Industrie-Applikationen

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Peptid-Arrays für die Charakterisierung von
Antikörper- und Protein-Bindungen
Ole Brandt und Heinrich Gausepohl
INTAVIS Bioanalytical Instruments AG, Köln
왘 Arrays mit Hunderten unterschiedlicher Peptide auf deren
Oberfläche können helfen, eine
Vielzahl immunologischer und
biochemischer Fragestellungen
zu beantworten. Anwendungen
von Peptid-Arrays sind unter anderem die Charakterisierung von
Antikörpern, Protein-Bindungsdomänen oder Kinasen, die eine
entscheidende Rolle bei der Regulierung der Signaltransduktion in Zellen spielen. Mini- und
Mikro-Arrays haben dabei den
großen Vorteil der parallelen
Analyse einer Probe gegen eine
Vielzahl an Substraten auf der
Oberfläche des Arrays, bei einem gleichzeitig geringen Verbrauch an Probenmaterial. Mit
identischen Kopien eines Arrays
können so auf effiziente Weise
mehrere Kinasen oder Antikörper gegen die gleichen PeptidSubstrate getestet werden.
Bindungsstudien auf PeptidArrays
Protein-Protein- oder Antikörper-Protein-Interaktionen liegen
zumeist definierte Peptid-Sequenzen als Erkennungsmotive
zugrunde. Diese Sequenzen haben bei Antikörpern aber auch
bei einigen Protein-Domänen
oft nur eine Länge von wenigen
Aminosäuren (ca. 4–15). Für viele Protein-Kinasen können inzwischen Konsensussequenzen
angegeben werden, die von den
entsprechenden Kinasen erkannt und phosphoryliert werden. So werden z. B. von der Proteinkinase B (PKB) Proteine mit
dem Motiv RXRXX(S/T)X erkannt[1]. Neben den Kinasen
spielen eine Vielzahl an ProteinDomänen wie SH2, SH3 oder
WW – um nur einige zu nennen
– bei der Zellregulation eine entscheidende Rolle[2]. Aufgrund
der großen Zahl noch nicht charakterisierter Antikörper, Bindungsdomänen und Kinasen ist
BIOspektrum · 2/06 · 12. Jahrgang
den nun Antikörper, die zuvor
gegen das entsprechende Protein generiert wurden, an unterschiedliche Epitope, so können
diese mit großer Wahrscheinlichkeit für einen Sandwich-Assay verwendet werden (Abb. 1).
Für die Charakterisierung der
Bindungsstellen von Proteinen
oder Antikörpern können Bibliotheken mit variierenden Bindungsmotiven hergestellt werden, die es anschließend ermöglichen, Aussagen über Vorhandensein und Intensität von
Interaktionen auf dem Array zu
treffen.
Neues Peptid-Array-Format
Abb. 1: Schematische Abbildung von überlappenden Peptiden einer Proteinsequenz zum Epitop-Mapping von Antikörpern.
noch einiger wissenschaftlicher
Einsatz zur Aufklärung von Bindungsmotiven notwendig. Einen Beitrag hierzu können Peptid-Bibliotheken mit Motivvariationen leisten, die sich besonders gut für eine genaue Charakterisierung von Antikörpern,
Kinasen oder anderen Proteinen
eignen.
Spezifische Antikörper, die
das jeweilige Antigen möglichst
selektiv erkennen, werden für
ELISA-Assays, Antikörper-Arrays, die Detektion von Phosphorylierungen oder Lokalisierungsstudien von Proteinen in
Zellen benötigt. Für SandwichELISA kommen sogar zwei
Antikörper zum Einsatz, die an
unterschiedliche Epitope des
gleichen Proteins binden. Solche
Antikörper-Paare bieten, da zwei
Bindungsstellen eines Proteins
erkannt werden müssen, eine
wesentlich höhere Spezifität als
einzelne Antikörper[3].
Design von Peptid-Arrays
Peptid-Bibliotheken für Arrays
können entsprechend der Fragestellung synthetisiert werden.
So können für die Auswahl von
Antikörper-Paaren gegen ein definiertes Protein überlappende
Peptide der entsprechenden Sequenz synthetisiert werden. Bin-
Wir zeigen hier exemplarisch die
Anwendung eines neuen Peptid-Array-Formats[4] anhand einer Bindungsstudie von Streptavidin an eine Peptid-Bibliothek mit Histidin-Prolin(HP)Motiven. Für die Herstellung
der Arrays wurden Peptide vollautomatisch mit dem MultiPep
Synthesizer auf modifizierten
Cellulose-Scheibchen synthetisiert. Die modifizierte Cellulose
mit den kovalent gebundenen
Peptiden kann anschließend
aufgelöst und auf unterschiedliche Oberflächen gespottet werden, sodass aus einer Synthese
eine beliebige Anzahl an PeptidArrays hergestellt werden kann.
