Rolle von CD4 CD25 regulatorischen T

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
- Abteilung Innere Medizin II Der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Rolle von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen
bei der chronischen HCV-Infektion
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt:
2005
von:
Tobias Elmar Böttler
geboren in:
Berlin
Dekan:
Prof. Dr. med. Christoph Peters
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. Drs. h.c. Hubert E. Blum
2. Gutachter:
Prof. Dr. med. Hans-Hartmut Peter
Jahr der Promotion: 2007
meiner Familie
4
Inhalt
1
Abkürzungsverzeichnis
6
2
Einleitung
7
2.1
T-Zell-Immunologie
7
2.2
Das Hepatitis C Virus
8
2.3
T-Zell-Antwort bei der Hepatitis C Virusinfektion
9
2.4
Regulatorische T-Zellen
9
2.5
Regulatorische T-Zellen bei Infektionskrankheiten
11
2.6
Zielsetzung
14
3
3.1
Material und Methoden
Studienpopulation
15
15
3.2
Zellkulturarbeiten
3.2.1
Isolierung von Lymphozyten
3.2.2
Zellselektionen
3.2.3
Antikörperfärbungen
3.2.4
Transwell®-Assays
3.2.5
Zytokin-Neutralisations-Assays
16
16
16
18
19
19
3.3
Antigenspezifische Untersuchungen
3.3.1
Antigenspezifisches Wachstum
3.3.2
Tetramer-Färbung
3.3.3
Intrazelluläre Zytokin-Färbung
3.3.4
CFSE-Färbung
20
20
21
22
24
3.4
Durchflusszytometrie
25
3.5
Statistik
25
5
4
Ergebnisse
26
Die Depletion von CD4+ Zellen führt zu einer gesteigerten in vitro
Expansion von HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit einer
chronischen HCV-Infektion
26
CD4+CD25+ Treg-Zellen hemmen die in vitro Expansion HCVspezifischer CD8+ T-Zellen
27
Treg-Zellen hemmen die IFN-γ Produktion von HCV-spezifischen CD8+
T-Zellen
28
4.4
Treg-Zellen vermitteln ihre Wirkung dosisabhängig
29
4.5
Die Suppression durch Treg-Zellen ist Zell-Zell-Kontakt abhängig
31
4.6
Die Inhibition durch Treg-Zellen ist unabhängig von IL-10 und TGF-β
32
4.7
Einfluss von IL-2 auf die Wirkung von Treg-Zellen
33
4.8
Stärkere Inhibition virusspezifischer T-Zell-Antworten bei Patienten mit
chronischer HCV-Infektion im Vergleich zu gesunden Probanden und
Personen, die das Virus eliminiert haben
35
Erhöhte Frequenz von Treg-Zellen bei Patienten mit chronischer HCVInfektion
37
4.1
4.2
4.3
4.9
5
Diskussion
39
6
Zusammenfassung
46
7
Literatur
47
8
Originalarbeiten
52
9
Danksagung
53
10
Lebenslauf
54
1 Abkürzungsverzeichnis
1
6
Abkürzungsverzeichnis
Ak
Antikörper
APC
Allophycocyanin (FACS-Fluoreszenz)
APZ
Antigen präsentierende Zellen
CD
Cluster of Differentiation
Cy-7
Cychrome-7 (FACS-Fluoreszenz)
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorting
FCS
Fetal Calf Serum
Flu
Influenza
FITC
Fluorescein Isothiocyanate (FACS-Fluoreszenz)
HCV
Hepatitis C Virus
HIV
Humanes Immundefizienz Virus
HLA
Humanes Leukozyten Antigen
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
i.v.
intravenös
MACS
Magnetic Cell Sorting
MHC
Major Histocompatibility Complex
n.u.
nicht untersucht
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells
PBS
Phosphate Buffered Saline
PE
Phycoerythrin (FACS-Fluoreszenz)
PMA
Phorbol Myristate Acetate
RNA
Ribonucleotid Acid
RPMI+++
Zellmedium mit definierten Zusätzen (Material und Methoden)
rpm
revolutions per minute
TGF
Transforming Growth Factor
Treg-Zellen
CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen
TZR
T-Zell-Rezeptor
2 Einleitung
2
Einleitung
2.1
T-Zell-Immunologie
7
Der Mensch ist ständig einer Vielzahl von potenziell krankheitserregenden
Mikroorganismen ausgesetzt. Der Körper ist jedoch in der Lage, die meisten dieser
Erreger zu eliminieren, ohne dass es zu einer Erkrankung kommt. Für die Elimination
der Erreger ist das Immunsystem des Menschen verantwortlich. Es wird zwischen einer
unspezifischen und einer spezifischen Immunabwehr unterschieden.
Zum unspezifischen oder angeborenen Immunsystem gehören natürliche Barrieren wie
die Haut, die Schleimhäute oder epitheliale Grenzschichten. Weiterhin werden
antimikrobielle Enzyme und Mediatoren wie Interferone, Lysozym oder C-reaktives
Protein (CRP) zu der angeborenen Immunabwehr gezählt.
Beim spezifischen Immunsystem wird zwischen humoraler und zellulärer Abwehr
unterschieden. Spezielle B-Zellen (Plasmazellen) sind als Teil der humoralen Immunität
in der Lage, spezifische Antikörper zu bilden. Diese binden den Fremdkörper (Antigen),
der anschließend phagozytiert oder durch das Komplementsystem inaktiviert wird. Die
zelluläre Immunabwehr wird vor allem durch T-Zellen vermittelt. T-Zellen werden
vereinfacht in CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen eingeteilt. Die THelferzellen haben ihre Bedeutung in erster Linie in der T-Zell-B-Zell-Kooperation und
der Regulierung der CD8+ T-Zell-Antworten. Die CD4+ T-Zellen erkennen Antigene,
die ihnen von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APZ, u.a. Makrophagen,
dendritische Zellen, B-Zellen) über MHC-Klasse-II Moleküle präsentiert werden. Diese
präsentieren exogen aufgenommene Antigene, die in Phagolysosomen zu Peptiden
fragmentiert werden. CD8+ T-Zellen erkennen Antigene, die von MHC-Klasse-I
Molekülen präsentiert werden. MHC-Klasse-I Moleküle werden von allen kernhaltigen
Körperzellen exprimiert und präsentieren den CD8+ T-Zellen zellinternes Antigen, das
im Proteasom zu Peptidfragmenten prozessiert wurde. CD8+ T-Zellen können
zytotoxische und nichtzytotoxische Effektorfunktionen ausüben. Die zytotoxische
Wirkung beruht vor allem auf der Sekretion von Perforin. Perforin zerstört die
2 Einleitung
8
Zellmembran der Zielzelle, wodurch diese abstirbt. Der nichtzytotoxische Effekt wird
u.a. über die Produktion von Zytokinen wie Interferon-γ vermittelt, wodurch der Erreger
abgetötet wird, ohne die infizierte Zelle zu zerstören.
Das Zusammenspiel der beiden T-Zell-Subpopulationen ist für die Entstehung sowie die
Aufrechterhaltung einer suffizienten T-Zell-Antwort von elementarer Bedeutung, wie
sie für die Elimination von vielen Krankheitserregern, z.B. dem Hepatitis C Virus
(HCV), notwendig ist.
2.2
Das Hepatitis C Virus
Das Hepatitis C Virus ist ein hepatotropes RNA-Virus, das zur Familie der Flaviviren
gehört. Es wird überwiegend parenteral übertragen. Zu den Risikogruppen für eine
HCV-Infektion zählen vor allem i.v. Drogenabhängige (kontaminierte Nadeln),
medizinisches Personal (Nadelstichverletzungen) und Patienten, die Bluttransfusionen
erhalten, aber auch Promiskuität gilt als Risikofaktor. In 50-70% der Fälle kann die
körpereigene Immunabwehr das Virus nicht eliminieren und es kommt zur Ausbildung
einer chronischen Infektion. Zurzeit ist die chronische HCV-Infektion mit weltweit
ungefähr 200 Millionen Erkrankten eine der häufigsten Erkrankungen überhaupt. In
Deutschland wird die Zahl der Virusträger auf 500.000 Personen geschätzt (RobertKoch-Institut). Das klinische Spektrum der chronischen HCV-Infektion reicht von
einem asymptomatischen oder milden Verlauf bis hin zu einer chronisch aktiven
Hepatitis. So entwickeln ca. 20% der Patienten mit chronisch aktiver HCV-Infektion im
Laufe der Jahre eine Leberzirrhose, auf deren Boden sich ein hepatozelluläres Karzinom
entwickeln kann [Moradpour et al., 2004]. Die Standardtherapie einer chronischen
HCV-Infektion besteht zurzeit aus einer Kombination von Interferon-α und Ribavirin,
die aber bei nur 50-80% der Patienten zu einer Elimination des Virus führt. Eine
prophylaktische oder therapeutische Vakzinierung steht bei der HCV-Infektion derzeit
nicht zur Verfügung und ist das Ziel zahlreicher Forschungsarbeiten.
2 Einleitung
2.3
9
T-Zell-Antwort bei der Hepatitis C Virusinfektion
Die grundlegenden Mechanismen, die zur Elimination oder aber der Persistenz des
Virus führen, sind noch weitgehend ungeklärt. Der HCV-spezifischen T-Zell-Antwort
wird aber allgemein eine entscheidende Rolle zugesprochen. So ist die Elimination des
Virus in der akuten Phase der Infektion mit einer multispezifischen T-Zell-Antwort
assoziiert, die sich in der virusinfizierten Leber anreichert [Diepolder et al., 1995;
Lechner et al., 2000; Thimme et al., 2001]. Weiterhin konnte durch Depletionsstudien
von CD4+ und CD8+ T-Zellen die entscheidende Rolle der T-Zellen bei der
Viruselimination direkt bewiesen werden [Grakoui et al., 2003; Shoukry et al., 2003].
Bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion werden unterschiedliche Gründe für ein
Versagen der T-Zell-Antwort diskutiert. Eine Möglichkeit ist das Auftreten von viralen
Escape-Mutanten. Das Virus entgeht dabei der virusspezifischen T-Zell-Antwort durch
Veränderung der Aminosäurenstruktur innerhalb von Epitopen, die von den T-Zellen
erkannt werden, es entstehen sogenannte virale Escapemutationen. Außerdem sind die
HCV-spezifischen T-Zell-Antworten bei der chronischen HCV-Infektion meistens
schwach ausgeprägt und weisen häufig Dysfunktionen auf, wie einen Defekt in der
Proliferationsfähigkeit oder aber ein Unvermögen, antivirale Zytokine wie Interferon-γ
zu sezernieren [Gruener et al., 2001; Wedemeyer et al., 2002]. Die Mechanismen, die
den Dysfunktionen HCV-spezifischer T-Zellen zu Grunde liegen sind bisher nicht
bekannt und sind u. a. Gegenstand dieser Doktorarbeit. So sollte in dieser Arbeit der
mögliche Einfluss von regulatorischen T-Zellen auf die Persistenz des Hepatitis C Virus
untersucht werden.
2.4
Regulatorische T-Zellen
Bereits in den 70er Jahren wurde die Existenz immunregulatorischer T-Zellen postuliert
[Gershon et al., 1970]. Es gelang jedoch nicht, eine Population zu charakterisieren, die
für die beobachteten immunregulatorischen Effekte verantwortlich gemacht werden
konnte. Dies hat dazu geführt, dass dieses Feld für viele Jahre aus dem Fokus der
immunologischen Forschung verschwunden ist. Mitte der neunziger Jahre konnten
Sakaguchi et al. zeigen, dass die Depletion von CD25+ Zellen zur Entstehung von
Autoimmunerkrankungen in Mäusen führt [Sakaguchi et al., 1995].
2 Einleitung
10
Mittlerweile wurde für viele verschiedene T-Zellsubpopulationen ein regulatorisches
Potenzial beschrieben. Die am besten charakterisierten regulatorischen T-Zellen sind
die CD4+CD25+ T-Zellen. CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (Treg-Zellen) werden
vereinfacht in natürlich vorkommende Treg-Zellen, die im Thymus reifen, und induzierte
Treg-Zellen eingeteilt. Induzierte Treg-Zellen entstehen aus CD4+CD25- Zellen, die nach
Antigenkontakt
das CD25-Molekül,
die
α-Kette des Interleukin-2-Rezeptors,
exprimieren und ihr regulatorisches Potenzial somit erst in der Peripherie, also
außerhalb des Thymus, erhalten.
Die Mechanismen, über die Treg-Zellen ihre suppressive Wirkung ausüben, sind bislang
nur unzureichend charakterisiert. Diskutiert wird die Beteiligung inhibitorischer
Zytokine, wie Interleukin-10 und TGF-β, und eine Zell-Zell-Kontakt abhängige
Wirkung. Nahezu alle verfügbaren in vitro Studien aus humanen Modellen beschreiben
eine Zell-Zell-Kontakt abhängige Suppression durch Treg-Zellen, die auch durch die
Zugabe von neutralisierenden Antikörpern gegen IL-10 und TGF-β nicht aufgehoben
werden kann [O'Garra et al., 2004]. Viele Arbeiten mit in vivo Modellen schreiben
inhibitorischen Zytokinen wie IL-10 und TGF-β eine Rolle bei der Treg-Zellvermittelten Inhibition zu [Shevach, 2002]. Insgesamt scheinen Treg-Zellen über
unterschiedliche Mechansimen zu verfügen, über die sie ihren inhibitorischen Effekt,
abhängig von der biologischen Situation, vermitteln.
