Modulation von CD4+ T-Zellen durch

Modulation von CD4+ T-Zellen durch
Lebersinusendothelzellen
vorgelegt von
Dipl. Biol.
Christine Rudolph
geb. in Dresden
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technische Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
im Fach Medizinische Biotechnologie
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzende: Prof. Dr. Claudia Fleck
Gutachter:
Prof. Dr. Roland Lauster
Prof. Dr. Alexander Scheffold
Prof. Dr. Jens Kurreck
Datum der wissenschaftlichen Aussprache: 05.12.2014
Berlin 2015
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ..................................................................................................... 7
1.1 Grundzüge des Immunsystems .............................................................. 8
1.2 T-Zellen .................................................................................................. 9
1.2.1 T-Zell-Differenzierung im Thymus ............................................... 9
1.2.2 Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen .................... 10
1.2.3 T-Helfer Zellen .......................................................................... 11
1.2.4 Regulatorische T-Zellen ............................................................ 13
1.2.5 Gewebespezifische Migration von T-Zellen ............................... 15
1.3 Leber als immunologisches Organ ....................................................... 16
1.3.1 Aufbau der Leber ...................................................................... 16
1.3.2 Immunologische Funktionen der Leber ..................................... 18
1.4 Regulation von Immunantworten .......................................................... 19
1.4.1 Suppression durch regulatorische T-Zellen ............................... 20
1.4.2 Das immunsuppressive Zytokin IL-10........................................ 21
1.5 Notch-Signalweg .................................................................................. 23
1.5.1 Notch-Rezeptor und seine Liganden ......................................... 23
1.5.2 Einfluss des Notch-Signalweges auf die T-ZellDifferenzierung.......................................................................... 24
2. Zielsetzung ................................................................................................ 26
3. Material und Methoden ............................................................................. 28
3.1 Versuchstiere ....................................................................................... 29
3.2 Reagenzien und Kits ............................................................................ 29
3.2.1 Reagenzien ............................................................................... 29
3.2.2 Vorgefertigte Systeme (Kits) ..................................................... 32
3.3 Materialien und Geräte ......................................................................... 33
3.3.1 Materialien ................................................................................ 33
3.3.2 Geräte ....................................................................................... 33
3.4 Primer .................................................................................................. 34
3.5 Antikörper ............................................................................................. 35
3.6 Medien und Puffer ................................................................................ 39
3.7 Isolation definierter Zellpopulationen .................................................... 40
3
Inhaltsverzeichnis
3.7.1 Zellzahlbestimmung .................................................................. 40
3.7.2 Prinzip der Isolation von Zellpopulationen durch magnetische
Zellseparation ........................................................................... 41
3.7.3 Isolation von nicht-parenchymatischen Zellen (NPC) der
Leber......................................................................................... 41
3.7.4 Isolation von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten ............. 43
3.7.5 Isolation von Lymphozyten aus der Lamina propria................... 45
3.8 T-Zell-Stimulation und T-Zellkulturen .................................................... 46
3.8.1 T-Zell-Stimulation ...................................................................... 46
3.8.2 In Vitro Suppressionsassay ....................................................... 48
3.9 Restimulation und Fixierung ................................................................. 48
3.10
Durchflusszytometrie................................................................. 49
3.10.1 Prinzip, Messung und Auswertung ............................................ 49
3.10.2 Fluoreszenzmarkierung von Oberflächenmolekülen .................. 49
3.10.3 Intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung........................................ 50
3.10.4 Analyse der Proliferation von T-Zellen....................................... 51
3.11
Reverse Transkriptase-PCR ..................................................... 52
3.11.1 RNA Extraktion ......................................................................... 52
3.11.2 Reverse Transkription ............................................................... 52
3.12
Real-time PCR .......................................................................... 53
3.12.1 Prinzip, Messung und Auswertung ............................................ 53
3.12.2 Durchführung der SYBR Green real-time PCR.......................... 54
3.13
Cytometric Bead Assay ............................................................. 56
3.14
Tierexperimentelle Methoden .................................................... 56
3.14.1 Zelltransfer durch intravenöse Injektion ..................................... 56
3.14.2 In vivo Migration von CD4+ T-Zellen .......................................... 57
3.14.3 Transfercolitis............................................................................ 57
3.14.4 Delayed type hypersensitivity-Model ......................................... 58
3.15
Histologie .................................................................................. 58
3.15.1 Immunfluoreszenz ..................................................................... 59
3.15.2 Immunpathologie ...................................................................... 59
3.16
Statistische Datenanalyse ......................................................... 60
4
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse ................................................................................................. 61
4.1 Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter
homöostatischen Bedingungen ............................................................ 62
4.1.1 LSEC induzieren einen Darm-Homingphänotyp bei CD4+ TZellen ........................................................................................ 62
4.1.2 LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ
und keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen ..................................... 64
4.1.3 TLSEC supprimieren CD8+ T-Zellen in vitro.................................. 65
4.1.4 TLSEC supprimieren eine Colitis in vivo ....................................... 68
4.1.5 TLSEC exprimieren regulatorische Markerproteine ...................... 71
4.2 Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter
entzündlichen Bedingungen ................................................................. 74
4.2.1 LSEC induzieren einen Darmhoming-Phänotyps bei Th1
Zellen ........................................................................................ 74
4.2.2 LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ
und keine Apoptose bei Reaktivierung exogen-aktivierter
Th1 Zellen ................................................................................. 77
4.2.3 LSEC induzieren die Expression des anti-inflammatorischen
IL-10 auf Th1 Zellen .................................................................. 78
4.2.4 Th1LSEC supprimieren eine DTH-Reaktion in vivo ...................... 80
4.2.5 ICOS-L und IL-27 spielen keine Rolle für die IL-10 Induktion
in Th1LSEC .................................................................................. 83
4.2.6 LSEC exprimieren alle vier Notch-Liganden .............................. 84
4.2.7 Die IL-10 Induktion in Th1LSEC ist abhängig vom NotchSignalweg ................................................................................. 86
5. Diskussion ................................................................................................. 93
5.1 Lebersinusendothelzellen induzieren Darmhoming-Phänotyp bei
CD4+ T-Zellen ....................................................................................... 94
5.2 LSEC hemmen die Expression von pro-inflammatorischen
Interferon-γ und induzieren keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen............. 98
5.3 LSEC induzieren regulatorische CD4+ T-Zellen unter
homöostatischen und inflammatorischen Bedingungen ...................... 102
5
Inhaltsverzeichnis
5.3.1 TLSEC supprimieren die Aktivierung von CD8+ T-Zellen und
die Pathogenese einer Colitis .................................................. 102
5.3.2 LSEC induzieren suppressive IL-10+ Th1 Zellen abhängig
vom Notchsignalweg ............................................................... 106
6. Zusammenfassung.................................................................................. 111
7. Summary.................................................................................................. 114
8. Literatur ................................................................................................... 117
9. Anhänge ........................................................................................................ I
9.1 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................... II
9.2 Abbildungsverzeichnis ......................................................................... VII
9.3 Tabellenverzeichnis .............................................................................. IX
9.4 Erklärung ............................................................................................... X
9.5 Danksagung ......................................................................................... XI
6
1.
7
Einleitung
Einleitung
1.1
Grundzüge des Immunsystems
Im Zuge der Evolution haben höhere Wirbeltiere, insbesondere Säugetiere, komplexe
und äußerst effiziente Abwehrmechanismen gegen pathogene Mikroorganismen und
Parasiten entwickelt, die in ihrer Gesamtheit als Immunsystem bezeichnet werden. Die
Aufgaben
des
Immunsystems
bestehen
darin,
intra-
und
extrazelluläre
Krankheitserreger abzuwehren sowie maligne und abgestorbene Zellen zu eliminieren.
Dabei unterscheidet man zwischen der angeborenen und adaptiven Immunität. Beide
Teile des Immunsystems sind nicht strikt voneinander zu trennen, da ihre
Komponenten interagieren müssen, um eine effiziente Immunabwehr zu generieren
(Übersicht in (Medzhitov 2001, Hoebe, Janssen et al. 2004)).
Das angeborene Immunsystem bietet schnellen und unspezifischen Schutz gegen
Pathogene und besteht aus drei Komponenten: mechanische Barrieren (Epithelien und
deren Sekrete), lösliche Komponenten (Akute-Phasen-Proteine, Komplementsystem)
und
zelluläre
Komponenten
(Hämozyten,
Natürliche
Killer-Zellen
(NK-Zellen),
Dendritische Zellen (DC)) (Übersicht in (Janeway and Medzhitov 2002, Levy 2007)).
Die Erkennung und Eliminierung der Pathogene wird durch sogenannte Pattern
Recognition Rezeptoren (PPR) vermittelt und basiert auf dem Vorhandensein hochkonservierter molekularer Strukturen (pathogen associated molecular patterns; PAMP)
in
den
Pathogenen.
Neben
der
Phagozytose
von
Pathogenen
ist
die
Antigenpräsentation gegenüber Zellen des adaptiven Immunsystems eine der
Hauptaufgaben der angeborenen Immunabwehr (Übersicht in (Medzhitov 2001, Brown
2006)).
Das adaptive Immunsystem ist durch eine hohe Antigenspezifität, Rezeptordiversität
und –variabilität charakterisiert. Parallel dazu wird ein immunologisches Gedächtnis
ausgebildet, welches bei erneuter Infektion mit dem gleichen Pathogen eine schnellere
und effektivere Immunabwehr ermöglicht (Mackay 1991). Antigene werden dabei von
antigenpräsentierenden Zellen (APC) an B-Zellen und T-Zellen präsentiert und über
deren Rezeptoren (B-Zellrezeptor, BCR; T-Zellrezeptor, TCR) erkannt. Jede Zelle
besitzt nur eine einzige Spezifität ihres Rezeptors auf ihrer Zelloberfläche. Durch
komplexe
Rekombinationsmechanismen
können
eine
Vielzahl
verschiedener
Rezeptorspezifitäten generiert werden. Nach der Erkennung ihres spezifischen
8
Einleitung
Antigens werden die Zellen aktiviert und durch klonale Selektion expandiert (Übersicht
in (Nemazee 2000)). Je nach Zytokinmileu differenzieren aktivierte T-Zellen zu
Effektorzellen oder Helferzellen. B-Zellen differenzieren nach der Aktivierung über ihren
BCR zu antikörpersekretierenden Plasmazellen. Diese Immunglobuline besitzen
dieselbe Spezifität, wie der oberflächengebundene BCR und zirkulieren im Körper um
dort die entsprechenden zellgebundenen Antigene erneut zu erkennen und für die Lyse
durch z.B. NK-Zellen zu markieren.
1.2
1.2.1
T-Zellen
T-Zell-Differenzierung im Thymus
Die Gesamtheit der reifen, naiven T-Zellen in der Peripherie wird ständig durch die
Auswanderung von Zellen aus dem Thymus erhalten (Übersicht in (Surh and Sprent
2008, Takada and Jameson 2009, Sprent and Surh 2011)). Die hauptsächliche
Ausbildung des T-Zell-Repertoires findet jedoch in der frühen Lebensphase statt und
nimmt mit zunehmendem Alter ab. Im Thymus erfolgt die Selektion der Vorläuferzellen,
die, entstehend aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen, aus dem
Knochenmark einwandern (Akashi, Reya et al. 2000). In den zunächst für die T-Zell
Ko-Rezeptoren CD4- und CD8- (cluster of differentiation, CD) doppelnegativen T-Zellen
erfolgt die Rekombination der TCR-Gene. Ein kleiner Anteil der Zellen rekombiniert
ihre γδ-TCR Gene und entwickelt sich zu CD3+CD4-CD8- γδ-T-Zellen (Übersicht in
(Chien and Konigshofer 2007)), während der Großteil der Zellen eine Rekombination
der αβ-TCR Gene durchläuft und sich zu CD3+CD4+CD8+ αβ-T-Zellen entwickelt. Im
Anschluss durchlaufen die Zellen zwei wichtige Selektionprozesse (Übersicht in (Fink
and Bevan 1995, Kruisbeek and Amsen 1996)). Während der negativen Selektion
werden alle T-Zellen deletiert, die mit hoher Affinität körpereigene Peptide binden, die
über major histocompatibility complex (MHC) Moleküle präsentiert werden. Somit wird
verhindert, dass auto-reaktive T-Zellen den Thymus verlassen. Im zweiten Schritt
erfolgt die Ausbildung von CD4 bzw. CD8 einzelpositiven Zellen durch die Erkennung
von Antigen, das über MHCII bzw. MHCI Moleküle präsentiert wird. Die reifen T-Zellen
wandern im Anschluss in die Peripherie aus und zirkulieren im Körper solange bis sie
9
Einleitung
ihr spezifisches Antigen über MHC Moleküle präsentiert bekommen und dadurch
aktiviert werden.
1.2.2
Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen
Für die Präsentation von Antigenen an T-Zellen ist die Expression von MHC Molekülen
durch Zellen notwendig. Intrazelluläre Antigene werden über MHC I Moleküle an CD8+
T-Zellen präsentiert und extrazelluläre Antigene über MHC II an CD4+ T-Zellen
(Übersicht in (Trombetta and Mellman 2005)). Einige APC sind in der Lage
extrazelluläre Antigene über MHCI Moleküle an CD8+ T-Zellen zu präsentieren. Dieser
Vorgang wird als Kreuzpräsentation bezeichnet und spielt in der Leber eine große
Rolle (Kurts, Heath et al. 1996, den Haan, Lehar et al. 2000, Limmer, Ohl et al. 2005).
Für die Aktivierung der T-Zellen ist zudem die Expression von kostimulatorischen
Molekülen wie CD80 und CD86 durch APC essentiell (Schweitzer, Borriello et al.
1997). Zusätzlich können Adhäsionsmoleküle wie intracellular adhesion molecule
(ICAM)-1, 2 oder vascular cell adhesion molecule (VCAM) kostimulatorische Signale
vermitteln (Van Seventer, Shimizu et al. 1990, Damle and Aruffo 1991). Das Fehlen
solcher Signale bewirkt hingegen Anergie oder eine Deletion der T-Zellen.
MHC I
Moleküle werden von nahezu jeder Zelle des Körpers exprimiert und damit können
diese bei einer Infektion erfolgreich erkannt und lysiert werden. MHCII Moleküle
werden fast ausschließlich von professionellen antigenpräsentierenden Zellen des
hämatopoetischen Systems exprimiert, dazu gehören Makrophagen, DC und B-Zellen.
Beschrieben ist aber auch eine MHCII Expression durch nicht-hämatopoetische Zellen
wie Endothelzellen (Lohse, Knolle et al. 1996).
Die Aktivierung der T-Zellen bewirkt eine Expression des frühen Aktivierungsmarkers
CD69, der hochaffinen Kette des Interleukin (IL)-2 Rezeptors (CD25) und die Sekretion
von IL-2, welches wiederum autokrin auf die T-Zelle wirkt und die weitere Proliferation
und Differenzierung fördert (Smith 1988). Die aktivierten T-Zellen durchlaufen eine
klonale Expansion, was zu einer effektiven spezifischen Abwehrreaktion führt und in
einer Sekretion zahlreicher Zytokine resultiert (Bird, Brown et al. 1998). Neben kurzlebigen Effektor-T-Zellen entstehen auch langlebige Gedächtnis-T-Zellen, die bei
erneutem Antigenkontakt die gleichen Effektorzytokine wie zuvor produzieren und
damit schneller zur Bekämpfung einer erneuten Infektion betragen können.
10
Einleitung
CD8+ T-Zellen entwickeln sich nach der Aktivierung zu zytotoxischen T-Zellen, die
durch die Sekretion von Granzym und Perforin oder durch die Expression von
oberflächengebundenen Fas-L und TRAIL Apoptose in den Zielzellen induzieren
(Übersicht in (Atkinson and Bleackley 1995, Griffiths 1995)). Da die CD8+ T-Zellen
nach der Aktivierung eine Vielzahl an infizierten Zellen lysieren können, ist der Prozess
stark reguliert und bedarf der zusätzlichen Aktivierung durch T-Helfer-Zellen (Th
Zellen).
1.2.3
T-Helfer Zellen
Nach der Aktivierung von CD4+ T-Zellen können je nach Zytokinmileu verschiedene Th
Zellen entstehen, die wiederum selbst verschiedene charakteristische Zytokine
produzieren. Initial wurde ausschließlich zwischen Th1 und Th2 Zellen unterschieden
(Übersicht in (Mosmann and Coffman 1989, Murphy and Reiner 2002)). Mittlerweile
sind weitere eigenständige Th Zell-Populationen beschrieben, die zu einer deutlich
komplexeren Darstellung der Th Zellen führt (Übersicht in (Weaver, Hatton et al. 2007,
Geginat, Paroni et al. 2013))(Abbildung 1). Neuere Studien ermöglichen zudem eine
Unterscheidung der verschiedenen Th Zellpopulationen anhand der Expression
verschiedener oberflächengebundener Chemokinrezeptoren, zusätztlich zu den
sekretierten Zytokinen und Transkriptionsfaktoren.
Th1 Zellen gehören zu den wichtigsten Zellen, die durch die Sekretion von Zytokinen
eine Immunantwort steuern. Die Zytokine Interferon (IFN)γ und Tumor-Nekrose-Faktor
(TNF)α aktivieren eine große Zahl weiterer Zellen, z.B. aktivieren sie Makrophagen, die
intrazelluläre Bakterien und Viren zerstören, und sie fördern die IL-12 Produktion durch
DC (Dalton, Pitts-Meek et al. 1993, Huang, Hendriks et al. 1993). Th1 Zellen entstehen
in der Anwesenheit von IL-12, welches die Aktivierung von signal transducer and
activator of transcription (STAT)4 bewirkt. Daraufhin exprimieren die Zellen den
Transkriptionsfaktor Tbet (Szabo, Kim et al. 2000, Trinchieri, Pflanz et al. 2003). Durch
die Aktivierung der DC wird eine weitere Th1-Antwort potenziert. Tbet selbst bewirkt die
Expression von CXC-Chemokin-Rezeptor (CXCR)3, das den Th1 Zellen ermöglicht in
periphere Gewebe einzuwandern (Rivino, Messi et al. 2004, Lord, Rao et al. 2005).
11
Einleitung
Abbildung 1: Komplexität der Th Zellpopulationen und regulatorischen T-Zellen.
+
Naive CD4 T-Zellen können nach Aktivierung im Kontext verschiedener Zytokine zu
zahlreichen Th Zell-Populationen differenzieren. Die Th Zellen sind durch die Expression von
spezifischen Transkriptionsfaktoren, Chemokinrezeptoren und durch die Sekretion von
Zytokinen gekennzeichnet. Abbildung aus Geginat et al. (Geginat, Paroni et al. 2013).
Während Th1 Zellen notwendig sind, um eine effektive Immunantwort gegen
intrazelluläre Bakterien und Viren zu generieren (Fietta and Delsante 2009), haben Th2
Zellen die Aufgabe eine Infektion durch extrazelluläre Parasiten zu bekämpfen. Th2
Zellen wird zudem eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung von allergischen
Reaktionen, wie Asthma zugeschrieben (Übersicht in (Romagnani 1994)). Die
Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen in der Gegenwart von IL-4 führt zur Entstehung
von Th2 Zellen, die einerseits durch die Expression des Transkriptionsfaktors GATA-3
und durch die Sekretion von IL4, IL-5, IL-13 charakterisiert sind (Zheng and Flavell
1997, Lantelme, Mantovani et al. 2001). Zudem zeichnen sich humane Th2 Zellen
durch eine selektive Expression des Prostaglandin D2 Rezeptors (CRTh2) aus (Messi,
12
Einleitung
Giacchetto et al. 2003, De Fanis, Mori et al. 2007). Th17 Zellen entstehen durch die
Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen in der Anwesenheit von transforming growth
factor (TGF)-β und IL-6 (Veldhoen, Hocking et al. 2006), aber auch IL-1β, IL-21 und IL23 spielen eine Rolle bei der Th17 Zell-Differenzierung (Korn, Bettelli et al. 2007,
Shainheit, Smith et al. 2008). Th17 Zellen exprimieren den Transkriptionsfaktor RORC,
sekretieren IL-17 und sind durch Oberflächenrezeptoren CC-Chemokin-Rezeptor
(CCR)6, sowie teilweise durch CD161 und CCR4 gekennzeichnet (Maggi, Santarlasci
et al. 2010). Zusätzlich zu den Th1, Th2 und Th17 Zellen wurden weitere Th Zellen
identifiziert. Sie sind jedoch weit weniger umfangreich charakterisiert. So wurde im
Zusammenhang mit chronischen Entzündungen die Entstehung von Th1/17 Zellen
beschrieben, die gleichzeitig IFNγ und IL-17 produzieren (Cosmi, Cimaz et al. 2011,
Hirota, Duarte et al. 2011). Des Weiteren wurden Th Zellen untersucht, die selektiv die
Zytokine IL-22 (Th22) bzw. IL-9 (Th9) sekretieren (Veldhoen, Uyttenhove et al. 2008,
Trifari, Kaplan et al. 2009).
1.2.4
Während
Regulatorische T-Zellen
die
bereits
beschriebenen
Th
Zellen
die
Entstehung
einer
Entzündungsreaktion unterstützen, sind regulatorische T-Zellen (Treg) notwendig um
eine Entzündung zu beenden, bzw. deren Induktion zu verhindern. Zum einen können
Treg direkt im Thymus entstehen. Sie werden als Thymus-induzierte Treg (tTreg)
bezeichnet. Zum anderen sind weitere suppressive T-Zellen beschrieben, die erst nach
der Aktivierung in der Peripherie aus naiven CD4+ T-Zellen entstehen, dazu zählen Th3
Zellen, Typ 1 regulatorische (Tr1) Zellen und Peripherie-induzierte T-Zellen (pTreg)
(Übersicht in (Maloy and Powrie 2001, Read and Powrie 2001, Bopp, Jonuleit et al.
2007, Geginat, Paroni et al. 2013))(Abbildung 1).
Naive Treg aus dem Thymus können durch die Expression von CD45RA oder CD31
identifiziert werden, während bei Treg, die bereits Antigenkontakt hatten, nicht mehr
zwischen tTreg und pTreg unterschieden werden kann (Hoffmann, Eder et al. 2006,
Kohler and Thiel 2009, Miyara, Yoshioka et al. 2009). Die Expression des
Transkriptionsfaktors Helios wurde initial als Nachweis für tTreg beschrieben,
mittlerweile wird diese Zuordnung jedoch stark diskutiert (Thornton, Korty et al. 2010,
Himmel, MacDonald et al. 2013). Der aktuell meist verwendete Marker für Treg ist der
13
Einleitung
Transkriptionsfaktor Forkhead box P3 (FoxP3) (Fontenot, Gavin et al. 2003, Hori,
Nomura et al. 2003). Innerhalb des FoxP3 Genlokus existiert eine evolutionär sehr
stark konservierte Region, die Treg-specific demethylated region (TSDR). Die
Demethylierung der TSDR ist essentiell für eine stabile FoxP3 Expression und damit
für die suppressive Funktion der Treg (Baron, Floess et al. 2007, Polansky, Kretschmer
et al. 2008, Toker, Engelbert et al. 2013). Über die zelloberflächengebundenen
Rezeptoren CD25 und CD127 kann eine Anreicherung der Treg z.B. aus dem
peripheren Blut erfolgen (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995, Sakaguchi, Sakaguchi et
al. 2001, Banham 2006). CD25 wird zwar auch von aktivierten Helfer- bzw. Gedächtnis
T-Zellen exprimiert, bei Treg hingegen ist das sonst hoch exprimierte CD127
herunterreguliert.
Tr1 Zellen sind im Gegensatz zu tTreg oder pTreg negativ für FoxP3. Ein Tr1-spezifischer
Transkriptionsfaktor ist bisher noch nicht identifiziert, sie zeichnen sich aber durch die
Sekretion von IL-10 und suppressive Funktion aus (Übersicht in (Battaglia, Gregori et
al. 2006)). Die Transkriptionsfaktoren cMaf (Apetoh, Quintana et al. 2010), ArylHydrocarbon-Rezeptor (AHR) (Gandhi, Kumar et al. 2010) und Blimp1 (Cretney, Xin et
al. 2011, Iwasaki, Fujio et al. 2013, Neumann, Heinrich et al. 2014) wurden im
Zusammenhang mit der Regulation der Il-10 Expression bei T-Zellen beschrieben. Die
Expression der Oberflächenmoleküle CD49b und Lag-3, sowie CD226 wurde auf
humanen und murinen Tr1 Zellen nachgewiesen (Okamura, Fujio et al. 2009, Magnani,
Alberigo et al. 2011, Gagliani, Magnani et al. 2013). Bei der Differenzierung von Tr1
Zellen spielt die Anwesenheit von Il-10 (Groux, O'Garra et al. 1997, Levings, Gregori et
al. 2005) oder IL-27 (Batten, Kljavin et al. 2008, Murugaiyan, Mittal et al. 2009) eine
Rolle.
Eine weitere Gruppe der regulatorischen T-Zellen stellen die Th3 Zellen dar (Wu,
Quintana et al. 2008). Sie produzieren hauptsächlich TGFβ und sind im Darm eine
relevante Quelle von TGFβ. Sie bilden inaktives TGFβ in Form von latency associated
peptide (LAP), welches über glycoprotein A repetitions predominant (GARP) an der
Zelloberfläche gebunden wird und schließlich von DC in aktives TGFβ umgewandelt
werden kann (Travis, Reizis et al. 2007, Tran, Andersson et al. 2009).
