Einfluss der neoadjuvanten Radiochemotherapie auf das zelluläre
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Aus dem Zentrum für operative Medizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, und Tumorchirurgie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. A. Hölscher Einfluss der neoadjuvanten Radiochemotherapie auf das zelluläre Immunsystem bei Patienten mit Ösophaguskarzinom Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Anika Worring aus Bergisch-Gladbach promoviert am 20. Februar 2013 Copy –Star Druck und Werbung GmbH, Köln Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2013 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin/Berichterstatter: Professor Dr. med. R. O. Metzger 2. Berichterstatterin/Berichterstatter: Professor Dr. rer. nat. K. Schomäcker Erklärung Ich erkläre hiermit, die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Anfertigung des Materials sowie der Herstellung des Manuskriptes habe ich außer von Herrn Universitätsprofessor Dr. med. R. Metzger und Universitätsprofessorin Dr. med. E. Bollschweiler keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorliegenden Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, 24.08.2012 Die Untersuchungsmaterialien und die klinischen Daten der untersuchten Patienten wurden von mir persönlich zusammengetragen. Die dieser Arbeit zu Grunde liegenden Daten (Blutentnahmen) wurden von mir selbst auf den Stationen der Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, und Tumorchirurgie der Universität zu Köln ermittelt. Die laborchemischen Untersuchungen haben im Labor der Universität zu Köln stattgefunden. Die statistische Auswertung der Daten sind von mir selbst mit Unterstützung von Frau Universitätsprofessorin Dr. med. E. Bollschweiler durchgeführt worden. Danksagung Herzlich danke ich dem gesamten Team der chirurgischen Klinik der Universität zu Köln. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1.Das Ösophaguskarzinom 1 1.1.1.Epidemiologie 1 1.1.2.Risiokofaktoren und Ätiologie 2 1.1.3.Pathologie, Ausbreitung und Tumorsitz 3 1.1.4.Diagnostik 6 1.1.5.Therapiemöglichkeiten 9 1.1.6.Prognose 15 1.2.Das Immunsystem 16 1.2.1.Komponenten und Aufgabe des Immunsystems 16 1.2.2.Tumorimmunologie 19 1.2.3.Immuntherapie 21 1.3.Fragestellung der Arbeit 22 2. Material und Methoden 23 2.1.Patientenkollektiv 23 2.2.Erhebung des Immunstatus 24 2.3.Statistische Auswertung 27 3. Ergebnisse 28 3.1.Leukozyten 28 3.2.Thrombozyten 31 3.3.Lymphozyten 34 3.4.CD3 37 3.5.CD4 40 3.6.CD8 42 3.7.CD4/CD8-Quotient 45 3.8.CD19 48 3.9.CD16+56 51 3.10.IL-2+ 54 3.11.HLA-DR+ 56 3.12.postoperative Komplikationen 59 3.13.Zusammenfassung der Ergebnisse 60 4. Diskussion 4.1.Immunsystem und Krebs 62 62 4.2.Das zelluläre Immunsystem unter neoadjuvanter Radiochemotherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom 63 4.3.Diskussion der Fehlermöglichkeiten 70 5. Zusammenfassung 72 6. Literaturverzeichnis 73 7. Veröffentlichungen 86 8. Lebenslauf 87 1. Einleitung 1.1.Das Ösophaguskarzinom 1.1.1.Epidemiologie Mit einer Inzidenz von 4 bis 5 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner pro Jahr steht das Ösophaguskarzinom an 9. Stelle der Krebstodesursachen beim Mann und an 15. Stelle bei der Frau. Das in Asien sehr seltene Adenokarzinom zeigt einen exponentiellen Anstieg in den westlichen Ländern. Weltweit bestehen erhebliche regionale Unterschiede in der Inzidenz von Ösophaguskarzinomen. Gebiete mit besonders hoher Inzidenz (mehr als 100 Karzinome je 100.000 Einwohner) befinden sich in China, den Staaten der ehemaligen Sowjetunion, im Iran, Südafrika, Puerto Rico und Chile. In Deutschland gehört das Ösophaguskarzinom zu den selteneren Tumoren [Hiddemann, Bartram, 2010]. Die höchste Zuwachsrate aller Malignome hat das Barrett-Karzinom. Obgleich der großen regionalen Unterschiede, ist die Inzidenz des Plattenepithelkarzinoms dagegen gleichbleibend [Bollschweiler 2001]. Männer sind bei beiden Tumorformen deutlich häufiger betroffen als Frauen; beim Adenokarzinom 9 Mal, beim Plattenepithelkarzinom 3 Mal häufiger. Bei der Tumoroperation sind die Patienten mit Plattenepithelkarzinom etwas jünger (ca. 6 Jahre) als die ca. 60 Jahre alten Barrett-Karzinomträger, die in der Regel zu einer höheren sozialen Schicht gehören. Lag die relative 5-JahresÜberlebenswahrscheinlichkeit 1990-1992 noch bei 8,7%, so stieg sie in den Jahren 2000-2002 auf 24,3% an [Brenner 2005]. Patienten mit Adenokarzinom zeigen charakteristischerweise häufig Refluxbeschwerden und haben kardio-vaskuläre Erkrankungen. Patienten mit Plattenepitehlkarzinom leiden häufiger unter Adipositas, Nikotinabusus und damit einhergehenden chronischen Lungenerkrankungen. Durch Alkoholabusus stellen Lebererkrankungen ebenfalls typische Begleiterkrankungen von Patienten mit Plattenepithelkarzinom dar. 1 1.1.2.Ätiologie und Risikofaktoren Plattenepithelkarzinom Hauptrisiken zur Entstehung eines Plattenepithelkarzinoms sind der Missbrauch der exogenen Noxen Nikotin und Alkohol (dosisabhängig). Der gängige Verzehr nitrosaminhaltiger Nahrungsmittel v.a. in asiatischen Ländern, allgemeine Mangelernährung, Laugenverätzung des Ösophagus, berufliche Belastung durch Asbest und Schadstoffe in der Gummiindustrie, ionisierende Strahlen und die Aufnahme sehr heißer Getränke sollen ebenfalls eine entscheidende Rolle in der Entstehung des Plattenepitehlkarzinoms spielen [Blot 1994]. Patienten mit Achalasie, Verätzungsstrikturen, Plummer-Vinson-Syndrom, Tylose (eine seltene, autosomal-dominant vererbte Hyperkeratose der Hände und Füße) und Vorbestrahlung im Hals-Thoraxbereich, haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines Plattenepithelkarzinoms des Ösophagus. Außerdem wird die verminderte Aufnahme von Obst und Gemüse als wichtiger Risikofaktor angesehen [Danaei 2005]. Gehäuft finden sich weitere Tumore im Hypopharynx, im Kehlkopf oder in der Lunge, die in ähnlicher Weise den o.g. Noxen ausgesetzt sind. Adenokarzinom Exogene Faktoren sind für die Entstehung des Adenokarzinoms weniger wichtig als für die Entstehung des Plattenepithelkarzinoms. Es besteht kein Einfluss des Alkoholkonsums auf das Erkrankungsrisiko. Neuere epidemiologische Studien legen jedoch nahe, dass eine enge Korrelation zwischen Nikotinmissbrauch und dem Auftreten von Adenokarzinomen besteht [Zhang 1997]. Darüber hinaus ist Übergewicht offenbar ein unabhängiger Risikofaktor [Calle 2003]. Der Ersatz des orthotopen Plattenepithels im distalen Ösophagus durch metaplastisches Zylinderepithel auf dem Boden chronisch-entzündlicher Vorgänge durch gastro-ösophagealen Reflux ist die entscheidende prämaligne Kondition für die Entstehung eines Adenokarzinoms im distalen Ösophagus (GERD). Dabei 2 spielen neben der Magensäure auch Gallensäuren eine Rolle [Banki 2005]. Ab einer Längenausdehnung von mehr als 3 cm wird dieses Phänomen als BarrettÖsophagus bezeichnet. 85% der Patienten mit Barrett-Karzinom haben eine typische Refluxanamnese [Leers 2005]. Die Zylinderepithelien submuköser oder pluripotenter Stammzellen in der Basalmembran der distalen Speiseröhre werden als Ursprung des neu entstandenen Epithels diskutiert. Diese Zylinderepithelmetaplasie wird auch als Barrett-Ösophagus bezeichnet (nach dem Erstbeschreiber, 1953), Barrett-Karzinom der sich darin entwickelnde Tumor. Bei über 90% der Patienten mit Adenokarzinom kann eine ösophageale Zylinderepithelmetaplasie nachgewiesen werden. Patienten mit Barrett-Ösophagus haben ein etwa 125-mal höheres Risiko, ein Adenokarzinom der Speiseröhre zu entwickeln als die Normalbevölkerung. In einer prospektiven bevölkerungsbasierten Studie aus Nordirland war allerdings über einen Zeitraum von 7 Jahren die Gesamtmortalität für Patienten mit Barrett-Ösophagus nicht erhöht [Anderson 2003]. Bei langstreckigem Barrett-Ösophagus ist das Risiko für die Entstehung eines Karzinoms höher als bei einem short-Barrett-Ösophagus. Vorstufen des invasiven Karzinoms sind vorerst gering gradige, dann höher gradige Neoplasien, welche durch vermehrte/unterschiedliche Mutationen bei zusätzlich vorhandener genomischer Instabilität und maligner Degeneration des BarrettEpithels entstehen [Metzger 2010]. 1.1.3.Pathologie, Ausbreitung, Tumorsitz Pathologie Unter dem Begriff „Ösophaguskarzinom“ werden alle epithelialen malignen Neubildungen der Speiseröhre zusammengefasst. Dabei handelt es sich zu 95% um Plattenepithel- und Adenokarzinome. Entsprechend der Wandauskleidung des Ösophagus können Plattenepithelkarzinome im gesamten Ösophagus auftreten. Adenokarzinome hingegen kommen gehäuft im distalen Ösophagus im Bereich erworbener Zylinderepithelmetaplasien vor. Sie können allerdings auch auf dem Boden angeborener atypisch lokalisierter Inseln mit Zylinderepithel oder 3 submuköser Schleimhautdrüsen in anderen Abschnitten der Speiseröhre entstehen. Seltene Entitäten nehmen nur 4% der Ösophagusmalignome ein. Epitheliale Karzinome können ulzerierend oder exophytisch wachsen, erste Form ist typisch für das Plattenepithelkarzinom, letztere mehr für das Adenokarzinom. Bei den Plattenepithelkarzinomen ist in ca. 10% eine Mulizentrizität des Tumorwachstums zu finden. Diese beschränkt sich beim Adenokarzinom auf das Segment der Barrett-Metaplasie [Metzger 2010]. Neben dem histologischen Typ ist noch der Differenzierungsgrad bedeutend zur pathologischen Klassifikation. Hier werden gut (G1), mäßig (G2), und schlecht (G3) differenzierte Tumoren unterschieden. Lymphknotenmetastasierung Auf Grund eines sehr dichten und oberflächlich gelegenen Lymphdrainagesystems in der Submukosa treten beim Ösophaguskarzinom frühzeitig regionale und entfernte Lymphknotenmetastasen auf. Die Lymphknotenmetastasierung ist abhängig vom Sitz des Primärtumors und betrifft in der Regel zunächst die benachbarten regionalen Lymphknoten [Wittekind 2003]. Die Richtung der Metastasierung erfolgt dabei überwiegend kranialwärts für Tumoren des oberen Drittels bzw. oberhalb der Trachealbifurkation und überwiegend kaudalwärts bei Tumoren des unteren Ösophagus bzw. unterhalb der Trachealbifurkation [Stahl 2010]. Entscheidend für die Bestimmung des Lymphknotenbefalls beim Frühkarzinom ist dabei eine Differenzierung zwischen Mukosa und Submukosa und deren jeweiligem Drittel nach der japanischen Klassifikation (z.B. sm1, sm2, sm3). Die Rate von infiltrierten Lymphknoten ist unabhängig davon, ob ein Adeno- oder Plattenepithelkarzinom vorliegt. Mukosakarzinome beider Entitäten weisen praktisch nie einen Lymphknotenbefall auf. Der entscheidende Schritt für die Lymphknotenmetastasierung ist die Infiltration der Submukosa. Bereits sm1Karzinome können in 10-20% Lymphknotenmetastasen hervorrufen und sm3Karzinome sind mit 50-60% Lymphknotenbefall durchaus mit fortgeschrittenen Tumoren vergleichbar [Bollschweiler 2006, Hölscher 2007]. Es zeigen sich ebenfalls 4 keine Unterschiede in der Häufigkeit von Lymphknotenmetastasen bei fortgeschrittenen Adeno- bzw. Plattenepihtelkarzinomen ab dem Stadium T2. Metastasierung Über den venösen Abfluss erfolgt die Metastasierung bei proximalen Tumoren v.a. in die Lunge, bei Tumoren des unteren Drittels über die Pfortader v.a. in die Leber, bei Adenokarzinomen des ösophagogastralen Übergangs muss mit einer peritonealen Aussaat gerechnet werden [Smith 1999]. Andere Metastasierungsorte sind selten. Tumorsitz -suprabifurkale oder in Höhe der Bifurkation wachsende Karzinome -infrabifurkale Karzinome Diese Einteilung hat therapeutische Relevanz, da der Bezug zum Tracheobronchialsystem deutlich wird und von Bedeutung ist. Bei den weiter zervikal gelegenen Karzinomen besteht die Gefahr der Infiltration von Luftröhre und/oder Bronchien. Dies ist nicht bei den weiter infrabifurkalen Karzinomen zu erwarten. Klassifikation Eine Einteilung der Ösophaguskarzinome anhand anatomischer Strukturen ist aufgrund der unterschiedlichen lymphatischen und venösen Abflusswege für die Therapieplanung sinnvoll [Stahl 2010]. Die UICC (Unio Internationalis Contra Cancerum) teilt den Ösophagus in vier Abschnitte ein, abhängig vom Bezug zur Zahnreihe: -zervikaler Ösophagus: bis 18 cm hinter der Zahnreihe (bis zur Thoraxapertur), -oberer Ösophagus: 18-24 cm, - mittlerer Ösophagus: 24-32 cm, -unterer Ösophagus: 32-40 cm (bis zur Kardia des Magens) 5 Die Einteilung der Adenokarzinome des distalen Ösophagus und des ösophagogastralen Übergangs geschieht nach Siewert [Siewert u. Hölscher, 1987]: -Typ-I-Tumor: 1-5cm oral der anatomischen Kardia; Adenokarzinom des Ösophagus, in der Regel auf dem Boden eines Barrett-Ösophagus (BarrettKarzinom) -Typ-II-Tumor: 1cm oral bis 2cm aboral der anatomischen Kardia; Kardiakarzinom -Typ-III-Tumor: 2-5cm aboral der anatomischen Kardia; subkardiales Magenkarzinom, das die Kardia infiltriert. 1.1.4.Diagnostik Typisches Beschwerdebild Das Leitsymptom des Ösophaguskarzinoms ist die Dysphagie, seltener die Odynophagie [Leers 2005]. Als Frühsymptome gelten Regurgitation und Globusgefühl v.a. beim Plattenepithelkarzinom, sowie trockener Husten auf Grund der Refluxösophagitis beim Adenokarzinom. Weitere Symptome der fortgeschrittenen Krankheit sind Gewichtsverlust, Kachexie, Heiserkeit auf Grund einer Rekurrensparese, Hämatemesis, zervikale oder mediastinale Lymphknotenschwellungen, Aspirationspneumonie bei ösophagealer Fistel. Vermehrtes Sodbrennen ist bei ca. 20% der Patienten vorwiegend mit Barrett-Karzinom zu beobachten und dauert häufig schon mehrere Jahre an. Auch wenn die typischen Symptome, inklusive Dysphagie, richtungsweidsend sind, beginnt in Europa die Therapie des Ösophaguskarzinoms erst nach 3 Monaten. Durch die bei bereits bekanntem Barrett-Ösophagus durchzuführenden Kontrolluntersuchungen werden die Frühkarzinome fest gestellt. Die weiter fortgeschrittenen Tumore (ab T1) sind meist Zufallsbefunde bei aus anderen Gründen durchgeführten Endoskopien [Metzger 2010]. 6 Diagnosesicherung bei klinischem Verdacht auf ein Ösophaguskarzinom: 1. Endoskopie mit Biopsie Die entscheidende Untersuchung für den Tumornachweis ist die Endoskopie mit Biopsie. Damit wird die Malignität bewiesen und die histologische Entität geklärt. Gleichzeitig ergibt die Spiegelung wichtige Informationen zum Sitz, zur Ausdehnung und zur Wachstumsform des Tumors. Die histologische Sicherung erfolgt durch repräsentative Stufenbiopsien aus der Tumorrandregion zu histologisch verwertbaren Biopsien. Ebenfalls sinnvoll ist die Durchführung einer Röntgenkontrastdarstellung, um die tumorösen Veränderungen in den anatomischen Gesamtzusammenhang einzuordnen. 