Dieses unterscheidet die neue
Methode von der SPOT-Methode[5], bei der die Peptide auf einer Membran synthetisiert werden, die anschließend direkt für
den jeweiligen Assay eingesetzt
wird. Nach dem Spotten der aufgelösten Scheibchen bildet sich
eine dreidimensionale Schicht
Abb. 2: Peptid-Array mit HP-Motiven für Streptavidin-Bindungsstudien. Innerhalb der Farbmarkierung (rote Spots)
wurden drei Blöcke einer Peptid-Bibliothek in jeweils vier Reihen gespottet. In jeder Reihe wurden von links nach
rechts folgende Peptide auf einen Objektträger gespottet: Biotin-(A)8, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Nano-Tag, 19 Peptide
und Biotin-(A)8. Die 19 Peptide in Reihe 1: AAAHP*AAA, Reihe 2: AAAHPQ*AA, Reihe 3: AA*HPQFAA und Reihe 4:
AA*HPQNAA (* = alle Aminosäuren ohne Cystein). Die Auswertung der ersten Reihe ergab die stärkste Bindung von
Streptavidin an das Peptid mit HPQ, gefolgt von HPM und HPF.
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aus Peptid-Cellulose-Konjugaten auf der Oberfläche aus. Neben gewöhnlichen Glas-Objektträgern können Objektträger mit
weißer Kunststoffbeschichtung
verwendet werden, sodass Fluoreszenzdetektion, Autoradiographie aber auch gängige Farbumsetzungen mit Alkalischer
Phosphatase (AP) oder Peroxidase (HRP) zur Analyse möglich
sind. Die letzteren Detektionsverfahren ermöglichen es, die
Analysen ohne teure Laserscanner nur mit einem gewöhnlichen
Flachbettscanner
durchzuführen. Neben der Menge der
aufgebrachten Peptid-Konjugate kann auch der Spot-Durchmesser und somit die Anzahl der
Spots pro Fläche angepasst werden. Ein Vorteil gegenüber konventionell hergestellten PeptidArrays ist die höhere Beladung
an Peptiden auf der Oberfläche,
die es ermöglichen sollte, auch
noch niedrig affine Bindungen
zu detektieren.
Bindungsstudie am Beispiel von
Streptavidin
Der hier gezeigte Array (Abb. 2)
besteht aus drei Blöcken, die in
Farbmarkierungen (rote Spots)
eingeschlossen sind. Jede Reihe
besteht aus vier Kontrollen, 19
Peptiden mit Sequenzvariationen und schließlich einer weiteren Kontrolle. Die Peptid-Cellulose-Konjugate wurden auf
Objektträger mit weißer Beschichtung aufgetragen. Nach
dem Blocken der Oberfläche
wurde der Array mit Streptavidin-AP-Konjugat inkubiert, gewaschen und die Umsetzung
von AP-Substrat (NBT/BCIP)
beobachtet. Der Array wurde mit
einem gewöhnlichen Flachbettscanner eingescannt und die Intensitäten ausgewertet. Für die
Peptide mit fixem HP-Motiv
und einer veränderten Aminosäure wurden HPQ und HPM
als die beiden stärksten Binder
ermittelt (Abb. 2). Eine stärkere
Bindung ergab sich für vier
(HPQF und HPQN) und mehr
Aminosäuren.
Als ein weiteres Beispiel wurde ein Array mit Phospho-Peptiden mit einem Phospho-Serinspezifischen Antikörper inku-
Messung der durch MicroRNAsvermittelten Regulation der
Genexpression
Sabine Moter1, Mark Springer2
Abb. 3: Bindungstest eines
Phospho-Serin-spezifischen Antikörpers gegen eine Peptid-Bibliothek, bestehend aus 288 Sequenzvariationen. Stärkste Bindung wird
bei einer Peptid-Sequenz mit X-TpS-X-Motiv (T = Threonin, pS =
Phospho-Serin, X = Gemisch aller
Aminosäuren) beobachtet. Detektiert wurde mit einem Sekundärantikörper (Alkalische Phosphatase
Konjugat).
biert und mittels Sekundärantikörper detektiert (Abb. 3).
Zusammenfassung
Die hier verwendeten Arrays
bieten die Möglichkeit, Interaktionen von Antikörpern, Proteinen und anderen Bindungspartnern an Peptiden zu analysieren.
Sie ermöglichen ein paralleles
Screening auf identischen Kopien eines Arrays, der mit den gängigsten Detektionsverfahren
analysiert werden kann.