14
Einleitung
1.2.5
Gewebespezifische Migration von T-Zellen
Abhängig von ihrem Aktivierungs- und Differenzierungsstatus durchlaufen T-Zellen eine
ständige Rezirkulation vom Blut ins Gewebe und über die Lymphflüssigkeit zurück in
den Blutkreislauf (Übersicht in (Gowans and Knight 1964, Gowans 1966, Sprent
1973)). Naive T-Zellen migrieren präferentiell in sekundäre lymphatische Organe, wo
sie nach antigenbeladenen DC suchen, die sie aktivieren. Anschließend unterstützen
sie B-Zellen dabei Antikörper zu produzieren (Übersicht in (Sallusto, Geginat et al.
2004, Geginat, Paroni et al. 2013)) oder wandern bei einer Entzündung in periphere
Gewebe ein bzw. halten sich permanent im Gewebe auf, um bei einer Reinfektion
sofort eine Immunreaktion zu initiieren (Übersicht in (Sheridan and Lefrancois 2011,
Shin and Iwasaki 2013)). Die Migrationseigenschaften der T-Zellen werden dabei durch
die
Expression
Adhäsionsmoleküle
spezifischer
und
Homingrezeptoren
Chemokinrezeproren
auf
bestimmt,
den
dazu
T-Zellen
zählen
und
die
korrespondierenden Chemokine und Adhäsionsmoleküle auf den Endothel- bzw.
Epithelzellen der Zielgewebe (Übersicht in (Salmi and Jalkanen 1997, Butcher,
Williams et al. 1999))(Dudda, Lembo et al. 2005). Die Induktion von bestimmten
Homingrezeptoren wird dabei von den APC und den Umgebungsbedingungen
reguliert.
Die
Einwanderung
in
sekundäre
lymphatische
Organe
wird
durch
die
Homingrezeptoren CD62L und CCR7 bestimmt. Diese Oberflächenmoleküle werden
hauptsächlich von naiven T-Zellen exprimiert, es ist aber auch eine Expression durch
Subpopulationen von Gedächtnis- und regulatorischen T-Zellen bekannt (Sallusto,
Lenig et al. 1999, Huehn, Siegmund et al. 2004, Ermann, Hoffmann et al. 2005). Die
Hochendothelvenolen der lymphatischen Organe exprimieren die Moleküle peripheral
lymph node addressin (PNAd) und CC-Chemokin-Ligand (CCL)21, die die T-Zellen
über ihre exprimierten Rezeptoren erkennen (Stein, Rot et al. 2000).
Die Aktivierung von T-Zellen durch DC aus der Haut induziert die Expression von
Homingrezeptoren, die eine Einwanderung in Hautgewebe ermöglichen (Dudda,
Lembo et al. 2005, Mora, Cheng et al. 2005). Auf den T-Zellen werden dabei die
Oberflächenmoleküle E-Selektin-Ligand (E-Lig), P-Selektin-Ligand (P-Lig) (Picker,
Kishimoto et al. 1991, Tietz, Allemand et al. 1998), CCR4 bzw. CCR10 (Campbell,
15
Einleitung
Haraldsen et al. 1999, Morales, Homey et al. 1999, Reiss, Proudfoot et al. 2001)
hochreguliert. In den postkapillären Venolen der Haut sind bei Entzündung die
entsprechenden Rezeptoren bzw. Liganden wie E-Selektin, P-Selektin (Weninger,
Ulfman et al. 2000), CCL17 (Campbell, Haraldsen et al. 1999) und CCL27 (Homey,
Alenius et al. 2002) exprimiert.
Dendritische Zellen aus den mesenterialen Lymphknoten (mLN) und Peyerschen
Plaques (PP) sind wiederum in der Lage, bei der Aktivierung von T-Zellen darmspezifische Homingrezeptoren zu induzieren, die eine entsprechende Migration der TZellen in das Darmgewebe und das darmassoziierte lymphatische Gewebe (GALT)
ermöglichen (Stagg, Kamm et al. 2002, Mora, Bono et al. 2003). Auf den Darm DCaktivierten T-Zellen erfolgt die Hochregulation von α4β7-Intergrin und CCR9 (Hamann,
Andrew et al. 1994, Wagner, Lohler et al. 1996, Zabel, Agace et al. 1999, Papadakis,
Prehn et al. 2000). Die Expression der Oberflächenmoleküle mucosal addressin cell
adhesion molecule-1 (MAdCAM-1) und CCL25 durch die postkapillären Venolen der
Lamina propria und Dünndarmepithelzellen, sowie durch die Hochendothelvenolen der
mLN resultiert in einer Rekrutierung der entsprechenden T-Zellen (Nakache, Berg et
al. 1989, Briskin, Winsor-Hines et al. 1997, Kunkel, Campbell et al. 2000, Papadakis,
Prehn et al. 2000, Wurbel, Philippe et al. 2000). Für die Induktion von α4β7-Intergrin
und CCR9 ist die Anwesenheit von Retinolsäure (retinoic acid; RA) entscheidend
(Iwata, Hirakiyama et al. 2004, Svensson, Johansson-Lindbom et al. 2008). Die
Blockade von α4β7-Intergrin wiederum verhindert ein Einwandern der T-Zellen in den
Darm und somit auch die Entstehung einer Entzündung durch Effektor-T-Zellen
(Hamann, Andrew et al. 1994, Feagan, Greenberg et al. 2005, Sandborn, Colombel et
al. 2005).
1.3
1.3.1
Leber als immunologisches Organ
Aufbau der Leber
Die Leber ist eines der größten Organe des menschlichen Körpers und prozessiert
sowohl das nährstoffreiche Blut vom Verdauungstrakt kommend, als auch das arterielle
Blut, welches die Leber über die Leberarterie erreicht. Die Leber ist aus einer Vielzahl
16
Einleitung
von Lobuli aufgebaut. Diese Untereinheit ist hexagonal strukturiert und in den Ecken
befinden sich die sogenannten Portalfelder, in denen jeweils ein Gefäß der
Leberarterie, Pfortader und Gallengang mündet (Abbildung 2 A).
Abbildung 2: Schematischer Aufbau der Leber.
Hexagonale Struktur des Leberlobulus mit der Zentralvene im Zentrum und den Portalfeldern in
den Ecken (A). Arterielles und venöses Blut vereint sich in den Sinusoiden und mündet in der
Zentralvene. Modifiziert nach Cunningham (Cunningham and Van Horn 2003). Längsschnitt
eines Lebersinusoids mit angrenzendem Parenchym und enthaltenen Zellpopulationen (B).
Modifiziert nach Lalor und Adams (Lalor and Adams 2002).
In den Mikrogefäßen, den Sinusoiden, mischt sich arterielles und venöses Blut. Daraus
resuliert
ein
niedriger
Sauerstoffgehalt
und
eine
niedgrige
und
irreguläre
Fließgeschwindigkeit des Blutstroms (Thomson and Knolle 2010, Benseler and Schlitt
2011). Das Blut in den Sinusoiden mündet über die Zentralvene in die Vena cava
inferior und schließlich wieder in den systemischen Kreislauf. Die Leber besteht
hauptsächlich aus plattenförmig angeordneten Hepatozyten, die zusammmen das
Parenchym bilden (Abbildung 2 B). Die Gefäße sind aus Lebersinusendothelzellen
17
Einleitung
(LSEC) aufgebaut und zeichnen sich weiterhin durch eine fehlende Basalmembran aus
(Fraser, Dobbs et al. 1995). Direkt unterhalb der LSEC befinden sich, im Disse´schen
Raum gelegen, die Sternzellen. Über die Fenestrae der LSEC können die Hepatozyten
und die Sternzellen über zelluläre Ausläufer und Moleküle im Austausch mit den Zellen
im Lumen des Gefäßes stehen. Innerhalb der Sinusoide, vor allem im Bereich der
Portalfelder, sind sessile Makrophagen der Leber, die Kupffer Zellen lokalisiert. Weitere
nicht parenchymatische Zellen sind die DC, NK-Zellen und Natürliche Killer-T (NKT)Zellen.
1.3.2
Immunologische Funktionen der Leber
Die Leber besitzt neben ihren metabolischen Aufgaben auch entscheidende
immunologische Funktionen (Übersicht in (Crispe 2009, Benseler and Schlitt 2011,
Protzer, Maini et al. 2012)). Für das angeborene Immunsystem spielt die Erkennung
von PAMP eine entscheidende Rolle. Die Leber ist zahlreichen Stimulanzien, z.B. von
Enterobakterien ausgesetzt, welche über die Pfortader in das Organ gelangen und
über PRR der Leberzellen erkannt werden. Über oberflächen- oder endosomalexprimierte Toll-like Rezeptoren (TLR) können Leberzellen ein breites Spektrum an
bakteriellen und viralen Molekülen erfassen und bakterielle Lipoproteine (TLR 1, 2),
Lipopolysaccharide (LPS; TLR 4), Flagellin (TLR 5), doppelsträngige RNA (TLR 3),
virale einzelsträngige RNA (TLR 7, 8) und bakterielle unmethylierte DNA (TLR 9)
erkennen und dadurch aktiviert werden. LSEC und Kupffer Zellen exprimieren TLR 4
und binden LPS, das in hohen Konzentrationen in der Leber vorliegt, und verhindern
so, dass es in die systemische Zirkulation gelangt (Catala, Anton et al. 1999). Weiterhin
nehmen die Zellen über Scavenger Rezeptoren und Mannose Rezeptoren Toxine und
Abbauprodukte aus dem sinusoidalen Blut auf und bauen diese ab (Übersicht in
(Thomson and Knolle 2010)). Kupffer Zellen produzieren zudem während einer
Entzündung
phagozytieren
Faktoren
des
Komplementsystems,
Mikroorganismen,
apoptotische
Akute-Phase
Zellen
und
Proteine
Zelltrümmer
und
(Naito,
Hasegawa et al. 2004). In der Leber akkumulierten aktivierte T-Zellen und werden
entweder moduliert oder deletiert (Mehal, Juedes et al. 1999, Mehal, Azzaroli et al.
2001, Crispe 2003, Crispe 2009). Unter homöostatischen Bedingungen sind Leber DC
und Kupffer Zellen tolerant und bewirken eine Inhibition der T-Zellaktivierung und der
Bildung pro-inflammatorischer Zytokine (Bissell, Wang et al. 1995, Xia, Guo et al.
18
Einleitung
2008). Die Frequenz von NK-Zellen und NKT-Zellen ist in der Leber im Vergleich zu
anderen Geweben stark erhöht (Norris, Collins et al. 1998, Crispe 2001, Tu,
Bozorgzadeh et al. 2007). NK-Zellen induzieren Apoptose in infizierten Zielzellen über
verschiedene Mechanismen, wie der Fas/Fas-L Weg, TRAIL/TRAIL-R Weg und
Granzym bzw. Perforin (Nakatani, Kaneda et al. 2004, Dunn, Brunetto et al. 2007).
NKT-Zellen ähneln den NK-Zellen, sie exprimieren jedoch zusätzlich einen invarianten
T-Zellrezeptor, der über CD1d präsentierte Glycolipidantigene erkennt. Werden NKTZellen über ihre PAMPs oder TCR aktiviert, so werden sie hoch zytotoxisch und
sekretieren TNFα, IFNγ und IL-4 (Kaneko, Harada et al. 2000, Biburger and Tiegs
2005, Chen, Duan et al. 2012).
Eine weitere wichtige Aufgabe der Leber besteht darin, orale Toleranz gegen
Nahrungsantigene zu induzieren. Wird die venöse Blutzufuhr vom Darm unterbrochen,
resultiert dies in einer Aufhebung der Toleranz (Yang, Liu et al. 1994). Ausführlich
beschrieben ist auch die Vermittlung von peripherer Toleranz, also der Schutz vor
potentiell autoreaktiven T-Zellen. Lebertransplantate werden besser akzeptiert, als
andere Organe und die simultane Transplantation von Leber und einem weiteren
Organ vermindert dessen Risiko einer Abstoßung (Calne, Sells et al. 1969, Kamada,
Davies et al. 1981, Rasmussen, Davies et al. 1995). Als mögliche Mechanismen
werden sowohl die Suppression durch programmed death ligand (PD-L)1 und IL-10,
die Depletion allo-reaktiver T-Zellen, als auch die Präsenz von regulatorischen T-Zellen
in der Leber diskutiert (Li, Carper et al. 2006, Jinushi, Takehara et al. 2007, Tay, Lu et
al. 2013).
1.4
Regulation von Immunantworten
Im Rahmen einer effektiven Immunantwort gegen Pathogene ist es von entscheidender
Bedeutung, dass eine Entzündungsreaktion nach erfolgreicher Bekämpfung des
Pathogens
beendet
wird,
um
Gewebsschädigung
und
die
Entstehung
von
Autoimmunität zu verhindern. Andererseits ist es essentiell, dass die Zellen des
Immunsystems nicht gegen körpereigene und nicht-pathogene Antigene reagieren,
sondern stattdessen Toleranz gegenüber diesen Antigenen entwickeln.
19
Einleitung
1.4.1
Suppression durch regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen haben die Fähigkeit Immunreaktionen zu unterdrücken. So
konnte zum einen gezeigt werden, dass eine Depletion von Treg mit der Entstehung von
Autoimmunerkrankungen einhergeht (Sakaguchi, Sakaguchi et al. 1995, McHugh and
Shevach 2002). Defekte in der FoxP3 Expression von Treg sind im Menschen mit der
Ausbildung des immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, and X-linked
(IPEX) Syndroms verbunden und führen zur Ausbildung zahlreicher Autoimmunerkrankungen (Powell, Buist et al. 1982, Wildin, Ramsdell et al. 2001). Andererseits
wurde vielfach experimentell gezeigt, dass der adoptive Transfer
von Treg
Autoimmunerkrankungen unterdrücken kann. Diese Ansätze wurden bereits in
klinischen Versuchen getestet (Marek-Trzonkowska, Mysliwiec et al. 2014, Martelli, Di
Ianni et al. 2014).
Die Suppression von Treg kann über verschiedene Effektormechanismen vermittelt
werden (Übersicht in (Sakaguchi 2004, Wing and Sakaguchi 2012). Treg exprimieren
cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4), das wichtig ist für deren
regulatorischen Eigenschaften (Wing, Onishi et al. 2008). CTLA-4 induziert die
Transzytose und den Abbau der kostimulatorischen Rezeptoren CD80 und CD86 auf
APC und reduziert damit die Fähigkeit dieser Zellen T-Zellen zu aktivieren (Qureshi,
Zheng et al. 2011).
Die Treg zeichnen sich durch eine hohe Oberflächenexpression des hochaffinen IL-2
Rezeptors (CD25) aus. IL-2 ist ein essenzieller Wachstumsfaktor für T-Zellen. Über
CD25 können Treg effektiv IL-2 aus der Umgebung binden und somit den Effektorzellen
entziehen und deren weitere Proliferation unterbinden (de la Rosa, Rutz et al. 2004,
Scheffold, Huhn et al. 2005).
Die Sekretion von IL-10 durch Treg spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der
T-Zell-Homöostase (Annacker, Pimenta-Araujo et al. 2001) und bei der Regulation von
auto-reaktiven Erkrankungen (Uhlig, Coombes et al. 2006). Weiterhin sind die
Bereitstellung von TGFβ und die daraus resultierende Suppression von NK-Zellen und
DC durch Treg untersucht (Nakamura, Kitani et al. 2004, Ghiringhelli, Menard et al.
2005).
20
Einleitung
Weitere Analysen zeigen, dass Treg durch die Sekretion von Granzym und Perforin
Apoptose in Zielzellen auslösen können (Grossman, Verbsky et al. 2004, Gondek, Lu
et al. 2005, Boissonnas, Scholer-Dahirel et al. 2010). Sie nehmen damit Eigenschaften
an, die charakteristisch für zytotoxische CD8+ T-Zellen und NK-Zellen sind. In diesem
Zusammenhang wird auch die Expression von Th spezifischen Markerproteinen durch
Treg beschrieben (Übersicht in (Wing and Sakaguchi 2012, Geginat, Paroni et al.
2013)). Treg exprimieren neben FoxP3 Th-spezifische Transkriptionsfaktoren, Zytokine
und damit auch die korrespondierenden Homingrezeptoren (Jankovic, Kullberg et al.
2007, Esplugues, Huber et al. 2011, Wang, Su et al. 2011). Es wird vermutet, dass die
Treg auf die gleichen differenzierenden Bedingungen reagieren, wie die Th Zellen und
dadurch die Fähigkeit besitzen, in die entsprechenden Gewebe einzuwandern, um dort
die Th Zellen zu supprimieren.
1.4.2
Das immunsuppressive Zytokin IL-10
IL-10 stellt das wichtigste anti-inflammatorische Zytokin dar, das pro-inflammatorische
Immunantworten sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems
unterdrücken kann (Übersicht in (Ouyang, Rutz et al. 2011, Shouval, Ouahed et al.
2014)). Die Rolle des Zytokins für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz wird
dadurch untermauert, dass IL-10- bzw. IL-10 Rezeptor-Defizienz in Menschen und
Mäusen zur Entstehung schwerer intestinaler Entzündungen führt (Kuhn, Lohler et al.
1993, Glocker, Kotlarz et al. 2009, Kotlarz, Beier et al. 2012, Moran, Walters et al.
2013). Auch kann ein Mangel an endogenem IL-10 bei einer Infektion eine lethale
Immunpathologie auslösen (Gazzinelli, Wysocka et al. 1996). Wurde hingegen Mäusen
in einer Transfercolitis rekombinantes IL-10 injiziert, so konnten diese vor einer
Darmentzündung geschützt werden (Powrie, Leach et al. 1994).
IL-10 besteht aus 178 Aminosäuren und zwischen der humanen und murinen Form
besteht eine Sequenzhomologie von ca. 73 % (Windsor, Syto et al. 1993). Das Zytokin
wird über den IL-10 Rezeptor (IL-10R) gebunden, welcher aus zwei Untereinheiten,
dem IL-10Rα und IL-10Rβ, besteht (Yoon, Logsdon et al. 2006). Die suppressive
Funktionsweise
von
IL-10
beruht
unter
anderem
auf
der
Inhibition
der
Zytokinsekrektion sowie der Expression von MHCII und kostimulatorischen Rezeptoren
auf Makrophagen und DC (de Waal Malefyt, Abrams et al. 1991, Ding, Linsley et al.
21
Einleitung
1993, Allavena, Piemonti et al. 1998). Weiterhin sind die Unterdrückung der Reifung
von DC aus Vorläuferzellen und eine direkte Wirkung auf T-Zellen beschrieben.
IL-10 verhindert T-Zell-vermittelte Immunreaktionen, die durch die Erkennung von
endogenen Bakterien durch APC im Darm ausgelöst werden und damit verbundene
Entzündungen und Gewebezerstörung. Im Darm wird IL-10 von CD11b+ myeloiden
Zellen (Murai, Turovskaya et al. 2009) und Makrophagen (Kamada, Hisamatsu et al.
2005) produziert. Interessanterweise tragen die Zellen damit auch zur Differenzierung
und Funktion von Treg bei (Murai, Turovskaya et al. 2009, Liu, Tonkonogy et al. 2011).
Reaktionen von Zellen des angeborenen Immunsystems im Darm sind hauptsächlich
gegen Enterobakterien gerichtet. Die Zellen erkennen die Pathogene über ihre PRR.
Werden Sie aktiviert, so wird das Signal über MyD88 weitergeleitet und die Expression
von pro-inflammatorischen Zytokinen wird induziert. Fehlt MyD88 in IL-10-defizienten
Mäusen, so kommt es nicht zu Ausbildung einer Darmentzündung (Rakoff-Nahoum,
Hao et al. 2006, Hoshi, Schenten et al. 2012).
Unter homöostatischen Bedingungen exprimieren Treg aus der Milz und den mLN nur
wenig IL-10, wohingegen Treg aus der Lamina propria zu einem hohen Anteil IL-10
exprimieren (Maloy, Salaun et al. 2003, Uhlig, Coombes et al. 2006, Tiittanen,
Westerholm-Ormio et al. 2008). Eine Deletion der IL-10 Expression in Treg unterstützt
die Ausbildung einer Colitis (Rubtsov, Rasmussen et al. 2008). Ursprünglich wurde IL10 in Th2 Zellen identifiziert (Fiorentino, Bond et al. 1989). Mittlerweile ist aber auch die
IL-10 Expression in Th1 und Th17 Zellen beschrieben wurden. IL-10 kann die
Proliferation dieser pro-inflammatorischen Th Zellen inhibieren und damit zu T-Zell
Homöostase beitragen (McGeachy, Bak-Jensen et al. 2007, Rutz, Janke et al. 2008,
Saraiva, Christensen et al. 2009). Die Expression von IL-10 in B-Zellen unter chronisch
entzündlichen Bedingungen induziert regulatorische Eigenschaften und supprimiert
Entzündungsreaktionen (DiLillo, Matsushita et al. 2010, Carter, Rosser et al. 2012).
22
Einleitung
1.5
1.5.1
Notch-Signalweg
Notch-Rezeptor und seine Liganden
Der Notch-Signalweg ist evolutionär hoch konserviert und spielt eine entscheidende
Rolle bei der Zelldifferenzierung in verschiedensten Geweben, während der
embryonalen und postnatalen Entwicklung (Übersicht in (Artavanis-Tsakonas, Rand et
al. 1999, Milner and Bigas 1999, Maillard, Fang et al. 2005). Entdeckt wurde Notch in
Drosophila melanogaster und hat dort einen Einfluss auf neuronale und epidermale
Zelldifferenzierungsprozesse (Weinmaster, Roberts et al. 1991).
Die Notch-Rezeptoren gehören zur Familie der Typ I Transmembranrezeptoren. In
Säugetieren sind vier Notch-Rezeptoren (Notch1, -2, -3, -4) und fünf -liganden bekannt,
die der Delta-like (Dll; Dll1, -3, -4)) bzw. Jagged (Jagged1, -2) Familie zuzuordnen sind
(Übersicht in (Radtke, Fasnacht et al. 2010, Radtke, MacDonald et al. 2013). Die
Signalweiterleitung scheint durch die hohe Zahl an Rezeptoren und Liganden eine
hohe Redundanz aufzuweisen, dennoch variiert die Interaktion spezifischer LigandRezeptor-Paarungen in verschiedenen Geweben (Shimizu, Chiba et al. 1999, Shimizu,
Chiba et al. 2000, Shimizu, Chiba et al. 2000). Besonders anschaulich wird die hohe
Relevanz der einzelnen Komponenten dadurch, dass eine Defizienz der Rezeptoren
Notch1 (Swiatek, Lindsell et al. 1994) und Notch2 (Hamada, Kadokawa et al. 1999), als
auch der Liganden Jagged1 (Xue, Gao et al. 1999), Jagged2 (Jiang, Lan et al. 1998)
und Dll1 (Hrabe de Angelis, McIntyre et al. 1997) embryonal oder perinatal lethal sind.
Bei Dll4 ist selbst ein heterozygoter Genotyp embryonal lethal (Gale, Dominguez et al.
2004). Notch und seine Liganden sind membrangebunde Proteine und eine Aktivierung
des Rezeptors findet bei direktem Zell-Zell-Kontakt benachbarter Zellen statt.
Untereinheiten des Notch-Rezeptors fungieren dabei als Transkriptionsfaktoren und
stellen somit eine sehr direkte Signalweiterleitung sicher (Übersicht in (Baron, Aslam et
al. 2002, Kopan 2002)). Die Bindung eines Liganden führt zunächst zur Abspaltung der
extrazellulären Notch Domäne durch ADAM Proteasen und anschließend zur
Abspaltung der intrazellulären Domäne von der Zellmemran durch γ-Sekretase (Kopan,
Schroeter et al. 1996, Schroeter, Kisslinger et al. 1998). Die Domäne kann mittels
zweier Kernlokalisationssequenzen direkt in den Zellkern wandern und dort mit DNAbindenden Proteinen (RBPJ) interagieren, die sonst als Transkriptionsrepressoren
23
Einleitung
agieren. In der Folge wird aus dem Suppressorkomplex ein Transkriptionsaktivator und
die Expression mehrerer Notch-Zielgene wie hairy/enhancer of split (Hes)-1 und
Deltex-1 wird induziert (Bailey and Posakony 1995, Hori, Fostier et al. 2004).
1.5.2
Einfluss des Notch-Signalweges auf die T-Zell-Differenzierung
Dem Notch-Signalweg wird eine große Rolle während der T-Zell-Entwicklung
zugesprochen. (Radtke, Fasnacht et al. 2010, Radtke, MacDonald et al. 2013). So sind
dessen Rezeptoren und Liganden bei der Entwicklung von Vorläuferzellen im
Knochenmark, bei der Differenzierung von T-Zellen im Thymus und bei der
Entwicklung von Th- und Effektor-Zellen in der Peripherie von entscheidender
Bedeutung. Durch die Gruppe um R. Flavell wurde erstmals ein Zusammenhang
zwischen der Expression der einzelnen Notch-Liganden auf APC und der Entwicklung
von Th1 und Th2 Zellen hergestellt (Amsen, Blander et al. 2004). Weitere Sudien
untermauerten die Aussagen, dass die Bindung von Dll-Liganden die Entwicklung von
IFNγ-produzierenden Th1 Zellen fördert, während eine Bindung der Jagged-Liganden
die Entwicklung von Th2 und Treg Zellen unterstützt (Übersicht in (Amsen, Antov et al.
