Das Adapterprotein Grb2 in B- und T-Lymphozyten der Maus

Das Adapterprotein Grb2 in B- und TLymphozyten der Maus
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
Vorgelegt von
Daniel Radtke
aus Berlin
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
29.01.2015
Vorsitzender des Prüfungsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms
Gutachter: Prof. Dr. Lars Nitschke
Prof. Dr. David Vöhringer
1
Inhalt
2
Zusammenfassung .................................................................................................................... 1
3
SUMMARY ............................................................................................................................. 3
4
Einleitung ................................................................................................................................. 4
4.1
B-Zell Entwicklung .......................................................................................................... 4
4.2
Transitionale B-Zellen ...................................................................................................... 6
4.3
Keimzentrumsreaktion und Gedächtnis B-Zellen ............................................................ 7
4.4
Der B-Zell Rezeptor in der Aktivierung von B-Zellen des IgM und des IgG Isotypes .... 8
4.5
B-Zell Rezeptor Signalleitung ........................................................................................ 10
4.6
T-Zell Entwicklung ........................................................................................................ 11
4.7
T-Helferzellen................................................................................................................. 14
4.8
Die Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ein Mausmodell für
Multiple Sklerose im Menschen ................................................................................................. 17
4.9
Das Adapterprotein „growth factor receptor bound protein 2” ...................................... 19
4.10
Die Rolle von Grb2 in B-Zellen ..................................................................................... 20
4.11
Die Rolle von Grb2 in T-Zellen ..................................................................................... 24
5
Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................................ 27
6
Ergebnisse .............................................................................................................................. 29
6.1
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus......................................................................... 29
6.1.1
Kein Einfluss von Grb2 auf die in vitro Überlebensrate von B-Zellen .................. 29
6.1.2
Grb2 spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung von unreifen zu reifen B-Zellen
33
6.1.3
Die Rolle von Grb2 in der B-Zell Signalleitung transitionaler und reifer B-Zellen
46
6.1.4
Einfluss von Grb2 auf die FcγR2b Expression ....................................................... 50
6.1.5
Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Immunantwort ................................................... 54
6.1.6
Keine erhöhte Autoimmunität in alternden Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen .................... 75
6.2
6.2.1
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus ......................................................................... 78
Erfolgreiche gewebespezifische Depletion von Grb2 in T-Zellen ......................... 78
6.2.2
Die T-Zell spezifische Grb2 Defizienz beeinträchtigt die frühe T-Zell Entwicklung
80
6.2.3
T-Zell spezifische Grb2 defiziente Mäuse zeigen eine reduzierte Zahl an CD4+ und
CD8+ T-Zellen im Thymus und in der Peripherie, zudem ist der Anteil der aktivierten CD4
und CD8 T-Zellen in der Milz erhöht. ................................................................................... 82
6.2.4
Die T-Zell spezifsiche Grb2 Defizienz beeinflusst die Zahl von naiven und
Gedächtnis T-Zellen in der Peripherie ................................................................................... 86
6.2.5
Kein großer Einfluss von Grb2 auf die Ca2+ Signalleitung im Thymus nach TZR-
Stimulation ............................................................................................................................. 90
6.2.6
Erhöhte Zahl von γδ T-Zellen in Teilen der Peripherie und Tendenz zu einer
Erhöhung im Thymus von T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen ............................ 92
6.2.7
Inhibitorischer Einfluss von Grb2 auf die TH17 Differenzierung in vitro, so wie
veränderte Treg und unveränderte TH1 und TH2 Differenzierung ............................................. 94
6.2.8
Ex vivo Analysen von CD4-Effektorzellen zeigen einen Einfluss von Grb2
abhängig vom Deletionszeitpunkt durch die Cre Rekombinase ............................................ 96
6.2.9
T-Zell
spezifische
Grb2 defiziente
Mäuse entwickeln eine schwächere
experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, die ein Mausmodell für multiple Sklerose im
Menschen ist .......................................................................................................................... 98
6.2.10
Verringerte Aktivierbarkeit von Grb2 defizienten CD4+ T-Zellen durch
dendritische Zellen im gemischten Lymphozyten Versuch ................................................. 108
7
8
Diskussion ............................................................................................................................ 110
7.1
Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Entwicklung und das Überleben von B-Zellen ...... 110
7.2
Bedeutung von Grb2 für die FcγR2b Expression und Signalleitung ........................... 114
7.3
Die Rolle von Grb2 in der Keimzentrumsreaktion ...................................................... 115
7.4
Einfluss von Grb2 auf die sekundäre Immunantwort und Gedächtnis B-Zellen ......... 116
7.5
Grb2 – Mögliche Autoimmunität in alternden Mäusen ............................................... 120
7.6
Einfluss von Grb2 auf B1 B-Zellen ............................................................................. 121
7.7
Die Rolle von Grb2 in der T-Zell Entwicklung ........................................................... 122
7.8
Grb2 und T-Effektorzellen der CD4+ Population ........................................................ 126
7.9
Die Rolle von Grb2 im autoimmunen Enzephalomyelitis Modell ............................... 129
Material ................................................................................................................................ 133
8.1
9
Antikörper .................................................................................................................... 133
8.1.1
Antikörper Durchflusszytometrie und Streptavidinkonjugate .............................. 133
8.1.2
Antikörper ELISA ................................................................................................ 134
8.1.3
Antikörper für magnetische Zellseperation / komplement vermittelte Lyse ........ 134
8.1.4
Antikörper Western-Blot ...................................................................................... 134
8.2
Chemikalien und Labormaterial ................................................................................... 134
8.3
Computerprogramme .................................................................................................... 136
8.4
Geräte ........................................................................................................................... 136
8.5
Kommerzielle Kits........................................................................................................ 137
8.6
Lösungen, Medien und Puffer ...................................................................................... 137
8.7
Stimulanzien / Antigene / Immunisierungszusätze ...................................................... 141
8.8
Zytokine........................................................................................................................ 142
Methoden .............................................................................................................................. 143
9.1
Aufarbeitung muriner Zellen und durchflusszytometrische Analyse ........................... 143
9.1.1
Zentrifugation ....................................................................................................... 143
9.1.2
Organentname und Aufbereitung von murinen Zellen ......................................... 143
9.1.3
Bestimmung der Gesamtzellzahl mit einer Neubauer Zählkammer ..................... 143
9.1.4
Durchflusszytometrische Messungen ................................................................... 144
9.1.5
Durchflusszytometrische Bestimmung der Lebend/Gesamtzellzahl mit Partikeln
und Propidiumiodid .............................................................................................................. 144
9.1.6
9.2
Messung der Calciummobilisierung nach Rezeptorstimulation in Lymphozyten 145
Aufreinigung von B- und T-Zellen............................................................................... 145
9.2.1
Zellsortierung über magnetische Partikel (MACS) .............................................. 145
9.2.2
Komplement-vermittelte T-Zelllyse zur B-Zell Anreicherung............................. 147
9.3
Untersuchungen zur Apoptose, Proliferation und Differenzierung von B-Zellen ........ 148
9.3.1
In vitro B-Zell Reifung ......................................................................................... 148
9.3.2
Messung der spontanen Apoptoserate in vitro mittels DAPI-Färbung ................. 148
9.3.3
Toll Like Rezeptor (TLR) Stimulation und 3H-Tritiumthymidin Proliferationsassay
148
9.4
Untersuchungen zur Apoptose, Proliferation und Differenzierung von T-Zellen ........ 149
9.4.1
T-Zell Proliferationsassay .................................................................................... 149
9.4.2
Allogener gemischter Lymphozytenversuch........................................................ 149
9.5
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion ........................................... 150
9.5.1
Realtime PCR – B-Zell Subpopulationen ............................................................ 150
9.5.2
RNA Isolierung mit Trizol und Chloroform ........................................................ 152
9.5.3
RNA Isolierung über Säulen ................................................................................ 152
9.5.4
cDNA Synthese .................................................................................................... 152
9.5.5
Detektion eines spezifischen RNA Abschnittes als Zeichen für einen
Klassenwechsel zu IgG1 ...................................................................................................... 153
9.5.6
DNA-Aufreinigung aus Ohr- und Schwanzbiopsien ........................................... 153
9.5.7
Polymerase Kettenreaktion (PCR) ....................................................................... 155
9.5.8
Agarose Gelelektrophorese .................................................................................. 159
9.6
Untersuchungen zu Autoimmunität ............................................................................. 159
9.6.1
Detektion von Autoantikörpern gegen Zellkomponenten von Hep-2 Zellen ....... 159
9.6.2
BUN - Harnstoff-Stickstoffgehalt im Blut ........................................................... 159
9.7
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay......................................................... 160
9.7.1
ELISA - Glykoprotein B / virusartige Partikel von humanem hCMV ................. 160
9.7.2
ELISA auf 4-Hydroxy-3-nitrophenyl (NP) und CGG.......................................... 161
9.7.3
ELISA auf dsDNA ............................................................................................... 161
9.7.4
ELISA auf Antikörper Subklassen ....................................................................... 162
9.8
ELISPOT...................................................................................................................... 162
9.9
Immun-Histologie ........................................................................................................ 163
9.9.1
Einbetten von Organen......................................................................................... 163
9.9.2
Erstellen von Kryoschnitten ................................................................................. 163
9.9.3
Immunhistologische Färbung ............................................................................... 164
9.10
Proteinbiochemische Methoden ................................................................................... 165
9.10.1
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................................ 165
9.10.2
Western Blot und Signaldetektion über Röntgenfilm .......................................... 165
9.11
Untersuchung von T-Helferzellen ................................................................................ 166
9.11.1
In vitro T-Zell Differenzierung............................................................................. 166
9.11.2
Intrazelluläre Färbung von Zytokinen .................................................................. 167
9.11.3
Intrazelluläre FoxP3-Färbung ............................................................................... 168
9.11.4
Ex vivo T-Zell Analyse ......................................................................................... 169
9.11.5
Cytometric Bead Array (CBA) zur Bestimmung von sekretierten Zytokinen ..... 169
9.12
Immunisierungen und Mausversuche ........................................................................... 170
9.12.1
Intravenöse (i.v.) Injektion ................................................................................... 170
9.12.2
NP-CGG / NP-KLG / CGG Immunisierung......................................................... 170
9.12.3
Immunisierung mit Glykoprotein B und virusartigen Partikeln (VLPs) des
humanen Zytomegalieviruses ............................................................................................... 170
9.12.4
Immunisierung mit Schafserythrozyten zur Keimzentrumsanalyse ..................... 170
9.12.5
NK-Zell Depletion ................................................................................................ 171
9.12.6
Adoptiver Zelltransfer .......................................................................................... 171
9.12.7
Serumgewinnung .................................................................................................. 172
9.12.8
Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ....................................... 172
9.12.9
Arbeit mit Versuchstieren und verwendete Mausstämme .................................... 173
10
Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 174
11
Anhang ..................................................................................................................................I
11.1
Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................I
11.2
Tabellenverzeichnis ........................................................................................................ IV
11.3
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................... V
12
Danksagung ..................................................................................................................... VIII
13
Publikationsliste .................................................................................................................. X
Zusammenfassung
2
Zusammenfassung
Das Adapterprotein growth factor receptor bound protein 2 (Grb2) ist ein kleines, hoch
konserviertes Protein von 25-30 kDa und verfügt über eine zentrale Src homology 2 (SH2) und
zwei flankierende Src homology 3 (SH3) Domänen. Grb2 besitzt keine katalytische Funktion,
sondern trägt dazu bei proximale, rezeptorvermittelte Signale weiterzuleiten und zu modulieren.
B-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse zeigen eine verringerte B-Zellzahl in der Peripherie. Grb2 hat
keinen Einfluss auf die Apoptose von peripheren B-Zellen, sondern ist entscheidend in der B-Zell
Entwicklung, was die reduzierten B-Zell Zahlen erklärt. B-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse haben
einen Block in der B-Zell Entwicklung, der in den unreifen B-Zellen im Knochenmark beginnt,
aber in den transitionalen B-Zellen der Milz am deutlichsten wird. Grb2 wirkt fördernd auf Gene,
die in transitionalen B-Zellen hoch reguliert werden und mit der PI3K Signalleitung in
Verbindung stehen. Dies lässt vermuten, dass die PI3K Signalleitung am B-Zell Block beteiligt
ist.
Grb2 bindet in vitro direkt an die immunoglobulin tail tyrosine (ITT) Bindestelle im IgG- und
IgE- B-Zell Rezeptor (BZR) und verstärkt so das BZR Signal. Durch den Transfer einer
definierten Zahl an IgG Gedächtniszellen und einer erneuten Immunisierung der Empfängertiere
zur Reaktivierung der Gedächtnis B-Zellen wurde gezeigt, dass Grb2 die Gedächtnisantwort auch
in vivo zellintrinsisch fördert. Dieser Effekt ist unabhängig von T-Zell Hilfe. Der positive B-Zell
intrinsiche Effekt von Grb2 auf die Gedächtnisantwort hängt vermutlich mit einer Bindung an die
immunoglobulin tail tyrosine (ITT) Bindestelle im IgG BZR zusammen.
Vorausgegangene Studien haben gezeigt, dass Grb2 in T-Zellen eine wichtige Rolle in der
positiven und negativen Selektion von T-Zellen spielt. Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse, die Grb2 früh in
der T-Zell Entwicklung deletieren, haben eine drastisch reduzierte Zahl an T-Zellen in der
Peripherie. Eine spätere Deletion von Grb2 in CD4+CD8+ T-Zellen des Thymus (Grb2fl/fl CD4cretg
Mäuse) führt zu einer milderen Reduktion der T-Zellen in der Peripherie.
T-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse weisen einen milderen Krankheitsverlauf im autoimmunen
Enzephalomyelitis Modell (EAE) auf als wildtyp Mäuse. Durch das fehlende Grb2 entwickeln
sich weniger TH1 und TH17 Zellen, welche die EAE fördern, während mehr regulatorische TZellen gebildet werden, die inhibierend auf die Krankheit wirken. Dies hängt wahrscheinlich mit
einer reduzierten Aktivierbarkeit der Grb2-/- T-Zellen durch antigenproduzierende Zellen
zusammen. Damit ist Grb2 ein positiver Faktor für die Entwicklung von T H1 und TH17 Zellen und
ein negativer Faktor für die Entwicklung von T-reg Zellen in der EAE. Mechanistisch fördert
1
B-Zell Entwicklung
Zusammenfassung
Grb2 die Produktion von IL-6 und könnte so das Verhältnis von TH17 zu regulatorischen T-Zellen
zu Gunsten der proinflammatorischen TH17 T-Zellen verschieben.
Zusammengefasst hat Grb2 wichtige, nicht redundante Funktionen bei der Entwicklung von
Lymphozyten und der Funktion von Effektorlymphozyten.
2
B-Zell Entwicklung
SUMMARY
3
SUMMARY
Growth factor receptor bound protein 2 (Grb2) is a small, ubiquitously expressed and strongly
conserved adapterprotein of 25-30 kDa. It contains one central Src homology 2 (SH2) and two
neighboring Src homology 3 (SH3) domains and has no catalytic activity. Adapter proteins
transmit and modulate proximal signals from receptors to distal functions.
B-cell specific Grb2-/- mice show reduced B cell numbers in the periphery. Grb2 does not
influence apoptosis of peripheral B cells but it is crucial for B cell development which explains
the reduced B cell numbers. B-cell specific Grb2-/- mice show a block in B cell development
which starts in immature B cells of the bone marrow but is most distinct in transitional B cells of
the spleen. Grb2 forces the expression of genes that are upregulated in transitional B cells and are
related to PI3K signaling. This implies that impaired PI3K signaling is a reason for the block in B
cell development.
Grb2 binds directly to the immunoglobulin tail tyrosine binding site of the IgG and IgE B-cell
receptor in vitro which enhances B-cell receptor signaling. The transfer of defined numbers of
IgG memory B-cells in recipient mice that are immunized afterwards to reactivate the IgG
memory cells shows that Grb2 enhances the memory response of B cells in vivo and in a B-cell
intrinsic fashion. This effect is independent of T-cell help. Grb2 enhances the memory response B
cell intrinsically which is probably related to its binding to the immunoglobulin tail tyrosine
binding site of the IgG B-cell receptor.
It has previously been shown that Grb2 has crucial functions in positive and negative selection of
T cells. Grb2fl/fl Lckcretg mice where Grb2 is deleted early in development show a drastically
reduced number of T cells in the periphery. If Grb2 is deleted at a later point in development at
the CD4+CD8+ stage (Grb2fl/fl CD4cretg mice) the reduction of T cells in the periphery is much
weaker.
T cell specific Grb2-/- mice show a less severe course of disease in an autoimmune
encephalomyelitis model (EAE). Without Grb2 less TH1 and TH17 cells develop that elevate EAE
severity whereas more regulatory T-cells develop that inhibit EAE. This seems to be related to a
reduced activation potential of Grb2-/- T cells through antigen presenting cells. Therefore Grb2 is
a positive factor for the development of TH1 and TH17 cells but a negative factor for the
development of regulatory T cells in EAE. Mechanistically Grb2 also elevates the production of
IL-6 which influences the ratio of TH17 and regulatory T cells and more proinflammatory TH17 T
cells develop.
In summary Grb2 has crucial and non redundant functions in lymphocyte development and in the
effector functions of lymphocytes.
3
B-Zell Entwicklung
Einleitung
4
Einleitung
4.1 B-Zell Entwicklung
B-Lymphozyten bilden einen wichtigen Teil des humoralen Immunsystems. Sie sind in der Lage
spezifische B-Zell Rezeptoren (BZR) zu bilden, deren lösliche Form sie auch als Antikörper
sekretieren können. B-Zellen sind über die Rekombination von Gensegmenten (V, D, J) fähig, ein
breites Spektrum an BZRs mit verschiedenen Spezifitäten zu generieren, wobei jede B-Zelle nur
BZRs und Antikörper einer Spezifität exprimiert. Der BZR besteht aus zwei schweren und zwei
leichten Ketten und hat eine variable und eine konstante Region. Die variable Region vermittelt
die spezifische Bindung an ein Antigen, während die konstante Region bei Antikörpern für
Effektorfunktionen zuständig ist. Die Generierung des Antikörperrepertoires erfordet strenge
Selektionsprozesse, um zu verhindern, dass Antikörper gegen körpereigene Antigene gebildet
werden (Miosge & Goodnow 2005; Goodnow et al. 2010). B-Zellen, die über ihren BZR
spezifisch
ein
fremdes
Antigen
erkennen,
können
hingegen
expandieren,
zu
antikörperproduzierenden Plasmazellen differenzieren, ihre Avidität und Affinität zum Antigen in
Keimzentrumsreaktionen verbessern, zu B-Gedächtniszellen werden und einen Klassenwechsel
zu einer anderen Immunglobulinklasse durchlaufen (Stavnezer et al. 2008; Oracki et al. 2010;
Takemori et al. 2014; Shlomchik & Weisel 2012).
4
B-Zell Entwicklung
Einleitung
Knochenmark
Langlebige
Plasmazelle
Multipotente
Stammzelle
Frühe lymphoide
Vorl. Zelle
Gedächtnis
B-Zellen
Keimzentrums
B-Zellen
cγ1-cre
mb1-cre
Pro-B Zelle
VDJH Rekombination
Naive follikuläre
B-Zelle
Kurzlebige
Plasmazelle
Pre-BZR
T2 B-Zelle
Pre-B Zelle
MZ B-Zelle
VJL Rekombination
BZR
Milz/Lymphknoten
unreife-B Zelle
T1 B-Zelle
Blut
Abb. 1: Schema B-Zell Entwicklung und Differenzierung zu Effektorzellen. Multipotente Vorläuferzellen
entwickeln sich über ein frühes lymphoides Vorläuferstadium, aus dem sich auch T-Zellen entwickeln können zu proB-Zellen, die sich weiter über pre-B-Zellen zu unreifen B-Zellen differenzieren. Diese verlassen das Knochenmark als
unreife B-Zellen und werden zu transitionalen B-Zellen (T1/T2), die in die Milz wandern. Dort differenzieren sie zu
reifen, naiven B-Zellen oder Marginalzonen B-Zellen (MZ). Während der Entwicklung von pro- zu unreifen B-Zellen
rearangieren die Zellen ihre VH,DH und JH Gene für die schwere Kette des B-Zell Rezeptors (BZR) und ihre VL, JL
Gene für die leichte Kette des BZR, der dann auf der Oberfläche von unreifen B-Zellen zum ersten Mal exprimiert
wird. Die naiven B-Zellen können nach einer Aktivierung zu kurzlebigen Plasmazellen, Gedächtniszellen oder
Keimzentrumszellen werden. Keimzentrums B-Zellen können zu Gedächtnis B-Zellen oder langlebigen Plasmazellen
differenzieren. Dunkelblau: Vorläuferzellen, die sich noch zu anderen Zelltypen außer B-Zellen differenzieren können;
Hellblau: B-Zell Stadien; Orange: B-Effektorzellen; rote Schrift: Erste Expression von cre unter verschiedenen
Promotoren, wobei Cγ1-cre auch beim Klassenwechsel zu IgG1 B-Zellen aktiviert wird. Quellen: Matthias et al. Nat.
Rev. Immunol. 2005, Kurosaki et al. Annu. Rev. Immunol. 2010, Pieper et al. J. Allergy Clin. Immunol. 2013,
Shlomchik and Weisel Immunol. Rev. 2012.
Sowohl in Mäusen als auch im Menschen werden B-Zellen im Knochenmark schrittweise aus
multipotenten Stammzellen generiert. Diese differenzieren zu frühen lymphoiden Vorläuferzellen
5
B-Zell Entwicklung
Einleitung
und weiter zu pre-pro-B-Zellen (Hardy Fraktionen A), die als erste Population den B-Zell Marker
B220 exprimieren und sich weiter zu pro-B-Zellen entwickeln (Hardy Fraktionen B und C). In
pro-B-Zellen wird dann auch CD19 exprimiert, das ebenfalls als B-Zell Marker dient. Außerdem
werden in diesen frühen B-Zell Stadien RAG-Gene aktiviert, die an der Umlagerung der Gene für
den BZR beteiligt sind (Igarashi et al. 2002) und die V-, D- und J- Gene für die schwere Kette des
BZRs werden rekombiniert. Im späten pro-B-Zell Stadium wird die VDJ-Rekombination für die
schwere Kette des BZR abgeschlossen (Hardy Fraktionen C). Zellen, die es schaffen, eine
funktionelle schwere Kette zu generieren, exprimieren einen pre-BZR mit einer vorläufigen
leichten Kette (surrogate light chain) und werden unterstützt durch die Signalleitung über den
pre-BZR zu pre-B-Zellen (Hardy Fraktionen D). In diesen werden V- und J- Segmente für die
leichten Ketten des BZR kombiniert. Nach einer erfolgreichen Kombination wird die vorläufige
leichte Kette durch die rekombinierten leichten Ketten ersetzt. Die Zellen werden zu unreifen BZellen (Hardy Fraktionen E), die einen Rezeptor des IgM-Typs exprimieren (Hardy & Hayakawa
2001; Busslinger 2004). Die unreifen B-Zellen wandern als transitionale Typ 1 B-Zellen (T1) in
die Milz, wo sie zu transitionalen Typ 2 B-Zellen (T2) und anschließend zu naiven B-Zellen
reifen. Während der Reifung von unreifen zu reifen B-Zellen regulieren die Zellen als wichtigen
Kontrollpunkt den BAFF-Rezeptor (BAFF-R) hoch. Überlebenssignale, die über den BAFFRezeptor vermittelt werden, sind für das Überleben von transitionalen B-Zellen und naiven reifen
B-Zellen entscheidend (Hsu et al. 2002; Yan et al. 2001; Sasaki et al. 2004; Schiemann et al.
2001; Otipoby et al. 2008; Batten et al. 2000). Kürzlich wurde beschrieben, dass der BAFFRezeptor den B-Zell Rezeptor für die Übertragung von Überlebenssignalen benötigt, was diese
beiden wichtigen Kontrollpunkte in der B-Zell Entwicklung verbindet (Schweighoffer et al. 2013;
Stadanlick et al. 2008).
4.2 Transitionale B-Zellen
Transitionale B-Zellen sind eine heterogene Population für die es keine einheitliche Einteilung
gibt. Sie wurden zuerst in transitionale Typ 1 (T1) (CD21loIgMhiIgDloCD24hi) und transitionale
Typ 2 (T2) B-Zellen (CD21hi/intIgMhiIgDhi CD24hi) unterteilt (Loder et al. 1999). Nach BZR
Stimulation proliferieren T2 Zellen, während T1 Zellen in Apoptose gehen (Su & Rawlings 2002;
Petro et al. 2002). Später wurde eine alternative Nomenklatur vorgeschlagen, die auf der
Expression von AA4.1 (CD93) basiert und bei der T2 B-Zellen als eine Population definiert
werden, die nach BZR Stimulation nicht proliferiert (Allman et al. 2001). Es wurde beschrieben,
dass die ursprünglich beschriebene T2 B-Zell Population (Loder et al. 1999) mitunter
Vorläuferpopulationen für Marginalzonen B-Zellen (Saito et al. 2003; Srivastava et al. 2005;
Pillai et al. 2005) und follikuläre B-Zellen enthält (CD21intIgMhiIgDhiCD24hiCD23+) (MeyerBahlburg et al. 2008).
6
Transitionale B-Zellen
Einleitung
Das Calciumsignal spielt eine wichtige Rolle in der B-Zell Entwicklung und wird abhängig vom
Differenzierungsstadium in T1, T2 und reifen B-Zellen unterschiedlich reguliert. In T1 B-Zellen
trägt es wahrscheinlich zur Apoptose bei, während es in T2 B-Zellen die B-Zell Reifung fördert
(Hoek et al. 2006; Gross et al. 2009).
Nach einer Stimulation über den BZR treten T2 B-Zellen schnell in den Zellzyklus ein, aktivieren
Akt, welches das Überleben von B-Zellen positiv beeinflusst und regulieren anti-apoptotische
Gene hoch, während T1 B-Zellen nach der BZR Stimulation nicht proliferieren, sondern in
Apoptose gehen (Carman et al. 1996; Su & Rawlings 2002; Andrews & Rawlings 2009; Petro et
al. 2002). Sortierte T2 B-Zellen (Loder et al. 1999) reifen in vitro nach BZR Stimulation zu
Zellen
aus,
lo
hi
die
lo
follikulären
B-Zellen
ähneln,
während
transitionale
Typ
1
(T1)
hi
(CD21 IgM IgD CD24 ) B-Zellen in Apoptose gehen (Su & Rawlings 2002; Petro et al. 2002).
Die Aktivierung von Akt über den PI3K Signalweg ist entscheidend für die Reifung von
transitionalen zu reifen oder Marginalzonen B-Zellen und deren Überleben (Calamito et al. 2010).
4.3 Keimzentrumsreaktion und Gedächtnis B-Zellen
Keimzentren werden in T-Zell abhängigen Immunantworten in sekundären lymphatischen
Organen gebildet. Dazu müssen B-Zellen an der T-B-Zell-Grenze der Milz oder in
interfollikulären Regionen der Lymphknoten mit T-Zell- Hilfe aktiviert werden. Hierfür nehmen
B-Zellen das beim ersten Kontakt gebundene Antigen auf, prozessieren es so, dass es auf MHCIIMoleküle geladen werden kann und präsentieren es T-Helferzellen. Erkennt eine T-Helferzelle ein
präsentiertes Peptid kann sie zur endgültigen Aktivierung der B-Zelle beitragen. Ein Teil der
aktivierten B-Zellen differenziert zu kurzlebigen Plasmazellen. Ein anderer Teil der T- und BZellen beginnt nach der Aktivierung B-cell lymphoma-6 (Bcl6) (Kerfoot et al. 2011; Kitano et al.
2011) zu exprimieren. Einige dieser B-Zellen wandern in den Follikel ein und es bilden sich
oligoklonale Keimzentren mit stark proliferierenden Blasten. Sie durchlaufen somatische
Hypermutation (Apel & Berek 1990; Jacob et al. 1991), die auf den Genbereich beschränkt ist,
der für den variablen Bereich des BZR kodiert. Reife Keimzentren können in eine helle und eine
dunkle Zone unterteilt werden. Die proliferierenden Blasten bzw. Zentroblasten befinden sich in
der dunklen Region. Sie entwickeln sich weiter zu Zentrozyten, die sich dann in der hellen Region
befinden und nicht proliferieren. In der hellen Zone befindet sich auch ein Netzwerk von
follikulären dendritischen Zellen, die in der Lage sind, Antigene zu präsentieren. Die
vorherschende Meinung ist, dass B-Zellen, die durch die somatische Hypermutation affiner für
ein Antigen sind, besser an das auf follikulären dendritischen Zellen gebundene Antigen binden
und Überlebenssignale von den follikulären dendritischen Zellen bekommen, während weniger
affine B-Zellen in Apoptose gehen (Honjo et al. 2002; Liu et al. 1989; MacLennan 1994).
Außerdem bekommen die B-Zellen positive Signale durch den Kontakt mit follikulären T-
7
Keimzentrumsreaktion und Gedächtnis B-Zellen
Einleitung
Helferzellen, welche die humorale Immunität unterstützen, indem sie die Keimzentrumsreaktion,
den Klassenwechsel von B-Zellen, die Affinitätsreifung von antikörper produzierenden B-Zellen
und lang anhaltende Antikörperantworten fördern. Ihr Einfluss auf Gedächtnis B-Zellen ist
weitgehend unklar (Crotty 2011; Yamane & Paul 2013; Shlomchik & Weisel 2012). Die
selektionierten B-Zellen können zu langlebigen Plasmazellen oder Gedächtnis-B-Zellen werden.
Viele der Keimzentrumszellen vollziehen zusätzlich einen Klassenwechsel (Stavnezer et al.
2008). Gedächtnis-B-Zellen können verschiedene Immunglobulin-Isotypen haben und müssen
keinen Klassenwechsel vollzogen haben, wie Berichte über IgM Gedächtniszellen zeigen (Dell et
al. 1989; Pape et al. 2011; White & Gray 2000; Dogan et al. 2009; Shlomchik & Weisel 2012;
Tomayko et al. 2010; Anderson et al. 2007). Neben der Möglichkeit, dass sich Gedächtnis-BZellen in der Keimzentrumsreaktion bilden gibt es auch Hinweise, dass sich Gedächtnis-B-Zellen
auch außerhalb von Keimzentrumsreaktion bilden können. Der Schwellenwert von IgGGedächtniszellen, um über den BZR aktiviert zu werden ist niedriger als bei naiven B-Zellen und
sie können nach Aktivierung schneller in den Zellzyklus eintreten (Gagro et al. 2003; Good et al.
2009; Yefenof et al. 1986). Außerdem können Antigene wie virusähnliche Partikel des humanen
Zytomegalievirus und Haptene mit verschiedenen Trägerproteinen spezifische Gedächtnis-BZellen auch ohne T-Zell Hilfe reaktivieren (Klinman & Doughty 1973; Hebeis et al. 2004; Weisel
et al. 2010).
4.4 Der B-Zell Rezeptor in der Aktivierung von B-Zellen des IgM und des
IgG Isotypes
IgG- Gedächtnis-B-Zellen können stärker über den BZR aktiviert werden als IgM-B-Zellen.
Welche Mechanismen für diesen Unterschied verantwortlich sind, ist bislang nur unvollständig
verstanden,
doch
konnte
gezeigt
werden,
dass
Gedächtnis-
B-Zellen
ein
anderes
Genexpressionsprofil als naive B-Zellen aufweisen (Bhattacharya et al. 2007; Tomayko et al.
2008). So werden in humanen IgM- und IgG-Gedächtnis B-Zellen KLF4, KLF9 und
promyelocytic leukemia zinc finger Transkriptionsfaktoren herunterreguliert, die für die
Aufrechterhaltung des ruhenden Zustandes der Zelle wichtig sind (Good & Tangye 2007).
Dagegen werden z.B. TNF Rezeptoren und Proteine der Bcl2 Familie hoch reguliert (Good et al.
2009). Für Mäuse wurde beschrieben, dass der Transkriptionsfaktor Bach2 in IgG1-GedächtnisB-Zellen herrunterreguliert ist, wodurch IgG1-Gedächtnis-B-Zellen prädispositioniert sind schnell
zu Plasmazellen zu differenzieren (Kometani et al. 2013). Ein Unterschied zwischen naiven BZellen und Gedächtniszellen ist auch die unterschiedliche Expression der Immunglobulin
Isotypen. Während naive B-Zellen sowohl einen IgM- als auch einen IgD- BZRs tragen,
exprimieren viele Gedächtniszellen einen IgG-BZR. IgM- und IgD-BZRs ragen beide nur mit drei
Aminosäuren in den intrazellulären Bereich, weshalb sie ihre Signale vorwiegend über die Igαund Igβ- Untereinheiten des BZR-Komplexes weitergeben. IgG-BZRs verschiedener Subklassen
8
Der B-Zell Rezeptor in der Aktivierung von B-Zellen des IgM und des IgG Isotypes
Einleitung
haben neben den Igα- und Igβ-Untereinheiten hingegen noch 28 Aminosäuren der schweren
Ketten, die in den intrazellulären Bereich reichen (Reth 1992). Diese vermitteln den IgG-BZRs
die intrinsische Kapazität zur Signalleitung über den IgG-Rezeptor, welche die Signalleitung
gegenüber der des IgM-Rezeptors erhöht (Martin & Goodnow 2002; Liu et al. 2010; Engels et al.
2009). So wurde gezeigt, dass transgene Mäuse mit einem spezifischen anti-HEL-BZR, bei denen
der zytoplasmatische-IgM Bereich durch den zytoplasmatischen-IgG1 Bereich ersetzt wurde,
nach BZR Stimulation zehn Mal mehr Plasmazellen bilden (Martin & Goodnow 2002).
Allerdings waren die untersuchten Zellen keine Gedächtnis B-Zellen.
Kürzlich wurde beschrieben, dass IgG-Gedächtniszellen hauptsächlich für einen schnellen
Anstieg des Antikörperspiegels nach einer erneuten Stimulation verantwortlich sind, während
IgM-Gedächtniszellen nach einer Restimulation eher zu Keimzentrumszellen werden. Für die
entsprechenden Versuche wurden Cγ1cre-Mäuse verwendet, in denen Cre ein Toxin aktivierte,
dass IgG1-Zellen spezifisch töteten sollte (Kometani et al. 2013). Cγ1cre ist aber nicht nur in
IgG1-B-Zellen, sondern auch in der frühen Keimzentrumsreaktion aktiv (Casola et al. 2006),
weshalb das Toxin unter Cre Kontrolle auch die Bildung von Keimzentren und somit die
Entwicklung von Gedächtnis B-Zellen beeinträchtigen könnte.
In Zellkultur wurde beschrieben, dass sowohl SAP97 (Liu et al. 2010) als auch das
Adapterprotein Growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) (Engels et al. 2009) über
verschiedene Bindemotive an die intrazelluläre Domäne von IgG binden und die Signalleitung
über den IgG-BZR verstärken können. Adoptive Transferexperimente mit Gedächtniszellen aus
B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen, die in Rag1-/- Mäusen übertragen wurden, weisen darauf hin,
dass die Bindung von Grb2 an die immunoglobulin tail tyrosine (ITT) Bindestelle auch in vivo
eine Rolle spielt (Ackermann et al. 2011). Auch die Umgebung, in der sich die B-Zellen befinden,
könnte einen Einfluss auf die Aktivierbarkeit der Gedächtnis-B-Zellen haben. So können adoptive
transferierte Gedächtnis-B-Zellen gegen virusartige Partikel des humanen Zytomegalivirus
(VLPs) direkt nach dem Transfer schlechter reaktiviert werden, als wenn ihnen Zeit gegeben
wurde, ihre Nischen zu finden (Weisel et al. 2010). Es erscheint wahrscheinlich, dass eine
Kombination von IgG-BZR extrinsischen und intrinsischen Signalen die stärkere Signalleitung
und schnellere Aktivierbarkeit der IgG Gedächtniszellen gegenüber naiven IgM-Zellen fördert.
9
Der B-Zell Rezeptor in der Aktivierung von B-Zellen des IgM und des IgG Isotypes
Einleitung
4.5 B-Zell Rezeptor Signalleitung
Nach einer Kreuzvernetzung des BZRs werden immunoreceptor tyrosine-based activation motifs
(ITAMs) der Igα- und Igβ- Untereinheit des BZRs durch Phosphotyrosinkinasen phosphoryliert.
Die Kinase Syk kann über seine SH2-Domäne an die ITAMs binden und wird so aktiviert. Syk
kann dann SLP65 (BLNK) phosphorylieren, das dann PLCγ2 und Btk über ihre SH2 Domänen
rekrutieren kann. Dieser Komplex gelangt an die innere Plasmamembran. PLCγ2 wird während
dieses Prozesses aktiviert und spaltet das Membranlipid Phosphatidyl-4,5-biphosphat in die
sekundären Botenstoffe 1,4,5-triphosphate (IP3) and Diacylglycerol (DAG). 1,4,5-triphosphate
(IP3) kann dann an den IP3-Rezeptor binden, der einen Ausstrom von Calcium aus dem
Endoplasmatischen Retikulum bewirkt. Durch das Calcium im Cytosol werden CRAC (calcium
release
activated
calcium)-Kanäle
aktiviert,
die
einen
Calcium-Einstrom
durch
die
Plasmamembran ermöglichen. DAG wiederum aktiviert die Proteinkinase C (PKC) und RasGRP
und startet so den NF-kB und den MAPK-Signalweg (Niiro & Clark 2002; Kurosaki et al. 2010).
Die Signalleitung über den BZR kann durch negative Corezeptoren, wie CD22, CD72 oder den
FcγR2b, negativ oder durch positive Corezeptoren, wie CD19 oder CD21 (Nitschke 2005;
Kurosaki 2002), positiv beeinflusst werden. Die inhibitorischen Rezeptoren wirken oft über
Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIM), welche die Phasphatasen SH2 domaincontaining phosphatase-1 (SHP-1) und SH2 domain-containing inositol phosphatase (SHIP)
aktivieren können, die das BZR-Signal inhibieren (Tsubata 1999; Daëron et al. 2008), während
aktivierende Corezeptoren meist über ihre ITAMs Kinasen aktivieren (Kurosaki 2002).
10
B-Zell Rezeptor Signalleitung
Einleitung
4.6 T-Zell Entwicklung
Einige thymusbesiedelnde Vorläuferzellen, die ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung verloren, aber
weiterhin die Fähigkeit haben, sich in verschiedene Entwicklungslinien zu differenzieren,
wandern aus dem Knochenmark in den Thymus. (Adolfsson et al. 2001; Christensen & Weissman
2001). Die Differenzierung zu T-Zellen verläuft als
gradueller
Prozess in vielen
Entwicklungsschritten (Koch & Radtke 2011). Wenige Vorläuferzellen wandern in den Thymus
ein und entwickeln sich zu frühen Thymus-Vorläuferzellen, die in vier Hauptfraktionen unterteilt
werden können. Die DN1 CD44+CD25− Zellen, zu denen die gerade eingewanderten Zellen
gehören, proliferieren im adulten Thymus für etwa 10 Tage im Bereich des perimedullären Cortex
(Porritt et al. 2003; Koch & Radtke 2011). Ein wichtiger Kontrollpunkt in den frühen DN1-Zellen
für die weitere T-Zell-Reifung ist die Aktivierung der Notch1 Signalleitung, die das Potential der
Zellen sich zu vielen anderen Zelltypen, wie B-Zellen, zu entwickeln, inhibiert (Wada et al. 2008;
Feyerabend et al. 2009; Bell & Bhandoola 2008). Der entscheidende Ligand für die Notch1
Signalleitung ist dabei DLL4 auf Epithelzellen des Thymus (Hozumi et al. 2008; Koch et al.
2008). DN1 Zellen wandern tiefer in den Cortex, genauer in den sub-kapsulären Bereich, wo sie
stimulatorische Signale von cortikalen Epithelzellen des Thymus und Fibroblasten bekommen
und sich zu DN2 (CD44+CD25+) Zellen entwickeln (Petrie & Zúñiga-Pflücker 2007; Takahama
2006). In diesem Stadium beginnen die Zellen, TCRγ, TCRδ und TCRβ Gene zu rearangieren
(Capone et al. 1998; Livák et al. 1999), ein Vorgang, der in den DN3-Zellen abgeschlossen wird
(Livák et al. 1999). Im DN2 Stadium spielt die IL-7 eine wichtige Rolle. Signale über den IL-7Rezeptor machen den TCRγδ Genlokus zugänglicher und Zellen mit einer höheren Expression
des IL-7-Rezeptor werden bevorzugt zu TCRγδ Zellen (Kang et al. 2001; Ye et al. 2001; Huang et
al. 2001). Im späten DN2 Stadium und im Übergang zum DN3 Stadium werden entscheidende
Gene für die β-Selektion der T-Zellen, wie Ptrca (pre-TCR α Kette) and Rag1, hochreguliert
(Balciunaite et al. 2005; Gounari et al. 2002; Taghon et al. 2006). Die Zellen entwickeln sich in
der subkapsulären Zone des Thymus weiter zum DN3 (CD44-CD25+) Stadium. Im weiteren
Verlauf der Rekombination der TZRγ, TZRδ und TZRβ Gene wird auch endgültig festgelegt, ob
sich die Zelle in eine γδ- oder αβ- T-Zelle differenziert. Die erfolgreiche Rekombination der
TZRγ und TZRδ Ketten legt das Schicksal zur γδ T-Zelle fest, das Notch unabhängig zu sein
scheint (Lauritsen et al. 2009; Wolfer et al. 2002; Ciofani et al. 2006). DN3 αβ-T-Zellen
entwickeln sich weiter und durchlaufen eine β-Selektion, nach der sie CD27 hoch regulieren.
Dazu benötigen sie Signale über einen funktionellen pre-TZR Komplex. Der Komplex besteht aus
einer funktionellen TCRβ-Kette, die mit einer vorläufigen invarianten pTα Kette kombiniert wird
und Komponenten von CD3 Ketten beinhalten (von Boehmer 2005). Zudem tragen CXCR4, der
Rezeptor für das Chemokin CXCL12 (Janas et al. 2010; Trampont et al. 2010) und der Notch1Rezeptor (Maillard et al. 2006; Ciofani et al. 2006; Ciofani & Zúñiga-Pflücker 2007) zur β-
11
T-Zell Entwicklung
Einleitung
Selektion bei. Notch1 vermittelt Überlebenssignale wahrscheinlich über den PI3K und AKT
Signalweg (Ciofani & Zúñiga-Pflücker 2005). Signale, die über CXCR4 vermittelt werden,
regulieren Bcl2-2A1, ein wichtiges Gen für das Überleben, hoch.
Außerdem führt die Expression des pre-TZR Komplexes im DN3 Stadium zu einer starken
Proliferation der Zellen, bis sie das doppelt positive CD4+CD8+ Stadium erreichen, in dem die
Rag-Gene erneut exprimiert werden, was die Rekombination der TZRα-Kette initiiert. So kann
eine funktionelle TZR β-Kette in den Nachkommen einer Zelle mit vielen TCR α-Ketten
kombiniert werden. Bevor die DN3 Zellen zu doppelt positiven CD4+CD8+ Zellen werden reifen
sie zu DN4 (CD44-CD25−) Zellen und fangen an, aus der subkapsulären Zone in Richtung
Medulla auszuwandern. Währenddessen regulieren die DN4 T-Zellen im Cortex CD4 und CD8
hoch und werden so zu doppelt positiven T-Zellen. Zellen, die im doppelt positiven Stadium einen
funktionellen αβ-TZR exprimieren, werden auf dessen Bindung an selbst-Peptid-major
histocompatibility complexes (MHC) auf cortikalen Epithelzellen des Thymus, dendritischen
Zellen oder Fibroblasten selektioniert. Zellen, die selbst-Peptid-MHCs mit einer ausreichenden
Affinität/Avidität binden, werden positiv selektioniert, während Zellen, die zu schwach an selbstPeptid-MHCs binden keine Überlebenssignale bekommen und in Apoptose gehen (Klein et al.
2009). Die CD4+CD8+ Zellen differenzieren nach der positiven Selektion zu CD4+CD8- oder
CD4-CD8+ einzel-positiven Zellen und wandern in die Medulla. Dort werden die Zellen negativ
selektioniert. Zellen, die mit einer zu hohen Affinität/Avidität an die selbst-Peptid-MHCs binden,
sterben durch Apoptose (Klein et al. 2009). Die einzel-positiven T-Zellen regulieren schließlich
den sphingosine-1-phosphate receptor 1 hoch und wandern aus dem Thymus in die Peripherie
aus, wo mehr des sphingosine-1-phosphate receptor 1 Liganden vorhanden sind (Matloubian et
al. 2004). Die Zellen werden zu reifen, naiven CD4+ T Helferzellen oder CD8+ zytotoxischen TZellen, die in der Peripherie zirkulieren.
12
T-Zell Entwicklung
Einleitung
Knochenmark
Hämatopoetische
Stammzelle
Thymus
besiedelnde
Vorl.-Zelle
Thymus
(Cortex)
Peripherie
Naive CD4+
einzelpositive
Zelle
Naive CD8+
einzelpositive
Zelle
CD4+
einzelpositive
Zelle
CD8+
einzelpositive
Zelle
Thymus
(Medulla)
αβ-TZR
DN-1
CD4+CD8+
doppelt pos.
Zellen
CD4-cre
TCRα
Rekombination
γδ -TZR
γδ T-Zellen
DN2
Lck-cre
TCRγδ / TCRβ
Rekombination
DN-3
pre-TZR
Thymus
(Subkapsuläre
Zone)
DN-4
Abb. 2: Schema T-Zell Entwicklung. Hämatopoetische Vorläuferzellen entwickeln sich zu thymus besiedelnden
Vorläuferzellen, die aus dem Knochenmark in den Thymus einwandern. Dort differenzieren sie vom doppelt negativen
(DN) 1 (CD4-CD8-) Stadium über das DN2 Stadium zum DN3 Stadium. Dabei verlieren sie die Zellen schrittweise die
Kapazität sich in andere Zelltypen zu differenzieren und rearangieren ihre T-Zell Rezeptor (TZR) γδ und TZR β Ketten.
Durch die Expression eines γδ TZR oder eines vorläufigen TZR mit β Kette entscheidet sich, ob die T-Zellen zu γδ TZellen oder αβ T-Zellen werden. In der weiteren αβ T-Zell Eintwicklung reifen die Zellen das DN4 zu doppelt positiven
T-Zellen CD4+CD8+, die einen vollständigen αβ TZR exprimieren. Die Zellen durchlaufen eine positive und eine
negative Selektion und differenzieren zu CD4+ oder CD8+ einzel positiven naiven T-Zellen, die in die Peripherie
auswandern. Dunkelblau/Hellblau: Vorläuferzellen, die sich noch zu anderen Zelltypen außer T-Zellen differenzieren
können; Grün: T-Zell Stadien; rote Schrift: Erste Expression von cre unter verschiedenen Promotoren. Quellen: Shah
und Zúñiga-Pflücker J. Immunol. 2014, Koch und Radtke Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2011.
13
T-Zell Entwicklung
Einleitung
4.7 T-Helferzellen
Viele Effektorfunktionen werden mit CD4+ T-Helferzellen (TH) in Verbindung gebracht, wobei
die Organisation und Entwicklung dieser Funktionen noch nicht vollständig verstanden ist. Der
erste Kontakt mit einer dendritischen Zelle, auf der die CD4+ T-Zelle ihr spezifisches PeptidAntigen auf einem MHCII Molekül entdeckt, hat einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung
und Funktion der Zelle, beispielsweise können dendritische Zellen dabei je nach Situation
verschiedene Zytokine sekretieren und die Costimulation für die T-Zelle variieren (Walsh & Mills
2013). Aber auch die Stärke der Signale, die über die T-Zell Rezeptoren (TZR) vermittelt werden,
spielt eine Rolle (Yamane & Paul 2013). Diese Signale können dann T-Zell- intrinsische
Entwicklungsprogramme anstoßen, die die Zelle und ihre Nachkommen in Richtung einer
definierten Effektor TH-Population treiben (Abb. 3).
TH1-Antworten vermitteln Immunantworten gegen intrazelluläre Pathogene (Paul & Seder 1994).
IL-12 und IFNγ induzieren die TH1-Antworten, die durch einen synergistischen Effekt von IL-18
verstärkt werden kann. Nach der TZR Aktivierung regulieren diese Zellen den IL-12Rβ2 hoch
(Szabo et al. 1997), was das Stat4-abhängie Reaktionspotential gegenüber IL-12 erhöht (M H
Kaplan et al. 1996). IFNγ löst Stat1-abhängig die Expression des TH1 Masterregulators T-bet aus,
der die IFNγ-Produktion fördert, aber gleichzeitig auch die IL-4 Expression inhibiert (Szabo et al.
2003).
TH2-Antworten vermitteln Immunantworten gegen extrazelluläre Parasiten durch die Produktion
von IL-4, IL-5, IL-13 und IL-25. Die T-Zellen regulieren den IL-4 Rezeptor hoch, der über Stat6
die Expression des TH2-Masterregulators GATA-3 fördert (Mark H Kaplan et al. 1996; Zheng &
Flavell 1997). GATA-3 wird für die TH2-Differenzierung benötigt, blockiert aber auch die TH1Antwort. IL-2 kann auch Stat5-abhängig die Produktion von TH2 Zytokinen verstärken (Zhu et al.
2003). TH1- und TH2- Antworten führen also zu Reaktionen, die sich gegenseitig ausschließen.
Zusätzlich wurde eine TH17 Entwicklungslinie beschrieben (Bettelli et al. 2006; Harrington et al.
2005; Mangan et al. 2006; Park et al. 2005; Veldhoen et al. 2006). TH17-Zellen wurden
ursprünglich mit Autoimmunerkrankungen und chronischen Entzündungen in Verbindung
gebracht, vermitteln aber auch Antworten gegen Pilze und extrazelluläre Bakterien durch die
Produktion von IL-17, IL-17F und IL-22 (Korn et al. 2009; Miossec et al. 2009). Es wurde
gezeigt, dass IL-6 und TGFβ die Produktion von IL-17 in naiven TH-Zellen auslösen können
(Bettelli et al. 2006; Veldhoen et al. 2006), beteiligt sind aber auch IL-21 und IL-23 (Zhou et al.
2007). TGFβ allein führt zur Bildung von induzierten T-reg Zellen, die inhibierend auf die
Immunantwort wirken. Die zusätzliche Gabe von IL-6 wiederum begünstigt die IL-17 Produktion
und inhibiert die FoxP3- abhängige Differenzierung zu T-reg Zellen. Außerdem wird nach IL-6Zugabe der orphan nuclear receptor RORγt Stat3-abhängig hoch reguliert. Diese Vorgänge
14
T-Helferzellen
Einleitung
führen zur Expression des TH17 Masterregulators RORγt (Ivanov et al. 2006), an dessen
Regulation der IRF-4 Rezeptor und das IRF4 bindende Protein beteiligt sind (Chen et al. 2008;
Brüstle et al. 2007). FoxP3 kann von RORγt und dem verwandten RORα gebunden werden,
wodurch FoxP3 inhibiert wird und eine Differenzierung zu T-reg Zellen unterbunden wird (Yang
et al. 2008; Zhou et al. 2008). Bei den TH17- und den Treg-Zellen handelt es sich also wie bei den
TH1- und die TH2-Zellen um eigene Entwicklungslinien, die sich teilweise gegenseitig inhibieren.
Außerdem gibt es follikuläre Helfer T-Zellen (TFH), welche die humorale Immunität unterstützen,
indem sie die Keimzentrumsreaktion, den Klassenwechsel von B-Zellen, die Affinitätsreifung von
antikörper produzierenden B-Zellen und lang anhaltende Antikörperantworten fördern. Ihr
Einfluss auf Gedächtnis B-Zellen ist weitgehend unklar (Crotty 2011; Yamane & Paul 2013). Sie
haben Bcl6 als Masterregulator (Nurieva et al. 2009; Johnston et al. 2009; Yu et al. 2009; Crotty
2011), der die Differenzierung zu TH1, TH2 und TH17 Zellen insbesondere durch die Inhibition der
Blimp-1 Expression unterdrückt. Außerdem exprimieren TFH Zellen den CXC-Chemokin
Rezeptor 5 (CXCR5), der wichtig für die Wanderung der Zellen in den Follikel ist (Breitfeld et al.
2000; Schaerli et al. 2000). Ob es sich bei den TFH Zellen um eine eigene Linie handelt oder, ob
sich die Zellen aus TH1, TH2 und TH17 Zellen entwickeln ist umstritten (Crotty 2011; Yamane &
Paul 2013). Die Differenzierung zu TFH Zellen wird aber unter anderem durch die Zytokine IL-6
und IL-21 und starke TZR-vermittelte Signale gefördert (Crotty 2011).
Neben den bereits aufgezählten Populationen wurden noch TH9 (Kaplan 2013) und TH22 (Eyerich
et al. 2009) Zellen beschrieben. Jede T-Helferzellinie ist auf spezifische Aufgaben in der
Immunantwort spezialisiert.
Gezeigt werden konnte außerdem, dass es bis zu einem gewissen Grad möglich ist, die
verschiedenen T-Helferzellen ineinander umzuwandeln, das heißt sie zeigen eine Plastizität
(Nakayamada et al. 2012; Zhou et al. 2009; O’Shea & Paul 2010).
15
T-Helferzellen
Einleitung
IFNγ + IL-12
TH1
STAT4
T-bet
TH17
STAT3
RORγT
Naive CD4+
einzelpositive
Zelle
IL-4 + IL-2
IL-17a, IL-17f,
TNFα, GM-CSF,
IL-22
iT-reg
STAT5
FoxP3
IL-10, IL-35,
TGFβ
TH2
STAT6
GATA3
IL-4, IL-5,
IL-13
T-fol. Helfer
Zellen
Bcl-6
IL-6; kein TGFβ
IFNγ, TNFα
IL-21,
IFNγ oder IL-4
TH9
PU.1?
IL-9, IL-10,
IL-21
TH22
?
IL-22
Abb. 3: T-Helferzell Differenzierung. Klassisch können sich naive CD4+ T-Zellen nach T-Zell Rezeptor Stimulation
abhängig vom Zytokinmilieu zu verschiedenen Helferzelllinien entwickeln. Dabei wirken unterschiedliche Zytokine auf
unterschiedliche STAT (signal transducer and activator of transcription) Transkriptionsfaktoren, die die Entwicklung
einer entsprechenden T-Helferzelllinie unterstützen (grün). Neben diesen Transkriptionsfaktoren gibt es
Transkriptionsfaktoren, die Master Regulatoren (Lila) genannt werden und nach der Induktion ihrer Expression
hauptsächlich zur Entwicklung und Aufrechterhaltung der entsprechenden T-Helferzelllinie beitragen. Das Schema ist
stark vereinfacht, da viele Faktoren an der Entwicklung der verschiedenen Populationen beteiligt sind und sich die THelferzellpopulationen teilweise ineinander umwandeln können. Gelb: Klassische T-Helferzelllinien; Rot: Es ist
umstritten, ob es sich bei diesen Zellen um eigene Linien handelt und ihre Entwicklung und Funktion in vivo ist
weitgehend unklar. Quellen: Zhu et al. Annu. Rev. Immunol. 2010, Evans und Jenner Brief. Funct. Genomics 2013,
Yamane und Paul Immunol. Rev. 2013, Walsh und Mills Trends Immunol.2013, Kaplan Immunol. Rev. 2013, O’Shea
und Paul Science 2010, Zhu und Paul Immunol. Rev. 2010.
16
T-Helferzellen
Einleitung
4.8 Die
Experimentelle
autoimmune
Enzephalomyelitis
(EAE)
ein
Mausmodell für Multiple Sklerose im Menschen
Multiple Sklerose ist eine auf Entzündungen basierende, demyelierende Krankheit des zentralen
Nervensystems (ZNS). Allerdings gibt es verschiedene Formen, die auch verschiedene Ursachen
und Verläufe haben können (Lucchinetti et al. 2000; Sospedra & Martin 2005). Die
experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das am weitesten verbreitete Modell für
die Multiple Sklerose und wird durch die Stimulation einer Immunantwort gegen ein Antigen des
zentralen Nervensystems ausgelöst (Stromnes & Goverman 2006). Die Gabe von Freund’s
Adjuvant (Kabat et al. 1947) und Pertussis- Toxin (Levine & Sowinski 1973) verbessern die
Effizienz der EAE Induktion, wobei es die Aufgabe des Pertussis- Toxins ist, die Blut-HirnSchranke durchlässiger zu macht. Als Antigene für die EAE kommen verschiedene Antigene in
Frage, z.B. Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG), ein kleiner Bestandteil des Myelin,
der eine starke Hirnhautentzündung hervorrufen kann (Linnington et al. 1984; Lebar & Vincent
1981). Es wurde gezeigt, dass es ausreicht T-Zellen, die eine spezifische MHCII-Peptid
Kombinationen erkennende aus EAE-Mäusen in Rezipienten zu übertagen, um eine EAE
auszulösen (Zamvil et al. 1985; McDevitt et al. 1987). Die aktive wie die passive EAE basieren
darauf, dass periphere Myelin- spezifische CD4+ T-Zellen, die den Toleranzmechanismen
entkommen sind, aktiviert werden (Seamons et al. 2003), weil diese besser in der Lage sind, die
Blut-Hirn-Schranke zu überqueren als naive T-Zellen (Wekerle et al. 1986; Brabb et al. 2000;
Hickey 1991). Im ZNS präsentieren sowohl lokale als auch eingewanderte antigenpräsentierende
Zellen auf ihren MHCII- Molekülen Myelinpeptide im Zusammenspiel mit costimulatorische
Molekülen (Tompkins et al. 2002; McMahon et al. 2005). Diese können infiltrierende Myelinspezifische T-Zellen aktivieren (Kawakami et al. 2004), was auch dazu führt, dass Chemokine
ausgeschüttet werden, die vorwiegend Makrophagen anlocken. Makrophagen wiederum können
proinflammatorische Proteine wie TNFα und IL1 ausschütten, die eine Entzündung verlängern
und zur Gewebeschäden führen (Kuchroo et al. 2002). Es bilden sich Infiltrate aus T-Zellen, BZellen und Makrophagen, sowie demyelierte Stellen im ZNS, wie sie auch in der Multiplen
Sklerose zu finden sind (Raine et al. 1978; Sospedra & Martin 2005). Die klinischen Symptome
haben mit der Position der Infiltrate zu tun (Sobel 2000), während die Schwere der Krankheit
auch mit der Zusammensetzung der Infiltrate (Berger et al. 1997) und der Anwesenheit
demyelierender Antikörper zusammenhängt (Linington et al. 1988). Die EAE kann akut,
chronisch oder wiederkehrend sein. Dies hängt vom Mausstamm, dem Antigen und der Gabe von
Pertussis- Toxin ab (Levine et al. 1966; Tsunoda et al. 2000). Außerdem können Geschlecht und
Alter der Tiere (Smith et al. 1999; Teuscher et al. 2004), sowie weitere Faktoren Einfluss nehmen
(Stromnes & Goverman 2006). In der klassischen Form der EAE reflektieren die klinischen
Anzeichen vorwiegend Entzündungen im Rückenmark, obwohl die MOG induzierte EAE auch
17
Die Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ein Mausmodell für Multiple Sklerose
im Menschen
Einleitung
den Sehnerv beeinträchtigt (Sakuma et al. 2004; Storch et al. 1998; Bettelli et al. 2003). Die
vorwiegend im Rückenmark vorkommenden Entzündungen und die limitierten Anzeichen für die
Krankheit stellen Unterschiede zur Multiplen Sklerose im Menschen dar. Es gibt aber neben dem
klassischen EAE Modell, weitere atypische Modelle, die helfen andere Aspekte der Multiplen
Sklerose zu untersuchen (Stromnes & Goverman 2006). CD4+ T-Zellen sind die vorwiegenden
Effektor- T-Zellen während einer EAE, wohingegen in der Multiplen Sklerose aber
wahrscheinlich auch CD8+ T-Zellen beteiligt sind (McDole et al. 2006; Lassmann & Ransohoff
2004; Friese & Fugger 2005; Johnson et al. 2007; Goverman et al. 2005). Durch die Nutzung von
Freund’s Adjuvant wird in der EAE vor allem eine TH1- und TH17-Immunantwort ausgelöst
(Tigno-Aranjuez et al. 2009; Batoulis et al. 2010). Mit in vitro differenzierten Myelinspezifischen T-Helferzellen wurde gezeigt, dass TH1-, TH17- und TH9- Zellen eine EAE
auslösen können (Jäger et al. 2009). IL-6 ist zusammen mit TGFβ an der Differenzierung von
naiven CD4+ T-Zellen zu TH17- Zellen beteiligt, während TGFβ allein zur Differenzierung zu Treg Zellen führt. IL-6 defiziente Mäuse entwickeln erwartungsgemäß eine mildere EAE, aber eine
in vivo Depletion der T-regs in diesen Tieren führte zur Bildung von TH17 Zellen und einem
stärkeren Krankheitsverlauf. IL-6 kontrolliert also die Balance zwischen einer TGFβ- abhängigen
T-reg- und TH17- Antwort. Diese Versuche belegen die Bedeutung von TH17- Zellen und T-regZellen in der EAE (Rangachari & Kuchroo 2013). Die EAE ist ein Krankheitsmodell für Multiple
Sklerose, das hauptsächlich auf der Wirkung von CD4+ T-Zellen basiert.
18
Die Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ein Mausmodell für Multiple Sklerose
im Menschen
Einleitung
4.9 Das Adapterprotein „growth factor receptor bound protein 2”
Adapterproteine dienen als Gerüst für Signalosomen und sind an der Bildung von
Antigenrezeptorkomplexen beteiligt (Lindquist et al. 2003; Samelson 2002; Samelson 1999). Das
Adapter Protein growth factor receptor bound protein 2 (Grb2) ist ein kleines, hoch konserviertes
Adapterprotein von etwa 25-30 kDa, verfügt über eine zentrale Src homology 2 (SH2) und zwei
flankierende Src homology 3 (SH3) Domänen (Abb. 4). Es wurde 1992 unabhängig von zwei
Gruppen beschrieben. Eine Gruppe entdeckte es in einem Screening für Proteine, die an die
phosphorylierte Form des epidermal growth factor receptor (EGFR) oder des platelet-derived
growth factor receptor binden und benannten es entsprechend (Lowenstein et al. 1992). Sie
fanden heraus, dass Grb2 die Wachstumsfaktor-Rezeptoren mit der Ras Signalleitung verbindet,
indem es an den GDP/GTP Austauschfaktor für Ras namens SOS bindet. Eine andere Gruppe
führte unabhängig einen cDNA Screen auf SH2-Domänen in Säugern durch und nannte das
Protein abundant Src homology (Ash) (Matuoka et al. 1992). Grb2 besitzt keine katalytische
Funktion, sondern kann mit seiner SH2 Domäne kurze Konsensussequenzen mit einem
phosphorylierten Tyrosinrest binden (Pawson & Gish 1992; Kessels et al. 2002), während es mit
seinen SH3 Domänen prolinreiche Regionen mit einem PXXP Kernstück erkennt und bindet (Ren
et al. 1993). Grb2 ist ein Mitglied der Grb2-Adapterfamilie zu der auch das Grb2-related adapter
protein (Grap) (Feng et al. 1996) und Grb2-related adapter downstream of Shc (Gads) gehören
(Liu & McGlade 1998). Gads wurde auch als Grap-2 (Qiu et al. 1998), Grb2-related protein of the
lymphoid system (GrpL) (Law et al. 1999),monocytic adapter (Mona) (Bourette et al. 1998),
Grb2-related protein with insert domain (GRID) (Ellis et al. 2000) und Grb2 family member of 40
kDa (Grf40) (Asada et al. 1999) beschrieben. Grap zeigt eine etwa 59%ige Übereinstimmung in
der Aminsosäuresequenz mit Grb2 und wird vorwiegend in Milz und Thymus exprimiert (Feng et
al. 1996). Gads weist ebenfalls eine hohe Ähnlichkeit zu Grb2 auf und wird vorwiegend im
hämatopoetischen System exprimiert (Liu & McGlade 1998). Die Funktionen des breiter
exprimierten Grb2 könnten in den lymphatischen Organen mit denen von Grap und Gads
überlappen. So binden die SH2 und SH3 Domänen von Grb2 und Grap ähnliche Proteine und
Grap- defizienten Mäuse haben keinen auffälligen Phenotyp (Cheng et al. 1998). Gads kann
zumindest über seine SH3 Domänen auch an andere Zieldomänen als Grb2 binden (Liu &
McGlade 1998; Liu et al. 1999; Liu et al. 2000). Grb2 spielt in der Embryonalentwicklung der
Maus eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Endodermzellen und der Bildung des
Epiblasten (Cheng et al. 1998; Findlay et al. 2013), weshalb Grb2-defiziente Mäuse embryonal
lethal sind (Cheng et al. 1998). In der Folge wurden Mäuse untersucht, die haploid Grb2 defizient
waren (Gong et al. 2001). Mit dem Cre/loxP System wurde es schließlich möglich, konditionale
knockout Mäuse zu generieren (Rajewsky et al. 1996; Kos 2004). Es wurden in zwei
19
Das Adapterprotein „growth factor receptor bound protein 2”
Einleitung
Arbeitsgruppen unabhängig voneinander konditionale Grb2 knockout Mäuse generiert
(Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2010).
B-Zell Corezeptoren
B-Zell Rezeptor
FcyR2b, CD72, CD22,
CD19
IgG, IgE
Grb2
PI3K Signalweg
Ras/MAPK
SH2
SHIP1, SHIP2,
BCAP, PI3K Cβ, p85 α/β, Vav
GAPT
Protein Tyrosin
Phosphatasen
SOS1/2, HPK-1
Adapterproteine
LAT, Dok-3, LAX,
SLP65, NTAL,
GAPT
SHP1, SHP2, PTP-PEST
PTPRα
SH3-C
SH3-N
T-Zell Corezeptoren
Weitere Bindepartner
CD28
Btk,
Themis
Abb. 4: Aufbau von Grb2 und Bindepartner, mit denen Grb2 in Lymphozyten über seine SH2 und SH3
Domänen interagiert.In grün sind positive Regulatoren und in rot sind negative Regulatoren verschiedener Signalwege
dargestellt. Verändert nach: Maignan et al. Science 1995, Neumann et al. Immunol. Rev. 2009. Zusätzliche Quellen:
Schneider et al. Eur. J. Immunol. 1995, Sommers et al. Bioessays 2004; Paster et al. J. Immunol. 2013, Engels et al.
Nat. Commun. 2014.
4.10 Die Rolle von Grb2 in B-Zellen
Grb2 hat eine Vielzahl von Interaktionspartnern in B-Zellen, die zumeist an der Signalleitung
über den BZR beteiligt sind. Grb2 moduliert die Signalleitung über den BZR unter anderem durch
seine Bindung an den aktivierenden BZR- Corezeptor CD19, der an der Bildung der B-Zell
Mikrocluster beteiligt ist und die anti- apoptotisch wirkende PI3K rekrutiert und das BZR- Signal
amplifiziert (Brooks et al. 2000; Depoil et al. 2008; Tuveson et al. 1993; Fujimoto et al. 2000;
Tedder et al. 1997; Neumann et al. 2009). Zusätzlich bindet Grb2 auch direkt an weitere Moleküle
des PI3K Signalweges (Neumann et al. 2009) und fördert die Aktivierung des anti-apoptotischen
Faktors Akt (Ackermann et al. 2011). Damit verstärkt Grb2 insgesamt die Signalleitung über
CD19 und den PI3K Signalweg.
20
Die Rolle von Grb2 in B-Zellen
Einleitung
Außerdem interagiert Grb2 mit negativen BZR- Corezeptoren, wie CD72, CD22 und FcγR2b,
sowie Phosphatasen, die von diesen Rezeptoren aktiviert werden (Poe et al. 2000; Nitschke 2005;
Neumann et al. 2009; Neumann et al. 2011). Funktionell wurde beschrieben, dass eine
Kreuzvernetzung des BZRs mit dem FcγR2b in einer reifen B-Zelllinie zu einer verstärkten
Bildung eines Dok-3/Grb2/SHIP Komplexes und einer reduzierten Bindung von Grb2 an CD19
führt. Dadurch wird das Verhältnis der inhibierenden und aktivierenden Funktionen von Grb2 in
Richtung der inhibierenden Funktionen verschoben (Neumann et al. 2011).
Grb2 moduliert die B-Zell Signalleitung auch durch die Bindung an andere Adapterproteine. So
wird das Adapterprotein Dok-3, welches an der Innenseite der Membran lokalisiert ist, nach BZRStimulation von Lyn phosphoryliert und bindet Grb2 aus dem Zytosol. Dieser Komplex wird dann
durch Grb2 in BZR- Mikrocluster rekrutiert, in denen auch die potentiellen Grb2 Bindepartner
SLP65 und Vav3 zu finden sind. Grb2 inhibiert dort die Syk- Phosphorylierung durch Lyn und
verstärkt die Phosphorylierung von SHIP und wirkt somit inhibierend. Auch die Btk-Aktivität
wird durch den Dok-3/Grb2 Komplex reduziert, was wiederum die PLCγ2 Aktivität, die IP3
Bildung und die Calcium Mobilisierung verringert (Lösing et al. 2012; Stork et al. 2007;
Schnyder et al. 2011). Während die Bindung von Grb2 an Dok-3 inhibierend wirkt, verstärkt die
Bindung von Grb2 an das Adapterprotein Non-T Cell Activation Linker (NTAL) die Calcium
Mobilisierung. NTAL rekrutiert Grb2 in lipid rafts und verhindert so seine Beteiligung an
inhibitorischen Prozessen (Stork et al. 2004). Die subzelluläre Position von Grb2 beeinflusst also
die biologische Funktion von Grb2 durch die Beteiligung an verschiedenen Signalkomplexen, die
aktivierend oder inhibierend wirken können. Somit ist Grb2 ein Adapter, der das Verhältnis von
inhibitorischen und aktivierenden Funktionen modulieren kann.
Die biologische Funktion von Grb2 in vivo konnte lange nicht untersucht werden, da ein
vollständiger Grb2 Knockout in der Maus embryonal lethal ist (Cheng et al. 1998). Dies wurde
erst durch konditional deletierbare Knockout Mäuse möglich (Ackermann et al. 2011; Jang et al.
2010). Um Grb2 in B-Zellen zu deletieren, wurde zum einen cre unter der Kontrolle des mb1Promotors verwendet (Ackermann et al. 2011), zum anderen cre unter der Kontrolle des CD19Promotors (Jang et al. 2011). In beiden Mäusen sind die Zellzahlen im Knochenmark normal,
aber die Zahl der Transitionalen Typ 1 (T1), Transitionalen Typ 2 (T2) und reifen B-Zellen in der
Peripherie ist reduziert (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011). In Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen war
die spontane in vitro Apoptoserate reifer B-Zellen leicht erhöht, die BAFF-Rezeptor Expression
war auf diesen moderat niedriger und die Aktivierung des anti-apoptotisch wirkenden AKT war
nach BZR-Stimulation reduziert, was auf einen Einfluss von Grb2 auf Apoptosemechanismen
nahelegt. Zudem war der BrdU Einbau in T1-Zell Vorläufern in vivo reduziert, was zu einer
niedrigeren Zahl an BrdU+ T1-Zellen in der Milz führte und auf eine reduzierte Proliferation in
der Entwicklung hindeutet (Ackermann et al. 2011).