2. Metastasensuche Um Fernmetastasen ausschließen zu können, werden die Sonographie (v.a. von Abdomen und Hals), die Computertomographie, und evtl. auch die Positronenemissionstomographie (PET) verwendet. International gehört die PET in der Diagnostik des Ösophaguskarzinoms bisher nicht zur Routinediagnostik. Nach Angaben der Studie von Räsänen 2003 [Surgicals Oncology] ist die PET-Untersuchung sehr sensitiv, sie kann kleinste Tumorläsionen identifizieren, wie z.B. Karzinomatosis des Bauchraumes; allerdings muss immer bedacht werden, dass über PET fest gestellte LKMetastasen histologisch und zytologisch abgeklärt werden müssen, da es eine hohe falsch-positive Rate gibt. Da Ösophaguskarzinome mit Fernmetastasen nur noch palliativ behandelt werden können und in der Regel nicht operiert werden, kommt dem Ausschluss bzw. Nachweis von Organmetastasen (M1-Stadium) zentrale Bedeutung zu. Eine Staging-Laparoskopie dient weniger zur besseren Einschätzung des T-Stadiums, als vielmehr einem frühzeitigen Erkennen eines M1-Stadiums. Dies würde das therapeutische Vorgehen wesentlich ändern [Smith 1999]. Falls schwere Begleiterkrankungen, Alter oder fehlende Compliance des Patienten eine intensive Therapie nicht zulassen, kann von einer weiterführenden Diagnostik abgesehen werden. Ansonsten sollte nach Ausschluss von Fernmetastasen die lokale 7 Tumorausdehnung weiter abgeklärt werden, um eine stadiengerechte Therapie einleiten zu können. 3. Lokale Tumorausdehnung Zur Festlegung der lokalen Tumorausdehnung kommt der endoskopische Ultraschall (EUS), evtl. auch eine Bronchoskopie (bei Karzinomen mit Bezug zum Tracheobronchialsystem) zum Einsatz. Die Endosonographie dient beim Staging der Beurteilung der Tiefeninfiltration des Tumors (uT1-4) [May 2004]. Abhängig von der Tiefeninfiltration erfolgt hierdurch u.a. die Entscheidung zur Durchführung einer neoadjuvanten Therapie. Die Lymphknoten paraösophageal, parakardial und paragastral werden im Größendurchmesser beschrieben. 4. Operatives Risiko Zur Ermittlung des operativen Risikos wird ein erweitertes Labor, eine Lungenfunktionsprüfung, ein EKG und eine Echokardiographie durchgeführt, da viele Patienten unter Begleiterkrankungen von Leber, Lunge und kardiovaskulärem System leiden und der Zwei-Höhlen-Eingriff einer Ösophagektomie eine große Belastung darstellt. Für die Erfassung eines individuellen Risikoprofils hat sich die Analyse der wichtigsten Organfunktionen bewährt [Bollschweiler 2000]. Allgemein haben sich Leberzirrhose, insbesondere im Stadium Child Pugh B und C, florider Alkoholabusus mit drohendem Entzug und pulmonale Erkrankungen mit deutlicher Lungenfunktionseinschränkung als besondere Risikofaktoren erwiesen. Wegen der gleichzeitigen Schädigung anderer Regionen („Schluck-Rauch-Straße“) muss primär und im weiteren Verlauf die Suche nach Zweittumoren stattfinden [CIO 2010]. 8 1.1.5.Therapiemöglichkeiten Die alleinige chirurgische Therapie des Ösophaguskarzinoms wurde lange Zeit als allgemeiner Standard angesehen. Lediglich Patienten mit lokalen, nicht resektablen Tumoren oder Inoperabilität aus medizinischen Gründen bzw. mit manifester Fernmetastasierung wurden einer Strahlentherapie zugeführt. Die Chirurgie ist auch heute noch das einzige monomodale Verfahren mit kurativem Potenzial. Dies gilt allerdings – zumindest bei Plattenepithelkarzinomen – nur für frühe Tumorstadien bis zum Stadium IIA bzw. T2 N0 M0. Für Adenokarzinome sind die Ergebnisse etwas günstiger. Lokal fortgeschrittene Tumoren weisen jedoch bei über 80% der Patienten Lymphknotenmetastasen auf, mit der Konsequenz, dass die alleinige Lokaltherapie nur bei weniger als 15% der Patienten kurativ sein kann [Siewert 2001]. Diese Ergebnisse haben in den letzten Jahren dazu geführt, vermehrt multimodale Therapieverfahren beim Ösophaguskarzinom einzusetzen. Wegen der frühen Tendenz zur Metastasierung gewinnt dabei die systemische Chemotherapie immer größere Bedeutung. Ein allgemein akzeptierter multimodaler Therapieansatz ist jedoch derzeit für kein Tumorstadium definiert [Hiddemann, Bartram 2010]. Die Therapie des Ösophaguskarzinoms ist stadienabhängig. Daher ist die Diskussion des Einzelfalls im Tumorboard vor Therapiebeginn obligat. Die Wahl der optimalen Therapie ist abhängig von Lokalisation, Tumorausdehnung, Allgemeinzustand des Patienten und Begleiterkrankungen [Hofheinz, Frick, Claßen, 2010]. Stadien- und lageabhängige Therapie (nach „Interdisziplinären Empfehlungen zur Therapie in der Onkologie“ 2010/2011): -Tis-T1m3: endoskopische Mukosektomie, ggf. chirurgische Therapie -T1sm1-2-T2 N0-1: minimalinvasive Ösophagektomie mit Lymphadenektomie. Als gleichwertige Therapiealternative insbesondere bei hochsitzenden Tumoren (schwierige Operation, Laryngektomie) definitive Radiochemotherapie erwägen. -T3-4 N0-1: neoadjuvante Radiochemotherapie sollte erwogen werden. Die operative Therapie alleine ist kein Standardverfahren (R0-Resektionsrate bei T3-Tumoren 50%, bei T4 20-30%). -Tx Nx M1: palliative Therapie 9 Operative Therapie des Ösophaguskarzinoms Eine Resektion ist bei operablen Patienten mit lokalisierten Tumoren die Standardbehandlung (Tis-T3; N0-1, M0). Als Primäres Ziel der onkologischen Ösophaguschirurgie wird eine R0-Situation, sowie ausreichende Lymphadenektomie angestrebt. Die folgenden vier Operationsoptionen (je nach Tumorsitz, Größe, Ausdehnung) stehen hierfür zu Verfügung: 1.Tranthorakale Lymphadenektomie en bloc-Ösophagektomie sowie abdominaler mit radikaler Lymphadenektomie mediastinaler (sog. 2-Feld- Lymphadenektomie) und Rekonstruktion mit hoch intrathorakaler oder zervikaler Anastomose nach Magenhochzug oder Koloninterposition, eine Erweiterung ist durch sog. 3-Feld-Lymphadenektomie möglich [Hölscher 2003,2007]. Letzteres bedeutet die Erweiterung des Eingriffs auf die zervikalen Lymphknoten des zerviko-thorakalen Übergangs [Lerut 2004, Altorki 2002,2005]. Diese operative Methode wurde bei unserem untersuchten Patientenkollektiv angewandt. 2.Transhiatale/zervikale Lymphadenektomie Lymphadenektomie (synonym des und transmediastinale) unteren Ösophagektomie Mediastinums Rekonstruktion mit sowie zervikaler mit abdominaler Anastomose nach Magenhochzug oder Koloninterposition. 3.Distale Ösophagusresektion mit Lymphadenektomie des unteren Mediastinum sowie partieller abdominaler Lymphadenektomie und Rekonstruktion durch Jejunuminterposition, sog. Operation nach Merendino mit oder ohne Vaguserhaltung [Gutschow 2004]. 4.Resektion des zervikalen Ösophagus mit regionaler Lymphadenektomie und Rekonstruktion durch freie Jejunuminterposition mit mikrovaskulärem Gefäßanschluss. 10 Das Operationsverfahren der Wahl ab der Kategorie T1sm sowohl beim infrabifurkalen Plattenepithelkarzinom als auch beim Adenokarzinom ist die subtotale en blocÖsophagektomie mit 2-Feld-Lymphadenektomie und hoch intrathorakaler Ösophagogastrostomie [Hölscher 2003,2007]. Die Rekonstruktion nach Ösophagektomie erfolgt in erster Linie durch Magenhochzug. Der abdominale Teil der dazu notwendigen Operation inklusive der erforderlichen Lymphadenektomie kann heute laparoskopisch ausgeführt werden [Hölscher 2007]. Steht der Magen wegen der Voroperation nicht zur Verfügung, so erfolgt eine Koloninterposition [Hölscher 2009]. Bei der rein zervikalen Ösophagektomie wird in einem freien Jejunumsegment rekonstruiert. Bei der rein distalen Ösophagus/Kardiaresektion nach Merendino erfolgt die transhiatale Interposition eines gefäßgestielten Jejunumsegmentes [Gutschow 2004]. Die wichtigste postoperative Komplikation stellt die Anastomoseninsuffizienz dar mit evtl. nachfolgender Ösophagektomie Mediastinitis; umfassen typische allgemeine Bronchopneumonie, Komplikationen nach Alkoholentzugssyndrom und Tachyarrythmien, die in entsprechender Weise intensivmedizinisch behandelt werden müssen [Stippel 2005]. Multimodale Therapie Multimodale Therapieansätze, wie adjuvante und neoadjuvante Chemotherapie, Strahlentherapie und Radiochemotherapie werden seit Jahren in Studien untersucht, da die Ergebnisse bzgl. des Langzeitüberlebens nach Ösophagektomie noch zu optimieren sind. Neoadjuvante Radiochemotherapie Aufgrund der enttäuschenden Langzeitergebnisse mit Chirurgie oder Strahlentherapie wurde seit dem Ende der 70er Jahre die neoadjuvante Radiochemotherapie in Studien geprüft. Sie bietet gerade beim Ösophaguskarzinom mehrere theoretische Vorteile 11 gegenüber alleiniger Operation. Diese bestehen in einer höheren Chance auf eine R0Resektion nach Verkleinerung des Primärtumors sowie in der Möglichkeit, Tumorwirksamkeit klinisch und pathohistologisch zu beurteilen und frühzeitig die (häufigen) Fernmetastasen zu bekämpfen. Die zusätzliche Radiotherapie legt dabei den Schwerpunkt auf die Optimierung der lokalen Tumorkontrolle über eine maximale Tumorrückbildung bzw. Tumorinaktivierung zum Zeitpunkt der Operation. Die Anwendung der Chemotherapie und der Radiotherapie in sequenzieller (alternierender) oder simultaner Form erscheint aus mehreren Gründen sinnvoll. Insbesondere zur simultanen Radiochemotherapie gibt es unter den Stichworten räumliche Kooperation, unabhängige Toxizität und Synergismus unterschiedliche theoretische Grundlagen, die eine gegenseitige Ergänzung und Wirkungsverstärkung wahrscheinlich machen [Vokes 1993]. Die Kombination von 4 Kursen Cisplatin und 5FU mit 50-Gray-Bestrahlung führte gegenüber alleiniger Bestrahlung mit 64 Gray zu einer signifikanten Verbesserung der lokalen Tumorkontrolle, zu einer Reduktion von Fernmetastasen und zu einem signifikant verbesserten Langzeitüberleben von Patienten mit lokalisierten Plattenepithelkarzinomen [Cooper 1999, Herskovic 1992]. Bei kurativer Behandlungsintention sollte heute die kombinierte (simultane) Radiochemotherapie einer alleinigen Bestrahlung vorgezogen werden. Klinische Daten aus Frankreich (FFCD: Fédération Francophone de Cancérologie Digestive) unterstützen präklinische Modelle in der Forderung, die Radiatio in einem Block ohne größere Pausen statt nach dem sog. „Split-course-Verfahren“ durchzuführen [Crehange 2007]. Gut belegt ist die Chemotherapie mit Cisplatin und 5-FU parallel zur Bestrahlung. Andere Kombinationen auf dem Boden von Cisplatin oder 5-FU simultan zur Radiotherapie sind durchführbar. Es liegen drei Metaanalysen vor, die sich auf die publizierten Ergebnisse von jeweils mehr als 1000 Patienten beziehen [Urschel 2003; Fiorica 2004; Stahl 2005]. Einheitlich kommen die Analysen zu dem Schluss, dass sowohl die lokale Tumorkontrolle als auch die Gesamtprognose der Patienten (Überleben nach 2 bzw. 3 Jahren) durch eine präoperative Therapie signifikant verbessert wird. Wird die Analyse von Studien bei Plattenepithel- und Adenokarzinomen getrennt durchgeführt, so zeigt sich, dass gerade Patienten mit Adenokarzinom von der multimodalen Therapie profitieren [Fiorica 2004]. Auf dem Boden dieser Metaanalysen wird die präoperative 12 Radiochemotherapie gefolgt von Operation international als Standard in der Behandlung lokalisierter Ösophaguskarzinome angesehen. Die neoadjuvante Therapie führt zum Downstaging des T- und N- Stadiums [Slater 2001]. Die postoperative Morbidität und Mortalität soll durch neoadjuvante Radiochemotherapie nicht signifikant erhöht sein [Mariette 2006]. Allerdings sollte die Entscheidung, welcher Patient eine neoadjuvante Therapie erhält, individuell entschieden und in speziellen Zentren durchgeführt werden, um toxische Nebenwirkungen der Therapie zu minimieren [Crehange 2010]. Zusammenfassend geht man inzwischen Plattenepithelkarzinom sowohl von beim einem Adenokarzinom Benefit durch als die auch beim neoadjuvante Radiochemotherapie aus [Bollschweiler 2010]. Der molekulare Wirkungsmechanismus und die häufigsten Nebenwirkungen der im Rahmen einer neoadjuvanten Radiochemotherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom angewandten Substanzen sollen im Folgenden kurz erläutert werden: Für die neoadjuvante Chemotherapie beim Ösophaguskarzinom haben sich folgende Substanzen durchgesetzt: Cisplatin/Carboplatin, Chemotherapeutika, welche die DNAReplikation durch Querverknüpfungen zwischen den beiden DNA-Strängen (cross links) hemmen und phasenunspezifisch wirken. Als besondere Nebenwirkungen sind v.a. Übelkeit/Erbrechen, Nephrotoxizität, Neuro- und Ototoxizität, sowie Knochenmarkstoxizität bekannt. Cisplatin betreffend, ist bekannt, dass eine sehr hohe Dosis des Chemotherapeutikums stark immunsupprimierend wirkt, jedoch in therapeutischen Dosen minimale Auswirkungen auf das Immunsystem habe und sogar in manchen Fällen von einer stimulierenden Wirkung auf einige Immunzellen auszugehen sei [Kempf 1985]. 5-FU ist ein Antimetabolit im Sinne eines Pyrimidinantagonisten, welches aufgrund der Strukturähnlichkeit in Nucleinsäuren eingebaut wird, aber nicht funktionstüchtig ist, phasenspezifisch Enzyme der Nucleotidbiosynthese hemmt und somit die DNA- und RNA- Synthese blockiert. Auch 5-Fluoruracil ist knochenmarkstoxisch, teilweise kommt es zu Mukositiden (Stomatitis, Ösophagitis, Enteritis). Schon in der 1985 erschienen klinisch-wissenschaftlichen Arbeit von Kempf und Mitchell wurde erläutert, dass 5Fluoruracil die humorale Immunität beim Menschen schwächt, nach Absetzen des 13 Medikamentes allerdings sehr schnell mit einer Erholung des Immunsystems zu rechnen ist [Kempf 1985]. In einer 2008 erschienen Studie von Eisenthal und Mitarbeiter wurden die immunologischen Wirkungen von 5-FU u.a. Chemotherapeutika untersucht und ermittelt, dass nach Applikation einer niedrigen Dosis von 5-FU die Synthese von Lymphozyten gesteigert wird, wobei dieser Sachverhalt noch als unklar dargelegt wird. Bei einer höheren Dosierung von 5-FU ist allerdings eine Zunahme von Zellapoptosen zu beobachten, was den natürlichen Effekt eines Chemotherapeutikums widerspiegelt. Des Weiteren konnte die Studiengruppe heraus finden, dass bestimmte Lymphozytensubgruppen in unterschiedlicher Weise auf das Chemotherapeutikum reagieren: CD 56+-und CD8+-Zellen sinken, CD4+-Zellen steigen, es kommt zu einer Umverteilung von Th2 zu Th1-Zellen. Die in unserer Studie fest gestellte Abnahme von CD8+-Zellen, sowie NK-Zellen könnte also durchaus auch in der Verwendung von 5-FU begründet sein. Paclitaxel, ein sog. Naturstoff aus der Rinde der pazifischen Eibe, welches als Mitosehemmstoff (sog. Spindelgift) durch Stabilisierung der Mikrotubuli die Spindelapparatausbildung innerhalb der Zellen hemmt. Als Nebenwirkung ist auch hier die Knochenmarkstoxizität hervor zu heben, sowie Überempfindlichkeitsreaktionen. Neben den o.g. spezielleren Nebenwirkungen sind generelle Nebenwirkungen von Chemotherapeutika zu nennen, welche neben der von uns untersuchten zellulären Supprimierung des Immunstatus bereits lange Zeit als bekannt gelten: Übelkeit, Erbrechen, Immunsuppression (v.a. i.S. einer Granulozytopenie, Lymphopenie), Thrombozytopenie, Anämie, Mukositiden, Haarausfall, Azospermie und Ovulationshemmung, Hyperurikämie bis hin zum Tumorlysesyndrom wie auch die Entstehung von Zweitkarzinomen [Karow T., Lang-Roth R., 2010]. Definitive/Palliative Radiochemotherapie Ein in andere Organsysteme metastasiertes Ösophaguskarzinom ist in der Regel nicht kurativ behandelbar. Bei starken Schmerzen und/oder nicht stentbarer Tumorstenose (z.B. hochzervikaler Sitz) kann die kleinvolumige perkutane Radiotherapie mit 36-45 Gray als Palliativmaßnahme eingesetzt werden [Wöll 2008]. Durch die kombinierte 14 Radiochemotherapie kann eine Verbesserung des 1-Jahresüberlebens von absolut ca. 9% und des 2-Jahresüberlebens von absolut ca. 8% bei