Die Institute Institut für Molekulare Immunologie

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Institut für Molekulare Immunologie
Institute of Molecular Immunology
München / Munich
(Direktor / Director: Prof. Dr. Dolores J. Schendel)
D
ie Forschungsaktivitäten des Instituts
bewegen sich im Grenzgebiet zwischen Hämatologie, Immunologie,
Onkologie und Transplantationsbiologie.
Hier werden Konzepte zur Modulation des
Immunsystems mittels zell- und molekularbiologischer Methoden entwickelt. Untersucht werden neue Strategien der Immuntherapie und Gentherapie bei Krebs sowie
bei Autoimmunerkrankungen und Transplantat-Abstoßungsreaktionen. Dabei kommen Tiermodelle und In-vitro-Studien mit
isolierten Zellen des menschlichen Immunsystems zum Einsatz. Auf der Grundlage
dieser Strategien werden in enger Kooperation mit medizinischen Fakultäten sowohl
innerhalb als auch außerhalb Münchens
klinische Studien entworfen und umgesetzt.
Das Institut beteiligt sich am Programm
Infektion und Immunität der HelmholtzGemeinschaft.
Die Arbeiten werden federführend von
Prof. Dr. D. J. Schendel, PD Dr. E. Nößner,
PD Dr. C. S. Falk, Prof. Dr. R. Mocikat und
Dr. E. Kremmer geleitet.
Im Institut für Molekulare Immunologie
arbeiten zum Jahresende 9 Wissenschaftler/
innen, 8 Nachwuchswissenschaftler/innen,
davon 4 sonderfinanziert, und 10 Technische
Assistenten/innen (3 sonderfinanziert) an
immunologischen Projekten der Grundlagenforschung bzw. der anwendungsorientierten Forschung. 2 Doktoranden promovierten 2004 zum Dr. rer. nat.
Als Beispiel unserer Forschungsaktivitäten
im Jahr 2004 stellen wir jeweils ein Projekt
aus der Arbeitsgruppe Monoklonale Antikörper sowie aus der Klinischen Kooperationsgruppe „Urologische Tumoren“ vor.
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R
esearch in the institute is focused
on the intersecting field between
haematology, immunology, oncology,
and transplantation biology. Concepts are
developed for modulating the immune
system by means of cellular and molecular
methods. New strategies are investigated
for the immunotherapy and gene therapy of
cancer, and the treatment of autoimmune
diseases and transplant rejection reactions.
The research uses both animal models and
in vitro studies with isolated cells from the
human immune system. Clinical studies
based on these strategies are designed and
carried out in close cooperation with
medical faculties both in Munich and elsewhere.
The Institute participates in the
programme on ‘Infection and Immunity’ of
the Helmholtz-Gemeinschaft. The research
is coordinated by Prof. D. J. Schendel,
PD Dr. E. Nößner, PD Dr. C. S. Falk,
Prof. R. Mocikat, and Dr. E. Kremmer.
At the Institute there are currently
9 scientists and 8 junior scientists, 4 of
them supported by research grants, and
10 technicians (3 supported by grant funds)
involved in basic and applied immunological research. In 2004, 2 students were
awarded their doctorates (Dr. rer. nat.).
As an example of our activities in 2004
we present projects from our ‘Monoclonal
Antibodies’ Group and the Clinical Cooperation Group ‘Urological Tumours’.
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Untersuchungen zur Genexpression
in neuronalen Geweben mittels
monoklonaler Antikörper
Elisabeth Kremmer, Christine Hennard,
Anna Malamid und Ralph Mocikat
Eine der bedeutendsten Herausforderungen
für die biomedizinische Forschung in den
nächsten Jahren besteht darin, den im
Rahmen des Humangenomprojektes identifizierten und sequenzierten menschlichen
Genen Funktionen zuzuweisen. Im Allgemeinen geschieht dies durch Methoden der
Proteomik, durch transgene Tiermodelle
sowie durch Suche nach homologen Genen,
deren Funktion bekannt ist, in anderen
Spezies. Ein wichtiger Modellorganismus ist
dabei der Zebrafisch, da er leicht handhabbar ist, eine kurze Generationszeit aufweist
und durchsichtig ist, so dass Entwicklungsvorgänge am lebenden Tier beobachtet
werden können.
