Protein-Expression der CEA-Adhäsionsmoleküle in benignen und
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Aus der Dermatologischen Klinik des St.-Josef-Hospitals Bochum - Universitätsklinik – der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. Peter Altmeyer Protein-Expression der CEA-Adhäsionsmoleküle in benignen und malignen melanozytären Hautläsionen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Sarah Grothe aus Castrop-Rauxel 2009 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. T. Gambichler Koreferent: Prof. Dr. med. S. Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 02.02.2010 Abstract Grothe, Sarah Protein-Expression der CEA-Adhäsionsmoleküle in benignen und malignen melanozytären Hautläsionen Problem: In der Routinediagnostik des Maligen Melanoms (MM) können Schwierigkeiten bei der Unterscheidung zwischen einem MM und einer benignen melanozytären Läsion auftreten. Eine genauere Differenzierung von melanozytären Läsionen erhöht die Diagnosesicherheit des MM. Die Dysregulation von Zelladhäsionsmolekülen scheint mit der Progression des MM assoziiert zu sein. Es besteht jedoch ein Mangel an systematischen Studien, die sich mit der Expression von Zelladhäsionsmolekülen wie z.B. CEA und CEACAM1 im MM beschäftigt haben. Wir führten daher eine umfangreiche Proteinexpression in immunhistochemische verschiedenen Untersuchung melanozytären zur CEA- Hautveränderungen und durch, CEACAM1um das Expressionsprofil der Zelladhäsionsmoleküle in benignen und malignen Pigmentläsionen zu vergleichen. Methode: Für eine retrospektive Vergleichsstudie wurden in Paraffin eingelegte Gewebeproben von primären superfiziell spreitenden Melanomen (SSM) und benignen melanozytären Hauttumoren untersucht. Dafür wurde mit Hilfe der Antikörper CEACAM1 und monoklonalem CEA eine immunhistochemische Analyse durchgeführt und die Proteinexpression der genannten Antikörper in den untersuchten Hautläsionen semiquantitativ bewertet. Ergebnis: Wir untersuchten 106 Gewebeproben auf ihre CEA- und CEACAM1-Proteinexpression, darunter benigne Naevi (BN, n = 42), dysplastische Naevi (DN, n = 22), SSM mit einer Tumordicke nach Breslow von < 1 mm (n = 21) sowie SSM mit einer Tumordicke von ≥ 1 mm (n = 21). Es konnte demonstriert werden, dass die CEA-Expression der BN im Vergleich zu der der DN und der der SSM deutlich geringer war. Zudem war die CEA-Expression in den SSM ≥ 1 mm wesentlich stärker als in den DN. CEACAM1 wurde in SSM bedeutend stärker exprimiert als in BN und DN. Dabei war zu beobachten, dass die SSM ≥ 1 mm eine wesentlich höhere CEACAM1Expressionsrate aufwiesen als die SSM < 1 mm. Dementsprechend konnte eine signifikante positive Korrelation zwischen der CEACAM1-Expression der SSM und der Tumordicke nach Breslow sowie dem Invasionslevel nach Clark beobachtet werden. Diskussion: Wir bestätigen Ergebnisse kleinerer Studien, die dafür sprechen, dass die Zelladhäsionsmoleküle der CEA-Familie eine Rolle in der Entwicklung und Progression des kutanen MM spielen und möglicherweise zukünftig als prognostische Marker dienen könnten. Die im klinischen Alltag manchmal schwierige Differenzierung des MM und benignen melanozytären Hautläsionen könnte durch den Einsatz der CEACAM1-Immunhistochemie erleichtert werden. Für meine Eltern 1 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Vorwort 3 1.2. Grundlagen 5 1.2.1. Definition des malignen Melanoms 5 1.2.2. Epidemiologie 5 1.2.3. Subtypen, Krankheitsverlauf und Exzisionskriterien 6 1.2.4. Diagnostische Kriterien 10 1.2.5. Metastasierung 15 1.2.6. Therapie 16 1.3. Der melanozytäre Naevus 17 1.3.1. Einteilung und Kriterien der melanozytären Naevi 17 1.3.2. Besonderheiten des dysplastischen Naevus 18 1.3.3. Wertigkeit und Behandlung des melanozytären Naevus 19 1.4. Grundprinzipien der Immunhistochemie 20 1.5. Bedeutung der Immunhistochemie für die MM-Diagnostik 20 2. Fragestellung 26 3. Material und Methoden 28 3.1. Patienten und Gewebeproben 28 3.2. Tumortypen 29 3.3. Herstellung von Paraffinschnitten 29 3.4. Entparaffinierung und Gewebevorbehandlung 30 3.5. Färbung der Gewebeproben 30 3.6. Entwässerung und Vollendung der Gewebeproben 31 3.7. Immunhistochemisches Färben 32 3.7.1. Immunologische Prinzipien 32 2 3.7.2. Bedeutung des Streptavidin-Biotin-Systems 33 3.8. Quantitative Auswertung der histologischen Schnitte 34 3.9. Statistische Analyse 35 4. Ergebnisse 37 4.1. Zusammenfassung der Geweberekrutierung 37 4.2. Tumorlokalisation und Geschlechterverteilung 37 4.3. Expression von CEA und CEACAM1 in gesunder Haut 38 4.4. Benigne Naevi 39 4.5. Dysplastische Naevi 39 4.6. Superfiziell spreitende Melanome < 1 mm 40 4.7. Superfiziell spreitende Melanome ≥ 1mm 40 4.8. Statistische Unterschiede zwischen den Läsionsgruppen 42 4.9. Bildmaterial der immunhistologischen Ergebnisse 47 5. Diskussion 53 5.1. Immunhistologische Diagnostik der MM und deren Vorläuferläsionen 53 5.2. Bedeutung von CEA und CEACAM1 in der Melanomdiagnostik 56 5.3. Weitere aktuell diskutierte Marker 63 5.4. Schlussfolgerungen 65 5.5. Einschränkungen der Arbeit 66 6. Zusammenfassung 67 7. Literaturverzeichnis 69 3 1. Einleitung 1.1. Vorwort Das maligne Melanom (MM) ist ein hochgradig maligner, invasiv wachsender, frühzeitig zur Metastasierung neigender Tumor, der von den melaninbildenden Zellen der Haut und Schleimhäute entspringt. Er manifestiert sich in der Regel im mittleren Lebensalter und tritt bei Frauen häufiger als bei Männern auf. Dabei zeigen die Inzidenz und die Mortalitätsrate besonders der hellhäutigen Population derzeit eine steigende Tendenz in Europa auf (AWMF-Leitlinien-Register, 2007; Ernst et al., 2003). Für die Prognose und die befundbezogene Behandlung jedes einzelnen Patienten spielt die Früherkennung des MM eine bedeutende Rolle. Da jedoch derzeit noch immer ein Mangel an effizienten Methoden zur Früherkennung des MM vorherrscht, kommt es häufig zu lymphogenen und hämatogenen Metastasen, welche die Prognose der Krankheit erheblich verschlechtern. Eine rechtzeitige Detektion dieses bösartigen Tumors einschließlich einer exakten Abgrenzung gegenüber benignen Hautveränderungen könnte daher erheblich zur Verbesserung der Prognose beitragen und den betroffenen Patienten könnte gegebenenfalls früher eine adäquate Therapie zugeführt werden. Daher werden spezielle Biomarker, z.B. CEACAM1, benötigt, die eine sichere Differenzierung zwischen benignen und malignen Hautläsionen erlauben. Diese Biomarker können zusätzlich eine prognostische Relevanz haben (Thies et al., 2002). Die voranschreitende Tumorprogression beim MM geht häufig mit einer Dysregulation von Zelladhäsionsmolekülen einher. Beim Wechsel der 4 horizontalen in die prognostisch schlechtere vertikale Wachstumsphase kann die Expression dieser Zelladhäsionsmoleküle entweder hoch- oder herunter reguliert werden. Ein bekanntes Zelladhäsionsmolekül ist hierbei das E-Cadherin, welches aus der Familie der Integrine stammt. Da viele Zelladhäsionsmoleküle jedoch bevorzugt in der vertikalen Wachstumsphase exprimiert werden, stellen sie keinen prognostisch zuverlässigen Marker bezüglich der Früherkennung von Melanomen dar. Dagegen fiel in diesem Kontext das Interesse in der letzten Zeit immer wieder auf das Zelladhäsionsmolekül CEACAM1, welches sowohl zu den carcinoembryonalen Antigenen (CEA) als auch zur ImmunoglobulinSuperfamilie gehört (Bogoevska et al., 2006). Ziel der vorliegenden retrospektiven Studie war es daher, das Ausmaß der Proteinexpression von CEA und CEACAM1 in superfiziell spreitenden Melanomen (SSM), dysplastischen Naevi (DN) und benignen Naevi (BN) zu untersuchen, um somit festzustellen, inwieweit sich diese Marker eignen, um zwischen unterscheiden zu können. Melanomen und deren Vorläuferläsionen 5 1.2. Grundlagen 1.2.1. Definition des malignen Melanoms Das MM, im Volksmund auch „schwarzer Hautkrebs“ genannt, ist vorwiegend ein Tumor der Haut und Schleimhäute, selten kann es sich jedoch auch am Auge, im Gastrointestinaltrakt und an den Hirnhäuten manifestieren (Markel et al., 2008). Melanome können einerseits spontan auf gesunder Haut entstehen oder aber sich aus einem bereits vorbestehenden Naevus entwickeln. Diese Vorgänge geschehen durch Transformation der Melanozyten, welche die pigmentbildenden Hautzellen darstellen (AWMF-Leilinien-Register, 2007; Ernst et al., 2003). Die Entstehung eines Melanoms ist am gesamten Integument möglich, bei Frauen entsteht der schwarze Hautkrebs allerdings bevorzugt am Unterschenkel, bei Männern hingegen in erster Linie am Rücken (Altmeyer et al., 2006). Er gilt als sehr aggressiver, invasiv wachsender Tumor, der zur frühzeitigen Metastasierung schon bei geringer Tumormasse neigt. Besonders betroffen sind dabei Leber, Lunge, Gehirn oder die Haut selbst. Auch Lymphknotenmetastasen sind häufig sehr früh zu beobachten (Büchels et al., 2000; Kropp et al., 2001). 1.2.2. Epidemiologie Mit 65% stellt das MM die häufigste Todesursache an Hauttumoren weltweit dar (Cummins et al., 2006). Die Inzidenz ist in den letzten 20 Jahren rapide gestiegen (AWMF-Leitlinien-Register, 2007; Blum et al., 2001; Kropp et al., 2001; Markel et al., 2006). Derzeit erkranken in 6 Europa 12.3 bis 14.8 von 100.000 Einwohnern pro Jahr (Altmeyer et al., 2006). Obwohl die Ursachen der Melanomentstehung bisher noch nicht hinreichend erklärt werden konnten, gibt es zahlreiche Risikofaktoren, die das Auftreten Sonnenempfindlichkeit des MM sowie begünstigen erhebliche können. Dazu Sonnenbelastung. zählen UV-Licht scheint eine Initiatorfunktion oder, bei disponierten Menschen, eine Promotorfunktion auszuüben. Besonders beim SSM und beim nodulären Melanom (NM) wird der Grundstein ihrer Entwicklung durch intensive UV-Belastung in der Kindheit und Adoleszenz gelegt (Garbe, 1995). Weitere Risikofaktoren für die Entstehung eines MM sind eine hohe Anzahl an melanozytären Naevi (> 50) oder Lentigines sowie atypische melanozytäre Naevi, ein vorausgegangenes Melanom, Immunsuppression und familiäre Vorbelastung. Dabei ist besonders die hellhäutige Bevölkerung betroffen (Marks et al., 1995). Statistisch gesehen ist derzeit einer von 35 Kaukasiern von einem MM betroffen, und die Tendenz steigt weiter an (Thies et al., 2002). Durchschnittlich tritt das MM im Alter von 50 bis 55 Jahren auf, wobei Frauen häufiger als Männer betroffen sind (1.5:1 bis 2.1:1) (Altmeyer et al., 2006; Ernst et al., 2003; Hohenberger et al., 1996). 1.2.3. Subtypen, Krankheitsverlauf und Exzisionskriterien Aufgrund klinischer und histologischer Kriterien werden 5 Melanomtypen der Haut unterschieden: Das superfiziell spreitende Melanom (SSM), das noduläre Melanom (NM), das Lentigo-maligna-Melanom (LMM), das akrolentiginöse Melanom (ALM) und das unklassifizierbare MM. Sie grenzen sich untereinander ab durch ihren Krankheitsverlauf, ihre Invasivität und ihre Häufigkeit. 