lokal fortgeschrittenen Tumoren erreicht werden. Entscheidend ist, dass die Chemotherapie und Radiotherapie simultan erfolgen. Bei sequentieller Gabe konnten keine Vorteile gegenüber alleiniger Radiotherapie nachgewiesen werden. Die hoch dosierte Radiotherapie (64,8 Gray) erwies sich gegenüber der niedrigeren Dosis (50,4 Gray) hinsichtlich der lokalen Tumorkontrolle, des Gesamtüberlebens und des Rezidiv-freien Überlebens nicht als überlegen. Hingegen nahmen die akuten Nebenwirkungen und Therapie-assoziierten Todesfälle bei erhöhter Strahlentherapiedosis signifikant zu. Somit gilt als Referenz das bereits 1992 als Ergebnis der Radiation Therapy Oncology Group (RTOG)-Studie 80-06 publizierte Dosierungsschema: 50,4 Gray Strahlentherapie mit simultan Cisplatin, sowie 5-FU. Nur bei absoluten Kontraindikationen gegen eine Chemotherapie sollte eine alleinige Radiotherapie gewählt werden. Zu mindestens einem Zeitpunkt der Erkrankung leiden viele Patienten unter ausgeprägten Symptomen (z.B. Schmerzen, Luftnot etc.) und psychosozialen Beeinträchtigungen, die eine spezialisierte palliativmedizinische Mitbehandlung nötig machen. Zur Beseitigung der Dysphagie bei Patienten mit nicht resektablem Ösophaguskarzinom besteht die Möglichkeit der Wiederherstellung der Speisepassage durch endoskopische Applikation eines Ösophagusstents oder, bei Schwierigkeiten einer Stentimplantation, durch Anwendung eines Lasers zur Lumeneröffnung bei nicht sondierbarer Tumorstenose. Dies wird allerdings nur noch selten durchgeführt, da es bei unbefriedigenden Ergebnissen zu erheblichen Komplikationen kommen kann. 1.1.6.Prognose Das entscheidende Kriterium bei der Chirurgie des Ösophaguskarzinoms ist die Erzielung einer Resektion ohne Residualtumor (R0-Resektion) [Hölscher 1995]. Die Überlebenskurven zeigen, dass alle Patienten mit mikroskopischem oder makroskopischem Tumorrest innerhalb von 2 Jahren versterben, während Patienten ohne Residualtumor eine 5-Jahresüberlebensrate von 40% aufweisen. Die Prognose für die Gesamtgruppe von Patienten mit Plattenepithelkarzinom liegt in den meisten 15 Serien etwas niedriger, da diese fortgeschrittenere Tumorstadien aufweisen und durch Zweittumoren belastet sind [Hölscher 1995]. N0-Patienten haben eine signifikant bessere 5-Jahresüberlebensrate als N1-Patienten. Das Überleben der N1-Patienten hängt jedoch von dem Prozentsatz bzw. der Zahl der befallenen Lymphknoten ab [Peyre 2008]. Je kleiner dieser Prozentsatz durch adäquate Lymphadenektomie gehalten wird, desto günstiger ist die Prognose. Neben dem Ansprechen auf die Induktionstherapie bleibt der Lymphknotenstatus der wesentliche Prognoseparameter der neoadjuvanten Radiochemotherapie bei fortgeschrittenem Ösophaguskarzinome. Patienten mit cT3/T4-Tumoren mit guter Response (<10% vitalem Resttumor) haben nach Daten der chirurgischen Klinik der Universität zu Köln eine 2-Jahresüberlebensrate von ca. 78% [Bollschweiler 2009]. 1.2.Das Immunsystem 1.2.1.Komponenten und Aufgaben des Immunsystems Das Immunsystem verteidigt den Organismus gegen Infektionen. Grundsätzlich leistet es die Unterscheidung zwischen Pathogenen und Körperzellen und damit die Bekämpfung der als „fremd“ erkannten Elemente. Eine strukturelle Aufgliederung des Abwehrorgans kann erfolgen in einen unspezifischen, angeborenen und einen spezifischen, erworbenen Arm, jeweils noch einmal untergliedert in eine zelluläre und eine humorale Komponente. Die Unterstützung und Verstärkung der angeborenen Immunität durch die erworbene Immunität ermöglicht die gezielte und kontrollierte Abwehr von Krankheitserregern. Die angeborene Immunität stellt einen Teil der natürlichen Resistenz dar. In diesem Sinne wirken z.B. die mit Flimmerepithel ausgestatteten Schleimhäute des Respirationstraktes oder die Darmperistaltik, die den laufenden Weitertransport des Darminhalts mit seinen unzähligen Mikroorganismen bewirkt. Nach Überwindung der äußeren Barrieren treffen Krankheitserreger auf die zellulären und humoralen Träger der angeborenen Immunität. Die wichtigsten Vorgänge sind hier die Keimaufnahme (Phagozytose) und die darauf folgende Keimabtötung durch Fresszellen. Die Phagozytose obliegt in erster Linie den Granulozyten und den Zellen des mononukleär16 phagozytären Systems. Eine besondere Funktion üben die NK-Zellen aus; sie sind in der Lage, virusinfizierte Zellen und Tumorzellen durch Kontakt abzutöten. Unter den humoralen Faktoren ist das Komplement an erster Stelle zu nennen. Es lysiert Bakterien und neutralisiert Viren. Hochwirksam sind auch die Interferone, welche die intrazelluläre Virusvermehrung hemmen [Hahn 2005]. Immunreaktionen Vorläuferzellen allgemein im werden Knochenmark durch Leukozyten abstammen. Aus vermittelt, einer die von pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle gehen einerseits die Lymphozyten hervor, welche für die angeborene Immunität verantwortlich sind, sowie andererseits myeloide Zelllinien, die sowohl an der angeborenen als auch an der erworbenen (adaptiven) Immunität beteiligt sind. Neutrophile, eosinophile und basophile Zellen bezeichnet man insgesamt als Granulozyten; sie zirkulieren im Blut, bis sie aktiviert werden, um als Effektorzelle an Infektions- und Entzündungsherden zu agieren. Makrophagen und Mastzellen beenden ihre Differenzierung in den Geweben, wo sie an vorderster Linie der Immunabwehr auftreten und Entzündungen auslösen. Makrophagen nehmen Bakterien durch Phagozytose auf und aktivieren im Blut andere phagozytotische Zellen, die neutrophilen Zellen. Mastzellen sind exozytische Zellen, die offenbar bei der Abwehr von Parasiten eine wichtige Rolle spielen und allergische Entzündungen auslösen. Sie aktivieren eosinophile und basophile Zellen, die ebenfalls exozytisch sind. Dendritische Zellen dringen als unreife Phagozyten in die Gewebe ein, wo sie sich darauf spezialisieren, Antigene aufzunehmen. Anschließend wandern diese antigenpräsentierenden Zellen in das Lymphgewebe. Es gibt zwei Hauptgruppen von Lymphozyten: die B-Lymphozyten, die im Knochenmark reifen, und die T-Lymphozyten, die sich im Thymus entwickeln. Darum bezeichnet man das Knochenmark und den Thymus als zentrale oder primäre lymphatische Organe. Gereifte Lymphozyten wandern fortwährend vom Blut zu den peripheren, oder sekundären, lymphatischen Organen und kehren über die Lymphgefäße in den Blutkreislauf zurück. Die meisten adaptiven Immunantworten werden ausgelöst, indem eine patroullierende T-Zelle an der Oberfläche einer dendritischen Zelle ihr spezifisches Antigen erkennt. Die drei Haupttypen des peripheren, lymphatischen Gewebes sind die Milz, die Antigene aus dem Blut sammelt, die Lymphknoten, die Antigene aus Infektionsherden im Gewebe festhalten, und die mucosaassoziierten lymphatischen Gewebe (MALT), die Antigene von den Oberflächenepithelien des Körpers aufnehmen. Adaptive Immunantworten werden in den peripheren lymphatischen Geweben ausgelöst: T-Zellen, die auf ein Antigen treffen, proliferieren 17 und differenzieren zu antigenspezifischen Effektorzellen, während B-Zellen proliferieren und zu antikörperfreisetzenden Zellen differenzieren [Janeway 2004]. Ein in den Körper eingedrungenes Antigen kann zum Beispiel von einer Zelle des phagozytären Systems oder einer anderen Antigen präsentierenden Zelle (APC) prozessiert und zusammen mit MHC-II-Molekülen auf der Oberfläche exprimiert werden. Diese werden dann von CD4+ T-Helferzellen erkannt, worauf diese Interleukine und Interferon-ausschütten, was dann die B-Lymphozyten dazu anregt, entweder zur Plasmazellen zu werden und spezifische, klonale Antikörper gegen dieses Antigen zu produzieren, oder zu Gedächtniszellen zu differenzieren, die bei einem zukünftigen, wiederholten Antigenkontakt sofort massiv und beschleunigt die humorale Antwort vollzieht. Körpereigene Zellen, die mit Viren infiziert sind oder im Rahmen eines Tumorgeschehens veränderte Proteine synthetisieren und diese in prozessierter Form gemeinsam mit MHC I Molekülen auf ihrer Oberfläche exprimieren, werden von CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten erkannt, die dann die Lyse der Zelle einleiten. Die Aufgabe von CD 8+-T-Suppressorzellen und einer in jüngerer Zeit entdeckten Subpopulation der CD 4+-T-Helferzellen, den regulatorischen T-Zellen, ist es, durch ihre hemmende Wirkung eine überschießende Immunantwort zu verhindern [Pezzutto 2007]. Da sich die vorliegende Arbeit insbesondere mit den Subgruppen der Lymphozyten beschäftigt, soll an dieser Stelle genauer die Funktion der bereits o.g. CD4+- und CD8+-Zellen erläutert werden. Die sog. zytotoxischen CD8+-Zellen erkennen Antigene, welche über MHC-Klasse-I präsentiert werden, und können, daher auch die Namensgebung, diese Zellen abtöten. Nach spezifischer Antigenerkennung differenzieren und expandieren CD8-Zellen weiter, reichern Lysosomen mit Perforin und viele Arten von Granzymen an, ebenso wird die Expression von dem zelltodinduzierenden Fas-Liganden erhöht. Über Exozytose werden Lysosomen frei gesetzt, Perforine setzen sich anschließend in die Zellmembran der Zielzelle, so dass Poren entstehen, durch welche Granzyme in die Zelle einwandern können und schließlich über die Induktion von Kaspasen eine Art Selbstzerstörung bzw. Apoptose der Zelle einleiten. Wichtiger für das Einleiten der Apoptose von Tumorzellen wird allerdings der Weg über den „Todesrezeptor“ Fas in Interaktion mit Fas-L angesehen, da die meisten Tumorzellen Fas an ihrer Zelloberfläche exprimieren. Einige zytotoxische T-Zellen werden zu lang lebenden Gedächtniszellen. Im Gegensatz dazu erkennen CD-4+-T-Zellen nur im Zusammenhang mit MHC-II Antigene über Antigen-präsentierende Zellen, z.B. dendritische Zellen, Makrophagen, 18 B-Zellen. Anschließend wird IL-2 frei gesetzt, welches wiederum an den IL-2-Rez.von CD4-Zellen bindet, was weitere T-Helferzellen aktiviert, eine sog. Autoregulation. Weiter differenzieren die CD4-Zellen zu Gedächtnis-, Effektor- und Suppressorzellen. Sie sezernieren Zytokine, Proteine und Peptide, welche mit den Tumorzellen in Interaktion treten. Die T-Helfer-Effektorzellen werden nochmals in Th1- und Th2Zellen unterteilt, wobei die Th1-Zellen IL-2, IL-3, INF-Gamma, TNF-Alpha/Beta und die Th2-Zellen IL-4, 5, 10, TNF-Alpha und GM-CSF sezernieren. Die Zytokinproduktion der einen Zellreihe supprimiert die Sezernierung von Interleukinen der anderen T-Zellsubgruppe. Wie wichtig das Zusammenspiel der vielen Zellklassen ist, beschreibt folgendes Beispiel: IL-2, produziert von den Th1-Zellen, ist entscheidend für die Proliferation der zytotoxischen T-Zellen. Außerdem werden von den meisten Tumorzellen MHC-I Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert, so dass v.a. CD8Zellen angelockt werden, allerdings wird davon ausgegangen, dass CD4-T-Zellen Tumorzellen allein bekämpfen könnten. NK-Zellen können hingegen, ohne Antigenpräsentation, NK-Zell-sensitive Tumorzellen mit Hilfe ihrer Vielzahl an Perforin- und Granzymhaltigen Granula lysieren. Somit haben sie den Vorteil, auch Tumorzellen zu eliminieren, welche gar keine MHCMoleküle exprimieren, z.B. in Form einer Apoptoseeinleitung. Über IL-2 aktivierte NKZellen gelten als effektive Antitumor Effektorzellen, so dass in einer Studie von Tumorrückgang durch aktivierte NK-Zellen berichtet wurde [Nagashima 1997]. Somit kann davon ausgegangen werden, dass sich NK-Zellen mit den T-Zellen in ihrer Funktion als tumorspezifische Zellen unterstützen und ablösen [Loose 2009]. 1.2.2.Tumorimmunologie Im Jahr 1953 wurde erstmals belegt, dass Tumoren immunogen sind, d.h. dass man gegen sie im Experiment eine Immunantwort etablieren kann. Tumorzellen sind körpereigene Zellen. Viele von ihnen reaktivieren embryonale Gene, die bei ausdifferenzierten Zellen nicht exprimiert werden, oder sie überexprimieren normale Antigene, die aufgrund der veränderten Quantität immunogen werden. Drittens können Mutationen oder abnormale posttranslationale Modifikationen zu Veränderungen von Selbst-Antigenen führen. Eine Studie konnte aufzeigen, welche wichtige Rolle das Immunsystem bei der Entstehung von Krebs spielt. Bei 905 Patienten, die eine Herz19 und/oder Lungentransplantation erhielten und anschließend immunsupprimierend therapiert wurden, konnte eine 7,1-fache Vermehrung von Krebserkrankungen, v.a. Leukämien, Lymphomen, Kopf-Hals- und Lungenkrebs festgestellt werden [Roithmaier 2007]. Es ist bekannt, dass viele Tumoren so genannte Tumorantigene exprimieren, die von autologen T-Lymphozyten prinzipiell erkannt werden können. Das Immunsystem reagiert entweder gegen Tumor-spezifische Antigene oder gegen Tumor-assoziierte Antigene, (Moleküle, die unterschiedlich von gesunden bzw. kranken Zellen exprimiert werde) [Graziano 2005]. Auch Virusantigene können als Tumorantigen fungieren, wie z.B. das humane Papillomavirus, EBNA-1, oder das Epstein-Barr-Virus [Hislop 2007]. Im unmittelbaren Umfeld des Tumors dominieren regulatorische T-Zellen, welche durch vermehrte Produktion von immunsupprimierendem TGF-β und Interleukin-10, Antitumor-Effektor-T-Zellen supprimieren [Zou 2006]. Tumorzellen können als körpereigene Zellen von den physiologischen Toleranzmechanismen profitieren, die auch andere Gewebe vor Angriffen des Immunsystems schützen. Solange sie nicht nekrotisch werden oder bei ihrer Invasion Gewebe zerstören, senden sie dem Immunsystem meist keine Gefahrensignale. Tumorzellen unterscheiden sich vom gesunden Gewebe durch ihre außerordentlich hohen Mutationsraten. In großen Tumoren finden sich daher stets mehrere Tumorzellpopulationen mit verschiedenen Eigenschaften. Die seltenen Varianten, die durch ihre Mutationen einen Wachstums- oder Überlebensvorteil erlangt haben, setzen sich im Verlauf einer Tumorerkrankung durch und werden dominant. Dies sind z.B. solche Tumoren, welche angiogenesefördernde Faktoren (z.B. VEGF) produzieren können. Denn ab einer bestimmten Größe müssen solide Tumoren eine eigene Blutgefäßversorgung aufbauen, da die Diffusionsvorgänge für Tumorzellatmung undErnährung nicht mehr ausreichen. Viele Tumorzellen sind so verändert, dass ihre Erkennung durch das Immunsystem erschwert ist (Ignoranz). So findet man in mehr als 80% metastasierender Tumoren Zellen, welche kein MHC-I mehr exprimieren. Der Verlust von MHC-I-Allelen enthemmt jedoch NK-Zellen. Diese können Tumorzellen lysieren, wenn sie auf deren Oberfläche Liganden für ihre aktivierenden NK-Zell-Rezeptoren finden. Es ist daher nicht verwunderlich, dass Tumoren Wachstumsvorteil haben können. 