21
Die Rolle von Grb2 in B-Zellen
Einleitung
B-Zellen von Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäusen zeigen eine reduzierte CD22
Phosphorylierung nach BZR Stimulation und dazu passend eine höhere PLCγ2 Phosphorylierung
und Calcium Mobilisierung (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011). Ein Grund dafür könnte die
leicht niedrigere Lyn- Aktivierung nach BZR- Stimulation sein, da Lyn CD22 phosphoryliert
(Jang et al. 2011). Grb2 interagiert auch mit SOS und HPK1 aus dem MAPK Signalweg
(Neumann et al. 2009). Die Bindung von Grb2 an SOS führt in vielen Zelltypen über die
Aktivierung von Ras zur Aktivierung von MAP-Kinasen. In B-Zellen gibt es aber Hinweise, dass
der Signalweg über RasGRP3 eine wichtigere Rolle bei der Ras Aktivierung spielt (Ehrhardt et al.
2004; Oh-hora et al. 2003; Teixeira et al. 2003). In Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäusen war die
Phosphorylierung von der MAP-Kinasen ERK, JNK und P38 nach BZR Stimulation erhöht (Jang
et al. 2011). Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse zeigten dagegen eine unveränderte ERK und P38
Phosphorylierung nach BZR- Stimulation, während die Phosphorylierung von JNK reduziert war.
Warum die Signalleitung in Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäusen unterschiedlich
beeinträchtigt ist, ist unklar. Trotz der unveränderten ERK Aktivierung in Grb2fl/fl mb1cre/+
Mäusen war die Aktivierung von Ras reduziert (Ackermann et al. 2011). Ras ist ein wichtiges
Protein für die ERK Aktivierung. Eine normale ERK- und beeinträchtigte Ras- Aktivierung
wurde aber auch für haploid Grb2 defiziente T-Zellen beschrieben (Gong et al. 2001). Es ist
unklar, welche alternativen Signale ERK in der Grb2fl/fl mb1cre/+ Maus aktivieren bzw., ob die
niedrigere Ras Aktivität ausreicht, um ERK und P38 aber nicht JNK auf ein mit dem Wildtyp
vergleichbares Niveau zu phosphorylieren.
B-Zell spezifische Grb2 defiziente Mäuse haben mehr IgM Plasmazellen, einen höheren IgM
Antikörperlevel und mehr IgM Autoantikörper. Außerdem proliferieren ihre B-Zellen in vitro
stärker nach anti-IgM Stimulation (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011) und weisen somit
einen hyperreaktiven Phänotyp auf. Grb2 wirkt also auch inhibierend auf die Zahl und die
Aktivität von IgM B-Zellen.
Die sekundäre Immunantwort gegen virusartige Partikel des humanen Zytomegalovirus (VLPs)
war in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen reduziert (Ackermann et al. 2011). Dazu passend wurde
beschrieben, dass Grb2 auch an den IgG- und den IgE-Rezeptor binden kann und die
Signalleitung in vitro im Vergleich zum IgM-Rezeptor verstärkt (Engels et al. 2009). Außerdem
war die IgG3 Immunatwort von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen gegen das Thymus- unabhängige Typ 2
Antigen TNP-Ficoll beeinträchtigt. Die primäre und sekundäre Antwort von Grb2fl/fl CD19cre/+
Mäusen gegen NP30KLH war dagegen unverändert (Jang et al. 2011). Der unterschiedliche
Einfluss von Grb2 auf die sekundäre Immunantwort zwischen der Grb2fl/fl mb1cre/+ Maus und der
Grb2fl/fl CD19cre/+ Maus kann an den unterschiedlichen Antigenen liegen, die verwendet wurden.
Während die von Viren abgeleiteten VLPs partikulär sind, ist NP30KLH ein lösliches
22
Die Rolle von Grb2 in B-Zellen
Einleitung
Proteinantigen. Grb2 fördert also sowohl Thymus- abhängige Immunreaktionen als auch
Antworten gegen Thymus- unabhängige Typ 2 Antigene.
Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäuse weisen eine beeinträchtigte Keimzentrumsreaktion
nach einer Immunisierung mit Schafserythrozyten auf (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011).
Für Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäuse wurde gezeigt, dass sie nach der Stimulation mit CXCL13 über
CXCR5 einen Defekt in der Produktion von Lymphotoxin-β aufweisen. Der Phänotyp von
Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäusen in der Milz gleicht darum dem von Lymphotoxin-β defizienten Tieren
(Junt et al. 2006; Endres et al. 1999; Tumanov et al. 2002), die eine beeinträchtigte
Keimzentrumsreaktion aufweisen , eine fehlerhafte Ausbildung des Netzwerks der follikulären
dendritischen Zellen in der Milz und eine Störung der Marginalzonenbildung (Junt et al. 2006;
Endres et al. 1999; Tumanov et al. 2002; Jang et al. 2011). Wurden Knochenmarkszellen aus der
Grb2fl/fl CD19cre/+ Maus mit einem retroviralen Vektor zur Überexpression von Lymphotoxin-β
transduziert und in Rag1-/- Mäuse übertragen, so zeigten diese normale Keimzentrumsreaktionen.
Auch Knochenmarkschimären, bei denen Wildtyp- und Grb2- defiziente B-Zellen über CD45.1
und CD45.2 unterschieden werden konnten , zeigten normale Keimzentrumsreaktionen, an denen
Grb2 defiziente B-Zellen beteiligt waren. Grb2 hat also keinen intrinsischen Effekt auf die
Differenzierung naiver B-Zellen zu Keimzentrumszellen (Jang et al. 2011). Neben den
Keimzentrumzellen ist in den Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäusen auch die Zahl der Gedächtnis B-Zellen
reduziert (Jang et al. 2011).
23
Die Rolle von Grb2 in B-Zellen
Einleitung
4.11 Die Rolle von Grb2 in T-Zellen
Die Rolle von Grb2 in vivo wurde zuerst in T-Zellen von Mäusen untersucht, die haploid Grb2defizient waren. Die Grb2+/- T-Zellen zeigten nach TZR-Stimulation eine schwächere JNK und
P38 Phosphorylierung, aber eine normale Phosphorylierung von ERK (Gong et al. 2001). Die
MAP-Kinasen ERK, JNK und P38 wirken unterschiedlich auf die Selektion im Thymus. ERK ist
wichtig für die positive Selektion (Pagès et al. 1999; O’Shea et al. 1996; Swan et al. 1995;
Alberola-Ila et al. 1995; Alberola-Ila et al. 1996), während JNK und P38 wichtig für die negative
Selektion sind (Rincón et al. 1998; Sabapathy et al. 1999; Sugawara et al. 1998; Dong et al. 1998;
Dong et al. 2000). Anhand von transgenen Mausmodellen wurde gezeigt, dass die negative
Selektion in den haploid Grb2 defizienten Mäusen passend zur niedrigeren JNK und P38
Aktivierung beeinträchtigt war, während die positive Selektion nicht betroffen war. Die
unterschiedliche Regulation der MAP-Kinasen könnte damit erklärt werden, dass der
Schwellenwert der Signalleitung für eine Aktivierung von ERK niedriger ist, als der für eine
Aktivierung von JNK oder P38. Eine Reduktion von Grb2 um etwa 60 % in Grb2+/- T-Zellen
könnte demnach noch ausreichen, um ERK zu aktivieren (Gong et al. 2001). Später wurde eine
konditionale T-Zell spezifische Grb2 Knockout Maus generiert, bei der Cre unter der Kontrolle
des Lck-Promotors steht und in der Grb2 ab dem Übergang vom DN2- zum DN3-Stadium
deletiert wird (Jang et al. 2010). Die Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse zeigten eine Reduktion der doppeltpositiven T-Zellen um etwa 30 %. Um die positive Selektion der CD4+ T-Zellen zu überprüfen,
wurden DO11.10 TZR trangene Mäuse verwendet. Diese exprimieren einen TZR, der das Antigen
OVA (chicken ovalbumin) in Verbindung mit einem I-Ad MHCII-Molekül erkennt (Murphy et al.
1990). DO11.10 TZR trangene Mäuse wurden mit Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen gekreuzt. Die Zahl
der positiv selektionierten CD4+ Zellen in diesen Mäusen war stark reduziert (Jang et al. 2010).
Um die positive Selektion der CD8+ T-Zellen zu untersuchen, wurden T-Zell spezifische Grb2
defiziente Mäuse mit H-Y transgenen Mäusen gekreuzt, die einen TZR exprimieren, der das
männliche Antigen H-Y in Verbindung mit einem H-2B MHCI-Molekül erkennt. Weibliche
Mäuse dieser Linie exprimieren kein H-Y Antigen, weshalb ihre T-Zellen positiv, aber nicht
negativ selektioniert werden (Kisielow et al. 1988). In den weiblichen Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen,
die einen H-Y spezifischen TZR exprimierten, war die positive Selektion der CD8+ T-Zellen stark
beeinträchtigt (Jang et al. 2010). Zusätzlich sollte auch die negative Selektion untersucht werden.
In männlichen Mäusen, die einen transgenen TZR exprimiern, der das männliche Antigen H-Y in
Verbindung mit einem H-2B MHCI-Molekül erkennt, werden die CD8+ Zellen negativ
selektioniert. In den männlichen Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen, die einen H-Y spezifischen TZR
exprimierten, war die negative Selektion der CD4+CD8+ und der CD8+ T-Zellen stark
beeinträchtigt (Jang et al. 2010). Auch durch die Gabe des Superantigens SEB (staphylococcal
enterotoxin B) wurde die negative Selektion untersucht. Auf MHCII- Komplexen präsentiert führt
24
Die Rolle von Grb2 in T-Zellen
Einleitung
es zur Deletion von TCRVβ8+ T-Zellen, während TCRVβ6+ T-Zellen unbeeinflusst bleiben
(White et al. 1989; Jenkinson et al. 1990). In Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen, die mit SEB behandelt
wurden, war die negative Selektion der CD4+ Zellen gegenüber Kontrolltieren stark beeinträchtigt
(Jang et al. 2010). Mit Hilfe dieser transgenen Modellen und dem Superantigen SEB wurde
gezeigt, dass sowohl die positive als auch die negative Selektion der T-Zellen in Grb2fl/fl Lckcretg
Mäusen gestört ist (Jang et al. 2010).
Darüber hinaus wurde entdeckt, dass auch die Signalleitung in den Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen
beeinträchtigt ist (Jang et al. 2010). Nach TZR Stimulation werden die ITAMs der CD3ζ Kette
von der Tyrosinkinase Lck phosphoryliert (Weiss & Littman 1994; Samelson et al. 1995). Die
ITAMS rekrutieren dann die Tyrosinkinase ZAP70, die durch Autophosphorylierung aktiviert
werden kann. ZAP 70 phosphoryliert den protein linker for activation of T cells (LAT), der
Signalkomplexe rekrutiert, die Grb2, SLP-76, Vav, Gads, PLCγ-1, und Itk enthalten. Dies führt zu
Veränderungen des Zytoskeletts, der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren im Kern und zur
Calcium- Mobilisierung (Weiss & Littman 1994; Samelson 1999; Schaeffer & Schwartzberg
2000; Myung et al. 2000). Die Phosphorylierung der TCRζ Kette, Lck, ZAP70 und LAT waren in
den Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen nach TZR Stimulation reduziert. Grb2 ist also ein positiver Faktor
für die Aktivierung von Proteinen, die an der Initiierung des TZR- Signales beteiligt sind.
Außerdem war in der TZR- Signalleitung die Aktivierung von P38 und JNK beeinträchtigt,
während die Aktivierung von ERK und Ras unverändert war. Dies zeigt, dass ERK und Ras in TZellen auch unabhängig von Grb2 aktiviert werden können. Wahrscheinlich erfolgt die
Aktivierung über RasGRP (Dower et al. 2000). Auch die Aktivierung von PLCγ und die damit
verbundene Calcium- Mobilisierung nach TZR- Stimulation waren in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen
reduziert (Jang et al. 2010). Damit ist Grb2 in naiven T-Zellen anders als in naiven B-Zellen
(Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011) ein positiver Regulator der Calcium- Mobilisierung.
Über retrovirale Transduktion wurden Grb2 Mutationen in Knochenmarkszellen von T-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen eingebracht, die zur Generierung von Knochenmarkschimären
verwendet wurden. So wurde gezeigt, dass die Entwicklung von CD4+ T-Zellen von der SH2- und
der C-terminalen SH3-, nicht aber von der N-terminalen SH3- Domäne von Grb2 abhängt (Jang et
al. 2010). Kürzlich wurde beschrieben, dass Grb2 über seine SH3- Domäne konstitutiv an
Thymocyte-expressed molecule involved in selection (THEMIS) binden kann (Paster et al. 2013).
THEMIS reguliert den Schwellenwert des TZR-Signales, das zur positiven und negativen
Selektion von T-Zellen nötig ist (Fu et al. 2013). Grb2 ist wichtig, um THEMIS über LAT zur
immunologischen Synapse zu rekrutieren, wo Themis dann durch Lck and ZAP-70 phosphoryliert
werden kann. Ohne diese Verbindung ist die Entwicklung der Thymozyten beeinträchtigt (Paster
et al. 2013). Die Rekrutierung von CD3ζ, ZAP70 und Grb2 in lipid rafts ist beispielsweise in
Patienten mit einer chronischen Hepatitis- Infektion gestört und trägt wahrscheinlich zu deren
25
Die Rolle von Grb2 in T-Zellen
Einleitung
defekten adaptiven Immunantwort bei. Dies unterstreicht die Wichtigkeit von Grb2 in der TZR
Signalleitung (Barboza et al. 2013). Grb2 ist also ein positiver Faktor für die Signalleitung über
den TZR und ist an der Organisation von lipid rafts/immunologischen Synapsen beteiligt.
26
Die Rolle von Grb2 in T-Zellen
Zielsetzung der Arbeit
5
Zielsetzung der Arbeit
B-Zell spezifische Grb2-/- Tiere haben eine reduzierte Zahl an B-Zellen in der Peripherie
(Ackermann et al. 2011). Es ist allerdings weitgehend unklar, über welchen Mechanismus Grb2
die peripheren B-Zellen beeinflusst. Durch die Untersuchung der Überlebensfähigkeit von BZellen durch in vitro Versuche und die Überexpression des Überlebensfaktors Bcl2 in vivo sollte
die Rolle von Grb2 beim Überleben von B-Zellen in der Peripherie untersucht werden. Als zweite
Möglichkeit wurde untersucht, ob ein Differenzierungsblock für die reduzierten B-Zellzahlen
verantwortlich ist. Dazu wurden in vitro Differenzierungansätze mit transitionalen Grb2-/- BZellen durchgeführt. Außerdem wurde die Aktivierbarkeit von Grb2-/- transitionalen Typ 1,
transitionalen Typ 2 und reifen B-Zellen anhand der Calciummobilisierung untersucht, um
herauszufinden, ob Grb2 die Differenzierung über die BZR Signalleitung beeinflusst. Zudem
wurde der Einfluss von Grb2 auf die Expression von Genen untersucht, die in der Entwicklung
von transitionalen Zellen zu reifen B-Zellen wichtig sind.
Neben der B-Zell Entwicklung spielt Grb2 auch in der sekundären Immunantwort und der
Keimzentrumsreaktion eine wichtige Rolle (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011). Es wurde
beschrieben, dass Grb2 in vitro direkt an eine immunoglobulin tail tyrosine (ITT) genannte
Bindestelle im IgG- und IgE-BZR binden kann und so das BZR Signal verstärkt (Engels et al.
2009). Um den intrinsischen Effekt von Grb2 auf die Gedächtnis B-Zellen zu untersuchen,
wurden Transferexperiemente mit angeglichenen Zahlen von antigen-spezifischen Grb2-/Gedächtnis B-Zellen und Kontroll-Gedächtniszellen durchgeführt. Zudem wurden Grb2fl/fl
(Ackermann et al. 2011) mit cγ1cre Mäusen (Casola et al. 2006) verpaart, um Tieren zu
generieren, in denen Grb2 erst in der Keimzentrumsreaktion deletiert wird. Diese Tiere
ermöglichten es, die Rolle von Grb2 in Gedächtnis B-Zellen unabhängig von seiner Funktion in
der B-Zell Entwicklung zu untersuchen. Die Restimulation spezifischer Grb2-/- Gedächtnis BZellen in vivo erfolgte zum einen mit einem Antigen, das die spezifisch übertragenen
Gedächtniszellen B-Zell-unabhängig reaktivieren kann, um den intrinsischen Effekt von Grb2 in
Gedächtnis-B-Zellen zu untersuchen (Hebeis et al. 2004). Zum anderen wurden NP-spezifische
Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen mit NP-CGG und der Unterstützung von T-Helferzellen restimuliert,
um zu analysieren, wie Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen auf T-Zell Hilfe reagieren.
T-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse (Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse) weisen eine beeinträchtigte positive
und negative Selektion auf, wenn Grb2 früh in der Entwicklung deletiert wird (Jang et al. 2010).
Durch die Kreuzung von Grb2fl/fl (Ackermann et al. 2011) mit CD4cretg Mäusen wurden Tiere
generiert, in denen Grb2 erst später in CD4+CD8+ Zellen deletiert wird. Der Effekt einer frühen
oder einer späteren Deletion von Grb2 während der T-Zell Entwicklung sollte anhand der Grb2fl/fl
Lckcretg und der Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse vergleichend untersucht werden.
27
Die Rolle von Grb2 in T-Zellen
Zielsetzung der Arbeit
Aufgrund der Beteiligung von Grb2 an einer Vielzahl von Signalwegen (Jang et al. 2010; Gong et
al. 2001) ist es wahrscheinlich, dass Grb2 auch die Entwicklung von T-Effektorzellen in der
Peripherie beeinflusst. Daher wurde der Einfluss von Grb2 auf die T-Helferzell Differenzierung
und Funktion in vitro und in vivo untersucht. Außerdem wurde der Effekt von Grb2 auf die THelferzellen im experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Modell, das stark von THelferzellen abhängig ist analysiert (Rangachari & Kuchroo 2013).
28
Die Rolle von Grb2 in T-Zellen
Ergebnisse
6
Ergebnisse
6.1 B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
6.1.1
Kein Einfluss von Grb2 auf die in vitro Überlebensrate von B-Zellen
6.1.1.1
Die Überlebensrate von B-Zellen in vitro mit oder ohne BAFF Zugabe wird nicht
durch Grb2 beeinflusst
Grb2
fl/fl
mb1cre/+ Mäuse weisen eine um die Hälfte reduzierte B-Zellanzahl in der Peripherie auf.
Diese Reduktion beginnt bei den transitionalen B-Zell Entwicklungsstadien (Ackermann et al.
2011; Jang et al. 2011). Außerdem ist die spontane Apoptose von reifen Grb2 defizienten BZellen in vitro leicht erhöht und könnte für die geringere B-Zell Zahl in den Grb2fl/fl mb1cre/+
Mäusen verantwortlich sein. Zusätzlich die BAFF-Rezeptor (BAFFR) Expression reifer Grb2
defizienter B-Zellen verringert, die für ihr Überleben wichtig ist (Ackermann et al. 2011). Um zu
überprüfen, ob Grb2 einen Einfluss auf das BAFF-abhängige Überleben hat, wurden unreife und
reife Grb2-/- B-Zellen und Zellen von Kontrolltieren in vitro mit verschiedenen Konzentrationen
des Zytokins BAFF (Blys) behandelt und die Zahl an vitalen Zellen (Propidiumiodid-negativ) zu
verschiedenen Zeitpunkten bestimmt (Abb. 5). Höhere BAFF-Konzentrationen führten generell
zum besseren Überleben der B-Zellen aus der Milz. Unabhängig von der Behandlung mit BAFF
war das Überleben von unreifen und reifen Grb2-/- B-Zellen vergleichbar mit dem der Kontrollen.
Die reduzierte BAFFR Expression von reifen Grb2-/- B-Zellen hatte dagegen unabhängig von der
BAFF Konzentration keinen Effekt auf die Apoptose der Zellen (Abb. 5). Zudem reicht die vorher
beschriebene leicht erhöhte spontane Apoptoserate in Grb2-/- B-Zellen nicht aus, um die Zahl der
lebenden Zellen im Versuch substantiell zu beeinflussen.
29
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
d0
B
d4
FL-3
Side scatter
Beads
5 ng/ml BAFF
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0
1
2
+
3high
immature (B220 HSA
time(d)
1.75
)
4
50 ng/ml BAFF
1.50 fl/fl
Grb2
+/+
mb1
1.25
Grb2fl/flmb1cre/+
1.00
Grb2fl/flmb1+/+ + BAFF
fl/fl
Grb2
0.75
mb1cre/+ + BAFF
0.50
0.25
0.00
0
1
2
3
immature time(d)
(B220+ HSAhigh )
1.75
4
440 ng/ml BAFF
1.50
Grb2fl/fl mb1+/+
1.25
Grb2fl/fl mb1cre/+
fl/fl
Grb2
1.00
fl/fl
Grb2
0.75
mb1+/+ BAFF
mb1cre/+ BAFF
0.50
0.25
0.00
0
1
2
3
time(d)
d3
1.75
5 ng/ml BAFF
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0
1
2 +
3
mature
(B220
HSAlow
)
1.75
50 ng/ml BAFF
1.50
Grb2fl/flmb1+/+
Grb2 mb1cre/+
1.00 fl/fl
Grb2 mb1+/+ + BAFF
0.75
Grb2fl/fl mb1cre/+ + BAFF
1.25 fl/fl
0.50
0.25
0.00
0
1.75
1
2
3
4
+
low
mature (B220
time(d)HSA )
440 ng/ml BAFF
1.50
Grb2fl/flmb1+/+
1.25
Grb2fl/flmb1cre/+
1.00
Grb2fl/flmb1+/+ + BAFF
Grb2fl/fl mb1cre/+ + BAFF
0.75
0.50
0.25
0.00
0
1
2
3
4
time(d)
n=6
d2
d4
*
4
time(d)
fl/fl
*
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+ BAFF
Grb2fl/fl mb1cre/+ BAFF
4
mature (B220high HSAlow)
Grb2 mb1
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+ BAFF
Grb2fl/fl mb1cre/+ BAFF
30
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
d3
d4
+/+
*
**
**
***
***
**
***
)
*
HSA
B220
D
relative number of viable cells relative number of viable cells
1.75
high
relative number of living cells
relative number of viable cells relative number of viable cells
relative number of viable cells
immature (B220
low
**
Propidium iodide
C
n=6
Ergebnisse
Abb. 5: Grb2 defiziente primäre B-Zellen reagieren weiter auf eine Zytokinbehandlung mit BAFF. Ihre
Überlebensrate ist vergleichbar mit der von primären B-Zellen aus Kontrollmäusen. Unreife (B220+ HSAhigh) und
reife B-Zellen (B220+ HSAlow) wurden aus Gesamtmilzzellen durchflusszytometrisch sortiert. Danach erfolgte eine
Inkubation zu den angegeben Zeitpunkte mit 5 ng/ml, 50 ng/ml oder 440 ng/ml BAFF oder ohne einen zusätzlichen
Stimulus. Anschließend wurde die Zahl der lebenden Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. A) Propidiumiodid
negative Zellen wurden als lebend definiert und B) TrueCount-Beads (BD) wurden verwendet, um die Zellzahlen zu
berechnen. C) Relative Zahl unreifer B-Zellen. D) Relative Zahl reifer B-Zellen. Für 5 ng/ml und 50 ng/ml BAFF
Grb2fl/fl mb1+/+ n=3; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=3; Grb2fl/fl mb1+/+ + BAFF n=3; Grb2fl/fl mb1+/+ + BAFF n=3. Für 440 ng/ml
BAFF Grb2fl/fl mb1+/+ n=6; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=6; Grb2fl/fl mb1+/+ + BAFF n=6; Grb2fl/fl mb1+/+ + BAFF n=6. Für die
Statistik wurde der T-Test verwendet.
6.1.1.2
Die Überlebensrate von B-Zellen mit oder ohne Bcl2 Überexpression wird nicht
signifikant durch Grb2 beeinflusst
Neben dem BAFF Signalweg könnten für das Überleben der B-Zellen andere Mechanismen
wichtig sein. Deswegen wurde mit dem anti-apoptotischen humanen Bcl2-Protein (B-cell
lymphoma 2), welches in Grb2-/- B-Zellen überexprimiert wurde, überprüft, ob eine längere
Überlebensrate der B-Zellen die reduzierten B-Zellzahlen ausgleichen kann. Die Überexpression
von Bcl2 führte generell zu verlängertem Überleben von Grb2-/- und wildtyp B Zellen (Abb. 6).
Die spontane in vitro Apoptoserate reifer Grb2-/- B-Zellen ohne Bcl2 Überexpression war
gegenüber reifen wildtyp B-Zellen nach einem Tag um etwa 5 % erhöht. In reifen Bcl2
überexprimierenden Grb2-/- B-Zellen war die spontane Apoptoserate ebenfalls um 7-10 % erhöht
allerdings erst nach 3 bzw. 4 Tagen. Unreife Grb2-/- B-Zellen, die Bcl2 überexprimieren zeigten
ebenfalls eine um etwa 3 % erhöhte Apoptoserate an denselben Tagen (Abb. 6C und D). Diese
zeitlich begrenzten, limitierten Veränderungen haben aber keinen Einfluss auf die Zahl der
lebenden Grb2-/- B-Zellen mit oder ohne Bcl2 Überexpression (Abb. 5; Abb. 6E). Daher folgern
wir, dass die Überlebensrate der B-Zellen durch Grb2 nicht stark beeinflusst wird.
31
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
CD24 (HSA)
FSC area
A
Single
cells
immature B cells
mature B cells
FSC-weight
B
B220
d0
d8
d3
count
G1
SubG1 S/G2/M
DAPI-area
2
75
50
25
*
*
3
4
1
0
0
0
0
1
2
5
6
7
8
100
75
50
25
1
0
2
3
4
5
n6
2
1
2
3
2
3
4
4
5
6
7
5
6
n=3
7
8
n6
*
1
8
Grb2fl/fl mb1+/+ fl/fl
+/+
Grb2
fl/fl
cre/+ mb1
Grb2 mb1 fl/fl
cre/+
Grb2
mb1
fl/fl
+/+
tg
Grb2 mb1 fl/fl
Bcl2
Grb2 mb1+/+ hBcl2tg
Grb2 fl/fl mb1 cre/+ Bcl2tg
Grb2 fl/fl mb1 cre/+ hBcl2tg
statistics: two way ANOVA
0
7
time(d)
0
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+ hBcl2tg
Grb2 fl/fl mb1 cre/+ hBcl2tg statistics: two way ANOVA
0
6
time(d)
Zälkammer
1
*
**
*
*
time(d)
E
Trypan blue negative
Cell Count (x105)
mature (B220high HSAlow)
% cells in sub-G1 phase
immature (B220low HSAhigh )
100
Zälkammer
D
Trypan blue negative
Cell Count (x105)
% cells in sub-G1 phase
C
8
time(d)
n=3
32
+/+
spezifische Grb2 Knockoutmaus
Grb2fl/fl mb1B-Zell
fl/fl
cre/+
Grb2 mb1
Grb2fl/fl mb1+/+ hBcl2tg
Ergebnisse
Abb. 6: Vergleichbare spontane Apoptose- und Überlebensrate nach Überexpression von humanem Bcl2 in
Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen und Kontrollzellen in vitro. Durch eine komplementvermittelte T-Zelllyse wurden BZellen aus der Milz angereichert und anschließend für die angegebenen Zeiten inkubiert (37 °C, 5 % CO 2). A) Die
Zellen wurden extrazellulär auf B220 und HSA (CD24) gefärbt und mit 2% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Am letzten
Tag wurden die Zellen permeabilisiert und mit DAPI intrazellulär gefärbt, um den DNA-Gehalt der Zellen zu
bestimmen. B) Der Prozentsatz an Zellen im sub-G1 Gate wurde durchflusszytometrisch bestimmt. C) Prozentsatz der
unreifen B-Zellen (B220low HSAhigh) im sub-G1 Gate. D) Prozentsatz der reifen B-Zellen (B220high HSAlow) im sub-G1
Gate. E) Die Zahl der Trypanblau-negativen Zellen wurden nach verschiedenen Inkubationszeiten mit einer Neubauer
Zählkammer bestimmt. Für C) und D): Grb2fl/fl mb1+/+ n=6; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=7; Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg n=8; Grb2fl/fl
mb1cre/+ Bcl2tg n=7. Für E) Zellen von 3 Mäusen pro Gruppe. Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05;
**p<0,01.
6.1.2
6.1.2.1
Grb2 spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung von unreifen zu reifen B-Zellen
Die Überexpression von humanem Bcl2 kann den Block in der B-Zell Entwicklung
von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen nicht ausgleichen
Zusätzlich zu den in vitro Apoptoseversuchen wurde der Einfluss von überexprimiertem
humanem Bcl2 auf B-Zell Populationen mit und ohne Grb2 in vivo untersucht. Die Anzahl der
gesamten B-Zellen war in Mäusen, die Bcl2 überexprimierten stark erhöht. Allerdings zeigten die
reifen, T1- und T2- B-Zell Populationen in Bcl2 überexprimierenden B-Zell spezifischen Grb2-/Mäusen gegenüber Bcl2 überexprimierenden Kontrolltieren im Verhältnis die gleiche Reduktion,
wie ohne Bcl2 Überexpression (Abb. 8; Tab. 1). Abgesehen von den höheren Gesamtzellzahlen
war die Zahl an Bcl2 überexprimierenden pro/pre Grb2-/- B-Zellen im Knochenmark unverändert
(Abb. 7; Tab. 1), während die Zahl der unreifen und reifen B-Zellen in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen
mit und ohne Bcl2 Überexpression reduziert war (Abb. 7; Tab. 1). Auch in der Milz waren die
unreifen und reifen B-Zellen von Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg Mäusen gegenüber Bcl2
überexprimierenden Kontrolltieren etwa im selben Verhältnis reduziert, wie in Tieren ohne Bcl2
Überexpression (Abb. 8; Tab. 1). Die Überexpression von humanem Bcl2 hatte keinen Einfluss
auf die Zahl der B1-Zellen im Peritoneum und konnte somit auch die signifikant reduzierte B1Zellzahl im Peritoneum von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren
nicht kompensieren (Abb. 9). Die humane Bcl2 Überexpression in vivo zeigte in Kombination mit
den in vitro Überlebensassays, dass eine erhöhte Apoptoserate keinen Einfluss auf die reduzierte
Zahl der B-Zellen in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen hatte, stattdessen weisen die Ergebnisse
auf eine Blockade in der Entwicklung hin.
33
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
Bone Marrow
B
fl/fl
cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+
immature
2.7%
±0.9
Grb2
mb1
mature
2.5%
±0.6
2.1%
±0.5
1.7%
±0.5
F5 BM IgM IgD B220 FcyR2b ohne Trans u MR
7
pro/pre
6.4%
±0.8
Grb2fl/fl mb1+/+
hBcl2tg
6.4%
±1.7
Grb2fl/fl mb1cre/+
hBcl2tg
5.2%
±1.3
5.8%
±1.2
*
*
6
Total cells (x106)
IgM
5.5%
±1.1
5
4
3
*
2
**
1
3.1%
±0.7
lls
ce
B
ce
e
B
m
at
ur
e
at
ur
m
7.4%
±1.1
im
6.8%
±1.1
pr
o/p
re
-B
ce
lls
lls
0
B220
Abb. 7: Eine Überexpression des anti-apoptotisch wirkenden humanen Bcl2 Genes in der B-Zell Entwicklung
kann den Verlust von Grb2 in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen nicht kompensieren. Das humane Bcl2 befindet sich im
Lokus für die µ-schwere Kette und wird so in B-Zellen überexprimiert. A) Für Knochenmarkszellen wurde der Anteil
pro/pre B-Zellen (B220+ IgM-), unreifen B-Zellen (B220low IgM+) und reifen B-Zellen (B220high IgM+)
durchflusszytometrisch bestimmt. B) Gesamtzellzahl für Populationen aus A). Grb2fl/fl mb1+/+ n=7 Mäuse; Grb2fl/fl
mb1cre/+ n=9 Mäuse; Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg n=8 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg n=5 Mäuse; Für die Statistik wurde der
T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01.
34
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Spleen
B
A
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
23.5%±4.8
31.7%±4.1
T cells
F1 SP B220 CD5
B1
3.6%±1.5
8.5%±1.6
300
Grb2fl/fl mb1cre/+
hBcl2tg
14.2%±1.2
12.4%±3.2
**
3.6%±0.7
*
0
**
45.5%
±4.9
ce
2
B
51.5%
±6.8
B
1
ce
lls
1.4%±0.3
100
ce
lls
CD5
Grb2fl/fl mb1+/+
hBcl2tg
200
T
20.8%
±3.7
lls
B2
40.6%
±6.8
Total cells (x106)
*
B220
D
C
B220+
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+
T2/MZ
3.7%±1.4
4.2%±1.5
F4 SP CD21 IgM B220 FcyR2b
Mature
13.4%±2.7
1.5%±1.2
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
hBcl2tg
hBcl2tg
1.4%±0.5
50
**
**
26%±2.7
5%±2.8
12.8%±3.2
IgM
*
0
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl
at
ur
e
31.1%±3.1
***
M
1.1%±0.4
100
T1
CD21
T1
T2
-M
Z
5.1%±1.2
*
150
Total cells (x106)
27.2%±4.4
mb1+/+
mb1cre/+
mb1+/+ hBcl2tg
mb1cre/+ hBcl2tg
35
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 8: Eine Überexpression des anti-apoptotisch wirkenden humanen Bcl2 Genes in der Peripherie kann den
Verlust von Grb2 in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen nicht kompensieren. Das humane Bcl2 befindet sich im Lokus für die
µ-schwere Kette und wird so in B-Zellen überexprimiert. A) Der Anteil von B1 B-Zellen (B220+ CD5+), B2 B-Zellen
(B220+ CD5-) und T-Zellen (B220- CD5+) in der Milz wurde durchflusszytometrisch bestimmt. B) Gesamtzellzahl für
Populationen aus A). C) Anteil von reifen B-Zellen (B220+ CD21med IgMmed), Transitionalen Typ 1 B-Zellen (B220+
CD21low IgMhigh) und Transitionalen Typ2 B-Zellen/Marginalzonen B-Zellen (B220+ CD21low IgMhigh) in der Milz. D)
Gesamtzellzahl für Populationen aus C). Grb2fl/fl mb1+/+ n=7 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=9 Mäuse; Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg
n=10 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg n=6 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001.
36
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Peritoneal Cavity
B
A
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+
4%±1.9
3.9%±2
B1
20.7%±6.4
F7 PC CD5 B220 FcyR2b
11.8%±4
T cells
2.5
CD5
16%
±6.6
Grb2fl/fl mb1+/+
hBcl2tg
Grb2fl/fl mb1cre/+
hBcl2tg
2.2%±0.8
2.9%±0.9
14.8%±4
7%±1.5
Total cells (x106)
B2
9.6%
±5.5
2.0
1.5
*
*
1.0
0.5
ce
lls
lls
T
ce
2
B
1
28.4%
±5.8
B
25.6%
±8.1
ce
lls
0.0
B220
C
CD19+
D
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+
B1a
12.6%±2.2
10.1%±2.8
F8 PC CD43 CD19 CD5 FcyR2b
7.5%
±4.1
0.9%
±0.4
7.8%
±2.8
4.1%
±4
Grb2fl/fl mb1+/+
hBcl2tg
Grb2fl/fl mb1cre/+
hBcl2tg
9.1%±2.1
4.9%±0.8
Total cells (x106)
B1b
1.5
1.0
*
*
0.5
p=0.05
*
B
2
ce
lls
ce
lls
3.3%
±1.2
1b
18.1%
±5
B
1.3%
±0.6
1a
20.7%
±6.1
ce
lls
0.0
B
CD5
2.0
B2
CD43
37
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 9: Geringere Zahl an B1a B-Zellen im Peritoneum von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen. Eine Überexpression des
anti-apoptotisch wirkenden humanen Bcl2 Genes in Zellen des Peritoneums hat keinen Einfluss auf die Zahl der
B1 B-Zellen. Das humane Bcl2 befindet sich im Lokus für die µ-schwere Kette und wird so in B-Zellen überexprimiert.
A) Der Anteil von B1 B-Zellen (B220+ CD5+), B2 B-Zellen (B220+ CD5-) und T-Zellen (B220- CD5+) im Peritoneum
wurde durchflusszytometrisch bestimmt. B) Gesamtzellzahl für Populationen aus A). C) Anteil von B1a B-Zellen
(CD19+ CD5+ CD43+), B1b B-Zellen (CD19+ CD5- CD43+) und B2 B-Zellen (CD19+ CD5- CD43-). D) Gesamtzellzahl
für Populationen aus C). Grb2fl/fl mb1+/+ n=5 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=8 Mäuse; Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg n=10 Mäuse;
Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg n=6 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05.
38
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Bone Marrow (x106)
proB/preB (B220+ IgM-)
Immature B (B220med IgM+)
Mature B (B220high IgM+)
Mature recirculating (B220+ IgDhigh)
Grb2fl/fl
mb1+/+
Grb2fl/fl
mb1cre/+
Grb2fl/flmb1+/+
Bcl2tg
Grb2fl/flmb1cre/+
Bcl2tg
2.2 ± 1.2
1.1 ± 0.6*
0.9 ± 0.5**
0.5 ± 0.2**
1.7 ± 0.6
0.6 ± 0.2
0.5 ± 0.2
0.2 ± 0.1
4.6 ± 2.2
4.3 ± 2.1*
3.8 ± 1.9*
4.0 ± 1.8*
4.0 ± 1.4
3.0 ± 1.4
1.7 ± 0.8
2.0 ± 0.6
3.3 ± 1.7*
37.4 ± 13.3**
21.2 ± 5.5
6.3 ± 1.8
1.2 ± 0.6*
4.2 ± 3.1**
4.6 ± 1.7**
3.6 ± 0.8*
25.6 ± 10.9**
5.8 ± 2.3
14.2 ± 5.2
21.4 ± 7.3
4.4 ± 2.5
0.5 ± 0.3
1.9 ± 0.8
0.9 ± 0.7
2.4 ± 1.2
8.9 ± 2.8
4.6 ± 1.8**
178.3 ± 82.3*
42.1 ± 16.4
20.0 ± 12.0
10.8 ± 6.4**
26.7 ± 9.8***
43.6 ± 19.3***
3.6 ± 1.4
106.0 ± 42.2*
7.9 ± 2.5
99.4 ± 25.4
31.0 ± 6.7
11.3 ± 6.6
2.8 ± 2.0
10.1 ± 2.9
10.1 ± 5.3
2.9 ± 1.1
56.5 ± 12.1
0.8 ± 0.6*
0.3 ± 0.2
0.2 ± 0.1
0.4 ± 0.2*
0.03 ± 0.01*
0.2 ± 0.1
0.2 ± 0.2
0.2 ± 0.1
0.1 ± 0.0
0.2 ± 0.1
0.05 ± 0.03
0.1 ± 0.1
0.7 ± 0.4*
1.3 ± 0.9
0.1 ± 0.1
0.4 ± 0.2*
0.05 ± 0.02
1.0 ± 0.7
0.3 ± 0.2
1.3 ± 1.0
0.1 ± 0.1
0.2 ± 0.1
0.14 ± 0.12
0.8 ± 0.7
Spleen (x106)
B1 (B220+ CD5+)
B2 (B220+ CD5-)
T cells (B220- CD5+)
T1-MZ (B220+ IgM+ IgDlow)
T2 (B220+ IgMhigh IgDhigh)
Mature B (B220+ IgMlow IgDhigh)
T1 (B220+ CD21low IgMhigh)
T2-MZ (B220+ CD21high IgMhigh)
Mature B (B220+ CD21med IgMmed)
Peritoneal Cavity (x106)
B1 (B220+ CD5+)
B2 (B220+ CD5-)
T cells (B220- CD5+)
B1a (CD19+ CD5+ CD43+)
B1b (CD19+ CD5- CD43+)
B2 (CD19+ CD5- CD43-)
Tab. 1: Absolute Zellzahlen für verschiedene Lymphozytenpopulationen von Grb2 fl/fl mb1+/+, Grb2fl/fl mb1cre/+,
Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg und Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg Mäusen. Verglichen wurden Grb2fl/flmb1cre/+ gegen Grb2fl/flmb1+/+
Mäuse und Grb2fl/flmb1cre/+ Bcl2tg gegen Grb2fl/flmb1+/+ Bcl2tg Mäuse. Grb2fl/flmb1+/+ n=5-7 Mäuse; Grb2fl/flmb1cre/+
n=8-9 Mäuse; Grb2fl/flmb1+/+ Bcl2tg n=8-10 Mäuse; Grb2fl/flmb1cre/+ Bcl2tg n=5-6 Mäuse; Für die Statistik wurde der TTest verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
39
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
6.1.2.2
Reduzierte Zahl transitionaler und reifer B-Zellen im Blut
Zu der reduzierten Zahl an transitionalen B-Zellen in der Milz von B-Zell spezifischen Grb2-/Mäusen könnte auch ein beeinträchtigter Übergang der B-Zellen vom Knochenmark in die Milz
beitragen. Bei einem Defekt der Zellen in die Milz einzuwandern würden sich die transitionalen
B-Zellen im Blut ansammeln. Da die Zahl von T1 B-Zellen von spezifischen Grb2-/- Mäusen im
Blut analog zur Zahl in der Milz um etwa die Hälfte reduziert und die Zahl reifer B-Zellen
ebenfalls reduziert war, weist dieser Versuch nicht auf eine veränderte Wanderung von
transitionalen B-Zellen in die Milz hin. (Abb. 10).
A
B
B220+
Grb2fl/fl mb1+/+
relativ IgM IgD Transitional blood
Mature
***
IgD
T1
Grb2fl/fl mb1cre/+
relative number of
Lymphocytes
0.8
Grb2fl/fl m
Grb2fl/fl m
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
***
0.2
0.1
T1
M
at
ur
e
0.0
IgM
Abb. 10: Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse weisen im Blut eine reduzierte Zahl an Transitionalen und reifen B-Zellen auf.
Die Erythrozyten wurden durch eine tonische Lyse aus den Blutproben depletiert. Die aufgereinigten Zellen wurden auf
die Marker B220, IGM und IgD angefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. B) Der relative Anteil an reifen BZellen (B220+,IgDhigh, IgMmed) und transitionalen Typ 1 B-Zellen (B220+,IgDlow, IgMhigh) wurde bestimmt, wobei die
Zahl der B220- Lymphozyten als Referenzwert diente. Grb2fl/fl mb1+/+ n=9 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=8 Mäuse. Für die
Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
40
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
6.1.2.3
Während der B-Zell Entwicklung wird der BAFF-R in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen
nicht hoch reguliert. Dieser Defekt kann nicht durch die Überexpression von
humanem Bcl2 ausgeglichen werden.
Die BAFF-R Expression wird während der Reifung von unreifen zu reifen B-Zellen
hochreguliert. In Grb2-/- B-Zellen ist dieser Prozess beeinträchtigt und die BAFF-R Expression
bleibt niedrig (Ackermann et al. 2011), was aber in vitro keinen negativen Effekt auf das
Überleben hatte. Um zu untersuchen, ob man einen Effekt der niedrigeren BAFF-R Expression in
B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen in vivo ausschließen kann wurde analysiert, ob die
Überexpression des Überlebensfaktors Bcl2 auch die Expression des BAFF-R in B-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen erhöht und somit den fehlenden Einfluss von Grb2 auf den BAFF-R
ausgleicht. Es wurden aber keine deutlichen Veränderungen in der BAFF-R Expression durch die
Überexpression von humanem Bcl2 festgestellt (Abb. 11), weshalb es anhand der Bcl2
überexprimierenden Mäuse nicht möglich war Rückschlüsse auf mögliche Funktionen der
niedrigeren BAFF-R Expression in vivo zu ziehen.
41
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
immature
mature
% of max
pro/pre
BAFF receptor expression
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+ hBcl2tg
cre/+ hBcl2tg
mb1B220
F6 BMGrb2
IgMfl/flIgD
BAFFR ohne Trans u MR
B
***
BAFF-R expression
(geometric Mean)
12.5
*
10.0
7.5
**
*
5.0
*
2.5
lls
ce
B
ce
m
at
ur
e
B
at
ur
e
m
im
pr
o/p
re
-B
ce
lls
lls
0.0
Abb. 11: Die Expression des BAFF-Rezeptors ist in den unreifen und reifen Grb2-/- B-Zellen reduziert und kann
nicht durch die Überexpression von humanem Bcl2 kompensiert werden. A) Die pro/pre B-Zellen (B220+ IgM-),
die unreifen B-Zellen (B220low IgMmed) und die reifen B-Zellen (B220high IgMmed) aus dem Knochenmark wurden
durchflusszytometrisch auf ihre BAFF-Rezeptor Expression untersucht. Grb2fl/fl mb1+/+ n=7 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+
n=9 Mäuse; Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg n=8 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg n=5 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test
verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
6.1.2.4
Bei der Entwicklung von Transitionalen Typ 2 zu reifen B-Zellen in vitro spielt
Grb2 eine wichtige Rolle
Die reduzierten B-Zellzahlen in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen wurden nicht durch eine erhöhte
Apoptoserate der B-Zellen ausgelöst. Darum wurde analysiert, ob die Reduktion durch einen
Block in der Differenzierung hervorgerufen wird. In einer Veröffentlichung wurde beschrieben,
dass isolierte T2 B-Zellen, die mit anti-IgM stimuliert werden in vitro zu reifen B-Zellen
42
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
differenzieren können, während T1 B-Zellen nicht zu reifen B-Zellen werden, sondern in
Apoptose gehen (Su & Rawlings 2002). Darum haben wir das Reifungspotential von sortierten T1
Grb2-/-
B-Zellen
(B220+
HSAhigh
CD21low)
und
sortierten
T2
Grb2-/-
B-Zellen
(B220+HSAhighCD21highCD23+) (Wie in Abb. 12 gezeigt) mit dem beschriebenen Protokoll
analysiert (Su & Rawlings 2002). Nach 48 h Inkubation war unabhängig von der Stimulation
keine Reifung von T1 Grb2-/- B-Zellen oder den entsprechenden Kontroll-T1 B-Zellen messbar
(Abb. 12A,C). Ein Teil der T2 Zellen war hingegen gereift und erschien im Gate für reife BZellen (Abb. 12B,C). Das Potential von T2 Grb2-/- B-Zellen sich spontan, nach BZR-Stimulation
oder nach BZR-Stimulation und BAFF Zugabe zu reiferen B-Zellen zu entwickeln war drastisch
reduziert (Abb. 13). Nach Stimulation mit dem Mitogen LPS war keine deutliche Reifung zu
erkennen und es war auch kein Unterschied zwischen den Grb2-/- und den Kontrollzellen
detektierbar (Abb. 13). Grb2 fördert also die Differenzierung von transitionalen Typ 2 zu
charakteristisch reiferen B-Zellen durch einen intrinsischen Effekt, da die Reifung in vitro
unabhängig von der Umgebung der Zellen in vivo gemessen wurde.
43
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Mature
CD21
CD21high
(T2/MZ)
Cells
CD21
B220+HSAhighCD21hi
B220+HSAhighCD21hi B220+
B220+
Mature
sorted cells
CD21low
(T1)
CD24 (HSA)
CD21high
(T2)
97%
Cells
pre-Sort
99.2%
CD21low
(T1)
T2
T2
CD24 (HSA)
CD23
CD23
B220+
CD21high
(T2)
95.2%
Mature
CD21high
(T2)
91.6%
CD21low
(T1)
CD21
CD21
Mature
B220+
CD21low
(T1)
CD24 (HSA)
CD24 (HSA)
B
B220+
Abb. 12: Strategie zum
sortieren staining
von T1, T2after
und reifen
B-Zellen.
T-Zellen wurden mit anti-CD90.2
(Thy1)
restained
cells
remaining
48h of
culture
magnetischen Beads depletiert, um B-Zellen aus der Milz anzureichern. Die Zellen wurden dann weiter
durchflusszytometrisch
wurden auf B220, HSA (CD24),
CD21, CD23 gefärbt. Transitionale
Mature
T1 aufgereinigt. A) Die ZellenT2
Mature
CD21
high BTyp 1 B-Zellen (B220+ HSAhigh CD21low), Transitionale Typ 2 B-Zellen (B220+ HSAhigh CD21high CD23+) CD21
oder reife
+
low
int
(T2)
Zellen (B220 HSA CD21 ) wurden sortiert.
Mature
CD21low
(T1)
CD24 (HSA)
Suppl. Fig. X: Sorting strategy for T1, T2 and mature B cells. Splenic B cells magnetically
44
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A T1 B cell maturation
B220+
unstim.
Grb2fl/fl mb1+/+
anti-IgM (Fab2)
anti-IgM (Fab2)
+ BAFF
LPS.
CD21high
(T2/MZ)
Mature
1.41%
0.93%
1.72%
1.55%
1.91%
4.62%
5.17%
CD21
CD21low
(T1)
Grb2fl/fl mb1cre/+
1.3%
CD24 (HSA)
anti-IgM (Fab2)
+ BAFF
anti-IgM (Fab2)
B T2 B cell maturation
B220+
unstim.
LPS.
Grb2fl/fl mb1+/+
CD21high
(T2/MZ)
Mature
9.82%
17.8%
21.2%
11.3%
5.13%
6.82%
19.4%
CD21
CD21low
(T1)
Grb2fl/fl mb1cre/+
2.82%
Test1Mittelwerte alle Exp T1 to T1
CD24 (HSA)
2.5
mature from T2
mature from T1
**
2.0
*
Grb2fl/fl mb1cre+/+
Grb2fl/fl mb1crecre/+
1.5
1.0
0.5
0.0
an
ti- ant
u
i
Ig
M -IgM ns
t
+
(1 im.
B
0µ
A
FF
g
(0 /ml
)
.2
LP µg
/
m
S
l)
(1
µg
/m
an
l)
ti- ant
u
i
Ig
M -IgM ns
t
+
(1 im.
B
0µ
A
FF
g
(0 /ml
)
.2
LP µg
/m
S
l)
(1
µg
/m
l)
mature B cells developed
from T1 or T2 B cells
C
45
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 13: Transitionale Typ 2 B-Zellen von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen weisen in vitro einen Differenzierungsblock
zu reifen naiven B-Zellen auf. A), B) und C) T-Zellen wurden mit anti-CD90.2 (Thy1) magnetischen Beads depletiert,
um B-Zellen aus der Milz anzureichern. Daraus wurden über durchflusszytometrische Zellsortierung die transitionalen
Typ 1 (T1) B-Zellen (B220+ HSAhigh CD21low) und die transitionalen Typ 2 (T2) B-Zellen (B220+ HSAhigh CD21high
CD23+) aufgereinigt. Die Zellen wurden für 48h mit anti-IgM (Fab2) (10 µg/ml), anti-IgM (Fab2) (10 µg/ml) und
BAFF (0.2 µg/ml), LPS (1 µg/ml) oder ohne zusätzliche Stimuli kultiviert (37 °C, 5 % CO2). A) Der Prozentsatz an
reifen B-Zellen, die sich aus sortierten transitionalen Typ1 B-Zellen (A) oder transitionalen Typ 2 B-Zellen (B)
differenzierten wurde durchflusszytometrisch bestimmt (B220+ HSAlow CD21int). C) Quantifizierung von vier
unabhängigen Experimenten. Als Referenz dienten die aus Grb2fl/fl mb1+/+ transitionalen Typ 2 Zellen ohne Stimulation
gereiften B-Zellen. Grb2fl/fl mb1+/+ n=4 Pools von Zellen. Jeder Pool bestand aus Zellen von 3-4 Mäusen; Grb2fl/fl
mb1cre/+ n=4 Pools von Zellen. Jeder Pool bestand aus Zellen von 3-4 Mäusen. Für die Statistik wurde der T-Test
verwendet; *p<0,05; **p<0,01.
6.1.3
6.1.3.1
Die Rolle von Grb2 in der B-Zell Signalleitung transitionaler und reifer B-Zellen
Beeinträchtigung der Genexpression von Genen in Grb2-/- B-Zellen, die
entscheidend für die Differenzierung von unreifen zu reifen B-Zellen sind
Die Differenzierung von transitionalen zu reifen B-Zellen ist von der der Transkription von
Genen abhängig, die nach der Stimulation über den BZR zum Überleben und zur Proliferation
beitragen (Carman et al. 1996; Andrews & Rawlings 2009; Andrews et al. 2012). Typischerweise
werden in reifen B-Zellen nach BZR Stimulation anti-apoptotische Gene, wie Gene der Bcl2Familie oder Gene, die für den Eintritt in den Zellzyklus wichtig sind, hoch reguliert. Um zu
überprüfen, ob die Expression solcher kritischer Gene in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
betroffen ist, wurden sortierte T1, T2 oder reife B-Zellen mit einer quantitativen Realtime PCR
untersucht. Grb2-/- T1 B-Zellen weisen eine reduzierte Expression der Gene für Bcl-xl und A1
(Bcl2a1), zwei Mitglieder der Bcl2-Familie auf (Abb. 14A,B). Die Menge an Bcl-xl war in T1, T2
und reifen B-Zellen auch noch nach BZR Stimulation niedrig. Die Expression des Gens für Bcl2
war hingegen in reiferen Grb2-/- B-Zellen und nach BZR Stimulation kaum mehr verändert. Die
Realtime PCR Analyse ergab außerdem, dass die Expression von Genen, die wichtig für den
Eintritt in den Zellzyklus sind, unterschiedlich von Grb2 beeinflusst werden. Während das Gen
für c-Myc in T2 und reifen B-Zellen nach Stimulation nur schwach exprimiert wurde, wurde das
Gen für Cyclin D2 höher in T2 B-Zellen exprimiert (Abb. 14C,D). Die Expression des
Transkriptionsfaktors Mef2c, der für das Überleben und die Proliferation von transitionalen BZellen wichtig ist, war in T1 und reifen B-Zellen ohne BZR Stimulation niedriger exprimiert
(Abb. 14E). Demnach reguliert Grb2 in B-Zellen mehrere Gene, die für das Überleben und die
Proliferation von transitionalen B-Zellen wichtig sind.
46
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
qRT PCR
B
A
Bcl2l1 (Bcl-xl)
Bcl2a1 (A1)
3
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
**
relative expression
2
1
0
*
1
p=0.07
5.0
2.5
0.0
M
at
ur
e
T2
Ccnd2
2.0
*
Grb2fl/fl mb1+/+
cre/+
Grb2fl/fl
1.5mb1
relative expression
*
10.0
anti-IgM Fab(2)
unstim.
D
Myc
7.5
T1
M
anti-IgM Fab(2)
C
at
ur
e
T2
M
T1
at
ur
e
T2
T1
M
at
ur
e
T2
T1
0
unstim.
Grb
Grb
1.0
0.5
unstim.
at
ur
e
M
T2
T1
at
ur
e
M
M
anti-IgM Fab(2)
unstim.
E
at
ur
e
T2
T1
M
at
ur
e
T2
T1
0.0
T1
relative expression
2
Grb
Grb
T2
relative expression
3
anti-IgM Fab(2)
Mef2c
*
2.0
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
*
1.5
1.0
0.5
unstim.
at
ur
e
M
T2
T1
at
ur
e
M
T2
0.0
T1
relative expression
2.5
anti-IgM Fab(2)
47
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 14: Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen zeigen eine verringerte Expression von Genen, die wichtig für das Überleben
und den Zellzyklus sind. T-Zellen wurden mit anti-CD90.2 (Thy1) magnetischen Beads depletiert, um B-Zellen aus
der Milz anzureichern. Daraus wurden über durchflusszytometrische Zellsortierung Transitionale Typ 2 B-Zellen
(B220+ HSAhigh CD21high CD23+), Transitionale Typ 1 B-Zellen (B220+ HSAhigh CD21low) oder reife B-Zellen (B220+
HSAlow CD21int) isoliert. Die isolierten Zellpopulationen wurden für 3h mit anti-IgM (Fab2) (10 µg/ml) oder ohne
zusätzliche Stimuli kultiviert (37 °C, 5 % CO2). Anschließend wurden die Expressionslevel von Genen mittels
quantitativer PCR bestimmt. Dargestellt sind Expressionslevel von Genen mit Aktin als Kalibrator und stimulierten T1
B-Zellen als Referenz. A) Bcl2l1 (Bcl-xl), B) Bcl2a1, C) Myc, D) Cyclin D2 (Ccnd2), E) Mef2c. Grb2fl/fl mb1+/+ n=3
Pools von Zellen. Jeder Pool bestand aus Zellen von 4-5 Mäusen. Grb2fl/fl mb1cre/+ n=3 Pools von Zellen. Jeder Pool
bestand aus Zellen von 5-7 Mäusen; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01.
6.1.3.2
Grb2 ist ein negativer Regulator des Calciumsignalweges in T2 und reifen B-Zellen
aber die Veränderungen haben keinen Einfluss auf die B-Zell Differenzierung
Das BZR vermittelte Ca2+ Signal löst unterschiedliche Reaktionen in T1 und T2 B-Zellen aus und
ist entscheidend für die Reifung von T2 zu reifen B-Zellen (Hoek et al. 2006; Gross et al. 2009).
B-Zellen der Milz aus B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen zeigen nach BZR Stimulation eine
erhöhte Calciummobilisierung (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011). Um zu testen, ob eine
beeinträchtigte Calciummobilisierung für den Differenzierungsdefekt von Grb2-/- B-Zellen
verantwortlich ist wurde die Calciummobilisierung für die T1, T2 und reifen B-Zellen einzeln
bestimmt. Nach der BZR-Stimulation von Grb2-/- B-Zellen war die Stärke des Calciumsignals in
T1 B-Zellen unverändert aber es war in T2 und reifen Grb2-/- B-Zellen erhöht (Abb. 15). In der
Abbildung ist auch die inhibitorische Rolle des FcγR2b in Grb2-/- B-Zellen dargestellt, die separat
beschrieben ist (6.1.4.1). Dies weist darauf hin, dass Grb2 in verschiedenen Entwicklungsstadien
unterschiedliche Funktionen in der Regulation des Calciumsignales hat. Dieses Ergebnis zeigt,
dass es keinen Defekt in der Calciummobilisierung von Grb2-/- T2 B-Zellen gibt, der die
beeinträchtigte Differenzierung zu reifen B-Zellen erklären kann.
48
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
Loading control
Intensity of stimulation
Goat IgG-F(ab)2
α-mouse-IgM:
3 µg
6 µg
10 µg
Goat IgG
α-mouse-IgM:
4.5 µg
9 µg
15 µg
0.05 µg Ionomycin
70000
60000
50000
40000
30000
0
50
100
150
200
90000
Ca
80000
70000
60000
50000
40000
30000
0
50
100
50000
40000
30000
0
50
100
150
200
Ca
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl
130000
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl
mb1+/+ -IgM Fab2
mb1+/+ -IgM
mb cre/+ -IgM Fab2
mb cre/+ -IgM
80000
30000
0
50
100
150
200
time(s)
time(s)
40000
30000
150
200
50000
40000
30000
0
50
100
time(s)
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
0
50
100
150
200
70000
60000
50000
40000
30000
100
100000
Ca
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2
-IgM Fab2
mb
70000
Legend
60000
50000
40000
30000
0
50
100
150
200
80000
70000
60000
50000
40000
30000
100
time(s)
200
100000
150
150
100000
Ca
-IgM Fab2
60000
50000
40000
30000
50
100
200
100000
Ca
150
200
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
-IgM Fab2
70000
Legend
60000
50000
40000
30000
0
50
100
60000
30000
0
50
100
150
150
Ca
Ca2+
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2 mb1+/+ -IgM
80000fl/fl
Grb2 mb cre/+ -IgM Fab2
70000
Legend
60000
50000
40000
30000
0
50
100
100000
150
200
stimulation
2+
210000
Ca
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2 mb1+/+ -IgM
150000
Grb2fl/fl mb cre/+ -IgM Fab2
Legend
180000 fl/fl
120000
90000
60000
30000
0
50
100
2
mb1+/+ -IgM
mb cre/+ -IgM Fab2
mb cre/+ -IgM
60000
50000
40000
30000
50
100
200
100000
Ca
150
200
210000
stimulation
2+
Ca
mb1+/+ -IgM Fab
Grb2fl/fl
Grb2
150000
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl
120000
180000 fl/fl
2
mb1+/+ -IgM
mb cre/+ -IgM Fab2
mb cre/+ -IgM
90000
60000
30000
0
50
100
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2 mb1+/+ -IgM
80000fl/fl
Grb2 mb cre/+ -IgM Fab2
70000
Legend
60000
50000
40000
30000
50
100
time(s)
150
200
stimulation
2+
210000
Ca
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2 mb1+/+ -IgM
150000
Grb2fl/fl mb cre/+ -IgM Fab2
Legend
180000 fl/fl
120000
90000
60000
30000
0
50
100
150
time(s)
49
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
200
Ca2+
90000fl/fl
0
150
time(s)
stimulation
2+
time(s)
200
Ca2+
stimulation
2+
0
150
time(s)
Ca
mb1+/+ -IgM Fab
Grb2fl/fl
Grb2
80000fl/fl
Grb2
70000
Grb2fl/fl
90000fl/fl
200
time(s)
Ca2+
stimulation
2+
mb
90000
time(s)
90000 fl/fl
Grb2 mb1+/+ -IgM
80000 fl/fl
cre/+
Grb2
120000
Ca2+
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
0
Ca
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2 mb1+/+ -IgM
150000
Grb2fl/fl mb cre/+ -IgM Fab2
Legend
180000 fl/fl
time(s)
90000 fl/fl
Grb2 mb1+/+ -IgM
80000 fl/fl
cre/+
Grb2 mb
70000
Legend
200
90000fl/fl
Ca2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
stimulation
2+
50
100
stimulation
2+
time(s)
90000
0
150
stimulation
2+
Marginal zone B cells
2+
Cahigh
(B220+ HSAhigh CD21
CD23-)
Ca
50
210000
Ca2+
90000 fl/fl
Grb2 mb1+/+ -IgM
80000 fl/fl
cre/+
time(s)
100000
0
Ca2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
80000
50
30000
Ca2+
stimulation
2+
90000
0
40000
time(s)
Mature B cells
2+
(B220+ HSAlow CD21Caint)
Ca
50000
stimulation
2+
time(s)
stimulation
2+
time(s)
100000
200
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca
stimulation
2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Transitional Type 2 B cells
2+
(B220+ HSAhigh CD21Cahigh CD23+)
100000
150
60000
time(s)
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
100
-IgM Fab2
mb
60000
Ca
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2 mb1+/+ -IgM
80000fl/fl
Grb2 mb cre/+ -IgM Fab2
70000
Legend
90000fl/fl
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
50000
Grb2
70000
Legend
100000
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
60000
Ca
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
90000 fl/fl
Grb2 mb1+/+ -IgM
80000 fl/fl
cre/+
Ca2+
stimulation
2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
70000
100000
Ca2+
stimulation
2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
80000
50
18 µg
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
90000
0
13.5 µg
Ca2+
stimulation
2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca
12 µg
0.1 µg Ionomycin
9 µg
Transitional Type 1 B cells
2+
(B220+ HSAhigh CD21Calow)
100000
9 µg
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Rabbit IgG
α-mouse-IgM:
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
mb1 -IgM
mb cre/+ -IgM Fab2
mb cre/+ -IgM
180000
Grb2fl/fl mb cre/+ -IgM Fab2
Legend
Rabbit IgG-F(ab)2 6 µg
α-mouse-IgM:
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
2
+/+
stimulation
2+
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM Fab2
Grb2fl/fl mb1+/+ -IgM
B
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
200
Camb1+/+ -IgM Fab
Grb2fl/fl
Grb2
70000
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl
60000
80000 fl/fl
time(s)
time(s)
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
150
90000
stimulation
2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca
80000
stimulation
2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
90000
Ca2+
Ca2+
Ca2+
stimulation
2+
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
mostly unstained B cells
Ca2+
CD5- MAC1-
200
Ergebnisse
Abb. 15: Höheres Ca2+ Signal nach B-Zell Rezeptor Stimulation ab den transitionalen B-Zell
Entwicklungsstadien und funktionelle Ca2+ Inhibition über den FcγR2b in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen. 107 mit
Indo-1 beladene Milzzellen, die extrazellulär auf A) Mac1 und CD5 oder B) B220 (RA3-6B2), HSA (M1/69), CD21
(E79) und CD23 (B3B4) gefärbt waren wurden auf die Ca2+ Mobilisierung nach Stimulation untersucht. Stimuliert
wurde mit equimolaren Konzentrationen von anti-IgM oder anti-IgM (Fab2). Der inhibitorische Effekt des FcγR2b auf
das Ca2+ Signal kann gemessen werden, in dem er über den IgG Fc-Teil des anti-IgM Antikörpers an den B-Zell
Rezeptor rekrutiert wird. Dies geschieht nicht, wenn mit anti-IgM (Fab2) stimuliert wird. Für A): Grb2 fl/fl mb1+/+ n=4
Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=4 Mäuse; Für B): Grb2fl/fl mb1+/+ n=3 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=3 Mäuse.
6.1.4
6.1.4.1
Einfluss von Grb2 auf die FcγR2b Expression
Grb2 hat keinen Einfluss auf die inhibitorische Funktion des FcγR2b in primären
B-Zellen
Grb2 ist ein negativer Regulator des Calciumsignalweges in Zelllinien und primären B-Zellen
nach BZR-Stimulation (Stork et al. 2004; Stork et al. 2007; Ackermann et al. 2011; Jang et al.
2011; Neumann et al. 2011). Zusätzlich verstärkt Grb2 die inhibitorische Wirkung des FcγR2b in
der reifen B-Zelllinie Bal17.TR (Neumann et al. 2011). Es sollte untersucht werden, ob Grb2 die
inhibitorische Wirkung des FcγR2b auch in primären B-Zellen erhöht. Dazu wurden primäre BZellen entweder mit anti-IgM (Fab2) oder mit einem kompletten IgG anti-IgM Antikörper in
equimolaren Konzentrationen stimuliert. Der IgG Fc-Teil des anti-IgM Antikörpers ist in der
Lage den FcγR2b zum BZR zu rekrutieren, wo er inhibitorisch auf die BZR Signalleitung wirken
kann. Um auszuschließen, dass Fc-Teile von Färbeantikörpern mit FcγR2b interagieren und so
den Versuch beeinflussen wurden Milzzellen auf die Expression von CD5 und Mac1 gefärbt und
das Calciumsignal für die CD5-Mac1- ungefärbten Milzzellen wurde bestimmt. Der verwendete
Ziege IgG anti-IgM Antikörper rekrutiert den FcγR2b zum BZR und die inhibitorische Wirkung
des FcγR2b auf die CD5-Mac1- Milzzellen in Grb2-/- B-Zellen und Kontrollzellen war deutlich
messbar (Abb. 15A). Die Stärke der Inhibition war aber schwer zu vergleichen, da die Grb2-/- BZellen ein höheres Calciumsignal aufwiesen (Abb. 15A). Anschließend wurde die inhibitorische
Wirkung des FcγR2b auf B-Zell Subpopulationen untersucht. Dazu wurden die Zellen direkt
gefärbt. Für die Stimulation wurde statt des Ziege IgG anti-IgM Antikörpers ein Kaninchen IgG
anti-IgM Antikörper verwendet, mit dem eine stärkere Inhibition über den FcγR2b erzielt wurde.
Auch in den direkt gefärbten Zellen war eine Inhibition über den FcγR2b messbar, die sowohl in
T1, T2 als auch in reifen B-Zellen mit und ohne Grb2 deutlich detektierbar war (Abb. 15B).
Allerdings ist die Stärke der Reduktion durch den FcγR2b in T2 und reifen B-Zellen mit und ohne
Grb2 aufgrund des grundsätzlich unterschiedlich hohen Calciumsignals kaum vergleichbar. In T1
B-Zellen, die ein etwa gleich hohes Calciumsignal aufweisen, war die Reduktion des
Calciumsignales durch den FcγR2b nach BZR-Stimulation mit und ohne Grb2 unverändert (Abb.
15B). Zusätzlich wurde der Calcium Level auch in primären B-Zellen aus dem Knochenmark
50
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
gemessen. Dort war die inhibitorische Wirkung des FcγR2b nach BZR-Stimulation ebenfalls
detektierbar (Daten von Christina Forsch und Daniel Radtke nicht gezeigt). Die inhibitorische
Wirkung des FcγR2b auf das Calciumsignal ist in primären T1, T2 und reifen Grb2-/- B-Zellen
deutlich messbar und auch die Stärke der Inhibition ist in Grb2-/- B-Zellen gegenüber
Kontrollzellen nicht sichtlich beeinträchtigt. Grb2 spielt in primären B-Zellen keine Rolle bei der
Inhibition über den FcγR2b.
6.1.4.2
Grb2 beeinflusst die FcγR2b Expression von B-Zell Subpopulationen im
Knochenmark und der Peripherie. Das Fehlen von Grb2 kann dabei nicht durch
die Überexpression von Bcl2 ausgeglichen werden
Die inhibitorische Wirkung des FcγR2b auf das Calciumsignal ist in primären Grb2-/- B-Zellen
funktionell. Allerdings verstärkt Grb2 die inhibitorische Wirkung des FcγR2b in Grb2
transfizierten Bal17.TR Zellen gegenüber Bal17.TR Zellen ohne Grb2 (Neumann et al. 2011).
Darum sollte überprüft werden, ob eine veränderte Expression des FcγR2b in primären Grb2-/- BZellen als Grund für die intakte inhibitorische Wirkung des FcγR2b in Frage kommt. Zudem
wurde untersucht, ob die Überexpression von humanem Bcl2 Auswirkungen auf die Expression
des FcγR2b hat. In primären Zellen aus dem Knochenmark von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen war die
Expression des FcγR2b im Knochenmark im Vergleich zu Kontrollzellen nicht verändert. In
Zellen aus Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg Mäusen war die Expression in den unreifen und reifen B-Zellen
im Vergleich zu Zellen aus Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg Mäusen leicht erhöht (Abb. 16A). In der Milz
war die Expression des FcγR2b in den unreifen, T1 und T2-MZ B-Zellen ohne Grb2 um etwa ein
Viertel bis ein Drittel erhöht, während die Expression in den reifen B-Zellen unverändert war.
Interessanterweise war die Expression des FcγR2b auf Grb2-/- B1-Zellen der Milz etwa um den
Faktor zwei erhöht (Abb. 16B, C und D). Darum wurde die FcγR2b auch im Peritoneum
untersucht, in dem die B1-Zellen die größte B-Zell Population stellen. Dort war die FcγR2b
Expression in Grb2-/- B1a Zellen allerdings unverändert und auf Grb2-/- B1B-Zellen war sie
tendenziell erhöht. Die Expression des FcγR2b war hier, anders als in der Milz, bei den B2-Zellen
um den Faktor zwei erhöht (Abb. 16E). Die Expression des FcγR2b in den B-Zellen der
Peripherie wurde weder in Zellen mit Grb2, noch in Zellen ohne Grb2 deutlich durch die
Überexpression von humanem Bcl2 beeinflusst. Die höhere Expression des FcγR2b auf unreifen
Grb2-/- B-Zellen kann potentiell die Calcium Inhibition über den FcγR2b verstärken. Die
unveränderte Expression auf Grb2-/- B-Zellen im Knochenmark und den reifen Grb2-/- B-Zellen
der Milz zeigte allerdings, dass die höhere Expression des FcγR2b nicht für die funktionelle
Inhibition des Calciumsignals durch den FcγR2b in Grb2-/- B-Zellen verantwortlich ist. Demnach
gibt es Unterschiede in der FcγR2b Signalleitung von primären Grb2-/- B-Zellen und Bal17.TR
Zellen.
