Enterale Proteinaufnahme und Mechanismen der nahrungsinduz-205

Aus der Medizinischen Klinik I
der Universität Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. H. L. Fehm
Enterale Proteinaufnahme und Mechanismen der
nahrungsinduzierten Cortisolsekretion
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
-Aus der Medizinischen Fakultät-
vorgelegt von
Daniel Niemeyer
aus Hamburg
Lübeck 2007
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Werner Kern
2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jürgen Sperner
Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2007
zum Druck genehmigt. Lübeck, den 24.04.2007
gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach
-Dekan der Medizinischen Fakultät-
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
V
1.
Einleitung und Fragestellung
1
1.1
Streß und seine physiologischen Auswirkungen
2
1.2
Nahrungsantigene und das intestinale Immunsystem
3
a.)
Antigeneigenschaft der Nahrung
3
b.)
Das intestinale Immunsystem
4
1.3
Die Physiologie der hypothalamo-hypophysäradrenocorticalen Achse (HPA-Achse)
6
1.4
Hormone der Streß-Reaktion und HPA-Achse
8
a) Corticotropin Releasing Hormone (CRH)
8
b) Adrenocorticotropes Hormon (ACTH)
8
c) Cortisol
9
d) Growth Hormone
9
e) Katecholamine 1. Adrenalin 2. Noradrenalin
10
f) Interleukin-6
11
g) TNF-RII
12
1.5
Zirkadianer Rhythmus der HPA-Achse
13
1.6
Die Physiologie des Cortisol-Mittagspeaks
15
1.7
Klinische Bedeutung der Thematik
16
a.) Orale Toleranz und Nahrungsallergien
16
b.) Chronisch entzündliche Darmerkrankungen
17
Fragestellung
18
1.8
II
2.
Material und Methode
19
2.1
Versuchspersonen
19
2.2
Versuchsdurchführung
19
2.3
Verwendete Substanzen
21
a.) Casein
21
b.) Casein Hydrolysat
21
c.) Aminoplasmal 5%
22
Experimentelle Methoden
22
2.4
2.4.1 Blutentnahmen
22
2.4.2 Hormonbestimmung
23
a.) ACTH
23
b.) Cortisol
24
c.) Growth Hormone
24
d.) Adrenalin, Noradrenalin
25
e.) Interleukin 6
26
f.) sTNF-RII
26
g.) L-Tryptophan
27
2.5
Statistische Auswertung
28
3.
Ergebnisse
29
3.1
Messungsergebnisse im Hauptexperiment
29
3.1.1 Messungsergebnisse der Hormone
29
3.1.1.1 Messungen von Cortisol
29
3.1.1.2 Messungen von ACTH
30
3.1.1.3 Messungen vom Growth Hormone
31
III
3.1.1.4 Messungen von Adrenalin
31
3.1.1.5 Messungen von Noradrenalin
31
3.1.1.6 Messungen von Interleukin-6
32
3.1.1.7 Messungen von TNF-RII
32
3.1.2 Messungsergebnisse der Blutbestandteile
33
3.1.2.1 Messungen der Leukozyten
33
3.1.2.2 Messungen der Erythrozyten
33
3.1.2.3 Messungen der Thrombozyten
33
3.1.2.4 Messungen der neutrophilen Granulozyten
34
3.1.2.5 Messungen der Monozyten
34
3.1.2.6 Messungen der Lymphozyten
35
3.1.2.7 Messungen der eosinophilen und basophilen Granulozyten
36
3.2
36
Messungsergebnisse im Zusatzexperiment
3.2.1 Messungen der Cortisolkonzentrationen
36
3.2.2 Messungen der L-Tryptophan-Konzentrationen
37
4.
Diskussion
38
4.1
Der Einfluß von Proteinen und Aminosäuren
38
auf die Cortisol-Sekretion
4.2
Der Einfluß von Proteinen und Aminosäuren
40
auf die ACTH-Sekretion
4.3
Vermittlungswege der aminosäureinduzierten
41
Cortisol und ACTH-Sekretion
4.4.
Der Einfluß von Proteinen und Aminosäuren auf GH
43
IV
4.5
Der Einfluß der Nahrung auf das sympathische
44
Nervensystem und das Nebennierenmark
4.6
Änderungen der Serumkonzentrationen von IL-6 und TNF-RII
45
nach Protein bzw. Aminosäureneinnahme
4.7
Blutbildveränderungen durch Nahrungsproteine bzw. Aminosäuren
48
4.8
Stimulation der Cortisolsekretion durch Aminosäuren
49
5.
Zusammenfassung
52
6.
Literaturverzeichnis
54
7.
Anhang
74
7.1
Tabellen
74
7.2
Abbildungen
75
8.
Danksagung
92
9.
Lebenslauf
93
V
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Bedeutung
Abb.
Abbildung
ACTH
Adrenocorticotropes Hormon
ADH
Antidiuretisches Hormon
ANOVA
Analysis of Variance
AUC
Area Under the Curve
BMI
Body Mass Index
CBG
Corticosteroid Binding Hormone
CD
Cluster Determinants
Cm
Centimeter
CRH
Corticotropin Releasing Hormone
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EGTA
Ethylenglykol-bis-aminoethyletherTetridessigsäure
ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay
Fa.
Firma
GALT
Gut Assoziated Lymphoid Tissue
GH
Growth Hormone
GHRH
Growth Hormone Releasing Hormone
GI
Gastrointestinal
HPA
Hypothalamo-HypophysäreAdrenocortical
HPLC
Hochleistungsflüssigkeits-
VI
chromatograph
HGH
Human Growth Hormone
IFN
Interferon
IL
Interleukin
Kg
Kilogramm
M.
Morbus
m²
Quadratmeter
ml
Milliliter
mm
Millimeter
MSH
Melanozyten Stimulierendes Hormon
NaCl
Natriumchlorid
Nm
Nanometer
NNM
Nebennierenmark
NNR
Nebennierenrinde
Nucl.
Nucleus
POMC
Proopiomelanocortinzellen
RIA
Radioimmunoassay
STH
Somatotropes Hormon
Tab.
Tabelle
TGF
Transforming Growth Factor
TNF
Tumor-Nekrose-Faktor
sTNF-RII
Löslicher Tumor-Nekrose-FaktorRezeptor II
Vs.
Versus
z.B.
Zum Beispiel
VII
ZNS
Zentrales Nervensystem
1
1.
Einleitung und Fragestellung
Die Aufnahme und Verdauung von Nahrung stellen essentielle Vorgänge im Leben des
Menschen dar. Diese Prozesse liefern dem menschlichen Organismus die Energie, die er zu
seiner Erhaltung benötigt. Die Nahrungsbestandteile werden im Gastrointestinaltrakt durch
mechanische
und
enzymatische
Prozesse
aufgespalten,
um
danach
über
die
Darmschleimhaut in das Blut und die Lymphe aufgenommen zu werden. Neben diesen
Verdauungsvorgängen lösen die Nahrungbestandteile weitere Veränderungen im
menschlichen Organismus hervor. Dazu gehören unter anderem Veränderungen des
Blutbildes, des Immunsystems sowie der hypothalamo- hypophysär-adrenocorticalen
Achse (HPA-Achse)
Die Nährstoffe stellen, neben ihren essentiellen nutritiven Eigenschaften, auch eine
Bedrohung für den Organismus dar. So beschrieb Fiocchi die intestinale Mucosa als einen
Ort der ständigen „physiologischen Inflammation“, die als Ergebnis einer Immunantwort
auf nahrungsbedingte und mikrobielle Antigene interpretiert wird (Fiocchi et al., 1997).
Neben
diesen
lokalen
Entzündungsreaktionen
an
der
Mukosa
scheint
die
Nahrungsaufnahme auch systemische Immunveränderungen hervorzurufen. So konnte in
früheren Studien ein Abfall von Lymphozyten, Monozyten, Il-1beta, TNF –alpha und IFN
-gamma bei gleichzeitigem Anstieg von neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten
postprandial beobachtet werden (Hansen et al, 1997). Weiterhin konnte gezeigt werden,
dass die Nahrungsaufnahme zu einer Aktivierung der HPA-Achse und somit zu einem
Anstieg von sogenannten „Streßhormonen“ wie Cortisol, ACTH und Katecholaminen führt
(Knoll et al, 1984).
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluß von Proteinen und Aminosäuren auf die
oben genannten Systeme nach nasogastraler Infusion.
2
1.1 Streß und seine physiologischen Auswirkungen
Bei Streß handelt es sich um eine nicht-spezifische Antwort des Organismus auf eine
Bedrohung oder Anforderung (Selye et al, 1973). Die Nebenniere, die für die Sekretion
von Cortisol und Katecholaminen verantwortlich ist, nimmt bei der Streßantwort ein
zentrale Rolle ein. Die Steuerung der Nebennierenhormonsekretion erfolgt durch die
Aktivierung der HPA-Achse
einerseits
und
des
sympathischen
Nervensystems
andererseits. Auslöser für eine Streßreaktion können physische und psychische Stimuli
(Stressoren) sein, die über das retikuläre aktivierende System, den Kortex und den
Hypothalamus zu einer Aktivierung der Adeno- und Neurohypophyse sowie des
sympathischen Nervensystems und darüber zu einer Stimulation der Nebennieren führen.
Die Adenohypophyse sezerniert ACTH (adrenocorticotropes Hormon), GH, Prolactin und
beta-Endorphin, während die Neurohypophyse Vasopressin ausschüttet. Über das ACTH
wird die Cortisolsekretion in der Nebennierenrinde stimuliert. Daneben werden durch
posteriore hypothalamische Kerne sympathische Nervenfasern aktiviert, welche über das
Splanchnikusnervensystem
das
Nebennierenmark
erreichen
und
dort
zur
Katecholaminsekretion führen (Goldstein, 1995). Diese hormonellen Veränderungen
begünstigen den katabolen Energiestoffwechsel, der letztendlich zu einem gesteigerten
Angebot an Energieträgern im Blut führt. Es kommt zu einer Steigerung der Lipolyse mit
Bereitstellung freier Fettsäuren, einem Proteinkatabolismus mit Synthese von Glykogen
und Glukose aus Aminosäuren in der Leber sowie einer Hyperglykämie. Daneben erfolgt
eine Aktivierung des kardiovaskulären Systems mit Erhöhung von Herzfrequenz,
Blutdruck und des Herzzeitvolumens. Die gastrointestinale Antwort auf Streß besteht aus
einer Zunahme der Stuhlfrequenz, Diarrhö, Dyspepsie, Übelkeit und einem Anstieg der
gastralen Säureproduktion. Pulmonal kommt es zu einer Hyperventilation mit Hypokapnie.
3
Während einer Streßreaktion werden die negativen Feedback-Mechanismen, welche
normalerweise die Hypophysensekretion mit steuern, aufgrund der starken Stimulation des
Hypothalamus, außer Kraft gesetzt, so daß es zu einer überschießenden Sekretion der
genannten Hormone kommt.
1.2 Nahrungsantigene und das intestinale Immunsystem
Die Mukosa des Intestinaltraktes ist einer großen Bandbreite an unterschiedlichen
Antigenen ausgeliefert. Dazu gehören insbesondere Nahrungsbestandteile, ortsständige
Bakterien und pathogene Mikroorganismen. Die Aufgabe der Mukosa besteht darin, daß
sie einerseits Nährstoffe aufnimmt und andererseits verhindert, daß Antigene in den
systemischen Kreislauf übertreten. Sie dient somit als Barriere zwischen der Umwelt und
dem Organismus und muß Nahrungsantigene von pathogenen Antigenen unterscheiden
können. Eine adäquate Immunantwort auf Pathogene sowie das Ausbleiben einer Antwort
auf nicht bedrohliche Antigene, wie z.B. Nahrungsantigene, ist von vitaler Bedeutung für
den Organismus. Eine inadäquate Antwort des intestinalen Immunsystems auf harmlose
Antigene spielt eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Nahrungsallergien und
inflammatorischen Darmerkrankungen (Strober et al, 1993).
a.) Antigeneigenschaft der Nahrung
Als Antigene werden Substanzen bezeichnet, die vom Organismus als fremd eingestuft
werden und zu einer Bildung von spezifischen Antikörpern bzw. immunkompetenten
Lymphozyten führen. Antigene setzen sich aus einem hochmolekularen Trägermolekül und
einer serologisch spezifischen Teilstruktur, der Determinanten, zusammen. Proteine bilden
den überwiegenden Anteil an Immunogenen, wobei sie als reine Proteine, Glykoproteine
oder Lipoproteine vorliegen können und die stärkste immunogene Wirkung besitzen. Reine
4
Lipide sind praktisch nicht immunogen, Nukleinsäuren besitzen lediglich eine schwache
Immunogenität, wohingegen Polysaccharide und Lipopolysaccharide stärker immunogen
wirksam sind. Zu den stärksten Antigenen der menschlichen Nahrung gehören
Kuhmilchproteine, wobei das in dieser Studie verwendete Casein ca. 80% der
Kuhmilchproteine ausmacht. Die Antigenreaktivität eines Proteins ist vor allem abhängig
von der Kapaziät Immunglobuline an seine funktionelle Bindungsstelle, dem Epitop, zu
binden (van Regenmortel et al, 1988). Dies ist bei den einzelnen Proteinen unterschiedlich,
bedingt durch die verschiedenen Strukturen und Anzahl der spezifischen Epitope. Im
Rahmen der Verdauung werden die Nahrungsproteine durch Einwirkung von Endo- und
Exopeptidasen im Magen, im Duodenum und oberen Jejunum zu Polypeptiden,
Oligopeptiden und Aminosäuren gespalten. Über die Mucosa gelangen dann die
Aminosäuren und in kleinerem Maße Oligopeptide ins Blut (Sleisenger und Kim, 1979).
Neben diesen immunogen inaktiven Substanzen werden auch in geringerem Maße
vollständige Proteine mit Antigeneigenschaft, die der enzymatischen Spaltung entgangen
sind, resorbiert (Heyman, 2001). Es konnte experimentell nachgewiesen werden, daß nach
oraler Milchzufuhr über die Hälfte des β-Lactoglobulins in intakter Form im Jejunum
nachzuweisen ist (Mahé et al, 1991).
b.) Das intestinale Immunsystem
Eine Hauptkomponente des intestinalen Abwehrsystems ist das darmassoziierte
lymphatische Gewebe (gut associated lymphoid tissue, GALT) zu dem unter anderem
intraepitheliale Lymphozyten, Lymphozyten und Makrophagen der Lamina propria und die
Peyerschen Plaques der Mukosa und Submukosa gehören. Antigene können über drei
verschiedene Wege aus dem Darmlumen aufgenommen werden. Ein Weg ist die
Aufnahme über dendritische Zellen, die sich im subepithelialen Gewebe befinden und über
5
Dendriten Kontakt zum Lumen erhalten (Rescigno et al, 2001). Die über die Dendriten
aufgenommenen Antigene werden dann von den dendritischen Zellen in Lymphfollikeln
Lymphozyten präsentiert. Lösliche Antigene sind in der Lage das Epithel transzellulär
durch Endozytose zu durchqueren. Durch Exozytose gelangen sie dann in den
Extrazellularraum, wo sie entweder von Makrophagen aufgenommen werden oder direkt
an T-Zellen gebunden werden. Ein kleiner Teil der Antigene erreicht auch direkt die
Lymphgefäße (Walker und Isselbacher, 1974). Der dritte Weg ist die Aufnahme der
Antigene aus dem Darmlumen über so genannte M-Zellen des Epithels. Über diese
gelangen sie dann in die subepitheliale Region, wo sie anschließend von follikulären
dendritischen Zellen, in Form von Immunkomplexen (Antigen-Antikörperkomplexen), Bund T-Lymphozyten präsentiert werden. In den Lymphfollikeln reifen dann die BLymphozyten mithilfe der T-Lymphozyten zu IgA-produzierenden Zellen aus, welche
anschließend aus den Peyerschen Plaques im Lymphstrom in die mesenterialen
Lymphknoten und von dort weiter zum Ductus thoracicus wandern. Nach Übertritt in das
Blutsystem werden die B-Zellen im Körper verteilt. Ein großer Teil der B-Zellen gelangt
jedoch von den mesenterialen Lymphknoten über efferente Lymphbahnen zurück zur
Lamina propria der Darmwand, wo sie zu Plasmazellen ausreifen und IgA-Antikörper
sezernieren (Wittig und Zeitz, 2003). Die Immunantwort auf Antigene erfolgt
hauptsächlich lokal im Bereich der Lamina propria. Neben den aus den Lymphfollikeln
migrierten T- und B-Lymphozyten befinden sich hier Makrophagen, Mastzellen,
dendritische Zellen und neutrophile Granulozyten. Neben der oben bereits erwähnten Ig AProduktion durch B-Lymphozyten wird die lokale Immunabwehr vor allem durch
zytotoxische T-Zellen und CD4-Effektorzellen gewährleistet. 60-70% der lokalen T-Zellen
sind CD4-Lymphozyten, die neben der Expremierung von T-Zell-Rezeptoren, nach
Stimulation, auch in großer Menge Zytokine produzieren (Targan et al, 1995; Brandtzaeg
6
et al, 1998). Es handelt sich um hochdifferenzierte Zellen, die eine angehobene
Aktivierungsschwelle besitzen, um eine Immunantwort auf harmlose Antigene zu
verhindern. Daneben finden sich ca. 30-40% CD8-Zellen, die vor allem als zytolytische
Effektorzellen arbeiten. Ein weiterer wichtiger Regulator der lokalen Immunantwort ist die
Regulation der Zytokinproduktion. Von den unterschiedlichen T-Helferzellen werden
proinflammatorische Zytokine wie IFN-γ und TNF-α aber auch Interleukine und TGF-β
produziert. Diese wiederum steuern die Produktion und Sekretion von IgA und anderen
Immunglobulinen. Andersherum wird die Funktion der T-Zellen im gastrointestinalen
Immunsystem durch Zytokine gesteuert und somit ein komplexes Interaktionssystem
geschaffen. Die primäre Antwort auf Antigene aus dem Gastrointestinaltrakt ist, wie hier
beschrieben, lokal und auf den Darm begrenzt (Nagler-Anderson, 2000; Brandtzaeg,
2002). Jedoch konnten auch, wie bereits oben erwähnt, systemische Veränderungen auf
Antigenbelastung beobachtet werden. Hierzu gehören neben der Aktivierung des
Immunsystem und Veränderungen des Blutbildes auch die Aktivierung des HPA-Systems
(Knoll et al, 1984; Hansen et al, 1997).
