Dokument_4.

Die Rolle von NFATc1 und IL-17A in der
T-Zell-spezifischen Immunregulation beim
metastatischen Melanom und Lungenkarzinom
Der naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr.rer.nat.
vorgelegt von
Sarah Reppert
aus Hildesheim
Als Dissertation genehmigt von der
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 11.03.2013
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Johannes Barth
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Falk Nimmerjahn
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Hans-Martin Jäck
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................... 1
2
SUMMARY......................................................................................... 5
3
EINLEITUNG .................................................................................... 7
3.1
Das Immunsystem und die T-Zell-Aktivierung ......................................................... 7
3.2
Krebs.............................................................................................................................. 8
3.2.1
Krebsentstehung ......................................................................................................... 8
3.2.2
Metastasierung............................................................................................................ 9
3.2.3
Lungenkrebs ............................................................................................................. 10
3.2.4
Malignes Melanom................................................................................................... 11
3.2.5
Mausmodelle für Lungenkarzinom und metastatisches Melanom........................... 13
3.2.6
Tumorimmunologie.................................................................................................. 14
3.2.6.1
3.2.6.1.1
Th1-Zellen .................................................................................................. 16
3.2.6.1.2
Th17-Zellen und der IL-17-Signalweg ...................................................... 17
3.2.6.1.3
Regulatorische T-Zellen ............................................................................. 21
3.2.6.2
3.3
CD4+ T-Zellen .................................................................................................. 16
CD8+ T-Zellen.................................................................................................. 21
Nuclear factor of activated T-cells (NFAT).............................................................. 22
3.3.1
Aufbau der NFAT-Proteine...................................................................................... 22
3.3.2
NFAT: Aktivierung und Regulation......................................................................... 23
3.3.3
NFAT-Proteine in der Onkogenese.......................................................................... 24
3.3.4
NFAT-Proteine im hämatopoetischen System ......................................................... 24
3.3.5
NFAT-Inhibitoren .................................................................................................... 26
4
FRAGESTELLUNG DER ARBEIT .............................................. 27
5
ERGEBNISSE .................................................................................. 29
5.1
NFATc1 in Immunreaktionen bei Lungenkrebs und metastatischen Melanom .. 29
5.1.1
NFATc1-Expression bei Lungenkrebs ..................................................................... 30
5.1.2
Maus-Modelle für Lungenkarzinom und metastatisches Melanom in konditionalen
NFATc1-defizienten Mäusen ................................................................................... 31
5.1.2.1
NFATc1-Defizienz in CD4-exprimierenden Zellen hat keinen Einfluss auf das
Wachstum von B16F10-induzierten Melanom-Metastasen in der Lunge ....... 33
II
5.2
5.1.2.2
Unverändertes Wachstum von Lewis-Lung-Karzinomen in der Lunge von
konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen .................................................... 34
5.1.2.3
Proliferationsdefekte in NFATc1-defizienten CD4+ und CD8+ T-Zellen........ 36
5.1.2.4
Reduzierte Anzahl an regulatorische T-Zellen in konditionalen
NFATc1-defizienten Mäusen ........................................................................... 37
5.1.2.5
Erhöhte Anzahl an NK-Zellen in konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen
.......................................................................................................................... 38
5.1.2.6
Veränderte Genexpression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen................ 39
Analyse der mRNA-Expression anti-inflammatorischer Proteine ............. 40
5.1.2.6.2
Analyse der mRNA-Expression pro-inflammatorischer Proteine.............. 46
Defekte in der T-Zell-Differenzierung in NFATc1-defizienten Zellen .................. 53
5.2.1
Fehlerhafte Th17-Differenzierung in NFATc1-defizienten CD4+ T-Zellen ............ 53
5.2.2
NFATc1 ist nicht essentiell für die Th1-Differenzierung ........................................ 56
5.2.3
Unveränderte Differenzierung CD4+ regulatorischer T-Zellen in Abwesenheit von
NFATc1.................................................................................................................... 58
5.2.4
Fehlerhafte Tc1-Differenzierung in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen .............. 60
5.2.5
Defekte in der Tc17-Differenzierung in Abwesenheit von NFATc1....................... 62
5.3
Die Rolle von IL-17A bei Lungenkrebs .................................................................... 65
5.3.1
Inverse Korrelation zwischen IL-17A und T-bet bei Lungenkrebs ......................... 65
5.3.2
T-bet spielt eine wichtige Rolle in der anti-Tumor Immunantwort bei
Lungenkarzinomen................................................................................................... 66
5.3.3
T-bet unterdrückt den IL-17-Signalweg durch Inhibition des IL-17-Rezeptors ...... 67
5.3.4
IL-17A fördert in Lungenkarzinom-Zellen die Sekretion von IL-6......................... 70
6
DISKUSSION ................................................................................... 73
6.1
NFATc1 ist involviert in regulatorische Funktionen und Effektorfunktionen bei
Tumor .......................................................................................................................... 73
6.1.1
Regulatorische Funktionen....................................................................................... 76
6.1.2
Effektorfunktionen ................................................................................................... 79
6.2
NFATc1 ist beteiligt an der T-Zell-Differenzierung................................................ 82
6.2.1
Typ1 T-Lymphozyten............................................................................................... 82
6.2.2
Typ17 T-Lymphozyten............................................................................................. 83
6.2.3
Regulatorische T-Zellen ........................................................................................... 84
6.3
7
5.1.2.6.1
Die Rolle von IL-17A bei Lungenkrebs .................................................................... 86
MATERIAL UND METHODEN ................................................... 91
III
7.1
Material ....................................................................................................................... 91
7.1.1
Geräte und Verbrauchsmaterialien ........................................................................... 91
7.1.2
Chemikalien und Reagenzien................................................................................... 93
7.1.3
Primer ....................................................................................................................... 96
7.1.4
Puffer ........................................................................................................................ 98
7.1.5
Zelllinien und humane Gewebeproben..................................................................... 99
7.2
Methoden................................................................................................................... 101
7.2.1
Versuchstiere und Genotypisierung ....................................................................... 101
7.2.2
Induktion des Tumorwachtums .............................................................................. 102
7.2.3
Anti-IL-17A Antikörper-Behandlung im L1C2 Tumormodell .............................. 102
7.2.4
Organpräparation.................................................................................................... 103
7.2.5
Bestimmung der Tumormasse................................................................................ 103
7.2.6
Zellisolation............................................................................................................ 104
7.2.7
Magnetische Zellseparation.................................................................................... 104
7.2.8
Zellkultur primärer T-Zellen .................................................................................. 105
7.2.8.1
CD8+ und CD4+ Kultivierung ........................................................................ 105
7.2.8.2
T-Zell Differenzierung ................................................................................... 106
7.2.9
Zellkultur der L1C2 Tumorzellen .......................................................................... 108
7.2.10 Durchflusszytometrie ............................................................................................. 108
7.2.11 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ................................................... 110
7.2.12 RNA-Isolation ........................................................................................................ 111
7.2.13 Microarray .............................................................................................................. 111
7.2.14 cDNA-Synthese...................................................................................................... 112
7.2.15 qPCR ...................................................................................................................... 112
7.2.16 Statistik................................................................................................................... 114
8
LITERATURVERZEICHNIS...................................................... 115
9
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................... 133
10
TABELLENVERZEICHNIS........................................................ 135
11
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................. 137
12
EIGENE PUBLIKATIONEN ....................................................... 141
13
DANKSAGUNG ............................................................................. 143
1
1 Zusammenfassung
Weltweit sind Krebserkrankungen mit hohen Mortalitätsraten verbunden. Bisher gibt es keine
ausreichenden Therapiemöglichkeiten. Je nach Art des Tumors beinhaltet die Behandlung
meist die operative Entfernung des betroffenen Gewebes, sowie eine Chemotherapie oder
Bestrahlung. Die Mechanismen zur Bekämpfung von Tumoren durch das Immunsystems sind
nicht vollständig verstanden. Bekannt ist, dass für eine effektive Immunantwort gegen
Tumore die CD4+ und CD8+ T-Zellen wichtig sind, da diese sowohl durch die Sekretion von
Zytokinen als auch durch die Ausschüttung zytotoxischer Moleküle an der Eliminierung von
Krebszellen beteiligt sind.
Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit dem Transkriptionsfaktor NFATc1. Dieser ist als
Mitglied der NFAT (nuclear factor of activated T-cells) -Proteinfamilie in die Genexpression
von T-Lymphozyten involviert. Nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors werden die
NFAT-Proteine aktiviert und induzieren die Expression von Genen in verschiedenen
T-Zell-Subtypen. Für NFATc1 wurde eine Rolle bei der Induktion der Zytokine „Interleukin“
IL-4 und IL-6 nachgewiesen und es wurden NFATc1-Bindestellen an den Promotoren von
Il-10, Il-17a, „forkhead box protein 3“ (Foxp3) und Il-2 entdeckt.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte beobachtet werden, dass die Expression von
NFATc1 in Tumorgeweben von Lungenkrebspatienten im Vergleich zu Kontrollgeweben
erhöht war. Da dies auf eine Dysregulation von NFATc1 im Tumormilieu hindeutete, sollte
ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Analyse der Rolle von NFATc1 in
T-Zell-spezifischen Immunreaktionen bei Tumorerkrankungen in der Lunge liegen. Für die
Untersuchungen wurden NFATc1fl/fl;CD4-Cre Mäuse, die eine konditionale NFATc1Defizienz in CD4-exprimierenden Zellen besaßen, verwendet. Als Kontrollmäuse wurden
NFATc1fl/fl Mäuse eingesetzt. Von der NFATc1-Defizienz betroffen waren neben den CD4+
auch die CD8+ T-Zellen, da diese während ihrer Entwicklung auch CD4 exprimieren. Die
hohe Sterberate bei Krebspatienten ist oft auf die Entwicklung von Metastasen
zurückzuführen. Daher diente in der vorliegenden Arbeit eine metastatische MelanomZelllinie, die stark in die Lunge metastasiert, als zweites murines Tumormodell neben einem
murinen Modell für Lungenkarzinom.
Eine konditionale Deletion von NFATc1 in CD4-exprimierenden Zellen hatte keine
Auswirkungen auf das Tumorwachstum von Lungenkarzinomen. Auch das Wachstum von
2
Melanom-Metastasen in der Lunge war zu den in der Arbeit analysierten Zeitpunkten
unverändert. Welche Effekte eine konditionale NFATc1-Defizienz im gesamten Verlauf der
Krebserkrankung hat, muss noch näher untersucht werden. Die Analysen zeigten, dass in
konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen eine reduzierte Anzahl an CD4+ und CD8+
T-Zellen vorlag. Dies weist auf eine Involvierung von NFATc1 in die Proliferation beider
T-Zell-Populationen hin. CD8+ T-Zellen exprimierten in Abwesenheit von NFATc1 erhöhte
Mengen an Eomesodermin und Perforin, was vermuten lässt, dass NFATc1 die Induktion
dieser Proteine hemmt und dadurch die Zytotoxizität der Zellen teilweise einschränkt. Zudem
war in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen die Expression der regulatorischen Proteine
„cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4“ (CTLA4), Helios, „folate receptor 4“ (Folr4)
und IL-10 verringert. Dies ist ein Hinweis darauf, dass NFATc1 in CD8+ T-Zellen die
Ausbildung einiger regulatorischer Eigenschaften fördert.
Um die Beteiligung von NFATc1 an den Funktionen spezifischer T-Zell-Subtypen zu
analysieren, wurden Differenzierungsanalysen an NFATc1-defizienten T-Zellen durchgeführt.
Es konnte in NFATc1-defizienten CD8+ Tc1 T-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen eine
verringerte Expression von „Interferon“ IFN-γ und „tumor necrosis factor alpha“ (TNF-α)
beobachtet werden. In CD4+ Th17- und CD8+ Tc17-Zellen führte eine NFATc1-Defizienz zu
einer verminderten Expression von IL-21. Zudem war die Expression der „RAR-related
orphan receptors“ (ROR)-Transkriptionsfaktoren in NFATc1-defizienten Th17-Zellen
reduziert.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle von IL-17A im Tumormilieu von
Lungenkarzinomen analysiert werden.
In
vorangegangenen
Studien innerhalb der
Arbeitsgruppe konnte im murinen Modell festgestellt werden, dass eine Blockade von IL-17A
zu einer Verringerung des Tumorwachstums von Lungenkarzinomen führte. Da dies von einer
erhöhten Expression von IFN-γ begleitet war, sollte im Rahmen dieser Arbeit die Beziehung
zwischen dem die IFN-γ-Expression induzierendem Transkriptionsfaktor „T-box expressed in
T-cells“ (T-bet) und IL-17A im Tumormilieu näher untersucht werden. Die Analysen zeigten,
dass die Expression von IL-17A und T-bet in Gewebe von Lungenkrebspatienten invers
korreliert. Untersuchungen an T-bet-defizienten Mäusen bestätigten die Annahme, dass dieser
Transkriptionsfaktor, der für seine Rolle in der anti-Tumor Immunität bekannt ist, auch für die
Immunantwort gegen Lungenkarzinome wichtig ist. So wiesen T-bet-defiziente Mäuse im
Vergleich zu Kontrollmäusen ein verstärktes Wachstum von Karzinomen in der Lunge auf.
Ferner
lag
in
T-bet-defizienten
+
Mäusen
+
eine
erhöhte
Anzahl
an
IL-17-Rezeptor-exprimierenden CD4 und CD8 T-Zellen vor. Dies gibt einen Hinweis
3
darauf,
dass
T-bet
den
IL-17-Signalweg
hemmt.
Die
Tatsache,
dass
die
Lungenkarzinom-Zellen nach Kultivierung mit IL-17A eine erhöhte Expression von IL-6
aufwiesen und zudem konstitutiv „transforming growth factor beta“ (TGF-β) exprimierten,
deutet darauf hin, dass diese Tumorzellen selbst an der Induktion der Th17-Zellen beteiligt
sind, was wiederum die Generierung von IL-17A-produzierenden Zellen und somit das
Tumorwachstum fördert.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass NFATc1 in CD8+ T-Zellen
die Ausbildung regulatorischer Eigenschaften induziert und die Expression einiger Proteine,
die mit zytotoxischen Reaktionen assoziiert sind, unterdrückt. Zudem ist NFATc1 für die
Differenzierung von CD8+ Typ1 und CD4+/CD8+ Typ17 T-Lymphozyten von Bedeutung. Die
Analysen ergaben ferner, dass das Zytokin IL-17A invers mit T-bet im Tumormilieu von
Lungenkarzinomen korreliert und durch seinen Einfluss auf die Karzinomzellen zu einer
Verstärkung der Th17-Immunantwort beiträgt.
4
5
2 Summary
Throughout the world, cancer is associated with high mortality rates. So far, there are no
sufficient therapeutic approaches available. Depending on the tumor type, the therapy
includes surgical removal of the tumor affected tissue, chemotherapy or radiation. The
mechanisms of anti-tumor immune responses are not fully understood. It is known that an
effective immune response against tumors requires CD4+ and CD8+ T-cells which are
involved in elimination of tumor cells through secretion of cytokines and cytotoxic molecules.
The first part of the thesis deals with the transcription factor NFATc1. As a member of the
NFAT (nuclear factor of activated T-cells) protein-family, it is involved in the regulation of
gene expression in T-lymphocytes. After stimulation of the T-cell receptor, NFAT-proteins
are activated and induce the gene expression in different T-cell subpopulations. NFATc1 has
been shown to induce the expression of the cytokines „interleukin“ IL-4 and IL-6. Moreover,
DNA-binding sites for NFATc1 have been found on the promoters of Il-10, Il-17a, „forkhead
box protein 3“ (Foxp3) and Il-2.
During the present study it has been observed that the expression of NFATc1 was elevated in
tumor-bearing tissue of lung cancer patients compared to control tissue. As this indicated a
dysregulation of NFATc1 in the tumor micro-environment, one part of this thesis was the
analysis of the role of NFATc1 for T-cell-specific tumor-associated immune reactions of
tumors in the lung. For that purpose, conditional NFATc1fl/fl;CD4-cre mice with a NFATc1deficiency in CD4-expressing cells, were used, and NFATc1fl/fl mice served as control.
Besides CD4+ T-cells also CD8+ T-cells were affected by the NFATc1-deletion because they
express CD4 during their development. Cancer deaths are often caused by metastases.
Therefore, a metastatic melanoma cell line, which strongly metastasises to the lung, served as
a second murine tumor model during this study beside a murine model of lung carcinoma.
Conditional deletion of NFATc1 in CD4-expressing cells caused no changes concerning the
tumor load of lung carcinoma in mice. Also the growth of melanotic metastases in the lungs
was not affected by NFATc1-deficiency at the analysed time points. The effects of a
conditional NFATc1-deletion during the whole process of tumor development needs to be
further analysed. Conditional NFATc1-deficient mice exhibited reduced numbers of CD4+
and CD8+ T-cells. This indicates an involvement of NFATc1 in the proliferation of both cell
populations. In the absence of NFATc1, CD8+ T-cells showed an increased expression of
Eomesodermin and Perforin, leading to the assumption that NFATc1 inhibits the expression
6
of these proteins and thereby partially restricts the cytotoxicity of CD8+ T-cells. Moreover,
NFATc1-deficient CD8+ T-cells exhibited a diminished expression of the regulatory proteins
„cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4“ (CTLA4), Helios, “folate receptor 4” (Folr4)
and IL-10, indicating that NFATc1 boosts the development of regulatory properties in CD8+
T-cells. To investigate the involvement of NFATc1 in the functions of specific T-cell
subpopulations, a further priority was the analysis of differentiation processes in
NFATc1-deficient T-cells. In the absence of NFATc1 CD8+ Tc1 T-cells showed a reduced
expression of “interferon” IFN-γ and “tumor necrosis factor alpha” (TNF-α) compared to
control cells. NFATc1-deficient CD4+ Th17 and CD8+ Tc17 T-cells exhibited lower
expression levels of IL-21. The absence of NFATc1 also led to a diminished expression of
„RAR-related orphan receptors“ (ROR)-transcription factors in Th17 T-cells.
The second part of the thesis deals with the role of IL-17A in the tumor micro-environment of
lung carcinoma. Previous studies within the working group revealed that the blockade of
IL-17A in a murine model led to a reduced growth of lung carcinoma. As this was
accompanied by an enhanced expression of IFN-γ, the relation between „T-box expressed in
T-cells“ (T-bet), a transcription factor inducing IFN-γ, and IL-17A had been further
investigated in this thesis. The results showed an inverse correlation between T-bet and
IL-17A in tissues of lung cancer patients. Investigations on T-bet-deficient mice confirmed
the assumption, that T-bet, which is generally known to be involved in anti-tumor immunity,
is also essential for the immune response against lung carcinoma. T-bet-deficient mice
exhibited an increased growth of lung carcinoma as compared to control mice. Additionally,
T-bet-deficient mice had elevated numbers of IL-17 receptor expressing CD4+ and CD8+
T-cells, indicating that T-bet could inhibit IL-17 signalling. The fact that lung carcinoma
tumor cells express increased levels of IL-6 upon culturing with IL-17A and constitutively
secrete „transforming growth factor beta” (TGF-β) reveals that these tumor cells themselves
could be involved in the induction of Th17-cells thereby promoting IL-17A-producing cells
and thus tumor growth.
In summary this thesis could demonstrate that NFATc1 promotes the generation of regulatory
features whereas it inhibits the expression of several cytotoxicity-associated proteins in CD8+
T-cells. Additionaly, it is important for the differentiation of CD8+ Typ1 T-lymphocytes and
CD4+/CD8+ Typ17 T-lymphocytes. Moreover, it turned out that IL-17A inversely correlates
with T-bet in the tumor micro-environment of lung carcinomas and reinforces Th17associated immune responses through its influence on tumor cells.
7
3 Einleitung
3.1
Das
Das Immunsystem und die T-Zell-Aktivierung
Immunsystem
schützt
den
Körper
vor
schädlichen
Eindringlingen
und
Krankheitserregern indem es diese beseitigt. Außerdem vernichtet es entartete Zellen um die
Entstehung von Krebs zu verhindern. Es besteht aus der angeborenen und der adaptiven
Immunität. Die angeborene Immunantwort erkennt Pathogene anhand von Strukturmotiven,
die für viele Bakterien und Viren charakteristisch sind, sog. Pathogen-assoziierte molekulare
Muster. Neben der angeborenen Immunantwort besitzt der Körper die adaptive Immunität, die
sich spezifisch gegen fremdartige Proteine, sog. Antigene, beispielsweise auf der Oberfläche
von Bakterien, richtet. Während die angeborene Immunantwort erblich festgelegt ist, kann
sich das adaptive Immunsystem im Laufe des Lebens an neue Krankheitserreger anpassen. Zu
den Zellen der erworbenen Immunantwort gehören die T- und B-Lymphozyten. T-Zellen
vermitteln die zelluläre Immunantwort und B-Zellen die humorale Immunantwort. Während
die Zellen der angeborenen Immunität direkt Pathogene angreifen können, bedarf es bei den
T- und B-Zellen einer Aktivierung, um deren Effektorfunktionen zu initiieren. Zu den
T-Zellen gehören die das Oberflächenmolekül CD8 exprimierenden CD8+ zytotoxischen
T-Zellen (Tc) und die CD4-exprimierenden T-Helferzellen (Th). Th-Zellen können den
B-Zellen „helfen“, indem sie sie aktivieren. Die B-Zellen produzieren daraufhin Antikörper
(Murphy et al., 2008).
T-Lymphozyten erkennen mithilfe ihres T-Zell-Rezeptors (TCR) körperfremde Antigene und
werden dadurch aktiviert. Jede T-Zelle besitzt eine Spezifität für ein bestimmtes Antigen. Für
die Aktivierung der Zellen sind sogenannte Antigen-präsentierende Zellen (APCs), wie
dendritische Zellen (DCs) oder Makrophagen nötig. APCs zirkulieren im Blut und in der
Lymphe, nehmen Bakterien und Viren auf oder sammeln freie, extrazelluläre fremd-Antigene,
wie Trümmer von Krebszellen, ein. In den lymphatischen Organen aktivieren die APCs die
Lymphozyten, indem sie ihnen auf der Zelloberfläche ihre spezifischen Antigene
„präsentieren“.
Die
Präsentation
der
Antigene
erfolgt
durch
den
Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC). MHC-Moleküle sind membranständige Proteine.
MHCI-Moleküle werden auf allen kernhaltigen Zellen des Körpers exprimiert, während
MHCII-Moleküle nur auf einigen Zellen des Immunsystems zu finden sind. In den APCs
werden die fremd-Antigene an MHC-Moleküle gebunden, an die Zelloberfläche befördert und
8
können dort von T-Zellen mittels des TCR erkannt werden. In Endosomen verpackte Proteine
werden in den APCs auf den MHCII-Komplex geladen, zytosolische Proteine, beispielsweise
in Virus-infizierten Zellen, werden an den MHCI gebunden und an die Oberfläche der Zelle
transportiert. Die APCs präsentieren die fremd-Antigene durch MHCI-Moleküle an naive
CD8+ T-Zellen und durch MHCII-Moleküle an naive CD4+ T-Zellen, wodurch diese aktiviert
werden. Für die Aktivierung der T-Zellen ist nicht nur der Kontakt des Antigens mit dem
TCR über die MHC-Komplexe notwendig, sondern auch die Anwesenheit der CD4 bzw.
CD8-Rezeptoren und costimulatorischer Moleküle wie CD80 und CD86 auf den APCs, die an
das auf der Oberfläche der T-Zellen befindliche CD28 binden. Ist eine T-Zelle aktiviert, setzt
die klonale Expansion ein, so dass viele Zellen mit derselben Spezifität für das schädliche
fremd-Antigen generiert werden.
Die Aktivierung von B-Zellen findet meist mithilfe von aktivierten Th-Zellen statt. Dabei
agiert die B-Zelle als APC. Sie bindet durch ihren B-Zell-Rezeptor ein Antigen und
präsentiert dies durch den MHCII-Komplex an die T-Zelle, die eine Spezifität für dasselbe
Antigen besitzt. Die T-Zelle schüttet daraufhin Signalstoffe, sogenannte Zytokine, aus, was zu
einer Aktivierung und Differenzierung der B-Zelle zu einer Antikörper-produzierenden Zelle
führt.
Aktivierte T-Zellen wandern von den lymphatischen Organen zum Infektionsherd. CD8+
T-Zellen erkennen dort mithilfe des MHCI die Virus-infizierten oder entarteten Zellen und
töten diese durch Ausscheidung zytotoxischer Substanzen. CD4+ T-Helferzellen (Th) und
zytotoxische CD8+ T-Zellen (Tc) produzieren zudem Zytokine, die andere Zellen des
Immunsystems rekrutieren und deren Effektorfunktionen induzieren (Parkin et al. 2001;
Murphy et al. 2008). Auf die verschiedenen T-Zell Subtypen wird in einem späteren
Abschnitt noch eingegangen.
3.2
3.2.1
Krebs
Krebsentstehung
Treten in Zellen Mutationen auf, wird der DNA-Schaden meist repariert oder die Zellen in
den programmierten Zelltod, die Apoptose, geführt. Geschieht dies nicht, muss das
Immunsystem die entarteten Zellen beseitigen. Führen Mutationen zu einer unkontrollierten
Vermehrung einer transformierten Zelle so bildet sich ein Tumor, der das gesunde Gewebe
verdrängt und es schädigt. Pathologische Proliferation von Zellen entsteht meist, wenn durch
9
die Mutation in der entarteten Zelle die Apoptose nicht mehr eingeleitet werden kann oder
Defekte in der Zellzykluskontrolle vorliegen. Gene, deren Veränderungen zu einem
unkontrollierten Wachstum der Zellen führen können, werden Proto-Onkogene oder
Tumorsuppressorgene genannt. Zu den Proto-Onkogenen gehören oft Gene, die an
Signaltransduktionskaskaden beteiligt sind, die ein externes Wachstumssignal in einen
Proliferationsstimulus umsetzen. Verändern die Proteine dieser Gene durch eine Mutation ihre
Funktion, kann ein eigentlich für die Zelle wichtiges Proto-Onkogen mit physiologischer
Funktion zum Onkogen mutieren, was dazu führt, dass die Zelle unkontrolliert proliferiert.
Gene,
die
für
Proteine
kodieren,
die
die
Zellproliferation
hemmen,
werden
Tumorsuppressorgene genannt. Ist ein Tumorsuppressorgen defekt, kann es beispielsweise
dazu kommen, dass beschädigte Zellen nicht während des Zellzyklus repariert werden,
sondern stattdessen mutiert replizieren (Weinberg 2006).
3.2.2
Metastasierung
Wenn Zellen eines Primärtumors über die Blutbahn oder das lymphatische System in
entfernte Regionen des Körpers wandern und sich in anderen Geweben vermehren, spricht
man von Metastasierung. Da ein Primärtumor genau lokalisiert und entfernt bzw. therapiert
werden kann, liegt die Ursache der hohen Krebssterblichkeitsrate meist in der
Metastasenbildung (Gupta, Massague 2006). Da sich in anderen Regionen des Körpers das
Milieu stark von den Gegebenheiten am Ort des Primärtumors unterscheidet, entwickeln nur
0,1 % der sich verbreitenden Tumorzellen distale Metastasen (Fidler 1970). Stephen Paget
stellte dazu bereits 1889 die „Seed and Soil“ Hypothese auf. Diese besagt, dass Tumorzellen
nur dort Metastasen entwickeln können, wo die Bedingungen für sie günstig sind (Paget
1889).
Die Metastasenbildung ist ein mehrschrittiger Prozess. Zuerst siedeln sich die Tumorzellen
vom Primärtumor ab und infiltrieren das angrenzende Gewebe. Nach der Durchstoßung der
Epithelzellen treten die Tumorzellen in die Blutbahn ein. Haben sie dort überlebt, verlassen
sie in bestimmten Organen die Blutbahn und proliferieren in distalen Geweben. Um die
Metastasierung zu erleichtern, können Tumorzellen ihre Morphologie verändern. Sie besitzen
die Fähigkeit sich von Epithelzellen in mesenchymale und amöboide Zellen umzuwandeln.
Außerdem können sie sich aus einem Zellhaufen entfernen und einzeln agieren (Christiansen
et al. 2006).
10
Bei der Invasion der Tumorzellen in das umliegende Gewebe sekretieren die Tumorzellen
Metalloproteasen.
Diese
zerstören
Zell-Zell-Kontakte,
degradieren
Proteine
der
extrazellulären Matrix und induzieren Zytokine und Wachstumsfaktoren (Wolf et al. 2007;
Artym et al. 2006). Amöboide Tumorzellen können Lücken in der extrazellulären Matrix
passieren (Friedl et al. 2003). Mesenchymale Tumorzellen besitzen eine erhöhte Invasivität
und eine gesteigerte Beweglichkeit, so dass sie leicht in das umliegende Gewebe einfallen
können. Sie können zudem Immunreaktionen inhibieren (Thiery et al. 2009).
Um in die Blutbahn zu gelangen, müssen Tumorzellen die Endothelzellen der
Blutgefäßwände durchdringen. Warum Tumorzellen in bestimmte Organe metastasieren und
ob dies ein aktiver oder passiver Prozess ist, ist nicht vollständig verstanden. Viele
Tumorzellen sind um einiges größer als viele Blutgefäße, so dass sie in Kapillarbetten
eingeschlossen werden (Gupta, Massague 2006). Einige Tumorzellen exprimieren zudem
Adhäsionsmoleküle und binden damit an die Blutgefäße bestimmter Organe. Um die
Blutgefäße wieder zu verlassen, sekretieren Tumorzellen Proteine, die die Zell-Zell-Kontakte
der Endothelzellen der Blutgefäße lockern und Hyperpermeabilität verursachen (Brown,
Ruoslahti 2004).
Haben die Tumorzellen die Blutbahn verlassen, müssen sie sich an das fremde Milieu des
distalen Organs anpassen um dort zu überleben. Daher existieren oft Metastasen in
verschiedenen Stadien. Es kommen sowohl nicht proliferierende Mikrometastasen vor, die
durch ein Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose ihre Größe nicht verändern, als
auch schnell wachsende, große Metastasen. Damit Mikrometastasen zu großen Metastasen
heranwachsen können, muss sich entweder die Mikroumgebung verändern oder die Zellen
müssen eine hohe Kapazität zur Selbst-Erneuerung besitzen (Chaffer, Weinberg 2011).
3.2.3
Lungenkrebs
Lungenkrebs ist gekennzeichnet durch unkontrolliertes Wachstum von entarteten Zellen der
Lunge. Nur etwa 15 % der Patienten überleben länger als fünf Jahre nach der Diagnose.
(Schuller
2002).
In
Deutschland
erkranken
nach
Angaben
des
Deutschen
Krebsforschungszentrums etwa 50.000 Menschen pro Jahr. Darunter sind ca. ein Drittel
Frauen und zwei Drittel Männer. Die häufigste Ursache für Lungenkrebs ist das Rauchen von
Zigaretten. Zigaretten enthalten Karzinogene, wie Nitrosamine, die Gen-Mutationen und
somit
maligne
Transformationen
in
Lungenzellen
auslösen
können
11
(Schuller et al. 1990; Hoffmann et al. 1993). Allerdings erkranken nur etwa 11 % der starken
Raucher an Lungenkrebs (Minna et al. 2002).
Die Haupt-Typen von Lungenkrebs sind das Kleinzellige und das Nicht-Kleinzellige
Bronchialkarzinom.
Plattenepithelkarzinom,
Zu
das
den
Nicht-Kleinzelligen
Großzellige
Karzinom
Karzinomen
und
das
gehören
Adenokarzinom.
das
Das
Plattenepithelkarzinom entsteht durch eine Entartung einer Plattenepithelzelle. Diese Art von
Epithelzellen befindet sich vorrangig in der Epidermis der Haut, ist aber auch im
Verdauungstrakt, der Lunge, sowie in anderen Regionen des Körpers zu finden.
Adenokarzinome haben ihren Ursprung in Epithelzellen von Drüsengeweben oder in Schleimproduzierenden Zellen. Dazu gehören in der Lunge u.a. die sekretorischen Clara-Zellen, die
TypII Pneumozyten und die Alveolar-Epithelzellen. Das Adenokarzinom ist die am weitesten
verbreitete Lungenkrebsart bei Frauen, Nichtrauchern und Jugendlichen (Schuller 2002;
Minna et al. 2002).
Als Ursachen für die Entstehung von Lungentumoren wurden verschiedene inaktivierte
Tumorsuppressorgene und aktivierte Onkogene identifiziert. Zu den Suppressorgenen gehören
p53, Rb, PTEN und p16. Als Onkogene wurden c-myc, cyclin D1, „B-cell lymphoma 2“
(BCL-2), K-ras und „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) beschrieben. In vielen NichtKleinzelligen Lungentumoren ist der EGFR überexprimiert. Da die Aktivierung des
EGFR-Signalwegs eine erhöhte Proliferation, Metastasenbildung, Angiogenese und eine
erniedrigte Apoptose in den Zellen bewirkt, ist die Überexpression begleitet von einer
schlechten klinischen Prognose (Dazzi et al. 1989; Lynch et al. 2004).
Eine häufig angewandte Therapie bei Nicht-Kleinzelligen Lungenkarzinomen stellt die
Blockade des EGFR dar, was zu einer Verminderung der Proliferation der Tumorzellen führt
(Thienelt et al. 2005). Eine weitere Behandlungsmöglichkeit ist die Blockade des „vascular
endothelial growth factor“ (VEGF) und seines Rezeptors. Die Unterdrückung des VEGFRSignalwegs führt zu einer Verminderung der Angiogenese innerhalb des Tumors und
reduziert somit die Funktionen der Tumorzellen, da diese weniger Sauerstoff erhalten
(Sandler et al. 2006; Carter et al. 2007).
3.2.4
Malignes Melanom
Das maligne Melanom wird auch als “schwarzer Hautkrebs” bezeichnet. Bei dieser
Krebserkrankung bildet sich der Primärtumor meist in der Haut und metastasiert schnell in
andere Organe. Laut des Deutschen Krebsforschungszentrums und des Zentrums für
12
Krebsregisterdaten am Robert-Koch-Institut wurden im Jahre 2008 in Deutschland etwa
23.000 Erkrankungen festgestellt. Als Risikofaktor gilt vor allem die UV-Strahlung. Deshalb
ist die Krankheit am häufigsten in den Ländern verbreitet, in denen Menschen helleren
Hauttyps leben. Das Melanom ist bei Männern die sechst-häufigste und bei Frauen die siebthäufigste Tumorerkrankung. Unter den Hautkrebs-Typen ist das Melanom die gefährlichste
Form und ist für die meisten Todesfälle verantwortlich (Gray-Schopfer 2007). Wird das
Melanom in einer frühen Phase der Tumorentwicklung diagnostiziert, können die Patienten
meist geheilt werden. Wird der Tumor erst spät entdeckt, beträgt die durchschnittliche
Lebenserwartung nach der Diagnose nur etwa 6-10 Monate und die Anzahl der Fälle, in denen
ein Patient mit metastatischen Melanom länger als fünf Jahre überlebt, liegt bei weniger als
5 % (Cummins et al. 2006).
Melanome entstehen durch bösartige Entartungen der Melanozyten der Haut. Diese befinden
sich in der Epidermis und ihre Homöostase wird durch epidermale Keratinozyten geregelt.
