine Überexpression von phospho-MET in 20 % (2/10) der Tumoren auf. Sie waren sämtlich negativ für HGF und MET, gefärbt mit beiden Antikörpern, SP44 und C-28. Ein PLS war FISH-positiv, mit einem niedrigen MET-Level. Dieser Fall war in der phospho-MET-Färbung nicht auswertbar. 3.8.5 Leiomyosarkome (LMS) LMS waren mit dem SP44-Antikörper gänzlich negativ. Mit dem MET-Antikörper C-28 waren 9 % (6/69) der LMS positiv. 10 % (7/68) waren positiv für phospho-MET und 7 % (5/68) für HGF. Alle MET-(C-28)-positiven LMS waren phospho-MET- und HGFnegativ. Die phospho-MET-positiven Tumoren waren HGF-negativ. 1/65 LMS war mit niedrigem MET-Level FISH-positiv. Dieser Tumor war immunhistochemisch MET-(C-28)-positiv, für die anderen immunhistochemischen Marker negativ. 3.8.6 Angiosarkome (ASA) 5/29 Angiosarkome (17 %) waren mit dem MET-(SP44)- und 7/41 (17 %) mit dem MET-(C-28)-Antikörper-positiv. Drei dieser Tumoren waren mit beiden Markern positiv. Zwei der MET-(SP44)-positiven ASA waren somit MET-(C-28)-negativ und vier der MET-(C-28)-positiven ASA waren MET-(SP44)-negativ. Eine phospho-MET-Expression wiesen 16/41 ASA (39 %) auf. Zwei der MET-positiven Angiosarkome beider Antikörper waren phospho-MET-positiv, und jeweils für den anderen MET-Antikörper negativ. Keines der Angiosarkome war positiv für phospho-MET und beide METAntikörper. 6/39 ASA (15 %) waren HGF-positiv. 3/5 MET-(SP44)-positiven und 2/7 MET-(C-28)-positiven ASA wiesen eine HGF-Expression auf. Von diesen HGFpositiven ASA war ein Tumor für beide MET-Antikörper positiv. Zwei der MET-(SP44) und HGF-positiven ASA wiesen gleichzeitig eine phospho-MET-Expression auf. Dieses Phänomen ließ sich bei keinem der MET-(C-28)-positiven Angiosarkomen nachweisen. 11 %, 4/36, der ASA waren FISH-positiv mit einem niedrigen MET-Level. In dieser Gruppe befand sich ein Tumor der MET-(SP44)-, MET-(C-28)- und HGF-positiv sowie phospho-MET-negativ war. Ein weiterer war MET-(C-28)- und HGF-positiv. Die beiden anderen Tumoren waren ausschließlich phospho-MET-positiv, wobei in einem dieser Fälle kein Ergebnis für die MET-(SP44)-Färbung vorlag. 59 Ergebnisse 3.8.7 Synovialsarkome (SS) Keines der Synovialsarkome wies eine MET-(SP44)-, phospho-MET oder HGFFärbung auf. Drei Tumoren (20 %) zeigten mit dem MET-(C-28)-Antikörper eine positive Färbereaktion. In der FISH-Analyse waren alle Synovialsarkome MET-negativ. 3.8.8 Maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNST) Keines der MPNST war positiv für MET-(SP44). 4/24 MPNST (17 %) waren MET-(C28)-positiv. Eine phospho-MET-Expression konnte in 5/24 MPNST (21 %) nachgewiesen werden. In der HGF-Färbung waren 3/24 Tumoren (13 %) positiv. Einer der MET-(C-28)-positiven Tumoren war gleichzeitig phospho-MET-positiv und HGFnegativ. 2/5 phospho-MET-positiven MPNST hatten eine Koexpression von HGF. Alle MPNST waren FISH-negativ. 3.8.9 Undifferenzierte pleomorphe Sarkome (UPS) Undifferenzierte pleomorphe Sarkome waren in 5/36 Fällen (14 %) MET-(SP44)positiv. Sie waren vollständig negativ für MET-(C-28). In der phospho-MET-Färbung waren 5/36 (14 %) positiv. Eine HGF-Expression wiesen 12/36 UPS (33 %) auf. Drei der MET-(SP44)-positiven UPS wiesen eine Koexpression von HGF auf, bei gleichzeitiger Negativität für phospho-MET. Eine Koexpression von HGF und phosphoMET zeigte sich in drei UPS. 19 % der undifferenzierten pleomorphen Sarkome (6/32) waren FISH-positiv, zwei dieser Tumoren hatten eine hohe MET-Amplifikation, ein Tumor hatte ein mittelgradiges MET-Level und drei ein niedriges MET-Level. Eines der hoch amplifizierten UPS wies eine Expression von phospho-MET und HGF auf. Das andere war für alle immunhistochemischen Marker negativ. Das Sarkom mit dem mittelgradigen MET-FISH-Level war MET-(SP44)-positiv. Von den UPS mit niedrigem MET-Level war eines HGF-positiv, die anderen beiden waren negativ für alle Immunmarker. 3.8.10 Klarzellensarkome (CCS) Für die MET-(SP44)-Färbung lag kein Material der CCS vor. In der MET-(C-28)Immunhistochemie waren alle Tumoren negativ. 5/13 Klarzellensarkomen (39 %) 60 Ergebnisse waren phospho-MET und 2/13 (15 %) waren HGF-positiv. Eine Koexpression der beiden Marker lag nicht vor. In der FISH waren alle Klarzellensarkom negativ. 3.8.11 Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) Keiner der gastrointestinalen Stromatumoren war MET-(SP44)-positiv. 10/128 GIST (8 %) waren MET-(C-28)-positiv. 3/129 GIST (2 %) waren phospho-MET-positiv. In der HGF-Färbung wies 1/127 Tumoren ein positives Färbeergebnis auf. Dieser zeigte eine Koexpression von MET-(C-28) bei Negativität für die anderen Marker. Alle phosphoMET-positiven GIST waren MET-(C-28)- und HGF-negativ. Alle GIST waren MET-FISH-negativ. 61 Diskussion 4 Diskussion Sarkome Sarkome sind zwar relativ selten im Vergleich zu anderen Tumorentitäten, haben jedoch häufig einen aggressiven klinischen Phänotyp. Demgegenüber hat die Therapie dieser Tumoren nur in Einzelfällen zu signifikanten Verbesserung des Verlaufs geführt. Der sich aktuell rasant entwickelnde molekularpathologische Bereich der personalisierten Medizin ist im Hinblick auf neue Therapien für Sarkome besonders interessant. Dennoch wurden sie aufgrund ihrer Seltenheit bislang hinsichtlich neuer Biomarker nicht sehr ausgedehnt untersucht. Um die bisher oft mangelhafte Therapie der Sarkome zu verbessern ist es entscheidend auch Sarkompatienten in klinische Studien von Biomarkern einzubinden. MET/HGF Einer dieser Biomarker ist MET, welcher derzeit Gegenstand von präklinischen und frühen klinischen Studien ist. Mögliche Therapieansätze sind MET-TKI sowie MET- und HGF-Antikörper. Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob Sarkome therapeutisch relevante Alterationen der HGF/MET-Achse aufweisen und somit potentielle Kandidaten für eine anti-MET- bzw. anti-HGF-Therapie sind. Bislang ist unklar, welcher Biomarker der beste Prognoseparameter einer solchen Therapie ist. Daher wurden hier mehrere Ebenen dieser komplexen Signalkaskade mit verschiedenen Methoden untersucht, die HGF-Expression und die Rezeptorexpression des gesamten und des phosphorylierten MET jeweils mit Immunhistochemie, die MET-Genkopienzahl mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung, und in ausgewählten Fällen die MET-RNA-Expression mit RT-qPCR. Klinische MET-Studien Die Einschlusskriterien der aktuellen klinischen Studien (Tabelle 33), die in den HGF/MET-Signalweg eingreifen, sind nicht einheitlich festgelegt. Einige Studien wählen die Patienten nach den vorliegenden MET-Veränderungen aus, z.B. positiver Immunstatus (135) oder MET-Amplifikation (99). Andere Studien schließen Tumoren ein, die generell MET exprimieren können (117). Jedoch gibt es keine einheitlichen Definitionen der Positivitätskriterien für Immunhistochemie und FISH. Die meisten Studien verlangen gar keine Veränderungen des HGF/MET-Signalwegs als Einschlusskriterium. Sie untersuchen während der laufenden Studie verschiedene Parameter des HGF/MET-Signalwegs und deren Veränderungen (19, 163). Diese 62 Diskussion Messungen schließen die Expression von MET im Gewebe und in zirkulierenden Tumorzellen, lösliches MET im peripheren Blut, die Höhe von phosphoryliertem MET, die Inhibition von phosphoryliertem MET, Messungen weiterer Marker des Signalwegs die MET nachgeschaltet sind, HGF-Werte in Serum und Knochenmark, METAmplifikation und -Genkopienzahl, das Vorkommen MET-amplifizierter zirkulierender Tumorzellen und MET-Mutationen. Bislang ist noch unklar, welche prognostische Bedeutung eine zugrundeliegende METAlteration für eine anti-MET-Therapie hat und welche Methode als Biomarker entscheidend ist. Insbesondere weiß man nicht, welche Bedeutung eine METAmplifikation in Tumoren hat, die immunnegativ sind. Denn zumeist ist der Rezeptor das eigentliche Ziel der Therapeutika, und dieses liegt in immunnegativen Tumoren nicht vermehrt vor. Eine Genamplifikation führt nicht automatisch zu einer Überexpression des