7 SSM Das SSM ist mit ca. 57 % aller MM der häufigste der 5 Grundtypen (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Es ist durch ein primär horizontales Wachstum gekennzeichnet. Im fortgeschrittenen Stadium kann es dann auch zu einem vertikalen, invasiven Wachstum kommen. Das klinische Bild zeigt rundliche, scharf begrenzte, meist bräunliche oder schwarze, zunächst flache Herde mit leicht erhabenem Rand. Später ist die Ausbildung von infiltrierenden Papeln oder Knötchen möglich (Altmeyer et al., 2006; AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Aufgrund der Häufigkeit des SSM wurde der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf diesen Melanomgrundtyp gelegt. NM Im Unterschied zum SSM zeichnet sich das NM durch vertikales Wachstum aus. Es stellt mit 21 % aller MM die knotige Form derselben dar und imponiert meist als primär knotiger, exophytischer, überwiegend schwarzbrauner, häufig erosiv-blutiger Tumor mit kurzer initialer horizontaler Wachstumsphase (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Durch das rasante Wachstum fehlt häufig die Möglichkeit zur Frühdiagnose, die Prognose ist folglich schlecht (Altmeyer et al., 2006). LMM Das LMM entwickelt sich auf dem Boden einer Lentigo maligna. Sein Anteil beträgt knapp 9 % aller MM (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Die schwärzlichen, leicht infiltrierenden Hautveränderungen und Knötchen sind vor allem am Unterschenkel und im Gesicht bei älteren Menschen lokalisiert (Altmeyer et al., 2006). Infolge der späten Metastasierung ist die Prognose des LMM günstiger als bei den anderen Melanomformen (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). 8 ALM Das ALM stellt mit 4 % die seltenste Melanomform dar (Altmeyer et al., 2006; AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Es entwickelt sich primär an den Handinnenflächen und Fußsohlen, oder aber auch an den Phalangen. Das klinische Bild zeigt braune bis schwarze, fleckige Hautveränderungen, die sich zu weichen, schwärzlichen Knoten mit oberflächlichen Erosionen und Ulzerationen entwickeln. Die akrolentiginöse Form tendiert zu einem superfiziellen Wachstum. Oft wird diese Melanomuntergruppe spät diagnostiziert und somit erst in einem fortgeschrittenen Stadium operativ behandelt, was die Prognose erheblich verschlechtert (Altmeyer et al., 2006; AWMF-Leitlinien- Register, 2007). Derzeit werden etwa 90 % aller MM als Primärtumor ohne erkennbare Metastasen diagnostiziert (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Diese Zahl wirkt auf den ersten Blick sehr zufriedenstellend. Wenn man jedoch die steigende Inzidenz dieses Tumors und seine extrem hohe Aggressivität beachtet, werden die häufig drastischen Folgen für die restlichen 10% der Patienten erst deutlich. Daher ist eine gezielte Diagnostik und Therapie erforderlich. Zur präoperativen Untersuchung gehört neben einer gründlichen Anamnese die Untersuchung des gesamten Körpers zur Abgrenzung weiterer Läsionen. Hier werden die klinischen Kriterien der Melanomdiagnostik eingesetzt, wie zum Beispiel die ABCDE-Regel, wobei das A für Asymmetrie, das B für die Begrenzung, das C für die Farbe, das D für den Durchmesser und das E für die Erhabenheit des Melanoms steht (Altmeyer et al., 2006). Diese Kriterien können bereits Hinweise auf eine maligne Entartung geben. Weiterhin spielen die Auflichtmikroskopie wichtige Rolle sonographische zur Diagnosefindung sowie die Sonographie eine bei der Untersuchung Vermessung des von Tumors Melanompatienten. Die liefert dabei für das 9 stadiengerechte operative Vorgehen wichtige präoperative Zusatzinformationen (Gambichler et al., 2007). Bei gesichertem Einhaltung Primärtumor standardisierter gilt die Exzision Sicherheitsabstände, der Läsion welche unter auf die Tumordicke und die Histologie des Melanoms abgestimmt sind, als Methode der Wahl. (Altmeyer et al., 2006; AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Handelt es sich bei der Läsion um ein Melanoma in situ (Clark Level I), ist ein Sicherheitsabstand von 0.5 cm ausreichend. Beim Melanom mit einer Dicke von unter 2 mm beläuft sich der Sicherheitsabstand auf 1 cm, wobei bei einer Melanomdicke von über 2 mm ein Sicherheitsabstand von 2 cm angestrebt wird (Altmeyer et al., 2006). Nach bisherigen Kenntnissen scheint ein zu gering gewählter Sicherheitsabstand das Risiko von Lokalrezidiven zu erhöhen (AWMFLeitlinien-Register, 2007). Bei allen MM, die dicker als 1 mm sind, wird außerdem eine Entfernung des Schildwächter-Lymphknotens empfohlen. Auch eine nur verdächtige Hautläsion wird heute primär vollständig exzidiert, da bei Probeexzisionen häufig nicht die maximale Tumordicke bestimmt wird. Danach erfolgt die histologische Aufarbeitung des Gewebes, auf welche im Folgenden histologische Nachresektion noch ausführlicher Aufarbeitung mit die eingegangen Diagnose entsprechendem eines wird. MM, Sicherheitsabstand, Ergibt erfolgt wobei die eine die Nachresektion einen zeitlichen Abstand von 4 Wochen zur primären Resektion nicht überschreiten sollte (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Bei früher Erkennung und stadiengerechter Behandlung des MM liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei 95% (Cummins et al., 2006). 10 1.2.4. Diagnostische Kriterien Nach der Exzision erfolgt die histologisch-pathologische Aufarbeitung des entnommenen Gewebes mit Hilfe der Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung). Auch immunhistologische Untersuchungen werden durchgeführt, wobei S-100 und HMB-45, zwei Melanom-assoziierte Antigene, eine wichtige Rolle spielen (Altmeyer et al, 2006; Büchels et al., 1998; Gutzmer et al., 2002; Kropp et al., 2001; Markel et al., 2002). Insbesondere S-100 dient heute zur Basis- und Verlaufskontrolle bei highrisk- und metastasierten Melanomen. Ebenso wird es zur Therapiekontrolle nach operativer Metastasenentfernung oder unter laufender Chemo- und / oder Immuntherapie bestimmt. Auch die Marker Ki-67 und MART-1 finden für die Melanomdiagnostik routinemäßig Anwendung. Sie dienen als Proliferations- bzw. als Differenzierungsmarker (Bioley et al., 2006; Chorny et al., 2003; Trefzer, 2006). Die histologische Aufarbeitung ermöglicht die Einteilung des Primärtumors in verschiedene Klassifikationen und richtet sich dabei nicht nach klinischen Kriterien. Die Begutachtung melanozytärer Tumoren repräsentiert einen der wichtigsten und vordringlichsten Aspekte der Routinediagnostik in der Dermatohistopathologie. Als wichtigste prognostische Faktoren gelten dabei die maximale Tumordicke nach Breslow (Tabelle 1) und die Tumoreindringtiefe des MM nach Clark (Tabelle 2) (Altmeyer et al., 2006; AWMF-Leitlinien-Register, 2007). 11 Tabelle 1: Tumordicke des Primärtumors nach Breslow pT1 Tumordicke < 0.75 mm pT2 Tumordicke 0.76 mm – 1.5 mm pT3 Tumordicke 1.51 mm – 4.0 mm pT4 Tumordicke > 4.0 mm pT4a Satelliten-Metastasen innerhalb von 2 cm vom Primärtumor pT4b In-Transit-Metastasen vor der regionären Lymphknotenstation Tabelle 2: Tumoreindringtiefe nach Clark I Tumorzellen streng intraepidermal, Basalmembran nicht durchbrochen (Melanoma in situ) II Tumorzellen dringen ins Stratum papillare ein, Basalmembran durchbrochen III Tumorzellen füllen das Stratum papillare aus / erreichen die Grenze zum Stratum reticulare IV Tumorzellen durchsetzen das Stratum reticulare, Grenze zur Subkutis ist nicht überschritten V Tumorzellen innerhalb der Subkutis Für die korrekte Diagnosestellung eines MM sind zusätzlich weitere reproduzierbare und einheitliche histologische Kriterien zu fordern. Die prognostisch relevanten und für das therapeutische Vorgehen wichtigen Tumorparameter müssen bei MM im histopathologischen Befundbericht vollständig und einheitlich erfasst werden (Tronnier et al., 1997). Um für diese Erfassung der Tumorparameter ein weltweit einheitliches Klassifikationssystem zu schaffen, wurde 1987 zwischen dem American Joint Committee on Cancer (AJCC) und der Union International Contre le Cancer (UICC) eine abgestimmte TNM-Stadieneinteilung entwickelt. 12 Diese Stadieneinteilung wurde 1997 noch einmal neu überarbeitet (Tabelle 3). Tabelle 3: Klinische Stadieneinteilung nach der UICC Stadium T- N- M- Klassifikation Klassifikation Klassifikation Ia pT1 N0 M0 Ib pT2 N0 M0 IIa pT3 N0 M0 IIb pT4 N0 M0 IIIa pTa*, pTb** N0 M0 IIIb jedes pT N1, N2 M0 IV jedes pT jedes N M1a, M1b pT: Primärtumor, siehe Tabelle N = Regionäre Lymphknotenmetastasen (N0: keine, N1: Metastase(n) 3 cm oder weniger in größter Ausdehnung in irgendeinem Lymphknoten, N2: Metastase(n) mehr als 3 cm in größter Ausdehnung in irgendeinem regionären Lymphknoten und / oder In-Transit-Metastasen) M = Fernmetastasen (M0: keine, M1a: Befall von Haut, Subkutis oder ferne Lymphknoten, M1b: viszerale Metastasen) * = Satelliten-Metastasen innerhalb von 2 cm vom Primärtumor (bzw. Lokalrezidiv nach Entfernung mit Sicherheitsabstand) ** = In-Transit-Metastasen vor der regionären Lymphknotenstation Weiterhin gibt es seit 2002 ein neu überarbeitetes Staging-System der AJCC, welches unter Berücksichtigung aktuellerer Erkenntnisse und wichtiger Prognosefaktoren erstellt wurde (siehe Tabellen 4 und 5). 13 Tabelle 4: TNM-Klassifikation nach AJCC 2002 T-Klassifikation Tis Primärtumordicke < oder = 1 mm Ulzerationsstatus a: ohne Ulzeration und Clark II/III b: mit Ulzeration oder Clark IV/V T2 1.01 – 2.0 mm a: ohne Ulzeration b: mit Ulzeration T3 2.01 – 4.0 mm a: ohne Ulzeration b: mit Ulzeration T4 > 4.0 mm a: ohne Ulzeration b: mit Ulzeration N-Klassifikation Zahl der befallenen LK Ausmaß der LKMetastasierung N1 1 a: Mikrometastasierung b: Makrometastasierung N2 2-3 a: Mikrometastasierung b: Makrometastasierung c: Satelliten- TransitN3 >4 o. Metastasen Satelliten- o. In-TransitMetastasen M-Klassifikation Ort der Serum-LDH Fernmetastasierung M1a Haut, Subkutangewebe normal o. Lymphknoten M1b Lunge M1c alle In- Viszeralorgane, Fernmetastase normal anderen normal bzw. erhöht jede 14 Tabelle 5: Klinische Stadieneinteilung des Melanoms nach AJCC 2002 Stadium T- N- M- Klassifikation Klassifikation Klassifikation 0 Tis N0 M0 IA T1a N0 M0 IB T1b bis T2a N0 M0 IIA T2b bis T3a N0 M0 IIB T3b bis T4a N0 M0 IIC T4a N0 M0 IIIA T1 bis T4a N1a oder N2a M0 IIIB T1 bis T4a N1b oder N2b M0 T1 bis T4b N2a M0 T1 bis T4a/b N2c M0 T1 bis T4b N1b oder N1c M0 jedes T N3 M0 jedes T jedes N M1a-M1c IIIC IV Tis = In situ Tumoren T = Primärtumor (Einteilung siehe Tabelle 4) N = Regionäre Lymphknotenmetastasen (N0 = keine, N1a = 1 Mikrometastase, N2a = 2 - 3 Mikrometastasen, N1b = 1 Makrometastase, N2b = 2 - 3 Makrometastasen, N3 = 4 Mikro- / Makrometastasen) M = Fernmetastasen (M0 = keine, M1a = Metastasen in Haut und / oder Subkutis, M1b = Lungenmetastasen, M1c = andere viszerale Metastasen) Die wichtigsten prognostischen Faktoren beim primären MM sind dabei die Tumordicke nach Breslow, das Invasionslevel nach Clark, der klinisch histologische Subtyp (die Prognose beim NM und ALM ist schlechter als bei den anderen Melanomsubtypen), das Geschlecht (schlechtere Prognose bei Männern), die anatomische Lokalisation (Prognose für oberen Stamm, Oberarme, Hals und behaarten Kopf ungünstiger) und das Vorhandensein von Ulzerationen (Altmeyer et al., 2006; AWMF 15 Leitlinien-Register, 2007). Die Patienten werden bezüglich des Metastasierungsrisikos in zwei Gruppen eingeteilt, wobei die Tumordicke nach Breslow eine wichtige Rolle spielt. Beträgt sie weniger als 1 mm und liegen keine Ulzerationen vor, spricht man vom Low-risk-Typ. Bei einer Tumordicke von über 1 mm oder der Anwesenheit von Ulzerationen handelt es sich dagegen um einen High-risk-Typ (Gutzmer et al., 2002). 