1.3 Die Physiologie der hypothalamo-hypophysär-adrenocorticalen Achse (HPA-Achse)
Hypothalamus, Hypophyse und die Nebennierenrinde bilden einen neuroendokrinen
Regelkreis in dessen Verlauf das Streßhormon Cortisol produziert wird. Die
hypothalamischen Zentren Nucl. paraventricularis und supraopticus sind die Syntheseorte
von Corticotropin Releasing Hormone (CRH) und Vasopressin. Sie werden aus den
axoterminalen Strukturen der Nervenzellen in der Eminentia mediana sezerniert. Über ein
spezielles Gefäßsystem, dem hypothalamo-hypophysären Portalkreislauf, welches in enger
Beziehung zu den axoterminalen Endigungen steht, gelangen die Botenstoffe zu den Zellen
des Hypophysenvorderlappens. Hier bewirken sie eine erhöhte Sekretion und
7
Ausschüttung von ACTH, beta-Endorphin und alpha-MSH. Das ACTH gelangt über den
allgemeinen Blutkreislauf zu der Nebennierenrinde und stimuliert dort die Synthese und
Sekretion von Glukokortikoiden, die wiederum über das Blutsystem zu ihren Zielorten
gelangen. Der für den Menschen wichtigste Vertreter der Glukokortikoide ist das Cortisol.
Neben seinen Funktionen an den Körperzellen wirkt Cortisol in Form einer negativen
Rückkoppelung auch auf die Hypophyse und den Hypothalamus und schließt somit den
Regelkreis der HPA-Achse. Diese Mechanismen unterliegen einem zirkadianen Rhythmus,
der dazu führt, daß die Hormonauschüttung tageszeitliche Maximal-und Minimalwerte
aufweist. Die HPA-Achse unterliegt zahlreichen extrahypothalamischen Einflüssen, die die
Aktivität innerhalb dieser verändern. Dazu gehören dem Hypothalamus übergeordnete
Zentren, wie das limbische System und der Hippokampus, die durch somatosensorische
Reize zu einer erhöhten ACTH-Sekretion führen oder die Striae terminalis und die
Amygdala, die durch olfaktorische Stimuli eine Aktivierung der HPA-Achse bewirken
(Casady und Taylor, 1976; Feldmann und Saphier, 1997). Weitere exogene Einflüsse auf
den Regelkreislauf sind physischer und psychischer Streß sowie die Nahrungsaufnahme,
die zu einer Erhöhung der sekretorischen Aktivität führen. Verschiedene, in der
Hypophyse, nachgewiesene Rezeptortypen weisen auf weitere Kontrollmechanismen der
ACTH-Sekretion hin. Ein weiterer Einflußfaktor ist die Hemmung der Sekretion von CRH,
Vasopressin und ACTH durch Cortisol. Dieser negative Feedback wird auf der Ebene von
Hypothalamus und Hypophyse sowie dem limbischen System vermittelt. Von posterioren
hypothalamischen Nuclei wird über sympathische Nervenfasern das NNM aktiviert mit
nachfolgender Ausschüttung von Katecholaminen. Daneben wird die Synthese von
Adrenalin und Noradrenalin noch durch das aus der NNR stammende Cortisol reguliert,
welches für die initiale Hydroxylierung von Tyrosin zu Dopamin sowie für die
Methylierung von Noradrenalin zu Adrenalin benötigt wird und so das Verhältnis dieser
8
beiden Hormone im Plasma mitbestimmt. Die sezernierten Katecholamine stimulieren nun
die ACTH-Sekretion im Hypothalamus und bewirken somit eine Ausschüttung von
Glukokortikoiden aus der NNR.
1.4 Hormone der Streßreaktion und der HPA-Achse
a) Corticotropin Releasing Hormone (CRH)
Das im Nucleus paraventricularis des Hypothalamus gebildete Neuropeptidhormon CRH
ist ein hochmolekulares Peptid aus 41 Aminosäuren. Über das Portalsystem gelangt es zum
Hypophysenvorderlappen wo es die Sekretion von ACTH und beta-Endorphin bewirkt.
Weiterhin wird vermutet, daß CRH auch auf die Sekretion von Somatotropin und Prolaktin
regulierend einwirkt (Hokfelt et al,1983). Immunoreaktives CRH wurde auch in vielen
extrahypothalamischen Geweben nachgewiesen, wie z.B. im Magen, Duodenum, Leber
und Pankreas sowie in der Lunge und der Nebenniere (Krusemann et al, 1982; Petrusz et
al, 1983). Im ZNS wurde CRH in verschiedenen Arealen nachgewiesen, wo es vor allem
die Funktion eines Neurotransmitters übernimmt (Smith et al, 1986). Es beeinflußt hier
eine Vielzahl an Verhaltensreaktionen, wie z.B. die Nahrungsaufnahme (Morley und
Levine, 1982). An der Regulation der CRH-Sekretion sind verschiedene Neurotransmitter
beteiligt. Dabei wirken Adrenalin, Acetylcholin, Prostaglandin E, Prostaglandin F2 alpha
und Histamin stimulierend und Norepinephrin und Melatonin dämpfend auf die
Freisetzung von CRH. Auch die beiden Hormone der HPA-Achse, ACTH und Cortisol,
beeinflußen die CRH-Regulation durch einen negativen Feedback-Mechanismus.
b) ACTH
ACTH
wird
als
Spaltprodukt
eines
höhermolekularen
Precursors
aus
den
Proopiomelanocortinzellen (POMC-Zellen) im Hypophysenvorderlappen gebildet. Neben
dem ACTH, welches als wichtigstes dieser Sekretionsprodukte gilt, wird auch noch beta-
9
Endorphin und alpha-MSH aus diesem Vorläufer gebildet (Eipper und Mains, 1980). Das
ACTH bewirkt an der Nebennierenrinde eine erhöhte Sekretion und Freisetzung von
Cortisol. Die ACTH-Sekretionskontrolle ist multifaktoriell. Neben CRH und Vasopressin
stimulieren auch eine Vielzahl anderer Substanzen wie Angiotensin II, Calcitonin,
Oxytozin und Katecholamine die ACTH-Freisetzung (Arimura et al, 1969; Gaillard et al,
1981; Giguere et al, 1981; Mezey et al, 1983; Vale et al, 1983; Jones und Gillham, 1988)
c.) Cortisol
Cortisol
ist
das
Wichtigste
von
den
in
der
Nebennierenrinde
produzierten
Glukokortikoiden. Es wird von den Zellen der Zona fasciculata sezerniert und in das Blut
abgegeben, wo es zu 90% an Transportproteine ( CBG und Albumin ) gebunden und zu
10% in freier Form vorliegt. Nur die freie Fraktion ist biologisch wirksam (Brien, 1980).
Im Blut gelangt es zu den verschiedenen Organen, wo es eine Vielzahl an metabolischen
Wirkungen auslöst. Die Regulation der Cortisolsekretion erfolgt, wie oben beschrieben,
durch die Einwirkung von ACTH sowie über die übergeordneten Zentren und wird durch
zahlreiche exogene und endogene Faktoren beeinflußt.
d.) GH
Das GH ist ein im Hypophysenvorderlappen gebildetes Proteohormon, dessen Bildung und
Sekretion unter anderem durch die hypothalamischen Hormone Somatostatin und Growth
Hormone Releasing Hormone kontrolliert werden. Es steuert das Skelettwachstum, steigert
die DNA-Synthese, regt die Proteinbiosynthese an und hemmt die Lipidsynthese.
Außerdem
bewirkt
GH die Ausschüttung
von
Glukagon,
die
Erhöhung des
Blutzuckerspiegels durch insulinantagonistische Wirkung sowie die Steigerung der
Glukoneogenese in der Leber und der Lipolyse im Fettgewebe. Die Freisetzung des GH
wird insbesondere durch eine Hypoglykämie und bei erhöhtem Glukagonspiegel gesteigert.
Die Ausschüttung des GH wird dagegen durch Glukose und Cortisol reduziert. Ebenso
10
kann das Hormon nur alleine durch mentalen Stress vermehrt ausgeschüttet werden
(Greenwood et al, 1966; Landon et al, 1966). Die Serumkonzentration dieses Hormons ist
bei Frauen höher als bei Männern, weiterhin steigt die Freisetzung besonders in den
Schlafstadien III und IV.
e.) Katecholamine
Katecholamine sind biogene Amine, deren Gemeinsamkeit die Dihydroxyphenyl-Gruppe
ist. Ihre Biosynthese beginnt mit der Aminosäure Tyrosin, die zu Dopa hydroxyliert und
anschließend zu Dopamin decarboxyliert wird. Durch eine weitere Hydroxylierung entsteht
Noradrenalin, welches durch Methylierung zu Adrenalin wird. Dopamin, Adrenalin und
Noradrenalin fungieren als Neurotransmitter. Adrenalin und Noradrenalin wirken
zusätzlich noch als Hormone.
1. Adrenalin
Adrenalin ist ein zu den Katecholaminen gehörender Neurotransmitter, der im
chromaffinen Gewebe, den Paraganglien des Sympathikus und im Nebennierenmark
gebildet wird. Präganglionäre sympathische Fasern bewirken durch Freisetzung von
Acetylcholin im NNM die Ausschüttung von Adrenalin in das Blut. Über dieses gelangt
Adrenalin zu den Erfolgsorganen, wo es an α- und β-Rezeptoren bindet.
2. Noradrenalin
Noradrenalin wird wie Adrenalin im NNM gebildet, ist darüber hinaus noch
Überträgerstoff an den meisten postganglionären sympathischen Nervenendigungen. Es hat
zum einen Adrenalin-antagonistische und zum anderen abgeschwächte Adrenalinsynergistische Wirkungen.
11
Systemische Wirkungen von Adrenalin und Noradrenalin:
1.
positiv chronotrop, dromotrop und inotrop am Herzen
2.
Vasokonstriktion
3.
Bronchodilatation
4.
Mydriasis
5.
Hemmung der Darmperistaltik
6.
Hyperglykämie und Glukosurie
7.
Steigerung der Lipolyse
f.) Interleukin-6
Interleukine
sind
von
Leukozyten
sezernierte
Kommunikationsproteine
der
Immunregulation, die vielfältige Funktionen besitzen. Sie werden numerisch von 1 bis 12
klassifiziert, wobei jedes Interleukin sich von den anderen durch seine Wirkungen
unterscheidet. Interleukin-6 wird von mononukleären Phagozyten, Endothelzellen,
aktivierten T-Zellen, Fibroblasten und anderen Zellen gebildet. Seine Sekretion wird
stimuliert durch IL-1 und TNF-alpha (Kishimoto, 1987). IL-6 besitzt eine wichtige Rolle in
der Regulation der Akute-Phase–Reaktion (Castell et al, 1988; Ramadori et al, 1988). Es
wirkt dabei auf Hepatozyten, die dadurch zahlreiche Plasmaproteine, wie z.B. Fibrinogen,
synthetisieren. Es vermittelt die Induktion von Fieber, die Immunglobulinsynthese in
aktivierten B-Zellen, die Aktivierung von T-Zellen und die Stimulation der
Myokaryopoese. Weiterhin wirkt es als Wachstumsfaktor in der Differenzierung von
aktivierten B-Zellen sowie als Kostimulator von T-Zellen und Thymozyten. Zusammen
mit anderen Zytokinen beeinflußt es auch als Kofaktor das Wachstum von
hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark. Gehemmt wird die IL-6-Synthese durch
Glukokortikoide. Klinisch ist Interleukin-6 ein unspezifischer Inflammationsmarker, wobei
IL-6 bei chronischen Entzündungen wie rheumatoider Arthritis oder auch bei soliden
Tumoren dauerhaft erhöht ist.
12
g.) TNF-RII
Der Tumor-Nekrose-Faktor liegt in zwei aktiven Formen im Plasma vor. Erstens als TNFalpha (syn. Kachektin), der vor allem von Makrophagen/Monozyten, Lymphozyten ,
Mastzellen aber auch in Kupffer-Zellen der Leber, Gliazellen und Keratinozyten der Haut
gebildet wird (Tracey und Cerami, 1993). Er beeinflußt Entzündungsreaktionen, Sepsis,
den Lipid- und Proteinstoffwechsel, die Blutbildung, Angiogenese, die Wundheilung sowie
Immunabwehr und hat zytolytische und zytostatische Wirkung auf Tumorzellen (Tracey ,
1991). Zweitens als TNF-beta (syn. Lymphotoxin), welches vor allem zytotoxisch auf
Tumorzellen wirkt. Sowohl exogene als auch endogene Faktoren stimulieren die Synthese
von TNF, wie z.B. Endotoxine (Lipopolysaccharide), Enterotoxine und das Toxische
Schock Syndrom Toxin. TNF triggert die Produktion von anderen Zytokinen, welche die
biologischen Effekte von TNF verstärken TNF wird aus dem Blut durch zwei verschiedene
Funktionen entfernt:
1. Bindung an zelluläre oder im Plasma gelöste TNF-Rezeptoren
2. Clearance durch die Leber und Niere
Bei den membranständigen Rezeptoren unterscheidet man TNF-RI und TNF-RII, zu denen
TNF jeweils dieselbe Affinität besitzt (Pfitzenmaier et al, 1993). Mit Ausnahme der
Erythrozyten sind beide Rezeptortypen auf jeder Körperzelle repräsentiert. Ebenso liegen
beide Rezeptortypen auch in gelöster Form im Serum vor, wo sie als TNF-bindende
Proteine bezeichnet werden (Van Zee et al, 1992). Diese löslichen Rezeptoren
konkurrieren mit den zellassoziierten Rezeptoren um das TNF. Die biologische Rolle der
lösliche Rezeptoren scheint Dosis-abhängig zu sein, d. h. bei hohen Konzentrationen
reduzieren diese die Bioaktivität von TNF, während in niedriger Konzentration die
Langzeiteffekte von TNF verlängert werden (Ashkenazi et al, 1991). Die Synthese der
löslichen Rezeptoren erfolgt durch proteolytische Spaltung der extrazellulären Domäne des
13
zellulären TNF-Rezeptors. TNF-Rezeptoren lassen sich im Serum und Urin von
Normalpersonen nachweisen.
Ihre Konzentration steigt nach Gabe von TNF,
Lipopolysacchariden und anderen Zytokinen an. Es wird vermutet, daß der Organismus
durch Freisetzung von löslichen TNF-Rezeptoren vor der Toxizität des exzessiv
produzierten TNF´s geschützt wird.
