6. Diskussion - Ruhr

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6. Diskussion
Nachdem Studien gezeigt hatten, das GM-CSF ein geeignetes Adjuvants für genetische
Impfstoffe ist, um zelluläre und humorale Immunantworten zu induzieren, wurde dies hier
vergleichend für DNA-Impfstoffe und adenovirale Vektoren untersucht. In verschiedenen
Prime/Boost-Immunisierungen
wurden
dabei
Vektoren
eingesetzt,
die
entweder
Fusionsproteine (GM-OVA) oder GM-CSF und das Modellantigen Ovalbumin bicistronisch
exprimierten.
Es konnte gezeigt werden, dass die biologische Aktivität des GM-CSF durch die Anhängung
des Antigens nicht beeinträchtigt wurde, was in früheren Studien bereits gezeigt werden
konnte [136;137]. In aufgereinigter Form behielt es ebenso die Fähigkeit, FDCP-1 Zellen zur
Proliferation anzuregen, wie die Generation von Dendritischen Zellen aus KnochenmarkVorläufern zu bewirken. Nachdem APC mit dem Fusionsprotein inkubiert wurden,
induzierten diese eine verstärkte Proliferation antigenspezifischer CD8+ T-Zellen. Dies zeigt,
dass durch die Fusion eine Antigenpräsentation über MHC I-Moleküle erfolgen kann, die für
ein lösliches rekombinantes Ovalbumin nur nach Einsatz einer 10-fach höheren Konzentration
detektiert
wurde.
Somit
stellt
die
Antigenaufnahme
über
GM-CSF-Rezeptoren
möglicherweise eine alternative Strategie zur zielgerichteten Antigenbeladung von DZ in vivo
dar, wie es für z.B. die C-Typ Lektin Rezeptoren beschrieben ist [107-109;114-119].
Dennoch induzierten die GM-OVA exprimierenden Vektoren, sowohl die Plasmid-DNA als
auch der adenovirale Vektor, weder nach einer einzelnen Injektion noch nach kombinierten
Prime/Boost-Immunisierungen eine stärkerer CTL-Antwort als die OVA-exprimierenden
Vektoren. Unabhängig von der Art des Vektors erhöhte die Expression des Fusionsproteins
das IgG1/IgG2a-Verhältnis im Vergleich zu dem Antigen allein, was ein Indiz für eine
stärkere Induktion der TH2-Helferantwort sein mag [95]. In dem hier eingesetzten OVAspezifischen Tumormodell vermittelten jedoch alle Impfansätze eine verzögerte Progression
des Tumorwachstums. Dies bestätigt Ergebnisse, die in DNA-Immunsierungen mit GM-CSFTAA Fusionsproteinen erzielt wurden [137]. Es konnte jedoch keine Korrelation zwischen
den induzierten Immunantworten und dem reduzierten Tumorwachstum hergeleitet werden.
Dies war aufgrund der sehr unterschiedlichen CTL-Antworten unerwartet. Es wurden auch zu
Zeitpunkten der fortschreitenden Tumorprogression in den imunnisierten Mäusen noch hohe
OVA-spezifische T-Zellantworten detektiert werden. Dies lässt vermuten, dass andere
Mechanismen der Immunantwort für die Kontrolle des Tumorwachstums verantwortlich sind.
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Dennoch erschien eine einzelne DNA-Injektion weniger effektiv zu sein als die einmalige
Injektion adenoviraler Vektoren bzw. Prime/Boost-Immunisierungen.
In den Prime/Boost-Immunisierungen induzierten hingegen die Vektoren, die GM-OVA
exprimieren, geringere CD8+ T-Zellantworten als es für OVA-exprimierende Vektoren zu
beobachten war. Die antigenspezifischen T-Zellen besitzen in beiden Fällen ähnliche
Funktionalitäten hinsichtlich ihrer Zytokinproduktion (IFN-γ/IL-2) und ihrer Expression von
CD107a, einem Marker für Degranulation [168]. Zeitgleich mit der Reduktion der CTL
werden jedoch neutralisierende α-GM-CSF Autoantikörper in den Tieren detektierbar, die die
GM-OVA exprimierenden Vektoren injiziert bekamen Diese können eine mögliche Erklärung
für diese Beobachtung darstellen.
