B-ZELLEN und ANTIKÖRPER Vorlesung 2
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Vorlesung Immunologie 6. Semester Humanmedizin B-Zellen und Antikörper 1/7 B-ZELLEN und ANTIKÖRPER Vorlesung 2 Antigen 1. Antigene Determinanten Begriffe ¾ Antigene sind Moleküle, die von den spezifischen Rezeptoren der B- oder TZellen erkannt werden. Sie unterscheiden sich in Bezug auf ihre Immunogenität. Diese wird beeinflusst durch : Molekülmasse, Molekülstruktur, Verweildauer und Prozessierbarkeit des Antigens in APC. ¾ B-Zellepitope liegen bevorzugt in hydrophilen Regionen auf der Oberfläche nativer Antigene. T-Zellepitope entstehen erst durch Prozessierung und müssen nicht auf der Oberfläche eines Antigens lokalisiert sein. Haptene sind inkomplette Antigene. Isoliert sind sie nicht immunogen, obwohl sie eine antigene Determinante darstellten, wenn das Hapten an ein größeres immunogenes Träger-Molekül gekoppelt wird. 2. Sequenz- und Konformations-Epitope ¾ B-Zellepitope können sequenziell definiert sein, oder als KonformationsEpitope vorkommen, die sich erst durch eine räumliche Gruppierung ergeben. Antikörper 1. Struktur der Immunoglobuline Domänen ¾ Antikörper gehören zur Molekül-Familie der Immungobuline (Ig). Ein Molekül besteht aus zwei identischen leichten Ketten (L) und zwei identischen schweren (H) Ketten. Jede Kette besitzt eine amino-terminale variable (V) Region, an die sich eine konstante (C) Region anschließt. Fragmente ¾ Durch enzymatische Fragmentierung (F) können Antikörper in ihre Bestandteile zerlegt werden. Emmrich, 2007 Vorlesung Immunologie 6. Semester Humanmedizin B-Zellen und Antikörper 2/7 Differente H- und L-Ketten ¾ Die konstante Region besteht bei jedem Antikörper aus einer von fünf HKetten-Sequenzen (µ, γ, δ, α, ε), den sogenannten Isotypen und einer von zwei L-Ketten-Sequenzen ( k,l ). Die H-Ketten-Isotypen bestimmen die Klasse des Antikörpers (IgM,IgG,IgD,IgA,IgE). Bei IgG (IgG1-4) und IgA ( IgA1 und IgA2) gibt es darüber hinaus Ig-Subklassen. Die H-Ketten von IgM und IgE besitzen je 5 Domänen, diejenigen von IgG, IgD und IgA jeweils 4. 2. Isotyp, Allotyp, Idiotyp Jeweils Gesamtheit aller Isotope, Allotope, Idiotope, deren jedes durch einen monoklonalen Antikörper definiert ist. ¾ Immunglobuline besitzen selbst auch antigene Determinanten, über die sie charakterisiert werden können. Die Gesamtheit der jeweiligen Determinanten bildet den „Typ“. ¾ Allotypen finden sich beim Menschen bei allen vier IgG Subklassen, bei der IgA2-Subklasse und bei der κ–Kette. Die Gm- Allotypen waren früher für forensische Untersuchungen sehr wichtig. ¾ Idiotope charakterisieren Unterschiede in der variablen Region bei gleichem Iso- und Allotyp. 