Wir interessierten uns für Gene und die
zugehörigen Genprodukte, die in neuronalen
Geweben des Zebrafisches exprimiert werden, für deren Expressionsmuster während
der Embryonalentwicklung sowie für die
Frage, ob es homologe Genprodukte in
anderen Spezies gibt. Zu diesem Zweck
wurden monoklonale Antikörper hergestellt,
mit deren Hilfe die entsprechenden Proteine
in Gewebeschnitten, im Western-Blot, in der
Immunpräzipitation sowie in Expressionsgenbanken detektiert werden konnten.
Nach Immunisierung von Ratten mit
Gehirngewebe des Zebrafisches wurden aus
den Milzen der immunisierten Tiere Antikörper-produzierende Hybridom-Zelllinien
etabliert. Für weitere Untersuchungen wurden nur die Antikörper ausgewählt, die in
histologischen Schnitten mit neuronalen
Strukturen des adulten oder embryonalen
Zebrafisches reagierten. Um herauszufinden, um welche Moleküle es sich bei den im
Nervengewebe exprimierten, von den Antikörpern spezifisch erkannten Proteinen
handelte, wurden zwei Methoden angewandt: Einerseits wurde mit den Antikörpern
eine Phagen-Expressionsgenbank abgesucht, welche aus Zellen von drei Tage alten
Zebrafischen generiert worden war. Die
Gene, deren Produkte von den Antikörpern
166 GSF
erkannt wurden, wurden isoliert und sequenziert. Andererseits wurden die Proteine mit
Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des
Fischgehirns immunpräzipitiert oder nach
Western-Blot-Analysen aus präparativen
Proteingelen isoliert. Die isolierten Proteine
wurden dann der Massenspektrometrie
zugeführt. Die dabei gefundenen Peptide
wurden mit Datenbanken verglichen, so dass
die zugehörigen Proteine identifiziert werden
konnten.
Um Hinweise auf die phylogenetische
Konservierung der im Zebrafisch erkannten
Zielstrukturen zu gewinnen, wurden die in
den beiden Ansätzen verwendeten monoklonalen Antikörper an Geweben anderer Spezies immunhistologisch getestet. Tatsächlich
zeigten sich Kreuzreaktionen zwischen neuronalen Strukturen des Zebrafisches und
solchen des Menschen, der Ratte oder der
Maus.
Ein Protein, das im Laufe unserer Arbeiten
mit Hilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie identifiziert werden konnte,
stellte sich als Tenascin-R heraus. Tenascin-R
ist Bestandteil der extrazellulären Matrix. Es
interagiert mit Proteoglykanen und wird vor
allem während früher Stadien der Entwicklung exprimiert. Es wird mit Prozessen der
Zellmigration, der Axonentwicklung und der
Synapsenbildung in Verbindung gebracht.
Der dagegen gerichtete Antikörper färbt im
Zebrafisch Strukturen des zentralen Nervensystems an. Abbildung 1 zeigt die Färbung
an einem elf Tage alten Rattenembryo.
Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass der Antikörper z.B. auch das entsprechende Protein von Maus, Ratte und
Mensch detektiert.
Mittels der Phagen-Expressionsgenbank
konnte das Protein VAT-1 identifiziert werden.
Dieses Protein wurde erstmals im Zitterrochen beschrieben und soll dort eine Rolle
bei der Nerven-Signalübertragung spielen.
Dementsprechend färbt der Antikörper, der
dieses Protein erkennt, beim zwölf Tage alten
Fisch Gehirn, Rückenmark und Retina an
(Abb. 2). Obwohl homologe Proteine auch in
Säugetieren gefunden wurden, konnte eine
Kreuzreaktion des Antikörpers mit anderen
Spezies nicht beobachtet werden. Die Funktion der zu VAT-1 homologen Säugerproteine
ist noch unbekannt. Der Genort beim Men-
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Abb. 1. Anfärbung von Tenascin-R in den Gehirnstrukturen eines elf Tage alten Rattenembryos mit
Hilfe eines monoklonalen Antikörpers, der durch
Immunisierung mit Gehirnzellen des Zebrafisches
generiert wurde. Vergrößerung 2,5 x.
