Fangt uns doch: parallele Hochdurchsatz

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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
DNA-Anreicherung
Fangt uns doch: parallele HochdurchsatzSequenzierung
EVA STERZEL
FEBIT BIOMED GMBH, HEIDELBERG
Verlässliches Barcoding von Proben unterstützt den Einzug von Hochdurchsatz-Sequenzierern in die Biomedizin und ermöglicht den Einsatz für
statistisch aussagekräftige Studien.
Reliable barcoding of samples paves the way for next-generation sequencing in modern biomedicine by providing statistically relevant data from
large cohort studies.
ó Es ist bereits seit vielen Jahren bekannt,
dass Mutationen des Erbguts eines Individuums mit der Entstehung bestimmter Krankheiten korrelieren. Die Bedeutung, die das
Wissen um eine solche Prädisposition für die
Früherkennung insbesondere bei der Therapie von Krebserkrankungen hat, lässt viele
Arbeitsgruppen nach solchen Mutationen
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suchen. Stetig steigt die Zahl an Mutationen,
die der Prädisposition bzw. Ursache für die
verschiedensten Krankheiten zugeordnet werden können.
Der Weg dieses Wissens in die RoutineDiagnostik ist beschwerlich und teuer, steht
aber im Fokus moderner Technologien zur
DNA-Analyse. Mit deren Hilfe sollen künftig
Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) und
andere Mutationen der DNA als diagnostische Marker für verschiedene Krankheiten
dienen und Einzug in den ärztlichen Alltag
halten. Leistungsfähige Hochdurchsatzmaschinen ermöglichen Sequenzierungen zu
deutlich günstigeren Preisen als noch vor
zwei Jahren. Trotzdem, die hohen Kosten pro
Patient, die enorme Datenflut und der gerin-
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˚ Abb. 1: Beim Barcoding werden die zu sequenzierenden DNA-Abschnitte jeder einzelnen Probe mit einer probenspezifischen Erkennungssequenz
versehen (1–2). Anschließend können die Proben gemischt und gemeinsam auf den Biochip für HybSelect gegeben werden (3). Dort hybridisieren die
gesuchten Fragmente aller Proben. Diese werden nach einem Waschschritt eluiert (4) und im Gemisch sequenziert (5). Die Zuordnung der Sequenzen
zu den verschiedenen Proben erfolgt anschließend anhand der Barcoding-Sequenz (6).
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Durchschnittliche Abdeckung über 1.000 SNP-Regionen (500 bp)
(500 kb Gesamtzielregion)
ge Automatisierungsgrad waren bis vor Kurzem die Stolpersteine auf dem Weg zu statistisch relevanten Daten aus groß angelegten
klinischen Studien [1]. Dies könnte sich nun
ändern: Eine neue Technologie der Firma
febit ermöglicht die Kombination von Barcoding in Zusammenhang mit gezielter Anreicherung für die anschließende Sequenzierung.
Durchschnitt = 469fach
¯ Abb. 2: Gezielte
Anreicherung von
SNP-Regionen. 1.000
Regionen von je 500
Basenpaaren Länge
mit je einem SNP
wurden von einer
HapMap-Referenzprobe mit HybSelect
gezielt angereichert.
Eine durchschnittlich
469fache Abdeckungstiefe wird
erreicht.
Barcoding
Unter Barcoding versteht man eine probenspezifische Markierung [2]. Diese Markierung kann dazu verwendet werden, ein
Gemisch aus verschiedenen Proben zu prozessieren und am Ende die Ergebnisse wieder
den einzelnen Proben zuordnen zu können
(Abb. 1).
Die zu sequenzierende DNA wird dazu
gemäß dem Protokoll des Sequenziergeräts
aufbereitet und mit Adaptoren versehen. Diese Adaptoren dienten bisher zum einen der
Amplifizierung vor der Sequenzierung und
zum anderen als Erkennungszeichen beim
Sequenzieren für den Beginn des jeweiligen
DNA-Fragments. Beim Barcoding werden die
Adaptoren um einen Sequenzabschnitt
erweitert, der als Kennzeichnung für DNAFragmente einer bestimmten Probe, z. B. von
einem bestimmten Patienten, dient.
Die so gekennzeichneten Proben können
nun als Gemisch im HybSelect-Verfahren
(febit) angereichert werden [3, 4]: Ein Mikroarray-basierter Biochip dient als Filter für
die gesuchten Sequenzen, die an entsprechende Fänger-Oligonukleotide hybridisieren. Das alles geschieht automatisch, und
die DNA ist bereit für den Einsatz im Sequenziergerät, z. B. Illumina GAII und Life
Technologies SOLiD 3, für die diese Technik
bereits optimiert ist. Nach einem Waschschritt werden die Sequenzen eluiert und
können nun im Sequenzierer entschlüsselt
werden. Anhand der Barcoding-Sequenzen
können alle sequenzierten Fragmente
nun ihrer Ursprungsprobe zugeordnet und
die Ergebnisse entsprechend analysiert werden.