51
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
3.0
*
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
B
e
B
ur
e
at
ur
m
at
M
at
ur
e
ce
B
e
B
T2
-M
Z
ce
lls
*
1.0
0.5
0.0
52
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
B
2
ce
lls
ce
lls
ce
lls
T
lls
ce
B
2
ce
lls
0.00
*
1b
0.25
1.5
B
0.50
*
ce
lls
0.75
2.0
1a
1.00
F
B
1.25
F8 PC CD43 CD19 CD5 FcyR2b
relative FcyR2b expression
(based on geo Mean)
**
1.50
1
at
m
im
**
*
B
ur
e
ur
at
2
B
B
T1
**
Peritoneal Cavity
F7 PC CD5 B220 FcyR2b
E
1.75
relative FcyR2b expression
(based on geo Mean)
lls
ls
ce
l
***
B
2.25
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
T
F4 SP CD21 IgM B220 FcyR2b
***
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
ce
lls
ce
1
ce
lls
p=0.05
m
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
C
F2 SP HSA B220 FcyR2b
*
***
1.3
relative FcyR2b expression
(based on geo Mean)
im
m
F1 SP B220 CD5 FcyR2b
*** ***
lls
relative FcyR2b expression
(based on geo Mean)
relative FcyR2b expression
(based on geo Mean)
ce
lls
ce
ce
pr
o/p
re
-B
Spleen
1.2
B
1.1
D
lls
0.0
lls
relative FcyR2b expression
(based on geo Mean)
F5Bone
BM IgMMarrow
IgD B220 FcyR2b ohne Trans u MR
*
A
3.5
*
Ergebnisse
Abb. 16: Höhere Fcγ-RezeptorIIb Expression auf unreifen- und B1 B-Zellen der Milz, sowie auf B2 B-Zellen im
Peritoneum. Die Expression des Fcγ-RezeptorsIIb wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Die Auswahl der einzelnen
Zellpopulationen ist teilweise exemplarisch in Abb. 7, Abb. 8 und Abb. 9 dargestellt. Es wurde jeweils eine Population
von Grb2fl/fl mb1cre/+ Zellen als Referenzwert gesetzt, um Schwankungen zwischen Experimenten zu relativieren. A)
Knochenmark: pro/pre B-Zellen (B220+ IgM-), unreife B-Zellen (B220low IgMmed), reife B-Zellen (B220high IgMmed); B)
Milz: B1 B-Zellen (B220+ CD5+), B2 B-Zellen (B220+ CD5-) und T-Zellen (B220- CD5+); C) Milz: Unreife B-Zellen
(B220low HSAhigh) reife B-Zellen (B220high HSAlow); D) Milz: Reifen B-Zellen (B220+ CD21med IgMmed), Transitionalen
Typ 1 B-Zellen (B220+ CD21low IgMhigh) und Transitionalen Typ2 B-Zellen/Marginalzonen B-Zellen (B220+ CD21low
IgMhigh); E) Peritoneum: B1 B-Zellen (B220+ CD5+), B2 B-Zellen (B220+ CD5-) und T-Zellen (B220- CD5+); F)
Peritoneum: B1a B-Zellen (CD19+ CD5+ CD43+), B1b B-Zellen (CD19+ CD5- CD43+) und B2 B-Zellen (CD19+ CD5CD43-). Knochenmark: Grb2fl/fl mb1+/+ n=7 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=9 Mäuse; Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg n=8 Mäuse;
Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg n=5 Mäuse; Milz: Grb2fl/fl mb1+/+ n=7 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=9 Mäuse; Grb2fl/fl mb1+/+
Bcl2tg n=10 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg n=6 Mäuse; Peritoneum: Grb2fl/fl mb1+/+ n=5 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=8
Mäuse; Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg n=10 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg n=6 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test
verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
6.1.4.3
Grb2 hat keinen Einfluss auf die Expression des FcγR2b im Keimzentrum nach
Immunisierung mit Schaferythrozyten.
Die Expression des FcγR2b wird in Keimzentrumzellen hochreguliert und eine niedrigere
Expression des FcγR2b kann zu Autoimmunität führen (Xiu et al. 2002; Jiang et al. 2000; Espéli
et al. 2012). Aufgrund der veränderten FcγR2b Expression in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen (Abb. 16)
und der beeinträchtigten Keimzentrumsbildung (Ackermann et al. 2011) sollte untersucht werden,
ob die Expression auch in Keimzentrumzellen verändert ist. Dazu wurden Keimzentrumzellen
zehn Tage nach einer Immunisierung mit Schafserythrozyten auf ihre FcγR2b Expression hin
untersucht. Die Hochregulation des FcγR2b in Keimzentrumzellen von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen
war vergleichbar mit der von Kontrollzellen (Abb. 17). Grb2 beeinflusst demnach die
Keimzentrumsreaktion nicht durch die Veränderungen der FcγR2b Expression.
53
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
B220+
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
non GC B cells (Fas- GL7-)
GL7
B
% of max
Fas
GC B cells (Fas+ GL7+)
- non Germinal Center B cells
- non Germinal Center B cells
- Germinal Center B cells
- Germinal Center B cells
Fcγr2b expression
F1 SP B220 Fas GL7 FcyR2b
FcyR2b expression
(geo Mean)
700
600
500
400
300
200
100
+
22
0
B
B
22
0
+
G
L7
G
L7
+
-
Fa
s
Fa
s
-
+
0
Abb. 17: Kein Einfluss von Grb2 auf die Hochregulation des FcγR2b in Keimzentrums B-Zellen. Grb2fl/fl mb1+/+
und Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse wurden mit 1x107 Schafserythrozyten pro Maus immunisiert. Nach 10 Tagen wurden die
Milzzellen durchflusszytometrisch analysiert. Die Zellen wurden auf A) B220, Fas, GL7 und FcγR2b (2.4G2) gefärbt.
B) Relative FcγR2b Expression. Für A) und B) Grb2 fl/fl mb1+/+ n=7 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=12 Mäuse. Für die
Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05. Das Experiment wurde zusammen mit Christina Forsch durchgeführt.
6.1.5
6.1.5.1
Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Immunantwort
Grb2 ist wichtig für die Gedächtnisantwort gegen virusartige Partikel des
humanen Cytomegalovirus und das darin enthaltene Glycoprotein B
Grb2 kann an eine konservierte Bindestelle im intrazellulären Teil des IgG und IgE Rezeptors
binden und so die Signalleitung über den BZR in vitro verstärken (Engels et al. 2009). Um diesen
Effekt zu untersuchen wurden Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl mb1+/+ Kontrolltiere zwei Mal i.p. mit
virusartigen Partikeln des humanen Zytomegalovirus (VLPs) immunisiert (Hebeis et al. 2004).
Die primäre und sekundäre IgM und IgG Immunantwort gegen VLPs wurde mittels ELISA
untersucht. Die IgM-Antwort der Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse war sowohl bei der primären als auch
bei der sekundären Antwort auf VLPs erhöht, während die IgG-Antwort bei der sekundären
54
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Antwort schwächer ausfiel (Abb. 18B). Nach 58 Tagen Wartezeit wurden CD19+ Milzzellen mit
jeweils der gleichen Zahl an IgG1/IgG2a/IgG2b+ Zellen, unter denen auch VLP spezifische
Gedächtniszellen sind, aus Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl mb1+/+ Mäusen in Rag1-/- Mäuse
übertragen. Die Gesamtzellzahl der IgG+ Zellen in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen gegenüber den
Grb2fl/fl mb1+/+ Kontrollen war drastisch reduziert (Abb. 18C). Nach sieben Tagen, in denen die
übertragenen B-Zellen Zeit hatten ihre Nischen in den Rag1-/- Mäusen zu finden wurden sie durch
eine i.v. Immunisierung mit VLPs reaktiviert, die Gedächtnis B-Zellen ohne T-Zell Hilfe
reaktivieren können (Hebeis et al. 2004). Während es keinen signifikanten Unterschied in der
IgM-Antwort der Grb2fl/fl mb1cre/+ und der Grb2fl/fl mb1+/+ Zellen in den Rag1-/- Mäusen gab war
die IgG-Antwort der Rag1-/- Tiere mit den Grb2fl/fl mb1cre/+ Zellen stark reduziert (Abb. 18D).
Auch die Zahl der VLP spezifischen Antikörper sekretierenden Zellen war stark vermindert (Abb.
18E). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass Grb2 wichtig für die IgG Gedächtnisantwort ist. Das
Experiment hat aber den Nachteil, dass nicht gezeigt wurde, ob die gleiche Zahl an antigenspezifischen B-Zellen übertragen wurde, da nur die gleiche Zahl an IgG1/IgG2a/IgG2b+ Zellen
übertragen wurde. Außerdem kann nicht ausgeschlossen werden, dass IgM-Memoryzellen, die
nach Reaktivierung schnell zu IgG1 wechseln können den Versuch beeinflussen.
Darum wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, bei dem Glykoprotein B (gB), ein
Bestandteil des humanen Zytomegalovirus als Antigen genutzt wurde. Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse und
Grb2fl/fl mb1+/+ Kontrolltiere wurden drei Mal mit gB immunisiert. Nach einer Wartezeit von 83
Tagen wurde die Zahl der B220+IgG1/IgG2a/IgG2b+gB-bindenden Zellen bestimmt. Sie war in
Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen gegenüber Grb2fl/fl mb1+/+ Tieren tendenziell reduziert (Abb. 19B). Es
wurden B220+IgG1/IgG2a/IgG2b+gB-bindende Gedächtniszellen in Rag1-/- Füllerzellen sortiert
und 1x104 Gedächtniszellen pro Maus in Rag1-/- Mäuse übertragen. Nach sechs Tagen wurden die
Empfängermäuse i.v. mit VLPs immunisiert, da lösliches gB allein nicht in der Lage ist die gB
spezifischen Gedächtniszellen zu reaktivieren (Hebeis et al. 2004). Sowohl der gB-spezifische
Serumtiter, als auch die Zahl der gB-spezifischen Antikörper sekretierenden Zellen in der Milz
und tendenziell im Knochenmark waren in Rag1-/- Mäusen mit Grb2fl/fl mb1cre/+ Gedächtniszellen
gegenüber Tieren mit Kontrollzellen deutlich reduziert (Abb. 19D und E). Somit konnte das
Ergebnis der VLP Immunisierung antigenspezifisch bestätigt werden. Grb2 ist essentiell für die
Gedächtnisantwort von IgG-Zellen.
55
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
VLPs of hCMV in Alum i.p.
d0
d32
d90
2µg
2µg
donor
Adoptive
transfer of
2x106
IgG+CD19+
splenic
cells i.v.
ELISA
recipient
(NK-cell depl.
Rag1-/- mice)
10
1
VLP (Boost)
10
Joche
1
VLP (Boost)
0.1
0.1
21
28
35
42
0
7
14
21
time(d)
0.1
7
Total cells (x106)
0.01
se
d
e/
+
+
+/
un
i
cr
b
b1
m
fl
m
m
fl
fl/
** ***
10
im
no
n
***
Spleen
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb cre/+
non immunised
1
14
21
0
7
14
time(d)
VLP-specific IgG - Spleen
*
Grb2fl/fl mb1+/+ donor cells
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
non immunised - donor cells
500
250
ls
on
or
ce
l
-d
do
no
rc
el
im
m
fl
fl/
b2
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
un
is
ed
m
m
b
b1
cr
e/
+
do
no
rc
el
+
+/
ls
0
ls
Antibody-secreting cells
per 106 cells
750
fl
fl/
0.02
***
100
time(d)
IgG VLP ELISPOT
Spleen
rb
2
0.03
0.1
0
56
0.04
immunisation with VLPs of hCMV
IgG
G
1000
1
0.05
0.00
FL-2
(notofstained)
immunisation with
VLPs
hCMV
postTransfer
IgM
VLP-specific IgG (AU)
VLP-specific IgM (AU)
Grb2fl/fl mb1+/+
0.06
Grb2fl/fl mb cre/+
0.11%±0.03
0.21%±0.12
10
E
42
IgG+ before transfer spleen
IgG+
***
0.07
Grb2fl/fl mb1+/+
non immunised
rb
2
IgG1/IgG2a/IgG2b
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2+ fl/fl mb1+/+
IgG fl/fl
Grb2
mb cre/+
0.19%±0.06
100
35
time(d)
d90
Grb2fl/fl mb1+/+
D
28
fl/
14
rb
2
7
G
0
C
ELISPOT
ELISA
immunisation with VLPs of hCMV
immunisation with VLPs of hCMV
ante Transfer IgG
IgM
*
1000
*
**
** *
*
**
***
100
100
VLP-specific IgM (AU)
d-7
VLP-specific IgG (AU)
B
d0 reactivation
VLPs in PBS i.v. d21
2µg
Grb2fl/fl mb1+/+ donor cells
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
non immunised - donor cells
21
Ergebnisse
Abb. 18: Schwächere sekundäre Immunantwort von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen gegen virusartige Partikel (VLP)
des humanen Cytomegalovirus und reduzierte Gedächtnisantwort von IgG+ Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen gegenüber
Kontrollzellen. Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl mb1+/+ Mäuse wurden zwei Mal mit 2 µg VLPs in Alum intraperitoneal
immunisiert. IgM und IgG Serumtiter wurden über die Zeit mittels ELISA bestimmt (B). Nach 90 Tagen wurde die
Zahl an IgG1/IgG2a/IgG2b+ Zellen in der Milz analysiert (C). Es wurden 2x106 CD19+ Milzzellen und damit eine
gleiche Anzahl an IgG+ Zellen aus Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl mb1+/+ Mäusen i.v. in Rag1-/- Rezipienten übertragen.
Die CD19+ Zellen wurden negativ über eine komplementvermittelte T-Zelllyse (anti-Thy1, anti-CD4, anti-CD8) und
danach positiv mit anti-CD19 Beads magnetisch angereichert. Die Rag1-/- Mäuse wurden zwei Tage vor dem Transfer
mit 1 mg/Maus anti-NK1.1 behandelt, um NK-Zellen zu depletieren. Dies geschah, weil die Donorzellen aus einem
gemischten BALB/c / C57BL/6 Hintergrund kommen, während die Rezipienten C57BL/6 Tiere sind. Die
Gedächtniszellen wurden 7 Tage nach dem Transfer über die Injektion von 2 µg/ Maus VLPs reaktiviert und der VLP
spezifische IgG Serumtiter wurde über die Zeit per ELISA bestimmt (D). Die Rezipienten wurden 28 Tage nach dem
Transfer geopfert und es wurde eine VLP spezifischer ELISPOT durchgeführt (E). Für B) und C) Grb2fl/fl mb1+/+ n=5
Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=5 Mäuse; For C) nicht immunisiert =2 Mäuse; Für D) und E) Grb2 fl/fl mb1+/+ Donorzellen
n=5 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Donorzellen n=4 Mäuse; naive Donorzellen =2 Mäuse. Für die Statistik wurde der T-Test
verwendet; *p<0,05; *p<0,01; *p<0,001. Jochen Ackermann hat die Donortiere immunisiert und ihre Seren gesammelt.
57
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
recipient
(NK-cell depl.
Rag1-/- mice)
Grb2fl/fl mb1+/+
non immunised
Grb2fl/fl mb1cre/+
0.12%±0.03
IgG+ before transfer spleen
0.05%±0.01
IgG+gB+
0.01%±0.01
0.00%±0.00
40
30
20
10
0
**
50
*
**
5
gB-specific IgG1 (AU)
p=0.05
14
21
28
time(d)
gB-specific IgG2b (AU)
7
50
***
5
0.5
immunisation with VLPs of hCMV
7
14
21
28
se
d
m
IgG2a
50
5
0
7
14
21
28
time(d)
Grb2fl/fl mb1+/+ donor cells
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
non immunised - donor cells
Grb2fl/fl mb1+/+ donor cells
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
non immunised - donor cells
50
im
immunisation with VLPs of hCMV
time(d)
IgG2b
un
i
m
fl
fl/
rb
2
**
**
0
0
Grb2fl/fl mb cre/+
non immunised
500
IgG1
500
0.05
Grb2fl/fl mb1+/+
immunisation with VLPs of hCMV
0.05
0.5
Spleen
NKp46+
NKp46+
immunisation withNKp46
VLPs of(CD335)
hCMV
500
IgG
D 500
Bone Marrow
d35 after
NK1.1 i.p.
gB-specific IgG2a (AU)
% of Max
NKp46+
cr
+/
b1
Spleen
d35 after
NK1.1 i.p.
Blood
d13 after
NK1.1 i.p.
G
Grb2fl/fl mb1cre/+
Grb2fl/fl mb1+/+
gB-specific IgG (AU)
Grb2fl/fl mb1+/+
non immunised
G
Post transfer
C
e/
+
+
gB-Cy5
b
0.03%±0.03
B220+IgG+gB+
50
no
n
IgG+ 0.13%±0.02
ELISPOT
m
Grb2fl/fl mb1+/+
d27
ELISA
fl
d187
IgG1/IgG2a/IgG2b
d-6
Ante transfer
B220+
d0 reactivation
VLPs in PBS i.v.
2µg VLPs
Total cells (x103)
B
Transfer of
1x104
IgG+CD19+gB+
cells mixed
with Rag1-/filler cells i.v.
fl/
gB of hCMV in Alum i.p.
d0
d28 d104
d187
10µg 5µg 5µg
donor
rb
2
A
5
0
300
Antibody-secreting cells
per 106 cells
Antibody-secreting cells
per 106 cells
E
IgG VLP ELISPOT Spleen
gB-specific
- +/+
Spleen
Grb2fl/flIgG
mb1
donor cells
*
fl/fl
cre/+
Grb2 mb
donor cells
30
7
100
0
21
28
Grb2fl/fl mb1+/+ donor cells
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
non immunised - donor cells
non immunised - donor cells
200
14
time(d)
IgG VLP ELISPOT
Bone Marrow
gB-specific IgG - Bone Marrow
20
10
0
on
or
ce
lls
on
or
ce
l
-d
un
is
ed
cr
e/
+
m
im
m
fl
fl/
b2
rb
2
fl/
fl
m
b
b1
se
d
+/
+
-d
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
un
i
m
im
do
no
rc
el
ls
do
no
rc
el
ls
ls
ls
do
no
rc
el
fl
fl/
b2
rb
2
fl/
fl
m
b
m
b1
cr
+/
+
58
e/
+
do
no
rc
el
ls
Suppl. Fig. X: Reduced memory immune response of Grb2fl/fl mb1cre/+ cells to glycoprotein B
Ergebnisse
Abb. 19: Schwächere Gedächtnisantwort von Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen gegen glykoprtein B (gB) des humanen
Zytomegalovirus gegenüber Kontrollzellen. Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl mb1+/+ Mäuse wurden ein Mal mit 10 µg
und zwei Mal mit 5 µg gB in Alum i.p. immunisiert. Nach 187 Tagen wurde die Zahl an B220 +, IgG+, gB-bindenden
Zellen in der Milz bestimmt (B) und 1x104 B220+, IgG1/IgG2a/IgG2b+,gB-bindende sortierte Zellen wurden zusammen
mit Rag1-/- Milzzellen als Füllerzellen i.v. in Rag1-/- Rezipienten übertragen. In die Rag1-/- Mäuse wurde zwei Tage vor
dem Transfer 1 mg/Maus anti-NK1.1 Antikörper i.p. injiziert, um NK-Zellen zu depletieren. Dies geschah, weil die
Donorzellen aus einem gemischten BALB/c / C57BL/6 Hintergrund kamen, während die Rezipienten C57BL/6 Tiere
waren. Die Depletion der NK-Zellen wurde durchflusszytometrisch überprüft (C). Die transferierten gB spezifischen
Gedächtnis B-Zellen wurden sechs Tage nach dem Transfer durch die Gabe von 2 µg virusartigen Partikeln in PBS i.v.
(enthalten gB) reaktiviert. gB spezifische Immunglobulinlevel wurden mittels ELISA über die Zeit bestimmt (D). Die
Rezipiententiere wurden 33 Tage nach dem Transfer der Gedächtniszellen geopfert und ein gB spezifischer ELISPOT
wurde durchgeführt (E). Für B) Grb2fl/fl mb1+/+ n=4 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=3 Mäuse; nicht immunisiert =2 Mäuse;
Für C), D) und E) Grb2fl/fl mb1+/+ Donorzellen n=3 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Donorzellen n=4 Mäuse; naive Donorzellen
=2 mice. Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; *p<0,01; *p<0,001. Die i.v. Injektion wurde von Prof.
Dr. Thomas Winkler durchgeführt.
6.1.5.2
Für den Immunglobulin Klassenwechsel in B-Zellen ist Grb2 nicht essentiell
Es wurde gezeigt, dass die sekundäre Immunantwort von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen gegen
virusartige Partikel des humanen Zytomegalievirus reduziert ist (Abb. 19B). Neben einer
abgeschwächten Aktivierung über den IgG-BZR könnte auch ein Defekt beim Klassenwechsel zu
dieser Reduktion beitragen. Darum wurde die Fähigkeit zum Klassenwechsel in Grb2fl/fl mb1cre/+
B-Zellen untersucht. Dazu wurden die Zellen in vitro kultiviert und entweder unbehandelt
belassen oder mit dem Mitogen LPS allein oder LPS und IL-4 stimuliert. Die Stimulation von
naiven B-Zellen mit LPS führt bevorzugt zu einem Wechsel zu IgG3, während eine Stimulation
mit LPS und IL-4 bevorzugt zu einem Wechsel zu IgG1 führt (Burstein et al. 1991). Der
Überstand der Zellen wurde mittels ELISA auf die Sekretion von IgM, IgG1 und IgG3 untersucht.
Stimulierte Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen sekretierten sowohl nach LPS als auch nach LPS und IL-4
Stimulation jeweils mehr IgM, IgG1 und IgG3. Außerdem war die Sekretion von IgM, IgG1 und
IgG3 tendenziell auch in den unstimulierten Zellen höher, was auf eine höhere Voraktivierung der
Zellen hindeutet (Abb. 20A). Die höhere Sekretion von Antikörpern nach Stimulation mit LPS
(Abb. 20A) könnte darauf hindeuten, dass die Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen stärker als die Kontrollen
über Toll-Like-Rezeptoren stimulierbar sind. Ein Stimulationsversuch mit Liganden für die TollLike-Rezeptoren 7 und 9, bei dem die Proliferation von unreifen und reifen B-Zellen gemessen
wurde bestätigte dies (Abb. 21). Trotz der stärkeren Stimulierbarkeit über Toll-Like-Rezeptoren
weist dieser Antikörperlevel im Überstand auf einen funktionellen Klassenwechsel von Grb2fl/fl
mb1cre/+ B-Zellen zu IgG1 und IgG3 hin. Es ist beschrieben, dass während des Klassenwechsels
DNA Stücke in zirkulärer Form aus dem Immunglobulin Lokus für die schwere Kette geschnitten
werden. Diese werden weiter in RNA umgeschrieben. Die RNA kann als Marker für einen
59
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
aktiven Klassenwechsel in einer reversen Transkriptase-PCR spezifisch nachgewiesen werden
(Kinoshita et al. 2001). Das spezifische zirkuläre Transkript für den Klassenwechsel zu IgG1
konnte nach LPS und IL-4 Stimulation sowohl in Grb2fl/fl mb1cre/+ als auch in Grb2fl/fl mb1+/+
Zellen nachgewiesen werden (Abb. 20A). Grb2 ist also nicht essentiell für die Fähigkeit von BZellen ihre Immunglobulinklasse zu wechseln. Es gibt keinen Hinweis, dass ein Defekt beim
Klassenwechsel zu einer niedrigeren sekundären IgG Antwort von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen gegen
virusartige Partikel beiträgt.
60
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
IgM
IgG1
IgG3
A
10000
IgG1
IgG3
100
Grb2fl/fl
mb1cre/+
LP
S
.
IL
-4
+
LP
S
.
Grb2fl/fl
mb1+/+
LP
S
+
LP
S
Grb2fl/fl
mb1+/+
*
100
10
un
st
im
IL
-4
LP
S
un
st
im
B
1000
10
.
10
**
1000
im
100
*
un
st
1000
10000
IgG3 (ng/ml)
10000
IgG1 (ng/ml)
IgM (ng/ml)
**
IL
-4
100000
**
+
**
IgM
LP
S
100000
Grb2fl/fl
mb1cre/+
Abb. 20: Primäre Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen können einen effizienten Klassenwechsel zu IgG1 und IgG3
vollziehen. A) Milzzellen von Grb2fl/fl mb1+/+ and Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen wurden für 6 Tage mit LPS (10 µg/ml), LPS
(10 µg/ml) und IL-4 (10 ng/ml) oder ohne weitere Stimulation in 5 ml Medium inkubiert (37 °C, 5 % CO2). Sekretiertes
IgM, IgG1 oder IgG3 im Überstand wurde mittels ELISA gemessen. B) Milzzellen wurden wie in A beschrieben
stimuliert und für 48 h inkubiert. Dann wurde die RNA der Zellen aufgereinigt und in cDNA umgeschrieben. Diese
wurde verwendet, um ein spezifisches RNA Stück nachzuweisen, das beim Klassenwechsel zu IgG1 synthetisiert wird.
Es wird von einem zirkulären DNA Stück trankribiert, welches beim Klassenwechsel zu IgG1 aus dem Bereich, der für
die Immunglobulin schwere Kette kodiert geschnitten wird. Für A): Grb2fl/fl mb1+/+ n=6 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=6
Mäuse; Für B): Grb2fl/fl mb1+/+ n=2 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=2 Mäuse. Für die Statistik wurde der T-Test verwendet;
*p<0,05; *p<0,01.
61
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
100000
***
**
**
10000
1000
100
0
0.2
1
5
10
counts per minute (cpm)
counts per minute (cpm)
R848 (TLR7 ligand) stimulated immature B cells (B220low HSAhigh) R848 (TLR7 ligand) stimulated mature B cells (B220high HSAlow)
100000
***
**
10000
1000
100
15
0.0
0.2
0.5
R848 (µg/ml)
10
15
***
10000
*
*
100
0,1
0.5
CPG (TLR9 ligand) stimulated mature B cells (B220high HSAlow)
counts per minute (cpm)
counts per minute (cpm)
100000
0.0 0,02
5
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb cre/+
CPG (TLR9 ligand) stimulated immature B cells (B220 low HSAhigh)
1000
1
R848 (µg/ml)
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb cre/+
B
*
2.0
3.5
5.0
100000
***
10000
**
*
*
1000
100
0.0 0,02
CPG (µg/ml)
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb cre/+
0,1
0.5
2.0
3.5
CPG (µg/ml)
Grb2fl/fl mb1+/+
Grb2fl/fl mb cre/+
Abb. 21: Stärkere Antwort von primären Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen auf TLR7 und TLR9 Stimulation. A) Unreife
(B220low HSAhigh) und reife B-Zellen (B220high HSAlow) wurden durchflusszytometrisch aus Gesamtmilzzellen heraus
sortiert. Sie wurden jeweils für 48 h mit den angegebenen Mengen R848 (TLR7 Ligand) oder CPG-ODN 1826 (TLR9
Ligand) in 0,2 ml Medium stimuliert. Für die letzten 12 h wurde 1µCi/Well 3H Tritiumthymidin zu den Zellen gegeben.
Nach der Inkubation wurde der 3H-Tritiumthymidineinbau detektiert (Berthold-Inotech Trace-96 - Berthold, Wildbad,
Germany), um die Proliferation der Zellen zu bestimmen. Für A) und B): Grb2fl/fl mb1+/+ n=3; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=3. Für
die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; *p<0,01; *p<0,001.
62
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
5.0
Ergebnisse
6.1.5.3
Grb2 in Keimzentrumszellen hat keinen Einfluss auf die Keimzentrumsbildung
nach einer Immunisierung mit Schafserythrozyten
Es wurde gezeigt, dass gB-spezifische Gedächtniszellen aus Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen nach
Restimulation eine schwächere Immunantwort hervorrufen als Memoryzellen aus Grb2fl/fl mb1+/+
Mäusen. Allerdings sind die B-Zell Entwicklung und die Keimzentrumsreaktion in Grb2fl/fl
mb1cre/+ Mäusen ebenfalls beeinträchtigt (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011) und es ist
unklar in wie weit diese Faktoren die Bildung der Gedächtniszellen beeinflussen. Um eine
Beteiligung dieser Faktoren bei der Untersuchung von Gedächtniszellen weitestgehend
auszuschließen zu können, wurden Grb2fl/fl Mäuse mit Cγ1cre/+ Mäusen verpaart, die Cre in
Keimzentrumzellen exprimieren (Casola et al. 2006). Die erfolgreiche Deletion von Grb2 in
Keimzentrumszellen von Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen wurde mittels Western Blot bestätigt (Abb. 22).
Grb2fl/fl
Cγ1cre/+
Mäuse
wurden
zur
Untersuchung
der
Keimzentrumsreaktion
mit
Schafserythrozyten immunisiert. Als Kontrolle dienten Grb2wt/wt Cγ1cre/+ Mäuse, da die
Antikörperproduktion in Cγ1cre/+ Mäusen gegenüber wt Tieren reduziert ist (Casola et al. 2006).
Zehn Tage nach der Immunisierung mit Schafserythrozyten wurde die Keimzentrumsreaktion in
der Milz untersucht. Es waren keine Veränderungen in der Struktur, Zahl oder Größe der
Keimzentren in Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen gegenüber Grb2wt/wt Cγ1cre/+ Tieren festzustellen (Abb.
23A und B; Abb. 24A und B). Auch das Verhältnis von B-Zellen aus der dunklen Zone zu BZellen aus der hellen Zone der Keimzentren war unverändert (Abb. 24C und D). Außerdem
wurden keine Unterschiede bei der Zahl der IgM-Plasmazellen und der IgG+ Zellen in der Milz
zwischen Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen und Kontrolltieren festgestellt (Abb. 23A und C). Die Zahl der
follikulären T-Helferzellen in der Milz von Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen war vergleichbar mit der
Anzahl in den Kontrolltieren (Abb. 24E und F). Das bedeutet, die Deletion von Grb2 in B-Zellen
des Keimzentrums beeinflusst die Struktur, Anzahl oder Größe von Keimzentren der Milz nicht.
63
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
Grb2wt/wt Cγ1cre/+
Grb2fl/fl Cγ1cre/+
α -Grb2
α -β-Aktin
Abb. 22: Deletion von Grb2 in Keimzentrums B-Zellen von Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen. Die Mäuse wurden zuvor für
NP-KLH Experimente verwendet, wobei die letzte Immunisierung mit NP-KLH mindestens 7 Wochen zurück lag.
Grb2fl/fl Cγ1+/+ und Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäuse wurden mit 1x107 Schafserythrozyten immunisiert. Nach 10 Tagen wurden
T-Zellen mit anti-CD90.2 (Thy1) magnetischen Beads depletiert, um B-Zellen aus der Milz anzureichern. Danach
wurden die Zellen auf B220 (RA3-6B2), Gl7 (GL-7) und Fas-Rezeptor (Jo2) gefärbt. B220+ GL7+ Fas-Rezeptor+
(Keimzentrums B-Zellen) und B220+ GL7- Fas-Rezeptor- B-Zellen wurden über durchflusszytometrische Zellsortierung
weiter aufgereinigt. Lysate der Zellen wurden für einen Western-Blot verwendet, um Grb2 und Aktin über anti-Grb2
(3F2) oder anti-Aktin (Caderlane) Antikörper in den Proben nachzuweisen.
Deletion
64 of Grb2 in Grb2
Cγ1
germinal center B cells. The mice were part of NP-KLH immunisation
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
65
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 23: Vergleichbare Struktur und Anzahl von Keimzentren, so wie IgG+ Zellen in Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen
und Kontrolltieren nach Immunisierung mit Schafserythrozyten. Grb2fl/fl Cγ1+/+ und Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäuse wurden
mit 1x107 Schafserythrozyten pro Maus immunisiert. Nach 10 Tagen wurden die Milzen in TissueTec eingefroren. Es
wurden 8 µm dicke Schnitte angefertigt. Dargestellt ist je ein Milzschnitt von drei Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen und je ein
Milzschnitt von drei Grb2wt/wt Cγ1cre/+ Mäusen, so wie ein Milzschnitt einer nicht immunisierten Kontrolle. Die Schnitte
wurden auf A) IgM (B7-6) und IgD (11-26c), B) PNA (FL-1071, Vector Laboratories) und IgD oder C) IgG (A11001,
Invitrogen) und IgD gefärbt wurden. Es wurden fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen gemacht. B) Die relative Zahl
und Fläche der Keimzentren wurde bestimmt. C) Die relative Zahl an IgG+ Zellen wurde bestimmt. Grb2fl/fl Cγ1cre/+ n=6
Mäuse; Grb2wt/wt Cγ1cre/+ n=6 Mäuse; Grb2fl/fl nicht immunisiert n=1 Maus. Für die Statistik wurde der T-Test
verwendet; *p<0,05.
66
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
B
B220+
Grb2wt/wt Cγ1cre/+
Grb2fl/fl Cγ1cre/+
Grb2fl/fl
non immunised
GC B cells
2.7%±1.1
1%
Fas
3.3%±1.1
GL7
C
D
B220+ Fas+
Grb2wt/wt Cγ1cre/+
Grb2fl/fl Cγ1cre/+
Grb2fl/fl
non immunised
Dark zone
37.5%±9
CXCR4
37.8%±3.2
25.6%
Light zone
41.8%±5.2
40.5%±9
40.7%
CD86
E
F
CD4+
Grb2wt/wt Cγ1cre/+
Grb2fl/fl Cγ1cre/+
Grb2fl/fl
non immunised
PD-1
Follicular TH cells
9.8%
±2.1
8.6%
±2.2
13.2%
CXCR5 (CD185)
67
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 24: Vergleichbare Zahl von Keimzentrums B-Zellen und follikulären T-Helferzellen in Grb2fl/fl Cγ1cre/+ und
Kontrollmäusen nach Immunisierung mit Schafserythrozyten. Grb2fl/fl Cγ1+/+ und Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäuse wurden
mit 1x107 Schafserythrozyten pro Maus immunisiert. Nach 10 Tagen wurden die Milzzellen durchflusszytometrisch
analysiert. Die Zellen wurden auf A) B220, Fas und GL7; C) B220, Fas, CXCR4, CD86 und E) CD4, PD-1 und
CXCR5 (CD185) gefärbt. Berechnung der Gesamtzellzahlen für A), C) und E) in B), D) und F). Grb2fl/fl Cγ1cre/+ n=5
Mäuse; Grb2wt/wt Cγ1cre/+ n=6 Mäuse; Grb2fl/fl nicht immunisiert n=1 Maus. Für die Statistik wurde der T-Test
verwendet; *p<0,05.
6.1.5.4
Die Deletion von Grb2 in Keimzentrums-B-Zellen oder in allen B-Zellen ab der
frühen Entwicklung hat keinen Einfluss auf die Affinitätsreifung von B-Zellen
Die primäre und sekundäre IgG1 Immunreaktion gegen NP-KLH ist in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen,
die Grb2 in der frühen B-Zell Entwicklung deletieren unverändert (Doktorarbeit Jochen
Ackermann). Allerdings könnte die Affinitätsreifung in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen durch die
veränderte Keimzentrumsreaktion (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011) gestört sein. Die
relative Affinität von Antikörpern lässt sich untersuchen, indem man die Bindefähigkeit der
Antikörper an ein Trägerprotein mit mehr gekoppelten Epitopen in ein Verhältnis zur
Bindefähigkeit
an
ein
Trägerprotein
mit
weniger
gekoppelten
Affinitätsreifung war in der sekundären Immunantwort von Grb2
fl/fl
Epitopen
cre/+
mb1
setzt.
Die
Mäusen im Vergleich
zu den Kontrolltieren unverändert (Abb. 25A). Zusätzlich wurde die IgG1 Immunantwort und die
Affinitätsreifung nach NP-KLH Immunisierung in Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen untersucht, die Grb2
erst in der Keimzentrumsreaktion deletieren (Casola et al. 2006). Die primäre IgG1
Immunantwort von Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen nach einer Immunisierung mit NP33-KLH war erhöht,
während die sekundäre Antwort unverändert war (Abb. 25B). Grb2 hat also einen inhibitorischen
Effekt auf die primäre IgG1-Antwort gegen NP-KLH in Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen. Die
Affinitätsreifung von B-Zellen in Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen war aber nicht verändert (Abb. 25B).
Die Deletion von Grb2 im Keimzentrum oder in B-Zellen ab der frühen B-Zell Entwicklung
beeinträchtigt die Affinitätsreifung von B-Zellen nicht.
68
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
10
1
0.1
0.01
0.001
Grbfl/flmb1+/+
NP33 -KLH (Boost)
Grb2fl/fl mb1cre/+
100
10
1
0.1
0.01
0.001
0
7
14
21
28
35
0
B
14
33
IgG1
100
*
*
10
1
0.1
NP33 -KLH (Boost)
0.01
NP4-specific IgG1 (AU)
*
21
28
0.001
7
14
21
Grbfl/flmb1+/+
Grb2fl/fl mb1cre/+
1.0
NP33 -KLH (Boost)
0.0
0
7
14
*
28
35
NP33 -KLH (Boost)
0.01
0
7
time(d)
14
21
28
35
2.0
IgG1
1.5
NP33 -KLH (Boost)
1.0
0.5
0.0
0
7
14
21
28
time(d)
time(d)
wt/wt
fl/fl
cre/+ wt/wt C1cre/+
Grb2wt/wt
C1cre/+
Grb2
C1cre/+
Abb. 25: Keine
Veränderung
in der Affinitätsreifung
von
Grb2
Cγ1cre/+ und Grb2fl/fl mb1Grb2
Mäusen
im
fl/fl
cre/+
fl/fl
cre/+
fl/fl
cre/+
Grb2
C
Grb2
35
33
1
0.1
28
Affinity
maturation
NP -KLH immunisation
p=0.08
*
21
time(d)
NP33-KLH immunisation
IgG1
10
G
G
0.5
35
0.001
0
1.5
IgG1
time(d)
Primary
immunisation: NP -KLH
NP -KLH immunisation 33
NP17-specific IgG1 (AU)
7
time(d)
100
NP4/NP17-specific IgG1 (AU)
1000
NP33 -KLH (Boost)
100
Affinity
NP33-KLHmaturation
immunisation
NP33-KLH immunisation
IgG1
NP4/NP17-specific IgG1 (AU)
1000
IgG1
NP4-specific IgG1 (AU)
NP17-specific IgG1 (AU)
Primary
NP33immunisation:
-KLH immunisationNP33-KLH
C
Grb2
C
Vergleich zu Kontrolltieren. A) Grb2fl/fl mb1cre/+ und Grb2fl/fl mb1+/+ Mäuse wurden an Tag 0 und 14 mit je 100 µg
NP33-KLH immunisiert. Der IgG1 Serumtiter gegen NP4 und NP17 wurde mittels NP-BSA ELISA von Tag 14 bis Tag
35 bestimmt. Das Verhältnis der NP4 zur NP17 Antwort wurde gebildet, um die Affinitätsreifung zu untersuchen.
Jochen Ackermann die Mäuse für A immunisiert und Serum gewonnen. B) und C) Grb2fl/fl Cγ1cre/+ und Grb2wt/wt
Cγ1cre/+ Mäuse wurden an Tag 0 und 21 mit je 50 µg NP 9- oder NP33-KLH immunisiert. Der IgG1 Serumtiter gegen
NP4 und NP17 wurde mittels NP-BSA ELISA bestimmt. Das Verhältnis der NP4 zur NP17 Antwort wurde gebildet,
um die Affinitätsreifung zu untersuchen. C) Wurde zusammen mit Felix Hartmann durchgeführt. Für A): Grb2fl/fl
mb1+/+ n=4 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=4 Mäuse; Für B) Grb2wt/wt Cγ1cre/+ n=4 Mäuse; Grb2fl/fl Cγ1cre/+ n=5 Mäuse; Für
C) Tage 0, 7 und 14: Grb2wt/wt Cγ1cre/+ n=11 Mäuse; Grb2fl/fl Cγ1cre/+ n=5 Mäuse; C) Tage 21, 28 und 35: Grb2wt/wt
Cγ1cre/+ n=6 Mäuse; Grb2fl/fl Cγ1cre/+ n=3 Mäuse. Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05.
Suppl. Fig. X: Elevated IgG1 responses of Grb2fl/fl Cγ1cre/+ mice after NP -KLH immunisation
69
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
35
Ergebnisse
6.1.5.5
Grb2 verstärkt die Gedächtnisantwort gegen Glycoprotein B des humanen
Cytomegalovirus auch nach einer intakten B-Zell Entwicklung
Neben der beeinträchtigten Gedächtnisantwort von Grb2-/- B-Zellen aus Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen
haben diese auch einen Defekt in der B-Zell Entwicklung und eine verminderte
Keimzentrumreaktion, die Auswirkungen auf die Generierung von Gedächtnis B-Zellen haben
könnte. Die Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Maus bietet mit der normalen Entwicklung von naiven B-Zellen, der
weitgehend unbeeinflussten Keimzentrumsreaktion (Abb. 23 und Abb. 24), sowie der intakten
Affinitätsreifung (Abb. 25) und der späten Deletion von Grb2 (Casola et al. 2006) die
Möglichkeit, Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen zu untersuchen, die eine weitgehend normale
Entwicklung durchlaufen haben. Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäuse und Grb2wt/wt Cγ1cre/+ Kontrolltiere
wurden drei Mal mit gB immunisiert. Die Bildung von gB-spezifischen IgG1 Antikörpern war in
Grb2fl/fl Cγ1cre/+ und Kontrolltieren vergleichbar (Abb. 26A). 71 Tage nach der letzten
Immunisierung war die Zahl der B220+IgG1+, und der B220+IgG1+gB-bindenden Zellen in der
Milz tendenziell reduziert, während die Zahl der B220+IgG2b+ Zellen unverändert war (Abb. 26C
und D). Es wurden Gesamt-CD19+-Milzzellen, die jeweils 8x103 CD19+B220+IgG1+gB-bindende
Zellen enthielten aus Grb2fl/fl Cγ1cre/+ und Kontrolltieren i.v. in Rag1-/- Rezipienten übertragen und
nach sechs Tagen mit VLPs reaktiviert. Die gB spezifische IgG1-Gedächtnisantwort war in
Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen im Vergleich zu den Grb2wt/wt Cγ1cre/+ Kontrolltieren reduziert (Abb.
26E). Die gB spezifischen IgG1-Serumtiter glichen sich aber etwa ab Tag 15 wieder aneinander
an, während die Zahl der IgG1+ gB-spezifischen antikörper-sekretierenden Plasmazellen in Rag1-/Mäusen, die Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Gedächtniszellen erhalten hatten, auch an Tag 42 noch stark
verringert war (Abb. 26E und F). Durch die Untersuchung von Gedächtnis-B-Zellen aus Grb2fl/fl
Cγ1cre/+ Mäusen, die eine weitgehend normale B-Zell-Entwicklung und Keimzentrumsreaktion
aufweisen konnte gezeigt werden, dass Grb2 unabhängig von der B-Zell Entwicklung und der
Keimzentrumsreaktion einen positiven Einfluss auf die Gedächtnisantwort von B-Zellen hat
(Abb. 18 und Abb. 19).
70
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
gB of hCMV in Alum i.p.
d0 reactivation
Transfer of
+
+
VLPs in PBS i.v. d43
d-6
d0
d28 d63
d134 IgG CD19 spleen
4µg
2µg 2µg
2µg VLPs
cells containing
recipient
donor
8x103
(Rag1-/- mice)
IgG+CD19+gB+
cells i.v.
ELISA
ELISPOT
ELISA
immunisation with gB of hCMV
C
Ante transfer
+
IgG2b+ before transfer
IgG1+ spleen
before transfer
spleen
IgG+ gB
before transfer spleen
wt/wt
cre/+
Grb2
c1
+
+
B220+ IgG2b
B220+ IgG1
B220+IgG1+gB+
2.0
Total cells (x104)
1
0.1
gB (2nd Boost)
gB (1st Boost)
0.01
0
d134
Grb2wt/wt cγ1cre/+
IgG1+
G
B220+
0.5
0.8
6
0.7
5
4
3
2
1
0.5
0.4
0.3
0.2
0.0
Grb2fl/fl cγ1cre/+
non immunised
Grb2fl/fl cγ1cre/+
Bone Marrow
Bone Marrow
0.04%±0.02
Grb2wt/wt cg1cre/+
fl/fl
cre/+
Grb2 cg
non immunised
IgG1+gB+
0.003%±0.001
immunisation with gB of hCMVgB-Cy5
500
0.6
0.1
0
0.06%±0.02
0.11%±0.06
IgG1
gB-specific IgG1 (AU)
1.0
7
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
0.011%±0.009
E
1.5
0.0
time(d)
D
Total cells (x104)
Grb2fl/fl cg1cre/+
10
Total cells (x104)
IgG1
rb
2w
t/
G wt
rb
c
2f g1
cr
l/f
no l cg e/+
1
n
im cre
/
m
un +
is
ed
G
rb
2 wt
/w
t
G
rb c
2 fl/ 1 cre
fl
/+
no
c
n
im 1 cre
/+
m
un
is
ed
G
rb
2 wt
/w
t
G
rb c
2 fl/ 1 cre
fl
/+
no
c
n
im 1 cre
/+
m
un
is
ed
gB-specific IgG1 (AU)
B 100
Spleen
Grb2wt/wt c1cre/+
fl/fl
cre/+
Grb2 c1
non immunised
Grb2wt/wt c1cre/+
Grb2fl/fl c1cre/+
non immunised
0.000%±0.000
Post transfer
IgG1
*
50
**
5
** *
0.5
0.05
0
7
14
21
28
35
42
time(d)
p=0.09
Antibody-secreting cells
per 106 cells
70
IgG gB ELISPOT Spleen
gB-specific IgG - Spleen
IgG1 gB ELISPOT Spleen
gB-specific IgG1 - Spleen
35
*
40
Grb2wt/wt c1cre/+ donor cells30
Grb2fl/fl cg1cre/+ donor cells 25
non immunised - donor cells20
30
15
50
20
10
0
10
5
0
rb
do
2f
l/f
no
lc
rc
g1
el
cr
ls
e/
on
+
d
im
on
m
or
un
ce
is
lls
ed
-d
on
or
ce
lls
60
rb
do
2f
l/f
no
lc
rc
g1
el
cr
ls
e/
on
+
d
im
on
m
or
un
ce
is
lls
ed
-d
on
or
ce
lls
Antibody-secreting cells
per 106 cells
F
t/w
tc
g1
cr
e/
+
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
2w
2w
t/w
tc
g1
cr
e/
+
Suppl. Fig. X: Reduced memory immune response of Grb2fl/fl Cγ1cre/+ cells to glycoprotein
B
71
Ergebnisse
Abb. 26: Schwächere Gedächtnisantwort von Grb2fl/fl cγ1cre/+ B-Zellen gegen Glykoprotein B (gB) des humanen
Zytomegalovirus verglichen mit Kontrollzellen. A) Grb2fl/fl cγ1cre/+ und Grb2wt/wt cγ1cre/+ Mäuse (10 Generationen auf
C57BL/6 zurückgekreuzt) wurden ein Mal mit 4 µg und zwei Mal mit 2 µg gB in Alum i.p. immunisiert. Die gB
spezifischen IgM und IgG Serumtiter wurden mittels ELISA über die Zeit bestimmt (B). 134 Tage nach der ersten
Immunisierung wurde der Anteil an B220+, IgG+, gB-bindenden Zellen in der Milz bestimmt (C und D). Es wurden
8x103 CD19+B220+IgG1+gB-bindende Milzzellen i.v. in Rag1-/- Rezipienten übertragen. Die CD19+ Zellen wurden
negativ über eine komplementvermittelte T-Zelllyse (anti-Thy1, anti-CD4, anti-CD8) und danach positiv mit anti-CD19
Beads magnetisch angereichert. Die transferierten gB spezifischen Gedächtnis B-Zellen wurden sechs Tage nach dem
Transfer durch die Gabe von 2 µg virusartigen Partikeln in PBS i.v. (enthalten gB) reaktiviert. gB spezifische
Immunglobulinlevel wurden mittels ELISA über die Zeit bestimmt (E). Die Rezipiententiere wurden 33 Tage nach dem
Transfer der Gedächtniszellen geopfert und ein gB spezifischer ELISPOT wurde durchgeführt (F). Für B), C) und D):
Grb2wt/wt Cγ1cre/+ n=6 mäuse; Grb2fl/fl Cγ1cre/+ n=6 Mäuse; Für C) und D) nicht immunisiert =2 Mäuse; Für E) und F)
Grb2wt/wt Cγ1cre/+ Donorzellen n=3 Mäuse; Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Donorzellen n=5 Mäuse; naive Donorzellen =1 Maus. Für
die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; *p<0,01.
6.1.5.6
Untersuchung zur Rolle von Grb2 in der Gedächtnisantwort gegen NP-CGG
Grb2 verstärkt die Gedächtnisantwort von B-Zellen (Abb. 18, Abb. 19 und Abb. 26). Die
bisherigen in vivo Experimente basieren auf einem Transfersystem, in dem die Gedächtnis BZellen ohne T-Zell Hilfe in Mäusen mit einem leeren B-Zell Kompartment reaktiviert wurden.
Hier soll untersucht werden, ob T-Zell Hilfe die reduzierte Gedächtnisantwort der Grb2-/Gedächtnis B-Zellen ausgleichen kann. Dazu wurden Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse und Grb2fl/fl mb1+/+
Kontrolltiere zunächst zwei Mal mit NP-CGG immunisiert, welches eine thymus-abhängige
Immunantwort auslöst (Abb. 27A). Die Primär- und Sekundärantwort für IgG1 und IgG2c waren
unverändert, während die primäre IgM-Antwort gegen NP erhöht war (Abb. 27B). Die Zahl der
B220+IgG1/IgG2a/IgG2b+NP-bindenende Zellen war 106 Tage nach der letzten Immunisierung in
Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen leicht aber nicht signifikant erniedrigt (Abb. 27C). Es wurden je 3x102
sortierte CD19+B220+IgG+NP-bindende Milzzellen zusammen mit naiven Milzzellen als
Füllerzellen i.v. in immunkompatible wt Rezipienten übertragen (Abb. 27D). Es gab zwei
Gruppen von Rezipienten. Eine Gruppe naiver wt Mäuse und eine weitere Gruppe, die vor dem
Transfer der Gedächtniszellen mit CGG immunisiert wurde. Fünf Tage nach dem Transfer
wurden die Gedächtniszellen durch die Gabe von 50 µg/Maus NP-CGG reaktiviert. Die T-Zellen
aus den Rezipienten, die mit CGG vorimmunisiert waren sollten in der Lage sein den
übertragenen NP-spezifischen Gedächtnis B-Zellen spezifische Hilfe zur Verfügung zu stellen, im
Gegensatz zu T-Zellen aus den naiven Rezipienten (Abb. 27E). Die IgM-Antwort gegen NP war
in allen vier Gruppen gleich. Die NP-spezifische IgG-Antwort dagegen war in den vorgeprimten
Tieren tendenziell stärker als in den naiven Rezipienten. Die Immunantwort der Mäuse, die
Grb2fl/fl mb1cre/+ Gedächtniszellen bekommen hatten war tendenziell niedriger als in denen die
72
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Grb2fl/fl mb1+/+ Gedächtniszellen bekommen hatten. Dies war auch in bei den Rezipienten zu
beobachten, die mit CGG vorimmunisiert wurden (Abb. 27F). Der Unterschied ist aber jeweils
nicht signifikant, was an der geringen Zahl der übertragenen Gedächtniszellen liegen könnte.
Auch die Affinitätsreifung der NP-spezifischen Antikörper war in Mäusen, die Grb2fl/fl mb1cre/+
Gedächtniszellen bekommen hatten gegenüber Tieren, die Grb2fl/fl mb1+/+ Gedächtniszellen
bekommen hatten, unabhängig von der Rezipientengruppe tendenziell niedriger (Abb. 27G).
73
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
56
0.05
63
0
7
14
21
28
56
0.05
0
63
7
21
28
0.00%±0.00
mb
5
4
3
2
1
e/
+
+
H-2Kb
cr
+/
immunisation with CGG
IgG
***
70
40
10
1
IgM
70
200
150
100
50
IgG
Spleen
Grb2fl/fl mb1+/+
60
50
40
30
20
10
0
0
0
2
4
6
time(d)
8
10
0
2
Grb2fl/fl mb cre/+
non immunised
no
tp
rim
ed
4
6
8
10
C
immunisation with NP-PE
postTransfer
G
NP4/NP17-specific IgG (AU)
NP17-specific IgM (AU)
250
H-2Kd
NP4-specific IgG (AU)
F
im
100
no
n
G
rb
2
E
0
IgDb
immunisation with NP-PE
immunisation with NP-PE
1.5
Affinity
IgG
not primed
1.0
CGG primed
0.5
0.0
7
10
time(d)
Grb2fl/fl mb1+/+ donor cells
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
non immunised - donor cells
time(d)
Grb2fl/fl mb1+/+ donor cells
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
non immunised - donor cells
Suppl. Fig. X: T cell help does not seem to compensate
for the reduced memory immune
fl/fl
+/+
74
63
0
like C57BL/6
like BALB/c
mixed allo-/haplotype
Blood
56
+
fl/fl
+/+
B220
IgG+NP+
Grb2
NP-APC
recipient mice
MHC I haplotypes
Blood
49
6Grb2fl/fl mb1cre/+
mb
2.83%±2.48
B220+ IgD allotypes
42
IgG+ before transfer spleen
Grb2fl/fl mb1+/+
non immunised
NP-PE+
D
35
time(d)
m
b
Grb2
3.31%±1.95
IgDa
14
fl
cre/+
fl/fl
mb1+/+
Grb2fl/fl mb1Grb2
fl/fl
cre/+
mb
NP-PE
49
b1
B220+IgG1/IgG2a/IgG2b+
+/+
+/+
Grb2fl/flfl/fl
mb1
Grb2
mb1
d134
fl/fl
cre/+
Grb2
42
time(d)
time(d)
C
35
se
d
49
fl/
42
m
35
rb
2
28
G
21
NP-CGG (Boost)
Total cells (x103)
14
0.5
fl
7
5
fl/
0
0.5
50
CGG-specific IgG (AU)
1.5
NP-CGG (Boost)
IgG2c
un
i
NP-CGG (Boost)
5
500
m
15
IgG1
ed
*
ante Transfer
50
pr
im
NP17-specific IgG1 (AU)
NP17-specific IgM (AU)
IgM*
G
ELISA
immunisation with NP-PE
B150
d0 reactivation
Adoptive transfer
2
d-5 NP27-CGG in PBS i.v. d10
of 3x10
+
+
50µg
IgG CD19 NPrecipient
binding splenic
(immunogenic
cells with matched
matched mice;
filler cells i.v.
ELISPOT
ELISA
CGG primed or not) immunisation
with NP-PE
immunisation with NP-PE
G
NP27-CGG in Alum i.p.
d0
d28
d134
50µg 50µg
donor
NP17-specific IgG2c (AU)
A
Grb2 mb1 donor cells in CGG primed mice
fl/fl Knockoutmaus
B-Zell
spezifische
Grb2
Grb2
mb cre/+ donor cells in CGG primed mice Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells in CGG primed m
Grb2fl/fl mb cre/+ donor cells
in CGG
primed mice
non immunised - donor cells in CGG primed mice Legend
Legend
Ergebnisse
Abb. 27: Untersuchung zur Rolle von Grb2 in der Gedächtnisantwort gegen NP-CGG.
A) Grb2fl/fl mb1cre/+
und Grb2fl/fl mb1+/+ Mäuse wurden zwei Mal mit i.p. mit 50 µg NP27-CGG in Alum immunisiert.
Die NP-spezifischen IgM, IgG1 und IgG2c Immunglobulin Serumtiter wurden mittels ELISA
über die Zeit bestimmt (B). 134 Tage nach der ersten Immunisierung wurde der Anteil an B220 +,
IgG+, NP-bindenden Zellen in der Milz bestimmt (C). Es wurden 3x102 sortierte B220+, IgG+, NPbindende Milzzellen zusammen mit Milzzellen von naiven immunologisch kompatiblen wt
Mäusen als Füllerzellen i.v. in immunologisch kompatible Rezipienten übertragen. Donortiere
und Rezipienten haben einen gemischten BALB/c / C57BL/6 Hintergrund, weshalb es nötig ist
Abstoßungsreaktionen zwischen Donor und Rezipient zu minimieren. Die immunologische
Kompatibilität wurde über den MHCI Haplotyp und den Immunglobulin Allotyp bestimmt (D).
Die Sortierung der Gedächtniszellen erfolgte in drei Schritten. Als erstes wurden die CD19 +
Zellen
über
magnetische
Beads
angereichert.
Die
weiteren
Schritte
nutzen
durchflusszytometrische Methoden. Im zweiten Schritt wurden die B220+, IgG+ Zellen mit einer
hohen durchflussrate angereichert und im dritten Schritt wurden daraus die B220+, IgG+, NPbindenden Zellen sortiert. Die Rezipienten wurden 22 vor dem Transfer der Gedächtniszellen
entweder mit 50 µg CGG oder nicht immunisiert und 27 Tage nach der CGG-Immunisierung
wurde der CGG spezifische Immunglobulintiter mittels ELISA bestimmt (E). Die transferierten
NP spezifischen Gedächtnis B-Zellen wurden fünf Tage nach dem Transfer durch die Gabe von
50µg NP27-CGG in PBS i.v. reaktiviert. NP spezifische Immunglobulinlevel (F), sowie die
Affinität (G) wurden mittels ELISA über die Zeit bestimmt (F). Für B) und C) Grb2fl/fl mb1+/+ n=5
Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=5 Mäuse; For C) nicht immunisiert =2 Mäuse; Für F) Grb2fl/fl mb1+/+
Donorzellen n=6 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Donorzellen n=3 Mäuse; naive Donorzellen =2 Mäuse;
Grb2fl/fl mb1+/+ Donorzellen n=5 CGG vorbehandelte Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ Donorzellen n=3
CGG vorbehandelte Mäuse; naive Donorzellen =2 CGG vorbehandelte Mäuse. Für die Statistik
wurde der T-Test verwendet; *p<0,05.
6.1.6 Keine erhöhte Autoimmunität in alternden Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen
B-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse bilden mehr IgM Autoantikörper und weisen mehr
Antikörperablagerungen in der Niere auf, was allerdings zu keinen Autoimmunerkrankungen
führt (Jang et al. 2011). Um dies zu belegen, sollte untersucht werden, wie sich das Fehlen von
Grb2 in alternden Mäusen auswirkt. Es wurden Schnitte von Hep-2 Zellen verwendet, um zu
untersuchen, ob es im Serum von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen mehr IgG Antikörper gegen
körpereigene Antigen im Zellkern (ANA), wie z.B. gegen DNA gibt. Dazu wurden die Hep-2
Zellen mit Serum aus den B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen inkubiert und IgG Antikörper aus
75
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
dem
Serum,
die
an
Antigene
der
Hep-2
Zellen
gebunden
hatten
wurden
über
fluoreszenzgekoppelte anti-IgG Antikörper nachgewiesen. Das Serum von 50 Wochen alten BZell spezifischen Grb2-/- Mäusen enthielt gegenüber 50 Wochen alten Kontrollmäusen keine
erhöhten IgG Autoantikörperlevel. Auch das Muster der Antikörperbindung, das Rückschlüsse
auf die Spezifität von Autoantikörpern zulässt (Mahler & Fritzler 2012) war nicht deutlich
verändert (Abb. 28A, B). Zusätzlich zeigt ein dsDNA ELISA über die Zeit, dass der Spiegel
autoreaktiver anti-dsDNA-IgG Antikörper in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen bis zu einem
Alter von 42 Wochen unauffällig war (Abb. 28C). B-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse weisen bis zu
einem Alter von 50 Wochen noch keine erhöhten IgG ANA-Autoantikörpertiter auf. Ergänzend
wurde ein Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) Test durchgeführt. Harnstoff fällt als Endprodukt des
Eiweißstoffwechsels an und wird in der Niere aus dem Blut gefiltert und über den Urin
abgegeben. Bei einer gestörten Nierenfunktion sammelt sich Harnstoff im Blut an und kann im
Serum nachgewiesen werden. Im Serum von 64 Wochen alten B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
war kein erhöhter Harnstofflevel festzustellen (Abb. 28D). Damit gab es keine Hinweise auf eine
beeinträchtigte Nierenfunktion in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen. Zusammenfassend zeigen
Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse im Alter keine Anzeichen für erhöhte IgG Autoantikörperlevel oder eine
beeinträchtigte Nierenfunktionen.
76
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Tota
Tota
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
20
*
10
Ergebnisse
0
A
control
(20 weeks)
Grb2fl/fl mb1+/+
100 µm
50 weeks
pos. control
(old MLR-lpr)
Grb2fl/fl mb1cre/+
ANA
Anti Nuclear Antibodies
(Mean fluorescence intensity)
B
C
200
grb2fl/flmb1+/+ 50 weeks
grb2fl/flmb1cre/+ 50 weeks
old MLR-lpr
150
grb2fl/flmb1+/+ 20 weeks
100
50
0
D
Anti-dsDNA (AU)
BUN
IgG anti-dsDNA
30
Blood urea nitrogen
grb2fl/flmb1wt/wt
grb2fl/flmb1cre/wt
20
100
mg/dl
IgG anti-dsDNA (AU)
1000
10
10
18
0
24
30
weeks
36
42
Grb2fl/flmb1+/+
Grb2fl/flmb1cre/+
Survival of Grb2 fl/fl mb1cre cre/wt mice weeks:Survival proportions
100
B-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
ival
p=0.19
75
Grb2fl/fl mb1wt/wt
Grb2fl/fl mb1cre/wt
77
Ergebnisse
Abb. 28: Keine erhöhte Autoimmunität in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen. A) Objektträger mit Schnitten von Hep-2
Zellen wurden mit 1:50 vorverdünntem Serum aus 50 Wochen alten Grb2fl/fl mb1+/+ oder Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen
inkubiert. Als Kontrollen dienten ein Gemisch aus Seren von alten MLR-lpr Mäusen und das Serum einer 20 Wochen
alten Grb2fl/fl mb1+/+ Maus. IgG-Antikörper, die gegen Bestandteile von Hep-2 Zellen gerichtet waren wurden über
einen Alexa Fluor 488 gekoppelten Ziege anti-Maus IgG (H+L) Antikörper detektiert. Gezeigt ist beispielhaft ein
Präparat pro Maus, wobei je zwei Beispiele für Grb2fl/fl mb1+/+ bzw. Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse ausgewählt wurden. B)
Zeigt die Quantifizierung von A anhand der durchschnittlichen Fluoreszenzstärke der Hep-2 Zellkerne. Pro Maus wurde
die durchschnittliche Fluoreszenzstärke von fünf Hep-2 Zellkernen mit ImageJ bestimmt und der Mittelwert gebildet.
Die Mittelwerte für die Fluoreszenz der Proben der einzelnen Mäuse sind grafisch dargestellt. C) Maxisorp-Platten
wurden erst mit Poly-L-Lysin und dann mit doppelstrang-DNA inkubiert. Es wurde 1:50 vorverdünntes Serum, das zu
unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen wurde, auf die Platten gegeben. Dann wurden an doppelstrang-DNA
gebundene IgG Antikörper über einen anti-IgG alkaline Phosphatase gekoppelten Antikörper und die Umsetzung von
Para-Nitrophenylphosphat detektiert. D) Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) von 64 Wochen alten Grb2fl/fl mb1+/+and
Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit bestimmt (Stanbio). Für A) und D) Grb2fl/fl
mb1+/+ n=3 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=5 Mäuse; Für C) Grb2fl/fl mb1+/+ n=3 Mäuse; Grb2fl/fl mb1cre/+ n=6 Mäuse; Für die
Statistik wurde der T-Test verwendet.
6.2 T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Grb2 hat in heterozygoten Grb2 Knockout Mäusen, sowie in T-Zell spezifischen Grb2 Knockout
Mäusen einen Einfluss auf die T-Zell Entwicklung und Aktivierung (Gong et al. 2001; Jang et al.
2010). Nachfolgend wurden diese Aspekte, sowie die Rolle von Grb2 in T-Helferzellpopulationen
weiter untersucht. Dafür wurden Grb2fl/fl Mäuse mit Lckcretg Mäusen verpaart, die Cre unter der
Kontrolle des proximalen Lck Promotors ab dem Übergang vom DN2 zum DN3
Entwicklungsstadium exprimieren (Shimizu et al. 2001). Außerdem wurden Mäuse in die Cre
unter der Kontrolle des CD4 Promotors eingebracht wurde und die Cre in der Entwicklung ab
dem CD4+CD8+ doppelt positiven T-Zell Stadium exprimieren mit Grb2fl/fl Mäusen verpaart.
Durch die Deletion von Grb2 in unterschiedlichen Stadien der T-Zell Entwicklung ist es möglich
Rückschlüsse auf die Wirkung von Grb2 im Verlauf der T-Zell Entwicklung zu ziehen.
6.2.1 Erfolgreiche gewebespezifische Depletion von Grb2 in T-Zellen
Die Deletion von Grb2 in CD4-CD8- T-Zellen, CD4+CD8+ T-Zellen und in CD4+ bzw. CD8+
einzel positiven T-Zellen im Thymus von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen wurde mittels Western-Blot
untersucht. In CD4-CD8- Grb2fl/fl Lckcretg T-Zellen war die Grb2 expression tendenziell reduziert
und ab den CD4+CD8+ T-Zellen war kein Grb2 mehr nachweisbar (Abb. 29A). Auch in T-Zellen
aus der Peripherie von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen konnte kein Grb2 mehr nachgewiesen werden
(Abb. 29B), weswegen Grb2 in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen erfolgreich ausgeknockt wurde.
78
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A Thymus
Grb2fl/fl
double
positive
CD4+
CD4
Lckcre
double
negative
-
+
-
+
-
+
-
+
CD8+
α -Grb2
CD8
α -β-Aktin
B
Spleen
Grb2fl/fl
Lckcre
CD3
T cells
-
-
+
+
B cells
α -Grb2
B220
α -β-Aktin
Abb. 29: T-Zell spezifische, genetische Depletion von Grb2 im Thymus und in der Peripherie von Grb2fl/fl
Lckcretg Mäusen. A) Thymocyten wurden auf CD4 und CD8 angefärbt. B) Milzzellen wurden auf B220 und CD3
angefärbt. A) Es wurden doppelt negative T-Zellen (CD4-CD8-), doppelt positive T-Zellen (CD4+CD8+), CD4
einzelpositive T-Zellen (CD4+CD8-), CD8 einzelpositive T-Zellen (CD4-CD8+) aus dem Thymus und B) T-Zellen
(CD3+B220-), sowie B-Zellen (CD3-B220+) aus der Milz über durchflusszytometrische Sortierung aufgereinigt. Gezeigt
sind Überlagerungsbilder der sortierten reanalysierten Zellpopulationen. Das Verhältnis der Populationen zueinander
spiegelt dabei nicht die Situation in der Ausgangssituation vor der Sortierung da. Lysate der sortierten Zellen wurden
für einen Immunoblot verwendet und mit anti-Grb2 (3F2) oder anti-Aktin (Cedarlane) Antikörpern auf den Grb2- bzw.
Aktingehalt untersucht.
cell specific deletion of Grb2 in the thymus and periphery of Grb2
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Lckcre mice. A) Splenic
cells were
79
Ergebnisse
6.2.2 Die T-Zell spezifische Grb2 Defizienz beeinträchtigt die frühe T-Zell Entwicklung
Die frühe T-Zell Entwicklung in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wurde
durchflusszytometrisch analysiert. Cre unter der Kontrolle des proximalen Lck Promotors wird ab
dem Übergang vom DN2 zum DN3 Entwicklungsstadium exprimiert (Shimizu et al. 2001),
während Cre unter der Kontrolle des CD4 Promotors später in der Entwicklung ab dem
CD4+CD8+ doppelt positiven T-Zell Stadium exprimiert wird. In der Grb2fl/fl CD4cretg Maus
waren in den doppelt negativen Stadien, in denen CD4cre noch nicht exprimiert wird, keine
Veränderungen in den Populationen vorhanden. In der Grb2fl/fl Lckcretg Maus waren die doppelt
negativen Stadien ab der Expression von Lckcre verändert. Es waren mehr DN3 T-Zellen und
weniger DN4 T-Zellen vorhanden (Abb. 30A). In CD4+CD8+ doppelt positiven T-Zellen wurde
die Hochregulation von CD5 und CD69 untersucht, die abhängig von der TZR-Expression und
Signalleitung sind und mit positiver Selektion in Verbindung gebracht werden (Azzam et al.
1998; Dutz et al. 1995; Swat et al. 1993; Bendelac et al. 1992; Testi et al. 1988). Der Anteil der
CD5+CD69+ Zellen an den CD4+CD8+ T-Zellen war in der Grb2fl/fl CD4cretg Maus und in der
Grb2fl/fl Lckcretg Maus gegenüber den Kontrollmäusen unverändert (Abb. 30B). Die Reifung der
B-Zellen wurde auch anhand des Reifungsmarkers HSA (CD24) untersucht. Die Zahl der
TCRβ+HSAhigh Zellen war in der Grb2fl/fl CD4cretg Maus unverändert, während sie in der Grb2fl/fl
Lckcretg Maus reduziert war. Dies kann mit der früheren Deletion von Grb2 in der Grb2fl/fl
Lckcretg Maus erklärt werden. Die Zahl der reiferen TCRβ+HSAlow Zellen war sowohl in der
Grb2fl/fl CD4cretg Maus als auch in der Grb2fl/fl Lckcretg Maus reduziert (Abb. 30C). Grb2 ist
wichtig für die T-Zell Entwicklung und spielt sowohl in den frühen doppelt negativen Stadien, als
auch in der späteren Entwicklung im Thymus eine Rolle.
80
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
-C
D
25
-
+
+
-C
D
25
C
D
25
+
D
44
C
C
N
2
N
3
C
N
4
D
44
TH DN % of DN
N
1
D
Grb2fl/fl Lckcretg
D
CD44
Grb2fl/fl
D
DN3
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cretg
D
44
DN4
% of parent
DN2
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
D
Grb2
DN1
TH F3 percent of parent
B
D
44
Grb2fl/fl CD4cretg
C
Thymus
C
D
25
+
- CD4- CD8A Gr1- CD11b- B220
fl/fl
***
80
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lckcretg
70
% of parent
60
50
*
40
30
20
10
-C
D
25
-
D
25
+
D
44
C
N
4
D
N
3
D
N
2
D
D
D
44
C
D
44
C
C
N
1
D
Grb2fl/fl CD4cretg
-C
+C
D
+C
D
D
44
CD25
C CD4+CD8+ Grb2fl/fl
25
+
25
-
0
TH F5 DP pos percent of parent fuer Abb
CD5+CD69+
17.5
% of parent
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
TH CD5 CD69 fuer Abb
+
0.0
D
69
+
C
D
5
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
17.5
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lckcretg
C
CD69
2.5
% of CD4+ CD8+
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
C
D
69
+
0.0
C
TH F2 percent of parent
H
H
**
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lckcretg
SA
H
hi
gh
SA
hi
gh
lo
w
*
H
hi
gh
lo
w
TH HSA TCRb
SA
hi
gh
*
hi
gh
Grb2fl/fl Lckcretg
% of parent
Grb2fl/fl
TC
R
HSA (CD24)
TCRhigh
HSAlow
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
SA
F
% of parent
TCRhighHSAhigh
Grb2fl/fl CD4cretg
hi
gh
Grb2fl/fl
TC
R
E
D
5+
CD5
TC
R
TC
R
TCRβ
Fig. X: Grb2 influences early T cell development positively. Deletion of Grb2 at the double
81
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 30: Grb2 ist wichtigfür die frühe T-Zell Entwicklung. Dabei führt die Deletion von Grb2 im doppelt
negativen 3 (DN3) Stadium (Lckcre) zu einer stärker beeinträchtigten Entwicklung, als die Deletion im
CD4+CD8+ Stadium. Thymuszellen von Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wurden mit fluochrom
gekoppelten Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. A) und B) Grb2-CD11b-B220-CD4-CD8- TZellen wurden über die CD25 und CD44 Expression in die doppelt negativen Zellstadien 1,2,3 und 4 unterteilt. C) und
D) Die positive Selektion wurde über den Anteil von CD5+CD69+ Zellen an den CD4+CD8+ T-Zellen untersucht. E)
und F) Die Reifung der T-Zellen im Thymus wurde über den Anteil der TCRβ+HSAhigh(CD24) funktionell unreiferen
und den TCRβ+HSAlow(CD24) funktionell reiferen T-Zellen an den Thymozyten untersucht. Für A) und B) Grb2fl/fl
CD4crewt n=13 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=16 Mäuse; Grb2fl/fl CD4Lckcretg n=16 Mäuse;
Für C), D), E) and F) Grb2fl/fl CD4crewt n=13 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=5 Mäuse;
Grb2fl/fl Lckcretg n=5 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Die
Grb2fl/fl Lckcretg Maus hat einen gemischten BALB/c / C57BL/6 Hintergrund, während die Grb2 fl/fl CD4cretg Maus 10
Generationen auf den C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzt wurde. Der Großteil der Daten für die Grb2fl/fl Lckcretg
Maus stammt aus Experimenten von Sonja Lacher.