Die Hauptfunktionen von Melanozyten sind die Synthese, die Speicherung und der Transfer
von Melanin-Pigmenten zu den umliegenden Epithelzellen. Durch UV-Strahlung stimuliert
sezernieren Keratinozyten Faktoren, die die Melanozyten dazu anregen, Melanin zu
produzieren. Dadurch kommt es zur Bräunung bzw. Gerbung der Haut, was wiederum die
Haut vor UV-Strahlung schützt (Gilchrest et al. 1999). Mehr als 90 % der Melanome haben
ihren Ursprung in der Haut. Die Entwicklung eines Melanoms geschieht in zwei Phasen. In
der radialen Wachstumsphase breiten sich entartete Melanozyten horizontal aus, in der
vertikalen Wachstumsphase dringen die Tumorzellen in die unteren Hautschichten ein und
vermehren sich dort. Zellen der vertikalen Wachstumsphase metastasieren in Lunge, Leber
und Gehirn (Miller et al. 2006). Als Onkogen wurde u.a. das dem Ras-Signalweg zugehörige
braf identifiziert (Patton et al. 2005) und als oftmals betroffene Tumor-Suppressorgene PTEN
und p53 beschrieben (Hwang et al. 2001; Straume and Akslen 1997). Bekannte TumorAntigene sind neben Melan-A/MART-1 auch NY-ESO-1, CAMEL, SSX-2 und MAGE-10
(Romero et al. 2002).
Bei Melanomen sind die Therapiemöglichkeiten bisher wenig erfolgreich. Die meisten
Therapien bewirken nur eine geringfügige Verlängerung der Lebensdauer der Patienten. Eine
häufig eingesetzte Immuntherapie ist die Gabe von Interferon-α (Gray-Schopfer et al. 2007).
Oft wird auch eine Therapie mit Interleukin-2 durchgeführt (Rosenberg et al. 1998). Dies
führt zu einer Aktivierung von Tumor-reaktiven T- und NK-Zellen. Eine weitere
Immuntherapie stellt der Transfer von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TILs) dar. Dabei
werden gezielt Melanom-Antigen- reaktive CD8+ T-Zellen aus dem Patienten isoliert,
13
vermehrt und in den Patienten zurück transferiert. Melanom-Antigen-spezifische T-Zellen
werden dadurch in vitro identifiziert, dass sie nach Kontakt mit Melanom-Zellen IFN-γ
produzieren (Besser et al. 2010). In Kombination mit dem T-Zell-Transfer wird oft die IL2-Therapie eingesetzt, um die Proliferation der T-Zellen zu bewirken. Dies ermöglicht einen
verbesserten Krankheitsverlauf (Mule et al. 1984). Außerdem werden als Therapie
Medikamente verwendet, die Signalwege in den Zellen blockieren, welche die Proliferation,
das Überleben der Zelle, das metatstatisches Potential sowie angiogenetische Faktoren
begünstigen. Dazu gehören Blocker gegen das anti-apoptotische Gen bcl2, den die
Proliferation induzierenden Ras-Signalweg und den NF-κB Signalweg, der Angiogenese und
Metastasenbildung fördert (Gray-Schopfer et al. 2007).
3.2.5
Mausmodelle für Lungenkarzinom und metastatisches Melanom
In der vorliegenden Arbeit wurden die murinen Tumorzelllinien LLC1 (LL/2), L1C2 und
B16F10 verwendet, um das Wachstum von Lewis Lung Karzinomen, broncho-alveolären
Karzinomen bzw. Melanom-Metastasen in der Lunge von Mäusen zu induzieren.
Die Melanom-Zelllinie B16F10 wurde 1973 hergestellt. Dafür wurden aus C57BL/6 Mäusen,
die spontan Melanom-Metastasen in der Lunge entwickelt hatten, die Tumorzellen aus der
Lunge isoliert. Diese wurden erneut in Mäuse intravenös injiziert und die Zellen aus der
Lunge isoliert. Nach zehn in vivo Selektionen durch wiederholte Injektion der Zellen in
C57BL/6 Mäuse und Isolation der sich entwickelnden Lungenmetastasen entstand aus der
parentalen B16 Zelllinie die B16F10 Zelllinie (Fidler 1973). Dieses murine Melanom-Modell
ist sowohl innerhalb der Arbeitsgruppe als auch in der Literatur ein etabliertes Modell
(Sauer et al. 2008) und wird sowohl für die Induktion von Melanomen der Haut als auch für
die Induktion von melanotischen Lungenmetastasen verwendet. Dies geschieht durch
subkutane bzw. intravenöse Injektion der Tumorzellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit
wurden die Zellen intravenös in die Schwanzvene appliziert. Dadurch wird der Prozess der
Metastasierung nachgeahmt, der über die Blutbahn stattfindet. Das schnelle und aggressive
Wachstum der Zellen ermöglicht einen kurzen Versuchsablauf und erleichtert die
Wiederholung der Experimente. Zudem bilden die B16F10-Zellen nach intravenöser
Applikation vorwiegend Metastasen in der Lunge, so dass die Analyse des Tumorwachstums
auf ein Organ beschränkt werden kann und somit relativ präzise ist. Zur Induktion des
Wachstums von Lungenkarzinomen wurden Lewis Lung Karzinom Zellen intravenös
appliziert. Diese Zellen werden vielfach in der Literatur verwendet. Sie exprimieren ein
Tumorantigen,
dass
durch
das
MHCI-Molekül
H2-b
präsentiert
wird.
Die
14
„Line 1 Alveolar Cell Carcinoma“ Zelllinie L1C2 wurde 1974 hergestellt. Dafür wurde aus
einer weiblichen Balb/c Maus ein alveoläres Karzinom isoliert, das zuvor in dieser Maus
gewachsen war. Die Tumorzellen wurden subkutan in die dorsale Körperregion einer anderen
Maus injiziert. Nach zwölf-facher Wiederholung der Transplantation der Zellen wurden die
Tumorzellen an Zellkulturbedingungen angepasst (Yuhas et al. 1974). Die „Lewis Lung
Carcinoma“ Zelllinie LLC1 wurde 1951 von M.R.Lewis etabliert. Die Zellen waren aus
Mäusen isoliert worden, die zuvor ein primäres Lewis Lung Karzinom implantiert bekommen
hatten (Betram, Janik 1980).
3.2.6
Tumorimmunologie
Während der malignen Transformation und des Tumorwachstums kommt es zu
Veränderungen im metabolischen Milieu einer Zelle, wodurch die Zellen der adaptiven
Immunität rekrutiert werden. Dazu gehören beispielsweise durch zellulären Stress generierte
Hitzeschock-Proteine und reaktive Sauerstoff-Spezies. Außerdem können in Tumorzellen, die
sich extensiv vermehren, genetische und epigenetische Veränderungen zu einer Expression
von Neo-Antigenen führen, die vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden
(Khong, Restifo 2002). Anti-Tumor Immunantworten werden durch Zellen des angeborenen
und des adaptiven Immunsystems vermittelt. Da die Zellen der adaptiven Immunität eine
vorherige Aktivierung und Differenzierung benötigen bevor sie gegen transformierte Zellen
agieren können, sind die Zellen des angeborenen Immunsystems die ersten „Angreifer“, die
die Zellen des erworbenen Immunsystems rekrutieren.
Die Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) der angeborenen Immunität besitzten auf ihrer
Oberfläche verschiedene Rezeptoren, mit denen sie inhibierende und aktivierende Signale
empfangen. Exprimieren transfomierte Zellen auf ihrer Oberfläche Stress-induzierte
Liganden, werden diese von den aktivierenden Rezeptoren der NK-Zelle erkannt und diese
wird stimuliert. Detektiert die NK-Zelle ein MHCI-Molekül, führt dies zu einem
inhibierenden Signal. Ist gleichzeitig ein inhibierender und ein aktivierender Stimulus
vorhanden, bleibt die NK-Zelle in einem inaktiven Zustand. Führt die Entartung zu einer
Defizienz in der Expression von MHCI-Molekülen, fällt die Inhibition aus und die NK-Zelle
wird stimuliert. Sie sezerniert daraufhin das Zytokin „interferon gamma“ (IFN-γ) und
zytotoxische Moleküle, die die veränderten Zellen eliminieren (Waldhauer, Steinle 2008). Die
Natürlichen Killer T-Zellen (NKT-Zellen) besitzen TCRs, die Lipid-Antigene erkennen,
welche von dem nicht-klassischen MHC-Molekül CD1d präsentiert werden. Sie sind
einerseits an der anti-Tumor Immunantwort beteiligt, da sie IFN-γ produzieren
15
(Hayakawa et al. 2002; Molling et al. 2005) und DCs stimulieren (Kitamura et al. 1999;
Fuji et al. 2003), besitzen aber auch regulatorische Fähigkeiten, wodurch sie die Beseitigung
von Tumoren unterdrücken können (Osada et al. 2005; Renukaradhya et al. 2006). In
humanen Studien konnte gezeigt werden, dass T-Zellen wichtig für die anti-Tumor
Immunantworten sind. Eine hohe Anzahl an T-Zellen korrelierte positiv mit der
Überlebensrate der Krebspatienten (Naito et al. 1998). Zudem zeigte ein Transfer von
T-Zellen in klinischen Ansätzen Erfolge in der Tumorbekämpfung (Morgan et al. 2006).
Regulation der zytotoxischen Aktivität
Um das Wachstum von Tumoren zu verhindern, ist es nötig, dass die Tumorzellen eliminiert
werden. Dazu sind die zytotoxischen Lymphozyten (CTL) in der Lage. Sie töten ihre ZielZellen direkt, indem sie diese durch die Ausscheidung zytotoxischer Substanzen lysieren.
NK-Zellen, NKT-Zellen, CD8+ T-Zellen und einige CD4+ T-Zellen besitzen diese
zytotoxische Fähigkeit.
Im Gegensatz zu CD8+ CTLs ist für die Zytotoxizität der NK-Zellen keine vorherige
Aktivierung der Zellen nötig. Reife NK-Zellen beinhalten bereits Granula mit den
zytotoxischen Substanzen Perforin und Granzym (Eriksson et al. 1999). Perforin, ein Porenformendes Protein, sorgt dafür, dass Granzyme in die entartete Zelle befördert werden, die
dann die Apoptose der Zielzelle induzieren (Voskoboinik et al. 2006). Während eine CD8+
T-Zelle mehrere Arten von Granzymen besitzt, existiert Perforin als einziges Porenformendes Protein (Pipkin et al. 2010).
Die T-box Transkriptionsfaktoren Eomesodermin (Eomes) und „T-box expressed in T-cells“
(T-bet) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der zytotoxischen Aktivität der CD8+
CTLs. Beide Transkriptionsfaktoren induzieren die Expression von Perforin. T-bet kann
zudem die Genexpression von Granzym B einleiten (Pearce et al. 2003; Glimcher et al. 2004).
T-Zellen
T-Zellen differenzieren nach ihrer Aktivierung in verschiedene Subtypen, die unterschiedliche
Aufgaben im Immunsystem besitzen. Die Differenzierung der Zellen hängt von dem sie
umgebenden Zytokin-Milieu ab. Die an der Induktion der T-Zell-Differenzierung beteiligten
Zytokine werden u.a. von Zellen des erworbenen Immunsystems sezerniert. Neben den CD8+
T-Zellen spielen die CD4+ Th-Zellen eine wichtige Rolle in der anti-Tumor Immunantwort.
Die Hauptrolle der Th-Zellen an der anti-Tumor Immunantwort besteht darin, dass sie die
Generierung und die Funktionen der zytotoxischen CD8+ T-Zellen unterstützen. Dies
16
geschieht sowohl durch zelluläre Interaktionen als auch durch die Sekretion von Zytokinen.
Th-Zellen exprimieren das Oberflächenmolekül CD40L, das mit CD40, exprimiert auf DCs,
interagiert. Dadurch wird in den DCs die Expression der MHC-Moleküle anregt
(Bennett et al. 1998; Ridge et al. 1998; Schoenberger et al. 1998). Zudem verhindern CD4+
T-Zellen die Induktion des „Activation-induced cell death“ (AICD) in CD8+ T-Zellen, der
normalerweise durch Kontakt der CD8+ T-Zelle mit ihrem Antigen ausgelöst wird und diese
in die Apoptose, führt (Janssen et al. 2005; Kennedy and Celis 2006). Andere Studien zeigen,
dass in der Effektorphase der Immunantwort Zell-Zell-Kontakte zwischen CD4+ und CD8+
T-Zellen stattfinden, die zu einer Expansion und länger andauernden Effektorfunktionen der
CD8+ T-Zellen führen (Giuntoli et al. 2002).
3.2.6.1
CD4+ T-Zellen
CD4+ Th-Zellen differenzieren nach ihrer Aktivierung u.a. in Th1-, Th2-, Th17- und
regulatorische T-Zellen (Treg).
3.2.6.1.1 Th1-Zellen
Th1-Zellen sezernieren die Zytokine IFN-γ, „tumor-necrosis factor alpha“ (TNF-α) und IL-2.
Diese sind entscheidend an der Beseitigung intrazellulärer Pathogene und an der Eliminierung
von Tumoren beteiligt. Die Th1 Zell-Differenzierung wird durch das von APCs produzierte
Zytokin IL-12 initiiert. IL-12 leitet die Aktivierung des Transkriptionsfaktors „signal
transducers and activators of transcription“ STAT4 ein, der daraufhin die IFN-γ-Expression
induziert. Die Bindung von IFN-γ an seinen Rezeptor bewirkt die Phosphorylierung des
Transkriptionsfaktors STAT1, der die Expression von T-bet induziert. T-bet verstärkt zudem
die Produktion von IFN-γ durch eine direkte Bindung an den Promotor (Szabo et al. 2003;
Berenson et al. 2004). Studien zeigen, dass IFN-γ eine zentrale Rolle in der
Tumorbekämpfung spielt. Es rekrutiert pro-inflammatorische T-Zellen und induziert die
Proliferation von Immunzellen (Dobrzanski et al. 2006; Hollenbaugh et al. 2004). IFN-γ
bewirkt zudem in Tumorzellen eine erhöhte Expression der MHCI-Moleküle, was eine
verstärkte Erkennung der Tumorzellen durch die CD8+ T-Zellen auslöst. In IFN-γ-defizienten
Mäusen ist die durch CD4+ T-Zellen vermittelte CD8+ CTL Aktivität vermindert und kann
nach IFN-γ-Gabe wiederhergestellt werden. Dies weist darauf hin, dass von CD4+ T-Zellen
produziertes IFN-γ essentiell für die Aktivität der CD8+ CTLs ist (Ferrone et al. 2006). Zudem
spielt TNF-α eine wichtige Rolle bei der Tumorbekämpfung (Sugarman et al.1985). Neben
seiner
Fähigkeit
pro-inflammatorische
Reaktionen
zu
initiieren,
indem
es
die
17
„nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells“ (NFκB) und die „c-Jun
N-terminal kinase“ (JNK)/ „activator protein 1“ (AP-1) Signalwege aktiviert, leitet TNF-α die
Apoptose in Tumorzellen ein (Hsu et al. 1995 ; Aggarwal et al. 2012).
3.2.6.1.2 Th17-Zellen und der IL-17-Signalweg
Th17-Differenzierung
Zur Induktion der Th17-Zellen spielen neben den Zytokinen IL-6 und „transforming growth
factor β“ (TGF-β) IL-21, IL-23 und IL1-β eine Rolle (Harrington et al. 2005;
Mangan et al. 2006). Als Transkriptionsfaktoren der Th17-Population wurden STAT3, die
„RAR-related orphan receptors“ ROR-α und ROR-γt (Ivanov et al. 2006; Yang et al. 2008),
„basic leucine zipper transcription factor, ATF-like“ BATF (Schraml et al. 2009) und
„interferon regulatory factor 4“ IRF4 (Brustle et al. 2007) beschrieben. Th17-Zellen
produzieren die Zytokine IL-17A (IL-17), IL-17F, IL-21 und IL-22 (Harrington et al. 2005).
Bei der Th17-Zell-Differenzierung führt die Bindung von IL-6, IL-23 und IL-21 an ihre
Rezeptoren zu der Aktivierung von STAT3, das im Zellkern zusammen mit anderen
Transkriptionsfaktoren wie IRF4, ROR-α und BATF die Expression der Th17-Zytokine
IL-17A, IL-17F und IL-21 induziert. STAT3 induziert außerdem die Expression des IL-23
Rezeptors (IL-23R), der die Aufrechterhaltung der Th17 Zellen durch IL-23 ermöglicht und
nach seiner Aktivierung IL-22 induziert (Abbildung 3-1) (Hwang 2010; Hirahara et al. 2010;
Torchinsky et al. 2010). Die Rolle von TGF-β ist kontrovers. Es wird sowohl angenommen,
dass TGF-β direkt an der Th17-Induktion beteiligt ist, indem es RORγt induziert, als auch
dass es die Th17-Differenzierung indirekt durch Inhibition der Th1- und Th2Transkriptionsfaktoren fördert (Hwang 2010).
18
Abbildung 3-1: Th17-Zell Differenzierung
(adaptiert nach Hwang 2010, Hirahara et al. 2010;
Torchinsky et al. 2010)
Der IL-17 Signalweg
Die Zytokine IL-17A und IL-17F werden nicht nur von Th17-Zellen, sondern auch von
anderen Zellen des Immunsystems, sezerniert. Dazu gehören CD8+ T-Zellen (Ciric et al.
2009), γd T-Zellen (Sutton et al. 2009), NKT-Zellen (Michel et al. 2008), NK-Zellen (Passos
et al. 2010) und „lymphoid-tissue inducer like cells“ (LTi) (Takatori et al. 2009).
Die Familie der IL-17 Rezeptoren (IL-17R) besteht aus den Untereinheiten IL-17RA,
IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD und IL-17RE (Aggarwal et al. 2002). Heterodimere aus den
Untereinheiten IL-17RA und IL-17RC bilden den Rezeptor für die von Th17-Zellen
sekretierten Zytokine IL-17A und IL-17F (Wright et al. 2008). Der IL-17RA ist vor allem auf
Immunzellen exprimiert, während IL-17RC vorwiegend auf Zellen exprimiert wird, die nicht
zum Immunsystem gehören (Ishigame et al. 2009; Kuestner et al. 2007). Die Bindeaffinitäten
von IL-17A und IL-17F an die IL-17 Rezeptor-Untereinheiten sind verschieden. IL-17A hat
eine höhere Affinität an den IL-17RA zu binden, während IL-17F eine höhere Affinität
gegenüber dem IL-17RC aufweist (Kuestner et al. 2007; Hymowitz et al. 2001). Die Bindung
von IL-17A an den IL-17RA induziert die Bildung des Heterodimers aus IL-17RA und
IL-17RC, indem der IL-17RA den IL-17RC rekrutiert. Während Zytokine der Th1- und Th2Zellen Signalkaskaden induzieren, die durch STAT-Transkriptionsfaktoren und Januskinasen
vermittelt werden, sind die nachgelagerten Signalkaskaden von IL-17A und IL-17F eher mit
den Signalkaskaden von Rezeptoren vergleichbar, die mit dem angeborenen Immunsystem
verknüpft sind. Daher sind die IL-17-Proteine in die frühe Immunantwort involviert und
bilden eine sog. Brücke zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem.
19
Nach Bindung von IL-17A oder IL-17F an den Rezeptor assoziiert das zytoplasmatische
Adapterprotein Act-1 mit IL-17RA und/oder IL-17RC (Linden et al. 2007). An diesen
Komplex bindet daraufhin der „TNFR-associated factor 6“ (TRAF6), was die Aktivierung
von NFκB, MAPK-AP-1 und C/EBP hervorruft. Es kann aber auch zu einer Inhibition der
NFκB und MAPK-AP-1-Signalwege kommen, wenn, ausgelöst durch Ligandenbindung am
IL-17R, TRAF3 die durch Act-1/TRAF6 vermittelte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren
unterdrückt (Abbildung 3-2). IL-17A und IL-17F rufen die Expression pro-inflammatorischer
Zytokine sowie die Expression von Chemokinen, anti-mikrobiellen Peptiden und
Metalloproteasen hervor. Während andere Mitglieder der IL-17 Zytokine vor allem auf
Epithelzellen und Fibroblasten einwirken, befinden sich unter den Zielzellen von IL-17A und
IL-17F auch T-und B-Zellen des adaptiven Immunsystems (Iwakura et al. 2011). Es wird
angenommen, dass die beiden Zytokine die Aktivierung von T-Zellen und die
Antikörperproduktion von B-Zellen verstärken (Nakae et al. 2002) sowie in Makophagen die
Sekretion von IL-1, IL-6, TNF und IL-12 auslösen (Iwakura et al. 2011). IL-17A ist dabei
wesentlich potenter in der Induktion pro-inflammatorischer Zytokine als IL-17F (Wright et al.
2008).
Abbildung 3-2: Signalweg der Zytokine IL-17A und IL-17F. (aus Iwakura et al. 2011)
Th17-Zytokine und ihre Rolle im Tumormilieu
Die Rolle von IL-17A in der Tumorentwicklung und -bekämpfung ist umstritten.
Verschiedene Studien zeigen, dass IL-17A sowohl das Tumorwachstum fördernde als auch
hemmende Effekte haben kann. In vielen Tumorzellen induziert IL-17A die Proliferation und
beschleunigt somit das Tumorwachstum (Zhang et al. 2008). In Fibroblasten löst es die
20
Produktion pro-angiogenetischer Faktoren aus, was die Neubildung von Gefäßen und somit
das Tumorwachstum fördert, da der Tumor eine bessere Nährstoffversorgung erhält und
metastasieren kann (Takahashi et al. 2005, Honorati et al 2004). Studien zeigen, dass eine
Überexpression von IL-17A in humanen Nicht-Kleinzelligen Lungentumorzellen deren
Wachstum in immundefizienten Mäusen begünstigt (Numasaki et al. 2005). Neben diesen
Effekten kann IL-17A auch bewirken, dass das Immunsystem den Tumor stärker bekämpft.
An Melanom erkrankte Mäuse zeigten nach Transfer von Tumor-spezifischen Th17-Zellen
eine erniedrigte Metastasenbildung in der Lunge. Dieser Effekt schien abhängig von IFN-γ zu
sein, da nach Gabe von Antikörpern gegen IFN-γ der anti-Tumor Effekt der Th17-Zellen
ausblieb (Muranski et al. 2008). Außerdem löste der Th17 Zell-Transfer eine erhöhte
Aktivierung von Tumor-spezifischen CD8+ T-Zellen aus (Martin-Orozco et al. 2009). Des
Weiteren induziert IL-17A die Reifung von DCs, was die T-Zell Aktivierung verstärkt
(Antonysamy et al. 1999).
IL-21 wirkt vor allem auf Immunzellen wie T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, DCs und
Makrophagen ein, aber auch auf Zellen, die nicht zum Immunsystem gehören wie
Fibroblasten. In CD8+ T-Zellen erhöht IL-21 die Proliferation, die Expression von CD28 und
die anti-Tumor Aktivität (Moroz et al. 2004). Die Bindung von IL-21 an seinen Rezeptor auf
NK-Zellen bewirkt eine Verstärkung ihrer Aktivierung und der Zytotoxizität, allerdings
induziert es auch die Apoptose dieser Zellen (Kasaian et al. 2002; Brady et al. 2004; Liu et al.
2009; Park et al. 2012). Auf DCs kann IL-21 eine inhibierende Wirkung haben. Es verhindert
die Reifung der Zellen sowie die Expression von MHCII und von co-stimulatorischen
Molekülen (Pelletier et al. 2004). Außerdem vermindert es die Produktion von TNF-α und
IL-12 (Brandt et al. 2003; Strengell et al. 2006). IL-21 besitzt eine starke anti-Tumor Aktivität
in vielen murinen Tumormodellen wie Melanom, Lungenkarzinom, Fibrosarkom, Darmkrebs
und Brustkrebs. Diese wird dadurch vermittelt, dass in NK- und CD8+ T-Zellen die Sekretion
von Perforin und IFN-γ induziert wird (Ma et al. 2003; Ugai et al. 2003; Brady et al. 2004; Di
Carlo et al. 2004). In klinischen Studien an Patienten, die am metastatischen Melanom oder
am Nierenkarzinom litten, wurde erfolgreich eine IL-21 Therapie eingesetzt. IL-21 induzierte
dabei die Aktivierung von NK-Zellen und CD8+ T-Zellen (Frederiksen et al. 2008). Zudem
besitzt IL-21 auch anti-angiogenetische Funktionen, indem es die Architektur der Gefäße
zerstört und die Proliferation von Epithelzellen inhibiert (Castermans et al. 2008).
21
3.2.6.1.3 Regulatorische T-Zellen
Eine große Rolle bei der Suppression der Immunantwort spielen CD4+CD25+ regulatorische
T-Zellen. Im Gegensatz zu allen anderen T-Zell-Populationen induzieren die regulatorischen
T-Zellen keine Immunantwort, sondern inhibieren die Immunantwort anderer Zellen. Dies
geschieht sowohl durch Zell-Zell Kontakte als auch durch Sekretion von löslichen Faktoren.
Neben den natürlichen regulatorischen T-Zellen (nTreg), die im Thymus generiert werden
und den Forkhead box P3 trancription factor (Foxp3) exprimieren, existieren die in der
Peripherie entstehenden induzierten regulatorischen T-Zellen (iTreg). Diese unterteilen sich in
die Foxp3+ iTreg, die Foxp3-negativen IL-10-produzierenden Tr1-Zellen (Roncarolo et al.
2006) sowie die TGF-β-produzierenden Th3-Zellen (Weiner et al. 2001). Die Zytokine IL-10
und TGF-β unterdrücken die Funktion von T-Zellen, DCs und NK-Zellen (Chen et al. 2003;
Fantini et al. 2004; Ghiringhelli et al. 2005). Regulatorische T-Zellen sind zudem durch die
Expression von Helios und „cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4“ (CTLA4)
gekennzeichnet. CTLA4 interagiert mit den DCs und löst dadurch die Produktion von
Indolamine 2,3-dioxygenase (IDO) aus, das Apoptose und Anergie in den T-Effektorzellen
herbeiführt (Mellor et al. 2004; Fallarino et al. 2003).
3.2.6.2
CD8+ T-Zellen
CD8+ Tc-Zellen können, genau wie CD4+ Th-Zellen, in verschiedene Subtypen
differenzieren. Die Differenzierung der Tc-Zellen ähnelt dabei stark der Differenzierung der
Th-Zellen. Es wurden bisher Tc1-, Tc2- und Tc17-Zellen beschrieben.
Studien zeigen, dass die Kultivierung von CD8+ T-Zellen mit den Zytokinen IL-6, IL-1-β,
IL-23, IL-21 und TGF-β die Differenzierung der CD8+ T-Zellen zu Tc17-Zellen, einen dem
Th17-Zellen ählichen Phänotyp, induziert. An der Tc17-Differenzierung beteiligt sind die
Transkriptionsfaktoren STAT3, ROR-α und ROR-γt. Tc17 CD8+ T-Zellen sezernieren die
Zytokine IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 und TNF-α (Hamada et al. 2009, Yen et al. 2009). In
vitro generierte Tc17-Zellen sezernieren kein Perforin und Granzym B und weisen somit
keine zytolytische Aktivität auf (Huber et al. 2009). Für die Differenzierung der Tc1-Zellen
ist IL-12 erforderlich. Die Transkriptionsfaktoren T-bet (Sullivan et al. 2003), Eomes, STAT1
und STAT4 (Carter et al. 1999) induzieren die Expression von IFN-γ (Croft et al. 1994; Sad et
al. 1995). Tc1-Zellen produzieren zudem die Zytokine IL-2 und TNF-α (Yen et al. 2009).
Studien in Maus-Modellen zeigten, dass der Transfer von Tc1-Zellen Melanom und
Brustkrebszellen eliminieren kann (Helmich et al. 2001; Ye et al. 2007; Dobrzanski et al.
2004; Dobrzanski et al. 2006). Auch der Transfer von Tc17-Zellen unterdrückte das
22
Tumorwachstum von Melanomen, sowohl im Früh- als auch im Spätstadium der Krankheit.
Die Zytokinproduktion der Tc17-Zellen führte dabei zu einer verstärketen Rekrutierung von
T-Zellen und Makrophagen zum Ort des Tumors. Es konnte zudem gezeigt werden, dass
Tc17-Zellen das Tumorwachstum 10 bis 50-fach weniger effektiv eindämmen können als
Tc1-Zellen (Garcia-Hernandez et al. 2010). In klinischen Studien wurden durch den Transfer
von CD8+ T-Zellen bisher nur kurzzeitige Erfolge in der Bekämpfung von Tumoren erzielt.
Es wird vermutet, dass dies daran liegt, dass die CD8+ T-Zellen nicht fortbestehen und keine
anhaltenden anti-Tumor Antworten vermitteln können (Shrikant et al. 2010).
Neben CD4+ T-Zellen können auch CD8+ T-Zellen regulatorische Eigenschaften annehmen.
In Lungenkrebspatienten wurde eine erhöhte Anzahl Foxp3-exprimierender CD8+
regulatorischen T-Zellen festgestellt (Meloni et al. 2006). Weitere Studien an Krebspatienten
zeigten, dass CD8+ regulatorische T-Zellen die Proliferation und die Zytotoxizität anderer
T-Zellen inhibieren (Filaci et al. 2007). Durch die Produktion von IL-10 unterdrücken
regulatorische CD8+ T-Zellen zudem die IFN-γ Expression anderer CD8+ T-Zellen (Entharti
et al. 2005).
3.3
Nuclear factor of activated T-cells (NFAT)
Nuclear factor of activated T cells (NFAT) wurde ursprünglich als Transkriptionsfaktor
entdeckt, der an den IL-2 Promotor bindet (Shaw et al. 1988). Die NFAT-Familie besteht aus
fünf Proteinen, NFAT1 (NFATc2, NFATp), NFAT2 (NFATc1, NFATc), NFAT3 (NFATc4),
NFAT4 (NFATx, NFATc3) und NFAT5 (tonicity enhancer binding proteinTonEBP) (Hogan
et al. 2003; Crabtree, Schreiber 2009). NFAT-Proteine werden nicht nur in aktivierten
T-Zellen, sondern auch in Gewebszellen vieler Organe, exprimiert. Eine essentielle Rolle
spielt NFAT bei der Herzentwicklung, Knochenentwicklung (Negishi-Koga, Takayanagi
2009), Pankreasentwicklung (Heit et al. 2006) und in Haut-Stammzellen (Horsley et al. 2008).
3.3.1
Aufbau der NFAT-Proteine
NFAT-Proteine besitzen eine regulatorische Domäne, die „NFAT homology region“ (NHR),
die eine amino-terminale Transaktivierungsdomäne beinhaltet. Zudem existiert eine DNABindedomäne, die „Rel-homology region“ (RHR), die mit der DNA-Bindedomäne der RELTranskriptionsfaktoren verwandt ist, (Chen et al. 1998) sowie eine Carboxyl(C)-terminaleDomäne. Die NHR ist in nicht-aktivierten T-Zellen phosphoryliert und beinhaltet die
Bindestelle für Calcineurin und andere Kinasen. Sie ist nur mäßig homolog unter den
23
verschiedenen NFAT Proteinen. NFATc1 und NFATc2 sind hoch homolog in der RHR.
NFAT3 und NFAT4 zeigen eine geringere Homologie zu NFATc1 und NFATc2 (Northrop et
al. 1994).
Jedes der NFAT Proteine besitzt alternative Spleißvarianten. Dies resultiert in einer
Variabilität innerhalb der Amino- und der Carboxylregion. NFATc1 existiert in drei
verschiedenen Isoformen: NFATc1A, NFATc1B und NFATc1C (Chuvpilo et al. 1999). Diese
unterscheiden sich in ihrer Länge und ihren Expressionsmechanismen. Die längeren
Isoformen NFATc1B+C sind in naiven T-Zellen konstitutiv exprimiert, während die kürzere
NFATc1A-Isoform in Effektor- T-Zellen exprimiert ist. Es wird vermutet, dass NFATc2
zusammen mit konstitutiv exprimiertem NFATc1 zur Expression der induzierten Isoform
NFATc1A beiträgt (Zhou et al. 2002). NFATc1A kann daraufhin, als einziges der NFAT
Proteine, in einem positiven auto-regulatorischem „Loop“ agieren (Chuvpilo et al. 2002).
Dies führt dazu, dass während der T-Zell Entwicklung die kurze NFATc1A-Isoform
akkumuliert.
3.3.2
NFAT: Aktivierung und Regulation
Die Proteine der NFAT-Familie liegen phosphoryliert im Zytoplasma vor. Erst nachdem sie
dephosphoryliert wurden, können sie in den Zellkern wandern, an die Promotoren von
Zielgenen binden und die Genexpression induzieren.
Wird in einer T-Zelle der TCR aktiviert, führt dies zu einer Aktivierung der Phospholipase C.
Diese spaltet membranständiges Phosphatidyl-4,5-bis-Phosphat in Di-acyl-glycerol (DAG)
und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3). IP3 bindet an seinen Rezeptor am Endoplasmatischen
Retikulum (ER), was zu einem Einstrom von Kalzium in das Zytoplasma führt. Aufgrund der
Leerung der Kalzium-Vorräte des ER wird der „calcium-release-activated calcium channel“
(CRAC) aktiviert und extrazelluläres Kalzium strömt in die Zelle. Freies Kalzium bindet an
das Kalzium-Sensor Protein Calmodulin, das daraufhin Calcineurin, eine Phosphatase,
aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert NFAT, woraufhin dieses aktiviert wird und in den
Zellkern wandert (Abbildung 3-3). Dort interagiert es mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren und aktiviert die Genexpression (Crabtree and Schreiber 2009; Macian 2005).
Während der Aktivierung der T-Zellen sind „activator protein 1“ (AP-1) -Proteine die HauptTranskriptionspartner von NFAT (Macian et al. 2001). In Abwesenheit von AP-1 führt der
NFAT Signalweg zu einer T-Zell-Inaktivierung (Macian et al. 2002). Neben AP-1 hat NFAT
noch andere transkriptionale Partner, darunter MAF, IRF4 und T-bet (Macian 2005).
24
Ca2+
TCR
CRAC
Zellmembran
PLC
Ca2+
PIP2
DAG
IP3
NFAT
P
Calmodulin/
Calcineurin
IP3
NFAT
ER
Ca2+
Zellkern
NFAT
Abbildung 3-3: NFAT-Signalkaskade.
3.3.3
NFAT-Proteine in der Onkogenese
In der Tumorentstehung besitzen NFATc1 und NFATc2 entgegengesetzte Effekte. Nfatc1 ist
ein Onkogen während Nfatc2 als Tumorsuppressorgen fungiert (Robbs et al. 2008). Studien
an Fibroblasten zeigen, dass eine konstitutive Expression von NFATc1 zu ZellTransformationen, ungehindertem Wachstum und Dysregulation der Zellkontakt-Inhibierung
führt (Neal et al. 2003). Außerdem spielt NFATc1 eine wichtige Rolle in der Regulation von
Quieszenz und Proliferation in Stammzellen (Horsley et al. 2008) und induziert
Lymphangiogenese (Kulkarni et al. 2009). In Pankreaskrebszellen wird NFATc1
überexprimiert, was das Entartungspotential der Zellen erhöht, da dadurch das Onkogen
c-myc induziert und die Zellproliferation erhöht wird (Buchholz et al. 2006). Bei NFATc2 ist
ein gegenteiliger Effekt auf die Tumorentstehung zu beobachten. Ist NFATc2 dauerhaft in
Fibroblasten exprimiert, führt dies zu Zellzyklus-Arrest, Apoptose und Inhibition der Rasabhängigen malignen Transformation (Robbs et al. 2008). NFATc2-defiziente Mäuse
entwickeln spontan Lymphoma und sind anfällig für chemisch-induzierte Karzinogenese.