2009, Auderset, Coutaz et al. 2012)).
Die Rolle des Notch-Signalwegs für die Th1 Differenzierung wurde mittels Blockade der
γ-Sekretase durch γ-Sekretase-Inhibitor (GSI) in Th1-vermittelten Mausmodel der
Experimentellen Autoimmunencephalitis untersucht, wobei der Krankheitsverlauf
dadurch gemildert war (Minter, Turley et al. 2005, Jurynczyk, Jurewicz et al. 2008). Es
wurde zudem die Hypothese aufgestellt, dass Notch1 an eine RBPJ-Bindestelle im
Tbet Promotor bindet, die jedoch in folgenden Studien nicht belegt werden konnte.
RBPJ knockout (ko) in T-Zellen führte nicht zu einer verminderten Th1 Antwort (Fang,
Yashiro-Ohtani et al. 2007, Auderset, Schuster et al. 2012). Für die Th1 Differenzierung
scheint eine Bindung der intrazellulären Notch Domäne an RBPJ nicht notwendig zu
sein, alternativ sind Untereinheiten des NF-κB Transkriptionsfaktors involviert (Shin,
Minter et al. 2006).
Der Einfluss von Notch auf die Th2 Differenzierung wurde in zahlreichen
experimentellen Mausmodellen untersucht und ist, im Gegensatz zu Th1 Zellen,
abhängig von der Bindung an RBPJ (Tanaka, Tsukada et al. 2006, Amsen, Antov et al.
24
Einleitung
2007). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich RBPJ Bindestellen im IL-4
enhancer Element befinden und auf einen direkten Einfluss des Notch-Signalwegs für
die IL-4 Transkription schließen lassen. Zudem wurde nachgewiesen, dass Notch an
den Gata3 Promotor, den Haupttranskriptionsfaktor von Th2 Zellen, bindet (Zheng and
Flavell 1997).
Die Entwicklung von Treg im Thymus und in der Peripherie, sowie deren suppressive
Eigenschaften sind durch den Notch-Signalweg beeinflusst. Notch 3 fördert
die
Entwicklung und suppressive Funktion von Treg durch Verstärkung der FoxP3
Expression (Campese, Grazioli et al. 2009, Barbarulo, Grazioli et al. 2011). Einen
positiven Einfluss von Notch auf die nachhaltige FoxP3 Expression in Treg wurde auch
in humanen Zellen bestätigt (Del Papa, Sportoletti et al. 2013). Die Expression von
Jagged2 auf hämatopoetischen Vorläuferzellen unterstützt die Treg Expansion und
supprimiert die Ausbildung einer Autoimmun-Diabetes in Mäusen (Kared, AdleBiassette et al. 2006). Entgegengesetzt dazu führte eine Blockade von Dll4 mittels
Antikörper während einer EAE zu einer Erhöhung der Treg Frequenz und einer
Milderung der Pathogenese (Bassil, Zhu et al. 2011). Die Dll4 Blockade in einem
Diabetes Maus-Model resultierte ebenfalls in erhöhten Treg Zahlen und einer
Suppression der Entzündung (Billiard, Lobry et al. 2012). Eine Überexpression von
Jagged 1 auf APC verstärkt die Treg Differenzierung in vitro und in vivo (Hoyne, Le
Roux et al. 2000, Vigouroux, Yvon et al. 2003). Die Expression des antiinflammatorischen Zyokins IL-10 kann durch GSI blockiert werden (Benson, Adamson
et al. 2005). Zudem sind in der Promotorregion des IL-10 Gens RBPJ Bindestellen
vorhanden. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass durch Notch IL-10 auf
Th1 Zellen induziert werden kann und dass vorrangig die Bindung von Dll4 für die IL-10
Expression verantwortlich ist (Rutz, Janke et al. 2008, Kassner, Krueger et al. 2010).
Neben der Differenzierung von T-Zellen wird Notch auch im Zusammenhang mit
Aktivierung, Proliferation und Zytokinsekretion von T-Zellen diskutiert (Übersicht in
(Osborne and Minter 2007). Dies wird zum einen durch eine Unterstützung der CD25
Expression und zum anderen durch eine Suppression von pro-apototischen Molekülen
vermittelt und resultiert in einer hohen Lebensdauer der Notch-aktivierten T-Zellen
(Adler, Chiffoleau et al. 2003, Helbig, Gentek et al. 2012).
25
2.
26
Zielsetzung
Zielsetzung
Die Induktion von systemischer Toleranz ist eine der wichtigsten immunologischen
Eigenschaften der Leber. Die Leber trägt auf der einen Seite dazu bei eine
Immunreaktion gegen harmlose Antigene zu verhindern und auf der anderen Seite
begrenzt sie eine bestehende Immunantwort durch Modulation der Effektorzellen oder
durch Induktion regulatorischer T-Zellen. Die zugrundeliegenden Mechanismen und
der Einfluss der leberresidenten Zellpopulationen sind noch nicht vollständig aufgeklärt.
Ziel dieser Arbeit war es einen Beitrag zum Verständnis der Toleranzinduktion durch
die Interaktion von CD4+ T-Zellen mit Lebersinusendothelzellen zu leisten. Folgende
Fragestellungen wurden dabei näher betrachtet:
(1) Wie beeinflusst die antigenspezifische Antivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC
die Migrationseigenschaften der T-Zellen? Inwieweit unterscheiden sich LSEC und
LSEC-negative Leber APC (LAPC) hinsichtlich ihrer Fähigkeit gewebespezifische
Homingrezeptoren zu induzieren?
(2)
Welchen Einfluß haben die antigenpräsentierenden Zellen der Leber auf die
Induktion von Apoptose und pro-inflammatorischen Zytokinen bei CD4+ T-Zellen?
(3) Haben regulatorische TLSEC die Fähigkeit die Proliferation und Zytokinexpression
von CD8+ T-Zellen zu supprimieren? Besitzen TLSEC einen regulatorischen Einfluss auf
eine T-Zell-vermittelte Darmentzündung?
(4) Welchen Phänotyp nehmen CD4+ T-Zellen an, die unter entzündlichen
Bedingungen
durch
LSEC
aktiviert
werden?
Wie
werden
die
funktionellen
Eigenschaften der T-Zellen beeinflusst und welche molekularen Mechanismen liegen
dem zugrunde?
27
3.
28
Material und Methoden
Material und Methoden
3.1
Versuchstiere
Der Wildtypmausstamm (WT) C57BL/6 wurde von den Forschungseinrichtungen für
experimentelle Medizin (Charité Universitätsmedizin Berlin) oder von Charles River
(Sulzfeld) erworben. Der OVA-TCR-transgene Stamm OT-IIxB6PL (H-2b) (Barnden,
Allison et al. 1998), dessen TCR das OVA323-339-Peptid im Kontext von IAb/IAd erkennt
(Robertson, Jensen et al. 2000) und dessen T-Zellen zusätzlich CD90.1 positiv sind,
wurde
vom
Deutschen
Knockoutstamm Notch1/2
Supply
Foundation,
Knockoutstamm
flox
Rheumaforschungszentrum
Cre
xCD4
Amsterdam,
ICOSkoxOT-II
Berlin
bezogen.
Der
wurde von Prof. Dr. Derk Amsen (Sanquin Blood
Niederlande)
wurde
von
Dr.
zu
Verfügung
Andreas
gestellt.
Hutloff
Der
(Deutsches
Rheumaforschungszentrum Berlin) zur Verfügung gestellt. Der Stamm B6.129S7Rag1tm1
Mom
wurde von Prof. Dr. Thomas Blankenstein (Freie Universität Berlin) zur
Verfügung gestellt.
Alle Tiere wurden unter spezifisch pathogen freien Bedingungen entsprechend
nationaler Richtlinien gehalten. Die Tiere wurden durch Genickbruch getötet. Alle
Tiertötungen und Tierversuche waren vom Landesamt für Gesundheit und Soziales
(Berlin) unter der Tötungsnummer T 0183/07 und der Tierversuchsnummer G 0336/08
genehmigt.
3.2
3.2.1
Reagenzien und Kits
Reagenzien
anti-CD62L MicroBeads, murin
Miltenyi Biotech, Bergisch
Gladbach
anti-CD90.2 MicroBeads, murin
Miltenyi Biotech, Bergisch
Gladbach
anti-PE MicroBeads
Miltenyi Biotech, Bergisch
Gladbach
β-Mercaptoenthanol
Gibco über Life Technologies
29
Material und Methoden
Bovines Serumalbumin Fraktion V (BSA)
Sigma Aldrich Chemie, Steinheim
Calciumchlorid (CaCl2)
Sigma Aldrich, Steinheim
5-,6-Carboxyfluorescein-diacetat-succinimidylester
Sigma Aldrich, Steinheim
(CFDA-SE)
Collagenase D
Roche Pharma, Grenzach-Whylen
Collagenase Typ IV
Sigma Aldrich, Steinheim
51
GE Healthcare, München
4-,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)
Roche Pharma, Grenzach-
Cr-Natriumchromat-Lösung (1-5 mCi / Gefäß)
Whyhlen
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma Aldrich, Steinheim
DNAse I
Calbiochem über Merck Millipore,
Darmstadt
Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM; mit 4,5 g/l
Invitrogen über Life Technologies,
Glucose, L-Glutamin)
Darmstadt
Eosin Y Lösung (0,5 %)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Ethanol
J.T.Baker, Mallinckrodt, NL
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 0,5 M, pH 8,0)
Promega, Mannheim
Fixable Viability Dye eFluor 780
eBioscience, Frankfurt a.M.
Formaldehyd-Lösung (37 %)
Carl Roth, Karlsruhe
Fötales Kälberserum (FCS), hitze-inaktiviert 30 min, 56°C
Linaris, Wertheim
γ-Sekretase-Inhibitor X (GSI)
Calbiochem über Merk Millipore,
Darmstadt
Glyceringelantine
Merck Millipore, Darmstadt
2+
2+
Hanks balanced salt solution (HBSS), mit Ca - und Mg -
Biochrom, Berlin
Ionen
Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure-Puffer-Lösung
30
Biochrom, Berlin
Material und Methoden
(HEPES; 1M)
Ionomycin
Sigma-Aldrich, Steinheim
Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3)
Sigma-Aldrich, Steinheim
LE 540
Wako, Richmond, VA, USA
L-Glutamin-Lösung (200 mM)
Invitrogen über Life Technologies,
Darmstadt
Mayers Hämalaun-Lösung
Merck Millipore, Darmstadt
Mitomycin C
Sigma Aldrich, Steinheim
Monensin (1000x)
Biolegend, Fell
Natriumchlorid (NaCl)
Sigma Aldrich, Steinheim
Natriumpyruvat-Lösung (100 mM)
Biochrom, Berlin
Nicht-essentielle Aminosäuren-Lösung (NEAA; 10 mM)
Biochrom, Berlin
Nycodenz
Axis Shield, Oslo, Norwegen
OVA-Peptid, Sequenz:
323
ISQAVHAAHAEINEAGR
339
Institut für Biochemie, Humboldt
Universität zu Berlin
Paraffin
Sigma-Aldrich, Steinheim
Paraformaldehyd (PFA)
Merck Millipore, Darmstadt
PCR Wasser
Bioline, Luckenwalde
Penicillin/Streptomycin-Lösung (10000 U / 10000 µg/ml)
Biochrom, Berlin
Percoll
GE-Healthcare
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne Ca
2+
und
PAA Laboratories, Cölbe
2+
Mg -Ionen
Propidiumjodid
Sigma-Aldrich, Steinheim
Rekombinante murine Zytokine: IFN-γ, IL-12, IL-2
R&D Systems, Wiesbaden
Rosewell Park Memorial Institute Medium
Invitrogen über Life Technologies,
TM
(RPMI 1640) mit GlutaMAX , HEPES und Phenolrot
31
Darmstadt
Material und Methoden
Saponin
Sigma Aldrich, Steinheim
SYBR Green PCR Master Mix
Applied Biosystem über Life
Technologies, Darmstadt
Trypanblau-Lösung (0,4 %)
3.2.2
Sigma Aldrich, Steinheim
Vorgefertigte Systeme (Kits)
Anti-APC-Multisort Kit
Miltenyi Biotech, Bergisch
Gladbach
Anti-FITC-Multisort Kit
Miltenyi Biotech, Bergisch
Gladbach
Cell Trace Violet Cell Proliferation Kit
Molecular Probes über Life
Technologies, Darmstadt
Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit
BD, Heidelberg
Dako REAL™ Detection System LSAB+ AP/RED
Dako, Hamburg
FoxP3 Staining Kit, murin
eBioscience, Frankfurt a.M.
HemoCARE, Test zur Bestimmung von okkultem Blut im
CARE Diagnostika, Möllersdorf,
Stuhl
Österreich
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
Applied Biosystems über Life
Technologies, Darmstadt
Mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13 plex Kit FlowCytomix
eBioscience, Frankfurt a.M.
RNeasy Plus Mini Kit
Qiagen, Hilden
32
Material und Methoden
3.3
Materialien und Geräte
3.3.1
Materialien
Einmal-Spritzen und –Kanülen
Braun, Melsungen
MACS-Säulen, -Magnete, -Ständer, Prä-Separationsfilter
Miltenyi Biotech, Bergisch
Gladbach
MicroAmp
®
Fast Reaction Tubes (8 Tube Strip)
Applied Biosystems über Life
Technologies, Darmstadt
MicroAmp
®
Optical 8-Cap Strip
Applied Biosystems über Life
Technologies, Darmstadt
PCR Tube Strips with Domed Cap Strips
Peqlab Biotechnologie Erlangen
Rundsiebe
Carl Roth, Karlsruhe
QIAshredder-Säulen
Qiagen, Hilden
Zellkulturplatten
Corning Costar über Sigma
Aldrich, Steinheim
Zellsiebe (100 µm Porengröße)
3.3.2
BD, Heidelberg
Geräte
CO2-Brutschrank
Binder Tuttlingen
Durchflusszytometer FACSCanto II
BD, Heidelberg
Gamma-Counter WIZARD
®
Wallac, Turku, Finnland
Kreisschüttler KS125
IKA Labortechnik, Staufen
Mikrotom Microm HM 325
Thermo Scientific, Schwerte
Mikroskop AxioImager Z1
Carl Zeiss MicroImaging, Inc.,
Jena
Neubauer Zählkammer
Carl Roth, Karlsruhe
Oditest Dickemessgerät
Kroeplin Längenmesstechnik,
33
Material und Methoden
Schlüchtern
Phasenkontrastmikroskop für Zellkultur Axiovert 25
Real-time PCR System StepOnePlus
TM
Carl Zeiss, Jena
Applied Biosystems über Life
Technologies
Rotlichtlampe Osram Theratherm
Osram, München
Spektralphotometer NanoDrop
Thermo Scientific, Schwerte
Sterilwerkbank Herasafe
®
Thermo Scientific, Schwerte
Thermocycler T 3000
Biometra, Göttingen
Ultraviolet Sterilizing PCR Workstation
Peqlab Biotechnologie, Erlangen
Zentrifugen: Multifuge X3R, Fresco-17
Thermo Scientific, Schwerte
3.4
Primer
Die verwendeten Primer wurden mit dem Programm Primer3 (Geneious, Auckland,
Neuseeland) entworfen und von der Firma TIB Molbiol (Berlin) synthetisiert. Die Tabelle
1 gibt die Sequenzen der forward (f) und reverse (r) Primer in 5‘ – 3‘ Richtung an.
Tabelle 1: Sequenzen der Primer und Annealing-Temperatur
Zielgen
Sequenz
AnnealingTemperatur
β-Aktin
f: TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA
62°C
r: TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC
Deltex-1
f: GTGCCCTACATCATCGACCT
61°C
r: CTGGATGGTGATGCAGATGT
Dll1
f: GGATACACACAGCAAACGTGA
62°C
r: CGCTTCCATCTTACACCTCAG
Dll4
f: CCTCTCGAACTTGGACTTGC
34
61°C
Material und Methoden
r: GCTCCTGCTTAATGCCAAAC
Gzmb
f: TCGACCCTACATGGCCTTAC
61°C
r: TGGGGAATGCATTTTACCAT
Hes-1
f: GCGAAGGGCAAGAATAAATG
60°C
r: TGTCTGCCTTCTCTAGCTTGG
IL-10
f: ATCGATTTCTCCCCTGTGAA
60°C
r: TTCGGAGAGAGGTACAAACGA
IFN-γ
f: CAACAACATAAGCGTCATT
60°C
r: ATTCAAATAGTGCTGGCAGA
Jagged1
f: CCCTGTCAGCAAACAATGAA
60°C
r: GGACGCCTCTGAACTCTGAC
Jagged2
f: GAGGCTGTCAGTGGGACTGT
62°C
r: ACAGCTATGGTAACCGCCATC
Prf
f: GATGTGAACCCTAGGCCAGA
61°C
r: GGTTTTTGTACCAGGCGAAA
UBC
f: AGCCCAGTGTTACCACCAAG
60°C
r: TCACACCCAAGAACAAGCAC
3.5
Antikörper
Tabelle 2: Fluorochrome und ihre Adsorptions- und Emissionsmaxima
Fluorochrom
Adsorption (nm)
Emission (nm)
Alexa-Fluor (AF) 405
401
421
Alexa-Fluor (AF) 488
495
519
35
Material und Methoden
Alexa-Fluor (AF) 647
650
668
Allophycocyanin (APC)
650
660
BD Horizon V450 (V450)
404
448
Brilliant-Violet (BV) 510
405
510
e-Fluor (eF) 405
405
421
e-Fluor (eF) 780
633
780
Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
495
520
R-Phycoerythrin (PE)
480/565
575
R-Phycoerythrin-Cychrome 7 (PE-Cy7)
480/565/743
767
Propidiumiodid (PI)
550
650
Tabelle 3: Antikörper für die Durchflusszytometrie, Spezies Maus
Spezifität
Klon
Isotyp
Annexin-V
Fluorochrom Herkunft
PE
BD, Heidelberg
α4β7-Integrin
DATK32
Ratte IgG2a
PE
BD, Heidelberg
CCR9
CW-1.2
Maus IgG2a
AF 647
Biolegend, Fell
CD4
L3T4
Ratte IgG2a
FITC
BD, Heidelberg
GK1.5
Ratte IgG2b
APC
Biolegend, Fell
RM4-5
Ratte IgG2a
BV510
BD, Heidelberg
53-6.7
Ratte IgG2a
APC
Biolegend, Fell
CD8
36
Material und Methoden
CD25
PC61
Ratte IgG1
PE
Biolegend, Fell
CD39 (ENTPD1)
24DMS1
Ratte IgG2b
AF647
eBioscience,
Frankfurt a.M.
CD44
IM7
Ratte IgG2b
PE
BD, Heidelberg
CD62L
MEL-14
Ratte IgG2a
APC
Biolegend, Fell
CD90.1
OX-7
Maus IgG1
AF488
Biolegend, Fell
V450
BD, Heidelberg
CD90.2
53-2.1
Ratte IgG2a
eF450
BD, Heidelberg
CD146
ME-9F1
Ratte IgG2a
FITC
Biolegend, Fell
Dll1
HMD1-3
Arm.
APC
Biolegend, Fell
PE
Biolegend, Fell
PE
eBioscience,
Hamster IgG
Dll4
HMD4-1
Arm.
Hamster IgG
FoxP3
FJK-16S
Ratte IgG2a
Frankfurt a.M.
Helios
22F6
Arm.
APC
Biolegend, Fell
Hamster IgG
IFN-γ
XMG1.2
Ratte IgG1
APC
BD, Heidelberg
IL-2
JES5-
Ratte IgG2b
PE
BD, Heidelberg
Ratte IgG2b
PE
eBioscience,
5H4
IL-10
JES516E3
Jagged1
HMJ1-29
Frankfurt a.M.
Arm.
PE
37
eBioscience,
Material und Methoden
Hamster IgG
Jagged2
HMJ2-1
Arm.
Frankfurt a.M.
PE
Hamster IgG
Miltenyi
Biotec,
Bergisch
Gladbach
MHCII
M5/114.5
PD-1
29F.1A12 Ratte IgG2a
Ratte IgG
APC
Biolegend, Fell
PE
Biolegend, Fell
P-Selektin/ Mensch
BD, Heidelberg
IgG Fc Chimäre
TNF-α
MP6-
Ratte IgG1
PE-Cy7
Biolegend, Fell
Affe
PE
BD, Heidelberg
XT22
Mensch IgG, FcFragment
Tabelle 4: Antikörper für die Immunfluoreszenz und Immunpathologie
Spezifität
Klon
Isotyp
Markierung /
Herkunft
Fluoreszenz
Affe anti-Ratte
AF488
Dianova,
Hamburg
anti-Maus CD4
4SM95
Ratte IgG
eBioscience,
Frankfurt a.M.
anti-Maus CD146
ME-9F1
Ratte IgG2a
Biolegend, Fell
anti-Maus Dll4
HMD4-1
Arm.
Biolegend, Fell
Hamster IgG
Kaninchen anti-
Bio
38
Dianova,
Material und Methoden
Ratte
Hamburg
Ziege anti-
AF647
Dianova,
Hamster
Hamburg
Tabelle 5: Antikörper für die Aktivierung und Blockade, Spezies Maus
Spezifität
Klon
Herkunft
CD3
37.5
DRFZ, Berlin
CD16/CD32
93
Biolegend, Fell
CD28
145-2C11
DRFZ, Berlin
Dll1
HMD1-3
DRFZ, Berlin
Dll4
HMD1-4
Biolegend, Fell
IL-4
11B11
DRFZ, Berlin
IL-10 Rezeptor
1B1.2
DRFZ, Berlin
IL-27p28
MM27-7B1
Biolegend, Fell
IgG1
19E1
DRFZ, Berlin
Ratten IgG
Jackson Immuno Research
Laboratories Inc., UK
3.6
Medien und Puffer
17 % Nycodenz-Lösung
17 % (w/v) Nycodenz, 26 % (v/v) RPMI 1640, 10 %
(v/v) FCS in Aqua dest.
30 % Nycodenz-Lösung
30 % (w/v) Nycodenz in Aqua dest.
36 % Percoll-Lösung
40 % (v/v) 90 % Percoll in PBS
90 % Percoll-Lösung
90 % (v/v) Percoll, 10 % (v/v) 10x PBS
39
Material und Methoden
Annexin V-Färbepuffer
2,5 mM CaCl2, 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4
Erythrozyten-Lyse-Puffer
10 mM KHCO3, 155 mM NH4Cl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5
HBSS/BSA
Hanks balanced salt solution (HBSS), mit Ca2+- und
Mg2+-Ionen, 0,5 % (w/v) BSA
Kollagenasemedium
200 U/ml Collagenase D, 20 µg/ml DNAse I in cRPMI
Komplett DMEM (cDMEM)
DMEM, 10 % (v/v) FCS, 1 % (v/v) Natriumpyruvat, 1 %
(v/v) Penicillin/Streptomycin, 25 mM HEPES, 1 % (v/v)
NEAA, 0,1 % (v/v) β-Mercaptoethanol
Komplett RPMI (cRPMI)
RPMI 1640 mit GlutaMAXTM und HEPES, 10 % (v/v)
FCS, 1 % (v/v) Natriumpyruvat, 1 % (v/v)
Penicillin/Streptomycin, 0,1 % (v/v) β-Mercaptoethanol
Paraformaldehyd-Lösung
1x PBS, 0,5 % (w/v) PFA, pH 7
PBS/BSA
1x PBS, 0,5 % (w/v) BSA
PBS/BSA/EDTA
1x PBS, 0,5 % (w/v) BSA, 2 mM EDTA
PBS/EDTA
1x PBS, 5 mM EDTA
Saponin-Puffer
1x PBS, 0,5 % (w/v) Saponin
Th1-Medium
cRPMI, 5 µg/ml OVA-Peptid, 10 ng/ml IL-2, 10 ng/ml
(antigenspezifisch)
IL-12, 10 µg/ml anti-IL4 mAk
Th1-Medium
cRPMI, 1 µg/ml anti-CD3 mAk, 0,5 µg/ml anti-CD28
(polyklonal)
mAk, 10 ng/ml IL-2, 10 ng/ml IL-12, 10 µg/ml anti-IL4
mAk
Verdaumedium
RPMI 1640 mit GlutaMAXTM und HEPES,5 % (v/v)
FCS, 0,05 % (w/v) Collagenase Typ IV
Waschmedium (wRPMI)
3.7
3.7.1
wie cRPMI, mit 5 % (v/v) FCS
Isolation definierter Zellpopulationen
Zellzahlbestimmung
Für die Bestimmung der Zellzahl wurde eine Trypanblau-Lösung verwendet. Lebende
Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf und erscheinen unter dem Mikroskop weiß vor
blauem Hintergrund. In tote Zellen dringt Trypanblau ein und färbt diese dunkelblau an.
Somit ermöglichte die Trypanblaufärbung eine Unterscheidung zwischen lebenden und
40
Material und Methoden
toten Zellen. 10 μl der Zellsuspension wurden in einem angemessenen Volumen mit
0,4 % Trypanblaulösung (v/v in PBS) verdünnt. 10 μl dieser Verdünnung wurden in
eine Neubauer Zählkammer gegeben und die Zahl der lebenden (ungefärbten) Zellen
in
den
4
großen
Außenquadraten
ermittelt.
Die
Zellzahl
berechnet
sich
folgendermaßen: Zellzahl/ml = (gezählte Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor x 10.000.