T-Zell spezifische Grb2 defiziente Mäuse zeigen eine reduzierte Zahl an CD4+ und
CD8+ T-Zellen im Thymus und in der Peripherie, zudem ist der Anteil der
aktivierten CD4 und CD8 T-Zellen in der Milz erhöht.
Die Gesamtzellzahlen an CD4+CD8+, CD4+ und CD8+ T-Zellen im Thymus bzw. CD4+ und CD8+
6.2.3
T-Zellen in der Peripherie von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wurden
untersucht. Es gab keine signifikanten Unterschiede für die Zahl an CD4+CD8+, CD4+ und CD8+
T-Zellen im Thymus von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen. In Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen war die Zahl der
CD4+CD8+ T-Zellen tendenziell reduziert, während die CD4+ und CD8+ T-Zellen signifikant
reduziert waren (Abb. 31A). Im Lymphknoten und in der Milz von Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl
CD4cretg Mäusen war die Zahl an CD4+ und CD8+ T-Zellen signifikant reduziert, wobei die
Reduktion in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen deutlich stärker ausfiel (Abb. 31B und C). In der Milz war
der Anteil der aktivierten (CD69+) CD4+ und CD8+ T-Zellen an der jeweiligen Population sowohl
in Grb2fl/fl Lckcretg als auch in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen leicht erhöht. Der Anteil der aktivierten
Zellen in den Lymphknoten war in beiden Mäusen gleich (Abb. 32). T-Zell spezifische Grb2
defiziente Mäuse weisen abhängigkeit vom Zeitpunkt der Grb2 Deletion in der T-Zell
Entwicklung reduzierte Zahlen an CD4+ und CD8+ T-Zellen im Thymus und in der Peripherie auf.
82
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
D
8
D
4
D
4
+
C
D
8
+
TH CD4+ CD8+ GZZ
C
Grb2fl/fl Lckcretg
C
Grb2fl/fl
+
TH F1 total cells
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
C
CD4 CD8+
B
+
Grb2fl/fl CD4cretg
CD8+
CD4
Thymus
CD4+
Grb2fl/fl
+
Total cells (x106)
A CD3+
100
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lckcretg
Total cells (x106)
p=0.08
75
50
25
***
***
+
C
D
8
+
D
4
C
D
4
+
C
CD8
C
D
8
+
0
CD8+
SP F1 total cells
20
*
15
*
10
5
SP CD4 CD8 GZZ
C
C
D
4
+
CD4
0
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
+
D
D
8
Grb2fl/fl CD4cretg
Grb2fl/fl
Total cells (x106)
CD4+
Spleen
C
***
Total cells (x106)
14
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lckcretg
12
10
**
8
6
4
2
F
CD8+
1.5
1.0
0.5
C
D
4
LN CD4 CD8 GZZ
C
Grb2fl/fl Lckcretg
Total cells (x106)
CD4
+
*
2.0
0.0
Grb2fl/fl
D
8
LN F1 total cells
*
2.5
+
Grb2fl/fl CD4cretg
D
8
Grb2fl/fl
+
CD4+
Total cells (x106)
Lymph Node
E
C
CD8
C
D
4
+
0
*
18
14
10
6
2
1.0
*
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lckcretg
0.5
+
D
8
C
C
CD8
D
4
+
0.0
Fig. X: Grb2 influences T cell numbers in the thymus and in the periphery. Deletion of Grb2
83
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 31: T-Zell spezifische Grb2 defiziente Mäusen zeigen verringerte T-Zellzahlen im Thymus und in der
Peripherie. Die Deletion von Grb2 ab dem doppelt negativen 3 Stadium (Lckcre) führt zu einer früheren und
ausgeprägteren Reduktion der T-Zellen als eine Deletion ab dem dem CD4+CD8+ Stadium (CD4cre). T-Zellen des
Thymus (A), der Milz (C) oder der Lymphknoten (E) wurden durchflusszytometrisch auf die CD4 und CD8 Expression
untersucht. Die Gesamtzellzahl für A), C) und E) wurden berechnet und in B), D) und F) dargestellt. Bei den Grb2fl/fl
CD4cretg Mäusen wurden nur die inguinalen (Leisten) Lymphknoten untersucht, bei den Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen
wurden alle auffindbaren Lymphknoten verwendet. Für B) Grb2fl/fl CD4crewt n=13 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8
Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=15 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcretg n=15 Mäuse; Für D) Grb2fl/fl CD4crewt n=13 Mäuse; Grb2fl/fl
CD4cretg n=8 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl Lcktg n=10 Mäuse; Für E) Grb2fl/fl CD4crewt n=8 Mäuse;
Grb2fl/fl CD4cretg n=6 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=9 Mäuse; Grb2fl/fl Lcktg n=10 Mäuse; Für die Statistik wurde der TTest verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Der Großteil der Daten für die Grb2 fl/fl Lckcretg Maus stammt aus
Experimenten von Sonja Lacher.
84
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Grb2fl/fl
Spleen
CD69+
CD69+
SP F4 percent of parent
**
17.5
15.0
12.5
10.0
***
7.5
5.0
2.5
0.0
D
C
C
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
D
D
4-
C
D
8+
0.0
C
CD69+
15.0
D
4+
CD69+
4..75%
5.6%
C
12.5%
12.7%
17.5
8-
CD69+
LN F4 percent of parent
CD8
% of CD69+ in population
8.32%
10.1%
C
Lymph node+
CD4+
CD4- CD8-
%of max
D
4-
CD69+
D
8+
3.64%
4.35%
8-
%of max
CD69+
CD8+
13%
18.7%
C
CD4+
8.07%
7.68%
D
4+
Grb2fl/fl CD4cretg
CD4- CD8-
% of CD69+ in population
A
C
CD69+
B
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lckcretg
Spleen
10
*
5
0
D
C
C
D
D
8+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
C
CD69+
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
8-
CD69+
3,53.%
3.09%
% of CD69+ in population
6.93%
8.18%
D
4C
CD69+
LN CD4 CD8 CD69+
CD8
C
4,25%
7.42%
%of max
Lymph node+
CD4+
CD4- CD8-
D
4C
CD69+
D
8+
CD69+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
15
8-
CD69+
***
20
C
CD69+
25
D
4+
3.4%
4.39%
D
4+
11.4%
19.3%
C
%of max
2.44%
3.87%
SP CD4 CD8 CD69+
CD8+
% of CD69+ in population
CD4+
CD4- CD8-
85
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 32: Grb2 Defizienz führt zu mehr aktivierten (CD69+) T-Zellen in der Milz naiver Mäuse. A) Der Anteil der
aktivierten T-Zellen wurde für CD4+ und CD8+ Zellen basierend auf der CD69 Expression mittels Durchflusszytometrie
bestimmt. A) Milz und Lymphknotenzellen von Grb2fl/fl CD4crewt and Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen. B) Milz und
Lymphknotenzellen von Grb2fl/fl Lckcrewt und Grb2fl/fl Lcktg Mäusen. Für A) Grb2fl/fl CD4crewt n=13 Mäuse; Grb2fl/fl
CD4cretg n=8 Mäuse; Für B) Grb2fl/fl Lckcrewt n=8 Mäuse; Grb2fl/fl Lcktg n=7 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test
verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Der Großteil der Daten für die Grb2fl/fl Lckcretg Maus stammt aus
Experimenten von Sonja Lacher.
6.2.4
Die T-Zell spezifsiche Grb2 Defizienz beeinflusst die Zahl von naiven und
Gedächtnis T-Zellen in der Peripherie
Der Einfluss von Grb2 auf die naiven und die gedächtnis T-Zellen wurde in der Grb2fl/fl Lckcretg
Maus und der Grb2fl/fl CD4cretg Maus vergleichend untersucht. Das Verhältnis von naiven zu
Gedächtnis T-Zellen war in Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen im Vergleich zu
Kontrolltieren verschoben. In der Milz von Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen und im
Knochenmark von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen waren im Verhältnis weniger naive CD4+ T-Zellen
und mehr CD4+ effektor Gedächtnis T-Zellen (TEM) in der CD4+ Population vorhanden als in
Kontrolltieren (Abb. 33A,B,C,D). Im Knochenmark von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen gab es keine
signifikanten Verschiebungen zwischen den CD4+ Populationen (Abb. 33C,D). In der Milz von
Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen waren im Verhältnis weniger naive CD8+ T-Zellen
und mehr CD8+ TEM und zentrale Gedächtnis T-Zellen (TCM) in der CD8+ Population vorhanden
als in Kontrolltieren (Abb. 34A,B). Dies gilt auch für die CD8+ T-Zellen im Knochenmark von
Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen, wobei die Grb2 defizienten TEM Zellen nur tendenziell erhöht waren
(Abb. 34C,D). Die CD8+ T-Zellen im Knochenmark von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen weisen einen
signifikant erhöhten Anteil an TEM Zellen auf, während die anderen Populationen nicht signifikant
verändert sind (Abb. 34C,D).
Neben relativen Veränderungen von T-Zell Populationen wurden auch deren Gesamtzellzahlen
untersucht. Die Zahl der naiven CD4+ und CD8+ T-Zellen war in der Milz und in den
Lymphknoten der Grb2fl/fl Lckcretg Maus stark reduziert, während die Reduktion in der Grb2fl/fl
CD4cretg Maus moderater ausfiel (Abb. 33; Abb. 34). Die zentralen CD4+ und CD8+ Gedächtnis
T-Zellen waren in Milz und Lymphknoten der Grb2fl/fl Lckcretg Maus reduziert (Abb. 33; Abb.
34). Die CD4+ effektor Gedächtnis T-Zellen (TEM) der Grb2fl/fl Lckcretg Maus waren in der Milz
signifikant und in den Lymphknoten tendenziell reduziert (Abb. 33). Die CD8+ effektor
Gedächtnis T-Zellen (TEM) der Grb2fl/fl Lckcretg Maus waren in der Milz unverändert und in den
Lymphknoten reduziert (Abb. 34). Im Gegensatz zu den reduzierten Gedächtnis T-Zellzahlen in
Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen waren die Gedächtnis T-Zellzahlen in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen nicht
signifikant verändert (Abb. 33; Abb. 34). Zusammengefasst weisen T-Zell spezifische Grb2-/Mäuse einen niedrigeren Anteil naiver T-Zellen an den CD4+ und CD8+ T-Zellpopulationen auf
86
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
und haben dafür einen höheren Anteil an Gedächtnis T-Zellen. Die Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl
CD4cretg Mäuse haben insgesamt weniger naive B-Zellen und die Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse weisen
zusätzlich reduzierte Gedächtnis T-Zellzahlen auf.
87
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
T(CM)
37.8%±10.6
7.2%
±2.7
SP F3 CD4 percent of parent
***
70
B
50
30
20
7.5
5.0
2.5
0
Total cells (x106)
D
44
C
-
L
D
62
C
C
p=0.14
Total cells x10
6
25
0.6
0.5
0.4
p=0.25
0.3
0.2
0.1
0.0
EM
)
-
D
44
C
-
L
D
62
C
D
62
Grb2fl/fl mb1cre+/+
Grb2fl/fl mb1crecre/+
Total cells (x106)
*
1
0.5
***
D
44
C
M)
C
D
62
L
C
-
C
D
62
D
44
L
-
+
C
(T
+
+
C
C
D
62
L
+
L
C
D
62
C
D
44
-
D
44
C
C
D
44
+
C
C
(n
ai
ve
)
EM
)
(T
-
D
62
-
D
44
L
D
62
D
44
+
C
L
C
+
(T
C
D
62
L
M)
ai
ve
)
+
L
EM
)
-
0.0
D
62
-
C
D
44
C
+
C
L
D
62
C
+
L
+
C
L
D
62
C
***
9
Grb2fl/fl mb1cre+/+
5 fl/fl mb1crecre/+*
Grb2
*
(n
CD44
(T
D
44
C
M)
(T
C
LN CD4 CD44 CD62L GZZ
C
C
D
44
-
D
44
C
-
D
62
L
C
+
L
D
62
C
D
62
23.5%
±8.9
*
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
+
+
D
44
L
D
62
C
(n
ai
ve
)
EM
)
(T
D
44
-
+
D
44
-
LN CD4 CD44 CD62L % of CD4
L
+
C
C
(T
(n
ai
ve
)
C
M)
-
-
0
-
7.8%
±4.3
(T
+
D
44
C
-
L
D
62
D
62
C
D
62
C
50
C
22.4%
±14.2
EM
)
-
L
D
62
C
+
C
L
+
C
+
D
44
-
D
44
C
L
D
44
M)
(T
C
(n
ai
ve
)
EM
)
(T
-
L
D
62
C
+
D
44
C
LN F3 CD4 total cells
**
0.7
p=0.13
30.7%
±18.7
46.4%±14.2
EM
)
-
L
D
62
C
**
1
-
L
D
62
C
-
D
44
C
D
62
+
C
D
44
C
p=0.23
% of CD4+
+
C
+
Grb2fl/fl mb1cre+/+
Grb2fl/fl mb1crecre/+
2
0.8
75
23.3%
±13.7
(T
D
44
C
M)
-
C
C
D
62
D
62
L
L
+
C
+
C
C
-
L
D
62
C
D
44
-
D
44
+
D
44
(T
(n
ai
ve
)
EM
)
(T
D
44
C
-
L
D
62
M)
C
(T
+
L
+
L
LN F3 CD4 percent of parent
D
% of CD4+
12%
±6.9
***
0
D
44
5%
±4.8
C
20
10
8%
±5.5
Grb2fl/fl Lckcretg
13.6%
±11.1
+
30
D
62
6.7%
±4.1
Grb2fl/fl
69.5%±14.9
C
M)
-
% of CD4
40
-
38.1%±20.7
12.9%
±6.7
25.8%
±19.1
4
0
Grb2fl/fl CD4cretg
T(CM)
SP CD4 CD44 CD62L GZZ
Grb2fl/fl mb1cre+/+
fl/fl
Grb2
mb1crecre/+
3
***
50
C
54.6%±19.5
D
44
C
L
D
62
60
D
44
naive
Grb2fl/fl
***
70
46%
±9.5
10.52%
±4.6
+
C
+
L
D
62
C
18.5%
±10.4
(n
ai
ve
)
25.4%
±10
(T
(n
ai
ve
)
-
D
44
25.1%±9
C
15.5%
±13.3
C
C CD4+
0.0
SP CD4 CD44 CD62L % of CD4
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
52.3%±14.3
34.8%
±6.6
15.2%
±6.9
T(EM)
(T
19%
±5.4
13.6%
±7.1
CD44
Lymph Node
***
40
10
6.8%
±4.7
CD62L
SP F3 CD4 total cells
***
10.0
60
12.3%
±8..8
+
CD62L
Spleen
60.4%±9.4
Grb2fl/fl CD4cretg
Total cells x106
naive
Grb2fl/fl
% of CD4+
ACD4+
p=0.26
p=0.3
Abb. 33: Der Verlust von Grb2 verschiebt das Verhältnis von naiven zu aktivierten CD4+ T-Zellen in Grb2fl/fl
Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen. Insgesamt weisen beide T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäuse eine
Reduktion der naiven CD4+ T-Zellen auf. Die Deletion von Grb2 ab dem doppelt negativen 3 Stadium (Lckcre)
führt zu reduzierten Zahl an CD4+ Gedächtnis T-Zellen, wohingegen eine Deletion ab dem CD4+CD8+ Stadium
(CD4cre) die Gedächtnis T-Zellzahlen in naiven Mäusen nicht beeinflusst. CD4+ periphere T-Zellen wurden
durchflusszytometrisch auf die Expression von CD62L und CD44 untersucht. CD4+ Milzzellen (A), CD4+
Knochenmarkszellen (B) wurden in CD62L+CD44- (naive Zellen), CD62L+CD44+ zentrale Memoryzellen (TCM),
CD62L-CD44+ T-Effektor-Memoryzellen (TEM) und CD62L-CD44- Zellen aufgeteilt. Bei den Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen
wurden nur die inguinalen (Leisten) Lymphknoten untersucht, bei den Grb2 fl/fl Lckcretg Mäusen wurden alle
auffindbaren Lymphknoten verwendet. Gesamtzellzahlen und Anteil an den CD4+ T-Zellen für A und C. Für B) Grb2fl/fl
CD4crewt n=13 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl CD4Lcktg n=10 Mäuse;
Für D) Grb2fl/fl CD4crewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=5 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl Lcktg n=10
Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Der Großteil der Daten für die
Grb2fl/fl Lckcretg Maus stammt aus Experimenten von Sonja Lacher.
88
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Total cells x106
*
*
2
20
-
D
44
-
C
L
D
62
C
*
+
-
D
44
L
-
C
D
62
D
62
L
C
C
0.2
EM
)
-
+
C
D
44
L
D
62
-
C
C
C
D
62
D
62
L
C
L
+
L
D
62
C
1.3
*
*
Grb2fl/fl***
mb1cre+/+
1.0 fl/fl mb1crecre/+
Grb2
0.7
0.50
Grb2fl/fl mb1cre+/+
Grb2fl/fl mb1crecre/+
*
0.25
**
**
0.00
EM
)
-
C
D
62
D
44
L
-
+
C
(T
D
44
C
M)
+
D
62
L
C
C
D
62
C
L
D
62
C
L
+
C
+
C
D
44
C
D
44
-
L
D
62
-
+
D
44
C
p=0.54
(T
(n
ai
ve
)
EM
)
-
(T
D
62
C
D
44
C
L
D
62
+
C
D
44
C
L
M)
+
(T
C
(n
ai
ve
)
+
L
D
62
-
C
D
44
C
(T
D
44
C
M)
+
+
C
LN CD8 CD44 CD62L GZZ
C
-
C
L
D
62
D
44
D
44
-
+
D
44
D
62
C
+
C
L
D
62
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
(T
(n
ai
ve
)
EM
)
(T
D
44
-
L
+
D
44
D
44
C
(T
(n
ai
ve
)
C
M)
-
-
0.0
+
CD44
(T
D
44
C
(T
+
+
C
D
62
0.3
0.1
Total cells (x106)
4.7%
±5.4
0.4
0
LN CD8 CD44 CD62L % of CD8
7.7%
±4.7
*
0.5
-
5.3%
±9.2
3.5%
±1.7
0.6
10
C
39,5%
±15.71
C
*
-
48.1%±15.3
EM
)
-
30
C
21.95%
±12.04
Total cells x10
40
% of CD8+
69.2%±14
C
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
L
+
L
D
62
C
6
50
L
T(EM)
11.9%
±6.7
31.7%
±28
D
44
-
D
44
C
C
D
44
C
0.7
p=0.7
60
D
62
27.7%
±25.9
(n
ai
ve
)
EM
)
(T
-
L
D
62
-
+
C
70
20
5.3%
±3.1
LN F3 CD8 total cells
0.8
80
12.5%
±8.5
C
M)
-
D
62
C
D
44
L
D
62
+
C
D
44
C
D
% of CD8+
43.9%±23.1
L
C
M)
+
(T
(n
ai
ve
)
+
L
D
62
-
C
D
44
T(CM)
10.2%
±5.7
p=0.33
p=0.06
0.25
0.00
LN F3 CD8 percent of parent
C
56.9%±22.8
Grb2fl/fl CD4cretg
+
C
L
D
62
1
0.50
0
C
CD62L
Lymph Node
naive
Grb2fl/fl
(T
D
44
C
M)
(T
Grb2fl/fl mb1cre+/+
Grb2fl/fl mb1crecre/+
10
CD44
C CD8+
EM
)
-
**
C
3
C
30
+
C
D
62
D
62
L
L
+
C
+
C
D
44
SP CD8 CD44 CD62L GZZ
Grb2fl/fl**mb1cre+/+
2 fl/fl mb1crecre/+
Grb2
Total cells (x106)
40
D
44
-
+
D
44
-
**
50
17.7%
±5.9
4.7%
±4.5
L
D
62
70
% of CD8+
4.6%
±5.1
C
D
62
C
80
60
8.4%
±4.9
3
(n
ai
ve
)
EM
)
-
L
C
(T
D
44
C
M)
(T
C
D
62
L
L
+
C
+
C
D
44
***
C
38.1%
±4.6
D
62
39.6%±12.3
20.7%
±9.2
C
66.4%±12.68
4
0
SP CD8 CD44 CD62L % of CD8
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
5
1
+
T(EM)
***
6
-
15.4%
±8.7
10.7%
±7.8
7
***
D
44
5.5%
±3.5
7%
±6.8
23.6%
±7.9
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
% of CD8+
50.4%±15.1
15.3%
±7.9
Spleen
CD62L
T(CM)
SP F3 CD8 total cells
SP F3 CD8 percent of parent
B
iv
e)
71.7%±9
Grb2fl/fl CD4cretg
-
naive
Grb2fl/fl
(n
a
ACD8+
p=0.06
Abb. 34: Der Verlust von Grb2 verschiebt das Verhältnis von naiven zu aktivierten CD8+ T-Zellen in Grb2fl/fl
Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen. Insgesamt weisen beide T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäuse eine
Reduktion der naiven CD8+ T-Zellen auf. Die Deletion von Grb2 ab dem doppelt negativen 3 Stadium (Lckcre)
führt zu Beeinträchtigungen bei den CD8+ Gedächtnis T-Zellen, wohingegen eine Deletion ab dem CD4+CD8+
Stadium (CD4cre) die CD8+ Gedächtnis T-Zellzahlen in naiven Mäusen nicht beeinflusst. CD8+ periphere TZellen wurden durchflusszytometrisch auf die Expression von CD62L und CD44 untersucht. CD8+ Milzzellen (A),
CD8+ Knochenmarkszellen (B) wurden in CD62L+CD44- (naive Zellen), CD62L+CD44+ zentrale Memoryzellen (TCM),
CD62L-CD44+ T-Effektor-Memoryzellen (TEM) und CD62L-CD44- Zellen aufgeteilt. Bei den Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen
wurden nur die inguinalen (Leisten) Lymphknoten untersucht, bei den Grb2 fl/fl Lckcretg Mäusen wurden alle
auffindbaren Lymphknoten verwendet. B) und D) Gesamtzellzahlen und Anteil an den CD8+ T-Zellen für A und C. Für
B) Grb2fl/fl CD4crewt n=13 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl CD4Lcktg n=10
Mäuse; Für D) Grb2fl/fl CD4crewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=5 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl
Lcktg n=10 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Der Großteil der
Daten für die Grb2fl/fl Lckcretg Maus stammt aus Experimenten von Sonja Lacher.
89
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Kein großer Einfluss von Grb2 auf die Ca2+ Signalleitung im Thymus nach TZRStimulation
Grb2 ist ein wichtiger positiver Faktor für die Signalleitung über den TZR (Jang et al. 2010). Dies
6.2.5
sollte im Bezug auf das Calciumsignal für Thymozyten aus Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen mittels
Durchflusszytometrie überprüft werden. Während Grb2 in CD4+, CD8+ und den CD4-CD8Kontroll-T-Zellen unabhängig von der Stimulationsstärke über den TZR keine Auswirkung auf
das Calciumsignal hatte (Abb. 35) war das Signal in CD4+CD8+ T-Zellen von Grb2fl/fl Lckcretg
Mäusen leicht erhöht. Insgesamt hat Grb2 keinen größeren Einfluss auf das Calciumsignal in TZellen.
90
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
Thymus
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
200
300
400
500
50000
40000
30000
Ca2+
20000
0
100
200
time(s)
100000
Ca2+
stimulation
stimulation
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
0
100
200
300
400
500
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
300
Ca
stimulation
100000
400
500
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
0
100
80000
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
200
300
time(s)
30000
Ca2+
20000
0
100
200
300
400
500
fl/fl
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
100
200
300
400
500
Ca
stimulation
100000
400
500
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
0
100
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
200
300
time(s)
300
400
500
Ca2+
stimulation
fl/fl
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
0
100
200
300
400
500
Ca
stimulation
100000
400
500
stimulation
stimulation
stimulation
200000
fl/fl
Grb2
180000
fl/fl
tg
160000 Lckcre
Grb2
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
100 200
stimulation
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
70000
60000
50000
40000
30000
Ca2+
20000
100
200
300
400
500
stimulation
stimulation
200000
fl/fl
Grb2
180000
fl/fl
tg
160000 Lckcre
Grb2
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
100 200
time(s)
Ca2+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
Ca2+
300
400
500
Ca2+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
Ca2+
300
400
500
Ca
2+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
Ca2+
300
400
time(s)
Abb. 35: Das Calciumsignal in CD4+CD8+ T-Zellen wird durch Grb2 inhibiert, während es in CD4+ bzw. CD8+
einzel positiven Zellen nicht beeinflusst ist. Es wurden 2x107 mit Indo-1 beladene Thymuszellen, die extrazellulär auf
CD4 und CD8 gefärbt waren auf die Ca2+ Mobilisierung nach T-Zell Rezeptor Stimulation untersucht. Im
extrazellulären Färbeschritt wurden die Zellen gleichzeitig mit einem anti-TCRβ Antikörper (H57) auf Eis inkubiert,
der später mit verschiedenen Mengen anti-Hamster IgG (H-1643) in vorgewärmten Zellen (1 min in 37 °C Wasserbad)
kreuzvernetzt wurde, um die Zellen zu stimulieren. Grb2fl/fl Lckcrewt n=4 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcretg n=4 Mäuse.
91
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
500
time(s)
2+
fl/fl
0
400
time(s)
stimulation
100000
Ca2+
300
stimulation
200000
fl/fl
Grb2
180000
fl/fl
tg
160000 Lckcre
Grb2
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
100 200
time(s)
stimulation
100
200
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
time(s)
fl/fl
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
2+
fl/fl
0
500
Ca2+
stimulation
time(s)
stimulation
0
400
Ca2+
stimulation
Ca2+
stimulation
100000
300
stimulation
100000
time(s)
90000
100
200
2+
stimulation
0
40000
stimulation
200000
fl/fl
Grb2
180000
fl/fl
tg
160000 Lckcre
Grb2
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
100 200
time(s)
fl/fl
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
time(s)
CD4-CD8Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
200
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
80000
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
90000
100
50000
time(s)
stimulation
0
60000
Ca2+
stimulation
Ca2+
stimulation
100000
500
stimulation
100000
time(s)
CD4+CD8+
400
70000
time(s)
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
CD8+
300
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
100
60000
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
0
70000
fl/fl
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
70000
fl/fl
Grb2
90000
fl/fl
tg
Grb2
80000 Lckcre
stimulation
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
80000
Ca2+
stimulation
100000
0.1 µg Ionomycin
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
90000
Ca2+
stimulation
stimulation
100000
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca2+
stimulation
stimulation
20 µl
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
10 µl
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
100000
4 µl
Ca2+ (bound/ unbound Indo-1)
Amount of ab to
crosslink TCR-β
CD4+
Loading control
Intensity of stimulation
500
Ergebnisse
Erhöhte Zahl von γδ T-Zellen in Teilen der Peripherie und Tendenz zu einer
Erhöhung im Thymus von T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen
Neben den αβ T-Zellen, die CD4+CD8+ doppelt positiv oder CD4+ bzw. CD8+ einzel positiv sind
6.2.6
gibt es auch γδ T-Zellen, die CD3+ aber CD4-CD8- doppelt negativ sind und ein verändertes TZell Rezeptor Repertoir aufweisen (Vantourout & Hayday 2013). Diese Population ist entgegen
den αβ T-Zellen, die im Thymus und in der Peripherie von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen reduziert sind
in der Milz erhöht. Im Thymus und in anderen peripheren Organen sind die γδ T-Zellen auch
tendenziell erhöht (Abb. 36). Damit beeinflusst Grb2 entweder die Linienentscheidung zwischen
γδ T-Zellen und αβ T-Zellen oder es beeinflusst die Homöostase der γδ T-Zellen evtl. bedingt
durch das weniger gefüllte αβ T-Zell Kompartment.
92
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Thymus
TCR β
TCR
TCR γδ+
2
1.0
0.5
p=0.06
0.0
Spleen
30
12
3
2
*
1
LN gamma delta T cells
total cells (x106)
TCR β
Lymph node

4.2
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
TCR β+
TCR γδ+
TC
R
CD3+
T
TCR γδ

C
Lymph node
ce
lls
0
T
TCR
γδ+
*
2.2
0.2
0.15
Lung
lung gamma delta T cells
ce
lls
TCR γδ+
TC
R


T
Lung
TCR β
TCR
2.15
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
β+
total cells (x106)
CD3+
Grb2fl/fl
Grb2fl/flL
0.00
TCR γδ
D
Grb2fl/fl
Grb2fl/flL
ce
lls
Spleen
TCR β
TCR β+
*
21
ce
lls
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
T
CD3+
TC
R


T
spleen gamma delta T cells
total cells (x106)
B
Grb2fl/fl
Grb2fl/flL
7
ce
lls
TCR γδ
*
12
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
β+
T
CD3+
total cells (x106)
A
Thymus
thymus gamma delta T cells
ce
lls
Ergebnisse
*
Grb2fl/fl
Grb2fl/flL
1.15
0.15
0.10
0.05
TC
R

T
ce
lls

T
ce
lls
0.00
TCR γδ
Abb. 36: Die Zahl der γδ T-Zellen in der Peripherie und tendenziell im Thymus ist in T-Zell spezifischen Grb2
defizienten Tieren erhöht. Die Zellen wurden auf die Expression von CD3, TCR β und TCR γδ gefärbt und
durchflusszytometrisch analysiert. Die Gesamtzellzahlen der CD3+TCR β+ und der CD3+TCRγδ+ Zellen wurden
berechnet. Grb2fl/fl Lckcrewt n=3 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcretg n=3 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet;
*p<0,05.
93
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
6.2.7
Inhibitorischer Einfluss von Grb2 auf die TH17 Differenzierung in vitro, so wie
veränderte Treg und unveränderte TH1 und TH2 Differenzierung
Sowohl Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse als auch Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse weisen eine reduzierte Zahl an
naiven CD4+ und CD8+ T-Zellen in der Peripherie auf (Abb. 33; Abb. 34). Außerdem sind von
den vorhandenen CD4+ und CD8+ T-Zellen prozentual mehr Zellen aktiviert (CD69+) als in
Kontrolltieren (Abb. 32). Diese beiden Punkte könnten auf eine veränderte Aktivierbarkeit bzw.
ein verändertes Differenzierungspotential von Grb2-/- T-Zellen hindeuten. Darum wurde das
Differenzierungspotential von naiven CD4+ Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Zellen in vitro
untersucht. Das Potential von CD4+ Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Zellen zu TH1-Zellen
zu differenzieren ist nicht verändert (Abb. 37A), während die naiven CD4+ Grb2fl/fl Lckcretg
Zellen vermehrt zu TH2 und TH17 Zellen differenzieren. Die Differenzierung zu T-reg Zellen war
hingegen stark beeinträchtigt (Abb. 37B, C, D). Naive CD4+ Grb2fl/fl CD4cretg Zellen zeigen ein
erhöhtes Potential sich in TH17 Zellen zu differenzieren, während die Differenzierung zu T H2 und
T-reg Zellen dem der Kontrollzellen entsprach (Abb. 37B, C, D). Grb2 inhibiert das
Differenzierungspotential von naiven CD4+ Zellen sich in TH17 Zellen zu differenzieren. Die
Differenzierung zu TH1-Zellen wird nicht von Grb2 beeinflusst. Die Differenzierung zu TH2 und
T-reg Zellen scheint schon früh in der T-Zell Entwicklung beeinflusst zu werden. Grb2
beeinflusst dabei die Differenzierung zu TH2 Zellen negativ und die zu T-reg Zellen positiv oder
die Unterschiede im genetischen Hintergrund der Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse
haben einen Einfluss auf das Differenzierungspotential der naiven CD4+ Zellen (9.12.9).
94
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
control stainings
90
60
30
0
T H1
T H17
T H2
T-reg
control stainings
20
10
0
T H2
T H17
T H1
T-reg
0
T H1
T H17
T H2
T-reg
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
TH2
FSC-2
CD4+
30
20
control stainings
*
10
0
T H2
T H17
T H1
T-reg
IFNγ
% of living cells
IL17
CD4+
20
control stainings
*
10
*
0
T H17
T H1
T H2
T-reg
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
TH17
CD4+
20
IL17
control stainings
*
10
0
T H17
T H1
T H2
T-reg
FoxP3
FoxP3
20
CD4+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cretg
T-reg
% of living cells
T-reg
40
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cretg
TH17
D
control stainings
CD4+
CD4+
CD4+
IL17
60
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cre/+
% of living cells
% of living cells
CD4+
FSC-2
IFNγ
TH17
CD4+
80
CD4+
TH2 Alternativauswertung
C
% of living cells
IL17
CD4+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
TH1
IL4
TH2
IL4
% of living cells
B
Grb2fl/fl Lckcretg
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cretg
TH1
CD4+
CD4+ Grb2fl/fl
% of living cells
TH1
Grb2fl/fl CD4cretg
Grb2fl/fl
CD4+
CD25
FSC-2
control stainings
70
35
0
T-reg
T H17
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl Lck
T-reg
T H1
T H2
% of living cells
CD4+
IFNγ
A
IFNγ
Ergebnisse
80
CD4+
***
control stainings
40
*
0
T-reg
TH17
TH1
TH2
95
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 37: Naive CD4+ Zellen von T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen zeigen in vitro ein verringertes
Potential sich zu TH17 und TH2 Zellen zu differenzieren aber das Potential sich zu T-reg-Zellen zu differenzieren
ist erhöht. Aus Milzzellen von Grb2fl/fl CD4cretg bzw. Milz und Lymphknotenzellen von Grb2fl/fl Lcktg Mäusen und den
entsprechenden Kontrollen wurden CD4+ Zellen durch negative Selektion anderer Populationen aufgereinigt, die CD4+
Zellen wurden dann positiv für CD62L+ Zellen selektiert. Für die Aufreinigung wurden magnetisierbare Partikel
gekoppelt an Antikörper verwendet, die gebundene Zellen in einem Magnetfeld zurückhalten können. Die
CD4+CD62L+ Zellen wurden mit unterschiedlichen Zytokinen behandelt, um das Differenzierungspotential zu TH1,
TH2, TH17 und T-reg Zellen zu untersuchen (Tab. 14). Die Differenzierung zu TH1, TH17 und T-reg Zellen wurde nach
72 h untersucht, während die TH2-Zellen vor der Analyse für weitere 48 h mit 50 U/ml IL-2 inkubiert wurden. Für die
letzten 4-6 h wurden die Zellen mit 1µg/ml Ionomycin, 20 ng/ml PMA und 1µg/ml Brefeldin A (Golgiplug BD)
behandelt. Anschließend folgten intra- und extrazelluläre Färbungen für A) und C) CD4, IFNγ, IL17, B) CD4 und IL4,
D) CD4 und FoxP3. Grb2fl/fl CD4crewt n=6 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=5 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=5 Mäuse; Grb2fl/fl
Lcktg n=5 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Der Großteil der
Daten für die Grb2fl/fl Lckcretg Maus stammt aus Experimenten von Sonja Lacher.
6.2.8
Ex vivo Analysen von CD4-Effektorzellen zeigen einen Einfluss von Grb2 abhängig
vom Deletionszeitpunkt durch die Cre Rekombinase
Nachdem ein verändertes Differenzierungspotential naiver CD4+ T-Zellen in vitro gemessen
wurde (Abb. 37) wurden die T-Helfer Populationen von Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen ex vivo untersucht. In den Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen war die Zahl der TH1, TH2 und TH17
Zellen tendenziell erhöht (Abb. 38A-D). In den Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen war nur die Zahl der
TH1 Zellen erhöht, während die Zahlen der TH2, TH17 und T-reg Zellen unverändert waren (Abb.
38A-D). Die Zahl der aktivierten CD4+ (CD25+) und der T-reg Zellen war in Grb2fl/fl Lckcretg
Mäusen signifikant erhöht, während diese Populationen in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen unverändert
waren (Abb. 38E). In T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen ist die Zahl der TH1 Zellen ex
vivo erhöht. Aufgrund der geringen Mauszahlen für die TH2 und TH17-Zellen aus Grb2fl/fl Lckcretg
Mäusen lassen sich keine konkreten Aussagen über die Auswirkung einer frühen Deletion von
Grb2 auf diese Zellen treffen. In Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen, die Grb2 in den CD4+CD8+ T-Zellen
deletieren war der Anteil der TH2, TH17 und T-reg Zellen ex vivo nicht verändert.
96
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
CD4+
Grb2fl/fl CD4cretg
Grb2fl/fl
IFNγ
TH1
/
TH17
Grb2fl/fl Lckcretg
IFNγ
TH1
CD4+ Grb2fl/fl
TH17
IL17
B
IL17
CD4+
CD4+
IL4
CD4+
T-reg
CD4+
% of CD4+ ex vivo
CD4+
8
% of parent
Grb2fl/fl
7
Grb2fl/fl CD4cre/+
6
0.5
re
g
H2
7
p=0.09
Fo
xP
3
D
25
D
25
+
C
C
D
25
+
0
+
5
+
10
0
C
T-
T
T
15
10
D
25
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cre/+
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cre/+
3
97
2
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
1
+
Fo
xP
3
+
D
25
C
D
25
+
C
+
H1
H1
T
*
Lymph node
Grb2fl/fl CD4cre/+
20
+
% of parent
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cre/+
4
+
Fo
xP
3
D
25
C
CD4+
***
Grb2fl/fl
CD4+
0
+
0.0
25
20
D
25
C
total cells (x106)
1.0
Spleen
**
30
+
+
C
D
25
Fo
xP
3
+
+
+
D
25
C
1.5
D
25
CD4+
+
T-
T
5
5
C
50
Grb2fl/fl
40 cre/+
Grb2fl/fl CD4
10
Fo
xP
3
D
25
C
CD4+
2.0
2
Lck Sonja SP % CD4 CD25 FoxP3 cells
Lck Sonja LN % CD4 CD25 FoxP3 cells
Lymph node
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cre/+
LN total CD4 CD25 FoxP3 cells
2.5
3
C
% of parent
CD4+
SP total CD4 CD25 FoxP3 cells
3.0
4
Fo
xP
3
re
g
H2
7
H1
T
T
15
0
3.5
5
0
LN % CD4 CD25 FoxP3 cells
Spleen
+
% of parent
CD4+
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD
1
H1
% of parent
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
FoxP3
CD4+
**
SP % CD4 CD25 FoxP3 cells
total cells (x106)
Lck Sonja % of CD4+ ex vivo
FoxP3
D
E
Side-Scatter
FL-4
C
CD25
Side-Scatter
% of parent
TH2
IL4
TH2
Ergebnisse
Abb. 38: In naiven T-Zell spezifisch Grb2 defizienten Mäusen (Grb2fl/fl Lcktg und Grb2fl/fl CD4cretg) ist der Anteil
der TH1-Zellen an den CD4+ T-Zellen erhöht. Wird Grb2 ab dem Übergang vom doppelt negativen 2 zum
doppelt negativen 3 Stadium deletiert (Lckcre) ist auch der Anteil der TH2, TH17 und T-reg Zellen an den CD4+
T-Zellen tendenziell erhöht. Aus Milz und Lymphknotenzellen von Grb2 fl/fl Lcktg Mäusen und den entsprechenden
Kontrollen wurden CD4+ Zellen durch negative Selektion anderer Populationen aufgereinigt. Für die Aufreinigung
wurden magnetisierbare Partikel gekoppelt an Antikörper verwendet, die gebundene Zellen in einem Magnetfeld
zurückhalten können. Milzzellen von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen und entsprechende Kontrollen wurden ex vivo ohne
weitere Aufreinigung in Einzelzellsuspension gebracht. Die Zellen wurden für 4-6 h mit 1µg/ml Ionomycin, 20 ng/ml
PMA und 1µg/ml Brefeldin A (Golgiplug BD) behandelt. Anschließend folgten intra- und extrazelluläre Färbungen für
A) CD4, IFNγ, IL17, B) CD4 und IL4, C) CD4 und FoxP3. D) Quantifizierung des Anteils der TH1, TH17, TH2 und Treg Zellen an den CD4+ Zellen. E) Quantifizierung des Anteils der CD25+ aktivierten CD4+ Zellen und der
CD25+FoxP3+ regulatorischen T-Zellen an den CD4+ Zellen. Für A) bis D) Grb2fl/fl CD4crewt n=10 Mäuse; Grb2fl/fl
CD4cretg n=5 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=2 Mäuse; Grb2fl/fl Lcktg n=3 Mäuse; Für E) Grb2fl/fl CD4crewt n=3 Mäuse;
Grb2fl/fl CD4cretg n=3 Mäuse; Grb2fl/fl Lckcrewt n=8 Mäuse; Grb2fl/fl Lcktg n=8 Mäuse; Für die Statistik wurde der TTest verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Der Großteil der Daten für die Grb2 fl/fl Lckcretg Maus stammt aus
Experimenten von Sonja Lacher.
6.2.9
T-Zell spezifische Grb2 defiziente Mäuse entwickeln eine schwächere experimentelle
autoimmune Enzephalomyelitis, die ein Mausmodell für multiple Sklerose im
Menschen ist
Aufgrund der veränderten Zusammensetzung von T-Helferzellen und des veränderten
Differenzierungspotentiales naiver CD4+ T-Zellen wurde die Rolle von Grb2 in einem
experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Modell mit Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen
untersucht. EAE ist ein Modell für Multiple Sklerose im Menschen. Die Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse
wurden aufgrund ihres reinen C57BL/6 Hintergrundes ausgewählt. Die Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse
haben einen gemischten Hintergrund, der für die klassische EAE nicht geeignet ist. Die Grb2fl/fl
CD4cretg Mäuse waren ab Tag 8 nach der Induktion der Krankheit tendentiell weniger krank.
Zum Höhepunkt der Krankheit (Tag 14-18) waren die Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse jedoch signifikant
gesünder. An den späteren Tagen glich sich der Krankheitsverlauf wieder an. Die Grb2fl/fl
CD4cretg blieben aber tendeziell gesünder (Abb. 39). Grb2 ist ein Faktor, der zu einem stärkeren
EAE Krankheitsverlauf beiträgt.
98
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
B
EAE mean clinical Score
Experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE)
EAE Score
5
**
4
EAE clicical score
***
†
†
*
3
**
2
0 = No clinical Signs
1 = Paralysed tail
2 = Loss in coordinated movement; hind limb paresis
3 = Both hind limbs paralysed
4 = Hind limbs and forelimbs paralysed
5 = Death
1
0
0
7
14
21
28
time(d)
fl/fl
Abb. 39: T-Zell spezifische
Grb2 defiziente Mäuse entwickeln eine schwächere experimentelle autoimmune
Grb2
Enzephalomyelitis
Grb2fl/flCD4cretg
Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse wurden subkutan am Rücken mit 50 µg Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG) 35-55
immunisiert und an Tag 0 und 2 wurden 200 µl Pertussistoxin i.p. verabreicht, um die experimentellen autoimmunen
Enzephalomyelitis (EAE) zu induzieren. Der Krankheitsverlauf wurde über ein klinisches Bewertungssystem bewertet:
0 = keine klinischen Zeichen, 1 = paralysierter Schwanz, 2 = Defizite in der koordinierten Fortbewegung, Paraparese, 3
= Beide Hinterbeine paralysiert, Paraplegie, 4 = Paraplegie mit Beeinträchtigung der Vorderbeine, 5 = sterbende / tote
Tiere. Grb2fl/fl CD4crewt Tag 1-14 n=11 Mäuse; Tag 15-28 n=4 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg Tag 1-14 n=12 Mäuse; Tag
15-28 n=4 Mäuse; Tiere, die aus dem Versuch genommen werden mussten sind mit einem Kreuz markiert; Für die
Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Die EAE Versuche wurden in Kooperation mit
Elisabeth Zinser (AG Steinkasserer) durchgeführt.
6.2.9.1
Die niedrigeren T-Zellzahlen in naiven T-Zell spezifischen Grb2 defizienten
Mäusen gleichen sich im experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Modell
den T-Zellzahlen der Kontrolltiere an. An Tag 30 ist ein negativer Einfluss von
Grb2 auf die T-effektor-Gedächtniszellen messbar.
Um den Höhepunkt der EAE an Tag 17 und an Tag 30, wenn die Krankheit abklingt (Abb. 39)
wurden die T-Zell Populationen der Milz von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen durchflusszytometrisch
untersucht. Die Gesamtzellzahl der CD3+, CD3+CD4+, bzw. CD3+CD8+ T-Zellen und der Anteil
der aktivierten (CD69+) Zellen dieser Populationen war in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen gegenüber
den Kontrollen unverändert (Abb.40A). Die Zahl der naiven CD4+ und CD8+ T-Zellen war an Tag
17 der EAE wie in naiven Mäusen (Abb. 34) reduziert. An Tag 30 hatte sich die Zahl der naiven
CD4+ T-Zellen der Zahl in den Kontrolltieren angeglichen (Abb.40B,C). In Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen war der Anteil der naiven T-Zellen an den CD4+ und CD8+ T-Zellen an Tag 17 der EAE
niedriger und der Anteil der effektor Gedächtniszellen war gegenüber den Kontrolltieren erhöht
(Abb.40B,C). Dies spiegelt die Situation in naiven Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wieder (siehe 6.2.4).
99
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
An Tag 30 der EAE war das Verhältnis der naiven CD4+ und CD8+ T-Zellen in Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen dagegen wie in den Kontrolltieren (Abb.40B,C). Die Zahl der Gedächtnis T-Zellen war
an Tag 17 unverändert. An Tag 30 war die Zahl der CD4+ zentralen und der effektor
Gedächtniszellen, sowie die Zahl der CD8+ zentralen Gedächtniszellen unverändert. Die Zahl der
CD8+ effektor Gedächtniszellen war allerdings verringert (Abb.40B,C). Die reduzierte Zahl an
CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ und naiven T-Zellen, die naive Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse aufweisen
wurde im Verlauf der EAE ausgeglichen. Dies kann mit der Krankheit oder mit dem Alter der
Mäuse zusammenhängen, da die T-Zell Populationen in älteren naiven Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen
noch nicht untersucht wurden. Auch der reduzierte Anteil naiver T-Zellen und der erhöhte Anteil
von T-effektor Gedächtniszellen an den CD4+ und CD8+ T-Zellen in naiven Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen gleichen sich bis an Tag 30 der EAE an die Situation in den Kontrolltieren an.
100
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
CD3+
EAE d17
Grb2fl/fl CD4cretg
7.5
5.0
D
8+
CD62L
CD8+
% of CD4+
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
40
30
20
0
EM
)
-
L
D
44
-
+
C
(T
D
44
C
M)
D
62
L
C
-
C
D
62
D
44
+
C
L
C
C
C
C
D
62
D
62
L
D
62
L
+
C
-
C
D
44
D
44
-
+
(n
a
C
-
L
(T
iv
e)
D
44
C
M)
D
62
C
+
C
L
C
C
D
62
D
62
L
D
62
L
+
C
-
C
D
44
D
44
-
+
(n
a
(T
iv
e)
EM
)
(T
D
44
-
+
C
L
D
62
C
CD8+ Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cretg
Grb2fl/fl CD4cretg
20
D
62
EM
)
L
D
44
-
+
C
(T
D
44
C
M)
(T
+
C
+
C
D
62
C
L
D
62
C
L
+
C
-
D
44
-
D
44
D
44
-
+
(n
a
(T
iv
e)
EM
)
-
-
C
L
D
62
C
D
44
C
+
L
D
62
C
D
44
C
M)
+
(n
a
-
D
44
+
C
C
D
62
L
L
D
62
C
(T
iv
e)
EM
)
-
C
D
62
L
D
44
-
+
C
(T
D
44
C
M)
C
+
C
L
D
62
C
L
D
62
C
D
44
-
+
(n
a
D
44
+
C
-
C
L
D
62
C
(T
iv
e)
EM
)
(T
+
D
44
-
L
D
62
C
L
D
62
30
0
-
-
C
+
+
C
D
44
-
C
D
44
C
M)
(T
iv
e)
(n
a
D
44
+
C
40
10
0.0
0
C
0
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
-
1
0.5
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
C
25
1.0
% of CD8
***
+
50
50
L
*
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
F3 CD8 % of parent
60
L
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
CD44
*
D
62
2
1.5
D
62
***
4
3
F3 CD8
+ total cells
CD8
F3 CD8 % of parent
75
C
CD44
**
Total cells (x106)
F3 +CD8 total cells
CD8
% of CD8+
6
Total cells (x10 )
5
C
CD62L
CD62L
Grb2fl/fl
50
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
10
-
D
44
C
M)
C
+
C
C
D
62
D
62
L
L
L
+
C
-
C
D
44
D
44
-
+
(n
a
+
D
44
-
D
62
C
C
(T
iv
e)
EM
)
(T
D
44
C
L
D
62
C
C
C
C
D
62
D
62
L
L
+
C
+
C
D
44
D
44
-
+
(n
a
(T
iv
e)
C
M)
-
0
60
EM
)
2
70
(T
3
F3 CD4 % of parent
CD44
+
4
CD4+
4.5
fl/fl
+/+
Grb2
4.0 CD4
fl/fl
cre/+
Grb2
3.5 CD4
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
***
-
% of CD4+
6
Total cells (x10 )
5
55
***
50Grb2fl/fl CD4+/+
45Grb2fl/fl CD4cre/+
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Total cells (x106)
*
6
1
L
Grb2fl/fl CD4cretg
F3 CD4 total cells
F3 CD4 % of parent
CD44
*
7
D
62
0
C
D
8+
C
C
D
3+
C
CD62L
F3 CD4 total cells
CD4+
8
C
5
CD4+ Grb2fl/fl
Grb2fl/fl CD4cretg
Grb2fl/fl
10
C
0.0
15
D
4+
2.5
0
D
3+
1
D
8+
C
D
4+
C
D
3+
C
10.0
D
3+
2
% CD69+ in population
3
12.5
C
4
% CD69+
20
D
8+
5
15.0
C
6
0
CD4+
Total cells (x106)
7
D
4+
10
CD3+
25
17.5
D
4+
% CD69+ in population
Total cells (x106)
20
CD8F1 CD3 gated CD69 % of parent
F1 CD3 gated total cells
CD3+
% CD69+
C
+
CD3
8
C
CD4
CD8F1 CD3 gated CD69 % of parent
F1 CD3 gated total cells
CD3+
30
B
EAE d30
Grb2fl/fl CD4cretg
CD3+ Grb2fl/fl
CD4
Grb2fl/fl
101
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb.40: Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse weisen an Tag 17 und Tag 30 nach Induktion einer experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis anders als naive Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse keine reduzierten T-Zellzahlen mehr
auf. Auch die Zahl naiver T-Zellen, die in naive Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse reduziert ist wurde im Verlauf der EAE
ausgeglichen. Zudem normalisierte sich das Verhältnis von naiven T-Zellen T-Effektorzellen, das in naiven
Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen verändert ist.T-Zellen der Milz wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis durchflusszytometrisch auf ihre CD4 und CD8 Expression untersucht (A). CD4+ (B)
und CD8+ (C) T-Zellen der Milz wurden durchflusszytometrisch auf die Expression von CD62L und CD44 untersucht.
Sie wurden in CD62L+CD44- (naive Zellen), CD62L+CD44+ zentrale Memoryzellen (TCM), CD62L-CD44+ T-EffektorMemoryzellen (TEM) und CD62L-CD44- Zellen unterteilt. Für die Quantifizierung sind Gesamtzellzahlen angegeben.
Für die CD3+ Zellen ist der Anteil der CD69+ (aktivierten) Zellen angegeben (A). Für die CD62L und CD44 Färbung
sind die Anteile der unterschiedenen Populationen an den CD4+ (B) und CD8+ (C) T-Zellen der Milz angegeben. Für
Tag 17: Grb2fl/fl CD4crewt n=6 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8 Mäuse; Für Tag 30: Grb2fl/fl CD4crewt n=9 Mäuse; Grb2fl/fl
CD4cretg n=11 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01.
6.2.9.2
Erhöhte Plasmablastenzahl in T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen im
experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Modell
T-Helferzellen können über costimulatorische Signale B-Zellen aktivieren, weswegen im Verlauf
der EAE auch B-Zellen untersucht wurden. Die Gesamtzahl der B-Zellen und der Plasmazellen
war sowohl an Tag 17 als auch an Tag 30 in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen gegenüber den Kontrollen
unverändert (Abb. 41A und B). Allerdings war die Zahl der Plasmablasten an Tag 17 der EAE
erhöht (Abb. 41A). Die Plasmablasten waren aber weniger aktiviert (Abb. 41A). An Tag 30 war
die Zahl der Plasmablasten in den Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen und den Kontrolltieren gleich (Abb.
41B). Grb2 in T-Zellen hat einen inhibierenden Einfluss auf die Zahl der Plasmablasten um den
Höhepunkt der EAE aber es führt zu einer stärkeren Aktivierung der vorhandenen Plasmablasten.
102
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
EAE d17
Grb2fl/fl CD4cretg
B
B220
EAE d30
Grb2fl/fl CD4cretg
+
8
D
13
+
C
D
13
-
22
0
B
25
20
15
10
5
+
8
22
0
B
B
22
0
-
+
C
D
13
8
+
0
D
13
+
B
22
0
-
22
0
B
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
30
C
+
8
D
13
8
22
0
+
8
B
22
0
-
22
0
B
Iab expression
35
+
C
D
13
C
D
13
8
+
0
Iab expression (geo mean)
F2 Iab geo mean
2
Grb2fl/fl 0CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
10
22
0
C
22
0
B
4
20
B
8
+
22
0
p=0.09
B
30
10
B
10
6
+
40
+
Iab expression (geo mean)
+
B
B
22
0
22
0
-
+
C
D
13
8
+
C
B
D
13
22
0
8
+
0
Iab expression
50
20
Grb2fl/fl CD4+/+
0 fl/fl CD4cre/+
Grb2
30
C
F2 Iab geo mean
5
Total cells
50
+
+
8
B
B
22
0
22
0
-
+
C
D
13
C
D
13
8
+
22
0
B
***
total cells (x106)
70
Grb2fl/fl CD4+/+
0 Grb2fl/fl CD4cre/+
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
30
+
F2 total cells
10
Total cells
% of parent
20
+
75
60
45
30
15
10
30
D
13
F2 total cells
% CD69+
40
Grb2fl/fl CD4+/+
Grb2fl/fl CD4cre/+
C
% of parent
40
CD138 F2 CD69 % of parent
*
+
F2 CD69 % of parent
% CD69+
22
0
50
B
C138
total cells (x106)
Grb2fl/fl
B220
Grb2fl/fl
Abb. 41: Erhöhte Zahl an Plasmablasten zum Höhepunkt der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
in T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen. B-Zellen der Milz wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der
experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis durchflusszytometrisch auf ihre B220 und CD138 Expression
untersucht. Sie wurden in B220+ Gesamt-B-Zellen, B220-CD138+ Plasmazellen und B220+CD138+ Plasmablasten
unterteilt. Für diese Populationen wurde die Gesamtzellzahl, der Anteil der CD69 + Zellen und die Expression von Iab
(MHCII) bestimmt. Für Tag 17: Grb2fl/fl CD4crewt n=6 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8 Mäuse; Für Tag 30: Grb2fl/fl
CD4crewt n=9 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=11 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001.
6.2.9.3
Anteilig mehr regulatorische T-Zellen an den CD4+ Grb2-/- T-Zellen und erhöhte
Aktivierbarkeit der CD4+ Grb2-/- T-Zellen über PMA und Ionomycin zum
Höhepunkt der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
Die verringerte Zahl an T-Zellen in naiven Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen (Abb. 31; Abb. 32) könnte
den EAE-Krankheitsverlaufes im Vergleich zu den Kontrolltieren beeinflussen. Um die
Effektorzellen von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen vergleichbar zu untersuchen wurden CD4+ T-Zellen
aus der Milz an Tag 17 nach Induktion der Krankheit aufgereinigt und in vitro restimuliert.
Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse zeigten im Vergleich zu den Kontrolltieren sowohl in der unstimulierten,
als auch in der spezifisch mit MOG-Peptid stimulierten Probe einen höheren Anteil
regulatorischer T-Zellen. Nach einer unspezifischen Stimulation mit PMA und Ionomycin war die
Zahl der T-reg Zellen in Grb2fl/fl CD4cretg und Kontrolltieren vergleichbar (Abb. 42A). Der Anteil
103
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
der TH17 bzw. TH1 Zellen an den CD4+ Zellen war in den unstimulierten und den spezifisch mit
MOG stimulierten Proben gleich. Nach einer Stimulation mit PMA und Ionomycin war der Anteil
der TH17 und TH1 Zellen an den CD4+ Zellen erhöht (Abb. 42B und C). Grb2 hat in T-Zellen aus
EAE Tieren in der unstimulierten Situation oder nach einer spezifischen TZR Stimulation einen
inhibitorischen Effekt auf die T-reg Zellen, während keine Unterschiede für den Anteil der TH17
und TH1 Zellen messbar waren. Bei einer unspezifischeren Stimulation über PMA und Ionomycin
war ein inhibitorischer Effekt von Grb2 auf die TH17 und TH1 Zellen messbar. Grb2 hatte in
dieser Situation keinen Effekt auf die T-reg Zellen. Der erhöhte Anteil der T-reg Zellen korreliert
mit dem schwächeren Krankheitsverlauf der Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse. Milzzellen, die an Tag 30
der EAE spezifisch restimuliert wurden zeigten, dass Grb2 einen fördernden Einfluss auf die Zahl
der TH17 Zellen hat (Daten von Dr. Elisabeth Zinser; nicht gezeigt).
104
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
EAE d17
A
CD4+
unstim.
Mog (20 µM)
PMA/Iono
Alternativgating mit CD4 int - T-regs - abb
CD4+
Grb2fl/fl
% Treg of parent
CD25
6
Grb2fl/fl
CD4cretg
**
CD4cre+/+ Grb2
CD4cre+/- Grb2f
5
*
4
3
2
1
B
unstim.
Mog (20 µM)
A
/Io
no
PM
og
M
FoxP3
CD4+CD5+
)
(2
0
µM
un
st
im
.
0
PMA/Iono
IL17+ - abb
Grb2fl/fl
CD4+CD5+
% IL17+ of parent
IL-17
7.5
Grb2fl/fl
CD4cretg
CD4cre+/+ Grb2
CD4cre+/- Grb2
5.0
*
2.5
CD4+CD5+
unstim.
Mog (20 µM)
A
/Io
no
PM
og
M
Forward Scatter
PMA/Iono
IFNgamma - abb
Grb2fl/fl
CD4+CD5+
***
% IFN + of parent
IFNγ
7
Grb2fl/fl
CD4cretg
CD4cre+/+ Grb
CD4cre+/- Grb2
5
3
1
0.50
0.25
A
/Io
no
PM
M
og
(2
0
µM
im
Forward Scatter
)
.
0.00
un
st
C
)
(2
0
µM
un
st
im
.
0.0
105
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 42: Anteilig weniger regulatorische T-Zellen an den CD4+ Grb2-/- T-Zellen und erhöhte Aktivierbarkeit der
CD4+ Grb2-/- T-Zellen über PMA und Ionomycin zum Höhepunkt der experimentellen autoimmunen
Enzephalomyelitis An Tag 17 der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis wurden Milzen von Grb2fl/fl
CD4cretg Mäusen und den entsprechenden Kontrollen entnommen und es wurden CD4+ Zellen durch negative Selektion
anderer Populationen aufgereinigt. Für die Aufreinigung wurden magnetisierbare Partikel gekoppelt an Antikörper
verwendet, die gebundene Zellen in einem Magnetfeld zurückhalten können. Milzzellen von Grb2 fl/fl CD4cretg Mäusen
und entsprechende Kontrollen wurden mit 20 µM MOG-Peptid, 1µg/ml Ionomycin, 20 ng/ml PMA oder unstimuliert
für 24 h inkubiert. Dann wurden alle Zellen für 6 h.mit 1µg/ml Ionomycin, 20 ng/ml PMA behandelt, wobei für die
letzten 4 h. 1µg/ml Brefeldin A (Golgiplug BD) zugegeben wurde. Anschließend folgten intra- und extrazelluläre
Färbungen für A) CD4, CD25 und FoxP3; Für B) CD4, CD5 und IL17, C) CD4, CD5 und IFNγ. Grb2fl/fl CD4crewt n=6
Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=8 Mäuse; Für die Statistik wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
6.2.9.4
An Tag 30 der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in vitro mit
MOG-Peptid reaktivierte Milzzellen aus T-Zell spezifischen Grb2 defizienten
Mäusen sekretieren weniger entzündungsfördernde Zytokine
An Tag 30 nach EAE Induktion wurden Milzzellen von Grb2fl/fl CD4cretg und Kontrollmäusen
ausgesät und mit verschiedenen Konzentrationen MOG-Peptid inkubiert, um MOG-spezifische TZellen
zu
aktivieren.
Die
Menge
der
sekretierten
Zytokine
im
Überstand
wurde
durchflusszytometrisch bestimmt (Abb. 43A). Mit der Menge an Stimulanz stieg auch die
Sekretion der Zytokine. Die Milzzellen aus Grb2fl/fl CD4cretg Tieren produzierten weniger IL17A, IL-2 und TNF als die Kontrollzellen. Die Produzierte Menge an IL-4, IL-8, IL-10 und IFNγ
war in Grb2fl/fl CD4cretg Tieren nicht signifikant verändert (Abb. 43B). Entsprechend des
schwächeren EAE Verlaufes in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wurden bei gleicher Zellzahl weniger
der Zytokine IL-17A, IL-2 und TNF sekretiert, die zur EAE beitragen. DieZahl der T-Zellen in
Grb2fl/fl CD4cretg Tieren glich sich im Verlauf der EAE der Zahl in den Kontrolltieren an
(Abb.40). Die gleiche Zahl an CD4+ Grb2-/- T-Zellen sekretieren also weniger Zytokine, welche
die EAE fördern. Für Tag 17 nach EAE Induktion gibt es ähnliche Ergebnisse (Daten von Dr.
Elisabeth Zinser; nicht gezeigt).
106
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
EAE d30
Beads
78 pg/ml
Forward Scatter
1000
IL-2 production
30
IL-17A
**
750
IL2 (pg/ml)
IL17A (pg/ml)
FL-2 (Cytokines)
IL17A production
B
1250 pg/ml
625 pg/ml
IL-2
IL-4
IL-6
IL-IFNγ
TNF
IL-17A
IL-10
FL-3 (Beads)
Side Scatter
Cytokine
Mix: 0 pg/ml
500
*
IL-2
*
20
10
250
20
µM
20
µM
20
µM
2µ
M
0,
M
02
µ
0,
Grb2
Grb2fl/flCD4cretg
30
20
120
fl/fl
100
IL6 (pg/ml)
Grb2
Grb2fl/flCD4cretg
80
0,
2µ
M
02
µ
M
IL-6 production
0,
µM
0,
00
2
0µ
M
20
µM
2µ
M
0,
2µ
M
M
0,
02
µ
µM
0µ
M
0,
00
2
MOG-peptide
IFN
Mog-peptide
IL-6
Grb2fl/fl
Grb2fl/flCD4cretg
60
40
Mog-peptide
IL-4
0,
2µ
M
M
0,
02
µ
µM
0,
00
2
20
µM
0
2µ
M
IL-4 production
0,
2µ
M
M
0,
02
µ
0,
00
2
µM
0µ
M
20
MOG-peptide
Grb2fl/fl
Grb2fl/flCD4cretg
Grb2
Grb2fl/flCD4cretg
1
20
µM
2µ
M
0,
2µ
M
M
0,
02
µ
0,
00
2
µM
0
0µ
M
IFN (pg/ml)
fl/fl
0
IFN production
fl/fl
IL4 (pg/ml)
MOG-peptide
IL-10
10
0
2
2µ
M
IL10 (pg/ml)
50
40
IL10 production
2µ
M
60
50
100
3
00
2
0,
*
Grb2fl/fl
Grb2fl/flCD4cretg
150
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
µM
0µ
M
20
µM
2µ
M
0,
2µ
M
M
0,
02
µ
0,
00
2
MOG-peptide
TNF
0µ
M
TNF (pg/ml)
200
µM
0µ
M
250
TNF production
0
2µ
M
*
0
MOG-peptide
Grb2fl/fl
Grb2fl/flCD4cretg
107
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
Abb. 43: An Tag 30 der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in vitro mit MOG-Peptid reaktivierte
Milzzellen aus T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen sekretieren weniger IL-17A, IL-2 und TNF. An Tag
30 der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis wurden Milzen von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen und den
entsprechenden Kontrollen entnommen und die Zellen wurden mit mit 0 µM, 0,002 µM, 0,02 µM, 0,2 µM, 2 µM, bzw.
20 µM MOG-Peptid für 72 h inkubiert. A) Die Menge der abgegebenen Zytokine im Überstand wurde
durchflusszytometrisch über Partikel bestimmt, an die Antikörper gegen je ein spezifisches Zytokin gekoppelt waren.
Ein gebundenes Zytokin kann über einen weiteren Antikörper gegen dasselbe Zytokin nachgewiesen werden, der an ein
Fluochrom gekoppelt ist. Partikel verschiedener Größen können unterschieden und gleichzeitig gemessen werden
(Cytometric Bead Array BD). B) Quantifizierung von IL-17A, IL-2, TNF, IL10, IFNγ, IL-6, IL-4 im Überstand mit
Hilfe eines bekannten Zytokinstandards. Grb2fl/fl CD4crewt n=6 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=7 Mäuse; Für die Statistik
wurde der T-Test verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Das Experiment wurde zusammen mit Lena Sandrock
(AG Steinkasserer) durchgeführt.
6.2.10 Verringerte Aktivierbarkeit von Grb2 defizienten CD4+ T-Zellen durch dendritische
Zellen im gemischten Lymphozyten Versuch
Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse stimulierten nach einer spezifischen Stimulation über den TZR mit
MOG-Peptid weniger Zytokine, die die EAE fördern (Abb. 43). Zudem gibt es Daten, dass die
TZR-Signalleitung in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen beeinträchtigt ist (Jang et al. 2010). Darum haben
wir die Aktivierbarkeit von Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen durch dendritische Zellen in einem
alloreaktiven Ansatz untersucht. Mit einer steigenden Zahl an alloreaktiven dendritische Zellen
steigt die Proliferation der Grb2fl/fl CD4cretg und Kontroll-T-Zellen an. Die Grb2fl/fl CD4cretg TZellen proliferieren aber deutlich schwächer als die Kontroll-T-Zellen (Abb. 44). Zusätzlich kann
es sein, dass die dendritischen Zellen in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen ein verringertes Potential haben
T-Zellen zu aktivieren, da Subpopulationen von dendritischen Zellen CD4-positiv sind und Grb2
in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen verloren haben sollten. Darum wurde erneut ein alloreaktiver
gemischter Lymphozytenversuch mit wildtyp T-Zellen und aus Grb2fl/fl CD4cretg Tieren
generierten dendritischen Zellen durchgeführt. Die aus dem Knochenmark von Grb2fl/fl CD4cretg
Tieren generierten dendritischen Zellen hatten dasselbe Potential T-Zellen zu aktivieren, wie
dendritische Zellen aus Kontrolltieren (Abb. 44). Diese in vitro Versuche zeigen, dass Grb2 in
CD4+ T-Zellen wichtig für die Aktivierbarkeit von T-Zellen durch dendritische Zellen ist.
108
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
Ergebnisse
A
unstimulated
TNF
250000
250000
200000
200000
LPS
250000
***
100000
200000
***
150000
***
cpm
**
150000
cpm
cpm
**
***
*
100000
**
***
***
150000
***
100000
**
75000
75000
75000
Grb2fl/fl CD4cretg DCs
fl/fl
Grb2 DCs
Grb2fl/flCD4cretg DCs
0
30
0
Grb2fl/fl CD4cretg DCs
fl/fl
Grb2 DCs
Grb2fl/flCD4cretg DCs
Abb. 44:Grb2 defiziente CD4+ T-Zellen können im gemischten Lymphozytenversuch weniger effizient durch
alloreaktive dendritische Zellen aktiviert werden als CD4+ T-Zellen aus Kontrolltieren. Umgekehrt können
dendritische Zellen aus Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen alloreaktive T-Zellen genauso gut stimulieren, wie alloreaktive
T-Zellen aus Kontrolltieren. A) dendritische Zellen wurden aus Knochenmarkszellen von BALB/c Mäusen durch
GM-CSF Zugabe generiert. Je 3x105 mit anti CD90.2 Beads magnetisch aufgreinigte T-Zellen aus 10 Generationen auf
den C57BL/6 Hintergrund zurückgekrezten Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wurden mit verschiedenen Zahlen von
dendritischen Zellen in 200 µl Medium gemischt und für 72 h inkubiert. Die dendritischen Zellen wurden aus
Knochenmarkszellen generiert und mit 100 ng/ml LPS oder 500 U/ml TNFα vorbehandelt bzw. unbehandelt eingesetzt.
Dann wurden die Zellen für 16 h mit 1µCi/Well 3H Tritiumthymidin inkubiert. Das in die Zellen eingebaute 3H
Tritiumthymidin wurde gemessen, um die Proliferation der Zellen zu bestimmen. B) dendritische Zellen wurden aus
Knochenmarkszellen von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen und C57BL/6 Kontrolltieren generiert. Je 3x105 Milzzellen aus
BALB/c Mäusen wurden mit verschiedenen Zahlen von dendritischen Zellen gemischt und für 72 h inkubiert. Sonst
war das Vorgehen wie in A. Grb2fl/fl CD4crewt n=5 Mäuse; Grb2fl/fl CD4cretg n=5 Mäuse; Für die Statistik wurde der TTest verwendet; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Diese Versuche wurden in Kooperation mit Elisabeth Zinser (AG
Steinkasserer) durchgeführt.
109
T-Zell spezifische Grb2 Knockoutmaus
0
0
30
00
0
30
0
10
00
30
00
0
10
00
30
00
10
00
30
00
0
0
0
0
30
0
0
10
00
25000
30
00
25000
0
25000
Grb2 DCs
Grb2fl/flCD4cretg DCs
10
00
50000
30
0
50000
10
00
cpm
100000
cpm
100000
Grb2fl/fl CD4cretg DCs
30
00
Grb2
Grb2fl/flCD4cretg LPS
100000
fl/fl
0
0
Grb2
Grb2fl/flCD4cretg TNF
50000
10
00
30
00
30
0
10
00
0
Number of BALB/c DCs
fl/fl
30
00
Grb2
tg
unstimulated
Grb2fl/flCD4cre
0
cpm
30
00
Number of BALB/c DCs
fl/fl
0
Number of BALB/c DCs
0
0
0
0
fl/fl
B
50000
10
00
*
30
00
30
0
10
00
30
00
0
10
00
0
0
0
**
30
00
*
50000
*
10
00
50000
Diskussion
7
Diskussion
7.1 Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Entwicklung und das Überleben von BZellen
Sowohl Grb2fl/fl mb1cre/+ als auch Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäuse weisen reduzierte B-Zell Zahlen auf,
die in der Entwicklung ab dem transitionalen B-Zell Stadium auftreten (Ackermann et al. 2011;
Jang et al. 2011). Dies scheint an einem späten Block in der B-Zell Entwicklung zu liegen, da die
Entwicklung von pre B-Zellen bis zum Stadium der unreifen B-Zellen nicht betroffen ist. In
dieser Arbeit sollte untersucht werden, welcher Mechanismus zu der reduzierten Zahl reifer BZellen in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen führt.