1.5 Zirkadianer Rhythmus der HPA-Achse
Die zirkadiane Rhythmik ist ein ubiquitär vorkommendes Phänomen, welches sowohl bei
Tieren als auch bei Pflanzen zu beobachten ist. Beim Menschen unterliegen zahlreiche
Körpersysteme, wie z.B. Schlaf, Körpertemperatur, Urinausscheidung von Kalium und die
Plasmakonzentration von Cortisol, einem solchen Rhythmus. Die Hauptfunktion dieser
Periodizität scheint in der Koordination metabolischer und physiologischer Vorgänge zu
liegen, um unabhängige Funktionen zu koordinieren und konkurrierende Prozesse zeitlich
zu trennen (Moore-Ede und Sulzmann, 1981). Die meisten Menschen haben eine 25
Stunden Periodizität in ihrem endogenen Rhythmus und stimmen damit nicht exakt mit
dem 24 Stunden Rhythmus der Erdrotation überein (Moore-Ede et al, 1983a/b). Das
zeitliche Sekretionsmuster der Hormone der HPA-Achse wird durch den Hypothalamus
und seine übergeordneten Zentren, wie auch durch exogene Einflüsse bestimmt. Es wird
vermutet, daß Neurone des Nucl. suprachiasmaticus, die ein zirkadianes Muster an
Impulsraten abgeben, als Schrittmacher fungieren (Green und Gillette, 1982; Inouye und
Kawamura, 1982). Weiterhin glaubt man, daß es bestimmte Zeitgeber gibt, wie den HellDunkel-Zyklus, Mahlzeiten und soziale Kontakte, die die Einstellung des Schrittmachers
bewirken (Sulzmann et al, 1977; Inouye und Kawamura, 1979; Vernikos-Danellis und
Winget, 1979). Als Folge dieser Mechanismen zeigt die Plasmacortisolkonzentration einen
zirkadianen Verlauf mit einem Nadir um Mitternacht sowie Höchstwerten in den
14
Morgenstunden (Perkoff et al, 1959; Krieger et al, 1971). Man fand heraus, daß der
Verlauf der zirkadianen Rhythmik sich nicht als glatte Kurve darstellte, sondern als eine
mit scharfen Anstiegen und Abfällen gezackte Linie. Weiterhin gab es auch keinen Beweis
für das Vorliegen einer Basalsekretion oder eines „steady states“ der CortisolKonzentration. Die Sekretionsepisoden machen 6,25 Stunden des Tages aus, wobei
während der restlichen 18 Stunden des Zyklus keine Sekretion stattfindet (Hellmann et al,
1970; Weitzmann et al, 1971). Die Hauptsekretionsphasen während eines 24 Stunden
Zyklus sind morgens zwischen 4 und 6 Uhr, mittags zwischen 11 und 14 Uhr und
nachmittags zwischen 16:30 und 18 Uhr (Krieger et al, 1971). Eine eindeutige Beziehung
zwischen Episoden von ACTH-Sekretion und nachfolgenden Cortisol-Peaks konnte von
Gallagher et al. nachgewiesen werden. Er zeigte, daß ACTH episodisch für sehr kurze
Zeitintervalle ausgeschüttet wird, gefolgt nach etwa 10 Minuten von einer CortisolSekretion (Gallagher et al, 1973). Dagegen konnten Fehm et al. nachweisen, daß auch
ACTH-unabhängige Mechanismen in der Regulation der Cortisol-Sekretion existieren
(Fehm et al, 1983; Fehm et al, 1984).
Neben diesem hypothalamisch kontrollierten Rhythmus konnte noch ein
tageszeitlicher Wechsel in der Reaktionssensitivität der Nebennierenrinde und der
Hypophyse auf ACTH festgestellt werden. Man geht davon aus, daß der Hypothalamus
den zirkadianen Rhythmus initiiert, aber die Amplituden vor allem durch die
Veränderungen in der Antwortbereitschaft der Hypophyse und Nebennierenrinde
hervorgerufen werden (Dallman et al, 1978). Follenius et al. zeigten, daß die
Reaktionsbereitschaft der Nebennierenrinde auf ACTH in der Nacht niedrig ist und mit
steigender Cortisol-Sekretion zunimmt (Follenius et al 1987). Es gibt Hinweise darauf, daß
die Nebenniereninnervation die adrenocorticale Antwortbereitschaft mitreguliert und somit
zum zirkadianen Rhythmus des Plasmacortisols beiträgt (Ottenweller und Meier, 1982).
15
Wie diese Ausführungen zeigen ist die periodische Ausschüttung von Cortisol das Resultat
vieler verschiedener Mechanismen die die Aktivität der HPA-Achse steuern und
beeinflußen.
1.6 Die Physiologie des Cortisol-Mittagspeaks
Zahlreiche Studien haben gezeigt, daß es im Verlauf des zirkadianen Cortisol-Rhythmus
tageszeitlich abhängige Phasen mit erhöhter Sekretion gibt, welche besonders morgens und
mittags auftreten (Perkoff et al, 1959; Hellman et al, 1970; Krieger et al, 1971; Weitzman
et al, 1971; Quigley und Yen, 1979). Als Auslöser, besonders für den Mittagspeak, wurde
die Aufnahme von Nahrung beschrieben (Krieger et al, 1971; Quigley und Yen, 1979;
Follenius et al, 1982; Brandenberger et al, 1984). Die dem Anstieg des Cortisols zu Grunde
liegenden Vorgänge scheinen sehr komplexer Natur zu sein. So haben Untersuchungen
herausgefunden, daß eine Mahlzeit am Mittag einen deutlich höheren Cortisolanstieg
bewirkt als Vormittags oder am Abend (Quigley und Yen, 1979; English et al, 1982;
Follenius et al, 1982; Knoll et al, 1984). Ursächlich hierfür könnten zum einen die bereits
beschriebene zirkadiane Rhythmik der HPA–Achsen Aktivität sowie die unterschiedliche
Reaktionsbereitschaft der Nebennierenrinde sein. Man vermutet weiterhin, daß das
Ausmaß des Cortisolanstiegs nach Stimulation abhängig ist vom Basallevel. Akerstedt et
al. fanden einen nur sehr kleinen Anstieg von Cortisol nach Essenseinnahme während
Perioden mit minimaler basaler Sekretion (Akerstedt und Levi, 1978). Derselbe Stimulus
führte jedoch bei höheren Basalwerten zu stärkeren Cortisolanstiegen. Ein weiterer
wichtiger Faktor ist die Zusammensetzung der Mahlzeit. So konnten Slag et al.
nachweisen, daß eine proteinreiche Nahrung zu einem signifkanten Anstieg von Cortisol
führt, während bei einer fett- oder kohlehydratreichen Mahlzeit der Cortisol-Anstieg
niedriger bzw. nicht signifikant ist (Slag et al, 1981). Dies wurde durch weitere Arbeiten
16
bestätigt (Ishizuka et al, 1983; Gibson et al, 1999). Daraus kann man folgern, daß der
Anteil der Proteine in der Nahrung die Höhe des Cortisol-Peaks beeinflußt. Daneben kann
der Mittagspeak aber auch nur durch den Anblick einer Mahlzeit ausgelöst werden
(Follenius et al, 1982; Holl et al 1984). Dies spricht dafür, daß auch cerebrale Vorgänge an
der Auslösung der Cortisolantwort beteiligt sind.`
1.7 Klinische Bedeutung der Thematik
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluß von Proteinen und Aminosäuren nach
nasogastraler Infusion auf die systemische Immunantwort und soll klären, ob die
Antigenität der Proteine Auslöser für die Aktivierung immunologischer Prozesse ist.
Weiterhin ist bisher unklar welche Funktion diese Immunabwehrprozesse und speziell die
Aktivierung der HPA-Achse mit Ausschüttung von Cortisol haben. Nahrung ist einerseits
essentiell für die Homöostase des Organismus, aber andererseits auch ursächlich für
Erkrankungen wie chronisch entzündliche Darmerkrankungen und Nahrungsallergien. Die
Erforschung der physiologischen Vorgänge ist daher unabdingbar für das Verständnis von
daraus resultierenden Krankheitsprozessen.
a.) Orale Toleranz und Nahrungsallergien
Trotz der großen Anzahl an Nahrungsantigenen, denen der Körper ausgesetzt ist,
entwickelt sich bei nur einem kleinen Teil der Menschen eine Nahrungsallergie. Dies ist
die Folge der Entwicklung einer oralen Toleranz. Sie wird als Zustand aktiver Inhibition
der Immunantwort auf ein Antigen, bei vorheriger Antigenexposition über den
Gastrointestinaltrakt, beschrieben (Chase, 1946). Kommt es zu einem Zusammenbruch der
oralen Toleranzmechanismen oder einem Fehlen der Induktion der oralen Toleranz führt
dies zur Ausbildung einer Nahrungshypersensitivität (Chehade und Mayer, 2005). Es
17
werden 2 Formen der oralen Toleranz, abhängig von der Dosis des intraluminalen
Antigens,
beschrieben:
1.
Hochdosistoleranz
und
2.
Niedrigdosistoleranz.
Die
Niedrigdosistoleranz wird durch Aktivierung von regulatorischen T-Zellen vermittelt, die
die Immunantwort durch lösliche oder zelloberflächenassoziierte supprimierende Zytokine
supprimieren. Dagegen wird die Hochdosistoleranz durch eine Lymphozytenanergie
verursacht (Chehade und Mayer, 2005). Weitere Einflussfaktoren auf die Ausbildung einer
oralen Toleranz sind die Form des Antigens, eine normale Darmflora, Alter des
Organismus und genetische Disposition. Störungen dieser Faktoren können zur Ausbildung
von Nahrungsallergien führen. Eine der häufigsten Nahrungsmittelallergien wird durch
Kuhmilchproteine hervorgerufen. Die Kuhmilchallergie betrifft ca. 2,5% aller Säuglinge
und wird in den ersten Lebensjahren erworben (Host, 1994). Hauptrisikofaktoren für die
Ausbildung einer Kuhmilchallergie sind eine positive familiäre Anamnese für
Kuhmilchallergien und andere atopische Erkrankungen sowie eine frühe Exposition
gegenüber Kuhmilchproteinen (Host, 1994). Daß Proteine mit ihrer Antigeneigenschaft
ursächlich für die Kuhmilchallergie sind, zeigt sich daran, daß eine nur aus hydrolysierten
Bestandteilen bestehende Milch signifikant die Prävalenz von Kuhmilchallergien senkt
(Ragno et al, 1993; Businco et al, 1999).
b.) Chronisch entzündliche Darmerkrankungen
Ein
Zusammenhang
zwischen
der
Ernährung
und
chronisch
entzündlichen
Darmerkrankungen ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Für eine ursächliche Rolle
der Ernährung in der Genese des M. Crohn und der Colitis ulcerosa sprechen die relative
Häufung in den Industriegesellschaften sowie daß die Erkrankung erst seit relativ kurzer
Zeit bekannt ist und die Inzidenz in den letzten Jahrzehnten deutlich zugenommen hat. Es
gibt Studien in denen der Zusammenhang zwischen bestimmten Nahrungsmitteln und einer
18
Verschlechterung der Symptomatik untersucht wird (Chuah et al, 1992; Persson et al,
1992; Ballegaard et al, 1997; Joachim, 1999). Dabei stellte sich heraus, daß besonders
Schokolade, Milchprodukte, Fette und künstliche Süßmittel eine Verschlechterung sowohl
bei Colitis ulcerosa als auch bei M. Crohn auslösen. Miura et al. stellten fest, daß bei M.
Crohn eine total parenterale Ernährung oder eine Diät häufig zu einer Remission führt. Sie
vermuten, daß vielleicht eine Reduktion der in der Nahrung enthaltenden Antigenlast
Ursache für die Besserung ist (Miura et al, 1998). Dafür sprechen auch Ergebnisse die
besagen, daß eine Diät, die ganze Proteine beinhaltet weniger effektiv ist in der Induktion
einer Remission bei M. Crohn als eine Diät ganz ohne Nahrungsantigene (Mansfield et al,
1995). In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, daß eine ansteigende Inzidenz von
M. Crohn stark mit zunehmender Einnahme von Tierproteinen korreliert sowie
abgeschwächt mit der Einnahme von Milchproteinen, ungesättigten Fettsäuren und Fett
korreliert (Shoda et al, 1996).
1.8 Fragestellung
1. Ist die Antigeneigenschaft der Proteine ursächlich für den Cortisol-Mittagspeak?
2. Wird dieser Prozeß durch Interleukine bzw. TNF-alpha vermittelt?
3. Wird der durch Aminosäure/ Proteine ausgelöste Mittagspeak durch ACTH vermittelt?
4. Bewirken Aminosäuren eine direkte Stimulation der HPA-Achse?
19
2. Material und Methoden
2.1 Versuchspersonen
An der Hauptstudie nahmen 12 gesunde und normalgewichtige Männer im Alter von 18-35
Jahren teil (Alter: 26,0 ± 0,69 Jahre; BMI: 23,64 ± 0,8 kg/m²). Im Zusatzexperiment
wurden 4 zusätzliche Männer untersucht (Alter: 23.00 ± 0,81 Jahre; BMI: 23,33 ± 1,26
kg/m²). Jeder Proband war Nichtraucher und nahm während des Zeitraumes der Studie
keine Medikamente ein. Ebenso litt keiner der Freiwilligen unter einer chronischen
Darmerkrankung
oder
einer
Erkrankung
des
endokrinen
Systems,
noch
sind
Essenstörungen, Tumorerkrankungen oder Autoimmunerkrankungen bekannt gewesen.
Alle Teilnehmer wurden vor Beginn der Studie medizinisch auf Tauglichkeit untersucht.
Während des Versuchzeitraumes mußte auf einen normalen Schlaf-Wach-Rhythmus sowie
eine regelmäßige Esseneinnahme geachtet werden. Ebenso war eine Voraussetzung, daß
die Probanden an keiner anderen Studie während dieses Zeitraumes teilnahmen noch Blut
spendeten. Die Versuchspersonen wurden dazu angehalten mindestens zwölf Stunden vor
Versuchsbeginn die letzte Mahlzeit einzunehmen. Vor Versuchsbeginn wurden die
Probanden sowohl mündlich als auch schriftlich über die Studie informiert und sie legten
anschließend ihr Einverständnis schriftlich nieder. Die Experimente wurden vorher von der
Ethikkommission bewilligt.
2.2 Versuchsdurchführung
Die Studie besteht aus einem Haupt- und einem Zusatzexperiment. Die Versuche
entsprachen den allgemeinen Kriterien einer Doppelblind-Cross-over-Studie. Die
Hauptversuchsreihe erstreckte sich über drei Tage, bei den Zusatzversuchen nahmen die
Probanden an zwei Sitzungen teil. Der Mindestabstand zwischen den Versuchstagen betrug
7 Tage. An den Versuchstagen befanden sich die Freiwilligen in einem klimatisierten
20
hellen Raum, in liegender Position, auf einer Untersuchungsliege. Die Probanden durften
lesen und Musik hören. Das Bett durfte nicht verlassen werden und die Versuchspersonen
wurden instruiert sich ruhig zu verhalten.
Die Sitzungen des Hauptversuches begannen immer um 10.00 Uhr vormittags und
endeten um 16.30 Uhr am Nachmittag. Der Versuch startete mit dem Legen einer
Venenverweilkanüle (Venflon® R2; 16G, 1.0 mm; Viggo AB) in eine Kubitalvene, über
die während des Versuchszeitraumes Blut abgenommen wurde. Um ein Verstopfen der
Braunüle zu verhindern, wurde diese während des Versuchszeitraums mit 1000 ml 0,9%iger NaCl-Lösung durchgespült. Um die Protein- bzw. Aminosäurenlösungen nasogastral
infundieren zu können, wurde den Versuchspersonen über die Nase eine Magensonde
(Magensonde mit Mandrain, Länge 100 cm, Charrière 14, Dahlhausen) gelegt. Die
Nasenschleimhaut wurde dabei vorher mit Xylocain Gel 2% anästhesiert. In der Zeitspanne
von 12.30 bis 13.00 Uhr erfolgte die gleichmäßige Zufuhr von 1000 Milliliter Flüssigkeit
aus einem Beutel zur enteralen Ernährung (Flocare-Top) über die Magensonde.
Verabreicht wurden entweder 50 g Caseinpulver (Casein Sodium Salt From Bovine Milk;
Sigma) bzw. 50 g Casein-Aminosäurepulver (Casein Acid Hydrolysate, Amicase From
Bovine Milk; Sigma) gelöst in 1000 ml Kochsalzlösung oder 1000 ml Kochsalzlösung
alleine. Die Versuchsbedingungen waren über alle Probanden ausbalanciert. Um 13.00 Uhr
wurde die Magensonde gezogen.