Da das CD25-Molekül als Teil des IL-2-Rezeptors auch von nicht regulatorischen,
aktivierten T-Zellen exprimiert wird, ist es kein spezifischer Marker für Zellen mit
regulatorischem Potenzial. Bisher ist es jedoch noch nicht gelungen, einen
Oberflächenmarker zu identifizieren, der hochspezifisch für Zellen innerhalb der
CD4+CD25+ Population mit regulatorischem Potenzial ist. Als bester intrazellulärer
Marker konnte in Mäusen das forkhead box protein P3 (Foxp3) identifiziert werden.
Seine Relevanz für die Charakterisierung von humanen Treg-Zellen ist jedoch umstritten
[Morgan et al., 2005].
Im Folgenden werden einige Studien dargestellt, in denen die Funktion von Treg-Zellen
in unterschiedlichen Modellen untersucht wurde. So beschäftigen sich viele Arbeiten
mit der Rolle von Treg-Zellen in Autoimmunerkrankungen. Bereits Anfang der 80er
Jahre konnte gezeigt werden, dass Mäuse, denen am dritten Lebenstag der Thymus
entfernt wurde, an einem schweren Polyautoimmunsyndrom erkrankten [Kojima et al.,
2 Einleitung
11
1981]. Bei einer späteren Thymektomie wurde jedoch kein Polyautoimmunsyndrom
beobachtet. In einer weiteren Arbeit konnte diese Beobachtung dem Fehlen von
CD4+CD25+ Zellen in den thymektomierten Mäusen zugeordnet werden, da sich durch
die Gabe von CD4+CD25+ Zellen die Entstehung eines Polyautoimmunsyndroms bei
früh thymektomierten Mäusen verhindern ließ [Asano et al., 1996]. Viglietta et al.
zeigten, dass Treg-Zellen bei Patienten mit Multipler Sklerose eine deutlich schwächere
inhibitorische Funktion aufweisen als bei gesunden Probanden. Somit konnte auch in
einem humanen Modell gezeigt werden, dass Dysfunktionen von Treg-Zellen zur
Entstehung oder Aufrechterhaltung bestimmter Autoimmunerkrankungen beitragen
können [Viglietta et al., 2004].
In den letzten Jahren sind die immunmodulatorischen Eigenschaften von Treg-Zellen
auch im Gebiet der Transplantattoleranz untersucht worden. In Mausmodellen konnte
z.B. gezeigt werden, dass Treg-Zellen sich an ihrem Wirkort, also dem Transplantat,
anreichern und Transplantattoleranz vermitteln [Waldmann et al., 2004; Wood et al.,
2003]. Inwiefern Treg-Zellen auch im humanen System in der Lage sind
Transplantattoleranz zu vermitteln ist momentan Gegenstand der Forschung [Sakaguchi,
2005].
Auch in der Tumorimmunologie wurde eine Rolle von Treg-Zellen beschrieben. Bereits
1999 konnte gezeigt werden, dass die Depletion von CD4+CD25+ Zellen bei Mäusen,
denen unterschiedliche Tumorzellen injiziert wurden, zu einem vollständigen Rückgang
der Tumoren führte. In den nicht depletierten Kontrollmäusen zeigte sich jedoch ein
progredientes Tumorwachstum, das zum Tod der Mäuse führte [Onizuka et al., 1999;
Shimizu et al., 1999]. In unterschiedlichen Tumormodellen konnte mittlerweile gezeigt
werden, dass Treg-Zellen die Funktion und die Proliferation autologer, tumorspezifischer
T-Zellen in vitro inhibieren [Ormandy et al., 2005; Unitt et al., 2005; Wang et al.,
2004].
2.5
Regulatorische T-Zellen bei Infektionskrankheiten
Wie bereits erwähnt, besteht eine der Hauptaufgaben des Immunsystems in der
Kontrolle verschiedener Infektionen. Zur Elimination der Krankheitserreger bedarf es
einer starken und multispezifischen Immunantwort des Körpers. Diese starken
Immunantworten können jedoch nicht nur potenziellen Krankheitserregern, sondern
2 Einleitung
12
auch dem eigenen Körper erheblichen Schaden zufügen. Deshalb müssen solche
Immunantworten einer adäquaten Kontrolle unterliegen. Verschiedene Arbeiten haben
gezeigt, dass Treg-Zellen in der Kontrolle dieser Immunantworten eine entscheidende
Rolle spielen können [Belkaid et al., 2005; Mittrucker et al., 2004].
Als Beispiel einer bakteriellen Infektion ist die Rolle von Treg-Zellen bei der
Helicobacter pylori-Infektion aufgezeigt worden. T-Zell-defiziente Mäuse erhielten
entweder CD4+ T-Zellen oder ausschließlich CD4+CD25- T-Zellen (also keine TregZellen) bevor sie oral mit H. pylori infiziert wurden. In der Gruppe, die CD4+CD25- TZellen erhalten hatten, konnte anschließend eine deutlich geringere Kolonialisierung des
Keims als in der ersten Gruppe nachgewiesen werden. Allerdings erkrankten diese
Mäuse an einer massiven Entzündung des Magens [Raghavan et al., 2003]. Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Anwesenheit von CD4+CD25+ Treg-Zellen zu
einer schwächeren T-Zell-Antwort führt, die den Keim nicht eliminieren kann, aber so
die Magenschleimhaut vor einer überschießenden Immunantwort geschützt wird. Auch
im humanen System konnte gezeigt werden, dass Treg-Zellen Helicobacter-spezifische
T-Zell-Antworten in einem in vitro System inhibieren [Lundgren et al., 2003].
Bei parasitären Infektionen konnte ebenfalls eine Wirkung von Treg-Zellen
nachgewiesen werden. So scheinen Treg-Zellen eine wichtige Rolle bei der Persistenz
von Leishmania major zu spielen, indem sie am Ort der Infektion akkumulieren und
dort die T-Zell-Antworten limitieren [Belkaid et al., 2002].
Weiterhin wurde kürzlich gezeigt, dass Mäuse, denen vor der Infektion mit einem
letalen Stamm von Plasmodium yoelii die CD4+CD25+ Treg-Zellen depletiert wurden,
überleben, während nicht depletierte Kontrollmäuse versterben. Dieser Schutz ist
bedeutenderweise mit einem massiven Ansteigen der pathogenspezifischen T-ZellAntworten assoziiert [Hisaeda et al., 2004]. Diese Beobachtung zeigt, dass die
Versuchstiere in der Abwesenheit von Treg-Zellen eine stärkere T-Zell-Antwort
generieren konnten.
Eine Vielzahl von Arbeiten hat sich mittlerweile mit der Rolle von Treg-Zellen bei
chronisch viralen Erkrankungen beschäftigt, insbesondere bei der HIV-Infektion. Durch
Depletionsassays oder Kokultivierung verschiedener T-Zell-Subpopulationen wurde in
2 Einleitung
13
diesen Arbeiten gezeigt, dass Treg-Zellen die Expansion von CD4+ und CD8+ Effektor
T-Zellen sowohl antigenspezifisch als auch unspezifisch inhibieren [Aandahl et al.,
2004; Andersson et al., 2005; Kinter et al., 2004; Weiss et al., 2004]. Ein ähnlicher
Effekt von Treg-Zellen auf die virusspezifische T-Zell-Expansion konnte auch für die
CMV-Infektion gezeigt werden [Aandahl et al., 2004].
Zu Beginn dieser Doktorarbeit lagen keine Arbeiten vor, die sich mit dem Einfluss von
Treg-Zellen auf die HCV-spezifische Immunantwort beschäftigt haben, daraus ergab sich
folgende Zielsetzung.
2 Einleitung
2.6
14
Zielsetzung
Ziel dieser Doktorarbeit war es, den Einfluss von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen
(Treg-Zellen) auf die CD8+ T-Zell-Antwort bei der chronischen HCV-Infektion zu
untersuchen. Hierzu sollten folgende Fragestellungen untersucht werden:
1. Haben Treg-Zellen einen inhibitorischen Effekt auf die Expansion und die IFN-γProduktion von HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen?
2. Ist die Wirkung von Treg-Zellen dosisabhängig?
3. Wird die Wirkung von Treg-Zellen durch inhibitorische Zytokine vermittelt, oder
bedarf es bei der Wirkung von Treg-Zellen einem direkten Zell-Zell-Kontakt?
4. Welche Rolle hat das Zytokin Interleukin-2 bei der Wirkung und der
Proliferation von Treg-Zellen?
5. Ist die Wirkung von Treg-Zellen bei gesunden Probanden und Personen, die das
Virus eliminiert haben, vergleichbar mit der von Patienten mit chronischer
HCV-Infektion?
6. Ist der Effekt von Treg-Zellen auf HCV-spezifische T-Zellen beschränkt?
7. Unterscheidet sich die Frequenz von zirkulierenden Treg-Zellen im Blut von
Patienten mit chronischer HCV-Infektion von der von gesunden Probanden und
Personen, die das Virus eliminiert haben?
Insgesamt war es somit das Ziel dieser Doktorarbeit, die biologische Relevanz von
CD4+CD25+ Treg-Zellen bei der chronischen HCV-Infektion zu untersuchen.
3 Material und Methoden
15
3
Material und Methoden
3.1
Studienpopulation
Vollblutproben von Patienten mit chronischer HCV-Infektion, von Personen, die das
Hepatitis C Virus entweder spontan oder therapieinduziert eliminiert haben und von
gesunden Blutspendern wurden nach Aufklärung und Einverständnis der Spender zu
einer Aufnahme in diese Studie entnommen. Ein positives Votum der lokalen
Ethikkommission
für
diese Untersuchungen
liegt
vor. Alle
in
die Studie
eingeschlossenen Personen waren positiv für das humane-Leukozyten-Antigen-A2
(HLA-A2). Eine Zusammenstellung der laborchemischen und virologischen Daten zeigt
Tabelle 3.1.
Tabelle 3.1 Daten der Patienten
Patient
(chron. HCV)
Alter Geschlecht
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
38
41
25
47
49
30
39
46
F
M
M
F
F
M
M
M
Person
(HCV eliminiert)
Alter
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
44
31
43
49
53
36
53
27
ALT
(U/l)
HCV
PCR
Genotyp
Viruslast
(GE/ml)
59
109
62
83
14
41
100
150
+
+
+
+
+
+
+
+
1
1
1
1
1
1
1
1
500.000
29.000.000
150.000
1.700.000
2.000.000
n.u.
900.000
5.000
Anti-HCV
Geschlecht
Ak
F
M
M
M
M
M
F
F
+
+
+
+
+
+
+
+
HCV
PCR
Elimination
-
Therapie
spontan
Therapie
spontan
spontan
Therapie
Therapie
spontan
3 Material und Methoden
3.2
Zellkulturarbeiten
3.2.1
Isolierung von Lymphozyten
16
EDTA-antikoagulierte Vollblutproben wurden im Verhältnis 1:1 mit PBS (Invitrogen,
USA) gemischt. Anschließend wurden 15 ml Röhrchen mit je 5 ml Lymphozyten
Separations Medium (PAA, Österreich) gefüllt. Das verdünnte Blut wurde vorsichtig in
10 ml Portionen auf das Separationsmedium geschichtet und bei 2000 rpm 20 min. ohne
Bremse zentrifugiert. Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten (zusammen PBMC:
Mononukleare Zellen des Peripheren Blutes) wurden durch die Zentrifugation über den
Gradienten von den anderen zellulären Bestandteilen (Erythrozyten, Thrombozyten etc.)
und dem Plasma getrennt und konnten so nach der Zentrifugation zwischen Plasma und
Separationsmedium vorsichtig entnommen werden. Da bei der Entnahme stets sowohl
etwas Plasma als auch Separationsmedium mit entnommen werden, wurden die PBMC
zweimal in 50 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden anschließend in PBS gelöst, bei
1600 rpm für 10 min. mit Bremse abzentrifugiert und erneut in PBS resuspendiert. Nach
dem zweiten Waschen wurde das Zellpellet in 20-30 ml PBS resuspendiert.
Ein Teil der Zellen wurde im Verhältnis 1:4 mit 0,4 % Trypan-Blau gefärbt und in einer
Neubauer Zählkammer gezählt.
3.2.2
Zellselektionen
CD4 Depletion: CD4+ Zellen wurden mit zwei unterschiedlichen Methoden von den
PBMC getrennt:
CD4 Dynabeads (Dynal Biotech, Norwegen): Es wurden je 107 Zellen in 1 ml DynalPuffer (PBS + 1% FCS) gelöst und 144 µl CD4 Dynabeads hinzu gegeben. Nach einer
Inkubation von 30 min. bei 4°C unter stetiger Rotation wurde das Röhrchen mit der
Zellsuspension in einen Dynal-MPC-Magneten gestellt. Die CD4 depletierte Fraktion
konnte anschließend am Boden des Röhrchens entnommen werden.