Proteins. Es kann durch verschiedene Regulierungs- mechanismen auf einem normalen Level gehalten werden, auch wenn das Gen in vielfacher Kopie vorliegt. Die Korrelation zwischen FISH und Immunhistochemie ist für MET noch nicht gut untersucht worden, deshalb wurden die Tumorproben hier mit beiden Methoden untersucht. Es gibt Hinweise darauf, dass Tumoren, die immunhistochemisch MET exprimieren, mit oder ohne Amplifikation, und amplifizierte Tumoren mit unbekanntem immunhistochemischen Status (99) auf eine anti-METTherapie ansprechen. In einer Studie an MET-amplifizierten, metastasierten Magenkarzinomen mit unbekanntem immunhistochemischen Status sprachen die Tumoren nicht auf eine MET-Inhibition mit Foretinib an (131). Um herauszufinden, ob sich Immunhistochemie oder FISH, die Kombination beider Methoden oder aber für verschiedene Therapeutika unterschiedliche Methoden am besten für die Patientenselektion eignen, sind weitere Untersuchungen und klinische Studien von Nöten. Entgegen dem Konzept der personalisierten Medizin ist eine weitere Überlegung, dass eine MET-Inhibition auch ohne eine zugrundeliegende MET-Alteration einen antitumorösen Effekt haben könnte, da MET eine universell vorkommende Tyrosinkinase ist. Es könnte ähnlich wie bei einer VEGFR-Inhibition ablaufen, die auch ohne VEGFR-Veränderungen eine antitumoröse Wirkung hat (33, 76). Dann könnten Patienten unabhängig davon, ob eine MET-Alteration vorliegt oder nicht, in Studien eingeschlossen werden. Die ersten klinischen Studien mit HGF/MET-Inhibitoren lieferten erfolgversprechende Ergebnisse (siehe im Anhang Tabelle 34). Verschiedene Wirkstoffe erzielten Erfolge, wie ein vollständiges oder partiellen Ansprechen, verhinderten eine Krankheitsprogression oder verbesserten das Überleben in mehreren Tumorentitäten, 63 Diskussion einschließlich einiger Weichteiltumoren (Angiomyolipome, Liposarkome, nicht näher spezifizierte Sarkome) und anderen Tumoren (Karzinome von Endometrium, Harnblase, Hoden, Niere, Pankreas, Prostata, Rektum, Schilddrüse (33, 117), Magen (19, 131, 163), Lunge – NSCLC (86, 99, 117, 130, 137), sowie Merkelzellkarzinome (163), neuroendokrine Karzinome, adenoid-zystische Karzinome, undifferenzierte kleinzellige Karzinome, und Melanome (117)). Einige dieser Tumoren waren MET- (19, 117, 137) oder HGF-immunpositiv (19, 117), MET-amplifiziert (19, 99, 130, 131, 137) oder -mutiert (163). Da die Therapeutika nicht nebenwirkungsfrei sind, wäre ein Biomarker-Assay, welches die Wirksamkeit vorhersagen kann wünschenswert. Die bisherigen klinischen Studien berichteten hauptsächlich von Nebenwirkungen die das hämatopoetische, renalen und gastro-intestinale System betrafen (19, 33, 86, 99, 117, 163). Zudem gilt MET als negativer Prognosefaktor. Patienten mit NSCLC die MET-FISH oder in der Immunhistochemie (IHC) positiv waren, hatten eine höhere Mortalitätsrate und IHC-positive Patienten eine schlechtere Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit (101). In NSCLC war ein positiver MET-Immunstatus mit einem schlechteren Überleben assoziiert (137). Für die hier untersuchten WTS lag keine Nachsorgedaten vor. Daher kann keine Aussage zu einer Assoziation von MET-, phospho-MET- und HGF-IHC oder FISH im Zusammenhang mit der Prognose, dem Rezidivrisiko oder dem Überleben gemacht werden. Immunhistochemie Wie bereits erwähnt, gibt es für die Immunhistochemie der Antikörper MET, phosphoMET und HGF keine offiziell empfohlenen Assays, Auswertestrategien oder Positivitätskriterien. Deshalb mussten zum Beginn dieser Arbeit die immunhistochemischen Antikörper gegen MET, phospho-MET und HGF, die hier gefärbt werden sollten gefunden werden. Von vier kommerziell erhältlichen METAntikörpern, Novocastra (Klon 8F11), Invitrogen (Klon 3D4), Acris (Klon SP59), und Santa Cruz (C-28:sc-161), war der einzige Antikörper mit dem überhaupt ein Färbeergebnis erzielt werden konnte, trotz Protokollvariationen und Rücksprache mit den Herstellern, der MET-(C-28)-Antikörper. Eine ähnliche Beobachtung machte die Arbeitsgruppe von Hartmut Koeppen, die bei einem Vergleich der Sensitivität und Spezifität verschiedener MET-Antikörper unterschiedlicher Hersteller herausfanden, dass nur zwei von neun Antikörpern gute Färbeergebnisse lieferten (61). Das Angebot für phospho-MET- und HGF-Antikörper war deutlich geringer. Doch es gelangen mit den verfügbaren Antikörpern (phospho-MET (pY1349), Epitomics, Klon 64 Diskussion EP2367Y; HGF, Zytomed) akzeptable Färbungen, sodass sie weiter verwendet werden konnten. Die Auswertung der MET-(C-28)-Immunhistochemie, der nach Herstellerangaben membranären Färbung, sollte initial nach den Kriterien des HercepTest erfolgen. Dies war nicht möglich, da nur die wenigsten Tumoren eine membranäre Färbung zeigten und der Großteil positiver Tumoren zytoplasmatisch angefärbt war. Diese Beobachtung machten auch andere Arbeitsgruppen, die den gleichen Antikörper verwendeten (107). Die Literaturrecherche zeigte verschiedenste Möglichkeiten der Auswertung immunhistochemischer Färbungen des Zytoplasmas. Auswerteschemata die zu detailliert auf den Anteil der gefärbten Tumorzellen eingingen (17, 53, 108), z.B. den prozentualen Anteil der gefärbten Zellen, kamen nicht in Betracht, da die Fläche der Tumorstanzen in den TMA sehr klein war. Wiederum andere Arbeitsgruppen berücksichtigten nicht die Färbeintensität (65), die hier jedoch auf jeden Fall dokumentiert werden sollte, um zu sehen, ob es Unterschiede zwischen den verschiedenen Intensitäten der Färbung und den Ergebnissen der FISH, den Tumoreigenschaften und den klinischen Parametern gibt. Das endgültige Auswerteschema fand sich als ich auf den MET-Antikörper MET-(SP44) (CONFIRM anti-Total c-MET (SP44)) (60) aufmerksam wurde. Für diesen Antikörper lagen Validierungsstudien vor, die die immunhistochemischen Färbeergebnisse mittels Westernblot überprüft haben und eine gute Korrelation zwischen beiden Methoden fanden. Derartige Daten fehlen für alle anderen gefärbten Antikörper. Um möglichst solide und verlässliche Ergebnisse zu bekommen wurden die noch verfügbaren Sarkomproben zusätzlich mit dem MET-(SP44)-Antikörper gefärbt. Die Ergebnisse der Färbungen von Testgewebe (Zelllinien und on-slide-Kontrollen) verliefen wie erwartet. Die Beurteilung der Färbungen sollte nach dem in der Validierung (60) und bereits in klinischen Studien (135) verwendeten Auswerteschema erfolgen. Es wurde in diesem Schema zwar auch auf den Anteil der gefärbten Tumorzellen eingegangen, jedoch konnte nach Absprache mit Hartmut Koeppen der Schwellenwert von original 50 % auf 10 % für die Einteilung der Grade gesenkt werden. Dies schien aufgrund der kleinen Tumorfläche der TMA-Stanzen für eine erste immunhistochemische Analyse sinnvoll. Im Rahmen der Antikörpervalidierung wurden Grad 2 und 3 als immunhistochemischpositiv, Grad 0 und 1 als negativ gewertet (60). Da, wie zuvor erwähnt, für keinen der drei anderen Antikörper (MET-(C-28), phosphoMET und HGF) anerkannte oder validierte Auswertungsschemata existierten, wurde das gleiche System wie für den MET-(SP44)-Antikörper auch dort angewandt. Die auf diese Weise erhobenen Daten müssten mit einer anderen Methode (Westernblot) verifiziert werden. Der Ansatz wirkt vielversprechend, denn es zeigte sich eine 65 Diskussion statistisch signifikante Korrelation zwischen der Positivität von MET-(SP44) und HGF in Angiosarkomen und undifferenzierten pleomorphen Sarkomen, der Positivität von MET-(SP44) und MET-(C-28) sowie MET-(SP44) und phospho-MET jeweils in Angiosarkomen. Der MET-(SP44)-Antikörper identifizierte zwei eindeutige Tumorentitäten, die eine MET-Positivität aufwiesen, Angiosarkome (ASA) und undifferenzierte pleomorphe Sarkome (UPS). Alle anderen Entitäten waren negativ. Angiosarkome waren in 17 % der Tumoren (5/29) MET-positiv. Die Positivität der Angiosarkome war unabhängig davon, ob die Genese spontan oder strahleninduziert war. Der