Bei dem Zusatzversuch wurde den Probanden zu Beginn jeder Sitzung eine
Magensonde und zwei Venenverweilkanülen gelegt. Über die Kanülen wurde zwischen
12.00 und 13.15 Uhr alle 15 Minuten Blut abgenommen. Nach der zweiten Blutentnahme
um 12.30 Uhr wurde die Infusion der Aminosäurelösung gestartet. Über die Magensonde
erhielten die Probanden in einem Zeitraum von 30 Minuten die in einem Liter
physiologischer
Kochsalzlösung
aufgelösten
50
Gramm
Aminosäurehydrolysat
21
(Aminoplasmal 5% usw.). Zeitgleich wurden 200 ml Kochsalzlösung intravenös zugeführt
Bei der intravenösen Gabe wurden über 45 Minuten 10 Gramm Aminosäurehydrolysat,
aufgelöst in 200 ml physiologischer Kochsalzlösung, verabreicht. Während dieses
Zeitraumes erhielten die Teilnehmer außerdem entsprechend 1000 ml Kochsalzlösung über
die Magensonde. Die unterschiedliche Dauer als auch die verschiedenen Mengen der
verabreichten Substanzen bei der parenteralen und enteralen Gabe basieren auf
Erkenntnissen aus vorausgegangenen Untersuchungen. Es sollte sichergestellt werden, daß
der Anstieg der Aminosäurekonzentrationen innerhalb der ersten 30 Minuten bei beiden
Bedingungen vergleichbar ist. Um dies überprüfen zu können, wurde nach Beginn der
Infusion über einen Zeitraum von 45 Minuten L-Tryptophan viertelstündlich im Serum
gemessen.
2.3 Verwendete Substanzen
a) Casein (Sodium Salt From Bovine Milk; Sigma). Casein ist ein Phosphoproteingemisch
(Proteid) bestehend aus 18 verschiedenen Aminosäuren. Eine Aufschlüsselung der
Aminosäurenverteilung ist in Tabelle 1 dargestellt. Casein ist der Hauptproteinbestandteil
der Milch. Elektrophoretisch kann das Casein in alpha-, beta-, gamma- und kappa-Casein
getrennt werden. Enzymatisch wird Casein durch Trypsin und Pepsin gespalten, wodurch
verschiedene Phosophopeptide entstehen, die unter anderem in reifendem Käse gefunden
werden.
b) Casein Hydrolysat (Casein Acid Hydrolysate, Amicase From Bovine Milk,Sigma).
Amicase wird durch Säurefällung aus Casein hergestellt und liegt als helles gelbes Pulver
vor. Es besteht zu 18-20 % aus Peptiden und 80-82 % Aminosäuren. Amicase löst sich in
Wasser und ist in Lösung stabil. Es enthält dieselbe Menge und Verteilung an
Aminosäuren wie Casein.
22
c) Aminoplasmal 5% (Braun Melsungen AG, Deutschland. Aminoplasmal ist eine
Aminosäurenlösung, die 20 verschiedene Aminosäuren beinhaltet. Die 500 ml Lösung ist
frei von Kohlenhydraten. Eine Auflistung der Aminosäuren findet sich in Tab. 2.
2.4 Experimentelle Methoden
2.4.1 Blutentnahmen
Im Hauptversuch erfolgte die erste Blutentnahme um 10.30 Uhr. Bis 11.30 Uhr wurden in
einem Abstand von dreißig Minuten die Blutproben entnommen, danach in einem
viertelstündlichen Rhythmus bis 15.00 Uhr und schließlich, bis zum Versuchsende um
16.30 Uhr, wieder in halbstündlichen Abständen. Beim Zusatzexperiment wurden
zwischen 12.00 und 13.15 Uhr alle 15 Minuten Blut abgenommen. Zu jedem Meßzeitpunkt
wurde zunächst 5 ml Blut entnommen und verworfen. Anschließend wurden nochmals 5
ml Blut in einer Injektionsspritze entnommen und sofort in einen EGTA-Vaccutainer (Fa.
Amersham, Buchler Braunschweig) injiziert. Diese Röhrchen waren für die Bestimmung
der Katecholamine vorgesehen. Zusätzlich wurde Blut in zwei 2,7 ml EDTA-Monovetten
®(Fa. Sarstedt, 5223 Nürnbrecht) für die Bestimmung von ACTH und des
Differentialblutbildes sowie in einer 7,5 ml Granulatmonovette (Fa. Sarstedt) für die
Bestimmung von Cortisol und GH entnommen.. Die Blutproben wurden für 10 min bei
4000 U/min und einer Temperatur von 4 Grad Celsius zentrifugiert (Zentrifuge Universal
16R, Hettich). Anschließend wurden das Serum bzw. Plasma in 300 und 500 µl Portionen
in Eppendorfgefäße ( Sarstedt, Nürnbrecht- Rummelsdorf) abpipettiert und bei –29 Grad
bzw. –80 Grad Celsius (Katecholamine) eingefroren.
23
2.4.2 Hormonbestimmung
Die Blutproben eines jeden Probanden wurden im Doppelansatz in demselben Assay und
anschließender
Mittelwertbildung
bestimmt.
Es
wurden
dabei
kommerzielle
halbautomatische Assay-Kits verwendet. Es folgt eine Beschreibung der einzelnen Assays.
a) ACTH
Das Plasma-ACTH wurde mit der Hilfe eines immunoluminometrischen Zweischritt-Assay
(LUMItest ACTH®, Fa. Brahms Berlin) bestimmt. Bei diesem Assay werden zwei
antigenspezifische monoklonale Antikörper, die das ACTH (Antigen) an jeweils
verschiedenen Determinanten erkennen, im Überschuß eingesetzt. Einer der beiden
Antikörper ist lumineszenz-markiert (Tracer), der andere auf der Innenseite des Röhrchens
fixiert (Coated-tube-Technik). Im 1. Inkubationsschritt erfolgt die Extraktion des in der
Probe enthaltenden ACTH durch an der Röhrenoberfläche fixierte anti-ACTH-Antikörper.
Nachdem
die
Röhrchen
gewaschen
wurden,
erfolgt
die
Zugabe
eines
lumineszenzmarkierten anti-ACTH-Antikörpers. Dieser bindet an das Antigen, welches
bereits mit dem Antikörper auf der Röhrchenwand reagiert hat. Nach mehrmaligem
Waschen wird der an der Röhrchenwand verbliebene Traceranteil durch die Messung des
Lumineszenzsignals in einem Luminometer ermittelt. Dieser ist der ACTH-Konzentration
der jeweiligen Probe direkt proportional. Durch das Erstellen einer Standardkurve wird die
ACTH-Konzentration ermittelt. Die Normalwerte betragen 10-60 pg/ml (2,2-13,2 pmol/l)
in der Zeit von 8-10 Uhr morgens und 6-30 pg/ml (1,3-6,6 pmol/l) für die Zeit von 20-22
Uhr abends. Ein Assay, ausreichend für maximal 100 Bestimmungen, enthält mindestens 7
Standards und 2 Kontrollseren. Die Sensitivität des Assays liegt bei 0,44 pmol/L. Die
Intra- und Inter- Assay- Variationskoeffizienten sind < 8,0 % bei ACTH – Konzentrationen
zwischen 2,2 und 220 pmol/l.
24
b) Cortisol
Das Plasma-Cortisol wurde mittels eines kompetetiven ELISA (Enzymun-Test® Cortisol,
Boehringer
Mannheim
Immundiagnostica)
bestimmt.
Nichtmarkiertes
Cortisol
(Patientenserum) und Inkubationslösung (Cortisol-POD-Konjugat) konkurrieren um die
Bindungsplätze an Cortisol- Antikörpern. Diese sind an eine feste Phase gebunden
(Röhrchenwand). Nach Inkubation und Trennung der gebundenen von den freien
Komponenten durch eine Waschlösung erfolgt eine Farbreaktion mit SubstratChromogenlösung (ABTS®).Dabei reagiert die Substrat-Chromogenlösung mit dem PODBestandteil
des
Cortisol-POD-Konjugates.
Die
Farbentwicklung
wird
im
Spektralphotometer durch eine Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge von 420 nm
quantifiziert. Die Messung erfolgt dabei gegen die Substrat-Chromogen-Lösung(ABTS®).
Die Extinktion ist reziprok zu der Konzentration an Cortisol im Serum. Durch die
Mitbestimmung von Standardseren mit bekannter Cortisolkonzentration wird der
Cortisolgehalt der Proben ermittelt. Der Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizient
beträgt < 5,0% bei Konzentrationen zwischen 50 und 822,7 nmol/l. Die Sensitivität liegt
bei 27,6 nmol/l. Die Referenzbereiche liegen morgens zwischen 7-25 µg/dl bzw. 193-690
nmol/l sowie abends zwischen 2-9 µg/dl bzw. 55-248 nmol/l. Ein Assaylauf mit maximal
100 Bestimmungen beinhaltet mindestens 5 Standards im Doppelansatz.
c.) GH
Zur Bestimmung des GH (hGH,STH) im Serum wurde ein komepetetiver Flüssigphasen
Radioimmunoassay (hGH-RIA, Fa. DPC Biermann GmbH, Bad Nauheim) verwendet.
Hierbei konkurrieren das inaktive GH aus der Probe und das 125|-markierte GH um eine
begrenzte Anzahl von Bindungsstellen eines spezifischen Antikörpers. Die an den
Antikörper gebundenen Komponenten des Reaktionsgemisches werden durch Fällung mit
25
einer Präzipitationslösung (Gemisch aus 2. Antikörper und Polyethylenglykol, PEG) von
den freien
Komponenten getrennt. Anschließend erfolgt die Zentrifugation mit
nachfolgendem Abgießen oder Absaugen des Überstandes. Es wird nun die Radioaktivität
im Präzipitat gemessen. Aus den Meßergebnissen des Standards wird eine Eichkurve
erstellt und von dieser die GH-Konzentration abgelesen. Der Intra- und Inter-Assay
Variationskoeffizient beträgt unter 8,3% bei Konzentrationen zwischen 1,1 und 10,9 ng/ml.
Der Normalbereich geht bis 7 ng/ml. Die Basalwerte liegen beim erwachsenen Mann bei
1,8 ±1 ,6 ng/ml und bei der Frau vor der Menopause bei 3 ± 1,6 ng/ml. Ein Assaylauf mit
maximal 70 Bestimmungen beinhaltet mindestens 6 Standards im Doppelansatz.
d) Adrenalin, Noradrenalin
Die quantitative Analyse der Katecholamine im Plasma erfolgte mit Hilfe eines
Hochleistungsflüssigkeitschromatographen
mit elektrochemischem Detektor (ClinRen-
Kit,Fa. Waters). Jede Probe wird dabei in eine Probenaufbereitungskartusche mit
Extraktionspuffer, Stabilisator und Standardlösung gegeben. Unter Schütteln binden sich
die Katecholamine an das Aluminiumoxid der Kartusche. Nach Absaugung des
Plasmaüberstandes werden die an Aluminiumoxid gebundenen Katecholamine mit
Waschpuffer gewaschen. Anschließend erfolgt eine Trockenzentrifugation. Nach Zugabe
eines Elutionspuffers werden die Proben für 30 Minuten im Kühlschrank inkubiert und
anschließend erneut zentrifugiert. 50 µl des Eluats werden in das HPLC-System injiziert
und analysiert. Von der quantitativen Analytik der aufgearbeiteten Proben wird ein
Eichchromatogramm erstellt, welches die Komponenten des Probengemisches enthält.
Anhand der Daten des Eichlaufs, Retentionszeit, Peakhöhen bzw. Peakflächen wird die
Probenauswertung vorgenommen. Das Ergebnis wird in pg/ml angegeben. Die Methode
gestattet
die
Bestimmung
von
Noradrenalin,
Adrenalin
und
Dopamin
im
26
Konzentrationsbereich zwischen 10 und 1000 pg/ml Plasma. Die Wiederfindungsrate
beträgt 70-90 % bezogen auf eine extern injizierte Standardlösung. Der Intra-Assay
Variationskoeffizient beträgt für Noradrenalin 6,7 %, für Adrenalin 7,6 % und Dopamin
6,1 %.Der Inter-Assay Variationskoeffizient beträgt für Noradrenalin 5,3 %, für Adrenalin
1,2 % und für Dopamin 3,9 %.
e) Interleukin 6
Zur Bestimmung von IL-6 wurde ein quantitativer Immunoassay (Quantikine®, Human
IL-6 Immunoassay, R&D Systems GmbH, Wiesbaden) benutzt. Der Assay arbeitet nach
der quantitativen Sandwich-Enzym-Immunoassay-Technik. Ein für IL-6 spezifischer
monoklonaler Antikörper befindet sich auf einer Mikrotiterplatte. Die Standards sowie die
Proben werden in die Löcher auf der Platte pipettiert und das vorhandene IL-6 wird durch
die immobilisierten Antikörper gebunden. Es werden dann die ungebundenen Substanzen
weggewaschen und ein für IL-6 spezifischer enzymgebundener polyklonaler Antikörper
hinzugefügt. Nach einem erneuten Waschvorgang, bei dem die ungebundenen AntikörperEnzym-Reagentien entfernt wurden, wird eine Substratlösung hinzugefügt. Es entwickelt
sich jetzt eine Farbe im Verhältnis zur Menge an IL-6. Die Farbentwicklung wird gestoppt
und die Intensität gemessen. Der Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizient beträgt unter
6,4% bei Konzentrationen zwischen 16,8 und 191 pg/ml. Ein Assaylauf mit maximal 96
Bestimmungen beinhaltet mindestens 1 Standard.
f) sTNF-RII
Die quantitative Bestimmung vom sTNF-Rezeptor II im Plasma erfolgte mit einem
immunoenzymometrischen Assay (sTNF-RII EASIA, Biosource Europe S.A., Nivelles,
Belgien). Es handelt
sich dabei um einen auf Mikrotiterplatten vorliegenden
27
Enzymverstärkten sensitiven Immunoassay (Enzym Amplified Sensitivity Immunoassay).
Der Assay basiert auf
einem oliklonalem System in welchem eine Mischung aus
monoklonalen Antikörpern (MAbs) benutzt wird, die gegen Epitope von TNF-RII gerichtet
ist. Antikörperproduzierende Zellen werden durch die Myelomzellfusionsmethode
unsterblich gemacht. Es wird eine Hybridzelle produziert, die spezifische homogene
Antikörper sekretiert. Der Standard oder die Proben mit dem sTNF-RII reagieren mit auf
der Mikrotiterplatte in Löchern umschlossenen monoklonalen Antikörpern (MAbs 1)
sowie mit monoklonalen Antikörpern (MAbs 2) mit Meerrettich Peroxidase (HRP). Nach
einer
Inkubationsphase
wird
die Mikrotiterplatte gewaschen,
um
ungebundene
enzymmarkierte Antikörper zu entfernen. Gebundende enzymmarkierte Antikörper werden
durch eine chromogene Reaktion gemessen. Die Chromlösung (TMB+H2O) wird
hinzugefügt und es folgt eine Inkubationsphase. Die Reaktion wird durch das Hinzufügen
einer Stopplösung (H2S04) unterbrochen. Die Mikrotiterplatte wird dann an der passenden
Wellenlänge abgelesen. Die Menge an Substratumsatz wird photometrisch bestimmt durch
die Messung der Absorption, welche proportional zur sTNF-RII Konzentration ist. Es wird
dann eine Standardkurve erstellt, von der durch Interpolation die sTNF-RII Konzentration
ermittelt wird. Der Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizient beträgt unter 8,9% bei
Konzentrationen zwischen 3,25 und 18,7 ng/ml. Ein Assaylauf mit maximal 96
Bestimmungen beinhaltet mindestens 6 Standards und 2 Kontrollseren.
g.) L-Tryptophan
Die Konzentration von Serum L-Tryptophan wurde mit Hilfe eines Standard HighPerfomance Flüssigchromatographen
(Eppendorf-Biotronik, Modell LC 3000) mit
photometrischer Detektion gemessen. Die Sensitivität beträgt 2 nmol/ml. Das Messprinzip
beruht auf der chromatographischen Auftrennung der Aminosäuren über einen stark sauren
28
Kationenaustauscher mit anschließender Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin bei
125°C und photometrischer Detektion des Farbkomplexes bei 570 nm. Bevor die Proben
analysiert werden können, muß eine Eiweißfällung durchgeführt werde. Hierzu werden
250 µL der Serumprobe mit 62,5 µL einer 10%igen Sulfosalicylsäurelösung versetzt,
geschüttelt und 45 Minuten im Kühlschrank bei 4-8°C belassen. Anschließend wird das
Eiweiß abzentrifugiert (13000 g/10 Minuten). Die überstehende klare Lösung wird
abpipettiert
und
zur
Analyse
verwendet.
Gegebenenfalls
wird
mit
einem
Probenverdünnungspuffer (Li-Acetatpuffer, pH 2,20) verdünnt. Im Gerät erfolgt
anschließend die Injektion über eine 20 µL Probenschleife. Die Probe wird über den stark
sauren Kationenaustauscher (Partikelgröße ca. 4 µm) getrennt, die einzelnen Aminosäuren
werden dann im nachgeschalteten Reaktor mit Ninhydrin-Farbreagenz bei 125°C
umgesetzt und bei 570 nm detektiert.