3.3.4
NFAT-Proteine im hämatopoetischen System
NFAT Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Differenzierung sowie für
die Effektorfunktionen von Immunzellen. Es konnte bereits eine Involvierung von NFATProteinen in die Funktionen von DCs (Zanoni et al. 2009), Mastzellen (Monticelli et al. 2004;
Klein et al. 2006), B-Zellen (Haylett et al. 2009; de Gorter et al. 2007), NK- Zellen
25
(Aramburu et al. 1995), NKT-Zellen (Lazarevic et al. 2009) T-Zellen (Hermann-Kleiter, Baier
2010) sowie T-follikulären Helferzellen (Ho et al. 1996) nachgewiesen werden. Die Mehrzahl
der NFAT-Proteine, die in Lymphozyten exprimiert werden, sind NFATc1 und NFATc2 (Rao
et al. 1997). Die Funktionen der einzelnen NFAT-Proteine sind bisher noch nicht vollständig
verstanden. Studien zeigen, dass verschiedene NFAT-Proteine in Th1-, Th2-, Th17- und
regulatorischen T-Zellen an der Genexpression beteiligt sind (Hermann-Kleiter, Baier 2010).
Während
der Th1-Differenzierung induzieren
NFAT-Proteine zusammen
mit
den
Transkriptionsfaktoren STAT4 und T-bet die Expression von IFN-γ (Campbell et al. 1996;
Avni et al. 2002; Niesner et al. 2008) . In Th17-Zellen sind NFAT-Proteine an der
Genexpression von ROR-γt, IL-17, IL-21 und IL-22 beteiligt (Shen et al. 2006; Mehta et al.
2005; Maminuma et al. 2012; Hermann-Kleiter, Baier 2010). Im Verlauf der Differenzierung
regulatorischer T-Zellen induzieren NFAT-Proteine die Foxp3-Expression (Tone et al. 2008)
und leiten zusammen mit Foxp3 die Expression von CTLA4, CD25 und „glucocorticoidinduced TNFR-related proteins“ (GITR) auf der Oberfläche der suppressorischen T-Zellen ein
(Wu et al. 2006; Hu et al. 2007; Hermann-Kleiter, Baier 2010). NFAT-Proteine sind zudem in
die Induktion der suppressorischen Funktionen von regulatorischen T-Zellen involviert (Bopp
et al. 2005).
NFATc1
Für die Expression vieler T-Zell-assoziierter Gene wurde bereits eine Involvierung der
NFAT-Proteine beschrieben (s.o.). Die meisten Studien konzentrieren sich hierbei auf
NFATc2. Da NFATc1-defiziente Mäuse an einem embryonalen Herzfehler versterben
(Aliprantes et al 2008), ist die Rolle von NFATc1 in T-Zellen bisher wenig untersucht.
NFATc1-defizienten T-Zellen aus NFATc1(-/-)/Rag1(-/-) chimären Mäusen zeigten eine
verminderte Proliferationsfähigkeit und eine erniedrigte Expression der Zytokine IL-4 und
IL-6. Die Expressionslevel von IFN-γ und TNF-α wiesen in NFATc1-defizienten Th1-Zellen
im Vergleich zu Kontrollzellen keine Unterschiede auf (Yoshida et al. 1998; Ranger et al.
1998). Bei Analysen an chimären-Mäusen, die eine Defizienz für NFATc1 und NFATc2
besaßen, zeigte sich in T-Zellen eine erniedrigte Expression von IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5,
TNF-α und IL-10 (Peng et al. 2001). Promotoranalysen ergaben, dass NFATc1 an die
Promotoren verschiedener T-Zell assoziierter Gene bindet, darunter die Promotoren von Il-10
(Lee et al. 2009), Foxp3 (Tone et al. 2008), Il17a (Gomez-Rodriguez et al. 2009) und Il-2
(Kim et al. 2005).
26
3.3.5
NFAT-Inhibitoren
NFAT Inhibitoren werden in der klinischen Therapie verwendet um Organabstoßungen nach
Transplantationen zu verhindern. Der NFAT-Signalweg wird bei der Therapie durch den
Einsatz von Calcineurin-Inhibitoren wie Cyclosporin A und Tacrolimus (FK506) blockiert
(Flanagan et al. 1991). Dadurch wird die Induktion verschiedener NFAT-Zielgene in
Immunzellen unterdrückt und es findet eine Immunsuppression statt, die die Organabstoßung
verhindert. Mehr als 80 % der Nieren- und Herztransplantationspatienten erhalten
Calcineurin-Inhibitoren als Therapie (Sommerer et al. 2011; Meier-Kriesche et al. 2006). Als
Indikator für eine erfolgreiche Immunsuppression durch NFAT-Inhibitoren wurde in
therapierten Patienten die Expression der durch NFAT induzierten Gene IL-2, IFN-γ,
„granulocyte macrophage colony-stimulating factor“ (GM-CSF) und TNF-α analysiert (Giese
et al. 2004a, Giese et al. 2004b). Doch der therapeutische Einsatz von Calzineurin-Inhibitoren
bei Transplantationspatienten hat auch Nachteile. Es konnte gezeigt werden, dass durch die
Immunsuppression die Anfälligkeit gegenüber Infektionen und Tumoren erhöht ist. Patienten
mit einer durch die Therapie stark erniedrigten Menge an NFAT-regulierten Genen zeigten
beispielsweise erhöhtes Risiko an Hautkrebs zu erkranken (Sommerer et al. 2006).
27
4 Fragestellung der Arbeit
Bei Krebserkrankungen spielen die CD4+ und CD8+ T-Zellen der adaptiven Immunität eine
wichtige Rolle, da sie durch die Ausscheidung von Zytokinen und zytotoxischen Substanzen
in die Elimination von Tumorzellen involviert sind.
In Tumorgewebe von Lungenkrebspatienten konnte beobachtet werden, dass die Expression
des Transkriptionsfaktors „Nuclear factor of activated T-cells“ NFATc1 im Vergleich zu
gesundem Gewebe erhöht war. Da dies auf eine Dysregulation von NFATc1 im Tumormilieu
hinwies, war ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit, die Involvierung von NFATc1 in
anti-Tumor Immunantworten im murinen Modell zu untersuchen. NFAT-Proteine sind in
vielen Zelltypen exprimiert. In T-Zellen werden sie nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors
aktiviert und sind an der Genexpression in verschiedenen T-Zell-Subtypen beteiligt. Um die
T-Zell-spezifischen Effekte von NFATc1 zu analysieren, sollten NFATc1(fl/fl) ;CD4-Cre
Mäuse verwendet werden. Diese weisen in Zellen, die während ihrer Entwicklung oder zu
späteren Zeitpunkten CD4 exprimieren, darunter auch CD8+ T-Zellen, eine NFATc1Defizienz auf. Da Krebspatienten oft an den Folgen der Metastasierung von Tumorzellen
sterben, sollte im Rahmen dieser Arbeit neben murinen Modellen für Lungenkarzinom auch
ein Melanom-Modell, bei dem die Zellen stark in die Lunge metastasieren, verwendet werden.
Desweiteren war ein Ziel, die Rolle von NFATc1 in den Differenzierungsvorgängen von
CD4+ T-Zellen, insbesondere von Th1-, Th17- und regulatorischen T-Zellen, sowie von CD8+
T-Zellen anhand NFATc1-defizienter T-Zellen zu untersuchen. Bisherige Studien zeigten
bisher nur eine Beteiligung von NFATc1 an der Differenzierung von Th2-Zellen.
Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit war die Analyse der Rolle von IL-17A im Tumormilieu
von Lungenkarzinomen. IL-17A wird von Typ17 T-Lymphozyten, γd T-Zellen und
NKT-Zellen sekretiert. Vorangegangene Studien innerhalb der Arbeitsgruppe konnten zeigen,
dass eine Blockade von IL-17A eine Reduktion des Wachstums von Lungenkarzinomen
hervorrief. Dies war begleitet von einer erhöhten Expression von IFN-γ in CD4+ T-Zellen.
Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von IL-17A auf Tumor-assoziierte
Immunreaktionen und die Beziehung zwischen IL-17A und T-bet im Tumormilieu näher
untersucht werden. Zu diesem Zweck sollte in einem murinen Lungenkrebsmodell eine
Blockade von IL-17A durch lokale Applikation eines neutralisierenden Antikörpers sowohl in
Wild-Typ-Mäusen als auch in T-bet-defizienten Mäusen durchgeführt werden.
28
29
5 ERGEBNISSE
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden zwei verschiedene Fragestellungen
bearbeitet.
Es sollten zum einen neue Erkenntnisse über eine T-Zell-spezifische Rolle von NFATc1 im
Tumormilieu von Melanom und Lungenkarzinom gewonnen und die Beteiligung von
NFATc1 während der Differenzierung von T-Zellen untersucht werden. Dabei lag der
Schwerpunkt auf der Analyse der CD8+ und CD4+ T-Zellen. Es wurden sowohl humane
Proben untersucht als auch murine Tumormodelle verwendet. Bei der murinen Analyse
wurden konditionale NFATc1-defiziente Mäuse eingesetzt, die von Geburt an eine
funktionale NFATc1-Defizienz in CD4-exprimierenden Zellen aufwiesen, darunter auch
CD8+ T-Zellen.
Die zweite Fragestellung umfasste die Involvierung von IL-17A in anti-Tumor
Immunantworten bei Lungenkrebs. Die Untersuchungen wurden in einem murinen Modell für
Bronchialkarzinom durchgeführt. Dabei wurde der IL-17A-Signalweg mithilfe eines
neutralisierenden Antikörpers gegen IL-17A blockiert.
Alle in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für ein bis vier durchgeführte
Experimente. Pro Experiment und Versuchsgruppe wurde eine Tierzahl von 4-8 Mäusen
verwendet. Für die Analysen an humanen Lungengeweben wurden 25 Tumorbiopsien von
Lungenkrebspatienten und 10 Kontrollbiospien von nicht-tumorösem Gewebe eingesetzt.
5.1
NFATc1 in Immunreaktionen bei Lungenkrebs und
metastatischen Melanom
Der Transkriptionsfaktor NFATc1 ist Mitglied der Familie der NFAT-Proteine und reguliert
in vielen Geweben die Zellfunktionen. Er gehört zu den NFAT-Proteinen, die in T-Zellen
stark exprimiert sind. Nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors wird eine Signalkaskade in
Gang gesetzt, die zur Dephosphorylierung und somit zur Aktivierung von NFAT führt. In
seiner dephoshorylierten Form bindet NFAT an die Promotoren von Zielgenen. Vorherige
Studien haben gezeigt, dass NFATc1 an der Induktion der Th2-Zytokine IL-4 und IL-6
beteiligt ist und die Proliferation von T-Zellen aktiviert (Yoshida et al. 1998).
30
5.1.1
NFATc1-Expression bei Lungenkrebs
Im Rahmen dieser Arbeit wurde Lungengewebe von Patienten analysiert, die an einem
Lungenadenokarzinom erkrankt waren. Dies geschah in Kollaboration mit dem Uniklinikum
Mainz. Unter den Patienten befanden sich sowohl Männer als auch Frauen verschiedener
Altersgruppen und Krankheitsstadien. Die Tumore wurden von einem Pathologen mithilfe der
G-Klassifikation beurteilt. Diese beschreibt den Differenzierungsstatus eines Tumors. Tumore
der Klasse G2 sind mittelgut differenziert und G3 umschreibt schlecht differenzierte Tumore
(Sobin et al. 2009). Als Kontrolle für die Analyse diente nicht-tumoröses Lungengewebe. Aus
dem entnommenen Lungengewebe wurde die RNA isoliert und nach erfolgter cDNASynthese qPCRs für NFATc1 und CD3 durchgeführt. Die Genexpression wurde mithilfe der
∆∆Ct-Methode berechnet.
Die
Analyse
der
Lungengewebe
ergab,
dass
die
durchschnittliche
NFATc1
mRNA-Expression in den von Tumor befallenen Geweben in allen untersuchten
Tumorstadien im Vergleich zu den Kontrollgeweben erhöht war (Abbildung 5-1). Um
auszuschließen, dass die erhöhte NFATc1-Expression aufgrund einer erhöhten Anzahl an
T-Zellen im Gewebe vorlag, wurde zusätzlich die CD3-Expression bestimmt. Es konnte
beobachtet werden, dass die CD3 mRNA-Expression der von Tumor befallenen Gewebe in
allen Tumorstadien im Mittel in etwa mit dem Kontrollgewebe vergleichbar war. Einzig die
Gewebe des G3 zeigten im Vergleich zu den Kontrollgeweben im Durchschnitt eine um etwa
50 % verringerte CD3-Expression (Abbildung 5-1).
31
B
**
30
NFATc1 mRNA Expression
NFATc1 mRNA Expression
A
25
20
15
10
5
0
Ktr
AK G2
AK G2-G3
*
10
8
6
4
2
0
AK G3
C
**
16
14
12
Ktr
AK G2
AK G2-G3
AK G3
D
*
2,5
CD3 m RNA Expression
CD3 mRNA Expression
7
6
5
4
3
2
1
*
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
Ktr
AK G2
AK G2-G3
AK G3
Ktr
AK G2
AK G2-G3 AK G3
Abbildung 5-1: Erhöhte NFATc1-Expression in Gewebe von Lungen-Adenokarzinom-Patienten. Aus
Lungengewebe von Lungen-Adenokarzinom-Patienten wurde die RNA isoliert und die
mRNA-Expression von NFATc1 (A+B) und CD3 (C+D) durch qPCR bestimmt. Die Auswertung
erfolgte mittels der∆∆Ct-Methode. A und C stellen die Expressionswerte der einzelnen Patienten dar.
Die Diagramme B und C zeigen die Expressions-Mittelwerte der histopathologischen
Klassifizierungsgruppen (G2; G2-G3; G3). G: Tumor-Grading, G-Klassifikation des
Differenzierungsstatus des Tumors; AK: Adenokarzinom; Ktr:Kontrollgewebe.
5.1.2
Maus-Modelle für Lungenkarzinom und metastatisches Melanom
in konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen
Die erhöhte Expression von NFATc1 in Gewebe von Lungenkrebspatienten deutete darauf
hin, dass NFATc1 während der Krebserkrankung eine Rolle spielt. Um diese Rolle von
NFATc1 in den Tumor-assoziierten Immunantworten genauer zu analysieren, wurden
NFATc1-defiziente Mäuse im Tumormodell für Karzinom und metastatisches Melanom in
der Lunge untersucht. Da der Fokus dabei auf der Analyse der T-Zell-spezifischen
Immunreaktionen lag, wurden konditionale NFATc1-defiziente (Nfatc1∆/∆) Mäuse analysiert,
die eine funktionale NFATc1-Defizienz ausschließlich in CD4-exprimierenden Zellen,
darunter auch CD8+ T-Zellen, da diese während ihrer Entwicklung CD4 exprimieren,
aufwiesen. Um eine konditionale Defizienz zu erhalten, wurden Mäuse, bei denen die
DNA-Bindedomäne des Nfatc1-Gens sog. „loxP“-Sequenzen enthielt, mit Mäusen verpaart,
die unter dem CD4-Promotor die Cre-Rekombinase exprimierten. Als Kontrollmäuse zu den
32
konditionalen Nfatc1∆/∆ Mäusen dienten Mäuse, die zwar ein loxP-flankiertes Nfatc1-Gen,
aber keine Cre-Rekombinase besaßen und somit keine NFATc1-Deletion aufwiesen
(Nfatc1fl/fl).
Um zu überprüfen, ob in den konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen in den CD8+ und
CD4+ T-Zellen die DNA-Bindedomäne des Nfatc1-Gens erfolgreich deletiert worden war,
wurden aus der Milz von Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen die CD8+ und CD4+ T-Zellen
isoliert und eine qPCR mit Primern durchgeführt, die die DNA-Bindedomäne des Nfatc1Gens amplifizieren. Die Analyse ergab, dass in CD8+ und CD4+ T-Zellen aus Nfatc1∆/∆
Mäusen die Expression der DNA-Bindedomäne des Nfatc1-Gens sowohl in unstimulierten
Zellen, als auch in Zellen, die mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert worden
waren, im Vergleich zu den Zellen aus Nfatc1fl/fl Mäusen um etwa 90 % reduziert war
(Abbildung 5-2).
33
NFATc1 mRNA Expression
1,2
NFATc1 mRNA Expression
CD4+
1,2
***
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
NFATc1 mRNA Expression
A
CD8+
1,4
1,2
***
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
B
CD8+
1,0
***
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
αCD3/αCD28
NFATc1 mRNA Expression
CD4+
1,2
***
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
αCD3/αCD28
Abbildung 5-2: Erfolgreiche Deletion der NFATc1-DNA-Bindedomaine in CD4+ und CD8+ T-Zellen in
∆/∆
fl/fl
konditionalen NFATc1-defizenten Mäusen. Aus der Milz von Nfatc1 und Nfatc1 Mäusen wurden
mittels magnetischer Separation die CD4+ und CD8+ T-Zellen isoliert und die mRNA-Expression des
Exon 3 des NFATc1-Gens, das die DNA-Bindedomäne beinhaltet, durch qPCR ermittelt. Analysiert
wurden unstimulierte CD4+ und CD8+ T-Zellen (A) und CD4+ und CD8+ T-Zellen, die für 48 Stunden
mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert worden waren (B). Die Auswertung wurde mit der
∆∆Ct-Methode erstellt.
5.1.2.1
NFATc1-Defizienz in CD4-exprimierenden Zellen hat keinen Einfluss auf das
Wachstum von B16F10-induzierten Melanom-Metastasen in der Lunge
Für die Analyse des Wachstums der Melanom-Metastasen in der Lunge wurden die Mäuse
mit B16F10-Tumorzellen gespritzt und am Tag 11 und 15 nach Injektion der Tumorzellen die
Tumorlast in der Lunge untersucht. Dazu wurde der prozentuale Anteil der von Tumorzellen
befallenen Oberfläche der Lunge im Vergleich zu der Gesamtoberfläche der Lunge berechnet.
Weder am Tag 11 nach Tumorinduktion, an dem die Tumorlast ca. 10 % betrug, noch am Tag
15, an dem ca. 30 % der Lungenoberfläche von Tumorzellen bedeckt waren, zeigte sich ein
Unterschied des Tumorgehaltes in der Lunge NFATc1-defizienter Mäuse im Vergleich zu den
Kontrollmäusen (Abbildung 5-3).
34
A
Tumorlast (%)
12
10
8
6
4
2
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Tumorlast (%)
B
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Abbildung 5-3: Nfatc1-Defizienz in CD4-exprimierenden Zellen hat keinen Effekt auf das Wachstum von
∆/∆
metastatischen Melanomen in der Lunge. Nfatc1
und Nfatc1fl/fl Mäuse wurden intravenös mit
B16F10-Tumorzellen gespritzt und am Tag 11 (A) und Tag 15 (B) nach Injektion der Zellen die
Oberfläche der Lunge quantifiziert, die mit schwarz pigmentierten Melanomzellen bedeckt war.
5.1.2.2
Unverändertes Wachstum von Lewis-Lung-Karzinomen in der Lunge von
konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen
Für die Analyse des Tumorwachstums von Lewis-Lung-Karzinomen in der Lunge von
Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen wurden die Mäuse mit LLC1-Tumorzellen gespritzt und am
Tag 21 nach Tumorinduktion analysiert. Mithilfe von Gewebeschnitten der Lunge, die zuvor
mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt worden waren, wurde der prozentuale Anteil der
tumorösen Regionen der Lungenfläche bestimmt. Die Analyse ergab, dass kein Unterschied
im Tumorwachstum zwischen Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen vorlag (Abbildung 5-4).
Tumorlast (%)
35
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Abbildung 5-4: Unverändertes Wachstum von Lewis-Lung-Karzinomen in konditionalen NFATc1∆/∆
fl/fl
defizienten Mäusen. Nfatc1 und Nfatc1 Mäuse wurden intravenös mit LLC1-Tumorzellen gespritzt
und nach 21 Tagen die Tumorlast in der Lunge mithilfe von H&E gefärbten Gewebeschnitten
analysiert. Die Tumorlast beschreibt dabei den quantitativen Anteil der von Tumor befallenen
Regionen im Vergleich zu der analysierten Gesamtfläche der Lunge.
Eine weitere Methode, um die Tumorlast von Mäusen zu analysieren, ist ein bildgebendes
Verfahren, das an lebenden Mäusen durchgeführt wird. Dafür wurden die Mäuse mit
LL/2 (LLC1)-luc-M38-Zellen, die das Enzym Luciferase exprimieren, gespritzt. Um die
Tumorlast zu analysieren, wurde den Mäusen am Tag 16 nach Induktion des Tumors i.p.
Luciferin appliziert. Dieses wird durch die Luciferase gespalten und eine Lumineszenz
entsteht. Die Intensität des Lumineszenz-Signals stellt dabei ein Maß für die Anzahl der
Tumorzellen und somit für die Tumorlast dar. Es konnte kein Unterschied in der Tumorlast
zwischen Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen festgestellt werden (Abbildung 5-5).
Nfatc1∆/∆
Photonenfluss (P/Sek/cm2/sr)
Nfatc1fl/fl
Lumineszenz
(x 106 Photonen/Sek.)
36
16
14
12
10
8
6
4
2
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0
Abbildung 5-5: Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäuse zeigen keine Unterschiede im Wachstum von LL/2-luc-M38
∆/∆
fl/fl
Tumorzellen. Nfatc1 und Nfatc1 Mäuse wurden mit LL/2-luc-M38 Tumorzellen, die das Enzym
Luciferase exprimieren, gespritzt. Am Tag 16 nach Injektion der Zellen wurde den Mäusen i.p.
Luciferin appliziert und in vivo die Lumineszenz anhand eines bildgebenden Verfahrens gemessen. Die
Intensität des Lumineszenzsignals kann als Maß für die Tumorlast gesehen werden.
5.1.2.3
Proliferationsdefekte in NFATc1-defizienten CD4+ und CD8+ T-Zellen
Obwohl in konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen keine
Unterschiede im Wachstum von Tumoren festgestellt werden konnten, weisen die erhöhten
Expressionslevel in Biopsien von Lungenkrebspatienten darauf hin, dass NFATc1 während
der Krebserkrankung eine Rolle spielt. Um den Phänotyp der Mäuse näher zu untersuchen,
wurde zuerst analysiert, in wieweit sich eine NFATc1-Defizienz auf die Populationsgröße der
CD4+ und CD8+ T-Zellen auswirkt. In früheren Studien an NFATc1(-/-)/Rag1(-/-) chimären
Mäusen war gezeigt worden, dass NFATc1-defiziente Milz- und Lymphknotenzellen eine
verminderte Proliferationsfähigkeit aufweisen. In diesen Mäusen wurden allerdings keine
Unterschiede in der Anzahl der CD4+ und CD8+ Zellen in Lymphknoten und Milz festgestellt
(Yoshida et al. 1998).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden aus Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen die CD4+ und CD8+
T-Zellen aus der Milz isoliert und deren Anzahl bestimmt. Nfatc1∆/∆ Mäuse besaßen im
Vergleich zu Nfatc1fl/fl Kontrollmäusen eine verringerte Anzahl an CD4+ und CD8+ T-Zellen
(Abbildung 5-6).
37
12
7
**
10
8
6
4
2
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
CD8+ T-Zellen (*106)
CD4+ T-Zellen (*106)
14
***
6
5
4
3
2
1
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Abbildung 5-6: Konditionale NFATc1-defiziente Mäuse weisen weniger CD4+ und CD8+ T-Zellen auf. Aus
der Milz von Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen wurden durch magnetische Zellseparation die CD4+ und
CD8+ T-Zellen isoliert und deren Anzahl bestimmt.
5.1.2.4
Reduzierte Anzahl an regulatorische T-Zellen in konditionalen
NFATc1-defizienten Mäusen
Regulatorische T-Zellen wirken suppremierend auf das Immunsystem ein, indem sie die
Immunantwort anderer Zellen verhindern. Dadurch blockieren sie auch die Immunzellen, die
Tumore bekämpfen. In naiven und mit B16F10-Zellen gespritzten Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl
Mäusen wurde die Anzahl regulatorischer T-Zellen mithilfe von durchflusszytometrischen
Analysen ermittelt. Dafür wurden die Gesamtzellen der Lunge mit Antikörpern gegen CD4,
CD25 und Foxp3 gefärbt und die Anzahl an CD25+Foxp3+ Zellen innerhalb der CD4+
T-Zell-Population bestimmt. Die Analyse ergab, dass Nfatc1∆/∆ Mäuse mit B16F10-Tumoren
im Vergleich zu Nfatc1fl/fl Kontrollmäusen weniger CD25+Foxp3+CD4+ Zellen aufwiesen. In
den naiven Mäusen, die nicht mit Tumorzellen gespritzt worden waren, zeigten sich keine
Unterschiede in der Anzahl der regulatorischen T-Zellen zwischen den Genotypen
(Abbildung 5-7).
38
Nfatc1fl/fl
B16F10
Nfatc1∆/∆
6,83%
12,9%
8,7%
Nfatc1∆/∆
B16F10
7,02%
FSC
Foxp3
Nfatc1fl/fl
CD25
CD4
CD25+Foxp3+ Zellen innerhalb
der CD4+ Lymphozyten
SSC
14
**
*
12
10
8
6
4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2
0
naiv
B16F10
naiv
B16F10
Abbildung 5-7: Nfatc1∆/∆ Mäuse besitzen weniger regulatorische T-Zellen als Nfatc1fl/fl Mäuse. Aus naiven
und mit B16F10-Tumorzellen gespritzten Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen wurden die Gesamtzellen der
Lunge isoliert und der prozentuale Anteil der CD25+Foxp3+ Zellen innerhalb der CD4+
Lymphozytenpopulation im Durchflusszytometer bestimmt.
5.1.2.5
Erhöhte Anzahl an NK-Zellen in konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen
Natürliche Killerzellen spielen in der Tumorbekämpfung eine wichtige Rolle. Sie können
durch Ausschüttung von Perforin und Granzymen Tumorzellen direkt eliminieren. Zudem
produzieren sie IFN-γ. Um zu analysieren, ob die NFATc1-defizienten Mäuse einen
Unterschied in der Anzahl der NK-Zellen aufweisen, wurden aus naiven Nfatc1∆/∆ und
Nfatc1fl/fl Mäusen und Mäusen mit B16F10-Tumoren die Gesamtzellen der Milz isoliert, mit
Antikörpern gegen CD3 und NK1.1 gefärbt und im Durchflusszytometer analysiert.
NK-Zellen exprimieren NK1.1, sind aber, im Unterschied zu NKT-Zellen, CD3-negativ. Die
Analyse ergab, dass sowohl naive Nfatc1∆/∆ Mäuse, als auch Nfatc1∆/∆ Mäuse mit
B16F10-Tumoren
innerhalb
der
Lymphozytenpopulation
im
Vergleich
zu
den
Kontrollmäusen eine erhöhte Anzahl an CD3- NK1.1+ NK-Zellen in der Milz besaßen
(Abbildung 5-8).
39
A
Nfatc1fl/fl
B16F10
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
3,96%
5,66%
4,57%
FSC
NK1.1
4,0%
Nfatc1∆/∆
B16F10
SSC
CD3
% CD3- NK1.1+ Zellen
innerhalb der Lymphozyten
B
**
7
0,052
6
5
4
3
2
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
1
0
naiv
B16F10
naiv
B16F10
Abbildung 5-8: Erhöhte Anzahl an NK-Zellen in Nfatc1∆/∆ Mäusen. In naiven und mit B16F10
Tumorzellen gespritzten Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen wurde der prozentuale Anteil der CD3NK1.1+ NK-Zellen innerhalb der Lymphozytenpopulation in der Milz mittels Durchflusszytometrie
ermittelt.
5.1.2.6
Veränderte Genexpression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen
CD8+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Tumorbekämpfung. Sie sezernieren proinflammatorische Zytokine und zytotoxische Substanzen, die die Tumorzellen eliminieren.
Sie können aber auch immunsuppressorische Eigenschaften annehmen und dadurch das
Immunsystem an der Beseitigung von Tumoren hindern.
Um zu analysieren welche Gene in CD8+ T-Zellen im Tumormilieu von B16F10-Melanomen
in ihrer Genexpression verändert sind, wenn NFATc1 nicht funktionell ist, wurde eine
Microarray-Analyse durchgeführt. Dafür wurden CD8+ T-Zellen aus der Milz von
konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen separiert, die zuvor mit
B16F10 Tumorzellen gespritzt worden waren. Eingesetzt wurden jeweils drei Proben pro
Gruppe (NFATc1fl/fl und NFATc1∆/∆ jeweils Proben 1-3). Die Analysen ergaben, dass eine
NFATc1-Defizienz in CD8+ T-Zellen zu einer signifikanten Verminderung der Genexpression
von CTLA4, Folr4 und Ikzf2 (Helios) und einer erhöhten Genexpression von Klra8 (Ly49h)
führte. Die Expressionsunterschiede sind in Tabelle 5-1 dargestellt.
40
Tabelle 5-1: Ergebnisse des Microarrays
Gen
x-fache Erhöhung (+)/ Reduktion (-) der
Genexpression in NFATc1-defizienten CD8+
T-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen
p- Wert
CTLA4
-1,9
0,0003 (***)
Folr4
-2,19
0,00025 (***)
Ikzf2 (Helios)
-1,75
0,0014 (**)
Klra8 (Ly49h)
+ 3,76
0,0016 (**)
Zudem sind die Expressionanalysen als sog. „Heat-map“ zu sehen. Dabei sind auf der linken
Seite die Proben der NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen (Nfatc1∆/∆) und auf der rechten
Seite die Zellen der Kontrollmäuse (Nfatc1fl/fl) gezeigt (Abbildung 5-9).
Ikzf2
Folr4
Ctla4
Klra8
NFATc1fl/fl (1-3)
NFATc1∆/∆ (1-3)
-1,9
1,9
und Nfatc1fl/fl
Mäusen mit B16F10-Tumoren wurden die CD8 T-Zellen separiert und die mRNA extrahiert. Die
Erstellung des Genexpressionsprofils erfolgte in freundlicher Kooperation mit Dr. Arif Ekici, Institut
für Humangenetik, Universität Erlangen.
Abbildung 5-9: Heatmap der Microarray-Analyse. Aus jeweils drei Milzen von Nfatc1
∆/∆
+
5.1.2.6.1 Analyse der mRNA-Expression anti-inflammatorischer Proteine
Da die Microarray-Analyse ergab, dass eine NFATc1-Defizienz zu einer verminderten
Ausprägung einiger suppressorischer Eigenschaften in CD8+ T-Zellen aus Mäusen mit
41
B16F10-Melanomen führt, wurden im Folgenden die Ergebnisse des Arrays durch qPCR
überprüft, sowie andere suppressorische Marker analysiert. Studien zeigen, dass neben CD4+
T-Zellen auch CD8+ T-Zellen regulatorische Eigenschaften annehmen und die Proliferation
sowie die IFN-γ-Expression anderer CD8+ T-Zellen inhibieren können (siehe Abschnitt
3.2.6.2). Die Genexpression wurde nicht nur in CD8+ T-Zellen aus Mäusen mit B16F10Tumoren, sondern auch aus Mäusen mit LLC1-Tumoren und aus naiven Mäusen untersucht.
Helios ist ein kürzlich entdeckter Transkriptionsfaktor der Ikaros-Famillie. Studien zeigen,
dass Helios von in der Peripherie induzierten, CD4+ Foxp3-exprimierenden regulatorischen
T-Zellen exprimiert wird. Die Analyse der Helios mRNA Expression ergab, dass CD8+
T-Zellen, die aus Mäusen mit B16F10-Tumoren und aus Mäusen mit LLC1-Tumoren isoliert
worden waren, im Vergleich zu den Zellen aus den Kontrollmäusen eine verminderte Helios
mRNA-Expression aufwiesen. Auch NFATc1-defiziente Zellen aus naiven Mäusen zeigten
eine tendentiell verringerte Expression von Helios (Abbildung 5-10).
unstimulierte CD8+ T-Zellen
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
naiv
1,6
1,4
**
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
B16F10
Helios mRNA Expression
Helios mRNA Expression
Helios mRNA Expression
1,6
1,4
0,0
1,8
1,8
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
*
0,4
0,2
0,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
LLC1
Abbildung 5-10: Reduzierte Helios mRNA Expression in CD8+ T-Zellen in Abwesenheit von NFATc1. Aus
der Milz von naiven NFATc1-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen (links) und Mäusen, die zuvor
mit B16F10-(mitte) oder LLC1-Tumorzellen (rechts) gespritzt worden waren, wurden die CD8+
T-Zellen isoliert und qPCRs für Helios durchgeführt. Die Berechnung der Expressionswerte erfolgte
mithilfe der ∆∆Ct-Methode.
Folr4 ist ein Oberflächenrezeptor regulatorischer T-Zellen, der für die Funktionen der Zellen
wichtig ist. Die Analyse der Folr4 mRNA-Expression ergab, dass NFATc1-defiziente CD8+
T-Zellen eine niedrigere Folr4 mRNA-Expression aufwiesen als Kontrollzellen. Dies konnte
sowohl in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen aus naiven Mäusen, als auch in Zellen, die aus
Mäusen mit B16F10- oder LLC1-Tumoren isoliert worden waren, beobachtet werden
(Abbildung 5-11).
42
***
naiv
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
***
B16F10
Folr4 mRNA Expression
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Folr4 mRNA Expression
Folr4 mRNA Expression
unstimulierte CD8+ T-Zellen
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
*
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
LLC1
+
Abbildung 5-11: Verringerte Folr4-Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. CD8 T-Zellen
wurden aus der Milz von naiven Mäusen (links) und Mäusen, die zuvor mit B16F10- (mitte) und
LLC1-Tumorzellen (rechts) gespritzt worden waren, isoliert, und qPCRs für Folr4 durchgeführt. Die
Berechnung der Expressionswerte erfolgte mithilfe der ∆∆Ct-Methode.
CTLA4 ist ein Oberflächenrezeptor regulatorischer T-Zellen, der nach Bindung des Liganden
ein inhibitorisches Signal an Effektor-T-Zellen leitet, so dass diese inaktiviert werden. Die
Analyse von CTLA4 ergab, dass in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen, die aus Mäusen mit
B16F10- oder LLC1-Tumoren isoliert worden waren, eine Reduktion der Genexpression von
CTLA4 vorlag, während in naiven Zellen keine Verringerung der Expression zu beobachten
war (Abbildung 5-12A). Um zu überprüfen, ob naive CD8+ T-Zellen nach Stimulation des
T-Zell-Rezeptors Unterschiede in der CTLA4-Expression aufweisen, wurden die Zellen für
48 Stunden in vitro mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert und anschließend die
Genexpression bestimmt. Es zeigte sich in stimulierten NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen
im Vergleich zu stimulierten Kontrollzellen auch eine Reduktion der CTLA4-Expression
(Abbildung 5-12B).