3.7.2
Prinzip der Isolation von Zellpopulationen durch magnetische
Zellseparation
Die MACS-Technologie (MACS: magnetic activated cell sorting) erlaubt die Sortierung
von bestimmten Zellpopulationen aus einem Zellgemisch. Diese Methode basiert auf
superparamagnetischen Partikeln (MicroBeads), welche an Antikörper gekoppelt sind.
Die epitopspezifischen Antikörper können direkt mit MicroBeads konjugiert sein oder
ein Fluoreszenz-markierter Primärantikörper bindet epitopspezifisch an die Zelle und
mittels eines Sekundärantikörpers, der gegen das Fluorochrom gerichtet ist und mit
MicroBeads konjugiert ist, werden die Zellen aus der Suspension isoliert. Dazu wird die
Zellsuspension mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert und in einem Magnetfeld
auf eine mit ferromagnetischer Matrix gefüllte Säule gegeben. Zellen, die mit
MicroBeads markiert sind, werden im magnetischen Feld zurückgehalten, und
unmarkierte Zellen passieren die Säule. Durch ein Entfernen der Säule aus dem
Magneten können auch die markierten Zellen gesammelt werden. Mit Hilfe dieser
Methode können Zellen aufgrund ihrer Oberflächenmoleküle positiv oder negativ aus
einem Zellgemisch selektiert werden (Miltenyi, Muller et al. 1990).
Bei allen Zellisolationen wurden die Zellsuspensionen in einer Zelldichte von 1x108/ml
PBS/BSA/EDTA mit Antikörpern für 10 min bei 4 °C inkubiert, während die Inkubation
mit MicroBeads in einer Zelldichte von 2x108/ml PBS/BSA/EDTA für 15 min bei 4 °C
erfolgte.
3.7.3
Isolation von nicht-parenchymatischen Zellen (NPC) der Leber
Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und das Peritoneum geöffnet.
Zur Isolation der NPC aus der Leber wurde diese über die Pfortader mit 5 ml
Verdaumedium gespült und nach der Entfernung der Gallenblase entnommen. Die
41
Material und Methoden
Leber wurde im Verdaumedium mittels Schere und Pinzette zerkleinert und für ca. 15
min bei 37 °C inkubiert. Nach dem Verdauschritt wurde die Leber in Waschmedium
aufgenommen, durch ein feines Rundsieb aus Metall gerieben und anschließend durch
ein Zellsieb gedrückt. Die Zellsuspension wurde für 5 min bei 20 g und
Raumtemperatur (RT) zentrifugiert und damit die Einzelzellen von den restlichen
Gewebsbestandteilen getrennt. Die Einzelzellsuspension wurde erneut zentrifugiert (8
min, 600 g, RT), der Überstand verworfen und die pelettierten Zellen in ErythrozytenLyse-Puffer aufgenommen, für 5 min auf Eis inkubiert und anschließend mit wRPMI
gewaschen. Um die Hepatozyten aus dem Zellgemisch abzutrennen, erfolgte eine
Dichtegradientenzentrifugation. Dazu wurden die Zellen in einer 26 % NycodenzLösung (6,5 ml 30 % Nycodenz, 1 ml Zellsuspension in wRPMI) aufgenommen, unter
wRPMI unterschichtet und zentrifugiert (20 min, 1200 g, RT). Die NPC befanden sich in
der Interphase, die abgenommen und mit PBS/BSA gewaschen wurde.
3.7.3.1
Isolation von Lebersinusendothelzellen
Zur Isolation der LSEC wurden die NPC mit einem anti-Fc-Rezeptor-Antikörper (antiCD16/CD32 mAk, 25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C inkubiert, um unspezifische Bindung des
Fluoreszenz-markierten
Antikörpers
zu
blockieren.
Anschließend
erfolgte
die
Markierung mit einem anti-CD146 FITC Antikörper (0,7 µg/ml). Die Zellsuspension
wurde mit PBS/BSA gewaschen und mit anti-FITC MicroBeads inkubiert. CD146+
LSEC wurden mittels MACS mit einer Reinheit von maximal 98 % isoliert. Die LSEC
wurden entweder direkt zur durchflusszytometrischen Analyse verwendet oder für
Kokulturen, zur Adhäsion der Zellen, über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 in cDMEM
kultiviert. Die adhärierten LSEC wurden daraufhin mit wRPMI gründlich gespült und für
die Kokultur mit T-Zellen in dem entsprechenden Kulturmedium aufgenommen.
3.7.3.2
Isolation von antigenpräsentierenden Zellen aus der Leber
Zur Isolation von antigenpräsentierenden Zellen aus der Leber (LAPC), wurden die
LSEC negativen Zellen aus der LSEC MACS verwendet. Die Zellen wurden nochmals
von den verbleibenden LSEC depletiert. Daraufhin wurden die Zellen zunächst mit
einem anti-MHCII mAk (0,1 µg/ml) in APC markiert, in PBS/BSA gewaschen und
daraufhin mit anti-APC MicroBeads inkubiert. Die Sortierung von LSEC-negativen
MHCII-positiven Leberzellen erfolgte über zwei positive Sortierungsschritte. Die
42
Material und Methoden
Reinheit betrug wenigstens 98 %. Die Zellpopulation setzte sich im Durchschnitt wie
folgt zusammen: 90 % B-Zellen, 6 % Kupffer Zellen, 4 % dendritische Zellen. Zur
Inhibition der Proliferation wurden die Zellen anschließend in cRPMI aufgenommen
und mit Mitomycin C in einer finalen Konzentration von 100 µg/ml für 30 min bei 37 °C
inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen. Für die Zellen, die mit CD4+ T-Zellen für
eine Kokultur verwendet wurden, erfolgte eine Inkubation in cRPMI über Nacht bei 37
°C und 5 % CO2 im Brutschrank. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen in einer
Konzentration von 2x106/ml in dem entsprechenden Zellkulturmedium aufgenommen.
3.7.4
Isolation von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten
Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet und die Milzen sowie
Lymphknoten
(axilläre-,
mandibuläre-,
brachiale-,
inguinale
und
mesenteriale
Lymphknoten) entnommen und von diesen Organen eine Einzelzellsuspension in
PBS/BSA/EDTA hergestellt. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert (300 g, 8
min, 4 °C) und die enthaltenen Erythrozyten in 3 ml Erythrozyten-Lyse-Puffer pro Maus
lysiert. Nach einem Waschritt mit PBS/BSA/EDTA wurden die verbleibenden
Gewebsbestandteile mittels eines Zellsiebs mit einer Maschenweite von 100 µm
entfernt. Alle Schritte erfolgten auf Eis. Die Einzelzellsuspension wurde nun für die
weitere Zellisolation verwendet.
3.7.4.1
Isolation naiver CD4+ T-Zellen
Zur Isolation von naiven CD4+ T-Zellen wurde die Einzelzellsuspension von Milz und
Lymphozyten zunächst mit einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C
inkubiert um die Fc-Rezeptoren der Zellen zu blockieren und ein unspezifisches Binden
der folgenden Antikörper zu verhindern. Anschließend wurde direkt ein anti-CD4 APC
mAk (0,2 µg/ml) hinzugegeben und für 10 min bei 4 °C inkubiert. Nach einem Waschritt
mit PBS/BSA/EDTA wurden die Zellen mit anti-APC-Multisort MicroBeads in einem
Verhältnis von 1:20 markiert, gewaschen und die CD4+ T-Zellen über MACS isoliert.
Die Reinheit der CD4+ T-Zellen betrug wenigstens 97 %. Die Zellen wurden daraufhin
in einer Zelldichte von 2,7x107 / ml aufgenommen und mit 35 µl Release-Reagent pro
ml Zellsuspension zunächst für 10 min bei 4 °C, daraufhin 20 min bei RT inkubiert,
gewaschen und die von den MicroBeads getrennten Zellen über MACS depletiert.
43
Material und Methoden
Naive CD4+ T-Zellen exprimieren im Gegensatz zu Effektor/Gedächtnis CD4+ T-Zellen
viel CD62L. Daher wurden naive CD4+ T-Zellen als CD4+CD62Lhigh T-Zellen definiert.
Die CD4+ T-Zellen wurden mit CD62L MicroBeads in einem Verhältnis von 1:60
inkubiert und über MACS positiv selektioniert. Die Reinheit der naiven CD4+ T-Zellen
betrug mindestens 98 %. Die Zellen wurden entweder direkt durchflusszytometrisch
analysiert oder für die Kultivierung in dem entsprechenden Zellkulturmedium
aufgenommen.
3.7.4.2
Isolation von regulatorischen CD4+ T-Zellen
Die Isolation von regulatorischen CD4+ T-Zellen (Treg) erfolgte wie im Abschnitt 3.7.4.1
beschrieben. Davon abweichend erfolgte die Markierung mit einem anti-CD4 FITC mAk
(1 µg/ml) und der Sortierung mit FITC-Multisort MicroBeads (1:20). Nachdem die
MicroBeads von den CD4+ T-Zellen abgetrennt wurden, erfolgte die Markierung mit
einem anti-CD25 PE mAk (0,5 µg/ml), anti-PE-MicroBeads (1:10) und einer
zweimaligen positiven Isolation. Die Reinheit der CD4+CD25+ T-Zellen betrug
wenigstens 95 %. Zusätzlich wurde der Anteil der FoxP3 positiven Zellen bestimmt; er
betrug im Durchschnitt 80 %. Die Zellen wurden entweder direkt durchflusszytometrisch analysiert oder für die Kultivierung in dem entsprechenden Zellkulturmedium aufgenommen.
3.7.4.3
Isolation von naiven CD8+ T-Zellen
Zur Isolation von naiven CD8+ T-Zellen wurde die Einzelzellsuspension von Milz und
Lymphozyten zunächst mit einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C
inkubiert. Anschließend wurde direkt ein anti-CD8 APC mAk (0,2 µg/ml) hinzugegeben
und für 10 min bei 4 °C inkubiert. Nach einem Waschritt mit PBS/BSA/EDTA wurden
die Zellen mit anti-APC-Multisort MicroBeads in einem Verhältnis von 1:20 markiert,
gewaschen und die CD8+ T-Zellen über MACS isoliert. Die Reinheit der CD8+ T-Zellen
betrug wenigstens 97 %. Die Zellen wurden daraufhin in einer Zelldichte von 2,7x107 /
ml aufgenommen und mit 35 µl Release-Reagent pro ml Zellsuspension zunächst für
10 min bei 4 °C, daraufhin 20 min bei RT inkubiert, gewaschen und die von den
MicroBeads getrennten Zellen über MACS depletiert. Naive CD8+ T-Zellen exprimieren
im Gegensatz zu Effektor/Gedächtnis CD8+ T-Zellen wenig CD44. Daher wurden naive
CD8+ T-Zellen als CD8+CD44low T-Zellen definiert. Die CD8+ T-Zellen wurden mit einem
44
Material und Methoden
anti-CD44 PE mAk (0,4 µg/ml) und anti-PE MicroBeads in einem Verhältnis von 1:10
inkubiert und über MACS negativ selektioniert. Die Reinheit der naiven CD8+CD44low TZellen betrug wenigstens 97 %. Die Zellen wurden entweder direkt durchflusszytometrisch
analysiert
oder
für
die
Kultivierung
in
dem
entsprechenden
Zellkulturmedium aufgenommen.
3.7.4.4
Isolation antigenpräsentierender Zellen
Zur Isolation der antigenpräsentierenden Zellen aus der Milz (spleen-derived antigen
presenting cells, SAPC) wurde die Einzelzellsuspension aus der Milz zunächst mit
einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) für 5 min bei 4 °C und anschließend mit antiCD90.2 MicroBeads für 15 min bei 4 °C inkubiert, gewaschen und über MACS isoliert.
Die CD90.2 negativen Milzzellen wurden als SAPC definiert. Zur Inhibition der
Proliferation wurden die Zellen anschließend in cRPMI aufgenommen und mit
Mitomycin C in einer finalen Konzentration von 100 µg/ml für 30 min bei 37 °C inkubiert
und nach dreimaligen Wachen mit PBS in dem entsprechenden Zellkulturmedium
aufgenommen.
3.7.5
Isolation von Lymphozyten aus der Lamina propria
Im Rahmen der Colitis-Versuche erfolgte eine Analyse der infiltrierten Lymphozyten der
Lamina propria (LPL) des Colons. Die in dem folgenden Protokoll angegebenen
Volumen beziehen sich auf die
LPL Isolation pro Maus. Dazu wurde ein zuvor
vermessener Abschnitt des Colons mit PBS gespült, zerkleinert, in 20 ml PBS/EDTA
aufgenommen und für 15 min, RT, 500 U/Min auf einem Kreisschüttler inkubiert. Die
Gewebsbestandteile wurden abzentrifugiert (1 min, 300 g), der Überstand verworfen
und das Pellet erneut in PBS/EDTA aufgenommen und nochmals, wie zuvor
beschrieben, inkubiert. Nach dem die Gewebsstücke abzentrifugiert worden waren und
der Überstand verworfen worden war, erfolgten zwei Waschschritte in cRPMI. Die
Colonstücke wurden zum Verdau des Gewebeverbandes in 10 ml Kollagenasemedium
aufgenommen und für 90 min, bei 37 °C und 500 U/min inkubiert. Die Gewebslösung
wurde anschließend durch mehrmaliges Aufziehen in eine 30 ml Spritze zerkleinert, mit
Hilfe eine Spritzenkolbens durch ein 100 µm Zellsieb gerieben und mit cRPMI gespült.
Nach einem Zentrifugationsschritt (10 min, 240 g, RT) wurden die vereinzelten Zellen
45
Material und Methoden
in 5 ml 36 % Percoll-Lösung aufgenommen und auf 5 ml 90 % Percoll-Lösung
überschichtet. Die Zentrifugation für 25 min bei RT erfolgte bei 1200 g und deaktivierter
Bremse. Die Lymphozyten, welche sich in der Interphase befanden, wurden geerntet
und zweimal mit cRPMI gewaschen (5 min, 370 g, RT). Die Zellen wurden in PBS/BSA
aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Die Zellzahl wurde ins Verhältnis zu der
Länge des Colonstückes gesetzt.
3.8
3.8.1
T-Zell-Stimulation und T-Zellkulturen
T-Zell-Stimulation
Die Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen unter homöostatischen Bedingungen, d.h.
ohne
polarisierende
Zytokine,
durch
LSEC,
LAPC
bzw.
SAPC
erfolgte
antigenspezifisch. Dazu wurden die antigenpräsentierenden Zellen aus WT Mäusen
und die naiven CD4+ T-Zellen aus OTIIxB6PL Mäusen isoliert. Die Kultivierung von
1x106/ml APC und 5x105/ml naiven CD4+ T-Zellen erfolgte in cRPMI unter der Zugabe
von 5 µg/ml OVA-Peptid für 6 Tage bei 37°C und 5 % CO2. Am Tag 3 wurde bei den
Kulturen mit LSEC 1/3 des ursprünglichen Kulturvolumens an cRPMI hinzu pipettiert;
die Kulturen mit LAPC bzw. SAPC wurden hingegen 1:3 gesplittet. Die so aktivierten TZellen wurden als TLSEC, TLAPC bzw. TSAPC bezeichnet.
Die Aktivierung von naiven CD4+ T-Zellen unter entzündlichen Bedingungen, d.h. unter
der Zugabe von Th1 polarisierenden Zytokinen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAk) durch LSEC
bzw.
SAPC
erfolgte
entweder
antigenspezifisch
oder
polyklonal.
Für
die
antigenspezifische Stimulation wurden die antigenpräsentierenden Zellen aus WT
Mäusen und die naiven CD4+ T-Zellen aus OTIIxB6PL Mäusen isoliert. Die Kultivierung
von 1x106/ml APC und 5x105/ml naiven CD4+ T-Zellen erfolgte unter der Zugabe von 5
µg/ml OVA-Peptid in Th1-Medium für 4 Tage bei 37°C und 5 % CO2. Für die
polyklonale Stimulation wurden die antigenpräsentierenden Zellen und die naiven CD4+
T-Zellen aus WT Mäusen isoliert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte wie oben
beschrieben, nur wurde anstelle des OVA-Peptids mit 1 µg/ml anti-CD3 und 0,5 µg/ml
anti-CD28 mAk stimuliert. Die so aktivierten Th1-Zellen wurden als Th1LSEC bzw.
Th1SAPC bezeichnet.
46
Material und Methoden
Für die Reaktivierung von Th1-Zellen durch LSEC, LAPC bzw. SAPC wurden zunächst
5x105/ml naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch unter entzündlichen Bedingungen, d.h.
der Zugabe von Th1 polarisierenden Zytokinen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAk) in Th1Medium mit 1x106/ml SAPC in cRPMI für 6 Tage bei 37 °C bei 5 % CO2 kultiviert. Die
toten Zellen wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt und 5x105/ml
vitale Th1 Zellen mit 1x106/ml LSEC, LAPC bzw. SAPC und OVA-Peptid in cRPMI für
3d bei 37 °C und 5 % CO2 reaktiviert. Die so reaktivierten Th1-Zellen wurden als
Th1LSEC, Th1LAPC bzw. Th1SAPC bezeichnet.
Am Ende der Kultur wurden die Zellen geerntet, in PBS/BSA gewaschen und direkt zur
durchflusszytometrischen Analyse verwendet. Die Zellen für in vivo Experimente
wurden zunächst mit Hilfe einer Dichtegradientenzentrifugation von den toten Zellen
abgetrennt. Dazu wurden die Zellen in PBS/BSA aufgenommen, auf eine 17 %
Nycodenz-Lösung überschichtet und zentrifugiert (10 min, 840 g, ohne Bremse, RT).
Die Interphase mit den lebenden Zellen wurde geerntet, zweimal mit PBS gewaschen,
in PBS aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.
Um den Einfluss von Retinolsäure auf die Expression der Homingrezeptoren zu
untersuchen, erfolgte die Kultivierung der Zellen zusätzlich in der Anwesenheit von 1
µM Retinolsäurerezeptorantagonist LE540 (Iwata, Hirakiyama et al. 2004).
Um den Einfluss von IL-27 zu analysieren, wurden die Kulturen in der Anwesenheit von
anti-IL-27p28 Antikörper durchgeführt.
Um einen Einfluss von ICOS-ICOS-Ligand Interaktionen beobachten zu können,
erfolgte eine Kultivierung mit naiven CD4+ T-Zellen, welche aus ICOSkoxOTII Mäusen
isoliert wurden.
Um den Einfluss von Notch-Rezeptor-Signalen zu analysieren, wurden die Zellen unter
der Zugabe von γ-Sekretase Inhibitor X oder Dimethylsulfoxid (DMSO) als
Lösungsmittelkontrolle, anti-Dll1 mAk und anti-Dll4 mAk in den angegebenen
Konzentrationen kultiviert. In diesem Kontext erfolgte alternativ eine Kultivierung mit
naiven CD4+ T-Zellen, welche aus Notch1/2 Rezeptor knockout Mäusen isoliert
wurden.
47
Material und Methoden
3.8.2
In Vitro Suppressionsassay
Für die Analyse der suppressiven Kapazität von T-Zellen wurden in vitro Suppressionsassays durchgeführt. Dabei wurden 1x106/ml CFDA-SE-markierte naive CD8+ T-Zellen
als responder-Zellen mit 4x105/ml SAPC kokultiviert und polyklonal mit 2 µg/ml antiCD3 mAk stimuliert. Als suppressorische Effektorzellen wurden entweder ex vivo
isolierte Treg als Positivkontrolle, in vitro generierte TLSEC oder naive CD4+ T-Zellen als
Negativkontrolle in einer Zellkonzentration von 1x106/ml, im Verhältnis 1:1 zu den CD8+
T-Zellen eingesetzt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte für 3 Tage bei 37 °C und 5 %
CO2. Am Ende der Kultur wurden die Zellen geerntet, in PBS/BSA gewaschen und
direkt
zur
durchflusszytometrischen
Analyse
verwendet.
Die
Analyse
des
Zellkulturüberstandes erfolgte ohne vorherige Restimulation der Zellen.
3.9
Restimulation und Fixierung
Die Zellkulturen wurden mit PMA (10 ng/ml) und Ionomycin (1 µg/ml) in cRPMI in einer
Konzentration von max. 4x106 Zellen /ml für 6 h im Brutschrank inkubiert. Nach 1 h
wurden die Sekretionshemmer Brefeldin A (5 µg/ml) und Monensin (1x) zugegeben.
Nach der verbleibenden Stimulationszeit wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen
und in einer Konzentration von 5x106 Zellen /ml mit 0,5 µl/ml PBS eines fixierbaren
Lebend/Tot-Farbstoffes (Fixable Viability Dye eFluor 780) für 30 min bei 4 °C markiert.
Tote Zellen binden verstärkt den Farbstoff auf der Zelloberfläche und erlauben bei der
durchflusszytometrischen Messung der Zellen, auch nach der Fixierung und
Permeabilisierung, eine Diskriminierung zwischen ursprünglich lebenden und toten
Zellen. Nach der Markierung wurden die Zellen mit PBS/BSA gewaschen (300 g, 8 min,
4 °C), in PBS/BSA aufgenommen und zusätzlich mit dem einfachen Volumen einer 4 %
PFA-Lösung versetzt und für 30 min bei 4 °C fixiert. Die Zellen wurden anschließend
zweimal mit PBS/BSA gewaschen, resuspendiert und bis zur intrazellulären Färbung
bei 4 °C gelagert.
48
Material und Methoden
3.10
3.10.1
Durchflusszytometrie
Prinzip, Messung und Auswertung
Zellen lassen sich aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften, wie Granularität und
Größe, durch Markierung mit fluorochromgekoppelten Antikörpern in Abhängigkeit der
Expression von intrazellulären Proteinen oder Oberflächenmolekülen und durch die
Expression von fluoreszenten Proteinen mit Hilfe eines Durchflusszytometers
(fluorescence activated cell sorting, FACS) charakterisieren. Eine ausführliche
Beschreibung der zugrunde liegenden Prinzipien erfolgte anderweitig (Radbruch 2000).
Die durchflusszytometrische Analyse der Zellen in dieser Arbeit erfolgte am
FACSCanto II (BD, Heidelberg). Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Analyse von
Vorwärtstreulicht (FSC; Größe), Seitwärtsstreulicht (SSC; Granularität) und acht
Fluoreszenzparametern und besitzt dafür drei Laser zur Anregung von Fluorochromen
(Violett: 405 nm, Blau: 488 nm, Rot: 633 nm). Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der
Software FlowJo (Tree Star Inc.). Zur Kontrolle wurden Proben gemessen, die alle
Fluorochrome bis auf das zu analysierende Fluorochrom enthielten und dadurch unter
Berücksichtigung des spektralen Hintergrunds der anderen Fluoreszenzen die korrekte
Setzung eines Analysefensters (Gate) für Zellen ermöglichte. Zelltrümmer, tote Zellen
und Dubletten wurden über FSC und SSC und Propidiumiodid- bzw. Fixable Viability
Dye-Analysefenster ausgeschlossen. Die Ergebnisse der Datenanalyse wurden
entweder als geometrischer Mittelwert der Fluoreszenzintensität (gMean) oder als
prozentualer Anteil der positiven Zellen für den untersuchten Parameter im Histogramm
oder im Dot Plot dargestellt.
3.10.2
Fluoreszenzmarkierung von Oberflächenmolekülen
Die durchflusszytometrische Analyse von Oberflächenmolekülen basiert auf der
Expression von spezifischen, mit Fluorochrom-markierten Antikörpern detektierbaren
Molekülen auf der Zelloberfläche. Der Antikörper bindet spezifisch an das zu messende
Molekül. Für die Markierung wurden ca. 1x106 Zellen in 100 µl PBS/BSA aufgenommen
und mit einem anti-CD16/CD32 mAk (25 µg/ml) , sowie weiteren Antikörpern in vorher
austitrierter Konzentration für 10 min bei 4 °C inkubiert. Für die Markierung von P-Lig
49
Material und Methoden
wurde eine Maus P-Selektin/Mensch-IgG Fc-Chimäre eingesetzt. Die Bindung des
Liganden-Konstrukts erfolgte Calcium- und Magnesiumabhängig und wurde in
HBSS/BSA durchgeführt. Über einen PE-markierten anti-Mensch IgG Antikörper
erfolgte anschließend die Fluoreszenzmarkierung der Zellen. Zur Detektion von
apoptotischen Zellen wurde eine Zellsuspension mit Annexin V markiert, welches an
Phosphadidylserin auf der Zelloberfläche von apoptotischen Zellen bindet. Die Bindung
von Annexin V ist ebenfalls Calcium abhängig und wurde in Annexin V-Färbepuffer
durchgeführt. Die Zellen wurden dazu für 15 min bei RT inkubiert.
Ungebundene Antikörper/Konjugate wurden durch Waschen in PBS/BSA, HBSS/PBS
bzw. Annexin V-Färbepuffer entfernt (300 g, 8 min, 4 °C) und die Zellen anschließend
in
dem
entsprechenden
Puffer
aufgenommen
und
bis
zur
Analyse
im
Durchflusszytometer bei 4 °C aufbewahrt. Unmittelbar vor der Messung wurde für die
Diskriminierung zwischen lebenden und toten Zellen der Nukleinsäure-spezifische
Farbstoff Propidiumiodid hinzugegeben. Da dieses Molekül spezifisch tote Zellen
anfärbt, können diese später von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Tote
und nekrotische Zellen binden unspezifisch Antikörper und können dadurch ein falschpositives Signal liefern.