Entstehung von Angiosarkomen (ASA) liegen drei Mechanismen zugrunde, i) sporadisch, ii) auf dem Boden eines bestehenden Lymphödems, iii) und postradiogen. Es ist davon auszugehen, dass die Anzahl der radiogeninduzierten ASA zukünftig weiter zunehmen wird, da viele Brustkrebspatienten eine adjuvante Bestrahlung bekommen. Die ASA treten meist erst mehrere Jahre nach der eigentlichen Bestrahlung auf (82). Nach lokaler Tumorresektion und gegebenenfalls Bestrahlung oder Chemotherapie besteht ein hohes Lokalrezidiv- und Metastasierungsrisiko (13, 81). UPS waren in 14 % der Fälle (5/36) MET-positiv. Zu deutlich höheren Positivitätsraten kam eine andere Studie (68). Zum Teil kann dies dadurch erklärt werden, dass dort ein dreistufiges Auswerteschema für die Immunhistochemie benutzt wurde, welches schwache und mittelgradige Färbeintensitäten zusammenfasste. Deshalb lassen sich die Daten nicht genau vergleichen. Die dortigen Fälle waren zu 100 % MET-positiv, 95 % HGF-positiv und 94 % phospho-MET-positiv. FISH-Analysen wurden dort nicht gemacht. Hier bestand eine statistisch signifikante Korrelation der MET-(SP44)- und HGFExpression (p < 0,001, Chi-Quadrat). Sechs der MET-(SP44)-positiven Tumoren koexpremierten HGF, dies war in 3/5 MET-(SP44)-positiven USP und 3/4 MET-(SP44)positiven ASA der Fall. Dieses Phänomen könnte durch eine autokrine Tumorzellaktivierung erklärt werden. Der sezernierte Ligand bindet extrazellulär an den Rezeptoren, die in der Zellmembran derselben und der benachbarten Zellen sitzt, und aktiviert diese (138). Eine autokrine Zellaktivierung kann zu Tumorentstehung, -wachstum und -progression führen (100). Für MET ist bereits bekannt, dass eine autokrine Aktivierung (109, 112) in Mammakarzinomen (149), Pankreaskarzinomen (32) und Ovarialkarzinomen (160) vorkommt. Bei dem mittels Immunhistochemie nachgewiesenen HGF kann es sich um freies aber auch um rezeptorgebundenes HGF handeln. Wenn es sich um rezeptorgebundenes HGF handelt, ist nicht eindeutig zu belegen, dass das nachgewiesene HGF aus den Sarkomzellen stammt. Es könnte zum Beispiel von umliegenden Fibroblasten oder anderen mesenchymalen Zellen sezerniert worden sein (87). Diese Zellarten können 66 Diskussion dann auch in der Immunhistochemie HGF-positiv sein. In den hier untersuchten Tumorproben waren die Fibroblasten HGF-negativ. Patienten, die eine derartige MET(SP44)/HGF-Koexpression aufweisen, kommen für eine anti-MET-Therapie in Betracht. In diesen Fällen könnten auch gegen HGF gerichtete Therapeutika, wie HGFAntikörper, zum Einsatz kommen. Einige Sarkome waren ausschließlich HGF-positiv, also MET-(SP44)-negativ. Diese HGF-Expression hat dann therapeutisch keine Relevanz. MET-(C-28) und phospho-MET färbten zwar auch ASA und UPS, jedoch zum Teil andere Fälle als MET-(SP44). Und es waren auch andere Entitäten mit diesen Antikörpern positiv, bei MET-(C-28) zusätzlich DDLS, LMS, SS, MPNST und GIST, bei phospho-MET DDLS, PLS, LMS, MPNST, CCS und GIST. Solange die immunhistochemischen Marker MET-(C-28), phospho-MET und HGF nicht durch eine zweite Methode validiert wurden, sind die Färbeergebnisse nur eingeschränkt glaubwürdig. Denn es bleibt unklar, ob sich das Auswerteschema von MET-(SP44) einfach auf die anderen drei Antikörper übertragen lässt oder wie deren optimale Beurteilung sein sollte. Allerdings war auch ohne vorherige Validierung der hohe Anteil phospho-MET-positiver Fälle bei den Klarzellensarkomen (39 %) auffällig. Auch die Daten anderer Arbeitsgruppen weisen auf eine MET-Überexpression in Klarzellensarkomen hin (26, 54, 153). 16 % der Klarzellensarkome hatten eine nachweisbare HGF-Expression, eine phospho-MET/HGF-Koexpression lag jedoch in keinem der Fälle vor. Alterationen des HGF/MET-Signalwegs in CCS könnten durch die genetisch charakteristische Translokation zwischen EWS und ATF1, t(12;22)(q13;12) oder EWS und CREB1, t(2;22)(q34;q12) in CCS erklärt werden (26, 54). EWS-ATF1 aktiviert die Expression des Microphthalmia-associated transcription factor (MITF), welcher wiederum direkt an den Promotor des MET-Gens bindet und das Gen aktiviert (26, 79). Aufgrund dieser Daten gab es eine klinische Phase II Studie mit dem MET-Inhibitor ARQ197 in Patienten mit MITF-positiven Tumoren, fortgeschrittenen CSS, ASPS (alveoläres Weichteilsarkom) und Nierenzellkarzinomen. In einem der 11 CCS konnte ein partielles Ansprechen (partial response) erzielt werden und in 28 weiteren Tumoren konnte zumindest eine Tumorprogression verhindert werden (stable disease - SD). Insgesamt wurde das Medikament gut vertragen, das Ansprechen war jedoch nur mäßig (152). Weitere Forschungsergebnisse zeigten, dass der TKI SU11274, ein small molecule MET inhibitor, eine dosisabhängige Reduktion der MET-Phosphorylierung und eine damit einhergehende Verminderung der Zellproliferation und Überlebensfähigkeit von CCSZelllinien und einem autokrinen Xenograftmodell verursacht. Die CCS-Zelllinien zeigten weiterhin eine HGF-Expression. Die Behandlung mit dem humanen monoklonalen anti67 Diskussion HGF-Antikörper (AMG 102) führte zu einer inkompletten Hemmung der METPhosphorylierung. In Xenograft-Mausmodellen führte AMG 102 zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums (26). Es wurden also bereits verschiedene Wirkstoffe, die in den HGF/MET-Signalweg eingreifen, gefunden, die in vivo und in vitro eine Wirksamkeit in Klarzellensarkomen zeigten. MPNST wiesen mit 21 % einen hohen Anteil phospho-MET positiver Tumorproben auf. Zwei von fünf dieser phospho-MET-positiven MPNST (40 %) hatten eine HGFKoexpression. Auch andere Arbeitsgruppen fanden MET-positive MPNST (107, 146). Eine Koexpression mit HGF wurde dort ebenfalls beschrieben. Allerdings wurden offenbar auch schwach HGF gefärbte Tumoren, entsprechend Grad 1, als positiv gewertet. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Derzeit gibt es keinen etablierten Auswertealgorithmus für MET-FISH in Sarkomen. In einer Publikation über MET-FISH in Lungenkarzinomen (124) wurde ein Modell angewandt, welches versuchte ausschließlich zweifelsfrei amplifizierte Tumoren zu identifizieren und auch nur diese als amplifiziert bewertete. Dazu wurden Positivitätskriterien zusammengeführt, die auch für andere FISH-Sonden gültig und generell anerkannt sind, z.B. bei Her2 (159), FGFR1 (123) und EGFR (151). Aufgrund der allgemeinen Akzeptanz dieser Kriterien wurden sie auch bei den hier untersuchten Sarkomen angewandt. Weiterhin gab es unter allen „nicht hoch amplifizierten“ Tumoren, außer den klar negativen, noch die zwei Zwischenkategorien des mittelgradigen und niedrigen MET-Levels. Tumoren wurden dort einsortiert, wenn die harten Positivitätskriterien (MET/CEN 7 Ratio ≥ 2,0 oder durchschnittliche METGenkopienzahl pro Zelle von ≥ 6,0 oder ≥ 15 MET-Kopien/Zellkern in ≥ 10 % der Tumorzellen) nicht erfüllt waren, aber trotzdem ein nicht von der Hand zu weisender MET-Zugewinne vorhanden war. Bei der FISH-Analyse von FGFR1 (123) und EGFR (151) gelten diese Gruppen als positiv. Ob diese geringeren Gen-Zugewinne jedoch klinisch oder therapeutisch auch bei MET relevant sind, ist bislang unklar. Dennoch wurden diese Zwischenkategorien eingeführt und auch als positiv gewertet. Die Anwendung dieser Auswertekriterien resultierte in einer hohen Amplifikationsrate von 6 % in undifferenzierten pleomorphen Sarkomen, und zwar ausschließlich in dieser Sarkomentität. Auffallend war, dass wenn man sich die mittelgradigen und niedrigen Fälle anschaute, es sich bei vier weiteren Tumoren um undifferenzierte pleomorphe Sarkome handelte, ein mittelgradiges und drei niedrige MET-Level. Wertet man nun alle drei Kategorien, hohe Amplifikation, mittelgradig und niedrig, als FISH-positiv, waren insgesamt 19 % der undifferenzierten pleomorphen Sarkome MET-positiv. Auch 68 Diskussion waren 11 % der Angiosarkome und 10 % der pleomorphen Liposarkome niedrig-METLevel. Die anderen Tumorentitäten (DDLS, MLS, LMS) wiesen