20 mit MHC-Klasse-I-Expression einen Noch charakteristischer als ungebremstes Wachstum ist für viele Tumorzellen ihre Unfähigkeit zu sterben. Der physiologische Zelltod, die Apoptose, ist eine aktive Zellleistung. Die Ausschaltung proapoptotischer Gene durch Mutation oder durch epigenetische Mechanismen der Chromatinkondensation und/oder die Überexpression antiapoptotischer Faktoren wie z.B. Bcl2 machen manche Tumorzellen resistent gegen die zytolytischen Signale von NK- und T-Zellen. Nicht selten exprimieren Tumoren Liganden für Todesrezeptoren (FasL, B7H1), so dass zytolytische Zellen, die mit ihnen todbringenden Zellkontakt suchen, selbst in die Apoptose geschickt werden. Es kann sogar zu einem sogenannten Tumorenhancement kommen, d.h. zu einer Tumorwachstumsförderung durch das Immunsystem selbst. Tumorinfiltrierende Makrophagen werden z.B. durch IL-10-sezernierende Tumoren auf ein antiinflammatorisches Repertoire umgeschaltet, statt die Tumoren extrazellulär zu killen. Sie produzieren jetzt ihrerseits IL10 oder TGF-ß und fördern damit ungehindertes Tumorwachstum. Zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen werden inhibiert und stattdessen regulatorische T-Zellen induziert. Auch chronische Entzündungen sind mit einem erhöhten Tumorrisiko assoziiert. Als Ursache werden Mutationen durch die dann - schädigende Wirkung reaktiver Sauerstoff- und Stickoxidintermediate diskutiert, welche z.B. von aktivierten Makrophagen freigesetzt werden. Schließlich begünstigt eine Aggregatbildung von Thrombozyten oder Monozyten mit Tumorzellen möglicherweise deren Metastasierung, wenn die Blutzellen mit ihren Adhärenzmolekülen die Haftung der Tumorzellen am Endothel kleiner Blutgefäße vermitteln [Schütt 2011]. 1.2.3.Immuntherapie Facetten der Immuntherapie in präklinischen und klinischen Studien sowie teilweise auch schon in der therapeutischen Praxis umfassen aktive Immunisierung durch prozessierte Tumorantigene, passive Immunisierung durch Verabreichung von Antikörpern gegen Tumorantigene, wie z.B. Trastuzumab (bei Her2-positiven Brustkrebspatientinnen), Applikation von mit autologen Antigenen inkubierten körpereigenen T-Zellen oder dendritischen Zellen, Kombination dieser Maßnahmen mit 21 Immunmodulation durch Interleukine oder Verabreichung der Standardchemotherapie und viele mehr [Mitchell 2003]. Erste Erfolge bei der Umschaltung von Tumorenhancement auf Tumorabwehr waren beim malignen Melanom zu verzeichnen. Durch Kultivierung mit IL4 und GM-CSF gelang die Ausdifferenzierung sowie Expansion dendritischer Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut der Patienten. Eine ex-vivo-Stimulation der dendritischen Zellen mit Tumorantigenen verursachte deren Umschaltung auf DC1-Zellen. Eine 2002 durchgeführte Studie bei Patienten mit malignem Melanom konnte zeigen, dass es durch Infusion von CD8-T-Zellen, die speziell zu Melanom-typischen Antigenen passten (MART-1, Melan-A, Glykoprotein 100), bei 8 von 10 Patienten zu einem Metastasenregress kommt [Yee 2002]. Der klassische Weg, eine TH1-dominierte Immunantwort zu induzieren, ist die Impfung mit dem Antigen. Dabei kryokonserviert man Tumorzellen aus dem resezierten Gewebe, nach dem Auftauen versetzt man die Zellen mit einem Adjuvans und für eine somatische Zelltherapie dem Patienten einmal wöchentlich als autologe Vakzine intradermal appliziert. Die klonale Expansion tumorspezifischer zytotoxischer T-Zellen durch die Immunisierung, verstärkt die immunologische Attacke gegen restliche Tumorzellen (minimal residual disease) [Schütt 2006]. 1.3.Fragestellung der Arbeit Wird das zelluläre Immunsystem bei Patienten mit Ösophaguskarzinom nach neoadjuvanter Radiochemotherapie signifikant supprimiert? Ist dies von klinischer Bedeutung? Hierzu werden folgende Detailfragen bearbeitet: 1. Die Werte von Lymphozytensubpopulationen, welche den zellulären Immunstatus widerspiegeln sollen, sowie von Thrombozyten und Leukozyten bei Patienten mit Ösophaguskarzinom, werden vor- und nach der neoadjuvanten Radiochemotherapie miteinander verglichen. 22 1a. Es wird analysiert, ob und in welchem Ausmaß statistisch auffällige Unterschiede zwischen den beiden Gruppen bestehen, um eine Aussage über den immunsupprimierenden Effekt von neoadjuvanter Radiochemotherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom in fortgeschrittenen Stadien machen zu können. 2. Es wird eine Relation der Ergebnisse zu Normwerten hergestellt, was für den klinischen Alltag bei der Beurteilung des Immunstatus eines Patienten von Bedeutung ist. 3. Zur Beurteilung neoadjuvante postoperativen der klinischen Radiochemotherapie Relevanz wird Komplikationen, im die einer Immunsupprimierung Häufigkeit engeren Sinn des Auftretens Pneumonien durch von und Anastomoseninsuffizienzen, untersucht. 2. Material und Methoden 2.1.Patientenkollektiv In dieser prospektiv durchgeführten Beobachtungsstudie wurden die Ergebnisse der Immunstatuserhebung von 25 Patientinnen und Patienten mit lokal fortgeschrittenem Ösophaguskarzinom analysiert, die sich im Zeitraum von 2008 bis 2009 einer neoadjuvanten Radiochemotherapie mit nachfolgender Operation im Rahmen eines multimodalen Therapiekonzeptes an der Chirurgischen Klinik der Universität zu Köln (Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. A.H. Hölscher) unterzogen haben. Das Patientenkollektiv setzte sich aus 3 Patientinnen und 22 Patienten zusammen, welche ein lokal fortgeschrittenes Ösophaguskarzinom aufwiesen. Das mediane Alter betrug bei den männlichen Patienten 60 Jahre, bei den weiblichen Patientinnen 65 Jahre. 8 Patienten wiesen ein Plattenepithelkarzinom, 17 Patienten ein Adenokarzinom des Ösophagus vor. Alle Patienten wurden im Zuge der neoadjuvanten Radiochemotherapie mit 5-Fluoruracil (1000mg/m² als 24h-Infusion) und Cisplatin (75mg/m² i.v. als Kurzinfusion) behandelt, sowie mit 36-40 Gray bestrahlt. Das Therapiekonzept sah vor, an Tag 1-5 der ersten Woche die Chemotherapie und parallel dazu in den Wochen 1-4 23 die Radiotherapie durchzuführen. Anschließend wurden 20 Patienten unter kurativer Absicht operiert. Die restlichen 5 Patienten wurden auf Grund von Vorerkrankungen oder mangelndem Operationsrisiko Ernährungsstatus nicht operiert. und damit Standartmäßig einhergehendem erfolgte eine erhöhten transthorakale Ösophagektomie mit anschließendem Magenhochzug. In die Studie eingeschlossen wurden alle Patienten, die ein gesichertes Ösophaguskarzinom aufwiesen und sich einer neoadjuvanten Radiochemotherapie unterzogen haben. 2.2.Erhebung des Immunstatus Der zelluläre Immunstatus wurde an Hand folgender Zellpopulationen bestimmt: CD3-, CD4-, CD8-, CD16+65-, CD19, IL2+-, HLA-DR+- Zellen, einschließlich dem CD4/CD8-Quotienten. Untersucht wurden die immunmodulatorischen Effekte der verabreichten Radiochemotherapie. Außerdem wurden die Werte für Thrombozyten und Leukozyten bestimmt. Die Bestimmung dieser Blutzellen erfolgte standardisiert vor Beginn der Radiochemotherapie und zum Zeitpunkt des Re-Staging nach Beendigung der Induktionstherapie, 5 Tage vor der Operation. Probenaufbereitung Um den zellulären Immunstatus zu bestimmen, muss den Patientinnen und Patienten aus der Armvene Blut mit einer 2,7 ml-Monovette (Sarstedt, Nümbrecht) entnommen werden, welche 1,6 mg EDTA/ml Blut enthält. Anschließend wird ein kleines Blutbild und ein Differenzialblutbild erstellt, um die gemessenen Leukozyten-und Lymphozytenwerte als Ausgangspunkt für die weiteren Messergebnisse zu benutzen. Falls die gemessenen Leukozyten unter 3,5 x 10³/µl liegen, sollte aufkonzentriert werden, wenn die Werte über 9,4 x 10³/µl liegen, sollte verdünnt werden [SimulTest TM IMK-Lymphocyte, For In Vitro Diagnostic Use, 2000]. Gemäß Laborprotokoll geschieht die Aufbereitung der Proben für die Messung im Durchflusszytometer mit dem SimultestTM IMK-Lymphocyte (Becton Dickinson Biosciences). Hierbei handelt es sich um einen Satz monoklonaler Antiköper - jeweils paarweise mit den Fluorochromen Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE) markiert - gegen die folgenden Oberflächenantigene: 24 Reagenz A: CD45/CD14 (Leuko GATE) Reagenz B: IgG1, clone X40/IgG2a, clone X39 (Kontrollreagenz) Reagenz C: CD3/CD19 Reagenz D: CD3/CD4 Reagenz E: CD3/CD8 Reagenz F: CD3/CD16+CD56 Zur Aufbereitung werden jeweils 100 µl Blut mit 10 µl der Antikörper-Reagenzien in Suspension gebracht und fünfzehn Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach werden zur Lyse der Erythrozyten 2ml FACS-Lysing-Solution (<50% Diethylenglykol, <15% Formaldehyd) 1:10 mit Aqua dest. verdünnt zugegeben und weitere zehn Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wird die Probe fünf Minuten bei 250-300 x g zentrifugiert, dekantiert und mit 2ml phosphatgepufferter Saline (PBS) verdünnt. Nach weiterer Zentrifugation wird die Probe nochmals dekantiert. Im Anschluss daran werden 300 µl Cellwash (Becton Dickinson) zugegeben. Dieser Schritt komplettiert die Vorbereitung auf die Messung im Durchflusszytometer. Durchflusszytometrie Das Prinzip der durchflusszytometrischen Differenzierung lymphatischer Zellen beruht auf der gleichzeitigen Messung mehrerer physikalischer und biochemischer Parameter von jeweils einer einzelnen Zelle. Erfasst werden die relative Partikelgröße, die relative Granularität und die Fluoreszenzintensität. Diese beruht auf der Markierung mit spezifischen fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern. Nach der Zugabe des monoklonalen Antikörperreagenz zu der Probe binden sich die mit Fluorchrom markierten Antikörper an die Antigene auf der Oberfläche der Leukozyten (s.o.). Für die Bestimmung der T-Lymphozyten hat sich das Prinzip der Doppelfärbung bewährt, da die eindeutige Zuordnung zum Zelltyp über die Coexpression von CD3 und CD4 bzw. CD8 möglich ist. Die gefärbte Probe wird anschließend mit einer Lyselösung behandelt, um die Erythrozyten zu lysieren. Während der durchflusszytometrischen Messung passieren die fluoreszenzmarkierten Zellen einzeln einen Laserstrahl (Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung). Dabei 25 wird das auftreffende Licht gestreut. Die Streulichtsignale werden von Photodioden (Vorwärtsstreulicht, forward scattered collection=FSC-Signal) und Photomultipliern (Seitwärtsstreulicht, side scattered collection =SSC-Signal) erfasst und anschließend in elektronische Signale umgewandelt. Je größer die Zelle und je stärker granuliert sie ist, desto höher fallen die Signale für FSC und SSC aus. Zusätzlich werden durch das Laserlicht die Fluorchrome der auf der Zelloberfläche gebundenen monoklonalen Antikörper angeregt, die emittierte Energie wird in Form von Licht freigesetzt. Jedes verwendete Fluorchrom hat ein anderes Emissionsmaximum, sodass unter Verwendung zwei verschiedener Laser gleichzeitig vier unterschiedliche Fluorchrom-markierte monoklonale Antikörper eingesetzt werden können. Folgende Fluoreszenzfarbstoffe werden für folgende markierte Oberflächenantigene eingesetzt: -FITC (Fluoresceinisothiocyanat) für CD3 mit Argonlaser -PE (Phycoerythrin) für CD8, CD16/56 mit Argonlaser -PerCP (Peridinchlorophyllprotein) für CD45 mit Argonlaser -APC (Allophycocyanin) für CD4, CD19 mit rotem Diodenlaser Die verschiedenen Fluoreszenzsignale werden in Abhängigkeit von ihren Wellenlängen mit Hilfe von Spiegeln und Filtern separiert und von Photomultipliern erfasst und in elektronische Signale umgewandelt. Auf diese Weise erhält man Informationen über Größe (Vorwärtsstreulicht), Granularität (Seitwärtsstreulicht) und Fluoreszenzintensität der Zellen. MultiTest-Reagenzien arbeiten mit Fluoreszenz-Triggerung. Dieses ermöglicht das automatische Setzen eines Analysefensters um die fluoreszierende Lymphozytenpopulation (Attractor). Das Triggern vermindert Verunreinigungen im Analysefenster, die z.B. durch nicht lysierte Erythrozyten entstehen. Die Bestimmung des T-Zell-Aktivierungsmarker HLA-DR bzw. CD25 wird in weiteren Ansätzen durchgeführt. Bei der Auswertung der Messung mit der SimulSET-Software werden gleichzeitig zwei verschiedene Fluorchrom-markierte monoklonale Anitkörper eingesetzt, dies sind folgende: 26 -FITC für CD45 und CD3 -PE für HLA-DR und CD25 Das Analysensystem, mit welchem die Messungen vorgenommen wurden, ist das Modell FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, USA) [Institut für Klinische Chemie der Universität zu Köln, Mellios 2010]. 2.3.Statistische Auswertung Das Programm SPSS ® (Statistical Package for Analysis in Social Science, 18.0, SPSS-Inc., Chicago, Illinois, U.S.A.) wurde zur statistischen Auswertung der Daten verwendet. Zunächst wurde das Patientenkollektiv im Sinne einer deskriptiven Statistik auf Diagnosehäufigkeiten, Alter und Therapiestatus zum Zeitpunkt der Messung des Immunstatus untersucht. Mit dem T-Test für verbunden Stichproben wurde untersucht, ob sich die Werte für Leukozyten und Lymphozytensubgruppen, sowie der Thrombozyten, der IL-2+-und HLA-DR+-Zellen, signifikant in den beiden Gruppen (vor/nach neoadjuvanter RTX), voneinander unterscheiden. Im Anschluss an den Vergleich der Absolutwerte wurden selbige zu den Normbereichen der Zellpopulationen in Beziehung gesetzt. Dieser Teil der Auswertung geschah rein deskriptiv mit Hilfe der Berechnung von Häufigkeiten, Häufigkeitsverteilungen, Mittelwerten und Extremwerten. Mit dem Fisher Exakt Test, ein Chi-Quadrat-Test, welcher genauere Ergebnisse bei geringer Fallzahl ermittelt, wurde mit Hilfe der p-Wert-Berechnung untersucht, ob es nach applizierter Radiochemotherapie zu einer signifikanten Supprimierung unter den Normbereich kommt. 