2.5 Statistische Auswertung
Alle Werte sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler. Die statistischen Tests basieren
auf ANOVA für wiederholte Messungen (Faktoren: Behandlung, Zeit). Die Werte sind
Baseline-korrigiert durch Subtrahieren der Mittelwerte während der 30 minütigen Baseline
von den Werten nach Verabreichung der Substanzen. Der Vergleich der einzelnen
Zeitpunkte wurde mit Hilfe des parametrischen Tests (Student´s t-test für Paardifferenzen)
durchgeführt. Für das Zusatzexperiment wurden Mittelwertvergleiche mit Hilfe des nonparametrischen Wilcoxon-Tests durchgeführt. Zusätzlich wurden für bestimmte selektierte
Zeitabschnitte Area under the Curve Analysen (AUC) durchgeführt. Ein p-Wert <0,05
wurde als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Auswertung wurde mithilfe des
Statistikprogramms BMDP durchgeführt.
29
3. Ergebnisse
3.1 Messungsergebnisse im Hauptexperiment
3.1.1 Messungsergebnisse der Hormone
3.1.1.1 Messungen von Cortisol
Die Abbildung 1 zeigt in graphischer Darstellung die Serumspiegel von Cortisol nach
enteraler Gabe von entweder 1000 ml Casein, Casein-Hydrolysat bzw. Kochsalzlösung.
Die nasogastrale Infusion von Casein und Casein-Hydrolysat löste einen substantiellen
Anstieg der Serumcortisolkonzentration aus (siehe Abb. 1). Die nasogastrale Gabe von
Kochsalzlösung dagegen induzierte keinen signifikanten Anstieg der Cortisolkonzentration
im Serum. Die Gabe des Casein führte im Vergleich zu NaCl zu einem signifikanten
Cortisolanstieg, der sich auch in der deutlich größeren AUC ausdrückt (542.95 ± 70.31 vs.
219.56 ± 39.12 µmol/l*min, p<0.002). Der Anstieg der Cortisolkonzentration war im
Zeitraum zwischen 45 und 75 Minuten nach Beginn der Caseingabe am deutlichsten.
Während dieses Intervalls erreichte die Cortisolkonzentration durchschnittlich 9.62 ± 1.00
µmol/l nach Gabe von Casein und 6.93 ± 0.65 µmol/l in der Kochsalz-Bedingung
(p<0.07). Das Casein-Hydrolysat induzierte im Vergleich zu den anderen Bedingungen den
deutlichsten Anstieg des Serumscortisols. Im Vergleich zum Placebo sind die
Cortisolwerte über 90 Minuten signifikant erhöht (von t = 45 min bis t = 135 min, p<0.01
und p<0.05). Im Vergleich zum Casein ist die Cortisolsekretion über 150 Minuten (von
t=75
min
bis
t=225
min,
p<0.05
und
p<0.01)
signifikant
erhöht.
Das
Konzentrationsmaximum wird nach 60 Minuten nach Beginn der Verabreichung erreicht
(Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung: 13.36 ± 1.10 vs. 6.91 ± 0.70 µmol/l, p<0.001; vs.
Casein:
9.68
±
1.12
µmol/l,
p<0.02).
Betrachtet
man
den
gesamten
Untersuchungszeitraum, so zeigt sich, daß die AUC entsprechend der Cortisol-Antwort am
30
stärksten nach der Gabe der Aminosäurenlösung war (742.70 ± 73.48 µmol/l*min)
verglichen mit dem Placebo (p<0.001) als auch mit Casein (p<0.03).
3.1.1.2 Messungen von ACTH
Abb. 2 zeigt die ACTH-Verläufe während der drei Bedingungen. Wie beim Cortisol löst
die nasogastrale Gabe von Casein und Casein-Hydrolysat einen Anstieg von ACTH mit
einem Maximum ebenfalls 60 Minuten nach Verabreichung aus. Die Placebogabe führte zu
keinem Anstieg der ACTH-Konzentration. Die Caseingabe führte nach 60 und 75 Minuten
zu signifikant höheren ACTH-Konzentrationen als nach Kochsalzlösung (Casein vs. NaCl
nach 60 Minuten: 26.92 ± 5.72 vs. 15.89 ± 1.55 pmol/l, p<0.05; nach 75 Minuten: 20.77 ±
3.38 vs. 14.85 ± 1.68 pmol/l, p<0.05). Wie beim Cortisol so ist auch beim ACTH die
Konzentration nach Caseingabe im Zeitraum zwischen 45 und 75 Minuten nach Beginn der
Verabreichung am stärksten (20.36 ± 4.13 pmol/l; 26.92 ± 5.72 pmol/l; 20.77 ± 3.38
pmol/l). Casein-Hydrolysat führte zu einer signifikant stärkeren ACTH-Ausschüttung als
das Placebo und auch Casein. Das Maximum wird 60 Minuten nach Beginn der
Verabeichung erreicht (Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung: 32.17 ± 5.15 vs. 15.89 ±
1.55 pmol/l, p<0.01; Casein-Hydrolysat vs. Casein: 32.17 ± 5.15 vs. 26.92 ± 5.72 pmol/l,
p<0.05). Auch beim Casein-Hydrolysat ist die ACTH-Konzentration im Zeitraum
zwischen 45 und 75 Minuten am höchsten (30.64 ± 4.65 pmol/l; 32.17 ± 5.15 pmol/l; 25.70
± 3.87 pmol/l). Insgesamt ist die ACTH-Konzentration beim Casein-Hydrolysat am
stärksten, im Vergleich zum Casein und zur Kochsalzlösung und kongruiert damit mit den
Ergebnissen der Cortisolbestimmungen.
31
3.1.1.3 Messungen vom Growth Hormone
Bei der Auswertung der Wachstumshormonkonzentrationen im Plasma ergaben sich
signifikante Unterschiede zwischen Aminosäurengabe und Kochsalz-Gabe. In der
Abbildung 3 zeigt sich, daß es nach 135 Minuten zu einem Anstieg von Growth Hormone
bei Aminosäuregabe kommt und bei den Zeitpunkten 195 und 225 Minuten die
Wachstumshormonkonzentration dann signifikant höher ist als bei Gabe von NaCl (15.48
± 3.13 vs. 3.53 ± 1.24 ng/ml, p < 0.01; 12.32 ± 2.65 vs. 2.60 ± 1.06 ng/ml, p<0.01). Die
Werte waren dabei bis zu 5mal so hoch wie bei Proteinen bzw. beim Placebo. Die
Proteingabe führte im Vergleich zur Kochsalzgabe zu einem leichten Anstieg, der aber
nicht signifikant war. Der Zeitpunkt des Anstieges ist bei Aminosäuren und Proteinen
gleich, ca. 135 Minuten nach Beginn der Gabe.
3.1.1.4 Messungen von Adrenalin
Die Mittelwerte der Serumspiegel von Adrenalin zeigten bei den drei getesteten
Bedingungen keine signifikanten Unterschiede. Ab dem Zeitpunkt t=165 min kommt es zu
einem Anstieg bei Casein-Hydrolysat-Gabe, jedoch erreicht dieser keine Signifikanz. Auch
bei Caseingabe steigt die Hormonkonzentration an, jedoch nicht so hoch wie bei
Aminosäuregabe. Die Werte sind in Abbildung 4 dargestellt.
3.1.1.5 Messungen von Noradrenalin
Betrachtet man die Serumspiegel für Noradrenalin bei den drei Bedingungen, so zeigt sich
hier ein Anstieg bei der Gabe von Casein-Hydrolysat mit einem Maximum bei 45 Minuten
(348.65 ± 33.35 pg/ml) nach Gabe der Substanz. Signifikanz wird im Vergleich zu Casein
nur nach 30 Minuten erreicht (Casein-Hydrolysat vs.Casein 289.22 ± 29.61 vs. 243.72 ±
20.16 pg/ml, p<0.05) 120 Minuten nach Beginn der Aminosäurengabe ist die
32
Noradrenalinkonzentration wieder auf dem Ausgangsniveau (228.37 ± 29.27 pg/ml). Auch
bei der Gabe von Casein kommt es zur Ausbildung eines Peaks nach 45 Minuten (319.56 ±
48.45 pg/ml), jedoch wird keine Signifikanz erreicht. In Abbildung 5 erfolgt die graphische
Darstellung.
3.1.1.6 Messungen von Interleukin-6
Bei der Auswertung der Interleukin-6-Daten ergaben sich keine signifikanten Unterschiede
zwischen den drei Substanzen. Sowohl bei Proteinen als auch bei Aminosäuren steigen 15
Minuten nach Beginn der Gabe die IL-6 Werte im Plasma an, erreichen jedoch keine
statistische Signifikanz. Im weiteren Verlauf fallen und steigen die Werte unregelmäßig.
Auffällig ist, daß es 195 Minuten nach Beginn zu einem Anstieg bei Gabe von Kochsalz
sowie auch bei Aminosäuren kommt, jedoch nicht bei Proteinen. Doch auch hier sind die
Ergebnisse nicht signifikant (p>0.2). In Abb. 6 sind die Daten graphisch dargestellt.
3.1.1.7 Messungen von TNF-RII
Abb. 7 zeigt die Ergebnisse der Analyse von TNF-RII im Plasma. Es zeigt sich, daß bei 90
und 105 Minuten nach Beginn der Gabe von Casein-Hydrolysat, im Vergleich zu
Kochsalz, die TNF-RII-Konzentrationen signifikant höher sind (3.02 ± 0.2 vs. 2.86 ± 0.12
ng/ml, p<0.01; 2.93 ± 0.24 vs. 2.83 ± 0.13 ng/ml, p<0.01). Erneut signifikante
Unterschiede zwischen Aminosäuren und dem Placebo erreichen die Werte bei Minute 195
und 225 (3.01 ± 0.22 vs. 2.76 ± 0.11 ng/ml, p<0.01; 3.02 ± 0.23 vs. 2.52 ± 0.25 ng/ml,
p<0.05). Zwischen diesen beiden Maxima sinkt der TNF-RII-Spiegel ab. Keine statistisch
signifikanten Unterschiede ergeben sich beim Vergleich zwischen Casein-Hydolysat und
Casein sowie zwischen Casein und dem Placebo.
33
3.1.2 Messungsergebnisse der Blutbestandteile
3.1.2.1 Messungen der Leukozyten
In Abb. 8 sind die Änderungen der Leukozytenkonzentration im Blut bei den drei
unterschiedlichen Bedingungen dargestellt. Es zeigt sich, daß die Gabe von CaseinHydrolysat zu einem Anstieg der Leukozytenzahl führt, welche ab der 195. Minute
signifikant gegenüber Kochsalzgabe ist (6.20 ± 0.38 vs. 5.47 ± 0.33 n/nl, p<0.05; 6.53 ±
0.46 vs. 5.30 ± 0.60 n/nl, p<0.05; 7.09 ± 0.56 vs. 5.38 ± 0.61 n/nl, p<0.05). Auch bei Gabe
der Proteinlösung steigen die Leukozyten im Blut an, jedoch bleiben die Werte unter den
bei Aminosäuregabe und erreichen im Vergleich zur Placebogabe keine Signifikanz.
Während die Leukozytenzahlen bei Aminosäuregabe stetig ansteigen, stagnieren sie bei
Proteingabe nach 255 Minuten. Zwischen Casein-Hydrolysat und Casein ergeben sich
keine signifikanten Unterschiede.
3.1.2.2 Messungen der Erythrozyten
Hier kommt es bei allen Bedingungen zu einem Absinken der Erythrozytenkozentration
unter das Ausgangsniveau. Bei den Zeitpunkten 120 und 135 min ist die Erythrozytenzahl
signifikant niedriger bei Caseingabe als bei der Placebobedingung (4.46 ± 0.12 vs. 4.54 ±
0.13 n/pl, p<0.05; 4.33 ± 0.15 vs. 4.55 ± 0.11 n/pl, p<0.05). Dauerhaft signifikante
Unterschiede im paarweisen Vergleich der drei Bedingungen ergeben sich nicht. Eine
graphische Darstellung findet sich in Abbildung 9.
3.1.2.3 Messungen der Thrombozyten
Die Mittelwerte der Anzahl der Thrombozyten im Plasma sind in Abb. 10 dargestellt.
Während die Werte bei Aminosäuren- und Kochsalzgabe relativ großen Schwankungen
unterliegen, bleiben die Thrombozytenzahlen bei Proteingabe relativ konstant. Die Anzahl
der Blutplättchen ist unter Aminosäurebedingungen geringer als unter Proteingabe, wobei
34
dies bei 60 Minuten (213.11 ± 12.7 vs. 217.93 ± 11.26 n/nl, p<0.01), 135 Minuten (197.26
± 11.96 vs. 210.58 ± 11.03 n/nl, p<0.01), 150 Minuten (197.64 ± 11.85 vs. 210.70 ± 11.73
n/nl, p<0.05) und 165 Minuten (199.46 ± 11.97 vs. 213.35 ± 11.41 n/nl, p<0.05)
signifikant ist. Keine Signifikanzen erreichen die paarweisen Vergleiche zwischen Casein
und Placebo sowie Casein-Hydrolysat und Placebo.
3.1.2.4 Messungen der neutrophilen Granulozyten
Abb. 11 zeigt die Veränderungen in der Anzahl der neutrophilen Granulozyten, welche in
der Aminosäuren- und Proteingruppe einen Anstieg zeigen, während bei Kochsalzgabe die
Zahl konstant bleibt. In der Aminosäuregruppe liegen die Werte höher als in der
Proteingruppe, jedoch ohne daß dieser Unterschied signifikant ist. Bei 105 Minuten (3.54 ±
0.25 vs. 3.10 ± 0.40 n/nl, p<0.05), 150 Minuten (3.90 ± 0.34 vs. 3.01 ± 0.38 n/nl, p<0.05),
165 Minuten (3.94 ± 0.34 vs. 3.25 ± 0.27 n/nl, p<0.05), 195 Minuten (4.06 ± 0.31 vs. 3.20
± 0.28 n/nl, p<0.01) und 225 min (4.24 ± 0.40 vs. 3.16 ± 0.42 n/nl, p<0.05) ist die Zahl der
neutrophilen Granulozyten bei Einnahme der Aminosäurelösung signifikant höher als bei
Einnahme der Kochsalzlösung. Auch bei Einnahme der Proteinlösung ist im Vergleich zur
Kochsalzeinnahme eine Zunahme der Werte zu beobachten, diese erreichen aber nur 195
Minuten nach Einnahme statistische Signifikanz (3.85 ± 0.34 vs. 3.20 ± 0.28 n/nl, p<0.05).
Zum Ende der Messungen zeigen sich sowohl bei Aminosäure als auch bei Proteingabe
eine Stagnation bzw. Rückgang.
3.1.2.5 Messungen der Monozyten
Bei den Messungen der Anzahl der Monozyten im peripheren Blutbild werden signifikante
Unterschiede zwischen den Aminosäure bzw. Proteingruppen und der Kochsalzgruppe
sichtbar. Besonders bei Aminosäuregabe zeigt sich ein zweigipfliger Verlauf mit einem
ersten Maximum noch während der Einnahme, wobei jedoch keine statistische Signifikanz
35
erreicht wird. Bereits 45 Minuten nach Einnahmebeginn sind die Werte unter die Baseline
abgesunken. Nach 105 Minuten beginnt dann der zweite Anstieg, welcher bis zum Ende
der Messungen anhält. 150 Minuten nach Einnahme bis zum Messende sind die
Monozytenzahlen im
Vergleich
zur Placebo-Bedingung signifikant höher: 150
Minuten(0.36 ± 0.024 vs. 0.28 ± 0.032 n/nl, p<0.05), 165 Minuten (0.37±0.032 vs.
0.32±0.021 n/nl, p<0.05), 195 Minuten (0.40±0.025 vs. 0.33±0.028 n/nl, p<0.01), 225
Minuten (0.40±0.027 vs. 0.31±0.039 n/nl, p<0.01) und 255 Minuten (0.46±0.048 vs.
0.29±0.037 n/nl, p<0.01). Auch bei Proteingabe steigen die Monozytenzahlen an, bleiben
jedoch unter denen bei Aminosäuregabe und stagnieren bzw. sind zum Ende der
Messungen bereits wieder rückläufig. 195 Minuten (0.37 ± 0.03 vs. 0.33 ± 0.03 n/nl,
p<0.05), 210 Minuten (0.38 ± 0.04 vs. 0.31 ± 0.04 n/nl, p<0.05) und 255 Minuten (0.37 ±
0.04 vs. 0.29 ± 0.04 n/nl, p<0.05) nach Einnahmebeginn sind die Unterschiede zwischen
der Casein und der Placebo-Bedingung statistisch signifikant. Keine signifikanten
Unterschiede ergaben sich zwischen Casein und Casein-Hydrolysatgabe. Eine graphische
Darstellung findet sich in Abbildung 12.