3. Antigenerkennung durch den V-Teil Hypervariable Regionen ¾ Innerhalb der V-Regionen von Antikörper-Molekülen finden sich auffällige Bereiche, in denen die Aminosäure-Sequenzen stark variieren, hypervariabel sind. Diese Bereiche determinieren die Bindungseigenschaften des Antikörpers = CDR complementarity determining region CDRs ¾ Die Domänen von Immunglobulinen besitzen eine charakteristische Tertiärstruktur, die sich auch bei vielen Molekülen findet, die keine Antikörper sind. ¾ Jede H- und jede L-Kette besitzt innerhalb ihrer V-Region drei complementarity dertermining regions (CDRs), von denen Antigenbindung und damit die Spezifität des Antikörpers bestimmt werden. Antigen-infuzierte Konformationsänderung ¾ Antigenbindung löst Konformationsänderungen im Immunglobulin-Molekül aus. Emmrich, 2007 Vorlesung Immunologie 6. Semester Humanmedizin B-Zellen und Antikörper 3/7 4. Funktionen des konstanten Teils Aufbau ¾ Die wesentlichen Ig-Klassen unterscheiden sich neben den Isotypen auch im Vorkommen der hinge-Regionen, die für besondere Flexibilität des Moleküls sorgen, bei IgE und IgM aber fehlen. IgA (Dimer) und IgM (Pentamer) kommen als Polymere vor. Sekretorisches IgA ¾ Täglich werden 5 – 15 g sekretorische IgA in den Schleimhäuten produziert. Im Jejunum finden sich mehr IgA-sezernierende Plasmazellen als die Gesamtzahl aller Plasmazellen in Knochenmark, Lymphsystem und Milz zusammen beträgt. ¾ Sekretorisches IgA besteht aus zwei IgA-Molekülen, die kovalent miteinander über eine J-Kette verbunden sind und somit ein Dimer bilden. Mit Hilfe eines Rezeptors für polymeres Immunglobulin (Poly-Ig-Rezeptor, bestehend aus fünf ig-ähnlichen Domänen) wird IgA (auch ein wenig IgM) an die „Innenseite“ von Schleimhaut-Epithelzellen gebunden und hindurchgeschleust in das Darmlumen, wobei der Rezeptor abgespalten und als sekretorische Komponente an das nun vollständige „sekretorische IgA“ angefügt wird. Dieses bildet einen Protease-resistenten „Schutzfilm“ im Darm. Übersicht IgG Wichtigste Immunglobulinklasse, als Monomer sezerniert, plazentagängig, vielfältige Wirkung auf Zellen über Fc-Rezeptoren IgM Membranständiger Antigenrezeptor, als Pentamer sezerniert (verknüpft mit einer J-Kette), wird früh gebildet, effektiver Agglutinator, effiziente Komplementaktivierung IgD Membranständiger Antigenrezeptor und sezerniertes Monomer IgA wird hautpsächlich im Darm gebildet und vermittelt die Schleimhautimmunität (Transzytose), in Körpersekreten als Dimer (mit J-Kette), liegt im Serum hauptsächlich als Monomer vor IgE Verschwindend geringe Konzentration, aber wichtig für Aktivierung von Mastzellen und Basophilen, Typ 1 Allergie- und Parasitenabwehr Emmrich, 2007 Vorlesung Immunologie 6. Semester Humanmedizin B-Zellen und Antikörper 4/7 Tabellarische Übersicht der Subklassen Funktion IgG IgG1 IgM IgG2 IgG3 IgG4 IgA IgD IgE IgA1 ÎgA2 Aktiviert klassischen Komplementweg Aktiviert alternativen Komplementweg Plazentatransfer + +/- ++ - +++ - - - - - - - - - + - - - + +/- + + - - - - - Mucosatransfer - - - - + ++ ++ - - Bindung an FcRezeptoren auf Phagozyten Membran-Ig auf B-Zellen ++ +/- ++ + - - - - +/- - - - - + - - + - - - - - - - - - +++ Mastzelldegranulation Antigenrezeptor der B-Zellen 1. Beobachtung des B-Zellrezeptors ¾ Antikörper können als sezernierte Moleküle in Körperflüssigkeit vorkommen, aber auch membranständig als Antigenrezeptoren der B-Lymphozyten (Menbran-mIgM/oder mIgD) 2. Aufbau des B-Zellrezeptors ¾ Der B-Zellrezeptor (BCR) für Antigen besteht neben mIgM oder mIgD aus weiteren nicht-kovalent gebundenen Molekülen (Igα/Igβ), die für die Signaltransduktion durch ITAM benötigt werden. Antikörpervielfalt 1. Rezeptor/Antigen-Repertoire ¾ Frühe Ansätze zur Erklärung der Antikörpervielfalt und der Entstehung eines hinreichend umfassenden Rezeptor-Repertoires haben vor 30 Jahren zwei Hypothesen hervorgebracht: Keimbahnhypothese und Mutationshypothese. Von den Hypothesen wurde gefordert, dass sie die Entstehung von mehr als einer Million unterschiedlicher Antikörper/Rezeptoren zu erklären vermögen. Emmrich, 2007 Vorlesung Immunologie 6. Semester Humanmedizin B-Zellen und Antikörper 5/7 2. Genumlagerung erzeugt Diversität Entdeckung ¾ Prinzip des Schlüsselexperiments (S. Tonegawa) für die Entdeckung der Immunglobulin-Genumlagerung (rearrangement) auf DNA-Ebene während der Ontogenese einer B-Zelle. Beispiel einer L-Kette ¾ Genumlagerung, Transkription mit Spleißen der RNA und Proteinsynthese am Beispiel der Igκ L-Kette bei der Maus. Beispiel einer H-Kette ¾ Genumlagerung, Transkription mit Spleißen Proteinsynthese bei der Igµ H-Kette der Maus der RNA und Rekombinationsmechanismus ¾ Flankierende Intronsequenzen neben den Gensegmenten werden durch spezielle Enzyme (Rekombinasen) erkannt, die das schleifenförmige Auskoppeln unterschiedlich langer Nukleotid-Sequenzen besorgen und die Gensegmente neu zusammenfügen. Heptamer-Nonamer-Regel : 1. basengepaartes Heptamer 2. Zwischenstück (Spacer) von 12 3. basengepaartes Nonamer bzw. 23 einzelnen Basen 3. Diversität durch weitere Mechanismen Junktionale Diversität ¾ Im gezeigten Beispiel gehen bei der Verbindung („joining“) von V-J KeimbahnGensegmenten einige Nukleotide verloren, so dass unterschiedliche BasenTriplets und entsprechend diverse Aminosäuresequenzen entstehen. P- und N-Nucleotide ¾ Während der Genumlagerung für das D-J joining bilden sich an den Enden spezielle Strukturen in Form einer Haarnadel ( hairpin ) aus. Bleiben diese Enden offen, so ergibt sich die Möglichkeit zur Vervollständigung des Palindroms sogenannte P-Nukleotide einzufügen. Darüber hinaus kann die terminale Transferase auch neue Nucleotide (NNukleotide) einfügen. Emmrich, 2007 Vorlesung Immunologie 6. Semester Humanmedizin B-Zellen und Antikörper 6/7 Somatische Hypermutation ¾ Somatische Hypermutation löst eine Affinitätsreifung der B-Zell-Rezeptoren und Antikörper aus. Dieses Phänomen findet sich im Verlauf der Immunantwort nur bei B-Zellen, nicht aber bei T-Zellen. Übersicht Diversitätsmechanismen der B-Zellen 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Kombinatorisches V-(D)-J joining Junktionale Diversität P-Nucleotid Einfügung N-Nucleotid Einfügung Somatische Hypermutation Verschiedene Keimbahngene Kombinatorische Assoziation von H- und L-Ketten Berechnung der möglichen Diversität ¾ Kalkulation der möglichen Antikörper-Vielfalt (Mensch) Damit ergeben sich 109 – 1011 verschiedene Varianten. Entwicklung der B-Zellen 1. Differenzierungsstufen ¾ B-Zellen werden lebenslang im menschlichen Knochenmark aus Stammzellen gebildet. Die