CD4+CD25+ Regulatorische T-Zellen Isolations Kit (Miltenyi Biotec, USA): Die zu
selektionierenden Zellen wurden in 90 µl MACS- Puffer (PBS, pH 7,2 plus 0,5% BSA
(bovine serum albumine) und 2mM EDTA) je 107 Zellen gelöst. Im ersten AntikörperSchritt wurden alle nicht CD4+ Zellen mit Biotin- Antikörpern markiert. Hierzu wurden
10 µl Antikörper Cocktail (Antikörper gegen: CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56,
3 Material und Methoden
17
CD123, TZR γ/δ und Glycophorin A) je 107 Zellen zur Suspension hinzu gegeben und
die Zellsuspension für 10 min. bei 4°C (im Kühlschrank) inkubiert.
Im zweiten Antikörper-Schritt wurden Anti-Biotin MicroBeads verwendet, die gegen
Biotin gerichtet sind und so an die Biotin-markierten Zellen binden. An die Anti-Biotin
Antikörper sind kleine Magneten (MicroBeads) gekoppelt. Nach einer Inkubation von
15 min. im Kühlschrank wurde die Suspension mit 10 ml MACS Puffer gewaschen. Der
Überstand wurde abgenommen und das Pellet erneut in 1 ml MACS Puffer gelöst.
Zur Vorbereitung der Separation wurde eine LD-Säule in einen MidiMACS-Magneten
eingehängt, die die antikörpermarkierten Zellen im Magnetfeld halten soll. Die Säule
wurde zunächst mit 2 ml MACS-Puffer gespült, anschließend wurde ein 15 ml
Röhrchen unter der Säule platziert, in der die unmarkierten Zellen (CD4+ Zellen)
aufgefangen werden sollten. Die Zellsuspension wurde anschließend auf die Säule
pipettiert. Nachdem die Suspension durch die Säule gelaufen war, wurde diese zweimal
mit
je
1
ml
MACS-Puffer
gewaschen.
Die
in
der
Säule
verbliebenen
antikörpermarkierten Zellen wurden dann in einem zweiten Röhrchen aufgefangen.
Dazu wurde die Säule aus dem Magnetfeld entfernt und nach Zugabe von 2 ml Puffer
mit einem dazugehörigen Stopfen durchfahren. Somit wurden die CD4 Zellen von der
Säule getrennt und in einem separaten Röhrchen aufgefangen (Abbildung 3.1, 1-3).
CD25 Selektion: CD4+ T-Zellen wurden für 15 min. in 90 µl MACS- Puffer und mit 10
µl Anti-CD25-MicroBeads je 107 Zellen bei 4° C inkubiert. Nach ausführlichem
Waschen wurden die Zellen in 500 µl MACS- Puffer resuspendiert. Für die Selektion
wurde eine MS-Säule in einen MiniMACS-Magneten gehängt. Die Suspension wurde
auf die Säule gegeben und die CD25- Fraktion aufgefangen. Die CD25+ T-Zellen
wurden wie oben beschrieben aus der Säule entfernt und in einem getrennten Gefäß
aufgefangen (Abbildung 3.1, 4-6).
3 Material und Methoden
18
CD4CD4+
CD25+
CD4+
CD25-
1.
4.
Magnet
Magnet
2.
CD4+ Zellen
3.
CD4 depletierte Zellen
5.
CD4+CD25- Zellen
6.
CD4+CD25+ Zellen
Abbildung 3.1 Schema der Zellselektionen mit paramagnetischen Microbeads (MACS). 1-3:
Trennung der CD4+ Zellen von CD4- Zellen; 4-6: Isolierung der Treg-Zellen aus der
CD4+ Population
3.2.3
Antikörperfärbungen
Um die Reinheit der Selektionen oder die Frequenz von zirkulierenden CD4+CD25+ TZellen im Blut zu bestimmen wurden Antikörperfärbungen durchgeführt. PBMC oder
selektionierte T-Zell-Subpopulationen wurden in PBS gelöst und je 0,1 – 0,5 x 106
Zellen auf einer 96-Loch-Platte ausplattiert. Mit einem Blocking-Antikörper (IgG1, BD
PharMingen, USA) wurden die unspezifischen Bindungsstellen blockiert (15 min.
Inkubation). Anschließend wurden die Zellen für 5-10 min. mit Antikörpern gegen
CD25 (PE, Miltenyi Biotec) und CD4 (FITC, Miltenyi Biotec) inkubiert. Parallel dazu
wurden stets Isotype-Kontrollfärbungen durchgeführt. Nach ausführlichem Waschen
wurden die Zellen mit je 100 µl CellFIX (BD PharMingen) fixiert. Anschließend
wurden die Proben durchflusszytometrisch gemessen (siehe Kapitel 3.4). Die Reinheit
der einzelnen T-Zell-Subpopulationen lag immer über 85% (repräsentativer Plot von
selektionierten CD4+CD25+ Treg-Zellen, Abbildung 3.2).
19
10 2
100
10 1
CD4 FITC
10 3
10 4
3 Material und Methoden
10 0
10 1
10 2
103
104
CD25 PE
Abbildung 3.2 Density Plot einer Population von CD4+CD25+ Treg-Zellen zur Kontrolle der
Zellselektion
3.2.4
Transwell®-Assays
Versuche mit Transwell-Platten ermöglichen eine Aussage über die Notwendigkeit von
direktem Zell-Zell-Kontakt für immunologische Zell-Zell-Interaktionen, da zwei
definierte Zellpopulationen im gleichen Medium kultiviert werden können, ohne dass
ein Zell-Zell-Kontakt besteht. Beide Populationen werden durch eine Membran getrennt
deren Porengröße 0,4 µm beträgt. Zytokine, die evtl. sezerniert werden, können sich
gleichmäßig im Medium verteilen und ihre Zielzellen erreichen.
CD4 depletierte PBMC wurden als CD8+ angereicherte Effektorpopulation in dem
Medium suspendiert und in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte gegeben. Treg-Zellen
wurden auf die Membran gegeben, die anschließend in die Vertiefung mit der
Zellsuspension gegeben wurde. Stimulation und Kultur erfolgten wie in Kapitel 3.3.1
ausführlich beschrieben.
3.2.5
Zytokin-Neutralisations-Assays
Mithilfe von Antikörpern, die gegen definierte Zytokine gerichtet sind, ist es möglich,
die von den entsprechenden Zytokinen vermittelten Signalwege zu unterbinden. Diese
3 Material und Methoden
20
Technik wurde angewandt, um den möglichen Einfluss bestimmter Zytokine auf die
CD4+CD25+ T-Zell-vermittelte Inhibition zu untersuchen. Dazu wurden den Kokulturen
von CD4 depletierten PBMC und Treg-Zellen Antikörper gegen Interleukin 10 bzw.
TGF-β hinzu gegeben. Stimulation und Kultur wurden wie in Kapitel 3.3.1 ausführlich
beschrieben durchgeführt.
3.3
Antigenspezifische Untersuchungen
Zellselektionen
PBMC
CD4 depletierte PBMC
(CD8+ angereichert)
CD4+
CD4+CD25-
CD4+CD25+
(Treg-Zellen)
Kokulturen
CD4 depletierte PBMC plus
CD4+CD25CD4+CD25+
(Treg-Zellen)
HCV-Peptid
Stimulation und
7 Tage Kultur
Abbildung 3.3 Schema der Zellselektionen und der Kokulturen
3.3.1
Antigenspezifisches Wachstum
Je 2 x 106 PBMC oder CD4 depletierte PBMC wurden in 1 ml RPMI+++ Zellmedium
(Invitrogen, USA; Zusätze: 10% FCS, 1,5% Hepes-Puffer (1M) und
+
Penicillin/Streptomycin) gelöst und alleine oder mit CD4 CD25
+
1%
T-Zellen oder
CD4+CD25- T-Zellen in einem bestimmten Verhältnis (z.B. 3:1 oder 10:1) in einer 48Loch-Platte kultiviert (Abbildung 3.3). Die Stimulation erfolgte mit 0,5 µg/ml antiCD28 und mit 10 µg/ml synthetischem HCV- oder Influenza-Peptid. Die
Aminosäuresequenzen und die Position aller in der Studie angewandten Peptide ist in
3 Material und Methoden
21
Tabelle 3.2 angegeben. In einigen Versuchen wurden die CD4+CD25+ T-Zellen
unmittelbar vor der Kultur bestrahlt (30Gy), hierdurch werden Zellteilungen unmöglich
gemacht. In einem Experiment wurden die Kokulturen mit 2 U/ml, 20 U/ml und 200
U/ml rekombinantem Interleukin-2 (Hoffmann-La Roche, Schweiz) stimuliert. Nach
einmaligem Mediumwechsel am dritten Tag wurden die Zellkulturen nach 7 Tagen mit
einem der folgenden antigenspezifischen Nachweisverfahren analysiert.
Tabelle 3.2 Immundominante Peptide
Virus
HCV
HCV
HCV
Influenza
3.3.2
Peptid
1
2
3
4
Aminosäuresequenz
CINGVCWTV
KLVALGINAV
ALYDVVTKL
GILGFVFTL
Position
NS3 1073
NS3 1406
NS5 2594
Matrix 58
Tetramer-Färbung
Mit dieser Methode ist es möglich, antigenspezifische Zellen direkt zu markieren, so
dass sie mit der Durchflusszytometrie detektiert werden können. Die T-Zelle erkennt
Antigene, die an MHC-Moleküle gebunden sind. Ein Tetramer besteht aus vier solcher
Komplexe, hierdurch wird die Avidität der Wechselwirkung zwischen T-Zell-Rezeptor
und MHC-Peptid-Komplex erhöht. Die vier MHC-Peptid-Komplexe sind an eine
Fluoreszenz gekoppelt, die es ermöglicht Tetramer-markierte antigenspezifische Zellen
mithilfe der Durchflusszytometrie zu visualisieren. Die verwendeten Tetramere
korrespondieren mit den in Tabelle 3.2 angegebenen Peptiden. Abbildung 3.4 zeigt das
Prinzip einer Tetramer-Färbung und eine entsprechende FACS-Analyse.
Für jede T-Zell-Kultur (z.B. PBMC oder CD4 depletierte PBMC + CD4+CD25+) wurde
eine Isotype-Kontrolle, eine CD8-Kontrolle ohne Tetramer und 1-2 Proben mit CD8Färbung und Tetrameren angesetzt. Dazu wurden je 0,2 x 106 Zellen pro Vertiefung in
200 µl PRMI+++ Medium gelöst und auf eine 96-Loch-Platte gegeben.
Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 13000 rpm wurden in jede Vertiefung 0,5 µl
Tetramer (APC markiert) und 50 µl Stain- Buffer (SB) gegeben und für 20 min. bei
37°C und 5,0% CO2 inkubiert. Anschließend wurden alle Proben zweimal mit je 100 µl
SB gewaschen und mit einem Blocking-Antikörper (IgG1, BD PharMingen), der die
3 Material und Methoden
22
unspezifischen Bindungsstellen belegt, inkubiert. Nach einer Inkubation für 20 min. bei
4° C wurde die CD8-Färbung entweder mit einem PE- oder Cy-7 PE-markierten CD8Antikörper (BD PharMingen) durchgeführt. Dementsprechend wurde neben dem APC
Isotype-Ak entweder ein PE oder ein Cy-7 PE Isotype-Ak verwendet. Die Inkubation
erfolgte wie beim Blocking-Ak. Anschließend wurden die Proben dreimal mit 100 µl
SB gewaschen und für die Messung an der FACS- Maschine mit je 100 µl CellFIX (BD
PharMingen) fixiert.
B
TZR
MHC-Klasse-I
Molekül
3
2
1
0
APC
CD8
10 10 10 10 10
TZR
Cy7 PE-markierter
CD8 Antikörper
APC-markiertes
Tetramer
Tetramer APC
4
A
0
10
1
10
2
10
3
10
CD8 Cy7
Peptid
Abbildung 3.4 Tetramer-Färbung. (A) Schema einer Tetramer-markierten CD8+ T-Zelle (B) FACSAnalyse einer CD8+ Tetramer+ T-Zell-Population (rechter oberer Quadrant)
3.3.3
Intrazelluläre Zytokin-Färbung
Da die Interferon-γ produzierenden Zellen das gebildete Zytokin aus der Zelle
sezernieren, ist es schwierig zu bestimmen, welche Zellen das Zytokin produzieren und
welche nicht. Bei der intrazellulären-Interferon-γ-Färbung wird die Zytokinfreisetzung
durch Zugabe von Golgi-Plaque (Brefeldin A) gehemmt, die Zellmembran
permeabilisiert und ein Antikörper gegen IFN-γ hinzu gegeben, der somit die Zellen
markiert, die auf eine Peptidstimulation mit einer IFN-γ Produktion reagiert haben. Mit
dieser
Methode
können
Zellen,
die
peptidspezifisch
IFN-γ
produzieren,
durchflusszytometrisch erfasst werden. Eine IFN-γ-Färbung ist in Abbildung 3.5
schematisch dargestellt.
4
10
3 Material und Methoden
23
Die Zellen wurden wie schon bei der Tetramer-Färbung nach 7 Tagen in Kultur in eine
96-Loch-Platte gegeben. Für jede T-Zell-Kultur wurden 4-5 unterschiedliche Färbungen
angefertigt.
•
Eine Isotype-Kontrolle.
•
Eine Negativ-Kontrolle, um zu bestimmen, wie viel Prozent der CD8+ T-Zellen
ohne erneute Peptid-Stimulation IFN-γ produzieren.
•
Jeweils ein Ansatz für jedes Peptid, mit dem die Kultur zu Beginn stimuliert
wurde, so dass die Peptid-induzierte IFN-γ Produktion gemessen werden konnte
(max. 2 Peptide).