3.10.3
Intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung
Die Analyse von intrazellulären Molekülen erfolgt nachdem die Zellen mit dem
Emergenz Saponin permeabilisiert worden sind, um das Eindringen der Antikörper in
die Zelle zu ermöglichen.
Um Zytokine in T-Zellen anfärben zu können, müssen diese zunächst restimuliert und
fixiert werden (siehe Abschnitt 3.9). Die Zellen wurden anschließend in einem SaponinFärbepuffer aufgenommen und 5 min bei RT inkubiert und durch Zentrifugation
pelletiert. Die Zellen wurden gelöst und mit den Fluorochrom-markierten Antikörpern,
verdünnt in Saponin-Färbepuffer, für 15 min bei 4°C markiert. Die Blockade von
unspezifischen Antikörperbindungen erfolgte durch Zugabe von Ratten IgG (1 µg/ml).
Die Zellen wurden zweimal in Saponin-Färbepuffer gewaschen, in PBS/BSA
aufgenommen und bis zur Analyse im Durchflusszytometer bei 4 °C aufbewahrt.
50
Material und Methoden
Die Fixierung, Permeabilisierung und Markierung der Transkriptionsfaktoren FoxP3 und
Helios erfolgte in einen entsprechenden Puffer-System (FoxP3 Staining Kit,
eBioscience) nach Herstellerangaben. Die Zellen wurden für 30 min bei RT mit den
entsprechenden Antikörperlösungen inkubiert, gewaschen, in PBS/BSA aufgenommen
und bis zur Analyse im Durchflusszytometer bei 4 °C aufbewahrt
3.10.4
Analyse der Proliferation von T-Zellen
Die Proliferation von T-Zellen lässt sich durch Markierung mit 5-,6-Carboxyfluoresceindiacetat-succinimidylester (CFDA-SE) oder CellTrace Violet bestimmen. CFDA-SE ist
eine farblose Substanz, von der nach passiver Aufnahme in die Zelle im Zytoplasma
durch zelleigene Esterasen die Azetatgruppen abgespalten werden. Dadurch entsteht
grün
fluoreszierender
Carboxyfluorescein
succinimidylester
(CFSE),
dessen
Estergruppen mit intrazellulären Aminen reagieren und der somit in der Zelle
zurückbehalten wird. Bei der Zellteilung wird der Farbstoff zu gleichen Teilen auf die
Tochterzellen verteilt. Dadurch lässt sich die Proliferation der Zellen durch Analyse im
Durchflusszytometer beobachten. Für die Markierung wurden die Zellen in einer
Konzentration von 1x107 Zellen /ml PBS aufgenommen und mit CFDA-SE gelöst in
DMSO in einer finalen Konzentration von 1,6 µM für 2 min bei RT inkubiert. Die
Reaktion wurde durch Zugaben von cRPMI abgestoppt, die Zellen zweimal mit cRPMI
gewaschen und für die weiteren Experimente in dem entsprechenden Zellkulturmedium
aufgenommen.
Die Markierung mit CellTrace Violet basiert auf der kovalenten Bindung eines
fluoreszierenden Farbstoffes an alle freien Aminogruppen auf der Zelloberfläche und
des Zellinneren. Bei jeder Zellteilung wird der Farbstoff zu gleichen Teilen auf die
Tochterzellen verteilt. Die Analyse erfolgt wie bei CFDA-SE im Durchflusszytometer.
Zur Markierung wurden 1x106 Zellen in 1 ml PBS aufgenommen und mit 1 µl/ml der
Farbstofflösung für 20 min bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von
cRPMI abgestoppt, die Zellen zweimal mit cRPMI gewaschen und für die weiteren
Experimente in dem entsprechenden Zellkulturmedium aufgenommen.
51
Material und Methoden
3.11
Reverse Transkriptase-PCR
3.11.1
RNA Extraktion
Die Isolation der RNA erfolgte mit Hilfe des RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen). Dazu
wurden max. 1x107 Zellen abzentrifugiert (300 g, 4°C, 8 min) und in 350 µl
Zelllysepuffer aufgenommen. Die lysierten Zellen wurden entweder direkt zur Isolation
der RNA weiter verwendet oder bei -20°C gelagert. Die Suspension wurde
anschließend über eine QIAshredder Säule gegeben und damit die Zellen zerkleinert
und die Lösung von Zelltrümmern befreit. Die weiterfolgende Aufarbeitung erfolgte
gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die abschließende Elution der mRNA von der
Säule erfolgte mit RNase-freiem PCR-Wasser (Bioline). Die RNA-Konzentration der
Lösung wurde am Spektralphotometer NanoDrop gemessen und diese direkt mittels
des High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit in cDNA transkribiert oder bei -80°C
gelagert.
3.11.2
Reverse Transkription
Die reverse Transkription von RNA in complementary DNA (cDNA) wurde mit Hilfe des
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit unter der Zugabe von RNase Inhibitor
durchgeführt. Die Zusammensetzung des Ansatzes ist der Tabelle 6 entnehmen. Die
Reaktion erfolgte nach dem in Tabelle 7 aufgeführten Programm im Thermocycler T
3000 (Biometra).
Tabelle 6: Pipettieransatz reverse Transkription
Volumen (40 µl total)
Reagenz
4 µl
10x RT Puffer
4 µl
10x RT Random Primer
52
Material und Methoden
1,6 µl
25x dNTP Mix
2 µl
Multiscribe TM Reverse Transcriptase
2 µl
RNase Inhibitor
6,4 µl
RNase-freies Wasser
20 µl
RNA
Tabelle 7: Programm reverse Transkriptase PCR
Dauer
Temperatur
10 min
25 °C
120 min
37 °C
5 min
85 °C
∞
4 °C
3.12
3.12.1
Real-time PCR
Prinzip, Messung und Auswertung
Die Quantifizierung einer definierten RNA kann nach cDNA Synthese innerhalb einer
real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter der Verwendung von spezifischen
Primern erfolgen. Dabei wird mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes, der mit der
doppelsträngigen DNA des Produktes interkaliert, die Zunahme der Fluoreszenz über
einen Zeitraum erfasst (Higuchi, Fockler et al. 1993, Gibson, Heid et al. 1996). Die
Messung der Fluoreszenz erfolgt jeweils am Ende eines Zyklus, während der
Elongation. Der Anstieg der gemessenen Fluoreszenzintensität mit jedem neuen PCRZyklus steht im direkten Verhältnis zur PCR-Produkt-Akkumulation. Über die Software
wird die gemessene Fluoreszenz gegen die Zyklenzahl dargestellt. In Abhängigkeit von
53
Material und Methoden
der vorhandenen Menge an Ziel-DNA unterscheiden sich in der exponentiellen Phase
der PCR die Fluoreszenzsignale signifikant von den Hintergrundsignalen. Diese
Schwelle wird von der Software als CT-Wert definiert und für die relative
Quantifizierung verwendet. Der CT-Wert ist dabei umso kleiner, je höher die Menge an
Ziel-DNA in der Probe ist.
Die Spezifität der Amplifikation wird gewährleistet, indem im Anschluss eine
Schmelzkurvenanalyse durchgeführt wird, dabei wird die DNA durch kontinuierliche
Temperaturerhöhung
aufgeschmolzen.
Abhängig
von
der
Länge
und
Nukleinsäuresequenz des spezifischen Produktes denaturiert der Doppelstrang bei
einer spezifischen Temperatur in zwei Einzelstränge und der Fluoreszenzfarbstoff wird
freigesetzt.
In
dieser Arbeit
erfolgte
die
real-time
PCR
mit
Hilfe
des
SYBR
Green
Fluoreszenzfarbstoffes. Die Messung wurde am Real-time PCR System StepOnePlus
TM
(beides Applied Biosystems) durchgeführt und die Auswertung erfolgte mittels der
Geräte-spezifischen Software.
Als Referenzgen wurde bei allen Versuchen entweder UbcH5B (ubiquitin-conjugating
enzyme E2D2, UBC) oder β-Aktin gemessen. Die Berechnung der relativen Expression
erfolgte nach der folgenden Formel:
Relative Expression = 2^(CT Referenzgen – CT Zielgen).
3.12.2
Durchführung der SYBR Green real-time PCR
Für die real-time PCR wurde der SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)
verwendet. Die Zusammensetzung des PCR-Ansatzes ist in Tabelle 8 aufgeführt. Die
Messung erfolgte im StepOnePlus TM nach dem in Tabelle 9 aufgelisteten Programm.
Tabelle 8: Pipettieransatz real-time PCR
Volumen (12,5 µl total)
Reagenz
6,25 µl
SYBR Green PCR Master Mix 2x
54
Material und Methoden
0,5 µl
forward Primer
0,5 µl
reverse Primer
3,25 µl
PCR Wasser
2 µl
cDNA
Tabelle 9: Programm real-time PCR
Zyklus
Zeit / Temperatur /
Anzahl
Temperaturanstieg
Denaturierung
95 °C; 10 min; max.
1
Amplifikation
95 °C, 15 s; max.
40
60-62 °C *, 15 s, max.
72 °C, 30 s, max.
einzelne Messung
Schmelzkurve
95 °C, 15 s, max.
1
60 °C, 1 min, max.
95 °C, 15 s, 0,3 °C/s
Kontinuierliche Messung
Abkühlen
25 °C, ∞, max.
* Annealing-Temperatur ist Primer-spezifisch (siehe Tabelle 1)
55
1
Material und Methoden
3.13
Cytometric Bead Assay
Für die Quantifizierung von Zytokinen im Zellkulturüberstand wurde der Cytometric
Bead Assay (CBA) verwendet. Das Prinzip dieser Methode basiert auf Partikeln, mit
unterschiedlicher Eigenfluoreszenz, die mit einem spezifischen, gegen das Zytokin
gerichteten Antikörper markiert sind. Wenn man nun Zytokine mit den Partikeln
inkubiert,
binden die Antikörper das im Überstand vorhandene Zytokin auf ihrer
Oberfläche. Im nächsten Schritt erfolgt die Zugabe eines Fluoreszenz-markierten
Antikörpers, der erneut gegen das Zytokin gerichtet ist. Die Intensität des zweiten
Fluoreszenzsignals steht in Korrelation zu der Konzentration des zu messenden
Zytokins. Für die exakte Quantifizierung wird eine Standardreihe mit definierter
Konzentration für das einzelne Zytokin durchgeführt. Anhand der Eichkurve kann nun
die Konzentration des Zytokins im gemessenen Zellüberstand berechnet werden. Die
Messung der Partikel erfolgte im Durchflusszytometer FACSCantoII (BD) und die
Auswertung erfolgte mit der Software FCAP Array
TM
Software (BD) bzw. FlowCytomix
Pro (eBioscience).
In dieser Arbeit wurden das Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit (BD) und
das Mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13 plex Kit FlowCytomix (eBioscience) verwendet. Die
Durchführung des Tests erfolgte gemäß dem jeweiligen Protokoll des Herstellers.
3.14
3.14.1
Tierexperimentelle Methoden
Zelltransfer durch intravenöse Injektion
Zur Erweiterung der Gefäße wurden die Mäuse zunächst unter einer Infrarotlampe
erwärmt und dann in einer abgedunkelten Vorrichtung fixiert. Die Zellinjektion erfolgte
mit einer 1 ml Spritze und einer 30G Kanüle intravenös (i.v.) in eine der
Schwanzvenen. Pro Tier wurden maximal 200 µl einer Zellsuspension (Zellen in PBS)
bzw. Antikörperlösung gespritzt.
56
Material und Methoden
3.14.2
In vivo Migration von CD4+ T-Zellen
Um die Migration von CD4+ T-Zellen in vivo zu untersuchen, wurden Homingassays
durchgeführt. Dazu wurden die Zellen in einer Zelldichte von 2x107/ml cRPMI mit
51
Chrom (20 μCi/ml) für 1 h bei 37 °C radioaktiv markiert. Nach zweimaligem Waschen
mit cRPMI wurden die Zellen für 1 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert und anschließend
die toten Zellen mittels eines 17 % Nycodenzgradienten entfernt.
Die radioaktiv markierten Zellen wurden in einer Zelldichte von 1x106/200 μl PBS i.v. in
die Mäuse gespritzt. Mit Hilfe eines WIZARD® Gamma-Counters wurde die in
bestimmten Organen, Blut und dem Restkörper enthaltene Radioaktivität gemessen.
Der angegebende Prozentsatz organspezifischer Radioaktivität, im Verhältnis zur
gesamten detektierten Radioaktivität, stellt den prozentualen Anteil von CD4+ T-Zellen
dar, die in das entsprechende Organ migriert waren.
3.14.3
Transfercolitis
Der Mausstamm B6.129S7-Rag1tm1
Mom
besitzt keine reifen B- und T-Zellen. Für die
Induktion der Colitis wurden 1x106 naive CD4+ T-Zellen (CD4+CD62Lhigh; WT) in ca. 12
Wochen
alte
Empfängertiere
dieses
Mausstammes
i.v.
injiziert.
Um
inflammatorische Potential von TLSEC zu testen, wurden alternativ 1x10
6
das
TLSEC
transferiert bzw. zur Analyse der suppressiven Kapazität der TLSEC Zellen, wurden
zusätzlich
zu
den
naiven
CD4+
T-Zellen
1x106
TLSEC
ko-transferiert.
Der
Gesundheitszustand der Tiere wurde regelmäßig überprüft. Erste Anzeichen einer
Colitis zeigten sich durch Gewichtsabnahme, Veränderung der Stuhlbeschaffenheit
bzw. Detektierbarkeit von Blut im Stuhl. Zur Analyse des Krankheitsverlaufs wurde die
durchschnittliche Gewichtsänderung gegenüber dem Ausgangswert aufgetragen.
Zusätzlich wurde der durchschnittliche klinische Score ermittelt, der sich aus den oben
genannten Parametern zusammensetzt und sich, wie in Tabelle 10 aufgeführt,
errechnet.
57
Material und Methoden
Tabelle 10: Scoringübersicht Klinischer Score der Colitis
Punkte
Gewichtsverlust
Stuhlbeschaffenheit
Rektale Blutung
0
0%
Geformt
Negativer HemoCARE
1
<5%
2
5 – 9,9 %
Breiig
Positiver HemoCARE
3
10 – 20 %
4
> 20 %
Flüssig
Negativer HemoCARE
3.14.4
Die
Delayed type hypersensitivity-Model
Hypersensitivitätsreaktion
vom
verzögerten
Typ
(DTH,
delayed
type
hypersensitivity) ist ein Entzündungsmodell, welches durch Th1 Zellen vermittelt wird.
Dazu wurden 5x105 OVA-TCR transgene in vitro differenzierte Th1 Zellen i.v. in WT
Empfängertiere transferiert. Nach 24 h wurde die DTH durch die subkutane (s.c.)
Injektion von 250 ng OVA-Peptid in inkompletten Freund´schen Adjuvants (IFA; IFA 1:1
mit PBS) in eine Fußsohle ausgelöst. In den Kontrollfuß wurde ausschließlich PBS in
IFA injiziert. Um die suppressive Kapazität der Th1LSEC Zellen zu testen, wurden jeweils
5x105 Th1 Zellen zusammen mit 5x105 Th1LSEC bzw. Th1SAPC ko-transferiert. Um das
von den T-Zellen sezernierte IL-10 zu blockieren, wurde einigen Tieren zeitgleich mit
dem Zelltransfer 1 mg eines anti-IL-10 Rezeptor Antikörpers bzw. entsprechenden
Kontrollantikörpers (Ratten IgG1k) i.v. gespritzt. Die DTH wurde anhand der
Fußsohlenschwellung detektiert und über einen Zeitraum von 7 Tagen verfolgt. Die
Fußsohlenschwellung wurde mit einem Oditest Dickenmesser bestimmt.
3.15
Histologie
In Kooperation mit dem Serviceprojekt Z1 des SFB633 unter Leitung von Dr. Anja Kühl
wurden die immunhistologischen und -pathologischen Analysen dieser Arbeit durch die
Arbeitsgruppe von Dr. Anja Kühl durchgeführt.
58
Material und Methoden
3.15.1
Immunfluoreszenz
Zur Analyse der Expression des Notch-Liganden Dll4 wurden von kryokonserviertem
Lebergewebe am Microtom (Microm HM 325) 5 µm Schnitte angefertigt, mit Aceton
fixiert, mit einem Ratte-anti-Maus CD146 Antikörper (Biolegend) und anschließend mit
einem AF488-markierten Affe anti-Ratte Sekundärantikörper (Dianova) inkubiert.
Daraufhin wurden die Schnitte mit einem Hamster anti-Maus Dll4 Antikörper
(Biolegend) und nachfolgend mit einem AF647 –markierten Ziege anti-Hamster
Sekundäranikörper
(Dianova)
inkubiert.
Vor
der
Markierung
mit
den
Sekundärantikörpern erfolgte eine Blockierung mit 10% Affen- bzw. Ziegenserum
(Dianvova). Die Zellkerne wurden mit DAPI (Roche) angefärbt, die Schnitte mit
Fluoromount (Biozol) überzogen und mit Hilfe des AxioImager Z1 Mikroskop (Carl
Zeiss MicroImaging, Inc., Jena) analysiert.
3.15.2
Immunpathologie
Zur Bewertung des Grades der Entzündung des Colons bei der Colitis wurden
histologische Analysen durchgeführt. Dazu wurden ca. 1 cm lange Colonabschnitte mit
PBS gespült und in 4 % PFA über Nacht fixiert und in Paraffin eingebettet. Am
Microtom wurden 2 μm Paraffinschnitte angefertigt. Diese Schnitte wurden daraufhin
durch Xylol entparaffiniert, durch eine absteigende Alkoholreihe rehydriert und mit
Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die Bilder wurden mittels eines AxioImager Z1 Mikroskop
generiert sowie mit der Axiovision Software prozessiert. Die Bewertung der Bilder
erfolgte geblindet wie durch die Gruppe Kühl beschrieben (Erben, Loddenkemper et al.
2014).
Zur Quantifizierung der T-Zellinfiltrate wurden die entparaffinierten Schnitte gekocht
und damit die bei der Fixierung entstehenden Quervernetzungen zwischen
verschiedenen Gewebeantigenen entfernt und die Antigene für Antikörper wieder
zugänglich gemacht. Die Schnitte wurden zunächst mit einen anti-Maus CD4 mAk
(eBioscience) und anschließend mit einem biotinylierten Kaninchen anti-Ratte
Antikörper (Dianova) markiert. Zur Detektion wurde das Kit Dako REAL™ Detection
System LSAB+ AP/RED (Dako) verwendet. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin
angefärbt und die Schnitte mit Glyceringelatine-Lösung (Merck Millipore) überzogen.
59
Material und Methoden
Als Negativkontrolle wurden Schnitte wie oben beschrieben behandelt, nur ohne
Primärantikörper. Es wurden alle CD4+ Zellen pro Gesichtsfeld (high power field, HPF,
0.237 mm2) und 10 HPF pro Colonprobe geblindet ausgezählt. Der Mittelwert wurde als
CD4+/HPF angegeben.
3.16
Statistische Datenanalyse
Die Auswertung der Daten erfolgte mit den Programmen Excel (Microsoft) und Prism
(GraphPad Software, Inc.). Für die statistische Analyse wurde ein Mann-Whitney-Test
durchgeführt. Die Berechnung erfolgte mit Hilfe der Software Prism.
60
4.
61
Ergebnisse
Ergebnisse
4.1
Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter
homöostatischen Bedingungen
Über den Blutstrom zirkulierende CD4+ T-Zellen können langanhaltend und wiederholt
mit den Endothelzellen des Lebersinusoids interagieren (Carambia, Frenzel et al.
2013). Die LSEC als nicht-klassische antigenpräsentierende Zellen exprimieren MHCII
Moleküle und können CD4+ T-Zellen aktivieren (Kruse, Neumann et al. 2009). Nun
stellte sich die Frage in wieweit LSEC die funktionellen Eigenschaften der aktivierten
CD4+ T-Zellen beeinflussen können.
4.1.1
LSEC induzieren einen Darm-Homingphänotyp bei CD4+ T-Zellen
Neben der Aktivierung von CD4+ T-Zellen können APC bestimmte Homingrezeptoren
auf den T-Zellen induzieren, die die Migration der Zellen in distinkte Gewebe oder den
Ort einer Entzündung ermöglichen (Dudda, Lembo et al. 2005, Huehn and Hamann
2005). Hier wurde untersucht, ob LSEC im Vergleich zu den anderen APC in der Leber
(LAPC) und Milz (SAPC) ein spezifisches Muster an Homingrezeptoren auf den TZellen induzieren. Dazu wurden naive antigenspezifische CD4+ T-Zellen mit den
verschiedenen APC und OVA-Peptid, ohne die Zugabe von polarisierenden Zytokinen,
kultiviert. Anschließend
darmspezifischen
wurde
auf
Homingrezeptoren
den
CD4+
T-Zellen
α4β7-Integrin
und
die
CCR9,
Expression
des
für
der
die
Einwanderung in die Lymphknoten benötigten Homingrezeptors CD62L und des für die
Migration in die Haut und entzündete Gewebe notwendigen Rezeptorliganden P-Lig
durchflusszytometrisch bestimmt.
Naive CD4+ T-Zellen waren vor dem Start der Kokultur hochpositiv für CD62L und
exprimierten kein α4β7-Integrin und CCR9, sowie kein P-Lig (Abbildung 3). Die
Kokultur der naiven CD4+ T-Zellen mit LSEC (TLSEC) bewirkte auf den T-Zellen eine
hohe Expression von α4β7-Integrin, während LAPC (TLAPC) und SAPC (TSAPC) eine
signifikant geringere Expression dieses Rezeptors induzierten (Abbildung 3 A). Eine
ähnliche Verteilung der Expression, wenn auch in geringerem Ausmaß, konnte für
CCR9 ermittelt werden (Abbildung 3 B).
62
Ergebnisse
+
Abbildung 3: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf CD4 T-Zellen.
+
high
CD4 CD62L
T-Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden für 6 d mit LSEC, LAPC oder SAPC
+
aus C57BL/6-Mäusen in Anwesenheit von OVA-Peptids kokultiviert. Naive bzw. aktivierte CD4
T-Zellen wurden mit einem anti-α4β7-Integrin (A), anti-CCR9 (B) oder anti-CD62L Antikörper (C)
markiert. Zur Ermittlung der P-Lig-Expression wurden die Zellen mit einem anti-Maus PSelektin/Mensch-IgG Fc-Chimärenprotein und einem anti-Mensch IgG Fc gefärbt (D). Die Zellen
wurden am Durchflusszytometer analysiert. Es sind repräsentative Histogramme aus 4
unabhängigen Experimenten dargestellt. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie,
+
+
+
+
+
Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile α4β7-Integrin , CCR9 , P-Lig und CD62L CD4 T+
Zellen sind angegeben. Das Gate liegt auf CD4 T-Zellen. * = p < 0,05; ** = p < 0,01 MannWhitney-Test.
63
Ergebnisse
Die Expression von CD62L blieb bei den TLSEC auf einem sehr hohen Niveau, während
bei den TLAPC und TSAPC eine sehr geringe Expression beobachtet wurde (Abbildung 3
C). Entgegengesetzt dazu wurde auf den TLSEC eine niedrige Expression von P-Lig
detektiert, wobei die TLAPC und TSAPC eine sehr hohe Expression des Rezeptors zeigten
(Abbildung 3 D).
Die Ergebnisse belegen, dass von LSEC aktivierte CD4+ T-Zellen, im Gegensatz zu
TLAPC und TSAPC, die darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9
exprimierten. LAPC und SAPC hingegen induzierten auf CD4+ T-Zellen viel P-Lig.
4.1.2
LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ und
keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen
Nach der Untersuchung der Homingrezeptoren auf CD4+ T-Zellen, welche durch
verschiedene
APC
Populationen
aktiviert
wurden,
sollte
die
Expression
entzündungsspezifischer Zytokine ermittelt werden. Dazu wurden Kokulturen von
naiven antigenspezifischen CD4+ T-Zellen und den verschiedenen APC ohne die
Zugabe von polarisierenden Zytokinen durchgeführt und analysiert ob die CD4+ TZellen das pro-inflammatorische IFNγ exprimieren.
TLSEC exprimierten kein IFNγ, während bei TLAPC und TSAPC hohe Frequenzen IFNγ+
CD4+ T-Zellen gemessen wurden (Abbildung 4 A). Interessanterweise war ein Großteil
der TLAPC und TSAPC apoptotisch, was sich in einem hohen gMean für Annexin-V
Bindung wiederspiegelte (Abbildung 4 B). In Kulturen mit LSEC traten kaum
apototische TLSEC auf.
64
Ergebnisse
+
Abbildung 4: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose bei CD4 T-Zellen.
+
high
CD4 CD62L
T-Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden für 6 d mit LSEC, LAPC oder SAPC
+
aus C57BL/6-Mäusen in Anwesenheit von OVA-Peptid kokultiviert. Naive bzw. aktivierte CD4
T-Zellen wurden für 4 h mit PMA/Iono/BrefA restimuliert, fixiert, permeabilisiert und mit einem
anti-IFNγ Antikörper (A) markiert. Zur Ermittlung der apoptotischen Zellen wurden die Zellen mit
einem Annexin-V Konjugat markiert (B). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert.
Es sind repräsentative Histogramme aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt. Ausgefüllte
+
Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie, Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile IFNγ T+
Zellen sind angegeben. Für Annexin-V ist der gMean angegeben. Das Gate liegt auf CD4 TZellen. * = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-Whitney-Test.