Dazu wurde das Überleben von Grb2-/- B-Zellen nach Stimulation mit BAFF in vitro untersucht.
Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen sind nicht in der Lage den BAFF-Rezeptor in der Entwicklung von
transitionalen zu reifen Zellen hochzuregulieren, weshalb reife B-Zellen in B-Zell spezifischen
Grb2-/- Mäusen weniger BAFF-Rezeptor auf der Oberfläche exprimieren (Ackermann et al. 2011).
Sowohl unreife als auch reife Grb2-/- B-Zellen wiesen nach Zugabe von BAFF keine Unterschiede
in ihrer Überlebensfähigkeit auf. Auch bei einer Titration der BAFF-Konzentration waren keine
Überlebensunterschiede in wt und Grb2-/- B-Zellen festzustellen. Darum kann ein verringertes
Überleben durch eine beeinträchtigte BAFF Antwort als Ursache für die reduzierten B-Zell
Zahlen in Grb2-/- Mäusen ausgeschlossen werden. Zudem weist eine normale Zahl an
Marginalzonen B-Zellen in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen auf eine weitgehend normale
Signalleitung über den BAFF-Rezeptor hin, da Marginalzonen B-Zellen stark von der
Signalleitung über den BAFF-Rezeptor abhängig sind (Sasaki et al. 2004).
Die Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse wurden mit Bcl2 trangenen Mäusen verpaart um zu überprüfen, ob
verminderte Apoptose bzw. verlängertes Überleben den Differenzierungsblock in vivo aufheben
können. Es wurde beschrieben, dass eine Bcl2 Überexpression die gestörte Entwicklung von
transitionalen B-Zellen z.B. in Lyn- (Meade et al. 2002) und BOB.1/OBF.1-defizienten Mäusen
(Brunner et al. 2003) wieder herstellen kann. B-Zellen von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen,
die Bcl2 überexprimieren, haben zwar ähnliche Überlebensraten wie Kontrollzellen, die Bcl2
überexprimieren aber die Überexpression von Bcl2 konnte den Differenzierungsblock in B-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen nicht aufheben. Knochenmarks B-Zellen, T1, T2 und reife B-Zellen
waren in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen mit transgenem Bcl2 gegenüber den Kontrolltieren
mit transgenem Bcl2 in ähnlicher Weise reduziert, wie in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
gegenüber Kontrollen ohne Bcl2 Überexpression. Dies deutet auf einen Differenzierungsblock
und weniger auf ein verringertes Überleben als Ursache für die reduzierte B-Zell Zahl in B-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen hin.
110
Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Entwicklung und das Überleben von B-Zellen
Diskussion
In vitro Differenzierungsversuche mit sortierten T2 B-Zellen bestätigten die Erkenntinisse aus den
Bcl2 transgenen Tieren. Die T2-Zellen reiften nach anti-IgM Stimulation zu reifen B-Zellen.
Allerdings war der Anteil der gereiften Zellen kleiner als in der Literatur beschrieben (Su &
Rawlings 2002). Die in vitro Differenzierung von Grb2-/- T2-Zellen war stark beeinträchtigt und
konnte auch nicht durch BAFF-Zugabe verbessert werden. Diese Daten deuten darauf hin, dass
die verringerte B-Zellzahl in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen eher auf einen Differenzierungsdefekt
zurückzuführen ist.
Calciumsignale, die über den BZR vermittelt werden sind entscheidend für die Entwicklung von
transitionalen zu reifen B-Zellen. Dies konnte mit Hilfe verschiedenster Mauslinien gezeigt
werden, in denen Signalmoleküle aus der BZR Signalleitung fehlten (Niiro & Clark 2002; Pappu
et al. 1999; Minegishi et al. 1999; Hayashi et al. 2000; Cheng et al. 1995; Turner et al. 1995; Xu
et al. 2000; Jumaa et al. 1999; Khan et al. 1995; Kerner et al. 1995). Grb2 ist ein negativer
Regulator des Calciumsignals, nicht nur in reifen B-Zellen (Ackermann et al. 2011), sondern auch
in T2 B-Zellen, wie das höhere Calciumsignal in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen zeigte. Das
Calciumsignal in T1 B-Zellen war aber nicht verändert. Es wurde beschrieben, dass wichtige
Elemente für den Schwellenwert der Calcium Mobilisierung in reifen B-Zellen während der
Reifung der transitionalen B-Zellen moduliert werden. So wird der inhibitorische BZR Corezeptor
CD22, der eine Grb2 Bindestelle besitzt, vom T1 B-Zell Stadium bis zu den reifen B-Zellen um
den Faktor 2,5 hochreguliert. Zudem hat die Src Kinase Lyn in reifen B-Zellen einen stärkeren
inhibitorischen Einfluss auf die Calciumsignalleitung als in unreifen B-Zellen (Gross et al. 2009).
Sowohl CD22 als auch Lyn werden in Grb2-/- B-Zellen nach BZR Stimulation weniger stark
phosphoryliert. Dieser beeinträchtigte inhibitorische Signalweg könnte zu dem höheren
Calciumsignal in Grb2-/- B-Zellen nach BZR Stimulation beitragen (Ackermann et al. 2011; Jang
et al. 2011). Mausstämme, die defizient für inhibitorische Proteine sind, weisen eine effizientere
Reifung von transitionalen zu reifen B-Zellen auf, wie beispielsweise für CD22 defiziente Mäuse
gezeigt wurde (Gerlach et al. 2003). Viele knockout Mäuse, denen positive Signalmoleküle
fehlen, weisen allerdings eine beeinträchtigte Reifung auf (Niiro & Clark 2002; Pappu et al. 1999;
Minegishi et al. 1999; Hayashi et al. 2000; Cheng et al. 1995; Turner et al. 1995; Xu et al. 2000;
Jumaa et al. 1999; Khan et al. 1995; Kerner et al. 1995; Wang et al. 2000; Hashimoto et al. 2000).
Darum ist es unwahrscheinlich, dass Calciumsignale in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen für
den beobachteten B-Zell Defekt verantwortlich sind.
Nachdem Calciumsignale als Ursache für den Differenzierungsdefekt ausgeschlossen werden
konnten wurde untersucht, ob andere Signalwege in Grb2-/- B-Zellen betroffen sind. Reife BZellen regulieren nach Stimulation beispielsweise c-Myc und Cyclin D2 hoch, die den Eintritt der
Zellen in den Zellzyklus fördern. Außerdem werden anti-apoptotische Gene der Bcl2 Familie
hochreguliert. Diese Gene werden in T1 B-Zellen nach BZR Stimulation nicht hochreguliert (Su
111
Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Entwicklung und das Überleben von B-Zellen
Diskussion
& Rawlings 2002; Andrews & Rawlings 2009; Carman et al. 1996). T1 Grb2-/- B-Zellen zeigten
einen Defekt in der Bcl2a1 (A1) und Bcl-xl Expression gegenüber Kontrollzellen. Zudem war die
Expression des Transkriptionsfaktors Mef2c verringert, der entscheidend für die Reifung von T1
B-Zellen zu reifen B-Zellen ist (Andrews et al. 2012). Für Bcl2a1 (A1), Bcl-xl und Mef2c konnten
wir die beschriebene Hochregulation nach BZR Stimulation in T2 und reifen B-Zellen nicht
nachweisen. Dies könnte am Zeitpunkt der Analyse nach der Stimulation liegen. A1 (Bcl2a1) und
Bcl-xl sind anti-apoptotische Proteine, die durch Akt und NFκB induziert werden können (Su &
Rawlings 2002; Su et al. 2002; Grumont et al. 1998; Grumont et al. 1999; Anderson et al. 1996;
Chen et al. 2000; Enzler et al. 2006). Allerdings scheint die NFκB Signalleitung in T1 und reifen
B-Zellen gleich reguliert zu werden (Andrews & Rawlings 2009). Weil die Grb2-/- B-Zellen starke
Beeinträchtigungen in der Akt Aktivierung nach BZR Stimulation aufweisen (Ackermann et al.
2011) könnte die verringerte Bcl2a1 (A1) und Bcl-xl Expression mit diesem Signalweg
zusammenhängen. Der Transkriptionsfaktor Mef2c ist in der Lage Bcl-xl, c-Myc und Cyclin
mRNAs zu induzieren. Dieser Effekt ist allerdings nicht direkt, weil es keine Bindestellen in
diesen
Zielgenen
gibt
(Andrews
et
al.
2012).
Mef2c
kann
calciumabhängig und
calciumunabhängig induziert werden. Weil die B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäuse nach BZR
Stimulation eine stärkere Calcium Mobilisierung zeigen ist es unwahrscheinlich, dass die
schwächere Mef2c Expression durch das Calciumsignal beeinflusst wird.
Für die Gene, die für c-Myc und Cyclin D2 kodieren, die den Zellzyklus initiieren, wurden
unterschiedliche Ergebnisse gemessen. Die c-Myc Expression ist in Grb2-/- B-Zellen nach BZR
Stimulation reduziert. Die Expression von c-Myc hängt vom PI3K Signalweg und
Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate Generierung ab (Gray et al. 1999; Astoul et al. 1999).
Die Defekte Akt Signalleitung in Grb2-/- B-Zellen nach BZR Stimulation, die ein Teil der PI3K
Signalkaskade ist, könnte die niedrigere c-Myc Expression erklären. Zuätzlich wurde beschrieben,
dass Cyclin D2 als wichtiger Faktor im Zellzyklus in T1 B-Zellen nach BZR Stimulation
schwächer induziert wird als in T2 B-Zellen (Su & Rawlings 2002). Cyclin D2 wird in der frühen
G1-Phase des Zellzyklus exprimiert und kodiert für eine cdk4 Untereinheit. Frühere Studien
haben gezeigt, dass sich Cyclin D2 nach BZR Stimulation in unreifen und reifen B-Zellen
ansammelt. Allerdings bleiben die unreifen im Gegensatz zu den reifen B-Zellen in der G1 Phase
und schaffen es nicht zu proliferieren. Sie sind nicht in der Lage wichtige Gene für den weiteren
Fortschritt des Zellzyklus zu exprimieren (Carman et al. 1996). Die Cyclin D2 Expression ist in
Grb2-/- B-Zellen generell erhöht. Dies könnte zumindest zum Teil mit einem höheren
Calciumsignal in T2 und reifen B-Zellen zusammenhängen, da ein höheres Calcium mit einer
stärkeren Cyclin D2 Expression in Verbindung gebracht wird (Chiles 2004). Sortierte unreife
Grb2-/- B-Zellen haben keinen Differenzierungsdefekt, sondern proliferieren eher stärker als
112
Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Entwicklung und das Überleben von B-Zellen
Diskussion
unreife B-Zellen aus Kontrolltieren (Ackermann et al. 2011). Dies spricht gegen einen Defekt in
der Induktion des Zellzyklus in Grb2-/- B-Zellen.
Zusammengefasst weisen die B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäuse einen Block in der B-Zell
Entwicklung auf. Dieser Block wird nicht durch eine beeinträchtigte BAFF Signallleitung
verursacht und kann auch nicht durch ein verlängertes Überleben der Zellen durch eine
Überexpression von Bcl2 aufgehoben werden. Die Expression verschiedener Gene in der
Signalleitung von Grb2-/- B-Zellen ist beeinträchtigt, die alle durch die PI3K/Akt Signalleitung
aktiviert werden können. Dieser Signalweg ist in BZR stimulierten Grb2-/- B-Zellen
beeinträchtigt. Die PI3K/Akt Signalleitung ist sowohl für das Überleben als auch für die
Differenzierung von peripheren B-Zellen wichtig (Fruman et al. 1999; Srinivasan et al. 2009).
Darum ist es wahrscheinlich, dass dieser Signalweg zum Phenotyp der B-Zell spezifischen Grb2-/Mäuse beiträgt. Aufgrund der Vielzahl an Signalwegen an denen Grb2 beteiligt ist, ist es in
Zukunft wichtig transkriptom- und proteomweite Analysen durchzuführen, die helfen einen
Überblick über alle veränderten Signalwege in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen zu gewinnen.
Auf dieser Grundlage könnten gezielt die Signalwege analysiert werden, die in B-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen verändert und wichtig für die B-Zell Entwicklung sind.
Aufgrund der reduzierten Zahl unreifer B-Zellen im Knochenmark und der reduzierten Zahl von
T1 B-Zellen im Blut ist es wahrscheinlich, dass der Block bei den unreifen B-Zellen im
Knochenmark beginnt. Dabei könnte auch die Auswanderung der B-Zellen aus dem
Knochenmark betroffen sein. BrdU Experimente zeigen einen geringeren BrdU Einbau in T1
Zellen von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen. Dies deutet auf eine reduzierte Zahl von B-Zellen
hin, die aus dem Knochenmark auswandern. Außerdem zeigten Versuche mit gemischten
Knochenmarkschimären einen kompetetiven Vorteil von unreifen Kontroll B-Zellen gegenüber
unreifen Grb2-/- B-Zellen im Knochenmark (Ackermann et al. 2011). Der Differenzierungsblock
ist in den T1, T2 und reifen B-Zellen der Milz am deutlichsten erkennbar. Allerdings könnte der
Block schon in unreifen B-Zellen stattfinden, die das Knochenmark verlassen. Dennoch haben
Grb2-/- T2 B-Zellen einen Differenzierungsdefekt weiter zu reifen B-Zellen, wie in den in vitro
Differenzierungsversuchen gezeigt werden konnte. Aufgrund der komplexen Signalstrukturen und
der Vielzahl an Signalwegen an denen Grb2 beteiligt ist, kann nicht ausgeschlossen werden, dass
verschiedene Funktionen von Grb2 die B-Zell Differenzierung in unterschiedlichen Stadien
beeinflussen.
113
Einfluss von Grb2 auf die B-Zell Entwicklung und das Überleben von B-Zellen
Diskussion
7.2 Bedeutung von Grb2 für die FcγR2b Expression und Signalleitung
Grb2 ist ein negativer Regulator der Calcium Mobilisierung über den BZR in Zelllinien und
primären B-Zellen (Stork et al. 2004; Stork et al. 2007; Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011;
Neumann et al. 2011). In einer reifen, murinen B-Zelllinie, die spontan Grb2 verloren hat (Harmer
& DeFranco 1999), wurde gezeigt, dass Grb2 die inhibitorische Wirkung des FcγR2b verstärkt.
Dabei verstärkt die Costimulation des BZR mit dem FcγR2b die Bildung von inhibitorischen
Komplexen, wie einem Dok-3/Grb2/SHIP Komplex an denen Grb2 beteiligt ist, während positive
Funktionen von Grb2 wie die Bindung an CD19 geschwächt werden (Neumann et al. 2011). Es
sollte untersucht werden, ob Grb2 auch in primären B-Zellen zur FcγR2b Signalleitung beiträgt.
Um die Funktionalität des FcγR2b in primären B-Zellen zu untersuchen, wurden
Calciumexperimente mit Grb2-/- B-Zellen durchgeführt. Dabei wurde die Wirkung des FcγR2b in
verschiedenen peripheren B-Zell Entwicklungsstadien untersucht, da viele Regulatoren des
Calciumsignalweges erst während der Entwicklung von unreifen zu reifen B-Zellen reguliert
werden (Gross et al. 2009), während der FcγR2b schon früh in der B-Zell Entwicklung exprimiert
wird (Foy et al. 1992). Sowohl in Grb2-/- T1, T2 als auch in reifen B-Zellen führte eine
Kreuzvernetzung des FcγR2b mit dem BZR über komplette anti-IgM Antikörper zu einer
Inhibition des Calciumsignales. In Grb2-/- T1 B-Zellen, bei denen das Calciumsignal gegenüber
Kontoll B-Zellen unverändert ist, war die Inhibition über den FcγR2b vergleichbar mit der in
Kontroll T1 B-Zellen. Auch im Knochenmark war die Inhibition über den FcγR2b in Grb2-/- pre
B-Zellen intakt (Daten von Christina Forsch und Daniel Radtke nicht gezeigt). Diese Experimente
deuten darauf hin, dass der Verlusst von Grb2 in primären B-Zellen die inhibitorische Funktion
des FcγR2b nicht beeinflusst.
Um zu überprüfen, ob die funktionelle Inhibition über den FcγR2b in primären B-Zellen
gegenüber der beeinträchtigten Inhibition in murinen Bal17.TR Zellen durch eine veränderte
Expression des FcγR2b auf primären Grb2-/- B-Zellen hervorgerufen wird, wurde die FcγR2b
Expression gemessen. Niedrigere Level des FcγR2b werden mit einer stärkeren Aktivierbarkeit
von B-Zellen und Autoimmunität in Verbindung gebracht (Xiu et al. 2002; Jiang et al. 2000;
Espéli et al. 2012; Su et al. 2007), während die Auswirkungen einer stärkeren Expression des
FcγR2b weitgehend unbekannt sind. In der Milz war die Expression des FcγR2b auf unreifen
Grb2-/- B-Zellen moderat erhöht. Die Expression des FcγR2b auf reifen Grb2-/- B-Zellen, in denen
die Inhibition über den FcγR2b intakt ist, war allerdings eher unverändert. Außerdem wurde die
FcγR2b Expression von Grb2-/- B-Zellen aus dem Knochenmark bestimmt. Grb2 hat keinen
Einfluss auf die FcγR2b Expression auf pro B-, pre B- oder reifen B-Zellen im Knochenmark.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die moderaten Unterschiede in der Expression des FcγR2b
keinen entscheidenden Einfluss auf die inhibitorische Wirkung des FcγR2b haben. Damit kann
114
Bedeutung von Grb2 für die FcγR2b Expression und Signalleitung
Diskussion
die Expression des FcγR2b nicht für die Unterschiede in der inhibitorischen Funktion des FcγR2b
zwischen der Bal17.TR Zelllinie und primären B-Zellen verantwortlich sein.
Aufgrund der veränderten FcγR2b Expression in Grb2-/- B-Zellen und der beeinträchtigten
Keimzentrumsbildung in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen (Ackermann et al. 2011) sollte untersucht
werden, ob die Expression des FcγR2b auch auf Keimzentrums B-Zellen verändert ist. Der
FcγR2b wird in Keimzentrumzellen hochreguliert. Eine niedrige Expression des FcγR2b in
Keimzentrumszellen führt zu Autoimmunität (Xiu et al. 2002; Jiang et al. 2000; Espéli et al.
2012). Die Hochregulation der FcγR2b Expression auf Keimzentrumszellen in Grb2fl/fl mb1cre/+
Mäusen war intakt. Grb2 hat also keinen Einfluss auf die Expression des FcγR2b in
Keimzentrums B-Zellen.
Zusammengefasst hat Grb2 keinen entscheidenden Einfluss auf die Inhibition des BZR Signals
durch den FcγR2b. Die Expression des FcγR2b ist weitgehend unverändert. Somit ist die defekte
Inhibition über den FcγR2b in Grb2-defizienten Bal17.TR Zellen (Neumann et al. 2011) nicht auf
primäre B-Zellen übertragbar. Damit ist weitgehend ausgeschlossen, dass der FcγR2b die
Aktivierarkeit von Grb2-/- B-Zellen verändert, einen Block in der frühen B-Zell Entwicklung
auslöst oder an einer beeinträchtigten Keimzentrumsentwicklung beteiligt ist.
7.3 Die Rolle von Grb2 in der Keimzentrumsreaktion
Die Keimzentrumsreaktion ist in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen beeinträchtigt (Ackermann
et al. 2011; Jang et al. 2011). Diese Beeinträchtigung hängt mit einem Defekt der Grb2-/- B-Zellen
zusammen, Lymphotoxin-β zu sezernieren, was unter Anderem zu einer beeinträchtigten Bildung
von Netzwerken aus follikulären dendritischen Zellen und der Marginalzone führt (Jang et al.
2011). Es wurde gezeigt, dass Grb2-/- B-Zellen in gemischten Knochenmarkschimären mit wt BZellen in der Lage sind normale Keimzentren zu bilden. Außerdem weisen Grb2 -/- B-Zellen, die
Lymphotoxin-β überexprimieren eine normale Keimzentrumsreaktion auf (Jang et al. 2011).
Somit ist Grb2 über seinen Einfluss auf die Lymphotoxin-β Sezernierung wichtig für die
Keimzentrumsreaktion.
Es sollte untersucht werden, ob normale Keimzentren gebildet werden, wenn Grb2 erst während
der Keimzentrumsreaktion in Keimzentrums B-Zellen ausgeschaltet wird. Dazu wurden
Grb2fl/flCγ1cre/+ Mäuse, die Grb2 erst in Keimzentrumszellen deletieren, mit Schafserythrozyten
immunisiert und die Keimzentrumsreaktion wurde 10 Tage nach der Immunisierung analysiert.
Sowohl die Zahl, die Größe und das Verhältnis von B-Zellen der dunklen zu B-Zellen der hellen
Zone der Keimzentren waren in Grb2fl/flCγ1cre/+ Mäusen unverändert. Auch die Zahl der
follikulären T Helferzellen war unverändert. Diese Daten zeigen, dass Grb2 in etablierten
115
Die Rolle von Grb2 in der Keimzentrumsreaktion
Diskussion
Keimzentrums B-Zellen keine essentielle Rolle spielt. Diese Ergebnisse sind kompatibel mit
veröffentlichten Daten die nahe legen, dass Grb2 wichtig für die Lymphotoxin-β Sezernierung
naiver B-Zellen ist. Lymphotoxin-β ist wiederum wichtig für die Architektur der Milz und somit
für die Induktion einer normalen Keimzentrumsreaktion (Jang et al. 2011).
Interessanterweise ist auch die Zahl der IgG+ B-Zellen in der Milz an Tag 10 nach der
Immunisierung mit Schafserythrozyten in Grb2fl/flCγ1cre/+ Mäusen unverändert, während Grb2fl/fl
mb1cre/+
Mäuse,
die
einen
Block
in
der
B-Zell
Entwicklung
und
eine
defekte
Keimzentrumsreaktion aufweisen, weniger IgG B-Zellen haben (Ackermann et al. 2011). Grb2
hat also keinen intrinsischen Einfluss auf die Entwicklung von IgG B-Zellen im Keimzentrum.
Dafür sprechen auch in vitro Versuche zum Klassenwechsel von Grb2-/- B-Zellen, die gezeigt
haben, dass Grb2 für den Klassenwechsel nicht gebraucht wird.
7.4 Einfluss von Grb2 auf die sekundäre Immunantwort und Gedächtnis BZellen
IgG Gedächtniszellen können stärker über ihren BZR stimuliert werden als IgM B-Zellen. Für
Zelllinien wurde beschrieben, dass sowohl SAP97 (Liu et al. 2010) als auch das Adapterprotein
Grb2 (Engels et al. 2009) über verschiedene Bindemotive an die intrazelluläre Domäne des IgGRezeptors binden können und die Signalleitung über den IgG-BZR verstärken. Allerdings ist die
Rolle von Grb2 bei der Signallleitung über den BZR umstritten (Liu et al. 2010). Es wurde
beschrieben, dass sowohl Grb2fl/fl CD19cre/+ Mäuse als auch Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse eine stärkere
IgM Antwort, aber eine unveränderte IgG Immunantwort gegen das lösliche Protein-Antigen NPKLH bilden (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011). Sonst ist der Einfluss von Grb2 auf die
Immunantwort in vivo weitgehend unbekannt.
Zunächst wurde getestet, ob Grb2 bei der sekundären IgG Immunantwort gegen ein partikuläres
Antigen eine Rolle spielt. Dazu wurden B-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse mit virusartigen
Partikeln des humanen Zytomegalovirus (VLPs) immunisiert, die eine starke sekundäre IgG
Antwort auslösen (Hebeis et al. 2004). Dadurch sollte überprüft werden, ob Grb2 in vivo einen
Einfluss auf die sekundäre Immunantwort / Reaktivierung von IgG-Zellen hat. Die sekundäre
Immunantwort gegen VLPs war in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen verringert. Dieser Effekt
war nicht auf einen generellen Defekt zum Klassenwechsel in Grb2-/- B-Zellen zurückzuführen, da
Grb2-/- B-Zellen in vitro fähig waren einen normalen Klassenwechsel zu vollziehen. Der Verlust
von Grb2 schwächt also die sekundäre Immunantwort von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
gegenüber Kontrolltieren. Die Zahl der B-Zellen ist in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
generell reduziert und könnte die geringere sekundäre Antwort erklären (Ackermann et al. 2011;
Jang et al. 2011). Um zu überprüfen, ob auch die Zahl der IgG Gedächtniszellen in B-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen reduziert ist und für die geringere sekundäre Antwort verantwortlich
116
Einfluss von Grb2 auf die sekundäre Immunantwort und Gedächtnis B-Zellen
Diskussion
sein könnte, wurde die Zahl der IgG1/IgG2a/IgG2b+ B-Zellen zwei Monate nach der letzten
Immunisierung mittels Durchflusszytometrie bestimmt. In B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
waren geringere IgG1/IgG2a/IgG2b+ B-Zellzahlen vorhanden. Daraus ergeben sich zwei
Hypothesen. Grb2 wirkt verstärkend auf die sekundäre Immunantwort, weil es einen positiven
Einfluss auf die Zahl der IgG positiven B-Zellen hat oder Grb2 verstärkt die Antwort von IgG
positiven Zellen über intrinsische Mechanismen.
Es sollte überprüft werden, ob Grb2 auch einen intrinsischen Effekt bei der Reaktivierung von
IgG Zellen hat. Darum wurden Gesamtmilzzellen mit gleich vielen IgG1/IgG2a/IgG2b+
Gedächtnis B-Zellen aus B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen bzw. Kontrolltieren in Mäuse ohne
B- und T-Zellen (Rag1-/-) übertragen und reaktiviert. Der IgG Antikörpertiter gegen VLPs und die
Zahl der IgG produzierenden Zellen war in Empfängermäusen mit Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen
deutlich geringer als in Empfängermäusen mit Kontroll-Gedächtnis B-Zellen. Dabei kann
ausgeschlossen werden, dass mögliche DNA Rückstände in den VLPs über die Bindung an Toll
Like Rezptoren für die reduzierte Immunantwort der Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen verantwortlich
sind, da Grb2-/- B-Zellen stärker über TLRs aktiviert werden können. Die defekte
Gedächtnisantwort ist auch unabhängig von der Antigenpräsentation der B-Zellen, da die
Reaktivierung der B-Zellen unabhängig von T-Zellhilfe funktioniert (Hebeis et al. 2004). Der
Transfer von IgG Gedächtnis B-Zellen reicht aber nicht aus um sicherzustellen, dass in dem Pool
der Gedächtniszellen auch dieselbe Zahl antigenspezifischer Gedächtniszellen vorhanden war.
Außerdem werden beim Übertrag von Gesamtmilzzellen auch IgM Gedächtniszellen mit
übertragen (Dell et al. 1989; Dogan et al. 2009; Pape et al. 2011; White & Gray 2000; Wolniak et
al. 2006). In B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen ist sowohl die Zahl der naiven als auch der IgM
Plasmazellen erhöht (Ackermann et al. 2011), was es wahrscheinlich macht, dass Grb2 auch einen
Einfluss auf IgM Gedächtniszellen hat. Auch wenn die meisten IgM Gedächtniszellen nach der
Reaktivierung zu Keimzentrumszellen werden, kann ein kleiner Teil auch zu IgG sekretierenden
Plasmazellen werden (Dogan et al. 2009; Kometani et al. 2013; Pape et al. 2011). Diese können
nicht mehr von Plasmazellen, die sich aus IgG Gedächtniszellen entwickelten, unterschieden
werden. Darum wurde als nächstes eine definierte Zahl sortierter, antigenspezifischer IgG+
Gedächtniszellen übertragen. Als Antigen wurde das aufgereinigte Glykoprotein B (gB) des
humanen Zytomegalovirus verwendet. Die gB-spezifischen Gedächtnis B-Zellen werden dabei
durch die Bindung von fluoreszenz-Farbstoff markiertem gB an den BZR identifiziert. Das
monomere gB allein ohne T-Zell Hilfe reicht allerdings nicht aus um die Gedächtniszellen zu
reaktivieren, wodurch eine Voraktivierung der Gedächtniszellen weitgehend vermieden wird
(Hebeis et al. 2004). In partikulärer Form, wie z.B. in VLPs ist gB aber in der Lage Gedächtnis BZellen ohne T-Zell Hilfe zu aktivieren (Weisel et al. 2010). Die Reaktivierung der gB
spezifischen Gedächtnis B-Zellen in den Empfängertieren erfolgte erneut T-Zell unabhängig mit
117
Einfluss von Grb2 auf die sekundäre Immunantwort und Gedächtnis B-Zellen
Diskussion
VLPs, die gB enthalten. Der gB-spezifische IgG Antikörpertiter und die Zahl der Zellen, die in
der Milz IgGs gegen gB produzierten, waren in Rag1-/- Mäusen mit Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen
deutlich geringer als in Rag1-/- Mäusen mit Kontroll-Gedächtnis B-Zellen. Grb2 verstärkt also
intrinsisch die Gedächtnisantwort von IgG+ antigenspezifischen B-Zellen.
Die verringerte Gedächtnisantwort der Grb2-/- B-Zellen aus Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen kann
mehrere Gründe haben. Zum einen kann die beeinträchtigte B-Zell Entwicklung dazu führen, dass
sich die Gedächtnis B-Zellen nicht richtig entwickeln. Gedächtnis B-Zellen bilden z.B. ein
anderes Genexpressionsprofil aus als naive B-Zellen (Bhattacharya et al. 2007; Tomayko et al.
2008). Dabei werden auch TNF Rezeptoren und Proteine der Bcl2 Familie hoch reguliert (Good
et al. 2009), die in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen schon in naiven B-Zellen schwächer exprimiert
werden (Ackermann et al. 2011). Auch das in naiven Grb2-/- B-Zellen nach BZR Stimulation
schwächer aktivierte Ras (Ackermann et al. 2011) könnte die Entwicklung der Gedächtnis BZellen negativ beeinflussen (Takahashi et al. 2005). Zum Anderen können intrinsische
Funktionen von Grb2 in den Gedächtnis B-Zellen wichtig für die Gedächtnisantwort sein. Für
Zelllinien wurde beschrieben, dass Grb2 an die immunoglobulin tail tyrosine (ITT) genannte
Bindestelle (Engels et al. 2009) des IgG-Rezeptors binden kann und so die Signalleitung über den
BZR verstärkt. Allerdings ist die Rolle von Grb2 bei der Signallleitung über den BZR umstritten
(Liu et al. 2010). Darum wurden gB spezifische Gedächtnis B-Zellen in Grb2fl/flCγ1cre/+ Mäusen
generiert, die Grb2 erst in Keimzentrumzellen deletieren und eine normale Keimzentrumsreaktion
aufweisen. Die Grb2fl/flCγ1cre/+ Mäuse wiesen sowohl nach der primären als auch nach der
sekundären Immunantwort normale Antikörpertiter gegen das lösliche Proteinantigen gB auf, was
auf eine intakte Immunantwort hindeutet. Die generierten Gedächtnis B-Zellen wurden in Rag1-/Mäuse übertragen und T-Zell unabhängig mit VLPs reaktiviert. Der gB spezifische IgG
Antikörpertiter und die Zahl der Zellen, die in der Milz IgGs gegen gB produzierten waren in
Rag1-/- Mäusen mit Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen deutlich reduziert. Grb2 verstärkt also
unabhängig von seinen Funktionen bei der Entwicklung naiver B-Zellen die Gedächtnisantwort
von IgG1 B-Zellen.
Es sollte weiterhin untersucht werden, ob T-Zell Hilfe die defekte Gedächtnisantwort von Grb2-/B-Zellen kompensieren kann. Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse wurden mit dem löslichen Protein/Haptenantigen NP-CGG immunisiert um Gedächtnis B-Zellen zu generieren. Diese wurden in
genetisch kompatible wt Rezipienten übertragen. Ein Teil der Rezipienten wurde ca. zwei
Wochen vor dem Übertrag mit CGG immunisiert. Dadurch gab es in den mit CGG
vorimmunisierten Mäusen aktivierte T-Zellen, die NP-spezifische Gedächtnis B-Zellen aus mit
NP-CGG immunisierten Donortieren effektiv bei der Aktivierung helfen konnten. Eine
gesteigerte T-Zell Hilfe verstärkte die humorale Immunantwort sowohl in Rezipienten mit Grb2 -/Gedächtnis B-Zellen als auch in Rezipienten mit Kontroll Gedächtnis B-Zellen tendenziell. Der
118
Einfluss von Grb2 auf die sekundäre Immunantwort und Gedächtnis B-Zellen
Diskussion
gB spezifische IgG Antikörpertiter war in Rezipienten mit Grb2-/- Gedächtnis B-Zellen mit und
ohne eine gesteigerte T-Zell Hilfe tendenziell geringer als in Rezipienten mit Kontroll Gedächtnis
B-Zellen. Dieser Ansatz weist darauf hin, dass die mit gB erzielten Ergebnisse auf ein anderes
Antigen übertragbar sein könnten. Zudem wurden die Gedächtniszellen anders als in den
Versuchen mit VLPs oder gB in Mäuse mit einem intakten Immunsystem übertragen, was die
Ergebnisse physiologisch relevanter macht. Der intrinsische Einfluss von Grb2 auf Gedächtnis BZellen scheint auch bei einer stärkeren T-Zell Hilfe eine wichtige Rolle für die humorale
Immunantwort zu spielen. Es sind aber weitere Versuche nötig, um diese Hypothese weiter zu
belegen.
Mögliche Mechanismen für die stärkere Gedächtnisantwort sind eine stärkere Aktivierung und
Signallleitung oder ein verlängertes Überleben der aktivierten B-Zellen. Diese Mechanismen
werden wahrscheinlich durch die Bindung von Grb2 an die immunoglobulin tail tyrosine (ITT)
genannte Bindestelle des IgG-Rezeptors gesteuert, die die Signalleitung über den BZR verstärkt
(Engels et al. 2009). Die Gruppe von Jürgen Wienands hat kürzlich gezeigt, dass Syk das ITT
Motiv im intrazellulären Teil von IgG phosphorylieren kann. In der Folge kann Grb2 über seine
SH2-Domäne an das ITT Motiv binden und rekrutiert über seine N-terminale SH3-Domäne
wiederum die Kinase Btk zum intrazellulären Bereich IgG-Rezeptors. Das durch Grb2 rekrutierte
Btk verstärkt die Calciummobilisierung in IgG+ B-Zellen gegenüber IgM+ B-Zellen. Außerdem
erhöht das ITT Motiv die Aktivierbarkeit von IgG+ B-Zellen gegenüber IgM+ B-Zellen. Versuche
mit Grb2 defizienten B-Zellen haben gezeigt, dass die Signalleitung über das ITT Motiv Grb2
spezifisch ist. Grap, das eine hohe Ähnlichkeit zu Grb2 aufweist bindet auch an das ITT Motiv
aber verstärkt die Signalleitung über den IgG BZR gegenüber dem IgM BZR nicht und rekrutiert
kein Btk zum IgG-Rezeptor (Engels et al. 2014).
Aufgrund der Vielzahl an Signalwegen an denen Grb2 beteiligt ist (Neumann et al. 2009) kann
aber nicht ausgeschlossen werden, dass neben der Bindung von Grb2 an das ITT Motiv im
zytoplasmatischen Teil des IgG und IgE BZRs auch andere Funktionen von Grb2 die
Gedächtnisantwort positiv beeinflussen.
119
Einfluss von Grb2 auf die sekundäre Immunantwort und Gedächtnis B-Zellen
Diskussion
7.5 Grb2 – Mögliche Autoimmunität in alternden Mäusen
Das Adapterprotein Grb2 ist an vielen inhibierenden und aktivierenden Signalwegen beteiligt.
Dabei können je nach Entwicklungsstadium und Situation die positiven oder die negativen
Funktionen von Grb2 überwiegen. So wirkt Grb2 auf die Aktivierung von IgM B-Zellen potentiell
inhibierend (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011), während es in Gedächtnis B-Zellen eher
aktivierend wirkt (Engels et al. 2009). Grb2 bindet an inhibitorische BZR Corezeptoren, wie
CD22, CD72 und den FcγR2b, so wie Phosphatasen der PEST Familie, SHP1 und SHP2, die alle
direkt oder indirekt mit Autoimmunität in Verbindung gebracht werden (Tsubata 1999; Jellusova
& Nitschke 2012; Bolland & Ravetch 2000; Chan et al. 1997; Ono et al. 1996; Ono et al. 1997;
Veillette et al. 2009). B-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse zeigen zudem eine schwächere
Phosphorylierung von CD22 und der Kinase Lyn und eine dazu passende stärkere Calcium
Mobilisierung, so wie hochregulierte Aktivierungsmarker, was darauf hindeutet, dass die Grb2-/IgM B-Zellen voraktiviert sind (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011). Durch die Interaktion
und Modulation von Faktoren, die mit Autoimmunität in Verbindung gebracht werden und die
Rolle von Grb2 bei der Generierung von IgM Plasmazellen, ist es möglich, dass Grb2 die
Entwicklung von Autoimmunerkrankungen beeinflussen kann. Es wurde bereits beschrieben, dass
5-6 Monate alte B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäuse höhere IgM Antikörpertiter gegen dsDNA,
ssDNA und Kernantigene bilden (Jang et al. 2011).
Um die Rolle von Grb2 in der Autoimmunität weiter zu untersuchen, wurden 10-12 Monate alte
B-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse auf anti-dsDNA IgG Antikörper, anti-nukleäre IgG Antikörper
und den Harnstoffanteil im Blut untersucht, der Rückschlüsse auf die Nierenfunktion zulässt
(Black 1973). Es wurden keine erhöhten Werte autoreaktiver Antikörper und auch kein erhöhter
Stickstoffanteil im Blut von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen gemessen. Dies spiegelt auch die
Literatur wieder, in der keine autoreaktiven IgG Antikörper in 5-6 Monate alten B-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen gefunden wurden und die Tiere bis zu einem Alter von einem Jahr
keine Autoimmunkrankheiten entwickelten (Jang et al. 2011). Grb2 allein ist also kein
entscheidender Faktor, der Autoimmunität verhindert. Aufgrund seiner Beteiligungen an
inhibitorischen Signalwegen ist es aber möglich, dass der Verlust von Grb2 in Kombination mit
dem Verlust anderer Faktoren zur Entwicklung von Autoimmunität beitragen kann.
120
Grb2 – Mögliche Autoimmunität in alternden Mäusen
Diskussion
7.6 Einfluss von Grb2 auf B1 B-Zellen
B1 B-Zellen sind für Thymus-unabhängige Typ II (TI-2) Immunantworten wichtig (Martin &
Kearney 2001; Fagarasan & Honjo 2000). Die Thymus-unabhängige Typ II Immunantwort des
IgG3 Isotyps gegen das TI-2 Antigen TNP-Ficoll ist in B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
reduziert (Ackermann et al. 2011).
Es sollte untersucht werden, ob die Zahl der B1-Zellen verändert ist und diesen Effekt erklären
kann. Die B1a und B1b B-Zellen im Peritoneum von B-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen sind
reduziert, während die Zahl der B1 B-Zellen in der Milz erhöht ist. Im Peritoneum sind die B1
Zellen die größte B-Zell Population (Berland & Wortis 2002; Baumgarth 2011) und kommen als
erstes mit dem i.p. verabreichten TNP-Ficoll Antigen in Kontakt. Der Verlust von Grb2
beeinflusst die Zahl an B1 Zellen im Peritoneum und reduziert somit wahrscheinlich die Thymusunabhängige Typ II Immunantwort (Ackermann et al. 2011). Die Veränderungen der B1
Zellpopulationen im Peritoneum wurden bereits beschrieben, waren aber aufgrund von geringen
Mauszahlen teilweise nicht signifikant (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011).
121
Einfluss von Grb2 auf B1 B-Zellen
Diskussion
7.7 Die Rolle von Grb2 in der T-Zell Entwicklung
Wird Grb2 früh in der T-Zell Entwicklung durch cre unter der Kontrolle des proximalen Lck
Promotors deletiert, der ab dem Übergang vom DN2 zum DN3 Stadium aktiv ist, kommt es zu
einer Reduktion der CD4+CD8+ T-Zellen um etwa 30 %. Anschließend ist die positive Selektion
beeinträchtigt, was zu einer starken Reduktion der CD4+ und CD8+ T-Zellen führt, die sich auch
in der Peripherie fortsetzt. Desweiteren wird die negative Selektion gestört. Dadurch gelangen TZellen in die Peripherie, die normal durch eine zu starke Bindung an MHC-Peptid Komplexe
negativ selektioniert worden wären und dadurch potentiell autoreaktiv sind (Jang et al. 2010).
Es sollte untersucht werden, wie sich die Deletion von Grb2 in unterschiedlichen
Entwicklungsstadien auf die T-Zell Entwicklung auswirkt. Dazu wurde die Deletion von Grb2
durch cre unter der Kontrolle des proximalen Lck Promotors (Orban et al. 1992) mit der Deletion
durch CD4cre verglichen. Der proximale Lck Promotor ist ab dem Übergang vom DN2 zum DN3
Stadium aktiv (Shimizu et al. 2001), während der CD4cre ab dem doppeltpositiven T-Zell
Stadium aktiv ist (Lee et al. 2001). In der frühen T-Zell Entwicklung von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen
waren mehr DN3 T-Zellen und weniger DN4 T-Zellen vorhanden, was auf einen leichten
Entwicklungsblock vom DN3 zum DN4 Stadium hindeutet, der zu der Reduktion der
doppeltpositiven T-Zellen um 30% (Jang et al. 2010) beitragen könnte. Die DN3 und DN4
Populationen sind in der Grb2fl/fl CD4cretg Maus unverändert, weil Grb2 in diesem Stadium noch
nicht deletiert wird. Dazu passt, dass die Zahl der TCRβ+HSA+ unreifen T-Zellen in Grb2fl/fl
Lckcretg Mäusen leicht reduziert und in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen unverändert ist. Die TCRβKette wird ab dem DN3 Stadium exprimiert (von Boehmer 2005), nach dem die T-Zellzahlen in
Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen schon leicht reduziert sind, während die T-Zellen in der Grb2fl/fl CD4cretg
Maus noch unverändert sind. Grb2 hat also einen moderaten Effekt auf die Entwicklung der
doppeltnegativen T-Zellen.
Die doppelt negativen T-Zellen entwickeln sich weiter zu CD4+CD8+ doppelt positiven T-Zellen
(Koch & Radtke 2011). In Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen waren tendenziell weniger doppelt positive TZellen vorhanden. Die Daten bestätigen die Ergebnisse aus der Literatur, dass die doppelt
positiven T-Zellen in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen um 30% reduziert sind (Jang et al. 2010). Dies
kann mit der beeinträchtigten Entwicklung der doppelt negativen T-Zellen in Grb2fl/fl Lckcretg
Mäusen zusammen hängen. Die Zahl der doppelt positiven T-Zellen in der Grb2fl/fl CD4cretg Maus
war hingegen unverändert. Zusätzlich wurde auch beschrieben, dass die positive Selektion von
Grb2-/- T-Zellen in TCR-transgenen Mausmodellen stark beeinträchtigt ist. Dabei ist Grb2 sowohl
122
Die Rolle von Grb2 in der T-Zell Entwicklung
Diskussion
in CD4+ als auch CD8+ T-Zellen wichtig (Jang et al. 2010). Die positive Selektion findet im
doppelt positiven T-Zell Stadium statt (Klein et al. 2009) und könnte somit zu der geringeren Zahl
an doppelt positiven T-Zellen in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen beitragen. Nach der Selektion
entwickeln sich die doppelt positiven T-Zellen zu CD4+ oder CD8+ einzel positiven Zellen (Klein
et al. 2009). In Folge der defekten positivien Selektion in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen ist die Zahl der
CD4+ bzw. CD8+ einzelpositiven T-Zellen wie in der Literatur beschrieben stark reduziert (Jang et
al. 2010).
Erwähnenswert ist, dass die Expression von CD5 und CD69 auf doppelt positiven T-Zellen von
Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen unverändert war. Die Expression von CD5
und CD69 ist abhängig von der TZR-Expression/Signalleitung und wird mit positiver Selektion in
Verbindung gebracht (Azzam et al. 1998; Dutz et al. 1995; Swat et al. 1993; Bendelac et al. 1992;
Testi et al. 1988), die in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen stark beeinträchtigt ist. Die positive Selektion ist
ein Prozess, der in mehreren Schritten stattfindet. Zur Initiierung ist die Bindung des T-Zell
Rezptors an MHC Moleküle notwendig, die dazu führt, dass doppelt positive T-Zellen zu einem
CD4+CD8+CD69+ Stadium differenzieren (Hare et al. 1999), in dem auch CD5 hochreguliert wird
(Merkenschlager et al. 1997). Dieser Schritt allein reicht aber nicht für eine positive Selektion aus
(Bendelac et al. 1992; Kishimoto & Sprent 1997). Für die positive Selektion sind weitere MHCunabhängige Schritte notwendig an denen Epithelzellen des Thymus beteiligt sind (Hare et al.
1999; Anderson et al. 1999). Die unveränderte Expression von CD69 und CD5 in
doppeltpositiven Grb2-/- B-Zellen legt nahe, dass eine Interaktion von doppeltpositiven Grb2-/- BZellen mit MHC-Molekülen stattfindet und die über den T-Zell Rezeptor vermittelten Signale
ausreichen, um CD69 und CD5 zu induzieren. Dafür, dass die Stärke des TZR Signales nicht stark
beeinträchtigt ist, sprechen auch Calcium Mobilisierungsexperimente, in denen doppeltpositive
Grb2-/- B-Zellen nach TZR Stimulation ein leicht stärkeres Calciumsignal zeigten. Der Defekt in
der positiven Selektion von Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen kann also mit qualitativen Unterschieden in
der TZR Signalleitung oder TZR unabhängigen Signalwegen im weiteren Verlauf der weiteren
positiven Selektion zusammenhängen, an denen Grb2 beteiligt ist. Grb2 spielt eine wichtige Rolle
in der positiven Selektion von T-Zellen in der Entwicklung, die unabhängig von den Signalwegen
ist, welche die CD69 und CD5 Expression steuern.
Die Zahl der CD4+CD8+, CD4+ oder CD8+ T-Zellen im Thymus von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen ist
nicht verändert. In Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen beginnt cre das Gen für Grb2 ab dem doppelt
positiven T-Zellstadium zu deletieren (Lee et al. 2001), in dem auch die positive Selektion
stattfindet, die in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen stark beeinträchtigt ist (Jang et al. 2010). Das die
positive Selektion in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen weniger stark betroffen ist, kann mit der
123
Die Rolle von Grb2 in der T-Zell Entwicklung
Diskussion
Deletionseffizienz und der Halbwertszeit von Grb2 zusammenhängen. Die Menge an Grb2, die
für eine gewisse Zeit in den T-Zellen verbleibt, könnte für viele Zellen ausreichen, um die
positive Selektion erfolgreich zu durchlaufen. So zeigten Mäuse mit einem haploid deletierten
Grb2-Gen, deren T-Zellen etwa 40 % der normalen Menge an Grb2 aufwiesen, keinen Defekt in
der positiven Selektion (Gong et al. 2001). Eine reduzierte Menge an Grb2 ist also ausreichend
für die positive Selektion. Alternativ könnte die Funktion von Grb2 in der frühen T-Zell
Entwicklung wichtig für die positive Selektion sein. Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse deletieren Grb2 früh
in der Entwicklung und weisen einen schweren Defekt der positiven Selektion auf, während die
positive Selektion in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen, die Grb2 später deletieren, kaum gestört zu sein
scheint.
Allerdings ist neben der positiven Selektion auch die negative Selektion in Grb2fl/fl Lckcretg
Mäusen beeinträchtigt (Jang et al. 2010). Da schon eine Reduktion von Grb2 um ca. 60 % in
haploid Grb2 defizienten Mäusen ausreicht, um die negative Selektion deutlich zu beeinträchtigen
(Gong et al. 2001) ist es wahrscheinlich, dass die negative Selektion auch in Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen gestört ist. Die geringere positive Selektion in T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
reduziert also die Zahl der T-Zellen und die beeinträchtigte negative Selektion in T-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen erhöht die Zahl der T-Zellen. Darum spiegeln die Zellzahlen der TZell spezifischen Grb2-/- Mäuse nur zum Teil Defekte in der positiven Selektion wider.
Für die Grb2fl/fl Lckcretg Maus wurde beschrieben, dass die CD4+ T-Zellen im Thymus den
Reifungsmarker HSA nicht herunteregulieren (Jang et al. 2010). Darum wurde die Reifung der TZellen im Thymus von Grb2fl/fl CD4cretg und Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen untersucht. Dabei wurde
festgestellt, dass die Zahl der reifen TCRβ+HSAlow Zellen in beiden Mäusen reduziert war, was
auf einen Reifungsdefekt hindeutet. Die unveränderten Gesamtzahlen an CD4 und CD8 einzel
positiven T-Zellen im Thymus von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen legen nahe, dass ein größerer Teil
dieser Zellen HSAhigh ist. HSAhigh T-Zellen sind in einer normalen T-Zell Entwicklung keine
funktionell kompetenten, reifen T-Zellen (Ramsdell et al. 1991; Nikolić-Zugić & Bevan 1990).
Sie sind eher anfällig für die Induktion von Apoptose und spielen eine Rolle bei der negativen
Selektion (Kishimoto & Sprent 1997; Hough et al. 1994). Die höhere Expression von HSA in den
einzel positiven Zellen von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen deutet, wie auch in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen
(Jang et al. 2010), auf einen Reifungsdefekt beim Übergang von den doppelt positiven zu den
einzel positiven T-Zellstadien hin. Grb2 fördert also die Reifung von einzel positiven T-Zellen im
Thymus. Es könnte sein, dass Grb2 die positive Selektion und die Reifung der T-Zellen im selben
Selektionsschritt beeinflusst, da die positive Selektion im späten doppelt positiven Stadium
124
Die Rolle von Grb2 in der T-Zell Entwicklung
Diskussion
stattfindet und der Block in T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen beim Übergang vom doppelt
positiven zum einzel positiven Stadium vermutet wird.
Um den Einfluss von Grb2 auf die T-Zellen der Peripherie zu untersuchen wurden T-Zellzahlen
der Lymphknoten und der Milz bestimmt. Die Zahl der peripheren T-Zellen in Grb2fl/fl Lckcretg
Mäusen war drastisch reduziert, während die Zahl in den Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen nur etwa um
1/3 reduziert war. Aufgrund der reduzierten Zahl an T-Zellen in der Entwicklung der Grb2fl/fl
Lckcretg Maus und der beeinträchtigten Reifung zu einzel positiven T-Zellen ist es
wahrscheinlich, dass die reduzierten T-Zellzahlen in der Peripherie auf Entwicklungsdefekte in
der T-Zell Entwicklung im Thymus zurückzuführen sind. Es ist aber nicht auszuschließen, dass
Grb2 auch die Homeostase der T-Zellen in der Peripherie beeinflusst. Interessanterweise sind in
der Milz und in den Lymphknoten von Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen weniger
naive T-Zellen vorhanden, während die Zahl an Gedächtnis T-Zellen in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen
erhöht und in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen unverändert ist. Zudem ist der Anteil an aktivierten Zellen
an den CD4+ und CD8+ T-Zellen der Milz in Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen
erhöht. Dies deutet darauf hin, dass Grb2 neben der T-Zell Entwicklung im Thymus auch Effekte
auf die T-Zellen in der Peripherie hat.
Neben der reduzierten Zahl an αβ T-Zellen in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen haben die Tiere
tendenziell mehr γδ T-Zellen im Thymus und mehr γδ T-Zellen in der Peripherie. γδ T-Zellen
haben ein limitierteres TZR Repertoir als αβ T-Zellen, erkennen teilweise andere Antigene, sind
anders im Körper verteilt und können schnell aktiviert werden (Born et al. 2011; Vantourout &
Hayday 2013). In wie weit die Grb2 Defizienz zu der höheren Zahl an γδ T-Zellen durch eine
erhöhte Rekrutierung von doppelt negativen T-Zellen zur γδ Linie in der frühen Entwicklung
beiträgt und ob spätere Homeostasemechanismen beeinflusst sind, ist unklar und wird weiter
untersucht.
125
Die Rolle von Grb2 in der T-Zell Entwicklung
Diskussion
7.8 Grb2 und T-Effektorzellen der CD4+ Population
Nach der Analyse der T-Zell Entwicklung in T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen wurde die
Aktivierung und Differenzierung zu CD4+ T-Helferzellen/Effektorzellen untersucht. Naive CD4+
T-Zellen können sich in verschiedene Effektorzellpopulationen entwickeln, die jeweils
spezifische Aufgaben in der Immunantwort übernehmen. Dieser Prozess ist sehr sensitiv für
Veränderungen in der Signalleitung (Zhu et al. 2010; Rincón, Conze, et al. 2000). Aufgrund der
vielfältigen Interaktionen von Grb2 mit verschiedenen Signalwegen und den schon beschriebenen
Einflüssen von Grb2 auf die Signalleitung in T-Zellen (Jang et al. 2010) ist es wahrscheinlich,
dass Grb2 die T-Helferzelldifferenzierung beeinflusst. Die am besten untersuchten THelferzellpopulationen sind die TH1, TH2, TH17 und iT-reg Zellen. TH1-Zellen vermitteln
Immunantworten gegen intrazelluläre Pathogene (Paul & Seder 1994). TH2-Zellen vermitteln
Immunantworten gegen extrazelluläre Parasiten (Zhu et al. 2010). TH17-Zellen wurden
ursprünglich mit Autoimmunerkrankungen und chronischen Entzündungen in Verbindung
gebracht aber vermitteln auch Antworten gegen Pilze und extrazelluläre Bakterien (Korn et al.
2009; Miossec et al. 2009). iT-regs wirken inhibierend auf die Immunantwort (DiPaolo et al.
2007). Die Differenzierung zu einer der T-Helferpopulationen kann durch viele Faktoren
beeinflusst werden. Dazu gehören costimulatorische Signale, wie Zytokine, und die Stärke und
Qualität des TZR Signales (Zhu et al. 2010).
Um den Einfluss von Grb2 auf die Differenzierung zu verschiedenen T-Helferpopulationen zu
untersuchen, wurden naive Grb2-/- CD4+ T-Zellen von Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen in vitro über die Stimulation des TZRs in Kombination mit CD28 und verschiedenen
Zytokinen bzw. Zytokin neutralisierenden Antikörpern zu TH1, TH2, TH17 bzw. iT-reg Zellen
differenziert. Naive Grb2-/- T-Zellen aus Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen differenzierten vermehrt zu TH2
und TH17 Zellen, während die Differenzierung zu T-reg Zellen gestört war. In naiven Grb2-/- TZellen aus Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen war nur die Differenzierung zu TH17 Zellen leicht erhöht. In
doppelt positiven T-Zellen des Thymus verstärkt Grb2 die Signalleitung über den TZR, in dem es
die Aktivierung von Tyrosinkinasen fördert (Jang et al. 2010). Die Calciumsignalleitung in
Grb2fl/fl Lckcretg T-Zellen war allerdings eher unverändert. Wenn Grb2 fehlt ist also die
Signalleitung über den TZR beeinträchtigt und eine schwächere Signalleitung über den TZR führt
eher zu einer TH2 Antwort als zu einer TH1 Antwort (Zhu et al. 2010). Die in der Literatur
beschriebene schwächere Signalleitung über den TZR passt also zu einem erhöhten
Differenzierungspotential naiver Grb2fl/fl Lckcretg T-Zellen. Das Differenzierungspotential von
naiven Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen ist allerdings unverändert. Dies kann mit dem genetischen
Hintergrund der Mäuse zusammenhängen, da BALB/c Mäuse stärker zu einer TH2 Antwort
neigen als C57BL/6 Tiere (Launois et al. 1997; Güler et al. 1996; Guéry et al. 1997) und die
Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse einen gemischten BALB/c / C57BL/6 haben, während die Grb2fl/fl
126
Grb2 und T-Effektorzellen der CD4+ Population
Diskussion
CD4cretg Mäuse 10 Generationen auf den C57BL/6 zurückgekreuzt wurden. Alternativ können
auch die Unterschiede in der T-Zell Entwicklung der Grb2 in der Grb2fl/fl Lckcretg Maus und der
Grb2fl/fl CD4cretg Maus für die unterschiedliche Kapazität von naiven Grb2fl/fl Lckcretg T-Zellen
und naiven Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen verantwortlich sein, zu T-Effektorzellen zu differenzieren.
Damit führt die Grb2 Defizienz in vitro unter bestimmten Bedingungen zu einer erhöhten
Differenzierung naiver T-Zellen zu TH2 Zellen. Die stärkere in vitro Differenzierung zu TH17
Zellen und die schwächere Differenzierung zu iT-regs von naiven Grb2fl/fl Lckcretg T-Zellen legen
eine erhöhte IL-6 Signalleitung nahe, da IL-6 in Kombination mit TGFβ die Entwicklung naiver
T-Zellen zu TH17 Zelle einleiten kann, während die Stimulation mit TGFβ allein zur
Differenzierung in iT-regs führt (Bettelli et al. 2006; Veldhoen et al. 2006; Zhou et al. 2007).
Naive Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen differenzieren wie naiven Grb2fl/fl Lckcretg T-Zellen besser zu
TH17 Zellen aber ihr Differenzierungspotential zu iT-regs ist nicht verändert. Dies legt nahe, dass
Veränderungen in der IL-6 Signalleitung nicht allein für das veränderte Differenzierungspotential
verantwortlich sind. Die Grb2 Defizient verstärkt also die Differenzierung zu TH17 Zellen in vitro
und inhibiert unter bestimmten Bedingungen die Differenzierung zu iT-reg Zellen.
Das Fehlen von Grb2 in vitro erhöht das Differenzierungspotential zu TH2, TH17 T-Helferzellen,
die Immunantworten fördern, während es die Generierung von iT-reg Zellen hemmt, die
Immunantworten inhibieren. Der Effekt von Grb2 auf die Differenzierung zu T H2-Zellen könnte
mit der positiven Rolle von Grb2 in der Signalleitung über den TZR zusammenhängen (Jang et al.
2010), da eine stärkere Signalleitung eher zu einer TH1 Antwort als zu einer TH2 Antwort führt
(Zhu et al. 2010). Die beeinträchtigte Signalleitung in T-Zell spezifischen Grb2 defizienten TZellen führt zu einer geringeren Aktivierung von P38 und JNK. Aktiviertes von P38 und
aktiviertes JNK2 fördern TH1 Antworten, während aktiviertes JNK1 die TH2 Antwort hemmt
(Rincón, Conze, et al. 2000; Rincón, Flavell, et al. 2000), was zu einer erhöhten Differenzierung
naiver Grb2-/- T-Zellen zu TH2-Zellen passen würde. Allerdings hat Grb2 in vitro keinen Einfluss
auf die TH1-Zell Differenzierung. Insgesamt war nur die Differenzierung zu TH17-Zellen durch
Grb2 unabhängig vom genetischen Hintergund bzw. der frühen T-Zell Entwicklung moderat
inhibiert.
Da in vitro Differenzierungsversuche aufgrund der vielen Faktoren, die die T-Zelldifferenzierung
beeinflussen physiologisch nur begrenzt aussagekräftig sind wurden die T-Helferzellpopulationen
der naiven Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse ex vivo durchflusszytometrisch
analysiert. Während in der Grb2fl/fl Lckcretg Maus tendenziell mehr TH1, TH2, TH17 und iT-reg
Zellen vorhanden waren, waren in der Grb2fl/fl CD4cretg Maus nur die TH1 Zellen erhöht. Die
gesteigerte Zahl an T-Effektorzellen passt zu einem höheren Anteil aktivierter CD4+ T-Zellen und
einer verringerten Zahl naiver CD4+ T-Zellen in den Milzen von Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl
CD4cretg Mäusen. Die genauen Mechanismen, die dazu führen, dass in den T-Zell spezifischen
127
Grb2 und T-Effektorzellen der CD4+ Population
Diskussion
Grb2-/- Mäusen mehr TH1-Zellen vorhanden sind, obwohl die Differenzierung aus naiven T-Zellen
zu TH1-Zellen in vitro unverändert ist sind unklar. Die Unterschiede zwischen den Grb2fl/fl
Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen können an dem unterschiedlichen Deletionszeitpunkt von
Grb2 in der T-Zell Entwicklung, dem genetischen Hintergrund der Mäuse (BALB/c / C57BL/6
bzw. C57BL/6) oder dem weitgehend leeren T-Zell Kompartiment in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen
gegenüber dem nur geringfügig beeinträchtigten T-Zell Kompartiment in Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen liegen. Allerdings müssen die Ergebnisse mit der Grb2fl/fl Lckcretg Maus noch durch
weitere Versuche bestätigt werden. Zusammenfassend haben naive Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse mehr
TH1 Zellen.
Insgesamt differenzieren naive Grb2-/- T-Zellen in vitro verstärkt zu T-Effektorzellen. Passend
dazu haben naive T-Zell spezifische Grb2-/- Mäuse mehr T-Effektorzellen.
128
Grb2 und T-Effektorzellen der CD4+ Population
Diskussion
7.9 Die Rolle von Grb2 im autoimmunen Enzephalomyelitis Modell
Die Untersuchung von T-Helferzellen in naiven Mäusen spiegelt nicht wieder, wie Grb2 die THelferzellen in einer Immunreaktion beeinflusst. Aufgrund der erhöhten Differenzierung zu TH17
Zellen aus naiven Grb2-/- T-Zellen in vitro und der erhöhten Zahl an TH1 Zellen in naiven T-Zell
spezifischen Grb2-/- Mäusen wurde die Rolle von Grb2 im autoimmunen Enzephalomyelitis
Modell (EAE) untersucht, in dem TH17 und die TH1 Zellen je nach Art der Krankheitsinduktion
entscheidend für die Entwicklung der Krankheit sind (Tigno-Aranjuez et al. 2009; Batoulis et al.
2010). Es wurde ein sowohl TH17- als auch TH1-Zell abhängiges Modell gewählt. Für das Modell
wurden Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse verwendet, weil sie einen C57BL/6 Hintergrund haben, der für
die Induktion der EAE wichtig ist (Rangachari & Kuchroo 2013) und die Zahl der T-Zellen
zusätzlich nicht so stark reduziert ist wie in Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen, was die Immunantworten
vergleichbarer mit den Kontrolltieren macht.
Die EAE wurde induziert und der Krankheitsverlauf bis Tag 28 nach der Induktion der EAE
anhand eines klinischen Bewertungssystems untersucht. Die Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse wiesen
einen schwächeren Krankheitsverlauf auf. Die EAE war ab Tag 9, einem der ersten Tage an dem
Krankheitssymptome auftraten, tendenziell schwächer. Von Tag 13 bis Tag 19 um den Höhepunkt
der Krankheit war dieser Unterschied signifikant. Anschließend wurden die Symptome in den
Kontrolltieren schwächer und die Symptome zwischen Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen und
Kontrolltieren waren ähnlich. An Tag 27 und 28 schwächte sich die Krankheit in Grb2fl/fl CD4cretg
Mäusen gegenüber den Kontrolltieren erneut leicht ab. Aufgrund der erhöhten in vitro T-Zell
Differenzierung naiver Grb2-/- T-Zellen zu TH17 Zellen und der höheren Zahl an TH1 Zellen in
naiven Mäusen war dieser Verlauf unerwartet. Allerdings sind die T-Zellzahlen in der Peripherie
von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen um etwa ein Drittel reduziert und die naiven T-Zellen aus denen
sich die T-Helferzellen differenzieren sind besonders betroffen.
Die T-Zellen der Milz von Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wurden an Tag 17 und Tag 30 der EAE
durchflusszytometrisch untersucht, um herauszufinden, ob es während des Krankheitsverlaufes
Unterschiede in der Größe der Zellpopulationen ergaben. Interessanterweise waren die
Gesamtzellzahlen der CD4+ und der CD8+ T-Zellen, so wie ihre Aktivierung (CD69+) sowohl an
Tag 17 als auch an Tag 30 unverändert, während sie in naiven Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen um etwa
ein Drittel reduziert waren. Dies kann zwei Gründe haben. Entweder gleichen sich die TZellzahlen bedingt durch die EAE während der Krankheit an oder die T-Zellzahlen naiver Grb2fl/fl
CD4cretg Mäuse gleichen sich im Alter unabhängig von der EAE an. Für die Bestimmung der TZellpopulationen naiver Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse wurden Tiere im Alter von 8 Wochen
verwendet, während die Tiere für das EAE Modell bei der Induktion der Krankheit etwa 12
129
Die Rolle von Grb2 im autoimmunen Enzephalomyelitis Modell
Diskussion
Wochen alt waren. An Tag 17 nach der Induktion war die Zahl der naiven T-Zellen in den Grb2fl/fl
CD4cretg Mäusen reduziert, glich sich aber bis an Tag 30 nach der Induktion an die Zahl in den
Kontrolltieren an. Die reduzierte Zahl naiver T-Zellen kann zu einem milderen EAE-Verlauf in
CD4cretg Mäusen beitragen, da sich die TH17 und die TH1 Zellen, die die Krankheit auslösen
(Tigno-Aranjuez et al. 2009; Batoulis et al. 2010) aus den naiven T-Zellen entwickeln (Zhu et al.
2010). Die Zahlen der zentralen CD4+ und der CD8+ T-Gedächtniszellen und der Effektor CD4+
T-Gedächtniszellen waren nicht verändert, während die Zahl der CD8+ Effektor TGedächtniszellen leicht erhöht war. Ob dies physiologisch relevant ist, ist unklar und könnte
durch ein EAE Modell mit wiederkehrenden EAE Schüben untersucht werden (Stromnes &
Goverman 2006). Die ausgeglichenen Gesamtzellzahlen der T-Zellen in der EAE machen es
unwahrscheinlich, dass die reduzierte Zahl an T-Zellen in T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen
einen großen Einfluss auf die EAE hat. Allerdings kann die reduzierte Zahl naiver T-Zellen in TZell spezifischen Grb2-/- Mäusen zu einer schwächeren EAE führen. Zudem ist die TZR
Signalleitung in Grb2-/- T Zellen beeinträchtigt (Jang et al. 2010) und die Stärke und Qualität des
TZR Signales sind entscheidend für die T-Zell Differenzierung (Zhu et al. 2010).
Interessanterweise war die Zahl der B220+ CD138+ B-Zellen in den Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen in
der EAE erhöht. Diese Zellen exprimierten weniger CD69 und waren somit weniger stark
aktiviert. Kürzlich wurde beschrieben, dass CD138+ B-Zellen durch die Produktion von IL-35
inhibierend auf die EAE wirken können (Shen et al. 2014). Ob die höhere Zahl an B220+ CD138+
B-Zellen in T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen während der Krankheit inhibierend auf die EAE
wirkt muss noch untersucht werden.
Weil sowohl die proinflammatorischen TH17 und TH1 Zellen als auch die inhibierenden T-reg
Zellen die EAE beeinflussen, wurden diese im Verlauf der Krankheit untersucht. CD4+ T-Zellen
der Milz wurden an Tag 17 der EAE aufgereinigt und in vitro mit MOG-Peptid oder PMA und
Ionomycin stimuliert bzw. unstimuliert inkubiert. Der Anteil der TH17, TH1 und T-reg Zellen an
den ausgesäten Zellen wurde bestimmt. Es waren keine Unterschiede bei den unstimulierten oder
den MOG-Peptid stimulierten TH17 und TH1 Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen gegenüber den Kontrollen
feststellbar. Nach der unspezifischen Stimulation mit PMA und Ionomycin waren mehr TH17, TH1
Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen vorhanden. Damit ist der schwächere Verlauf der EAE in Grb2fl/fl
CD4cretg Mäusen zum Höhepunkt der Krankheit nicht mit einer niedrigeren Zahl an TH17 und
TH1 Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen in der Milz verbunden. Allerdings wird die klassische EAE vor
allem durch eine Demeyelierung von Nervenzellen im Rückenmark und im Gehirn ausgelöst
(Stromnes & Goverman 2006) und die erwartete Zahl an Effektorzellen in der Milz ist an Tag 17
der EAE noch gering. An Tag 30 der EAE wurde aber festgestellt, dass T-Zell spezifische Grb2-/Mäuse weniger TH17 und TH1 Zellen in der Milz aufweisen (Daten Elisabeth Zinser AG
Steinkasserer nicht gezeigt). Die Zahl der Grb2fl/fl CD4cretg T-reg Zellen war an Tag 17 der EAE
130
Die Rolle von Grb2 im autoimmunen Enzephalomyelitis Modell
Diskussion
bei den unstimulierten oder den MOG-Peptid stimulierten T-Zellen erhöht, während es keinen
Unterschied bei den mit PMA und Ionomycin stimulierten Zellen gab. T-Zell spezifische Grb2-/Mäuse haben also in der Milz während der EAE weniger TH17 und TH1 Zellen, während mehr Treg Zellen gebildet werden, was zu einem milderen EAE-Verlauf passt. Dazu passend zeigen TZell spezifische Grb2-/- Mäuse an Tag 17 der EAE im Rückenmark und im Gehirn weniger CD45+
Infiltrate (Daten Elisabeth Zinser AG Steinkasserer nicht gezeigt), die an der Demyelierung der
Nervenzellen beteiligt sind (Sobel & Kuchroo 1992; McCombe et al. 1992; Schiffenbauer et al.
1998).
An Tag 30 der EAE wurden analog zu Tag 17 Gesamtmilzzellen ausgesät, stimuliert und die
Menge der sekretierten Zytokine bestimmt. Die Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen produzierten generell
weniger Zytokine als die Kontrollzellen. Die Menge des von T H17 Zellen produzierten
proinflammatorischen IL-17A war im Überstand von Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen reduziert.
Außerdem waren IL-2 und TNFα erhöht. Diese werden besonders von TH1-Zellen produziert und
tragen zur TH1-Zell Differenzierung bei (Zhu et al. 2010; O’Garra & Arai 2000). IFNγ, das ein
wichtiger Faktor für TH1-Zellen ist, war signifikant verändert. Das inhibitorisch wirkende IL-10,
das von T-reg Zellen produziert wird und IL-4, das zur TH2-Antwort beiträgt, sowie IL-6, das an
der Differenzierung zu TH17-Zellen beteiligt ist, waren nicht signifikant verändert (Zhu et al.
2010; O’Garra & Arai 2000; Rangachari & Kuchroo 2013). Grb2 fördert also in der EAE die
Produktion von prolinflammatorischen Zytokinen, die die TH17 und TH1 Antwort verstärken.
Interessanterweise ist die Menge an RNA, die für IL-6 kodiert im Gehirn von T-Zell spezifischen
Grb2-/- Mäusen niedriger (Daten Elisabeth Zinser AG Steinkasserer nicht gezeigt). IL-6 wird mit
der Balance zwischen TH17 und T-reg Zellen in Verbindung gebracht. Weniger IL-6 führt zur
Differenzierung von weniger TH17 Zellen aber mehr T-reg Zellen und schwächt so die EAE ab
(Rangachari & Kuchroo 2013). Durch geringere IL-6 Produktion in T-Zell spezifischen Grb2-/Mäusen könnte also das Verhältnis der Differenzierung von TH17 und T-reg Zellen zu Gunsten
der T-reg Zellen verschoben werden, was zu einer milderen EAE beitragen würde.