1.2.5. Metastasierung Das MM hat eine starke Tendenz zur Metastasierung. Meist sind es die frühen Metastasen, die das Überleben der Patienten begrenzen. Etwa 2/3 aller Erstmetastasierungen Lymphabflussgebiet sind begrenzt. zunächst Am auf häufigsten das regionäre dabei sind Hautmetastasen. Hierbei handelt es sich um satellitenartig um den Primärtumor Primärtumor liegende und (Satellitenmetastasen) regionalen Lymphknoten oder zwischen (In-Transit-Metastasen) angeordnete, pigmentierte und unpigmentierte Geschwülste (Altmeyer et al., 2006). Das MM metastasiert weiterhin sehr häufig in die Lymphknoten. Lymphknotenmetastasen stellen sich als harte, indolente, später verbackene, im Lymphknoten dar Lymphabstromgebiet liegende (regionäre) (Altmeyer et al., 2006). Die Lymphabstromszintigraphie dient dem Nachweis des Sentinel Lymph Node (SLN), also dem ersten im regionalen Abfluss des Melanoms liegenden Lymphknoten. Ein weiterer Metastasierungsweg erfolgt hämatogen. Die hämatogene Metastasierung tritt meist erst zu einem späteren Zeitpunkt auf. Sie erfolgt vor allem in die Lungen, die Leber, das Gehirn, die Haut oder die Knochen und verschlechtert die Prognose des betroffenen Patienten erheblich (Altmeyer et al., 2006). 16 1.2.6. Therapie Die Therapie der Wahl besteht zunächst wie oben bereits genannt in der lokalen Exzision des Primärtumors mit entsprechendem Sicherheitsabstand, gleiches gilt für Hautmetastasen, Lokalrezidive und Melanom-verdächtige Läsionen (Altmeyer et al., 2006). Bei regionären Lymphknotenmetastasen wird eine radikale Lymphadenektomie empfohlen (Altmeyer et al., 2006; AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Bei isolierten oder limitierten Fernmetastasen ist bei singulärem Auftreten, vertretbarem Operationsrisiko und möglich erscheinender R0Resektion eine Operation sinnvoll, bei disseminierter Organmetastasierung hingegen nicht (Altmeyer et al., 2006). Beim Auftreten von Fernmetastasen ist die Prognose infaust, hier beträgt die mediane Überlebensrate ohne Behandlung 4-6 Monate (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). In diesem Fall wie auch im Falle inoperabler Rezidivtumoren oder inoperabler regionärer Metastasen gilt die palliative Monochemotherapie mit dem aus der Gruppe der Alkylantien stammenden Zytostatikum Dacarbazin mit einer Ansprechrate von 5.3 bis 23 % als Standard (Altmeyer et al., 2006; ESMO Guidelines Working Gruop, 2007). Aber auch neuere Substanzen wie Vinka-Alkaloide, Platinanaloga, Texane oder einige Biomodulatoren stehen für die Chemotherapie zur Verfügung. Ihre Wirksamkeit ist mit der des Dacarbazins vergleichbar. Auch eine kombinierte Chemoimmuntherapie mit Hinzunahme von Interleukin-2 zu oben genannten Substanzen ist möglich (Altmeyer et al., 2006). Bei symptomatischen Knochen- und Gehirnmetastasen wird hingegen eine palliative Strahlentherapie empfohlen (Altmeyer et al., 2006). Die Tumornachsorge spielt beim MM eine wichtige Rolle. Sie orientiert sich an den initialen Tumorparametern bzw. dem Tumorstadium (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Da in den ersten 5 17 postoperativen Jahren 90 % der Metastasen auftreten, ist die Nachsorge intensiv zu gestalten. Sie wird über 10 Jahre hinweg empfohlen, da Spätmetastasen nicht ungewöhnlich sind (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Folgende Ziele werden mit Nachsorgeuntersuchungen verbunden: 1. Feststellung der Tumorfreiheit bzw. Früherkennung einer Progression 2. Überwachung des Pigmentsystems zur Früherkennung von Melanomvorläufern und Zweitmelanomen 3. Psychosoziale Betreuung 4. Dokumentation der Krankheitsverläufe 5. Durchführung und Überwachung einer adjuvanten Therapie 1.3. Der melanozytäre Naevus 1.3.1. Einteilung und Kriterien der melanozytären Naevi Der melanozytäre Naevus ist ein gutartiger angeborener oder erworbener Hauttumor, der von den Melanozyten ausgeht und meist in der Mehrzahl auftritt (Altmeyer et al., 2006). Die Prävalenz ist abhängig von Alter, ethnischer Umweltfaktoren. Klinisch bzw. und genetischer histologisch Prädisposition lassen sich 3 und Typen melanozytärer Naevi unterscheiden: 1. Junktionsnaevus: lokalisiert in der Epidermis, fleckförmige, plaqueartige, braun gefärbte Läsion 18 2. Compoundnaevus: lokalisiert in Epidermis und Dermis, unterschiedlich erhabene und im Allgemeinen hellere Läsion als der junktionale Naevus 3. dermaler Naevus: ausschließlich in der Dermis lokalisiert, meist erhabenes, auch papillomatöses und deutlich helleres Gebilde als der Compoundnaevus. 1.3.2. Besonderheiten des DN Als weitere Form kann der DN aufgeführt werden. Die Entstehung des DN basiert auf einer Vermehrung atypischer Zellen mit unregelmäßigem Aussehen. Die klinischen Kriterien der Atypie bei melanozytären Naevi zeigen hierbei Überschneidungen mit der ABCDE-Regel für die Kriterien des frühen MM (Hauschild et al., 2005). Sie haben mehr Farbtöne als ein gutartiger melanozytärer Naevus, sie reichen von hell- bis dunkelbraun, und sind unregelmäßig eingefärbt. Die Begrenzung solcher dysplastischer Hautveränderungen kann scharf sein, meist handelt es sich jedoch um unscharfe ausgefranste Ränder. Im Gegensatz zum asymmetrisch aufgebauten MM ist beim DN der Aufbau der Läsion meist noch symmetrisch (Hauschild et al., 2005). DN sind oft größer als 5 mm im Durchmesser und können in geringem Ausmaße erhabene Anteile aufweisen, die sich bevorzugt im Zentrum der Läsion befinden. Weiterhin Nestbildung zeigen sich im Bereich Durchwanderung von histologisch der häufig Junktionszone Einzelzellelementen oder eine unregelmäßige sowie Nestern beginnende durch die Epidermis und lamelläre oder konzentrische Fibroplasie. Außerdem sind auch Kernpolymorphien und Verschiebungen der Kern-Plasma-Relation histologisch zu beobachten (Hauschild et al., 2005). Der DN gilt als Vorläufer und sogar auch als Marker des SSM. (Crowson et al., 2002; 19 Skender-Kalenas et al., 1995). Die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung eines primären MM steigt bei Patienten mit DN von 0.8 % auf 18 % an (Ernst et al., 2003). 1.3.3. Wertigkeit und Behandlung des melanozytären Naevus Unauffällige Naevi sind nicht behandlungsbedürftig. Auffällige Naevi, bei denen eine erhöhte Gefahr für die Entwicklung eines MM besteht, sollten exzidiert oder festgehalten ihre und Größe per regelmäßig Fotodokumentation kontrolliert werden. und Maßstab Patienten mit erhöhtem Risiko sollten die Sonne meiden (Altmeyer et al., 2006). Klinische Zeichen für Malignität sind dabei neben den Faktoren der ABCDE-Regel auch Haarverlust bei zuvor bestehender Behaarung, pigmentiertem Hof um entzündliche Reaktionen einen wie leicht erhabenen Juckreiz, Naevus sowie Erosionen und Oberflächenblutungen (Altmeyer et al., 2006). Bei Geburt sind wenige melanozytäre Naevi vorhanden, in den ersten 3 Lebensdekaden kommt es dann zu einem Anstieg des Auftretens und im zunehmenden Alter zur Rückentwicklung (Altmeyer et al., 2006). Umweltfaktoren wie Sonnenexposition beeinflussen deutlich die Entwicklung melanozytärer Naevi (Altmeyer et al., 2006). Dabei haben hellhäutige Menschen eine größere Naevianzahl als Angehörige dunkel pigmentierter Rassen. Die Gesamtzahl der melanozytären Naevi und das Vorhandensein DN sind signifikante Risikofaktoren für die Entstehung eines MM (Altmeyer et al., 2006; Crowson et al., 2002; Skender-Kalenas et al., 1995). Bei großen kongenitalen pigmentierten, behaarten Naevi erfolgt bei 10 - 25 % der Patienten eine Entwicklung des Naevus zum MM. Dies kann zum Teil sogar schon in der Kindheit geschehen (Altmeyer et al., 2006). 20 1.4. Grundprinzipien der Immunhistochemie Die Anwendung immunhistochemischer Techniken stellt einen erheblichen Fortschritt in der histologischen Diagnostik zur genauen differentialdiagnostischen Abgrenzung des MM dar. Sie beruht auf Antikörper-Reaktionen und wird an formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe durchgeführt (Ernst et al., 2003). Die Immunhistochemie ermöglicht die Lokalisation von Proteinen, wie z.B. Antigenen, im Gewebeschnitt. Diese können nach erfolgter AntigenAntikörper-Reaktion durch eine Farbreaktion nachgewiesen und lichtmikroskopisch betrachtet werden (Orchard et al., 1994). Für eine genaue Diagnosestellung sollte die Immunhistochemie immer in Zusammenhang mit der Routinehistologie bewertet werden und stets mit einer Kontrollfärbung einhergehen (Selby et al., 1992). Die vorliegende Arbeit basiert im Wesentlichen auf den Prinzipien der Immunhistochemie. 1.5. Bedeutung der Immunhistochemie für die MM-Diagnostik Wie andere Zellen tragen auch Melanomzellen verschiedene spezifische Oberflächenantigene. Gewöhnlich erfolgt die Diagnose der primären Melanome und auch der Melanommetastasen durch den Dermatohistopathologen. Um MM jedoch definitiv diagnostizieren oder auszuschließen zu können, ist die Anwendung immunhistologischer Färbungen erforderlich. Dies hängt damit zusammen, dass MM in ihrer Erscheinung sehr variabel oder auch undifferenziert sein können und somit von anderen malignen Tumoren schwer zu unterscheiden sind. Die zu diesem Zweck meist genutzten Antikörper sind HMB-45, anti-S100, MART-1 und Ki-67. 21 HMB-45 HMB-45 ist ein in der immunhistochemischen Diagnostik gebräuchlicher monoklonaler Antikörper, der sowohl primäre MM, Melanommetastasen als auch zytoplasmatische Prämelanosomen durch Bindung an ein Glykoprotein (gp100) identifizieren kann. Weiterhin gilt HMB-45 als spezifisch für junktionale melanozytäre Naevi und fetale Melanozyten. Der Antikörper hat jedoch eine Sensitivität von nur 67-93 % und führt daher besonders in der Diagnostik von Melanommetastasen häufig zu falsch negativen Ergebnissen (Trefzer et al., 2000). Dort wurde in vorherigen Studien gezeigt, dass sich bei immunhistochemischer Diagnostik mit Hilfe des Antikörpers HMB-45 nur 82-83 % aller Melanommetastasen anfärbten (Selby et al., 1992; Trefzer et al., 2000). HMB-45 scheint sich dem Antikörper zu entziehen, weshalb er für die Diagnostik von Melanommetastasen als Antikörper allein nicht ausreichend ist. Anti-S100 Das kalziumbindende S100-Protein befindet sich meist im Zytoplasma der Zelle (Keijser et al., 2006). Es wird durch den Antikörper Anti-S100 erkannt. Dieser ist sehr sensitiv bei MM, jedoch nicht melanomspezifisch (Selby et al., 1992). In vorherigen Untersuchungen zeigte sich, dass Anti-S100 in 21 von 84 nichtmelanozytären Neoplasmen anfärbbar war (Trefzer et al., 2000). Der Antikörper markiert also nicht nur MM und deren Metastasen, sondern auch sämtliche S100-Isoformen, welche sich zusätzlich in benignen Zellen, bevorzugt Astrozyten, Schwannzellen und Oligodendrozyten, befinden bzw. in aus diesen Zellen bestehenden Tumoren (Keijser et al., 2006; Thies et al., 2007). Weiterhin wird er in Antigen-präsentierenden Zellen wie den Langerhanszellen der Haut und Makrophagen exprimiert sowie im Parakortex von Lymphknoten (Thies et al., 2007) Der Wert dieses monoklonalen Antikörpers ist jedoch 22 begrenzt, da es ihm trotz seiner mit 96 % hohen Sensitivität von allem an Spezifität mangelt (Trefzer et al., 2000). Dennoch gehört die S-100Bestimmung routinemäßig zur Verlaufskontrolle bei High-risk- Melanomen. Ki-67 Das Antigen Ki-67, das durch den Antikörper MIB-1 erkannt wird, wird von proliferierenden Zellen exprimiert, d.h. die Expression von Ki-67 findet während des Zellzyklus in der G1-, der S-, der G2- und in der MPhase statt. Zellen, die sich in der G0-Phase befinden, exprimieren das Antigen nicht (Hazan et al., 2002). Somit können proliferierende