niedrige MET-Level in ≤ 4 % der Tumoren auf. Die Entitäten ALT, SS, MPNST, CCS und GIST waren vollständig MET-negativ. Bislang ist unklar, ob eine MET-Amplifikation oder mittelgradiger/niedriger METGengewinn ein Prädiktor für das Ansprechen eines Tumors auf eine anti-METTherapie ist. Insbesondere in Fällen, die zwar einen genetischen Zugewinn haben, aber keine immunhistochemisch nachweisbare MET- oder phospho-MET- Überexpression zeigen, ist der Effekt einer anti-MET-Therapie unklar. Denn die TKI oder Antikörper wirken gegen den Rezeptor und wenn dieser nicht überexpremiert wird, ist fraglich, ob die Therapie eine Wirkung auf die Tumorzellen hat. Mit dem MET(SP44)-Antikörper, dem einzigen verfügbaren validierten MET-Antikörper, hatten nur 2/13 FISH-positiven Fällen eine MET-Überexpression. Wohingegen mit den nicht validierten Antikörpern 4/14 Tumoren MET-(C-28)- und 3/13 phospho-MET-positiv waren. Diese positiven Färbungen waren ganz verstreut, nur ein einziger Fall war mit zwei Markern, MET-(SP44)- und MET-(C-28)-positiv. Es handelte sich um ein Angiosarkom. Deshalb wird hier der Ansatz favorisiert, die Methoden der Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Immunhistochemie voneinander unabhängig zu betrachten bis weitere Erkenntnisse bezüglich der Prädiktion vorliegen. Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion Für die reverse Transkriptase-quantitative PCR stand kein frisches sondern nur Formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe zur Verfügung. Die Fixierung kann häufig zu einer starken Fragmentierung der RNA führen, wodurch die Qualität der Ergebnisse leidet. Ein weiteres, leider unumgängliches Problem war das unterschiedliche Alter der Paraffinblöcke, denn die CP-Werte sind vom Alter des Materials abhängig (9) und darunter leidet die Vergleichbarkeit der CP-Werte. Das Kontrollgewebe Darmwand war aus den Jahren 2011 und 2012, die Tumorproben stammten von 2005-2011. Bei einigen Proben, Darmwand- und Tumorproben, lag kein CP-Wert vor. Ursachen dafür, obwohl die RNA-Menge ausreichend war, können Fehler während der cDNASynthese oder der RT-qPCR gewesen sein. Obwohl, wie in den MIQE-Empfehlungen (minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments) (15) geschrieben, die Produkte zweier cDNA-Synthesen Schwankungen in der cDNA-Synthese auszugleichen. 69 gemischt wurden, um Diskussion Die MET-Expression war in der Gesamtgruppe der in der RT-qPCR untersuchten Tumoren sowie in den Entitäten ASA, LMS und MPNST im Vergleich zur Darmwand signifikant herunterreguliert. Dies ist ein bekanntes Phänomen bei MET (36). Einige der ausgewählten Tumorgruppen hatten eine erhöhte MET-Expression verglichen mit dem jeweiligen Kontrollgewebe (FISH-positive, niedriges MET-Level, ASA und LMS im Vergleich zu FISH-negativen Tumoren; MET-(SP44)-positive im Vergleich zu MET-(SP44)-negativen ASA; MET-(C-28)-positive LMS und MPNST im Vergleich zu IHC-negativen Tumoren). Die vermehrte Expression war jedoch nicht signifikant. Dies könnte an den hier zum Teil sehr kleinen Fallzahlen liegen. HGF-positive ASA, LMS und MPNST hatten ein erhöhtes MET-Expressionslevel als HGF-negative Tumoren dieser Entitäten, jedoch war die vermehrte Expression nicht signifikant. HGF als Ligand des MET-Rezeptors scheint in diesen Tumorzellen über eine autokrine, positive Rückkopplung zu einer gesteigerten Expression des METGens zu führen. Schlussfolgerung Im Frühstadium der Entwicklung neuer Biomarker und Therapeutika sind noch sehr viele Punkte unklar. Die Ergebnisse der klinischen Studien von MET werden hoffentlich zeigen, ob überhaupt eine vorab Selektion der Patienten nach Alterationen sinnvoll ist oder nicht, welche Störungen des Signalwegs relevant sind, ob FISH und Immunhistochemie oder andere Methoden ein Prädiktor für das Ansprechen der Patienten von klinischen Studien sind, und ob unsere Auswertungsstrategien richtig sind. Im Idealfall werden durch die Ergebnisse der klinischen Studien Schwellenwerte und Positivitätskriterien für FISH und Immunhistochemie zu errechnen sein. Es stellt sich die Frage, ob denn zum jetzigen Zeitpunkt eine Patientenstratifizierung sinnvoll ist oder ob es ein besserer Ansatz wäre, alle Patienten in die Studien einzuschließen, im Verlauf verschiedene Parameter des MET-Signalwegs zu messen und retrospektiv eine Abhängigkeit des Therapieerfolges von diesen Parametern zu ermitteln. Für das erstgenannte Vorgehen, also eine frühzeitige Patientenstratifizierung, spricht, dass in mehreren Studien das Therapieansprechen bei Tumoren mit MET-Alterationen besser war als bei Tumoren ohne MET-Alteration. Daher ist die Empfehlung, die sich aus meinen Ergebnissen ergibt, dass Angiosarkome und undifferenzierte pleomorphe Sarkome auf eine MET-Überexpression und METAmplifikation, Klarzellensarkome und MPNST auf eine MET- und HGF-Expression, und pleomorphe Liposarkome auf eine MET-Amplifikation untersucht werden sollten (Details und Zusammenfassung zu den einzelnen Entitäten siehe unten). Somit könnte 70 Diskussion man Patienten, die für eine anti-MET- bzw. anti-HGF-Therapie in Frage kommen, identifizieren. Patienten mit anderen Sarkomentitäten, wie den häufigen Subtypen der atypischen lipomatösen Tumoren, dedifferenzierten Liposarkomen, Leiomyosarkomen und GIST können von vornherein von einer MET-FISH-Untersuchung ausgeschlossen werden. Auch Synovialsarkome (SS) kommen nach meinen Daten nicht für eine MET-Therapie in Frage, obwohl die Literatur Hinweise dafür liefert, dass der HGF/MET-Signalweg eine Rolle in diesen Tumoren spielt (65, 94). 71 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Sarkome sind eine relativ seltene und heterogene Tumorgruppen. In Deutschland liegt die Inzidenz bei ca. 1500-2000 Neuerkrankungen jährlich. Die Therapieoptionen sind beschränkt und daher ist die Prognose meist schlecht. Umfassende präklinische und insbesondere klinische Studien in Hinblick auf eine mögliche personalisierte Therapie wurden in Sarkomen bislang kaum durchgeführt. MET ist ein derzeit in präklinischen und frühen klinischen Studien erprobter Biomarker. Es handelt sich um einen Tyrosinkinaserezeptor, der bei aberranter Aktivierung zu Tumorentstehung, -progression, Angiogenese und Metastasierung führen kann. Der einzige Ligand dieses Rezeptors ist HGF. In dieser Arbeit sollten Sarkome daraufhin untersucht werden, ob sie potentielle Kandidaten für eine gegen die HGF/MET-Achse gerichtete molekulare Therapie sind. Der HGF/MET-Signalweg wurde auf mehreren Ebenen auf Aberrationen hin untersucht. Immunhistochemisch wurde die MET- und HGF-Proteinexpression mit vier verschiedenen Antikörpern untersucht. Mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung wurde die MET-Genkopienzahl untersucht. In ausgewählten Fällen wurde die MET-RNAExpression mit einer reversen Transkriptase-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) gemessen. Insgesamt wurden 484 Tumorproben von elf klinisch relevanten Sarkomentitäten eingeschlossen. In den immunhistochemischen Untersuchungen mit dem validierten Antikörper MET(SP44) konnten eindeutig zwei Entitäten mit einer MET-Proteinüberexpression identifiziert werden. Ausschließlich Angiosarkome (17 %) und undifferenzierte pleomorphe Sarkome (UPS) (14 %) waren MET-positiv. Dies entsprach 2,6 % aller Sarkome. In den Färbungen mit dem MET-(C-28)-Antikörper waren 6 % der Tumoren positiv (insbesondere Synovialsarkome 20 %, Angiosarkome 17 % und maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNST) 17 %). Phosphoryliertes MET (phosphoMET-Antikörper) war in 11 % der Tumoren nachweisbar (besonders in Angiosarkomen 42 %, Klarzellensarkomen 39 %, MPNST 21 %, pleomorphen Liposarkomen 20 % und UPS 14 %). HGF-positiv waren 6 % der Sarkome (besonders UPS 33 %, Angiosarkome 15 %, Klarzellensarkome 15 %, MPNST 13 %). Die Korrelation zwischen der MET-(SP44)-Expression und den anderen drei Antikörpern war signifikant. Die Koexpression