Abb. 2. Anfärbung von VAT-1 in Gehirn,
Rückenmark und Retina eines zwölf Tage alten
Zebrafisches.
schen liegt interessanterweise im Bereich
des BRCA-1-Gens, das mit der neoplastischen Entartung von Mamma und Ovar in
Verbindung gebracht wurde.
Unsere Arbeiten leisten einen Beitrag zur
Genom- und Proteomforschung. Wir konnten zeigen, dass monoklonale Antikörper ein
wichtiges Werkzeug sind, mit deren Hilfe die
Funktion menschlicher Gene aufgeklärt
werden kann.
ron-α) mit Ansprechraten von 30 %. Die
relativ hohe Ansprechrate auf eine unspezifische Immuntherapie wird als Hinweis gewertet, dass das Nierenzellkarzinom, ähnlich
dem Melanom, ein immunogener Tumor ist.
Folgerichtig wird in vielen Arbeitsgruppen
an einer Verbesserung von Immuntherapien
für das Nierenzellkarzinom gearbeitet. Im
Rahmen unserer Klinischen Kooperationsgruppe arbeiten wir vorwiegend an der
Etablierung und klinischen Umsetzung von
aktiven Vakzinierungsstrategien. So befindet
sich momentan die gentechnisch optimierte
Vakzine RCC-26 IL2/CD80 in der klinischen
Erprobung. Ferner wird auch die Nutzung
von dendritischen Zellen zur aktiven Vakzinierung von Tumorpatienten im Labor
intensiv untersucht.
Unabhängig von der Verbesserung der
Immuntherapie wäre es äußerst wünschenswert, tumorbezogene prognostische Parameter zu haben, die eine individuelle Abschätzung des Ansprechens eines Patienten
auf eine adjuvante Immuntherapie erlauben.
Mit hoher Wahrscheinlichkeit sind Immunevasions-Mechanismen der Tumoren für das
Scheitern von adjuvanten Immuntherapien
bei RCC-Patienten verantwortlich; eine
bessere Kenntnis dieser Toleranzmechanismen wäre daher von hoher klinischer Relevanz. Ein Molekül, das in diesem Zusammenhang in den letzten Jahren eine stetig
wachsende Bedeutung erlangt hat, ist das
Klinische Kooperationsgruppe
„Immuntherapien bei urologischen
Tumoren“
Transiente Expression des Tumorsuppressors CEACAM1 als ImmunevasionsMechanismus beim Nierenzellkarzinom
Robert Kammerer, Julia Schleypen und
Heike Pohla
Das Nierenzellkarzinom (RCC) führt in
Deutschland zu ca. 12 000 Neuerkrankungen
jährlich. Etwa 30 % der Patienten haben zum
Diagnosezeitpunkt bereits Metastasen,
weitere 30 % entwickeln sie im weiteren
Verlauf. Wegen weitgehender Strahlen- und
Chemoresistenz existiert als einzige etablierte systemische Therapieoption eine kostenintensive und nebenwirkungsreiche unspezifische Immuntherapie auf der Basis von
Zytokinen (meist Interleukin-2 und Interfe-
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g
a
200 µm
100 µm
A
B
t
200 µm
C
D
50 µm
Abb. 3: Immunhistologische Färbung von Normalnierengewebe (A), papillärem Adenom (B), klarzelligem Nierenzellkarzinom (C) und einer Lungenmetastase (D) mit CEACAM1-spezifischen Antikörpern.