Zellen von ruhenden Zellen unterschieden werden (Böni et al., 1996; Laprie et al., 2001; Ramsay immunhistochemischen et al., 1995). Melanomdiagnostik Ki-67 wird verwendet, in der um die Wachstumsfraktion und -geschwindigkeit bzw. die Mitoserate innerhalb einer Zellpopulation zu bestimmen. Dieser Vorgang dient unter anderem der Beurteilung der Dignität von Tumoren und kann in einigen Fällen dazu beitragen, eine nachfolgende Metastasenentstehung frühzeitig zu entdecken (Böni et al., 1996). MART-1 MART-1, auch bekannt als Melan A, ist ein Differenzierungsantigen der Melanozyten, das aus 118 Aminosäureestern zusammengesetzt ist. Es kommt sowohl in Melanozyten der normalen Haut und der Netzhaut als auch in melanozytären Naevi und Melanomen vor (Bioley et al., 2006). Es wird von CD8-positiven Zellen erkannt und ist derzeit Thema in mehreren immuntherapeutischen Studien (Bioley et al., 2006; Sörensen et al., 2008; Zarour et al., 2000). MART-1 weist bezüglich des MM eine relativ gute Spezifität auf, während jedoch die Sensitivität im Gegensatz zu Markern wie dem S-100-Protein eher gering ausfällt und es an 23 prognostischer Aussagekraft mangelt (Ohsie et al., 2008). In dieser Arbeit liegt das Hauptaugenmerk auf der Expression von CEA und CEACAM1 in primären MM. Diese Marker werden im Folgenden vorgestellt. CEA Das carcinoembryonale Antigen ist ein Mitglied einer relativ großen Familie eng verwandter Makromoleküle, welche in der Immunologie als potentielle Kreuzreaktoren gelten (Ghosh et al., 1987). Es handelt sich um stark glykosylierte Proteine aus der Immunoglobulin-Superfamilie mit einer molekularen Masse von ungefähr 200 kDa. Die CEA-Proteine werden kodiert von 29 Genen, die sich alle hintereinander auf dem Chromosom 19 (19q13.2) befinden. Alle CEA-Gene werden in 2 Hauptsubtypen unterteilt, Adhäsionsmoleküle dazu (CEACAM) gehören und die die Gruppe der CEA- schwangerschaftsspezifische Glykoprotein-Subgruppe. CEA stellt einen klinisch äußerst wichtigen Tumormarker für eine Reihe von malignen Tumoren, insbesondere für das Kolon-, das Mamma- und das Pankreaskarzinom sowie für das Adenokarzinom der Lunge dar (Pavoni et al., 2006; Sheahan et al., 1990; Zoubir et al., 1990). In Gewebeschnitten eines physiologischen Kolons zeigte sich, dass CEA sich hauptsächlich an der apikalen Grenze der Epithelzellen befindet, während in Gewebeschnitten des Kolonkarzinoms der Marker hauptsächlich an der apikalen Grenze von glandulären Strukturen lokalisiert ist und somit leicht ins Blut abgegeben werden kann. Weiterhin bauen Zellen, die CEA bilden, Glykoproteinmoleküle in ihre Zellwand ein und können dadurch ebenfalls nachgewiesen werden. Die Serumkonzentration des Tumormarkers korreliert teilweise mit der Gesamttumormasse, wobei sich bei Rauchern häufig falsch-negative Werte finden. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Abkömmlinge der CEA-Familie auch in melanozytären 24 Naevi stark exprimiert werden, und dass die Anfärbung von polyklonalem CEA in MM und deren Metastasen nicht selten ist und sich aus CEA-verwandten Molekülen zu ergeben scheint (Ben-Izhak et al., 1994; Egawa et al., 2000; Selby et al., 1992). CEACAM1 CEACAM1 ist ein Mitglied der carcinoembryonalen Familie und gehört damit ebenso zur Immunoglobulin-Superfamilie (Ebrahimnejad et al., 2004; Markel et al., 2008; Thies et al., 2007). Es ist auch bekannt als biliäres Glykoprotein I oder als CD66a. CEACAM1 ist ein interzelluläres, multifunktionelles, signalregulatorisches Zelladhäsionsmolekül, welches in eine Reihe von physiologischen Prozessen verwickelt ist und mit einigen anderen Molekülen interagiert (Beauchemin et al., 1997; Markel et al., 2004; Thies et al., 2007). Neuere Studien zeigen, dass dabei besonders die Interaktion von CEACAM1 mit CEACAM5 und Integrin-β von großer Bedeutung für die interzelluläre Signaltransduktion ist (Brümmer et al., 2001; Markel et al., 2004). CEACAM1 ist bekannt als Tumorsuppressor in epithelialem Gewebe, als potenter angiogenetischer Faktor in Kapillargefäßen und als mikrobieller Rezeptor in humanen Granulozyten und Epithelzellen und scheint auch bei der Insulin-Clearance eine Rolle zu spielen (Brümmer et al., 2001; Markel et al., 2008; Markel et al., 2006). Es kann unter physiologischen Bedingungen sowohl auf der Oberfläche von einigen Immunzellen als auch auf Epithelzellen, Endothelien sowie auf hämatopoetischen Zellen exprimiert werden (Markel et al., 2004; Markel et al., 2008). Während CEACAM1 beim Kolorektal-, Prostata-, Brust-, Leber- und Endometriumkarzinom herunterreguliert wird, wird es beim MM und auch beim Adenokarzinom der Lunge hochreguliert (Brümmer et al., 2001; Thies et al., 2007). 25 In vorherigen Studien wurde CEACAM1 bereits thematisiert und unter anderem als unabhängiger Faktor für das Metastasenrisiko beim MM mit einem höheren prädiktiven Wert als dem der Breslow-Tumordicke betitelt (Ebrahimnejad et al., 2004; Thies et al., 2002). Weiterhin scheint die steigende CEACAM1-Expression in primären MM mit der nachfolgenden Metastasierung signifikant assoziiert zu sein (Markel et al., 2004; Thies et al., 2007; Thies et al., 2002). Dabei scheint die Expression dieses Moleküls an der invasiven Front der MM am stärksten zu sein (Thies et al., 2002). Die CEACAM1-Expression erhöht so die Zellinvasion und –migration (Ebrahimnejad et al., 2004). Ein weiterer CEACAM1-spezifischer Aspekt ist die Tatsache, dass die Anwesenheit dieses Adhäsionsmoleküls die Prognose des MM deutlich verschlechtert, da Melanomzellen in der Lage sind, ihre CEACAM1Expression zu erhöhen, was ihnen zu einer verstärkten Resistenz gegenüber natürlichen Lymphozyten durch Killerzellen Blockade wie ihrer den tumorinfiltrierenden Effektorfunktionen verhilft (Ebrahimnejad et al., 2004; Markel et al., 2004; Markel et al., 2006). Durch diesen Mechanismus können die Melanomzellen der Zerstörung im Rahmen der Tumorlyse durch tumorreaktive Lymphozyten entkommen (Markel et al., 2006). Aufgrund dieser Kenntnisse scheint CEACAM1 von erheblicher Bedeutung für Diagnose, prognostische Bestimmung und therapeutische Ansätze bezüglich des MM und somit ein potentielles Ziel für antimetastatische Tumortherapie in der Zukunft zu sein. 26 2. Fragestellung In der heutigen immunhistochemischen Melanomdiagnostik werden routinemäßig die Antikörper Anti-S100, HMB-45, MART-1 und Ki-67 untersucht, um das MM sicher erkennen zu können. Häufig kann dieser bösartige Hauttumor jedoch nur schwer von benignen melanozytären Hautläsionen differenziert werden, was durch seine ausgeprägte Aggressivität mit schweren Folgen für den betroffenen Patienten einhergehen kann. Dies liegt unter anderem daran, dass die oben genannten Antikörper Defizite hinsichtlich ihrer Spezifität und ihrer Sensitivität aufweisen. Insbesondere die Grenzen zwischen benignen, dysplastischen und malignen melanozytären Hautläsionen sind sehr schwierig auszumachen. Daher wäre es für die Melanomdiagnostik eine große Bereicherung, wenn ein ausschließlich für Melanomzellen spezifischer Antikörper zur Verfügung stünde, durch dessen Anfärbungsrate man auf den Progress der Melanomentstehung schließen könnte. In Vorarbeiten ist es gelungen, den Antikörper CEACAM1 zu isolieren, welcher im Gegensatz zu vielen anderen Tumoren in Melanomen scheinbar hochreguliert wird und im Falle des Vorhandenseins eine nachfolgende Metastasierung des MM anzeigen und somit Angaben über die Prognose der Erkrankung machen kann. Vor diesem Hintergrund soll die Expression von CEACAM1 und CEA bei verschiedenen melanozytären Tumoren untersucht und charakterisiert werden, wobei insbesondere die Frage im Vordergrund steht, ob diese Marker zur Abgrenzung von benignen und malignen melanozytären Hautläsionen geeignet sind. Zur Analyse der Expression der CEA- und CEACAM1-Proteine wurden gutartige melanozytäre Läsionen, DN sowie MM untersucht. Im Rahmen 27 der immunhistochemischen Analyse der Antikörper CEA und CEACAM1 sollten folgende Fragen beantwortet werden: 1. Wie sieht die Immunreaktivität von CEA und CEACAM1 aus? Ist sie spezifisch für das SSM oder ist sie auch in BN und DN zu finden? 2. Kann man von der jeweiligen Färbeintensität des Antikörpers auf den Tumorprogress schließen? 3. In welchem Bereich des Tumors besteht die intensivste Färbeintensität? 4. Gibt es Gemeinsamkeiten bzw. Unterschiede zwischen den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit und denen vorheriger Studien? 28 3. Material und Methoden 3.1. Patienten und Gewebeproben Die Datenbank der Dermatologischen Klinik der Ruhr-Universität Bochum wurde nach melanozytären Naevi und MM durchsucht. Die in dieser Arbeit verwendeten Gewebeproben wurden zwischen 2002 und 2008 entnommen. Zu den Patienten, denen die Proben entnommen wurden, zählten 57 Frauen und 49 Männer, die alle zwischen 16 und 82 Jahren alt waren. Die Gewebeproben wurden jeweils nach der operativen Entnahme im Labor mit gepuffertem Formaldehyd fixiert, entwässert und in Paraffin eingebettet. Es erfolgte die Routinebearbeitung durch das histologische Labor. Hierbei wurde sowohl eine normale HE-Färbung durchgeführt als auch die Antikörperfärbungen von S-100, HMB-45, MART-1 und Ki-67, welche zur Abklärung des MM in der Routinehistologie verwendet werden. Die genaue Diagnostik erfolgte durch zwei erfahrene Dermatohistopathologen. Im Falle des Vorhandenseins eines MM wurde ein komplettes Tumorstaging durchgeführt, in dessen Rahmen Zweitmelanome durch klinische Untersuchungen ausgeschlossen oder bestätigt werden mussten. Außerdem wurden Sonographien des Abdomens einschließlich des Beckens und des Retroperitoneums als auch Computertomographien des Thorax und des Abdomens zum Ausschluss von Lymphknoten- und Organmetastasen durchgeführt. Bei einigen Patienten konnte auch das Blutbild erste Hinweise auf eine Tumorprogression bei erhöhter SerumLDH oder auf Lebermetastasen bei erhöhter GOT, GPT und γ-GT geben. Weiterhin erfolgte bei Melanomen mit einer Dicke von ≥ 1 mm nach szintigraphischer Darstellung Schildwächterlymphknotens eine Entnahme (Sentinel-Lymph-Node-Dissection, des SLND) 29 mit anschließender histologischer Untersuchung, was als Routinestaging zur Prognoseeinschätzung dient (AWMF-Leitlinien-Register, 2007). Auf diese Art fand ein Tumorstaging statt, welches richtungsweisend sein konnte für die weiteren Therapiemöglichkeiten der untersuchten Melanompatienten. 3.2. Tumortypen Zu den 106 entnommenen Präparaten gehörten 42 BN unterschiedlichen histologischen Subtyps, 22 DN sowie 21 dünne SMM mit einer Tumordicke nach Breslow von < 1 mm Durchmesser und 21 dicke SSM mit einer Tumordicke nach Breslow von ≥ 1 mm Durchmesser. Es handelte sich dabei um kutane Gewebeläsionen verschiedener Lokalisationen. Teilweise stammten die Proben von Patienten mit mehreren primären MM. In solchen Fällen wurden alle zur Verfügung stehenden Läsionen untersucht. 3.3. Herstellung von Paraffinschnitten Von den in Formaldehyd fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben wurden mit Hilfe des Mikrotoms 4 µm dicke Schnitte angefertigt und danach auf Superfrost-Objektträger gebracht. Anschließend wurden die Schnitte circa 1 Stunde im Brutschrank bei 60°C gelagert. 