27 3.Ergebnisse 3.1.Leukozyten Nach neoadjuvanter Radiochemotherapie ist ein Abfall der Leukozyten im Blut fest zu stellen. Der Mittelwert vor Therapie liegt mit 7,99 x 109/l weit über dem errechneten Mittelwert von 5,83 x 109/l nach Therapie. Das Minimum der Leukozyten aller Patienten liegt vor der Therapie bei 3,97 x 109/l, danach bei 2,68 x 109/l. Beide liegen somit unter dem Normbereich von 4,4-11,3 x 109/l. Das Maximum der Werte liegt vor den Therapiemaßnahmen mit 13,42 x 109/l deutlich über dem höchsten ermittelten Wert nach der Therapie mit 8,56 x 109/l und über der Norm. Diese Werte zeigen eindrücklich, dass die neoadjuvante Radiochemotherapie einen supprimierenden Effekt auf die Leukozyten hat, was durch den mit Hilfe des T-Tests für verbundene Stichproben errechneten p-Wert von <0,001 verdeutlicht wird. Dies spricht für ein hochsignifikantes Ergebnis. Wie in den weiter unten aufgeführten Box-Plot-Darstellungen ersichtlich, kommt es zu einer Verschiebung der Werte im Bereich des Normbereichs, d.h., dass sich der Großteil der Leukozyten nach neoadjuvanter Radiochemotherapie im unteren Drittel des Normbereichs befindet. Die Grafik der gestapelten Säulen verdeutlicht, bei wie viel Prozent der Patienten die Werte über, im oder unter dem Normbereich liegen. Es zeigt sich, dass trotz des signifikanten Abfalls der Leukozyten, noch 70-80% der Patienten mit ihren Werten im Normbereich liegen. Außerdem erhöht sich der prozentuale Anteil derer, die nach der Therapie unter die Norm fallen, von 8% auf 24%. Mit Hilfe des Fisher Exakt Tests konnte hervor gehoben werden, dass es nach Radiochemotherapie zu keiner signifikanten Supprimierung unter den Normbereich kommt. Über der Norm liegen zu Beginn der Therapie noch 12%, nach erfolgter Chemo- und Strahlentherapie befinden sich gar keine Werte mehr über dem Normbereich. Trotz des großen Anteils der im Normbereich liegenden Werte, wird mit Hilfe der zweiten Darstellung deutlich, dass ein großer Prozentsatz, nämlich 64% der Leukozyten signifikant zum Ausgangswert sinkt, was einem Abfall von über 20% vom Ausgangswert entspricht. Nur 24% sinken wenig, also unter 20% vom Ausgangswert aus. Insgesamt ist fest zu halten, dass die Leukozyten durch die neoadjuvante Radiochemotherapie signifikant sinken. Allerdings befinden sich die Werte nach der Therapie noch bei dem Großteil der Patienten im Normbereich. Der Anteil, welcher 28 nach neoadjuvanter Radiochemotherapie unter die Norm sinkt, ist statistisch nicht signifikant. Leukozyten Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der Leukozyten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p < 0,001 x109 /l 29 Veränderungen der Leukozyten vor/nach Radiochemotherapie bezogen auf den Normbereich p-Wert: nicht signifikant 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm in der Norm ̽unter der Norm 1.Messung 12% 80% 8% 2.Messung 0% 76% 24% Veränderung der Leukozyten nach neoadjuvanter Radiochemotherapie bezogen auf den Ausgangswert Leukozyten 64% 24% 12% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes 30 Anstieg 3.2.Thrombozyten Der Mittelwert von Thrombozyten im peripheren Blut von Patienten vor der neoadjuvanten Therapie liegt mit 254 Tsd./µl weit über dem errechneten Mittelwert nach Therapie mit 197 Tsd./µl. Beide Werte liegen allerdings im Normbereich von 150400 Tsd./µl. Bei Vergleich der Minimalwerte beider Gruppen ist die starke Differenz zwischen 154 Tsd./µl vor Therapiebeginn und 34 Tsd./µl nach den Therapiemaßnahmen auffällig. Der zweite Wert liegt weit unter der Norm. Bei Betrachtung des dazugehörigen Box-Plot-Diagrammes, wird allerdings deutlich, dass dieser Minimumwert als Ausreißer gewertet werden kann, trotzdem insgesamt mehr Patienten niedrigere Werte nach Therapie aufzeigen als zuvor. Dieses Ergebnis ist hoch signifikant. Das gemessene Maximum von 412 Tsd./µl vor Therapiebeginn liegt über der Norm, während es nach der Therapie mit 299 Tsd./µl einen viel kleineren Wert annimmt. Das Box-Plot zeigt, dass das vor der Therapie gemessene Maximum als Ausreißer zu interpretieren ist und daher die Spanne, in der sich die Werte bewegen, sowohl vor als auch nach Therapie ähnlich groß ist. Bei Bezug auf den Normbereich, fällt auf, dass die Thrombozyten durch die neoadjuvante Therapie absinken, sich jedoch weiterhin größtenteils, zu 80%, im Normbereich bewegen. Vor der Therapie liegen keine Werte unter der Norm, danach sind es 20%. Dies ist ein signifikanter Abfall unter den Normbereich. Der p-Wert wurde mit Hilfe des Fisher Exakt Tests bestimmt und liegt bei 0,05. Diese Sachverhalte werden in der Graphik mit den gestapelten Säulen wieder gegeben. Bei dem Vergleich mit den Ausgangswerten, ist hervorzuheben, dass der Großteil, nämlich 68% der Thrombozyten signifikant, d.h. über 20% vom Ausgangswert aus, abfällt. Somit ist, wie auch bei den Leukozyten, ein signifikant supprimierender Effekt der neoadjuvanten Radiochemotherapie zu beobachten. Der Großteil aller Werte befindet sich jedoch auch nach Therapie im Normbereich. Anders als bei den Leukozyten, ist bei den Thrombozyten nach erfolgter Radiochemotherapie die Anzahl von Patienten, welche mit ihren Werten unter den Normbereich fällt, signifikant erhöht. 31 Thrombozyten Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der Thrombozyten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p < 0,001 Tsd./µl 32 Thrombozyten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert: 0,05 100% 80% 60% 40% 20% 0% 1.Messung 8% 92% 0% über der Norm in der Norm unter d.Norm ̽ Veränderungen der Radiochemotherapie Thrombozyten mit Bezug 2.Messung 0% 80% 20% nach neoadjuvanter zum Ausgangswert Thrombozyten 68% 28% 4% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes 33 Anstieg 3.3.Lymphozyten (B-und T-Lymphozyten) Auch die Gruppe der Lymphozyten sinkt nach neoadjuvanter Radiochemotherapie signifikant mit den Werten ab. Der errechnete Mittelwert 1,86 x 109/l vor der Therapie ist weitaus höher als der Mittelwert 0,98 x 109/l nach der Therapie, welcher unter der Norm (1-4,8 x 109/l) liegt. Die jeweiligen Minimalwerte beider Gruppen unterscheiden sich vor und nach Therapie nicht signifikant voneinander, während der Maximalwert vor der neoadjuvanten Therapie mit 4,42 x 109/l über dem Maximum nach Therapie liegt, welches 2,42 x 109/l beträgt. Wie aus diesen Angaben und dem dazugehörigen Box-Plot ersichtlich, wird die Spanne, in der sich die Werte bewegen, viel kleiner und sie bewegt sich insgesamt in kleineren Werten. Außerdem zeigt sich, dass 50% aller Werte vor Therapie zwischen 0,2 und 2,0 liegen (die anderen 50% liegen darüber), während nach der neoadjuvanten Therapie die Hälfte der Werte für Lymphozyten im Bereich zwischen 0,3 und 0,7 liegen. Insgesamt liegen also die meisten posttherapeutischen Werte tiefer als zuvor. Dieser Aspekt wird durch die Berechnung des p-Wertes mit Hilfe des t-Tests für verbundene Stichproben objektiviert: p<0,001. Bei Bezug zum Normbereich, fällt auf, v.a. im Gegensatz zu den zuvor genannten Leukozyten und Thrombozyten, dass bereits vor Therapiebeginn einige Patienten unter der Norm (16%) liegen, nach Therapie immer noch 44% im Normbereich zu finden sind, allerdings die meisten, nämlich 56%, unter die Norm fallen. Dieser Abfall unter die Norm ist statistisch signifikant. Dies entspricht dem Ergebnis der Thrombozyten, nicht aber der Leukozyten. Berechnet wurde der p-Wert:0,007 mit Hilfe des Fisher Exakt Tests. Der Abfall der Werte wird noch deutlicher, wenn man den Vergleich zu den Ausgangswerten heran zieht: 80% der Werte sinken nach neoadjuvanter Therapie signifikant, d.h. über 20% vom Ausgangswert aus ab, während nur 8% marginal fallen. Zusammenfassend ist fest zu halten, dass die Lymphozyten stark unter den angewandten Therapiemaßnahmen leiden, im Gegensatz zu den vorherigen Zellpopulationen sogar mit dem Großteil ihrer Werte unter dem Normbereich liegen. Sowohl der Abfall der Werte insgesamt nach Radiochemotherapie, als auch die steigende Anzahl an Werten unter die Norm, sind statistisch relevante, d.h. signifikante, Ergebnisse. Um genauere Aussagen darüber machen zu können, welche Lymphozytensubpopulation für diesen deutlichen Abfall verantwortlich ist, wird im 34 Weiteren zwischen B- und T- (CD4+- und CD8+-)Zellen unterschieden und die Ergebnisse veranschaulicht. Lymphozyten Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der Lymphozyten (gesamt) vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p < 0,001 x 109 /l 35 Lymphozyten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert : 0,007 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm Normbereich unter d.Norm ̽ über der Norm 1.Mes sung 0% 84% 16% 2.Mes sung 0% 44% 56% Normbereich unter d.Norm ̽ Lymphozyten nach der Therapie mit Bezug zum Ausgangswert Lymphozyten 80% 12% 8% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes 36 Anstieg 3.4.CD3+-Zellen (T-Lymphozyten) Die CD3+-Zellen (T-Lymphozyten) fallen signifikant nach neoadjuvanter Radiochemotherapie ab. Wie schon bei den vorherigen Zellpopulationen beobachtet, liegen auch die T-Lymphozyten vor der neoadjuvanten Radiochemotherapie mit dem Mittelwert (1,37 x 109/l) über dem errechneten Mittelwert nach Therapie, welcher 0,79 x 109/l beträgt. Zu berücksichtigen ist, dass beide Werte im Normbereich (0,6-4,08 x 109/l) liegen. Das Minimum von 0,13 x 109/l vor den Therapiemaßnahmen unterscheidet sich kaum vom Minimalwert 0,21 x 109/l nach Therapie. Beide Werte liegen aber unter der Norm. Auch bei den Werten für das jeweilige Maximum unterscheiden sich die beiden Gruppen kaum voneinander. Insgesamt sinken die T-Lymphozyten also, allerdings bleibt die Spanne, in der sich die Werte bewegen, ungefähr gleich. Mit Hilfe des t-Tests für verbundene Stichproben konnte der p-Wert <0,001 berechnet werden, welcher das hoch signifikante Ergebnis verdeutlicht. Wie aus dem Diagramm der gestapelten Säulen ersichtlich, liegen 88% der Patienten mit ihren Werten für T-Lymphozyten vor Radiochemotherapie im Normbereich, nach der Therapie sind es noch 68%, unter der Norm liegen nun 32% der Werte, während vor Therapiebeginn 12% der Patienten Werte unter der Norm aufweisen. Dieser Unterschied ist, nach Berechnung des p-Wertes mit Hilfe des Fisher Exakt Tests, nicht signifikant (p-Wert: 0,178). Aus der dritten Graphik wird deutlich, dass, obwohl nach Therapie noch so viele Patienten im Normbereich liegen, es bei 72% zu einem signifikanten Abfall der T-Lymphozyten kommt, wenn man den Bezug zum Ausgangswert betrachtet. 8% der Werte sinken nur marginal, also unter 20% vom Ausgangswert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass auch die T-Lymphozyten nach neoadjuvanter Radiochemotherapie signifikant absinken, der Großteil aber immer noch im Normbereich liegt. Obwohl ein größerer Anteil unter den Normbereich fällt, ist dieser statistisch nicht relevant. 37 CD-3+-(T)Lymphozyten Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der TLymphozyten (CD3+-Zellen) vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p < 0,001 X 109 /l 38 T-Lymphozyten vor/nach neoadjuvanter Therapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert: nicht signifikant CD3 T-Lymphozyten im Vergleich 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% über der Norm Normbereich unter d.Norm ̽ 1. Messung 0% 88% 12% 2. Messung 0% 68% 32% CD3+-Zellen nach der Therapie mit Bezug zum Ausgangswert CD3 72% 20% 8% Abfall <20%vom Ausgangswert Abfall >20% vom Ausgangswert 39 Anstieg 3.5.CD4-+-Zellen (T-Helfer-Lymphozyten) Durch die neoadjuvante Radiochemotherapie sinken die CD4-+-Zellen signifikant ab. Dies konnte mit Hilfe des t-Tests für verbundene Stichproben errechnet werden (pWert<0,001). Beim Vergleich der Mittelwerte beider Gruppen, 0,89 x 109/l vor Therapie und 0,49 x 109/l nach den Therapiemaßnahmen, fällt der starke Abfall der CD4-Zellen nach neoadjuvanter Radiochemotherapie auf. Sowohl für das Minimum, als auch für die Maximalwerte, lässt sich kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen herausstellen. Die kleinsten Werte liegen bei 0,08 x 109/l (vorher) und 0,13 x 109/l (nachher), die größten Werte bei 1,64 bzw. 1,62 x 109/l bei einem Referenzbereich von 0,29-2,83 x 109/l. Bei Betrachtung des Diagramms der gestapelten Säulen zeigt sich, dass vor der Therapie bei 96% der Patienten die Werte für CD4-Zellen im Normbereich liegen, während nur 4% aller Patienten Werte unter der Norm aufweisen. Nach Radiochemotherapie liegen noch knapp 70% mit ihren Werten im Normbereich, die Anzahl derer, die Werte unter der Norm zeigen, veracht-facht sich auf 32%. Damit ist diese Veränderung der Werte unter dem Normbereich, nach Berechnung des pWertes mit Hilfe des Fisher Exakt Tests, signifikant (p-Wert: 0,023). Auch wenn, wie oben schon geschildert, noch knapp 70% der Werte nach Therapie im Normbereich liegen, so ergibt sich bei Betrachtung der Ausgangswerte folgendes Bild, welches aus der dritten Graphik entnommen werden kann: über 70% der Werte für CD4-Zellen sinken über 20% (signifikant) vom Ausgangswert aus ab, 12% sinken minimal, also unter 20% vom Ausgangswert aus, und 16% steigen sogar nach Therapie an. Insgesamt ist also fest zu halten, dass auch die CD4+-T-Lymphozyten sehr stark unter den neoadjuvanten Therapiemaßnahmen leiden und daher stark sinken, ein großer Prozentsatz aber immer noch im Normbereich zu finden ist. Jedoch ist die Anzahl der Patienten, deren Werte für CD4+-Zellen nach Radiochemotherapie unter den Normbereich abfallen, statistisch signifikant hoch im Vergleich zu vorher. Somit ähneln die Ergebnisse denen der Lymphozyten gesamt. 40 CD4+-T-Lymphozyten Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der CD4+-T-Lymphozyten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p < 0,001 x 109 /l CD4+-T-Lymphozyten vor/nach Therapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert : 0,023 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm im Normbereich unter d.Norm ̽ 1.Messung 0 96% 4% 41 2.Messung 0 68% 32% CD4+-T-Lymphozyten nach neoadjuvanter Therapie mit Bezug zum Ausgangswert CD4 72% 16% 12% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes Anstieg 3.6.CD8-T-Lymphozyten Ähnlich den Ergebnissen der CD4-Zellen, wird auch bei den CD8-Zellen der supprimierende Effekt der neoadjuvanten Therapiemaßnahmen deutlich. Der mit Hilfe des t-Tests für verbundene Stichproben berechnete p-Wert 0,019 verdeutlicht das signifikante Ergebnis. Die Mittelwertbetrachtung ergibt folgendes: vor Therapie liegt er mit 0,42 x 109/l über dem Mittelwert 0,28 x 109/l in der Gruppe von Patienten, die neoadjuvant therapiert wurden. Beide Werte befinden sich im Normbereich (0,19-2,30 x 109/l). Die Spanne, in welcher sich die Werte bewegen ist für die Gruppe nach Therapie viel kleiner. Die Werte vor Therapie liegen insgesamt höher im Normbereich, als nach Therapie. Bei Bezug zu den Normwerten, fällt auf, dass nach Therapie die Werte bei einigen Patienten unter den Normbereich fallen. Bei Vergleich zu den unter der Norm gelegenen Werte vor den Therapiemaßnahmen und Berechnung des p-Wertes mit Hilfe des Fisher Exakt Tests, ist der Unterschied allerdings statistisch nicht signifikant (p42 Wert:0,345). Im Normbereich liegen trotz Therapie noch 64%, vor den Therapiemaßnahmen liegen 80% der Patienten mit ihren Werten im Normbereich. Ein Abfall von über 20% vom Ausgangswert findet allerdings nur bei 64% der Patienten statt, 24% der Werte steigen nach der Therapie sogar an, diese liegen aber im Normbereich. Zusammenfassend lässt sich fest halten, dass auch die CD8zytotoxischen-T-Zellen durch die neoadjuvante Radiochemotherapie stark supprimiert werden, dies auch statistisch signifikant ist. Jedoch fällt, bei Vergleich zu den vorherig dargestellten Ergebnissen für die CD4+-Zellen auf, dass die CD8+-Zellen weniger stark in ihrer Gesamtheit der Werte absinken. So auch der Anteil der Werte, welcher unter der Norm liegt, sich nach neoadjuvanter Radiochemotherapie nicht signifikant zur ersten Messung (vor Therapiebeginn) verändert. Die CD8+-Zellen (zytotoxische T-Zellen) werden weniger stark durch die neoadjuvante Radiochemotherapie supprimiert als die CD4+-Zellen (T-Helferzellen). CD8+-T-Lymphozyten Boxplot-Darstellung der Absoluwerte der CD8+T-Lymphozyten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p = 0,019 X109 /l 43 CD8+-T-Zellen vor/nach Therapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert : nicht signifikant 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm in der Norm unter d.Norm ̽ 1.Messung 0 80% 20% 2.Messung 0 64% 36% CD8+-T-Zellen nach der Therapie mit Bezug zum Ausgangswert CD8 64% 24% 12% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes 44 Anstieg 3.7.CD4/CD8-Quotient Bei Betrachtung der Ergebnisse für den CD4/CD8-Quotienten fällt auf, dass eine eindeutige Aussage über die Veränderungen des Quotietnten durch neoadjuvante Radiochemotherapie nicht möglich ist, da sich die Werte sehr unterschiedlich entwickeln. Beim Vergleich beider Mittelwerte, 2,86 x 109/l vor der Therapie und 2,35 x 109/l nach neoadjuvanter Radiochemotherapie, fällt der minimale Unterschied beider Werte auf. Hervorzuheben ist allerdings, dass der erste Wert knapp über dem Normbereich (0,6-2,8 x 109/l) liegt. Bei Betrachtung des Box-Plot-Diagrammes für die erste Gruppe zeigt sich, dass mehr als die Hälfte der Werte im obersten Normbereich angesiedelt ist. Die Minimalwerte differieren ziemlich stark in beiden Gruppen. Während vor Beginn der Therapie das Minimum bei 1,1 x 109/l liegt, so ergibt sich nach Radiochemotherapie 0,5 x 109/l als kleinster gemessener Wert, welcher damit unter der Norm liegt. Die höchsten gemessenen Werte unterscheiden sich in beiden Gruppen kaum voneinander (7,9 und 8,0 x 109/l), beide Werte liegen allerdings weit über der Norm. Zu beachten ist, und das wird bei Betrachtung des dazu gehörigen Boxplot deutlich, dass diese als Ausreißer zu interpretieren sind. Das Diagramm der gestapelten Säulen veranschaulicht, dass sich kein signifikanter oder ein nur marginaler Unterschied zwischen der Verteilung der Prozentsätze vor-und nach Therapie zeigt. Die im Normbereich liegenden Werte steigen sogar nach Therapie von 68% auf 72% an, unter der Norm liegen in der neo-Gruppe nur 4%. Über der Norm liegen in beiden Gruppen ca. 1/3 der Werte. Die Veränderungen in Bezug zum Ausgangswert fallen recht inhomogen aus: die Mehrzahl der Werte, nämlich 40%, sinken über 20% vom Ausgangswert aus ab, ähnlich viele (36%) steigen nach der Therapie an, 24% sinken nur marginal ab (unter 20% vom Ausgangswert). Fest zu halten ist demnach, dass keine eindeutige Aussage über die Entwicklung des CD4/CD8-Quotienten nach neoadjuvanter Radiochemotherapie zu machen ist. Die errechneten p-Werte zeigen sowohl im t-Test für verbundene Stichproben als auch im Fisher Exakt Test keine signifikanten Ergebnisse, was sich mit zuvor genannter Bemerkung deckt. Bei einem Teil der Patienten steigt der Wert, bei anderen fällt der Wert für den Quotienten. 