4.1.3
TLSEC supprimieren CD8+ T-Zellen in vitro
Die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC führt nicht zur Expression des proinflammatorischen Zytokins IFNγ. Demzufolge wurde untersucht, ob die TLSEC evtl. antiinflammatorische bzw. suppressive Eigenschaften besitzen und diese mit der Kapazität
von ex vivo isolierten regulatorischen T-Zellen (Treg) verglichen. Kollegen aus unserer
Arbeitsgruppe zeigten bereits, dass TLSEC die Proliferation von CD4+ T-Zellen in vitro
supprimierten (Kruse, Neumann et al. 2009). Hier sollte nun die Suppression von CD8+
T-Zellen untersucht werden. Dazu wurden CFDA-SE markierte naive CD8+ T-Zellen in
der Anwesenheit von TLSEC bzw. Treg durch SAPC und anti-CD3 mAk für 3 d aktiviert
und anschließend hinsichtlich ihrer Proliferation und Expression von Effektorzytokinen
65
Ergebnisse
analysiert. CD8+ T-Zellen benötigen für ihre Differenzierung in zytotoxische
Effektorzellen die Hilfe durch CD4+ T-Zellen. Dafür wurden die Kokulturen als
zusätzlichen Kontrollansatz in der Gegenwart von naiven CD4+ T-Zellen durchgeführt.
Die in der Anwesenheit von naiven CD4+ T-Zellen aktivierten CD8+ T-Zellen
proliferierten am stärksten, erkennbar am niedrigsten gMean von CFSE (Abbildung 5
A). Bei den Kokulturen mit TLSEC und Treg wurde hingegen eine signifikant geringere
Proliferation der CD8+ T-Zellen beobachtet (Abbildung 5 B). Bei den Kulturen mit
naiven CD4+ T-Zellen hatten die CD8+ T-Zellen die höchsten Frequenzen an den
Zytokinen IL-2, IFNγ und TNFα (Abbildung 5 B-D). Waren hingegen TLSEC oder Treg in
der Kokultur anwesend, war der prozentuale Anteil an Zytokin-positiven Zellen
signifikant reduziert. Bei der Analyse der Zellkulturüberstände wurden in der
Anwesenheit der naiven CD4+ T-Zellen die höchsten Konzentrationen an IFNγ und
TNFα gemessen (Abbildung 5 E, F). Diese waren reduziert, sobald TLSEC bzw. Treg in
den Kulturen präsent waren.
Zusammenfassend wurde hier gezeigt , dass CD8+ T-Zellen, die durch anti-CD3 mAk
und SAPC aktiviert worden waren, in der Gegenwart von naiven CD4+ T-Zellen stark
proliferierten und eine hohe Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen
aufwiesen. Die Anwesenheit von TLSEC bzw. Treg in den Kokulturen resultierte in einer
signifikant verringerten Proliferation und Expression der Effektorzytokine IL-2, IFNγ und
TNFα der CD8+ T-Zellen. Ein Unterschied zwischen den TLSEC und Treg in den Kulturen
und bei den analysierten Parametern wurde nicht ermittelt, sie wirkten gleichermaßen
suppressiv.
66
Ergebnisse
67
Ergebnisse
+
Abbildung 5: In vitro Suppression von CD8 T-Zellen durch TLSEC.
+
CFDA-SE markierte CD8 CD44 T-Zellen als responder-Zellen wurden mit SAPC für 3 d kokultiviert und polyklonal mit 2 µg/ml anti-CD3 mAk stimuliert. Als suppressorische Effektorzellen
+
wurden entweder ex vivo isolierte Treg, in vitro generierte TLSEC oder naive CD4 T-Zellen als
+
Negativkontrolle im Verhältnis 1:1 zu den CD8 T-Zellen eingesetzt. T-Zellen wurden für 4 h mit
PMA/Iono/BrefA restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IL-2 (B), anti-IFNγ (C) bzw.
anti-TNFα (D) Antikörper markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die Zellüberstände
wurden abgenommen und mittels CBA analysiert (E, F). Prozentuale Anteile Zytokin-positiver
+
+
CD8 T-Zellen sind angegeben. Für die Proliferation CD8 T-Zellen ist der gMean der CFSE
+
Markierung angegeben (A). Das Gate liegt auf CD8 T-Zellen. * = p < 0,05; ** = p < 0,01 MannWhitney-Test.
4.1.4
TLSEC supprimieren eine Colitis in vivo
In den vorhergehenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass in vitro generierte
TLSEC sowohl darmspezifische Homingrezeptoren exprimieren, als auch in der Lage
sind die Aktivierung und Ausbildung von Effektorzytokinen von T-Zellen zu inhibieren.
Nun stellte sich die Frage, ob TLSEC in vivo die Fähigkeit besitzen, eine durch T-Zellen
vermittelte Entzündung im Darm zu supprimieren. Dazu wurde das Transfercolitismodel
verwendet (Powrie, Leach et al. 1993). Rag1-/- Mäuse besitzen keine reifen B- und TZellen. Werden nun naive CD4+ T-Zellen (CD4+CD62Lhigh) i.v. in diese Tiere injiziert, so
findet zum einen eine Autoproliferation der transferierten Zellen statt um das leere
Kompartiment aufzufüllen und zum anderen eine Aktivierung durch Antigene
endogener Bakterien (Übersicht in (Izcue, Coombes et al. 2009)). Beide Faktoren
zusammen bewirken die Ausprägung einer Darmentzündung, die sich durch
Gewichtsverlust, Verkürzung des Colons und massive Infiltration von mononukleären
Zellen in die Lamina propria äußert.
Zum einen wurden naive CD4+ T-Zellen allein in Rag1-/- Rezipienten injiziert - bei
diesen Mäusen sollte die stärkste Ausprägung des Krankheitsverlaufs beobachtet
werden können. Um zu analysieren welchen Einfluss TLSEC auf den Krankheitsverlauf
haben, wurden bei einer Gruppe zusätzlich zu den naiven CD4+ T-Zellen TLSEC kotransferiert. Des Weiteren wurden einer Gruppe an Mäusen TLSEC allein injiziert. In
diesen Tieren sollte beobachtet werden, ob die Eigenschaften der TLSEC stabil sind oder
die Zellen eine Darmentzündung auslösen. Zum Vergleich wurden Mäuse beobachtet,
die keine Zellen erhalten hatten. In diesem Kontext wurde ein initialer Versuch mit je
fünf Mäusen pro Gruppe durchgeführt.
68
Ergebnisse
69
Ergebnisse
Abbildung 6: In Vivo Suppression einer Transfercolitis durch T LSEC.
+
high
-/CD4 CD62L
T-Zellen aus C57BL/6 Mäusen wurden i.v. in Rag1 Mäuse transferiert.
Alternativ bzw. zusätzlich wurden in vitro generierte TLSEC transferiert. Die Gewichtsabnahme
wurde in Relation zum Ausgangsgewicht aufgetragen (A). Der klinische Score errechnete sich
aus Gewichtsabnahme, Stuhlbeschaffenheit und dem Nachweis von okkultem Blut im Stuhl (B).
Nach Versuchsende wurde die Colonlänge bestimmt (C) und der Entzündungsgrad im Colon
(D) immunpathologisch ermittelt. Die Lymphozyten der Lamina propria wurden isoliert (E). Die
Bestimmung der Anzahl der entzündungsauslösenden CD4 Zellen erfolgte mittels
Immunpathologie (F, G). Dargestellt ist ein Experiment mit 5 Tieren pro Gruppe. Statistischer
+
Vergleich in (A) und (B) erfolgte zwischen den Gruppen naive CD4 T-Zellen und Ko-Transfer
+
Naive CD4 T-Zellen + TLSEC. * = p<0,05; ** = p<0,01; Mann-Whitney-Test.
Der größte Gewichtsverlust trat bei den Mäusen auf, die nur naive CD4+ T-Zellen
erhielten (Abbildung 6 A). Beim Ko-Transfer von naiven CD4+ T-Zellen und TLSEC war
der Gewichtsverlust partiell signifikant geringer ausgeprägt. Sowohl die unbehandelten
Tiere, als auch die Tiere, die nur TLSEC erhalten hatten, zeigten keine Veränderung des
Körpergewichtes. Bei den Tieren mit naiven CD4+ T-Zellen wurde der höchste klinische
Score im Vergleich zu allen anderen Gruppen ermittelt (Abbildung 6 B). Vergleichend
dazu zeigte die Gruppe, bei der TLSEC zusammen mit naiven CD4+ T-Zellen kotransferiert wurden, teilweise eine signifikante Reduktion des klinischen Scores. Für die
Gruppen mit den unbehandelten Tieren und dem alleinigen Transfer von TLSEC wurde
der niedrigste klinische Score ermittelt. Die Colonlänge bei Mäusen mit nCD4+ T-Zellen
allein und im Ko-Transfer mit TLSEC war am stärksten verkürzt (Abbildung 6 C). Wurden
TLSEC allein transferiert, so waren die Colonlängen vergleichbar zu den unbehandelten
Tieren. Bei der Analyse des histo-pathologischen Scores im Colon wurden für die
Gruppen mit CD4+ T-Zellen allein oder zusammen mit TLSEC die höchsten Werte
bestimmt (Abbildung 6 D). Die zusätzliche Applikation von TLSEC zu naiven CD4+ TZellen resultierte in keiner Veränderung des Score-Wertes. Die Gruppe der
unbehandelten Mäuse zeigte keine pathologische Veränderung des Colons, während
in den Dickdärmen der TLSEC-Gruppe größtenteils geringe Zellinfiltrate beobachtet
wurden, die mit einem Score-Wert von 1 gewertet wurden. Die Anzahl der isolierten
Lymphozyten aus der Lamina propria (LPL) war bei der Gruppe der nCD4 am höchsten
(Abbildung 6 E). Der Ko-transfer von TLSEC resultierte hier in einer signifikanten
Verringerung der LPL Zahl. Die unbehandelten Mäuse und die Tiere mit TLSEC allein
zeigten die geringsten Zellzahlen an LPL. Bei der Quantifizierung von CD4+ Zellen im
Colongewebe wurden bei den Tieren mit nCD4 die höchste Zahl an CD4+ Zellen
detektiert (Abbildung 6 F, G). Der Ko-Transfer von TLSEC und naiven CD4+ T-Zellen
70
Ergebnisse
resultierte in einer hoch signifikanten Verringerung der Zahl CD4+ Zellen in der Lamina
propria. Für die unbehandelte Gruppe und TLSEC allein konnten nahezu keine CD4+
Zellen im Gewebe gemessen werden.
Zusammengefasst zeigte die Gruppe, die nur naive CD4+ T-Zellen erhalten hatte, den
schwersten Krankheitsverlauf der Dickdarmentzündung. Bei den untersuchten
Parametern Gewichtsverlauf, klinischer Score, LPL Zahl und Anzahl CD4 Zellen im
Gewebe führte der Transfer von TLSEC zusätzlich zu den nCD4 zu einer teilweise
signifikanten Milderung der Pathogenese. Die Colonlänge und der histopathologische
Score waren durch den Ko-transfer der TLSEC
nicht verändert. Der Transfer von
-/-
ausschließlich TLSEC in Rag1 Mäuse löste keine Colitis aus. Die Mäuse dieser Gruppe
verhielten sich weitestgehend wie die unbehandelte Kontrollgruppe.
4.1.5
TLSEC exprimieren regulatorische Markerproteine
Die Suppression unerwünschter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen wird
sowohl durch zellgebundene als auch durch lösliche Faktoren vermittelt. Durch die
Expression
verschiedener
Markerproteine
ist
zudem
eine
Zuordnung
von
regulatorischen Zellen zu beschriebenen, regulatorisch wirkenden T-Zellpopulationen
möglich. TLSEC konnten CD8+ T-Zellen supprimieren und die Pathogenese einer Colitis
reduzieren. In diesem Zusammenhang sollte jetzt untersucht werden, ob TLSEC
charakteristische Marker exprimieren, die im Kontext von regulatorischen T-Zellen
beschrieben sind. Dazu wurden naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch durch LSEC
oder SAPC ohne die Zugabe von polarisierenden Zytokinen in vitro aktiviert und
hinsichtlich der Expression der entsprechenden Proteine durchflusszytometrisch oder
über realtime PCR untersucht.
Die Expression der Transkriptionsfaktoren FoxP3 und Helios durch T reg ist ausführlich
beschrieben (Sakaguchi 2005, Sakaguchi, Yamaguchi et al. 2008, Getnet, Grosso et al.
2010). TLSEC exprimierten im Gegensatz zu TSAPC zu einem hohen Anteil Helios
(Abbildung 7 A). Bei TLSEC war zudem ein kleiner Anteil an FoxP3-positiven Zellen
nachweisbar. Die TSAPC Kultur enthielt nahezu keine FoxP3+ Zellen.
71
Ergebnisse
ENTPD1
(CD39)
ist
im
Zusammenhang
von
regulatorischen
T-Zellen
und
Immunosuppression durch Leukozyten beschrieben worden (Bynoe and Viret 2008,
Hyman, Petrovic-Djergovic et al. 2009). Auf TLSEC wurde eine höhere Expression von
CD39 nachgewiesen, als bei TSAPC (Abbildung 7 B).
Durch die Sekretion von Granzym und Perforin induzieren regulatorische T-Zellen
Apoptose in Zielzellen (Grossman, Verbsky et al. 2004, Gondek, Lu et al. 2005,
Boissonnas, Scholer-Dahirel et al. 2010). Über realtime PCR wurde die relative
Expression von Granzym B und Perforin-1 von naiven CD4+ T-Zellen vor und nach der
antigenspezifischen Aktivierung durch LSEC bzw. SAPC bestimmt und ins Verhältnis
zueinander gesetzt. Bei TLSEC wurde eine signifikant höhere Induktion sowohl der
Granzym B als auch der Perforin-1 mRNA ermittelt, als bei TSAPC (Abbildung 7 C, D).
Die Ergebnisse belegen, dass auf TLSEC die Expression Helios und einem sehr
geringen Anteil von FoxP3 nachzuweisen ist. Ebenso konnte gezeigt werden, dass
TLSEC die Effektormoleküle ENTPD1, Granzym und Perforin in einem größeren Umfang
exprimierten, als TSAPC.
72
Ergebnisse
Abbildung 7: Charakterisierung der suppressiven Eigenschaften der TLSEC.
+
high
CD4 CD62L
T-Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden für 6 d mit LSEC oder SAPC aus
+
C57BL/6 Mäusen in Anwesenheit von OVA-Peptid kokultiviert. Aktivierte CD4 T-Zellen wurden
mit einem anti-ENTPD1 Antikörper (B) markiert, bzw. fixiert, permeabilisiert und mit einem antiHelios und anti-FoxP3 Antikörper (A) markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die
mRNA der T-Zellen wurde isoliert und die Expression von Granzym B (C) und Perforin-1 (D)
über realtime PCR bestimmt. Es sind repräsentative Histogramme bzw. Graphen aus 3
unabhängigen Experimenten dargestellt. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte
+
Linie, Antikörperfärbung. Das Gate liegt auf CD4 T-Zellen. * = p < 0,05 Mann-Whitney-Test.
73
Ergebnisse
4.2
Modulation von CD4+ T-Zellen durch das Lebersinusendothel unter
entzündlichen Bedingungen
Für aktivierte und Effektor/Gedächtnis T-Zellen wurde beschrieben, dass sie vorrangig
in die Leber migrieren um dort moduliert oder deletiert zu werden (Mehal, Juedes et al.
1999, Klugewitz, Blumenthal-Barby et al. 2002, Limmer, Ohl et al. 2005). Hier sollte
nun untersucht werden ob die Modulation von Th1 Zellen durch Lebersinusendothelzellen die migratorischen und inflammatorischen Eigenschaften der T-Zellen
beeinflusst.
4.2.1
LSEC induzieren einen Darmhoming-Phänotyps bei Th1 Zellen
Im ersten Teil dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen, die
unter homöostatischen Bedingungen mit dem Lebersinusendothel interagieren,
darmspezifische Homingrezeptoren hochregulieren. Im folgenden Teil sollte untersucht
werden, welchen Einfluss LSEC auf die Migrationseigenschaften von CD4+
Effektorzellen haben. Dazu wurden in vitro naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch unter
Th1 polarisierendem Bedingungen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAK) für sechs Tage durch
SAPC aktiviert und dann auf LSEC, LAPC bzw. SAPC antigenspezifisch für drei Tage
reaktiviert, ohne dass erneut Zytokine hinzugegeben worden waren. Die Expression
des darmspezifischen Homingrezeptors α4β7-Integrin und des Liganden P-Lig, der für
eine Einwanderung in die Haut und entzündetes Gewebe notwendig ist, wurde nach
Markierung mit den entsprechenden Antikörpern durchflusszytometrisch analysiert.
Die Reaktivierung von Th1 Zellen durch LSEC (Th1LSEC) bewirkte eine sehr starke
Induktion von α4β7-Integrin. Die Kokultur von Th1 Zellen mit LAPC (Th1LAPC) als auch
mit SAPC (Th1SAPC) resultierte hingegen in einer signifikant geringeren Expression von
α4β7-Integrin auf den T-Zellen (Abbildung 8 A). Entgegengesetzt dazu führte die
Rekultur von Th1 Zellen auf LSEC zu einer verringerten P-Lig Expression der T-Zellen,
während bei LAPC und SAPC eine hohe P-Lig Expression detektiert wurde (Abbildung
8 B).
74
Ergebnisse
Abbildung 8: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf Th1 Zellen.
In vitro generierte Th1 Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen für 3 d mit LSEC, LAPC oder SAPC aus
C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid reaktiviert. Die Reaktivierung der Th1
75
Ergebnisse
durch LSEC erfolgte zusätzlich in der An- und Abwesenheit von LE-540 (C, D). Th1 bzw.
reaktivierte Th1 wurden mit einem anti-α4β7-Integrin (A, C) Antikörper markiert. Zur Ermittlung
der P-Lig-Expression wurden die Zellen mit einem anti-Maus P-Selektin/Mensch-IgG FcChimärenprotein und einem anti-Mensch IgG Fc gefärbt (B, D). Die Zellen wurden am
Durchflusszytometer analysiert. Es sind repräsentative Histogramme aus 4 unabhängigen
Experimenten dargestellt. Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie,
+
+
Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile α4β7-Integrin und P-Lig T-Zellen sind angegeben. Das
Gate liegt auf CD4+ T-Zellen. In vitro re-aktivierte Th1LSEC bzw. Th1SAPC wurden radioaktivmarkiert und i.v. in C57BL/6 Mäuse transferiert (E). Radioaktivität der einzelnen Organe wurde
am Wizard Gamma Counter vermessen und ins Verhältnis zu gesamten Radioaktivität des
Körpers gesetzt. Es sind zwei unabhängige Experimente mit je 5 Tieren pro Gruppe dargestellt.
* = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-Whitney-Test.
Es ist beschrieben worden, dass das Vitamin A Metabolit Retinolsäure (RA) ein
wichtiger Faktor für die Induktion von α4β7-Integrin auf T-Zellen ist (Iwata, Hirakiyama
et al. 2004). Vorhergehende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass
LSEC RA zur Verfügung stellen können (Neumann, Kruse et al. 2012). Um zu
Untersuchen, ob die Induktion von α4β7-Integrin auf Th1 Zellen von Retinolsäure
abhängig ist, wurden die oben beschriebenen Kulturen in der Anwesenheit des
Retinolsäurerezeptorinhibitors LE-540 durchgeführt. Dies bewirkte eine verringerte
Expression von α4β7-Integrin (Abbildung 8 C) und eine verstärkte Expression von PLig (Abbildung 8 D) und zeigte die Notwendigkeit des Vorhandenseins von
Retinolsäure für die Ausbildung des darmspezifischen Homingrezeptors α4β7-Integrin
auf Th1LSEC.
Im Anschluss sollte untersucht werden, ob die differentielle Expression der
Homingrezeptoren
auf
Th1LSEC
und
Th1SAPC
einen
Einfluss
auf
deren
Homingeigenschaften hat. Dazu wurden radioaktiv-markierte Th1LSEC bzw. Th1SAPC i.v.
in WT Mäuse transferiert und nach 24 h die verbleibende Radioaktivität in den Organen
im Verhältnis zur gesamten Radioaktivität des Körpers betrachtet. Th1LSEC wanderten
signifikant stärker in mLN, PP, Dünn- und Dickdarmgewebe und Milz ein als Th1SAPC
(Abbildung 8 E). Für die Leber wurde ein vergleichbarer Anteil an eingewanderten
Th1SAPC und Th1LSEC ermittelt.
Die Daten, die in diesem Zusammenhang erhoben wurden, belegen, dass LSEC die
Expression des darmspezifischen Homingrezeptors α4β7-Integrin auf Th1 Zellen in
Abhängigkeit von Retinolsäure induzierten. Die Th1LSEC migrierten daraufhin verstärkt
in das Darmgewebe und das GALT.
76
Ergebnisse
4.2.2
LSEC induzieren kein pro-inflammatorisches Interferon-γ und
keine Apoptose bei Reaktivierung exogen-aktivierter Th1 Zellen
Die
Expression
des
pro-inflammatorischen IFNγ
entscheidendes Effektormolekül bei
der
durch Th1 Zellen
Entstehung
gilt
und dem Verlauf
als
einer
Entzündungsreaktion (Übersicht in (Young and Hardy 1995, Boehm, Klamp et al.
1997)).
Hier
sollte
untersucht
werden,
welchen
Einfluss die
verschiedenen
antigenpräsentierenden Zellen der Leber und der Milz auf die Aufrechterhaltung der
IFNγ Expression bei Th1 Zellen haben. Des Weiteren wurde analysiert, ob die
Reaktivierung von Th1 Zellen durch die entsprechenden APC zur Induktion von
Apotose in den T-Zellen führt. Dazu wurden in vitro naive CD4+ T-Zellen
antigenspezifisch unter Th1 polarisierendem Bedingungen (IL-12, IL-2, anti-IL-4 mAK)
für sechs Tage durch SAPC aktiviert und dann auf LSEC, LAPC bzw. SAPC
antigenspezifisch für drei Tage reaktiviert, ohne dass erneut Zytokine hinzugegeben
worden waren. Die IFNγ Expression in Th1 Zellen wurde durchflusszytometrisch
bestimmt. Durch Bindung von Annexin-V auf der Zelloberfläche erfolgte der Nachweis
von Phosphatidylserin, welches auf pro-apoptotischen Zellen von der zytosolischen
Membranseite auf die Zelloberfläche transportiert wird.
Bei Th1 Zellen, die durch LSEC reaktiviert wurden (Th1LSEC) waren die Frequenzen an
IFNγ Produzenten signifikant gegenüber Th1LAPC und Th1SAPC verringert (Abbildung 9
A). Deren IFNγ Frequenzen unterschieden sich nicht von dem prozentualen Anteil der
IFNγ positiven Zellen vor dem Start der Kokultur. Die Reaktivierung von Th1 Zellen
durch LAPC bewirkte die höchste Intensität der Annexin-V-Markierung und somit die
höchste Dichte von proapoptotischen Phosphadidylserin auf der Zelloberfläche
(Abbildung 9 B). Die Th1LSEC zeigten hingegen die geringste Fluoreszenzintensität
dieser Markierung.
Die Reaktivierung von Th1 Zellen durch LSEC resultiert in einer Verringerung der IFNγ
Expression und in der geringsten Induktion von Apoptose.
77
Ergebnisse
Abbildung 9: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose auf Th1 Zellen.
In vitro generierte Th1 Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen für 6 d mit LSEC, LAPC oder SAPC aus
C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid reaktiviert. Th1 bzw. reaktivierte Th1
wurden für 4 h mit PMA/Iono/BrefA restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IFNγ (A)
Antikörper markiert. Zur Ermittlung der apoptotischen Zellen wurden die Zellen mit einem
Annexin-V Konjugat markiert (B). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert.
Ausgefüllte Kurve, unmarkierte Zellen; verstärkte Linie, Antikörperfärbung. Prozentuale Anteile
+
IFNγ Zellen sind angegeben. Für Annexin-V ist der gMean der Zellen angegeben. Das Gate
+
liegt auf CD4 T-Zellen. Es sind repräsentative Histogramme aus 4 unabhängigen
Experimenten dargestellt.* = p < 0,05; ** = p < 0,01 Mann-Whitney-Test.
4.2.3
LSEC induzieren die Expression des anti-inflammatorischen IL-10
auf Th1 Zellen
Wurden naive CD4+ T-Zellen durch LSEC ohne die Zugabe von polarisierenden
Zytokinen aktiviert, so exprimierten die entstandenen TLSEC kein IFNγ. Wenn Th1
Zellen, die durch APC der Milz aktiviert worden waren, unter homöostatischen
Bedingungen durch LSEC reaktiviert worden, dann erfolgte eine Verringerung der IFNγ
Expression der Th1 Zellen. Nun stellte sich die Frage, wie CD4+ T-Zellen durch LSEC
moduliert werden, wenn in der Leber selbst eine Entzündung vorliegt. Für die
Entstehung von Th1 Zellen aus naiven CD4+ T-Zellen stellt IL-12 einen entscheidenden
Faktor dar (Trinchieri 1995, O'Garra 1998). Lebersinusendothelzellen exprimieren
78
Ergebnisse
selbst kein IL-12 (Knolle, Schmitt et al. 1999), dennoch kann dieses Zytokin von den
myeloiden dendritischen Zellen in der Leber exprimiert werden und so für die
Modulation von Th1 Zellen durch LSEC im Gewebe zur Verfügung stehen (O'Connell,
Son et al. 2003). Um den Einfluss von LSEC auf die Entstehung von Th1 Zellen zu
analysieren, wurden die Kokulturen in der Anwesenheit von exogenen IL-12
durchgeführt
und
so
ein
pro-inflammatorisches
Milieu
simuliert.