Diese Autoimmunität gegen GM-CSF wurde bereits nach Proteinimmunisierungen mit
rekombinantem GM-CSF oder GM-CSF-Fusionsproteinen sowohl im Mausmodell als auch
im humanen System beobachtet werden [137;174-176]. Da die rekombinanten Proteine
zumeist in E.coli oder Hefen hergestellt wurden, sind Unterschiede in der posttranslationalen
Modifizierung der Proteine (z.B. Glykosylierungen) als mögliche Ursache für das Entstehen
solcher Autoimmunreaktionen postuliert worden [174;176].
Betrachtet man hingegen die Induktion dieser autoreaktiven Antikörper nach genetischen
Immunisierungen mit Antigen-Fusionsproteinen, muss ein alternativer Mechanismus
zugrunde liegen, da die GM-CSF Proteine von der Wirtszelle selbst produziert werden. In
diesem Fall könnten kreuzreaktive T-Helferzellen für die klonale Expansion von GM-CSFspezifischen Plasmazellen verantwortlich sein. So könnten B-Zellen, deren Immunglobuline
spezifisch für körpereigenes GM-CSF sind, das Fusionsprotein aufnehmen und degenerierte
OVA-Peptide auf MHC-II Molekülen präsentieren. Die OVA/MHC-II Komplexe würden nun
von OVA-spezifischen T-Helferzellen erkannt, wodurch die Aktivierung der B-Zelle und
somit die Produktion GM-CSF-spezifischer Antikörper erfolgen kann. Dies stünde im
Einklang mit einer früheren Hypothese zur Entstehung von autoreaktiven Antikörpern [177]
und Beobachtungen aus Experimenten mit anderen zellulären Fusionsproteinen [178;179].
Die Konsequenzen dieser α-GM-CSF Autoantikörper für den Wirt sind nicht vollständig
bekannt. So erfolgte in Mäusen die Rekonstitution weißer Blutzellen nach einer
Knochenmarks-Transplantation in unveränderter Weise trotz vorhandener Autoantikörper.
Ebenso entwickeln diese Tiere eine normale Immunantwort gegen einen Proteinimpfstoff
[180]. Dennoch haben Studien an GM-CSF -/- Knock-out Mäusen gezeigt, dass die Induktion
einer CD8+ T-Zellantwort gegen eine Peptid-basierte Vakzine inhibiert ist. In diesem Modell
wurde auch eine verzögerte Produktion von IgG2a Antikörpern detektiert [138].
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Obwohl diese Beobachtungen mit den OVA-spezifischen Immunantworten der GM-OVA
behandelten Tieren übereinstimmten, konnte keine generelle Beeinträchtigung durch die
Vakzin-induzierten Autoantikörper auf den Verlauf nachfolgender Infektionen bestimmt
werden. Der Infektionsverlauf des hier eingesetzten murinen Retrovirus (FV) war ebenso
unabhängig von der Präsenz der neutralisierenden α-GM-CSF Antikörper wie die induzierte
virus-spezifische, zelluläre Immunantwort. In Krebspatienten konnten bislang ebenfalls keine
pathologischen Veränderungen mit dieser Autoimmunität assoziiert werden [174]. Dennoch
können Langzeitfolgen nicht ausgeschlossen werden, so wird beispielsweise die pulmonale
Alveolarproteinose auf eine Autoimmunität gegen GM-CSF zurückgeführt[181;182].
Da die hier eingesetzten und andere Fusionsproteine zwischen körpereigenen und
Fremdproteinen [178;179] zeigen, dass es möglich ist, die immunologische Toleranz zu
durchbrechen, sollte deren Einsatz in genetischen Impfstoffen kritisch hinsichtlich möglicher
Konsequenzen durch Autoimmunitäten betrachtet werden.