von MET und HGF, die in 66 % der MET-(SP44)positiven Fällen gesehen wurde, deutete auf eine autokrine Aktivierungsschleife der Tumorzellen hin. 72 Zusammenfassung Auch in der MET-FISH waren hauptsächlich undifferenzierte pleomorphe Sarkome und Angiosarkome positiv. Zwei UPS waren hochgradig amplifiziert (6 %). Ein UPS (3 %) wies einen mittelgradigen und 12 Tumoren, darunter drei weitere UPS (9 %) und vier Angiosarkome (11 %), einen niedrigen MET-Gengewinn auf. Insgesamt waren 4 % aller Tumoren FISH-positiv. Die RT-qPCR konnte zwischen der MET-RNA-Expression von FISH- oder immunhistochemisch-positiven Tumoren und negativen Tumoren oder Normalgewebe keine signifikante Hochregulierung zeigen. Aufgrund dieser Ergebnisse, insbesondere der MET-(SP44)-Immunhistochemie und der FISH, ist es empfehlenswert, dass in erster Linie Angiosarkome und UPS auf eine MET-Überexpression und MET-Amplifikation untersucht werden sollten. Weiterhin sollte in Erwägung gezogen werden Klarzellensarkome und MPNST auf eine MET- und HGF-Expression, und pleomorphe Liposarkome auf eine MET-Amplifikation zu untersuchen. Dadurch könnten auch Patienten mit malignen Weichteiltumoren für klinische Studien für anti-MET- oder anti-HGF-Therapeutika ausgewählt werden. 73 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis 1. 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PLoS ONE. 10(4):e0120079. 85 Anhang 8 Anhang 8.1 Protokoll der immunhistochemischen Färbung Indirekte-2-Schritt-Methode: 1) 3-4 μm dicke Paraffinschnitte herstellen, auf Objektträger (X-tra® Slides, Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland) ziehen und über Nacht bei 60 °C trocknen lassen 2) Entparaffinieren mit 2 x 100 % Xylol für 10 Min. 3) Rehydrieren in absteigender Alkoholreihe (2 x 100 % Ethanol 10 Min., 1 x 96 % Ethanol 5 Min., 1 x 80 % Ethanol 5 Min., 1 x 70 % Ethanol 5 Min.) 4) Waschen mit einem Puffer (Tris buffered saline & Tween 20) 5) Vorbehandlung entsprechend dem Antikörper mit EDTA oder Citrat 6) Inkubation der Schnitte mit dem jeweiligen Primärantikörper in der blocking for entsprechenden Konzentration für 30 Min. bei Raumtemperatur 7) 5 Min. Hydrogen-Peroxid-Behandlung 8) Spülen mit Waschpuffer 9) Inkubation mit dem Enhancer/Verstärker (post antibody BrightVision plus) für 10 Min. 10) Spülen mit Waschpuffer 11) 15 Min. Inkubation mit Polymer Poly-HRP-GAM/R/RIgG 12) 8 Min. Inkubation mit DAB (Substrat/Chromogen) 13) Spülen mit Waschpuffer 14) 2 Min. Hämalaun einwirken lassen 15) Spülen mit Waschpuffer und anschließend mit Wasser 16) Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydrieren 17) Eindecken der Objektträger mit einem Deckglas. 86 Anhang 8.2 Protokoll der Fluoreszenz in situ Hybridisierung Die hier verwendeten FISH-Präparate wurden mit dem FISH-Automaten VP2000 Prozessor (Abbott Molecular, Wiesbaden, Deutschland) hergestellt. Das nachfolgende Protokoll erstreckt sich über zwei Arbeitstage, wobei zahlreiche Schritte automatisiert im VP2000 ablaufen. Tag 1: 1) 4 µm dicke Paraffinschnitte herstellen und auf Adhäsions-Objektträgern aufziehen, bei 37 °C trocknen 2) 30 Min. bei 60 °C Paraffin ablaufen lassen 3) 2 Wasserbäder, 80 °C und 37-°C vorbereiten, Lösungen vorwärmen (automatisch im VP2000) 4) Einsetzen der Objektträger in die Halterung des VP2000, starten des automatischen Computersystems 5) 2 x 10 Min. Xylol 6) 2 x 5 Min. 100 % Isopropanol 7) 1 Min. 96 % Isopropanol 8) 1 Min. 80 % Isopropanol 9) 1 Min. 70 % Isopropanol 10) 5 Min. bei 37 °C oder RT trocknen lassen 11) 20 Min. 0,2 M HCl 12) 3 Min. Aqua dest 13) 3 Min. 2 x SSC-Waschpuffer 14) 30 Min. Pretreatment Solution (80 °C ) 15) 1 Min. Aqua dest 16) 2 x 5 Min. 2 x SSC-Waschpuffer 17) 1,5 Std. Protease bei 37 °C 18) 2 x 5 Min. 2 x SSC-Waschpuffer 19) 10 Min. 4 % gepuffertes Formalin 20) 2 x 5 Min. 2 x SSC-Waschpuffer 21) 1 Min. Aqua dest 22) Schnitte bei 37 °C oder RT trocknen lassen. Ende des VP2000-Programms. 23) 5-10 µl Sonde auf den Schnitt geben, mit Deckgläschen versehen und mit Fixogum abdichten 24) Hybridisierung über Nacht bei 37 °C im HyBrite™ VYSIS (Abbott) Tag 2: 87 Anhang 25) 10 Min. bei 75 °C denaturieren 26) Wasserbad auf ca. 76 °C einstellen, Post-Hybridisierungs-Puffer in 2 x SSC vorwärmen 27) Fixogum vom Objektträger entfernen 28) in 2 x SSC-Waschpuffer stellen bis Deckgläschen abgeht 29) 2 Min. Post-Hybridisierungs-Puffer bei 72 °C (wichtigster Schritt, Temperatur muss exakt sein, immer kontrollieren, höchstens drei Schnitte gleichzeitig inkubieren) 30) kurz in 2 x SSC-Waschpuffer 31) Schnitt abtrocknen 32) 10 µl DAPI auf Objektträger, eindecken. 88 Anhang 8.3 Protokoll der RNA-Extraktion Die RNA-Extraktion aus dem Formalin-fixierten Tumor- und Kontrollgewebe wurde mit dem RNeasy FFPE-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) wie folgt durchgeführt: 1) Sechs 10 µm dicke Paraffinschnitte unter RNAse freien Konditionen schneiden und auf Objektträger ziehen 2) Entparaffinierung und Rehydrierung (Verdünnungen mit RNAse-freiem DEPCWasser): a. 2 x 10 Min. Xylol b. 2 x 10 Min. 100 % Ethanol c. 10 Min. 96 % Ethanol d. 10 Min. 80 % Ethanol e. 10 Min. 70 % Ethanol f. 1 Min. DEPC-Wasser 3) Makrodissektion des Tumorgewebes in 1,5 ml Eppendorf mit 240 µl PDK-Puffer und 10 µl Proteinase K 4) 5 Min. bei 56 °C inkubieren 5) 15 Min. bei 80 °C inkubieren 6) 1 Min. zentrifugieren, 13,300 rpm 7) Klare Flüssigkeit in ein neues 1,5 ml Eppendorf Tube pipettieren 8) 3 Min. auf Eis inkubieren 9) 15 Min. zentrifugieren, 13,300 rpm 10) Überstand in ein neues 2 ml Eppendorf Tube pipettieren 11) 25 µl DNAse Booster Buffer und 10 µl DNAse Stock Solution hinzupipettieren 12) 15 Min. bei Raumtemperatur inkubieren 13) 500 µl RPC Puffer 14) 1200 µl Ethanol 100% 15) 700 µl in eine RNeasy MinElute spin column pipettieren, 15 Sek. zentrifugieren bei 10,000 rpm, Durchlaufflüssigkeit verwerfen 16) Diesen Schritt wiederholen, bis die Flüssigkeit aufgebraucht ist 17) 500 µl RPE Puffer in die RNeasy MinElute spin column pipettieren, 15 Sek. bei 10,000 rpm zentrifugieren 89 Anhang 18) 500 µl RPE Puffer in die RNeasy MinElute spin column pipettieren, 2 Min. bei 10,000 rpm zentrifugieren, um die Membran zu waschen 19) Durchflussflüssigkeit und collection tube verwerfen 20) Spin column in ein neues 2 ml collection tube einsetzen, mit offenem Deckel 5 Min. bei 13,300 rpm zentrifugieren 21) Durchfluss und collection tube verwerfen, spin column in ein neues 1,5 ml Eppendorf tube setzen 22) 30 µl RNAse-freies-Wasser direkt auf die Membran pipettieren 23) 1 Min. inkubieren 24) 1 Min. zentrifugieren, 13,000 rpm, spin column verwerfen 25) Eluat in einen Kühlblock stellen 26) Lagerung der RNA bei -80 °C 90 typ zahl CEN7- Disome Signale Signale Zellen (n) (n) (%) Zellen mit Zellen mit Zellen mit Zellen mit ≥3 MET- ≥4 MET- ≥5 MET- ≥15 MET- ≥3 CEN7- Zellen mit Signalen Signalen Signalen Signalen Signalen (%) (%) (%) (%) (%) MET/ MET- CEN7- Amplifi- CEN7- Signale Signale kations- Ratio i.D. i.D. level 1 LMS 60 196 153 40 60 45 21,7 0 50 1,3 3,3 2,6 niedrig 2 ASA 60 245 158 20 80 60 38,3 0 50 1,6 4,1 2,6 niedrig 3 ASA 60 202 156 35 65 45 20 0 45 1,3 3,4 2,6 niedrig 4 ASA 60 232 160 23,3 67,7 55 35 0 45 1,4 3,9 2,7 niedrig 5 ASA 60 260 185 38,3 61,7 45 38,3 3,3 63,3 1,4 4,3 3,1 niedrig 6 DDLS 60 338 282 38,3 61,7 40 38,3 8,3 48,3 1,2 5,6 4,7 niedrig 7 DDLS 60 196 185 35 65 41,7 15 0 60 1,1 3,3 3,1 niedrig 8 MLS 60 242 189 21,7 78,3 58,3 41,7 0 65 1,3 4 3,2 niedrig 9 PLS 60 230 150 31,7 68,3 41,7 30 1,7 41,7 1,5 3,8 2,5 niedrig 10 UPS 60 198 231 33,3 66,7 41,7 16,7 0 71,7 0,9 3,3 3,9 niedrig 11 UPS 60 195 166 28,2 71,7 46,7 15 0 55 1,2 3,3 2,8 niedrig 12 UPS 60 263 256 35 65 56,7 25 0 70 1 4,4 4,3 niedrig 13 UPS 60 308 158 15 85 63,3 51,7 1,7 53,3 1,95 5,1 2,6 mittel 14 UPS 60 914 708 1,7 98,3 96,7 96,7 53,3 91,7 1,3 15,2 11,8 hoch 15 UPS 60 501 309 13,3 86,7 71,7 65 20 75 1,6 8,4 5,2 hoch Anhang Nr. MET- Tabelle der Parameter der FISH-positiven Fälle Zell- 8.4 Tumor- Tabelle 30: Parameter der FISH-positiven Fälle (126) Legende: ASA, Angiosarkom; DDLS, dedifferenziertes Liposarkom; i.D., im Durchschnitt; LMS, Leiomyosarkom; MLS, myxoides Liposarkom; Nr., Nummer; PLS, pleomorphes Liposarkom; UPS, undifferenziertes pleomorphes Sarkom; CEN 7, Zentromer 7. 