43
A
1,6
1,4
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,6
*
CTLA4 mRNA Expression
1,6
CTLA4 mRNA Expression
CTLA4 mRNA Expression
unstimulierte CD8+ T-Zellen
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
naiv
1,4
1,2
1,0
0,8
*
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
B16F10
LLC1
B
CTLA4 mRNA Expression
in vitro mit αCD3/α
αCD28
stimulierte CD8+ T-Zellen
2,5
2,0
1,5
*
1,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,5
0,0
naiv
Abbildung 5-12: Verminderte CTLA4-Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. Aus der Milz
von naiven Mäusen und Mäusen, die zuvor mit B16F10- oder LLC1-Tumorzellen gespritzt worden
waren, wurden CD8+ T-Zellen isoliert und mittels qPCR die CTLA4 mRNA-Expression bestimmt. Die
Expression wurde in unstimulierten Zellen (A) und in Zellen, die in vitro für 48 Stunden mit αCD3 und
αCD28 Antikörpern stimulierten worden waren (B) analysiert. Die Expressionswerte wurde mithilfe
der ∆∆Ct-Methode berechnet.
Foxp3 ist ein Transkriptionsfaktor, der auf regulatorischen T-Zellen exprimiert wird. Darunter
befinden sich nicht nur CD4+ regulatorische T-Zellen, sondern auch CD8+ T-Zellen mit
regulatorischen Eigenschaften. Es konnte beobachtet werden, dass NFATc1-defiziente CD8+
T-Zellen, isoliert aus naiven Mäusen und Mäusen mit LLC1-Tumoren, nach in vitro
Kultivierung für 48 Stunden mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 im Vergleich zu den
Kontrollzellen keine Unterschiede in der Expression von Foxp3 aufwiesen (Abbildung 5-13).
In unstimulierten Zellen, die nicht mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert worden
44
waren, zeigten sich ebenfalls keine Unterschiede in der Genexpression von Foxp3 (Daten sind
nicht gezeigt).
B
Foxp3 mRNA Expression
48 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
naiv
48 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
1,4
Foxp3 mRNA Expression
A
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
LLC1
+
Abbildung 5-13: Foxp3-Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. In CD8 T-Zellen, die aus
der Milz von naiven Mäusen (A) oder Mäusen mit LLC1-Tumoren (B) isoliert und in vitro mit
Antikörpern gegen CD3 und CD28 für 48 Stunden kultiviert worden waren, wurde mittels qPCR die
Expression von Foxp3 bestimmt. Die Expressionswerte wurden mithilfe der ∆∆Ct-Methode ermittelt.
TGF-β ist ein Zytokin, das suppressorische Einflüsse auf andere Zellen des Immunsystems
ausübt, indem es deren Proliferation und Effektorfunktionen inhibiert. Für die Analyse der
TGF-β-Expression wurden CD8+ T-Zellen aus der Milz von naiven Mäusen und Mäusen, die
zuvor mit LLC1-Tumorzellen gespritzt worden waren, separiert und für 24 Stunden in vitro
mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert. Die Zellkulturüberstände wurden für
ELISA verwendet. Es konnte festgestellt werden, dass NFATc1-defiziente CD8+ T-Zellen
gleiche Mengen an TGF-β sekretierten wie die Kontrollzellen (Abbildung 5-14).
80
80
70
70
60
60
TGF-β
β (pg/ml)
TGF-β
β (pg/ml)
45
50
40
30
20
40
30
20
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
10
10
0
50
naiv
0
LLC1
Abbildung 5-14: Unveränderte TGF-β
β-Sekretion in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. Aus der Milz
von naiven Mäusen und Mäusen, die zuvor mit LLC1-Tumorzellen gespritzt worden waren, wurden die
CD8+ T-Zellen separiert und in vitro mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 für 24 Stunden kultiviert.
Die Sekretion von TGF-β in den Zellkulturüberständen wurde durch ELISA ermittelt.
Ein weiteres Zytokin, das eine inhibierende Wirkung auf Immunreaktionen ausübt, ist IL-10.
Die Analysen ergaben, dass NFATc1-defiziente CD8+ T-Zellen verminderte Mengen an IL-10
sekretierten. Dies konnte sowohl in naiven CD8+ T-Zellen als auch in Zellen, die aus Mäusen
mit B16F10-Tumoren isoliert und für 24 Stunden in vitro mit Antikörpern gegen CD3 und
CD28 kultiviert worden waren, festgestellt werden. In NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen,
die aus Mäusen mit LLC1-Tumoren isoliert und stimuliert worden waren, lag nur eine leichte
Tendenz zu einer verringerten IL-10 Expression vor (Abbildung 5-15).
46
35
40
35
**
30
25
*
20
25
20
15
10
20
15
10
15
10
5
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
5
5
0
25
IL-10 (pg/ml)
IL-10 (pg/ml)
IL-10 (pg/ml)
30
naiv
0
B16F10
0
LLC1
CD8+ T-Zellen
wurden aus der Milz von naiven Mäusen und Mäusen, die zuvor mit B16F10- oder LLC1-Tumorzellen
gespritzt worden waren, isoliert und für 24 Stunden in vitro mit Antikörpern gegen CD3 und CD28
kultiviert. Die IL-10-Proteinmenge in den Zellkulturüberständen wurde mittels ELISA bestimmt.
Abbildung 5-15: Reduzierte IL-10-Sekretion in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen.
5.1.2.6.2 Analyse der mRNA-Expression pro-inflammatorischer Proteine
Zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten spielen eine wichtige Rolle in der anti-Tumor
Immunantwort. Sie eliminieren Tumorzellen durch die Ausschüttung zytotoxischer Moleküle.
Zudem sezernieren sie die pro-inflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α
Für die Analyse wurden aus naiven NFATc1-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen, sowie
aus Mäusen mit B16F10- oder LLC1-Tumoren die CD8+ T-Zellen aus der Milz isoliert und
qPCRs für IFN-γ durchgeführt. Es konnte beobachtet werden, dass keine Unterschiede in der
Expression zwischen den Genotypen vorlagen (Abbildung 5-16A). Zudem wurde die IFN-γ
mRNA-Expression in Zellen analysiert, die, nachdem sie aus den Mäusen isoliert worden
waren, in vitro mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 stimuliert wurden. Es konnten auch
nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors keine Unterschiede in der mRNA Expression von
IFN-γ in CD8+ T-Zellen festgestellt werden (Abbildung 5-16B).
47
A
unstimulierte CD8+ T-Zellen
10
8
6
4
2
12
10
8
6
4
2
0
naiv
IFN-γγ mRNA Expression
IFN-γγ mRNA Expression
IFN-γγ mRNA Expression
12
0
14
14
14
12
10
8
6
4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2
0
B16F10
LLC1
B
48 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
3,0
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
naiv
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
LLC1
3,0
IFN-γγ mRNA Expression
2,5
3,0
IFN-γγ mRNA Expression
IFN-γγ mRNA Expression
IFN-γγ mRNA Expression
3,0
72 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
naiv
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
B16F10
Abbildung 5-16: IFN-γγ mRNA-Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. Aus der Milz von
naiven Mäusen und Mäusen, die zuvor mit B16F10- oder LLC1-Zellen gespritzt worden waren,
wurden die CD8+ T-Zellen isoliert und die IFN-γ mRNA-Expression mittels qPCR bestimmt. Dabei
wurden sowohl unstimulierte Zellen (A), als auch Zellen, die nach der Isolation in vitro mit
Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert worden waren (B), analysiert. Die Berechnung der
mRNA-Expression erfolgte mit der ∆∆Ct-Methode.
Das Zytokin TNF-α ist wichtig für die anti-Tumor Immunantwort, da es in Tumorzellen die
Apoptose auslöst. Die Expressionsanalyse von TNF-α ergab, dass NFATc1-defiziente CD8+
T-Zellen, die aus der Milz von naiven Mäusen und Mäusen mit B16F10-Tumoren isoliert und
in vitro mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 stimuliert worden waren, im Vergleich zu den
Kontrollzellen eine Tendenz zu einer verringerten Expression von TNF-α aufwiesen
(Abbildung 5-17). In unstimulierten Zellen konnten keine Expressionsunterschiede zwischen
den Genotypen festgestellt werden (Daten sind nicht gezeigt).
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
naiv
α mRNA Expression
TNF-α
TNF-α
α mRNA Expression
48
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
LLC1
Abbildung 5-17: TNF-α
α-Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. CD8 T-Zellen wurden aus
+
der Milz von naiven Mäusen und aus Mäusen, die LLC1-Tumore besaßen, isoliert, 48 Stunden mit
Antikörpern gegen CD3 und CD28 in vitro kultiviert und qPCR für TNF-α durchgeführt. Die
Berechnung der mRNA-Expression erfolgte mit der ∆∆Ct-Methode.
Das Poren-formende Protein Perforin löst eine Perforierung der Zellmembran aus, so dass
zytotoxische Granzyme in die Zielzellen gelangen und die Apoptose einleiten können.
NFATc1-defiziente CD8+ T-Zellen, die aus naiven Mäusen und Mäusen mit B16F10Tumoren isoliert worden waren, zeigten im Vergleich zu Zellen aus den Kontrollmäusen eine
erhöhte Perforin mRNA-Expression. In Zellen aus Mäusen mit LLC1-Tumoren konnten keine
Expressionsunterschiede festgestellt werden (Abbildung 5-18A). Um zu untersuchen, ob die
CD8+ T-Zellen aus den Mäusen mit LLC1-Tumoren nach in vitro Stimulation des
T-Zell-Rezeptors Unterschiede in der Genexpression von Perforin aufweisen, wurden die
Zellen nach ihrer Isolation für 48 Stunden mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert.
Es konnte beobachtet werden, dass die NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen aus den Mäusen
mit LLC1-Tumoren im Vergleich zu den Kontrollzellen nach in vitro Stimulation auch eine
erhöhte Expression von Perforin aufwiesen (Abbildung 5-18B).
49
A
*
naiv
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
Perforin mRNA Expression
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Perforin mRNA Expression
Perforin mRNA Expression
unstimulierte CD8+ T-Zellen
B16F10
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
LLC1
B
Perforin mRNA Expression
in vitro mit αCD3/α
αCD28
stimulierte CD8+ T-Zellen
3,5
3,0
**
2,5
2,0
1,5
1,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,5
0
LLC1
Abbildung 5-18: Erhöhte Perforin mRNA-Expression in Nfatc1∆/∆ CD8+ T-Zellen. Aus der Milz von
naiven Mäusen und Mäusen, die mit B16F10- oder LLC1-Tumorzellen gespritzt worden waren,
wurden die CD8+ T-Zellen isoliert und die Perforin mRNA-Expression bestimmt. Dabei wurden
qPCRs sowohl mit unstimulierten Zellen (A) als auch mit Zellen, die für 48 Stunden in vitro mit
anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern stimuliert worden waren, durchgeführt (B). Die Berechnung der
mRNA-Expression erfolgte unter Anwendung der ∆∆Ct-Methode.
In der Expression von Granzym B lagen in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen im Vergleich
zu Kontrollzellen keine Unterschiede vor. Dies konnte sowohl in unstimulierten CD8+
T-Zellen (Daten sind nicht gezeigt), als auch in Zellen aus naiven Mäusen und Mäusen mit
B16F10- oder LLC1-Tumoren, die nach ihrer Isolation in vitro mit Antikörpern gegen CD3
und CD28 stimuliert worden waren, beobachtet werden (Abbildung 5-19).
50
1,5
1,0
0,5
0,0
naiv
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
LLC1
2,5
Granzym B mRNA Expression
2,0
72 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
Granzym B mRNA Expression
2,5
Granzym B mRNA Expression
Granzym B mRNA Expression
48 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
naiv
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
B16F10
Abbildung 5-19: NFATc1 hat keinen Einfluss auf die Granzym B mRNA-Expression in CD8+ T-Zellen.
CD8+ T-Zellen wurden aus der Milz von naiven Mäusen und Mäusen, die zuvor mit B16F10- oder
LLC1-Tumorzellen gespritzt worden waren, isoliert und für 48 Stunden (links) oder 72 Stunden
(rechts) mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 in vitro kultiviert. Anschließend wurden qPCRs für
Granzym B durchgeführt. Die Berechnung der mRNA-Expression erfolgte mittels der ∆∆Ct-Methode.
Die Genexpression von IFN-γ und Perforin wird in CD8+ T-Zellen sowohl durch T-bet als
auch durch Eomes induziert. T-bet vermittelt zudem die Genexpression von Granzym B.
Die Analyse der mRNA-Expression von Eomesodermin in CD8+ T-Zellen aus der Milz ergab,
dass NFATc1-defiziente CD8+ T-Zellen aus naiven Mäusen und aus Mäusen, die B16F10oder LLC1-Tumore in sich trugen, mehr Eomes exprimierten als Zellen aus Nfatc1fl/fl Mäusen
(Abbildung 5-20).
51
unstimulierte CD8+ T-Zellen
10
8
*
6
4
2
0
**
12
Eomes mRNA Expression
12
Eomes mRNA Expression
Eomes mRNA Expression
12
10
8
6
4
2
0
naiv
10
8
6
4
*
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2
0
B16F10
LLC1
Abbildung 5-20: Erhöhte Eomes-Expression in CD8+ T-Zellen. Aus der Milz von naiven, mit B16F10-
oder LLC1-Zellen gespritzten Mäusen wurden die CD8+ T-Zellen isoliert und die Eomes
mRNA-Expression durch qPCR bestimmt. Die Berechnung der Expression erfolgte mithilfe der ∆∆CtMethode.
Die Analyse von T-bet ergab, dass NFATc1-defiziente CD8+ T-Zellen im Vergleich zu
Kontrollzellen keine Unterschiede in der mRNA-Expression des Transkriptionsfaktors
aufwiesen. Dies konnte sowohl in stimulierten CD8+ T-Zellen (Abbildung 5-21), als auch in
unstimulierten Zellen (Daten sind nicht gezeigt) festgestellt werden.
10
8
6
4
2
0
naiv
14
12
10
8
6
4
Nfatc1fl/fl
2
0
Nfatc1∆/∆
LLC1
T-bet mRNA Expression
12
T-bet mRNA Expression
T-bet mRNA Expression
14
72 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
14
T-bet mRNA Expression
48 Stunden Kultur mit αCD3/α
αCD28
14
12
10
8
6
4
2
0
naiv
12
10
8
6
4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2
0
B16F10
Abbildung 5-21: T-bet Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. Aus der Milz von Mäusen, die
mit LLC1- oder B16F10-Tumorzellen gespritzt worden waren, wurden CD8+ T-Zellen isoliert, mit
Antikörpern gegen CD3 und CD28 für 48 Stunden (links) oder 72 Stunden (rechts) kultiviert und die
T-bet mRNA-Expression mittels qPCR ermittelt. Die Berechnung der Expression erfolgte mithilfe der
∆∆Ct-Methode.
Der aktivierende Rezeptor Ly49h wird normalerweise auf der Oberfläche von NK-Zellen
exprimiert und erkennt den Liganden des Zytomegalie-Virus (CMV). Nach der Aktivierung
werden in den NK-Zellen Signalkaskaden eingeleitet, die zur Eliminierung der infizierten
Zellen führen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte beobachtet werden, dass auch
52
CD8+ T-Zellen Ly49h exprimieren. In vorangegangenen Studien war bereits gezeigt worden,
dass CD8+ T-Zellen einen den NK-Zellen ähnlichen Phänotyp entwickeln können (Kobayashi
et al. 2001). In NFATc1-defizienten Zellen lag im Vergleich zu den Kontrollzellen eine
erhöhte Expression von Ly49h vor. Dies konnte sowohl für CD8+ T-Zellen aus naiven
Mäusen, als auch aus Mäusen mit B16F10- oder LLC1-Tumoren beobachtet werden
(Abbildung 5-22).
10,0
8,0
6,0
**
4,0
2,0
0,0
naiv
12,0
10,0
**
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
B16F10
Ly49h mRNA Expression
12,0
Ly49h mRNA Expression
Ly49h mRNA Expression
unstimulierte CD8+ T-Zellen
12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
**
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2,0
0,0
LLC1
Abbildung 5-22: Erhöhte Expression von Ly49h in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. Aus der Milz von
naiven Mäusen und Mäusen, die zuvor mit B16F10- oder LLC1-Tumorzellen gespritzt worden waren,
wurden CD8+ T-Zellen isoliert und qPCRs für Ly49h durchgeführt. Die Berechnung der Expression
erfolgte mithilfe der ∆∆Ct-Methode.
53
5.2
Defekte in der T-Zell-Differenzierung in NFATc1defizienten Zellen
Naive T-Zellen differenzieren nach ihrer Aktivierung in verschiedene Subpopulationen. CD4+
T-Zellen entwickeln sich dabei u.a. zu Th1-, Th17- und regulatorischen T-Zellen. CD8+
T-Zellen können in die Subpopulationen Tc1 und Tc17 differenzieren.
Um zu untersuchen, welche Rolle NFATc1 bei der Differenzierung von CD4+ und CD8+
T-Zellen spielt, wurden aus der Milz von Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen naive T-Zellen
isoliert und mit Zytokinen, die die Differenzierung der Zellen in verschiedene Subtypen
auslösen, kultiviert. Als Kontrollkondition wurden die Zellen ohne Differenzierungs-Stimuli
nur mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern kultiviert (Th0/Tc0). Nach 40 Stunden
Kultivierung wurde die Expression spezifischer Transkriptionsfaktoren, Zytokine und
Oberflächenmoleküle analysiert.
5.2.1
Fehlerhafte Th17-Differenzierung in NFATc1-defizienten CD4+
T-Zellen
Für die Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen wurden CD4+CD62L+ Zellen mittels
magnetischer Separation aus der Milz isoliert, mit den Th17-induzierenden Zytokinen IL-6
und TGF-β sowie mit Antikörpern gegen CD3, CD28, IFN-γ und IL-4 kultiviert (Th17). Nach
40 Stunden Kultivierung wurde die mRNA-Expression mittels qPCR bestimmt. Als
Kontrollkondition wurden die Zellen nur mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern kultiviert
(Th0).
Die NFATc1-defizienten Th17-Zellen zeigten im Vergleich zu den Kontrollzellen eine
verringerte mRNA-Expression der Transkriptionsfaktoren ROR-α und ROR-γt, während
BATF
keine
Expressionsunterschiede
zwischen
den
Genotypen
zeigte.
Unter
Th0-Kulturbedingungen konnten ebenfalls keine Expressionsunterschiede festgestellt werden
(Abbildung 5-23).
54
35
30
25
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
*
20
15
10
5
0
Th0
Th17
ROR-γt mRNA Expression
B
ROR-α mRNA Expression
A
14
12
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
**
10
8
6
4
2
0
Th0
Th17
BATF mRNA Expression
C
3,0
2,5
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Th0
Th17
Abbildung 5-23: NFATc1-Defizienz vermindert die Expression de ROR-Transkriptionsfaktoren. Aus der
Milz von Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen wurden mittels magnetischer Zellseparation die
CD4+CD62L+ T-Zellen isoliert und für 40 Stunden entweder mit Antikörpern gegen CD3 und CD28
(Th0) oder mit Antikörper gegen CD3, CD28, IFN-γ, IL-4 und den Zytokinen IL-6 und TGF-β (Th17)
kultiviert. Die Bestimmung der mRNA-Expression von ROR-α (A), ROR-γt (B) und BATF (C) erfolgte
durch qPCR mithilfe der ∆∆Ct-Methode.
In NFATc1-defizienten Th17-Zellen zeigte sich im Vergleich zu den Th17-Zellen aus
Nfatc1fl/fl Mäusen eine Reduktion der mRNA-Expression von IL-21, während die Expression
von IL-10 nur tendentiell eine Verringerung zeigte. In der Expressions der Zytokine IL-17A
und IL-17F lagen keine Unterschiede zwischen den Genotypen vor. Auch in den NFATc1defizienten Zellen, die unter Th0-Bedingungen kultiviert worden waren, waren im Vergleich
zu den Kontrollzellen keine Unterschiede in der mRNA-Expression der untersuchten
Zytokine zu beobachten (Abbildung 5-24).
55
3,5
3,0
IL-17F mRNA Expression
B
IL-17A mRNA Expression
A
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Th0
Th17
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Th0
Th17
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Th0
*
Th17
IL-10 mRNA Expression
D
IL-21 mRNA Expression
C
8
7
6
5
4
3
2
1
0
70
60
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
50
40
30
20
10
0
Th0
Th17
+
Abbildung 5-24: NFATc1 induziert in Th17-Zellen die Genexpression von IL-21. Naive CD4 T-Zellen
aus der Milz wurden für 40 Stunden mit den Th17-induzierenden Zytokinen IL-6 und TGF-β sowie mit
Antikörpern gegen IFN-γ, IL-4, CD3 und CD28 (Th17) oder mit Antikörpern gegen CD3 und CD28
allein (Th0) kultiviert. Anschließend wurden zur Bestimmung der mRNA-Expression von IL-17A (A),
IL-17F (B), IL-21 (C) und IL-10 (D) qPCRs durchgeführt. Die Errechnung der Expressionswerte
erfolgte mit der ∆∆Ct-Methode.
Für die Aufrechterhaltung der Th17-Zellen ist der IL-23-Signalweg erforderlich. Th17-Zellen
exprimieren daher im Laufe ihrer Differenzierung den IL-23-Rezeptor. Die Analyse ergab,
dass unter Th0-Kulturbedingungen kultivierte NFATc1-defiziente Zellen im Vergleich zu
Kontrollzellen mehr IL-23R exprimierten. Die NFATc1-defizienten Zellen, die unter Th17induzierenden Kulturbedingungen kultiviert worden waren, zeigten im Vergleich zu Zellen
aus Kontrollmäusen eine Tendenz zu einer verringerten Expression des IL-23R (Abbildung
5-25).
IL-23R mRNA Expression
56
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
*
Th0
Th17
Abbildung 5-25: Veränderte IL-23R-Expression in NFATc1-defizienten CD4+ T-Zellen. Aus der Milz
isolierte naive CD4+CD62L+ Zellen wurden unter Th17-induzierenden Bedingungen mit den Zytokinen
IL-6 und TGF-β und Antikörpern gegen CD3, CD28, IFN-γ und IL-4 (Th17) oder mit Antikörpern
gegen CD3 und CD28 ohne weitere Stimuli (Th0) für 40 Stunden kultiviert und die mRNA-Expression
des IL-23R durch qPCR ermittelt. Die Errechnung der Expression erfolgte unter Anwendung der
∆∆Ct-Methode.
Frühere Studien haben gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor Eomes die Th17Differenzierung hemmt (Ichiyama et al 2011). In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass
die Eomes mRNA-Expression in CD4+ Zellen, die unter Th17-induzierenden Bedingungen
kultiviert wurden, im Vergleich zu Th0-Bedingungen vermindert vorlag. NFATc1-defiziente
Eomes mRNA Expression
Th17-Zellen zeigten eine erhöhte Expression des Transkriptionsfaktors (Abbildung 5-26).
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
*
Th0
Th17
+
+
Abbildung 5-26: Eomes-Expression in Th17-Zellen. Naive CD4 CD62L Milzzellen wurden entweder
mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 (Th0) oder mit Antikörpern gegen CD3, CD28, IFN-γ, IL-4 und
den Zytokinen IL-6 und TGF-β (Th17) für 40 Stunden kultiviert und anschließend eine qPCR für
Eomes durchgeführt. Die Errechnung der mRNA Expression erfolgte mit der ∆∆Ct-Methode.
5.2.2
NFATc1 ist nicht essentiell für die Th1-Differenzierung
Bisherige Studien an NFATc1-defizienten Th1-Zellen ergaben, dass diese keine Unterschiede
in der Expression von IFN-γ- und TNF-α im Vergleich zu Kontrollzellen aufweisen (Yoshida
et al. 1998). In dieser Arbeit konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Für die Analyse
wurden aus der Milz von Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen naive CD4+CD62L+ T-Zellen
mithilfe magnetischer Separation isoliert und mit IL-12 und Antikörpern gegen IL-4, CD3
57
und CD28 kultiviert (Th1). Als Kontrollkondition wurden die Zellen nur mit Antikörpern
gegen CD3 und CD28 kultiviert (Th0). Nach 40 Stunden Kultur wurde die mRNA-Expression
von IFN-γ und TNF-α mittels qPCR analysiert. NFATc1-defiziente Th1-Zellen zeigten im
Vergleich zu den Kontrollzellen weder Unterschiede in der IFN-γ mRNA-Expression noch in
der TNF-α mRNA-Expression. Auch in den Th0-Kulturbedingungen lagen keine
Unterschiede zwischen NFATc1-defizienten Zellen und Kontrollzellen vor (Abbildung 5-27).
7
6
5
4
3
2
1
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
TNF-α mRNA Expression
B
IFN-γ mRNA Expression
A
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Th0
Th1
Abbildung 5-27: Unveränderte IFN-γγ und TNF-α
α-Expression in NFATc1-defizienten Th1-Zellen. Aus der
Milz von Nfatc1∆/∆ und Nfatc1fl/fl Mäusen wurden CD4+CD62L+ T-Zellen isoliert und für 40 Stunden
unter Th1-induzierenden Bedingungen mit dem Zytokin IL-12 und Antikörpern gegen IL-4, CD3 und
CD28 kultiviert (Th1). Als Kontrollkondition wurden die Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD28
ohne zusätzliche Stimuli kultiviert (Th0). Die Expression der mRNA von IFN-γ (A) und TNF-α (B)
wurde durch qPCR ermittelt und mithilfe der ∆∆Ct-Methode berechnet.
Neben CD8+ T-Zellen können auch CD4+ T-Zellen zytolytische Eigenschaften annehmen und
Zielzellen durch die Ausscheidung zytotoxischer Moleküle eliminieren (Kiniwa et al. 2007).
Die Analyse ergab, dass NFATc1-defiziente Th0- und Th1-Zellen die gleichen mRNA level
von Granzym B und Perforin aufwiesen wie Kontrollzellen (Abbildung 5-28).
58
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Perforin mRNA Expression
B
Granzym B
mRNA Expression
A
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Th1
Th0
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Th0
Th1
Abbildung 5-28: Unveränderte Granzym B und Perforin mRNA-Expression in Th1-Zellen. Naive
CD4+CD62L+ T-Zellen wurden aus der Milz von konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen und
Kontrollmäusen isoliert und entweder nur mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 (Th0) oder
zusätzlich dazu noch mit dem Th1-induzierenden Zytokin IL-12 für 40 Stunden kultiviert (Th1). Die
Analyse der mRNA-Expression von Granzym B (A) und Perforin (B) erfolgte durch qPCR unter
Anwendung der ∆∆Ct-Methode.
Die Genexpression von IFN-γ und Perforin wird durch den Transkriptionsfaktor T-bet
induziert (Glimcher et al. 2004). Es konnten keine Unterschiede zwischen den Genotypen in
T-bet mRNA Expression
der Expression von T-bet festgestellt werden (Abbildung 5-29).
2,5
2,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
1,5
1,0
0,5
0
Th0
Th1
Abbildung 5-29: NFATc1 spielt keine Rolle in der Induktion der T-bet mRNA-Expression in CD4+
+
T-Zellen. Aus der Milz von NFATc1-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen wurden die CD4
CD62L+ T-Zellen isoliert und entweder mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 allein (Th0) oder
zusätzlich noch mit IL-12 kultiviert (Th1). Die Errechnung der mRNA Expression erfolgte mit der
∆∆Ct-Methode.
5.2.3
Unveränderte Differenzierung CD4+ regulatorischer T-Zellen in
Abwesenheit von NFATc1
In früheren Studien wurde gezeigt, dass der Promotor des Foxp3-Gens eine Bindestelle für
NFATc1 besitzt (Tone et al. 2008). Um die direkten Effekt von NFATc1 auf die
Genexpression von Foxp3 und anderen Markern regulatorischer T-Zellen zu untersuchen,
59
wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit naive CD4+ Zellen aus der Milz in vitro zu
Foxp3-exprimierenden
regulatorischen
T-Zellen
differenziert.
Dies
geschah
durch
Kultivierung der CD4+CD62L+ T-Zellen mit TGF-β, IL-2 und Antikörpern gegen CD3, CD28
und IL-6R (Treg). Als Kontrollkondition wurden die Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und
CD28 allein stimuliert (Th0).
Regulatorische T-Zellen sind u.a. durch die Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3 und
der Oberflächenmoleküle Helios, CTLA4, CD25 und Folr4 gekennzeichnet. Nach 40 Stunden
Kultur konnten im Vergleich zu den Kontrollzellen keine Unterschiede in der Expression von
Helios, CTLA4, CD25 und Foxp3 in NFATc1-defizienten Zellen festgestellt werden
(Abbildung 5-30).
60
35
30
25
20
15
10
5
0
CTLA4 mRNA Expression
B
Foxp3 mRNA Expression
A
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Th0
Treg
2,5
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Th0
Treg
D
2,5 Nfatc1fl/fl
∆/∆
2,0 Nfatc1
Helios mRNA Expression
CD25 mRNA Expression
C
3,0
1,5
1,0
0,5
0
Th0
Treg
4,0 Nfatc1fl/fl
3,5 Nfatc1∆/∆
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
Th0
Treg
25
20
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
15
10
5
0
Th0
Treg
Folr4 mRNA Expression
E
Abbildung 5-30: Die Differenzierung regulatorischer T-Zellen ist unabhängig von NFATc1. Naive
CD4+CD62L+ Zellen aus der Milz wurden entweder mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 (Th0) oder
mit Antikörpern gegen CD3, CD28, IL-6R und den Zytokinen IL-2 und TGF-β kultiviert (Treg). Nach
40 Stunden Kultur wurden qPCRs für Foxp3 (A), CTLA4 (B), CD25 (C), Helios (D) und Folr4 (E)
durchgeführt. Die mRNA-Expression wurde mittels der ∆∆Ct-Methode berechnet.
5.2.4
Fehlerhafte Tc1-Differenzierung in NFATc1-defizienten CD8+
T-Zellen
Neben CD4+ T-Zellen können auch CD8+ T-Zellen in Subtypen differenzieren. Um die Rolle
von NFATc1 in der Differenzierung von CD8+ Typ1 (Tc1) -Zellen zu ermitteln, wurden naive
CD8+ Zellen aus der Milz isoliert und mit Antikörpern gegen CD3, CD28 und IL-4 sowie
dem Zytokin IL-12 kultiviert (Tc1). Als Kontrolle dienten Zellen, die nur mit Antikörpern
gegen CD3 und CD28 kultiviert wurden (Tc0).
61
NFATc1-defiziente Tc1-Zellen wiesen eine verringerte mRNA-Expression von IFN-γ auf,
während die Expression von Granzym B im Vergleich zu den Tc1-Kontrollzellen unverändert
war. Bei den Tc0-Zellen konnte eine tendentielle Reduktion der IFN-γ mRNA Expression in
den NFATc1-defizienten Zellen festgestellt werden. Die Granzym B-Expression wies jedoch
keine Unterschiede auf (Abbildung 5-31).
B
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Tc0
*
Tc1
6
Granzym B
mRNA Expression
IFN-γ mRNA Expression
A
5
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
4
3
2
1
0
Tc0
Tc1
Abbildung 5-31: NFATc1- defiziente Tc1-Zellen exprimieren weniger IFN-γγ. Naive CD8 CD62L
+
+
Milzzellen wurden entweder unter Tc0-Kulturbedingungen mit Antikörpern gegen CD3 und CD28
oder unter Tc1-Kulturbedingungen mit Antikörpern gegen CD3, CD28, IL-4 und dem Zytokin IL-12
für 40 Stunden kultiviert. Anschließend wurde in den Zellen die mRNA-Expression von IFN-γ (A) und
Granzym B (B) mittels qPCR analysiert. Die Berechnung erfolgte unter Anwendung der ∆∆CtMethode.
Bei der Analyse der mRNA-Expression von TNF-α und T-bet konnte in den 40 Stunden
Kulturen keine Induktion der mRNA-Expression zwischen den Th0-Zellen und den Zellen,
die unter Tc1-induzierenden Bedingungen kultiviert wurden, beobachtet werden. Allerdings
war die TNF-α mRNA-Expression in NFATc1-defizienten Zellen, die unter Tc1Bedingungen kultiviert worden waren, im Vergleich zu den Tc1-Kontrollzellen verringert. In
der T-bet-Expression waren keine Unterschiede zwischen NFATc1-defizienten Zellen und
Kontrollzellen zu beobachten (Abbildung 5-32).
62
*
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
Tc0
Tc1
T-bet mRNA Expression
B
TNF-α mRNA Expression
A
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
0,2
0,0
Tc0
Tc1
Abbildung 5-32: Verringerte TNF-α
α mRNA-Expression in NFATc1-defizienten Tc1-Zellen. Aus der Milz
wurden naive CD8+CD62L+ T-Zellen isoliert und mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 (Tc0) oder
mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 und dem Zytokin IL-12 (Tc1) für 40 Stunden kultiviert. Die
Analyse der mRNA-Expression von TNF-α (A) und T-bet (B) erfolgte mittels qPCR. Die Berechnung
der Expressionslevel wurde mit der ∆∆Ct-Methode durchgeführt.
5.2.5
Defekte in der Tc17-Differenzierung in Abwesenheit von NFATc1
CD8+ Zellen können zu Tc17-Zellen differenzieren, die in ihrem Expressionsprofil den Th17Zellen sehr ähnlich sind. Für die Analyse der Rolle von NFATc1 während der
Differenzierung dieser Zellen wurden naive CD8+ Zellen sowohl mit Antikörpern gegen CD3,
CD28, IFN-γ und IL-4 als auch mit den Zytokinen IL-6, TGF-β, IL-23, IL-1β und IL-21
kultiviert (Tc17). In früheren Studien war gezeigt worden, dass diese Zytokine die
Differenzierung von naiven CD8+ T-Zellen zu Tc17-Zellen bewirken (Huber et al. 2009;
Hamada et al. 2009). Als Kontrolle dienten Zellen, die nur mit Antikörpern gegen CD3 und
CD28 kultiviert worden waren (Tc0).
Während die IL-17A und IL-17F mRNA-Expressionslevel in NFATc1-defizienten
Tc17-Zellen keine Unterschiede aufwiesen, war die IL-21 und IL-23R mRNA Expression im
Vergleich zu den Nfatc1fl/fl Kontrollzellen, die unter Tc17-Kulturbedingungen kultiviert
worden waren, verringert. In den Tc0-Kulturbedingungen konnten keine Unterschiede
zwischen den Genotypen festgestellt werden (Abbildung 5-33).
63
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IL-17F mRNA Expression
B
IL-17A mRNA expression
A
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Tc0
Tc17
20
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
15
10
5
0
Tc0
Tc17
60
50
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
*
40
30
20
10
0
Tc0
Tc17
IL-23R mRNA Expression
D
IL-21 mRNA Expression
C
25
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Tc0
*
Tc17
Abbildung 5-33: NFATc1 induziert die Expression von IL-21 und IL-23R in Tc17-Zellen. Naive
CD8+CD62L+ Milzzellen wurden entweder mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 (Tc0) oder mit
Antikörpern gegen CD3, CD28, IL-4 und IFN-γ und den Zytokinen IL-6, TGF-β, IL-23, IL-1β und
IL-21 (Tc17) für 40 Stunden kultiviert. Die Bestimmung der mRNA-Expression von IL-17A (A),
IL-17F (B), IL-21 (C) und IL-23R (D) erfolgte mittels qPCR unter Anwendung der ∆∆Ct-Methode.