•
PMA als Positiv-Kontrolle, dies stimuliert die IFN-γ Produktion von T-Zellen
unabhängig vom T-Zell-Rezeptor.
Nach dem Ausplattieren wurden die Ansätze mit den entsprechenden Peptiden und
PMA für 5 Stunden inkubiert. Außerdem wurde den Zellen noch das Zellgift Brefeldin
A hinzu gegeben.
Nach 5 stündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde die 96-Loch-Platte
abzentrifugiert. Anschließend wurden die Proben zweimal mit je 100 µl SB gewaschen.
Anschließend wurde in alle Vertiefungen ein Blocking-Antikörper (IgG1, BD
PharMingen) gegeben, der die unspezifischen Bindungsstellen belegt. Nach einer 20minütigen Inkubation bei 4°C wurde die CD8-Färbung mit einem PE-markierten CD8Antikörper (BD PharMingen) durchgeführt. Die Inkubation erfolgte wie beim BlockingAk. Nach der CD8-Färbung wurden die Zellen abzentrifugiert, gewaschen und für die
intrazelluläre Zytokinfärbung fixiert und permeabilisiert. Hierfür wurden die Zellen mit
Cytofix/Cytoperm (BD PharMingen) für exakt 15 min. bei 4°C inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen erneut gewaschen und mit FITC-markiertem Antikörper gegen
intrazelluläres IFN-γ inkubiert. Parallel wurden bei allen Antikörper-Schritten die
analogen Isotype-Kontrollfärbungen durchgeführt. Nun wurde die Platte dreimal mit
100 µl SB gewaschen und für die Messung an der FACS- Maschine mit je 100 µl
CellFIX (BD PharMingen) fixiert.
3 Material und Methoden
24
B
104
A
data.018
IFN-γ FITC
CD8
Intrazellulärer
FITC-markierter
IFN−γ Antikörper
100
PE-markierter
CD8 Antikörper
101 102 103
IFN−γ
100
100
101
101
102
CD8 PE
102
10 3
103
104
104
CD8 PE
Abbildung 3.5 Intrazelluläre Zytokin-Färbung (A) Schema einer Interferon-γ produzierenden,
Antikörper-markierten CD8+ T-Zelle (B) FACS-Analyse einer CD8+ IFN-γ+ T-ZellPopulation (rechter oberer Quadrant)
3.3.4
CFSE-Färbung
Das Proliferationsverhalten von Zellen in einer Kultur lässt sich mit der CFSE-Färbung
untersuchen. Die Zellen werden zu Beginn der Kultur mit CFSE (5-(und-6)Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl Ester, Molecular Probes, USA) beladen, die
jede Zelle bei der Zellteilung gleichmäßig an beide Tochterzellen weitergibt. Da diese
Substanz fluoreszierende Eigenschaften hat, kann mittels Durchflusszytometrie über die
Farbintensität indirekt darauf geschlossen werden, wie viele Zellteilungen eine Zelle in
einer Kultur hinter sich hat. Abbildung 3.6 zeigt schematisch das Prinzip der CFSEFärbung.
Je 107 CD4 depletierte PBMC wurden in 1 ml PBS resuspendiert und mit 1 µmol/l
CFSE für 10 min. bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal in 10 ml
RPMI Zellmedium gewaschen und in unterschiedlichen Verhältnissen mit unmarkierten
CD4+CD25+ Treg-Zellen oder mit CD4+CD25- Zellen kultiviert. Stimulation und Kultur
erfolgte wie in Kapitel 3.3.1 beschrieben. Für die Auswertung der Kultur wurde eine
Tetramer-Färbung durchgeführt.
3 Material und Methoden
25
B
CFSE
100
101
1. Zellteilung
CD8 Cy7 PE
102
103
104
A
100
101
102
CFSE
103
104
2. Zellteilung
Abbildung 3.6 CFSE-Färbung (A) Schema der Weitergabe von absorbiertem CFSE bei Zellteilungen
(B) FACS-Analyse nach Kultur zeigt CD8+ T-Zellen, die proliferiert haben (linker
oberer Quadrant) und CD8+ T-Zellen, die nicht proliferiert haben (rechter oberer
Quadrant)
3.4
Durchflusszytometrie
Die einzelnen Proben wurden nach den Antikörperfärbungen in spezielle FACSRöhrchen überführt. Die Messungen wurden an einem FACSCalibur-Gerät (BD
Biosciences) mithilfe von Cell Quest Software (BD Biosciences) durchgeführt. Bei den
Auswertungen wurden ausschließlich Zellen im Lymphozyten-Gate berücksichtigt.
3.5
Statistik
Die statistische Signifikanz der Ergebnisse aus den Kapiteln 4.8 und 4.9 wurde mit dem
Mann-Whitney U-Test geprüft, wobei p<0,05 als Signifikanzschwelle festgelegt wurde.
4 Ergebnisse
26
4
Ergebnisse
4.1
Die Depletion von CD4+ Zellen führt zu einer gesteigerten in vitro
Expansion von HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit einer
chronischen HCV-Infektion
CD4+ Zellen werden einerseits für das Priming und die Expansion HCV-spezifischer
CD8+ T-Zellen benötigt um das Virus zu eliminieren [Kalams et al., 1998], andererseits
gibt es eine Subpopulation von CD4+ Zellen, der in verschiedenen Modellen ein
inhibitorisches Potenzial bezüglich der Proliferation und Funktion antigenspezifischer
CD8+ T-Zellen zugeschrieben wird [Shevach, 2002]. Zuerst sollte untersucht werden,
ob CD4+ Zellen bei der chronischen HCV-Infektion die Expansion von HCVspezifischen CD8+ T-Zellen unterstützen oder eine inhibitorische Funktion aufweisen.
Hierzu wurden sowohl PBMC als auch CD4 depletierte PBMC mit HCV-Peptid
stimuliert und für 7 Tage kultiviert. Anschließend wurde die Expansion HCVspezifischer T-Zellen durch eine Tetramer-Färbung bestimmt.
Interessanterweise führte die Depletion von CD4+ Zellen zu einer deutlich stärkeren
Expansion von virusspezifischen CD8+ T-Zellen (Abbildung 4.1). Dieser Effekt konnte
bei allen Patienten mit chronischer Hepatitis C Virusinfektion nachgewiesen werden,
bei denen eine CD8+ T-Zell-Antwort gegen eines der immundominanten Epitope mittels
Tetramer-Technologie nachweisbar war. Bei einer Patientin (C1) konnten wir diesen
Effekt sogar für zwei unterschiedliche Epitope zeigen.
Diese Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass bei der chronischen HCV-Infektion eine
inhibitorische Funktion innerhalb der CD4+ Zellen überwiegt.
4 Ergebnisse
27
9
8
% tetramer+/ CD8+
7
6
5
4
3
2
1
0
Patient/
Peptid
C1/2 C1/3
C2/3
C3/2
C4/1
C5/2
C6/2
C7/3
C8/1
Abbildung 4.1 Depletion von CD4+ Zellen steigert die Expansion der HCV-spezifischen CD8+ TZellen. PBMC (weiße Balken) und PBMC nach Depletion der CD4+ Zellen (schwarze
Balken) wurden mit HCV-Peptid stimuliert und 7 Tage kultiviert. Bei allen untersuchten
Patienten war die HCV-spezifische CD8+ T-Zell-Expansion nach Depletion der CD4+
Zellen verstärkt.
4.2
CD4+CD25+ Treg-Zellen hemmen die in vitro Expansion HCV-spezifischer
CD8+ T-Zellen
Um der Frage nachzugehen, ob Treg-Zellen für den inhibitorischen Effekt innerhalb der
CD4+ Zellpopulation verantwortlich sind, wurde die CD4+ Zellpopulation von der CD4Zellpopulation getrennt. Die CD4+ Zellen wurden in CD4+CD25- Zellen und in
CD4+CD25+ (Treg-Zellen) Zellen aufgetrennt. Nach diesen Selektionsschritten
resultieren nun drei Zellpopulationen: CD4 depletierte PBMC, CD4+CD25- Zellen und
Treg-Zellen. CD4 depletierte PBMC wurden alleine, in Anwesenheit von CD4+CD25Zellen (Verhältnis 3:1) oder Treg-Zellen (Verhältnis 3:1) in Kultur genommen und mit
HCV-spezifischen Peptiden sowie anti-CD28 Antikörpern stimuliert (Abbildung 3.3).
Nach 7 Tagen Kultur erfolgte die Auswertung durch Tetramer-Färbungen.
Interessanterweise führte die Kokultivierung von CD4 depletierten PBMC mit
autologen CD4+CD25- Zellen zu einer deutlichen Steigerung der Expansion von HCVspezifischen CD8+ T-Zellen verglichen mit der Kultur ohne CD4+ Zellen. Im Gegensatz
4 Ergebnisse
28
dazu zeigte sich in Gegenwart von Treg-Zellen eine deutliche Inhibition der HCVspezifischen Expansion (Abbildung 4.2).
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der CD4+ Zellpopulation, nämlich die
CD4+CD25+ Treg-Zellen, einen inhibitorischen Effekt auf die Proliferation von CD8+ TZellen hat, wohingegen die CD4+CD25- Zellen die HCV-spezifische Expansion der
CD8+ T-Zellen unterstützen.
1,8
14
10
1
% tetramer+/ CD8+
5
0
0
Patient C1 / Peptid 2
1
1,8
Patient C1 / Peptid 3
1
0,5
0
0
Patient C2 / Peptid 3
Patient C3 / Peptid 2
Abbildung 4.2 Treg-Zellen inhibieren die Expansion HCV-spezifischer CD8+ T-Zellen. CD4
depletierte PBMC wurden allein (graue Balken), in Anwesenheit von CD4+CD25Zellen (schwarze Balken) oder Treg-Zellen (weiße Balken) nach HCV-PeptidStimulation für 7 Tage kultiviert. Die Zugabe von CD4+CD25- Zellen steigert die HCVspezifische Expansion von CD8+ T-Zellen, die Zugabe von Treg-Zellen inhibiert die
Expansion im Vergleich zu allein wachsenden CD4 depletierten PBMC.
4.3
Treg-Zellen hemmen die IFN-γ Produktion von HCV-spezifischen CD8+ TZellen
Als nächstes untersuchten wir, ob Treg-Zellen auch die intrazelluläre IFN-γ Produktion
der CD8+ T-Zellen inhibieren. Dazu wurde der gleiche Versuchsansatz wie in Kapitel
4.2 beschrieben verwendet. Nach der Kultur erfolgte die Auswertung jedoch durch eine
intrazelluläre IFN-γ-Färbung.
4 Ergebnisse
29
Es zeigte sich, dass die durch HCV-Peptid-Stimulation induzierte Produktion von IFN-γ
in vergleichbarer Weise durch die Wirkung von Treg-Zellen beeinflusst wird wie die
Proliferation. Die intrazelluläre Produktion dieses Zytokins durch CD8+ T-Zellen wird
hingegen
in
der
Anwesenheit
von
CD4+CD25-
Zellen
verstärkt.
Der
immunmodulatorische Effekt von Treg-Zellen auf HCV-spezifische Effektorzellen
konnte also sowohl für die Proliferationskapazität als auch für die Zytokinproduktion
nachgewiesen werden (Abbildung 4.3).
CD4 depletierte PBMC plus
CD4+CD25-
-
10 2
10 3
CD8 PE
4
3
10
2
1
10
0
100
104
101
102
103
CD8 PE
10
10 1
4,5%
10
10
1
10
0
10
100
data.043
10
4
10
26%
2
10
2
10
1
10
10
0
IFN-γ
data.038
10
3
21%
3
10
4
data.033
CD4+CD25+
104
100
101
102
103
CD8 PE
104
CD8
Patient C1 / Peptid 3
Abbildung 4.3 Treg-Zellen inhibieren die IFN-γ Produktion von HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen.
CD4 depletierte PBMC wurden allein (graue Balken), in Anwesenheit von CD4+CD25Zellen (schwarze Balken) oder Treg-Zellen (weiße Balken) nach HCV-Peptid
Stimulation für 7 Tage kultiviert. Die Zugabe von CD4+CD25- Zellen steigert die HCVspezifische IFN-γ Produktion von CD8+ T-Zellen, die Zugabe von Treg-Zellen inhibiert
die IFN-γ Produktion im Vergleich zu allein wachsenden CD4 depletierten PBMC.
4.4
Treg-Zellen vermitteln ihre Wirkung dosisabhängig
Um der Frage nachzugehen, ob der prozentuale Anteil von Treg-Zellen in einer Kultur
entscheidend für das Ausmaß der suppressiven Wirkung ist, wurden CD4 depletierte
PBMC
in
Anwesenheit
unterschiedlicher
Konzentrationen
von
Treg-Zellen
peptidspezifisch kultiviert. Die CD4 depletierten PBMC wurden zunächst mit dem
Proliferationsmarker
CFSE
beladen.
Anschließend
wurden
Treg-Zellen
in
unterschiedlichen Verhältnissen zu der CD4- Effektorpopulation hinzugegeben. Da
bereits mit einem Verhältnis von 3:1 (CD4 depletierte PBMC: Treg-Zellen) eine nahezu
komplette Inhibition der HCV-spezifischen T-Zell-Proliferation beobachtet wurde
4 Ergebnisse
30
(Kapitel 4.2), wurden für diesen Versuch Verhältnisse von 10:1 (9% Treg), 15:1 (6,25%),
30:1 (3,2%) und 100:1 (0,99%) gewählt. Nach 7 Tagen in vitro Kultur wurde die
Expansion der HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen mithilfe einer Tetramer-Färbung
ermittelt.