45 CD4/CD8-Quotient Boxplot-Darstellung der Absolutwerte des CD4/CD8-Quotienten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p = 0,081 x109 /l 46 CD4/8-Quotient vor/nach Therapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert : nicht signifikant 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm in der Norm unter d.Norm ̽ 1.Messung 32% 68% 0% 2.Messung 24% 72% 4% CD4/8-Quotient nach Therapie mit Bezug zum Ausgangswert CD4/CD8-Quotient 40% 36% 24% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes 47 Anstieg 3.8.CD19+-Zellen (B-Lymphozyten) Die CD-19-+-Zellen liefern eindrückliche Ergebnisse, die klar zeigen, dass diese Zellpopulation mit am stärksten unter der neoadjuvanten Radiochemotherapie leidet. Schon beim Vergleich beider Mittelwerte fällt der signifikante Abfall der Werte nach Therapie auf: 0,19 x 109/l für die erste Gruppe und 0,04 x 109/l für die zweite Gruppe. Dieser Mittelwert liegt unter dem Normbereich von 0,07-1,1 x109/l. Die Minimalwerte liegen in beiden Gruppen weit unter der Norm mit 0,02 x 109/l (vorher) und 0,00 x 109/l, also in Aplasie, für die Gruppe nach neoadjuvanter Therapie. Mit dem durch den t-Test für verbundene Stichproben errechneten p-Wert<0,001 wird deutlich, dass BLymphozyten nach neoadjuvanter Radiochemotherapie stark supprimiert werden und dieses Ergebnis statistisch hoch signifikant ist. Schon prätherapeutisch liegen bei vielen Patienten, genauer bei 12%, die B-Lymphozyten unter der Norm, sie gehen also nicht mit optimalen Ausgangsbedingungen in die multimodale Krebstherapie hinein. Wie aus dem Diagramm der gestapelten Säulen ersichtlich, liegen immerhin 88% der Patienten zu Therapiebeginn mit ihren Werten für CD19+-Zellen im Normbereich, nach der Radiochemotherapie sind es nur noch 24%. Ein enorm großer Anteil, nämlich 76% fallen unter den Normbereich. Auch diese Veränderung ist, nach Berechnung des pWertes durch den Fisher Exakt Test, hoch signifikant (p<0,001). Bei Betrachtung des Ausgangswertes und die diesbezüglichen Veränderungen nach Therapie wird das bereits Beschriebene noch einmal verdeutlicht: 88% der B-Lymphozyten fallen signifikant, d.h. über 20% vom Ausganswert aus, ab, kein Wert fällt minimal ab (also unter 20%) und 12% steigen mit ihren Werten an. Diese Werte liegen aber trotzdem noch immer unter der Norm oder in der Norm, da es keinen Patienten gibt, der Werte über dem Normbereich hat. Die aufgeführten Ergebnisse veranschaulichen eindrücklich, dass die B-Lymphozyten, die Zellpopulation ist, welche bei der Durchführung unserer Studie signifikant am stärksten unter der neoadjuvanten Therapie leidet. 48 CD19+-(B)-Lymphozyten Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der CD19+-B-Lymphozyten vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p < 0,001 x109 /l 49 B-Lymphozyten vor/nach neoadjuvanter Therapie mit Bezug zum Normbereich *p-Wert : <0,001 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm in der Norm unter d.Norm ̽ 1.Messung 0 88% 12% 2.Messung 0 24% 76% B-Lymphozyten nach der Therapie mit Bezug zum Ausgangswert CD19 88% 12% 0% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes 50 Anstieg 3.9.NK-Zellen (CD16+56+-Zellen) Ähnlich den B-Lymphozyten sinken auch die NK-Zellen nach neoadjuvanter Radiochemotherapie sehr stark mit ihren Werten im peripheren Blut ab. Dies wird durch den mit Hilfe des t-Tests für verbundene Stichproben errechneten p-Wert=0,001 verdeutlicht, welcher angibt, dass dieses Ergebnis signifikant ist. Bei Betrachtung der Mittelwerte, wie auch der Minimum- und Maximumwerte beider Gruppen, kann man grob festhalten, dass alle Werte in der zweiten Gruppe um ca. die Hälfte abnehmen. Zu Therapiebeginn liegt der Mittelwert bei 0,26 x 109/l, nach neoadjuvanter Therapie nur noch bei 0,13 x 109/l. Beide ermittelten Werte liegen im Normbereich. Die kleinsten Werte für beide Gruppen liegen unter der Norm mit 0,08 und 0,04 x 109/l, während die höchsten Werte mit 0,84 vor und 0,45 x 109/l nach der Therapie beide im Normbereich liegen. 92% der Patienten zeigen vor der Therapie Werte im Normbereich (0,1-0,91 x 109/l), nach den neoadjuvanten Therapiemaßnahmen sind es nur noch 60%, die restlichen 40% liegen unter der Norm. Bei der ersten Messung liegen lediglich 8% unter der Norm. Diese Veränderung der Werte unter dem Normbereich nach den Therapiemaßnahmen ist ebenfalls statistisch signifikant, da der durch den Fisher Exakt Test berechneten p-Wert 0,008 beträgt. Die Anzahl derer, die Werte unter der Norm aufweisen, verfünffacht sich. Diese Sachverhalte können der beigefügten Darstellung der gestapelten Säulen entnommen werden. Eindrücklich zeigt die dritte Abbildung, dass 72% der Werte für NK-Zellen signifikant, also 20% vom Ausgangswert aus, abfallen. Die Tendenz ist ähnlich den Veränderungen der BLymphozyten. Auch hier steigen 16% mit den Werten an, diese liegen aber nach wie vor weiter in der Norm. Über der Norm liegen keine Werte. Zusammenfassend lässt sich bei den NK-Zellen fest halten, dass auch diese Zellpopulation sehr stark und statistisch signifikant nach neoadjuvanter Radiochemotherapie supprimiert ist. 51 CD16/CD56+-Zellen Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der CD16+CD56+-Zellen vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p = 0,001 x109 /l 52 NK-Zellen vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie mit Bezug zum Normbereich 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm in der Norm unter d.Norm ̽ p-Wert : 0,008 1.Messung 0% 92% 8% 2.Messung 0% 60% 40% NK-Zellen nach der Therapie mit Bezug zum Ausgangswert CD16+56 72% 16% 12% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes 53 Anstieg 3.10.IL-2+-Zellen Bei Betrachtung der Ergebnisse der Veränderungen von IL-2+-Zellen zeigt sich ein heterogenes Bild. Der Mittelwertvergleich (0,5 zu 0,3 x 109/l) gibt einen Hinweis, dass die Werte insgesamt nach neoadjuvanter Therapie sinken. Auch bei Betrachtung des Box-Plot zeigt sich eine minimale Verlagerung der Box in den Bereich niedrigerer Werte. Der Minimalwert vor Therapiebeginn liegt mit 0,07 x 109/l tiefer als der niedrigste Wert mit 0,11 x 109/l nach Radiochemotherapie; untereinander variieren die Werte nicht stark, beide Il-2+-Zell-Werte liegen außerdem unter dem Normbereich. Was die Maximalwerte betrifft, so ist zu beobachten, dass der Wert der ersten Gruppe mit 1,38 x 109/l über dem in der zweiten Gruppe gemessenen Wert von 1,06 x 109/l, wie auch über der Norm liegt. Allerdings kann, bei Betrachtung des dazu gehörigen BoxPlot-Diagrammes, dieser Maximalwert als Ausreißer interpretiert werden. Das Diagramm der gestapelten Säulen gibt wieder, dass sich die Mehrheit der Patienten vor Therapiebeginn mit ihren Werten für IL-2+-Zellen im Normbereich (0,13-1,15 x 109/l) befinden, nämlich über 80%. Nach der Therapie steigt dieser Prozentsatz auf 94% an, während der Anteil derer, die mit ihren Werten unter dem Normbereich liegen, gleich bei 6% bleibt, so dass davon auszugehen ist, dass die vorerst über der Norm gelegenen Werte in den Normbereich fallen. Die vor Therapiebeginn über der Norm liegenden 12%, verlagern sich in den Normbereich. Wenn man nun die Veränderungen bezogen auf die Ausgangswerte betrachtet, so wird deutlich, dass 70% aller Werte für IL-2+Zellen signifikant, nämlich über 20% vom Ausgangswert aus, sinken, obwohl insgesamt über 90% im Normbereich liegen. Knapp ¼ der Werte steigen nach neoadjuvanter Radiochemotherapie sogar an, ohne aber über den Normbereich hinaus zu gehen. Insgesamt lässt sich fest halten, dass die IL-2+-Zellen nach erfolgter Radiochemotherapie mit ihren Werten abfallen. Ein nicht unerheblicher Anteil steigt nach den Therapiemaßnahmen an. Die meisten Patienten haben sowohl vor als auch nach Radiochemotherapie Werte im Normbereich. 54 IL-2+-Zellen Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der IL-2+-Zellen vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p = 0,046 x109 /l IL-2+-Zellen vor/nach der neoadjuvanten Therapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert : nicht signifikant 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm in der Norm unter d.Norm ̽ 1.Messung 12% 82% 6% 55 2.Messung 0% 94% 6% IL-2+-Zellen nach der Therapie mit Bezug zum Ausgangswert IL-2+ 70,60% 23,50% 5,90% Abfall <20% des Ausgangswertes Abfall >20% des Ausgangswertes Anstieg 3.11.HLA-DR+-Zellen Aus allen drei Diagrammen wird deutlich, dass die HLA-DR+-Zellen die einzigen Zellen sind, welche nach neoadjuvanter Radiochemotherapie mit ihren Werten ansteigen. Ein signifikanter Abfall der Werte kann nicht verzeichnet werden. Die Mittelwerte, wie auch die Maximalwerte von HLA-DR+-Zellen im peripheren Blut der zu untersuchenden zwei Gruppen, unterscheiden sich nicht voneinander. Beide Werte für das jeweilige Minimum, vor bzw. nach Therapie, der HLA-DR+-Zellen unterscheiden sich wenig voneinander (0,02 versus 0,07 x 109/l), zu beachten ist allerdings der Anstieg des Wertes in der Gruppe nach Therapie. Beide Werte liegen unter dem Normbereich (0,08-0,72 x 109/l). Wie schon bei den IL-2+-Zellen beobachtet, ist auch hier bei Betrachtung des Diagrammes der gestapelten Säulen, auffällig, dass der Prozentsatz derer, die im Normbereich liegen, nach neoadjuvanter Therapie weiter ansteigt, nämlich von 72% auf 89%. Somit sinkt der Anteil von Werten, die unter der Norm liegen von anfänglich 28% auf 11%. Über der Norm liegen keine Werte. 56 Zahlenmäßig liegen nach Radiochemotherapie weniger Patienten mit ihren Werten für HLA-DR+-Zellen unter dem Normbereich als vor den Therapiemaßnahmen. Bei Bezugnahme auf den Ausgangswert, wird deutlich, dass die meisten Werte tatsächlich signifikant ansteigen und nicht sinken: wie aus der dritten Abbildung ersichtlich, steigen über 60% der Werte für HLA-DR+-Zellen nach neoadjuvanter Radiochemotherapie an. Somit ist zusammenfassend zu sagen, dass diese Zellpopulation die einzige ist, welche nach den Therapiemaßnahmen mit der Mehrheit ihrer Werte im Blut ansteigt und nicht abfällt. HLA-DR-+-Zellen Boxplot-Darstellung der Absolutwerte der HLA-DR+-Zellen vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie p = 0,370 x109 /l 57 HLA-DR+-Zellen vor/nach neoadjuvanter Radiochemotherapie mit Bezug zum Normbereich p-Wert : nicht signifikant 100% 80% 60% 40% 20% 0% über der Norm in der Norm unter d.Norm ̽ 1.Messung 0% 72% 28% 2.Messung 0% 89% 11% HLA-DR+-Zellen nach der Therapie mit Bezug zum Ausgangswert HLA-DR+ 61% 16,70% Abfall <20% des Ausgangswertes 22,20% Abfall >20% des Ausgangswertes 58 Anstieg 1.12.Postoperative Komplikationen Keine (14) Anastomoseninsuffizienz (4) Pneumonien (2) 10% 20% 70% Das oben abgebildete Kreisdiagramm soll die Anzahl an post-operativen Komplikationen veranschaulichen (in Klammern gesetzte Ziffern geben die absoluten Patientenanzahlen wieder): 20 Patienten wurden nach neoadjuvanter Radiochemotherapie operiert. Von diesen 20 Patienten (= 100%) wiesen insgesamt 6 Patienten (= 30%) postoperative Komplikationen, unterteilt in Pneumonien und Anastomoseninsuffizienzen, auf. Von den 6 Patienten hatten 2 Patienten (= 10%) Pneumonien und 4 Patienten (= 20%) Anastomoseninsuffizienzen. Die Mehrzahl (14) der operierten Patienten hatte keine postoperativen Komplikationen (= 70%). Im Einzelvergleichen fiel auf, dass bei der Mehrzahl der Patienten (80%) mit postoperativen Komplikationen die CD4-+-Zellen unter dem Normbereich lagen. 59 3.13.Zusammenfassung der Ergebnisse: Um den Einfluss der neoadjuvanten Radiochemotherapie auf das zelluläre Immunsystem bei Patienten mit Ösophaguskarzinom beurteilen zu können, bestimmten wir vor und nach der Induktionstherapie folgende Parameter: Leukozyten, CD4+-und CD8+-T-Zellen, B-Lymphozyten, NK-Zellen, CD4/8-Quotienten, IL-2+-und HLADR+-Zellen und Thrombozyten. Nach neoadjuvanter Radiochemotherapie kommt es zu einem signifikanten Abfall bis in den unteren Normbereich der meisten unserer untersuchten Parameter. Auch wenn dies eine signifikante Supprimierung des zellulären Immunsystems darstellt, befindet sich prozentual der Großteil aller Werte noch im Normbereich. Am stärksten wird die Gruppe der Lymphozyten, darunter v.a. die BLymphozyten und die Gruppe der NK-Zellen supprimiert. Dies wird dadurch deutlich, dass der Anteil der unter der Norm liegenden Werte nach den Therapiemaßnahmen bei B-Lymphozyten von 12% auf 76%, und bei den NK-Zellen von 8% auf 40% signifikant ansteigt. T-Lymphozyten insgesamt werden weniger stark supprimiert als die Gruppe der B-Lymphozyten: bei den T-Lymphozyten liegen auch nach neoadjuvanter Radiochemotherapie noch 68% (20% weniger als vor der Therapie) im Normbereich, bei den B-Lymphozyten sind es nur noch 24% (vorher 88%). Bei weiterer Unterteilung der T-Lymphozyten in CD-4+- und CD8-Zellen fällt auf, dass CD4-+Zellen stärker supprimiert werden, als CD8+-Zellen. Nach neoadjuvanter Radiochemotherapie liegen 32% der Patienten mit ihren Werten für CD4+-Zellen unter dem Normbereich, während es vor der Therapie nur 4% waren. Die Anzahl der unter dem Normbereich liegender Werte für CD8+-Zellen steigt nach den Therapiemaßnahmen nur von 20% auf 36% an (nicht signifikant). T-Helferzellen werden durch die neoadjuvante Radiochemotherapie folglich mehr in Mitleidenschaft gezogen als zytotoxische T-Zellen. Der CD4/CD8Quotient verhält sich nach den Therapiemaßnahmen inhomogen: Bei 40% der Patienten sinken die Werte für den Quotienten signifikant ab, bei 36% steigen die Werte nach der Therapie an. Der über der Norm liegende Anteil sinkt von 32% auf 24%, im Normbereich steigt er von 68% auf 72%. IL-2+- und HLA-DR+-Zellen steigen als einzige Parameter mit ihren Werten nach der Induktionstherapie an. So steigt bei den HLA-DR+-Zellen nach den Therapiemaßnahmen der Anteil der im Normbereich liegenden Werte von 72% auf 89% an, während der unter der Norm gelegene Prozentsatz von 28% auf 11% sinkt. Die klinische Bedeutung der Supprimierung des zellulären Immunsystems wurde an Hand der Häufigkeit von postoperativen 60 Pneumonien und Anastomoseninsuffizienzen untersucht. Diese postoperativen Komplikationen zeigen sich bei einem kleinen Teil unserer untersuchten Patienten. 