30 3.4. Entparaffinierung und Gewebevorbehandlung Die vollständige Entfernung des Einbettungsmediums zur Vermeidung von Hintergrundfärbungen und Überdeckung positiv gefärbter Zellen ist vor dem Färbevorgang besonders wichtig. Folgende Schritte wurden zur Entparaffinierung und Gewebevorbehandlung durchlaufen: 2 x 10 min. Xylol 2 x 5 min. 99%iges Ethanol 5 min. 96%iges Ethanol 5 min. 70%iges Ethanol 5 min. 50%iges Ethanol ca. 5 min. fließendes Leitungswasser Anschließend wurden die Gewebeproben für die Färbung vorbereitet. 3.5. Färbung der Gewebeproben Nachdem die Präparate 20 Minuten lang in Target Retrieval Solution (DAKO, Hamburg, Germany) gewaschen wurden, wurden sie 20 Minuten im Dampfgarer mit Zitratpuffer bei 96 °C gekocht. Danach erfolgte eine 30-minütige Auskühlzeit. Anschließend wurden die Proben mit 200 µl monoklonalem CEACAM1Antikörper (29H2, Maus IgG1) mit einer Verdünnung von 1:50 und mit 200µl monoklonalem CEA-Antikörper (II-7, Maus IgG1) mit einer Verdünnung von 1:100 bedeckt (siehe Tabelle 5). Dieser Vorgang geschah mit Hilfe des DAKO Autostainer-Immunfärbeautomaten und betrug für die Inkubation mit dem CEACAM1-Antikörper 29H2 60 31 Minuten, für die Inkubation mit dem CEA-Antikörper II-7 hingegen 30 Minuten. Als zweiter Antikörper wurde ChemMate Link, Biotinylated Secondary Antibodies (DAKO) verwendet, welcher sich an die Primärantikörper II-7 bzw. 29H2 anheftete. Hierbei handelt es sich um biotinylierte Ziege-Anti-Maus- Immunoglobuline. und Anschließend Ziege-Anti-Kaninchen- wurden die Präparate mit Waschpufferlösung (DAKO) 10 x 2 Minuten lang gewaschen. Danach erfolgte die 30-minütige Inkubation mit Streptavidin-Alkaline- Phosphatase zur Anlagerung an das Biotin des Sekundärantikörpers (DAKO) sowie die Hinzugabe von Chromogen Red (Red permanent, DAKO) zur Farbstoffumsetzung durch die alkalische Phosphatase. Somit konnte die Färbung abgeschlossen werden. Tabelle 6 verschafft einen Überblick über die verwendeten Primärantikörper. Tabelle 6: Verwendete Primärantikörper Antikörper Klon Herkunft CEA II-7 DAKO, Verdünnung Glostrup, 1:100 Denmark CEACAM1 29H2 Abcam Inc., 1:50 Camebridge, MA, USA 3.6. Entwässerung und Vollendung der Gewebeproben Nach der Färbung wurden die Präparate 10 Minuten lang in Leitungswasser gelegt und an der Luft getrocknet, bevor zuletzt noch ein Entwässerungsvorgang mit folgenden Schritten erfolgte: 32 2-3 min. 70%iges Ethanol 2-3 min. 96%iges Ethanol 2 x 2-3 min. 99%iges Ethanol 3 x 2-3 min. Xylol Abschließend wurden die Präparate in Folie eingedeckt. 3.7. Immunhistochemisches Färben 3.7.1. Immunologische Prinzipien Die Immunhistochemie stellt eine Methode dar, mit der Proteine mithilfe von Antikörpern in histologischen Schnittpräparaten sichtbar gemacht werden können. So lässt sich darstellen, in welchem Kompartiment der Zelle sich das Protein befindet. In der Regel werden für Antikörperfärbungen paraffineingebettete Proben von etwa 5 µm Dicke verwendet, in der vorliegenden Arbeit, wie unten näher beschrieben, handelt es sich um 4 µm dicke Schnitte. Zur Antikörperfärbung benötigt man einen spezifisch gegen das zu untersuchende Protein, also das Antigen, gerichteten Primärantikörper, welcher mit einer Pufferlösung auf das Gewebe gegeben und inkubiert wird, so dass eine AntigenAntikörper-Reaktion stattfinden kann. Um unspezifische Signale, sogenannte Hintergrundsignale, zu vermeiden, werden anschließend durch Waschschritte in Pufferlösungen nicht gebundene Antikörper entfernt. Danach erfolgt in der Regel eine Inkubation des Gewebes mit einem zweiten Antikörper, dem Sekundärantikörper. Dieser ist gegen den Fc-Teil, also den konstanten Teil des Primärantikörpers, gerichtet. 33 Durch diesen Schritt wird eine Verstärkung des Signals erreicht, da mehrere Sekundärantikörper an den Primärantikörper binden können. Der Sekundärantikörper ist gleichzeitig mit einem Signalmolekül gekoppelt, welches je nach Färbemethode aus verschiedenen Stoffen bestehen kann, zum Beispiel aus alkalischer Phosphatase oder Biotin (Stövesand, 2008). 3.7.2. Bedeutung des Streptavidin-Biotin-Systems Beim Streptavidin-Biotin-System verwendet man Sekundärantikörper, die mit Biotin gekoppelt sind, welches dann von Steptavidin erkannt wird. Dieses ist wiederum mit einer alkalischen Phosphatase oder auch mit einer Peroxidase verbunden. Anschließend wird dabei durch die alkalische Phosphatase bzw. die Peroxidase ein Farbstoff umgesetzt, der zur Darstellung des eigentlichen Signals dient. Dieses System hat eine zusätzliche signalverstärkende Wirkung (Stövesand, 2008). 34 Abbildung 1: Prinzip des Streptavidin-Biotin-Systems. Nach Bindung des Primärantikörpers an sein Antigen und des biotinylierten Sekundärantikörpers erfolgt die Anlagerung des Streptavidin-Konjugats (Streptavidin + alkalische Phosphatase) an das Biotin. Letztlich erfolgt die Umsetzung eines zugegebenen Chromogens durch die alkalische Phosphatase, woraus die Farbreaktion resultiert. 3.8. Quantitative Auswertung der histologischen Schnitte Die Diagnose der Gewebeschnitte wurde in allen Fällen durch zwei erfahrene Dermatohistopathologen nach gängigen histologischen Kriterien gestellt. Zusätzlich wurde von jeder Gewebeprobe ein HEgefärbtes Präparat bereitgestellt. 35 Alle immunhistochemischen Ergebnisse wurden anschließend separat von demselben Untersucher ausgewertet. Innerhalb des Läsionsgewebes wurden pro Präparat 3 zufällig ausgewählte Gesichtsfelder mit einer 40fachen Vergrößerung unter Zuhilfenahme eines Rasterokulars sorgfältig mikroskopisch untersucht. Es handelte sich dabei um eine blinde Auswertung, bei der die zu untersuchenden Tumorarten in einer zufälligen Reihenfolge Tumorgewebe jeder nacheinander Probe wurden ausgewertet dabei jeweils wurden. drei Im zufällig ausgewählte Gesichtsfelder analysiert. Dabei wurde die Anzahl der mit dem Antikörperklon gefärbten Zellen von der Gesamtzahl aller Zellen eines Gesichtsfeldes bestimmt. Diese Ergebnisse wurden ausgedrückt als Prozentsatz der positiv gefärbten Zellen innerhalb einer Läsion. Die Prozentsätze jedes einzelnen Gewebeschnitts wurden anschließend addiert und durch die Gesamtzahl der auswertbaren Gesichtsfelder der jeweiligen Probe dividiert. Außerdem wurde besondere Aufmerksamkeit auf die Lokalisation mit der stärksten Antikörperexpression innerhalb der Läsion gelegt und die verschiedenen Lokalisationen miteinander verglichen. 3.9. Statistische Analyse Die Auswertung der Daten wurde durchgeführt anhand des statistischen Programmpakets MedCalc Software (Mariakerke, Belgien). Die Verteilung der Daten wurde mit Hilfe des D’Agostino-Pearson-Tests bewertet. Normalverteilte Daten wurden ausgedrückt als Mittelwert ± der Standardabweichung (SD), nicht normalverteilte Daten hingegen als Median (Spannweite). Die univariate Varianzanalyse (ANOVA), die Kruskal-Wallis-ANOVA (einschließlich Mann-Whitney post-hoc-Test) und der Chi-Quadrat-Test wurden zur Auswertung von normal- bzw. nicht 36 normalverteilten Daten angewendet. Auch der Spearman- Korrelationskoeffizient wurde ermittelt. Ein P-Wert < 0.05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. 37 4. Ergebnisse 4.1. Zusammenfassung der Geweberekrutierung Es wurden histologisch diagnostizierte BN, DN sowie SSM unterschiedlicher Größe auf ihre Immunreakitivität mit den Antikörpern CEA und CEACAM1 untersucht. Insgesamt wurden Gewebepräparate von 106 Patienten analysiert. Die Gruppe der BN bestand dabei aus 42 Subtypen (21 Compoundnaevi und 21 Junktionsnaevi), während die Gruppe der DN aus 22 und die Melanomgruppe < 1 mm Tumordicke aus 21 Gewebeproben bestand. Auch die Melanomgruppe ≥ 1 mm Tumordicke beinhaltete 21 Proben. 4.2. Tumorlokalisation und Geschlechterverteilung Bezüglich der Tumorlokalisation gab es keine signifikanten Unterschiede in den jeweiligen Gruppen (P = 0.23). Die meisten untersuchten Läsionen befanden sich an den unteren Extremitäten (28/106, 26.4 %) sowie am oberen (40/106, 37.7 %) und unteren (25/106, 23.6 %) Stamm. Die übrigen Läsionen hingegen waren an den oberen Extremitäten (10/106, 9.4 %) und am Kopf (3/106, 2.8 %) lokalisiert. Die Geschlechterverteilung wies ebenfalls eine relative Homogenität auf. Insgesamt gingen 57 Frauen und 49 Männer in die Untersuchung ein. Das Alter der Patienten unterschied sich jedoch in den jeweiligen Gruppen deutlich. Dabei nahm die Malignität der melanozytären Läsionen mit steigendem Alter zu, so dass in den Melanomgruppen ein erhöhtes Alter im Gegensatz zu dem der Patienten in den Naevigruppen 38 beobachtet werden konnte. Dieser Zusammenhang zeigte sich als statistisch signifikant, der P-Wert betrug hier < 0.0001. (siehe Tabelle 8). Tabelle 7: Klinische Charakteristiken von Patienten mit benignen und malignen melanozytären Hautläsionen Diagnose Geschlecht Alter (m/w) (in Jahren) BN (n=42) 16 / 26 38.5 ± 11.7 DN (n=22) 9 / 13 46.6 ± 16.3 SSM (<1 mm; n=21) 11 / 10 58.1 ± 12.8 SSM (≥ 1 mm; n=21) 13 / 8 60.8 ± 12.4 P = 0.07 P < 0.0001 Unterschiede zwischen den Gruppen 4.3. Expression von CEA und CEACAM1 in gesunder Haut In allen untersuchten Läsionen zeigte sich in normaler, gesunder Haut keine CEA- oder CEACAM1-Immunreaktivität, auch nicht, wenn es sich um an den Tumor angrenzendes gesundes Gewebe handelte. Lediglich Talg- und Schweißdrüsen sowie ihre Ausführungsgänge zeigten eine moderate Anfärbung in beiden Antikörpergruppen. 39 4.4. BN CEA Von allen untersuchten 42 BN (21 Junktions- und 21 Compoundnaevi) färbten sich 17 Präparate an. Die mediane Antikörperexpression betrug 0 % (0 - 4.9). Die Färbeintensität war eher schwach ausgeprägt. 25 Proben wiesen keine Antikörperfärbung auf. CEACAM1 Bei diesem Antikörper färbten sich 22 von 42 untersuchten Präparaten an. Die mediane CEACAM1-Expression lag hier bei 1 % (0 - 78). 20 Gewebeproben blieben ungefärbt. Die Färbeintensität war in dieser Gewebegruppe moderat ausgeprägt. 4.5. DN CEA Von den 22 untersuchten DN unterschiedlicher Größe zeigten insgesamt 15 Präparate eine Anfärbung. Die mediane Expression von CEA lag bei 1.8 % (0 - 12.9) und damit höher als in der Gruppe der BN. Weiterhin zeigte sich eine schwache bis moderate Färbeintensität. 7 Proben blieben ungefärbt. CEACAM1 Hier konnten 16 der 22 untersuchten Gewebeproben eine Antikörperfärbung aufweisen. Die mediane Expression von CEACAM1 lag in dieser Gruppe bei 9.6 % (0 - 62.7) und lag damit auch hier deutlich höher als in der Gruppe der BN. Es konnte weiterhin eine moderate bis starke Färbeintensität des Gewebes mit dem Antikörper nachgewiesen 40 werden. 6 Präparate blieben in dieser Gruppe ungefärbt. 4.6. SSM < 1mm In dieser Gruppe befanden sich von 21 Patienten 16 im AJCC-Stadium IA, ein Patient im Stadium IIA, zwei hatten bereits Stadium IIIA erreicht, einer IIIB und ein Patient befand sich bereits im Stadium IV. CEA Von den 21 Präparaten färbten sich 19 an. Hier lag die mediane Antikörperexpression von CEA mit 5 % (0 – 76.8) deutlich höher als die der DN und der BN. Die Färbeintensität war in dieser Gruppe moderat. In wenigen Proben konnte auch eine starke Färbeintensität nachgewiesen werden. 