Bei der Analyse der Transkriptionsfaktoren ROR-α, ROR-γt und BATF konnte keine
Induktion der mRNA-Expression zwischen Tc0 und Tc17-Kulturbedingungen beobachtet
werden. Die Analyse ergab, dass in NFATc1-defizienten Zellen, die unter Tc17-Bedingungen
kultiviert worden waren, im Vergleich zu den Tc17-Kontrollzellen, keine Veränderungen der
Expression von ROR-α und ROR-γt vorlagen. Bei BATF konnte ein Trend zu einer
verminderten Expression in Abwesenheit von NFATc1 festgestellt werden. In NFATc1defizienten Zellen, die nur mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 kultiviert worden waren,
lag im Vergleich zu den Kontrollzellen eine tendetielle Verringerung der mRNA-Expression
von ROR-γt vor (Abbildung 5-34).
64
B
2,5
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
ROR-α mRNA Expression
BATF mRNA Expression
A
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Tc0
Tc17
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
Tc0
Tc17
ROR-γt mRNA Expression
C
1,4
1,2
Nfatc1fl/fl
Nfatc1∆/∆
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Tc0
Tc17
Abbildung 5-34: Expression von BATF, ROR-α
α und ROR-γγt in Tc17-Zellen. Aus der Milz wurden naive
CD8+ T-Zellen isoliert und entweder mit Antikörpern gegen CD3 und CD28 allein (Tc0) oder
zusätzlich noch mit Antikörpern gegen IFN-γ, IL-4 und den Zytokinen IL-6, TGF-β, IL-23, IL-1β und
IL-21 (Tc17) für 40 Stunden kultiviert. Die Analyse der mRNA-Expression von BATF (A), ROR-α (B)
und ROR-γt (C) erfolgte durch qPCR und wurde mithilfe der ∆∆Ct-Methode berechnet.
65
5.3
Die Rolle von IL-17A bei Lungenkrebs
Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von IL-17A bei
Lungenkrebs. IL-17A bewirkt verschiedene Effekte im Tumormilieu. Einige Studien zeigen,
dass IL-17A das Tumorwachstum fördert, da es die Proliferation der Tumorzellen begünstigt
und angiogenetische Effekte besitzt (Takahashi et al. 2005; Numasaki et al. 2005). Andere
Studien belegen, dass Th17-Zellen die Immunantworten von CD8+ T-Zellen steigern und
somit die Tumorbekämpfung verstärken (Zhang et al. 2009; Martin-Orozco et al. 2009).
5.3.1
Inverse Korrelation zwischen IL-17A und T-bet bei Lungenkrebs
Analysen, die im Rahmen einer früheren Dissertation innerhalb der Arbeitsgruppe
durchgeführt worden waren, hatten ergeben, dass in Gewebe von Patienten mit
Lungenkarzinomen die mRNA-Expression von IL-17A und den Th17-spezifischen
Transkriptionsfaktoren ROR-α und ROR-γt im Vergleich zu gesunden Geweben erhöht war
(siehe Dissertation Ildiko Boross, Uniklinikum Mainz; Reppert et al. 2011). Dies hatte die
Vermutung nahe gelegt, dass eine Dysregulation von IL-17A im Tumormilieu von
Lungenkarzinomen vorliegt. Daher wurde in Zusammenarbeit mit Ildiko Boross die Rolle von
IL-17A bei Lungenkrebs in einem murinen Modell untersucht. Dafür wurden in Mäusen
mithilfe der brocho-alveolären Karzinom-Zelllinie L1C2 Lungentumore induziert und die
Mäuse während des Tumorwachstums mit Antikörpern gegen IL-17A behandelt. Die
Ergebnisse im Rahmen der Dissertation von Ildiko Boross ergaben, dass die Blockade von
IL-17A zu einer Reduktion der Tumorlast führt. Eine Blockade des IL-17A Signalwegs
bewirkte zudem sowohl in vivo als auch in vitro eine erhöhte Sekretion des Zytokins IFN-γ
durch CD4+ T-Zellen (siehe Dissertation Ildiko Boross und Reppert et al. 2011). Da die
Expression von IFN-γ in CD4+ T-Zellen durch den Transkriptionsfaktor T-bet induziert wird,
führte dies zu der Frage, welche Rolle T-bet bei der durch Blockade des IL-17A-Signalweges
vermittelten Verstärkung der anti-Tumor Immunantwort spielt.
Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit anhand von humanen Geweben von
Lungenkrebspatienten eine Korrelation zwischen der Expression von T-bet und IL-17A im
Tumormilieu von Lungenkarzionomen aufgestellt. Es konnte beobachtet werden, dass in den
Tumorgeweben eine inverse Korrelation zwischen der Expression von T-bet und IL-17A
vorlag (Abbildung 5-35A), während dies in den Kontrollproben nicht der Fall war (Abbildung
5-35B).
66
A
B
Tumorgewebe
Kontrollgewebe
9
R2 = 0.1378
IL-17A mRNA Expression
IL-17A mRNA Expression
y = -0.5577x + 3.1745
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
T-bet mRNA Expression
5
y = -0.0469x + 1.2756
R2 = 0.0022
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
T-bet mRNA Expression
Abbildung 5-35: Inverse Korrleation zwischen T-bet und IL-17A in Lungengewebe von
Lungenkrebspatienten. Aus Tumorgewebe von Lungenkrebspatienten und Kontrollgewebe wurde die
RNA isoliert und qPCRs für IL-17A und T-bet durchgeführt. Die Berechnung der Expressionswerte
erfolgte mithilfe der ∆∆Ct-Methode. Gezeigt sind die Korrelation der Expressionswerte von T-bet und
IL-17A in Tumorgewebe (A) und Kontrollgewebe (B).
5.3.2
T-bet spielt eine wichtige Rolle in der anti-Tumor Immunantwort
bei Lungenkarzinomen
Die inverse Korrelation zwischen T-bet und IL-17A lässt vermuten, dass T-bet und IL-17A
im Tumormilieu von Lungentumoren gegensätzlich exprimiert werden. Es konnte bereits in
früheren Studien gezeigt werden, dass T-bet für die anti-Tumor Immunantwort wichtig ist.
Eine T-bet-Defizienz führte beispielsweise zu einer erhöhten Tumorlast von MelanomMetastasen in der Lunge von Mäusen (Werneck et al. 2008; Sauer et al. 2008). Um den Effekt
einer T-bet-Defizienz auf das Wachstum von Lungenkarzinomen zu analysieren, wurden im
Rahmen der vorliegenden Arbeit Wild-Typ und T-bet(-/-) Mäusen die Lewis-LungKarzinom-Zellen LL/2-luc-M38, die das Enzym Luziferase-exprimieren, appliziert, und an
den Tagen 3, 9, 11 und 14 nach Induktion des Tumorwachstums die Tumorlast in der Lunge
bestimmt. Dies geschah durch intraperitoneale Injektion von Luciferin. Das Luciferin wird
durch die Luciferase zersetzt und es entsteht eine Lumineszenz, deren Intensität durch das
Messgerät als Photonenfluss pro Sekunde wiedergegeben wird. Je mehr Tumorzellen sich in
der Lunge der Tiere befinden, desto stärker ist das Lumineszenz-Signal. Dieses kann somit als
Maß für die Tumorlast herangezogen werden. Es konnte festgestellt werden, dass T-bet(-/-)
Mäuse im Vergleich zu Wild-Typ-Mäusen eine höhere Tumorlast von Lungenkarzinomen
aufwiesen (Abbildung 5-36).
WT
T-bet(-/-)
Tag 9
Tag 11
Tag 14
1,0
0.8
0.6
0.4
0.2
Photonenfluss
(P/Sek/cm2/sr)
Tag 3
x107
Lumineszenz
(x 107 Photonen/Sek)
67
12
WT
T-bet(-/-)
10
8
6
4
**
2
0
Tag
3
9
11
14
Abbildung 5-36: T-bet-defiziente Mäusen weisen eine erhöhte Tumorlast von Lewis-Lung-Karzinomen
auf. Wild-Typ und T-bet-defizienten Mäusen wurde die murine LL/2-luc-M38 Tumorzelllinie, die das
Enzym Luciferase exprimiert, intravenös appliziert. An den Tagen 3, 9, 11 und 14 nach
Tumorinduktion wurde den Mäusen i.p. Luciferin appliziert und das Lumineszenzsignal optisch
gemessen. Die Lumineszenz kann dabei als Maß für die Tumorlast gesehen werden.
Da im Rahmen der Dissertation von Ildiko Boross in T-bet-defizienten Mäusen nach Gabe
von Antikörpern gegen IL-17A keine Reduktion der Tumorlast im Vergleich zu
unbehandelten Mäusen beobachtet werden konnte, lässt sich vermuten, dass in Abwesenheit
von T-bet die Inhibition des IL-17A Signalwegs nicht zu einem verminderten
Tumorwachstum führt. Der IL-17A Signalweg scheint somit die Unterdrückung der antiTumor Immunantworten durch die Inhibition von T-bet zu vermitteln.
5.3.3
T-bet unterdrückt den IL-17-Signalweg durch Inhibition des
IL-17-Rezeptors
Um die Abhängigkeit von T-bet und IL-17A näher zu analysieren, wurde in T-bet-defizienten
Mäusen und Wildtyp-Mäusen die Expression des IL-17-Rezeptors auf CD4+ und CD8+
T-Zellen untersucht, da dieser für die durch IL-17A vermittelten Effektorfunktionen wichtig
ist. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass in T-bet-defizienten Mäusen mit L1C2
Tumoren eine erhöhte Anzahl an IL-17R-exprimierenden Zellen innerhalb der CD4+ und
CD8+ Zellpopulationen vorlag (Abbildung 5-37). Dies lässt vermuten, dass T-bet im
Tumormilieu die Expression des IL-17R hemmt und somit den IL-17-Signalweg unterdrückt.
Um zu analysieren, welchen Effekt die Blockade von IL-17A auf die IL-17R-Expression
besitzt, wurden Mäuse mit L1C2-Tumoren während der Tumorentwicklung mit Antikörpern
gegen IL-17A behandelt. In T-bet-defizienten Tieren, die mit Antikörpern gegen IL-17A
behandelt worden waren, konnte eine geringere Anzahl an IL17R-exprimierenden CD4+
T-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Tieren beobachtet werden. Dieser Effekt konnte im
Wild-Typ nicht festgestellt werden (Abbildung 5-37).
68
A
naiv
L1C2 L1C2 L1C2 L1C2
αIL-17A αIL-17A
100 101 102 103 104
8.18%
100 101 102 103 104
T-bet(-/-) L1C2 αIL-17A
100 101 102 103 104
4.21%
100 101 102 103 104
IL-17R
100 101 102 103 104
100 101 102 103 104
IL-17R
naiv
T-bet(-/-) L1C2
WT L1C2
**
100 101 102 103 104
CD4+IL-17R+ Zellen
innerhalb der CD4+
Lymphozyten (%)
**
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
5.68%
100 101 102 103 104
CD4
CD4
B
4
2
0
100 101 102 103 104
naiv
naiv
L1C2 L1C2
L1C2 L1C2
αIL-17A αIL-17A
CD8
2.5%
100 101 102 103 104
CD8
100 101 102 103 104
6
100 101 102 103 104
8
WT L1C2
IL1-7R
***
P<0.01
10
100 101 102 103 104
12
IL-17R
CD8+IL-17R+ Zellen
innerhalb der CD8+
Lymphozyten (%)
14
T-bet(-/-) L1C2
9.2%
100 101 102 103 104
Wild-Typ
Tbet (-/-)
Abbildung 5-37: Erhöhte IL-17R-Expression auf CD4+ und CD8+ T-Zellen in Abwesenheit von T-bet. Aus
der Lunge von naiven und mit L1C2-Tumorzellen gespritzten Wild-Typ und T-bet-defizienten
unbehandelten Mäusen und Mäusen, die mit Antikörpern gegen IL-17A behandelt worden waren,
wurden die Gesamtzellen der Lunge isoliert und mit fluoreszmarkierten Antikörpern gegen CD4, CD8
und IL-17R inkubiert. Die Bestimmung der prozentualen Menge an IL-17R-exprimierenden Zellen
innerhalb der CD4+ T-Zellen (A) und der CD8+ T-Zellen (B) erfolgte mithilfe eines
Durchflusszytometers.
Da auch in CD8+ T-Zellen in Abwesenheit von T-bet eine Erhöhung der IL-17R-Expression
vorlag, wurden die CD8+ T-Zellen näher untersucht. Um zu analysieren, welche Rolle T-bet
in der Induktion der IFN-γ-Expression in CD8+ T-Zellen im Tumormilieu besitzt, wurden
CD8+ T-Zellen aus der Lunge von T-bet(-/-) und Wild-Typ Mäusen mit L1C2-Tumoren isoliert
und die mRNA Expression von IFN-γ analysiert. Es zeigte sich in T-bet-defizienten Mäusen
im Vergleich zu Wild-Typ Mäusen eine verminderte Expression von IFN-γ (Abbildung 5-38).
Um zu untersuchen, welche Effekte eine Blockade von IL-17A sowohl in T-bet-defizienten
Mäusen, als auch in Wildtyp-Mäusen auf die Expression von IFN-γ hat, wurden beiden
Stämmen L1C2-Tumorzellen appliziert und die Mäuse mit Antikörpern gegen IL-17A
behandelt. Die Analyse ergab, dass die Blockade mit Antikörpern gegen IL-17A in WildTyp-Mäusen keine Veränderungen in der IFN-γ-Expression hervorrief, während die
IFN-γ-Expression in T-bet(-/-) Mäusen nach Applikation der Antikörper erhöht vorlag
(Abbildung 5-38).
CD8+ IFN-γ mRNA Expression
69
**
1,2
*
1,0
0,8
Wild-Typ
Tbet (-/-)
0,6
0.4
0.2
0
IgG
T5,8
IgG
T5,8
αIL-17A
T5,8
αIL-17A
T5,8
Abbildung 5-38: Verringerte IFN-γγ-Expression in T-bet-defizienten CD8+ T-Zellen. Wild-Typ Mäuse und
T-bet-defiziente Mäuse wurden mit L1C2-Tumorzellen gespritzt und an den Tagen 5 und 8 mit
Antikörpern gegen IL-17A oder IgG behandelt. Am Tag 14 nach Tumorinduktion wurden die CD8+
T-Zellen aus der Lunge isoliert und die IFN-γ mRNA-Expression mittels qPCR bestimmt. Die
Berechnung der Expressionswerte erfolgte mittels der ∆∆Ct-Methode.
Da nach Blockade von IL-17A in Abwesenheit von T-bet eine erhöhte Expression von IFN-γ
festgestellt worden war und bekannt ist, dass IFN-γ in CD8+ T-Zellen neben T-bet auch durch
Eomes induziert wird, wurde in den o.g. CD8+ T-Zellen die Expression von Eomes
untersucht. Es zeigte sich in T-bet-defizienten Zellen, im Vergleich zu den Zellen aus WildTyp-Mäusen, eine reduzierte Expression von Eomes. Zudem konnte beobachtet werden, dass
nach Blockade von IL-17A in den CD8+ T-Zellen aus den Wild-Typ-Mäusen eine Erhöhung
der Eomes-Expression vorlag (Abbildung 5-39).
CD8+ Eomes mRNA Expression
70
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
**
*
Wild-Typ
Tbet (-/-)
IgG
T5,8
IgG
T5,8
αIL-17A αIL-17A
T5,8
T5,8
Abbildung 5-39: Erhöhte Eomes-Expression in CD8+ T-Zellen nach IL-17A-Blockade. Wild-Typ und
T-bet-defiziente Mäuse wurden mit L1C2-Tumorzellen gespritzt und an den Tagen 5 und 8 nach
Tumorinduktion mit Antikörpern gegen IL-17A oder IgG behandelt. Am Tag 14 wurden die CD8+
T-Zellen aus der Lunge isoliert und die mRNA Expression von Eomes durch qPCR bestimmt. Die
Berechnung der Expressionswerte erfolgte mittels der ∆∆Ct-Methode.
5.3.4
IL-17A fördert in Lungenkarzinom-Zellen die Sekretion von IL-6
Da Studien gezeigt haben, dass IL-17A nicht nur auf das Immunsystem, sondern auch auf
andere Zellen einwirkt, wurde der Effekt von IL-17A auf die hier verwendeten Tumorzellen
analysiert. Studien an murinen Melanom-Zellen zeigten, dass IL-17A einen Einfluss auf die
IL-6-Expression besitzt (Wang et al. 2009) und somit wiederum auch die Entstehung von
IL-17A-sezernierenden Zellen begünstigt. Um zu untersuchen, ob und in wieweit IL-17A
einen Effekt auf die L1C2-Tumorzellen ausübt, wurde zuerst die Expression des IL-17R auf
den Tumorzellen untersucht. Die Analyse ergab, dass ca. 80 % der in vitro kultivierten Zellen
den IL-17R exprimierten (Abbildung 5-40).
71
Abbildung 5-40: L1C2-Tumorzellen exprimieren den IL-17-Rezeptor.
In vitro kultivierte
L1C2-Tumorzellen wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen IL17R inkubiert und der
prozentuale Anteil der IL-17R-exprimierenden Zellen im Durchflusszytometer bestimmt.
Die Kultivierung mit IL-17A löste in L1C2-Tumorzellen die Expression von IL-6 aus. Die
Expression stieg dabei proportional zu der gegebenen IL-17A-Menge (Abbildung 5-41A). Es
ist bekannt, dass viele Tumorzellen zudem das Zytokin TGF-β produzieren, um die antiTumor Immunreaktion zu unterdrücken. Auch bei den L1C2-Zellen konnte beobachtet
werden, dass diese TGF-β produzieren. IL-17A hatte dabei allerdings keinen Einfluss auf die
Menge von TGF-β (Abbildung 5-41B).
A
B
350
**
300
*
**
10
**
TGF-β1(pg/ml)
IL-6 mRNA Expression
12
8
6
*
4
200
150
100
50
2
0
250
0 ng/ml 0,5 ng/ml
rcIL-17A rcIL-17A
5 ng/ml 50 ng/ml
rcIL-17A rcIL-17A
1 µg/ml
αIL-17A
0
0 ng/ml 0,5 ng/ml
rcIL-17A rcIL-17A
5 ng/ml 50 ng/ml
rcIL-17A rcIL-17A
1 µg/ml
αIL-17A
Abbildung 5-41: IL-17A löst in L1C2-Tumorzellen die IL-6 Expression aus. L1C2-Tumorzellen wurden
in vitro für 48 Stunden mit rekombinantem IL-17A oder anti-IL-17A Antikörpern kultiviert.
Anschließend wurde die IL-6 mRNA-Expression der Zellen mittels qPCR bestimmt (A) und in den
Zellüberständen die TGF-β Menge mithilfe von ELISA gemessen (B).
72
73
6 Diskussion
Bei Krebserkrankungen spielen die CD4+ und CD8+ T-Zellen des adaptiven Immunsystems
eine wichtige Rolle. In Krebspatienten wurde erfolgreich ein Transfer von Tumorspezifischen T-Zellen durchgeführt und verbesserte den Krankheitsverlauf (Morgan et al.
2006). T-Zellen sind an der Elimination von Tumorzellen sowohl indirekt durch die Sekretion
von Zytokinen als auch direkt durch die Ausschüttung zytotoxischer Substanzen, die die
Tumorzellen in die Apoptose führen, beteiligt. Die Regulation der T-Zell spezifischen antiTumor Immunantworten ist noch nicht vollständig verstanden.
Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag daher in der Analyse der Rolle des
Transkriptionsfaktors NFATc1 in T-Zell assoziierten Immunreaktionen bei Lungenkrebs und
metastatischen Melanom. Um die Funktionen von NFATc1 in der Genexpression von
spezifischen T-Zell Subtypen zu ermitteln, wurden zudem die Effekte einer NFATc1Defizienz auf die Differenzierung von T-Zellen untersucht.
Ein weiterer Schwerpunkt im Rahmen dieser Arbeit stellte die Analyse der Rolle von IL-17A
im Tumormilieu von Lungenkarzinomen dar. Vorarbeiten innerhalb der Arbeitsgruppe hatten
gezeigt, dass eine Blockade von IL-17A zu einem verringerten Tumorwachstum im murinen
Modell führte. Da dies von einer erhöhten IFN-γ-Produktion in T-Zellen begleitet war, wurde
in der vorliegenden Arbeit zudem die Rolle von T-bet näher analysiert.
6.1
NFATc1 ist involviert in regulatorische Funktionen und
Effektorfunktionen bei Tumor
Die Zellfunktionen der adaptiven T-Zellen werden durch verschiedene Transkriptionsfaktoren
reguliert.
Die
Proteine
der
NFAT-Familie
steuern
im
Gegensatz
zu
anderen
Transkriptionsfaktoren nicht die Genexpression in spezifischen Subtypen, sondern sie sind in
vielen Subtypen exprimiert. NFAT-Proteine sind sowohl an der Expression von Genen mit
pro-inflammatorischen als auch mit anti-inflammatorischen Funktionen beteiligt. Es wurde
zudem gezeigt, dass NFAT-Proteine nicht nur die Genexpression einleiten, sondern sie
scheinen bei manchen Genen auch eine Inhibition der Expression hervorzurufen (Hodge et al.
1996; Xanthoudakis et al 1996; Kiani et al. 1997). Eine Blockierung aller Proteine der
NFAT-Familie durch den Einsatz von Calcineurin-Inhibitoren zieht eine erhöhte Anfälligkeit
gegenüber Tumoren mit sich, da die anti-Tumor Immunantwort stark eingeschränkt ist
(Sommerer et al. 2011). Dies wurde an Transplantationspatienten festgestellt, bei denen oft
74
nach der Organtransplantation NFAT-Inhibitoren eingesetzt werden, um durch eine
Verringerung der pro-inflammatorischen Zytokine eine Organabstoßung zu vermeiden. Die
Beteiligung der NFAT-Proteine an T-Zell-Funktionen wurde vor allem durch Analysen an
NFATc2-defizienten Zellen nachgewiesen. Die Folgen einer NFATc1-Defizienz in T-Zellen
sind bisher wenig untersucht, da vollständig NFATc1-defiziente Mäuse nicht lebensfähig
sind. Bisherige Studien an NFATc1(-/-)/Rag1(-/-) chimären Mäusen zeigten, dass eine Defizienz
dieses Proteins zu einer verminderten Th2-Immunantwort führt, während die Sekretion der
Th1-spezifischen Zytokine unbeeinflusst ist (Yoshida et al 1998).
Analysen an Gewebe von Lungenkrebspatienten ergaben, dass die Expression von NFATc1 in
Gewebe, das von Tumor befallen war, im Vergleich zu Kontrollgewebe erhöht war. Dies war
nicht auf eine erhöhte Anzahl an T-Zellen zurückzuführen, da die Expression von CD3 in
denselben Geweben kaum Unterschiede zwischen Kontrollgewebe und Tumorgewebe zeigte.
Bei Gewebe von Patienten im G3-Stadium der Krebserkrankung konnte sogar trotz einer
verringerten Expression von CD3 im Vergleich zu früheren Stadien der Krankheit eine gleich
bleibende NFATc1 Expression beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine
Überexpression bzw. Dysregulation von NFATc1 im Tumormilieu hin. Da die Analyse an
Gewebestücken erfolgte, kann nicht genau eingegrenzt werden, welche Zellen eine
Überexpression von NFATc1 aufwiesen, da NFATc1 nicht nur in T-Zellen, sondern auch in
anderen Zelltypen, exprimiert ist. Studien haben zudem gezeigt, dass eine Überexpression von
NFATc1 zu einer Entartung von Zellen beiträgt (Neal et al. 2003). Da NFATc1 in T-Zellen
stark exprimiert wird, ist anzunehmen, dass die detektierte Expression von NFATc1 in dem
analysierten Gewebe zu einem Teil auch die T-Zell-assoziierte Expression von NFATc1
wiedergibt. Um eine T-Zell-spezifische Involvierung von NFATc1 im Tumormilieu zu
analysieren, wurden in der vorliegenden Arbeit murine Tumormodelle für Lungenkarzinom
und metastatisches Melanom verwendet. Untersucht wurden NFATc1fl/fl;CD4-Cre Mäuse, die
eine konditionale NFATc1-Defizienz ausschließlich in CD4-exprimierenden Zellen
aufwiesen. Dazu zählen auch die CD8+ T-Zellen, da diese während ihrer Entwicklung CD4
exprimieren. Als Kontrollmäuse dienten NFATc1fl/fl Mäuse.
Die Analyse von B16F10-Metastasen in der Lunge der Mäuse zeigte keine Unterschiede in
der Tumorlast zwischen konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen.
Auch im Lewis Lung Karzinom-Modell konnten keine Unterschiede in der Tumorlast der
Lunge zwischen den Genotypen festgestellt werden. Eine NFATc1-Defizienz in CD4exprimierenden Zellen scheint somit keine sichtbaren Auswirkungen auf das Tumorwachstum
von Karzinomen und Melanom-Metastasen in der Lunge zu haben. Diese Aussage kann
75
allerdings nur für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Stadien der Krankheit getätigt
werden. In weiteren Analysen soll daher festgestellt werden, wie sich der Einfluss einer
T-Zell-spezifischen NFATc1-Deletion im gesamten Verlauf der Tumorerkrankung auswirkt.
In früheren Studien wurde zwar gezeigt, dass NFATc1 die Tumorentstehung auslösen kann,
die Rolle von NFATc1 in T-Zell-assoziierten anti-Tumor Immunreaktionen wurde bisher aber
noch nicht im Mausmodell analysiert. Untersuchungen an NFATc2-defizienten Mäusen
zeigten, dass eine NFATc2-Defizienz zu einem erhöhtem Wachstum von Alveolarkarzinomen
führte (Maxeiner et al. 2009), während das Wachstum von B16F10-Tumoren in NFATc2defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen vermindert war (Werneck et al. 2011).
Da NFATc1 und NFATc2 zum Teil unterschiedliche Funktionen besitzen, beispielsweise in
der Onkogenese, ließen sich aus den genannten früheren Publikationen keine konkreten
Hinweise für die Auswirkungen einer NFATc1-Defizienz auf das Tumorwachstum ableiten.
Zudem wurden die Analysen an Mäusen durchgeführt, die in allen Zellen eine NFATc2Defizienz aufwiesen, während in der vorliegenden Arbeit nur Mäuse mit einer Defizienz
ausschließlich in CD4-exprimierenden Zellen untersucht wurden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte festgestellt werden, dass die Anzahl an CD4+ und
CD8+ T-Zellen in der Milz von konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen im Vergleich zu
Kontrollmäusen reduziert war. Dies bestätigt die Proliferationsanalyse von Yoshida et al. und
trägt zu der Annahme bei, dass NFATc1 eine wichtige Rolle in der Expansion von T-Zellen
spielt, indem es diese fördert. Es wäre zudem möglich, dass die reduzierte Anzahl an T-Zellen
in konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen teilweise auf eine verminderte Expression von
IL-21 durch NFATc1-defiziente Typ17 T-Lymphozyten zurückzuführen ist, da dieses Zytokin
die Aufrechterhaltung der CD8+ T-Zell-Population fördert (Moroz et al. 2004). Die
Proliferation von T-Zellen ist wichtig für die klonale Expansion von Antigen-spezifischen
T-Zellen. Dadurch kann gewährleistet werden, dass Tumorzellen effektiv eliminiert werden
können. Eine reduzierte Anzahl an T-Zellen ermöglicht es den Tumorzellen sich stärker zu
vermehren, da ihr Wachstum nicht stark genug eingedämmt wird. In humanen Studien wurde
zudem gezeigt, dass der Transfer von CD8+ T-Zellen in Patienten sich positiv auf den Verlauf
der Tumorerkrankung auswirkte (Morgan et al. 2006). Die verringerte Menge an CD4+ und
CD8+ T-Zellen in NFATc1-defizienten Mäusen hätte vielleicht erwarten lassen, dass die
Mäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen ein erhöhtes Tumorwachstum aufweisen. Die
Tatsache, dass dies nicht der Fall war, kann möglicherweise dadurch erklärt werden, dass die
vorhandenen NFATc1-defizienten T-Zellen Eigenschaften aufweisen, die die anti-Tumor
Immunantwort eher unterstützen als sie zu unterdrücken.
76
6.1.1
Regulatorische Funktionen
Die Analyse ergab, dass konditionale NFATc1-defiziente Mäuse mit Melanomen in der
Lunge eine reduzierte Anzahl an CD4+ CD25+Foxp3+ regulatorischen Zellen aufwiesen. Dies
deutet darauf hin, dass eine NFATc1-Defizienz die Proliferation dieser Zellen im
Tumormilieu hemmen könnte. Regulatorische T-Zellen suppremieren die Immunantwort
anderer Zellen des Immunsystems. Sie können sowohl durch Zell-Zell Kontakte, als auch
durch die Sekretion von Zytokinen die pro-inflammatorischen Funktionen von CD8+ T-Zellen
unterdrücken (Endharti et al. 2005). Eine erhöhte Anzahl an Foxp3+ T-Zellen korreliert mit
einer schlechten Prognose in Krebspatienten, beispielsweise bei Patienten mit Eierstockkrebs
und Melanom (Curiel et al. 2004, Brody et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit konnte
zudem beobachtet werden, dass die Anzahl der Foxp3+ regulatorischen T-Zellen in KontrollMäusen mit B16F10-Metastasen in der Lunge im Vergleich zu Mäusen ohne Tumor erhöht
war. Dies spiegelt die Situation in Krebspatienten wider. Studien an Melanom-Patienten
zeigen, dass sich Foxp3+ regulatorische T-Zellen in metastatischen Tumorläsionen und
Lymphknoten anhäufen und die Funktionen der infiltrierenden T-Zellen inhibieren (Jandus
2008; Viguier 2004). Werden regulatorische T-Zellen während einer Krebserkrankung
blockiert, wirkt sich dies positiv auf das Tumorwachstum aus. Dies konnte sowohl im
murinen Tumormodell für Melanom als auch bei Tumorpatienten gezeigt werden (Kline et
al.2008, Telang et al. 2011). Die reduzierte Anzahl an regulatorischen T-Zellen mag daher
dazu beitragen, dass in konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen Effektorzellen stärker
agieren können, da ihre Funktionen weniger stark supprimiert werden.
Nicht nur CD4+ regulatorische T-Zellen üben suppremierende Effekte auf andere Zellen des
Immunsystems aus, auch CD8+ T-Zellen können einen regulatorischen Phänotyp ausbilden.
Studien haben gezeigt, dass CD8+ regulatorische T-Zellen immunsuppressorische Effekte
beispielsweise bei Prostatakrebs auslösen (Kiniwa et al. 2007). Im Rahmen der vorliegenden
Arbeit konnte beobachtet werden, dass die Expression verschiedener suppressorischer
Proteine in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen verringert war. Darunter befand sich der
Transkriptionsfaktor Helios. Dieser ist wichtig für die suppressorischen Eigenschaften CD4+
regulatorischer T-Zellen. Analysen konnten zeigen, dass eine Inhibition von Helios dazu
führt, dass regulatorischen T-Zellen CD25-negativen Zellen nicht mehr so stark in ihrer
Proliferation hemmen können. Zudem weisen Helios-defiziente CD4+ T-Zellen eine
verminderte Foxp3-Expression auf (Getnet et al. 2010). Es konnte festgestellt werden, dass
Helios nicht nur in CD4+ T-Zellen, sondern auch in CD8+ T-Zellen exprimiert wird (Akimova
et al. 2011). In Abwesenheit von NFATc1 konnten trotz einer Verringerung der Helios
77
Expression in CD8+ T-Zellen allerdings keine Unterschiede in der Expression von Foxp3
beobachtet werden. Da bisherige Studien vor allem an CD4+ T-Zellen durchgeführt worden,
kann es möglicherweise sein, dass diese Beobachtung nicht direkt auf CD8+ T-Zellen
übertragbar ist. Studien haben gezeigt, dass die Anzahl an CD8+ CD25+ Foxp3+
regulatorischen Zellen im Tumormilieu erhöht ist. Dies trägt zu einer verringerten anti-Tumor
Immunantwort bei, da diese Zellen Effektorzellen in ihrer Funktion inhibieren (Kiniwa et al.
2007). In früheren Studien wurde am Promotor von Foxp3 eine Bindestelle für NFATc1
gefunden (Tone et al. 2008). Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass NFATc1 an der
Genexpression von Foxp3 beteiligt ist. Da eine NFATc1-Defizienz keine Auswirkungen auf
die Foxp3-Expression in CD8+ T-Zellen hatte, kann vermutet werden, dass NFATc1 in CD8+
T-Zellen
nicht
essentiell
für
die
Genexpression
von
Foxp3
ist
und
andere
Transkriptionsfaktoren die Rolle von NFATc1 in der Foxp3-Expression ersetzen können.
Die Immunsuppression durch CD8+ regulatorische T-Zellen im Tumormileu erfolgt u.a. durch
die Produktion von TGF-β und IL-10 (Jarnicki et al. 2006). Bei der Induktion von TGF-β
scheint NFATc1 keine entscheidende Rolle zu spielen. Es kann davon ausgegangen werden,
dass die durch Foxp3 und TGF-β- vermittelten Effekte der Immunsuppression im
Tumormilieu nicht von NFATc1 anhängig sind. Im Gegensatz dazu scheint die Expression
von IL-10 durch NFATc1 induziert zu werden. Studien zeigen, dass IL-10 im Tumormilieu
dazu beiträgt, dass die anti-Tumor Immunantwort verringert wird (Jarnicki et al 2006). Daher
lässt sich daraus schließen, dass NFATc1 durch seinen Effekt auf die Induktion der
IL-10-Expression die anti-Tumor Immunantwort regulativ beeinflusst.
Die Expression eines weiteren regulatorischen Protein, CTLA4, war in Abwesenheit von
NFATc1 vermindert in CD8+ T-Zellen. CTLA4 ist ein dem co-stimulatorischen CD28
ähnliches Protein. Es wirkt im Gegensatz zu CD28 allerdings als ein Inhibitor, der das
Immunsystem herunterreguliert. Wird CTLA4 auf T-Zellen exprimiert, so werden diese bei
Kontakt mit co-stimulatorischen Molekülen der DCs inaktiviert und sind nicht mehr in der
Lage Tumorzellen zu bekämpfen. Die Ergebnisse der Analysen an NFATc1-defizienten
Zellen geben somit einen Hinweis darauf, dass NFATc1-defiziente CD8+ T-Zellen durch eine
verringerte CTLA4-Expression weniger stark deaktiviert werden nach Kontakt mit DCs, einen
länger andauernden Effektor-Phänotyp aufweisen und dadurch zu einer Verstärkung der durch
CD8+ T-Zellen vermittelten anti-Tumor Immunantwort beitragen. Neben Effektor-T-Zellen
exprimieren auch regulatorische T-Zellen CTLA4. Studien zeigten, dass eine Blockade von
CTLA4 spezifisch in regulatorischen T-Zellen zu einer verminderten suppressorischen
Aktivität dieser Zellen führte (Wing et al. 2008) und diese nicht mehr in der Lage waren, in
78
DCs die Expression von co-stimulatorischen Molekülen zu unterdrücken um somit die
Antigen-Präsentation der DCs zu verhindern (Oderup et al. 2006). Geht man davon aus, dass
CTLA4 in CD8+ T-Zellen ähnliche Funktionen einnimmt wie in CD4+ T-Zellen, so scheint
NFATc1 durch Induktion von CTLA4 das suppressorische Potential von CD8+ T-Zellen zu
fördern. Eine Blockade von CTLA4 wurde bereits in klinischen Studien an Melanom- und
Prostatakrebspatienten erfolgreich eingesetzt. Durch die Inhibition von CTLA4 konnte auch
dort eine Verstärkung der anti-Tumor Immunantwort erreicht werden (Verschraegen 2012;
Kwek et al. 2012). Dies lässt darauf schließen, dass eine durch Inhibition von NFATc1
vermittelte Reduktion von CTLA4 zu einer Erhöhung der anti-Tumor Immunantwort beiträgt.