91 Fall- Anhang 8.5 Tabelle der ausführlichen Darstellung der Korrelation zwischen MET-FISH und MET-(SP44)-Immunhistochemie Tabelle 31: Ausführliche Darstellung der Korrelation zwischen MET-FISH und MET(SP44)-Immunhistochemie (126) FISH-Ergebnis, Anzahl (% der auswertbaren Fälle) METTumor- Fall- IHC* typ zahl ALT DDLS MLS PLS LMS ASA SS 43 70 30 10 69 41 15 Negativ Positiv Niedrig Mittelgradig Hoch n.a. Gesamt 0 33 0 0 0 9 42 (100%) 1+ 0 0 0 0 0 0 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 1 0 0 0 0 1 Gesamt 34 (100%) 0 0 0 9 43 0 61 1 0 0 3 65 (96%) 1+ 2 1 0 0 0 3 (4%) 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 2 0 0 0 0 2 Gesamt 65 (97%) 2 (3%) 0 0 3 70 0 21 0 0 0 0 21 (100%) 1+ 0 0 0 0 0 0 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 5 1 0 0 3 9 Gesamt 26 (96%) 1 (4%) 0 0 3 30 0 9 1 0 0 0 10 (100%) 1+ 0 0 0 0 0 0 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 0 0 0 0 0 0 Gesamt 9 (90%) 1 (10%) 0 0 0 10 0 62 1 0 0 4 67 (97%) 1+ 2 0 0 0 0 2 (3%) 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 0 0 0 0 0 0 Gesamt 64 (98%) 1 (2%) 0 0 4 69 0 14 2 0 0 3 19 (66%) 1+ 4 0 0 0 1 5 (17%) 2+ 4 1 0 0 0 5 (17%) n.a. 11 1 0 0 4 12 Gesamt 33 (88%) 4 (12%) 0 0 4 41 0 11 0 0 0 2 13 (93%) 92 Anhang FISH-Ergebnis, Anzahl (% der auswertbaren Fälle) METTumor- Fall- IHC* typ zahl CCS Positiv Niedrig Mittelgradig Hoch n.a. Gesamt 1+ 1 0 0 0 0 1 (7%) 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 0 0 0 0 1 1 Gesamt 12 (100%) 0 0 0 3 15 0 18 0 0 0 3 15 (63%) 1+ 2 0 0 0 1 3 (13%) 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 0 0 0 0 0 0 Gesamt 20 (100%) 0 0 0 4 24 0 17 3 0 1 4 25 (69%) 1+ 5 0 0 1 0 6 (17%) 2+ 4 0 1 0 0 5 (14%) n.a. 0 0 0 0 0 0 Gesamt 26 (81%) 3 (9%) 1 (3%) 2 (6%) 4 36 0 0 0 0 0 0 0 1+ 0 0 0 0 0 0 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 11 0 0 0 2 13 Gesamt 11 0 0 0 2 13 0 58 0 0 0 17 75 (100%) 1+ 0 0 0 0 0 0 2+ 0 0 0 0 0 0 n.a. 40 0 0 0 18 58 Gesamt 98 (100%) 0 0 0 35 133 MPNST 24 UPS Negativ 36 13 GIST 133 Gesamt 484 398 (96%) 12 (3%) 1 (0.3%) 2 (0.6%) 71 484 Negativ: Positiv: 15 (4%) 398 (96%) Legende: ALT, atypischer lipomatöser Tumor; ASA, Angiosarkom; CCS, Klarzellensarkome; DDLS, dedifferenziertes Liposarkom; GIST, gastrointestinaler Stromatumor; IHC, Immunohistochemie; LMS, Leiomyosarkom; MLS, myxoides Liposarkom; MPNST, maligner peripherer Nervenscheidentumor; n.a., nicht auswertbar; PLS, pleomorphes Liposarkom; SS, Synovialsarkom; UPS, undifferenziertes pleomorphes Sarkom; * Grad 3-Färbungen waren nicht nachweisbar. Die Prozentwerte beziehen sich nur auf die auswertbaren Fälle und nicht auf die Gesamtfallzahl. 93 Anhang 8.6 Tabelle der Ergebnisse der RT-qPCR (CP-Werte) Tabelle 32: Ergebnisse der RT-qPCR (CP-Wert) Gewebe DDLS ASA LMS Fallnummer T667/08 T735/07 T627/07 T607/08 T665/08 T653/07 T781/07 T66/08 T216/08 T270/08 T462/06 T477/09 T712/07 T733/07 T356/09 T541/11 T799/11 T1071/10 T303/11 T523/11 T766/08 T295/08 T58/08 T129/07 T578/06 T577/06 T574/06 T171/09 T167/06 T168/09 T775/08 C16193/11 T78/11 T823/10 T533/06 T535/06 T259/05 T348/05 T297/09 T132/09 T334/08 T276/07 CP-Wert MET 35,47 39,59 30,92 39,26 39,33 36,76 38,07 40,55 37,34 40,44 41,11 39,54 37,46 42,46 41,60 32,68 33,30 34,43 33,77 38,26 37,54 39,05 41,05 34,20 36,28 39,40 38,99 38,86 39,64 35,57 38,78 39,73 38,16 38,84 40,45 38,95 39,54 37,95 39,69 40,20 39,03 39,57 CP-Wert IPO8 32,23 34,99 33,51 34,34 33,67 33,26 34,92 35,45 33,29 34,79 34,25 32,19 35,08 38,35 34,61 31,66 30,04 33,01 31,70 32,69 33,59 31,51 33,65 32,23 31,00 33,94 36,48 33,18 33,28 32,90 35,86 36,63 34,45 34,77 34,87 34,61 33,80 33,23 31,93 33,65 33,58 33,68 CP-Wert PPIA 30,22 33,36 32,70 35,86 34,30 34,70 32,66 43,14 29,34 32,35 36,56 35,08 32,21 31,07 32,95 28,10 29,20 29,01 29,92 32,18 32,53 30,87 33,93 31,00 32,33 35,17 37,36 34,42 33,43 31,08 37,43 37,89 35,23 31,61 35,07 35,88 36,68 33,45 32,81 33,53 36,38 35,86 94 Anhang MPNST Kontrollgewebe Darmwand 95 T532/05 T458/06 T460/06 T255/06 T584/08 T74/06 T255/07 T176/05 T221/05 T238/05 T240/05 T483/06 T585/06 T586/06 T165/07 T620/07 T718/07 T54/08 T203/08 T206/08 T374/08 T745/08 T805/08 T257/09 C606/12 C870/12 C1102/12 C2946/12 C2960/12 C2724/12 C298/12 C31722/11 C35193/11 C35713/11 C36898/11 C38003/11 C38776/11 C39660/11 C40019/11 C3505/12 C5299/12 C3507/12 40,29 38,01 41,23 41,66 38,70 39,52 38,98 33,03 39,77 38,90 39,77 41,22 39,10 38,03 40,74 40,44 40,32 41,80 41,09 39,39 36,01 36,27 38,17 33,65 39,85 38,09 40,51 36,87 40,06 38,90 37,61 41,34 38,04 36,49 37,33 35,99 37,32 38,19 40,48 37,70 38,02 41,43 32,87 31,79 35,70 32,90 30,62 33,92 33,77 32,91 32,01 38,59 31,91 35,17 32,28 32,84 35,06 32,50 35,39 32,88 33,99 34,90 32,38 32,29 31,82 30,63 37,03 34,26 35,44 34,50 38,50 35,43 34,17 38,11 34,07 33,01 33,28 33,10 33,45 34,67 36,01 33,05 33,03 35,65 35,46 32,63 38,65 32,67 32,50 35,45 36,72 35,49 33,69 38,33 31,76 37,65 33,16 33,71 36,38 33,37 36,47 34,64 34,86 33,85 30,68 29,41 32,80 31,25 34,26 31,16 36,97 34,18 38,91 37,08 36,29 41,24 34,93 30,04 29,77 32,88 34,20 30,59 31,80 33,58 34,75 36,78 Anhang 8.7 Tabelle der Zusammenfassung der aktuellen klinischen Studien von MET- und HGF-Inhibitoren für solide Tumoren Tabelle 33: Zusammenfassung der aktuellen klinischen Studien von MET- und HGFInhibitoren für solide Tumoren (93) Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor AMG 208 MET / small Amgen Solide Tumoren - Fragestellung: Korrelation Phase 1 molecule Therapie-ansprechen mit inhibitor MET-Expression, Mutation, -Amplifikation AMG 337 MET / small Amgen Fortgeschrittene solide k.A. Phase 1 Fortgeschrittene solide - Tumorprofil: Phase 1 Tumoren; Sarkome; MET-Expression IHC 1+ in Magenkarzinome > 10 % Tumorzellen molecule Tumoren; inhibitor terapierefraktäre solide Tumoren inkl. ZNS bei Kindern - Fragestellung: Level von MET und phospho-MET vor und nach Therapie in Tumorbiopsien Magenkarzinome - Tumorprofil: MET- Phase 2 Amplifikation - Fragestellung: Korrelation METAmplifikation, -Expression , -Mutation mit Therapieansprechen RCC - Fragestellung: Korrelation Phase 2 Therapieansprechen und MET-Expression Metastasierte k.A. Phase 2 Prostatakarzinome Rezidivierte oder - Tumorprofil: Hohe MET- Phase 2 metastasierte Kopf- Expression, hohe MET- /Halstumoren Genkopienzahl Maligne Mesotheliome - Fragestellung: Phase 2 Änderungen Serum 96 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor HGF/MET-IHC zwischen Therapieansprechen und nicht Ansprechen; Assoziation zwischen HGF/MET-IHC und METAmplifikation mit PFS; führt MET-Amplifikation zu sensitiverem Ansprechen; Korrelation MET-FISH und -IHC Metastasierte, triple- - Fragestellung: MET- und Phase 2 negative HGF-Expression vor und Mammakarzinome während der Studie in IHC und FISH; MET- und phospho-MET-Level im Archivtumormaterial; MET in CTC; Therapiewirkung auf MET- und HGF-Level in IHC und FISH Armando Maligne pleurale Santoro, MD Mesotheliome; NSCLC - Fragestellung: Phase 1/2 Veränderungen von HGF und sMET unter Therapie; phospho-MET- und METExpression Fortgeschrittene CRC - Tumorprofil: MET- Phase 2 Überexpression IHC 2+ oder 3+ in ≥ 50 % der Tumorzellen mit dem Ventana Test Kit (METSP44) ArQule Fortgeschrittene solide - Fragestellung: Tumoren Pharmakodynamik von Phase 1 MET und phospho-MET RCC und andere - Tumorprofil: MET- Phase 1 Tumoren Expression HCC bei Zirrhose - Fragestellung: Therapie- Phase 1 assoziierte Veränderungen von HGF und sMET Fortgeschrittene, KRAS- k.A. positive NSCLC; HCC; 97 Phase 2 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor translokationsassoziierte RCC, ASPS, CCS (MiTF positive Tumoren); Magenkarzinome; Pankreaskarzinome