2 Präparate blieben ungefärbt. CEACAM1 Hier färbten sich 20 von 21 Gewebeproben. Auch in dieser Gruppe lag die mediane CEACAM1-Expressionsrate mit 18 % (0 - 82) erheblich höher als in den Gruppen der BN und der DN. Die Färbeintensität war hier moderat bis stark ausgeprägt. Nur ein Präparat wies keine Färbung auf. 4.7. SSM ≥ 1mm Auch hier gab es insgesamt 21 Patientenproben. Im Stadium IA der AJCC-Klassifikation befand sich jedoch im Gegensatz zum malignen Melanom < 1 mm nur ein Patient. Es befanden sich hingegen 6 Patienten im Stadium IB und 5 im Stadium IIA. Weiterhin gab es einen 41 Patienten, der sich im Stadium IIB, und zwei, die sich im Stadium IIIA befanden. Im Stadium IIIB befindlich waren weitere 4 Patienten und 2 im Stadium IV. CEA Hier wiesen 17 von 21 Gewebeproben eine positive Antikörperreaktion auf. Mit einer medianen Expressionsrate des Antikörpers CEA von 7.7 % (0-74.8) lag in dieser Gruppe der höchste Wert im Rahmen aller CEAgefärbten Präparate vor. Die untersuchten Gewebeproben waren moderat bis stark gefärbt. In 4 Präparaten blieb die Färbung jedoch aus. CEACAM1 Alle 21 Gebeschnitte färbten sich in dieser Gruppe deutlich an. Die mit Abstand höchste mediane CEACAM1-Expression lag in dieser Gruppe mit 74 % (7.2-100) vor und unterschied sich damit signifikant von allen anderen untersuchten Läsionsgruppen. Auch die Färbeintensität war hier höher als die der anderen melanozytären Läsionen. Sie war in fast allen Präparaten stark ausgeprägt. Die Unterschiede der Ergebnisse in den verschiedenen Gruppen waren sowohl bezüglich der CEA- als auch der CEACAM1-Expression signifikant. Dies macht der P-Wert deutlich, welcher in beiden Antikörpergruppen < 0.0001 blieb (Tabelle 9). 42 Tabelle 8: Expression von CEA- und CEACAM1-Proteinen in Zusammenhang mit klinischen Charakteristiken von Patienten mit benignen und malignen melanozytären Hautläsionen Diagnose Geschlecht Alter CEA- CEACAM1- (m/w) (in Jahren) Expression Expression in % in % Median (Rang) Median (Rang) BN (n=42) 16 / 26 38.5 ± 11.7 0 (0-4.9) 1 (0-78) DN (n=22) 9 / 13 46.6 ± 16.3 1.8 (0-12.9) 9.6(0-62.7) 11 / 10 58.1 ± 12.8 5 (0-76.8) 18 (0-82) 13 / 8 60.8 ± 12.4 7.7 (0-74.8) 74 (7.2-100) Unterschiede P = 0.07 P < 0.0001 P < 0.0001 P < 0.0001 zwischen Chi²-Test ANOVA Kruskal- Kruskal- Wallis- Wallis- ANOVA ANOVA SSM (<1 mm; n=21) SSM (≥ 1 mm; n=21) den Gruppen Insgesamt wurde die Reaktivität sowohl von CEA als auch von CEACAM1 in einer moderaten membränosen und zytoplasmatischen Verteilung gefunden, wobei die Färbeintensität von CEACAM1 an der invasiven Front der SSM am stärksten war. 4.8. Statistische Unterschiede zwischen den Läsionsgruppen Um Unterschiede der jeweiligen Antikörperexpressionen zwischen den untersuchten Läsionsgruppen zu eruieren, wurden die im Methodenteil bereits beschriebenen statistischen Untersuchungen durchgeführt. 43 CEA Ingesamt wird deutlich, dass signifikante Unterschiede bezüglich der Expression von CEA zwischen den untersuchten Läsionsgruppen bestehen (P < 0.0001). Verglichen mit der CEA-Expression von BN (mediane CEA-Expression 0 %) zeigte sich ein deutlicher Anstieg der medianen Antikörper-Expression in der Gruppe der SSM ≥ 1 mm (mediane CEA-Expression 7.7 %; P < 0.0001), SSM < 1 mm (mediane CEA-Expression 5 %; P < 0.0001) sowie in der Gruppe der DN (mediane CEA-Expression 1.8 %; P < 0.007). Verglichen mit den DN zeigte die mediane CEA-Expression der SSM < 1 mm keine wesentliche Erhöhung (P = 0.052), jedoch war die mediane CEA-Expression in den SSM ≥ 1 mm deutlich höher als in der Gruppe der DN (siehe Abbildung 2; P = 0.013). Weiterhin ist zu sagen, dass die CEA-Expression in SSM keine signifikante Korrelation mit der Tumordicke nach Breslow und dem Invasionslevel nach Clark aufwies (r = 0.16; P = 0.3 und r = 0.22; P = 0.16). 44 Abbildung 2: Mediane CEA-Expression in BN und DN sowie in SSM < und SSM ≥ 1mm. Verglichen mit den BN war die mediane CEA-Expression in den DN sowie in den SSM deutlich erhöht. CEACAM1 Auch bei der Untersuchung dieses Antikörpers wurden erhebliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Läsionsgruppen deutlich (P < 0.0001). Verglichen mit der Gruppe der BN (mediane CEACAM1Expression = 1) zeigte sich sowohl in der Gruppe der SSM < 1 mm (mediane CEACAM1-Expression 18 %; P = 0.022) als auch in der Gruppe der SSM ≥ 1 mm (mediane CEACAM1-Expression 74 %; P < 0.0001) eine signifikante Erhöhung der CEACAM1-Expression. Die mediane CEACAM1-Expression in DN hingegen unterschied sich mit 9.6 45 % nicht bedeutsam von der Expression der BN (P = 0.39). Verglichen mit den DN (P < 0.0001) und den SSM < 1 mm (P = 0.0009) war die mediane CEACAM1-Expression der SSM ≥ 1 mm jedoch deutlich erhöht (siehe Abbildung 4). Im Gegensatz zur CEA-Expression zeigte sich zwischen der CEACAM1-Expression und der Tumordicke nach Breslow eine signifikante positive Korrelation (siehe Abbildung 3; r = 0.57; P = 0.0002). Zwischen der CEACAM1-Expression und dem Invasionslevel nach Clark konnte ebenso eine positive Korrelation nachgewiesen werden (r = 0.52; P = 0.0009). Abbildung 3: Signifikante positive Korrelation zwischen der Expression von CEACAM1 und der Tumordicke nach Breslow des SSM 46 Abbildung 4: Mediane CEACAM1-Expression in BN, DN sowie in SSM < 1 mm und ≥ 1 mm. Die Grafik zeigt die erhöhte Expression des Antikörpers in den SSM im Vergleich zu den BN. Die folgenden Bildergebnisse werden die Expressionsprofile der verschiedenen Antikörper in den untersuchten benignen und malignen Hautläsionen noch einmal veranschaulichen. 47 4.9. Bildmaterial der immunhistologischen Ergebnisse Abbildung 5 : BN vom Junktionstyp. Deutliche Melaninablagerungen, besonders in der Epidermis. Keine positive CEA-Anfärbung. 48 Abbildung 6: SSM mit einer Tumordicke nach Breslow von 1 mm. Moderate Anfärbung der CEA-exprimierenden Zellen in der Dermis erkennbar. 49 Abbildung 7: BN vom Junktionstyp. Deutliche Melaninablagerungen in Epidermis und Dermis. Keine signifikante CEACAM1-Anfärbung. 50 Abbildung 8: DN. Deutliche gruppierte Expression von CEACAM1 in der Dermis. Vereinzelt Melaninablagerungen sichtbar. Schwache Lymphozyteninfiltration. 51 Abbildung 9: SSM mit einer Tumordicke nach Breslow von 2 mm. Deutliche Expression von CEACAM1 in der Dermis. Keine nennenswerte Lymphozyteninfiltration 52 Abbildung 11: Immunreaktivität von CEA- und CEACAM1-Antikörpern in SSM und BN im direkten Vergleich. A, negative CEA-Anfärbung eines BN; B, CEA-positive Zellen eines SSM mit einer Tumordicke nach Breslow von 1 mm; C, Fehlen von positiver CEACAM1-Anfärbung in einem BN; D, deutliche und starke Anfärbung von CEACAM1positiven Zellen in einem SSM mit einer Tumordicke von 2.5 mm. 53 5. Diskussion 5.1. Immunhistologische Diagnostik der MM und deren Vorläuferläsionen In mehreren Arbeiten verschiedener Autoren konnte gezeigt werden, dass die hauptsächlich in der immunhistochemischen Melanomdiagnostik Anwendung findenden Antikörper Anti-S100 und HMB-45 als auch die Marker MART-1 und Ki-67 hinsichtlich Spezifität und Sensitivität einige Defizite ausweisen (Trefzer et al., 2000). Demnach ist Anti-S100 bezüglich der MM-Diagnostik trotz hoher Sensitivität von 83 bis 100 % sehr unspezifisch (Ordonez et al., 1988). In vorherigen Untersuchungen zeigte sich, dass Anti-S100 in 21 von 84 nichtmelanozytären Neoplasmen anfärbbar war (Trefzer et al., 2000). Der Antikörper markiert also nicht nur das MM und seine Metastasen, sondern auch sämtliche andere S100-Isoformen, welche sich zusätzlich in benignen Zellen, bevorzugt Astrozyten, Schwannzellen und Oligodendrozyten, befinden bzw. in aus diesen Zellen bestehenden Tumoren (Keijser et al., 2006; Thies et al., 2007). Weiterhin wird der Antikörper in Antigen-präsentierenden Zellen wie den Langerhanszellen der Haut und den Makrophagen exprimiert sowie im Parakortex von Lymphknoten (Thies et al., 2007). Der Wert dieses monoklonalen Antikörpers ist also begrenzt (Trefzer et al., 2000). Die Sensitivität von HMB-45 liegt hingegen bei 67 bis 93 %, jedoch zeichnet sich in der Klinik bei diesem Marker eine nicht ausreichende Unterscheidungsmöglichkeit zwischen Melanomen und nichtmelanozytären Neoplasmen ab (Ordonez et al., 1988). Dieser 54 Umstand führt daher besonders in der Diagnostik von Melanommetastasen häufig zu falsch negativen Ergebnissen (Trefzer et al., 2000). Es wurde in vorherigen Studien gezeigt, dass sich bei immunhistochemischer Diagnostik mit Hilfe des Antikörpers HMB-45 nur 82 bis 83 % aller Melanommetastasen anfärbten (Selby et al., 1992; Trefzer et al., 2000). Daher ist HMB-45 für die Diagnostik von Melanommetastasen als Antikörper allein nicht ausreichend. Auch zu MART-1 und Ki-67 gibt es eine Reihe von Studien an MM und deren Vorläuferläsionen. Das Antigen MART-1 wird häufig für spezifische Immuntherapien eingesetzt (Trefzer, 2006). Eine Studie beschreibt die Reaktivität von primären MM mit Anti-MART-1. Diese betrug dort 68 %. Bezüglich der Metastasierung zeigte sich, dass Anti-MART-1 in nur 58 % der Fälle mit über 50 % aller Tumorzellen reagierte, was einen Hinweis für aktives Immun-Escape in der Entwicklung vom Primärtumor zur Metastase darstellt (Trefzer, 2006). Eine weitere Untersuchung ergab, dass MART-1 zwar eine ziemlich zufriedenstellende Spezifität aufweist, dass es jedoch an der Sensitivität im Vergleich zum S-100-Protein mangelt (Ohsie et al., 2008). Diese Untersuchungen wurden durch eine weitere Arbeitsgruppe bestätigt, die dieselben Phänomene beschrieb wie sie bereits oben genannt wurden (Trefzer et al., 2000). Daher wird unabhängiger deutlich, dass Faktor für auch das Antigen prognostische MART-1 Aussagen nicht über als die Melanomprogression fungieren kann. Ki-67 ist ein Proliferationsmarker, welcher Zellen in allen Phasen des Zellzyklus mit Ausnahme der G0-Phase identifizieren kann. In einer vorherigen Studie wurde gezeigt, dass die Proliferationsraten beim SSM mit 25 % deutlich höher waren als bei BN wie z.B. dem CompoundNaevi, dessen Proliferationsrate negativ war (Chorny et al., 2003). Weiterhin wurde entdeckt, dass 5 bis 62 % der SSM Ki-67-positive 55 Zellen aufwiesen. Anhand der Proliferationsrate kann also in einigen Fällen durchaus auf die Dignität des jeweiligen Tumors geschlossen werden, jedoch erscheinen die Unterschiede der jeweiligen Proliferationsraten in dieser Studie statistisch gesehen nicht signifikant genug (Chorny et al., 2003). In einer weiteren Arbeit konnte eine hohe Proliferationsrate von Ki-67 nur in 47.4 % aller MM entdeckt werden. MM mit einer Tumordicke von unter 4 mm zeigten keine positive Korrelation zwischen Ki-67- Expression und Outcome, so dass der prognostische Wert limitiert zu sein scheint. Bei MM über 4 mm Tumordicke nach Breslow konnte hingegen eine Überexpression von Ki-67 beobachtet werden, jedoch war auch diese statistisch nicht signifikant, so dass auch hier davon auszugehen ist, dass Ki-67 kein unabhängiger prognostischer Faktor für das klinische Outcome sein kann (Hazan et al., 2002). Ebenso machte noch eine andere Studie die prognostische Aussagekraft von Ki-67 von der Tumordicke abhängig. Dort ist jedoch bereits ab einer Tumordicke von 1.5 mm von einer positiven Korrelation zwischen Ki-67Expression und Metastasenentwicklung die Rede. Diese Korrelation wurde jedoch in dünneren Melanomen (<0.75 mm) nicht entdeckt. Noch andere Untersuchungen bezüglich der beschreiben Überlebensrate der Ki-67 als betroffenen einen Faktor, Patienten der deutlich sensitiver als die Tumordicke nach Breslow sein soll (Ramsay et al., 1995). Die prognostischen Bewertungen von Ki-67 gehen in der Literatur weit auseinander. Derzeit sieht es danach aus, dass dieses Antigen zwar unabhängige prognostische Informationen bereitstellen kann, die potentiell für das risikobasierte Management von Melanompatienten genutzt werden können, jedoch scheint dies nicht auf alle Melanome anwendbar zu sein. 56 Zumeist werden die Antikörper HMB-45, S100, KI-67 und MART-1 in der immunhistochemischen Diagnostik des MM parallel eingesetzt, da sie sich gegenseitig gut ergänzen. Häufig fällt es in der Routinediagnostik schwer, MM von ihren Vorläuferläsionen zu differenzieren. Da die exakte Detektion jedoch für die weitere Diagnostik und Therapie unabdingbar ist, wäre es vorteilhaft, einen Antikörper zu haben, welcher die für die Melanomdiagnostik nutzbaren Eigenschaften der gebräuchlichen Routinemarker erweitern kann, um somit die Differentialdiagnose von MM, DN oder BN zu erleichtern mit der Zielsetzung, den betroffenen Patienten letztendlich ein frühzeitigeres und adäquateres Therapiespektrum zu ermöglichen. Melanozytäre Naevi sind sowohl Marker für ein erhöhtes Risiko kutaner Melanomentstehung als auch direkte Vorläuferläsionen. Sowohl BN als auch DN existieren häufig in direkter Nachbarschaft zum MM. Insbesondere handelt es sich dabei um das SSM sowie um das LMM. Dies deutet darauf hin, dass melanozytäre Naevi eine sehr ausgeprägte Anfälligkeit für maligne Entartung aufweisen können (Crowson et al., 2002; Kanzler et al., 2001). Deshalb wurden für diese Arbeit verschiedene Typen pigmentierter Läsionen stratifiziert, welche sowohl benigne als auch prämaligne und maligne melanozytäre Proliferationsspektren beinhalteten. 