Auch die Expression des Folr4 war in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen im Vergleich zu
Kontrollzellen verringert. Folr4 ist ein Oberflächenrezeptor für die Folsäure. Studien zeigen,
dass Folate-Rezeptoren in vielen Tumoren überexprimiert vorliegen, u.a. in LungenAdenokarzinomzellen (O´Shannessy et al. 2012). Auch im Immunsystem spielt der Folr4 eine
Rolle. Es konnte beobachtet werden, dass in regulatorischen T-Zellen eine starke Expression
des Rezeptors vorhanden ist. Eine Blockade von Folr4 führte in Mäusen mit Tumoren zu einer
reduzierten Anzahl an regulatorischen T-Zellen und erhöhte die anti-Tumor Immunantwort
(Yamaguchi et al. 2007). Dies gibt einen Hinweis darauf, dass die Verringerung der Folr4Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen auch zu einer Verminderung der
regulatorischer Eigenschaften dieser Zellen führt.
Geht man davon aus, dass die Funktionen der genannten regulatorischen Proteine, die vor
allem für CD4+ T-Zellen bekannt sind, in CD8+ T-Zellen ähnliche Funktionen einnehmen wie
in CD4+ T-Zellen, so kann vermutet werden, dass NFATc1 an der Induktion suppressorischer
Eigenschaften in CD8+ T-Zellen beteiligt ist. Es ist davon auszugehen, dass dies in NFATc1defizienten Mäusen dazu beiträgt, dass CD8+ T-Zellen mit einem geringeren regulatorischen
Potential ausgebildet werden. Durch eine verringerte suppressorische Aktivität der T-Zellen
wird das Immunsystem in den NFATc1-defizienten Mäusen schwächer in seiner anti-Tumor
Immunantwort inhibiert. Dies mag dazu beitragen, dass die NFATc1-defizienten Mäuse trotz
einer geringeren Anzahl an T-Zellen keine Unterschiede in der Tumorlast zu Kontrollmäusen
aufwiesen. Ob NFATc1-defiziente Zellen weniger in der Lage sind, die Immunantwort
anderer Zellen zu inhibieren, muss noch in weiteren Analysen untersucht werden.
79
6.1.2
Effektorfunktionen
Im Rahmen der Analyse der Proteine mit anti-tumoralen Funktionen zeigte sich eine erhöhte
Expression von Eomes in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen. Dies deutet darauf hin, dass
NFATc1 die Eomes-Expression in CD8+ T-Zellen inhibiert. Eomes ist in CD8+ T-Zellen ein
wichtiger Transkriptionsfaktor, da er die Expression von IFN-γ und Perforin induziert
(Glimcher et al. 2004). Studien zeigen, dass eine reduzierte Expression von Eomes zu einer
verminderten Zytotoxizität führt (Gill et al. 2012). Es lässt sich vermuten, dass NFATc1
durch die Unterdrückung der Eomes-Expression die Zytotoxizität der CD8+ T-Zellen
teilweise vermindert. Dies wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass NFATc1-defiziente
CD8+ T-Zellen eine erhöhte Expression von Perforin aufwiesen. Mäuse mit einer PerforinDefizienz zeigen ein stärkeres Wachstum von Methylcholanthren-induzierten Tumoren und
eine erhöhte Anfälligkeit für die Entwicklung von spontanen Tumoren wie Lymphoma oder
Lungen-Adenokarzinomen (Pipkin et al. 2010). Es kann vermutet werden, dass CD8+
T-Zellen in Abwesenheit von NFATc1 durch die erhöhte Menge an Perforin eine stärkere
Poren-Bildung in Tumorzellen auslösen und diese durch Granzym B schneller eliminiert
werden können. Die erhöhte Perforin-Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen
könnte eine sekundäre Folge der Erhöhung der Eomes-Expression der Zellen sein. Es ist aber
auch möglich, dass NFATc1 direkt an den Promotor von Perforin bindet und die Expression
unterdrückt. Die Expression von Granzym B zeigte keine Unterschiede in NFATc1defizienten CD8+ T-Zellen. Dies deutet darauf hin, dass NFATc1 nicht in die Induktion der
Genexpression von Granzym B involviert ist. Granzym B ist ein wesentlicher Bestandteil der
zytotoxischen Maschinerie. CD8+ CTLs scheiden Granzyme aus, die die Zielzellen in den
Zelltot führen. Da die Granzym B-Expression in NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen jedoch
unverändert war, muss in weiteren Studien noch festgestellt werden, ob in den Zellen allein
aufgrund der induzierten Perforin-Expression eine erhöhte Fähigkeit zur Elimination von
Tumorzellen vorliegt.
Die Expression von Granzym B wird in CD8+ T-Zellen durch den Transkriptionsfaktor T-bet
induziert und kann, im Gegensatz zu Perforin und IFN-γ, nicht von Eomes herbeigeführt
werden (Glimcher et al. 2004). Da die Expression von T-bet keine Unterschiede in NFATc1defizienten CD8+ T-Zellen zeigte, lässt sich vermuten, dass T-bet unabhängig von NFATc1
exprimiert wird. IFN-γ wird in CD8+ T-Zellen sowohl durch Eomes als durch T-bet induziert
und ist wichtig für die anti-Tumor Immunabwehr, da es in Tumorzellen die Expression von
MHCI induziert und dadurch deren Erkenneung durch die CD8+ CTLs erleichtert (Campbell
et al. 1985). Studien haben gezeigt, dass IFN-γ- und IFN-γR-defiziente Mäuse im Vergleich
80
zu Wildtyp-Mäusen eine erhöhte Anfälligkeit für die Entwicklung von Tumoren aufweisen
(Kaplan et al. 1998; Street et al. 2001). In NFATc1-defizienten CD8+ T-Zellen, die aus der
Milz von Mäusen mit Tumoren isoliert worden waren, konnte beobachtet werden, dass diese
keine Unterschiede in der mRNA Expression von IFN-γ im Vergleich zu Kontrollzellen
aufwiesen. Dies würde daraufhin deuten, dass NFATc1 für die Induktion von IFN-γ nicht
essentiell ist. Die Analysen der Tc1-Differenzierung in NFATc1-defizienten Zellen ergaben
allerdings, dass naive NFATc1-defiziente CD8+ T-Zellen, die mit Tc1-induzierenden
Zytokinen kultiviert worden waren, verringerte Mengen an IFN-γ exprimierten. Auch die
Expression von TNF-α war in NFATc1-defizienten, differenzierten CD8+ Tc1-Zellen im
Vergleich zu Tc1-Kontrollzellen verringert, während die Expression in den aus der Milz
isolierten CD8+ T-Zellen keine Unterschiede zwischen den Genotypen aufwies. Diese
Diskrepanz kann möglicherweise dadurch erklärt werden, dass im Rahmen der
Differenzierungsanalyse im Gegensatz zu den nicht in vitro differenzierten Zellen der Milz
speziell ein T-Zell-Subtyp untersucht wurde und dadurch die Expressionsunterschiede stärker
detektierbar sind. Dies deutet darauf hin, dass NFATc1 teilweise in die Expression von IFN-γ
und TNF-α in CD8+ T-Zellen involviert ist.
TNF-α setzt sowohl pro-inflammatorische Signalwege, als auch Signalwege, die die
Apoptose einleiten, in Kraft, da er sowohl den Transkriptionsfaktor NFκB, der die
Zellproliferation und das Zellüberleben verstärkt (Hsu et al. 1995), als auch proteolytische
Caspasen, aktiviert (Morgan et al. 2010). TNF-α wird in der Klinik bei Krebspatienten
erfolgreich eingesetzt und vermindert das Tumorwachstum beispielsweise bei Sarkomen und
Melanomen (Deroose et al. 2011a; Deroose et al. 2011b). Dies gibt einen Hinweis darauf,
dass eine erhöhte Menge von TNF-α letztendlich zu einer Verminderung des
Tumorwachstums führt. NFATc1 scheint an der Induktion der Expression von TNF-α in
CD8+ T-Zellen beteiligt zu sein und somit verstärkend auf diesen Ast der anti-Tumor
Immunantwort einzuwirken.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte zudem festgestellt werden, dass NFATc1defiziente CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen eine erhöhte Expression von Ly49h
aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass NFATc1 die Expression von Ly49h in CD8+ T-Zellen
unterdrückt. Ly49h ist normalerweise bekannt als aktivierender Rezeptor, der auf NK-Zellen
exprimiert wird. Er erkennt auf der Oberfläche von Zellen, die mit murinen ZytomegalieViren (MCMV)-infiziert sind, das virale Protein m157 und die NK-Zelle eliminiert daraufhin
die infizierte Zelle (IIzuka et al. 2007). Über die Rolle von Ly49h in CD8+ T-Zellen ist bisher
81
wenig bekannt. Humanen Studien zeigen, dass CD8+ T-Zellen einige Oberflächenmarker, die
charakteristisch für NK-Zellen sind, exprimieren können. Die Analysen dieser „NK-type“
CD8+ T-Zellen zeigten, dass diese im Vergleich zu konventionellen CD8+ T-Zellen erhöhte
Mengen an IFN-γ, Perforin und Granzym B produzierten und eine verstärkte Zytotoxizität
aufwiesen (Ohkawa et al. 2001). Studien in denen CD8+ T-Zellen konstruiert wurden, die die
extrazelluläre Domäne des Ly49h und die zytoplasmatische Domäne des CD3 besaßen,
ergaben, dass diese Zellen in der Lage sind, MCMV-infizierte Zellen zu eliminieren. Zudem
schützte ein Transfer dieser T-Zellen vor Infektionen mit MCMV (Iizuka et al. 2007). Es kann
vermutet werden, dass CD8+ T-Zellen in Abwesenheit von NFATc1 verstärkt Zellen, die mit
MCMV infiziert sind, erkennen können, um sie danach zu eliminieren. Da Ly49h speziell ein
Virus-Protein erkennt, ist fraglich, ob die erhöhte Expression dieses Rezeptors in NFATc1defizienten Zellen im Tumormilieu überhaupt irgendeinen Einfluss besitzt. Würde eine
transformierte Zelle allerdings ein Protein exprimieren, dass durch Ly49h erkannt wird, so
bestünde die Möglichkeit, dass in Abwesenheit von NFATc1 die Erkennung dieser
transformierten Zelle durch die CD8+ T-Zelle erleichtert wird und sie effektiver eliminiert
werden kann. Diese Vermutung ist allerdings sehr spekulativ.
NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunität. Sie erkennen
Tumorzellen, die eine Defizienz in MHCI-Molekülen besitzen und eliminieren diese durch
Ausscheidung zytotoxischer Substanzen. In früheren Studien wurde gezeigt, dass NK-Zellen
in die anti-Tumor Immunantwort gegen Melanome involviert sind (Carrega et al. 2009;
Casado et al. 2009). Die Analyse der NK-Zellen im murinen B16F10-Modell ergab, dass
sowohl naive, als auch von B16F10-Tumoren befallene NFATc1-defiziente Mäuse eine
erhöhte Anzahl an NK-Zellen besitzen. Da NK-Zellen kein CD4 exprimieren und somit auch
keine NFATc1-Defizienz aufweisen, ist die erhöhte Anzahl an NK-Zellen als ein sekundärer
Effekt zu betrachten. IL-21 inhibiert die Proliferation von NK-Zellen (Brady et al. 2004). Die
verringerte Expression von IL-21 in NFATc1-defizienten Typ17 T-Zellen könnte ein Grund
sein, warum die Anzahl an NK-Zellen in NFATc1-defizienten Mäusen erhöht ist. IL-21
unterdrückt zudem die Aktivierung der DCs und deren IL-12-Expression (Brandt et al. 2003).
Fällt diese Inhibition aus, ist es möglich, dass die DCs mehr IL-12 produzieren und dadurch
die Induktion von NK-Zellen steigt. Es ist davon auszugehen, dass eine erhöhte Anzahl von
NK-Zellen in NFATc1-defizienten Mäusen zu einer gesteigerten Aktivität der angeborenen
Immunität beiträgt und dadurch die anti-Tumor Immunantwort in der frühen Phase der
Tumorentwicklung verstärkt wird.
82
6.2
NFATc1 ist beteiligt an der T-Zell-Differenzierung
Um zu analysieren, welche Rolle NFATc1 in der Differenzierung spezifischer T-ZellSubtypen spielt, wurden Differenzierungsanalysen durchgeführt. Dafür wurden aus der Milz
von naiven NFATc1-defizienten Mäusen und Kontrollmäusen die naiven CD4+ oder CD8+
T-Zellen separiert und unter spezifischen Kulturbedingungen kultiviert, um die Entwicklung
zu den einzelnen Subtypen zu induzieren. Anhand NFATc1-defizienter T-Zellen aus
NFATc1(-/-)/Rag1(-/-) chimären Mäusen wurde bereits gezeigt, dass NFATc1 an der
Differenzierung von Th2-Zellen beteiligt ist, indem es die Expression von IL-4 und IL-6
induziert. In der gleichen Studie wurden auch NFATc1-defiziente CD4+ Th1-Zellen
untersucht. Diese zeigten keine Veränderungen in der Sekretion von IFN-γ und TNF-α
(Yoshida et al. 1998). Wie sich eine NFATc1-Defizienz auf die Differenzierung anderer
T-Zell-Subtypen auswirkt, wurde bisher wenig beschrieben.
6.2.1
Typ1 T-Lymphozyten
Bei der Analyse der Tc1-Differenzierung konnte eine Verringerung der IFN-γ und TNF-α
mRNA Expression in NFATc1-defizienten CD8+ Tc1-Zellen beobachtet werden, während die
Expression von Granzym B keine Unterschiede zeigte. In NFATc1-defizienten CD4+
Th1-Zellen wurde keine reduzierte IFN-γ Expression beobachtet. Dies war schon in einer
früheren Studie gezeigt worden (Yoshida et al. 1998) und deutet darauf hin, dass NFATc1
nicht essentiell für die Expression von IFN-γ in CD4+ T-Zellen ist. In CD8+ Tc1-Zellen
hingegen scheint NFATc1 die Expression von IFN-γ und TNF-α zu induzieren. Da keine
vollständige Reduktion der IFN-γ und TNF-α mRNA-Expression in NFATc1-defizienten
Tc1-Zellen
vorlag,
ist
davon
auszugehen,
dass
neben
NFATc1
auch
andere
Transkriptionsfaktoren die Expression dieser Zytokine induzieren können, allerdings nur
unvollständig. STAT4 induziert während der Differenzierung die Expression von IFN-γ, das
über STAT1 die Expression von T-bet und damit eine Verstärkung der IFN-γ Expression
auslöst (Szabo et al. 2003). Auch TNF-α wird durch STAT4 positiv reguliert (Wirtz et al.
1999). Es lässt sich vermuten, dass STAT4 in CD8+ T-Zellen ohne NFATc1 nicht ausreichend
ist, um die Expression von IFN-γ und TNF-α vollständig zu induzieren, während dies in
CD4+ T-Zellen der Fall zu sein scheint. In der Expression des Transkriptionsfaktors T-bet
zeigten sich keine Unterschiede zwischen NFATc1-defizienten Zellen und Kontrollzellen.
Dies war sowohl in CD4+ T-Zellen, als auch in CD8+ T-Zellen zu beobachten und lässt
vermuten, dass NFATc1 nicht an der Induktion der T-bet-Expression beteiligt ist oder die
83
Rolle von NFATc1 durch andere Transkriptionsfaktoren kompensiert werden kann, so dass
keine Effekte der NFATc1-Defizienz sichtbar sind. In CD4+ Th1-Zellen zeigten sich keine
Unterschiede in der Expression von Perforin und Granzym B zwischen NFATc1-defizienten
Zellen und Kontrollzellen. NFATc1 scheint in CD4+ T-Zellen, im Gegensatz zu CD8+
T-Zellen, nicht die Expression von Perforin zu unterdrücken, sondern keinen Einfluss darauf
zu haben.
6.2.2
Typ17 T-Lymphozyten
Durch Bindung von IL-6 an seinen Rezeptor wird in Typ17 T-Lymphozyten die
Phosphorylierung von STAT3 ausgelöst. pSTAT3 induziert die Expression von IL-21, IL-23R
(Dienz and Rincon 2009; Hwang 2010), ROR-γt (Hirahara et al. 2010) und BATF (Ellyard et
al. 2011). Da in NFATc1-defizienten Th17-Zellen die Expression von ROR-γt und IL-21
reduziert vorlag, ist anzunehmen, dass pSTAT3 ohne NFATc1 nicht in der Lage ist, die
Expression dieser Gene vollständig zu induzieren. Auch andere Transkriptionsfaktoren
scheinen das Fehlen von NFATc1 in der Induktion von IL-21, ROR-α und ROR-γt nicht
vollständig kompensieren zu können. Die Expression dieser Gene kommt allerdings in
Abwesenheit von NFATc1 nicht gänzlich zum Erliegen. Dies deutet darauf hin, dass pSTAT3
und andere Transkriptionsfaktoren in der Lage sind, die Expression teilweise zu vermitteln.
Studien zeigen, dass in STAT3-defizienten Zellen eine 10-fach verringerte Expression von
ROR-γt vorliegt (Yang et al. 2007). Dies lässt vermuten, dass STAT3 in der Induktion von
ROR-γt eine sehr wichtige Rolle spielt, während für NFATc1 nur eine Beteiligung an der
Expression vorliegt. Da Studien gezeigt haben, dass Eomes in Th17-Zellen die Expression
von ROR-γt unterdrückt (Ichiyama et al 2011), könnte die reduzierte Expression von ROR-γt
in NFATc1-defizienten Th17-Zellen auch sekundär durch eine erhöhte Expression von Eomes
in diesen Zellen hervorgerufen werden. Im Gegensatz zu Perforin scheint NFATc1 die
Expression von Eomes sowohl in CD8+ als auch in CD4+ T-Zellen zu unterdrücken.
Die Tatsache, dass die Expression des IL-23-Rezeptors in Tc17-Zellen verringert und in
Th17-Zellen tendentiell reduziert vorlag, aber in nicht-differenzierten Th0-Zellen erhöht war
in Abwesenheit von NFATc1, lässt eine unterschiedliche Rolle von NFATc1 in der
Regulation der IL-23R-Expression vermuten. Der IL-23 Signalweg ist nicht an der Induktion,
sondern an der Aufrechterhaltung des Th17-Phänotyps beteiligt. Erst nach Initialisierung der
Th17-Differenzierung wird die Expression des IL23R induziert (Aggarwal et al. 2003). Dies
könnte ein Hinweis darauf sein, dass NFATc1 in bereits differenzierten Th17-Zellen die
84
IL-23R-Expression induziert, während er in naiven Zellen die Expression des Rezeptors
unterdrückt.
In Abwesenheit von NFATc1 waren die Expressionslevel von IL-17A und IL-17F in Th17und Tc17-Zellen unverändert in Vergleich zu Zellen, die NFATc1 exprimieren. Die
Genexpression von IL-17A und IL-17F wird durch die Transkriptionsfaktoren ROR-α,
ROR-γt, pSTAT3 und BATF vermittelt (Hwang 2010). Die Verringerung der Expression von
ROR-α und ROR-γt in NFATc1-defizienten Zellen und die Tatsache, dass der IL-17APromotor eine NFATc1-Bindestelle aufweist (Gomez-Rodriguez et al. 2009), hätte eine
reduzierte Expression von IL-17A in Abwesenheit von NFATc1 erwarten lassen. Da dies aber
nicht der Fall ist, ist davon auszugehen, dass NFATc1 zwar eine Rolle bei der Expression
dieser Zytokine spielt, aber nicht essentiell ist. Es scheinen andere Transkriptionsfaktoren das
Fehlen von NFATc1 kompensieren zu können. Dies könnten beispielsweise BATF und
STAT3 sein. In NFATc1-defizienten Th17-Zellen konnte eine tendentielle Reduktion der
IL-10-Expression im Vergleich zu Kontrollzellen festgestellt werden. Dies gibt einen Hinweis
darauf, dass NFATc1 während der Th17-Differenzierung die IL-10 Expression induzieren
könnte. Dies würde die Analyse von Lee et al.stützen, die am il-10 Promotor eine NFATc1Bindestelle nachwiesen (Lee et al. 2009). Da aber nur eine tendentielle Verringerung der
Expression vorliegt, sind noch weitere Analysen durchzuführen.
In CD8+ Tc17-Zellen konnte während der in vitro Zelldifferenzierung nach 40 Stunden Kultur
kaum eine Induktion von ROR-γt, ROR-α und BATF im Vergleich zu Zellen, die nicht unter
Tc17-induzierenden Bedingungen kultiviert worden waren, festgestellt werden. Dies könnte
ein Hinweis darauf sein, dass diese Transkriptionsfaktoren im Vergleich zu Th17-Zellen
eventuell eine leicht abweichende Rolle während der Tc17-Differenzierung spielen. Um dies
festzustellen, müssen noch weitere Analysen an unterschiedlichen Zeitpunkten während der in
vitro Differenzierung durchgeführt werden.
6.2.3
Regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen vermitteln die Suppression von Immunreaktionen u.a. durch zelluläre
Interaktionen. Die Analyse der Differenzierungsvorgänge in CD4+ regulatorischen T-Zellen
ergab, dass durch die Kultivierung der naiven T-Zellen mit TGF-β und IL-2 die Expression
von CD25, Foxp3, CTLA4, Helios und Folr4 induziert wurde im Vergleich zu Th0-Zellen.
NFATc1-defiziente Treg-Zellen zeigten allerdings bei keinem der genannten Gene im
Vergleich zu Kontrollzellen Unterschiede in der Expression. Am Promotor des Foxp3-Gens
85
wurde in früheren Studien eine Bindestelle für NFATc1 gefunden (Tone et al. 2008). Dies
legt die Vermutung nahe, dass NFATc1 zwar an der Genexpression von Foxp3 beteiligt ist,
aber in Abwesenheit von NFATc1 andere Transkriptionsfaktoren den Verlust von NFATc1
ersetzen können. In regulatorischen T-Zellen führen TGF-β und IL-2 zu einer Aktivierung
von SMAD2/3 bzw. STAT5, die wiederum die Expression von Foxp3 induzieren (Fuji et al.
1995; Fantini et al. 2004; Passerini et al. 2008). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese
beiden Transkriptionsfaktoren oder noch weitere Transkriptionsfaktoren ohne NFATc1 die
Induktion der Foxp3-Expression vermitteln können. Es ist anzunehmen, dass NFATc1 auch
bei der Induktion der Genexpression von CTLA4 und CD25 keine essentielle Rolle spielt. Die
Expression von CTLA4 und CD25 wird von Foxp3 und dem „Runt-related transcription
factor 1“ (Runx1) induziert (Ono et al. 2007) und daher kann somit vermutet werden, dass
Foxp3 und Runx1 die Expression dieser Gene ohne NFATc1 vermitteln können. Auch bei der
Induktion der Expression von Helios und Folr scheint NFATc1 nicht essentiell zu sein. Diese
Ergebnisse stehen teilweise im Gegensatz zu den Funktionen von NFATc1 in CD8+ T-Zellen
und deuten daraufhin, dass NFATc1 in CD4+ und CD8+ T-Zellen verschiedene Funktionen
haben kann.
86
6.3
Die Rolle von IL-17A bei Lungenkrebs
IL-17A wird von Typ17-Lymphozyten, NKT-Zellen und γd T-Zellen sezerniert (Iwakura et
al. 2011). Die Rolle des Zytokins im Tumormilieu ist umstritten. Studien zeigen, dass IL-17A
sowohl das Tumorwachstum fördernde, als auch hemmende Effekte besitzt. In der
vorliegenden Arbeit sollte die Rolle von IL-17A im Tumormilieu von Lungenkarzinomen
analysiert werden. Vorarbeiten innerhalb der Arbeitsgruppe hatten gezeigt, dass die
Expression von IL-17A im Tumorgewebe von Lungenkrebspatienten im Vergleich zu
Lungengewebe, das nicht von Tumor befallen war, erhöht war. Dies ließ vermuten, dass eine
Dysregulation von IL-17A im Tumormilieu von Lungenkrebs vorliegt. Bei anderen
Tumorerkrankungen wie besipielsweise Magenkrebs und Eierstockkrebs wurde bereits eine
erhöhte Anahl an Th17-Zellen im Tumormilieu beobachtet, was im Zusammenhang mit einer
schlechten klinischen Prognose stand (Zhang et al. 2008; Miyahara et al. 2008).
In vorangegangenen Studien innerhalb der Arbeitsgruppe war gezeigt worden, dass eine
lokale Inhibition von IL-17A in einem murinen Modell für Lungenkarzinom durch die
Applikation eines neutralisierenden Antikörpers das Tumorwachstum in der Lunge reduzierte.
Zudem lag eine erhöhte Expression von IFN-γ in CD4+ T-Zellen nach Blockade von IL-17A
vor (Dissertation Ildiko Boross; Reppert et al. 2011). IFN-γ ist wichtig für die anti-Tumor
Immunantwort, da es die Tumor-Angiogenese durch einen direkten Einfluss auf die
Tumorzellen verhindert (Beatty, Paterson 2001), die Apoptose von Tumorzellen durch
Erhöhung der Fas-Expression induziert (Xu et a. 1998) und die Entstehung regulatorischer
T-Zellen unterdrückt (Nishikawa et al. 2005). Zudem erhöht es in Tumorzellen die Expression
von MHCI-Molekülen, was ihre Erkennung durch CD8+ CTLs verstärkt (Wan et al. 1987).
Die Expression von IFN-γ wird durch den Transkriptionsfaktor T-bet induziert (Szabo et al.
2000). In T-bet-defizienten Mäusen hatte nach Blockade von IL-17A keine Reduktion der
Tumorlast festgestellt werden können (Dissertation Ildiko Boross; Reppert et al. 2011). Es
kann angenommen werden, dass die Reduktion der Tumorlast nach Blockade von IL-17A
durch T-bet vermittelt wird. Korrelationsanalysen ergaben, dass die Expression von IL-17A
und T-bet im Tumorgewebe von Lungenkrebspatienten invers korrelieren, d.h., dass bei
niedriger T-bet-Expression eine hohe IL-17A-Expression vorliegt und umgekehrt. In früheren
Studien war bereits gezeigt worden, dass T-bet die Expression von IL-17 durch die Inhibition
des Th17-Transkriptionsfaktors ROR-γt hemmt (Mathur et al. 2006; Lazarevic et al. 2011).
Andere Studien belegen, dass IL-17 die durch den IL-12R vermittelte Expression von IFN-γ
87
unterdrückt, indem es die Expression des IL-12R hemmt (Toh et al. 2009). IFN-γ wiederum
ist in Th1-Zellen wichtig für die Induktion der T-bet-Expression. Diese Studien bestätigen,
dass nicht nur T-bet die Expression von IL-17 negativ beeinflusst, sondern IL-17 auch einen
regulativen Effekt auf IFN-γ bzw. T-bet hat.
T-bet spielt eine wichtige Rolle in der anti-Tumor Immunantwort. Dies wurde beispielsweise
in einem murinen Modell für Melanom ermittelt. T-bet-defiziente Mäusen zeigten ein
geringeres Wachstum von Melanom-Metastasen in der Lunge (Werneck et al. 2008). Um zu
überprüfen, ob T-bet auch für die Eliminierung von Lungenkarzinomen wichtig ist, wurde in
dieser Arbeit in T-bet-defizienten Mäusen das Wachstum von Karzinomen induziert und die
Tumorlast in der Lunge bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass eine Defizienz von
T-bet sowohl in der frühen Phase, als auch in der späten Phase der Tumorentwicklung zu
einem erhöhten Wachstum von Lungenkarzinomen im Vergleich zu Wild-Typ Mäusen führte.
Daraus lässt sich schließen, dass T-bet auch eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von
Lungenkarzinomen spielt.
Um festzustellen, welche Effekte T-bet auf den IL-17 Signalweg im Tumormilieu ausübt,
wurde die Expression des IL-17-Rezeptors auf T-Zellen von T-bet-defizienten Mäusen im
Vergleich zu Wild-Typ Mäusen untersucht Es konnte beobachtet werden, dass im
Tumormilieu die Abwesenheit von T-bet zu einer erhöhten Anzahl an IL-17R-exprimierenden
CD4+ und CD8+ T-Zellen führte. Dies deutet darauf hin, dass T-bet die Expression des
IL-17R hemmt. In früheren Studien in murinen Modellen für Prostatakrebs und Melanom
wurde festgestellt, dass eine Defizienz des IL-17 Rezeptors das Tumorwachstum unterdrückt.
Dies war begleitet von einer erhöhten Infiltration von CD8+ T-Zellen und einer verminderten
Infiltration suppressorischer Immunzellen. Auch die Blockade von IL-17A führte in den
genannten Tumormodellen zu einer Reduktion des Tumorwachstums, wohingegen die
Applikation von IL-17A ein verstärktes Tumorwachstum verursachte (He et al. 2010). Die
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben einen Hinweis darauf, dass T-bet an der
Unterdrückung des IL-17R in CD4+ und CD8+ T-Zellen beteiligt ist, somit den
IL17-Signalweg inhibiert und dadurch das Tumorwachstum vermindert. Ob T-bet direkt die
Expression des IL-17R unterdrückt oder ob dies durch sekundäre Effekte ausgelöst wird,
muss noch weiter untersucht werden. Ein Protein, von dem bekannt ist, dass es die Expression
des IL-17R induziert, ist IL-21 (Zeng et al. 2005). Studien zeigen, dass T-bet eine
inhibitorische Wirkung auf die Expression von IL-21 besitzt (Mehta et al. 2005). Es besteht
daher die Möglichkeit, dass T-bet durch seine inhibitorische Wirkung auf IL-21 die Induktion
des IL-17R in CD4+ und CD8+ T-Zellen im Tumormilieu vermindern könnte. Eine Blockade
88
von IL-17A führte in T-bet-defizienten Mäusen mit Tumoren zu einer verringerten Anzahl an
IL-17R+ CD4+ T-Zellen im Vergleich zu T-bet-defizienten Mäusen, die nicht mit Antikörpern
gegen IL-17A behandelt worden waren. In Wild-Typ Mäusen konnten hingegen nach
Blockade von IL-17A keine Veränderungen in der Anzahl der CD4+IL-17R+ Zellen
beobachtet werden. Es kann vermutet werden, dass in Abwesenheit von T-bet IL-17A die
Expression des IL-17R induziert. Ist T-bet vorhanden, scheint IL-17A nicht in der Lage zu
sein, die IL-17R Expression zu beeinflussen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass T-bet die durch
IL-17A vermittelte Induktion des IL-17R unterdrückt.
Weitere Analysen zeigten, dass T-bet-defiziente CD8+ T-Zellen im Tumormilieu eine
verringerte Expression von IFN-γ aufwiesen. Da die Expression von IFN-γ in CD8+ T-Zellen
in Abwesenheit von T-bet nicht vollständig zum erliegen kam, zeigt, dass T-bet nicht
essentiell für die IFN-γ Expression ist. Bereits in früheren Studien konnte beobachtet werden,
dass T-bet zwar in CD4+ T-Zellen für die Induktion der IFN-γ Expression nötig ist (Szabo et
al. 2002), in CD8+ T-Zellen neben T-bet aber auch Eomes die Expression von IFN-γ induziert
(Pearce et al. 2003). Die Analyse der Eomes Expression ergab, dass T-bet-defiziente CD8+
T-Zellen im Tumormilieu von Lungentumoren eine verringerte Expression von Eomes
aufwiesen. Dies lässt vermuten, dass T-bet im Tumormilieu von Lungenkarzinomen an der
Induktion der Eomes-Expression in CD8+ T-Zellen beteiligt ist und würde erklären warum die
IFN-γ Expression in CD8+ T-Zellen in Abwesenheit von T-bet verringert vorliegt.
Um zu analysieren, ob die Blockade des IL-17-Signalwegs neben CD4+ T-Zellen auch in
CD8+ T-Zellen einen Einfluss auf die IFN-γ-Expression besitzt, wurde die IFN-γ-Expression
in CD8+ T-Zellen aus Mäusen, die mit Antikörpern gegen IL-17A behandelt worden waren,
untersucht. In Zellen aus Wildtyp-Mäusen konnten keine Unterschiede in der IFN-γ
Expression nach Blockade von IL-17A festgestellt werden. In Abwesenheit von T-bet
bewirkte die Applikation eines neutralisierenden Antikörpers allerdings eine Induktion der
IFN-γ Expression in CD8+ T-Zellen. Dies deutet darauf hin, dass IL-17A in Anwesenheit von
T-bet die Expression von IFN-γ in CD8+ T-Zellen nicht beeinflusst, während dies in CD4+
T-Zellen der Fall zu sein scheint. Zudem lässt sich vermuten, dass in CD8+ T-Zellen in
Abwesenheit von T-bet IL-17A die Expression von IFN-γ unterdrückt, während IL-17A in
Anwesenheit von T-bet die IFN-γ Expression in CD8+ T-Zellen nicht beeinflussen kann. Es
ist davon auszugehen, dass die Reduktion der Tumorlast, die durch Blockade von IL-17A in
Wildtyp-Mäusen ausgelöst wurde, nicht durch einen Effekt auf die IFN-γ-Expression in CD8+
T-Zellen verursacht wurde. Die Blockade von IL-17A in T-bet-defizienten Mäusen löste zwar
89
in CD8+ T-Zellen eine Erhöhung der IFN-γ Expression aus, dies scheint aber keine
detektierbare Wirkung auf die Tumorlast auszuüben, da T-bet-defiziente Mäuse nach
Blockade von IL-17A keine Unterschiede in der Tumorlast aufwiesen (s.o.). Die Blockade
von IL-17A führte in CD8+ T-Zellen zudem zu einer Erhöhung der Eomes Expression.
IL-17A scheint somit die Expression von Eomes normalerweise zu unterdrücken. In T-betdefizienten CD8+ T-Zellen war die Eomes Expression nach Blockade von IL-17A
unverändert. Dies lässt darauf schließen, dass IL-17A die Expression von Eomes nur hemmen
kann, wenn T-bet vorhanden ist. Dies steht allerdings im Gegensatz zu den Ergebnissen, die
zeigen, dass T-bet die Expression von Eomes induziert. Die Tatsache, dass in
T-bet-defizienten CD8+ T-Zellen nach Blockade von IL-17A eine Erhöhung der IFN-γ
Expression vorlag, kann zudem nicht durch einen Effekt auf Eomes hervorgerufen werden.
Um zu untersuchen, ob IL-17A Effekte auf Lungenkarzinom-Zellen ausübt, wurde zuerst
analysiert, ob die Tumorzellen, die in dem murinen Tumormodell der vorliegenden Arbeit zur
Induktion des Tumorwachstums verwendet wurden, den IL-17 Rezeptor exprimieren. Es
konnte festgestellt werden, dass in etwa 80 % der Tumorzellen den IL-17 Rezeptor
exprimierten. Da in früheren Studien gezeigt werden konnte, dass IL-17 die Proliferation von
Tumorzellen begünstigt (Zhang et al. 2008), kann vermutet werden, dass IL-17 auch in dem
hier verwendeten Tumormodell das Tumorwachstum durch diesen Mechanismus begünstigt.