Eine nahezu maximale Inhibition zeigte sich bei einem Verhältnis von 3:1 und bei
einem Verhältnis von 10:1 (CD4 depletierte PBMC: CD4+CD25+ Treg-Zellen).
Weiterhin zeigte sich, dass ein geringer werdender Anteil von Treg-Zellen in der Kultur
zu einer stärkeren peptidspezifischen CD8+ T-Zell-Expansion führte. Mit der CFSEFärbung konnte gezeigt werden, dass bei Verhältnissen von 3:1 und 10:1 (CD4
depletierte PBMC: CD4+CD25+ Treg-Zellen) nur ein geringer Anteil Tetramer+ CD8+ TZellen proliferiert hat. Ab einem Verhältnis von 15:1 kam es zu einer Zunahme der
HCV-spezifischen CD8+ T-Zell-Proliferation (Abbildung 4.4). Dieser Versuch konnte
also auf der Einzel-Zell-Ebene zeigen, dass Treg-Zellen die Proliferation HCVspezifischer CD8+ T-Zellen dosisabhängig inhibieren.
4 Ergebnisse
31
% tetramer+/CD8+
5
2,5
0
102
CFSE
103
104
100
101
102
CFSE
103
104
102
CFSE
103
104
20
counts
M1
0
5
counts
M1
5
101
85 %
15
15
71 %
0
100
data .020
10
20
20
10
counts
0
5
10
counts
0
101
100:1
data .016
M1
5
10
counts
0
100
54 %
M1
M1
30:1
data .012
15
17 %
15
15
18 %
15:1
data .008
20
20
data.020
5
counts
10:1
10
3:1
100
101
102
CFSE
103
104
100
101
102
CFSE
103
104
CFSE
Patient C1 / Peptid 3
Abbildung 4.4 Treg-Zellen hemmen die Proliferation HCV-spezifischer CD8+ T-Zellen
dosisabhängig. Bei nachlassender Anzahl von Treg-Zellen kommt es zu einer Zunahme
der Proliferation HCV-spezifischer CD8+ T-Zellen. Die abgebildeten Plots zeigen
ausschließlich CD8+ Tetramer+ T-Zellen.
4.5
Die Suppression durch Treg-Zellen ist Zell-Zell-Kontakt abhängig
Als nächstes untersuchten wir, ob ein direkter Zell-Zell-Kontakt für die inhibitorische
Wirkung von Treg-Zellen notwendig ist. Wie bereits in Kapitel 3.2.4 beschrieben, ist es
mit einer Transwell®-Membran möglich, zwei Zellpopulationen im gleichen Medium
zu kultivieren, ohne dass ein direkter Zell-Zell-Kontakt besteht; ein Austausch von
Zytokinen wird hierdurch nicht verhindert.
CD4 depletierte PBMC wurden als Effektorpopulation alleine und in der Anwesenheit
von Treg-Zellen kultiviert. Zusätzlich wurde noch eine Kokultur angelegt, in der beide
Zellpopulationen durch eine Membran getrennt wurden. Die Kulturen wurden
anschließend mit HCV-Peptiden stimuliert und für eine Woche kultiviert, bevor eine
Tetramer-Färbung durchgeführt wurde.
4 Ergebnisse
32
Dieser Versuch zeigte, dass Treg-Zellen, die aufgrund der Membran keinen Zell-ZellKontakt mit CD8+ T-Zellen eingehen können, nicht in der Lage sind, die Expansion der
Effektorzellen zu inhibieren. Wenn beide Zellpopulationen aber ohne Membran
gemeinsam kultiviert wurden, war wiederum eine deutliche Reduktion der CD8+ T-ZellExpansion zu beobachten (Abbildung 4.5). Diese Ergebnisse zeigten somit, dass ein
direkter Zell-Zell-Kontakt für die von Treg-Zellen vermittelte Suppression der Expansion
HCV-spezifischer T-Zellen notwendig ist.
CD4 depletierte PBMC plus
CD4+CD25+ (3:1)
kein Zell-Zell-Kontakt
10 4
4
10
2
10
1
10
0
10 0
10 1
10 2
10 3
CD8 Cy7-PE
10 4
10
10 1
10 2
10 3
CD8 Cy7-PE
1.67%
10
10
10
1
10
0
10
10 0
data.019
3
4
9.80%
2
10
2
10
1
10
10
0
tetramer
CD4+CD25+ (3:1)
Zell-Zell-Kontakt
data.011
10
9.44%
3
data.003
3
10
4
-
10 0
10 1
10 2
10 3
CD8 Cy7-PE
10 4
CD8
Patient C1 / Peptid 3
Abbildung 4.5 Inhibition durch Treg-Zellen ist Zell-Zell-Kontakt abhängig. CD4 depletierte PBMC
wurden allein (links), in Anwesenheit von Treg-Zellen aber durch eine Membran
getrennt (Mitte) und in Anwesenheit von Treg-Zellen mit direktem Zell-Zell-Kontakt
kultiviert (rechts).
4.6
Die Inhibition durch Treg-Zellen ist unabhängig von IL-10 und TGF-β
Verschiedene Arbeiten haben auf eine mögliche Rolle von Zytokinen wie Interleukin 10
und TGF-β in der Inhibition von Effektorzellen durch Treg-Zellen hingewiesen.
Um den Einfluss dieser Zytokine auf die Treg-Zell-vermittelte Inhibition zu untersuchen,
wurden den Kokulturen von CD4 depletierten PBMC und Treg-Zellen neutralisierende
Antikörper gegen IL-10 und TGF-β hinzu gegeben, bevor sie mit HCV-Peptiden
stimuliert und für eine Woche kultiviert wurden. Anschließend wurde eine TetramerFärbung durchgeführt.
4 Ergebnisse
33
Diese Versuche zeigten, dass die Zugabe neutralisierender Antikörper nur einen sehr
geringen Einfluss auf die Inhibition der HCV-spezifischen CD8+ T-Zell-Expansion
durch Treg-Zellen hat (Abbildung 4.6). Dies deutet daraufhin, dass die Inhibition von
HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen durch Treg-Zellen unabhängig von Interleukin-10 und
TGF-β ist.
keine Antikörper
anti TGF-β
50
anti IL-10
% Inhibition
100
0
Patient C1 / Peptid 3
Abbildung 4.6 Inhibition durch Treg-Zellen ist unabhängig von IL-10 und TGF-β. Kokulturen von
Treg-Zellen und CD4 depletierten PBMC wurden neutralisierende Antikörper gegen IL10 und TGF-β hinzugegeben. Hierdurch wurde die inhibitorische Kapazität der TregZellen nicht aufgehoben.
4.7
Einfluss von IL-2 auf die Wirkung von Treg-Zellen
Treg-Zellen exprimieren konstitutiv die α-Kette des Interleukin-2 Rezeptors CD25 auf
ihrer Oberfläche. Somit stellt sich die Frage nach der Rolle von Interleukin-2 bei der
Treg-Zell-vermittelten Suppression. Einige Arbeiten haben beschrieben, dass die Zugabe
von exogenem IL-2 die inhibitorische Wirkung von Treg-Zellen aufhebt, andere Arbeiten
haben dies aber nicht bestätigen können.
Um den möglichen Einfluss von IL-2 auf die Wirkung von Treg-Zellen in unserem
System zu untersuchen, wurden CD4 depletierte Zellen mit Treg-Zellen, wie in Kapitel
4.2 beschrieben, kultiviert und zusätzlich mit 2 U/ml, 20 U/ml oder 200 U/ml
4 Ergebnisse
34
Interleukin-2 stimuliert. Die Zugabe von steigenden Mengen exogenem IL-2 hatte
jedoch
nahezu
keinen
Einfluss
auf
die
Treg-Zell-vermittelte
Inhibition
der
virusspezifischen CD8+ T-Zell-Expansion.
Anschließend sollte das Proliferationsverhalten von Treg-Zellen untersucht werden.
Dazu wurden CD25+ T-Zellen mit CFSE beladen und in Kultur gebracht. Die
Stimulation erfolgte entweder nur mit anti-CD28 oder mit anti-CD28 und
rekombinantem IL-2. An den Tagen 2, 4, 5 und 7 wurde über eine CD4-Färbung
untersucht, wie viel Prozent der CD4+CD25+ Treg-Zellen proliferiert haben. Nur in den
Kulturen, die mit IL-2 stimuliert wurden, proliferierten Treg-Zellen, aber nur zu einem
geringen Anteil von 14%. In den Kulturen, die nur mit anti-CD28 stimuliert wurden,
zeigte sich keine Proliferation von Treg-Zellen (Abbildung 4.7). Diese Versuche zeigen
somit, dass Treg-Zellen Interleukin-2 zum Wachstum benötigen, doch trotz massiver
Zugabe von Interleukin-2 (200 U/ ml an Tag 0 und Tag 4) proliferierten nur 14% der
Treg-Zellen.
A
B
anti-CD28
+ IL-2
data.004
15
anti-CD28 + IL-2
anti-CD28
100
CD4
% Proliferation der
CD4+CD25+ T-Zellen
14%
10
101
102
103
CFSE FITC
104
anti-CD28
data.002
<1%
5
0
1
2
3
4
5
6
7
100
101
102
103
CFSE FITC
104
Tage in Kultur
CFSE
Abbildung 4.7 Treg-Zellen sind nur nach Zugabe hoher Dosen von Interleukin-2 in der Lage zu
proliferieren. (A) CD25+ Zellen wurden mit CFSE beladen und in Kultur gebracht.
Stimulation erfolgte entweder nur mit gelöstem anti-CD28 oder zusätzlich mit
rekombinantem IL-2. Nach 7 Tagen zeigte sich, dass Treg-Zellen nur nach Zugabe von
IL-2 proliferieren. (B) Dot plots beider Kulturen nach 7 Tagen.
4 Ergebnisse
35
Weiterhin untersuchten wir, ob in den Kokulturen eine Proliferation von Treg-Zellen
notwendig ist, um suppressiv auf CD8+ T-Zellen zu wirken. Hierfür wurden Treg-Zellen
nach der Selektion mit
30 Gy bestrahlt. Dadurch wird den Zellen die
Proliferationsfähigkeit genommen. Anschließend wurden die bestrahlten Treg-Zellen
gemeinsam mit CD4 depletierten PBMC in Kultur gebracht. Interessanterweise hatte die
Bestrahlung aber keinen Einfluss auf die suppressive Kapazität von Treg-Zellen
(Abbildung 4.8). Somit scheint die Proliferation von Treg-Zellen für die Inhibition der
% tetramer+/ CD8+
CD8+ Effektorzellen nicht notwendig zu sein.
3
1
1,5
0,5
0
0
Patient G1 / Peptid 4
Patient G2 / Peptid 4
Abbildung 4.8 Bestrahlte Treg-Zellen verlieren nicht ihre inhibitorische Kapazität. CD4 depletierte
PBMC wurden alleine (schwarze Balken), mit Treg-Zellen (weiße Balken) und mit
bestrahlten Treg-Zellen (schraffierte Balken) kultiviert. Bestrahlte Treg-Zellen behalten
ihre suppressive Wirkung.
4.8
Stärkere Inhibition virusspezifischer T-Zell-Antworten bei Patienten mit
chronischer HCV-Infektion im Vergleich zu gesunden Probanden und
Personen, die das Virus eliminiert haben
Mit den folgenden Experimenten sollte untersucht werden, ob die Suppression von
virusspezifischen T-Zellen spezifisch für die chronische Hepatitis C Virusinfektion ist.
Hierfür wurden neben Patienten mit chronischer HCV-Infektion auch Personen
untersucht, die HCV entweder spontan oder therapieinduziert eliminiert haben.
Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Treg-Zell-vermittelte Inhibition spezifisch für
das persistierende Antigen ist, oder ob sich auch eine Hemmung anderer
virusspezifischer T-Zellen nachweisen lässt. Als Kontrollantigen wurde hierfür ein
immundominantes Peptid des Influenza Virus verwendet.
4 Ergebnisse
36
CD4 depletierte PBMC wurden in Anwesenheit von CD4+CD25- Zellen (Verhältnis 3:1)
oder CD4+CD25+ Treg-Zellen (Verhältnis 3:1) in Kultur gebracht und mit HCVspezifischen und Influenza-spezifischen Peptiden sowie anti-CD28 Antikörpern
stimuliert. Nach 7 Tagen Kultur erfolgte die Auswertung durch Tetramer-Färbungen.
Um die Stärke der jeweils beobachteten Inhibition vergleichen zu können, wurde die
prozentuale Inhibition berechnet.
Es zeigte sich, dass die Proliferation von Influenza-spezifischen CD8+ T-Zellen bei
chronisch HCV-infizierten Personen nahezu gleich stark inhibiert wurde wie die von
HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die
Wirkung von Treg-Zellen nicht auf das persistierende Antigen beschränkt. Auch bei
Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion zeigte sich eine gleich starke Hemmung von
HCV-spezifischen und Influenza-spezifischen T-Zellen. Interessanterweise war die
Inhibition der CD8+ T-Zellen bei Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion und
gesunden Probanden aber deutlich schwächer als bei Patienten mit chronischer HCVInfektion (Abbildung 4.9). Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Wirkung
von Treg-Zellen bei der chronischen HCV-Infektion verstärkt, aber nicht spezifisch für
das persistierende Antigen ist.