Für die Detektion wurden Peroxidase-konjugierter anti-Maus-Ig-Antikörper und 3-Amino-9-EthylCarbazol verwendet, gegengefärbt wurde mit Mayer’s Hämalaun. Das Normalgewebe zeigt CEACAM1Expression in den Glomeruli (g), endothelialen Zellen () und proximalen Tubuli (). Tumorgewebe (t)
zeigt CEACAM1-Expression nur in den Endothelzellen und infiltrierenden Granulozyten (Kontrollfärbungen mit Markern für Endothelzellen und Granulozyten hier nicht gezeigt). CEACAM1-negativ sind die
distalen Tubuli () und die Epithelzellen des Adenoms (a).
CEACAM1, ein Zelladhäsionsmolekül aus
der Familie der karzinoembryonalen Antigene (CEA). CEACAM1 wird u.a. auf Epithelzellen, T-Zellen, natürlichen Killer(NK)-Zellen
sowie dendritischen Zellen exprimiert.
CEACAM1 spielt eine Rolle bei der Zell/ZellKommunikation, da es nach Ligandenkontakt der Zelle regulatorische Signale
vermittelt. Als zelluläre Liganden wurden
CEACAM1 selbst und CEA/CEACAM5 identifiziert. Auf Tumorzellen scheint es interessanterweise eine Zelltyp-spezifische Funktion auszuüben. So ist bekannt, dass
CEACAM1 in verschiedenen Karzinomen
eine Tumorsuppressorfunktion ausübt und
dementsprechend in diesen Tumoren herunterreguliert ist. Überraschenderweise
168 GSF
konnte jedoch kürzlich gezeigt werden, dass
beispielsweise beim malignen Melanom die
De-novo-Expression von CEACAM1 mit
einer deutlich schlechteren Prognose korreliert. Vermutlich beruht dies darauf, dass
CEACAM1-exprimierende Melanomzellen in
der Lage sind, die zytotoxische Aktivität von
NK-Zellen zu inhibieren und so der Überwachung durch das Immunsystem zu entkommen. Die Expression von CEACAM1 im RCC
wurde bisher noch nicht untersucht.
Da die meisten monoklonalen Antikörper
gegen CEACAM1 mit anderen CEA-Familienmitgliedern kreuzreagieren, haben wir
mittels genetischer Immunisierung einen
neuen CEACAM1-spezifischen monoklonalen Antikörper (8G5) hergestellt. Mit diesem
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Antikörper konnten wir die CEACAM1Expression im Normalgewebe der tumortragenden Niere immunhistochemisch bestimmen. Es zeigte sich, dass CEACAM1 in
vereinzelt angetroffenen Granulozyten, den
Endothelzellen der Nierenkapillaren und den
epithelialen Zellen der proximalen Tubuli,
von denen sich das klarzellige RCC ableitet,
exprimiert wird (Abb. 3). Völlig überraschend
war deshalb der Befund, dass in keinem
der 35 untersuchten RCC eine CEACAM1Expression in den Tumorzellen nachweisbar
war. Im Tumor war CEACAM1 ausschließlich
auf Endothelzellen und tumorinfiltrierenden
Granulozyten zu finden. Ebenso wie im
Primärtumor zeigten die Tumorzellen in
Metastasen oder in Nierenzellthromben der
Vena Cava kein CEACAM1-Protein. Da wir
selbst in Adenomen der Niere einen kompletten Verlust der CEACAM1-Expression
beobachteten, muss man davon ausgehen,
dass die Herunterregulation von CEACAM1
ein äußerst frühes Ereignis während der
Tumorgenese darstellt.
(Abb. 4). RT-PCR-Analysen zeigten, dass die
CEACAM1-Expression auf Transkriptionsebene reguliert wird, jedoch nur transient ist
und nach Entzug von IFN-γ innerhalb von 6
Tagen wieder vollständig eingestellt wird.
Da auch in frisch isolierten Tumorzellen
durch IFN-γ eine CEACAM1-Expression
induziert werden kann, muss man davon
ausgehen, dass diese Hochregulation auch
in vivo während einer gegen den Tumor
gerichteten Immunreaktion stattfindet.