5.2. Bedeutung von CEA und CEACAM1 in der Melanomdiagnostik Ob Antikörper aus der CEA-Proteinfamilie den oben genannten Zielen der MM-Diagnostik gerecht werden können, wurde in dieser Arbeit ausführlich untersucht. Die humane CEA-Proteinfamilie beinhaltet mehrere Formen von Proteinen mit verschiedenen biochemischen 57 Eigenschaften. CEA ist ein onkofetales Glykoprotein, welches zu 50 % aus Kohlenhydraten besteht und ein molekulares Gewicht von annähernd 200 kDa hat (Obrink, 1997). CEA wird in verschiedenen Tumorarten epithelialen Ursprungs überexprimiert und ist bekannt als wichtiger und häufig genutzter klinischer Tumormarker für das kolorektale Karzinom und andere maligne Tumoren (Beauchemin et al., 1997). Somit ist CEA aufgrund seines Expressionsprofils, seiner Rolle in der Tumorprogression und seiner Immunogenität ein attraktives Ziel für immuntherapeutische Behandlungszwecke und –ansätze. Unter physiologischen Bedingungen wird CEACAM1 auf der Oberfläche von Epithelien, Endothelien und hämatopoetischen Zellen exprimiert. Durch alternatives Spleißen entstehen die Isoformen CEACAM1-L und CEACAM1-S, in welche sich der Länge ihres zytoplasmatischen Ausläufers unterscheiden. Beide CEACAM1-Isoformen sind beteiligt an homophilen interzellulären Adhäsionen und fungieren als Rezeptor für die pathogene Steuerung verschiedener zellulärer Funktionen wie Proliferation, Differenzierung, Morphogenese und Apoptose. CEA Insgesamt wurden 106 Läsionen analysiert. Der Klon II-7, der in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, ist ein monoklonaler Antikörper gegen CEA. Mit Hilfe von II-7 konnte gezeigt werden, dass es im Vergleich zwischen BN und DN sowie SSM offensichtlich eine schrittweise Erhöhung der CEA-Expression in diesen melanozytären Tumoren gibt. Tatsächlich konnten in DN und SSM eine signifikante, sich sukzessiv erhöhende CEA-Expression im Vergleich zu der Gruppe der BN beobachtet werden. Hervorzuheben ist, dass sich sowohl gutartige als auch bösartige Läsionen anfärbten. Während der Median der CEAExpression in BN bei 0 lag, betrug er in der DN-Gruppe 1.8 und in der 58 Gruppe der SSM < 1 mm 5. Bei den SSM ≥ 1 mm lag er hingegen bei 7.7. Hier färbten sich auch 85.7 % der untersuchten Präparate an. Dies entspricht in etwa dem Ergebnis, welches in einer vorherigen Studie für MART-1 erarbeitet wurde (Thies et al, 2007). In SMM mit einer Tumordicke nach Breslow von ≥ 1 mm war die Expressionsrate von CEA sogar noch deutlicher höher als in kleineren SMM und DN. Insgesamt liegen in der bisherigen Literatur über die CEA-Expression in benignen und malignen melanozytären Hautläsionen widersprüchliche Daten vor. Eine frühere Arbeit zeigte, dass die polyklonale CEAAnfärbung in MM häufiger als bisher gedacht vorkommt. Dagegen war jedoch die monoklonale CEA-Färbung in allen MM negativ (Ben-Izhak et al., 1994). Über ähnliche Ergebnisse berichteten auch andere Arbeitsgruppen (Ravindranath et al., 2000; Sander et al., 1994). Ravindranath et al. untersuchten dafür die CEA-Expressionsrate sowohl an der Zelloberfläche als auch in Zelllysaten von Zellreihen des MM mit Hilfe zweier Ravindranath verschiedener et al. eine Arten des ELISA. Westernblot-Analyse Weiterhin zur setzen Detektion von immunablagerndem CEA-Antigen ein. Die Durchführung gelang mit Hilfe der monoklonalen Antikörper T84-66 und COL-1, welche spezifisch für CEA sind. Das Ergebnis der Zellreihe des MM wurde verglichen mit dem des Kolonkarzinom, welches als positive Kontrolle in dieser Studie diente. Dabei konnte beobachtet werden, dass beide monoklonalen Antikörper stark mit den Zellreihen des Kolonkarzinom, jedoch nicht oder kaum mit denen des MM reagierten. Im Gegensatz dazu wurde in einer anderen Arbeit demonstriert, dass die CEA-Immunoreaktivität an einer signifikanten Anzahl der Melanomfälle beobachtet werden konnte (Selby et al., 1992). Die Autoren berichteten, dass die CEA- exprimierenden Tumorzellen sich wie unspezifische kreuzreagierende Antigene verhielten, welche die Seiten der Antigenität mit CEA teilten (Selby et al., 1992). 59 Weiterhin konnte von Egawa et al. 2000 dargestellt werden, dass die Mitglieder der CEA-Familie in allen untersuchten Subtypen melanozytärer Naevi mit Ausnahme blauer Naevi eine starke CEAExpression aufweisen konnten. Dort wurde die immunhistochemische CEA-Expression an 45 erworbenen, sowie 16 kongenitalen und 20 blauen Naevi bestimmt. Dazu dienten einige mono- und polyklonale Antikörper, welche in der Lage waren, verschiedene Epitope von CEA, aber auch von CEA-verwandten Molekülen aufzudecken. Die dort aufgetretene CEA-Expression sowohl in kongenitalen als auch in erworbenen melanozytären Naevi wurde erklärt durch Entstehung von architektonischen Veränderungen in der melanozytären Zellreihe. Eine weitere Arbeitsgruppe benutze einen komplett humanen Einzelketten-CEA-Antikörper mit hoher Affinität (Pavoni et al., 2006). Dabei wurde der humane Antikörper MA39 scFv aufgrund seiner Fähigkeit zur CEA-Epitopenerkennung im humanen Kolonkarzinom isoliert und anschließend per in-vitro-Mutagenese zu einem Antikörper mit verbesserter Affinität gegenüber CEA-verwandten Epitopen modifiziert. Dieses neu entstandene Immunreagens konnte in dieser Studie die Kriterien für eine potentielle Antikrebsverbindung erfüllen, da es eine hohe Affinität und eine selektive Bindung zu dem CEA-Epitop aufwies, welches neben dem Lungen- und dem Kolonkarzinom auch vom MM exprimiert wird. Die Tatsache, dass auch melanozytäre Naevi eine CEA-Expression aufweisen, konnte in der vorliegenden Arbeit anhand oben genannter Ergebnisse bestätigt werden. CEACAM1 Ähnlich wie bei den CEA-Ergebnissen dieser Studie zeigte auch die CEACAM1-Expression eine sukzessive Erhöhung in den melanozytären Hautläsionen mit steigender Malignität. Es konnte demonstriert werden, 60 dass die Expression von CEACAM1 im Vergleich zu BN deutlich erhöht ist in Melanomen < 1 mm und ≥ 1 mm sowie in DN. Während der Median der CEACAM1-Expression der BN bei 1 lag, betrug er bei den DN 9.5 und bei den SSM < 1 mm 18. In der Gruppe der SSM ≥ 1 mm lag er sogar bei 74. Hier wiesen alle 21 untersuchten Präparate eine deutliche CEACAM1-Überexpression auf. Weiterhin ist zu sagen, dass sich in gesunder Haut keine epithelialen Zellen anfärbten. Vereinzelt waren Färbungen von Schweiß- und Talgdrüsen zu beobachten, positive Anfärbung von Epithelzellen konnten jedoch nur in MM sowie in deren Vorläuferläsionen, also in BN und DN, demonstriert werden. Wie es auch zuvor bereits von einer anderen Arbeitsgruppe beschrieben wurde, konnte ausgeprägte in dieser Arbeit Färbungsintensität ebenfalls an der eine invasiven deutlich Front stärker der MM beobachtet werden (Thies et al., 2007; Thies et al., 2002). Weiterhin bestand eine bedeutsame Korrelation zwischen der CEACAM1-Expression und der Tumordicke nach Breslow sowie dem Invasionslevel nach Clark. Je dicker der Tumor und je tiefer die Tumorinvasion war, desto stärker zeigte sich die Antikörperexpression. Präklinische Studien über das MM haben weiterhin verdeutlicht, dass CEACAM1 ein unabhängiger Faktor für das Metastasenrisiko des MM ist, mit höherem prädiktivem Wert als dem der vertikalen CEACAM1-Genmutation Behandlung mit Tumordicke. das Ferner invasive monoklonalen hemmt Wachstum des die spezifische MM Anti-CEACAM1-Antikörpern und die blockiert dosisabhängig die CEACAM1-induzierte Zellinvasion und –migration (Thies et al., 2007). Bei der Interaktion mit den Integrinen, insbesondere Integrin β3, konnte dargelegt werden, dass CEACAM1-L das migratorische und metastatische Potential von Melanomzellen steigern kann (Brümmer et al., 2001; Ebrahimnejad et al., 2004). Tatsächlich gibt es klinische Studien mit einer 10-jährigen Nachbeobachtungszeit, welche 61 veranschaulichen, dass die CEACAM1-Expression in primären MM mit einer nachträglichen Metastasenentwicklung assoziiert ist (Thies et al., 2007, Thies et al., 2002). Dabei wurde von Thies et al. 2002 in 100 primären kutanen MM die CEACAM1-Expression immunhistochemisch evaluiert und in einer 10-jährigen Nachbeobachtungszeit mit der Metastasenentstehung korreliert. Dabei konnte gezeigt werden, dass CEACAM1 als potenter angiogenetischer Faktor in der Vaskularisation von Tumorzellen die Prognosebestimmung des MM verbessern kann. Weiterhin wurde davon ausgegangen, dass die Hochregulation von CEACAM1 einen wichtigen Faktor für die zukünftige Immuntherapie des MM darstellen kann. Anschließend fand zur weiteren Untersuchung der Bedeutung von CEACAM1 für die Metastasenentwicklung von Thies et al. 2007 die Erstellung eines klinischen Melanommodells statt. In klinischen Studien wurde hierbei Metastasenentwicklung in das sechs Tumorwachstum und verschiedenen die humanen Melanomzelllinien, welche subkutan in Mäuse mit einem schweren kombinierten Immundefekt (SCID) übertragen wurden, analysiert und mit der Expression von verschiedenen Metastasenmarkern korreliert. Das in dieser Studie präsentierte Mausmodell spiegelte annähernd genau die klinische Situation wider, unterstrich die Komplexität der Metastasenentwicklung und eignete sich somit für weitere präklinische Studien bezüglich der Metastasenentwicklung des MM. In einer weiteren Studie wurde auch darauf hingewiesen, dass der Anti-CEACAM1Antikörper 4D/C2 hoch sensitiv und spezifisch und somit bezüglich der MM-Diagnostik eine wertvolle Ergänzung zu den in der Klinik gebräuchlichen Standardantikörpern sei (Thies et al., 2007). Dort stand insbesondere die Untersuchung der Antikörper CEACAM1 und L1 in BN, primären MM, in den dazugehörigen SLN sowie in Fernmetastasen im Gegensatz zu den in der histologischen Routinediagnostik üblicherweise verwendeten Markern MART-1, S100 und HMB-45 im Vordergrund. Es 62 konnte gezeigt werden, dass CEACAM1 und L1 in allen oben genannten melanozytären Läsionen exprimiert wurden und dass deren Sensitivität und Spezifität die Werte von MART-1, S100 