3.1.2.6 Messungen der Lymphozyten
In Abb. 13 sind die Verläufe der Konzentrationen der Lymphozyten im Plasma graphisch
dargestellt. Die Lymphozytenkonzentrationen sind bei Casein-Hydrolysatgabe kleiner als
bei Kochsalzgabe, wobei diese Unterschiede bei 135 und 150 Minuten nach Einnahme
signifikant sind (1.24 ± 0.09 vs. 1.54 ± 0.07 n/nl, p<0.01; 1.34 ± 0.12 vs. 1.43 ± 0.14 n/nl,
p<0.05). Ebenso verhält es sich bei Casein und dem Placebo, jedoch ohne Signifikanz. Die
Lymphozytenkonzentrationen steigen bei allen drei Bedingungen zum Ende der Messung
an, jedoch ohne statistische Signifikanz zu erreichen.
36
3.1.2.7 Messungen der eosinophilen und basophilen Granulozyten
Bei der Konzentration der Eosinophilen im Plasma zeigen sich bei den drei Bedingungen
relativ gleichmäßige Verläufe, wobei jedoch bei Proteingabe die Werte unter denen bei
NaCl und Aminosäuregabe liegen. Bei den Basophilen ergeben sich ebenfalls keine
eindeutigen Unterschiede zwischen den drei Substanzen. In allen drei Gruppen sind
lediglich
regellose
Konzentrationsschwankungen
ohne
dauerhafte
signifikante
Unterschiede zu beobachten. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 14 und 15
dargestellt.
3.2 Messungsergebnisse im Zusatzexperiment
3.2.1 Messungen der Cortisolkonzentrationen
Im Zusatzexperiment wurde der Anstieg von Serumcortisol nach intravenöser und
nasogastraler Gabe einer Aminosäurelösung verglichen. Die nasogastrale Gabe induzierte
einen deutlichen Anstieg der Cortisolkonzentration im Plasma, vergleichbar mit dem
Anstieg der Cortisolkonzentration nach nasogastraler Gabe des Aminosäurehydrolysats im
Hauptexperiment. Die AUC für den Zeitraum 0-60 Minuten nach der Infusion von
Aminosäuren erreichte durchschnittlich 502.44 ± 40.56 µmol/l*min im Zusatzexperiment.
Im Hauptexperiment erreichte die AUC, zum Vergleich, 514.81 ± 43.04 µmol/l*min nach
Infusion von Caseinhydrolysat (p>0,77, Man-Whitney-U-Test).
Bei der intravenösen Gabe der Aminosäuren gab es keinen signifikanten Anstieg
der Cortisolkonzentration während der ersten 60 Minuten nach Beginn der Infusion. Der
Anstieg der Cortisolkonzentration nach der nasogastralen Gabe von Aminosäuren
überstieg deutlich den Anstieg nach intravenöser Gabe, welches durch den Vergleich der
AUC im Zeitraum 0-60 Minuten nach Gabe verdeutlicht wird ( nasogastral versus
intravenös: 502.44 ± 40.56 vs. 297.32 ± 30.35 µmol/l*min, p<0.04) sowie durch die
37
Cortisolkonzentrationen nach 15 Minuten (10.15 ± 0.6 vs. 7.3 ± 0.21 µmol/l, p<0.04), 30
Minuten (11.15 ± 0.84 vs. 6.82 ± 0.22 µmol/l, p<0.04) und 45 Minuten 12.6 ± 1.37 vs.
7.13 ± 0.92 µmol/l, p<0.04). Die Ergebnisse sind in Abbildung 16 graphisch dargestellt.
3.2.2 Messungen der L-Tryptophan-Konzentrationen
Die L-Tryptophan-Konzentrationen stiegen bei beiden Konditionen während der ersten 45
Minuten nach Beginn der Infusion an. Der Anstieg ist nahezu vergleichbar während der
ersten 30 Minuten, wenn die Cortisolkonzentration während der nasogastralen Gabe schon
beginnt anzusteigen. Bei 45 Minuten war die L-Tryptophan-Konzentration nach der
nasogastralen Gabe höher als bei der intravenösen Verabreichung (119,28 ± 7,7 vs. 83,59 ±
3,26 µmol/l, p<0,04). Zu diesem Zeitpunkt war die Cortisolkonzentration während der
nasogastralen Gabe der Aminosäuren bereits wieder am fallen. Abbildung 16 zeigt die
graphische Darstellung der Ergebnisse.
38
4. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern Proteine und Aminosäuren sich in
ihrer Wirkung auf das Immunsystem, die sekretorische Aktivität der HPA-Achse und das
Blutbild beim Menschen nach nasogastraler Infusion unterscheiden. Ein besonderes
Interesse lag in der Frage, ob der physiologische Cortisolmittagspeak durch die
Antigenwirkung von Proteinen ausgelöst wird und wie diese Reaktion vermittelt wird. Zur
Klärung dieser Fragen erhielten 12 Probanden über eine Magensonde Casein, CaseinHydrolysat und Kochsalzlösung im Hauptversuch. Da auch durch den alleinigen Anblick
einer Mahlzeit die Cortisolkonzentration im Blut ansteigt, wurden die Flüssigkeiten über
zuvor gelegte Magensonden verabreicht (Follenius et al, 1982; Holl et al, 1984). Somit
wurden visuelle, olfaktorische und gustatorische Stimuli verhindert. Im Blut wurden
während des Untersuchungszeitraumes die Konzentrationsänderungen der verschiedenen
Hormone sowie Blutbestandteile gemessen. In einem Zusatzexperiment wurde an 4
Probanden untersucht, ob die parenterale Gabe von Aminosäuren ebenso zu einer
Cortisolausschüttung führt wie die enterale Gabe. Hierzu wurde den Probanden in einer
Sitzung enteral und in einer zweiten Sitzung parenteral eine Aminosäurenlösung
(Aminoplasmal©) verabreicht. Anschließend wurde die Serumcortisolkonzentration
bestimmt.
4.1 Der Einfluß von Proteinen und Aminosäuren auf die Cortisol-Sekretion
In zahlreichen Studien wurde bisher nachgewiesen, daß der Mahlzeiten-bedingte Anstieg
von Cortisol vor allem auf Proteine zurückzuführen ist (Nuttall et al, 1979; Slag et al,
1981; Ishizuka et al, 1983; Gibson et al, 1999). Daher wurde vermutet, daß die Antigenität
der Proteine über eine lokale Immunantwort im Darm zu einer systemischen Aktivierung
der Cortisolsekretion führt. Hierdurch soll eine aktive Hemmung der lokalen
39
Immunantwort erfolgen und somit die Ausbildung antigenspezifischer Antworten auf
Nahrungsantigene
verhindert
werden,
welche
ansonsten
eine
Aufnahme
von
Nahrungsbestandteilen mit Antigeneigenschaften verhindern würde. In der vorliegenden
Studie zeigte sich nun aber, daß die Cortisolausschüttung nach nasogastraler Gabe von
Casein-Hydrolysat signifikant stärker ausfiel als nach Casein, obgleich das Hydrolysat
weniger antigen ist (Ratner et al, 1958; Docena et al, 1996). Diese Ergebnisse sprechen
somit gegen unsere Hypothese, daß der Grad der Antigenwirkung von Proteinen die
Cortisolsekretion nach Nahrungsaufnahme bestimmt.
Weiterhin zeigen die Ergebnisse, daß das Volumen keinen Einfluss auf die
Cortisolsekretion ausübt, da die Gabe der Kochsalzlösung ohne Wirkung auf die
Cortisolausschüttung blieb. Somit spielt die Menge der aufgenommenen Nahrung und die
dadurch hervorgerufene mechanischen Belastung nur eine untergeordnete Rolle im
Rahmen des Mahlzeiten-induzierten Cortisolanstiegs.
Die hier gemachten Beobachtungen werden durch vorhergehende Studien
unterstützt. Es konnte nachgewiesen werden, daß einige Aminosäuren wie Tryptophan,
Arginin und Glutamat potente Stimulatoren der HPA-Achse sind (Woolf und Lee, 1977;
Ljungquist,1978; Modlinger et al, 1980). Über welche Mechanismen die Aminosäuren die
Cortisolsekretion stimulieren, wurde mithilfe eines Zusatzexperimentes untersucht und
wird in den folgenden Abschnitten diskutiert.
Die vorliegenden Ergebnisse scheinen dies zu spezifizieren bzw. darauf
hinzudeuten, daß die Höhe der Aminosäurenkonzentration im Blut postprandial
ausschlaggebend für die Höhe der Cortisolsekretion ist. Es liegen einige Arbeiten vor, die
diese These unterstützen und herausfanden, daß Arginine, Tryptophan, Glutamat und
andere Aminosäuren sowohl bei enteraler als auch parenteraler Applikation einen
signifikanten Anstieg der Konzentration von Cortisol aber auch GH, Prolactin und ACTH
40
im Plasma bewirken (Carlson und Shah, 1989; Saito und Kimura, 1992; di Luigi et al,
1999).
4.2 Der Einfluß von Proteinen und Aminosäuren auf die ACTH-Sekretion
In der vorliegenden Studie wurden neben der Cortisolkonzentration auch die
Konzentrationen von ACTH und weiteren Hormonen der HPA-Achse sowie der
Streßreaktion gemessen. Aminosäuren bewirken, wie schon bereits beim Cortisol
beschrieben, auch einen signifikanten Anstieg der ACTH-Konzentration im Plasma,
während bei Proteinen der Peak niedriger ausfällt. Wie beim Cortsiol führt auch beim
ACTH die Verabreichung von Kochsalzlösung zu keinem signifikanten Anstieg der
Hormonkonzentration im Serum, sodaß mechanische Dilatation des Gastrointestinaltraktes
als Ursache auszuschließen ist.
Das Maximum der ACTH-Konzentration wird, ebenso wie beim Cortisol, nach 60
min erreicht. Diese Ergebnisse korrelieren mit Studien über die Proteinverdauung und
Aminosäurenresorbtion
im
Darm.
So
zeigt
sich,
daß
das
Maximum
der
Aminosäurenkonzentration im Blut 60 min nach Proteinzufuhr erreicht wird und bis zu 4
Stunden anhält (Frame, 1958; Adibi und Mercer, 1973; Adibi et al, 1973; Nasset et al,
1979; Ahmed et al, 1980). Die Zeitspanne zwischen Proteineinnahme und Cortisolanstieg
liegt auch in anderen Arbeiten bei 30 bis 60 min. Weiterhin ist aus vorherigen Arbeiten
bekannt, daß Proteine in der Nahrung zu einer ACTH-Sekretion führen und somit die
Ergebnisse der vorliegenden Studie stützen (Slag et al, 1981). Ebenso wurde in mehreren
Untersuchungen nachgewiesen, daß verschiedene Aminosäuren zu einer ACTH-Sekretion
führen. Bereits 1980 konnte dies von Modlinger et al bei der oralen Gabe der Aminosäure
Tryptophan nachgewiesen werden (Modlinger et al, 1980). In einer weiteren Arbeit fand
man heraus, daß die Verabreichung einer Aminosäurelösung zu einer erhöhten
41
hypophysären Reaktionsbereitschaft auf hypothalamische Stimulation führt (di Luigi et al,
1999). Die vorliegende Arbeit zeigt nun, daß oral verabreichte Aminosäuren und in einem
geringeren Ausmaße auch Proteine zu einer ACTH-Ausschüttung führen.
4.3 Vermittlungswege der aminosäureinduzierten Cortisol und ACTH-Sekretion
Die Ergebnisse dieser Studie haben gezeigt, daß Aminosäuren und Proteine 60 Minuten
nach Applikation zu einem ACTH und Cortisol-Peak führen. Diese zeitliche Korrelation
spricht dafür, daß die Cortisolausschüttung durch ACTH vermittelt wird. Durch die Gabe
von Kochsalzlösung, welche zu keiner signifikanten Cortisol und ACTH-Ausschüttung
führte, konnte eine rein durch Dehnung des Magens via parasympathischer Nerven
hervorgerufene Aktivierung der HPA-Achse ausgeschlossen werden. Ebenso wurde eine
Stimulierung der Hypophyse bzw. der Nebennierenrinde durch olfaktorische und
gustatorische Reize, durch Applikation der Substanzen über eine Magensonde, vermieden,
sodaß die Hormonausschüttung alleine die Folge der Wirkung der Aminosäuren und
Proteine ist. Es gibt mehrere denkbare Möglichkeiten wie die aminosäureinduzierte
Cortisolsekretion vermittelt wird. Wie oben beschrieben, sprechen die Ergebnisse dieser
Studie dafür, daß die durch Aminosäuren hervorgerufene Cortisolsekretion durch ACTH
vermittelt wird. Wie aus früheren Arbeiten bekannt ist, findet man in den
enterochromaffinen Zellen des Gastrointestinaltraktes neben anderen Hormonen auch
ACTH (Larsson, 1979; Sanchez-Franco et al, 1981). Sie könnten, neben dem
hypophysären ACTH, zur Stimulation der Nebennierenrinde beitragen. In einer früheren
Arbeit durch Al-Damluji et al konnte jedoch festgestellt werden, daß die postprandiale
Cortisolsekretion durch hypophysäres ACTH vermittelt wird, da bei Patienten mit
bekannter ACTH-Sekretionsstörung aber normal arbeitenden Nebennieren keine ACTH
42
und Cortisolausschüttung nach Aufnahme einer Standardmahlzeit erfolgte(Al-Damluji et
al, 1987).
Frühere Studien unterstützen die vorliegenden Ergebnisse, daß Aminosäuren zu
einer hypophysären ACTH-Sekretion und in Folge davon zu einer Cortisol-Ausschüttung
führen. Es konnte gezeigt werden, daß die orale Einnahme der Aminosäuren Tryptophan,
Tyrosin und Glutamat zu einer signifikanten Erhöhung von ACTH und Cortisol im Serum
führen (Modlinger et al, 1980; Ishizuka et al, 1983; Carlson und Shah, 1989). Die Wirkung
der alimentären Aminosäuren kann über Rezeptoren am Hypothalamus oder an der
Hypophyse
erfolgen.
Eine
weitere
Möglichkeit
ist
die
direkte
Wirkung
als
Neurotransmitter. Eine lokale Verabreichung von Glutamat auf den hypothalamischen
Nucleus paraventricularis führt zu einer CRH-Ausschüttung und zu einem Anstieg von
ACTH (Feldmann und Saphier, 1997). Al-Damluji et al. wies nach, daß zentrale
hypothalamische Alpha1-Adrenozeptoren an der postprandialen hypophysären ACTHSekretion maßgeblich beteiligt sind (Al-Damluji et al, 1987). Außerdem stellten Dodt et al
fest, daß zentrale cholinerge Neurone stimulierend auf die aktivierte HPA-Achse wirken
(Dodt et al, 1994). Daneben zeigen Ergebnisse aus früheren Arbeiten eine ACTHunabhängige Cortisol-Sekretion, speziell beim Mittagspeak (Fehm et al, 1983; Fehm et al,
1984). Weiterhin konnte nachgewiesen werden, daß die alleinige Präsentation von Essen
zu einem Cortisolanstieg im Blut führt (Follenius et al, 1982; Holl et al, 1984).
Zusammenfassend muß daher davon ausgegangen werden, daß die Cortisolsekretion, als
Folge der Stimulation der HPA-Achse, durch viele verschiedene Faktoren beeinflußt wird.
Diese Arbeit zeigt jedoch, daß Aminosäuren und auch Proteine in der Nahrung ein sehr
potenter Stimulus für die Cortisolausschüttung sind und daß dieser Vorgang zentralnervös
vermittelt wird.
43
4.4 Der Einfluß von Proteinen und Aminosäuren auf GH
Die Aminosäuregabe bewirkt eine signifikante Erhöhung der GH-Konzentration im Plasma
im Vergleich zur Kochsalzlösung. Auch bei Proteingabe steigt der Plasmaspiegel des
Hormons an, jedoch ohne Signifikanz zu erreichen. Dies belegt, daß Aminosäuren in der
Nahrung zu einer Aktivierung der Hypophyse führen. Diese Ergebnisse werden durch
vorherige Arbeiten bestätigt, in denen nachgewiesen wurde, daß die orale Aufnahme von
Aminosäuren alleine oder als Bestandteil einer proteinreichen Nahrung zu einer GHSekretion führt (Knopf et al, 1966; Daughaday, 1989; di Luigi et al, 1999; Chromiak und
Antonio, 2002). Teilweise zeigte sich dabei ein bis zu siebenfacher Anstieg der GHKonzentration im Serum. Es scheint, daß die alleinige Applikation einer einzelnen
Aminosäure zu keiner GH-Ausschüttung führt, sondern daß dieser Effekt erst durch die
Kombination von mindestens 2 Aminosäuren hervorgerufen wird (Isidori et al, 1981).