Literatur
[1] Alessi, D. R., et al. (1996): Molecular
basis for the substrate specificity of protein kinase B; comparison with MAPKAP
kinase-1 and p70 S6 kinase. FEBS Lett.
399(3): 333–338.
[2] Pawson, T., and Nash, P. (2003):
Assembly of cell regulatory systems
through protein interaction domains.
Science 300: 445–452.
[3] MacBeath, G. (2002): Protein microarrays and proteomics. Nat Genet. 32:
Suppl. 526–532.
[4] Frank, R., et al. (2004): Patent applied for.
[5] Frank, R., et al. (2002): The SPOTsynthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports – principles
and applications. J. Immunol. Methods
267: 13–26.
Korrespondenzadresse:
Dr. Ole Brandt
INTAVIS AG
Im Neuenheimer Feld 583
D-69120 Heidelberg
Tel.: 06221-6582 553
Fax: 06221-6582 554
[email protected]
1Applied
Biosystems, Darmstadt, 2Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA
왘 Kleine
nicht-kodierende
RNAs, so genannte small noncoding-RNAs (sRNAs), spielen
eine wichtige Rolle bei der Genregulation, indem sie die Hemmung (Repression), das Ausschalten (Gene Silencing) oder
die Verstärkung (Enhancing) der
Genexpression vermitteln. Die
MicroRNAs (miRNAs), eine
Unterklasse der sRNAs, sind regulatorische Moleküle, welche
die Aktivität von Genen z. B..
während der Zelldifferenzierung
und Embryonalentwicklung
kontrollieren. Reife miRNAMoleküle mit einer Länge von
18–25 Nukleotiden gehen aus
einem längeren Vorläufermolekül (Precursor) hervor, welches
eine Haarnadelstruktur bildet.
Mittels der in letzter Zeit entwickelten Real-Time-PCR-Assays ist es möglich geworden, reife miRNAs in unterschiedlichen
Zelltypen nachzuweisen und zu
quantifizieren.
Entdeckung der MicroRNAs
1993 wurde ein Artikel über die
Embryonalentwicklung des Fadenwurms Caenorhabditis elegans
veröffentlicht[1], in dem die
Funktion des Gens für eine kleine non-coding-RNA namens
lin4 zum ersten Mal beschrieben
wurde. Lin4 war das erste bekannte Gen einer neuen Klasse
regulatorischer RNAs, die später
MicroRNAs genannt wurden.
Das lin4-Gen kodiert ein 22 Nukleotide langes RNA-Molekül,
das die Translation einer mRNA
in Proteine unterdrückt, die den
zeitlichen Verlauf der postembryonalen Entwicklung von C.
elegans steuern. In der Folge dieser Entdeckung wurden zahlreiche miRNAs in den Genomen
fast aller multizellulären Organismen gefunden. Die nächste
Aufgabe ist nun, die Targets all
dieser miRNAs in vivo zu identifizieren und die Bedeutung der
regulatorischen Aktivität der
miRNAs in zentralen biologischen Prozessen zu entschlüsseln.
Small non-coding-RNAs
Anfänglich wurden miRNAs aus
solchen Regionen des Genoms
isoliert, die auch als „Junk“DNA bezeichnet werden, da sie
nicht für Proteine kodieren. Zu
der Klasse der nicht-kodierenden RNAs gehören neben den
miRNAs small interfering-RNAs
(siRNAs) und short hairpinRNAs (shRNAs). Der Prozess
der RNA-Interferenz wurde
1989 von Mello und Fire[2] beschrieben. Hierbei vermitteln
doppelsträngige RNA-Moleküle
das „Silencing“ homologer Gene durch eine Antisense-Basenpaarung. MicroRNAs unterscheiden sich von anderen Angehörigen der sRNA-Familie in
ihrer Wirkungsweise und in den
RNA-Molekülen, mit denen sie
interagieren. In tierischen Organismen wirken miRNAs häufig
durch Repression der Translation des Ziel-mRNA-Moleküls. In
der Taufliege Drosophila melanogaster entzifferten Genetiker die
Rolle von miRNAs bei der Zellproliferation und dem Zelltod
während der Entwicklung[3],
und in C. elegans wurde eine Beteiligung bei der Regulation der
zeitlichen Abfolge von Entwicklungsprozessen nachgewiesen[3, 4].
Real-Time-PCR-Assays zur
Quantifizierung von MicroRNAs
Die Aufklärung der Rolle, die
miRNAs in biologischen Prozessen wahrnehmen, wird durch
BIOspektrum · 2/06 · 12. Jahrgang