Daiichi Solide Tumoren k.A. Phase 1 Sankyo Inc. Metastasierte CRC k.A. Phase 1/2 Keimzelltumoren, nicht k.A. Phase 2 k.A. Phase 3 ZNS nicht-plattenepitheliale NSCLC Dana-Farber Metastasierte, triple- - Fragestellung: Expression Phase 2 Cancer negative von MET und phospho Institute Mammakarzinome MET, MET-positive CTC Kyowa Hakko HCC; NSCLC k.A. Phase 1 Kirin NSCLC mit EGFR- k.A. Phase 2 Company, aktivierender Mutation; Limited Magenkarzinome k.A. Phase 3 k.A. Phase 1/2 k.A. Phase 1/2 k.A. Phase 1 k.A. Phase 1/2 k.A. Phase 1/2 NSCLC mit EGFRWildtyp; HCC Sarah Unbehandelte, Cannon metastasierte Research Adenokarzinome distaler Institute Ösophagus, GEJ, Magen SCRI Fortgeschrittene solide Development Tumoren; unbehandelte, Innovations, metastasierte LLC Adenokarzinome Ösophagus, GEJ, Magen BMS-777/ MET / ASLAN002607 selektiver, ATPkompetitiver Aslan Fortgeschrittene oder Pharma- metastasierte solide ceuticals Tumoren Bristol-Myers Fortgeschrittene oder Kinaseinhibitor Squibb metastasierte solide Tumoren E7050 MET, VEGFR2 Eisai Inc. Fortgeschrittene solide (Golvatinib) / ATP- Tumoren; Glioblastome; kompetitiver Melanome (Stadium 3/4); Multikinase- Magenkarzinome; inhibitor Plattenepithelkarzinome 98 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor Kopf/Hals; HCC EMD 1204831 MET / EMD Serono Solide Tumoren - Tumorprofil: MET- selektiver Mutation, Überexpression, Kinaseinhibitor Amplifikation EMD 1214063 MET / EMD Serono Solide Tumoren - Tumorprofil: MET- selektiver Mutation, Amplifikation , Kinaseinhibitor Überexpression GSK1363089 MET, VEGFR2 GlaxoSmith- Metastasierte, nicht (vormals / ATP- Kline XL880) kompetitiver Tumoren; HCC Mulitkinase- Metastasierte inhibitor Mammakarzinome, Phase 1 Phase 1 k.A. Phase 1 k.A. Phase 1/2 resektable solide Her2-positiv NSCLC Fragestellung: Korrelation Phase 1/2 zwischen Therapieansprechen und MET-Mutation, Amplifikation, -Expression, phospho-MET-Expression, Serum HGF-Level Papilläre RCC k.A. Phase 2 Metastasierte - Fragestellung: Phase 2 Adenokarzinome distaler Plasmakonzentration Ösophagus, GEJ, Magen sMET und HGF Triple-negative k.A. Phase 2 Mammakarzinome; Plattenepithelkarzinome Kopf/Hals HMPL-504 MET / small AstraZeneca Papilläre RCC k.A. Phase 2 (Volitinib) molecule Hutchison k.A. Phase 1 inhibitor Medipharma Tumoren Fortgeschrittene solide Limited INC280 MET / NIH Papilläre RCC k.A. Phase 2 selektiver Novartis Therapierefraktäre - Tumorprofil: MET- Phase 1 NSCLC; HCC; Dysregulation Kinaseinhibitor Mammakarzinome; nasopharyngeale 99 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor Karzinome; RCC; Magenkarzinome; Glioblastome; solide Tumoren Glioblastome, PTEN k.A. Phase 1/2 mutiert, homozygot deletiert oder IHCnegativ Plattenepithelkarzinome - Tumorprofil: MET-positiv, Phase 1/2 Kopf/Hals; metastasierte MET-IHC 2+ oder 3+ in CRC ≥ 50 % der Tumorzellen NSCLC mit EGFR- - Tumorprofil: MET- Mutation und amplifiziert Phase 2 Progression nach EGFR- - Fragestellung: Messung Therapie der MET-Inhibition durch phospho-MET-IHC vor und nach Therapie HCC - Tumorprofil: MET- Phase 2 Dysregulation - Fragestellung: sMET und HGF vor und unter Therapie Melanome mit BRAF- k.A. Phase 2 Mutation University of NSCLC - Tumorprofil: MET-positiv, Phase 1 California, FISH-positiv, IHC 2+/3+, Davis RT-PCR-positiv oder mutiert INCB28060 MET / Incyte Fortgeschrittene Fragestellung: Messung selektiver Corporation Tumoren der prozentualen Kinaseinhibitor Phase 1 Inhibierung der METPhosphorylierung JNJ-38877605 MET / selektiver, Johnson & Fortgeschrittene solide Johnson Tumoren Genentech Fortgeschrittene oder k.A. Phase 1 k.A. Phase 1 ATPkompetitiver Kinaseinhibitor MetMab MET / (PRO143966) Antikörper metastasierte solide Tumoren 100 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor CRC k.A. Phase 2 NSCLC - Tumorprofil: MET-IHC- Phase 2 positiv NSCLC - Tumorprofil: MET-IHC- Phase 3 positiv Hoffmann- La Fortgeschrittene oder Roche k.A. Phase 1 k.A. Phase 2 metastasierte solide Tumoren Metastasiertes, triplenegative Mammakarzinome; Glioblastome Magenkarzinome, Her2- - Tumorprofil: MET-IHCnegativ positiv NSCLC - Tumorprofil: MET-IHC- Phase 2/3 Phase 3 positiv MGCD265 MET, VEGFR2 MethylGene Fortgeschrittene / ATP- Inc. kompetitiver k.A. Phase 1 NSCLC k.A. Phase 1/2 Fortgeschrittene solide k.A. Phase 1/2 k.A. Phase 1 k.A. Phase 1/2 Tumoren Multikinaseinhibitor MK2461 MET, FGFR, Merck PDGFR, KDR, Tumoren FLT, TRK / ATPkompetitiver Multikinaseinhibitor MK-8033 MET / Merck selektiver, Fortgeschrittene solide Tumoren ATPkompetitiver Kinaseinhibitor MP-470 MET, KIT, Astex Fortgeschrittene solide (Amuvatinib) RET, FLT3, Pharma- Tumoren; SCLC PDGFRa / ceuticals ATPkompetitiver Multikinaseinhibitor 101 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor PF-02341066 MET, ALK / Baylor Breast Metastasierte (Crizotinib) ATP- Care Center Mammakarzinome kompetitiver Children's Soliden Tumoren und Multikinase- Oncology Neuroblastome bei inhibitor Group Kindern Eastern NSCLC k.A. Phase 2 k.A. Phase 1/2 k.A. Phase 3 Cooperative Oncology Group European Maligne Tumoren; CCS; - Tumorprofil: ALK- oder Organisation papilläre RCC; ASPS; Phase 2 MET-Alteration for Research alveoläre and Rhabdomyosarkome Treatment of Cancer Hunan NSCLC k.A. Phase 1 NSCLC und LCLC k.A. Phase 1 NSCLC - Fragestellung: MET- Phase 1 Province Tumor Hospital National Institutes of Health Clinical Center Pfizer Amplifikation, -Mutation; Messung von phosphoMET und MET im Tumor, HGF und sMET im Blut NSCLC - Tumorprofil: ALK- oder Phase 1 ROS-Rearrangement, MET-Amplifikation LCLC; SCLC; NSCLC k.A. Phase 1 Adenokarzinome; RCC; HCC; Glioblastome NSCLC - Fragestellung: Level von Phase 1/2 sMET und HGF UNICANCER Solide oder metastasierte Tumoren - Tumorprofil: MET- Phase 2 Amplifikation oder Mutation , ALK- oder ROS- 102 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor Translokation PF-04217903 MET / Pfizer selektiver, Fortgeschrittene k.A. Phase 1 Karzinome/Tumoren ATPkompetitiver Kinaseinhibitor SGX523 MET / Dana-Farber Solide Tumoren - Fragestellung: Phospho- Phase 1 selektiver, Cancer MET-Expression in IHC ATP- Institute kompetitiver Kinaseinhibitor XL184 MET, VEGFR, Abramson (Cabozantinib) RET, KIT, FLT- Cancer Therapierefraktäre k.A. Phase 2 k.A. Phase 1 Phase 2 differentierte 3, TIE-2, Center of the Schilddrüsenkarzinome TRKB, AXL / University of ATP- Pennsylvania kompetitiver Bristol-Myers Solide Tumoren Multikinase- Squibb inhibitor Cedars-Sinai Metastasierte, - Fragestellung: Medical kastrationsresistente Veränderungen von Center Prostatakarzinome Serum-HGF Dana-Farber Prostatakarzinome k.A. Phase 1 Cancer Metastasierte, triple- - Fragestellung: Expression Phase 1/2 Institute negative von MET und phospho- Mammakarzinome MET, MET-Amplifikation in CTC Merkelzellkarzinome - Fragestellung: Korrelation Phase 2 MET- und phospho-METExpression mit Therapieansprechen Duke CRC mit KRAS-Wildtyp k.A. Phase 1 k.A. Phase 2 University European Uterussarkome, Organisation metastasierte GIST for Research and Treatment of Cancer EORTC 103 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor Exelixis Solide Tumoren - Fragestellung: Korrelation Phase 1 MET-Protein- und Gendysfunktionen mit Therapieansprechen Glioblastome; k.A. Phase 1 NSCLC k.A. Phase 1/2 Astrozytom Grad 4; k.A. Phase 2 Riesenzell-Glioblastom; Gliosarkome; RCC; Schilddrüsenkarzinome kastrationsresistente Prostatakarzinome mit Knochenmetastasen Glioblastoma multiforme - Fragestellung: Korrelation Phase 2 von MET-Dysfunktion mit Therapieansprechen HCC; metastasierte k.A. Phase 3 k.A. Phase 3/ RCC; kastrationsresistente Prostatakarzinome Medulläre Schilddrüsenkarzinome Massachu- Kastrationsresistente Phase 4 k.A. Phase 1 - Fragestellung: ORR, Phase 2 setts General Prostatakarzinome Hospital Cholangiokarzinome PFS, OS in nach METÜberexpression stratifizierten Tumoren; MET-Überexpression: > 50 % der Tumorzellen mit