Ebenso bedarf es einer bestimmten Menge an Aminosäuren, um die GH-Sekretion
auszulösen (Fogelholm et al, 1993; Lambert et al, 1993). Ebenso wie beim Cortisol stellt
sich beim GH die Frage, wie die Aktivierung der Hypophyse durch Aminosäuren
vermittelt wird. In vitro konnte festgestellt werden, daß Aminosäuren Hypophysenzellen
direkt stimulieren und somit die Hormonsekretion auslösen (Ohata et al, 1997; Villalobos
et al, 1997). In der vorliegenden Arbeit begann der Anstieg der GH-Konzentration erst
nach 135 Minuten und erreichte das Maximum nach 195 Minuten nach Applikation der
Aminosäurenlösung.
Wie
oben
bereits
erwähnt,
ist
das
Maximum
der
Aminosäurenkonzentration im Blut nach Proteinaufnahme nach 60 Minuten erreicht. Im
Vergleich zu den Cortisol und ACTH-Peaks in dieser Studie erfolgt die GH-Sekretion
deutlich verzögert, sodaß diese Ergebnisse eher gegen eine direkte Stimulation der
Hypophyse durch die Aminosäuren sprechen. Dafür sprechen auch die Resultate der Studie
von Isidori et al, in der es nach oraler Einnahme von Aminosäuren zu einer GHRH und
44
GH-Sekretion kam, sodaß vermutet werden muß, daß die Hypophysenaktivierung über den
Hypothalamus erfolgte (Isidori et al, 1981). Neben dem Hypothalamus konnte im
Gastrointestinaltrakt als auch in verschiedenen anderen Organen GHRH-Aktivität
nachgewiesen werden (Christofides et al, 1984). Zusätzlich wurde 1999 das Hormon
Ghrelin entdeckt, welches ein potenter Auslöser der GH-Sekretion ist (Peino et al, 2000).
Ghrelin wird vor allem im Magen, aber auch im Darm, in den Nieren und im
Hypothalamus produziert. Das im GI-Trakt sezernierte Ghrelin gelangt über das Blut zum
Hypothalamus und zur Hypophyse wo es an Ghrelin-Rezeptoren bindet. Es scheint jedoch,
daß GHRH essentiell für die volle Wirkung von Ghrelin auf die Hypophyse ist. So konnte
Takaya et al nachweisen, daß Ghrelin nur zu einer Sekretion von GH führt, jedoch nicht
eine Stimulation der Synthese bewirkt wie GHRH (Takaya et al, 2000). Ob Aminosäuren
eine Sekretion von Ghrelin bewirken und darüber zu einer GH-Ausschüttung führen ist
bisher noch nicht untersucht.
4.5 Der Einfluß der Nahrung auf das sympathische Nervensystem und das
Nebennierenmark
Neben der Aktivierung der HPA-Achse sollte durch diese Studie geklärt werden, ob durch
Proteine bzw. Aminosäuren eine Stimulation des sympathischen Nervensystems mit
Produktion der Hormone Adrenalin und Noradrenalin erfolgt. Der Einfluß der Nahrung auf
die Sympathikusaktivität wurde bereits in vorherigen Arbeiten untersucht. Es konnte hier
zunächst eine durch Nahrungsaufnahme ausgelöste Sekretion von Adrenalin und
Noradrenalin festgestellt werden (Mullen et al, 1981; Knoll et al, 1984). Bereits in der
Arbeit von Knoll et al. wurde vermutet, daß die Zusammensetzung der Nahrung einen
Einfluß auf die Dauer der Noradrenalinerhöhung hat. Sie stellten fest, daß bei der Gabe
von 50%iger Glukoselösung es zu einem höheren Anstieg der Noradrenalinkonzentration
45
im Plasma kam als bei der Gabe von Fetten, Proteinen bzw. isokalorischer Lösung.
Weitere Studien kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Es zeigte sich, daß eine
kohlenhydratreiche Mahlzeit zu einer deutlichen Noradrenalinsekretion führt, wobei
fettreiches oder proteinreiches Essen keinen Einfluß auf das Hormon zu haben scheint
(Welle et al, 1981; Potter et al, 1989; Heseltine et al, 1990). Die Adrenalinsekretion scheint
durch Nahrungsaufnahme nicht stimuliert zu werden (Steffens et al, 1986; Vaz et al, 1995).
Diese Beobachtungen decken sich mit den Ergebnissen aus unseren Untersuchungen, in
welchen
für
Adrenalin
und
Noradrenalin
keine
dauerhaften
signifikanten
Konzentrationsänderungen beobachtet wurden. Somit zeigt sich anhand dieser Ergebnisse,
daß sowohl Aminosäuren als auch Proteine in der Nahrung zu keiner Aktivierung des
Nebennierenmarks führen.
4.6 Änderungen der Serumkonzentrationen von IL-6 und TNF-RII nach Protein bzw.
Aminosäureneinnahme
Interleukin-6 ist ein Mediator für viele physiologische Vorgänge im Körper. Unter
anderem ist es ein sehr sensitiver Parameter für systemische Inflammationsprozesse und
kann bei Überproduktion Mitauslöser für einen chronischen Krankheitsverlauf sein. Aus in
vitro und in vivo – Studien weiß man, daß IL-6 die HPA-Achse stimuliert (Lyson und
McCann, 1991; Navarra et al, 1991; Harbuz et al, 1992; Mastorakos et al, 1993; SpäthSchwalbe et al, 1994). Es kommt zu einem Anstieg von ACTH und Cortisol im Serum,
wobei das Interleukin sowohl am Hypothalamus, der Hypophyse als auch an der
Nebennierenrinde stimulierend wirkt. Somit wird die ACTH-Freisetzung als auch die
daraus folgende Cortisolsekretion durch Interleukin-6 vermittelt, wobei ACTH und IL-6 in
der Nebenniere synergistisch wirken. (Salas et al, 1990). Aus den vorliegenden Studien
läßt sich schließen, daß IL-6 ein Mediator im Zusammenspiel zwischen dem Immun- und
46
Inflammationssystem und der hypothalamo-hypophysär-adrenocorticalen Achse ist. Die
vorliegende Studie untersuchte, ob Nahrung bzw. Nahrungsbestandteile zu einer Erhöhung
von Interleukin-6 und TNF-α-Rezeptoren im Plasma führte.
Die Ergebnisse in dieser Untersuchung erbrachten keine Signifikanz bezüglich der
Serumkonzentrationsänderungen von Interleukin-6 bei der Gabe von Proteinen und
Aminosäuren. 280 Minuten nach Applikation fällt eine Zunahme bei Gabe von
Aminosäuren aber auch bei Kochsalzlösung auf. Dies spricht dafür, daß es sich hier um
unspezifische Veränderungen handelt und keine Reaktion auf Aminosäuren. Aus
Untersuchungen weiß man, daß IL-6 relativ früh nach einem inflammatorischen Ereignis
im Serum ansteigt und nur für eine kurze Zeit erhöht bleibt, sodaß der
Untersuchungszeitraum ausreichend für die Erfassung von Konzentrationsänderungen war.
Die Ergebnisse korrelieren mit der Studie von Hansen et al, in welcher nach Verabreichung
einer proteinreichen Mahlzeit kein signifikanter Anstieg von IL-6 im Serum beobachtet
wurde (Hansen et al, 1997). Somit kann ausgeschlossen werden, daß Interleukin-6 an der
Vermittlung der ACTH und Cortisol-Ausschüttung nach oraler Aminosäuren bzw.
Proteinaufnahme beteiligt ist.
Ähnlich wie Interleukin–6 ist auch der Tumornekrosefaktor ein Mediator der
systemischen Inflammation und des Immunsystems. TNF stimuliert die Sekretion von
ACTH und Cortisol, sowohl durch direkte Wirkung auf die Organe, als auch vermittelt
durch Interleukin 1 und 6 (Darling et al, 1989). Daneben vermitteln noch zahlreiche andere
Zytokine die Wirkung von TNF, wobei TNF selber die Produktionen dieser Botenstoffe
stimuliert. Dagegen inhibieren Glucocorticoide die TNF-α und IL-1-Sekretion Es ergibt
sich somit ein komplexes Interaktionssystem zwischen dem Immunsystem und der HPAAchse sowie den einzelnen Komponenten der Systeme untereinander mit stimulatorischen
und inhibitorischen Effekten.
47
Wie bei IL-6 sollten mit der Bestimmung von TNF-RII geprüft werden, ob Proteine
bzw. Aminosäuren das humorale Immunsystem bzw. eine Inflammation stimulieren und
darüber zu einer Aktivierung der HPA-Achse führen.
Die Gabe von Aminosäuren führte im Vergleich zum Placebo zu einer signifikanten
Erhöhung von löslichen TNF-Rezeptoren im Serum, jedoch nicht im Vergleich zur
Proteingabe. In einer vorhergehenden Studie zeigten sich nach Einnahme einer
proteinreichen Mahlzeit keine Veränderungen in den Serumkonzentrationen von TNF-α
und Interleukin-6 (Hansen et al, 1997). Der fehlende Einfluß der Proteinlösung auf die
TNF-Konzentration bestätigt diese Studie, jedoch scheinen Aminosäuren in hoher
Konzentration eine vermehrte Bildung von TNF-α zu bewirken, welches dann durch die
TNF-Rezeptoren neutralisiert wird. Es ist zu vermuten, daß Aminosäuren zu einer
Inflammation führen, die dann eine Aktivierung von TNF bewirkt. Möglicherweise erfolgt
hierüber dann die Aktivierung der HPA-Achse. Gegen diese Hypothese spricht das
Ausbleiben einer IL-6 Stimulation, als sehr sensitiver Marker für Inflammationsprozesse.
In vorhergehenden Studien konnte nachgewiesen werden, daß TNF die IL-1 Bildung
stimuliert, welches wiederum im Hypothalamus eine vermehrte Sekretion von CRH
bewirkt mit anschließender Aktivierung der HPA-Achse (Dinarello et al, 1986;
Berkenbosch et al, 1987). Ebenso konnte eine direkte Stimulierung der Hypophyse mit
vermehrter ACTH-Sekretion durch TNF-α beobachtet werden (Darling et al, 1989). In
dieser Studie zeigte sich nun, daß Aminosäuren in der Nahrung zu einer vermehrten TNFSekretion führen und darüber möglicherweise zu einer Aktivierung der HPA-Achse.
48
4.7 Blutbildveränderungen durch Nahrungsproteine bzw. Aminosäuren
Um festzuhalten, inwiefern Nahrungsproteine wegen ihrer antigenen Eigenschaften die
systemische Immunantwort beeinflussen, haben wir in der vorliegenden Studie Parameter
des weißen Blutbildes gemessen. In einer Studie von Hansen et al verursachte eine
proteinreiche Mahlzeit im Vergleich zum Fasten einen Anstieg der neutrophilen
Granulozyten und der Thrombozyten, jedoch einen Abfall der Lymphozyten (Hansen et al,
1997). In den Ergebnissen der vorliegenden Studie ergab sich ein signifikanter Anstieg der
Leukozyten
nach
Aminosäureneinnahme
im
Vergleich
zum
Placebo.
Im
Differentialblutbild zeigte sich dann, daß dies durch einen Anstieg der Monozyten und
neutrophilen Granulozyten verursacht wird. Basophile und eosinophile Granulozyten
veränderten sich nicht signifikant in ihrer Zahl. Weiterhin wurde bei den Lymphozyten und
Thrombozyten ein zeitweiliger Abfall nach Aminosäurengabe beobachtet. Keine
signifikanten Veränderungen ergaben sich bei den Erythrozytenzahlen. Die Ergebnisse bei
den neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten korrelieren mit denen von Hansen et al.
Die Veränderungen der Zellzahlen im Blut spiegeln die Migration dieser Zellen wieder,
welche durch Aminosäurenaufnahme angeregt wird. Es zeigt sich somit, daß, wie auch
schon in der oben genannten Studie beobachtet, Nahrung und hier speziell Aminosäuren
eine Aktivierung des zellulären Immunsystems bewirken. In der Vermittlung dieser
Aktivierung spielen viele verschiedene Faktoren eine Rolle. Zu den stärksten Regulatoren
der Immunantwort gehören Glucocorticoide, wobei speziell Cortisol die Zahl der
neutrophilen Granulozyten durch vermehrte Freigabe aus dem Knochenmark erhöht
(Cupps und Fauci, 1982). Ebenfalls Einfluß auf das zelluläre Immunsystem hat das GH. Es
konnte nachgewiesen werden, daß das GH bei Tieren und in vitro zu einem
lymphopoetischen Effekt führt (Murphy et al, 1993). Wie oben bereits beschrieben, kam es
nach Aminosäurengabe zu einem signifikanten Anstieg der GH-Konzentration, sodaß über
49
dieses Hormon ebenfalls eine Stimulation der neutrophilen Granulozyten erfolgt und die
Migration der Lymphozyten aus dem Blut mitgesteuert wird und so der Abfall der
Lymphozytenzahl zu erklären ist. Andererseits scheint es sich bei den in der Studie von
Murphy et al. beobachteten Effekten um langsame Prozesse zu handeln, sodaß Zweifel
bestehen, daß diese für die schnelle Änderungen der Zellzahlen verantwortlich sein
können.
Weiteren Einfluß auf die Immunzellmigration haben Katecholamine, welche zu
einer Erhöhung der Lymphozytenzahlen im Blut führen (Van Tits et al, 1990; Schedlowski
et al, 1996). Wie oben bereits erwähnt, führt kohlenhydratreiche Nahrung zu einer
Noradrenalinsekretion, wohingegen fett und proteinreiches Essen zu keiner Stimulation der
Katecholaminsekretion führt (Welle et al, 1981; Potter et al, 1989; Heseltine et al, 1990).
Unsere Untersuchungen bestätigten dies und zeigten, daß Aminosäuren und Proteine zu
keiner Stimulation des Nebennierenmarks führen, sodaß daraus gefolgert werden kann, daß
die Aktivierung der Immunzellmigration durch Nahrungsproteine bzw. -aminosäuren nicht
durch Katecholamine vermittelt wird.
4.8 Stimulation der Cortisolsekretion durch Aminosäuren
Im Hauptexperiment konnten wir nachweisen, daß Aminosäuren in der Nahrung zu einer
ACTH-vermittelten Cortisolsekretion führen. Es ergibt sich nun die Frage, über welche
Wege die Hypophyse bzw. der Hypothalamus durch alimentäre Aminosäuren stimuliert
wird. Aus vorausgegangenen Studien ist bekannt, daß Aminosäuren wie z.B. Tryptophan
potente Stimulatoren der HPA-Achse sind (Woolf und Lee, 1977; Ljungquist, 1978;
Modlinger et al, 1980; Wurtmann et al, 1980). Ungeklärt blieb, ab welchem Zeitpunkt der
Resorption der Aminosäuren aus dem Darm die Triggerung der Aminosäuren-induzierten
Cortisol-Antwort erfolgt. So besteht die Möglichkeit, daß bereits vor Erreichen des
50
portalen Blutsystems über unterschiedliche Mechanismen die Aktivierung der HPA-Achse
erfolgt oder erst durch direkte Wirkung der Aminosäuren auf den Hypothalamus bzw. die
Hypophyse. Das in dieser Studie durchgeführte Zusatzexperiment erbrachte, daß nur
enteral verabreichte Aminosäuren zu einer Cortisolsekretion führen, es allerdings bei
parenteraler Zufuhr zu keiner vermehrten Cortisolsekretion kommt. Daraus lässt sich
schließen, daß der stimulierende Effekt der oral aufgenommenen Aminosäuren auf die
Cortisol-Sekretion durch ein Signal getriggert wird, welches in der gastrointestinalen
Mukosa bzw. im prähepatischen Blutstrom oder in der Leber generiert wird. Durch die
Messung der L-Tryptophan-Konzentration im Serum nach parenteraler und oraler
Applikation zum Zeitpunkt der größten Cortisolkonzentrationen wurde gezeigt, daß die
Aminosäurenkonzentrationen bei beiden Bedingungen identisch sind. Da Tryptophan ein
potenter Stimulator der HPA-Achse ist, zeigen die Ergebnisse, daß nur oral verabreichtes
Tryptophan zu einer Cortisol-Sekretion führt. Bestätigt werden diese Resultate durch
vorausgegangene Studien, die ebenfalls zeigten, daß L-Tryptophan die HPA-Sekretion nur
dann stimuliert, wenn es oral verabreicht wird, jedoch nicht bei parenteraler Gabe
(Modlinger et al, 1980; Wurtmann et al, 1980; Winokur et al, 1986).