Um
eine
Immunpathologie als Folge von übertriebenen Entzündungsreaktionen zu vermeiden
müssen Immunantworten begrenzt werden. Das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 ist
in der Lage die pro-inflammatorische Wirkung von Th1 Zellen wirkungsvoll zu
beschränken. IL-10 selbst kann durch Th1 Zellen exprimiert werden und auto-regulativ
auf Th1 Zellen wirken (Jankovic, Kullberg et al. 2007, Trinchieri 2007). Um zu
untersuchen, ob LSEC in Th1 Zellen IL-10 induzieren, wurden naive CD4+ T-Zellen
antigenspezifisch durch LSEC bzw. SAPC unter der Zugabe von IL-12 aktiviert. Die
Th1SAPC und Th1LSEC wurden hinsichtlich der Expression von IFNγ und IL-10 mittels
Durchflusszytometrie, CBA und realtime PCR analysiert.
Abbildung 10: Induktion von IL-10 auf Th1 Zellen durch LSEC
+
high
Naive CD4 CD62L
Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d mit LSEC oder
SAPC aus C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid und IL-12 aktiviert. Th1LSEC
und Th1SAPC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert,
79
Ergebnisse
mit einem anti-IFNγ und anti-IL-10 Antikörper markiert (A, B). Die Zellen wurden am
Durchflusszytometer analysiert. Die Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10 und IFNγ
Gehalt analysiert (C). Relative IL-10 und IFNγ mRNA Expression wurde mittels quantitativer
+
+
+
realtime PCR ermittelt (D). Prozentuale Anteile IL-10 IFNγ bzw. IFNγ Zellen sind angegeben.
+
Das Gate liegt auf CD4 T-Zellen. Es sind repräsentative Dotplots aus 4 unabhängigen
Experimenten dargestellt.* = p < 0,05; Mann-Whitney-Test.
Der prozentuale Anteil der IFNγ-positiven Zellen bei Th1 Zellen, die durch LSEC bzw.
SAPC aktiviert wurden, lag auf einem vergleichbar hohen Niveau (Abbildung 10 A, B).
Durch die exogene Zugabe von IL-12 war die IFNγ Expression der Th1LSEC nicht
reduziert (siehe Kapitel 4.2.2). Interessanterweise exprimierten die IFNγ-positiven
Zellen der Th1LSEC zu einem hohen Anteil das anti-inflammatorische Zytokin IL-10,
während die Th1SAPC nur einen geringen Anteil IL-10-positiver Zellen beinhalteten. Die
Konzentrationen von IFNγ im Zellkulturüberstand waren bei beiden APC-Populationen
vergleichbar, während die IL-10-Konzentration bei den LSEC-Kulturen im Vergleich zu
den SAPC signifikant erhöht war (Abbildung 10 C). Die IFNγ mRNA Expression der
Th1LSEC und Th1SAPC unterschied sich nicht signifikant, während für die Th1LSEC eine
signifikant höhere IL-10 Expression detektiert werden konnte (Abbildung 10 D).
Obwohl sich Th1LSEC und Th1SAPC in der IFNγ Epression nicht unterschieden,
exprimierten Th1LSEC zu einem sehr hohen Anteil das anti-inflammatorische Zytokin IL10, Th1SAPC hingegen nicht.
4.2.4
Th1LSEC supprimieren eine DTH-Reaktion in vivo
CD4+ T-Zellen, die unter inflammatorischen Bedingungen in vitro durch LSEC aktiviert
wurden exprimieren neben dem pro-inflammatorischen Zytokin IFNγ das antiinflammatorische IL-10. Um zu analysieren, ob die Th1LSEC während einer Entzündung
in vivo pro- oder anti-inflammatorische Eigenschaften besitzen, wurde das delayed
type hypersensitivity-Model (DTH) verwendet. Dazu wurden OVA-spezifische Th1LSEC
i.v. in WT Mäuse injiziert und 24 Stunden später durch die s.c. Applikation von OVAPeptid in inkompletten Freund´s Adjuvant (IFA) in die Fußsohle eine DTH-Reaktion
ausgelöst. Als Kontrolle wurden SAPC-aktivierte Th1 Zellen verwendet.
80
Ergebnisse
Die Th1SAPC lösten am Tag 1 nach Antigengabe eine starke Schwellung der Fußsohle
aus, die sich an den folgenden Tagen langsam reduzierte (Abbildung 11 A). Als
Kontrolle für die Basalschwellung aufgrund einer leichten Entzündung, die durch die
Injektion durch IFA ausgelöst wird, erhielten einige Mäuse anstelle des OVA-Peptids
PBS. Bei diesen Tieren wurde eine geringe Schwellung der Fußsohle auf ca. das
halbe Niveau der OVA-immunisierten Füße ermittelt. Die Th1LSEC lösten eine signifikant
niedrigere Fußschwellung im Vergleich zu den Th1SAPC nach Antigengabe aus. Die
Fußschwellung der Th1LSEC Gruppe lag auf dem Niveau der PBS Kontrolle.
Um zu untersuchen, ob Th1LSEC aktiv die Entstehung einer DTH-Reaktion unterdrücken
können, wurden sie zusammen mit den entzündungsauslösenden Th1SAPC im
Verhältnis 1:1 ko-transferiert. Als Kontrolle wurden wiederum Th1SAPC verwendet. Der
Transfer der zweifachen Anzahl an Th1SAPC führte zu einer größeren Schwellung der
Fußsohle, als der Transfer der einfachen Zahl an Th1SAPC, was sich durch die erhöhte
Gesamtzellzahl erklärt (Abbildung 11 B). Der Ko-transfer von Th1SAPC und Th1LSEC
bewirkte
hingegen
bereits
am
ersten Tag
eine
signifikante
Reduktion
der
Fußsohlenschwellung und an den darauffolgenden Tagen zusätzlich eine stärke und
schnellere Abnahme der Fußsohlenschwellung.
Durch die Gabe eines blockierenden anti-IL-10 Rezeptor Antikörpers zusätzlich zu dem
Ko-transfer von Th1SAPC + Th1LSEC bzw. Th1SAPC + Th1SAPC sollte analysiert werden, ob
die Reduktion der Entzündungsreaktion durch die Th1LSEC von deren IL-10 Expression
abhängig ist. Als Kontrolle wurde alternativ ein Antikörper des entsprechenden
Isotypsappliziert. Die Blockade des IL-10 Rezeptors bewirkte, dass die Suppression
der Th1LSEC aufgehoben wurde und die Fußsohlenschwellung auf der Höhe des
zweifachen Transfers von Th1SAPC lag (Abbildung 11 C). Die Applikation des
Kontrollantikörpers hatte keinen Einfluss auf die supprimierende Wirkung der Th1LSEC.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass LSEC-aktivierte Th1 Zellen in
vivo keine Entzündungsreaktion auslösen, sondern sogar die Fähigkeit besitzen, durch
ihr sezerniertes IL-10, eine Th1-induzierte Inflammation zu unterdrücken.
81
Ergebnisse
Abbildung 11: In vivo Suppression einer DTH-Reaktion durch Th1LSEC.
In vitro generierte LSEC-stimulierte (Th1LSEC) oder SAPC-stimulierte (Th1SAPC) Th1 Zellen
wurden allein (A) oder zusammen mit Th1SAPC (B) i.v. in C57BL/6 Mäuse transferiert, jeweils
6
1x10 Zellen. Die DTH-Reaktion wurde 24 h nach Zelltransfer durch s.c. Injektion von OVAPeptid in IFA in die Fußsohle der Mäuse ausgelöst (geschlossenes Symbol; ●) und der Verlauf
der Fußsohlenschwellung in den folgenden 6 d gemessen. Alternativ wurde PBS in IFA
appliziert (offenes Symbol; ○). Zusätzlich zum Zelltransfer erfolge die Gabe eines anti-IL-10
Rezeptor Antikörpers bzw. entsprechender Isotypkontrolle (C). Es wurden jeweils zwei
unabhängige Versuche mit je 5 Tieren pro Gruppe durchgeführt. Statistische Analyse in (A, B)
erfolgte zwischen den OVA-immunisierten Tieren, in (C) zwischen Th1SAPC + Th1LSEC mit antiIL10R mAk und IgG1. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001; Mann-Whitney-Test.
82
Ergebnisse
4.2.5
ICOS-L und IL-27 spielen keine Rolle für die IL-10 Induktion in
Th1LSEC
IL-10 Expression der T-Zellen kann über zahlreiche Mechanismen, wie Zytokine oder
Rezeptoren auf der Zelloberfläche induziert werden. Ein entscheidender Faktor für die
IL-10 Expression bei Th1 vermittelten Immunreaktionen ist IL-27 (Fitzgerald, Zhang et
al. 2007, Freitas do Rosario, Lamb et al. 2012).
In den Überständen von über Nacht kultivierten LSEC war IL-27 Protein mittels CBA
nachweisbar (Abbildung 12 A). Allerdings hatte ein neutralisierender IL-27p28
Antikörper in der Kokultur von CD4+ T-Zellen und LSEC keinen Einfluss auf die
Frequenz der IL-10 positiven Th1 Zellen (Abbildung 12 B).
Abbildung 12: Einfluss von IL-27 und ICOS auf die IL-10 Expression von Th1LSEC.
Ex vivo isolierte LSEC aus C57BL/6 Mäusen wurden über Nacht kultiviert und der
+
high
Zellüberstand mittels CBA auf IL-27 Proteingehalt analysiert (A). Naive CD4 CD62L
Zellen
aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d durch LSEC aus C57BL/6 Mäusen in der
Anwesenheit von OVA-Peptid, IL-12 und eines anti-IL-27p28 Antikörpers bzw. entsprechende
+
high
Isotypkontrolle aktiviert (B). Naive CD4 CD62L
Zellen aus OT-IIxICOSko bzw. WT Mäusen
wurden in vitro für 4 d durch LSEC in der Anwesenheit von OVA-Peptid und IL-12 aktiviert (C)
Th1LSEC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit
einem anti-IFNγ und anti-IL-10 Antikörper markiert (B, C). Die Zellen wurden am
+
+
Durchflusszytometer analysiert. Prozentuale Anteile IL-10 IFNγ angegeben. Das Gate liegt auf
+
CD4 T-Zellen. Es sind Ergebnisse aus mind. 2 unabhängigen Experimenten dargestellt.
Alternativ können antigenpräsentierende Zellen IL-10 auf T-Zellen über inducible costimulator ligand (ICOS-L) induzieren. Weiterhin ist bekannt, dass Endothelzellen
ICOS-L exprimieren (Kroczek, Mages et al. 2004). Um zu analysieren, ob die
Interaktion zwischen ICOS und ICOS-L für die IL-10 Expression auf Th1LSEC
83
Ergebnisse
verantwortlich ist, wurden Kokulturen mit naiven CD4+ T-Zellen aus ICOSkoxOT-II
Mäusen durchgeführt. Die ko Mäuse hatten im Vergleich zu den WT Mäusen keine
veränderten Frequenzen der IL-10-positiven Th1 Zellen (Abbildung 12 C).
Zusammengefasst demonstrieren die Ergebnisse, dass sowohl IL-27, als auch ICOS-L
keine Rolle bei der Induktion von IL-10 in Th1LSEC spielen.
4.2.6
LSEC exprimieren alle vier Notch-Liganden
Durch unsere Arbeitsgruppe wurde unlängst ein weiterer Signalweg zur Induktion von
IL-10 beschrieben - der Notch-Signalweg. Durch die Interaktion von Notch mit dessen
Liganden, die z.B. auf plasmazytoiden DC exprimiert sind, wird IL-10 in Th1 Zellen
hochreguliert (Rutz, Janke et al. 2008, Kassner, Krueger et al. 2010). Es stellte sich
also die Frage ob auf LSEC die Expression von Notch-Liganden nachweisbar ist. Dazu
wurde ex vivo isolierte nichtparenchymatische Zellen (NPC) mit einem LSECspezifischen anti-CD146 Antikörper und anti-Dll1, anti-Dll4, anti-Jagged1 bzw. antiJagged2 Antikörper markiert und im Durchflusszytometer analysiert. Des Weiteren
wurde die relative Expression der Notchliganden von der mRNA frisch isolierter LSEC
mittels realtime PCR bestimmt. Die Expression der Notch-Liganden wurde dazu ins
Verhältnis zur β-Actin Expression gesetzt. Um die Expression von Dll4 im
Lebergewebe zu untersuchen, wurden kryokonservierte Leberschnitte mit einem antiCD146 und anti-Dll4 Antikörper markiert und mikroskopisch analysiert.
Die durchflusszytometrische Analyse der nichtparenchymatischen Zellen zeigte, dass
eine Expression der Notch-Liganden nur auf LSEC nachweisbar war. LSEC wiesen
eine mittelstarke Expression der Liganden Dll1 und Dll4 auf, während die Liganden
Jagged1 und Jagged2 sehr hoch exprimiert waren (Abbildung 13 A). Die mRNAAnalyse der LSEC ergab, dass Dll4 am höchsten exprimiert war (Abbildung 13 B). Die
Expression von Dll1 war ungefähr zehnfach geringer als die Expression von Dll4. Das
Expressionsniveau der Notchliganden Jagged1 und Jagged2 war deutlich niedriger als
das der Dll Familie. Durch die Analyse der Leberschnitte konnte demnach eine KoLokalisation von CD146 und Dll4 im Lebergewebe ermittelt werden (Abbildung 13 C).
84
Ergebnisse
Mit verschiedenen Methoden wurde die Expression der Notchliganden auf LSEC
nachgewiesen.
Abbildung 13: Expression der Notchliganden Dll1, Dll4, Jagged1 und Jagged2 durch
LSEC.
Frisch isolierte nicht-parenchymatische Zellen aus C57BL/6 Mäusen wurde mit einem LSECspezifischen anti-CD146 Antikörper und anti-Dll1, anti-Dll4, anti-Jagged1 bzw. anti-Jagged2
Antikörper markiert und durchflusszytometrisch analysiert (A). Die relative mRNA Expression
von Dll1, Dll4, Jagged1 und Jagged2 wurde mittels quantitativer realtime PCR von frisch
isolierten LSEC ermittelt (B). Kryo-konservierte Leberschnitte von WT Mäusen wurden mit
einem anti-CD146 (grün) und anti-Dll4 (rot) Antikörper markiert und mikroskopisch analysiert
Die Zellkerne wurde mit DAPI (blau) gegengefärbt. Es sind Ergebnisse von mind. 4
unabhängigen Experimenten dargestellt. Das Gate liegt auf lebenden Zellen.
85
Ergebnisse
4.2.7
Die IL-10 Induktion in Th1LSEC ist abhängig vom NotchSignalweg
4.2.7.1
Blockade von Dll1 und Dll4 führt nur zu einer teilweisen
Reduktion der IL-10 Expression in Th1LSEC
Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe ergaben, dass vorrangig die Liganden der Dll
Familie dazu in der Lage sind IL-10 auf Th1 Zellen zu induzieren (Rutz, Janke et al.
2008). In diesem Zusammenhang wurde nun untersucht, ob eine Blockade von Dll1
bzw. Dll4 einen Einfluss auf die IL-10 Expression der Th1LSEC hat. Dazu wurden naive
CD4+ T-Zellen antigenspezifisch, unter der Zugabe von IL-12 durch LSEC aktiviert. Die
Kultur erfolgte zusätzlich unter der Zugabe eines blockierenden anti-Dll1 bzw. anti-Dll4
Antikörpers, bzw. der Kombination aus beiden Antikörpern. Die Zellen wurden auf die
Expression von IL-10 und IFNγ durchflusszytometrisch und mittels realtime PCR
analysiert. Zudem erfolgte eine Analyse der Zellkulturüberstände auf den Proteingehalt
an IL-10 und IFNγ.
Die Blockade von Dll1 reduzierte den Anteil der IL-10 positiven T-Zellen um ca. 30 %
(Abbildung 14 A). Wurde Dll4 in der Kultur der Th1LSEC blockiert, verringerte sich der
Anteil der IL-10 positiven T-Zellen um ca. 25 %. Bei einer gleichzeitigen Blockade von
Dll1 und Dll4 konnte kein weiterer Rückgang der IL-10 Expression im Vergleich zur
alleinigen Blockade von Dll1 beobachtet werden. Der IL-10 Proteingehalt und die IL-10
mRNA Expression war im gleichen Umfang reduziert, wie der Anteil der IL-10+ Th1
Zellen (Abbildung 13 B, C).
Die Ergebnisse zeigen, dass die Blockade der Dll Liganden zu einer teilweisen, aber
nicht vollständigen Inhibition der IL-10 Expression aus Th1LSEC führt.
86
Ergebnisse
Abbildung 14: Einfluss der Blockade von Dll1 und Dll4 auf die IL-10 Expression von
Th1LSEC.
+
high
Naive CD4 CD62L
Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d durch LSEC aus
C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid, IL-12 und eines anti-Dll1, anti-Dll4
Antikörpers bzw. entsprechender Isotypkontrolle (je 50 µg/ml) aktiviert. Th1LSEC wurden für 6 h
mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit einem anti-IFNγ und antiIL-10 Antikörper markiert (A). Die Zellen wurden am Durchflusszytometer analysiert. Die
Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10 Proteingehalt analysiert (B). Relative IL-10 mRNA
+
Expression wurde mittels quantitativer realtime PCR ermittelt (C).Das Gate liegt auf CD4 TZellen. Es sind beispielhafte Dotplots aus 3 unabhängigen Experimenten dargestellt.
4.2.7.2
Blockade des Notch-Signalweges mittels γ-Sekretaseinhibitor
reduziert IL-10 Expression in Th1LSEC
Die Blockade der Liganden der Dll Familie führte nur zu einer teilweisen Reduktion der
IL-10 Expression auf Th1LSEC. Auf den LSEC selbst konnte jedoch auch eine sehr hohe
Expression der Liganden der Jagged Familie nachgewiesen werden. Um den Einfluss
aller Notch-Liganden zu untersuchen, wurde der Notch-Signalweg vollständig durch
den γ-Sekretaseinhibitor (GSI) blockiert. Der GSI verhindert in der T-Zelle die
Abspaltung der intrazellulären Domäne des Notch-Rezeptors nach Bindung des
Liganden und führt zu einer Inhibition der Expression der Notch-Zielgene Hes-1 und
Deltex-1 (Schroeter, Kisslinger et al. 1998, Seiffert, Bradley et al. 2000). In den
folgenden Experimenten wurden naive CD4+ T-Zellen antigenspezifisch unter Zugabe
87
Ergebnisse
von IL-12 durch LSEC aktiviert. Zu den Kulturen wurden ansteigende Konzentrationen
von GSI bzw. des Lösungsmittels DMSO hinzugegeben. Die Th1LSEC wurden
hinsichtlich der Expression von IFNγ und IL-10 mittels Durchflusszytometrie, CBA und
realtime PCR analysiert. Zusätzlich erfolgte die Messung der Expression der NotchZielgene Hes-1 und Deltex-1 durch realtime PCR. Die Expression der genannten Gene
wurde ins Verhältnis zur UBC Expression gesetzt.
Die Frequenz der IL-10 produzierenden Zellen wurde durch GSI drastisch gegenüber
unbehandelten und DMSO behandelten Zellen reduziert, was sich auch in der
verringerten IL-10 Konzentration im Zellüberstand und der niedrigeren Expression von
IL-10 mRNA widerspiegelte (Abbildung 15 A, B, C, F). Die Reduktion der IL-10
Produktion durch GSI war abhängig von der Konzentration des Inhibitors, was auf
dessen spezifische Wirkung hindeutet. Unerwarteterweise reduzierte auch DMSO, das
Lösungsmittel des GSI, die IL-10 Expression, allerdings signifikant schwächer als GSI
(Abbildung 15 A, D, E). Auch die IFNγ Konzentration im Zellüberstand wurde durch
DMSO beeinflusst. GSI reduzierte die Frequenzen an IFNγ+ T-Zellen nicht, aber die
Konzentration an IFNγ im Zellüberstand. Die Expression der Notch-Zielgene Hes-1 und
Deltex-1 war durch GSI spezifisch reduziert, was auf eine vollständige Blockade des
Notchsignalwegs hindeutet (Abbildung 15 G, H).
Zusammengefassend lässt sich sagen, dass die Inhibition des Notch-Signalweges
mittels GSI in den Th1LSEC Kulturen zu einer spezifischen Reduktion der IL-10
Expression führte. Des Weiteren konnte eine signifikant geringere Expression der
Notch-Zielgene Hes-1 und Deltex-1 beobachtet werden. Dennoch gab es einen
geringen Einfluß des Inhibitors auf die IFNγ Sekretion, aber nicht auf die Anzahl an
Zellen, die in der Lage waren IFNγ zu produzieren.
88
Ergebnisse
Abbildung 15: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC durch γ-Sekretaseinhibitor.
+
high
Naive CD4 CD62L
Zellen aus OT-IIxB6PL Mäusen wurden in vitro für 4 d durch LSEC aus
C57BL/6 Mäusen in der Anwesenheit von OVA-Peptid und IL-12 aktiviert. Zusätzlich wurden die
Zellen mit einem γ-Sekretase-Inhibitor (0,63 – 5 mM) bzw. dessen Lösungsmittel DMSO (0,63 –
5 µl/ml) versetzt. Th1LSEC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert,
permeabilisiert, mit einem anti-IFNγ und anti-IL-10 Antikörper markiert (A, B, C). Die Zellen
wurden am Durchflusszytometer analysiert. Die Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10
und IFNγ Gehalt analysiert (C, E). Relative IL-10, Deltex-1 und Hes-1 mRNA Expression wurde
89
Ergebnisse
+
+
mittels quantitativer realtime PCR ermittelt (F, G, H). Prozentuale Anteile IL-10 IFNγ Zellen
+
sind angegeben. Das Gate liegt auf CD4 T-Zellen. Es sind repräsentative Dotplots und
Ergebnisse aus 4 unabhängigen Experimenten dargestellt.* = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p <
0,001; Mann-Whitney-Test.
4.2.7.3
Die IL-10 Expression ist in Notch-defizienten Th1LSEC inhibiert
Die Verwendung eines γ-Sekretaseinhibitors zur Blockade des Notch-Signalweges
resultierte in einer spezifischen Reduktion der IL-10 Expression bei Th1LSEC. Um die
spezifischen Effekte zu validieren, wurden Notch-defiziente T-Zellen für die Kokultur mit
LSEC verwendet. Auf naiven CD4+ T-Zellen sind vorrangig Notch-1 und -2 exprimiert
(Ohishi, Varnum-Finney et al. 2000, Amsen, Blander et al. 2004). Für die folgenden
Experimente wurden naive CD4+ T-Zellen aus Mäusen verwendet, die auf CD4 Zellen
einen knockout für Notch-1 und -2 besitzen (Notch-1/2floxxCD4Cre+, N1/2ko; Notch1/2floxxCD4Cre-, N1/2wt; (Helbig, Gentek et al. 2012)). Diese wurden durch LSEC unter
der Zugabe von anti-CD3, und anti-CD28 mAk und IL-12 aktiviert. Die Th1LSEC wurden
hinsichtlich der Expression von IFNγ, IL-10 und TNFα mittels Durchflusszytometrie,
CBA und realtime PCR analysiert. Zusätzlich erfolgte die Messung der Expression der
Notch-Zielgene Hes-1 und Deltex-1 durch realtime PCR. Die Expression der
genannten Gene wurde ins Verhältnis zur UBC Expression gesetzt.
Die Th1LSEC aus den N1/2ko Mäusen hatten im Vergleich zu den N1/2wt einen
signifikant niedrigeren Anteil an IL-10+IFNγ+ T-Zellen, während der Anteil der IFNγ+
und TNFα+ T-Zellen unverändert blieb (Abbildung 16 A, B, C, D). Äquivalent dazu war
die IL-10 Konzentration im Zellüberstand bei den N1/2ko Zellen signifikant reduziert,
während der Gehalt an IFNγ Protein auf einem vergleichbaren Niveau blieb (Abbildung
16 E, F). Die Analyse der mRNA Expression der Th1LSEC aus N1/2ko Mäusen zeigte
eine Reduktion der IL-10 Expression, IFNγ blieb unverändert (Abbildung 16 G, H). Die
Expression der Notch-Signalweg Zielgene Hes-1 und Deltex-1 war in den N1/2ko fast
vollständig aufgehoben, was ein komplettes Fehlen des Notch-Signals in den Th1
Zellen bestätigt und das Signal über andere Notch-Moleküle ausschließt (Abbildung 16
I, J).
90
Ergebnisse
Abbildung 16: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC aus Notch-Rezeptordefizienten Mäusen.
+
high
+
Naive CD4 CD62L
Zellen aus Notch1/2ko (CD4 Cre ) bzw. Notch1/2wt (CD4 Cre ) Mäusen
wurden in vitro für 4 d mit anti-CD3 mAk und IL-12 durch LSEC aus C57BL/6 Mäusen aktiviert.