Es wurde bereits gezeigt, dass IL-17A in Melanom-Zellen die Expression von IL-6 auslöst
(Wang et al. 2009). Auch in den hier verwendeten Lungenkarzinom-Zellen konnte beobachtet
werden, dass steigende Mengen an IL-17A eine Erhöhung der IL-6-Expression auslösen. Zur
Induktion der Typ17-Lymphozyten sind die Zytokine IL-6 und TGF-β notwendig (Chen et al.
2007; Mangan et al. 2006). Da festgestellt werden konnte, dass die Tumorzellen neben IL-6
auch konstitutiv TGF-β produzierten, ist davon auszugehen, dass die durch IL-17A ausgelöste
IL-6-Expression in Kombination mit TGF-β zu einer vermehrten Bildung von
IL-17A-produzierenden Typ17-Lymphozyten im Tumormilieu führt, was wiederum das
Tumorwachstum fördert. Diese Vermutung wird auch durch eine frühere Studie in murinen
Modellen für Brust- und Darmkrebs gestützt, in der gezeigt wurde, dass TGF-β das
Tumorwachstum indirekt durch seinen positiven Einfluss auf die Bildung von Th17-Zellen
begünstigt (Nam et al. 2008).
90
91
7 Material und Methoden
7.1
7.1.1
Material
Geräte und Verbrauchsmaterialien
Tabelle 7-1: Geräte
Gerät
Hersteller
Absorptionsreader MRX TC Revelation
Dynex Technologies GmbH, Denkendorf
CO2-Inkubator HERAcell 150i
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA
Durchflusszytometer BD FACS Calibur™
BD Biosciences, Heidelberg
Gel-Dokumentationssystem
Intas Science Imaging Instruments GmbH,
Göttingen
Gelelektrophorese Stromquelle
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Heizblock Thermomixer Comfort
Eppendorf AG, Hamburg
Heraeus Megafuge 1.0R
Heraeus Instruments GmbH, München
Ivis imaging system
Caliper LifeSciences, Mainz
Kompaktschüttler KS 15A
Johanna Otto GmbH, Hechingen
Kühlzentrifuge
Eppendorf AG, Hamburg
Neubauerkammer
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
OctoMACS Separation Unit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
pH-Meter InoLab®
WTW Wissenschaftlich-Technische
Werkstätten GmbH, Weilheim
Pipetten
Eppendorf AG, Hamburg
Pipettierhilfe
Hirschmann Laborgeräte GmbH, Heilbronn
QuadroMACS Separation Unit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Spektrophotometer Nanodrop
PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Sterilbank Herasafe KS
Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA
Thermocycler für qPCR CFX-96
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Tischzentrifuge
Eppendorf AG, Hamburg
Ultraschallbad Sonorex RK 510S
Bandelin Elektronic GmbH, Berlin
92
Gerät
Hersteller
Vakuumpumpe MINI VAC E1
PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Vortexer Reax Control
Heidolph, Schwabach
Waage AE50
Mettler, Basel, Schweiz
Waage PM300
Mettler, Basel, Schweiz
Zellkulturmikroskop
VWR International GmbH, Darmstadt
Zellzählgerät CASY TT
Schärfe Systeme GmbH, Reutlingen
Zentrifuge Megafuge 1.0R Sorvall
Heraeus Instruments, Hanau
Tabelle 7-2: Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien
Hersteller
0,2 ml-Reaktionsgefäß für PCR
VWR International GmbH, Darmstadt
0,5 ml-Reaktionsgefäß
Eppendorf AG, Hamburg
1,5 ml-Reaktionsgefäß
Eppendorf AG, Hamburg
2,0 ml-Reaktionsgefäß
Eppendorf AG, Hamburg
24-Well-Platte
Cellstar, Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
48-Well-Platte
Cellstar, Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
96-Well-Platte
Cellstar, Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
Cryotubes
Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA
Durchflusszytometrie-Röhrchen
BD Biosciences, Heidelberg
MACS Separationssäulen (MS, LS)
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
MaxiSorp 96-Well-Platte für ELISA
Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA
Multiplate® Low 96 well clear für qPCR
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Parafilm
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Petrischale
Cellstar, Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
Plastikpipetten steril (5; 10; 25; 50 ml)
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Polysine-Objektträger
Menzel, Braunschweig
93
Verbrauchsmaterialien
Hersteller
PP-Röhrchen 50 ml, 15 ml
Cellstar, Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
Sieb Cell strainer 40 µm Nylon
BD Falcon, Bedford, MA
Skalpelle, steril
Feather Safety Razor Co, Köln
Spritzen Injekt-F
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Spritzen Omnifix®-F
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
7.1.2
Chemikalien und Reagenzien
Tabelle 7-3: Chemikalien und Reagenzien
Chemikalie / Reagenz
Hersteller
10x Permwash Konzentrat
ebioscience, Frankfurt
5x-Puffer für Reverse Transkriptase
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Accutase
PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Aceton
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Agarose
STARLAB GmbH, Ahrensburg
Ammoniumchlorid
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Assay Diluent für ELISA
BD Biosciences Pharmingen
Bovine serum albumine (BSA)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Casy®clean Lösung
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Casy®ton Lösung
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Chloroform
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Citronensäure-Monohydrat
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Desoxy-Nukleosid-Triphosphate (dNTPs)
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Dinatriumcarbonat
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
DMEM Kulturmedium
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
DMSO
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
DNaseI
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Essigsäure
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Ethanol (100 %)
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
FCS
PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Formaldehyd (37 %)
Merck KGaA , Darmstadt
94
Chemikalie / Reagenz
Hersteller
GelRed®
Biotium Inc., Hayward,CA, USA
Glykogen
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Igepal®
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Isofluran
Abbott, GmbH & Co. KG, Wiesbaden
Isopropanol
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Kaliumchlorid
Merck KGaA , Darmstadt
Kaliumhydrogencarbonat
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Ketamin
Ratiopharm GmbH, Ulm
Kollagenase TypIa
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
M-MuLV Reverse Transkriptase
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Natriumchlorid
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Natriumdihydrogenphosphat
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Natriumhydrogencarbonat
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Natriumhydroxid
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Nuclease-freies Wasser
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Paraformaldehyd
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Penicillin/Streptomycin Lösung
Invitrogen GmbH, Darmstadt
PeqGold RNAPure™
PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen
Permfix
ebioscience, Frankfurt
Phosphate buffered saline (PBS)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Phosphate buffered saline + EDTA
Lonza GmbH, Köln
Proteinase K
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Random Hexamer Primer
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
REDTaq® ReadyMix™
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
RiboLockTM RNase-Inhibitor
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Rompun® (Xylazin)
Bayer AG, Leverkusen
RPMI Kulturmedium
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
SsoFast™ EvaGreen® Supermix für qPCR
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Sterofundin
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Tetramethylbenzidin
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Tris-Base
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Tris-HCl
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
95
Chemikalie / Reagenz
Hersteller
Tween-20
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
VivoGloTM Luciferin
Promega GmbH, Mannheim
Wasserstoffperoxid
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Tabelle 7-4: Antikörper
Antikörper
Maus CD3 Allophycocyanin
Hersteller
ebioscience, Frankfurt
Maus CD4 AlexaFluor 488
BD Biosciences, Heidelberg
Maus CD8a Allophycocyanin
BD Biosciences, Heidelberg
Maus Foxp3 Allophycocyanin
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Maus IL-17R Phycoerythrin
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
Maus anti-CD28
Generiert aus Hybridoma-Zellen
Maus anti-CD3
Generiert aus Hybridoma-Zellen
Maus anti-IFN-γ
Generiert aus Hybridoma-Zellen
Maus anti-IL-17A
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
Maus anti-IL-4
Generiert aus Hybridoma-Zellen
Maus anti-IL-6R
Chugai pharmazeuticals, Japan
Maus NK1.1 FITC
ebioscience, Frankfurt
Maus CD25 PerCP Cy5.5
BD Biosciences, Heidelberg
Maus CD4 PerCP Cy5.5
BD Biosciences, Heidelberg
Tabelle 7-5: ELISA Kits
Kit
Maus IFN-γ (BD OptEIA TM)
Hersteller
BD Biosciences, Heidelberg
Maus IL-10
BD Biosciences, Heidelberg
Maus TGF-β
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
Maus TNF-α (BD OptEIA TM)
BD Biosciences, Heidelberg
Tabelle 7-6: Magnetische beads
beads
Maus anti-CD8
Hersteller
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Maus anti-CD4
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Maus anti-CD62L
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
96
beads
Maus CD8+ isolation kit II
Hersteller
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Maus CD4+CD62L+ isolation kit
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach
Tabelle 7-7: Rekombinante Proteine
Protein
Rekombinantes TGF-β1 (human)
Hersteller
PeproTech GmbH, Hamburg
Rekombinantes IL-6 (murin)
PeproTech GmbH, Hamburg
Rekombinantes IL-23 (murin)
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
Rekombinantes IL-21 (murin)
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
Rekombinantes IL-1β (murin)
PeproTech GmbH, Hamburg
Rekombinantes IL-12 (murin)
PeproTech GmbH, Hamburg
Rekombinantes IL-2 (murin)
PeproTech GmbH, Hamburg
Rekombinantes IL-17A (murin)
R&D Systems GmbH, Wiesbaden
7.1.3
Primer
Alle Primer wurden von der Firma Eurofins MWG Operon, Ebersberg gekauft.
Tabelle 7-8: Sequenzen der Genotypisierungs-Primer
Name
NFATc1 flox Primer a (INT2-S5)
Sequenz
5′-AAGGAATTACTGGGAAGCCTGGCA-3′
NFATc1 flox Primer b (INT3-S2)
5′-AGGGACTATCATTTGGCAGGGACA-3′
NFATc1 flox Primer c (INT3-AS2)
5′-ACAGGAAACAGCTCTGTTCCACAC-3′
CD4-cre fwd
5`-CCCAACCAACAAGAGCTC-3´
CD4-cre rev
5´-CCCAGAAATGCCAGATTA-3´
T-bet Primer I
5´-GCGCGAAGGGGCCACCAAAGAACGGAG-3´
T-bet Primer II
5´-GACTGAAGCCCCGACCCCCACTCCTAAG-3´
T-bet Primer III
5´-TGGGCATACAGGAGGCAGCAACAAATA-3´
Tabelle 7-9: Sequenzen der qPCR-Primer
Gen
Human CD3
Human HPRT
Sequenz
Fwd: 5’-CTG GAC CTG GGA AAA CGC ATC-3´
Rev: 5´-GTA CTG AGC ATC ATC TCG ATC-3´
Fwd: 5´-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3´
Rev: 5´-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3´
97
Gen
Human IL-17A
Human NFATc1
Human T-bet
Maus BATF
Maus β-Actin
Maus CD25
Maus CTLA4
Maus Eomesodermin
Maus Folr4
Maus Foxp3
Maus Granzym B
Maus Helios
Maus IFN-γ
Maus IL-10
Maus IL-17A
Maus IL-17F
Maus IL-21
Maus IL-23R
Maus IL-6
Maus NFATc1 Exon3
Maus Perforin
Maus ROR-α
Maus ROR-γt
Sequenz
Fwd: 5′-TCACCTTGGAATCTCCACCGCA-3′
Rev: 5′-GGCAGTGTGGAGGCTCCCTG-3′
Fwd: 5´-GCATCACAGGGAAGACCGTGTC-3´
Rev: 5´-GAAGTTCAATGTCGGAGTTTCTGAG-3´
Fwd: 5´-CCC TTG GTG TGG ACT GAG AT-3´
Rev: 5´-GTC GGT GTC CTC CAA CCT AA-3´
Fwd: 5´-GTT CTG TTT CTC CAG GTC C-3´
Rev: 5´-GAA GAA TCG CAT CGC TGC-3´
Fwd: 5´-TGT TAC CAA CTG GGA CGA GA-3´
Rev: 5´-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA-3´
Fwd: 5´-GCT CAC CTG GCA ACA CAG ATG G-3´
Rev: 5´-GGA AAC AGC CGT TAG GTG AAT GCT-3´
Fwd: 5´-GGA TCC TTG TCG CAG TTA GC- 3´
Rev: 5´-TCA CAT TCT GGC TCT GTT GG-3´
Fwd: 5´-GTG ACG GCC TAC CAA AAC AC-3´
Rev: 5´-GAC CTC CAG GGA CAA TCT GA-3´
Fwd: 5´-CAC TGT GGA CTG CTG A-3´
Rev: 5´-GGC TCA AAC CAC TTC TG-3´
Fwd: 5´-AGA GCC CTC ACA ACC AGC TA-3´
Rev: 5´-CCA GAT GTT GTG GGT GAG TG-3´
Fwd: 5´-CCCAGGCGCAATGTCAAT-3´
Rev: 5´-CCAGAATAAGAAACTCGA-3´
Fwd: 5´-TAACCAGTGCGGAGCTTCTT-3´
Rev: 5´-TGTGTTCCTCCAGTGAGCTG-3´
Fwd: 5´-GCT TTG CAG CTC TTC CTC AT-3´
Rev: 5´-GTC ACC ATC CTT TTG CCA GT-3´
Fwd:5´-CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA-3´
Rev: 5´-TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG-3´
Fwd: 5´-TCC AGA AGG CCC TCA GAC TA-3´
Rev: 5´-AGC ATC TTC TCG ACC CTG AA-3´
Fwd: 5´-GCACCCGTGAAACAGCCATGGTC-3´
Rev: 5´-GGCCGCTTGGTGGACAATGGGC-3´
Fwd: 5´-CAGGAGGGGAGGAAAGAAAC-3´
Rev: 5´-GGGAATCTTCTCGGATCCTC-3´
Fwd: 5´-GGGAAAGAAGACAGCACAGC-3´
Rev: 5´-CAACCCACATGTCACCAGAG-3´
Fwd: 5´-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3´
Rev: 5´-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3´
Fwd: 5´-TGCCTTTTGCGAGCAGTATCT-3´
Rev: 5´-CAGGCAAGGATGGGCTCATAT-3´
Fwd: 5´-GAT GTG AAC CCT AGG CCA GA-3´
Rev: 5´-GGT TTT TGT ACC AGG CGA AA-3´
Fwd: 5´-TCT CCC TGC GCT CTC CGC AC-3´
Rev: 5´-TCC ACA GAT CTT GCA TGG A-3´
Fwd: 5´-TGC AAG ACT CAT CGA CAA GG-3´
Rev: 5´AGG GGA TTC AAC ATC AGT GC-3´
98
7.1.4
Puffer
Tabelle 7-10: Puffer für ELISA
Puffer
Carbonatpuffer (pH = 9,5)
Zusammensetzung
3 mM Na2CO3, 10 mM NaHCO3
Waschpuffer
PBS + 0,05% Tween-20
TMB-Lösung
2 mM Tetramethylbenzidin, 172 mM
Aceton, 1,95 M Ethanol, 50 mM H2O2 (30%)
Substratpuffer
30 mM Zitronensäure-Monohydrat
Lösung zum Abstoppen der Enzymreaktion
30 % H2SO4
Tabelle 7-11: Andere Puffer
Puffer
ACK-Lyse (pH = 7,2-7,4)
Carbonatpuffer für anti-CD3 Beschichtung
Zusammensetzung
0,15 M NH4Cl;
0,1 mM KHCO3;
0,1 mM Na2-EDTA
0,5 M NaHCO3
der Zellkulturplatten
Puffer für MACS Separation
PBS-EDTA mit 0,5 % BSA
TAE Puffer für Agarose-Gelelektrophorese
400 mM Tris
10 mM Na2-EDTA
200 mM Essigsäure
Kollagenase-Verdau Lösung
300 U/ml Kollagenase TypI; 0,01 % DNaseI
(10 mg/ml) in PBS
100mM Tris-Base
500 mM EDTA
200mM NaCl
0,2 % SDS
Stammlösung für Ohrbiopsie-Verdau
Gebrauchslösung für Ohrbiopsie-Verdau
200 µl Stammlösung für Ohrbiopsie-Verdau
5 µl Proteinase K (10 mg/ml)
1 µl Tween 20
1 µl Igepal® (10 %)
99
Puffer
Separations-Stammlösung für die MACS®Zellisolation
Separations-Gebrauchslösung für die
MACS®-Zellisolation
7.1.5
Zusammensetzung
500 ml PBS-EDTA
25 g BSA
500 ml PBS-EDTA
55 ml Separations-Stammlösung
Zelllinien und humane Gewebeproben
Tabelle 7-12: Zelllinien
Zelllinie
Murine B16F10 Melanoma Zellen
Murine LLC1 (LL/2)Lewis Lung Karzinom Zellen
Murine LLC1 (LL/2)-luc-M38 Bioware Zelllinie
Murine L1C2 (Line 1 alveolar cell carcinoma)
Hersteller
ATCC global bioresource center, USA
ATCC global bioresource center, USA
Caliper LifeSciences, Mainz
Prof. Rainer Wiewrodt, Universität
Münster
Tabelle 7-13: humane Gewebeproben
Gewebe
Tumor 1
Tumor 2
Tumor 3
Tumor 4
Tumor 5
Tumor 6
Tumor 7
Tumor 8
Tumor 9
Tumor 10
Tumor 11
Tumor 12
Tumor 13
Tumor 14
Tumor 15
Tumor 16
Tumor 17
Tumor 18
Tumor 19
Tumor 20
Tumor 21
Tumor 22
Tumor 23
Zelltyp
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
Adenokarzinom
G-Klasse
G2-3
G3
G2
G2
G3
G3
G2-3
G2
G3
G3
G2
G3
G3
G3
G2-3
G2-3
G2-3
G2
G3
G2
G2
G2-3
G2-3
T
3
4
1
2
2
2
3
1
2
2
2
2
1
2
2
1
2
1
1
2
1
2
2
N
2
1
0
2
2
2
2
2
0
0
0
2
0
0
0
2
1
0
0
2
1
1
2
Geschlecht
männlich
männlich
männlich
männlich
männlich
männlich
weiblich
männlich
männlich
männlich
männlich
männlich
männlich
weiblich
männlich
männlich
weiblich
männlich
männlich
männlich
weiblich
männlich
männlich
Alter
54
63
56
66
58
48
52
39
43
47
51
72
61
69
63
42
54
55
49
58
67
62
70
100
Gewebe
Zelltyp
G-Klasse
T
N
Geschlecht
Alter
Tumor 24
Adenokarzinom
G3
2
0
männlich
64
Tumor 25
Adenokarzinom
G3
2
1
männlich
68
G = G-Klassifikation (G1-G4: gute Differenzierung bis hochgradig maligne);
T-Klassifikation (Größe des Primärtumors); N = N-Klassifikation (fehlen bzw.
Vorhandensein von regionalen Lymphknotenmetastasen)
101
7.2
7.2.1
Methoden
Versuchstiere und Genotypisierung
In der vorliegenden Arbeit wurden C57BL/6 konditionale NFATc1-defiziente Mäuse,
C57BL/6 Nfatc1fl/fl Mäuse sowie Balb/c Wild-Typ und Balb/c Tbet(-/-) Mäuse im Alter von 6-9
Wochen verwendet.
Die konditionalen NFATc1-defizienten Mäuse enthielten eine funktionale NFATc1-Defizienz
in allen CD4-exprimierenden Körperzellen. Um diese Zelltyp-spezifische Deletion des
Nfatc1-Gens zu erhalten, wurden CD4-Cre Mäuse mit sog. „gefloxten“ Mäusen (Nfatc1fl/fl)
verpaart, bei denen das Exon 3 des Nfatc1-Gens von LoxP Sequenzen flankiert war
(Aliprantes et al. 2008). Das Exon 3 des Nfatc1-Gens kodiert für die DNA-Bindedomäne.
CD4-Cre Mäuse exprimieren unter dem CD4 Promotor das Enzym Cre-Rekombinase. Bei
Aktivierung des CD4-Promotors wird zusätzlich zu dem CD4-Protein auch die CreRekombinase exprimiert. Diese katalysiert an den loxP-Sequenzen des Exon 3 des Nfatc1Gens durch Rekombination die Spaltung der DNA, so dass das Exon 3 entfernt wird. Die
verbleibenden DNA-Abschnitte werden neu verknüpft und der DNA-Abschnitt des Exon 3
enzymatisch abgebaut (Kühn, Torres 2002). Da das Exon 3 des Nfatc1-Gens die DNABindestelle des Transkriptionsfaktors an Zielgene beinhaltet, kann in den Mäusen, die in der
vorliegenden Arbeit verwendet wurden, NFATc1 in CD4+ exprimierenden Zellen nicht mehr
an Promotoren von Zielgenen binden, so dass eine funktionelle NFATc1-Defizienz in CD4exprimierenden Zellen vorliegt. Diese umfasste u.a. auch CD8+ T-Zellen, da diese während
ihrer Entwicklung auch CD4 exprimieren. Als Kontrollmäuse zu den konditionalen NFATc1
knockout-Mäusen (Nfatc1∆/∆) wurden C57BL/6 Mäuse verwendet, die ein „gefloxtes“ Exon 3
des NFATc1 Gens besaßen, aber keine Cre-Rekombinase unter dem CD4 Promotor
exprimierten (Nfatc1fl/fl).
Zur Genotypisierung wurde den Mäusen eine Biospie am Ohr entnommen und diese in der
Gebrauchslösung für den Ohrbiopsie-Verdau über Nacht bei 55°C verdaut. Um die
enzymatische Reaktion abzubrechen, wurden die Biopsien für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Die
Polymerasekettenreaktionen (PCRs) wurden mit REDTaq® Ready MixTM PCR Reaktion und
entsprechenden Primern durchgeführt, die Produkte auf ein Agarose-Gel (1,5 %) aufgetragen
und durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Banden der PCR-Produkte wurden durch
Anfärben des Gels mit GelRed® sichtbar gemacht.
102
Um bei den konditionalen NFATc1-defizienten Mäusen die Insertion der loxP-Sequenzen und
der Cre-Rekombinase zu analysieren, wurden zwei PCRs durchgeführt. Für die Cre-PCR
wurden Primer verwendet, die die Cre-Rekombinase amplifizieren. So konnte durch An- bzw.
Abwesenheit der Bande im Agarose-Gel die Existenz oder das Fehlen des Rekombinase-Gens
bestimmt werden. Um zu überprüfen, ob die loxP-Sequenzen am Nfatc1 Gen auf beiden
Allelen integriert sind, wurden die Primer a, b und c eingesetzt (Tabelle 7-8) und die PCRProdukte, wie in einer früheren Publikation beschrieben (Aliprantes et al. 2008), ausgewertet.
Bei der T-bet PCR wurden die T-bet Primer I-III (Tabelle 7-8) verwendet. Bei 260bp befindet
sich die Wild-Typ Bande im Gel, bei 500bp die Bande der T-bet-defizienten Mäuse.
7.2.2
Induktion des Tumorwachtums
Zur Induktion des Tumorwachstums in der Lunge der Mäuse wurden die murine B16F10
Melanom-Zelllinie, die murine „Lewis Lung Carcinoma“ Zelllinie LLC1 (LL/2), die murine
LL/2-luc-M38 Bioware Zelllinie, die das Enzym Luciferase exprimiert, und die murine „Line
1 Alveolar cell carcinoma“ Zelllinie L1C2 verwendet. Die L1C2 Tumorzellen wurden in
RPMI und die anderen Tumorzellen in DMEM Medium mit 10 % FCS und 1 %
Penicillin/Strepomycin so lange kultiviert, bis sie eine Zelldichte von 70-80 % erreicht hatten.
Für die Passagierung der Zellen wurde das Kulturmedium aus der Kulturflasche entnommen,
die Zellen vorsichtig mit PBS gewaschen und mithilfe von Accutase vom Boden der
Zellkulturflasche abgelöst. Die Zellen wurden daraufhin aus der Flasche entnommen, bei
800 rpm und 4 °C für 7 Minuten zentrifugiert und 1/10 der Zellen weiter kultiviert, bis die für
die Tumorinduktion erforderliche Anzahl an Zellen vorhanden waren. Für eine längerfristige
Lagerung wurden die Zellen in FCS mit 10 % DMSO bei -80 °C in Cryo-Röhrchen
eingefroren. Zum Auftauen wurden sie durch Verwendung von Medium aus dem Röhrchen
gelöst, bei 800 rpm und 4 °C für 7 Minuten zentrifugiert, in Medium aufgenommen und
kultiviert. Für die Induktion des Tumorwachstums wurden den Mäusen entweder 2x105
B16F10 Zellen, 5x105 LLC1 Zellen, 7.5x105 LL/2-luc-M38 Bioware Zellen oder 2x105 L1C2
Zellen in die Schwanzvene (200µl) injiziert.
7.2.3
Anti-IL-17A Antikörper-Behandlung im L1C2 Tumormodell
Das Wachstum von L1C2-Tumoren in Balb/c Mäusen wurde wie in Kapitel 7.2.2 beschrieben
induziert. Für die Behandlung der Mäuse mit Antikörpern gegen IL-17A wurden die Mäuse
mit Ketamin/Xylazin narkotisiert und intranasal die Antikörper verabreicht. Dies geschah
durch Auftropfen der Antikörpersuspension auf die Nase der Mäuse. Die Behandlung der
103
Mäuse erfolgte an den Tagen 5 und 8 nach Induktion des Tumorwachstums. Dabei wurden je
3 µg Antikörper verabreicht.
7.2.4
Organpräparation
Für die Organentnahme wurden die Mäuse nach vorheriger Narkotisierung mit
Ketamin/Rompun® durch zervikale Dislokation getötet. Unter sterilen Bedingungen wurde
die Bauchdecke geöffnet und Lunge und Milz entnommen. Für die histologische Analyse der
Tumormasse wurde die Lunge in 4 % Formalin fixiert.
7.2.5
Bestimmung der Tumormasse
Bei den Mäusen, denen B16F10 Tumorzellen injiziert worden waren, wurde die Tumormasse
der Metastasen durch Quantifizierung der melanotischen, schwarzen Fläche auf der
Oberfläche der Lunge bestimmt. Dazu wurde die Lunge mit einer herkömmlichen Kamera
fotografiert und im Computerprogramm ImageJ ausgewertet. Zur Ermittlung des prozentualen
Befalls der Lunge durch den Tumor wurde die Summe der melanotischen Flächen in Bezug
zur Gesamtoberfläche der Lunge gesetzt.
Für die Bestimmung der Tumormasse der Mäuse, die mit LLC1 Tumorzellen gespritzt
worden waren, wurden die in Formalin fixierten Gewebe in Paraffin eingebettet und ca. 5 µm
dünne Schnitte angefertigt. Mit diesen wurde eine Hämatoxilin-Eosin (H & E) Färbung nach
standardisiertem Protokoll durchgeführt. Dies erfolgte in freundlicher Kooperation mit Prof.
Dr. Rieker, Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Erlangen. Die H & E Färbung liefert
einen Überblick über die Struktur des Gewebes und dient zur Unterscheidung zwischen
normalem und krankhaft verändertem Gewebe. Hämatoxilin färbt dabei alle basophilen
Strukturen, z.B. die DNA in Zellkernen, blau. Alle Zellstrukturen, die acidophil sind, werden
von dem sauren Farbstoff Eosin rot angefärbt. Dazu gehören vor allem die Proteine des
Zytoplasmas.
Die Tumorlast der Mäuse, die mit LL/2-luc-M38 Bioware Zellen gespritzt worden waren,
wurde in vivo mithilfe des bildgebenden Ivis-Systems der Firma Caliper bestimmt. Die
Zelllinie exprimiert das Enzym Luciferase. Vor der Messung wurde den Mäusen 150 µl
Luciferin (c = 15 mg/ml) intraperitoneal verabreicht. Das Luciferin wird durch die Luciferase
gespalten und es kommt zu einer Lumineszenz. Einer 10-minütigen Inkubationszeit folgten
die Betäubung der Mäuse mit Isofluran und die Messung der Lumineszenz. Die Intensität der
Lumineszenz wird von dem Gerät als Photonenfluss in Photonen/ Sekunde (p/s) angegeben
104
und kann als ein Maß für die Anzahl der Tumorzellen und somit für die Tumorlast gesehen
werden.
7.2.6
Zellisolation
Um aus Lunge und Milz eine Einzellzell-Suspension zu erhalten, wurden diese zunächst
unterschiedlich aufgearbeitet. Da Lungengewebe viel Kollagen enthält, wurde es zuerst einem
Kollagenase-Verdau unterzogen. Dazu wurde die Lunge mit einem Skalpell in kleine Stücke
geschnitten und in einer Lösung mit Kollagenase und DNAse bei 37 °C für 45 Minuten
geschüttelt. Bei der Verarbeitung der Milz entfiel dieser Schritt. Anschließend wurden Milz
und verdautes Lungengewebe mithilfe des Stempels einer Spritze durch ein Zellsieb mit der
Porengröße 40 µm „gedrückt“ um die Zellen zu vereinzeln. Daraufhin erfolgte ein
Zentrifugationsschritt für 10 Minuten bei 4 °C und 1500 rpm. Die pelletierten Zellen wurden
in 10 ml ACK-Lyse aufgenommen und für 2 Minuten bei RT inkubiert, um die Erythrozyten
zu lysieren. Nach einer Zentrifugation der Zellen für 5 Minuten bei 1500 rpm und 4 °C
wurden die Zellen mit PBS gewaschen, um Fett und andere störende Teilchen zu entfernen.
7.2.7
Die
Magnetische Zellseparation
Isolation
der
verschiedenen
Zellpopulationen
(CD8+,
CD4+,
CD4+CD62L+,
CD8+CD62L+) aus Milz und Lunge erfolgte mittels der MACS® (Magnetic activated cell
sorting) -Methode der Firma Miltenyi Biotec. Das Prinzip beruht darauf, dass die zu
isolierenden Zellen mit einem Oberflächenmarker-spezifischen Antikörper versehen werden,
dem ein Magnet angekoppelt ist, den sog. „beads“. Die Separation erfolgt über Säulen, die an
einem Magneten befestigt sind. Wird nun die Zellsuspension auf die Säule gegeben, bleiben
die magnetischen Zellen aufgrund des magnetischen Feldes dort haften und die unmarkierten
Zellen passieren die Säule. Nach einigen Waschschritten wird die Säule, die die separierte
Zellpopulation enthält, vom Magneten entfernt und die Zellen werden von der Säule eluiert.
Für die Isolation der CD8+ und CD4+ Zellen wurden die Einzellzellsuspensionen der
Gewebszellen abzentrifugiert (10 Minuten, 4 °C, 300 g), das Zellpellet in 900 µl SeparationsPuffer und 10 µl CD4+ oder CD8+ beads pro 107 Zellen aufgenommen und für 15 Minuten
bei 4 °C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion mit 10 ml Puffer erfolgte ein erneuter
Zentrifugationsschritt (10 Minuten, 4 °C, 300 g) nach dem die Zellen in 500 µl Puffer
aufgenommen wurden. Danach wurde die Zellsuspension auf die mit Puffer aquälibrierte
Säule gegeben und die durch die Säule gelangenden negativen Zellpopulationen verworfen.
105
Nach einigen Waschschritten der Säule mit Puffer wurde die Säule vom Magneten entfernt
und die markierten Zellen mit 1 ml Puffer von der Säule eluiert.
Bei der Isolation der naiven CD4+ und CD8+ T-Zellen (CD4+CD62L+, CD8+CD62L+) erfolgte
zuerst eine Negativ-Selektion der CD4- bzw. CD8-exprimierenden Zellen und als zweiter
Schritt eine positive Selektion für den Oberflächenmarker CD62L. Für die Isolation der
CD4+CD62L+ Zellen wurde das CD4+CD62L+ Kit der Firma Miltenyi Biotec verwendet. Es
wurden zunächst zu den pelletierten Zellen der Milz 400 µl Puffer und 100 µl CD4+ T Cell
Biotin-Antibody Cocktail II pro 108 Zellen hinzugegeben. Der Antibody Cocktail enthält
biotinylierte Antikörper gegen CD8a, CD45R, CD11b, CD25, CD49b, TCRγ/δ und Ter-119.
Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 4 °C wurden zu der Zellsuspension 300 µl Puffer und
200 µl magnetische anti-biotin beads pro 108 Zellen hinzugegeben und für 15 Minuten bei
4 °C inkubiert. So wurden die Zellen, die den Oberflächenmarker CD4 nicht exprimieren, mit
magnetischen beads versehen. Es folgte ein Waschschritt mit 10 ml PBS sowie eine
Zentrifugation der Zellen für 10 Minuten bei 4 °C und 300 g nach der das Zellpellet in 500 µl
Puffer aufgenommen wurde. Nach der Äqualibrierung der Säulen mit Puffer wurde die
Zellsuspension auf die Säule gegeben und die unmarkierten CD4-exprimierenden Zellen, die
direkt durch die Säule liefen, da sie nicht magnetisch beladen waren, aufgefangen. Diese
wurden daraufhin abzentrifugiert und das Pellet für die folgende Positiv-Selektion in 800 µl
Puffer und 200 µl CD62L-beads aufgenommen. Nach einer 10-minütigen Inkubation wurden
die Zellen mit 10 ml PBS gewaschen, zentrifugiert (10 Minuten, 4 °C, 300 g) und
anschließend das Zellpellet in 500 µl Puffer aufgenommen. Die weitere Separation der
CD62L+-Zellen erfolgte nach dem Protokoll der CD4+ und CD8+ Zell-Separation.
Zur Separation der CD8+CD62L+ Zellen wurde das CD8+ Isolation Kit für die negative
Isolation und CD62L-beads für die darauf folgende Positiv-Selektion der Firma Miltenyi
Biotec verwendet. Der experimentelle Ablauf der Zellseparation entsprach dem der
CD4+CD62L+ Isolation.
7.2.8
7.2.8.1
Zellkultur primärer T-Zellen
CD8+ und CD4+ Kultivierung
Die durch magnetische Zellseparation isolierten CD8+ und CD4+ Zellen wurden in RPMI
Medium mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
Zur Stimulation der T-Zellen wurden die Zellkulturplatten zuvor mit anti-CD3 Antikörpern
beschichtet und dem Kulturmedium lösliche anti-CD28 Antikörper (1 µg/ml) zugesetzt. Für
106
die Beschichtung des Plattenbodens wurde dieser mit anti-CD3 Antikörpern (5 µg/ml) in
0,5 M NaHCO3 bedeckt und für 1 Stunde bei 37 °C Inkubiert. Anschließend wurde die Platte
mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden zu einer Konzentration von 1,5 x 106 Zellen pro
Milliliter kultiviert. Nach 24-stündiger Inkubation wurde das Medium abgenommen. Für die
mRNA Expressionsanalyse wurden die Zellen nach verschiedenen Inkubationszeitpunkten in
PeqGold RNA PureTM aufgenommen und bis zur Verwendung bei -80 °C weggefroren.