Stammzellen benötigen Kontakt zu Stromazellen und Zytokine (IL-7) für die Reifung. B-Zellen sind durch charakteristische Marker wie CD 19, 20, 21 erkennbar. Man unterscheidet verschiedene Reifungsstufen in Bezug auf die funktionelle Kompetenz. Frühe B-Zellvorläufer, Frühe Pro-B-Zelle (D-J), späte Pro-B-Zelle (V-DJ), Prä-B-Zelle (VDJ, intrazellulär µ) unreife B-Zelle (mIgM), reife B-Zelle (mIgM, mIgD). ¾ Ohne Antigenkontakt durchlaufen die frühen B-Zellformen sequentielle IgGenumlagerungen. Jede intakte Ig-Kette gibt nach ihrem Entstehen der Zelle ein Signal, die Umordnung des Gensegmentsatzes einzustellen, aus dem sie selbst stammt (allelic exclusion). Damit sind die Voraussetzungen für klonale Selektion gegeben, die durch den Kontakt mit Antigen eingeleitet wird. 2. Allele Exklusion ¾ Allele Exklusion beschreibt ein Phänomen, mit dem gesichert wird, dass eine B-Zelle (und ihre unmittelbaren Nachkommen) nur eine Spezifität aufweisen. Unmittelbar nach einer produktiven Genumlagerung von VL-JL oder VH-DH-JH, d.h. sobald ein Protein entsteht, wird die Genumlagerung auf dem anderen Chromosom gestoppt. Der Prozess verläuft als Kaskade von L- zu H-Ketten Genen. Der Mechanismus liefert die Voraussetzung für die klonale Selektion von Immunzellen. Emmrich, 2007 Vorlesung Immunologie 6. Semester Humanmedizin B-Zellen und Antikörper 7/7 3. Antigen-unabhängige Reifung ¾ Die Reifung des Immunsystems verläuft in zwei Phasen. Die erste Phase ist unabhängig von „Fremd“- Antigen und spielt sich in den primären lymphatischen Organen ab. Die zweite Phase wird bestimmt durch „Fremd“Antigene und die klonale Selektion von Lymphozyten in den sekundären lymphatischen Organen. ¾ Autoantigene im Knochenmark können zu Inaktivierung (klonale Anergie) oder Eliminierung (klonale Deletion) von unreifen B-Zellen führen. Monoklonale Antikörper 1. Herstellung ¾ Zur Herstellung von Hybridomen wird eine immortalisierte B-Zell-Linie verwendet, die einen enzymatischen Defekt aufweist (HGPRT-). Demzufolge kann diese Zelle nicht mehr auf den Nebenweg der Nukleotid-Synthese ausweichen, wenn der Hauptweg „vergiftet“ wird. Daher können die nicht fusionierten Zellen der HPRT- -Zelllinie nicht überleben. Es überleben nur fusionierte Zellen, die kloniert und für Spezifität und verschiedene Eigenschaften selektiert werden. ¾ Monoklonale Antikörper sind weit über das Fach Immunologie hinaus als „Werkzeuge“ in Diagnostik und Therapie unverzichtbar geworden. 2. Anwendungen A. Target : Lösliche Moleküle (z.B. Zytokine, Hormone, Enzyme) 1. Diagnostik - qualitativer Nachweis im Schnelltest - Konzentrationsbestimmung (RIA, ELISA) 2. Therapie - Neutralisation B. Target : Zelloberflächenmoleküle (erstmals möglich geworden) 1. Diagnostik - Zytoflurometrie - Histologie - Imaging 2. Therapie - Zytotoxizität - Immunmodulation VORTEILE 1. Hohe Spezifität für (A) ein Zielmolekül oder (B) ein Ziel-Epitop (besonders wichtig für Erkennung von Zelloberflächenmolekülen) 2. Bekannte (auswählbare) Affinität 3. Bekannter (auswählbarer) Isotyp 4. Standardisierbare Massenproduktion Emmrich, 2007