IHC ≥ 2+ Karzinoide und k.A. Phase 2 neuroendokrine Pankreastumore; hormonpositive Mammakarzinome Lungenkarzinome; solide - Fragestellung: Korrelation Phase 2 Tumoren außer Mamma Therapieansprechen mit M.D. und Prostata MET-Amplifikation Androgen-abhängige, k.A. Phase 2 104 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor Anderson metastasierte Cancer Prostatakarzinome Center National Rezidivierte und k.A. Phase 1 Cancer therapierefraktäre solide Institute Tumoren; Melanom;, solide - Fragestellung: Phase 1/2 Tumoren Veränderung der MET- Prostatatumoren Expression in IHC; Messung HGF-SerumLevel; Korrelation MET-, phospho-MET- und HGFExpression mit Therapieansprechen Endometriumkarzinome - Fragestellung: Phase 2 Vorhandensein METAmplifikation, -Mutation Therapierefraktäre - Fragestellung: Phase 2 Schilddrüsenkarzinome Tumorgenotypisierung für MET, MET- Expression in IHC als prädiktiver Biomarker Fortgeschrittene - Fragestellung: Vergleich Phase 2 Weichteilsarkome des von HGF- und sMET vor Erwachsenen und unter Therapie Rezidivierte Ovarial-, - Fragestellung: Korrelation Phase 2 Tuben- und primäre MET-Expression und - Peritonealtumoren Genkopienzahl mit Therapieansprechen RCC - Fragestellung: Phase 2 Unterschiede in Therapieansprechen/ PFS bei hoher und niedriger MET-Expression in IHC Urothelkarzinome k.A. Phase 2 NSCLC mit EGFR- - Fragestellung: MET als Phase 2 Wildtyp prädiktiver Biomarker für Therapieansprechen University of Pankreaskarzinome 105 k.A. Phase 1 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Wirkstoff- Fragestellung und Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor Michigan Kastrationsresistente - Fragestellung: Cancer Prostatakarzinome mit Veränderungen der MET- Center Knochenmetastasen Expression University of NSCLC mit zerebralen - Tumorprofil: ein Teil der Pittsburgh Tumoren ist MET- Metastasen Phase 2 Phase 2 amplifiziert, FISH Ratio (MET/CEP7) > 2.0 - Fragestellung: ORR basierend auf METAmplifikation HGFInhibitoren AMG 102 HGF / Amgen (Rilotumumab) Antikörper Fortgeschrittene solide - Tumorprofil: MET-positiv Phase 1 Tumoren; metastasierte (nach validierter IVD) Karzinome Magen, GEJ Prostatakarzinome; k.A. Phase 1/2 k.A. Phase 2 SCLC; metastasierte CRC mit KRAS-Wildtyp Fortgeschrittene RCC; fortgeschrittene maligne Gliome Karzinome distaler - Tumorprofil: MET- positiv Phase 3 Ösophagus, GEJ, Magen in IHC Duke Glioblastoma multiforme, k.A. Phase 2 University Gliosarkome National Rezidivierte Ovarial-, - Fragestellung: HGF-Level Phase 2 Cancer Tuben-, primäre vor und während Therapie Institute Peritonealtumoren Southwest Plattenepithelkarzinome k.A. Oncology der Lunge Phase 2/3 Group UNICANCER Ösophaguskarzinome; Magenkarzinome - Fragestellung: MET als Phase 2 prädiktiver Biomarker University of GEJ-Karzinome - Fragestellung: Korrelation Phase 2 Chicago MET-Positivität mit OS University of NSCLC k.A. Phase 1/2 Pittsburgh AV-299 HGF / AIDS HIV-assoziierte Karposi- Antikörper Malignancy Sarkome Phase 1/2 Clinical Trials 106 Anhang Wirkstoff Target / Sponsor Tumortyp Fragestellung und Wirkstoff- Studien- Assoziation mit MET/HGF phase gruppe MET-Inhibitor Consortium TAK-701 AVEO Solide Tumoren mit k.A. Phase 1 Pharma- Lebermetastasen, ceuticals NSCLC k.A. Phase 1/2 HGF / Millennium Nicht-hämatologische k.A. Phase 1 Antikörper Pharma- Malignome ceuticals, Inc. Legende: ASPS, alveolar soft parts sarcoma (alveoläres Weichteilsarkom); CCS, clear cell sarcoma (Klarzellensarkom); CRC, colorectal cancer (kolorektales Karzinom); FISH, Fluoreszenz in situ Hybridisierung; GEJ, gastro-esophageal junction (gastroösophageale Übergang); GIST, gastrointestinaler Stromatumor; HCC, hepatocellular carcinoma (hepatozelluläres Karzinom); IHC, Immunhistochemie; inkl., inklusive; IVD, in vitro Diagnostik; k.A., keine Angabe; LCLC, large cell lung cancer (großzelliges Lungenkarzinom); MiTF, microphthalmia-associated transcription factor; NSCLC, non-small cell lung cancer (nichtkleinzelliges Lungenkarzinom); ORR, overall response rate (Gesamtansprechrate); PFS, progression free survival (progressionsfreies Überleben); RCC, renal cell carcinoma (Nierenzellkarzinom); SCLC, small cell lung cancer (kleinzelliges Lungenkarzinom); ZNS, zentrales Nervensystem. 107 Anhang 8.8 Tabelle der Ergebnisse klinischer MET-Studien Tabelle 34: Ergebnisse klinischer MET-Studien Medikament Tumortyp Ergebnis Assoziation mit MET/HGF Studienphase ARQ197/ Solide PR: Karzinome – Prostata, Verringerung HGF-Plasmalevels Phase 1 Tivantinib Tumoren Hoden, Neuroendokrin; im Vergleich PR/SD mit DP, aber Ref. (117) SD: Karzinome (Harnblase, statistisch nicht signifikant; keine Adenoidzystisch, Pankreas, eindeutige Assoziation der Endometrium, phospho-MET Färbung mit Neuroendokrin, Schilddrüse klinischem Ansprechen; Patienten papillär, NSCLC, Rektum, mit Prostatakarzinom zeigten Nieren klarzellig, kleinzellig höhere Expression von MET, undifferenziert, Melanom, phospho-MET und HGF und Angiomyolipom, hatten radiologisch PR Liposarkom, Sarkom (NOS) ARQ197/ Fortge- SD für 4 Monate in 14 Signifikante Verminderung von Tivantinib schrittene Patienten, geringe phospho-MET und MET unter Karzinome Tumorregression in Therapie; keine MET- Phase 1 (163) Phase 2 (130) und solide metastasierten Magen- und Amplifikation nachweisbar; Tumoren Merkelzellkarzinomen Patienten mit metastasierten Melanomen mit MET-Mutationen hatten SD für 20 Wochen ET verbessertes PFS; Patienten mit erhöhter MET- Tivantinib (T) Objektives Ansprechen in Genkopienzahl zeigten PFS- + Erlotinib (E) 10% der Patienten mit ET, Vorteil von ET ohne statistische oder placebo 7% der Patienten mit EP Signifikanz; ähnliches zeigte sich ARQ197/ NSCLC beim OS MetMAb Metasta- CR für 2 Jahre; MetMAb Primärtumor hatte MET-Zugewinn Phase 1 siertes Therapie nach Rezidiv (≥ 4 MET Kopien/Zelle in 60% der Magen- erzielte ein PR der beiden Tumorzellen), IHC-MET- karzinom initialen Läsionen, aber Proteinexpression (mittelgradig (19) Entwicklung multipler neuer bis hoch (2+)); HGF expremiert Herde im Zytoplasma der Tumorzellen IHC (3+), passend zu autokriner Schleife; hohes HGF Plasmalevel; keine Mutation 108 Anhang Studien- Medikament Tumortyp Ergebnis Assoziation mit MET/HGF MetMab (M) + NSCLC PFS und OS Benefit durch PFS und OS Verbesserung durch Phase 2 (136, Erlotinib (E) ME mit einer fast 3-fachen ME in MET FISH+ NSCLC und 137) oder placebo Reduktion des Sterberisikos FISH-/IHC+, mit fast 3-facher (P) phase Ref. Reduktion des Sterberisikos; Patienten mit MET- Tumoren zeigten schlechteres OS und PFS unter ME im Vergleich zu EP MetMab (M) + NSCLC Verschlechterung von PFS Erlotinib (E) und OS nach Einnahme von oder placebo MetMAb– vorzeitige (P) Unterbrechung der Studie Crizotinib NSCLC MET IHC+ Phase 3 Schnelle und anhaltende PR MET-Amplifikation, MET /CEN 7 Phase 1 (134) (99) Ratio > 5,0 Foretinib Solide PR: 2 PR in papillären (XL880) Tumoren Nierenzellkarzinomen über > MET- und phospho-MET-IHC- Nach Therapie Abnahme von Phase 1 (33) 48 und 12 Monate, 1 PR für Intensität 10 Monate in medullärem Schilddrüsenkarzinom; SD: 22 Patienten mit SD von 1 bis 10 Monaten Dauer (durchschnittlich 4 Monate). Legende: +, positiv; -, negativ; CEN 7, Zentromer 7; CR, complete response/komplette Remission; CTC, circulating tumor progression/Krankheitsprogression; cells FISH, (zirkulierende Fluoreszenz Tumorzellen); in situ DP, disease Hybridisierung; IHC, Immunhistochemie; NOS, not otherwise specified/nicht spezifiziert; NSCLC, non-small cell lung cancer/nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; OS, overall survival/Gesamtüberleben; ORR, overall response rate (Gesamtansprechen); Überleben; PR, partial PFS, progression free survival/progressionsfreies response/partieller Remission; SD, stable disease/Krankheitsstabilisierung. Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht. Köln, 29.09.2014 _________________________________ Katja Schmitz 109