Proliferationsversuche mit Gesamtmilzzellen aus T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen mit EAE, in
denen die Proliferation nach IL-2 oder MOG Restimulation gegenüber Kontrollzellen verringert
ist, deuten darauf hin, dass Grb2 zur Aktivierung der T-Helferzellen über den TZR und
spezifische costimulatorische Wege beiträgt (Daten Elisabeth Zinser AG Steinkasserer nicht
gezeigt). Dazu würde auch passen, dass die Signalleitung in Grb2-/- T-Zellen des Thymus
beeinträchtigt ist (Jang et al. 2010). Um zu überprüfen, ob der Einfluss von Grb2 auf die
Stimulation über den TZR in Kombination mit costimulatorischen Signalen einen Effekt auf die
Aktivierbarkeit von T-Zellen hat wurden CD4+ Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen aus dem C57BL/6
Hintergrund in vitro in einem allogenen gemischten Lymphozytenversuch mit dendritischen
131
Die Rolle von Grb2 im autoimmunen Enzephalomyelitis Modell
Diskussion
Zellen aus BALB/c Mäusen gemischt. Dabei binden T-Zellen mit ihrem TZR an allogene MHCIIKomplexe der dendritischen Zellen und werden von diesen ähnlich wie in einer normalen
Immunreaktion aktiviert (Sherman & Chattopadhyay 1993; Archbold et al. 2008; D’Orsogna et al.
2012; D’Orsogna et al. 2013). CD4+ Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen proliferieren weniger als
Kontrollzellen im gemischten Lymphozytenversuch und sind somit schlechter durch dendritische
Zellen aktivierbar. Grb2 in T-Zellen ist also wichtig für die Aktivierung von T-Zellen durch
dendritische Zellen. Die beeinträchtigte Aktivierung der Grb2-/- T-Zellen könnte auch die
Induktion der EAE hemmen, da die EAE in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen von Beginn an schwächer
ausfällt. Allerdings wird Grb2 in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen auch in CD4+ dendritischen Zellen
deletiert. Darum wurde die Fähigkeit von dendritischen Zellen, die aus Grb2fl/fl CD4cretg
Knochenmarkszellen generiert wurden getestet allogene T-Zellen zu aktivieren. Die Fähigkeit von
Grb2fl/fl CD4cretg Knochenmarkszellen allogene T-Zellen zu aktivieren war nicht verändert. Damit
hängt die schwächere Induktion der EAE in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen nicht von einer
beeinträchtigten Fähigkeit der dendritischen Zellen ab T-Zellen zu aktivieren.
Ein Problem bei der Untersuchung von EAE in Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen ist die reduzierte Zahl
der T-Zellen in naiven Grb2fl/fl CD4cretg Tieren. Eine reduzierte Zahl an T-Zellen kann
unabhängig von der Funktion von Grb2 in der T-Zelle zu einer schwächeren EAE führen. Da für
die in vitro Versuche gleiche Zellzahlen an Grb2fl/fl CD4cretg und Kontrollzellen eingesetzt
wurden und sich die Zahl der T-Zellen zwischen den Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen und den
Kontrollen an den untersuchten Zeitpunkten der EAE nicht unterschied, sollte das Problem in den
in vitro Versuchen nicht auftreten. Allerdings könnte eine reduzierte Zahl an T-Zellen bei der
Induktion der Krankheit die Entwicklung der Krankheit und die T-Helferzellpopulationen
beeinflussen. Darum sollen passive EAE Transferversuche (Stromnes & Goverman 2006) mit
gleichen Zellzahlen von MOG spezifischen Grb2fl/fl CD4cretg T-Zellen und entsprechenden
Kontrollzellen helfen den intrinsischen Effekt von Grb2 auf die Entwicklung der EAE besser zu
verstehen.
Zusammengefasst entwickeln sich in der EAE von T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen weniger
TH1 und TH17 Zellen aber mehr T-reg Zellen. Mechanistisch könnte eine schwächere IL-6
Produktion in T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen das Verhältnis der Differenzierung von TH17
und T-reg Zellen zu Gunsten der antiinflammatorischen T-reg Zellen beeinflussen, was zu einem
schwächeren EAE-Verlauf in T-Zell spezifischen Grb2-/- Mäusen führen würde. Außerdem ist
Grb2 in T-Zellen bei der Induktion der EAE wichtig, da es bei der Aktivierung der T-Zellen durch
antigenpräsentierende Zellen eine entscheidende Rolle spielt.
132
Die Rolle von Grb2 im autoimmunen Enzephalomyelitis Modell
Material
8
Material
8.1 Antikörper
Abkürzungen für die Tiere aus denen die Antikörper stammen: H = armenischer Hamster; HS =
syrischer Hamster; R = Kaninchen; M = Maus; Ra = Ratte.
8.1.1 Antikörper Durchflusszytometrie und Streptavidinkonjugate
Bezeichnung
Spezies, Isotyp, Klon
Verdünnung
anti-BAFFR-FITC
R, IgG1 κ, eBio7H22-E16 1:200
anti-CD11b-FITC
R, IgG2b κ, M1/70
1:200
anti-CD138-PE
R, IgG2a κ, 281-2
1:200
anti-CD16/CD32 (Fc-Block)
IgG, 2.4G2
1:100
anti-CD16/CD32-bio
R, IgG2b κ, 2.4G2
1:100
anti-CD19-PE
Ra, IgG2a κ, 1D3
1:400
anti-CD21-bio
R, IgG2a κ, 7E9
1:1000
anti-CD23-PE
R, IgG2a κ, B3B4
1:200
anti-CD24-FITC (HSA)
R, IgG2c κ, 30-F1
1:600
anti-CD25-bio
R IgG1λ, PC61.5
1:500
anti-CD25-PE
R IgG1λ, PC61.5
1:100
anti-CD335 (NKp46)-FITC
Ra, IgG2a κ, 29A1.4
1:400
anti-CD44-APC
R, IgG2b κ, IM7
1:100
anti-CD45R/B220-APC
R, IgG2a κ, RA3-6B2
1:200
anti-CD45R/B220-FITC
R, IgG2a κ, RA3-6B2
1:100
anti-CD45R/B220-PE-cy5.5
R, IgG2a κ, RA3-6B2
1:200
anti-CD4-PE
R, IgG2a κ, GK1.5
1:50
anti-CD5-APC
R, IgG2a κ, 53-7.3
1:200
anti-CD62L-bio
R, IgG2a κ, MEL-14
1:100
anti-CD69-bio
H, IgG, H1.2F3
1:200
anti-CD8a -FITC
R, IgG2a κ, 53-6.7
1:50
anti-CD95/Fas-PE
H, IgG2, λ2, Jo2
1:200
anti-GL7-Alexa647
R, IgM,GL7
1:100
anti-Gr-1-FITC
R, IgG2b κ, RB6-8C5
1:200
anti-IgDa-bio
M, IgG2a, AMS15.1.5
1:100
anti-IgDb-FITC
M, IgG1, AF6 122.2.5
1:25
anti-IgD-bio
anti-IgG1- FITC
anti-IgG2a- FITC
anti-IgG2b- FITC
anti-IgM-PE
Anti-MHC Class I (H-2Kb)-APC
Anti-MHC Class I (H-2Kd)-bio
anti-NK1.1-PE
anti-TCRβ-bio
anti-TCRγδ-FITC
R, IgG2a κ, 11.26C-1
Ra, IgG1 κ, A85-1
Ra, IgG1 κ, R19-15
Ra, IgG2a κ, R12-3
R, IgG2a κ, II/41
M, IgG2a, AF6-88.5.5.3
M, IgG2a κ, SF1-1.1
M, IgG2a, PK-136
H, IgG, H57-597
M, IgG1 κ, B1
1:200
1:250
1:250
1:250
1:100
1:200
1:800
1:100
1:100
1:100
Hersteller
eBioscience
eBioscience
BD Biosciences
Eigenes Hybridom
Becton Dickinson
eBioscience
Eigenes Hybridom
Becton Dickinson
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
Becton Dickinson
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
Becton Dickinson
eBioscience
Becton Dickinson
von AG Winkler
erhalten
von AG Winkler
erhalten
Eigenes Hybridom
Becton Dickinson
Becton Dickinson
Becton Dickinson
eBioscience
eBioscience
Becton Dickinson
eBioscience
eBioscience
Becton Dickinson
133
Antikörper
Material
gB-Cy5
NIP-APC
1:100 bis
1:400
1:600
NIP-PE
1:800
Streptavidin -PE-cy5.5
Streptavidin-PerCP-cy5.5
1:200
1:200
AG Winkler
Geschenk Mark
Shlomchik
Geschenk Mark
Shlomchik
eBioscience
eBioscience
Tab. 2: Antikörper Durchflusszytometrie und Streptavidinkonjugate
8.1.2 Antikörper ELISA
Bezeichnung
Anti- IgG AP/UNLB
Anti- IgG1 AP/UNLB
Anti- IgG2a AP/UNLB
Anti- IgG2b AP/UNLB
Anti- IgG2c AP/UNLB
Anti- IgM AP/UNLB
Spezies, Isotyp, Klon
G, polyclonal, x
G, polyclonal, x
G, polyclonal, x
G, polyclonal, x
G, polyclonal, x
G, polyclonal, x
Verdünnung/Konzentration
1:1000
1:1000
1:1000
1:1000
1:1000
1:1000
Hersteller
Southern Biotech
Southern Biotech
Southern Biotech
Southern Biotech
Southern Biotech
Southern Biotech
Tab. 3: Antikörper ELISA
8.1.3 Antikörper für magnetische Zellseperation / komplement vermittelte Lyse
Bezeichnung
Spezies, Isotyp,
Hersteller
Klon
Für Magnetische Zell-Sortierung
anti-CD90.2 Micro Beads
rat, IgG2b, x
Miltenyi
anti-CD19 Micro Beads
rat, IgG2a, x
Miltenyi
Tab. 4: Antikörper für magnetische Zellseperation
Bezeichnung
Anti-CD4
Anti-CD8
Anti-CD90 (Thy1)
Spezies, Isotyp,
Klon
IgM, RL174.2
IgM, 3168.1
IgM, AT83
Verdünnung/Konzentration Hersteller
500 μl/Milz
500 μl/Milz
500 μl/Milz
Eigenes Hybridom
Eigenes Hybridom
Eigenes Hybridom
Tab. 5: Antikörper für komplement vermittelte Depletion
8.1.4 Antikörper Western-Blot
Bezeichnung
Spezies, Isotyp,
Klon
anti-Grb2
M, IgG1 kappa,
3F2
HRP linked Ziege-anti-Maus
G, Polyklonal, x
IgG (H+L)
Verdünnung/Konzentration Hersteller
1:500
Upstate Biotechnology
1:5000
Bio-Rad
Tab. 6: Antikörper Western-Blot
8.2 Chemikalien und Labormaterial
Substanzen/Produkte
1 x DPBS steril
2-Mercaptoethanol
Hersteller
Gibco
Gibco
134
Chemikalien und Labormaterial
Material
Acrylamid-Bisacrylamid (29:1) (RotiphoreseR Gel 40)
Roth
Alum
AMP (2-Amino-2-methyl-1-propanol)
APS (Amoniumperoxodisulfat)
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-Indoxylphosphat)
BD TruCOUNT Tubes
BSA (bovine serum albumin)
DAPI
Diethanolamin
DMSO
dNTP Mix 1mM
dsDNA (D 4522)
ECL Westernblotting Detektionsreagenz 1 u. 2
EDTA Dinatrium Salz
FCS
Formaldehyd 4 % w/v
Gelatin
GeneRuler 100 bp DNA Ladder
Glycerol
Horse Serum
ImmuGloTM ANA HEp-2 Cells IFA Objektträger
Serva
Roth
Sigma
Roth
Becton Dickinson
Roth
Sigma
Roth
Roth
Fermentas
Sigma
Amersham
Applichem
PAN
Medite
Sigma
Thermo Scientific
Roth
Sigma
Euroimmun
Indo-1
Ionomycin
LD Säulen
L-Glutamin 200 mM
Low Tox rabbit complement
LS Säulen
Magermilchpulver
MaxiSorp 96-Well ELISA Platten
Invitrogen
Sigma
Miltenyi Biotec
Gibco
Cedarlane
Miltenyi Biotec
Roth
NUNC,
ThermoScientific
Becton Dickinson
Sigma-Genosys
Calbiochem
Gibco
Gibco
Pall Corporation /
Hartenstein
Biosearch Technologies
Microtainer® Röhrchen mit FloTop Collector
MOG 35-55
Mowiol
Natriumpyruvat
Nicht essenzielle Aminosäuren (100 x NEAA)
Nitrocellulose Membran
NP-PE4,15 bzw. 17
PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus
Pluronic® F-127
PMA (Phorbol Myristate Acetate)
p-Nitrophenylphosphat-disodium hexahydrat
Poly-L-Lysine
Propidiumiodid (PI) 50ug/ml
Proteinase K
Fermentas,
ThermoScientific
Invitrogen
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Roche
135
Chemikalien und Labormaterial
Material
QiaShredder
Röntgenfilm RX
Roti®-Load 1
RPMI 1640- Medium
Schafs Erythrocyten in Alseverlösung steril (31100100)
SDS
Supertaq-polymerase
Supertaq-polymerase buffer
TEMED
Thymidin [3H]
TissueTek® O.C.T.
TritonX-100
Trypanblau
Tween® 20
Tab. 7: Chemikalien und Labormaterialien
8.3 Computerprogramme
Computerprogramm
AxioVision
CellQuest
DACSDiva
FlowJo
GraphPad Prism v4.03
ImageJ
SoftMax Pro v3.0
Stratagene MxPro
QPCR
Hersteller
Zeiss
Becton Dickinson
Becton Dickinson
Treestar
GraphPad Software
Rasband, W.S., U. S.
National Institutes of Health
Molecular Device
Stratagene
Tab. 8: Computerprogramme
8.4 Geräte
Bezeichnung
5415C Zentrifuge
5415R Zentrifuge
Cryostat CM 1900
Durchflusszytometer FACSCalibur
Durchflusszytometer LSR II
ELISA-reader VersaMaxPlus
Fluoreszenz-Mikroskop Axioscope
A1
Megafuge1.0R
Mx3000P QPCR System
Nanodrop
PCR Maschine Primus 96 Plus
PCR-Maschine Professional Trio
Hersteller
Eppendorf
Eppendorf
Leica
Becton Dickinson
Becton Dickinson
Molecular
Devices
Zeiss
Heraeus
Stratagene
Thermo Scientific
MWG Biotech
Biometra
136
Computerprogramme
Qiagen
Fuji
Roth
Gibco
Fiebig-Nährstofftechnik
Sigma
HAT Biotechnology
HAT Biotechnology
Serva
Biomedicals
Hartenstein
Sigma
Gibco
Roth
Material
TE Mighty SmallTM Tank Transfer
Unit
Zellsortiergerät FACSAria II
Zellsortiergerät MoFlo
Hoefer
Becton Dickinson
Beckman Coulter
Tab. 9: Geräte
8.5 Kommerzielle Kits
Name
Amersham ECL Western Blotting Detection Reagents
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/ Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug
BRILLIANT II SYBR® GREEN QRT-PCR MASTER MIX WITH ROX, 1-STEP
CD4+ CD62L+ T cell isolation Kit II
Hersteller
GE Healthcare
Becton
Dickinson
Stratagene
Miltenyi
CD4+ T cell isolation Kit II
Miltenyi
Rneasy mini kit
SuperScriptTM III RNase H-Reverse Transcriptase
α-Maus/Ratte Foxp3 staining set APC
Qiagen
Invitrogen
eBioscience
Tab. 10: Kommerzielle Kits
8.6 Lösungen, Medien und Puffer
Bezeichnung
Stammlösung
Menge
Anmerkung
AMP Substratpuffer
9,58 (v/v) % AMP
0,74 mM MgCl2 x 6H2O
0,01 % (v/v) TritonX-100
pH 10,25 mit Hcl einstellen
H2O (entionisiert)
9,58 ml
0,015 g
10 µl
ad 100 ml
Brij-Lysepuffer
100 mM Tris (pH 7,5)
70 mM NaCl
5 mM EDTA
1 % (v/v) Brij
1M Tris, pH7,5
5M NaCl
0,5M EDTA
H2O (entionisiert)
10 ml
1,4 ml
1 ml
1 ml
wird ab 56 °C
flüssig
ad 100 ml
DAPI-Lösung für intrazelluläre
Färbung
10 µg/ml 4,6-Diamino-2-Phenylindol
100 μg
0,1 % (v/v) TritonX
1 x PBS
10 µl
ad 10 ml
in H2O lösen
DAPI-Lösung für Untersch.
vital/apoptotisch
137
Kommerzielle Kits
Material
0,05 µg/ml 4,6-Diamino-2-Phenylindol
10 µg/ml DAPI
1 x PBS
50 µl
in H2O lösen
ad 10 ml
Diethanolaminpuffer
0,5 mM MgCl2 x 6H2O
0,02 % (w/v) Natriumazid
10 % NaN3
0,1 g
2 ml
9,7 % (v/v) Diethanolamin
pH 9,8 mit HCl einstellen
97 ml
H2O (entionisiert)
ad 1 l
ca. 10-15 ml
38 % HCLSäure
10 x Elektrophoresepuffer
250 mM Tris
1.92 M Glycin
1 % (w/v) SDS
H2O (entionisiert)
30,3 g
144,13 g
10 g
ad 1 l
ELISA Blockierlösung
1% (w/v) BSA
1 x PBS
1g
ad 100 ml
ELISA Kopplungspuffer gB und VLP
15 mM Na2Co3
1,59 g/l
35 mM NaHCO3
2,94 g/l
pH 9,6 einstellen
H2O (entionisiert)
ad 1 l
ELISA Substratpuffer
1 mg/ml pNitrophenylphosphat
1 M Diethanolaminpuffer
20 mg
ad 20 ml
1 Tablette
ELISA Verdünnungspuffer
0,1 % (w/v) BSA
0,05 % w/v Natriumazid (optional)
10 % NaN3
1 x PBS
0,1 g
0,5 ml
ad 100 ml
ELISPOT Substratpuffer
(AMP-Puffer mit BCIP)
frisch ansetzen
1mg/ml BCIP
AMP Substratpuffer
100 mg
100 ml
FACS Puffer
138
Lösungen, Medien und Puffer
Material
1 x PBS
0,1 % w/v BSA
0,01 % w/v Natriumazid
10 % NaN3
500 ml
0,5 g
0,5 ml
Gey's Lösung - für tonische
Erythrozytenlyse
Stammlösung A
654 mM NH4Cl
35 g
25 mM KCl
8,4 mM Na2HPO4
1,85 g
1,5 g
0,88 mM KH2PO4
0,12 g
28 mM Glucose
H2O (entionisiert)
5g
ad 1 l
sterilfiltrieren
Stammlösung B
20,7 mM MgCl2 x 6 H2O
1,05 g
5,7 mM MgSO4 x 7 H2O
0,35 g
30,8 mM CaCl2
0,85 g
H2O (entionisiert)
ad 250 ml
autoklavieren
Stammlösung C
267,8 mM NaHCO3
H2O (entionisiert)
5,625 g
ad 250 ml
sterilfiltrieren
Gey's Lösung - aus Stammlösungen
Lösung A
Lösung B
Lösung C
H2O (entionisiert)
200 ml
50 ml
50 ml
ad 1 l
Krebs-Ringer Lösung
10mM HEPES (pH 7)
140mM NaCl
4mM KCl 1mM
1mM MgCl2 1mM
1mM CaCl2
10mM Glucose
in H2O (entionisiert)
6x DNA-Ladepuffer
30 % (v/v) Glycin
0,25 % Xylencyanol
0,25 % Bromphenolblau
in H2O (entionisiert)
Lysepuffer
139
Lösungen, Medien und Puffer
Material
10 mmol/l TRIS pH 7,8
5 mM EDTA
0,2 % SDS
20 mM NaCl
MACS-Puffer
0,5 % (v/v) PAN FCS (hitzeinktiviert)
2 mM EDTA (0,5M, steril)
1 x PBS
2,5 ml
2 ml
500 ml
Mowiol
Glycerol (w/v)
Mowiol
H2O (entionisiert)
6g
2,4 g
6 ml
2 h bei Raumtemperatur rühren lassen
200 mM Tris, pH 8,5
10 min 55 °C inkubieren
15 min bei 5000 g zentrifugieren
Überstand aliquotieren und wegfrieren
12 ml
1x PBS
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
8 mM Na2HPO4
1,76 mM KH2PO4
pH 7,4 mit HCl einstellen
H2O (entionisiert)
8 g NaCl
0,2 g KCl
1,15 g
0,24 g
ad 1 l
10 x Transferpuffer
250 mM Tris
1,92 M Glycin
H2O (entionisiert)
30,3 g
144,13 g
ad 1 l
1 x Transferpuffer
10 x Transferpuffer
Methanol
H2O (entionisiert)
100 ml
200 ml
ad 1 l
RPMI+
RPMI 1640-Medium (Gibco)
5 % (v/v) PAN FCS (hitzeinktiviert)
1,2 mM L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat
1 x NEAA (nicht essentielle Aminosäuren)
10.000 U/ml Penicillin/Streptomycin
140
Lösungen, Medien und Puffer
500 ml
25 ml
3 ml
5 ml
5 ml
5 ml
Material
50 µM 2-Mercaptoethanol
0,5 ml
RPMI10+
RPMI 1640-Medium (Gibco)
10 % (v/v) PAN FCS (hitzeinktiviert)
1,2 mM L-Glutamin
1 mM Natriumpyruvat
1 x NEAA (nicht essentielle Aminosäuren)
10.000 U/ml Penicillin/Streptomycin
50 µM 2-Mercaptoethanol
500 ml
50 ml
3 ml
5 ml
5 ml
5 ml
0,5 ml
Western-Blot Blockierlösung
5% (w/v) Magermilchpulver
0,05 % (v/v) Tween 20
1 x PBS
5g
50 μl
ad 100 ml
Zellpuffer / Sortierpuffer
2 % (v/v) PAN FCS (hitzeinktiviert)
2 mM EDTA (0,5M)
1 x PBS
10 ml
2 ml
500 ml
Tab. 11: Lösungen, Medien und Puffer
8.7 Stimulanzien / Antigene / Immunisierungszusätze
Stimulanzien/Antigene
/Immunisierungszusät
ze
anti-CD28
anti-CD3ε
anti-Hamster-IgG
Spezies,
Isotyp, Klon
HS, IgG2 λ,
37.51
H, IgG1 κ,
145-2C11
x,x,H-1643
anti-IgM
Ra, IgG1 κ,
XMG1.2
G,x,x
anti-IgM (Fab2)
G,x,x
anti-Mouse IgM
R,x,x
anti-NK1.1 AK
M, IgG2a, PK136
H, IgG, H57597
mouse
recombinant, x,
x
anti-IFNγ
anti-TCR beta
BAFF
CGG
CpG (ODN 1826)
Verdünnung/
Konzentratio
n
1,3 µg/ml
Reaktivität
Hersteller
CD28
eBioscience
1 µg/ml
CD3
eBioscience
variiert
armenischer
Hamster IgG
IFNγ
Sigma
5 µg/ml
variiert
eBioscience
IgM B-Zell
Rezeptor
variiert
IgM B-Zell
Rezeptor
variiert
IgM B-Zell
Rezeptor
0,8-1 mg/Maus NK1.1
Jackson Dianova
1:50
eBioscience
variiert
variiert
variiert
T-Zell
Rezeptor β
BAFFRezeptor,
TACI, APRIL
TLR9
Jackson Dianova
Jackson Dianova
BioXcell
ENZO Life
Sciences
Jackson Dianova
InvivoGen
141
Stimulanzien / Antigene / Immunisierungszusätze
Material
gB
Ionomycin
LPS
Streptomyces
conglobatus, x,
x
E. coli O55, x,
x
variiert
variiert
AG Winkler
Sigma
10 µg/ml
TLR4
Mycobacterium
Tubercolosis (H37Ra)
NP-CGG
10 µg/ml
NP-KLH
variiert
Pertussis Toxin
R848
VLPs (hCMV
Densebodies)
200 µl/Maus
variiert
variiert
variiert
TLR7
Tab. 12: Stimulanzien / Antigene / Immunisierungszusätze
8.8 Zytokine
Zytokin
Rekombinante murine IL-12
Rekombinante murine IL-6
Rekombinante humane IL-2
Rekombinante humane
TGFβ1
Rekombinante murine IL-4
Stammlösung
2 µg/ml
10 µg/ml
10000 U/ml
2 µg/ml
Hersteller
Peprotech
Peprotech
Peprotech
Peprotech
10µg/ml
Becton
Dickinson
Tab. 13: Zytokine
142
Zytokine
Calbiochem
Difco/BD
Bioscience
Biosearch
Technologies
Biosearch
Technologies
List/Quadratech
InvivoGen
AG Winkler
Methoden
9
Methoden
9.1 Aufarbeitung muriner Zellen und durchflusszytometrische Analyse
9.1.1
Zentrifugation
Sofern nicht anders angegeben wurden die Zellen bei Zentrifugationsschritten mit 1300
Umdrehungen pro Minute für 5 min bei 4°C zentrifugiert (Megafuge1.0R) und der Überstand
anschließend verworfen.
9.1.2 Organentname und Aufbereitung von murinen Zellen
Die Mäuse wurden durch Inhalation von CO2 getötet und zeitnah untersucht. Zellen aus dem
Peritoneum wurden durch Ausspülen gewonnen. Dazu wurden mit einer Spritze 5 ml PBS mit 2
% FCS und 2 mM EDTA in den peritonealen Raum gespritzt. Die Zellen wurden durch Drücken
auf das Peritoneum gelöst und dann mit einer Spritze abgesaugt. Blut wurde gewonnen, indem der
Brustraum eröffnet und das Herz angeschnitten wurde. Dann wurde das Blut mit einer 1ml Spritze
ohne Nadel aus dem Brustraum gesaugt. Knochenmarkszellen wurden gewonnen, indem Femur
und gegebenenfalls Tibia entnommen, äußerlich von Geweberückständen gereinigt, an beiden
Seiten an der Gelenkkapsel eröffnet und anschließend mit einer Spritze (0,45 mm Kanüle) und 5
ml PBS mit 2 % FCS und 2 mM EDTA aus dem Knochen gespült wurden. Thymus, Milz,
Lymphknoten und Lunge wurden entnommen und mit dem Stempel einer Spritze durch ein 70
µM Nylonsieb gedrückt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Wenn nicht anders angegeben
wurden die Zellen nach der Entnahme möglichst auf Eis gehalten. Zellen aus Milz, Lymphknoten,
Knochenmark, Lunge, Blut wurden einer tonischen Lyse (Geys Lösung) unterzogen. Dazu
wurden die Zellen abzentrifugiert, in 5 ml Geys Lösung aufgenommen und 5 min auf Eis
inkubiert, abzentrifugiert und in 5 ml PBS mit 2 % FCS und 2 mM EDTA aufgenommen.
9.1.3 Bestimmung der Gesamtzellzahl mit einer Neubauer Zählkammer
Zellen wurden entsprechend ihrer Zahl mit Trypanblau verdünnt (Standard 1:10) und 10 µl der
Verdünnung wurden in eine Neubauer Zählkammer pipettiert und unter dem Mikroskop
ausgezählt. Trypanblau kann in Zellen mit beschädigter Membran eindringen und färbt diese blau.
So können lebende und apoptotische/tote Zellen unterschieden werden. Kennt man den Anteil
einer bestimmten Subpopulation in der Zellsuspension z.B. durch durchflusszytometrische
Analysen
kann
deren
Gesamtzellzahl
ebenfalls
berechnet
werden.
Berechnung
der
Gesamtzellzahl:
143
Aufarbeitung muriner Zellen und durchflusszytometrische Analyse
Methoden
Ø Zellen aus 4 Großquadraten x Verdünnungsfaktor x 104 (Kammerfaktor) = Zellzahl/ml
Zellzahl/ml x Gesamtvolumen der Zellsuspension in ml = Gesamtzellzahl
Gesamtzellzahl x (Anteil einer Subpopulation in % / 100) = Gesamtzellzahl der Subpopulation
9.1.4 Durchflusszytometrische Messungen
1x106 bis 5x106 Zellen einer Zellsuspension wurden in ein 5 ml Röhrchen überführt und
abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 20 µl Färbelösung aufgenommen und für 20 min bei 4°C
inkubiert, abzentrifugiert und bis zur Messung in FACS-Puffer aufgenommen und dunkel
gelagert. Die Färbelösung enthielt fluochromgekoppelte Antikörper (FITC, PE, APC, PE-Cy5.5,
PE-Cy5.5, Cy5) oder andere fluochromgekoppelte Konjugate. Es wurden auch Biotin-gekoppelte
Antikörper verwendet. Biotin wurde nach dem ersten Inkubationsschritt in einem zweiten
Färbeschritt an Streptavidin an das ein Fluochrom gekoppelt war gebunden (20 µl Färbelösung
aufgenommen und für 15 min bei 4°C). In FACS Puffer aufgenommene Proben wurden
durchflusszytometrisch analysiert und mit FlowJo (Treestar) oder CellQuest (BD) analysiert. Zum
verhindern von unspezifischen Färbungen enthielten die Färbelösungen 2.4G2 Antikörper
(1:100), der an FC-Rezeptoren bindet. Ausgenommen sind Versuche, bei denen die Wirkung des
FcγR2b untersucht werden sollte. Für T-Zell-Färbungen wurde vor dem ersten Färbeschritt ein
zusätzlicher Blockierschritt durchgeführt (10% Ziegenserum in Zellpuffer, 10-20 min, 4 °C).
Berechnungen der Gesamtzellzahl von Subpopulationen beziehen sich auf den Anteil der
Population in einem „Forward/Sideward Scatter“ basierten Lebendgate.
9.1.5
Durchflusszytometrische Bestimmung der Lebend/Gesamtzellzahl mit Partikeln und
Propidiumiodid
Zellen in Einzelsuspension können mit einer definierten Zahl an Partikeln (BD TrueCount Beads)
gemischt werden, die im Durchflusszytometer von Zellen und anderen Messpunkten
unterscheidbar sind. Weil die Zahl an Partikeln pro Volumen bekannt ist, kann berechnet werden,
wie viele Zellen sich pro gemessenem Partikel in der Probe befinden. Bezieht man diesen Wert
auf das Gesamtvolumen der Zellsuspension hat man die Gesamtzellzahl. BD TrueCount Beads
sind sehr klein, darum kann es nötig sein den Schwellenwert für Events, die das
Durchflusszytometer aufnehmen soll zu verändern (Forward Scatter). Am ersten Tag der Messung
wurde eine Beadlösung für alle Messzeitpunkte in einem 50 ml Falcon angesetzt. Dazu wurden
ca. 15 Beads/µl in Zellpuffer aufgenommen. Zum messen wurden die ausgesäten Zellen geerntet
und ohne Zentrifugationsschritt in ein 5 ml Röhrchen übertagen. Dann wurde dasselbe Volumen
an Beadsuspension in das 5 ml Röhrchen übertragen. 5 min vor der Messung kann
Propidiumiodidlösung 50 µg/ml im Verhältnis 1:20 zu den Zellen gegeben werden.
Propidiumiodid kann für die Unterscheidung von vitalen und apoptotischen Zellen im
Durchflusszytometer genutzt werden. Alternativ kann auch DAPI verwendet werden, das auch
144
Aufarbeitung muriner Zellen und durchflusszytometrische Analyse
Methoden
apoptotische Zellen färbt. Es dringt in Zellen mit beschädigter Membran ein, interkaliert mit der
DNA und färbt so beschädigte Zellen.
9.1.6 Messung der Calciummobilisierung nach Rezeptorstimulation in Lymphozyten
Für 1x107 Zellen wurden 700 µl RPMI mit 5 % FCS zugegeben und resuspendiert. Bei mehr
Zellen wurden die Mengen entsprechend angepasst. Es wurden 7 µl Indo1-Mix zugegeben und
bei 30°C für 25 min inkubiert. Indo1 Mix besteht aus 7,4% Pluronic F127 (Molecular Probes)
und 0,1 µg/µl Indo-1 in DMSO. Dann wurden 700 µl RPMI mit 10 % FCS zupipettiert und die
Zellen wurden weitere 10 min bei 37 °C inkubiert. Nach der Beladung wurden die Zellen
abzentrifugiert und exrtazellulär gefärbt. Anschließend wurden die Zellen zwei Mal mit KrebsRinger-Lösung gewaschen und auf Eis gelagert. Für die Messung wurden die Zellen 1:10 mit
vorgewärmter Krebs-Ringer-Lösung versetzt (37 °C) und für 1 min bei 37 °C im Wasserbad
inkubiert, bevor sie am LSR II gemessen und das Calcium-Signal mit FlowJo ausgewertet wurde.
Bei der Messung wurde zuerst der Calcium-Grundlevel bestimmt, bevor die Zellen stimuliert
wurden. Die Stärke des Calciumsignales wird über das Verhältnis von Calcium gebundenen Indo1
zu Indo1 bestimmt. Die Bindung von Calcium verändert das Emissionsmaximum von Indo1 von
475 nm zu 400 nm. Die Verschiebung des Emissionsmaximums kann am LSRII über
einen UV-Laser gemessen werden. B-Zellen wurden direkt mit unterschiedlichen
Konzentrationen Ziege oder Kaninchen IgG anti-IgM oder IgG anti-IgM (Fab2) stimuliert. Der
inhibitorische Effekt des FcγR2b auf das Calciumsignal kann gemessen werden, in dem er über
den IgG Fc-Teil des anti-IgM Antikörpers an den B-Zell Rezeptor rekrutiert wird. Dies geschieht
nicht, wenn mit anti-IgM (Fab2) stimuliert wird. Der Fc-Teil des Kaninchen-Antikörpers ist in der
Lage den FcγR2b stärker zu aktivieren als der Ziegen-Antikörper. T-Zellen wurden in zwei
Schritten stimuliert. Zu dem extrazellulären Färbeschritt wurde ein armenischer Hamster antiMaus-TCRβ 1:50 Antikörper zugegeben (H57-597), der an den T-Zell Rezeptor β bindet. Der
Calciumflux wurde während der Messung durch die Kreuzvernetzung des anti-TCRβ Antikörpers
durch einen anti-Hamster-IgG Antikörper (H-1643) ausgelöst. Ionomycin wurde verwendet, um
die Indo1-Beladung der Lymphozyten zu überprüfen.
9.2 Aufreinigung von B- und T-Zellen
9.2.1 Zellsortierung über magnetische Partikel (MACS)
Bei diesem Verfahren werden Antikörper eingesetzt, an die magnetisierbare Partikel gebunden
sind. Binden diese Antikörper an Zellen können die Zellen in einem magnetischen Feld
zurückgehalten werden. Zellen an die keine Antikörper mit magnetisierbaren Partikeln gebunden
können das magnetische Feld passieren.
9.2.1.1
Aufreinigung naiver CD62L+CD4+ T-Zellen
145
Aufreinigung von B- und T-Zellen
Methoden
Die Aufreinigung erfolgte mit dem kommerziellen CD4+ CD62L+ T cell isolation Kit II
(Miltenyi).
Negativer Selektionsschritt: Weil die Erythrozyten über Antikörper gegen Ter-119 depletiert
werden ist keine Erythrozytenlyse notwendig. Die Milz- Lymphknotenzellen wurden für 10 min
bei 1400 rpm abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Pro 1x108 bis 1,5x108 Zellen wurden
400 µl MACS-Puffer mit 100 µl CD4+ T-Zell Biotin-Antikörpermix gemischt. Die Milzzellen
wurden in der Antikörperlösung resuspendiert und 10 min im Kühlschrank inkubiert. Nach der
Inkubationszeit wurden pro Milz 300 µl MACS-Puffer versetzt mit 200 µl anti-Biotin
„MicroBeads“ zugegeben. Die Zellen wurden weitere 15 min im Kühlschrank inkubiert. Es folgte
ein Waschschritt mit 10 ml MACS Puffer. Die Zellen wurden für 10 min bei 1400 rpm
abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Dann wurde das Pellet in 3ml MACS Puffer gelöst
und auf eine mit 3 ml MACS Puffer äquilibrierte LS-Säule gegeben, die sich in einem
magnetischen Feld befand. Die Säule wurde zwei Mal mit je 3ml MACS Puffer gewaschen. Der
Durchfluss wurde optional auf eine zweite mit 3ml MACS Puffer äquilibrierte LS-Säule gegeben,
die mit 3 ml MACS Puffer gewaschen wurde, um die Reinheit zu erhöhen. Durch diesen Schritt
wurden CD8a+, CD25+, CD45R+, CD49b+, TCRγδ + und Ter-119+ Zellen depletiert. Es wird mit
den Zellen aus dem Durchfluss weiter gearbeitet. Anstelle von MACS-Puffer kann Zellpuffer
verwendet werden.
Positiver Selektionsschritt: Die Zellen im Durchfluss wurden für 10min bei 1400 rpm
abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Es wurden pro Probe 800 µl MACS-Puffer mit 200
µl anti-CD62L „MicroBeads“ gemischt. Die Milzzellen wurden in der Antikörperlösung
resuspendiert und 15min im Kühlschrank inkubiert. Es folgte ein Waschschritt mit 10 ml MACS
Puffer. Die Zellen wurden für 10 min bei 1400 rpm abzentrifugiert und der Überstand verworfen.
Dann wurde das Pellet in 3 ml MACS Puffer gelöst und auf eine mit 3 ml MACS Puffer
äquilibrierte LS-Säule gegeben, die sich in einem magnetischen Feld befand. Die Säule wurde
zwei Mal mit je 6 ml MACS Puffer gewaschen. Die Säule wurde aus dem magnetischen Feld
entfernt und in ein frisches 15 ml Röhrchen überführt. Es wurden 5 ml MACS Puffer mit dem
beiliegenden Spritzenstempel durch die Säule gedrückt. Dadurch werden die vormals durch das
Magnetfeld an die Säule gebundenen CD62L+ Zellen von der Säule gewaschen. Die
aufgereinigten Zellen wurden durchflusszytometrisch auf ihre Reinheit überprüft. Dazu wurde die
Expression von CD5 und CD4 untersucht. Anstelle von MACS-Puffer kann Zellpuffer verwendet
werden.
9.2.1.2
Aufreinigung von CD4+ T-Zellen
Die Aufreinigung erfolgte mit dem kommerziellen CD4+ T cell isolation Kit II (Miltenyi).
146
Aufreinigung von B- und T-Zellen
Methoden
Bei der Aufreinigung handelt es sich um einen negativen Selektionsschritt wie in 9.2.1.1
beschrieben. Allerdings wurde der CD4+ T-Zell Biotin-Antikörpermix aus dem CD4+ T cell
isolation Kit II verwendet, der sich leicht von dem genauso benannten Mix aus dem CD4+
CD62L+ T cell isolation Kit II unterscheidet. Es werden CD8a+, CD11b+, CD11c+, CD19+,
CD45R (B220)+, CD49b (DX5)+, CD105+, Anti-MHC class II+, und Ter-119+ Zellen depletiert.
9.2.1.3
T-Zell Depletion zur B-Zell Anreicherung
Milzzellen wurden mit 10ml MACS-Puffer gewaschen. Die Bindung der Partikel-gebundenen
Antikörper wurde in einem Volumen von 200µl MACS-Puffer mit 20µl anti-CD90.2 (Thy1)
Partikel-gebundenen Antikörpern (Miltenyi) pro 50 mio Zellen durchgeführt (LD-Säulen Miltenyi
benutzt). Die Lösung enthielt zusätzlich 2.4G2 Fc-Block (1:100). Die Inkubationszeit betrug
10min bei 4 °C (nicht auf Eis, sondern im Kühlschrank). Die Zellen wurden mit 5ml MACSPuffer gewaschen. Parallel wurde pro Probe eine LD-Säule mit 2ml MACS-Puffer equilibriert.Die
Zellen wurden in 1000µl MACS-Puffer aufgenommen und in einem Magnetfeld auf die LD-Säule
geben. Die Säule 3x mit MACS-Puffer nachspülen. Die mit Partikel-gebundenen Antikörpern
gelabelten Zellen verbleiben in der Säule. Im Durchfluss befinden sich die angereicherten BZellen.
9.2.1.4
Positive B-Zell Aufreinigung
Bei der Aufreinigung handelt es sich um einen positiven Selektionsschritt wie in 9.2.1.1
beschrieben. Allerdings wurden statt der anti-CD62L Beads pro Milz 60 µl anti-CD19 Beads in
MACS-Puffer für die Färbung verwendet.
9.2.2 Komplement-vermittelte T-Zelllyse zur B-Zell Anreicherung
Aufgereinigte Zellen einer Milz wurden in 1 ml RPMI5+ resuspendiert. Dazu wurden je 500 µl
Hybridomüberstände mit IgM-anti-CD4 (Klon: RL 174,2), IgM-anti-CD8 (3168.1) und IgM-antiThy1 (CD90) (Klon: AT83A) pipettiert. Die Zellen wurden für 30 min bei 4 °C inkubiert und
anschließend mit 5 ml RPMI5+ gewaschen. Die Zellen wurden in 3 ml Mausmedium
aufgenommen zu dem 0,33 ml Kaninchen-Komplement in H2O pipettiert wurde. Das
Komplement muss mit 1 ml kaltem Wasser frisch angesetzt werden. Es folgt eine Inkubation für
45 min bei 37 °C unter leichtem Schwenken. In dieser Zeit tötet das Komplementsystem die mit
IgM-Antikörpern markierten Zellen. Anschließend wurden die Zellen mit 5 ml Mausmedium
gewaschen.
147
Aufreinigung von B- und T-Zellen
Methoden
9.3 Untersuchungen zur Apoptose, Proliferation und Differenzierung von BZellen
9.3.1 In vitro B-Zell Reifung
B-Zellen der Milz wurden über anti-CD90.2 (Thy1) Partikel-gebundenen Antikörper (Miltenyi)
wie in 9.2.1.3 beschrieben angereichert. Die Zellen wurden auf B220 (RA3-6B2), HSA (M1/69),
CD21 (E79) und CD23 (B3B4) gefärbt. Es wurden durchflusszytometrisch (BD FACSAria II) T2
B-Zellen (B220+HSAhighCD21highCD23+) und reife B-Zellen (B220+HSAlowCD21int) separiert
(Abb. 12). Um die Zellen zu schonen wurden sie in Röhrchen mit 1 ml PBS mit 2 % FCS und 2
mM EDTA sortiert, das einen Tag vorher vorgelegt wurde. Unspezifische Bindestellen werden so
abgesättigt und die Zellen haften weniger am Plastik. Es kann nötig sein die Zellen zwei Mal zu
sortieren, um die Reinheit zu erhöhen. Für die Sortierung wurden nur DAPI-negative Zellen
berücksichtigt. Bis zu 2x105 Zellen wurden für 48 h mit oder ohne Stimulantien bei 37 °C and 5
% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die Zellen wurden entweder mit anti-IgM (Fab2) (10 µg/ml),
anti-IgM (Fab2) (10 µg/ml) und BAFF (Blys) (0.2 µg/ml) oder LPS (1 µg/ml) stimuliert oder
nicht stimuliert. Der Anteil der T1, T2 und reifen B-Zellen nach der Stimulation wurde
durchflusszytometrisch bestimmt. Ausgesäte reife B-Zellen dienten als Referenz für die Gates.
9.3.2 Messung der spontanen Apoptoserate in vitro mittels DAPI-Färbung
Milzzellen wurden durch eine komplement-vermittelte T-Zelllyse, wie in 9.2.2 beschrieben
angereichert. 1x105 bis 2x105 Zellen pro Well (96 Well Flachbodenplatte) wurden für
verschiedene Zeiträume in RPMI5+ bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Dann wurden die Zellen
extrazellulär auf B220 (RA3-6B2) und HSA (M1/69) angefärbt und anschließend für 10 min mit
1ml 2% Paraformaldehyd in PBS für 10 min fixiert. Die Zellen können in FACS-Puffer gelagert
werden. Nach Abschluss der Stimulation wurden die Zellen aller Zeitpunkte gleichzeitig über
Nacht in 1ml 70 % Methanol in PBS permeabilisiert. Es folgte ein 30 min Färbeschritt in 500 µl
DAPI-Lösung bei RT. Dabei dringt DAPI in die permeabilisierten Zellen ein und interkaliert mit
der DNA. Dann wurden die Zellen zwei Mal mit je 1 ml FACS-Puffer gewaschen und wurden
zum messen (LSRII) in FACS-Puffer aufgenommen. Apoptotische Zellen verlieren nach der
Permeabilisierung einen fragmentierten Teil ihrer DNA, weshalb sie einen geringeren DNAGehalt aufweisen als vitale Zellen in der G1-Phase und im subG1 Bereich als definierte Fraktion
gemessen werden können. Zur Auswertung wurde das Programm FlowJo (Treestar) verwendet.
9.3.3 Toll Like Rezeptor (TLR) Stimulation und 3H-Tritiumthymidin Proliferationsassay
Durchflusszytometrisch sortierte unreife (B220low HSAhigh) und reife B-Zellen (B220high HSAlow)
wurden jeweils für 48 h bei 37 °C und 5 % CO2 mit R848 (TLR7 Ligand) oder CPG-ODN 1826
(TLR9 Ligand) in 0,2 ml RPMI5+ stimuliert. Für die letzten 12 h wurde 1µCi/Well 3HTritiumthymidin
zu
den
Zellen
gegeben.
Nach
der
Inkubation
wurde
148
Untersuchungen zur Apoptose, Proliferation und Differenzierung von B-Zellen
der
3
H-
Methoden
Tritiumthymidineinbau am Szintillationszähler detektiert (Berthold-Inotech Trace-96 - Berthold,
Wildbad, Germany). Die Zahl der gemessenen Ereignisse pro Minute (cpm) ist direkt proportional
zum 3H-Tritiumthymidineinbau in die Zellen. Dieser ist ein Maß für die Proliferation.
9.4 Untersuchungen zur Apoptose, Proliferation und Differenzierung von TZellen
9.4.1 T-Zell Proliferationsassay
Milzzellen aus Mäusen mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis wurden in RPMI10+
mit 0 µM, 0,002 µM, 0,02 µM, 0,2 µM, 2 µM, bzw. 20 µM MOG-Peptid für 72 h bei 37 °C und 5
% CO2 restimuliert. Für die letzten 16 h wurde 1µCi/Well 3H-Tritiumthymidin zu den Zellen
gegeben. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit einem IH-110 Zellernter (Innotech) geerntet
und der 3H-Tritiumthymidineinbau am Szintillationszähler (1450 Microplate Counter von Wallac)
detektiert. Die Zahl der gemessenen Ereignisse pro Minute (cpm) ist direkt proportional zum 3HTritiumthymidineinbau in die Zellen. Dieser ist ein Maß für die Proliferation.
9.4.2 Allogener gemischter Lymphozytenversuch
Die Aktivierbarkeit von T-Zellen durch dendritische Zellen oder die Aktivierungskapazität von
dendritischen Zellen gegenüber T-Zellen kann im allogenen gemischten Lymphozytenversuch
untersucht werden. CD4+ T-Zellen wurden aus Milzen wie in 9.2.1.2 beschrieben über
magnetische Seperation aufgereinigt. dendritische Zellen wurden aus Knochenmarkszellen von
BALB/c Mäusen durch GM-CSF Zugabe generiert (von AG Steinkasserer). Dazu wurden
Knochenmarkszellen in einer Dichte von 2x106/10 ml in RPMI10+ ausgesät und mit dem 1:10
verdünnten GM-CSF haltigen Überstand von einer Zelllinie, die mit dem murinem GM-CSF Gen
transfiziert war behandelt. Nach 10 Tagen Reifung in denen die dendritischen Zellen reifen
wurden sie mit T-Zellen gemischt und ausplattiert. Je 4x106 CD4+ T-Zellen aus 10 Generationen
auf den C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzten Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen wurden mit
verschiedenen Zahlen von dendritischen Zellen in RPMI10+ gemischt und für 72 h in einer 96
Well Rundbodenplatte inkubiert. Für die letzten 16 h wurde 1µCi/Well 3H Tritiumthymidin
zugegeben. Das in die Zellen eingebaute
Proliferation
der
Zellen
zu
Knochenmarkszellen von Grb2
fl/fl
messen.
3
H Tritiumthymidin wurde gemessen, um die
Alternativ
wurden
dendritische
Zellen
tg
aus
6
CD4cre Mäusen und Kontrolltieren generiert. Je 4x10 T-
Zellen aus BALB/c Mäusen wurden mit verschiedenen Zahlen von dendritischen Zellen gemischt
und für 72 h inkubiert und dann wie oben beschrieben mit 3H Tritiumthymidin behandelt.
149
Untersuchungen zur Apoptose, Proliferation und Differenzierung von T-Zellen
Methoden
9.5 Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
9.5.1 Realtime PCR – B-Zell Subpopulationen
B-Zellen der Milz wurden über anti-CD90.2 (Thy1) Partikel-gebundenen Antikörper (Miltenyi)
wie in 9.2.1.3 beschrieben angereichert. Die Zellen wurden auf B220 (RA3-6B2), HSA (M1/69),
CD21 (E79) und CD23 (B3B4) gefärbt. Es wurden durchflusszytometrisch (BD FACSAria II) T1
B-Zellen (B220+HSAhighCD21low), T2 B-Zellen (B220+HSAhighCD21highCD23+) und reife B-Zellen
(B220+HSAlowCD21int) separiert (Abb. 12). Es kann nötig sein die Zellen zwei Mal zu sortieren,
um die Reinheit zu erhöhen. Für die Sortierung wurden nur DAPI-negative Zellen berücksichtigt.
Bis zu 1x106 sortierte Zellen pro Well wurden in einer Konzentration von 1x106 Zellen/ml in
RPMI5+ ausgesät und für 3 h mit 10 µg/ml anti-IgM (Fab2) oder ohne Stimulation stimuliert
(37°C, 5% CO2). Für die Inkubation wurden je nach Zellzahl unterschiedlich große
Zellkulturplatten mit flachem Boden verwendet. Nach der Inkubation wurde die RNA aus den
Zellen isoliert, wie in 9.5.3 beschrieben und in cDNA umgeschrieben, wie in 9.5.4 beschrieben.
Für die Realtime PCR wurde ein kommerzielles Kit verwendet (BRILLIANT II SYBR® GREEN
QRT-PCR MASTER MIX WITH ROX, 1-STEP Stratagene).
150
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
Ansatz (1x 25 µl)
-
12,5 µl Mastermix (als erstes rein)
-
5 µl
-
0,375 ref Dye (vorher 1:500 in H2O vorverdünnt)
-
5,13µl Nuklease freies H2O
-
2µl
Primer (beide Primer im Stock je 1pmol/µl)
cDNA-Template
Die PCR wurde in einer Stratagene MX3000P PCR-Maschine (AG Slany) mit folgendem
Programm durchgeführt:
1 Zyklus
95 °C
10 min
Denaturierung
95 °C
15 s
Denaturierung
60 °C
30 s
Anlagerung
72 °C
30 s
Verlängerung
95 °C
30 s
Denaturierung
67 °C
30 s
Anlagerung
95 °C
30 s
Denaturierung
45 Zyklen
1 Zyklus
SYBR® Green I interkaliert mit doppelsträngiger DNA und bildet einen fluoreszierenden
Komplex mit ihr. Ist es nicht an doppelsträngige DNA gebunden fluoresziert es kaum. Auf diese
Weise kann über die Fluoreszenz die Menge an doppelsträngiger DNA in verschiedenen Zeiten
einer PCR in Echtzeit bestimmt werden. Der Schwellenwert ab dem die Fluoreszenz einer Probe
signifikant über der Hintergrundfluoreszenz liegt wird CT-Wert genannt. Der CT-Wert wird in
der exponentiellen Phase der PCR gemessen. Um die Messgenauigkeit zu steigern wurden pro
Probe Duplikate gemessen. Von dem CT-Wert der zu untersuchenden Probe wurde der CT-Wert
eines Referenzgenes abgezogen, um den ΔCT-Wert zu erhalten. Aktin wurde als Referenzgen
gewählt. Geht man davon aus, dass sich die DNA Menge pro Zyklus in der exponentiellen Phase
verdoppelt, kann man die relative Expression eines Genes durch 2-ΔCT berechnen. Eine Probe
wurde als Kalibrator bestimmt zu dem Änderungen relativ angegeben werden. Für die Messung
und Auswertung wurden die MxPro QPCR Software und Excel benutzt.
151
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
9.5.2 RNA Isolierung mit Trizol und Chloroform
Trizol enthält Phenol. Darum wurde mit Handschuhen unter dem Abzug gearbeitet. Bis zu 5x10 6
Zellen wurden in 0,5 ml Trizol resuspendiert. Es wurden 100 µl Chlorophorm dazu pipettiert. Die
Proben wurden 2-3 min bei RT inkubiert. Dann wurden die Proben mit 13000 rpm für 10 min bei
4 °C abzentrifugiert. Die obere Phase wurde vorsichtig abgenommen und in ein 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt. Dazu wurden 250 µl Isopropanol gegeben und gut vermischt. Es folgte
eine weitere Inkubation für 10 min bei RT. Dann wurden die Proben mit 13000 rpm für 10 min
bei 4 °C abzentrifugiert. Die Zellen wurden mit 75 % Ethanol in entionisiertem H2O gewaschen.
Es folgte ein Zentrifugationsschritt mit 13000 rpm für 10 min bei 4 °C. Der Überstand wurde
verworfen und das Pellet wurde luftgetrocknet, bevor es in 25 µl DEPC-H2O aufgenommen
wurde. Die RNA-Menge wurde mit einer Nanodrop-Messung bestimmt. Die RNA kann bei -80°C
gelagert werden.
9.5.3 RNA Isolierung über Säulen
Zur RNA-Isolierung wurde ein kommerzielles Kit verwendet (“Rneasy mini kit” Qiagen). Für
die Isolierung von RNA wurde möglichst steril und mit Handschuhen gearbeitet. Die Zellen
wurden in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und 5 min bei 4000 rpm abzentrifugiert. Das
Medium wurde komplett abgenommen. Bei weniger als 5 mio Zellen wurden diese in 350µl RLTPuffer aufgenommen. Bis zu 10mio Zellen wurden in 600µl RLT Puffer resuspendiert. Der RLTPuffer enthielt 10 µl 2-Mercaptoethanol pro ml. Die Proben wurden gevortext. Die Lysate wurden
in QiaShredder-Säulchen überführt und 2 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. An dieser Stelle
besteht die Möglichkeit die Lysate bei -80°C einzufrieren. Es wurde ein Mal das Volumen des
Lysates in Form von 70% Alkohol zugeben. Davon wurden bis zu 700µl in eine RNeasy MiniSpin-Säule gegeben, die sich in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß befindet und 15 s bei 10.000 rpm
abzentrifugiert. Die Flüssigkeit aus dem 1,5 ml Reaktionsgefäß wurde verworfen. Bei einem zu
großen Volumen kann der Schritt mit derselben Säule wiederholt werden. Es wurden 700µl RW
Waschpuffer auf die Säule pipettiert und 15 s bei 10.000 rpm abzentrifugiert. Die Flüssigkeit aus
dem 1,5 ml Reaktionsgefäß wurde verworfen. Dann wurden 500µl RPE-Lösung auf die Säule
gegeben und 2 min bei 10.000 rpm zentrifugiert. Die Säule wurde in ein frisches 2ml
Reaktionsgefäß überführt und 2 min bei 10.000 rpm trocken zentrifugiert. Die Säule wurde in ein
frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Es wurden mit 30 µl entionisiertes H2O auf die Säule
gegeben, gefolgt von einer 1 min Zentrifugation bei 10.000 rpm, um die DNA von der Säule zu
eluieren. Dieser Schritt kann wiederholt werden, um die RNA Ausbeute zu erhöhen. Die RNAMenge wurde mit einer Nanodrop-Messung bestimmt. Die RNA kann bei -80°C gelagert werden.
9.5.4 cDNA Synthese
Für die cDNA Synthese aus RNA wurde eine kommerzielles Kit verwendet (SuperScriptTM III
RNase H-Reverse Transcriptase Invitrogen). Es wurden wenn möglich 1-5 µg RNA eingesetzt.
152
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
Wenn nicht genug RNA vorhanden war, wurde die maximal vorhandene Menge an RNA
eingesetzt. Zu der RNA wurden 1µl 500 ng oligo(dT)18 und 1µl (10 nM) DNTPs ad 13 µl RNAse
freies H2O gegeben. Der Mix mit der RNA wurde für 10 min auf 65 °C erhitzt, um die
Sekundärstruktur zu lösen und verbleibende Proteine zu denaturieren. Dann wurden die Proben 1
min auf Eis gekühlt. In dieser Zeit wurde pro Probe ein Mix aus 4 µl 5x „first strand buffer“, 1 µl
DTT (0,1 M) und 1 µl \SuperScriptIII (200 U) möglichst ohne Blasenbildung zugegeben. Die
Proben wurden für den Umschreibevorgang für 60 min bei 50 °C und anschließend 15 min bei 70
°C inkubiert (Trio Professional PCR Maschine). Die cDNA-Menge kann optional mit einer
Nanodrop-Messung bestimmt werden. Die cDNA kann bei -80°C gelagert werden.
9.5.5
Detektion eines spezifischen RNA Abschnittes als Zeichen für einen Klassenwechsel
zu IgG1
Mit dieser Methode wird ein spezifisches RNA Stück nachgewiesen, das beim Klassenwechsel zu
IgG1 synthetisiert wird. Es wird von einem zirkulären DNA Stück trankribiert, welches beim
Klassenwechsel zu IgG1 aus dem Bereich, der für die Immunglobulin schwere Kette kodiert
geschnitten wird (Kinoshita et al. 2001). Milzzellen von Grb2fl/fl mb1+/+ and Grb2fl/fl mb1cre/+
Mäusen wurden für 48 h mit LPS (10 µg/ml), LPS (10 µg/ml) und IL-4 (10 ng/ml) oder ohne
weitere Stimulation in 5 ml RPMI5+ inkubiert (37 °C, 5 % CO2). Die RNA der Zellen wurde
aufgereinigt und in cDNA umgeschrieben (9.5.2 und 9.5.4). Dann wurde eine PCR nach dem
unten angegebenen Programm durchgeführt.
Cγ1 zirkuläres
Transkript
1 Ansatz 50 µl
Programm
H2O
39,9 µl
94 °C
10x Puffer
5 µl
--Block 35x wiederholen--
I-Gamma-1F
1,5 µl
94 °C
45 sek
CµR
1,5 µl
50 °C
60 sek
dNTPs
1 µl
72 °C
90 sek
Taq-Polymerase
0,1 µl
--------------------------------
Template
1µl
72 °C
5 min
15 °C
unendlich
Banden:
zirkuläres Transkript für
IgG1
408 bp
Primer:
I-Gamma-1F
CµR
9.5.6
5' GGC CCT TCC AGA TCT TTG AG 3'
(20 bp)
5' AAT GGT GCT GGG CAG GAA GT 3'
(20 bp)
2 min
DNA-Aufreinigung aus Ohr- und Schwanzbiopsien
153
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
Ohr- oder Schwanzbiopsien wurden in 30 µl Lysepuffer mit 1 µl Proteinase K aufgenommen und
über Nacht bei 56 °C inkubiert. Die Lysate können optional bei 1 h auf 84 °C erhitzt werden, um
Enzyme zu inaktivieren. Die Proben wurden 5 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Die DNA ist
im Überstand vorhanden und kann zur Genotypisierung genutzt werden.
154
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
9.5.7 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren mit dem spezifische DNA-Abschnitte
vervielfältigt werden können. Diese können dann wie in 9.5.8 beschrieben nach ihrer Größe
aufgetrennt und detektiert werden. Unterschiedliche Fragmentgrößen oder das Fehlen bzw.
Vorhandensein einer DNA-Bande können Rückschlüsse auf den Genotyp einer Maus zulassen.
Für die PCR werden bis auf Ausnahmefälle mindestens zwei spezifische Primer verwendet, die
jeweils den Anfang der komplementären DNA-Stränge des gewünschten PCR Produktes bilden
und in umgekehrter Orientierung an komplementäre Template DNA-Einzelstränge binden
können. Ausgehend von den gebundenen Primern kann eine DNA-Polymerase aus freien
Nukleotiden einen Komplementärstrang zum DNA-Templatestrang synthetisieren. Das Verfahren
ist Temperaturabhängig. Doppelsträngige DNA wird bei 96 °C denaturiert. Dann wird die
Temperatur abhängig von der Schmelztemperatur der eingesetzten Primer gesenkt, damit sich die
Primer an die nun Einzelsträngige Template DNA anlagern können. Dann wird die Temperatur so
eingestellt, dass die DNA-Polymerase optimal arbeiten kann und den Templatestrang ausgehend
vom Primer komplementär synthetisiert. Das doppelsträngige Produkt kann wieder denaturiert
und als Template verwendet werden. Diese Schritte werden mehrmals wiederholt, um das
gewünschte Produkt zu vervielfältigen. Als Template kann auch cDNA genutzt werden, um RNA
Sequenzen nachzuweisen.
Grb2 - LoxP
überspannt eine LoxP Sequenz
1 Ansatz 50 µl
Programm
H2O
39,8 µl
94 °C
10x Puffer
5 µl
--Block 35x wiederholen--
LoxP check in - 2S
1,5 µl
94 °C
20 sek
LoxP check in - 2AS
1,5 µl
55 °C
20 sek
dNTPs
1 µl
72 °C
30 sek
DMSO
0,5 µl
--------------------------------
Taq-Polymerase
0,2 µl
72 °C
10 min
Template
0,5 µl
15 °C
unendlich
Primer:
LoxP check in - 2S
LoxP check in - 2AS
4 min
Produkte:
5' CCA GCA CAC ATG TCC TGC CTT C 3'
(22 bp)
5' GGT GGC TCA CAA CCA CCT ATA AC 3'
(23 bp)
wt
241 bp
gefloxt
209 bp
Aggregat wt u ko Produkt
> wt
155
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
Grb2 - LoxP2
überspannt beide LoxP Sequenzen
1 Ansatz 30 µl
Programm
H2O
25,1 µl
94 °C
10x Puffer
3 µl
--Block 35x wiederholen--
Grb2-in1S_check
0,6 µl
94 °C
30 sek
LoxP check in - 2AS
0,6 µl
63 °C
30 sek
dNTPs
0,6 µl
68 °C
90 sek
Taq-Polymerase
0,1 µl
--------------------------------
Template
0,5 µl
68 °C
5 min
15 °C
unendlich
Primer:
4 min
Produkte:
5' TTA CAG CCT TCC TTC TGC CCT CC 3'
(23 bp)
5' GGT GGC TCA CAA CCA CCT ATA AC 3'
(23 bp)
Grb2-in1S_check
LoxP check in - 2AS
wt
884 bp
gefloxt
973 bp
ko
298 bp
Anmerkung: mb1cre ist teilweise in der Keimbahn aktiv, darum kann es sinnvoll sein zu
überprüfen, ob die Deletion auf einem Allel in allen Zellen stattgefunden hat. Eine komplette
Deletion auf beiden Allelen würde dazu führen, dass die Mäuse embryonal letal wären.
mb1cre
1 Ansatz 50 µl
Programm
H2O
36,3 µl
94 °C
10x Puffer
5 µl
--Block 35x wiederholen--
mb1-in1 jo
2 µl
94 °C
45 sek
mb1-cre-rev
1 µl
63 °C
60 sek
mb1-ex2-rev jo
1 µl
68 °C
60 sek
dNTPs
1 µl
--------------------------------
DMSO
2,5 µl
68 °C
10 min
Taq-Polymerase
0,2 µl
15 °C
unendlich
Template
0,5 µl
Primer:
mb1-in1 jo
mb1-cre-rev
mb1-ex2-rev jo
10 min
Produkte:
5' GTC TGG GCT AGA GCA ATC ATC TCC 3'
(24 bp)
5' TCC TCA TCA CCA GGG ACA CAG C 3'
(22 bp)
5' ACG CGG AGG TAA GTA CCA CAG G 3'
(22 bp)
wt
357 bp
mb1cre-Bande
469 bp
156
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
Bcl2Transgen
1 Ansatz 30 µl
Programm
H2O
23,1 µl
94 °C
10x Puffer
3 µl
--Block 35x wiederholen--
IMR550
1 µl
94 °C
30 sek
IMR551
0,6 µl
55 °C
30 sek
mBcl2-in1AS
0,6 µl
72 °C
30 sek
dNTPs
Super TaqPolymerase
0,6 µl
--------------------------------
0,1 µl
72 °C
1 min
Template
1 µl
15 °C
unendlich
Primer:
IMR550
IMR551
mBcl2-in1AS
4 min
Produkte:
5' TGG ATC CAG GAT AAC GGA GG 3'
(20 bp)
5' TGT TGA CTT CAC TTG TGG CC 3'
(20 bp)
5' TGA GAG TTA CTG GAG GGA TGC 3'
(21 bp)
wt
304 bp
Bcl2
177 bp
Cγ1cre
1 Ansatz 30 µl
Programm
H2O
24,4 µl
94 °C
10x Puffer
3 µl
--Block 33x wiederholen--
IgG1 KPN1_Fw
0,5 µl
94 °C
30 sek
Cg1-cre_Fw
0,7 µl
57 °C
30 sek
IgG1_Rev
0,7 µl
72 °C
60 sek
dNTPs
0,6 µl
--------------------------------
Taq-Polymerase
0,1 µl
72 °C
1 min
Template
0,5 µl
15 °C
unendlich
Primer:
IgG1 KPN1_Fw
Cg1-cre_Fw
IgG1_Rev
90 sek
Produkte:
5' TGT TGG GAC AAA CGA GCA ATC 3'
(21 bp)
5' GGT GGC TGG ACC AAT GTA AAT A 3'
(22 bp)
5' GTC ATG GCA ATG CCA AGG TCG CTA G 3'
(25 bp)
wt
240 bp
Cγ1cre
455 bp
157
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
Methoden
LckcreTran
sgen
1 Ansatz 50 µl
Programm
H2O
38,8 µl
94 °C
10x Puffer
5 µl
--Block 35x wiederholen--
oIMR 7338
1 µl
94 °C
30 sek
oIMR 7339
1 µl
51,7 °C
30 sek
oIMR 7394
1 µl
72 °C
60 sek
oIMR 7393
1 µl
--------------------------------
dNTPs
1 µl
72 °C
2 min
Taq-Polymerase
0,2 µl
15 °C
unendlich
Template
0,5 µl
Primer:
oIMR 7338
(int. Pos. Kontr.)
oIMR 7339
(int. Pos. Kontr.)
oIMR 7393 fwd
oIMR 7394 rev
3 min
Produkte:
5' CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT 3'
(24 bp)
5' GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C3'
(25 bp)
5' CCT CCT GTG AAC TTG GTG CTT GAG 3'
(24 bp)
5' TGC ATC GAC CGG TAA TGC AG 3'
(20 bp)
wt
(Kontr. in IL-2 Gen Chr. 3)
324 bp
Lckcre-Transgen
ca. 200 bp
CD4creTransgen
1 Ansatz 50 µl
Programm
H2O
39,8 µl
94 °C
10x Puffer
5 µl
--Block 38x wiederholen--
oIMR 7338
1 µl
94 °C
30 sek
oIMR 7339
1 µl
56 °C
30 sek
CD4cre fwd
1 µl
72 °C
60 sek
CD4cre rev
1 µl
--------------------------------
dNTPs
1 µl
72 °C
10 min
Taq-Polymerase
0,2 µl
15 °C
unendlich
Template
1µl
Produkte:
wt
(Kontr. In IL-2 Gen Chr. 3)
324 bp
CD4cre-Transgen
288 bp
Primer:
oIMR 7338
(int. Pos. Kontr.)
oIMR 7339
(int. Pos. Kontr.)
CD4cre fwd
CD4cre rev
5' CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT 3'
(24 bp)
5' GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C 3'
(25 bp)
5' CGA TGC AAC GAG TGA TGA GG 3'
(20 bp)
5' GCA TTG CTG TCA CTT GGT CGT 3'
(21 bp)
158
Genexpressionsanalysen und Polymerase Kettenreaktion
3 min
Methoden
9.5.8 Agarose Gelelektrophorese
Agarosegele mit verschiedenen Konzentrationen wurden verwendet, um verschieden große DNAFragmente zu detektieren (Standardkonzentration: 1,5 %). Die Agarose wurde in 0,5x TNE-Puffer
aufgekocht, bis die Flüssigkeit klar war. Wenn das Gel etwa handwarm war wurden 3 µl
Ethidiumbromid bzw. verschiedene Ersatzstoffe zu dem Gel pipettiert. Die Gele wurden in eine
Form gegossen, wo sie auspolymerisierten. Es wurden fünf Teile PCR-Produkt mit einem Teil 6x
Ladepuffer gemischt und in die Geltaschen aufgetragen. Als Standard dienten DNA-Fragmente
bekannter Größe. Es folgte eine Elektrophorese mit 80 V bis 130 V. Ethidiumbromid, das mit
UV-Licht detektiert werden kann, interkaliert mit den DNA-Fragmenten im Gel. So kann die
DNA im Gel analysiert werden.
9.6 Untersuchungen zu Autoimmunität
9.6.1 Detektion von Autoantikörpern gegen Zellkomponenten von Hep-2 Zellen
Objektträger mit Schnitten von Hep-2 Zellen (Humane Epitheliomzellen Typ 2 eines
Larynxkarzinoms) wurden 15 min bei RT erwärmt und dann mit 50 µl von 1:50 vorverdünntem
Serum aus 50 Wochen alten Mäusen für 30 min in einer feuchten Kammer inkubiert. Als
Positivkontrolle dienten Seren aus alten MLR-lpr Mäusen Mäusen, die hohe Level an antinukleären Antikörpern (ANAs) im Serum haben. Die Objektträger wurden mit 1x mit PBS
gewaschen und dann für 10 min bei RT in PBS inkubiert. IgG-Antikörper, die gegen Bestandteile
von Hep-2 Zellen gerichtet waren wurden über einen Alexa Fluor 488 gekoppelten Ziege antiMaus IgG (H+L) Antikörper detektiert, der 1:500 in PBS verdünnt war. Die Platten wurden 3x
mit PBS gewaschen. Dann wurde ein Deckgläschen mit 100 µl Mowiol aufgebracht, das über
Nacht im Dunkeln bei RT aushärtete. Die Proben wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop
untersucht. Die Intensität und Verteilung der Fluoreszenz lässt Rückschlüsse auf die Menge und
die Spezifität von Autoantikörpern zu. Die Bilder wurden mit derselben Belichtungszeit und
Belichtungsstärke aufgenommen, damit sie vergleichbar sind. Helligkeit und Kontrast wurden bei
Bedarf für alle Bilder gleich abgeändert.