und HMB-45 übertraf. Damit zeichneten sich L1 und CEACAM1 als zuverlässige Marker im Bezug auf die Diagnose, die prognostische Bestimmung und die Behandlung des MM aus und repräsentierten somit ein potentielles Ziel für eine zukünftige antimetastatische Immuntherapie. Es konnte weiterhin Melanomzellen, Angriff veranschaulicht welche überlebten, einen aktiv werden, spezifischen hochreguliert dass CEACAM1 in lymphozytenvermittelten wurde als Reaktion auf Interferone. So erhalten die MM eine transient erhöhte Resistenz (Markel et al., 2004; Markel et al., 2002; Markel et al., 2008; Markel et al., 2006). Weiterhin konnten Markel et al. (2008) demonstrieren, dass es sich bei diesem Mechanismus um einen aktiven Prozess handelte und dass die verstärkte CEACAM1-Expression abhängig war vom Vorhandensein von Interferon γ (IFN-γ) und innerhalb von 48 Stunden stark abnahm. Dieser dynamische Mechanismus zeigt eine potentielle komplexe Tumorstrategie auf, welche als ein offensives Wirkmittel gegen Immunattacken anzusehen ist, um aktiv die Protektion der überlebenden Zellen zu steigern. All die eben genannten Dinge zeigen die wichtige Rolle von CEACAM1 in der Entwicklung aggressiver Melanome und der Entstehung von Melanommetastasen auf. Bezüglich der Spezifität sind die Aussagen zu CEACAM1 umstritten. In der vorliegenden Arbeit wurde einerseits zwar bis auf einige Talg- und Schweißdrüsen kein gesundes epitheliales Gewebe angefärbt, jedoch unterscheidet melanozytären sich das Ergebnis Vorläuferläsionen bezüglich teilweise der von Anfärbung den von Ergebnissen vorheriger Arbeiten. Thies et al. (2007) berichteten unter anderem von positiv gefärbten ekkrinen Schweißdrüsen in gesunder Haut, die als positive Kontrollen gedient haben. Dasselbe war auch in der 63 vorliegenden Arbeit zu beobachten. Weiterhin wurde in der genannten vorherigen Studie zur CEACAM1-Färbung sowohl der Antikörper 4D1/C2 als auch Novo verwendet. Dort färbte sich in BN nur ein kleiner Teil der Melanozyten an. Bei 4D1/C2 waren dies 3 von 12 und bei Novo 0 von 12 Gewebeproben von melanozytären Naevi, die eine positive CEACAM1Expression aufwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit 29H2 ein anderer Anti-CEACAM1-Antikörper verwendet. Dieser färbte 22 von 42 BN an, was damit deutlich höher liegt als bei Thies et al (2007). Zu diskutieren bleibt, ob es sich dabei um eine im Gegensatz zu 4D1/C2 und Novo eingeschränkte Spezifität von 29H2 in Bezug auf die BN handelt oder ob die deutlich höhere Anzahl der Stichproben der vorliegenden Arbeit das Spektrum der CEACAM1-exprimierenden BN deutlicher repräsentieren kann. In der Studie von Thies et al. (2007) war eine Expressionsrate von 100 % sowohl von MART-1 als auch von HMB-45 und S-100 in BN zu beobachten. In dieser Arbeit färbten sich durch CEACAM1 hingegen, wie oben bereits genannt, 22 von 42 BN an. Hierdurch wird deutlich, dass es anhand von CEACAM1 eher gelingen kann, einen BN von einem SSM zu unterscheiden als anhand von allen anderen drei genannten Markern. 5.3. Weitere aktuell diskutierte Marker des MM Außer der Bindung von CEACAM1 an den verschiedenen untersuchten Zellreihen wurden von Thies et al. 2007 auch die Expression der biotinylierten Lectine Helix Pomatia Lectin (HPA), Wheat Germ Agglutinin (WGA) und Phytohemagglutinin (PHA) untersucht. HPA ist in der Lage, terminale alpha-N-Acetylgalactosaminreste zu erkennen. Eine große Anzahl an immunhistochemischen Studien hat in der Vergangenheit demonstriert, dass die Expression von HPA-bindenden Glykoproteinen 64 durch Tumorzellen als ein Metastasenmarker mit schlechter Prognose bezüglich einer Reihe von humanen Adenokarzinomen betrachtet werden kann. Hierzu zählen die Karzinome der Mamma, des Magens, der Ovarien, des Ösophagus, des Kolons, der Schilddrüse und der Prostata. (Brooks, 2000). Es konnte von Thies et al. (2007) gezeigt werden, dass HPA an alle der sechs untersuchten Zellreihen band. Darunter fiel auch eine Metastasenzellreihe. So konnte durch HPA eine Tumorwachstumsphase von 90 Tagen beobachtet werden. Daher sollte auch dieser Marker laut Thies et al. (2007) im Hinblick auf zukünftige therapeutische Melanomstudien in Betracht gezogen werden. PHA und WGA sind Lectine, welche die Ausbreitung von Metastasen der murinen B16-Melanomzellen anzeigen können, deren Expression jedoch nicht mit der humanen Metastasenentwicklung korreliert (Tao et al., 1982). Auch das von Thies et al. (2007) untersuchte Modell konnte keine Korrelation der PHA- und WGA-Lectine im Zusammenhang mit der humanen Metastasenentwicklung nachweisen. Außerdem wurde ebenfalls von Thies et al. 2007 das Adhäsionsmolekül L1 im Zusammenhang mit der Progression des MM diskutiert. Wie bereits oben genannt wurde eine L1-Expression, ebenso wie es bei der CEACAM1-Expression der Fall war, sowohl in benignen melanozyäteren Läsionen als auch in primären MM, in SLN und auch in Fernmetastasen nachgewiesen und kann daher möglicherweise als Komplettierung der Standardantikörperanalyse in der Melanomdiagnostik Anwendung finden und zukünftiges Ziel für Immunotoxine sein (Thies et al., 2007). In den letzen Jahren war weiterhin die Regulation des Tumorwachstums durch Komponenten der Extrazellulärmatrix ein zentrales Thema in der Tumorbiologie. Dazu wurden an SSM sowie an deren Vorläuferläsionen die peritumorale Immunreaktivität von den Proteoglykanen Versican und Decorin untersucht (Gambichler et al., 2008). Hier konnte eine signifikante Erhöhung der medianen Versicanexpression in SSM im 65 Vergleich zu BN und DN beobachtet werden. Dies lässt darauf schließen, dass auch die Versicanüberexpression im peritumoralen Gewebe eine Rolle in der Pathogenese der Melanomentstehung spielen kann. Eine signifikante Überexpression von Decorin konnte hingegen nicht beobachtet werden. 5.4. Schlussfolgerungen Sowohl in den MM als auch in deren gutartigen Vorläuferläsionen waren eine CEA- und eine CEACAM1-Expression zu beobachten. Diese waren jedoch nicht in allen Läsionen gleich stark ausgeprägt. Je höher die Malignität der Hautläsion, desto stärker wurden CEA und CEACAM1 exprimiert. Es konnte insgesamt gezeigt werden, dass das SSM im Gegensatz zu seinen Vorläuferläsionen sowohl CEA als auch das Adhäsionsmolekül CEACAM1 überexprimiert. Laut oben genannten Ergebnissen ist die CEACAM1-Expressionsrate durchaus in der Lage, prognostische Aussagen bezüglich der Progression von MM-Vorläuferläsionen bis zum High-risk-MM zu machen. Weiterhin ist es anhand der Expression teilweise möglich, zwischen benignen und malignen melanozytären Hautläsionen zu unterscheiden. Aufgrund dieser Eigenschaften kann der Marker CEACAM1 durchaus in der Lage sein, als ein attraktives Ziel für eine neuartige Immuntherapie zu dienen. Diese Arbeit unterstützt folglich vorherige Arbeiten, welche gezeigt haben, dass das Zelladhäsionsmolekül CEACAM1 eine erhebliche Rolle in der Entwicklung und Progression des kutanen MM zu spielen scheint und möglicherweise in der Zukunft als prognostischer Marker dienen kann. 66 5.5. Einschränkungen der Arbeit Die Einschränkungen dieser Arbeit bestehen vor allem darin, dass aufgrund fehlender Überlebensdaten der Patienten keine Aussage bezüglich der Korrelation der Antikörperexpression Überlebensdauer unserer Patienten getroffen werden konnte. mit der 67 6. Zusammenfassung Im klinischen Alltag fällt es schwer, ein MM histologisch von einer gutartigen melanozytären Läsion sicher abzugrenzen. In der Melanomdiagnostik werden in der Regel die Antikörper HMB-45, AntiS100 sowie MART-1 und Ki67 verwendet, obwohl die Sensitivität bzw. Spezifität dieser Marker Grenzen aufweist. Wir führten daher eine systematische immunhistochemische Studie über die CEA- und CEACAM1-Proteinexpression in Melanomen und verschiedenen benignen melanozytären Tumoren durch. Über die Antikörper CEA und insbesondere dessen Adhäsionsmolekül CEACAM1 sind kürzlich Studien durchgeführt worden, in denen vor allem CEACAM1 als prognostisch bedeutsamer Marker für das MM und deren Metastasenentwicklung eingeschätzt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde an 42 BN, 22 DN und 42 SSM das Färbeverhalten von CEA bzw. von CEACAM1 mittels Immunhistochemie an Paraffinschnitten charakterisiert und verglichen. Es zeigte sich, dass sowohl CEA als auch CEACAM1 für normale Zellen der Haut negativ waren, dass sich jedoch Talg- und Schweißdrüsen positiv darstellten. Mit Hilfe von II-7, einem monoklonalen Antikörper gegen CEA, konnte außerdem veranschaulicht werden, dass es im Vergleich zwischen BN und DN sowie in SSM offensichtlich eine sukzessive Erhöhung der CEAExpression gibt, die statistisch signifikant ist. Ähnlich wie es bei der CEA-Expression der Fall war, zeigte auch die CEACAM1-Expression (29H2) eine schrittweise Erhöhung bei steigender Malignität. Es konnte in dieser Arbeit ebenfalls die deutlich stärker ausgeprägte Färbungsintensität an der invasiven Front der Melanome beobachtet werden. Weiterhin bestand eine bedeutsame Korrelation zwischen der CEACAM1-Expression und der Tumordicke nach Breslow sowie dem 68 Invasionslevel nach Clark. Je dicker der Tumor und je tiefer die Invasion, desto stärker war die Expression des Antikörpers ausgebildet. Diese Arbeit unterstützt somit zum Großteil die Ergebnisse vorheriger Arbeiten. Dort konnte gezeigt werden, dass die Mitglieder der CEAFamilie mit Ausnahme blauer Naevi in allen untersuchten Subtypen melanozytärer Naevi eine starke CEA-Expression aufweisen konnten, was in der vorliegenden Arbeit anhand der oben genannten Ergebnisse bestätigt werden konnte. Weiterhin konnten eine vorherige Studie demonstrieren, dass das Zelladhäsionsmolekül CEACAM1, welches aus der CEA-Familie stammt, eine erhebliche Rolle in der Entwicklung und Progression des kutanen MM zu spielen scheint und in der Zukunft sowohl als prognostischer Marker als auch zur antimetastatischen Therapie dienen könnte. Diese Aussage kann ebenfalls anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstützt werden. 69 Literaturverzeichnis Altmeyer, P., Hoffmann, K. (2006). Basiswissen Dermatologie. W3L-Verlag Herdecke/Bochum AWMF-Leitlinien-Register. (2007). Malignes Melanom. Nr. 032/024 Beauchemin, N., Kunath, T., Robitaille, J., Chow, B., Turbide, C., Daniels, E., Veillette, A. (1997). 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Alexander Kreuter für die Hilfe bei der Auswahl des Bildmaterials - Frau Elisabeth Panz für die freundliche Hilfestellung bei der Einarbeitung in die Immunhistologie - Meiner Familie für die wertvolle Unterstützung in jeder Hinsicht - Henny Rochol und Daniel Lichte für den netten Beistand und die Hilfe bei der Überarbeitung Lebenslauf Persönliche Daten Name: Sarah Grothe Geburtstag und Geburtsort: 12. September 1983 in CastropRauxel Familienstand: ledig Schulausbildung 1990 – 1994 Grundschule an der Langfortstraße in Herne 1994 – 2003 Otto-Hahn-Gymnasium in Herne Abitur Hochschulausbildung 2003 – 2009 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 09/2005 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 2008/2009 Praktisches Jahr im Marienhospital in Herne, Wahlfach Geriatrie 12/2009 Abschluss des Studiums mit dem Zweiten Abschnitt der Ärztlichen Prüfung seit 02/2010 Assistenzärztin der Medizinischen Klinik III des Marienhospitals in Herne Zusatzausbildungen seit 2001 Rettungsschwimmerin