7.2.8.2
T-Zell Differenzierung
Naive CD4+ und CD8+ Zellen differenzieren nach ihrer Aktivierung in Abhängigkeit des sie
umgebenden Zytokinmilieus in verschiedene Subtypen. In der vorliegenden Arbeit wurde das
Differenzierungsverhalten von naiven CD4+ und CD8+ T-Zellen in An- und Abwesenheit des
Transkriptionsfaktors NFATc1 anylsiert. Dabei wurde bei den naiven CD4+ T-Zellen die
Differenzierung in Th1-, Th17- und regulatorische T-Zellen untersucht und bei den naiven
CD8+ T-Zellen die Entwicklung in Tc1- und Tc17-Zellen analysiert. Die Zellen wurden zu
einer Konzentration von 1,5 x 106 Zellen pro Milliliter kultiviert. Das Kulturmedium enthielt
neben Antikörpern gegen CD3 und CD28 polarisierende Zytokine und Antikörper (Tabelle
7-14 bis Tabelle 7-18). Nach 40 Stunden Kultur wurden die Zellen für die Analyse der
mRNA-Expression in PeqGOLD RNAPure™ aufgenommenen und bei -80 °C weggefroren.
Tabelle 7-14: Zytokine und Antikörper für die Th17 Kulturbedingung
Zytokin/ Antikörper
Konzentration
Rekombinantes IL-6 (Maus)
20 ng/ml
Rekombinantes TGF-β1 (Human)
3 ng/ml
Anti-IFNγ Antikörper
10 µg/ml
Anti-IL-4 Antikörper
10 µg/ml
Anti-CD3 Antikörper
Zellkulturplatte mit 5 µg/ml in 0,5 M NaHCO3
beschichtet
Anti-CD28 Antikörper
1 µg/ml
107
Tabelle 7-15: Zytokine und Antikörper für die Tc17 Kulturbedingung
Zytokin/ Antikörper
Konzentration
Rekombinantes IL-6 (Maus)
20 ng/ml
Rekombinantes TGF-β1 (Human)
3 ng/ml
Rekombinantes IL-21
80 ng/ml
Rekombinantes IL-23
50 ng/ml
Rekombinantes IL-1β
20 ng/ml
Anti-IFNγ Antikörper
10 µg/ml
Anti-IL-4 Antikörper
10 µg/ml
Anti-CD3 Antikörper
Zellkulturplatte mit 5 µg/ml in 0,5 M NaHCO3
beschichtet
Anti-CD28 Antikörper
1 µg/ml
Tabelle 7-16: Zytokine und Antikörper für die Differenzierung regulatorischer T-Zellen
Zytokin/ Antikörper
Konzentration
Rekombinantes TGF-β1 (Human)
0,3 µg/ml
Rekombinantes IL-2
100 ng/ml
Anti-IL-6R Antikörper
10 µg/ml
Anti-CD3 Antikörper
Zellkulturplatte mit 5 µg/ml in 0,5 M NaHCO3
beschichtet
Anti-CD28 Antikörper
1 µg/ml
108
Tabelle 7-17: Zytokine und Antikörper für die Tc1-Kulturbedingung
Zytokin/ Antikörper
Konzentration
Rekombinantes IL-12
12 ng/ml
Anti-IL-4 Antikörper
10 µg/ml
Anti-CD3 Antikörper
Zellkulturplatte mit 5 µg/ml in 0,5 M NaHCO3
beschichtet
Anti-CD28 Antikörper
1 µg/ml
Tabelle 7-18: Zytokine und Antikörper für die Th1-Kulturbedingung
Zytokin/ Antikörper
Konzentration
Rekombinantes IL-12
12 ng/ml
Anti-IL-4 Antikörper
10 µg/ml
Anti-CD3 Antikörper
Zellkulturplatte mit 5 µg/ml in 0,5 M NaHCO3
beschichtet
Anti-CD28 Antikörper
7.2.9
1 µg/ml
Zellkultur der L1C2 Tumorzellen
Die L1C2 Tumorzellen wurden zu einer Konzentration von 6,25 x 104 Zellen pro Milliliter
mit verschiedenen Konzentrationen an rekombinantem IL-17A oder mit Antikörpern gegen
IL-17A für 48 Stunden kultiviert. Nach 48 Stunden wurden die Zellüberstände abgenommen
und bei -20°C für spätere Analysen mittels ELISA aufbewahrt. Die Zellen wurden in PeqGold
RNA PureTM aufgenommen und bei -80°C gelagert. Die RNA-Isolation aus den Zellen, die
cDNA-Synthese und die qPCR erfolgte wie in Kapitel 7.2.11 bis 7.2.13. beschrieben. Zur
Normalisierung der qPCR wurde β-Actin verwendet.
7.2.10 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie wird zur Analyse der Expression von Oberflächenmolekülen und
intrazellulären Proteinen in Zellen angewandt. Dabei werden fluoreszenz-markierte
Antikörper verwendet, die sich gegen ausgewählte Antigene richten. So können
Zellpopulationen quantitativ analysiert werden.
109
Im Durchflusszytometer passieren die fluoreszenz-markierten Zellen einzeln einen
Laserstrahl. Die Fluorochrome der gebundenen Antikörper auf der Zelle absorbieren
daraufhin das Licht und gehen in den angeregten Zustand über. Verschiedene Detektoren
nehmen die Emission des Lichtes auf. Je nach Fluorochrom wird das Licht der
Anregungswellenlänge in einer anderen Wellenlänge emittiert. Für jeden Fluoreszenz
Emissions-Peak
existiert
ein
Detektor,
der
das
Signal
auswertet.
Neben
den
Fluoreszenzdetektoren existieren Detektoren, die anhand der Streuung des Lichts Größe und
Granularität der Zellen analysieren können. Das Licht, das vorwärts im flachen Winkel von
der Zelle gestreut wird (Forward Scatter = FSC) ist ein Maß für das Zellvolumen und das
seitwärts im rechten Winkel gestreute Licht (Side-Scatter = SSC) gibt Informationen über
Granularität, Größe und Struktur der Zellen. Durch diese Methode ist eine multiparametrische Analyse und Charakterisierung von Zellpopulationen möglich, da verschiedene
Fluorochrome gleichzeitig und in kürzester Zeit auf einer Vielzahl von Zellen analysiert
werden können. Zur Messung wurde das Durchflusszytometer FACS Calibur™ der Firma BD
Biosciences verwendet, das mit einem Argon-Laser und einem Helium-Neon-Laser
ausgestattet ist. Der Argon-Laser emittiert Licht der Wellenlänge 488 nm, der HeliumNeon-Laser Licht der Wellenlänge 633 nm. Werden Fluorochrome mit Licht dieser beiden
Wellenlängen angeregt, geben sie Licht verschiedener Wellenlängen ab, das durch die
Detektoren FL1-4 detektiert wird.
Zum Anfärben der Zellen mit fluoreszenz-markierten Antikörpern werden, je nachdem ob das
Antigen auf der Oberfläche der Zelle oder intrazellulär exprimiert wird, zwei Färbungen
unterschieden. Zum Anfärben der Oberflächen-Antigene wurde eine Färbelösung aus PBS
und Antikörpern zu 5 x 105 Gesamtzellen gegeben. Nach einer Inkubation für 30 Minuten bei
4 °C wurde die Färbung durch Zugabe von 300 µl PBS abgestoppt, die Zellen zentrifugiert
(4 °C, 5 Minuten, 1500 rpm) und zur Analyse im Durchflusszytometer in 200 µl BPS
aufgenommen.
Um intrazelluläre Proteine zu färben, ist es erforderlich, die Zellen zu fixieren und zu
permeabilisieren, damit der Antikörper in die Zelle gelangen kann. Für diese Färbung wurden
1 x 106 Zellen eingesetzt. Nach der Färbung der Oberflächenmoleküle folgte hierbei eine
Fixierung der Zellen mit 150 µl Permfix-Lösung der Firma eBioscience bei 4 °C für
35 Minuten. Nach anschließender Zentrifugation (4 °C, 5 Minuten, 1500 rpm) und Absaugen
der Permfix-Lösung wurden die Zellen permeabilisiert und mit Antikörpern gegen
intrazelluläre Antigene gefärbt. Dafür wurden die Antikörper in Permwash-Lösung der Firma
eBioscience verdünnt, zu den Zellen gegeben und bei 4 °C für 30 Minuten inkubiert. Zur
110
Beendigung des Färbungvorgangs wurde 200 µl Permwash-Lösung hinzugegeben, die Zellen
nach anschließender Zentrifugation (4 °C, 5 Minuten, 1500 rpm) in 200 µl PBS aufgenommen
und am Durchflusszytomter analysiert. Um das Durchflusszytometer vor jeder Messung
optimal einzustellen, wurden pro Oberflächen- und intrazellulärer Färbung Einzelfärbungen
durchgeführt, wobei diese dieselbe Prozedur wie die mehrfach-gefärbten Proben durchliefen.
Die Messungen wurden mithilfe der FlowJo Software von Treestar (San Carlos, USA)
ausgewertet.
7.2.11 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Die quantitative Analyse der Zytokine der CD8+ T-Zell Kulturüberstände erfolgte mittels
eines sogenannten „sandwich“-ELISAs laut Protokoll des Herstellers. Dafür wird eine 96-well
Platte mit einem Antikörper beschichtet, der spezifisch für das zu analysierende Zytokin ist.
Die Bindung des Antikörpers an die Platte erfolgt über Nacht unter Verwendung
verschiedener Puffer. Nach einem Waschschritt werden durch Zugabe eines BSA- oder FCShaltigen Puffers unspezifische Bindestellen geblockt. Einem erneuten Waschschritt folgt die
Zugabe von 200 µl Zellkulturüberstand auf die Platte. Die Zytokine der Überstände binden
dabei an die an der Platte haftenen Antikörper. Die Proben werden zwei Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert und in einem anschließenden Waschschritt ungebundene Proteine
wieder von der Platte gewaschen. Es folgt die Zugabe eines biotinylierten DetektionsAntikörpers, der an ein anderes Epitop des Zytokins bindet als der Antikörper, der an die
Platte gebunden ist. So befindet sich das Zytokin sprichwörtlich „im Sandwich“. Je nach
ELISA-Protokoll wird entweder in einem separaten Schritt oder gleichzeitig mit dem
Detektionsantikörper eine Streptavidin-gebundene Meerrettichperoxidase (HRP = horseradish
peroxidase) zugegeben. Diese bindet an den biotinylierten Detektionsantikörper. Nach einem
Waschschritt wird Tetramethylbenzidin (TMB), das Substrat der HRP, zugegeben. Die HRP
wandelt das farblose TMB in ein blaues Produkt um. Die Blaufärbung korreliert dabei positiv
mit der Menge des zu analysierenden Zytokins. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von
30 % Schwefelsäure abgestoppt, wobei ein Farbumschlag von blau zu gelb stattfindet. Die
Absorption des stabilen, gelben Produkts wird mithilfe eines Photometers bei 450 nm
gemessen. Um die Konzentration des Zytokins in den Überständen zu ermitteln, wird parallel
eine Standardverdünnungsreihe mit dem jeweiligen Zytokin durchgeführt. Das Programm
Revelation
Quicklink
von
Dynex
(Version
4.25,
2003)
errechnet
Standardverdünnungsreihe die Zytokinkonzentration in den einzelnen Proben.
anhand
der
111
7.2.12 RNA-Isolation
Die RNA-Isolation aus den murinen CD8+ und CD4+ T-Zellen erfolgte mittels PhenolChlorofom Extraktions-Technik. Die murinen Zellen wurden beim Ernten direkt in PeqGOLD
RNAPure™ der Firma PeqLab aufgenommen, während bei den humanen Gewebeproben vor
der RNA-Isoaltion eine Homogenisation des Gewebes erforderlich war. Die in PeqGOLD
RNAPure™ aufgenommenen Proben wurden zuerst für 5 Minuten bei RT inkubiert um die
Nukleotidkomplexe zu dissoziieren. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform pro Milliliter
PeqGOLD RNAPure™ wurden die Proben gevortext, für 3 Minuten bei 4 °C inkubiert und
anschließend 5 Minuten bei 12.000 g und 4 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation zeigten
sich zwei Phasen. Die untere organische Chloroformphase enthält die Proteine, während in
der oberen, wässrigen Phase die RNA vorliegt. In der Phasengrenze befindet sich die DNA.
Danach wurde die obere wässrige Phase abgenommen und 400 µl Chloroform zugegeben,
gevortext und für 3 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert, um verbliebene Proteine und DNA
vollständig zu entfernen. Erneut wurde die obere Phase abgenommen, 3 µl Glykogen
(c = 10 mg/ml) und 350 µl Isopropanol hinzugegeben. Durch Zugabe von Isopropanol wurde
die RNA gefällt, Glykogen erleichterte dabei das Sichtbarmachen des RNA-Pellets. Das
Gemisch wurde für 15 Minuten bei 4 °C inkubiert und anschließend 15 Minuten bei
13000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde vorsichtig der
Überstand entfernt und das Pellet zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen. Anschließend wurde
das Pellet an der Luft getrocknet und in 20 µl Nuklease-freiem Wasser für 5 Minuten bei
65 °C gelöst. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte am Nanodrop®-Spektrophotometer.
Für die RNA-Isolation aus den humanen Gewebeproben wurde das RNeasy Mini Kit der
Firma Qiagen laut Protokoll der Firma verwendet.
7.2.13 Microarray
Der Microarray ist eine Methode mit der die mRNA Expressionslevel von tausenden
verschiedenen Genen zur selben Zeit in einer Probe analysiert werden können. Dabei werden
auf eine Glasscheibe, DNA-Abschnitte von Genen, sog. Sonden, aufgetragen. Die mRNAMoleküle der zu analysierenden Probe werden mit einer fluoreszierenden Lösung versehen
und auch auf die Glasscheibe aufgetragen. Nun binden die mRNA-Moleküle an die Sonden.
Diesen Vorgang nennt man Hybridisierung. Mit einem Scanner wird das Fluoreszenzsignal
der gebundenen mRNA-Moleküle für jeden Punkt des Microarrays detektiert. Da genau
bekannt ist, an welchem Punkt des Microarrays sich die Bindestelle von welchem Gen
befinden, kann anhand der Intensität des Fluoreszenzsignals die Menge der gebundenen
112
mRNA ermittelt und somit die Expressionslevel der verschiedenen Gene bestimmt werden.
Für die Analysen im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der GeneChip® Gene 1.0 ST
Array der Firma Affymetrix verwendet. Die Auswertung des Arrays ist als sog. Heatmap
dargestellt. Die Analyse der Proben und die Auswertung der Genexpressionsprofile erfolgten
in freundlicher Kollaboration mit Dr. Arif Ekici, Institut für Humangenetik, Universität
Erlangen.
7.2.14 cDNA-Synthese
Um die Expressionsrate der murinen RNA zu analysieren, wurde zuerst die aus den Zellen
isolierte RNA in copy-RNA (cDNA) umgeschrieben. Für die cDNA-Synthese wurde je nach
Konzentration der RNA 100-1000 ng RNA eingesetzt. Das für die Synthese verwendete
Volumen der RNA wurde mit DEPC-Wasser auf 11 µl aufgefüllt. Es folgte die Zugabe von
einem Mix aus RevertAid™ Reverse Transkriptase (200 U), RiboLock™ RNase Inhibitor
(20 U), dNTP-Mix (1 mM), Random Hexamer Primer (0,5 µg) und 5 x Reaktionspuffer zu
einem Reaktionsvolumen von 20 µl. Eine Inkubation für 5 Minuten bei 25 °C ermöglichte die
Aktivierung der Primer. Die cDNA-Synthese fand bei 42 °C für eine Stunde statt. Eine
anschließende Erhitzung auf 70 °C für 5 Minuten beendete die Reaktion. Die cDNA wurde
mit DEPC-Wasser so verdünnt, dass pro 100 ng eingesetzte RNA ein cDNA Endvolumen von
20 µl entstand, und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
Die cDNA-Synthese der humanen RNA erfolgte mit 5 µg RNA und wurde mit dem
Superscript II Kit von Invitrogen nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
7.2.15 qPCR
Die quantitative real-time PCR (qPCR) wird verwendet, um DNA zu amplifizieren und
gleichzeitig zu quantifizieren. Dadurch ist es möglich, aus der Menge der cDNA
Rückschlüsse auf die mRNA und somit auf die Expressionsrate eines bestimmten Gens zu
ziehen. Bei dieser Methode wird die cDNA in einer PCR unter Einsatz des für das zu
analysierende Gen spezifischen Primers amplifiziert. Im Reaktionsansatz befindet sich zudem
ein Fluoreszenzfarbstoff, beispielsweise SYBR®-Green, der in doppelsträngige DNA
interkaliert und dabei fluoresziert. Nach Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 497 nm
steigt die Fluoreszenz des SYBR®-Green an, wobei die Emissionswellenlänge 520 nm
beträgt. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität ist somit ein Maß für die DNA Menge. Die
Quantifizierung der DNA wird in der exponentiellen Phase der PCR durchgeführt. Das Gerät
113
detektiert den sogenannten Schwellenwert-Zyklus (Ct = Threshold cycle), den PCR-Zyklus,
bei dem sich die Fluoreszenzintensität stark von der Hintergrundfluoreszenz unterscheidet
und einen bestimmten Schwellenwert erreicht hat. Nach erfolgter PCR führt das Gerät eine
Schmelzkurvenanalyse durch, indem das PCR-Produkt langsam von 55 °C auf 95 °C erhitzt
wird. Anhand der Tatsache, dass Primerdimere eine geringere Schmelztemperatur besitzen als
das PCR-Produkt, lässt sich dadurch erkennen, ob es sich um ein spezifisches Produkt
handelt.
In dieser Arbeit wurde für die murinen Proben das Gerät CFX96 der Firma Biorad verwendet.
Für die PCR wurden pro Well 17 µl SsoFast™ EvaGreen® Supermix, versetzt mit Primern
(125 pmol/ml), in eine 96-well Platte pipettiert und pro Probe in Duplikaten oder Triplikaten
3 µl cDNA hinzugegeben. Der Ablauf der PCR bestand aus 50 Zyklen. Dabei fand die
Aktivierung der Polymerase bei 98 °C für zwei Minuten, die Denaturierung bei 95 °C für 5
Sekunden und die Hybridisierung und Elongation bei 60 °C für 10 Minuten statt. Als
Referenzgen wurde die HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase) verwendet, die
unabhängig von experimentellen Bedingungen ubiquitär exprimiert wird. Dies diente als
relativer Indikator der eingesetzten cDNA-Mengen.
Für die qPCR-Analyse der humanen Gewebeproben wurde das Gerät ABI PRISM 3700 von
Applied Biosciences verwendet. Die qPCR-Reaktion wurde mit dem QuantiTec SYBR Green
PCR Kit der Firma Qiagen laut Herstellerangaben angesetzt. Die Konzentration der Primer
betrug 300 nM. Die initiale Aktivierung fand bei 95 °C für 15 Minuten statt, die
Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, die Hybridisierung der Primer bei 60 °C für
30 Sekunden und die Amplifikation bei 72 °C für 30 Sekunden. Der Ablauf der PCR bestand
aus 40 Zyklen. Zur Normalisierung der Reaktion wurde die HPRT eingesetzt.
Für die Quantifizierung der Genexpression wurde die ∆∆Ct- Methode angewandt. Der von
dem Gerät ermittelte Ct-Wert der HPRT wurde dabei zunächst vom Ct-Wert des zu
analysierenden Gens subtrahiert. Von dem draus resultierenden ∆Ct-Wert wurde von jeder
Probe der Mittelwert der ∆Ct-Werte der Kontrollgruppe subtrahiert (∆∆Ct). Um den
Expressionswert E zu errechnen wurde die Formel E = 2-∆∆ct angewandt. Daraus ergibt sich in
der Kontrollgruppe ein mittlerer Expressionswert von etwa 1. Errechnet sich in der
Versuchsgruppe ein Expressions-Wert, der größer ist als eins, liegt eine erhöhte
Expressionsrate vor, ein geringerer Wert als 1 zeigt im Vergleich zur Kontrollgruppe eine
erniedrigte Expressionsrate an.
114
7.2.16 Statistik
Die statistischen Berechnungen erfolgten mithilfe der Software Excel (Microsoft Office). Der
Mittelwert ist stets als arithmetisches Mittel mit dem Standardfehler des Mittelwertes
angegeben. Um zu testen, ob die Ergebnisse statistisch signifikant sind, wurde der zweiseitige
studentische T-Test angewandt. Dabei gilt: ist p
≤
0,05, dann liegt eine schwache
Signifikanz vor (*), ist p ≤ 0,01, dann spricht man von einer Signifikanz (**) und bei einem
Wert von p ≤ 0,001 liegt ein hoch signifikantes Ergebnis vor (***).
115
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132
133
9 Abbildungsverzeichnis
ABBILDUNG 3-1:
ABBILDUNG 3-2:
ABBILDUNG 3-3:
ABBILDUNG 5-1:
ABBILDUNG 5-2:
ABBILDUNG 5-3:
ABBILDUNG 5-4:
ABBILDUNG 5-5:
ABBILDUNG 5-6:
ABBILDUNG 5-7:
ABBILDUNG 5-8:
ABBILDUNG 5-9:
ABBILDUNG 5-10:
ABBILDUNG 5-11:
ABBILDUNG 5-12:
ABBILDUNG 5-13:
ABBILDUNG 5-14:
ABBILDUNG 5-15:
ABBILDUNG 5-16:
ABBILDUNG 5-17:
ABBILDUNG 5-18:
ABBILDUNG 5-19:
ABBILDUNG 5-20:
ABBILDUNG 5-21:
ABBILDUNG 5-22:
ABBILDUNG 5-23:
ABBILDUNG 5-24:
ABBILDUNG 5-25:
ABBILDUNG 5-26:
TH17-ZELL DIFFERENZIERUNG ................................................................... 18
SIGNALWEG DER ZYTOKINE IL-17A UND IL-17F. ...................................... 19
NFAT-SIGNALKASKADE............................................................................. 24
ERHÖHTE NFATC1-EXPRESSION IN GEWEBE VON LUNGENADENOKARZINOM-PATIENTEN.................................................................... 31
ERFOLGREICHE DELETION DER NFATC1-DNA-BINDEDOMAINE IN CD4+
+
UND CD8 T-ZELLEN IN KONDITIONALEN NFATC1-DEFIZENTEN MÄUSEN.33
NFATC1-DEFIZIENZ IN CD4-EXPRIMIERENDEN ZELLEN HAT KEINEN EFFEKT
AUF DAS WACHSTUM VON METASTATISCHEN MELANOMEN IN DER LUNGE.34
UNVERÄNDERTES WACHSTUM VON LEWIS-LUNG-KARZINOMEN IN
KONDITIONALEN NFATC1-DEFIZIENTEN MÄUSEN. .................................... 35
NFATC1∆/∆ UND NFATC1FL/FL MÄUSE ZEIGEN KEINE UNTERSCHIEDE IM
WACHSTUM VON LL/2-LUC-M38 TUMORZELLEN....................................... 36
KONDITIONALE NFATC1-DEFIZIENTE MÄUSE WEISEN WENIGER CD4+ UND
CD8+ T-ZELLEN AUF. ................................................................................. 37
NFATC1∆/∆ MÄUSE BESITZEN WENIGER REGULATORISCHE T-ZELLEN ALS
NFATC1FL/FL MÄUSE. ................................................................................... 38
ERHÖHTE ANZAHL AN NK-ZELLEN IN NFATC1∆/∆ MÄUSEN. ...................... 39
HEATMAP DER MICROARRAY-ANALYSE. .................................................... 40
REDUZIERTE HELIOS MRNA EXPRESSION IN CD8+ T-ZELLEN IN
ABWESENHEIT VON NFATC1...................................................................... 41
VERRINGERTE FOLR4-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+
T-ZELLEN. .................................................................................................. 42
VERMINDERTE CTLA4-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+
T-ZELLEN. .................................................................................................. 43
FOXP3-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+ T-ZELLEN. ............... 44
UNVERÄNDERTE TGF-β-SEKRETION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+
T-ZELLEN. .................................................................................................. 45
REDUZIERTE IL-10-SEKRETION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+ T-ZELLEN.
.................................................................................................................... 46
IFN-γ MRNA-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+ T-ZELLEN. .... 47
TNF-α-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+ T-ZELLEN. .............. 48
ERHÖHTE PERFORIN MRNA-EXPRESSION IN NFATC1∆/∆ CD8+ T-ZELLEN. . 49
NFATC1 HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE GRANZYM B MRNA-EXPRESSION
+
IN CD8 T-ZELLEN. .................................................................................... 50
ERHÖHTE EOMES-EXPRESSION IN CD8+ T-ZELLEN. ................................... 51
T-BET EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+ T-ZELLEN. ................ 51
ERHÖHTE EXPRESSION VON LY49H IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD8+
T-ZELLEN. .................................................................................................. 52
NFATC1-DEFIZIENZ VERMINDERT DIE EXPRESSION DE RORTRANSKRIPTIONSFAKTOREN. ...................................................................... 54
NFATC1 INDUZIERT IN TH17-ZELLEN DIE GENEXPRESSION VON IL-21. .... 55
VERÄNDERTE IL-23R-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN CD4+
T-ZELLEN. .................................................................................................. 56
EOMES-EXPRESSION IN TH17-ZELLEN. ....................................................... 56
134
ABBILDUNG 5-27: UNVERÄNDERTE IFN-γ UND TNF-α-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN
TH1-ZELLEN. .............................................................................................. 57
ABBILDUNG 5-28: UNVERÄNDERTE GRANZYM B UND PERFORIN MRNA-EXPRESSION IN
TH1-ZELLEN. .............................................................................................. 58
ABBILDUNG 5-29: NFATC1 SPIELT KEINE ROLLE IN DER INDUKTION DER T-BET MRNAEXPRESSION IN CD4+ T-ZELLEN. ................................................................ 58
ABBILDUNG 5-30: DIE DIFFERENZIERUNG REGULATORISCHER T-ZELLEN IST UNABHÄNGIG VON
NFATC1. .................................................................................................... 60
ABBILDUNG 5-31: NFATC1- DEFIZIENTE TC1-ZELLEN EXPRIMIEREN WENIGER IFN-γ. ........... 61
ABBILDUNG 5-32: VERRINGERTE TNF-α MRNA-EXPRESSION IN NFATC1-DEFIZIENTEN
TC1-ZELLEN. .............................................................................................. 62
ABBILDUNG 5-33: NFATC1 INDUZIERT DIE EXPRESSION VON IL-21 UND IL-23R IN TC17ZELLEN. ...................................................................................................... 63
ABBILDUNG 5-34: EXPRESSION VON BATF, ROR-α UND ROR-γT IN TC17-ZELLEN............... 64
ABBILDUNG 5-35: INVERSE KORRLEATION ZWISCHEN T-BET UND IL-17A IN LUNGENGEWEBE
VON LUNGENKREBSPATIENTEN. .................................................................. 66
ABBILDUNG 5-36: T-BET-DEFIZIENTE MÄUSEN WEISEN EINE ERHÖHTE TUMORLAST VON
LEWIS-LUNG-KARZINOMEN AUF................................................................. 67
ABBILDUNG 5-37: ERHÖHTE IL-17R-EXPRESSION AUF CD4+ UND CD8+ T-ZELLEN IN
ABWESENHEIT VON T-BET. ......................................................................... 68
ABBILDUNG 5-38: VERRINGERTE IFN-γ-EXPRESSION IN T-BET-DEFIZIENTEN CD8+ T-ZELLEN.
.................................................................................................................... 69
ABBILDUNG 5-39: ERHÖHTE EOMES-EXPRESSION IN CD8+ T-ZELLEN NACH IL-17ABLOCKADE. ................................................................................................. 70
ABBILDUNG 5-40: L1C2-TUMORZELLEN EXPRIMIEREN DEN IL-17-REZEPTOR. ....................... 71
ABBILDUNG 5-41: IL-17A LÖST IN L1C2-TUMORZELLEN DIE IL-6 EXPRESSION AUS. ............. 71
Abdruckgenehmigung
Abbildung 3-2: Abgedruckt aus Immunity, 34:149-162; Iwakura, Y., Ishigame, H., Saijo, S.
and Nakae, S. (2011). Functional specialization of interleukin-17 family members.
Mit Erlaubnis von Elsevier/ Copyright Clearance Center.
135
10 Tabellenverzeichnis
TABELLE 5-1: ERGEBNISSE DES MICROARRAYS ........................................................................ 40
TABELLE 7-1: GERÄTE .............................................................................................................. 91
TABELLE 7-2: VERBRAUCHSMATERIALIEN ................................................................................ 92
TABELLE 7-3: CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN ........................................................................ 93
TABELLE 7-4: ANTIKÖRPER ....................................................................................................... 95
TABELLE 7-5: ELISA KITS........................................................................................................ 95
TABELLE 7-6: MAGNETISCHE BEADS ......................................................................................... 95
TABELLE 7-7: REKOMBINANTE PROTEINE ................................................................................. 96
TABELLE 7-8: SEQUENZEN DER GENOTYPISIERUNGS-PRIMER ................................................... 96
TABELLE 7-9: SEQUENZEN DER QPCR-PRIMER ......................................................................... 96
TABELLE 7-10: PUFFER FÜR ELISA .......................................................................................... 98
TABELLE 7-11: ANDERE PUFFER ............................................................................................... 98
TABELLE 7-12: ZELLLINIEN ...................................................................................................... 99
TABELLE 7-13: HUMANE GEWEBEPROBEN ................................................................................ 99
TABELLE 7-14: ZYTOKINE UND ANTIKÖRPER FÜR DIE TH17 KULTURBEDINGUNG .................. 106
TABELLE 7-15: ZYTOKINE UND ANTIKÖRPER FÜR DIE TC17 KULTURBEDINGUNG .................. 107
TABELLE 7-16: ZYTOKINE UND ANTIKÖRPER FÜR DIE DIFFERENZIERUNG REGULATORISCHER
T-ZELLEN ....................................................................................................... 107
TABELLE 7-17: ZYTOKINE UND ANTIKÖRPER FÜR DIE TC1-KULTURBEDINGUNG .................... 108
TABELLE 7-18: ZYTOKINE UND ANTIKÖRPER FÜR DIE TH1-KULTURBEDINGUNG.................... 108
136
137
11 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
°C
Grad Celsius
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
AP
activator protein
BATF
basic leucine zipper transcription factor, ATF-like
BCL-2
B-cell lymphoma 2
bp
Basenpaare
BSA
bovine serum albumin (Rinder-Serumalbumin)
bzw.
beziehungsweise
CD
cluster of differentiation
cDNA
copy DNA
CO2
Kohlenstoff-Dioxid
CTL
cytotoxic lymphocytes (zytotoxische Lymphozyten)
CTLA4
cytotoxic T-lymphocyte antigen 4
DC
dendritic cells (Dendritische Zellen)
DMEM
Dulbecco´s modified eagle medium
DNA
deoxyribonucleicacid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTPs
Deoxy-Nukleosid Triphosphate
EDTA
Ethylendiamintetraessisäure
EGFR
Epidermal growth factor receptor
ELISA
enzyme-linked immunodorbent assay
et al.
et alii
Eomes
Eomesodermin
EtOH
Ethanol
FACS
fluorescence activated cell sorting (Durchflusszytometrie)
FasL
fas ligand
FCS
fetal calf serum (Fötales Kälberserum)
Folr4
folate receptor 4
138
Foxp3
forkhead box protein 3
fwd
forward (Vorwärstsequenz)
g
Gramm
GATA-3
GATA-binding protein
GITR
glucocorticoid-induced TNF receptor
GM-SCF
granulocyte macrophage colony-stimulating factor
H2SO4
Schwefelsäure
HCL
Salzsäure
HE
Hämatoxilin-Eosin
HPRT
Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase
HRP
horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase)
i.p.
intraperetoneal
i.v.
intravenös
IDO
Indolamine 2,3-Dioxygenase
IFN
Interferon
IL
Interleukin
IRF
interferon regulating factor
JNK
c-Jun N-terminal kinase
KHCO3
Kaliumhydrogencarbonat
KOH
Kaliumhydroxid
MACS
magnetic activated cell sorting
MHC
major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
min
Minuten
ml
Milliliter
mRNA
messenger RNA
n.s.
nicht signifikant
Na2CO3
Dinatriumcarbonat
Na2HPO4
Dinatriumhydrogenphosphat
NaH2PO4
Natriumdihydrogenphosphat
NaHCO3
Natriumhydrogencarbonat
139
NaN3
Natriumazid
NFAT
nuclear factor of activated T-cells
NFkB
nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer” of activated B-cells
ng
Nanogramm
NH4Cl
Ammoniumchlorid
NKT-Zelle
natürliche Killer-T-Zelle
NK-Zelle
natürliche Killerzelle
p
Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS
phosphate buffered saline
PCR
Polymerase-chain-reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PTEN
phosphatase and tensin homolog
qPCR
quantitative real-time polymerase chain reaction
RAS
rat sarcoma
Rb
Retinoblastom-Protein
rev.
reverse (Rückwärtssequenz)
RNA
Ribonukleinsäure
ROR
RAR-related orphan receptor
rpm
revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
SEM
standard error of the mean (Standardfehler)
SDS
sodiumdodecylsulfate (Natriumlaurylsulfat)
STAT
signal transducer and activators of transcription
TAE
Tris-Acetat-EDTA
T-bet
T-box expressed in T-cells
TCR
T-cell receptor (T-Zell Rezeptor)
TGF-β
transforming growth factor β
Th
T-Helferzelle
TIL
Tumor-infiltrierende Lymphozyten
TMB
3,3,5,5-Tetramethylbenzidin
TNF-α
Tumornekrosefaktor α
140
Treg
regulatorische T-Zellen
u.a.
unter anderem
VEGF
vascular endothelial growth factor
z.B.
zum Beispiel
α
anti
141
12 Eigene Publikationen
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Reppert, S., Boross, I., Koslowski, M., Türeci, Ö. Koch, S., Lehr, H.A. and Finotto, S.
“A role for T-bet-mediated tumour immune surveillance in anti-IL-17A treatment of lung
cancer.” Nature Communications. 2011 Dec. 20; 2:600. doi: 10.1038/ncomms1609.
Reppert, S., Andreev, K., Wittmann, S. and Finotto, S. “Intranasal application of immunoregulatory molecules: a method to investigate strategies for local cancer immunotherapies in
the lung”. Protocol Exchange. 2012 July 18. DOI:10.1038/protex.2012.037
Vorträge und Poster
07.-11.05.2010
Immunology 2010™, 97th annual meeting, Baltimore;
Posterpräsentation und Vortrag: “The role of NFATc1 in tumor
T-cell responses to lung cancer”
13.-17.05.2011
Immunology 2011™, 98th annual meeting, San Francisco;
Posterpräsentation: “Anti-IL17A treatment of lung cancer”
142
143
13 Danksagung
Mein besonderer Dank geht an Frau Prof. Dr. Dr. Susetta Finotto für die Bereitstellung des
interessanten Promotionsthemas und die Betreuung meiner Doktorarbeit. Zudem möchte ich
mich für die stetige Unterstützung, Förderung und das Vertrauen bedanken.
Herrn Prof. Dr. Falk Nimmerjahn danke ich herzlich für die Übernahme des Erstgutachtens.
Mein weiterer Dank geht an Herrn Prof. Dr. Hans-Martin Jäck für die Übernahme des
Zweitgutachtens.
Ein großes Dankeschön geht an die gesamte AG Finotto für die tolle Arbeitsatmosphäre und
die Unterstützung im Labor. Ich danke besonders Sonja Koch, Katerina Andreev, Caroline
Übel, Sandra Wittmann und Anna Graser.
Ein großer Dank geht an meine Eltern, die mich während meiner Promotionszeit immer
unterstützt haben.