9.6.2 BUN - Harnstoff-Stickstoffgehalt im Blut
Der Harnstoff-Stickstoffgehalt ist ein Maß für die Nierenkapazität. Harnstoff wird im
Eiweißstoffwechsel gebildet, über die Niere gefiltert und über den Urin ausgeschieden. Bei
Funktionsstörungen der Niere steigt der Harnstoffgehalt im Blut. Ein Wert von bis zu 30 mg/dl
Harnstoff gilt als unauffällig. Alle Reagenzien wurden vor dem Versuch auf RT gebracht. Für den
Versuch wurden 96 Well Zellkulturplatten mit flachem Boden verwendet. Es wurde 1 µl Serum
zu 100 µl BUN-Enzymreagenz gegeben und für 10 min bei RT inkubiert. Als Kontrolle wurde 1
µl PBS verwendet. Als Standard diente eine Probe mit einer bekannten Konzentration von 30
mg/dl Harnstoff. Nach der Inkubation wurden 100 µl Farbreagenz zugegeben. Es folgte ein
weiterer Inkubationsschritt von 10 min bei RT. Die Proben wurden im ELISA-Messgerät
159
Untersuchungen zu Autoimmunität
Methoden
(VersaMaxPlus) für eine Absorption von 600 nm gemessen. Der Messwert für die
Negativkontrolle wurde von Standard und unbekannten Proben abgezogen. Die Konzentration für
unbekannte Proben kann anhand des Standards berechnet werden:
Harnstoff-Stickstoffgehalt im Blut (mg/dl) = (OD Probe / OD Standard) x 30
9.7 ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Der ELISA (Enzym-vermittelte immunosorbent-Analyse oder Enzyme Linked Immunosorbent
Assay) ist ein Verfahren mit dem man Stoffe, die an eine Platte gekoppelt sind oder Stoffe, die
wiederum daran gebunden sind durch ein Farbreaktion nachweisen kann. Der Nachweis erfolgt
meist über einen enzymgekoppelten Antikörper, der ein Substrat umsetzt und einen Farbumschlag
herbei führt. Dieser Farbumschlag kann über die Absorption von Licht einer bestimmten
Wellenlänge gemessen werden. Als Enzym wurde alkalische Phosphatase verwendet, die in
Diethanolamin-Puffer gelöstes Nitrophenylphosphat zu einem gelben Farbstoff umsetzt. Dieser
Farbumschlag kann über die OD bei einer Wellenlänge von 405 nm im ELISA-Reader (ELISAreader VersaMaxPlus) bestimmt werden. Es wurden Verdünnungsreihen von Proben und
Standards erstellt und es wurde anhand von einer vier Parameter Gleichung eine Kurve basierend
auf OD und Verdünnungsgrad für jede Probe erstellt. Über einen relativen Standard oder einen
Standard mit definierten Konzentrationen lassen sich die Proben vergleichen und gegebenenfalls
quantifizieren. Für die Auswertung wurde das Programm SoftMax Pro verwendet.
Formel für eine logistische Kurve mit 4 Parametern:
F(x) = ((A-D)/(1+((x/C)B))) + D
Diese kann nach x aufgelöst werden:
x = C(((A-D)/(F(x)-D))-1)(1/B)
x = Konzentration, A = Untere Asymptote, B = Steigung der Kurve, C = Wendepunkt, D = Obere
Asymptote
9.7.1 ELISA - Glykoprotein B / virusartige Partikel von humanem hCMV
Antikörperlevel gegen Glycoprotein B (gB) aus humanem hCMV und gegen virusartige Partikel
aus humanem hCMV können mittels ELISA subklassenspezifisch bestimmt werden. 96 Well
Maxisorp-Platten wurden pro Well mit 50 µl ELISA Kopplungspuffer und 1 µg/ml VLPs bzw.
0,5 µg/ml gB aus humanem hCMV über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer beschichtet.
Die Platten wurden 3x mit PBS gewaschen und mit 180 µl/well 5 % FCS, 0,05 % Tween20 in
PBS über Nacht bei 4 °C blockiert. Die Platten wurden 3 x mit PBS gewaschen und pro Well mit
50 µl Serumverdünnungen befüllt. Seren von unterschiedlichen Zeitpunkten nach gB oder VLP
160
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Methoden
Immunisierung wurden 1:20 in ELISA Verdünnungspuffer vorverdünnt. Ausgehend von der
Vorverdünnung wurde eine 1:3 Verdünnungsreihe mit 7 Verdünnungsschritten angefertigt. Es
wurde ein relativer Standard aus gepoolten Seren verwendet und wie die Proben verdünnt. Wenn
nötig kann die Standardreihe auch weiter verdünnt werden, um einen größeren Bereich
abzudecken. Für den Standard wurden Seren von Tagen verwendet, an denen der zu messende
Antikörpertiter voraussichtlich hoch war. Die Platten wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert und
am nächsten Tag 3x mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie für 2 h mit alkalischer
Phosphatase gekoppelten sekundären Antikörpern gegen Maus-IgM, IgG, IgG1, IgG2a oder
IgG2b inkubiert (1 µg/ml in ELISA Verdünnungspuffer). Die Platten wurden 3x mit PBS
gewaschen. Es wurde eine Tablette Nitrophenylphosphat pro 20 ml Diethanolamin-Puffer gelöst
(1 mg/ml Nitrophenylphosphat). Davon wurden 100 µl pro Well als Substrat für die alkalischer
Phosphatase auf die Platte pipettiert. Die Messung erfolgte mit einem ELISA-Reader (ELISAreader VersaMaxPlus).
9.7.2 ELISA auf 4-Hydroxy-3-nitrophenyl (NP) und CGG
Antikörperlevel gegen das Hapten 4-Hydroxy-3-nitrophenyl (NP), das oft in Immunisirungen
verwendet wird, können per ELISA bestimmt werden. 96 Well Maxisorp-Platten wurden pro Well
mit 50 µl 10 µg/ml NP4-BSA bzw. NP17-BSA (Stock 10mg/ml) oder Huhn gamma Globulin
(CGG) über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer beschichtet. Zu jedem Well wurden 180 µl
Blockierlösung pipettiert und die Platten wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Wenn es
Probleme mit dem Hintergrundsignal gab wurden dem Blockierpuffer 2 % FCS zugefügt. Das
weitere Vorgehen war prinzipiell wie in 9.7.1 beschrieben. Als Sekundärer Antikörper wurden ein
anti-IgG und ein anti-IgG2c Antikörper verwendet. Über das Verhältnis der NP4- zur NP17spezifischen Immunantwort gegen NP lassen sich Rückschlüsse auf die Affinitätsreifung der BZellen ziehen.
9.7.3 ELISA auf dsDNA
Autoantikörper gegen Doppelstrang DNA können mit einem ELISA gemessen werden. 96 Well
Maxisorp-Platten wurden pro Well mit 50 µl 0,01 % w/v poly-L-Lysin in H2O 2 h bei
Raumtemperatur vorbeschichtet. Die Platten wurden 3x mit H2O gewaschen und die Flüssigkeit
wurde durch Klopfen möglichst komplett entfernt. Die Platten wurden pro Well mit 100 µl
20ug/ml dsDNA (aus Kalbsthymus) in H2O oder TE-Puffer über Nacht bei 4 °C beschichtet. Die
Platten wurden 3x mit PBS gewaschen. Blockiert wurde für 1 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4
°C mit 2 % BSA in PBS. Die Platten wurden 3x mit 100µl PBS 0,05% Tween gewaschen und mit
50 µl Serumverdünnung inkubiert. Die Seren wurden 1:25 in Verdünnungspuffer vorverdünnt und
dann 7x seriell 1:3 verdünnt. Als relativer Standard dienten Seren aus alten MLR-lpr Mäusen, die
1:150 vorverdünnt und dann ebenfalls seriell verdünnt wurden. Die Platten wurden über Nacht bei
161
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Methoden
4°C inkubiert. Die weiteren Schritte erfolgten wie in 9.7.1 beschrieben. Als Sekundärer
Antikörper wurde ein Ziege-anti-Maus IgG Antikörper verwendet.
9.7.4 ELISA auf Antikörper Subklassen
Um die Menge an Antikörpern unterschiedlicher Subklassen zu bestimmen, die verschieden
stimulierte B-Zellen in vitro sekretieren wurden die Antikörperlevel im Überstand mit einem
ELISA bestimmt. 96 Well Maxisorp-Platten wurden pro Well mit 50 µl PBS und 1 µg/ml eines
anti-IgM, IgG1 und IgG3 über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer beschichtet. Die
weiteren Schritte erfolgten wie in 9.7.1 beschrieben. Als Sekundärer Antikörper wurde jeweils ein
Antikörper gegen dieselbe Subklasse verwendet, gegen die der Antikörper zum beschichten
gerichtet war.
9.8 ELISPOT
Ein ELISPOT wird genutzt, um die Zahl der Antikörper-produzierenden Zellen in einer
Population zu bestimmen.
Protokoll 1:
Für diesen Versuch muss steril gearbeitet werden. 96 Well Maxisorp-Platten wurden pro Well mit
50 µl ELISA Kopplungspuffer und 0,5 µg/ml gB aus humanem hCMV über Nacht bei 4 °C in
einer feuchten Kammer beschichtet. Die Platten wurden 3x mit PBS gewaschen und mit 180
µl/well 5 % FCS, 0,05 % Tween20 in PBS über Nacht bei 4 °C blockiert. Die Platten wurden 1x
mit PBS, 1x mit PBS 0,05 % Tween20 und dann erneut 2x mit PBS gewaschen. 20 mio/ml
Milzzellen oder 10 mio/ml Knochenmarkszellen in RPMI5+ wurden seriell 1:3 verdünnt. Es
wurde eine Verdünnungsreihe mit 7 Verdünnungsschritten angefertigt. 150 µl Zellsuspension
wurden pro Well in die Platten übertragen, die dann möglichst erschütterungsfrei in den
Brutschrank (37 °C 5 % CO2) gestellt wurden. Es folgte ein Inkubationsschritt bei 37 °C über
Nacht. Ab diesem Schritt muss nicht mehr steril gearbeitet werden. Die Platten wurden 3x mit
PBS und 1x mit PBS 0,05 % Tween20 gewaschen. PBS mit 1% Gelatine und 1% Tween wurde
aufgekocht. Dabei wird die Lösung durch das Tween20 trüb. Als die Lösung handwarm und
wieder klar war, wurde 1µg/ml an alkalische Phosphatase gekoppelter anti-IgG oder anti-IgG1
Antikörper zugegeben. Davon wurden 50 µl in jedes Well pipettieren und möglichst
erschütterungsfrei 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden 3x mit PBS gewaschen. Dann
wurden die Wells für 30 min mit PBS 0,05 % Tween20 inkubiert. Der Überstand wurde
verworfen und es wurden 50 µl/Well ELISPOT Substratpuffer zugegeben (2 h bei 37 °C). Die
Platten wurden 3x mit H2O gewaschen. Bei hohem Hintergrund kann man öfter waschen. Ein
blauer Punkt steht für eine gB-spezifische Antikörper-sekretierende Zelle. Die Punkte wurden mit
dem Auge ohne weitere Vergrößerung oder unter dem Durchlichtmikroskop ausgezählt.
162
ELISPOT
Methoden
Protokoll 2:
Rechteckige 25 Well Zellkulturplatten wurden mit 1 ml/Well 1 µg/ml gB bzw. 1 µg/ml
virusartigen Partikeln des humanen Cytomegalovirus (VLPs) in Kopplungspuffer 2-4 h bei 37 °C
oder über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit 5 % FCS in PBS für 2 h bei 37 °C
oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden 3x mit 1ml/Well PBS gewaschen. Es
wurden pro Maus ein Mal 1x106 und ein Mal 2 x105 Milz- oder Knochenmarkszellen pro Well
pipettiert und möglichst erschütterungsfrei in den Brutschrank (37 °C 5 % CO2) gestellt. Es folgte
ein Inkubationsschritt bei 37 °C über Nacht. Ab diesem Schritt muss nicht mehr steril gearbeitet
werden. Die Platten wurden 3x mit mit PBS 0,05 % Tween20 und 1x mit PBS gewaschen und
möglichst trocken geklopft. Anschließend wurden die Platten für 3 h mit alkalischer Phosphatase
gekoppelten sekundären Antikörpern gegen Maus-IgM, IgG bei 37 °C inkubiert (1 µg/ml in PBS).
Die Platten wurden 3x mit mit PBS 0,05 % Tween20 und 1x mit PBS gewaschen und möglichst
trocken geklopft. Es wurden 5 Teile vorgewärmter ELISPOT Substratpuffer mit einem Teil frisch
aufgekochter Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt (Low melting agarose) gemischt.
Davon wurden 1 ml/Well pipettiert. Dies geschah möglichst Erschütterungsfrei und wenn möglich
bei einer Umgebungstemperatur von 4 °C, damit die Agarose schnell abkühlt und man distinkte
Punkte bekommt. Dieses Protokoll hat gegenüber Protokoll 1 den Nachteil, dass die Zeit in der
die Agarose abkühlt reicht, damit sich das umgesetzte Substrat verteilt und einen hohen
Hintergrund erzeugt, den man nicht weg waschen kann.
9.9 Immun-Histologie
9.9.1 Einbetten von Organen
Organe wurden entnommen, von Fettresten befreit und gegebenenfalls mit einem Skalpell
zerschnitten und aufgeteilt. Dabei sollen die Organe möglichst wenig beschädigt werden, um ihre
Struktur zu erhalten. Dann wurden die Organe in ein zur Hälfte mit TissueTek® gefülltes
Organschälchen (Cryomold Intermediate 15mm x 15mm x 5mm; Bestellnummer 4566) gelegt,
das darauf komplett mit TissueTek® aufgefüllt wurde. Das von TissueTek® umgebene Organ
wurde auf Trockeneis gelegt, bis es komplett durchgefroren war (10-15 min). Dabei verfärbt sich
das durchsichtige TissueTek® weißlich. Die Organe können bei -80 °C gelagert werden.
9.9.2 Erstellen von Kryoschnitten
Aus in TissueTek® eingefrorenen Organen wurden mit einem Kryotom (Cryostat AG
Brandtstätter, Tierphysiologie) 8 µm dicke Organschnitte der Milz hergestellt. Dazu wurde die
Temperatur der Objektkammer auf -21 °C gestellt und die des Objekttisches auf -17 °C. Die
Schnitte wurden auf Objektträger überführt und bei RT ca. 15 min getrocknet, bevor sie unter
dem Abzug mit Aceton überschichtet wurden. Nachdem das Aceton verdampft war wurden die
163
Immun-Histologie
Methoden
Schnitte für die spätere Färbung mit einem Roti®-Liquid Barrier Marker umrandet. Die Schnitte
können bis zur Färbung bei -20 °C gelagert oder direkt gefärbt werden.
9.9.3 Immunhistologische Färbung
Gefrierschnitte der Milz wurden 15 min bei RT an die Temperatur angeglichen. Dann wurden sie
für 5 min mit PBS rehydriert. Dazu pipettiert man vorsichtig so viel Flüssigkeit auf den Schnitt,
dass er bedeckt ist, die Roti®-Liquid Barrier aber nicht durchbrochen wird Man lässt das PBS
ablaufen. Anschließend wurden die Proben für 30 min bei RT mit 20 % Pferdeserum, 20 % FCS
und 1:100 2.4G2 Antikörper in PBS blockiert. Man lässt die Blockierlösung ablaufen. Ab diesem
Schritt wurden die Proben möglichst wenig Licht ausgesetzt. Es folgte ein 30 min Färbeschritt bei
RT in PBS mit 2 % FCS, 0,05 % Tween20 und je nach Färbung verschiedenen
Antikörperkombinationen. Man lässt die Färbelösung ablaufen und taucht den Objektträger 1x in
eine Wanne mit PBS. Optional erfolgte eine sekundäre Färbung analog zum ersten Färbeschritt.
Anschließend wurden die Proben 2x für 5 min mit 0,05 % Tween20 in PBS inkubiert und
anschließend für 5 min mit PBS. Man lässt die Flüssigkeit ablaufen und entfernt die
Restflüssigkeit mit einem Tuch. Es wurden75 µl Mowiol auf ein Deckglas mit der Größe des
Objektträgers geben und der Objektträger damit eingedeckelt. Das Mowiol härtete über Nacht bei
RT aus. Am nächsten Tag konnten Aufnahmen der Proben unter dem Fluoreszenzmikroskop
gemacht werden, die mit ImageJ weiter ausgewertet wurden. Die einzeln aufgenommenen Kanäle
wurden zusammengefügt und die Farbbalance angepasst. Dabei wurden alle Bilder gleich
behandelt, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
Färbungen:
Keimzentren:
-
anti-IgD- bio
1:400
-
PNA- FITC
1:400
- sekundär gefärbt mit: Streptavidin-Cy3 1:100
B-Zell Subpopulationen / IgM Plasmazellen:
-
anti-IgD- bio
1:400
-
anti-IgM- FITC
1:50
- sekundär gefärbt mit: Streptavidin-Cy3 1:100
IgG Plasmazellen
-
anti-IgD- bio
1:400
-
anti-IgG- Alexa488
1:200
- sekundär gefärbt mit: Streptavidin-Cy3 1:100
164
Immun-Histologie
Methoden
9.10 Proteinbiochemische Methoden
9.10.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Bei der eindimensionalen diskontinuierlichen SDS-Gelelektrophorese erfolgt die Auftrennung
von Proteinen nach ihrer molekularen Masse in einem elektrischen Feld. Ein Polyacrylamid-Gel
besteht meist aus einem Sammel- und einem Trenngel. In einer Gießvorrichtung wurde zuerst das
Trenngel gegossen und mit Isopropanol überschichtet. War das Trenngel polymerisiert wurde das
Isopropanol entfernt und das Sammelgel als zweite Schicht auf das Trenngel geschichtet. In das
Trenngel wurde ein Kamm für die Taschen eingebracht. Ist das Gel polymerisiert kann es in
einem feuchten Tuch bei 4 °C gelagert werden. Das Gel wird für die Elektrophorese in eine
Kammer mit Elektrophoresepuffer überführt und der Kamm entfernt. Jetzt kann es mit Proben
beladen und an die Stromversorgung angeschlossen werden. Eine definierte Zahl B- oder TLymphozyten wurden in Brij-Lysepuffer aufgenommen und für 30 min auf Eis lysiert (Richtwert:
25000/µl Lysepuffer). Dann wurden die Proben bei 13000 rpm für 5 min und 4 °C abzentrifugiert,
um Zelltrümmer zu pelletieren. Der Überstand wurde in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß
überführt. An dieser Stelle können die Proben optional bei -80 °C weggefroren werden. Es
wurden drei Teile Lysat mit einem Teil denaturierendem 4x Roti®-Load gemischt und für 5 min
auf 96 °C erhitzt. Dann wurden die Proben kurz anzentrifugiert und auf ein Polyacrylamid-Gel
aufgetragen. Als Referenz diente ein definierter Proteinstandard (PageRulerTM Prestained Protein
Ladder Plus). Solange die Proben das Sammelgel durchliefen wurde eine Spannung von 80 V
angelegt, im Trenngel waren es 130 V. Je nach gewünschtem Auftrennungsgrad kann man die
Porengröße des Gels durch seine Prozentigkeit variieren.
Trenngel (10 %):
Bisacrylamid Lösung
Sammelgel (3 %):
33,3 % (v/v)
13 % (v/v)
375 mM Tris pH 8,8
125mM Tris pH
0,1 % (v/v)
0,1 % (v/v)
Tetramethylethylendiamin (TEMED)
0,001 % (v/v)
0, 002% (v/v)
Ammoniumpersulfat (APS) Lösung
0,5 %
0, 5% (v/v)
(Mischung Acrylamid - Bisacrylamid 29:1)
Tris
6,8
SDS
in entionisiertem Wasser
9.10.2 Western Blot und Signaldetektion über Röntgenfilm
165
Proteinbiochemische Methoden
Methoden
Nach erfolgreicher SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden die Proteine aus dem Gel auf
eine Nitrozellulosemembran übertragen. Dazu wurde Mighty SmallTE Tank Transfer System
benutzt. Hierbei handelt es sich um ein Wet-Blot-Verfahren. Der Transfer der Proteine erfolgte in
1x Transferpuffer bei 80 V für 1 h oder bei 40 V über Nacht bei 4 °C. Unspezifische Bindestellen
der Membran wurden mit 0,05 % Tween und 5 % Milchpulver in PBS entweder 1 h bei RT oder
über Nacht bei 4 °C unter Bewegung blockiert. Es folgten drei Waschschritte mit 0,1 % Tween in
PBS für je 7 min. Die Membran wurde in PBS mit 10 ml 5 % BSA, 0,1% (v/v) Tween20 und
Primärantikörper für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Es wurde drei Mal mit 0,1 %
Tween in PBS für je 7 min gewaschen. Die Membran wurde für 1 h bei RT mit 20 ml
Sekundärantikörper in PBS mit 0,1% (v/v) Tween20 inkubiert, der spezifisch den Fc-Teil
Primärantikörpers erkennt und Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert ist. Es wurde drei Mal mit
0,1 % Tween in PBS für je 7 min gewaschen. Zum Entwickeln wurden ECL Westernblotting
Detektionsreagenz 1 u. 2 (Amersham benutzt). Diese enthalten Luminol, das von HRP zu einem
3-Aminophthalat-Anion umgewandelt werden kann und Licht emittiert, wenn es in seinen
Grundzustand zurückkehrt. Detektionsreagenz 1 u. 2 wurden 1:1 gemischt und die Membran
wurde komplett benetzt. Und für 1 min inkubiert. Die Membran wurde blasenfrei zwischen zwei
Klarsichtfolien gelegt und in eine Filmkassette gelegt. In einer Dunkelkammer wurde ein
Röntgenfilm auf die Klarsichtfolie gelegt (Fuji RX) und durch die Chemilumineszenz belichtet.
Der Film wurde entwickelt, fixiert und fotografiert. Es können zwei Filme übereinander gelegt
werden, um eine höhere Chance zu haben einen der Filme mit der richtigen Lichtmenge zu
inkubieren. Alternativ für ECL Westernblotting Detektionsreagenz 1 kann 0,33 % H2O2 in Wasser
verwendet werden.
9.11 Untersuchung von T-Helferzellen
9.11.1 In vitro T-Zell Differenzierung
Durch die Stimulation naiver CD4+ T-Zellen mit verschiedenen Zytokinen in vitro kann das
Differenzierungspotential der Zellen in verschiedene induzierte T-Helferzellpopulationen
untersucht werden. Die Wells einer 96-Well Rundbodenplatte wurden mit je 50 µl Tris-Puffer pH
9,5 mit 1 µg/ml anti-CD3 Antikörper für 3 h bei 37 °C im Brutschrank gecoatet. Nach der
Inkubation wurden die gecoateten Wells 2x mit 100µl Zellpuffer gewaschen. Naive CD4+ TZellen wurden parallel zum caoten der Platten aufgereinigt (siehe 9.2.1.1). Es wurden 2 mio
Zellen/ml in RPMI10+ aufgenommen. Davon wurden je 50µl Zellsuspension in die gecoateten
und 2x gewaschenen Wells der 96 Well Platten pipettiert. Es wurde vermieden Wells am Rand zu
befüllen, um Randeffekt zu umgehen. Die Wells am Rand wurden mit je 100 µl RPMI10+ gefüllt.
Zu den Zellen wurden 50µl eines 2x konzentrierten Zytokinmixes gegeben, der ebenfalls in
RPMI10+ angesetzt wurde (siehe Tab. 14). Die Zellen wurden für 72h bei 37°C und 5% CO2
inkubiert. Anschließend wurden die ausgesäten Zellen 2x mit 80 µl/Well Zellpuffer in der Platte
166
Untersuchung von T-Helferzellen
Methoden
gewaschen. Die TH2-Zellen wurden in 50µl RPMI10+ mit 50 Units IL-2/Well resuspendiert, auf
eine neue nicht gecoatetet Platte übertragen und erneut für 48h bei 37°C und 5% CO2 im
Brutschrank inkubiert. Die übrigen Zellen wurden auf der alten Platte in 50µl RPMI10 + mit
1µg/ml Ionomycin und 20ng/ml PMA, sowie 1µg/ml Golgiplug (BD) resuspendiert und für 6h bei
37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die Differenzierung wurde durchflusszytometrisch
überprüft. Die TH2-Zellen wurden nach der erneuten Inkubation 2x mit 80 µl/Well Zellpuffer in
der Platte gewaschen, in 50µl RPMI10+ mit 1µg/ml Ionomycin und 20ng/ml PMA, sowie 1µg/ml
Golgiplug (BD) resuspendiert und für 6h bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die
Differenzierung wurde ebenfalls durchflusszytometrisch überprüft.
Tab. 14: Stimulationsansätze für die Differenzierung von TH1, TH2, T-reg und TH17 Zellen aus naiven
CD4+CD62L+ T-Zellen.
anti-CD3 (coated)
anti-CD28
anti-IFNγ
IL-12
IL-2
IL-4
IL-6
TGFβ
TH1
TH2
T-reg
TH17
1 µg/ml
1 µg/ml
1 µg/ml
1 µg/ml
1,3 µg/ml 1,3 µg/ml
1,3 µg/ml
1,3 µg/ml
5 µg/ml
5 µg/ml
5 µg/ml
4 ng/ml
50 U/ml
50 U/ml
50 U/ml
10 ng/ml
30 ng/ml
3 ng/ml
2 ng/ml
9.11.2 Intrazelluläre Färbung von Zytokinen
Alle intrazellulären Färbungen außer die Färbungen auf FoxP3 wurden mit dem BD
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit mit BD GolgiPlug von BD
durchgeführt. Damit sich die produzierten Proteine/Zytokine im Endoplasmatischen Retikulum
ansammeln wurden bis zu 2x106 Zellen in 1 μl/ml BD GolgiPlug in RPMI10+ resuspendiert und
für 6 h bis 12 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Dieser Schritt muss nur durchgeführt werden,
wenn vorher noch kein BD GolgiPlug zu den Zellen gegeben wurde. Die Zellen wurden in 5 ml
Röhrchen überführt und optional extrazellulär gefärbt wie in 9.1.4 beschrieben. An dieser Stelle
können die Proben mit 500µl 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min im Dunkeln bei RT fixiert
werden. Es folgt ein Waschschritt mit FACS-Puffer und die Zellen können in 1 ml FACS-Puffer
über Nacht gelagert werden. Alternativ werden die Zellen in 250μl Fixation/Permeabilization
Lösung resuspendieren und für 20 min. bei 4°C inkubiert. Als nächstes wurde 2x mit 0,5 ml BD
Perm/Wash Puffer (1x Verdünnung aus 10x Stock) gewaschen, bevor die Zellen in 50 μl/Well BD
Perm/Wash Puffer mit Färbeantikörpern resuspendieren und 30 min bei 4 °C inkubiert wurden.
Optional kann 2.4G2 Fc-Block zur Färbelösung gegeben werden, wenn er noch nicht bei der
extrazellulären Färbung verwendet wurde. Die Zellen wurden 2x mit 0,5 ml BD Perm/Wash
167
Untersuchung von T-Helferzellen
Methoden
buffer (1x Verdünnung aus 10x Stock) gewaschen und für die Durchflusszytometrie in 150 µl
FACS-Puffer aufgenommen.
Färbungen:
TH1- und TH17-Zellen:
extrazellulär:
o
anti-CD4- FITC (GK1.5)
1:200
o
anti-CD16/CD32 (2.4G2) Fc-Block
1:100
intrazellulär:
o
anti-IL17-PE (eBio17B7)
1:100
o
anti-IFNγ-APC (XMG1.2)
1:200
TH2-Zellen:
extrazellulär:
o
anti-CD4- FITC (GK1.5)
1:200
o
anti-CD16/CD32 (2.4G2) Fc-Block
1:100
intrazellulär:
o
IL-4-APC
1:100
9.11.3 Intrazelluläre FoxP3-Färbung
Für die Färbung auf FoxP3+ regulatorische T-Zellen wurde das α-Maus/Ratte Foxp3 staining set
APC von eBioscience verwendet. Alle Schritte sollen auf 4 °C durchgeführt werden. Damit sich
das produzierte FoxP3 im Endoplasmatischen Retikulum ansammelt wurden bis zu 2x106 Zellen
in 1 μl/ml BD GolgiPlug in RPMI10+ resuspendiert und für 6 h bis 12 h bei 37 °C und 5 % CO2
inkubiert. Dieser Schritt muss nur durchgeführt werden, wenn vorher noch kein BD GolgiPlug zu
den Zellen gegeben wurde. Die Zellen wurden in 5 ml Röhrchen überführt und optional
extrazellulär gefärbt wie in 9.1.4 beschrieben. Dann wurden die Zellen in 200 µL kaltem
eBioscience Fix/Perm Puffer aufgenommen und für 30 min bis 18 h inkubiert. Hier besteht die
Möglichkeit die Proben über Nacht zu lagern. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der
Überstand verworfen, bevor sie 2x mit 200µL 1x Permeabilization Puffer gewaschen wurden. Die
Zellen wurden in 50 μl/Well BD Perm/Wash Puffer mit Färbeantikörpern resuspendieren und 30
min bei 4 °C inkubiert. Optional kann 2.4G2 Fc-Block zur Färbelösung gegeben werden, wenn er
noch nicht bei der extrazellulären Färbung verwendet wurde. Zu den Proben wurden 150ul 1x
Permeabilization Puffer pipettiert. Dann wurden die Proben abzentrifugiert und der Überstand
168
Untersuchung von T-Helferzellen
Methoden
verworfen, bevor sie 2x mit 200µL 1x Permeabilization Puffer gewaschen wurden. Die Zellen
wurden für die Durchflusszytometrie in 150 µl FACS-Puffer aufgenommen.
Färbungen:
T-reg Zellen:
extrazellulär:
o
anti-CD4- FITC (GK1.5)
1:200
o
anti-CD25-PE (optional)
1:100
o
anti-CD16/CD32 (2.4G2) Fc-Block
1:100
intrazellulär:
o
anti-FoxP3-APC
1:200
9.11.4 Ex vivo T-Zell Analyse
Diese Analyse kann genutzt werden, um den Anteil der T-Helferzellpopulationen möglichst nahe
an der in vivo Situation zu untersuchen. CD4-Zellen aus der Milz wurden optional wie in 9.2.1.2
beschrieben aufgereinigt. Alternativ wurden Gesamtmilzzellen verwendet. Es wurden 2x106
Zellen/ml in 1 ml RPMI+ mit 1µg/ml Ionomycin, 20ng/ml PMA, sowie 1µg/ml Golgiplug (BD)
resuspendiert und für 6 h bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Dann wurden
intrazelluläre Färbungen durchgeführt, wie in 9.11.2 und 9.11.3 beschrieben.
9.11.5 Cytometric Bead Array (CBA) zur Bestimmung von sekretierten Zytokinen
Die Menge an Zytokinen in Überstanden kann mit einem „Cytometric Bead Array“ (CBA)
bestimmt werden. Es wurden Überstände von Milzzellen aus Mäusen mit experimenteller
autoimmuner Enzephalomyelitis verwendet, die mit verschiedenen Konzentrationen MOG für 72
h bei 37 °C und 5 % CO2 restimuliert wurden. Der Überstand kann bis zur Verwendung bei -20
°C gelagert werden. Für den CBA wurde das kommerzielle “BD Cytometric Bead Array (CBA)
Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit“ verwendet. Die untersuchten Überstände wurden wie in 9.4
beschrieben gewonnen. Die Menge der abgegebenen Zytokine im Überstand wurde
durchflusszytometrisch über Partikel bestimmt, an die Antikörper gegen je ein spezifisches
Zytokin gekoppelt waren. Ein gebundenes Zytokin kann über einen weiteren Antikörper gegen
dasselbe Zytokin nachgewiesen werden, der an ein Fluochrom gekoppelt ist. Partikel
verschiedener Größen können unterschieden und gleichzeitig gemessen werden (Cytometric Bead
Array BD). Mit dem Kit kann die Menge an IL-17A, IL-2, TNF, IL10, IFNγ, IL-6 und IL-4 im
Überstand anhand eines bekannten Zytokinstandards bestimmt werden. Für die Erstellung der
Standardkurve wurde eine logistische Funktion der dritten Ordnung verwendet, die mit Microsoft
Excel berechnet wurde.
169
Untersuchung von T-Helferzellen
Methoden
9.12 Immunisierungen und Mausversuche
9.12.1 Intravenöse (i.v.) Injektion
Die Mäuse wurden unter einer Rotlichtlampe erwärmt und dann in einem „Restrainer“
(Plastikröhre) fixiert. Vor der Injektion kann der Schwanz mit Alkohol abgesprüht werden.
Dadurch sind die Venen oft deutlicher zu erkennen. Außerdem kann das Blut im Schwanz gestaut
werden, damit die Venen deutlicher hervortreten. Es können abhängig von der Größe der Maus
bis zu 200 µl Flüssigkeit injiziert werden. Für die Injektion wurde eine 1 ml Spritze mit einer
dünnen Nadel (STERICAN 0.45X25 braun GR 18) verwendet.
9.12.2 NP-CGG / NP-KLG / CGG Immunisierung
Die Thymus abhängige Immunantwort bzw. Gedächtnisantwort sollte anhand einer NP-CGG
Immunisierung untersucht werden. Mäuse wurden intraperitoneal (i.p.) mit 50 µg NP27-CGG in
Alu-Gel-S immunisiert. Das Alu-Gel-S muss vor dem pipettieren gut gemischt werden. Es
wurden 1 µg/µl NP27-CGG in PBS mit Alu-Gel-S in einem 50 ml Reaktionsgefäß 1:1 vermischt
und 1 h im Dunkeln bei RT unter Rühren inkubiert. Das Gemisch wurde mit 5 ml PBS
gewaschen. Dann wurde das NP27-CGG/ Alu-Gel-S Gemisch so mit PBS versetzt, dass 50 µg
NP27-CGG in 200 µl Volumen vorhanden waren. Pro Maus wurden 200 µl i.p. injiziert. Zum
spritzen wurde eine 1 ml Spritze mit einer BD MICROLANCE 3 Kanuele (26 G 1/2 0,45x13 mm
REF 303800) verwendet. Die Mäuse wurden je nach Versuch zu unterschiedlichen Zeitpunkten
erneut nach demselben Protokoll mit 50 µg NP27-CGG geboostet. Memoryzellen, die in
Rezipienten-Mäuse übertragen wurden konnten mit 50 µg NP27-CGG in 100 µl PBS intravenös
(i.v.) reaktiviert werden. Die Gabe des Antigens intravenös ohne Alum soll eine schwächere
primäre Immunantwort in den Rezipienten auslösen, um die Memoryantwort besser untersuchen
zu können. Den Mäusen wurde zur Serumgewinnung zu verschiedenen Zeitpunkten Blut aus einer
Schwanzvene entnommen. Das Protokoll für die Injektion mit Alum kann auch genauso für NPKLH oder CGG allein angewendet werden. Dabei können 50 µg - 100 µg Antigen eingesetzt
werden.
9.12.3 Immunisierung mit Glykoprotein B und virusartigen Partikeln (VLPs) des humanen
Zytomegalieviruses
Die Immunisierungen wurden prinzipiell wie in 9.12.2 durchgeführt. Alum und PBS mit
verschiedenen Konzentrationen an Glykoprotein B oder virusartigen Partikeln wurden 1:1
gemischt, inkubiert und i.p. gespritzt. Die Reaktivierung von Memoryzellen erfolgte i.v. in PBS.
9.12.4 Immunisierung mit Schafserythrozyten zur Keimzentrumsanalyse
Eine Immunisierung von Mäusen mit Schafserythrozyten führt zu
einer
starken
Keimzentrumsreaktion. Es wurden Schafserythrozyten in Alseverlösung (steril von FiebigNährstofftechnik) 1:100 mit PBS vorverdünnt und dann zum zählen 1:10 in Trypanblau verdünnt.
Pro
Maus
wurden
1x109
Schafserythrozyten
gespritzt.
Die
170
Immunisierungen und Mausversuche
gewünschte
Zahl
an
Methoden
Schafserythrozyten wurde in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt und 20 min bei 2400 rpm
zentrifugiert.
Der
Überstand
wurde
verworfen.
Anschließend
wurden
pro
1x109
Schafserythrozyten 200 µl PBS zugegeben. Pro Maus wurden 200 µl intraperitoneal gespritzt.
Zum spritzen wurde eine 1 ml Spritze mit einer BD MICROLANCE 3 Kanuele (26 G 1/2 0,45x13
mm REF 303800) verwendet. Die Keimzentrumsreaktion wurde an Tag 10 histologisch und
durchflusszytometrisch untersucht.
9.12.5 NK-Zell Depletion
Um allogene Abstoßungsreaktionen von Zellen aus einem anderen gentischen Hintergrund in
Rezipientenmäusen gering zu halten konnten NK-Zellen durch die Injektion von 0,8 bis 1
mg/Maus anti-NK1.1 AK (BioXcell) ca. 48 h vor dem adoptiven Zelltransfer depletiert werden.
9.12.6 Adoptiver Zelltransfer
Protokoll 1:
Für die Untersuchung von Memory B-Zell Antworten wurden Memoryzellen/B-Zellen in
Rezipientenmäuse
übertragen.
Milzzellen
aus
immunisierten
Mäusen
wurden
in
Einzelzellsuspension gebracht. T-Zellen wurden komplementvermittelt lysiert (siehe 9.2.1.3) und
dann positiv über magnetische Seperation für CD19+ Zellen angereichert (siehe 9.2.1.4). Der
Anteil der Memoryzellen an den aufgereinigten Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt
(Abb. 18, Abb. 26). Dazu wurde ein Teil der Zellen mit ihrem Antigen, dass an einen
Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt war in Kombination mit weiteren Markern gefärbt. Die
Memoryzellzahl für die übrigen Zellen konnte berechnet werden und es wurden gleich viele
Memoryzellen in jedes Tier aus den zu vergleichenden Gruppen übertragen. Nach 5 bis 7 Tagen,
wenn die Memoryzellen ihre Nischen gefunden haben wurden sie reaktiviert.
Protokoll 2:
Alternativ wurden Memoryzellen direkt durchflusszytometrisch mit dem MoFlow Zellsortiergerät
sortiert. Dieses Protokoll hat den Nachteil, dass die Memoryzellen durch die direkte Färbung mit
dem Antigen aktiviert werden können.
Für NP-spezifische Memoryzellen: Milzzellen wurden in Einzelzellsuspension gebracht und mit
Färbelösung, die anti-IgG1-, anti-IgG2a-, anti-IgG2b-FITC je 1:100 und B220-PE 1:400 (Klon:
RA3-6B2 eBioscience), sowie Fc-Block 1:100 enthielt gefärbt (Abb. 27). In einem ersten
Sortierschritt, der auf Geschwindigkeit und weniger auf Reinheit optimiert war wurden
B220+IgG1/IgG2a/IgG2b+ Zellen angereichert. Diese wurden in einem weiteren Färbeschritt mit
gB-Cy5 inkubiert. Bei der Färbung wurde mit 1500 rpm für 10 min zentrifugiert um möglichst
wenige Zellen zu verlieren. Es folgte ein zweiter Sortierschritt, der weniger auf Geschwindigkeit
als auf Reinheit ausgelegt war. In diesem wurden die B220+IgG1/IgG2a/IgG2b+gB bindende
171
Immunisierungen und Mausversuche
Methoden
Zellen in ein Röhrchen mit Rag1-/- Füllerzellen sortiert. Es wurden gleich viele Memoryzellen in
jedes Tier aus den zu vergleichenden Gruppen übertragen. Nach 5 bis 7 Tagen, wenn die
Memoryzellen ihre Nischen gefunden haben wurden sie reaktiviert.
Für Glykoprotein B spezifische Memoryzellen: Milzzellen wurden in Einzelzellsuspension
gebracht und positiv über magnetische Seperation für CD19+ Zellen angereichert (siehe 9.2.1.4).
Anschließend wurden die Zellen mit anti-IgG1-, anti-IgG2a-, anti-IgG2b-FITC je 1:100, B220PE-Cy5.5 1:400, NIP-PE 1:800 und NIP-APC 1:1600 gefärbt (Abb. 19). In einem ersten
Sortierschritt, der auf Geschwindigkeit und weniger auf Reinheit optimiert war wurden
B220+IgG1+/IgG2a+/IgG2b+ Zellen angereichert. Es folgte ein zweiter Sortierschritt, der weniger
auf
Geschwindigkeit
als
auf
Reinheit
ausgelegt
war.
In
diesem
wurden
die
B220+IgG1/IgG2a/IgG2b+NIP+ Zellen in ein Röhrchen mit wt-Milz-Füllerzellen sortiert. Es
wurden gleich viele Memoryzellen in jedes Tier aus den zu vergleichenden Gruppen übertragen.
Nach 5 bis 7 Tagen, wenn die Memoryzellen ihre Nischen gefunden haben wurden sie reaktiviert.
9.12.7 Serumgewinnung
Die Mäuse wurden unter einer Rotlichtlampe erwärmt. Dann wurde eine seitliche Schwanzvene
leicht mit einem Skalpell angeritzt und austretendes Blut mit einem BD Microtainer® Röhrchen
mit FloTop Collector oder einem 1,5 ml Reaktionsgefäß aufgefangen. Das Blut wurde im Fall von
1,5 ml Reaktionsgefäßen 1 h bei 37°C inkubiert und dann 10min bei 13000 rpm abzentrifugiert.
Die obere Srum-Phase wurde abgenommen, in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und
gegebenenfalls bei -20 °C gelagert. Bei Microtainer® Röhrchen wurde das Blut für 30 min bei RT
inkubiert und dann 5 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Die Röhrchen können bei -20 °C
gelagert werden.
9.12.8 Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE)
Die Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Mausmodell für die Multiple
Sklerose im Menschen. 50 µg Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35-55 in 50 µl
H2O wurden mit 50 µl komplettem Freunds-Adjuvans (CFA) mit 10 µg/ml Mycobacterium
Tubercolosis (H37Ra; Difco/BD Bioscience) gemischt. Die Mäuse wurden subkutan (s.c.) mit 100
µl des Gemisches im Bereich des vorderen Rückens immunisiert. Zusätzlich wurden 200 µl
Pertussis Toxin (List/Quadratech) i.p. an Tag 0 und 2 gespritzt, um die Blut-Hirn-Schranke
durchlässig zu machen. Dieses EAE-Protokoll löst eine chronische EAE aus (Rangachari &
Kuchroo 2013). Der Verlauf der EAE wurde anhand eines klinischen Bewertungssystemes
verfolgt.
172
Immunisierungen und Mausversuche
Methoden
9.12.9 Arbeit mit Versuchstieren und verwendete Mausstämme
Die Mäuse wurden unter pathogenarmen Bedingungen im Biotechnologisches Entwicklungslabor
(BTE) gezüchtet und gehalten. Bei den Versuchen wurde das deutsche Tierschutzgesetz
eingehalten. Es wurden mindestens 6 Wochen alte Tiere verwendet.
Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse – Die Grb2fl/fl Tiere wurden von Dr. Jochen Ackermann generiert
(Ackermann et al. 2011) und mit mb1cre/+ Mäusen (Hobeika et al. 2006) verpaart. Die Tiere
wurden im Rahmen dieser Arbeit für 10 Generationen auf C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzt.
Die ersten Schritte der Rückkreuzung wurden von Jochen Ackermann überwacht. Die meisten
Versuche wurden aber mit Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen im ursprünglichen, gemischten BALB/c /
C57BL/6 Hintergrund durchgeführt, die nicht zu C57BL/6 zurückgekreuzt waren.
Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg - Diese Tiere wurden im Rahmen der Arbeit durch die Kreuzung von Bcl2tg
Mäusen (Strasser et al. 1991) im C57BL/6 Hintergrund (von Prof. Dr. Andre Gessner zur
Verfügung gestellt) und Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen mit gemischten BALB/c / C57BL/6 Hintergrund
generiert.
Grb2fl/fl cγ1cre/+ Mäuse - Diese Tiere wurden im Rahmen der Arbeit durch die Kreuzung von
cγ1cre/+ Mäusen (wir danken Prof. Dr. Stefano Casola für die Erlaubnis die Mäuse zu nutzen und
Prof. Dr. David Vöhringer für die Bereitstellung) im C57BL/6 Hintergrund (Casola et al. 2006)
mit Grb2fl/fl Mäusen generiert, die 10 Generationen auf C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzt
waren.
Grb2fl/fl Lckcretg Mäuse - Diese Tiere wurden im Rahmen meiner Masterarbeit durch die
Kreuzung von Lckcretg Mäusen (Takahama et al. 1998) im C57BL/6 Hintergrund (von Dr. Andre
Gessner zur Verfügung gestellt) mit Grb2fl/fl Mäusen im gemischten BALB/c / C57BL/6
Hintergrund generiert.
Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse - Diese Tiere wurden im Rahmen der Arbeit durch die Kreuzung von
CD4cretg Mäusen (Sawada et al. 1994) im C57BL/6 Hintergrund (von Prof. Dr. David Vöhringer
zur Verfügung gestellt) mit Grb2fl/fl Mäusen generiert, die 10 Generationen auf C57BL/6
Hintergrund zurückgekreuzt waren.
173
Immunisierungen und Mausversuche
Literaturverzeichnis
10 Literaturverzeichnis
Ackermann, J.A., Radtke, D., Maurberger, A., Winkler, T.H., & Nitschke, L., 2011. Grb2
regulates B-cell maturation, B-cell memory responses and inhibits B-cell Ca2+ signalling.
EMBO J., 30, 1621–33.
Adolfsson, J., Borge, O.J., Bryder, D., Theilgaard-Mönch, K., Astrand-Grundström, I., Sitnicka,
E., Sasaki, Y., & Jacobsen, S.E., 2001. Upregulation of Flt3 expression within the bone
marrow Lin(-)Sca1(+)c-kit(+) stem cell compartment is accompanied by loss of self-renewal
capacity. Immunity, 15, 659–69.
Alberola-Ila, J., Forbush, K.A., Seger, R., Krebs, E.G., & Perlmutter, R.M., 1995. Selective
requirement for MAP kinase activation in thymocyte differentiation. Nature, 373, 620–3.
Alberola-Ila, J., Hogquist, K.A., Swan, K.A., Bevan, M.J., & Perlmutter, R.M., 1996. Positive and
negative selection invoke distinct signaling pathways. J. Exp. Med., 184, 9–18.
Allman, D., Lindsley, R.C., DeMuth, W., Rudd, K., Shinton, S. a, & Hardy, R.R., 2001.
Resolution of three nonproliferative immature splenic B cell subsets reveals multiple
selection points during peripheral B cell maturation. J. Immunol., 167, 6834–40.
Anderson, G., Hare, K.J., & Jenkinson, E.J., 1999. Positive selection of thymocytes: the long and
winding road. Immunol. Today, 20, 463–8.
Anderson, J.S., Teutsch, M., Dong, Z., & Wortis, H.H., 1996. An essential role for Bruton’s
[corrected] tyrosine kinase in the regulation of B-cell apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A., 93, 10966–71.
Anderson, S.M., Tomayko, M.M., Ahuja, A., Haberman, A.M., & Shlomchik, M.J., 2007. New
markers for murine memory B cells that define mutated and unmutated subsets. J. Exp.
Med., 204, 2103–14.
Andrews, S.F., Dai, X., Ryu, B.Y., Gulick, T., Ramachandran, B., & Rawlings, D.J., 2012.
Developmentally regulated expression of MEF2C limits the response to BCR engagement in
transitional B cells. Eur. J. Immunol., 42, 1327–36.
Andrews, S.F. & Rawlings, D.J., 2009. Transitional B cells exhibit a B cell receptor-specific
nuclear defect in gene transcription. J. Immunol., 182, 2868–78.
Apel, M. & Berek, C., 1990. Somatic mutations in antibodies expressed by germinal centre B
cells early after primary immunization. Int. Immunol., 2, 813–819.
Archbold, J.K., Macdonald, W. a, Burrows, S.R., Rossjohn, J., & McCluskey, J., 2008. T-cell
allorecognition: a case of mistaken identity or déjà vu? Trends Immunol., 29, 220–6.
Asada, H., Ishii, N., Sasaki, Y., Endo, K., Kasai, H., Tanaka, N., Takeshita, T., Tsuchiya, S.,
Konno, T., & Sugamura, K., 1999. Grf40, A novel Grb2 family member, is involved in T
cell signaling through interaction with SLP-76 and LAT. J. Exp. Med., 189, 1383–90.
Astoul, E., Watton, S., & Cantrell, D., 1999. The dynamics of protein kinase B regulation during
B cell antigen receptor engagement. J. Cell Biol., 145, 1511–1520.
174
Literaturverzeichnis
Azzam, H.S., Grinberg, A., Lui, K., Shen, H., Shores, E.W., & Love, P.E., 1998. CD5 expression
is developmentally regulated by T cell receptor (TCR) signals and TCR avidity. J. Exp.
Med., 188, 2301–11.
Balciunaite, G., Ceredig, R., & Rolink, A.G., 2005. The earliest subpopulation of mouse
thymocytes contains potent T, significant macrophage, and natural killer cell but no Blymphocyte potential. Blood, 105, 1930–6.
Barboza, L., Salmen, S., Teran-Angel, G., Peterson, D.L., & Berrueta, L., 2013. A deficient
translocation of CD3ζ, ZAP-70 and Grb2 to lipid raft, as a hallmark of defective adaptive
immune response during chronic hepatitis B infection. Cell. Immunol., 284, 9–19.
Batoulis, H., Addicks, K., & Kuerten, S., 2010. Emerging concepts in autoimmune
encephalomyelitis beyond the CD4/T(H)1 paradigm. Ann. Anat., 192, 179–93.
Batten, M., Groom, J., Cachero, T.G., Qian, F., Schneider, P., Tschopp, J., Browning, J.L., &
Mackay, F., 2000. BAFF mediates survival of peripheral immature B lymphocytes. J. Exp.
Med., 192, 1453–66.
Baumgarth, N., 2011. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector
functions. Nat. Rev. Immunol., 11, 34–46.
Bell, J.J. & Bhandoola, A., 2008. The earliest thymic progenitors for T cells possess myeloid
lineage potential. Nature, 452, 764–7.
Bendelac, A., Matzinger, P., Seder, R.A., Paul, W.E., & Schwartz, R.H., 1992. Activation events
during thymic selection. J. Exp. Med., 175, 731–42.
Berger, T., Weerth, S., Kojima, K., Linington, C., Wekerle, H., & Lassmann, H., 1997.
Experimental autoimmune encephalomyelitis: the antigen specificity of T lymphocytes
determines the topography of lesions in the central and peripheral nervous system. Lab.
Invest., 76, 355–64.
Berland, R. & Wortis, H.H., 2002. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of
CD5. Annu. Rev. Immunol., 20, 253–300.
Bettelli, E., Carrier, Y., Gao, W., Korn, T., Strom, T.B., Oukka, M., Weiner, H.L., & Kuchroo,
V.K., 2006. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector
TH17 and regulatory T cells. Nature, 441, 235–8.
Bettelli, E., Pagany, M., Weiner, H.L., Linington, C., Sobel, R. a, & Kuchroo, V.K., 2003. Myelin
oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous
autoimmune optic neuritis. J. Exp. Med., 197, 1073–81.
Bhattacharya, D., Cheah, M.T., Franco, C.B., Hosen, N., Pin, C.L., Sha, W.C., & Weissman, I.L.,
2007. Transcriptional Profiling of Antigen-Dependent Murine B Cell Differentiation and
Memory Formation. J. Immunol., 179, 6808–6819.
Black, D.A., 1973. The measurement of renal function. Am. Heart J., 85, 147–52.
Von Boehmer, H., 2005. Unique features of the pre-T-cell receptor alpha-chain: not just a
surrogate. Nat. Rev. Immunol., 5, 571–7.
175
Literaturverzeichnis
Bolland, S. & Ravetch, J. V, 2000. Spontaneous autoimmune disease in Fc(gamma)RIIB-deficient
mice results from strain-specific epistasis. Immunity, 13, 277–85.
Born, W.K., Zhang, L., Nakayama, M., Jin, N., Chain, J.L., Huang, Y., Aydintug, M.K., &
O’Brien, R.L., 2011. Peptide antigens for gamma/delta T cells. Cell. Mol. Life Sci., 68,
2335–43.
Bourette, R.P., Arnaud, S., Myles, G.M., Blanchet, J.P., Rohrschneider, L.R., & Mouchiroud, G.,
1998. Mona, a novel hematopoietic-specific adaptor interacting with the macrophage
colony-stimulating factor receptor, is implicated in monocyte/macrophage development.
EMBO J., 17, 7273–81.
Brabb, T., von Dassow, P., Ordonez, N., Schnabel, B., Duke, B., & Goverman, J., 2000. In situ
tolerance within the central nervous system as a mechanism for preventing autoimmunity. J.
Exp. Med., 192, 871–80.
Breitfeld, D., Ohl, L., Kremmer, E., Ellwart, J., Sallusto, F., Lipp, M., & Förster, R., 2000.
Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles,
and support immunoglobulin production. J. Exp. Med., 192, 1545–52.
Brooks, S.R., Li, X., Volanakis, E.J., & Carter, R.H., 2000. Systematic analysis of the role of
CD19 cytoplasmic tyrosines in enhancement of activation in Daudi human B cells:
clustering of phospholipase C and Vav and of Grb2 and Sos with different CD19 tyrosines.
J. Immunol., 164, 3123–31.
Brüstle, A., Heink, S., Huber, M., Rosenplänter, C., Stadelmann, C., Yu, P., Arpaia, E., Mak,
T.W., Kamradt, T., & Lohoff, M., 2007. The development of inflammatory T(H)-17 cells
requires interferon-regulatory factor 4. Nat. Immunol., 8, 958–66.
Brunner, C., Marinkovic, D., Klein, J., Samardzic, T., Nitschke, L., & Wirth, T., 2003. B cellspecific transgenic expression of Bcl2 rescues early B lymphopoiesis but not B cell
responses in BOB.1/OBF.1-deficient mice. J. Exp. Med., 197, 1205–11.
Burstein, H.J., Tepper, R.I., Leder, P., & Abbas, A.K., 1991. Humoral immune functions in IL-4
transgenic mice. J. Immunol., 147, 2950–6.
Busslinger, M., 2004. Transcriptional control of early B cell development. Annu. Rev. Immunol.,
22, 55–79.
Calamito, M., Juntilla, M.M., Thomas, M., Northrup, D.L., Rathmell, J., Birnbaum, M.J.,
Koretzky, G., & Allman, D., 2010. Akt1 and Akt2 promote peripheral B-cell maturation and
survival. Blood, 115, 4043–50.
Capone, M., Hockett, R.D., & Zlotnik, A., 1998. Kinetics of T cell receptor beta, gamma, and
delta rearrangements during adult thymic development: T cell receptor rearrangements are
present in CD44(+)CD25(+) Pro-T thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95, 12522–7.
Carman, J.A., Wechsler-Reya, R.J., & Monroe, J.G., 1996. Immature stage B cells enter but do
not progress beyond the early G1 phase of the cell cycle in response to antigen receptor
signaling. J. Immunol., 156, 4562–9.
Casola, S., Cattoretti, G., Uyttersprot, N., Koralov, S.B., Seagal, J., Segal, J., Hao, Z., Waisman,
A., Egert, A., Ghitza, D., & Rajewsky, K., 2006. Tracking germinal center B cells
176
Literaturverzeichnis
expressing germ-line immunoglobulin gamma1 transcripts by conditional gene targeting.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 103, 7396–401.
Chan, V.W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, a L., & Lowell, C. a, 1997. Characterization of the
B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and
down-regulation. Immunity, 7, 69–81.
Chen, C., Edelstein, L.C., & Gélinas, C., 2000. The Rel/NF-kappaB family directly activates
expression of the apoptosis inhibitor Bcl-x(L). Mol. Cell. Biol., 20, 2687–95.
Chen, Q., Yang, W., Gupta, S., Biswas, P., Smith, P., Bhagat, G., & Pernis, A.B., 2008. IRF-4binding protein inhibits interleukin-17 and interleukin-21 production by controlling the
activity of IRF-4 transcription factor. Immunity, 29, 899–911.
Cheng, A.M., Rowley, B., Pao, W., Hayday, A., Bolen, J.B., & Pawson, T., 1995. Syk tyrosine
kinase required for mouse viability and B-cell development. Nature, 378, 303–6.
Cheng, A.M., Saxton, T.M., Sakai, R., Kulkarni, S., Mbamalu, G., Vogel, W., Tortorice, C.G.,
Cardiff, R.D., Cross, J.C., Muller, W.J., & Pawson, T., 1998. Mammalian Grb2 regulates
multiple steps in embryonic development and malignant transformation. Cell, 95, 793–803.
Chiles, T.C., 2004. Regulation and function of cyclin D2 in B lymphocyte subsets. J. Immunol.,
173, 2901–7.
Christensen, J.L. & Weissman, I.L., 2001. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell
differentiation: a simple method to isolate long-term stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A., 98, 14541–6.
Ciofani, M., Knowles, G.C., Wiest, D.L., von Boehmer, H., & Zúñiga-Pflücker, J.C., 2006. Stagespecific and differential notch dependency at the alphabeta and gammadelta T lineage
bifurcation. Immunity, 25, 105–16.
Ciofani, M. & Zúñiga-Pflücker, J.C., 2005. Notch promotes survival of pre-T cells at the betaselection checkpoint by regulating cellular metabolism. Nat. Immunol., 6, 881–8.
Ciofani, M. & Zúñiga-Pflücker, J.C., 2007. The thymus as an inductive site for T lymphopoiesis.
Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 23, 463–93.
Crotty, S., 2011. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu. Rev. Immunol., 29, 621–63.
D’Orsogna, L.J., Nguyen, T.H.O., Claas, F.H.J., Witt, C., & Mifsud, N. a, 2013. Endogenouspeptide-dependent alloreactivity: new scientific insights and clinical implications. Tissue
Antigens, 81, 399–407.
D’Orsogna, L.J., Roelen, D.L., Doxiadis, I.I.N., & Claas, F.H.J., 2012. TCR cross-reactivity and
allorecognition: new insights into the immunogenetics of allorecognition. Immunogenetics,
64, 77–85.
Daëron, M., Jaeger, S., Du Pasquier, L., & Vivier, E., 2008. Immunoreceptor tyrosine-based
inhibition motifs: a quest in the past and future. Immunol. Rev., 224, 11–43.
Dell, C.L., Lu, Y.X., & Claflin, J.L., 1989. Molecular analysis of clonal stability and longevity in
B cell memory. J. Immunol., 143, 3364–70.
177
Literaturverzeichnis
Depoil, D., Fleire, S., Treanor, B.L., Weber, M., Harwood, N.E., Marchbank, K.L., Tybulewicz,
V.L.J., & Batista, F.D., 2008. CD19 is essential for B cell activation by promoting B cell
receptor-antigen microcluster formation in response to membrane-bound ligand. Nat.
Immunol., 9, 63–72.
DiPaolo, R.J., Brinster, C., Davidson, T.S., Andersson, J., Glass, D., & Shevach, E.M., 2007.
Autoantigen-specific TGFbeta-induced Foxp3+ regulatory T cells prevent autoimmunity by
inhibiting dendritic cells from activating autoreactive T cells. J. Immunol., 179, 4685–93.
Dogan, I., Bertocci, B., Vilmont, V., Delbos, F., Mégret, J., Storck, S., Reynaud, C.-A., & Weill,
J.-C., 2009. Multiple layers of B cell memory with different effector functions. Nat.
Immunol., 10, 1292–9.
Dong, C., Yang, D.D., Tournier, C., Whitmarsh, a J., Xu, J., Davis, R.J., & Flavell, R. a, 2000.
JNK is required for effector T-cell function but not for T-cell activation. Nature, 405, 91–4.
Dong, C., Yang, D.D., Wysk, M., Whitmarsh, A.J., Davis, R.J., & Flavell, R.A., 1998. Defective
T cell differentiation in the absence of Jnk1. Science, 282, 2092–5.
Dower, N.A., Stang, S.L., Bottorff, D.A., Ebinu, J.O., Dickie, P., Ostergaard, H.L., & Stone, J.C.,
2000. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nat.
Immunol., 1, 317–21.
Dutz, J.P., Ong, C.J., Marth, J., & Teh, H.S., 1995. Distinct differentiative stages of CD4+CD8+
thymocyte development defined by the lack of coreceptor binding in positive selection. J.
Immunol., 154, 2588–99.
Ehrhardt, A., David, M.D., Ehrhardt, G.R.A., & Schrader, J.W., 2004. Distinct mechanisms
determine the patterns of differential activation of H-Ras, N-Ras, K-Ras 4B, and M-Ras by
receptors for growth factors or antigen. Mol. Cell. Biol., 24, 6311–23.
Ellis, J.H., Ashman, C., Burden, M.N., Kilpatrick, K.E., Morse, M. a., & Hamblin, P. a., 2000.
GRID: a novel Grb-2-related adapter protein that interacts with the activated T cell
costimulatory receptor CD28. J. Immunol., 164, 5805–14.
Endres, R., Alimzhanov, M.B., Plitz, T., Fütterer, A., Kosco-Vilbois, M.H., Nedospasov, S.A.,
Rajewsky, K., & Pfeffer, K., 1999. Mature follicular dendritic cell networks depend on
expression of lymphotoxin beta receptor by radioresistant stromal cells and of lymphotoxin
beta and tumor necrosis factor by B cells. J. Exp. Med., 189, 159–68.
Engels, N., König, L.M., Heemann, C., Lutz, J., Tsubata, T., Griep, S., Schrader, V., & Wienands,
J., 2009. Recruitment of the cytoplasmic adaptor Grb2 to surface IgG and IgE provides
antigen receptor-intrinsic costimulation to class-switched B cells. Nat. Immunol., 10, 1018–
25.
Engels, N., König, L.M., Schulze, W., Radtke, D., Vanshylla, K., Lutz, J., Winkler, T.H.,
Nitschke, L., & Wienands, J., 2014. The immunoglobulin tail tyrosine motif upgrades
memory-type BCRs by incorporating a Grb2-Btk signaling module. Nat. Commun., in press.
Enzler, T., Bonizzi, G., Silverman, G.J., Otero, D.C., Widhopf, G.F., Anzelon-Mills, A., Rickert,
R.C., & Karin, M., 2006. Alternative and classical NF-kappa B signaling retain autoreactive
B cells in the splenic marginal zone and result in lupus-like disease. Immunity, 25, 403–15.
178
Literaturverzeichnis
Espéli, M., Clatworthy, M.R., Bökers, S., Lawlor, K.E., Cutler, A.J., Köntgen, F., Lyons, P. a, &
Smith, K.G.C., 2012. Analysis of a wild mouse promoter variant reveals a novel role for
FcγRIIb in the control of the germinal center and autoimmunity. J. Exp. Med., 209, 2307–
19.
Eyerich, S., Eyerich, K., Pennino, D., Carbone, T., Nasorri, F., Pallotta, S., Cianfarani, F.,
Odorisio, T., Traidl-Hoffmann, C., Behrendt, H., Durham, S.R., Schmidt-Weber, C.B., &
Cavani, A., 2009. Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal
immunity and remodeling. J. Clin. Invest., 119, 3573–85.
Fagarasan, S. & Honjo, T., 2000. T-Independent immune response: new aspects of B cell biology.
Science, 290, 89–92.
Feng, G.S., Ouyang, Y.B., Hu, D.P., Shi, Z.Q., Gentz, R., & Ni, J., 1996. Grap is a novel SH3SH2-SH3 adaptor protein that couples tyrosine kinases to the Ras pathway. J. Biol. Chem.,
271, 12129–32.
Feyerabend, T.B., Terszowski, G., Tietz, A., Blum, C., Luche, H., Gossler, A., Gale, N.W.,
Radtke, F., Fehling, H.J., & Rodewald, H.-R., 2009. Deletion of Notch1 converts pro-T cells
to dendritic cells and promotes thymic B cells by cell-extrinsic and cell-intrinsic
mechanisms. Immunity, 30, 67–79.
Findlay, G.M., Smith, M.J., Lanner, F., Hsiung, M.S., Gish, G.D., Petsalaki, E., Cockburn, K.,
Kaneko, T., Huang, H., Bagshaw, R.D., Ketela, T., Tucholska, M., Taylor, L., Bowtell,
D.D., Moffat, J., Ikura, M., Li, S.S.C., Sidhu, S.S., Rossant, J., & Pawson, T., 2013.
Interaction Domains of Sos1/Grb2 Are Finely Tuned for Cooperative Control of Embryonic
Stem Cell Fate. Cell, 152, 1008–1020.
Foy, T.M., Lynch, R.G., & Waldschmidt, T.J., 1992. Ontogeny and distribution of the murine B
cell Fc gamma RII. J. Immunol., 149, 1516–23.
Friese, M. a & Fugger, L., 2005. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for
therapy? Brain, 128, 1747–63.
Fruman, D. a, Snapper, S.B., Yballe, C.M., Davidson, L., Yu, J.Y., Alt, F.W., & Cantley, L.C.,
1999. Impaired B cell development and proliferation in absence of phosphoinositide 3kinase p85alpha. Science, 283, 393–7.
Fu, G., Casas, J., Rigaud, S., Rybakin, V., Lambolez, F., Brzostek, J., Hoerter, J. a H., Paster, W.,
Acuto, O., Cheroutre, H., Sauer, K., & Gascoigne, N.R.J., 2013. Themis sets the signal
threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature, 504, 441–5.
Fujimoto, M., Poe, J.C., Hasegawa, M., & Tedder, T.F., 2000. CD19 regulates intrinsic B
lymphocyte signal transduction and activation through a novel mechanism of processive
amplification. Immunol. Res., 22, 281–98.
Gagro, A., Toellner, K.-M., Grafton, G., Servis, D., Branica, S., Radojcić, V., Kosor, E., Hrabak,
M., & Gordon, J., 2003. Naive and memory B cells respond differentially to T-dependent
signaling but display an equal potential for differentiation toward the centroblast-restricted
CD77/globotriaosylceramide phenotype. Eur. J. Immunol., 33, 1889–98.
179
Literaturverzeichnis
Gerlach, J., Ghosh, S., Jumaa, H., Reth, M., Wienands, J., Chan, A.C., & Nitschke, L., 2003. B
cell defects in SLP65/BLNK-deficient mice can be partially corrected by the absence of
CD22, an inhibitory coreceptor for BCR signaling. Eur. J. Immunol., 33, 3418–26.
Gong, Q., Cheng, A.M., Akk, A.M., Alberola-Ila, J., Gong, G., Pawson, T., & Chan, A.C., 2001.
Disruption of T cell signaling networks and development by Grb2 haploid insufficiency.
Nat. Immunol., 2, 29–36.
Good, K.L., Avery, D.T., & Tangye, S.G., 2009. Resting human memory B cells are intrinsically
programmed for enhanced survival and responsiveness to diverse stimuli compared to naive
B cells. J. Immunol., 182, 890–901.
Good, K.L. & Tangye, S.G., 2007. Decreased expression of Kruppel-like factors in memory B
cells induces the rapid response typical of secondary antibody responses. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A., 104, 13420–5.
Goodnow, C.C., Vinuesa, C.G., Randall, K.L., Mackay, F., & Brink, R., 2010. Control systems
and decision making for antibody production. Nat. Immunol., 11, 681–8.
Gounari, F., Aifantis, I., Martin, C., Fehling, H.-J., Hoeflinger, S., Leder, P., von Boehmer, H., &
Reizis, B., 2002. Tracing lymphopoiesis with the aid of a pTalpha-controlled reporter gene.
Nat. Immunol., 3, 489–96.
Goverman, J., Perchellet, A., & Huseby, E.S., 2005. The role of CD8(+) T cells in multiple
sclerosis and its animal models. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy, 4, 239–45.
Gray, A., Van Der Kaay, J., & Downes, C.P., 1999. The pleckstrin homology domains of protein
kinase B and GRP1 (general receptor for phosphoinositides-1) are sensitive and selective
probes for the cellular detection of phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate and/or
phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. Biochem. J., 344 Pt 3, 929–36.
Gross, A.J., Lyandres, J.R., Panigrahi, A.K., Prak, E.T.L., & DeFranco, A.L., 2009.
Developmental acquisition of the Lyn-CD22-SHP-1 inhibitory pathway promotes B cell
tolerance. J. Immunol., 182, 5382–92.
Grumont, R.J., Rourke, I.J., & Gerondakis, S., 1999. Rel-dependent induction of A1 transcription
is required to protect B cells from antigen receptor ligation-induced apoptosis. Genes Dev.,
13, 400–11.
Grumont, R.J., Rourke, I.J., O’Reilly, L.A., Strasser, A., Miyake, K., Sha, W., & Gerondakis, S.,
1998. B lymphocytes differentially use the Rel and nuclear factor kappaB1 (NF-kappaB1)
transcription factors to regulate cell cycle progression and apoptosis in quiescent and
mitogen-activated cells. J. Exp. Med., 187, 663–74.
Güler, M.L., Gorham, J.D., Hsieh, C.S., Mackey, A.J., Steen, R.G., Dietrich, W.F., & Murphy,
K.M., 1996. Genetic susceptibility to Leishmania: IL-12 responsiveness in TH1 cell
development. Science, 271, 984–7.
Guéry, J.C., Galbiati, F., Smiroldo, S., & Adorini, L., 1997. Non-MHC-linked Th2 cell
development induced by soluble protein administration predicts susceptibility to Leishmania
major infection. J. Immunol., 159, 2147–53.
180
Literaturverzeichnis
Hardy, R.R. & Hayakawa, K., 2001. B cell development pathways. Annu. Rev. Immunol., 19,
595–621.
Hare, K.J., Jenkinson, E.J., & Anderson, G., 1999. CD69 expression discriminates MHCdependent and -independent stages of thymocyte positive selection. J. Immunol., 162, 3978–
83.
Harmer, S.L. & DeFranco, a L., 1999. The src homology domain 2-containing inositol
phosphatase SHIP forms a ternary complex with Shc and Grb2 in antigen receptorstimulated B lymphocytes. J. Biol. Chem., 274, 12183–91.
Harrington, L.E., Hatton, R.D., Mangan, P.R., Turner, H., Murphy, T.L., Murphy, K.M., &
Weaver, C.T., 2005. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage
distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat. Immunol., 6, 1123–32.
Hashimoto, a., Takeda, K., Inaba, M., Sekimata, M., Kaisho, T., Ikehara, S., Homma, Y., Akira,
S., & Kurosaki, T., 2000. Cutting Edge: Essential Role of Phospholipase C- 2 in B Cell
Development and Function. J. Immunol., 165, 1738–1742.
Hayashi, K., Nittono, R., Okamoto, N., Tsuji, S., Hara, Y., Goitsuka, R., & Kitamura, D., 2000.
The B cell-restricted adaptor BASH is required for normal development and antigen
receptor-mediated activation of B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97, 2755–60.
Hebeis, B.J., Klenovsek, K., Rohwer, P., Ritter, U., Schneider, A., Mach, M., & Winkler, T.H.,
2004. Activation of virus-specific memory B cells in the absence of T cell help. J. Exp.
Med., 199, 593–602.
Hickey, W.F., 1991. Migration of hematogenous cells through the blood-brain barrier and the
initiation of CNS inflammation. Brain Pathol., 1, 97–105.
Hobeika, E., Thiemann, S., Storch, B., Jumaa, H., Nielsen, P.J., Pelanda, R., & Reth, M., 2006.
Testing gene function early in the B cell lineage in mb1-cre mice. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 103, 13789–94.
Hoek, K.L., Antony, P., Lowe, J., Shinners, N., Sarmah, B., Wente, S.R., Wang, D., Gerstein,
R.M., & Khan, W.N., 2006. Transitional B Cell Fate Is Associated with Developmental
Stage-Specific Regulation of Diacylglycerol and Calcium Signaling upon B Cell Receptor
Engagement. J. Immunol., 177, 5405–5413.
Honjo, T., Kinoshita, K., & Muramatsu, M., 2002. Molecular mechanism of class switch
recombination: linkage with somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol., 20, 165–96.
Hough, M.R., Takei, F., Humphries, R.K., & Kay, R., 1994. Defective development of
thymocytes overexpressing the costimulatory molecule, heat-stable antigen. J. Exp. Med.,
179, 177–84.
Hozumi, K., Mailhos, C., Negishi, N., Hirano, K., Yahata, T., Ando, K., Zuklys, S., Holländer, G.
a, Shima, D.T., & Habu, S., 2008. Delta-like 4 is indispensable in thymic environment
specific for T cell development. J. Exp. Med., 205, 2507–13.