10% der operierten Patienten weisen Pneumonien, 20% Anastomoseninsuffizienzen auf. Bei 80% dieser Patienten liegt nach applizierter Radiochemotherapie der Wert für CD4+Zellen unter der Norm. Folgende Hauptaussagen sind zu treffen: Die neoadjuvante Radiochemotherapie supprimiert bei Patienten mit Ösophaguskarzinom das zelluläre Immunsystem. Trotz des nachweisbaren Abfalls bewegt dieser sich bei den meisten Patienten noch im Normbereich so dass über dessen Relevanz spekuliert werden kann. Klinische Folgen der Immunsupprimierung zeigen sich nur bei wenigen Patienten. Bei dem Großteil der Patienten mit postoperativen Komplikationen liegt der Wert für CD4+-T-Zellen unter dem Normbereich. 61 4.Diskussion: In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der neoadjuvanten Radiochemotherapie auf das zelluläre Immunsystem bei Patienten mit Ösophaguskarzinom untersucht. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass es unter einer neoadjuvanten Radiochemotherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom zu einem signifikanten Konzentrationsabfall der einzelnen Lymphozytensubpopulationen, sowie Thrombozyten und Leukozyten im Blut kam. Dennoch lag die Mehrzahl aller Patienten nach neoadjuvanter Therapie mit ihren Werten für die untersuchten Parameter im Normbereich. Die klinische Bedeutung der Immunsuppression stufen wir als gering ein, da nur wenige der untersuchten Patienten postoperative Komplikationen aufwiesen. Wie unsere Ergebnisse gezeigt haben, könnte der Grund für das Auftreten postoperativer Komplikationen der signifikante Konzentrationsabfall der CD-4+-T-Zellwerte unter den Normbereich sein. 4.1 Immunsystem und Krebs Welche Bedeutung ein geschwächtes Immunsystem für den Organismus darstellt, zeigte eine Studie von Rothmaier im Jahr 2007: 905 Patienten, die eine Lungen-, Herz-oder Herzlungentransplantation erhielten, zeigten nach verabreichter immunsupprimierender Therapie deutlich mehr Kopf-Hals-Karzinome, Lungenkrebs, Leukämien und Lymphome. In der Übersichtsarbeit von Loose und Van de Wiele von 2009 sind unter anderem die wichtigsten Mechanismen von Veränderungen des Immunsystems durch eine Krebserkrankung aufgeführt worden: erstens können maligne Zellen immunsupprimierende Zytokine und Prostaglandine produzieren, welche wiederum dazu führen, dass die humorale Immunantwort gegen die Tumorzellen abnimmt, die NK-Zell- und T-Helfer-bzw. -zytotoxische Zellproliferation und Zellaktivität sinkt; unseren Ergebnissen zu Folge, liegen die meisten Patienten vor der neoadjuvanten Radiochemotherapie mit ihren Werten für NK-Zellen-, T-Helfer-Zellen und zytotoxischen T-Zellen im Normbereich, allerdings kommt es nach applizierter Therapie zu einem signifikanten Abfall der Werte. Auch sinkt bei uns die Zellaktivität nicht, sondern steigt die Konzentration von HLA-DR+- und IL-2+-Zellen an. An Hand 62 unserer Ergebnisse zeigt sich also keine Immunsuppression durch das alleinige Vorliegen einer Krebserkrankung. Zweitens wird in der o.g. Arbeit erklärt, dass maligne Zellen selbst eine Immunresistenz entwickeln, indem sie beispielsweise den MHCKomplex und damit die Antigenität verändern und sich dadurch vor der Erkennung durch Immunzellen schützen; letztlich sollen die Tumorzellen aktiv in der Lage sein, TZellen über den induzierten Zelltod zu eliminieren. Auch in unserer Studie sinken die TZellen gesamt stark ab, ob dies allein auf die neoadjuvante Radiochemotherapie oder auf den o.g. induzierten Zelltod durch Tumorzellen zurück zu führen ist, bleibt offen. 4.2 Das Immunsystem unter neoadjuvanter Radiochemotherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom Die Hauptgründe für die zunehmende Anwendung neoadjuvanter Radiochemotherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom sollen kurz an Hand von Studienergebnissen aufgeführt werden. In vielen Studien wurde deutlich, dass die neoadjuvante Radiochemotherapie vor einer Operation die Maßnahme ist, welche zu einer Tumorverkleinerung, minimierten Mikrometastasierung, verbessertem Langzeitüberleben, sowie erhöhter 5-JÜR, Rezidiv-freiem Überleben und Downstaging führt [Refaely Y., 2002, Sherman, 2002]. In diesem Jahr erschien die überarbeitete Metaanalyse aus dem Jahr 2011 von Sjoquist und Kollegen, in welcher noch einmal deutlich veranschaulicht wurde, dass mit Anwendung von neoadjuvanter Radiochemotherapie/Chemotherapie bei fortgeschrittenem Ösophaguskarzinom signifikante Überlebensvorteile verbunden sind, im Vergleich zu alleiniger Operation. Ein klarer Vorteil der Radiochemotherapie gegenüber alleiniger Chemotherapie konnte allerdings nicht heraus gearbeitet werden, weshalb von den Autoren diesbezüglich die Durchführung weiterer Studien gewünscht wird [Sjoquist, 2011]. Wir konnten zeigen, dass die Gesamtanzahl von Lymphozyten und deren Subgruppen, wie auch derer von Leukozyten und Thrombozyten nach Radiochemotherapie signifikant absinken, genauso wie es in der Studie von Westerterp und Kollegen bereits fest gestellt wurde [Westerterp, 2008]. Auch eine bereits 1999 durchgeführte Studie aus dem HNO-Bereich, bei welcher der Effekt von Radiochemotherapie auf das zelluläre Immunsystem bei Pat. mit fortgeschrittenem Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals63 Bereichs untersucht wurde, stellte eine deutliche Veränderung des Immunsystems nach erfolgter Therapie fest. Die Therapie verursachte einen hochsignifikanten, aber reversiblen Konzentrationsabfall sämtlicher Lymphozytensubpopulationen im Blut. Die Beobachtungen ähneln in den meisten Fällen unseren Ergebnissen: alle untersuchten Zellreihen, darunter Leukozyten, Lymphozyten, CD3-,CD4-,CD8-,CD19-,NK-Zellen sanken nach erfolgter Therapie signifikant ab, jedoch konnte ein Anstieg von Zytokinen und IL-2+,sowie HLA-DR+-Zellen verzeichnet werden, was unseren Ergebnissen ebenfalls entspricht. Die Autoren dieser Studie deuten dies als kompensatorische Reaktion des Immunsystems. Zusätzlich zu unseren Ergebnissen, konnte heraus gefunden werden, dass auch die Lymphozytenfunktion passager gestört war [Nollert 1999]. Die Zunahme an HLA-DR+-Zellen nach neoadjuvanter Radiochemotherapie wurde ebenfalls in der Studie von Heidecke aus dem Jahr 2002 fest gestellt, allerdings wurde eine Zunahme der HLA-DR+-T-Lymphozyten schon vor applizierter Radiochemotherapie gemessen [Heidecke, 2002]. Wie auch in unseren Ergebnissen verdeutlicht, zeigt sich, dass einige Zellreihen durchaus supprimiert werden, jedoch gerade diese Zellgruppen, welche die Antigenpräsentation und die anschließende Signalkaskade zur adäquaten Immunantwort koordinieren (HLA-DR+ und IL-2+-Zellen), ansteigen, so dass nicht global von einer kompletten Immunschwäche - induziert durch Radiochemotherapie – ausgegangen werden kann, sondern vielmehr als Gegenregulation zu werten sein könnte. Ebenso wurde in unserer Studie deutlich, dass v.a. die B-Lymphozyten und NK-Zellen unter der Radiochemotherapie leiden, während die CD8+-Zellen (T-Suppressorzellen) weniger stark durch die Therapiemaßnahmen supprimiert werden. So wurde in der o.g. Studie von Westerterp beschrieben, dass sich die CD8-+Zellen auch nach der Therapie besonders schnell erholen, v.a. im Gegensatz zu den CD4+-Zellen, B-Zellen und NKZellen, welche post-operativ stark vermindert sind und sich nur allmählich wieder erholen. Dass dieser Sachverhalt klinisch relevant sein könnte, wird unter anderem daran deutlich, dass die Mehrzahl der von uns untersuchten Patienten mit postoperativen Komplikationen Werte für CD4-+Zellen unter dem Normbereich aufweist. Obwohl in den meisten Fällen, die Subpopulationen der Lymphozyten, sowie die meisten anderen untersuchten Zellgruppen stark abfallen (über 20% vom Ausgangswert aus), bewegen sie sich doch zum größten Teil immer noch im allgemein gültigen 64 Normbereich. An dieser Stelle soll auf eine ähnliche Studie hingewiesen werden, in der das zelluläre Immunsystem von Mammakarzinom-Patienten nach adjuvanter Radiochemotherapie untersucht wurde und ebenfalls eine starke Suppression der untersuchten Zellpopulationen beobachtet werden konnte. Die untersuchten Zellreihen lagen jedoch auch weiterhin größtenteils im Normbereich [Mellios, 2010]. Die Autorin dieser Studie schloss daraus, dass eine immunstimulierende bzw. modulierende Therapie nicht indiziert und ggf. sogar kontraindiziert scheint. Eine unserem Studiendesign ähnliche Studie von Westerterp aus dem Jahr 2008, die den zellulären Immunstatus von Pat. mit Ösophaguskarzinom nach neoadjuvanter Radiochemotherapie mit dem von Pat. vergleicht, die ausschließlich eine kurative Ösophagektomie erhielten, konnte zeigen, dass das Immunsystem von Patienten, welche eine Radiochemotherapie erhielten stärker negativ beeinflusst wurde, als durch die alleinige operative Therapie. Es gibt allerdings einen entscheidenden Unterschied zu unserem Studiendesign: die regelmäßige Applikation von Hyperthermie, welche ebenfalls einen supprimierenden Effekt auf das Immunsystem ausüben könnte. Außerdem wurde anstelle von 5-FU und Cisplatin, Paclitaxel und Carboplatin als Chemotherapie appliziert. Wie auch unsere Ergebnisse zeigen, wurde deutlich, dass v.a. die Granulozyten und Lymphozytensubpopulationen angegriffen werden. Wie auch die Studie von Heidecke zeigt, wird die Zytokinproduktion von der Radiochemotherapie kaum beeinträchtigt, obwohl die Zellzahl der CD4+-T-Zellen stark sinkt; dies blieb in unserer Analyse unberücksichtigt, da wir die Zytokinproduktion der T-Zellen nicht gemessen haben. Da in der o.g. Studie noch eine weitere Blutentnahme kurz vor der OP durchgeführt wurde, konnte der Verlauf der Zellerholung beobachtet werden. Dabei fällt auf, dass die zytotoxischen T-Zellen sich sogar noch vor der OP wieder erholen. An Hand unserer Ergebnisse wurde das inhomogene Verhalten des CD4+/CD8+Quotienten deutlich: bei manchen Pat. steigt der Wert dieses Verhältnisses, bei vielen sinkt er im Vergleich zum Ausgangswert vor neoadjuvanter Radiochemotherapie ab. Dieses Ergebnis bzgl. des CD4/8-Quotienten reflektiert recht anschaulich die derzeitige Datenlage anderer Studien, welche auch den zell. Immunstatus bei Krebspatienten untersuchten und es beim Vergleich der Werte zu keinem einheitlichen Ergebnis kam. Tsutsui und Mitarbeiter haben 1 Woche nach Bestrahlung von Ösophaguskarzinompatienten einen Abfall des CD4/CD8-Quotienten beschrieben, und 65 es darauf zurück geführt, dass die CD4-Zellen sich im peripheren Blut langsamer erholen, als die CD8-Zellen. An Hand einer ähnlich strukturierten Arbeit von Mafune aus dem Jahr 2000, welche ebenfalls den zellulären Immunstatus von Ösophaguskarzinompatienten nach multimodaler Therapie untersuchte, wurde ein Anstieg des CD4/CD8-Quotienten nach Ösophagektomie, noch vor Applikation einer Radio- Chemotherapie, beobachtet. Der Grund dafür wird in einem postoperativen Anstieg der CD4+-Zellen und postoperativen Absinken der CD8+-Zellen gesehen. Auf Grund dieser uneinheitlichen Ergebnisse bzgl. des CD4/8-Quotienten kann dieser nur unzureichend den zellulären Immunstatus von Karzinompatienten reflektieren. Außerdem wurde in der o.g. Studie deutlich, dass, neben der NK-Aktivität v.a. CD8+,CD16+-,CD57+-Lymphozyten postoperativ signifikant sinken. CD4+-Lymphozyten steigen postoperativ an. Ob der immunsupprimierende Effekt eher auf die Operation (o.g. Studie) oder aber auf die neoadjuvante Radiochemotherapie (vorliegende Arbeit) zurückzuführen ist, bleibt bis jetzt unklar. Der zelluläre Immunstatus wurde ebenfalls bestimmt, allerdings wurden nicht 5-FU/Cisplatin als Chemotherapeutika verwendet, sondern Mitomycin, 5-FU, Tegafur und ein Immuntherapeutikum OK-432, so dass ein direkter Verglich der Ergebnisse ungültig wäre. Auffällig erscheint, bei Betrachtung der Ergebnisse von Mafune, dass im Gegensatz zu unseren Werten, nach Applikation der adjuvanten Radiochemotherapie kein weiterer Abfall der untersuchten Zellreihen zu beobachten ist, trotz der Applikation der Chemotherapeutika und der Radiatio steigen sogar vereinzelt die Werte wieder an. Das würde bedeuten, dass es nicht entscheidend für das zelluläre Immunsystem ist, welche Art der Therapie vorrangig appliziert wird, sondern dass Ösophaguskarzinomatienten durch Ösophagektomie, sowie neoadjuvante Radiochemotherapie immunsupprimiert werden und sich anschließend wieder erholen, gleich welche Therapieform angewandt wurde. Zu berücksichtigen ist allerdings die wichtige Tatsache, dass den Pat. ein Immunstimulanz (OK-432) intradermal appliziert wurde, was den weiteren Verlauf des zell. Immunstatus eventuell verändert. Die Behauptung, die chirurgische Therapie bei Ösophauguskarzinompatienten sei immunsupprimierender als eine neoadjuvante RTX, wurde schon 1992 von Tsutsui widerlegt, in dessen Studie das zelluläre Immunsystem von Ösophaguskarzinomatienten vor und nach Radiochemotherapie, sowie vor und nach Ösophagektomie untersucht und verglichen wurde. Sie stellten fest, dass die operative Therapie bei schon immunsupprimierten Ösophaguskarzinomatienten v.a. die Gesamtanzahl an Lymphozyten signifikant erniedrigt, hingegen die präoperative Radiochemotherapie viel 66 ausgeprägter die Immunsituation beim Pat. schwächt. Kein untersuchter, immunologischer Parameter der Pat. ist postoperativ abgesunken, bis auf den bereits durch die neoadjuvante Radiochemotherapie erniedrigten CD4/CD8-Quotienten. Im Gegensatz dazu, wurde nach präoperativer Radiochemotherapie beobachtet, dass sich nicht nur die Anzahl der Gesamtlymphozyten verringert, sondern auch der CD4/CD8-Quotient, die NK-Aktivität, sowie die PHA Antwort. Außerdem konnte diese Studie ermitteln, dass bereits vor jeglicher Therapieform, das zelluläre Immunsystem, insbesondere die NK-Aktivität, die PHA Antwort und der CD4/CD8-Quotient stark supprimiert sind, v.a. in den weiter fortgeschrittenen Tumorstadien III-IV (nach TNM Klassifikation). Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen, steigen nach der neoadjuvanten Radiochemotherapie die Werte für CD8+-Zellen an, CD4-Lymphozyten sinken, so dass der CD4/8-Quotient abnimmt. Es ist also nicht von einer einheitlichen Veränderung der Zellzahl der Lymphozytensubpopulationen auszugehen, was die einheitliche Interpretation der Werte erschwert. In der Studie von Tsutsui aus dem Jahr 1996 wurde davon ausgegangen, dass ein erniedrigter Wert für den CD4/CD8-Quotienten mit einer geringeren Lebenserwartung bei Ösophaguskarzinomatienten in Verbindung zu bringen ist und umgekehrt ein erhöhter Wert für den Quotienten für ein signifikant längeres Gesamtüberleben steht. Außerdem würde die Tiefe bzw. Höhe des Wertes mit dem Tumorstadium korrelieren. Wenn man Ergebnisse von Studien, wie z.B. von Anderson und Mitarbeiter, welche den Immunstatus anderer invasiver Karzinomarten untersuchten, vergleicht, wird deutlich, dass der Grund für die Immunsuppression nicht allein im Vorhandensein einer Krebserkrankung liegen könnte. Die untersuchten Lymphozytensubpopulationen z.B. von Patientinnen mit Uteruskarzinom lagen vor jeglichen Therapiemaßnahmen alle im Normbereich. Demnach könnte man davon ausgehen, dass der Grund für eine Immunsuppression individuell unterschiedlich, von der Therapie, dem Ernährungszustand, sowie von Vorerkrankungen und anderen multifaktoriellen Ereignissen abhängig ist. Dass Bestrahlung alleine eine Verminderung der Lymphozytensubpopulationen hervorrufen kann, zeigt eine Studie aus Mexiko von Verastegui (2003), welche v.a. die CD4 und CD8-Zellen von Pat. untersuchte, die wegen eines Kopf-Hals-Karzinoms bestrahlt werden mussten. Es zeigte sich im Verlauf, dass neben den stark gesunkenen B-Zellen, die T-Lymphozyten auf eine lange Zeit, nämlich über 12 Monate lang, 67 supprimiert wurden, hingegen die B-Lymphozyten sich schnell wieder erholten und die Leukozyten erst gar nicht absanken [Verastegui 2003]. Unsere Ergebnisse zeigen eher eine sehr starke Suppression von Leukozyten und B-Lymphozyten, weshalb man davon ausgehen kann, dass dies v.a. durch die Chemotherapie hervorgerufen wurde. Es konnte fest gestellt werden, dass jüngere Pat. schneller ihren Ausgangspunkt der Immunlage erreichten als ältere Menschen. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war, dass vermehrt lokale Infektionen in Zusammenhang mit der Immunsuppression gebracht werden konnten, während systemische Infektionen an Häufigkeit nicht zunahmen, was unseren Ergebnissen ebenfalls entspricht, da postoperative, systemische Infektionen nur bei 30% insgesamt beobachtet wurden. Allerdings bestehe wegen der lang anhaltenden Supprimierung der T-Zellzahl das Risiko für ein erneutes Tumorrezidiv. Beachtet werden sollte, dass gerade bei Bestrahlung von Karzinomen im Kopf-Hals-Bereich 1/3 der Körper-LK bestrahlt wird, weshalb der starke Einfluss auf die Lymphozyten zu erklären ist. Des Weiteren wird erwähnt, dass auch Unterernährung, Zinkmangel, Leberinsuffizienz und der Tumor selbst einen supprimierenden Effekt auf die Zellimmunität haben. Welchen Einfluss die neoadjuvante Radiochemotherapie auf das Immunsystem und insbesondere die Klinik des Patienten haben könnte, wurde in verschiedener Art und Weise bereits in mehreren Studien untersucht und soll im Folgenden kurz diskutiert werden. Meist ist aufgezeigt worden, dass die neoadjuvante Therapie immunsupprimierend wirkt, teilweise wurde eine erhöhte perioperative Mortalität beschrieben [Imdahl, 2005], jedoch konnte eine schnelle Erholung vieler Immunzellen verzeichnet werden [Westerterp, 2008] und verdeutlicht werden, dass der Abfall einiger Zellpopulationen für den Patienten selbst kaum von klinischer Bedeutung ist, da kaum Infektionen oder Anastomoseninsuffizienzen postoperativ auftreten. Dies entspricht den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, bei welcher auch nur die Minderheit der untersuchten Patienten (30%) Anastomoseninsuffizienzen+Pneumonien postoperativ entwickelten. In einer neu erschienen Studie von Dähn aus dem Jahr 2010 wurde die Rate an ARDS/ALI/Pneumonien/Pneumothoraces bei Ösophaguskarzinompatienten untersucht, welche präoperativ eine Radiochemotherapie mit 5-FU und Cisplatin erhielten, und mit der Rate an o.g. Komplikationen bei Patienten verglichen, welche ausschließlich operativ therapiert wurden. Als Resultat konnte aufgezeigt werden, dass die mit Radiochemotherapie vortherapierten 68 Patienten nicht vermehrt an ALI/ARDS/Pneumonien und Pneumothoraces erkrankten [Dähn 2010]. Trotz alledem sollte, so die Empfehlung der Autoren, das Risiko solcher Komplikationen vor Applikation von multimodalen Therapieansätzen bedacht werden. Es zeigte sich, dass bei pulm. Vorerkrankungen, wie Asthma, COPD, Silikose die Häufigkeit an postoperativen ALI/ARDS ansteigt. Außerdem konnte erstaunlicherweise aufgezeigt werden, dass nicht die applizierte Bestrahlungsmenge entscheidend für die postoperativen Komplikationen ist, sondern ein großes Bestrahlungsfeld. Die von Dähn untersuchten Daten zeigten keine signifikante Immunschwächung nach Bestrahlung auf. Im Gegensatz dazu berichten Heidecke und Mitarbieter in ihrer Studie von 2002, in welcher die T-Zellfunktion von Ösophaguskarzinompatienten mit Plattenepithelkarzinom nach Radiochemotherapie untersucht wurde, von einer deutlich erhöhten Morbidität und Mortalität, sowie Infektionen, Pneumonien und Anstomoseninsuffizienzen nach neoadjuvanter Radiochemotherapie und Operation, [Heidecke, 2002], als bei Pat., die lediglich operiert wurden. Unsere Ergebnisse zeigen einerseits auf, dass das Immunsystem geschwächt wird, so dass sicherlich o.g. Infektionen auftauchen könnten, v.a. bei den Patienten, welche mit ihren Werten nach neoadjuvanter Radiochemotherapie signifikant unter der Norm liegen. So konnte von uns aufgezeigt werden, dass die Mehrheit der Patienten mit postoperativen Komplikationen signifikant mit ihren Werten für CD4+-Zellen unter dem Normbereich liegen. Lymphozyten verteidigen den Körper vor allem vor viralen, Granulozyten vor bakteriellen Infekten. Wie in vielen Studien bereits beschrieben, leiden die meisten Patienten nach Radiochemotherapie nicht unter o.g. Infekten. In einer erst vor Kurzem erschienenen Studie von Aiko und Mitarbeiter wurde untersucht, ob eine immunstimulierende Diät mit Antioxidantien bei Ösophagus-Ca-Patienten, welche eine neoadjuvante Radiochemotherapie erhalten, sinnvoll erscheint. Die Morbidität konnte post-operativ nicht vermindert werden [Aiko, 2012]. Als vielversprechender Ansatz gilt, bei vielen Krebsarten, die Immuntherapie mit spezifischen Antikörpern, wie z.B. mit Trastuzumab bei Her2-neu-positivem Mammakarzinom, oder die intravenöse Applikation von tumorspezifischen T-Zellen, sowohl bei Leukämien als auch bei soliden Tumoren [Finn 2008]. In einer Studie von Yee wurde ermittelt, dass die Infusion von speziell auf Melanom Ag MART-1, Melan69 A, Glykoprotein 100 gerichtete CD-8-T-Zellen bei 8 von 10 Patienten zu Tumor- und Metastasenregress führten. Somit ist Finn zu der These gelangt, möglichst früh Immuntherapie anzuwenden, unabhängig der Bestimmung eines zellulären Immunstatus. Diesem Ansatz können wir nicht zustimmen, da unsere Ergebnisse zeigen, dass erstens die Mehrzahl aller neoadjuvant behandelter Patienten Werte im Normbereich für viele Immunparameter aufweisen und zweitens nur sehr wenig postoperative Komplikationen entstanden. Vielleicht wäre eine Immuntherapie i.S. einer Applikation von bestimmten Immunparametern sinnvoll, wenn man betrachtet, dass die Patienten, welche postoperativ Pneumonien oder Anastomoseninsuffizienzen bekamen, CD4-+-T-Zellen unter dem Normbereich aufwiesen. Genau diese Zellen könnten beispielsweise ersetzt werden. Auch die Kombination aus Krebsimpfung und erneuter Chemotherapie bei Patienten mit Krebsrezidiv sind ermutigend: Finn geht von einer synergistischen Reaktion beider Therapiemaßnahmen aus, die gemeinsam zu einer Elimination regulatorischer T-Zellen führen sollen. Denn schon vor 20 Jahren konnte gezeigt werden, dass CD4-SuppressorT-Zellen in der Maus die Antitumor-Immunität inhibieren und die Elimination dieser Zellen durch Chemotherapie oder Bestrahlung zu einer verbesserten Antitumorantwort führen [North RJ 1986]. 4.3.Diskussion der Fehlermöglichkeiten: Bei Interpretation der vorliegenden Daten sollte beachtet werden, dass die Fallzahl der untersuchten Patienten mit 20 klein ist. Auch wenn sich die meisten Ergebnisse mit denen anderer Studien decken, muß dieser Punkt bei der Interpretation der Ergebnisse bedacht werden. Gerad im Hinblick auf die postoperativen Komplikationen sollte dieser Punkt berücksichtigt werden, da die Werte somit nur bedingt repräsentativ sind. Was ebenfalls wichtig erscheint, ist die Tatsache, dass auch andere Faktoren, außer der Applikation einer neoadjuvanten Radiochemotherapie, immunsupprimierend wirken können. Beispielsweise sollten dabei nicht die Begleiterkrankungen unterschätzt werden: viele der untersuchten Patienten gaben zum Zeitpunkt der ersten Blutentnahme an, alkoholabhängig zu sein/gewesen zu sein, was ebenfalls einen negativen Einfluss auf das Immunsystem hat [Parlesak 2009]. 70 Auch die Psyche könnte eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Immunsupprimierung bei Krebspatienten spielen: nicht nur die Diagnose Krebs, sondern auch die anschließende, langwierige Therapie verändern das Leben des Patienten in allen Aspekten. Der Zusammenhang von psychischem Stress und Immunsupprimierung wurde schon früh in Studien untersucht [Herbert 1993]. Daher sollten die aufgezeigten Ergebnisse nicht nur als therapeutisch induziert bewertet werden. Auch die Ernährung hat einen bedeutenden Einfluss auf den Immunstatus, welcher in der vorliegenden Arbeit ebenfalls unberücksichtigt blieb. Eine unausgewogene Ernährung, insbesondere die mangelnde Zufuhr von Vitaminen und Spurenelementen, sowie fettreiche Nahrung [Bollschweiler 2000], spielen nicht nur bei der Entstehung des Ösophaguskarzinoms eine entscheidende Rolle, sondern führen – neben den Effekten der Radiochemotherapie – zur defizienten Immunlage [Hadden 2003]. Bezüglich des Studiendesigns muß ebenfalls einschränkend bedacht werden, dass nur insgesamt zwei Blutabnahmen stattfanden - vor und nach neoadjuvanter Radiochemotherapie. Zusätzliche Informationen, v.a. über die Erholungszeit der einzelnen Zellpopulationen, erhielte man beispielsweise bei einer dritten/vierten Blutentnahme, jeweils prä- und postoperativ. Somit wäre ein direkter Vergleich des Einflusses der Operation zu dem der Radiochemotherapie möglich. Eine weitere Blutentnahme nach einigen Wochen der Erholung würde so z.B. aufzeigen können, in welchem Maße sich die Zellen stabilisieren. 71 5.Zusammenfassung: In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von neoadjuvanter Radiochemotherapie bei Patienten mit Öspophaguskarzinom im lokal fortgeschrittenen Stadium auf die im peripheren Blut zirkulierenden immunkompetenten Zellen mittels Durchflusszytometrie in Bezug auf Absolut- als auch auf Normwerte untersucht. Dieser Bezug zum Normbereich stellt einen Zugewinn gegenüber den meisten bisherigen Studien dar. Zu beachten ist in der vorliegenden Arbeit die geringe Fallzahl, weshalb die Schlussfolgerungen nicht als allgemein gültig zu bewerten sind. Insgesamt lässt sich ein signifikanter Konzentrationsabfall sämtlicher untersuchten Parameter (Leukozyten, Thrombozyten, T- und B-Lymphozyten, sowie CD4- und CD8+-Zellen, NK-Zellen) nach neoadjuvanter Radiochemotherapie – bestehend aus der Applikation von 5FU/Cisplatin und sequentiellen Bestrahlungseinheiten (insg. 36-40 Gray) – verzeichnen. Es kommt zu einer Schwächung des zellulären Immunsystems. Da allerdings die Mehrzahl der Patienten mit ihren Werten für die meisten von uns untersuchten Parameter weiterhin im zugehörigen Normbereich liegt, ist demzufolge nicht von einer signifikanten Immunsuppression durch die Induktionstherapie auszugehen. Auffällig ist der Anstieg der IL-2+- und HLA-DR+- Zellen nach Therapie. Mit dem Wissen um deren Funktion im Abwehrsystem, sollte dies als eine Art der Immunaktivierung und damit Bekämpfung der Tumorzellen i.S. einer Gegenregulation interpretiert werden. Die klinische Relevanz der Schwächung des zellulären Immunsystems bei Patienten mit Ösophaguskarzinom durch neoadjuvante Radiochemotherapie kann, unseren Ergebnissen zu Folge, als relativ gering eingestuft werden. Nur eine kleine Anzahl von Patienten unseres Untersuchungsgutes entwickelte postoperative Komplikationen. Allerdings konnte bei 80% dieser Patienten ein Abfall von CD4-+-Zellen unter den Normbereich fest gestellt werden. Wir gehen davon aus, dass der signifikante Abfall von CD4+-T-Zellen unter den Normbereich für die Entstehung von postoperativen Komplikationen, wie Pneumonien und Anastomoseninsuffizienzen, von Bedeutung ist. Demzufolge ist bei signifikanter Immunsuppression bei einzelnen Patienten mit klinischen Folgen zu rechnen. Nur bei diesen erscheint deshalb die Bestimmung des zellulären Immunstatus als sinnvoll. Nützlich wäre in diesem Zusammenhang die Durchführung von experimentellen Studien, in denen die Auswirkungen einer Immuntherapie bei Patienten mit Ösophaguskarzinom untersucht würden. 72 6.Literaturverzeichnis: 1. Agarwal A, Rani M, Saha GK, Valarmathi TM, Bahadur S, Mohanti BK, Das SN (2003). Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma. Immunol Invest; 32(1-2):17-30. 2. Aiko S, Kumano I, Yamanaka N, Tsujimoto H, Takahata R, Maehara T (2012). Effects of an immuno-enhanced diet containing antioxidants in esophageal cancer surgery following neoadjuvant therapy. Dis Esophagus; 25(2): 137-45. 3. Albonico HU, Bräker HU, Hüsler J (1998). Febrile infectious childhood diseases in the history of cancer patients and matched controls. Med Hypotheses; 51(4): 315-20. 4. Altorki N, Kent M, Ferrara C, Port J (2002). Three-field lymph node dissection for squamous cell and adenocarcinoma of the esophagus. Ann Surg; 236(2): 177–183 5. 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Metzger R, Bollschweiler E, Worring A, Alakus H, Brabender J, Vallböhmer D, Hölscher AH: Immundefizite nach neoadjuvanter Radiochemotherapie beim Ösophaguscarcinom. Deutscher Chirurgenkongress 2009 2. Herbold T, Worring A, Hölscher AH, Bollschweiler E, Metzger R: Radiochemotherapie-induziertes Immundefizit bei der multimodalen Therapie des Ösophaguskarzinoms. Deutscher Chirurgenkongress 2011 3. Herbold T, Bollschweiler E, Worring A, Alakus H, Schröder W, Brabender J, Vallböhmer D, Hölscher AH, Metzger R: Radiochemotherapie-induziertes Immundefizit bei der multimodalen Therapie des Ösophaguscarcinoms. Chirurgische Forschungstage 2011 4. Herbold T, Worring A, Hölscher AH, Bollschweiler E, Schröder W, Metzger R: Immundefizit nach neoadjuvanter Radiochemotherapie bei Ösophaguskarzinom. Deutscher Chirurgenkongress 2012 5. Herbold T, Bollscheiler E, Worring A, Alakus H, Schröder W, Brabender D, Vallböhmer D, Hölscher AH, Metzger R: Radiochemotherapie-induziertes Immundefizit bei der multimodalen Therapie des Ösophaguscarcinoms. Deutscher Krebskongress 2012 86 87