Durch den Einsatz eines bicistronischen Vektors konnte diese Autoimmunität umgangen
werden. Obwohl die GM-CSF-Aktivität von diesem Vektor sogar erhöht ist im Vergleich zur
GM-CSF-Aktivität des Fusionsproteins (~10-fach), konnten keine αGM-CSF Autoantikörper
detektiert werden. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Fusion für den Verlust der
Toleranz verantwortlich ist, und die OVA-spezifischen T-Helferzellen die αGM-CSFProduktion stimulieren. Lima et al. [137] konnten ebenfalls zeigen, dass eine Koexpression
von GM-CSF und TAA nicht zu einer Autoimmunität führt, während die entsprechenden
Fusionsproteine es taten. Somit scheint nicht allein die Überexpression des Zytokins für die
Induktion der Autoantikörper verantwortlich zu sein.
Die
bicistronische
Expression
von
GM-CSF
beeinflusst
im
Gegensatz
zu
den
Fusionsproteinen nicht das Verhältnis der OVA-spezifischen Antikörper. Im Vergleich zu den
OVA-exprimierenden Vektoren sind sowohl die IgG1- als auch IgG2a-Titer kaum verändert.
Aufgrund früherer Studien waren diese Beobachtungen unerwartet. So führt die Koexpression
von GM-CSF und dem Amyloid-beta Protein von intranasal verabreichten adenoviralen
Vektoren zu einer verstärkten humoralen und TH2 Antwort [183]. Des weiteren bewirkte die
Koexpression von GM-CSF in zahlreichen DNA-Immunisierungen einen Anstieg der
antigenspezifischen Antikörperproduktion [40;42;128-130;177].
Diese unterschiedlichen Ergebnisse zeigen, dass die immunmodulatorischen Eigenschaften
von GM-CSF von der Form des Antigens, der Injektionsroute und der Art des verwendeten
Vektors abhängig sein können. Daher sind auch die Ergebnisse hinsichtlich der Aktivierung
von CD8+ T-Zellantworten durch GM-CSF-Koexpression sehr unterschiedlich.
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So zeigen einige Studien zu DNA-Immunisierungen eine erhöhte CTL-Aktivierung [41;184],
während andere kaum einen Einfluss detektieren konnten [127;185].
In dieser Studie induziert die bicistronische Expression von GM-CSF nach dem Prime/Boost
Protokoll eine erhöhte CTL-Antwort im Vergleich zum Antigen allein. Aufgrund der
Beschaffenheit des bicistronischen Promotors liegt die OVA-Expression unterhalb derer, die
von den anderen Vektoren beobachtet werden. Dennoch ist der Anteil der induzierten CTLAntwort mit ca. 25 % OT-I spezifischer CD8+ T-Zellen deutlich höher als für die OVAexprimierenden Vektoren (ca.11 %) und ist in dieser Höhe zuvor noch nicht beschrieben
worden. Die GM-CSF Koexpression führt auch zu einer verstärkten Aktivierung der
polyfunktionalen CD8+ T-Zellen, die neben IFN-γ und dem cytotoxischen Marker CD107a
auch das proliferations-stimulierende Zytokin IL-2 produzieren. Dieser Zellpopulation wird
eine wichtige Bedeutung bei der Ausbildung langlebiger Gedächtnisantworten zugeschrieben.