Hsu, B.L., Harless, S.M., Lindsley, R.C., Hilbert, D.M., & Cancro, M.P., 2002. Cutting edge:
BLyS enables survival of transitional and mature B cells through distinct mediators. J.
Immunol., 168, 5993–6.
181
Literaturverzeichnis
Huang, J., Durum, S.K., & Muegge, K., 2001. Cutting edge: histone acetylation and
recombination at the TCR gamma locus follows IL-7 induction. J. Immunol., 167, 6073–7.
Igarashi, H., Gregory, S.C., Yokota, T., Sakaguchi, N., & Kincade, P.W., 2002. Transcription
from the RAG1 Locus Marks the Earliest Lymphocyte Progenitors in Bone Marrow.
Immunity, 17, 117–130.
Ivanov, I.I., McKenzie, B.S., Zhou, L., Tadokoro, C.E., Lepelley, A., Lafaille, J.J., Cua, D.J., &
Littman, D.R., 2006. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation
program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell, 126, 1121–33.
Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., & Weiss, U., 1991. Intraclonal generation of antibody
mutants in germinal centres. Nature, 354, 389–92.
Jäger, A., Dardalhon, V., Sobel, R. a, Bettelli, E., & Kuchroo, V.K., 2009. Th1, Th17, and Th9
effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different
pathological phenotypes. J. Immunol., 183, 7169–77.
Janas, M.L., Varano, G., Gudmundsson, K., Noda, M., Nagasawa, T., & Turner, M., 2010.
Thymic development beyond beta-selection requires phosphatidylinositol 3-kinase
activation by CXCR4. J. Exp. Med., 207, 247–61.
Jang, I.K., Cronshaw, D.G., Xie, L.-K., Fang, G., Zhang, J., Oh, H., Fu, Y.-X., Gu, H., & Zou, Y.,
2011. Growth-factor receptor-bound protein-2 (Grb2) signaling in B cells controls lymphoid
follicle organization and germinal center reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2, 2–7.
Jang, I.K., Zhang, J., Chiang, Y.J., Kole, H.K., Cronshaw, D.G., Zou, Y., & Gu, H., 2010. Grb2
functions at the top of the T-cell antigen receptor-induced tyrosine kinase cascade to control
thymic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 107, 10620–5.
Jellusova, J. & Nitschke, L., 2012. Regulation of B Cell Functions by the Sialic Acid-Binding
Receptors Siglec-G and CD22. Front. Immunol., 2.
Jenkinson, E.J., Kingston, R., & Owen, J.J., 1990. Newly generated thymocytes are not refractory
to deletion when the alpha/beta component of the T cell receptor is engaged by the
superantigen staphylococcal enterotoxin B. Eur. J. Immunol., 20, 2517–20.
Jiang, Y., Hirose, S., Abe, M., Sanokawa-Akakura, R., Ohtsuji, M., Mi, X., Li, N., Xiu, Y.,
Zhang, D., Shirai, J., Hamano, Y., Fujii, H., & Shirai, T., 2000. Polymorphisms in IgG Fc
receptor IIB regulatory regions associated with autoimmune susceptibility. Immunogenetics,
51, 429–35.
Johnson, A.J., Suidan, G.L., McDole, J., & Pirko, I., 2007. The CD8 T cell in multiple sclerosis:
suppressor cell or mediator of neuropathology? Int. Rev. Neurobiol., 79, 73–97.
Johnston, R.J., Poholek, A.C., DiToro, D., Yusuf, I., Eto, D., Barnett, B., Dent, A.L., Craft, J., &
Crotty, S., 2009. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular
helper cell differentiation. Science, 325, 1006–10.
Jumaa, H., Wollscheid, B., Mitterer, M., Wienands, J., Reth, M., & Nielsen, P.J., 1999. Abnormal
development and function of B lymphocytes in mice deficient for the signaling adaptor
protein SLP-65. Immunity, 11, 547–54.
182
Literaturverzeichnis
Junt, T., Tumanov, A. V, Harris, N., Heikenwalder, M., Zeller, N., Kuprash, D. V, Aguzzi, A.,
Ludewig, B., Nedospasov, S. a, & Zinkernagel, R.M., 2006. Expression of lymphotoxin beta
governs immunity at two distinct levels. Eur. J. Immunol., 36, 2061–75.
Kabat, E.A., Wolf, A., & Bezer, A.E., 1947. THE RAPID PRODUCTION OF ACUTE
DISSEMINATED ENCEPHALOMYELITIS IN RHESUS MONKEYS BY INJECTION
OF HETEROLOGOUS AND HOMOLOGOUS BRAIN TISSUE WITH ADJUVANTS. J.
Exp. Med., 85, 117–30.
Kang, J., Volkmann, A., & Raulet, D.H., 2001. Evidence that gammadelta versus alphabeta T cell
fate determination is initiated independently of T cell receptor signaling. J. Exp. Med., 193,
689–98.
Kaplan, M.H., 2013. Th9 cells: differentiation and disease. Immunol. Rev., 252, 104–15.
Kaplan, M.H., Schindler, U., Smiley, S.T., & Grusby, M.J., 1996. Stat6 is required for mediating
responses to IL-4 and for development of Th2 cells. Immunity, 4, 313–9.
Kaplan, M.H., Sun, Y.L., Hoey, T., & Grusby, M.J., 1996. Impaired IL-12 responses and
enhanced development of Th2 cells in Stat4-deficient mice. Nature, 382, 174–7.
Kawakami, N., Lassmann, S., Li, Z., Odoardi, F., Ritter, T., Ziemssen, T., Klinkert, W.E.F.,
Ellwart, J.W., Bradl, M., Krivacic, K., Lassmann, H., Ransohoff, R.M., Volk, H.-D.,
Wekerle, H., Linington, C., & Flügel, A., 2004. The activation status of neuroantigenspecific T cells in the target organ determines the clinical outcome of autoimmune
encephalomyelitis. J. Exp. Med., 199, 185–97.
Kerfoot, S.M., Yaari, G., Patel, J.R., Johnson, K.L., Gonzalez, D.G., Kleinstein, S.H., &
Haberman, A.M., 2011. Germinal center B cell and T follicular helper cell development
initiates in the interfollicular zone. Immunity, 34, 947–60.
Kerner, J.D., Appleby, M.W., Mohr, R.N., Chien, S., Rawlings, D.J., Maliszewski, C.R., Witte,
O.N., & Perlmutter, R.M., 1995. Impaired expansion of mouse B cell progenitors lacking
Btk. Immunity, 3, 301–12.
Kessels, H.W.H.G., Ward, A.C., & Schumacher, T.N.M., 2002. Specificity and affinity motifs for
Grb2 SH2-ligand interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99, 8524–9.
Khan, W.N., Alt, F.W., Gerstein, R.M., Malynn, B. a, Larsson, I., Rathbun, G., Davidson, L.,
Müller, S., Kantor, a B., & Herzenberg, L. a, 1995. Defective B cell development and
function in Btk-deficient mice. Immunity, 3, 283–99.
Kinoshita, K., Harigai, M., Fagarasan, S., Muramatsu, M., & Honjo, T., 2001. A hallmark of
active class switch recombination: transcripts directed by I promoters on looped-out circular
DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 98, 12620–3.
Kishimoto, H. & Sprent, J., 1997. Negative selection in the thymus includes semimature T cells.
J. Exp. Med., 185, 263–71.
Kisielow, P., Blüthmann, H., Staerz, U.D., Steinmetz, M., & von Boehmer, H., 1988. Tolerance in
T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.
Nature, 333, 742–6.
183
Literaturverzeichnis
Kitano, M., Moriyama, S., Ando, Y., Hikida, M., Mori, Y., Kurosaki, T., & Okada, T., 2011. Bcl6
protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell
heterogeneity. Immunity, 34, 961–72.
Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., & Kyewski, B., 2009. Antigen presentation in the
thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol., 9, 833–44.
Klinman, N.R. & Doughty, R.A., 1973. Hapten-specific stimulation of secondary B cells
independent of T cells. J. Exp. Med., 138, 473–8.
Koch, U., Fiorini, E., Benedito, R., Besseyrias, V., Schuster-Gossler, K., Pierres, M., Manley,
N.R., Duarte, A., Macdonald, H.R., & Radtke, F., 2008. Delta-like 4 is the essential,
nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment. J. Exp. Med.,
205, 2515–23.
Koch, U. & Radtke, F., 2011. Mechanisms of T cell development and transformation. Annu. Rev.
Cell Dev. Biol., 27, 539–62.
Kometani, K., Nakagawa, R., Shinnakasu, R., Kaji, T., Rybouchkin, A., Moriyama, S., Furukawa,
K., Koseki, H., Takemori, T., & Kurosaki, T., 2013. Repression of the transcription factor
Bach2 contributes to predisposition of IgG1 memory B cells toward plasma cell
differentiation. Immunity, 39, 136–47.
Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., & Kuchroo, V.K., 2009. IL-17 and Th17 Cells. Annu. Rev.
Immunol., 27, 485–517.
Kos, C.H., 2004. Methods in Nutrition Science: Cre/loxP System for Generating Tissue-specific
Knockout Mouse Models. Nutr. Rev., 62, 243–246.
Kuchroo, V.K., Anderson, A.C., Waldner, H., Munder, M., Bettelli, E., & Nicholson, L.B., 2002.
T cell response in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE): role of self and
cross-reactive antigens in shaping, tuning, and regulating the autopathogenic T cell
repertoire. Annu. Rev. Immunol., 20, 101–23.
Kurosaki, T., 2002. Regulation of B-cell signal transduction by adaptor proteins. Nat. Rev.
Immunol., 2, 354–63.
Kurosaki, T., Shinohara, H., & Baba, Y., 2010. B cell signaling and fate decision. Annu. Rev.
Immunol., 28, 21–55.
Lassmann, H. & Ransohoff, R.M., 2004. The CD4-Th1 model for multiple sclerosis: a critical
[correction of crucial] re-appraisal. Trends Immunol., 25, 132–7.
Launois, P., Swihart, K.G., Milon, G., & Louis, J.A., 1997. Early production of IL-4 in
susceptible mice infected with Leishmania major rapidly induces IL-12 unresponsiveness. J.
Immunol., 158, 3317–24.
Lauritsen, J.P.H., Wong, G.W., Lee, S.-Y., Lefebvre, J.M., Ciofani, M., Rhodes, M., Kappes,
D.J., Zúñiga-Pflücker, J.C., & Wiest, D.L., 2009. Marked induction of the helix-loop-helix
protein Id3 promotes the gammadelta T cell fate and renders their functional maturation
Notch independent. Immunity, 31, 565–75.
184
Literaturverzeichnis
Law, C.L., Ewings, M.K., Chaudhary, P.M., Solow, S.A., Yun, T.J., Marshall, A.J., Hood, L., &
Clark, E.A., 1999. GrpL, a Grb2-related adaptor protein, interacts with SLP-76 to regulate
nuclear factor of activated T cell activation. J. Exp. Med., 189, 1243–53.
Lebar, R. & Vincent, C., 1981. Tentative identification of a second central nervous system myelin
membrane autoantigen (M2) by a biochemical comparison with the basic protein (BP). J.
Neuroimmunol., 1, 367–89.
Lee, P.P., Fitzpatrick, D.R., Beard, C., Jessup, H.K., Lehar, S., Makar, K.W., Pérez-Melgosa, M.,
Sweetser, M.T., Schlissel, M.S., Nguyen, S., Cherry, S.R., Tsai, J.H., Tucker, S.M., Weaver,
W.M., Kelso, A., Jaenisch, R., & Wilson, C.B., 2001. A critical role for Dnmt1 and DNA
methylation in T cell development, function, and survival. Immunity, 15, 763–74.
Levine, S. & Sowinski, R., 1973. Experimental allergic encephalomyelitis in inbred and outbred
mice. J. Immunol., 110, 139–43.
Levine, S., Wenk, E.J., Devlin, H.B., Pieroni, R.E., & Levine, L., 1966. Hyperacute allergic
encephalomyelitis: adjuvant effect of pertussis vaccines and extracts. J. Immunol., 97, 363–
8.
Lindquist, J. a, Simeoni, L., & Schraven, B., 2003. Transmembrane adapters: attractants for
cytoplasmic effectors. Immunol. Rev., 191, 165–82.
Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C., & Vass, K., 1988. Augmentation of
demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal
antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. Am. J. Pathol., 130, 443–
54.
Linnington, C., Webb, M., & Woodhams, P.L., 1984. A novel myelin-associated glycoprotein
defined by a mouse monoclonal antibody. J. Neuroimmunol., 6, 387–96.
Liu, S.K., Fang, N., Koretzky, G. a., & McGlade, C.J., 1999. The hematopoietic-specific adaptor
protein gads functions in T-cell signaling via interactions with the SLP-76 and LAT
adaptors. Curr. Biol., 9, 67–75.
Liu, S.K. & McGlade, C.J., 1998. Gads is a novel SH2 and SH3 domain-containing adaptor
protein that binds to tyrosine-phosphorylated Shc. Oncogene, 17, 3073–82.
Liu, S.K., Smith, C. a., Arnold, R., Kiefer, F., & McGlade, C.J., 2000. The Adaptor Protein Gads
(Grb2-Related Adaptor Downstream of Shc) Is Implicated in Coupling Hemopoietic
Progenitor Kinase-1 to the Activated TCR. J. Immunol., 165, 1417–1426.
Liu, W., Meckel, T., Tolar, P., Won Sohn, H., & Pierce, S.K., 2010. Intrinsic Properties of
immunoglobulin IgG1 Isotype-Switched B Cell Receptors Promote Microclustering and the
Initiation of Signaling. Immunity, 32, 778–789.
Liu, Y.J., Joshua, D.E., Williams, G.T., Smith, C.A., Gordon, J., & MacLennan, I.C., 1989.
Mechanism of antigen-driven selection in germinal centres. Nature, 342, 929–31.
Livák, F., Tourigny, M., Schatz, D.G., & Petrie, H.T., 1999. Characterization of TCR gene
rearrangements during adult murine T cell development. J. Immunol., 162, 2575–80.
185
Literaturverzeichnis
Loder, F., Mutschler, B., Ray, R JPaige, C.J., Sideras, P., Torres, R., Lamers, M.C., & Carsetti,
R., 1999. B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by
the quality of B cell receptor-derived signals. J. Exp. Med., 190, 75–89.
Lösing, M., Goldbeck, I., Manno, B., Oellerich, T., Schnyder, T., Bohnenberger, H., Stork, B.,
Urlaub, H., Batista, F.D., Wienands, J., & Engelke, M., 2012. The Dok-3/Grb2 signal
module attenuates Lyn-dependent activation of Syk in B cell antigen receptor microclusters.
J. Biol. Chem.
Lowenstein, E.J., Daly, R.J., Batzer, a G., Li, W., Margolis, B., Lammers, R., Ullrich, A.,
Skolnik, E.Y., Bar-Sagi, D., & Schlessinger, J., 1992. The SH2 and SH3 domain-containing
protein GRB2 links receptor tyrosine kinases to ras signaling. Cell, 70, 431–42.
Lucchinetti, C., Brück, W., Parisi, J., Scheithauer, B., Rodriguez, M., & Lassmann, H., 2000.
Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of
demyelination. Ann. Neurol., 47, 707–17.
MacLennan, I.C., 1994. Germinal centers. Annu. Rev. Immunol., 12, 117–39.
Mahler, M. & Fritzler, M.J., 2012. The clinical significance of the dense fine speckled
immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune
diseases. Clin. Dev. Immunol., 2012, 494356.
Maillard, I., Tu, L., Sambandam, A., Yashiro-Ohtani, Y., Millholland, J., Keeshan, K., Shestova,
O., Xu, L., Bhandoola, A., & Pear, W.S., 2006. The requirement for Notch signaling at the
beta-selection checkpoint in vivo is absolute and independent of the pre-T cell receptor. J.
Exp. Med., 203, 2239–45.
Mangan, P.R., Harrington, L.E., O’Quinn, D.B., Helms, W.S., Bullard, D.C., Elson, C.O., Hatton,
R.D., Wahl, S.M., Schoeb, T.R., & Weaver, C.T., 2006. Transforming growth factor-beta
induces development of the T(H)17 lineage. Nature, 441, 231–4.
Martin, F. & Kearney, J.F., 2001. B1 cells: similarities and differences with other B cell subsets.
Curr. Opin. Immunol., 13, 195–201.
Martin, S.W. & Goodnow, C.C., 2002. Burst-enhancing role of the IgG membrane tail as a
molecular determinant of memory. Nat. Immunol., 3, 182–8.
Matloubian, M., Lo, C.G., Cinamon, G., Lesneski, M.J., Xu, Y., Brinkmann, V., Allende, M.L.,
Proia, R.L., & Cyster, J.G., 2004. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid
organs is dependent on S1P receptor 1. Nature, 427, 355–60.
Matuoka, K., Shibata, M., Yamakawa, A., & Takenawa, T., 1992. Cloning of ASH, a ubiquitous
protein composed of one Src homology region (SH) 2 and two SH3 domains, from human
and rat cDNA libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89, 9015–9.
McCombe, P.A., Fordyce, B.W., de Jersey, J., Yoong, G., & Pender, M.P., 1992. Expression of
CD45RC and Ia antigen in the spinal cord in acute experimental allergic encephalomyelitis:
an immunocytochemical and flow cytometric study. J. Neurol. Sci., 113, 177–86.
McDevitt, H.O., Perry, R., & Steinman, L.A., 1987. Monoclonal anti-Ia antibody therapy in
animal models of autoimmune disease. Ciba Found. Symp., 129, 184–93.
186
Literaturverzeichnis
McDole, J., Johnson, A.J., & Pirko, I., 2006. The role of CD8+ T-cells in lesion formation and
axonal dysfunction in multiple sclerosis. Neurol. Res., 28, 256–61.
McMahon, E.J., Bailey, S.L., Castenada, C.V., Waldner, H., & Miller, S.D., 2005. Epitope
spreading initiates in the CNS in two mouse models of multiple sclerosis. Nat. Med., 11,
335–9.
Meade, J., Fernandez, C., & Turner, M., 2002. The tyrosine kinase Lyn is required for B cell
development beyond the T1 stage in the spleen: rescue by over-expression of Bcl-2. Eur. J.
Immunol., 32, 1029–34.
Merkenschlager, M., Graf, D., Lovatt, M., Bommhardt, U., Zamoyska, R., & Fisher, a G., 1997.
How many thymocytes audition for selection? J. Exp. Med., 186, 1149–58.
Meyer-Bahlburg, A., Andrews, S.F., Yu, K.O. a, Porcelli, S. a, & Rawlings, D.J., 2008.
Characterization of a late transitional B cell population highly sensitive to BAFF-mediated
homeostatic proliferation. J. Exp. Med., 205, 155–68.
Minegishi, Y., Rohrer, J., Coustan-Smith, E., Lederman, H.M., Pappu, R., Campana, D., Chan,
A.C., & Conley, M.E., 1999. An essential role for BLNK in human B cell development.
Science, 286, 1954–7.
Miosge, L. a & Goodnow, C.C., 2005. Genes, pathways and checkpoints in lymphocyte
development and homeostasis. Immunol. Cell Biol., 83, 318–35.
Miossec, P., Korn, T., & Kuchroo, V.K., 2009. Interleukin-17 and type 17 helper T cells. N. Engl.
J. Med., 361, 888–98.
Murphy, K.M., Heimberger, A.B., & Loh, D.Y., 1990. Induction by antigen of intrathymic
apoptosis of CD4+CD8+TCRlo thymocytes in vivo. Science, 250, 1720–3.
Myung, P.S., Boerthe, N.J., & Koretzky, G. a, 2000. Adapter proteins in lymphocyte antigenreceptor signaling. Curr. Opin. Immunol., 12, 256–66.
Nakayamada, S., Takahashi, H., Kanno, Y., & O’Shea, J.J., 2012. Helper T cell diversity and
plasticity. Curr. Opin. Immunol., 24, 297–302.
Neumann, K., Oellerich, T., Heine, I., Urlaub, H., & Engelke, M., 2011. Fc gamma receptor IIb
modulates the molecular Grb2 interaction network in activated B cells. Cell. Signal., 23,
893–900.
Neumann, K., Oellerich, T., Urlaub, H., & Wienands, J., 2009. The B-lymphoid Grb2 interaction
code. Immunol. Rev., 232, 135–49.
Niiro, H. & Clark, E.A., 2002. Regulation of B-cell fate by antigen-receptor signals. Nat. Rev.
Immunol., 2, 945–56.
Nikolić-Zugić, J. & Bevan, M.J., 1990. Functional and phenotypic delineation of two subsets of
CD4 single positive cells in the thymus. Int. Immunol., 2, 135–41.
Nitschke, L., 2005. The role of CD22 and other inhibitory co-receptors in B-cell activation. Curr.
Opin. Immunol., 17, 290–7.
187
Literaturverzeichnis
Nurieva, R.I., Chung, Y., Martinez, G.J., Yang, X.O., Tanaka, S., Matskevitch, T.D., Wang, Y.H., & Dong, C., 2009. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science,
325, 1001–5.
O’Garra, A. & Arai, N., 2000. The molecular basis of T helper 1 and T helper 2 cell
differentiation. Trends Cell Biol., 10, 542–50.
O’Shea, C.C., Crompton, T., Rosewell, I.R., Hayday, a C., & Owen, M.J., 1996. Raf regulates
positive selection. Eur. J. Immunol., 26, 2350–5.
O’Shea, J.J. & Paul, W.E., 2010. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of
helper CD4+ T cells. Science, 327, 1098–102.
Oh-hora, M., Johmura, S., Hashimoto, A., Hikida, M., & Kurosaki, T., 2003. Requirement for Ras
guanine nucleotide releasing protein 3 in coupling phospholipase C-gamma2 to Ras in B cell
receptor signaling. J. Exp. Med., 198, 1841–51.
Ono, M., Bolland, S., Tempst, P., & Ravetch, J. V, 1996. Role of the inositol phosphatase SHIP in
negative regulation of the immune system by the receptor Fc(gamma)RIIB. Nature, 383,
263–6.
Ono, M., Okada, H., Bolland, S., Yanagi, S., Kurosaki, T., & Ravetch, J. V, 1997. Deletion of
SHIP or SHP-1 reveals two distinct pathways for inhibitory signaling. Cell, 90, 293–301.
Oracki, S. a, Walker, J. a, Hibbs, M.L., Corcoran, L.M., & Tarlinton, D.M., 2010. Plasma cell
development and survival. Immunol. Rev., 237, 140–59.
Orban, P.C., Chui, D., & Marth, J.D., 1992. Tissue- and site-specific DNA recombination in
transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 6861–5.
Otipoby, K.L., Sasaki, Y., Schmidt-Supprian, M., Patke, A., Gareus, R., Pasparakis, M.,
Tarakhovsky, A., & Rajewsky, K., 2008. BAFF activates Akt and Erk through BAFF-R in
an IKK1-dependent manner in primary mouse B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 105,
12435–8.
Pagès, G., Guérin, S., Grall, D., Bonino, F., Smith, A., Anjuere, F., Auberger, P., & Pouysségur,
J., 1999. Defective thymocyte maturation in p44 MAP kinase (Erk 1) knockout mice.
Science, 286, 1374–7.
Pape, K. a, Taylor, J.J., Maul, R.W., Gearhart, P.J., & Jenkins, M.K., 2011. Different B cell
populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.
Science, 331, 1203–7.
Pappu, R., Cheng, A.M., Li, B., Gong, Q., Chiu, C., Griffin, N., White, M., Sleckman, B.P., &
Chan, A.C., 1999. Requirement for B cell linker protein (BLNK) in B cell development.
Science, 286, 1949–54.
Park, H., Li, Z., Yang, X.O., Chang, S.H., Nurieva, R., Wang, Y.-H., Wang, Y., Hood, L., Zhu,
Z., Tian, Q., & Dong, C., 2005. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue
inflammation by producing interleukin 17. Nat. Immunol., 6, 1133–41.
188
Literaturverzeichnis
Paster, W., Brockmeyer, C., Fu, G., Simister, P.C., de Wet, B., Martinez-Riano, A., Hoerter, J. a.
H., Feller, S.M., Wulfing, C., Gascoigne, N.R.J., & Acuto, O., 2013. GRB2-Mediated
Recruitment of THEMIS to LAT Is Essential for Thymocyte Development. J. Immunol.
Paul, W.E. & Seder, R.A., 1994. Lymphocyte responses and cytokines. Cell, 76, 241–51.
Pawson, T. & Gish, G.D., 1992. SH2 and SH3 domains: from structure to function. Cell, 71, 359–
62.
Petrie, H.T. & Zúñiga-Pflücker, J.C., 2007. Zoned out: functional mapping of stromal signaling
microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol., 25, 649–79.
Petro, J.B., Gerstein, R.M., Lowe, J., Carter, R.S., Shinners, N., & Khan, W.N., 2002.
Transitional type 1 and 2 B lymphocyte subsets are differentially responsive to antigen
receptor signaling. J. Biol. Chem., 277, 48009–19.
Pillai, S., Cariappa, A., & Moran, S.T., 2005. Marginal zone B cells. Annu. Rev. Immunol., 23,
161–96.
Poe, J.C., Fujimoto, M., Jansen, P.J., Miller, a S., & Tedder, T.F., 2000. CD22 forms a quaternary
complex with SHIP, Grb2, and Shc. A pathway for regulation of B lymphocyte antigen
receptor-induced calcium flux. J. Biol. Chem., 275, 17420–7.
Porritt, H.E., Gordon, K., & Petrie, H.T., 2003. Kinetics of steady-state differentiation and
mapping of intrathymic-signaling environments by stem cell transplantation in nonirradiated
mice. J. Exp. Med., 198, 957–62.
Qiu, M., Hua, S., Agrawal, M., Li, G., Cai, J., Chan, E., Zhou, H., Luo, Y., & Liu, M., 1998.
Molecular cloning and expression of human grap-2, a novel leukocyte-specific SH2- and
SH3-containing adaptor-like protein that binds to gab-1. Biochem. Biophys. Res. Commun.,
253, 443–7.
Raine, C.S., Traugott, U., & Stone, S.H., 1978. Chronic relapsing experimental allergic
encephalomyelitis: CNS plaque development in unsuppressed and suppressed animals. Acta
Neuropathol., 43, 43–53.
Rajewsky, K., Gu, H., Kühn, R., Betz, U.A., Müller, W., Roes, J., & Schwenk, F., 1996.
Conditional gene targeting. J. Clin. Invest., 98, 600–3.
Ramsdell, F., Jenkins, M., Dinh, Q., & Fowlkes, B.J., 1991. The majority of CD4+8- thymocytes
are functionally immature. J. Immunol., 147, 1779–85.
Rangachari, M. & Kuchroo, V.K., 2013. Using EAE to better understand principles of immune
function and autoimmune pathology. J. Autoimmun., 45, 31–9.
Ren, R., Mayer, B.J., Cicchetti, P., & Baltimore, D., 1993. Identification of a ten-amino acid
proline-rich SH3 binding site. Science, 259, 1157–61.
Reth, M., 1992. Antigen receptors on B lymphocytes. Annu. Rev. Immunol., 10, 97–121.
Rincón, M., Conze, D., Weiss, L., Diehl, N.L., Fortner, K.A., Yang, D., Flavell, R.A., Enslen, H.,
Whitmarsh, A., & Davis, R.J., 2000. Conference highlight: do T cells care about the
mitogen-activated protein kinase signalling pathways? Immunol. Cell Biol., 78, 166–75.
189
Literaturverzeichnis
Rincón, M., Flavell, R.A., & Davis, R.A., 2000. The JNK and P38 MAP kinase signaling
pathways in T cell-mediated immune responses. Free Radic. Biol. Med., 28, 1328–37.
Rincón, M., Whitmarsh, A., Yang, D.D., Weiss, L., Dérijard, B., Jayaraj, P., Davis, R.J., &
Flavell, R.A., 1998. The JNK pathway regulates the In vivo deletion of immature
CD4(+)CD8(+) thymocytes. J. Exp. Med., 188, 1817–30.
Sabapathy, K., Hu, Y., Kallunki, T., Schreiber, M., David, J.P., Jochum, W., Wagner, E.F., &
Karin, M., 1999. JNK2 is required for efficient T-cell activation and apoptosis but not for
normal lymphocyte development. Curr. Biol., 9, 116–25.
Saito, T., Chiba, S., Ichikawa, M., Kunisato, A., Asai, T., Shimizu, K., Yamaguchi, T.,
Yamamoto, G., Seo, S., Kumano, K., Nakagami-Yamaguchi, E., Hamada, Y., Aizawa, S., &
Hirai, H., 2003. Notch2 is preferentially expressed in mature B cells and indispensable for
marginal zone B lineage development. Immunity, 18, 675–85.
Sakuma, H., Kohyama, K., Park, I.-K., Miyakoshi, A., Tanuma, N., & Matsumoto, Y., 2004.
Clinicopathological study of a myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced demyelinating
disease in LEW.1AV1 rats. Brain, 127, 2201–13.
Samelson, L.E., 1999. Adaptor proteins and T-cell antigen receptor signaling. Prog. Biophys.
Mol. Biol., 71, 393–403.
Samelson, L.E., 2002. Signal transduction mediated by the T cell antigen receptor: the role of
adapter proteins. Annu. Rev. Immunol., 20, 371–94.
Samelson, L.E., Donovan, J.A., Isakov, N., Ota, Y., & Wange, R.L., 1995. Signal transduction
mediated by the T-cell antigen receptor. Ann. N. Y. Acad. Sci., 766, 157–72.
Sasaki, Y., Casola, S., Kutok, J.L., Rajewsky, K., & Schmidt-Supprian, M., 2004. TNF Family
Member B Cell-Activating Factor (BAFF) Receptor-Dependent and -Independent Roles for
BAFF in B Cell Physiology. J. Immunol., 173, 2245–2252.
Sawada, S., Scarborough, J.D., Killeen, N., & Littman, D.R., 1994. A lineage-specific
transcriptional silencer regulates CD4 gene expression during T lymphocyte development.
Cell, 77, 917–29.
Schaeffer, E.M. & Schwartzberg, P.L., 2000. Tec family kinases in lymphocyte signaling and
function. Curr. Opin. Immunol., 12, 282–8.
Schaerli, P., Willimann, K., Lang, a. B., Lipp, M., Loetscher, P., & Moser, B., 2000. CXC
chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell helper
function. J. Exp. Med., 192, 1553–62.
Schiemann, B., Gommerman, J.L., Vora, K., Cachero, T.G., Shulga-Morskaya, S., Dobles, M.,
Frew, E., & Scott, M.L., 2001. An essential role for BAFF in the normal development of B
cells through a BCMA-independent pathway. Science, 293, 2111–4.
Schiffenbauer, J., Butfiloski, E., Hanley, G., Sobel, E.S., Streit, W.J., & Lazarovits, A., 1998.
Prevention of experimental allergic encephalomyelitis by an antibody to CD45RB. Cell.
Immunol., 190, 173–82.
190
Literaturverzeichnis
Schnyder, T., Castello, A., Feest, C., Harwood, N.E., Oellerich, T., Urlaub, H., Engelke, M.,
Wienands, J., Bruckbauer, A., & Batista, F.D., 2011. B cell receptor-mediated antigen
gathering requires ubiquitin ligase cbl and adaptors grb2 and dok-3 to recruit Dynein to the
signaling microcluster. Immunity, 34, 905–18.
Schweighoffer, E., Vanes, L., Nys, J., Cantrell, D., McCleary, S., Smithers, N., & Tybulewicz,
V.L.J., 2013. The BAFF receptor transduces survival signals by co-opting the B cell
receptor signaling pathway. Immunity, 38, 475–88.
Seamons, A., Perchellet, A., & Goverman, J., 2003. Immune tolerance to myelin proteins.
Immunol. Res., 28, 201–21.
Shen, P., Roch, T., Lampropoulou, V., O’Connor, R. a, Stervbo, U., Hilgenberg, E., Ries, S.,
Dang, V.D., Jaimes, Y., Daridon, C., Li, R., Jouneau, L., Boudinot, P., Wilantri, S., Sakwa,
I., Miyazaki, Y., Leech, M.D., McPherson, R.C., Wirtz, S., Neurath, M., Hoehlig, K., Meinl,
E., Grützkau, A., Grün, J.R., Horn, K., Kühl, A. a, Dörner, T., Bar-Or, A., Kaufmann,
S.H.E., Anderton, S.M., & Fillatreau, S., 2014. IL-35-producing B cells are critical
regulators of immunity during autoimmune and infectious diseases. Nature.
Sherman, L.A. & Chattopadhyay, S., 1993. The molecular basis of allorecognition. Annu. Rev.
Immunol., 11, 385–402.
Shimizu, C., Kawamoto, H., Yamashita, M., Kimura, M., Kondou, E., Kaneko, Y., Okada, S.,
Tokuhisa, T., Yokoyama, M., Taniguchi, M., Katsura, Y., & Nakayama, T., 2001.
Progression of T cell lineage restriction in the earliest subpopulation of murine adult thymus
visualized by the expression of lck proximal promoter activity. Int. Immunol., 13, 105–17.
Shlomchik, M.J. & Weisel, F., 2012. Germinal center selection and the development of memory
B and plasma cells. Immunol. Rev., 247, 52–63.
Smith, M.E., Eller, N.L., McFarland, H.F., Racke, M.K., & Raine, C.S., 1999. Age dependence of
clinical and pathological manifestations of autoimmune demyelination. Implications for
multiple sclerosis. Am. J. Pathol., 155, 1147–61.
Sobel, R. a, 2000. Genetic and epigenetic influence on EAE phenotypes induced with different
encephalitogenic peptides. J. Neuroimmunol., 108, 45–52.
Sobel, R.A. & Kuchroo, V.K., 1992. The immunopathology of acute experimental allergic
encephalomyelitis induced with myelin proteolipid protein. T cell receptors in inflammatory
lesions. J. Immunol., 149, 1444–51.
Sospedra, M. & Martin, R., 2005. Immunology of multiple sclerosis. Annu. Rev. Immunol., 23,
683–747.
Srinivasan, L., Sasaki, Y., Calado, D.P., Zhang, B., Paik, J.H., DePinho, R.A., Kutok, J.L.,
Kearney, J.F., Otipoby, K.L., & Rajewsky, K., 2009. PI3 kinase signals BCR-dependent
mature B cell survival. Cell, 139, 573–86.
Srivastava, B., Quinn, W.J., Hazard, K., Erikson, J., & Allman, D., 2005. Characterization of
marginal zone B cell precursors. J. Exp. Med., 202, 1225–34.
Stadanlick, J.E., Kaileh, M., Karnell, F.G., Scholz, J.L., Miller, J.P., Quinn, W.J., Brezski, R.J.,
Treml, L.S., Jordan, K. a, Monroe, J.G., Sen, R., & Cancro, M.P., 2008. Tonic B cell antigen
191
Literaturverzeichnis
receptor signals supply an NF-kappaB substrate for prosurvival BLyS signaling. Nat.
Immunol., 9, 1379–87.
Stavnezer, J., Guikema, J.E.J., & Schrader, C.E., 2008. Mechanism and regulation of class switch
recombination. Annu. Rev. Immunol., 26, 261–92.
Storch, M.K., Stefferl, A., Brehm, U., Weissert, R., Wallström, E., Kerschensteiner, M., Olsson,
T., Linington, C., & Lassmann, H., 1998. Autoimmunity to myelin oligodendrocyte
glycoprotein in rats mimics the spectrum of multiple sclerosis pathology. Brain Pathol., 8,
681–94.
Stork, B., Engelke, M., Frey, J., Horejsí, V., Hamm-Baarke, A., Schraven, B., Kurosaki, T., &
Wienands, J., 2004. Grb2 and the non-T cell activation linker NTAL constitute a Ca(2+)regulating signal circuit in B lymphocytes. Immunity, 21, 681–91.
Stork, B., Neumann, K., Goldbeck, I., Alers, S., Kähne, T., Naumann, M., Engelke, M., &
Wienands, J., 2007. Subcellular localization of Grb2 by the adaptor protein Dok-3 restricts
the intensity of Ca2+ signaling in B cells. EMBO J., 26, 1140–9.
Strasser, a, Whittingham, S., Vaux, D.L., Bath, M.L., Adams, J.M., Cory, S., & Harris, a W.,
1991. Enforced BCL2 expression in B-lymphoid cells prolongs antibody responses and
elicits autoimmune disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 88, 8661–5.
Stromnes, I.M. & Goverman, J.M., 2006. Active induction of experimental allergic
encephalomyelitis. Nat. Protoc., 1, 1810–9.
Su, K., Yang, H., Li, X., Li, X., Gibson, A.W., Cafardi, J.M., Zhou, T., Edberg, J.C., & Kimberly,
R.P., 2007. Expression profile of FcgammaRIIb on leukocytes and its dysregulation in
systemic lupus erythematosus. J. Immunol., 178, 3272–80.
Su, T.T., Guo, B., Kawakami, Y., Sommer, K., Chae, K., Humphries, L. a, Kato, R.M., Kang, S.,
Patrone, L., Wall, R., Teitell, M., Leitges, M., Kawakami, T., & Rawlings, D.J., 2002. PKCbeta controls I kappa B kinase lipid raft recruitment and activation in response to BCR
signaling. Nat. Immunol., 3, 780–6.
Su, T.T. & Rawlings, D.J., 2002. Transitional B lymphocyte subsets operate as distinct
checkpoints in murine splenic B cell development. J. Immunol., 168, 2101–10.
Sugawara, T., Moriguchi, T., Nishida, E., & Takahama, Y., 1998. Differential roles of ERK and
p38 MAP kinase pathways in positive and negative selection of T lymphocytes. Immunity, 9,
565–74.
Swan, K.A., Alberola-Ila, J., Gross, J.A., Appleby, M.W., Forbush, K.A., Thomas, J.F., &
Perlmutter, R.M., 1995. Involvement of p21ras distinguishes positive and negative selection
in thymocytes. EMBO J., 14, 276–85.
Swat, W., Dessing, M., von Boehmer, H., & Kisielow, P., 1993. CD69 expression during
selection and maturation of CD4+8+ thymocytes. Eur. J. Immunol., 23, 739–46.
Szabo, S.J., Dighe, A.S., Gubler, U., & Murphy, K.M., 1997. Regulation of the interleukin (IL)12R beta 2 subunit expression in developing T helper 1 (Th1) and Th2 cells. J. Exp. Med.,
185, 817–24.
192
Literaturverzeichnis
Szabo, S.J., Sullivan, B.M., Peng, S.L., & Glimcher, L.H., 2003. Molecular mechanisms
regulating Th1 immune responses. Annu. Rev. Immunol., 21, 713–58.
Taghon, T., Yui, M. a, Pant, R., Diamond, R. a, & Rothenberg, E. V, 2006. Developmental and
molecular characterization of emerging beta- and gammadelta-selected pre-T cells in the
adult mouse thymus. Immunity, 24, 53–64.
Takahama, Y., 2006. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and
selection. Nat. Rev. Immunol., 6, 127–35.
Takahama, Y., Ohishi, K., Tokoro, Y., Sugawara, T., Yoshimura, Y., Okabe, M., Kinoshita, T., &
Takeda, J., 1998. Functional competence of T cells in the absence of
glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins caused by T cell-specific disruption of
thePig-agene. Eur. J. Immunol., 28, 2159–2166.
Takahashi, Y., Inamine, A., Hashimoto, S.-I., Haraguchi, S., Yoshioka, E., Kojima, N., Abe, R.,
& Takemori, T., 2005. Novel role of the Ras cascade in memory B cell response. Immunity,
23, 127–38.
Takemori, T., Kaji, T., Takahashi, Y., Shimoda, M., & Rajewsky, K., 2014. Generation of
memory B cells inside and outside germinal centers. Eur. J. Immunol., 44, 1258–64.
Tedder, T.F., Inaoki, M., & Sato, S., 1997. The CD19-CD21 complex regulates signal
transduction thresholds governing humoral immunity and autoimmunity. Immunity, 6, 107–
18.
Teixeira, C., Stang, S.L., Zheng, Y., Beswick, N.S., & Stone, J.C., 2003. Integration of DAG
signaling systems mediated by PKC-dependent phosphorylation of RasGRP3. Blood, 102,
1414–20.
Testi, R., Phillips, J.H., & Lanier, L.L., 1988. Constitutive expression of a phosphorylated
activation antigen (Leu 23) by CD3bright human thymocytes. J. Immunol., 141, 2557–63.
Teuscher, C., Bunn, J.Y., Fillmore, P.D., Butterfield, R.J., Zachary, J.F., & Blankenhorn, E.P.,
2004. Gender, age, and season at immunization uniquely influence the genetic control of
susceptibility to histopathological lesions and clinical signs of experimental allergic
encephalomyelitis: implications for the genetics of multiple sclerosis. Am. J. Pathol., 165,
1593–602.
Tigno-Aranjuez, J.T., Jaini, R., Tuohy, V.K., Lehmann, P. V, & Tary-Lehmann, M., 2009.
Encephalitogenicity of complete Freund’s adjuvant relative to CpG is linked to induction of
Th17 cells. J. Immunol., 183, 5654–61.
Tomayko, M.M., Anderson, S.M., Brayton, C.E., Sadanand, S., Steinel, N.C., Behrens, T.W., &
Shlomchik, M.J., 2008. Systematic comparison of gene expression between murine memory
and naive B cells demonstrates that memory B cells have unique signaling capabilities. J.
Immunol., 181, 27–38.
Tomayko, M.M., Steinel, N.C., Anderson, S.M., & Shlomchik, M.J., 2010. Cutting Edge:
Hierarchy of Maturity of Murine Memory B Cell Subsets. J. Immunol.
193
Literaturverzeichnis
Tompkins, S.M., Padilla, J., Dal Canto, M.C., Ting, J.P.-Y., Van Kaer, L., & Miller, S.D., 2002.
De novo central nervous system processing of myelin antigen is required for the initiation of
experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol., 168, 4173–83.
Trampont, P.C., Tosello-Trampont, A.-C., Shen, Y., Duley, A.K., Sutherland, A.E., Bender, T.P.,
Littman, D.R., & Ravichandran, K.S., 2010. CXCR4 acts as a costimulator during thymic
beta-selection. Nat. Immunol., 11, 162–70.
Tsubata, T., 1999. Co-receptors on B lymphocytes. Curr. Opin. Immunol., 11, 249–55.
Tsunoda, I., Kuang, L.Q., Theil, D.J., & Fujinami, R.S., 2000. Antibody association with a novel
model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsing-remitting and
progressive forms of EAE in H2s mouse strains. Brain Pathol., 10, 402–18.
Tumanov, A., Kuprash, D., Lagarkova, M., Grivennikov, S., Abe, K., Shakhov, A., Drutskaya, L.,
Stewart, C., Chervonsky, A., & Nedospasov, S., 2002. Distinct role of surface lymphotoxin
expressed by B cells in the organization of secondary lymphoid tissues. Immunity, 17, 239–
50.
Turner, M., Mee, P.J., Costello, P.S., Williams, O., Price, A.A., Duddy, L.P., Furlong, M.T.,
Geahlen, R.L., & Tybulewicz, V.L., 1995. Perinatal lethality and blocked B-cell
development in mice lacking the tyrosine kinase Syk. Nature, 378, 298–302.
Tuveson, D.A., Carter, R.H., Soltoff, S.P., & Fearon, D.T., 1993. CD19 of B cells as a surrogate
kinase insert region to bind phosphatidylinositol 3-kinase. Science (80-. )., 260, 986–9.
Vantourout, P. & Hayday, A., 2013. Six-of-the-best: unique contributions of γδ T cells to
immunology. Nat. Rev. Immunol., 13, 88–100.
Veillette, A., Rhee, I., Souza, C.M., & Davidson, D., 2009. PEST family phosphatases in
immunity, autoimmunity, and autoinflammatory disorders. Immunol. Rev., 228, 312–24.
Veldhoen, M., Hocking, R.J., Atkins, C.J., Locksley, R.M., & Stockinger, B., 2006. TGFbeta in
the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17producing T cells. Immunity, 24, 179–89.
Wada, H., Masuda, K., Satoh, R., Kakugawa, K., Ikawa, T., Katsura, Y., & Kawamoto, H., 2008.
Adult T-cell progenitors retain myeloid potential. Nature, 452, 768–72.
Walsh, K.P. & Mills, K.H.G., 2013. Dendritic cells and other innate determinants of T helper cell
polarisation. Trends Immunol., 34, 521–30.
Wang, D., Feng, J., Wen, R., Marine, J.C., Sangster, M.Y., Parganas, E., Hoffmeyer, A., Jackson,
C.W., Cleveland, J.L., Murray, P.J., & Ihle, J.N., 2000. Phospholipase Cgamma2 is essential
in the functions of B cell and several Fc receptors. Immunity, 13, 25–35.
Weisel, F.J., Appelt, U.K., Schneider, A.M., Horlitz, J.U., van Rooijen, N., Korner, H., Mach, M.,
& Winkler, T.H., 2010. Unique requirements for reactivation of virus-specific memory B
lymphocytes. J. Immunol., 185, 4011–21.
Weiss, a & Littman, D.R., 1994. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell, 76,
263–74.
194
Literaturverzeichnis
Wekerle, H., Linnington, H., Lassmann, H., & Meyermann, R., 1986. Cellular immune reactivity
within the CNS. Trends Neurosci., 9, 271–277.
White, H. & Gray, D., 2000. Analysis of Immunoglobulin (Ig) Isotype Diversity and Igm/D
Memory in the Response to Phenyl-Oxazolone. J. Exp. Med., 191, 2209–2220.
White, J., Herman, A., Pullen, A.M., Kubo, R., Kappler, J.W., & Marrack, P., 1989. The V betaspecific superantigen staphylococcal enterotoxin B: stimulation of mature T cells and clonal
deletion in neonatal mice. Cell, 56, 27–35.
Wolfer, A., Wilson, A., Nemir, M., MacDonald, H.R., & Radtke, F., 2002. Inactivation of Notch1
impairs VDJbeta rearrangement and allows pre-TCR-independent survival of early alpha
beta Lineage Thymocytes. Immunity, 16, 869–79.
Wolniak, K.L., Noelle, R.J., & Waldschmidt, T.J., 2006. Characterization of (4-hydroxy-3nitrophenyl)acetyl (NP)-specific germinal center B cells and antigen-binding B220- cells
after primary NP challenge in mice. J. Immunol., 177, 2072–9.
Xiu, Y., Nakamura, K., Abe, M., Li, N., Wen, X.S., Jiang, Y., Zhang, D., Tsurui, H., Matsuoka,
S., Hamano, Y., Fujii, H., Ono, M., Takai, T., Shimokawa, T., Ra, C., Shirai, T., & Hirose,
S., 2002. Transcriptional Regulation of Fcgr2b Gene by Polymorphic Promoter Region and
Its Contribution to Humoral Immune Responses. J. Immunol., 169, 4340–4346.
Xu, S., Tan, J.E., Wong, E.P., Manickam, A., Ponniah, S., & Lam, K.P., 2000. B cell
development and activation defects resulting in xid-like immunodeficiency in BLNK/SLP65-deficient mice. Int. Immunol., 12, 397–404.
Yamane, H. & Paul, W.E., 2013. Early signaling events that underlie fate decisions of naive
CD4(+) T cells toward distinct T-helper cell subsets. Immunol. Rev., 252, 12–23.
Yan, M., Brady, J.R., Chan, B., Lee, W.P., Hsu, B., Harless, S., Cancro, M., Grewal, I.S., & Dixit,
V.M., 2001. Identification of a novel receptor for B lymphocyte stimulator that is mutated in
a mouse strain with severe B cell deficiency. Curr. Biol., 11, 1547–52.
Yang, X.O., Pappu, B.P., Nurieva, R., Akimzhanov, A., Kang, H.S., Chung, Y., Ma, L., Shah, B.,
Panopoulos, A.D., Schluns, K.S., Watowich, S.S., Tian, Q., Jetten, A.M., & Dong, C., 2008.
T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha
and ROR gamma. Immunity, 28, 29–39.
Ye, S.K., Agata, Y., Lee, H.C., Kurooka, H., Kitamura, T., Shimizu, A., Honjo, T., & Ikuta, K.,
2001. The IL-7 receptor controls the accessibility of the TCRgamma locus by Stat5 and
histone acetylation. Immunity, 15, 813–23.
Yefenof, E., Sanders, V.M., Uhr, J.W., & Vitetta, E.S., 1986. In vitro activation of murine
antigen-specific memory B cells by a T-dependent antigen. J. Immunol., 137, 85–90.
Yu, D., Rao, S., Tsai, L.M., Lee, S.K., He, Y., Sutcliffe, E.L., Srivastava, M., Linterman, M.,
Zheng, L., Simpson, N., Ellyard, J.I., Parish, I. a, Ma, C.S., Li, Q.-J., Parish, C.R., Mackay,
C.R., & Vinuesa, C.G., 2009. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper
cell lineage commitment. Immunity, 31, 457–68.
195
Literaturverzeichnis
Zamvil, S., Nelson, P., Trotter, J., Mitchell, D., Knobler, R., Fritz, R., & Steinman, L., 1985. Tcell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and
demyelination. Nature, 317, 355–8.
Zheng, W. & Flavell, R.A., 1997. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for
Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell, 89, 587–96.
Zhou, L., Chong, M.M.W., & Littman, D.R., 2009. Plasticity of CD4+ T cell lineage
differentiation. Immunity, 30, 646–55.
Zhou, L., Ivanov, I.I., Spolski, R., Min, R., Shenderov, K., Egawa, T., Levy, D.E., Leonard, W.J.,
& Littman, D.R., 2007. IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential
engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nat. Immunol., 8, 967–74.
Zhou, L., Lopes, J.E., Chong, M.M.W., Ivanov, I.I., Min, R., Victora, G.D., Shen, Y., Du, J.,
Rubtsov, Y.P., Rudensky, A.Y., Ziegler, S.F., & Littman, D.R., 2008. TGF-beta-induced
Foxp3 inhibits T(H)17 cell differentiation by antagonizing RORgammat function. Nature,
453, 236–40.
Zhu, J., Cote-Sierra, J., Guo, L., & Paul, W.E., 2003. Stat5 activation plays a critical role in Th2
differentiation. Immunity, 19, 739–48.
Zhu, J., Yamane, H., & Paul, W.E., 2010. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*).
Annu. Rev. Immunol., 28, 445–89.
196
Anhang
11 Anhang
11.1 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schema B-Zell Entwicklung und Differenzierung zu Effektorzellen......................................... 5
Abb. 2: Schema T-Zell Entwicklung. .................................................................................................... 13
Abb. 3: T-Helferzell Differenzierung. ................................................................................................... 16
Abb. 4: Aufbau von Grb2 und Bindepartner, mit denen Grb2 in Lymphozyten über seine SH2 und
SH3 Domänen interagiert. ..................................................................................................................... 20
Abb. 5: Grb2 defiziente primäre B-Zellen reagieren weiter auf eine Zytokinbehandlung mit BAFF.
Ihre Überlebensrate ist vergleichbar mit der von primären B-Zellen aus Kontrollmäusen. .................. 31
Abb. 6: Vergleichbare spontane Apoptose- und Überlebensrate nach Überexpression von humanem
Bcl2 in Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen und Kontrollzellen in vitro. ............................................................. 33
Abb. 7: Eine Überexpression des anti-apoptotisch wirkenden humanen Bcl2 Genes in der B-Zell
Entwicklung kann den Verlust von Grb2 in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen nicht kompensieren. ................. 34
Abb. 8: Eine Überexpression des anti-apoptotisch wirkenden humanen Bcl2 Genes in der Peripherie
kann den Verlust von Grb2 in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen nicht kompensieren. ...................................... 36
Abb. 9: Geringere Zahl an B1a B-Zellen im Peritoneum von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen. Eine
Überexpression des anti-apoptotisch wirkenden humanen Bcl2 Genes in Zellen des Peritoneums hat
keinen Einfluss auf die Zahl der B1 B-Zellen. ...................................................................................... 38
Abb. 10: Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäuse weisen im Blut eine reduzierte Zahl an Transitionalen und reifen BZellen auf............................................................................................................................................... 40
Abb. 11: Die Expression des BAFF-Rezeptors ist in den unreifen und reifen Grb2-/- B-Zellen reduziert
und kann nicht durch die Überexpression von humanem Bcl2 kompensiert werden............................ 42
Abb. 12: Strategie zum sortieren von T1, T2 und reifen B-Zellen........................................................ 44
Abb. 13: Transitionale Typ 2 B-Zellen von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen weisen in vitro einen
Differenzierungsblock zu reifen naiven B-Zellen auf. .......................................................................... 46
Abb. 14: Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen zeigen eine verringerte Expression von Genen, die wichtig für das
Überleben und den Zellzyklus sind. ...................................................................................................... 48
Abb. 15: Höheres Ca2+ Signal nach B-Zell Rezeptor Stimulation ab den transitionalen B-Zell
Entwicklungsstadien und funktionelle Ca2+ Inhibition über den FcγR2b in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen. 50
Abb. 16: Höhere Fcγ-RezeptorIIb Expression auf unreifen- und B1 B-Zellen der Milz, sowie auf B2
B-Zellen im Peritoneum. ....................................................................................................................... 53
Abb. 17: Kein Einfluss von Grb2 auf die Hochregulation des FcγR2b in Keimzentrums B-Zellen. .... 54
Abb. 18: Schwächere sekundäre Immunantwort von Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen gegen virusartige Partikel
(VLP) des humanen Cytomegalovirus und reduzierte Gedächtnisantwort von IgG + Grb2fl/fl mb1cre/+ BZellen gegenüber Kontrollzellen. .......................................................................................................... 57
I
Anhang
Abb. 19: Schwächere Gedächtnisantwort von Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen gegen glykoprtein B (gB) des
humanen Zytomegalovirus gegenüber Kontrollzellen. ......................................................................... 59
Abb. 20: Primäre Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen können einen effizienten Klassenwechsel zu IgG1 und
IgG3 vollziehen. .................................................................................................................................... 61
Abb. 21: Stärkere Antwort von primären Grb2fl/fl mb1cre/+ B-Zellen auf TLR7 und TLR Stimulation. 62
Abb. 22: Deletion von Grb2 in Keimzentrums B-Zellen von Grb2fl/fl Cγ1cre/+ Mäusen......................... 64
Abb. 23: Vergleichbare Struktur und Anzahl von Keimzentren, so wie IgG+ Zellen in Grb2fl/fl Cγ1cre/+
Mäusen und Kontrolltieren nach Immunisierung mit Schafserythrozyten. ........................................... 66
Abb. 24: Vergleichbare Zahl von Keimzentrums B-Zellen und follikulären T-Helferzellen in Grb2fl/fl
Cγ1cre/+ und Kontrollmäusen nach Immunisierung mit Schafserythrozyten.......................................... 68
Abb. 25: Keine Veränderung in der Affinitätsreifung von Grb2fl/fl Cγ1cre/+ und Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen
im Vergleich zu Kontrolltieren.............................................................................................................. 69
Abb. 26: Schwächere Gedächtnisantwort von Grb2fl/fl cγ1cre/+ B-Zellen gegen Glykoprotein B (gB) des
humanen Zytomegalovirus verglichen mit Kontrollzellen. ................................................................... 72
Abb. 27: Untersuchung zur Rolle von Grb2 in der Gedächtnisantwort gegen NP-CGG. ..................... 75
Abb. 28: Keine erhöhte Autoimmunität in Grb2fl/fl mb1cre/+ Mäusen. .................................................... 78
Abb. 29: T-Zell spezifische, genetische Depletion von Grb2 im Thymus und in der Peripherie von
Grb2fl/fl Lckcretg Mäusen........................................................................................................................ 79
Abb. 30: Grb2 ist wichtigfür die frühe T-Zell Entwicklung. Dabei führt die Deletion von Grb2 im
doppelt negativen 3 (DN3) Stadium (Lckcre) zu einer stärker beeinträchtigten Entwicklung, als die
Deletion im CD4+CD8+ Stadium. .......................................................................................................... 82
Abb. 31: T-Zell spezifische Grb2 defiziente Mäusen zeigen verringerte T-Zellzahlen im Thymus und
in der Peripherie. Die Deletion von Grb2 ab dem doppelt negativen 3 Stadium (Lckcre) führt zu einer
früheren und ausgeprägteren Reduktion der T-Zellen als eine Deletion ab dem dem CD4+CD8+
Stadium (CD4cre). ................................................................................................................................ 84
Abb. 32: Grb2 Defizienz führt zu mehr aktivierten (CD69+) T-Zellen in der Milz naiver Mäuse. ....... 86
Abb. 33: Der Verlust von Grb2 verschiebt das Verhältnis von naiven zu aktivierten CD4+ T-Zellen in
Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen. Insgesamt weisen beide T-Zell spezifischen Grb2
defizienten Mäuse eine Reduktion der naiven CD4+ T-Zellen auf. Die Deletion von Grb2 ab dem
doppelt negativen 3 Stadium (Lckcre) führt zu reduzierten Zahl an CD4+ Gedächtnis T-Zellen,
wohingegen eine Deletion ab dem CD4+CD8+ Stadium (CD4cre) die Gedächtnis T-Zellzahlen in
naiven Mäusen nicht beeinflusst. .......................................................................................................... 88
Abb. 34: Der Verlust von Grb2 verschiebt das Verhältnis von naiven zu aktivierten CD8 + T-Zellen in
Grb2fl/fl Lckcretg und Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen. Insgesamt weisen beide T-Zell spezifischen Grb2
defizienten Mäuse eine Reduktion der naiven CD8+ T-Zellen auf. Die Deletion von Grb2 ab dem
doppelt negativen 3 Stadium (Lckcre) führt zu Beeinträchtigungen bei den CD8+ Gedächtnis T-Zellen,
II
Anhang
wohingegen eine Deletion ab dem CD4+CD8+ Stadium (CD4cre) die CD8+ Gedächtnis T-Zellzahlen in
naiven Mäusen nicht beeinflusst. .......................................................................................................... 89
Abb. 35: Das Calciumsignal in CD4+CD8+ T-Zellen wird durch Grb2 inhibiert, während es in CD4+
bzw. CD8+ einzel positiven Zellen nicht beeinflusst ist. ...................................................................... 91
Abb. 36: Die Zahl der γδ T-Zellen in der Peripherie und tendenziell im Thymus ist in T-Zell
spezifischen Grb2 defizienten Tieren erhöht. ........................................................................................ 93
Abb. 37: Naive CD4+ Zellen von T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen zeigen in vitro ein
verringertes Potential sich zu TH17 und TH2 Zellen zu differenzieren aber das Potential sich zu T-regZellen zu differenzieren ist erhöht......................................................................................................... 96
Abb. 38: In naiven T-Zell spezifisch Grb2 defizienten Mäusen (Grb2fl/fl Lcktg und Grb2fl/fl CD4cretg) ist
der Anteil der TH1-Zellen an den CD4+ T-Zellen erhöht. Wird Grb2 ab dem Übergang vom doppelt
negativen 2 zum doppelt negativen 3 Stadium deletiert (Lckcre) ist auch der Anteil der T H2, TH17 und
T-reg Zellen an den CD4+ T-Zellen tendenziell erhöht. ........................................................................ 98
Abb. 39: T-Zell spezifische Grb2 defiziente Mäuse entwickeln eine schwächere experimentelle
autoimmune Enzephalomyelitis ............................................................................................................ 99
Abb.40: Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse weisen an Tag 17 und Tag 30 nach Induktion einer experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis anders als naive Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse keine reduzierten TZellzahlen mehr auf. Auch die Zahl naiver T-Zellen, die in naive Grb2fl/fl CD4cretg Mäuse reduziert ist
wurde im Verlauf der EAE ausgeglichen. Zudem normalisierte sich das Verhältnis von naiven TZellen T-Effektorzellen, das in naiven Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen verändert ist.................................. 102
Abb. 41: Erhöhte Zahl an Plasmablasten zum Höhepunkt der experimentellen autoimmunen
Enzephalomyelitis in T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen. ................................................. 103
Abb. 42: Anteilig weniger regulatorische T-Zellen an den CD4+ Grb2-/- T-Zellen und erhöhte
Aktivierbarkeit der CD4+ Grb2-/- T-Zellen über PMA und Ionomycin zum Höhepunkt der
experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis.............................................................................. 106
Abb. 43: An Tag 30 der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in vitro mit MOG-Peptid
reaktivierte Milzzellen aus T-Zell spezifischen Grb2 defizienten Mäusen sekretieren weniger IL-17A,
IL-2 und TNF. ..................................................................................................................................... 108
Abb. 44:Grb2 defiziente CD4+ T-Zellen können im gemischten Lymphozytenversuch weniger
effizient durch alloreaktive dendritische Zellen aktiviert werden als CD4+ T-Zellen aus Kontrolltieren.
Umgekehrt können dendritische Zellen aus Grb2fl/fl CD4cretg Mäusen alloreaktive T-Zellen genauso
gut stimulieren, wie alloreaktive T-Zellen aus Kontrolltieren. ........................................................... 109
III
Anhang
11.2 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Absolute Zellzahlen für verschiedene Lymphozytenpopulationen von Grb2fl/fl mb1+/+, Grb2fl/fl
mb1cre/+, Grb2fl/fl mb1+/+ Bcl2tg und Grb2fl/fl mb1cre/+ Bcl2tg Mäusen. ..................................................... 39
Tab. 2: Antikörper Durchflusszytometrie und Streptavidinkonjugate ................................................ 134
Tab. 3: Antikörper ELISA ................................................................................................................... 134
Tab. 4: Antikörper für magnetische Zellseperation ............................................................................. 134
Tab. 5: Antikörper für komplement vermittelte Depletion ................................................................. 134
Tab. 6: Antikörper Western-Blot......................................................................................................... 134
Tab. 7: Chemikalien und Labormaterialien ......................................................................................... 136
Tab. 8: Computerprogramme .............................................................................................................. 136
Tab. 9: Geräte ...................................................................................................................................... 137
Tab. 10: Kommerzielle Kits ................................................................................................................ 137
Tab. 11: Lösungen, Medien und Puffer ............................................................................................... 141
Tab. 12: Stimulanzien / Antigene / Immunisierungszusätze ............................................................... 142
Tab. 13: Zytokine ................................................................................................................................ 142
Tab. 14: Stimulationsansätze für die Differenzierung von TH1, TH2, T-reg und TH17 Zellen aus naiven
CD4+CD62L+ T-Zellen........................................................................................................................ 167
IV
Anhang
11.3 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
°C
A
Abb.
AG
ANA
AP
APS
BAFF (BLyS)
BAFFR
BCIP
Bcl2
Bcl6
bio
bp
BSA
BTE
Btk
BZR
bzw.
C
Ca.
ca.
CBA
CD
cDNA
CFA
CGG
cpm
CRAC
cy
DAG
DAPI
DAPI
DNA
dNTP
dsDNA
DTT
EAE
ECL
EDTA
ELISA
ELISPOT
Bedeutung
Grad Celsius
Adenin
Abbildung
Arbeitsgruppe
anti-nukleäre Antikörper
Alkalische Phosphatase
Ammoniumperoxodisulfat
B cell activating factor of the TNF family
B cell activating factor of the TNF family receptor
5-Brom-4-chlor-3-Indoxylphosphat
B-cell lymphoma 2
B-cell lymphoma-6
Biotin
Basenpaar
bovine serum albumin
Biotechnologisches Entwicklungslabor
Bruton´s Tyrosin-Kinase
B-Zell-Rezeptor
Beziehungsweise
Cytosin
circa
circa
Cytometric Bead Array
Cluster of differentiaton
Copy desoxyribonucleic acid
komplettes Freund-Adjuvans
Chicken Gamma Globulin
Ereignisse pro Minute
calcium release activated calcium
Cychrome
Diacylglycerol
4´,6-Diamin-2-phenylindol
4´,6-Diamin-2-phenylindol
deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
Desoxyribonukleotid-triphosphat
double stranded deoxyribonucleic acid
Dithiotreitol
Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
enhanced chemiluminescens
Ethylendiamintetraacetat
enzyme-linked immunosorbent assay
enzyme-linked immuno-spot
V
Anhang
ER
ERK
et al.
Fc
FCS
FITC
FSC
G
G
gB
GRB2
h
H
H+L
HRP
HSA (CD24)
i. p.
i.p.
i.v
Ig
IL
IP3
ITT
JNK
ko
l
Lck
LPS
M
M
MACS
MAPK
Mef2c
mg
MHC
min
ml
MOG
MZ
NEAA
NF-κB
NP
NP
PBS
PCR
PCR
PE
VI
Endoplasmatisches Riticulum
extracellular signal regulated kinase
et alii/alia
fragment crystallisable
fötales Kälberserum
Fluorescein isothiocyanate
Forward Scatter
Ziege(goat)
Guanin
Glykoprotein B des humanen Zytomegalievirus
Growth factor receptor-bound protein 2
Stunde (hour)
armenischer Hamster
heavy and light chain
horse raddish peroxidase
heat stable antigen
intra peritoneal
intraperitoneal
intravenös
Immunglobulin
Interleukin
inositol 1, 4, 5 triphosphate
immunoglobulin tail tyrosine
Jun N-terminal kinase
knockout
Liter
lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
Lipopolysaccharid
Maus
Molar
Magnetische Zellseperation
mitogen activated protein kinase
myocyte enhancer factor-2C
Milligramm
major histocompatibility complex
Minute
Milliliter
Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
Marginalzone
non essential amino acids
nuclear factor κB
4-Hydroxy-3-nitrophenyl
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl Hapten
phosphate buffered saline
Polymerase Kettenreaktion
Polymerase-Kettenreaktion (polymererase chain reaction)
Phycoerythrin
Anhang
Pen
pH
PIP3
PLC
PNA
qRT-PCR
R
Ra
RNA
rpm
RPMI
RT
RT
s.c.
SDS
sek.
sek.
SH3
SH3
SLP-65
ssDNA
Strep
Syk
T
T1
T2
Tab.
Tab.
Taq
TEMED
TLR
TNF
Tris
UNLB
V
v/v
VLP
w/v
wt
z. B.
μg
μl
Penicillin
pondus hidrogenii
phosphatidylinositol-(3,4,5)-triphosphate
Phospholipase C
Peanut Agglutinin
Realtime-quantitative Polymerase-Kettenreaktion
Kaninchen (rabbit)
Ratte
ribonucleic acid
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
Roswell Park Memorial Institute (Medium)
Raumtemperatur
Raumtemperatur
subkutan
Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
Sekunde
Sekunde
Src homology 2
Src homology 3
SH2 domain–containing leukocyte protein of 65 kD
single stranded deoxyribonucleic acid
Streptavidin
spleen tyrosine kinase
Thymin
Transitionale Typ 1
Transitionale Typ 2
Tabelle
Tabelle
Thermus aquaticus
Tetramethylethylendiamin
toll like receptor
Tumor-Nekrose-Faktor (tumor necrosis factor)
Trishydromethylaminomethan
unmarkiert (unlabeled)
Volt
Volumen/Volumen (volume / volume)
Virusartige Partikel (virus like particle)
Gewicht / Volumen (weight/volume)
wildtyp
zum Beispiel
Mikrogramm
Mikroliter
VII
Danksagung
12 Danksagung
Besonders möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Lars Nitschke für die Bereitstellung des
vielseitigen und interessanten Themas bedanken. Außerdem danke ich ihm dafür, dass er mir die
Teilnahme am Graduiertenkolleg des TRR-130 und an zahlreichen nationalen, sowie internationalen
Kongressen ermöglicht hat.
Weiter möchte ich Prof. David Vöhringer für die Erstellung des Zweitgutachtens und für nützliche
Vorschläge und Diskussionen, so wie die Bereistellung von Mäusen danken.
Prof. Dr. Thomas Winkler und Prof. Dr. Alexander Steinkasserer danke ich für die Bereitschaft, mich
bei der Verteidigung meiner Dissertation zu prüfen und für hilfreiche Diskussionen und Gespräche.
Bei Dr. Jochen Ackermann bedanke ich mich herzlich für die Einarbeitung, die Übergabe des Grb2
Projektes und seine lockere offene Art.
Ich möchte mich bei meinen Kooperationspartnern Prof. Dr. Thomas Winkler, Dr. Elisabeth Zinser,
Prof. Dr. Jürgen Wienands, Dr. Niklas Engels, Dr. Lars König, Prof. Dr. Becker, Dr. Moritz Leppkes
und Prof. Dr. Alexander Steinkasserer für spannende Projekte und die problemlose Zusammenarbeit
bedanken.
Bei Prof. Dr. Robert Slany, Lisa Füller, Prof. Dr. Falk Nimmerjahn, Heike Danzer, Katharina Gerlach,
Martina Seefried, Dr. Adriana Neves, Prof. Dr. Dr. Andre Gessner, Dr. Selina Sitte und Prof. Dr.
Brandstätter möchte ich mich für die Bereitstellung von Geräten, Labormaterial, Antikörpern, Zellen,
durchgeführte Versuche und das Beibringen neuer Methoden herzlich bedanken.
Danken möchte ich auch den Tierpflegern für ihre zuverlässige Arbeit mit den Mäusen.
Weiter möchte ich mich bei allen Mitgliedern des Lehrstuhls für Genetik für das gute Arbeitsklima
und die interessanten Seminare bedanken.
VIII
Danksagung
Ein ganz besonderer Dank gilt allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der AG Nitschke.
Sieglinde Angermüller und Anne Urbat danke ich für die optimale technische Unterstützung.
Den ehemaligen Bachelor- und Masterstudenten Anna Maurberger, Sonja Lacher, Christina Forsch,
Alisa und Felix Hartmann möchte ich für die tatkräftige Unterstützung bei meinen Versuchen danken.
Sieglinde Angermüller, Dr. Stefan Hutzler und Dr. Jochen Ackermann danke ich für die gute
Atmosphäre in unserem kleinen Labor.
Dr. Jenniffer Müller, Dr. Julia Jellusova, Nina Weidner, Dr. Susanne Bökers, Lamia Özgör, Heike
Schmitt, Dr. Miriam Wöhner, Dr. Astrid Elter und Ingrid Obermeier danke ich für ihre
Hilfsbereitschaft und die nicht immer wissenschaftlichen Gespräche.
Nicht zu vergessen Julia Koch, Dr. Carolin Brandl, Hannah Seifried und Sarah Mrotzek, die auch für
eine lebendige AG sorgen. Insgesamt war es eine schöne Zeit zu der besonders die zahlreichen
Aktivitäten wie Ski- und Wanderausflüge beitrugen.
Ich danke meiner Freundin und meiner Familie, die mich immer unterstützen.
IX
Publikationsliste
13 Publikationsliste
Ackermann, J.A., Radtke, D., Maurberger, A., Winkler, T.H., & Nitschke, L., 2011. Grb2 regulates B-cell
maturation, B-cell memory responses and inhibits B-cell Ca2+ signalling. EMBO J., 30, 1621–33.
Dütting, S., Vögtle, T., Morowski, M., Schiessl, S., Schäfer, C.M., Watson, S.K., Hughes, C.E.,
Ackermann, J.A, Radtke, D., Hermanns, H.M., Watson, S.P., Nitschke, L., & Nieswandt, B., 2014.
Growth factor receptor-bound protein 2 contributes to (hem)immunoreceptor tyrosine-based
activation motif-mediated signaling in platelets. Circ. Res., 114, 444–53.
Engels, N., König, L.M., Schulze, W., Radtke, D., Vanshylla, K., Lutz, J., Winkler, T.H., Nitschke, L., &
Wienands, J., 2014. The immunoglobulin tail tyrosine motif upgrades memory-type BCRs by
incorporating a Grb2-Btk signaling module. Nat. Commun., in press.
Radtke, D., Ackermann, J.A., & Nitschke, L., Grb2 regulates the development of immature transitional
to mature B cells. J. Immunol. , submitted.
X