Expression von CEACAM1 auf tumorinfiltrierenden Lymphozyten
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Die vorübergehende Expression von
CEACAM1 in RCC-Zellen könnte zu einer
A
CaKi 2
bp
–
A498
+
–
RCC26
+
–
IFN-γ
CEACAM1-4L
+
600
CEACAM1-4S
300
CEACAM1-3L
CEACAM1-3S
900
GAPDH
Regulation der CEACAM1-Expression
B
In Übereinstimmung mit den immunhistologischen Ergebnissen an Tumorschnitten
zeigen auch RCC-Zelllinien einen Verlust der
CEACAM1-Expression. Eine Rolle des
CEACAM1 bei der Interaktion der Tumorzellen mit Zellen des Immunsystems erscheint
daher eher unwahrscheinlich. Um dies zu
verifizieren, haben wir einen Angriff aktivierter zytotoxischer T-Zellen gegen die Tumorzellen in vitro simuliert und die CEACAM1Expression zu verschiedenen Zeitpunkten
der Interaktion bestimmt. Dabei stellte sich
heraus, dass die Herunterregulation des
CEACAM1 auf den Tumorzellen reversibel
ist, da nach einer dreitägigen Kokultur von
allogenen CD8+-T-Zellen mit den RCC-Zelllinien A498 und RCC26 diese eine deutliche
CEACAM1-Expression zeigten. In gleicher
Weise konnte eine Hochregulation von
CEACAM1 auf den zytotoxischen T-Zellen
(CTL) beobachtet werden, was auf einer
Allo-Aktivierung dieser Zellen beruht. Die
Hochregulation auf den Tumorzellen könnte
durch das von den aktivierten CTL sezernierte IFN-γ induziert werden. In der Tat ist die
Stimulation der RCC-Zelllinien mit IFN-γ
ausreichend, um CEACAM1 zu induzieren
64
88
– IFN-γ
0
100
101
102
+ IFN-γ
103
0
100
CEACAM1
101
102
103
C
265
0
0
10
0d
101
265
102
0
0
10
3d
101
102
CEACAM1
265
0
0
10
6d
101
102
Abb. 4: CEACAM1-Expression ist durch IFN-γ in
RCC-Linien und primären RCC-Zellen induzierbar.
(A) RT-PCR-Analyse der vier wichtigsten CEACAM1Spleißvarianten von mRNA aus 106 Zellen +/500 U/ml IFN-γ. Insbesondere die Spleißvarianten
für den langen zytoplasmatischen Anteil sind
induzierbar. Gezeigt ist zur quantitativen Abschätzung auch die GAPDH-Kontrollamplifikation.
(B) Durchflusszytometrische Analyse primärer
RCC-Zellen nach 3 Tagen +/- 500 U/ml IFN-γ.
(C) Analyse der transienten CEACAM1-Expression
auf einer RCC-Zelllinie an Tag 0, Tag 3 und Tag 6
nach 3-tägiger Kultivierung mit IFN-γ (= 0 d).
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Inhibition von zytotoxischen tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) führen und so
einen Immunevasions-Mechanismus für das
RCC darstellen. Dieser Mechanismus kann
jedoch nur dann wirksam sein, wenn auch
die TIL CEACAM1 exprimieren. Eine solche
Expression konnten wir bei den immunhistochemischen Untersuchungen jedoch nicht
beobachten. Dies könnte darauf beruhen,
dass die TIL im Tumor in Anergie verharren.
Durchflusszytometrische Analysen ergaben,
dass etwa 90 % der TIL T- oder NK-Zellen
waren, wobei die NK-Zellen einen Anteil von
7– 40 % ausmachten. Auch diese Analysen
ergaben, dass nur wenige TIL minimale
Mengen CEACAM1 exprimieren; die NKZellen waren vollständig negativ für
CEACAM1. Allerdings führte die Stimulation
mit IL-2 zu einer Expression von CEACAM1
auf der Mehrheit der T- und NK-Zellen.