Die Kontrolle chronischer, viraler Infektionen, wie CMV, EBV oder in HIV LTNP scheint
von diesen ebenfalls abhängig zu sein [45]. Es konnte gezeigt werden, dass es diesbezüglich
von Vorteil ist, die bicistronischen Vektoren sowohl in der initialen DNA-Injektion als auch
in der adenoviralen Boost-Immunisierung einzusetzen. Verwendet man sie nur in einem der
Immunisierungsschritte und ersetzt sie in dem anderen durch OVA-exprimierende Vektoren,
ist die Induktion der polyfunktionalen CD8+ T-Zellen geringer. Diese Beobachtung geht mit
einer erhöhten Aktivierung IFN-γ produzierender CD4+ T-Zellen einher. Nach Injektion der
bicistronischen Vektoren und einer TCR-spezifischen in vitro-Restimulation ist der Anteil der
zytokinproduzierenden CD4+ T-Zellen höher als nach Injektion der OVA-exprimierenden
Vektoren. Dies lässt auf eine verstärkte TH1-Helferantwort schließen, die wiederum die
Entwicklung und Qualität der CTL-Antworten beeinflussen kann, wie es bereits für andere
Immunreaktionen beschrieben ist [186-188].
Somit scheint GM-CSF ein geeignetes Adjuvants für Prime/Boost-Strategien mit PlasmidDNA und adenoviralen Vektoren zu sein, was die Induktion polyfunktionaler T-Zellen
begünstigt. Hingegen führt der Einsatz der Fusionsproteine nicht zu der erwarteten
Immunogenitätssteigerung. Die beobachtete Suppression der CTL-Antwort ist dabei offenbar
eine Konsequenz der biologischen Aktivität des Fusionsproteins, da dieses Phänomen für ein
nicht aktives Fusionsprotein, basierend auf rhesusGM-CSF, nicht zu beobachten ist. Ebenso
induziert die nicht-aktive Variante keine Verschiebung des IgG1/IgG2a-Verhältnisse, obwohl
die beiden Fusionsproteine denselben strukturellen Aufbau besitzen und in vergleichbarer
Stärke exprimiert werden. Demnach resultieren diese Phänomene entweder aus der
induzierten Autoimmunität oder durch die rezeptorvermittelte Antigenaufnahme in vivo
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kommt es zu einer veränderten Antigenpräsentation, die wiederum eine Verschiebung der
induzierten Immunantwort in Richtung TH2 zur Folge hat.
Obwohl die GM-OVA Fusionsproteine in vitro eine erhöhte Aktivierung von OT-Ispezifischen CD8+ T-Zellen induzierten, führte diese Strategie zur zielgerichteten
Antigenaufnahme in vivo zu gegensätzlichen Ergebnissen. Daher wurde ein alternativer
Ansatz zur zielgerichteten Antigenaufnahme im adenoviralen System untersucht. In dieser
Studie wurde ein Einzelkettenantikörper, der gegen den DZ-Rezeptor DEC205 gerichtet ist,
an das Ovalbumin fusioniert. Analog zu den GM-OVA Fusionsproteinen führten diese in
vitro im Vergleich zu einer DZ-unspezifischen Isotypkontrolle des Einzelkettenantikörpers zu
einer gesteigerten Antigenpräsentation durch DZ und einer anschließenden Aktivierung
transgener OT-I spezifischer T-Zellen. Dass Fusionsproteine aus DEC205-spezifischen
Antikörpern und Antigenen zu einer Präsentation auf MHC I Molekülen in vitro und in vivo
führen, wurde bereits für die vollständigen Immunglobuline [114-119], aber auch für
Einzelkettenantikörper gezeigt [120]. Letztere zeigten auch nach Expression von PlasmidDNA eine erhöhte Induktion zellulärer und humoraler Immunantworten im Vergleich zu
unfusionierten Antigenen oder Fusionsproteinen deren Antikörperanteil gegen CD11c, ein
weiteres Oberflächenprotein von Dendritischen Zellen, gerichtet ist [120]. Es bleibt jedoch
festzuhalten, dass in der zitierten Studie keine Aufspaltung in CD4+ oder CD8+-Antworten
erfolgte und nur die Gesamtmenge an IgG-Antikörpern bestimmt wurde.
Im Gegensatz dazu, induzieren in dieser Studie die adenoviralen Vektoren, die die
Fusionsproteine aus der unspezifischen Isotypkontrolle und dem Antigen exprimieren, eine
stärkere CTL-Antwort als es für die DEC-OVA exprimierenden Vektoren zu beobachten war.