4 Ergebnisse
37
chron. HCV
HCV eliminiert
gesund
p=0.018
100
89.2%
87.4%
% Inhibition
80
60
55.0%
52.6%
50.8%
40
20
p=0.028
p=0.018
0
HCV
Peptid
Flu
Peptid
HCV
Peptid
Flu
Peptid
Flu
Peptid
Abbildung 4.9 Stärkere Inhibition durch Treg-Zellen bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion
als bei Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion und gesunden Kontrollpersonen.
Für die Berechnung der prozentualen Inhibition wurde folgende Formel angewandt: 100
– (Prozentzahl Tetramer+ CD8+ T-Zellen in Gegenwart von Treg-Zellen geteilt durch die
Prozentzahl Tetramer+ CD8+ T-Zellen in Gegenwart von CD4+CD25- T-Zellen) x 100.
Chronische HCV: HCV-Peptid (C1[2 Epitope], C2, C3 und C4), Flu-Peptid (C1, C2,
C3, C4 und C5); HCV eliminiert: HCV-Peptid (R1, R2[2 Epitope], R3, R7 und R8[2
Epitope]), Flu-Peptid (R2, R3, R4, R5 und R6) und 6 gesunde Probanden.
4.9
Erhöhte Frequenz von Treg-Zellen bei Patienten mit chronischer HCVInfektion
Um die biologische Relevanz von Treg-Zellen bei der chronischen Hepatitis C
Virusinfektion weiter zu charakterisieren, sollte die Frequenz der zirkulierenden TregZellen im peripheren Blut untersucht werden. Mithilfe von FACS-Färbungen wurde der
Anteil CD4+CD25+ Treg-Zellen an den Lymphozyten von Patienten mit chronischer
HCV-Infektion ermittelt. Als Kontrollgruppen dienten erneut Personen, die das
Hepatitis C Virus eliminiert haben und gesunde Kontrollpersonen. Wie in Abbildung
4.10 dargestellt zeigte sich, dass Treg-Zellen bei Patienten mit chronischer Infektion in
4 Ergebnisse
38
signifikant höherer Prozentzahl im peripheren Blut zirkulieren als bei den beiden
Kontrollgruppen.
p=0.0004
% CD4+CD25+ Lymphozyten
6
5
4
3.7
3
2.6
2.3
2
1
p=0.009
0
chron.
HCV
n=10
HCV
eliminiert
n=9
chron. HCV
Gesunde
Spender
n=10
HCV eliminiert
2,8%
2,5%
CD4
4,1%
gesund
100
10 1
102
CD25 PE
103
104
100
10 1
102
CD25 PE
103
104
100
10 1
102
CD25 PE
103
104
CD25
Abbildung 4.10 Erhöhte Frequenz von Treg-Zellen im Blut von Patienten mit chronischer HCVInfektion verglichen mit Personen, die das Virus eliminiert haben und gesunden
Kontrollpersonen Treg-Zellen im Blut von Patienten mit chronischer HCV-Infektion,
Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion und gesunden Probanden (oben);
Repräsentative density plots aus jeder Population (unten)
5 Diskussion
5
39
Diskussion
Die chronische HCV-Infektion geht typischerweise mit Dysfunktionen der HCVspezifischen T-Zellen, wie einer gestörten Proliferationsfähigkeit, verminderter
Zytokinsekretion und reduzierter zytotoxischer Funktion, einher [Gruener et al., 2001;
Ulsenheimer et al., 2003; Wedemeyer et al., 2002]. Die Mechanismen, die den
Dysfunktionen der HCV-spezifischen T-Zellen bei der chronischen Infektion zu Grunde
liegen, sind bislang noch ungeklärt. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von
CD4+CD25+ Treg-Zellen auf die Funktion von CD8+ T-Zell-Antworten bei der
chronischen
HCV-Infektion
untersucht.
Mithilfe
von
vorbeschriebenen,
immundominanten, HLA-A2-restringierten Peptiden wurde der Einfluss von Treg-Zellen
auf die HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen untersucht. Insgesamt konnten wir zeigen,
dass Treg-Zellen die Proliferation sowie die Zytokinproduktion (am Beispiel von
Interferon-γ) von virusspezifischen CD8+ T-Zellen inhibieren. Außerdem konnten wir
zeigen, dass die Inhibition durch Treg-Zellen dosisabhängig ist und nicht durch
inhibitorische Zytokine, wie TGF-β und Interleukin-10, vermittelt wird (Abbildung 4.6).
Treg-Zellen benötigen für ihre inhibitorische Wirkung direkten Zell-Zell-Kontakt zu den
CD8+ Effektorzellen (Abbildung 4.5).
Die biologische Relevanz von Treg-Zellen bei der chronischen HCV-Infektion wird
durch zwei zusätzliche Beobachtungen unterstützt. Zum einen liegen CD4+CD25+ TregZellen bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion in signifikant höherer Frequenz vor
als bei Personen nach HCV-Infektion oder gesunden Kontrollpersonen (Abbildung
4.10). Zum anderen ist die Treg-Zell-vermittelte Suppression von CD8+ T-Zellen in der
chronischen Phase der Infektion stärker ausgeprägt als bei Personen mit ausgeheilter
HCV-Infektion oder gesunden Probanden. So konnten gesunde Kontrollpersonen und
Personen, die das Hepatitis C Virus eliminiert haben, in Anwesenheit von Treg-Zellen
stärkere virusspezifische CD8+ T-Zell-Antworten generieren als Patienten mit
chronischer Infektion (
Abbildung 4.9). Diese Beobachtung ist überraschend, da das Verhältnis von
Effektorzellen zu Treg-Zellen in den Experimenten bei allen Gruppen gleich war.
5 Diskussion
40
Deshalb kann diese Beobachtung nicht dadurch erklärt werden, dass sich die Frequenz
der zirkulierenden Treg-Zellen in den einzelnen Gruppen unterscheidet. Dieses Ergebnis
lässt vermuten, dass sich die Treg-Zellen von Patienten mit chronischer HCV-Infektion
von denen der Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion unterscheiden. Diese
Vermutung kann jedoch nicht mit abschließender Sicherheit verifiziert werden, da
momentan noch kein Marker bekannt ist, der hochspezifisch für Treg-Zellen ist. Das
CD25-Molekül kann, als Teil des Interleukin-2 Rezeptors, auch von aktivierten CD4+
Zellen ohne regulatorisches Potenzial exprimiert werden. Auf der Suche nach einem
spezifischen oder zumindest besseren Marker für Treg-Zellen sind bereits einige
Vorschläge gemacht worden [Bruder et al., 2004; Lechner et al., 2001; Takahashi et al.,
2000], das CD25-Molekül ist jedoch nach wie vor der Marker mit der höchsten
Spezifität. In Mausmodellen konnte das forkhead box protein 3 (Foxp3) als typischer
Marker für Treg-Zellen etabliert werden, seine Rolle im humanen System ist jedoch
umstritten [Fontenot et al., 2003; Morgan et al., 2005]. Folglich kann im humanen
System derzeit noch nicht ermittelt werden, welcher Prozentsatz an CD4+CD25+ TregZellen tatsächlich über ein regulatorisches Potenzial verfügt. Gleichwohl deuten unsere
Ergebnisse darauf hin, dass der Prozentsatz an solchen „echten regulatorischen TZellen“ innerhalb der CD4+CD25+ Population bei Patienten mit chronischer HCVInfektion höher ist als bei Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion und gesunden
Probanden.
Insgesamt stützen diese Beobachtungen die These, dass chronische Viruserkrankungen
zu einer Expansion von Treg-Zellen führen, die die antivirale Immunantwort inhibieren
[Aandahl et al., 2004; Iwashiro et al., 2001; MacDonald et al., 2002; Sugimoto et al.,
2003]. Dieser Vorgang könnte einen physiologischen Schutzmechanismus darstellen,
der den Körper vor einer überschießenden Immunantwort schützt. Andererseits könnte
die Induktion von Treg-Zellen einen viralen Escape-Mechanismus darstellen, mit dem
sich das Virus vor einer starken T-Zell-Antwort schützt. Es wird daher interessant sein,
festzustellen, zu welchem Zeitpunkt der Infektion es zu einer Expansion von Treg-Zellen
kommt.
Überraschenderweise scheint die Treg-Zell-vermittelte Suppression bei chronisch HCVinfizierten Patienten jedoch nicht ausschließlich HCV-spezifisch zu sein. So konnten
5 Diskussion
41
wir mithilfe eines Influenza-Antigens zeigen, dass die Stärke der Inhibition von CD8+
T-Zellen durch Treg-Zellen bei HCV-spezifischen und bei Influenza-spezifischen CD8+
T-Zellen ein ähnliches Ausmaß hat. Es ist bisher noch nicht klar, ob die chronische
HCV-Infektion zu einer Aktivierung und Expansion Antigen-unspezifischer Treg-Zellen,
oder zu einer Induktion antigenspezifischer Treg-Zellen führt, die nach ihrer
Aktivierung, z.B. durch HCV-Antigen, auch Immunantworten gegen andere Liganden,
durch einen sogenannten Bystander-Effekt, supprimieren [Taams et al., 2002; Tanchot
et al., 2004; Wang et al., 2004]. Diese Überlegung wird durch Beobachtungen aus
unterschiedlichen in vitro Modellen unterstützt, die zeigen, dass Treg-Zellen über ihren
T-Zell-Rezeptor spezifisch aktiviert werden müssen, bevor sie ihre inhibitorische
Aktivität anschließend antigenunspezifisch vermitteln [Homann et al., 1999; Thornton
et al., 2000]. Weiterhin konnten Suvas et al. zeigen, dass die akute Herpes simplex
Virus Typ 1 Infektion mit einer gesteigerten Treg-Zell-Aktivität einhergeht, die CD8+ TZell-Antworten sowohl virusspezifisch als auch unspezifisch inhibieren [Suvas et al.,
2003].
Die in vitro Beobachtung einer identisch starken Inhibition von HCV- und Influenzaspezifischen CD8+ T-Zellen ist jedoch nicht unbedingt mit der Situation in vivo
gleichzusetzen. So wird z.B. bei der chronischen HCV-Infektion kein genereller
Immundefekt beobachtet und betroffene Patienten leiden nicht vermehrt an
Infektionskrankheiten wie Influenza. Es ist durchaus denkbar, dass sich Treg-Zellen in
vivo hauptsächlich an solchen Orten mit hoher Antigenlast - wie der virusinfizierten
Leber - anreichern, um vor allem dort ihre suppressive Wirkung zu entfalten. Auf diese
Weise könnte sichergestellt werden, dass die Wirkung von Treg-Zellen auf die
biologisch relevanten Kompartimente beschränkt bleibt. Interessanterweise konnte
bisher tatsächlich in anderen Infektions- und Tumormodellen gezeigt werden, dass TregZellen an Orten mit hoher Antigenlast akkumulieren [Belkaid et al., 2002; Groux et al.,
1997]. Auch Rushbrook et al. konnten zeigen, dass die Frequenz von Treg-Zellen in der
Leber von chronisch HCV-infizierten Patienten höher ist als im peripheren Blut
[Rushbrook et al., 2005]. Deshalb könnte das Verhältnis von CD8+ Effektorzellen zu
Treg-Zellen, das für eine starke Inhibition benötigt wird (3:1 und 10:1, Abbildung 4.4),
tatsächlich die intrahepatische Situation in vivo widerspiegeln. Um dieser wichtigen
Frage nachzugehen, bedarf es jedoch zusätzlicher Studien, in denen die Funktion und
5 Diskussion
42
der Phänotyp intrahepatischer Treg-Zellen bei Patienten mit chronischer HCV-Infektion
eingehend untersucht werden müssen.
Treg-Zellen exprimieren konstitutiv die α-Kette des Interleukin-2-Rezeptors CD25.
Somit haben sie eine höhere Affinität zu IL-2 als die Zellen, die nur die ß-Kette
(CD122) und die γ-Kette (CD132) des IL-2-Rezepors exprimieren [Malek et al., 2004].
Einige Arbeiten haben beschrieben, dass Interleukin-2 eine entscheidende Rolle bei der
Entstehung und Aktivierung von Treg-Zellen aufweist [Bayer et al., 2005; de la Rosa et
al., 2004]. Inwiefern die Anwesenheit von Interleukin-2 jedoch die in vitro Funktion
von Treg-Zellen beeinflusst, ist sehr umstritten. So haben einige Arbeiten einen
kompletten Abbruch der Treg-Zell-vermittelten Suppression nach der Zugabe von
exogenem IL-2 [Camara et al., 2003] oder schon nach der Zugabe von anti-CD28,
welches die endogene IL-2 Produktion bestimmter T-Zellen stimuliert [Thornton et al.,
2004], beschrieben. Diese Ergebnisse konnten jedoch in anderen Studien nicht
reproduziert werden [Piccirillo et al., 2001]. In unseren Kulturen erfolgte die
Stimulation nur mit anti-CD28, nicht aber mit exogenem IL-2, so dass von einer
geringen Konzentration an verfügbarem IL-2 auszugehen ist. Wir haben daher
untersucht, ob der Mechanismus der Suppression durch Treg-Zellen durch ihre hohe
Affinität für IL-2 erklärt werden kann, über die sie den CD8+ T-Zellen einen
entscheidenden Wachstumsfaktor nehmen würden. Unsere Ergebnisse zeigen aber, dass
dies nicht der Fall ist. So konnten wir beobachten, dass die Zugabe von exogenem IL-2
zu den Kulturen nicht zu einem Abbruch der Treg-Zell-vermittelten Suppression führt.