Bereits ohne das Barcoding ist es bei einfacher Nutzung des Geniom-Biochip möglich,
24 Proben in sechs Arbeitstagen gezielt anzureichern. Kürzlich konnte die Anwendung
von 16 plex-Barcoding-Reagenzien auf dem
SOLiD 3-Sequenziergerät gezeigt werden, die
die parallele Sequenzierung von 16 Proben in
einem einzigen Sequenzierlauf ermöglichen.
Damit können in sechs Arbeitstagen 384 Proben angereichert werden.
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SNP-Regionen (n = 1.000)
Hohe Abdeckungsraten
Hohe Abdeckungsraten bei der Anreicherungstechnologie sind der ausschlaggebende
Faktor für den Erfolg bei Multiplex-Sequenzierungen. Werden nicht ausreichend viele
Kopien aus jeder Probe für jedes gesuchte
Gen angereichert, ist eine Zuordnung im
Anschluss an die Sequenzierung nicht zuverlässig möglich. Die nötige coverage für eine
erfolgreiche Anreicherung wird in der Praxis
mit etwa 20 Kopien pro Genabschnitt angegeben [5]. Bei parallelen Sequenzierungen
mit mehreren Proben sollte die Abdeckung
höher liegen.
Solche „ertragreichen“ Anreicherungen
gelingen am besten, wenn die Voraussetzungen für die Hybridisierung optimal sind, das
heißt vor allem optimierte Fängersonden und
konstante Reaktionsbedingungen. Die mikrofluidischen Kanäle von unserem Biochip
haben sich hierfür als optimal erwiesen und
führen mit dem ausgereiften tiling zu höchsten Abdeckungsraten.
Dieser Vorteil hat sich insbesondere bei der
Untersuchung von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) gezeigt. Um das zu belegen,
wurde eine HapMap-Referenzprobe mit HybSelect gezielt angereichert [6]. Gesucht wurden 1.000 Regionen von je 500 Basenpaaren
Länge mit je einem, mittig gelegenen SNP.
Das Verhältnis der homozygoten und heterozygoten Allele betrug 1:1. Die anschließende
Sequenzierung zeigte eine durchschnittlich
469fache Abdeckung (Abb. 2).
Mutationsscreening von krankheitsassoziierten Genen
Die Möglichkeit nun parallele Sequenzierungen durchführen zu können, wird routinemäßige Sequenzanalysen zu einem wertvollen
Werkzeug für die Untersuchung und Diagnostik krankheitsassoziierter Mutationen
machen. Die Praxis zeigt, dass eine Anrei-
cherungstechnologie insbesondere für die
Untersuchung solcher Mutationen in den verschiedensten biomedizinischen Bereichen
gefragt ist.
So werden Mutationen untersucht, die mit
verschiedenen Krebserkrankungen in Verbindung stehen, aber auch neurologische und
immungenetische Erkrankungen.
Ausblick
Ziel ist es, die Möglichkeiten der Hochleistungssequenzierer auch für medizinische und
pharmakologische Fragestellungen, wie z. B.
der personalisierten Medizin, einsetzen zu
können. Durch die Durchführung von groß
angelegten Studien, die statistisch relevante
Daten liefern, können Mutationsanalysen zu
einem wichtigen diagnostischen Werkzeug
der Medizin etabliert werden.
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Literatur
[1] Summerer D (2009) Enabling technologies of genomicscale sequence enrichment for targeted high-throughput
sequencing. Genomics 94:363–368
[2] Craig DW, Pearson JV, Szelinger S et al. (2008)
Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed
sequencing. Nat Methods 5:887–893
[3] Schracke N, Kornmeyer T, Kränzle M et al. (2009) Specific
sequence selection and next generation resequencing of 68 E.
coli genes using HybSelect. N Biotechnol 26:229–233
[4] Schracke N, Kränzle M, Stähler P (2009) Spezifische
Genselektion durch mikrofluidische Biochips. BIOspektrum
1:54–55
[5] Li H, Ruan J, Durbin R (2008) Mapping short DNA
sequencing reads and calling variants using mapping quality
scores. Genome Res 18:1851–1858
[6] Summerer D, Wu H, Haase B (2009) Microarray-based
multicycle-enrichment of genomic subsets for targeted nextgeneration sequencing. Genome Res 19:1616–1621
Korrespondenzadresse:
Eva Sterzel
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Im Neuenheimer Feld 519
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