Dies zeigt deutlich die Abhängigkeit der Immunantwort von der gewählten Applikationsform
der Vakzine. Als Proteinimpfstoff induziert die Isotypkontrolle sogar in Gegenwart starker
DZ-Aktivatoren (αCD40-Antikörper plus Poly IC) keine detektierbare CTL-Antwort,
während die zielgerichtete Form des Antigens eine starke zelluläre Immunantwort auslöst
[117;118]. Der adenovirale Vektor hingegen ist selbst so immunogen [62;63], dass er
zusammen mit der resultierenden endogenen Antigenexpression eine starke CD8+ TZellantwort auslösen kann [189].
Möglicherweise wird dadurch der eigentlich positive Effekt, den man von der zielgerichteten
Antigenaufnahme aufgrund der Proteinstudien erwartet, abgeschwächt. Dennoch bewirkt die
Fusion an den DEC205-spezifischen Einzelkettenantikörper eine veränderte Immunreaktion
gegen das Antigen.
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Neben der reduzierten CTL-Antwort ist auch die Verteilung der antigenspezifischen
Antikörper zu einem erhöhten IgG1/IgG2a-Verhältnis verschoben, was wiederum auf eine
verstärkte TH2-Antwort schließen lässt. Diese Beobachtungen sind analog zu den Ergebnissen
der genetischen Immunisierungen mit den GM-OVA Fusionsproteinen, die ebenfalls in vitro
eine zielgerichtete Antigenaufnahme vermittelten. Daher tritt möglicherweise in beiden Fällen
eine veränderte Antigenaufnahme der sezernierten Proteine in vivo auf, die zu einer
veränderten T-Zellaktivierung (TH2) führen. Des Weiteren könnte die zielgerichtete
Antigenaufnahmen auch zur Induktion von regulatorischen T-Zellen führen, die somit der
CTL-Antwort entgegen wirken würde [98].
Es müssen auch die Wahl des Vektorsystems und die Applikationsroute berücksichtigt
werden, die sich von den bisherigen Studien unterscheiden. Fehlende Kostimulatoren, wie
αCD40-Antikörper oder TLR-Liganden, haben in Studien mit derartigen Proteinimpfstoffen
gezeigt, dass eine periphere Toleranz gegen das Antigen induziert werden konnte [83]. Daher
sollte untersucht werden, ob die simultane Expression von Immunmodulatoren, sCD40L oder
GM-CSF, einen Einfluss auf die oben beschriebenen Effekte hat.
Keiner dieser Kostimulatoren zeigte einen Einfluss auf die Polarisation der induzierten
Immunantwort in Richtung einer TH2-Helferantwort. In beiden Fällen war eine reduzierte
CTL-Antwort für die zielgerichtete Antigenvariante zu beobachten und die dominante IgG1Antikörperproduktion blieb erhalten.
Die Koexpression des sCD40L zeigte keine Effekte hinsichtlich der Induktion der zellulären
Immunantworten (CD4+ als auch CD8+). Dies wiederum steht im Gegensatz zu
Beobachtungen früherer DNA-Immunisierungen, wo die Koexpression eines löslichen
CD40L-Trimers zu einer verbesserten zellulären als auch humoralen Immunantwort führte
[152]. In dieser Studie war lediglich die humorale Immunantwort geringfügig erhöht, wobei
dies unabhängig von der Wahl des Antigenfusionsproteins war. Diese Unterschiede könnten
wiederum auf die eingesetzten genetischen Vektoren zurückzuführen, die unterschiedlich
hohe Mengen des kostimulatorischen Moleküls in vivo produzieren können. Ein weiterer
Unterschied besteht in der Form des sCD40L. Während der hier eingesetzte lediglich aus
einer Exportsequenz und dem Anteil der extrazellulären Domäne des CD40Liganden (AS113260), enthält das DNA-Konstrukt zusätzlich einen so genannten Leucin-Zipper, der die
Stabilität des Trimers erhöhen soll [152]. Die Stabilität dieser Trimere scheint entscheidend
für die Verstärkung der induzierten Immunantworten zu sein. In diesem Zusammenhang
zeigen auch stabilere Formen des CD40Liganden, darunter Dimere oder Tetramere des
Trimers, eine stärkere Aktivierung als es für einfache Trimere beobachtet wird [157;190].