Darüber hinaus haben wir in unseren Transwell®-Assays keine Suppression der CD8+
T-Zell-Expansion beobachtet. Wenn aber die Konkurrenz um IL-2 der in vitro
Mechanismus der Suppression durch Treg-Zellen wäre, hätte man auch in diesen
Versuchen einen suppressiven Effekt beobachten müssen, da beide Zellpopulationen im
gleichen Medium kultiviert wurden. Weiterhin haben wir die Proliferationskapazität
von Treg-Zellen in vitro untersucht. Wie bereits von Jonuleit et al. beschrieben [Jonuleit
et al., 2001] konnten auch wir zeigen, dass nur die Zugabe von exogenem IL-2, nicht
aber von anti-CD28, zu einer Proliferation von Treg-Zellen führte (Abbildung 4.7).
Außerdem konnten wir zeigen, dass bestrahlte Treg-Zellen, also Treg-Zellen, die nicht
mehr proliferieren können, weiterhin in der Lage sind, die virusspezifische CD8+ TZell-Expansion zu inhibieren (Abbildung 4.8). Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse
5 Diskussion
43
somit, dass die Anwesenheit von Interleukin-2 zu einer Proliferation von Treg-Zellen
führt, ohne ihnen dabei ihre suppressive Kapazität zu nehmen. Darüber hinaus ist eine
Proliferation von Treg-Zellen in unserem System nicht notwendig, um ihre suppressive
Wirkung zu vermitteln.
Interessanterweise beobachteten wir, dass die Depletion von CD4+ Zellen bei chronisch
HCV-infizierten Patienten zu einer gesteigerten Expansion HCV-spezifischer CD8+ TZellen führt (Abbildung 4.1). Diese Ergebnisse sind überraschend, da den CD4+ Zellen
allgemein eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung einer
potenten CD8+ T-Zell-Antwort zugesprochen wird [Kalams et al., 1998]. In mehreren
Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass periphere aber auch intrahepatische CD4+
T-Zell-Antworten mit der Elimination des Virus in HCV-infizierten Menschen oder
Schimpansen assoziiert sind [Diepolder et al., 1995; Gerlach et al., 1999; Missale et al.,
1996; Thimme et al., 2002]. Diese Arbeiten haben sich mit der Rolle von CD4+ TZellen bei der akuten HCV-Infektion beschäftigt. In unserer Arbeit wurden jedoch
Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion untersucht. Die hier vorgestellten Daten
legen die Vermutung nahe, dass die CD4+ Zellpopulation bei der akuten und bei der
chronischen HCV-Infektion deutlich unterschiedliche Funktionen wahrnehmen. Bei der
akuten Infektion sind CD4+ Zellen für die Entstehung und Aufrechterhaltung einer
starken und multispezifischen CD8+ T-Zell-Antwort und somit für die Elimination des
Virus mitverantwortlich. Bei der chronischen HCV-Infektion hingegen scheinen CD4+
Zellen die Stärke der CD8+ T-Zell-Antworten zu reduzieren. Zusammenfassend lässt
sich von diesen Ergebnissen das folgende Modell über die Rolle von CD4+ Zellen bei
der HCV-Infektion ableiten: Im Rahmen der akuten HCV-Infektion überwiegt die
Wirkung von CD4+CD25- T-Zellen innerhalb der CD4+ Population, in der chronischen
Phase der Infektion scheint jedoch die Wirkung von CD4+CD25+ Treg-Zellen im
Vordergrund zu stehen (Abbildung 5.1).
5 Diskussion
44
CD4+
CD25-
Akute Infektion
Aktivierung
Antigenpresentation!
CD8+
Inhibition
Effektorfunktionen
Chronische Infektion
CD4+
CD25+
Abbildung 5.1 Modell der Rolle von CD4+ Zellen bei der HCV-Infektion. Bei der chronischen
HCV-Infektion überwiegt die inhibitorische Wirkung der CD4+CD25+ Treg-Zellen
innerhalb der CD4+ Population auf die CD8+ Effektorzellen. Bei der akuten HCVInfektion überwiegt die unterstützende Wirkung der CD4+CD25- Zellen.
Kürzlich ist eine Arbeit erschienen, die sich ebenfalls mit der Rolle von Treg-Zellen bei
der chronischen HCV-Infektion beschäftigt und interessanterweise sehr ähnliche
Beobachtungen beschreibt [Cabrera et al., 2004]. So konnte gezeigt werden, dass die
Frequenz von Treg-Zellen im Blut von Patienten mit chronischer HCV-Infektion höher
ist als bei Personen mit spontan ausgeheilter HCV-Infektion und gesunden Probanden.
Auch die Beobachtung, dass Treg-Zellen die Expansion HCV-spezifischer T-Zellen
dosisabhängig und Zell-Zell-Kontakt-abhängig inhibieren, wird in dieser Arbeit
beschrieben. Lediglich bei der Frage nach der Rolle von TGF-β bei der Treg-Zellvermittelten Suppression unterscheiden sich die Ergebnisse dieser Studie von den hier
vorgestellten Daten. So führt in der Studie von Cabrera et al. die Zugabe von
neutralisierenden Antikörpern gegen TGF-β zu einem Abbruch der Suppression durch
Treg-Zellen. Dies steht jedoch auch im Widerspruch zu einer anderen Arbeit, die sich
ebenfalls mit dem Einfluss von Treg-Zellen auf die T-Zell-Antwort bei der chronischen
HCV-Infektion beschäftigt und gemeinsam mit unserer Studie eingereicht und publiziert
wurde. So konnten Rushbrook et al., analog zu unseren Resultaten, keine Veränderung
der suppressiven Aktivität von Treg-Zellen nach Zugabe von neutralisierenden
5 Diskussion
45
Antikörpern gegen TGF-β beobachten [Rushbrook et al., 2005]. Insgesamt unterstützen
aber alle diese Arbeiten die These einer wichtigen biologischen Bedeutung von TregZellen bei der chronischen HCV-Infektion.
6 Zusammenfassung
6
46
Zusammenfassung
Die chronische HCV-Infektion ist mit einer schwachen, insuffizienten und
dysfunktionellen HCV-spezifischen T-Zell-Antwort assoziiert. Die Mechanismen, die
diesen T-Zell-Dysfunktionen zu Grunde liegen und somit wahrscheinlich zur Persistenz
des Virus beitragen sind bisher kaum bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde
die Rolle von CD4+CD25+ Treg-Zellen bei der chronischen Hepatitis C Virusinfektion
untersucht. Durch Depletions-Versuche und Kokultur-Experimente konnte gezeigt
werden, dass die peptidspezifische Expansion und Interferon-γ Produktion von HCVspezifischen CD8+ T-Zellen durch Treg-Zellen inhibiert wurden. Dieser inhibitorische
Effekt durch CD4+CD25+ T-Zellen war dosisabhängig, abhängig von direktem ZellZell-Kontakt und unabhängig von den Zytokinen IL-10 und TGF-β. Darüber hinaus
wurde beobachtet, dass CD4+CD25+ T-Zellen bei Patienten mit chronischer HCVInfektion in signifikant höherer Frequenz vorliegen als bei Personen mit ausgeheilter
HCV-Infektion und gesunden Kontrollpersonen. Außerdem war die Inhibition der
HCV-spezifischen CD8+ T-Zell-Expansion durch Treg-Zellen bei Patienten mit
chronischer HCV-Infektion stärker ausgeprägt als bei Personen mit ausgeheilter
Infektion und gesunden Probanden. Hierbei beschränkt sich die inhibitorische Wirkung
von Treg-Zellen nicht nur auf das persistierende Antigen. So wurde die Influenzaspezifische CD8+ T-Zell-Expansion sowohl bei Patienten mit chronischer HCVInfektion als auch bei Personen mit ausgeheilter HCV-Infektion genauso stark inhibiert
wie die HCV-spezifische CD8+ T-Zell-Expansion. Insgesamt lassen diese Ergebnisse
vermuten, dass die chronische HCV-Infektion zu einer Expansion von Treg-Zellen führt,
was möglicherweise zu einer reduzierten HCV-spezifischen T-Zell-Antwort und somit
zur Persistenz des Virus beiträgt.
7 Literatur
7
47
Literatur
Aandahl EM, Michaelsson J, Moretto WJ, Hecht FM and Nixon DF (2004) Human
CD4+ CD25+ regulatory T cells control T-cell responses to human immunodeficiency
virus and cytomegalovirus antigens. J Virol 78: 2454-2459
Andersson J, Boasso A, Nilsson J, Zhang R, Shire NJ, Lindback S, Shearer GM and
Chougnet CA (2005) Cutting edge: The prevalence of regulatory T cells in lymphoid
tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol 174: 3143-3147
Asano M, Toda M, Sakaguchi N and Sakaguchi S (1996) Autoimmune disease as a
consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation. J Exp Med 184:
387-396
Bayer AL, Yu A, Adeegbe D and Malek TR (2005) Essential role for interleukin-2 for
CD4(+)CD25(+) T regulatory cell development during the neonatal period. J Exp Med
201: 769-777
Belkaid Y, Mendez S, Lira R, Kadambi N, Milon G and Sacks D (2000) A natural
model of Leishmania major infection reveals a prolonged "silent" phase of parasite
amplification in the skin before the onset of lesion formation and immunity. J Immunol
165: 969-977
Belkaid Y, Piccirillo CA, Mendez S, Shevach EM and Sacks DL (2002) CD4+CD25+
regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature 420:
502-507
Belkaid Y and Rouse BT (2005) Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat
Immunol 6: 353-360
Bruder D, Probst-Kepper M, Westendorf AM, Geffers R, Beissert S, Loser K, von
Boehmer H, Buer J and Hansen W (2004) Neuropilin-1: a surface marker of regulatory
T cells. Eur J Immunol 34: 623-630
Cabrera R, Tu Z, Xu Y, Firpi RJ, Rosen HR, Liu C and Nelson DR (2004) An
immunomodulatory role for CD4(+)CD25(+) regulatory T lymphocytes in hepatitis C
virus infection. Hepatology 40: 1062-1071
Camara NO, Sebille F and Lechler RI (2003) Human CD4+CD25+ regulatory cells
have marked and sustained effects on CD8+ T cell activation. Eur J Immunol 33: 34733483
de la Rosa M, Rutz S, Dorninger H and Scheffold A (2004) Interleukin-2 is essential for
CD4+CD25+ regulatory T cell function. Eur J Immunol 34: 2480-2488
Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, Wierenga EA, Santantonio T, Jung MC,
Eichenlaub D and Pape GR (1995) Possible mechanism involving T-lymphocyte
response to non-structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus
infection. Lancet 346: 1006-1007
Fontenot JD, Gavin MA and Rudensky AY (2003) Foxp3 programs the development
and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol 4: 330-336
7 Literatur
48
Gerlach JT, Diepolder HM, Jung MC, Gruener NH, Schraut WW, Zachoval R,
Hoffmann R, Schirren CA, Santantonio T and Pape GR (1999) Recurrence of hepatitis
C virus after loss of virus-specific CD4(+) T-cell response in acute hepatitis C.
Gastroenterology 117: 933-941
Gershon RK and Kondo K (1970) Cell interactions in the induction of tolerance: the
role of thymic lymphocytes. Immunology 18: 723-737
Grakoui A, Shoukry NH, Woollard DJ, Han JH, Hanson HL, Ghrayeb J, Murthy KK,
Rice CM and Walker CM (2003) HCV persistence and immune evasion in the absence
of memory T cell help. Science 302: 659-662
Groux H, O'Garra A, Bigler M, Rouleau M, Antonenko S, de Vries JE and Roncarolo
MG (1997) A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and
prevents colitis. Nature 389: 737-742
Gruener NH, Lechner F, Jung MC, Diepolder H, Gerlach T, Lauer G, Walker B,
Sullivan J, Phillips R, Pape GR and Klenerman P (2001) Sustained dysfunction of
antiviral CD8+ T lymphocytes after infection with hepatitis C virus. J Virol 75: 55505558
Hisaeda H, Maekawa Y, Iwakawa D, Okada H, Himeno K, Kishihara K, Tsukumo S
and Yasutomo K (2004) Escape of malaria parasites from host immunity requires CD4+
CD25+ regulatory T cells. Nat Med 10: 29-30
Homann D, Holz A, Bot A, Coon B, Wolfe T, Petersen J, Dyrberg TP, Grusby MJ and
von Herrath MG (1999) Autoreactive CD4+ T cells protect from autoimmune diabetes
via bystander suppression using the IL-4/Stat6 pathway. Immunity 11: 463-472
Iwashiro M, Messer RJ, Peterson KE, Stromnes IM, Sugie T and Hasenkrug KJ (2001)
Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection.
Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9226-9230
Jonuleit H, Schmitt E, Stassen M, Tuettenberg A, Knop J and Enk AH (2001)
Identification and functional characterization of human CD4(+)CD25(+) T cells with
regulatory properties isolated from peripheral blood. J Exp Med 193: 1285-1294
Kalams SA and Walker BD (1998) The critical need for CD4 help in maintaining
effective cytotoxic T lymphocyte responses. J Exp Med 188: 2199-2204
Kinter AL, Hennessey M, Bell A, Kern S, Lin Y, Daucher M, Planta M, McGlaughlin
M, Jackson R, Ziegler SF and Fauci AS (2004) CD25(+)CD4(+) regulatory T cells from
the peripheral blood of asymptomatic HIV-infected individuals regulate CD4(+) and
CD8(+) HIV-specific T cell immune responses in vitro and are associated with
favorable clinical markers of disease status. J Exp Med 200: 331-343
Kojima A and Prehn RT (1981) Genetic susceptibility to post-thymectomy autoimmune
diseases in mice. Immunogenetics 14: 15-27
Lechner F, Wong DK, Dunbar PR, Chapman R, Chung RT, Dohrenwend P, Robbins G,
Phillips R, Klenerman P and Walker BD (2000) Analysis of successful immune
responses in persons infected with hepatitis C virus. J Exp Med 191: 1499-1512
Lechner O, Lauber J, Franzke A, Sarukhan A, von Boehmer H and Buer J (2001)
Fingerprints of anergic T cells. Curr Biol 11: 587-595
7 Literatur
49
Lundgren A, Suri-Payer E, Enarsson K, Svennerholm AM and Lundin BS (2003)
Helicobacter pylori-specific CD4+ CD25high regulatory T cells suppress memory Tcell responses to H. pylori in infected individuals. Infect Immun 71: 1755-1762
MacDonald AJ, Duffy M, Brady MT, McKiernan S, Hall W, Hegarty J, Curry M and
Mills KH (2002) CD4 T helper type 1 and regulatory T cells induced against the same
epitopes on the core protein in hepatitis C virus-infected persons. J Infect Dis 185: 720727
Malek TR and Bayer AL (2004) Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2.
Nat Rev Immunol 4: 665-674
Missale G, Bertoni R, Lamonaca V, Valli A, Massari M, Mori C, Rumi MG, Houghton
M, Fiaccadori F and Ferrari C (1996) Different clinical behaviors of acute hepatitis C
virus infection are associated with different vigor of the anti-viral cell-mediated immune
response. J Clin Invest 98: 706-714
Mittrucker HW and Kaufmann SH (2004) Mini-review: regulatory T cells and infection:
suppression revisited. Eur J Immunol 34: 306-312
Moradpour D and Blum HE (2004) [Hepatitis C]. Ther Umsch 61: 493-498
Morgan ME, van Bilsen JH, Bakker AM, Heemskerk B, Schilham MW, Hartgers FC,
Elferink BG, van der Zanden L, de Vries RR, Huizinga TW, Ottenhoff TH and Toes RE
(2005) Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells
in humans. Hum Immunol 66: 13-20
O'Garra A and Vieira P (2004) Regulatory T cells and mechanisms of immune system
control. Nat Med 10: 801-805
Onizuka S, Tawara I, Shimizu J, Sakaguchi S, Fujita T and Nakayama E (1999) Tumor
rejection by in vivo administration of anti-CD25 (interleukin-2 receptor alpha)
monoclonal antibody. Cancer Res 59: 3128-3133
Ormandy LA, Hillemann T, Wedemeyer H, Manns MP, Greten TF and Korangy F
(2005) Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with
hepatocellular carcinoma. Cancer Res 65: 2457-2464
Piccirillo CA and Shevach EM (2001) Cutting edge: control of CD8+ T cell activation
by CD4+CD25+ immunoregulatory cells. J Immunol 167: 1137-1140
Raghavan S, Fredriksson M, Svennerholm AM, Holmgren J and Suri-Payer E (2003)
Absence of CD4+CD25+ regulatory T cells is associated with a loss of regulation
leading to increased pathology in Helicobacter pylori-infected mice. Clin Exp Immunol
132: 393-400
Rushbrook SM, Ward SM, Unitt E, Vowler SL, Lucas M, Klenerman P and Alexander
GJM (2005) Regulatory T Cells Suppress In Vitro Proliferation of Virus-Specific CD8+
T Cells during Persistent Hepatitis C Virus Infection. J. Virol. 79: 7852-7859
Sakaguchi S (2005) Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells
in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol 6: 345-352
Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M and Toda M (1995) Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).
7 Literatur
50
Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune
diseases. J Immunol 155: 1151-1164
Shevach EM (2002) CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nat
Rev Immunol 2: 389-400
Shimizu J, Yamazaki S and Sakaguchi S (1999) Induction of tumor immunity by
removing CD25+CD4+ T cells: a common basis between tumor immunity and
autoimmunity. J Immunol 163: 5211-5218
Shoukry NH, Grakoui A, Houghton M, Chien DY, Ghrayeb J, Reimann KA and Walker
CM (2003) Memory CD8+ T cells are required for protection from persistent hepatitis C
virus infection. J Exp Med 197: 1645-1655
Sugimoto K, Ikeda F, Stadanlick J, Nunes FA, Alter HJ and Chang KM (2003)
Suppression of HCV-specific T cells without differential hierarchy demonstrated ex
vivo in persistent HCV infection. Hepatology 38: 1437-1448
Suvas S, Kumaraguru U, Pack CD, Lee S and Rouse BT (2003) CD4+CD25+ T cells
regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med 198:
889-901
Taams LS, Vukmanovic-Stejic M, Smith J, Dunne PJ, Fletcher JM, Plunkett FJ, Ebeling
SB, Lombardi G, Rustin MH, Bijlsma JW, Lafeber FP, Salmon M and Akbar AN
(2002) Antigen-specific T cell suppression by human CD4+CD25+ regulatory T cells.
Eur J Immunol 32: 1621-1630
Takahashi T, Tagami T, Yamazaki S, Uede T, Shimizu J, Sakaguchi N, Mak TW and
Sakaguchi S (2000) Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+)
regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen
4. J Exp Med 192: 303-310
Tanchot C, Vasseur F, Pontoux C, Garcia C and Sarukhan A (2004) Immune regulation
by self-reactive T cells is antigen specific. J Immunol 172: 4285-4291
Thimme R, Bukh J, Spangenberg HC, Wieland S, Pemberton J, Steiger C, Govindarajan
S, Purcell RH and Chisari FV (2002) Viral and immunological determinants of hepatitis
C virus clearance, persistence, and disease. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 15661-15668
Thimme R, Oldach D, Chang KM, Steiger C, Ray SC and Chisari FV (2001)
Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection.
J Exp Med 194: 1395-1406
Thornton AM, Donovan EE, Piccirillo CA and Shevach EM (2004) Cutting edge: IL-2
is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor
function. J Immunol 172: 6519-6523
Thornton AM and Shevach EM (2000) Suppressor effector function of CD4+CD25+
immunoregulatory T cells is antigen nonspecific. J Immunol 164: 183-190
Ulsenheimer A, Gerlach JT, Gruener NH, Jung MC, Schirren CA, Schraut W, Zachoval
R, Pape GR and Diepolder HM (2003) Detection of functionally altered hepatitis C
virus-specific CD4 T cells in acute and chronic hepatitis C. Hepatology 37: 1189-1198
7 Literatur
51
Unitt E, Rushbrook SM, Marshall A, Davies S, Gibbs P, Morris LS, Coleman N and
Alexander GJ (2005) Compromised lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma:
the role of T-regulatory cells. Hepatology 41: 722-730
Viglietta V, Baecher-Allan C, Weiner HL and Hafler DA (2004) Loss of functional
suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Exp
Med 199: 971-979
Waldmann H, Graca L, Cobbold S, Adams E, Tone M and Tone Y (2004) Regulatory T
cells and organ transplantation. Semin Immunol 16: 119-126
Wang HY, Lee DA, Peng G, Guo Z, Li Y, Kiniwa Y, Shevach EM and Wang RF
(2004) Tumor-specific human CD4+ regulatory T cells and their ligands: implications
for immunotherapy. Immunity 20: 107-118
Wedemeyer H, He XS, Nascimbeni M, Davis AR, Greenberg HB, Hoofnagle JH, Liang
TJ, Alter H and Rehermann B (2002) Impaired effector function of hepatitis C virusspecific CD8+ T cells in chronic hepatitis C virus infection. J Immunol 169: 3447-3458
Weiss L, Donkova-Petrini V, Caccavelli L, Balbo M, Carbonneil C and Levy Y (2004)
Human immunodeficiency virus-driven expansion of CD4+CD25+ regulatory T cells,
which suppress HIV-specific CD4 T-cell responses in HIV-infected patients. Blood
104: 3249-3256
Wood KJ and Sakaguchi S (2003) Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nat
Rev Immunol 3: 199-210
8 Originalarbeiten
8
52
Originalarbeiten
Im Rahmen dieser Doktorarbeit ist folgende Publikation entstanden:
Tobias Boettler, Hans Christian Spangenberg, Christoph Neumann-Haefelin,
Elisabeth Panther, Simonetta Urbani, Carlo Ferrari, Hubert E. Blum, Fritz von
Weizsäcker, and Robert Thimme
T cells with a CD4+CD25+ regulatory phenotype suppress in vitro
proliferation of virus-specific CD8+ T cells during chronic hepatitis C virus
infection
Journal of Virology, 2005 Jun; 79(12):7860-7
Teile dieser Arbeit wurden auf folgenden Kongressen präsentiert:
59.
Jahrestagung
der
Deutschen
Gesellschaft
für
VerdauungsStoffwechselkrankheiten (DGVS), 1.-4. September 2004, Leipzig
und
55th Annual meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases
(AASLD), October 29th – November 2nd 2004, Boston, USA
21. Jahrestagung der German Association for the study of the liver (GASL), 28.-29.
Januar 2005, Ulm
XVI. Kongress der Südwestdeutschen Gesellschaft für Gastroenterologie, 2.-4. Juni
2005, Heidelberg
9 Danksagung
9
53
Danksagung
Mein herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Drs. h.c. Hubert E. Blum für die Möglichkeit,
in seiner Abteilung zu promovieren und für die wertvolle Unterstützung bei der
Ausarbeitung der Publikation und der Kongressbeiträge.
Herrn Prof. Dr. Hans-Hartmut Peter danke ich für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Robert Thimme für die Überlassung
dieses spannenden Themas und für die herausragende Betreuung zu jedem Zeitpunkt
dieser Arbeit. Durch sein außerordentliches persönliches Engagement hat er meine
Begeisterung für die Immunologie zunächst geweckt und später gefördert. Ferner danke
ich ihm für die Möglichkeit, Teile dieser Arbeit bei nationalen und internationalen
Kongressen präsentieren zu können. Ich danke außerdem Dr. Hans Christian
Spangenberg, der die initiale Idee zu dieser Arbeit hatte und mir bei der Umsetzung
immer mit Rat zur Seite stand. Dr. Christoph Neumann-Haefelin und Dr. Elisabeth
Panther danke ich für zahlreiche Diskussionen und Anregungen und ihre andauernde
Hilfsbereitschaft. Nadine Kersting und Natalja Nazarova möchte ich für ihre Geduld,
ihren immensen Einsatz und die gute Zusammenarbeit danken. Thomas Killinger und
Bertram
Bengsch
danke
ich
für
ihren
Beitrag
zu
einer
hervorragenden
Arbeitsatmosphäre.
Meinen wichtigsten „gesunden Probanden“ Steffen Heeg und Alexander von Werder
danke ich für viele Aderlässe, ohne die ein Teil der Experimente nicht durchführbar
gewesen wäre.
Max, Flo, Philipp, dem Mat und Boschi danke ich für Tipps, Anregungen und
geduldiges Zuhören, wenn ich mal wieder von meiner Arbeit erzählt habe.
Meinen Eltern und Geschwistern danke ich für ihre fortwährende Unterstützung und obwohl fachfremd – für ihr reges Interesse an dieser Arbeit.
Petra danke ich für ihr Interesse an meiner Arbeit und ihre andauernde Unterstützung.
10 Lebenslauf
10
54
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Geburtstag:
Geburtsort:
Familienstand:
Konfession:
Eltern:
Geschwister:
Tobias Elmar Böttler
27. November 1979
Berlin-Zehlendorf
verheiratet mit Dr. med. Petra Böttler
evangelisch
Winfried Böttler, Theologe
Angelika Böttler, Lehrerin
Jonas Böttler, Politologe
Simon Böttler, Tonmeisterstudent
Schulbildung:
1985 – 1989
1989 – 1992
1992 – 1999
Juli 1999
Christian-Morgenstern-Grundschule, Berlin Spandau
Helmut-von-Moltke-Grundschule, Berlin Charlottenburg
Carl-Friedrich-von-Siemens-Gymnasium, Berlin Spandau
Abitur
Zivildienst:
1999 – 2000
Universitätskinderklinik Freiburg i. Br.
Studium:
Seit 2000
September 2002
August 2003
Studium der Humanmedizin an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg i. Br.
Physikum
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Famulaturen:
März/April 2003
September/Oktober 2004
März 2005
Innere Medizin, Helios-Klinik, Breisach
Pädiatrie, CUB Campus Benjamin-Franklin, Berlin
Dermatologie, Universitätsklinik Freiburg
Sonstiges:
2003 – 2004
Seit 2005
Wissenschaftliche Hilfskraft Abteilung Klinische Chemie
Wissenschaftliche Hilfskraft Medizin II AG Prof. Thimme