Die beiden Experimente zeigen, daß die ACTH-vermittelte Cortisolsekretion auf
aminosäurereiche Nahrung von der Aktivierung in der Darmmukosa bzw. im portalen
Blutstrom oder in der Leber abhängen könnte. Wie diese Signale die HPA-Achse erreichen
ist unklar. Es kommen mehrere Möglichkeiten in Betracht. Es wurde in Studien lokales
darmassoziiertes ACTH nachgewiesen, jedoch nicht, ob dies hormonelle Aktivität besitzt
(Orwoll et al, 1978; Larsson, 1979). Al-Damluji et al wiesen außerdem nach, daß die
postprandiale Cortisolsekretion nur durch Stimulation von hypophysärem ACTH erfolgt,
sodaß
lokales
darmassoziiertes
ACTH
als
Auslöser
für
die
Cortisolsekretion
unwahrscheinlich ist (Al-Damluji et al, 1987). Daneben besteht noch die Möglichkeit, daß
51
Inkretine wie Cholezystokinin und Gastrin-releasing peptide (Bombesin) durch
Nahrungsproteine und -aminosäuren freigesetzt werden und dann die HPA-Achse
stimulieren (Olsen et al, 1992; Abelson und Young, 2003). Weiterhin bildet der Nervus
vagus mit seinen afferenten Neuronen eine Verbindung zwischen dem Verdauungstrakt
und dem ZNS. Es konnte nachgewiesen werden, daß durch Stimulation afferenter VagusNerven eine vermehrte IL-1beta Expression erfolgt und auch die HPA-Achse stimuliert
wird (Hosoi et al, 2000). Das geschilderte verdeutlicht, daß es sich bei der
aminosäureinduzierten Aktivierung der HPA-Achse um einen multifaktoriellen Prozeß
handelt, dessen genaue Aufschlüsselung noch erfolgen muß.
52
5. Zusammenfassung
Die mit der Nahrung aufgenommenen Nährstoffe führen neben einer lokalen Inflammation
der Mukosa des Gastrointestinaltraktes auch zu systemischen Immunveränderungen und
einer Aktivierung der hypothalamo-hypophysären-adrenocorticalen Achse, an dessen Ende
die Ausschüttung des Stresshormons Cortisol steht. Ursächlich schienen die in der
Nahrung enthaltenen Antigene, von denen Proteine die stärkste immunogene Wirkung
besitzen, zu sein. Speziell die HPA-Achse wird durch die Nahrungsaufnahme stimuliert,
wobei nachgewiesen wurde, daß insbesondere proteinreiche Nahrung zu einer Stimulation
der Cortisolsekretion am Mittag führt. Aus diesen Beobachtungen ergab sich die Frage, ob
die Antigenwirkung der Nahrungsproteine die postprandiale Stimulation der HPA-Achse
bewirkt und weiterhin eine systemische Inflammation hervorruft. Hieraus könnten sich
weitere Erkenntnisse bezüglich der Entstehung von nahrungsassoziierten Erkrankungen,
wie chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Nahrungsmittelallergien, ergeben.
In der vorliegenden Arbeit wurden in einem Hauptexperiment 12 Probanden
nasogastral an drei aufeinander folgenden Terminen entweder 50 Gramm Casein bzw.
Casein-Hydrolysat aufgelöst in 500 ml Kochsalzlösung oder nur 500 ml Kochsalzlösung
verabreicht. Während des Untersuchungszeitraumes wurden Cortisol, ACTH, Interleukin6, GH, Adrenalin, Noradrenalin, sTNF-RII und das Differentialblutbild bestimmt. In dem
Zusatzexperiment wurden 4 zusätzliche Probanden an zwei aufeinander folgenden Tagen
entweder nasogastral oder intravenös 50 Gramm Aminoplasmal 5% aufgelöst in 1000 ml
Kochsalzlösung bzw. 10 Gramm Aminoplasmal 5% aufgelöst in 200 ml Kochsalzlösung
verabreicht und die Serumspiegel von Cortisol und L-Tryptophan gemessen.
Die Ergebnisse des Hauptexperiments erbrachten, daß die Aminosäurelösung zu
einer signifikant stärkeren Stimulation der ACTH- und Cortisol- Sekretion führt als die
entsprechende Menge an Proteinen bzw. das Placebo. Keine signifikanten Unterschiede
53
zwischen Proteinen und Aminosäuren ergaben sich bei Interleukin-6, GH, Adrenalin,
Noradrenalin und TNF-RII. Signifikante Unterschiede im Differentialblutbild ergaben sich
bei Casein- bzw. Casein-Hydrolysat-Gabe lediglich bei den Thrombozyten, welche nach
der Gabe von Aminosäuren abfielen. Im Vergleich zum Placebo kam es jedoch zu einem
Anstieg der Leukozyten und hier speziell der neutrophilen Granulozyten und Monozyten
Im Zusatzexperiment zeigte sich, daß die intravenöse Verabreichung von
Aminosäuren, im Vergleich zur nasogastralen Applikation, zu keinem signifikanten
Anstieg der Cortisolkonzentration im Plasma führt, bei gleichen Serum-L-TryptophanKonzentrationen.
Die Ergebnisse der beiden Experimente weisen nach, daß die postprandiale
Cortisolsekretion nicht durch die Antigenwirkung von Proteinen hervorgerufen wird,
sondern durch die Aminosäuren in der Nahrung. Weiterhin konnte ausgeschlossen werden,
daß die Magen- bzw. Darmdehnung durch das Volumen der Nahrung zu einer
Cortisolsekretion führt. Das Zusatzexperiment erbrachte die Erkenntnis, daß die
aminosäureinduzierte Cortisolsekretion nicht durch direkte Wirkung der Aminosäuren an
dem Endorgan hervorgerufen wird, sondern über ein Signal gesteuert werden muß,
welches in der intestinalen Mukosa, in dem prähepatischen Blutstrom oder in der Leber
generiert wird. Nachweislich konnte gezeigt werden, daß die aminosäureinduzierte
Cortisolsekretion durch ACTH vermittelt wird. Dagegen konnte keine Aktivierung des
sympathischen Nervensystems und des Nebennierenmarks durch Proteine bzw.
Aminosäuren festgestellt werden. Weiterhin wurde eine Aktivierung des zellulären jedoch
nicht des humoralen Immunsystems nach Aminosäuregabe beobachtet. Es scheint, daß
Aminosäuren zu einer Inflammation führen, welche jedoch nicht durch Interleukin-6
vermittelt wird.
54
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74
7. Anhang
7.1 Tabellen
Tabelle 1:Aminosäurenverteilung in Casein: Milligramm/Milligramm total
Alanin
55,7
Lysin
90,1
Arginin
35,7
Methionin
22,0
Aspartat
50,1
Phenylalanin
41,3
Cystein
0,2
Prolin
83,5
187,5
Serin
24,6
34,6
Glutamat
Glycin
21,3
Threonin
Histidin
28,4
Tryptophan
Isoleucin
46,9
Tyrosin
28,8
Leucin
75,6
Valin
64,3
Tabelle
2:Aminosäurenverteilung
in
Aminoplasmal
0,5
5%:
Milligramm/Gramm
Aminoplasmal
Alanin
137,0
Arginin
Ornithin
25,0
92,0
Lysin
56,0
Asparagin
32,8
Methionin
38,0
Aspartat
13,0
Phenylalanin
51,0
Cystein
5,0
Prolin
89,0
Glutamat
46,0
Serin
24,0
Glycin
79,0
Threonin
41,0
Histidin
52,0
Tryptophan
18,0
Isoleucin
51,0
Tyrosin
13,0
Leucin
89,0
Valin
48,0
75
7.2.Abbildungen
Abbildung 1
Mittelwerte (±SEM) der Serumspiegel von Cortisol bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis
0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung ( 500 ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung (a – p<0,05, aa - p<0,01), Casein vs.
Kochsalzlösung (b - p<0,05, bb - p<0,01) und Casein vs. Casein-Hydrolysat (c- p<0,05, cc
- p<0,01). Die Werte sind bezogen auf die Baseline.
76
Abbildung 2
Mittelwerte (±SEM) der Serumspiegel von ACTH bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis 0
min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500 ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie).
Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis 30 min). Die P-Werte zeigen den
paarweisen
Vergleich
an
zwischen
den
Effekten
von
Casein-Hydrolysat
vs.
Kochsalzlösung (a – p<0,05, aa - p<0,01), Casein vs. Kochsalzlösung (b - p<0,05, bb p<0,01) und Casein vs. Casein-Hydrolysat (c- p<0,05, cc - p<0,01). Die Werte sind
bezogen auf die Baseline.
77
Abbildung 3
Mittelwerte (±SEM) der Serumspiegel von Growth Hormone bei 12 Versuchspersonen vor
(-30 bis 0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung
(500 ml, durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie).
Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis 30 min). Die P-Werte zeigen den
paarweisen
Vergleich
an
zwischen
den
Effekten
von
Casein-Hydrolysat
Kochsalzlösung (aa - p<0,01). Die Werte sind bezogen auf die Baseline.
vs.
78
Abbildung 4
Mittelwerte (±SEM) der Serumspiegel von Adrenalin bei 12 Versuchspersonen vor (-30
bis 0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500
ml, durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie).
Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis 30 min). Die Werte sind bezogen auf
die Baseline.
79
Abbildung 5
Mittelwerte (±SEM) der Serumspiegel von Noradrenalin bei 12 Versuchspersonen vor (-30
bis 0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500
ml, durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie).
Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis 30 min). Die P-Werte zeigen den
paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von Casein vs. Kochsalzlösung (b p<0,05) und Casein vs. Casein-Hydrolysat (c- p<0,05). Die Werte sind bezogen auf die
Baseline.
80
Abbildung 6
Mittelwerte (±SEM) der Serumspiegel von Interleukin 6 bei 12 Versuchspersonen vor (-30
bis 0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500
ml, durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert ( 0 bis
30 min ). Die Werte sind bezogen auf die Baseline.
81
Abbildung 7
Mittelwerte (±SEM) der Serumspiegel von TNF-Rezeptor II bei 12 Versuchspersonen vor
(-30 bis 0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung
(500 ml, durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung (a – p<0,05, aa - p<0,01). Die Werte sind bezogen
auf die Baseline.
82
Abbildung 8
Mittelwerte (±SEM) der Leukozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis 0 min) und
nach
nasogastraler
Applikation
von
physiologischer
Kochsalzlösung
(500
ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min ). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung (a – p<0,05), Casein vs. Kochsalzlösung (b p<0,05) und Casein vs. Casein-Hydrolysat (c- p<0,05). Die Werte sind bezogen auf die
Baseline.
83
Abbildung 9
Mittelwerte (±SEM) der Erythrozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis 0 min) und
nach
nasogastraler
Applikation
von
physiologischer
Kochsalzlösung
(500
ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min ). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein vs. Kochsalzlösung (b - p<0,05) und Casein vs. Casein-Hydrolysat (c- p<0,05). Die
Werte sind bezogen auf die Baseline
84
Abbildung 10
Mittelwerte (±SEM) der Thrombozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis 0 min) und
nach
nasogastraler
Applikation
von
physiologischer
Kochsalzlösung
(500
ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein vs. Casein-Hydrolysat (c- p<0,05, cc-p<0,01 ). Die Werte sind bezogen auf die
Baseline.
85
Abbildung 11
Mittelwerte (±SEM) der neutrophilen Granulozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis
0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500 ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung (a – p<0,05, aa - p<0,01) und Casein vs.
Kochsalzlösung (b - p<0,05). Die Werte sind bezogen auf die Baseline.
86
Abbildung 12
Mittelwerte (±SEM) der Monozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis 0 min) und nach
nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500 ml, durchgezogene
Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung, gestrichelte Linie) und
Casein-Hydrolysat (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung, gepunktete Linie).
Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis 30 min). Die P-Werte zeigen den
paarweisen
Vergleich
an
zwischen
den
Effekten
von
Casein-Hydrolysat
vs.
Kochsalzlösung (a – p<0,05, aa – p<0,01 ) und Casein vs. Kochsalzlösung (b - p<0,05) .
Die Werte sind bezogen auf die Baseline.
87
Abbildung 13
Mittelwerte (±SEM) der Lymphozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis 0 min) und
nach
nasogastraler
Applikation
von
physiologischer
Kochsalzlösung
(500
ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min ). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung (a – p<0,05, aa – p<0,01), Casein vs.
Kochsalzlösung (b - p<0,05) und Casein-Hydrolysat vs. Casein (c - p<0,05). Die Werte
sind bezogen auf die Baseline.
88
Abbildung 14
Mittelwerte (±SEM) der eosinophilen Granulozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis
0 min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500 ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min ). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung (a – p<0,05) und Casein-Hydrolysat vs. Casein (c p<0,05). Die Werte sind bezogen auf die Baseline.
89
Abbildung 15
Mittelwerte (±SEM) der basophilen Granulozyten bei 12 Versuchspersonen vor (-30 bis 0
min) und nach nasogastraler Applikation von physiologischer Kochsalzlösung (500 ml,
durchgezogene Linie), Casein (50 g in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung,
gestrichelte
Linie)
und
Casein-Hydrolysat
(50
g
in
500
ml
physiologischer
Kochsalzlösung, gepunktete Linie). Die Substanzen wurden über 30 min appliziert (0 bis
30 min). Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich an zwischen den Effekten von
Casein-Hydrolysat vs. Kochsalzlösung (a – p<0,05). Die Werte sind bezogen auf die
Baseline.
90
Abbildung 16
Mittelwerte (±SEM) der Serumkonzentrationen von Cortisol bei 4 Versuchspersonen vor (30 b is 0 min) und nach nasogastraler (gestrichelte Linie) bzw. intravenöser
(durchgezogene Linie) Gabe einer Aminosäurelösung (Aminoplasmal, nasogastral: 50 g
Aminosäuren in 500 ml Kochsalzlösung gelöst; intravenös: 10 g Aminosäuren in 200 ml
Kochsalzlösung gelöst). Die Aminosäuren wurden nasogastral über 30 Minuten (0-30 min)
und intravenös über 45 Minuten verabreicht. Die P-Werte zeigen den paarweisen Vergleich
91
an zwischen den Effekten nasogastraler vs. intravenöser Gabe (*<0.05 ). Die Werte sind
bezogen auf die Baseline.
Serumkonzentrationen von L-Tryptophan während des Baseline-Intervalls und 15 bzw. 30
Minuten nach Gabe der Aminosäuren. (Aminoplasmal, nasogastral: 50 g Aminosäuren in
500 ml Kochsalzlösung gelöst; intravenös: 10 g Aminosäuren in 200 ml Kochsalzlösung
gelöst). Die enterale Gabe wird als weiße, die parenterale Gabe als schwarze Säule
dargestellt. Nichtsignifikanz wird mit n.s. abgekürzt.
92
8. Danksagung
Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. Kern danke ich für die Vergabe des
Dissertationsthemas, die Überlassung von Arbeitsplatz und Materialen sowie für das große
Interesse und die hilfreiche Beratung während der Durchführung.
Herrn Christian Benedict aus der Forschergruppe Klinische Neuroendokrinologie danke
ich für die Beratung und Korrektur des Manuskriptes.
Frau Christiane Zinke und Frau Stefanie Baxmann aus dem Klinischen Labor der Klinik
für Innere Medizin der Universität Lübeck danke ich für die Durchführung der zahlreichen
Hormonbestimmungen und für die Beratung in labortechnischen Fragen.
Der Firma Frank Gutjahr danke ich für die Bestimmung von L-Tryptophan.
Einen besonderen Dank an meine Eltern, die mir das Medizinstudium und diese
Dissertation durch Ihre Unterstützung erst ermöglichten.
93
9. Lebenslauf
Berufspraxis
10/05-
Assistenzarzt bei Herrn Prof. Dr. med. Flachskamp
Abteilung für Kardiologie, Allgemeines Krankenhaus
Harburg, Hamburg
02/03-10/05
Assistenzarzt bei Herrn Prof. Dr. med. Kaukel
Abteilung für Pneumologie, Allgemeines Krankenhaus
Harburg, Hamburg
10/02-02/03
Assistenzarzt bei Herrn Dr. med. Wedel
Abteilung für Innere Medizin, Krankenhaus Winsen
Winsen an der Luhe
03/01-09/02
Arzt im Praktikum bei Herrn Prof. Dr. med. Kaukel
Abteilung für Pneumologie, Allgemeines Krankenhaus
Harburg, Hamburg
Studium
1999-2000
Praktisches Jahr
1993-1999
Studium der Humanmedizin an der Universität Lübeck
Promotionsarbeit
1997-2000
Probenanalysen und zweite experimentelle Untersuchung
02/97.12/97
Erste experimentelle Untersuchung
Zivildienst
09/91-12/92
Zivildienst in der Kurt-Juster-Heim-Gesellschaft, Hamburg
Schulausbildung
1987-1991
Lessing-Gymnasium, Hamburg
1984-1987
Realschule Sinstorf, Hamburg
94
1981-1984
Gymnasium Sinstorf, Hamburg
1977-1981
Grundschule Marmstorf, Hamburg
06.02.1971
Geburtsdatum