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Daher sind diese Konstrukte eine mögliche Alternative zu dem hier eingesetzten sCD40L und
sollten in weiteren Studien hinsichtlich ihrer Adjuvantwirkung im adenoviralen System
untersucht werden.
Im Gegensatz zu dem sC40L konnte mit der Koexpression von GM-CSF eine Verstärkung
der Immunantworten gezeigt werden. In dieser Studie zeigte sich allerdings kein qualitativer
Unterschied in der antigenspezifischen CD8+ T-Zellantwort. Dennoch war der Anteil der
polyfunktionalen CD8+ und CD4+ T-Zellen erhöht, wie es auch im ersten Teil der Arbeit zu
beobachten war. Dies galt unabhängig von der Spezifität des Fusionsproteins.
Insgesamt bestätigt diese Arbeit, dass Prime/Boost-Immunisierungen mit Plasmid-DNA und
adenoviralen Vektoren sehr effizient zelluläre und humorale Immunantworten induzieren.
Dies wurde bereits gezeigt für das Mausmodell, nicht-humane Primaten und das humane
System. Eine weitere Verbesserung dieses System durch den Einsatz des genetischen
Adjuvants GM-CSF ist daher eine interessante Beobachtung.
Da gezeigt wurde, dass gerade die polyfunktionalen T-Zellen ein entscheidendes Maß für die
Qualität der Immunantwort bei chronischen Infektionen darstellen [45], ist die Anreicherung
dieser Zellpopulation nach GM-CSF Koexpression von besonderer Bedeutung.
Des Weiteren stellt die verstärkte Aktivierung der CD4+ T-Zellen eine Verbesserung da, die
hinsichtlich einer präventiven Vakzinierung gegen HIV vorteilhaft sein kann. In diesem
Zusammenhang wird es interessant zu sehen sein, ob ebenfalls das Spektrum der Epitope, die
von CD4+ und CD8+ T-Zellen nach Immunisierung erkannt werden, erweitert ist. Aufgrund
der Variabilität des Virus ist dies ebenfalls von großem Interesse [71;191].
Die zielgerichtete Antigenaufnahme, sowohl durch GM-CSF Fusionsproteine als auch über
fusionierte Einzelkettenantikörper, führte nicht zu der erhofften Verstärkung der CTLAntwort, lieferte dennoch eine starke detektierbare zelluläre Immunantwort. Zusätzlich lässt
sich an Hand der Antikörperverteilung eine verstärkte TH2-Helferantwort vermuten. In diesem
Fall gilt es zu untersuchen, ob die Effekte der zielgerichteten Antigenaufnahme bei weniger
immunogenen Vektoren oder geringeren Dosen anders sind und eher den berichteten Studien
entsprechen [114-120].
Insgesamt ist die unterschiedliche Qualität der hier induzierten Immunantworten in
geeigneten Infektionsmodellen zu bestätigen, wobei auch die Anforderungen für verschiedene
Infektionen zu berücksichtigen sind. So könnte die zielgerichtete Antigenaufnahme, wie sie
hier eingesetzt wurde, für Impfstoffe gegen parasitäre Infektionen geeignet sein, deren Schutz
auf einer guten TH2-Antwort oder auf IgG1-Antikörpern basiert [192;193].
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In weiteren Studien sollen nun die Auswirkungen der hier vorgestellten Ansätze zur
Verbesserung der Immunogenität genetischer Impfstoffe in einem SIV-Modell untersucht
werden Dies soll sowohl im Maus- als auch im Primatenmodell getestet werden, um
möglicherweise bessere Korrelationen für den Einsatz bei einer HIV-Vakzinierung zu
erhalten.
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