Zusammenarbeit
Bedeutung der Ergebnisse
Die Hoffnung, die Erfolgsaussichten einer
Immuntherapie anhand der CEACAM1Expression im RCC individuell abschätzen
zu können, hat sich nicht erfüllt. Dagegen
haben diese Untersuchungen gezeigt, wie
wichtig für die erfolgreiche Anwendung von
Tumorimmuntherapien eine genaue Kenntnis von Immunevasions-Mechanismen ist.
In erster Linie sollte der Dynamik der TumorImmunzell-Interaktion deutlich mehr Beachtung geschenkt werden. So könnte man sich
z.B. vorstellen, dass nicht die bestehende
CEACAM1-Expression im Tumorgewebe,
wohl aber das Maß der CEACAM1-Induzierbarkeit ein prognostischer Faktor für den
Erfolg einer Immuntherapie beim RCC ist.
Im Hinblick auf die Therapie legen die Ergebnisse dieser und weiterer Untersuchungen nahe, die Immunantwort gegen Tumorzellen durch Blockierung der CEACAM1Funktion (z. B. durch inhibierende
Antikörper) zu verbessern. Experimente, in
denen solche Ansätze überprüft werden
sollen, werden gegenwärtig durchgeführt.
Ausgewählte Veröffentlichungen
Sieben Mitarbeiter/innen sind am Lehrbetrieb der
Ludwig-Maximilians-Universität beteiligt. Die Institutsleiterin ist Koordinatorin des HGF-Programms „Infektion
und Immunität“ für die GSF und stellvertretende Sprecherin eines DFG-Sonderforschungsbereichs (SFB 455).
Arbeitsgruppen des Instituts sind an insgesamt vier
Sonderforschungsbereichen beteiligt.
Kolb, H.J., Schmid, C., Barrett, A.J., Schendel, D.J.: Graftversus-leukemia reactions in allogeneic chimeras. Blood,
103, 767-776 (2004)
Fünf Klinische Kooperationsgruppen, die Abteilung
Genexpression sowie ein GMP-Labor sind dem Institut
angeschlossen.
Roth, W., Sustmann, C., Kieslinger, M., Gilmozzi, A.,
Irmer, D., Kremmer, E., Turck, C., Grosschedl, R.: PIASyDeficient Mice Display Modest Defects in IFN and Wnt
Signaling. J. Immunol., 173, 6189-6199 (2004)
Die Arbeiten des Instituts werden mit Drittmitteln der EU,
der DFG, der Wilhelm-Sander-Stiftung, der MildredScheel-Stiftung für Krebsforschung und der Else-KrönerFresenius-Stiftung gefördert.
Es bestehen direkte Kooperationen mit verschiedenen
HGF-Zentren (DKFZ Heidelberg, MDC Berlin). Daneben
bestehen intensive Kooperationen mit der Urologischen
Klinik und Poliklinik und der III. Medizinischen Klinik der
Ludwig-Maximilians-Universität, mit dem Institut für
Experimentelle Onkologie und Therapieforschung der
Technischen Universität München sowie mit der Hautklinik bzw. dem Institut für Zellbiologie, Abt. Immunologie,
der Eberhard-Karls-Universität Tübingen.
170 GSF
Misslitz, A., Pabst, O., Hintzen, G., Ohl, L., Kremmer, E.,
Petrie, H.T., Forster, R.: Thymic T cell development and
progenitor localization depend on CCR7. J. Exp. Med.
200, 481-491 (2004)
Schleypen, J.S., von Geldern, M., Weiss, E.H., Kotzias, N.,
Rohrmann, K., Schendel, D.J., Falk, C.S.*, Pohla, H*.:
Renal cell carcinoma-infiltrating natural killer cells
express differential repertoires of activating and inhibitory receptors and are inhibited by specific HLA class I
allotypes. (* gleicher Beitrag) Int. J. Cancer. 106, 905-912
(2003)
Ulbrecht, M., Maier, S., Hofmeister, V., Falk, C.S., Brooks,
A.G., McMaster, M.T., Weiß, E.H.: Truncated HLA-G
isoferms are retaiend in endoplasmatic reticulum and
insufficient provide HLA-E ligands. Hum. Immunol. 65,
200-2008 (2004)