Th1LSEC wurden für 6 h mit PMA/Iono/BrefA/Monensin restimuliert, fixiert, permeabilisiert, mit
einem anti-IL-10, anti-IFNγ, anti-TNFα Antikörper markiert (A, B, C, D). Die Zellen wurden am
Durchflusszytometer analysiert. Die Zellüberstände wurden mittels CBA auf IL-10 und IFNγ
Gehalt analysiert (E, F). Relative IL-10, IFNγ, Deltex-1 und Hes-1 mRNA Expression wurde
+
+
+
mittels quantitativer realtime PCR ermittelt (G, H, I, J). % Anteile IL-10 IFNγ , IFNγ bzw.
+
+
TNFα Zellen sind angegeben. Das Gate liegt auf CD4 T-Zellen. Repräsentative Dotplots und
Ergebnisse aus 2 unabhäng. Exp. mit je 4 Mäusen dargestellt.* = p<0,05; Mann-Whitney-Test.
91
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigen, dass LSEC bei CD4+ T-Zellen aus N1/2ko Mäusen nicht in der
Lage sind, IL-10 zu induzieren. Die Expression der Th1 Zytokine IFNγ und TNFα war
hingegen nicht beeinträchtigt. Darum kann man davon ausgehen, dass LSEC in Th1
Zellen über den Notch-Signalweg IL-10 induzieren.
92
5.
93
Diskussion
Diskussion
5.1
Lebersinusendothelzellen induzieren Darmhoming-Phänotyp bei
CD4+ T-Zellen
Das klassische Konzept des Homing beschreibt die Migration von antigenerfahrenen
Effektor/Gedächtnis T-Zellen vorrangig in das Gewebe, in dessen assoziierten
sekundären lymphatischen Organen sie initial durch ihr spezifisches Antigen aktiviert
wurden (Cahill, Poskitt et al. 1977, Campbell and Butcher 2002, Agace 2006).
Entgegengesetzt dazu findet aber auch eine Migration der T-Zellen in Gewebe statt,
die unabhängig sind von der erstmaligen T-Zell-Aktivierung. So wurden Th17 Zellen in
der Leber von Patienten lokalisiert, die an verschiedenen Autoimmunerkrankungen der
Leber leiden (Oo, Banz et al. 2012). Th17 Zellen werden vornehmlich im Darm, als
Antwort auf eine bakterielle Infektion, induziert (Nutsch and Hsieh 2012). Im Darm
aktivierte CD4+ T-Zellen induzieren in IL-10 defizienten Mäusen eine Hepatitis,
nachdem diese mit Trichinella spiralis infiziert wurden (Douglas, Beiting et al. 2010).
Diese Analysen zeigen beispielhaft, dass im Darm- bzw. in der Leber-aktivierte TZellen, auch einen Einfluss auf die Pathologie einer Erkrankung im jeweils anderen
Organ haben (Übersicht in (Grant, Lalor et al. 2002)). Die Induktion von spezifischen
Homingrezeptoren auf Lymphozyten ist also zum einem durch den Ort der
Antigenpräsentation, als auch durch die Umgebungsbedingungen bestimmt.
Vorhergehende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass naive CD4+ TZellen, die unter nicht-polarisierenden Bedingungen durch LSEC aktiviert werden
(TLSEC), präferentiell in den Darm und mesenteriale Lymphknoten migrierten, im
Gegensatz zu CD4+ T-Zellen, welche durch Milz APC (TSAPC) aktiviert wurden (Kruse,
Neumann et al. 2009). Die TSAPC wanderten verstärkt in die Leber ein. Weiterführende
Arbeiten demonstrierten die Induktion der darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7Integrin und CCR9 auf TLSEC und nur eine geringe Expression des hautspezifischen
Homingrezeptors P-Lig. TSAPC exprimierten nur geringfügig α4β7-Integrin und kein
CCR9, sowie viel P-Lig (Neumann, Kruse et al. 2012). Bisher war unklar, ob LSEC die
einzige Zellpopulation in der Leber darstellt, die in der Lage ist, einen DarmhomingPhänotyp bei T-Zellen zu induzieren. Zudem war es von großem Interesse, ob auch die
migratorischen Eigenschaften von Effektor/Gedächtnis T-Zellen durch LSEC moduliert
werden können.
94
Diskussion
In vitro Studien der hier vorliegenden Arbeit zeigten, dass LSEC in der Leber allein die
Fähigkeit besitzen darmspezifische Homingrezeptoren auf CD4+ T-Zellen (TLSEC) zu
induzieren, während eine Zellpräparation bestehend aus B-Zellen, DC und Kupffer
Zellen der Leber dazu nicht in der Lage war. Weiterführend wurde hier erstmals
gezeigt, dass durch LSEC reaktivierte Th1 (Th1LSEC) Zellen in vivo stärker in das
Darmgewebe und das GALT migrierten, was durch die signifikant erhöhte Expression
der darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 ermöglicht wurde.
Th1 Zellen, die durch LSEC-negative Leber APC (Th1LAPC) aktiviert wurden, wiesen
hingegen eine signifikant geringere Expression des Homingrezeptors α4β7-Integrin
und eine höhere Expression des Hauthoming-Rezeptors P-Lig auf. Der Phänotyp der
Th1LAPC entsprach dem Homingphänotyp von Th1 Zellen, welche durch Milz APC
(Th1SAPC) reaktiviert worden waren. Th1SAPC migrierten demzufolge in vivo zu einem
signifikant geringeren Anteil in das Darmgewebe und GALT als Th1LSEC, aber
vergleichbar hoch in die Leber. Somit ist nicht nur die Mikroumgebung in einem Organ
entscheidend für die migratorischen Eigenschaften der aktivierten T-Zellen, besonders
die antigenpräsentierende Zelle selbst spielt eine entscheidende Rolle. Allerdings ist
hier und bei den folgenden Ergebnissen zu berücksichtigen, dass die LAPC eine
gemischte Zellpopulation von APC der Leber darstellen. In weiterführenden Studien
sollte eine Betrachtung von einzelnen APC der Leber stattfinden.
Die Induktion der darmspezifischen Homingrezeptoren wurde, unabhängig von den
Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zur Leber, bisher nur für spezialisierte DC im
Darm gezeigt. Diese sind zum einen in den Peyer´schen Plaques lokalisiert oder
wandern von der Lamina propria in die mLN um dort auf T-Zellen die Hochregulation
von α4β7-Integrin und CCR9 zu induzieren (Mora, Bono et al. 2003, Agace 2010). Die
Rezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 zusammen mit deren Liganden MAdCAM-1 und
CCL25, exprimiert auf Epithel- und Endothelzellen im Darmgewebe, bilden die Basis
für eine Zellmigration in den Darm. Interessanterweise werden die Liganden MAdCAM1
und
CCL25
bei
einer
Primär
Sklerosierenden
Cholangitis
(PSC),
einer
hochenzündlichen Lebererkrankung, in der Leber selbst hochreguliert und α4β7Integrin- und CCR9-positive T-Zellen in die Leber rekrutiert (Grant, Lalor et al. 2001,
Eksteen, Grant et al. 2004). Eine Reaktivierung von im Darmgewebe bzw. GALT
aktivierten CD8+ T-Zellen durch Leber DC und Sternzellen resultierte nicht in einer
95
Diskussion
Hochregulation von α4β7-Integrin und CCR9 auf den T-Zellen (Eksteen, Mora et al.
2009). Diese Ergebnisse bestätigen indirekt die exklusive Fähigkeit der LSEC in der
Leber einen Darmhoming-Phänotyp bei T-Zellen zu induzieren, wobei die LSEC selbst
nicht Bestandteil der Analysen waren. Die antigenspezifische Aktivierung von CD8+ TZellen in der Leber und Darm unter homöostatischen Bedingungen wurde erst kürzlich
durch die Arbeitsgruppe von E. Schott untersucht (Eickmeier, Seidel et al. 2014). So
migrierten OVA-spezifische CD8+ T-Zellen (OT-I) nach Aktivierung durch ihr Antigen,
welches im Darm exprimiert wurde, erneut in den Darm und das GALT, sowie in das
Lebergewebe. Wurden OT-I Zellen hingegen in der Leber durch ihr Antigen aktiviert, so
erfolgte keine Akkumulation der CD8+ T-Zellen im Darm. Das Antigen OVA wurde
allerdings in der Leber durch Hepatozyten exprimiert. Eigene Voruntersuchungen
deuten darauf hin, dass LSEC in vitro auch bei CD8+ T-Zellen die darmspezifischen
Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 hochregulieren können (Daten nicht
gezeigt).
Die Regulation der Migration der CD8+ T-Zellen in die Leber war nicht Bestandteil der
Analysen von Eickmeier et al.. Die Expression von MAdCAM-1 und CCL25 in der
Leber wurde nicht untersucht. Es ist anzunehmen, dass diese Liganden unter
homöostatischen
Bedingungen
nicht
verstärkt
exprimiert
werden.
Spezifische
Homingrezeptoren, die eine Migration von T-Zellen in die Leber unter homöstatischen
Bedingungen ermöglichen, sind bisher nur ansatzweise untersucht. Möglicherweise
spielt das von humanen LSEC exprimierte VAP-1 eine Rolle, indem es die Adhäsion
und Transmigration von Lymphozyten durch das Lebersinusendothel fördert (McNab,
Reeves et al. 1996, Lalor, Edwards et al. 2002). Für dessen erst kürzlich identifizierte
Liganden Siglec-9 und-10 sind noch keine funktionellen Analysen durchgeführt worden
(Kivi, Elima et al. 2009, Aalto, Autio et al. 2011). Zusätzlich zu VAP-1 könnte die
Bindung von CXCR3 und CXCR6 bzw. von ICAM-1 und VCAM-1 die Migration in die
Leber unterstützen, deren Bedeutung für die Einwanderung in die entzündete Leber ist
bereits bekannt (Lalor and Adams 2002, Tuncer, Oo et al. 2013).
Für die Induktion der darmspezifischen Homingrezeptoren ist Retinolsäure notwendig
(Iwata, Hirakiyama et al. 2004). In der hier vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt,
dass das Vitamin A Metabolit Retinolsäure für die Hochregulation des Homingrezeptors
96
Diskussion
α4β7-Integrin
auf
Th1
Zellen
durch
LSEC
verantwortlich
ist.
Wurde
der
Retinolsäurerezeptor auf T-Zellen während der Reaktivierung auf LSEC mittels LE-540
blockiert, erfolgte keine Expression von α4β7-Integrin, aber dafür die Hochregulation
von P-Lig, ein Homingrezeptor, welcher die Einwanderung in die Haut und entzündete
Gewebe ermöglicht. Der Phänotyp dieser LE-540 behandelten Zellen entsprach dem
Phänotyp von Th1 Zellen, die durch andere Leber APC bzw. APC der Milz reaktiviert
wurden. In der Leber, als das größte Speicherorgan für Vitamin A, wird dieses von den
Sternzellen gespeichert und über den Disse´schen Raum an die Leberzellen
abgegeben (Blomhoff and Wake 1991, Friedman 1996). Eksteen et al. untersuchte die
Fähigkeit
der
leberresidenten
DC
und
Sternzellen
die
darmspezifischen
+
Homingrezeptoren α4β7-Integrin und CCR9 auf CD8 T-Zellen zu induzieren (Eksteen,
Mora et al. 2009). Wie oben bereits erwähnt, konnten beide Zellpopulationen kein
α4β7-Integrin und CCR9 auf CD8+ T-Zellen hochregulieren. Obwohl Sternzellen
Vitamin A speichern, sind sie anscheinend nicht in der Lage mittels zelleigener
Retinaldehydrogenasen Retinolsäure zu metabolisieren, LSEC hingegen besitzen die
dazu notwendigen Enzyme und können Retinolsäure aus Vitamin A umsetzen
(Neumann, Kruse et al. 2012). In dieser Eigenschaft sind LSEC vergleichbar mit DC
aus dem GALT (Iwata, Hirakiyama et al. 2004).
Der Zusammenhang zwischen hepatischen und intestinalen Erkrankungen, sowie die
Analysen über die migratorischen Eigenschaften von in der Leber- bzw. Darmaktivierten T-Zellen resultierten in einem Modell des enterohepatischen Kreislaufs
(Grant, Lalor et al. 2002). Das Model beschreibt die Migration von darmaktivierten TZellen in den Darm selbst und in die Leber. Des Weiteren wird die Wanderung von
leberaktivierten T-Zellen in die Leber und in den Darm postuliert. Die Darm-LeberAchse ist ausführlich beschrieben und akzeptiert. Die Leber-Darm-Achse hingegen
wird kontrovers diskutiert. In diesem Zusammenhang muss jedoch angemerkt werden,
dass Untersuchungen zu der Induktion von Darmhoming-Rezeptoren nur einzelne
Leber APC eingeschlossen hatten. Weiterführende Analysen sollten nicht nur alle
bisher beschriebenen Leber APC einbinden, sondern sowohl die Wirkung auf CD8+ als
auch auf CD4+ T-Zellen betrachten.
97
Diskussion
Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Induktion von Darmhoming-Rezeptoren
auf CD4+ T-Zellen in der Leber eine spezifische Eigenschaft der Lebersinusendothelzellen ist. LSEC-aktivierte T-Zellen exprimieren verstärkt die darmspezifischen
Homingrezeptoren α4β7-Integrin und teilweise CCR9 und migrieren präferentiell in den
Darm. Die Induktion der Darmhoming-Rezeptoren ist abhänging von Retinolsäure,
welche von LSEC zur Verfügung gestellt wird. Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen
die Existenz der Leber-Darm-Achse und schließen den enterohepatischen Kreislauf.
5.2
LSEC hemmen die Expression von pro-inflammatorischen
Interferon-γ und induzieren keine Apoptose bei CD4+ T-Zellen
Die Mechanismen der Toleranzinduktion in der Leber stehen im Fokus der aktuellen
Forschung. In der hier vorliegenden Arbeit war es von großem Interesse, ob die
verschiedenen Leber APC unterschiedliche Funktionen bei der Modulation der
Effektorfunktion von CD4+ T-Zellen übernehmen. In dieser Studie wurde gezeigt, dass
unter homöostatischen Bedingungen LSEC-negative Leber APC (LAPC; TLAPC) in vitro
das Th1-spezifische pro-inflammatorische Zytokin IFNγ in CD4+ T-Zellen im gleichen
Umfang induzierten, wie APC der Milz (SAPC; TSAPC). Im Gegensatz dazu war in
LSEC-aktivierten CD4+ T-Zellen (TLSEC) keine IFNγ Expression detektierbar. Wurden
durch Milz APC aktivierte Th1 Zellen auf LSEC reaktiviert, so erfolgte eine
Verringerung des Anteils IFNγ+ T-Zellen, während in der Kokultur auf LAPC und SAPC
der Anteil IFNγ+ T-Zellen gleich blieb. Während der Aktivierung von naiven CD4+ TZellen und Th1 Zellen durch LSEC waren die niedrigsten Frequenzen apoptotischer TZellen detektierbar, wohingegen deren Anteil bei der Kokultur mit LAPC signifikant
erhöht war.
Für die Differenzierung von Th1 Zellen ist das durch APC produzierte IL-12 notwendig
(Trinchieri 1995, O'Garra 1998). Die Gruppe um P. Knolle zeigte erstmals, dass LSEC
bei CD4+ T-Zellen kein IFNγ induzieren können, die Daten aus dieser Arbeit stimmen
mit deren Ergebnissen überein (Knolle, Schmitt et al. 1999). Auch eine Aktivierung der
LSEC über den TLR4 mittels LPS induzierte keine Th1 Zellen. Später wurde zwar
festgestellt, dass LPS bei LSEC eher zu Anergie führt, als eine Aktivierung zu
98
Diskussion
bewirken, dennoch wurde vermutet, dass LSEC kein IL-12 produzieren. Bei eigenen
Untersuchungen von LSEC konnte ebenso keine Expression der IL-12 spezifischen
Kette IL-12p40 nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Die Induktion von IFNγ in
TLAPC könnte durch IL-12 der myeloiden und plasmazytoiden DC der Leber vermittelt
werden (O'Connell, Son et al. 2003, Bosma, Metselaar et al. 2006). Gleichzeitig ist zu
vermuten, dass dadurch auch die IFNγ Expression der Th1 Zellen während der Reaktivierung durch LAPC stabil gehalten werden konnte.
Die Reduktion der IFNγ Expression bei Th1 Zellen durch LSEC könnte hingegen zwei
Gründe haben. Zum einen könnte ein Mangel an IL-12 keine neue Expression des
Transkriptionsfaktors Tbet induzieren und demzufolge auch kein IFNγ. Zum anderen
könnten LSEC die IFNγ Expression aktiv supprimieren. Die Gruppe um J. Herkel
untersuchte den Einfluss von LSEC auf die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch DC
und konstatierte, dass LSEC die Sekretion sowohl von IFNγ als auch von IL-17 in Th
Zellen supprimierten (Carambia, Frenzel et al. 2013). Für die Inhibition der IFNγ
Expression wurden das von LSEC sezernierte IL-10 bzw. zellgebundenes PD-L1
identifiziert. Über LSEC-exprimiertes PD-L1 wird ebenso bei CD8+ T-Zellen eine
Reduktion der Effektorfunktion vermittelt (Diehl, Schurich et al. 2008). Für den Mangel
an IL-12 und die daraus resultierende fehlende Neuinduktion würde sprechen, dass bei
exogener Zugabe von IL-12 kein Unterschied der IFNγ Expression bei Th1LSEC und
Th1SAPC detektiert wurde. Allerdings ist für die Induktion von IFNγ in T-Zellen auch eine
ausreichende Kostimulation über CD28 notwendig (Chapoval, Ni et al. 2001, Kane,
Andres et al. 2001). Erfolgte bei TLSEC Kulturen eine zusätzliche Kostimulation mittels
anti-CD28 mAk, dann wurde eine geringe Expression von IFNγ in TLSEC detektiert
(persönliche
Mitteilung
von
Ruth
Seikowski).
Die
geringe
Expression
von
kostimulatorischen Rezeptoren und die vergleichsweise hohe Expression von
koinhibitorischen Molekülen auf LSEC könnten den Einfluss auf die IFNγ Expression
erklären. Die von LSEC produzierte Retinolsäure könnte ebenso die IFNγ Expression
regulieren. Studien mit Endothelzellen aus der Nabelschnur zeigten eine inhibitorische
Wirkung der Retinolsäure auf die IFNγ Expression von Th1 Zellen, die über den CD28
Signalweg vermittelt wurde (Cantorna, Nashold et al. 1996).
99
Diskussion
T-Zell Apoptose ist wichtig für die Homöostase des Immunsystems. Im Speziellen ist
die Deletion von antigen-spezifischen T-Zellen einer der essentiellen Mechanismen der
Toleranzinduktion (Lenardo, Chan et al. 1999). Aktivierte T-Zellen migrieren
präferentiell in die Leber um dort deletiert oder moduliert zu werden (Mehal, Juedes et
al. 1999, Crispe, Dao et al. 2000). Es ist von großem Interesse, ob die in der Leber
residenten Zellen dabei unterschiedliche Aufgaben übernehmen. Die Ergebnisse der
hier durchgeführten Studie deuten darauf hin, dass LSEC-negative Leber APC,
bestehend aus B-Zellen, DC und Kupffer Zellen, höhere Level an Apoptose bei CD4+ TZellen induzierten, als LSEC. Übereinstimmend mit diesen Daten zeigten Mehal et al.,
dass
in
einem
Knochenmarkchimärenmodell,
bei
dem
Antigen
nur
über
hämatopoetische Zellen präsentiert wurde, in der Leber höhere Frequenzen an
apoptotischen CD8+ T-Zellen ermittelt wurden, als bei der Antigenpräsentation über
nicht
hämatopoetische
Zellen,
wie
LSEC
(Mehal,
Azzaroli
et
al.
2001).
Entgegengesetzt dazu wurde die Induktion von Apoptose bei CD3+ T-Zellen auch
durch LSEC beschrieben (Karrar, Broome et al. 2007). Allerdings ist hier anzumerken,
dass LSEC mit Endothelzellen der Aorta verglichen wurden und eine Betrachtung
anderer Leber APC nicht erfolgte. In der hier vorliegenden Arbeit induzierten LAPC
höhere Level an Apoptose bei CD4+ T-Zellen als SAPC. Diese Daten stimmen mit den
Untersuchungen von Tokita et. al. überein, in denen Leber DC bei einer allogenen
Stimulation höhere Frquenzen apoptotischer CD4+ T-Zellen induzierten, als Milz DC
(Tokita, Sumpter et al. 2008). Wurden bei Tokita et al. allerdings die Treg aus den CD4+
T-Zellen depletiert, war die Differenz zwischen den DC aus Milz und Leber
aufgehoben. In den hier verwendeten Th1 Zellen waren hingegen keine FoxP3+ Treg
detektierbar (Daten nicht gezeigt). Demzufolge ist der Unterschied zwischen LAPC und
SAPC in der Fähigkeit Apoptose zu induzieren in den hier gezeigten Daten nicht auf
die Präsenz von Treg zurückzuführen und hat vermutlich andere Gründe. Der
Unterschied zwischen LSEC und LAPC bzw. SAPC könnte in der stärkeren Aktivierung
der T-Zellen durch die professionellen APC und der damit verbundenen Induktion von
activation-induced cell death (AICD) in den T-Zellen begründet sein (Arakaki, Yamada
et al. 2014). Im Kontext der antigenspezifischen Stimulation von T-Zellen mittels
Nahrungsantigenen ist es für Leber DC anerkannt, dass diese Zellen Apoptose
induzieren (Crispe 2003, Thomson and Knolle 2010).
100
Diskussion
Apoptose wird in T-Zellen über zahlreiche Signalwege induziert, z.B. über den
extrinsischen Signalweg vermittelt über zelloberflächengebundene Rezeptoren oder
über den intrinsischen Signalweg, ausgelöst durch Hypoxie oder Mangel an
Wachstumsfaktoren (Lavrik 2010). Der extrinsische Signalweg beinhaltet u.a. den FasSignalweg und den Tumor Nekrose Faktor Rezeptor-1 (TNFR1). Die Bindung der
Liganden bewirkt die Aktivierung der Caspase 8, die zuvor mittels einer Fas-Associated
via Death Domain (FADD) als inaktive Procaspase 8 gebunden wird. Die Caspase 8
kann wiederum mehrere weitere Caspasen aktivieren und resultiert letztendlich in einer
Fragmentierung der DNA und dem damit verbundenen Zelltod. Der intrinsische
Signalweg induziert die Freisetzung von Cytochrom C
in das Zytosol und die
Aktivierung von Caspase 9. Diese wiederum aktiviert Caspase 3 und führt auch zur
Aktivierung von Molekülen mit Dnase Aktivität. In weiterführenden Studien könnte
Induktion der Apoptose durch die Aktivität verschiedener Caspasen in in vitro Studien
untersucht werden. Zudem könnte eine selektive Blockade von Caspasen Aufschluß
über den Signalweg geben.
Im Lebergewebe selbst wird die Deletion von T-Zellen und die Lyse von proapoptotischen T-Zellen zu einem signifikanten Anteil durch Hepatozyten vermittelt, eine
Zellpopulation, die in der hier vorliegenden Arbeit nicht einbezogen wurde.
Hepatozyten nehmen z.B. autoreaktive CD8+ T-Zellen in Vesikeln auf und führen sie
dem lysosomalen Abbau zu (Benseler, Warren et al. 2011). Dabei scheint das Niveau
an apoptotischen Zellen direkt mit der Menge an hepatozytenpräsentiertem Antigen zu
korrelieren (Tay, Wong et al. 2014). Für CD8+ T-Zellen ist weiterhin beschrieben, dass
sie in der Leber abhängig von B7-H1 deletiert oder anergisiert werden, auf die Zahl der
CD4+ T-Zellen hatte eine Deletion von B7-H1 jedoch keinen Einfluss (Dong, Zhu et al.
2004).
Die Ergebnisse, die im Kontext der Regulation von IFNγ und der Induktion von
Apoptose durch die verschiedenen Leber APC bei CD4+ T-Zellen erhoben wurden,
deuten darauf hin, dass LSEC die Expression von Effektorzytokinen verhindern,
während die LAPC vorrangig Apoptose induzieren. Sowohl die nicht-hämatopoetischen
LSEC, als auch hämatopoetische Leber APC tragen demnach gemeinsam zur
101
Diskussion
Induktion von Toleranz in der Leber bei und übernehmen dabei unterschiedliche
Funktionen.
5.3
LSEC induzieren regulatorische CD4+ T-Zellen unter
homöostatischen und inflammatorischen Bedingungen
5.3.1
TLSEC supprimieren die Aktivierung von CD8+ T-Zellen und die
Pathogenese einer Colitis
Die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC unter nicht-polarisierenden
Bedingungen führte zur Induktion von regulatorischen T-Zellen, die die Proliferation
von CD4+ T-Zellen supprimieren können (Kruse, Neumann et al. 2009). Bisher war
unklar, ob auch die Aktivierung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen durch TLSEC beeinflußt
werden kann. In der hier vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die suppressorische
Funktion von TLSEC auf CD8+ T-Zellen demonstriert. In einem in vitro Suppressionsassay waren die Proliferation und die Expression von Effektorzytokinen von CD8+ TZellen in der Anwesenheit von TLSEC im Vergleich zu naiven CD4+ T-Zellen signifikant
reduziert. Die TLSEC wirkten gleichermaßen suppressiv wie ex vivo isolierte Treg. In
dieser Arbeit wurde zudem die selektive Fähigkeit der LSEC in der Leber demonstriert,
die darmspezifischen Homingrezeptoren auf TLSEC zu induzieren. Demzufolge war es
von großem Interesse, ob TLSEC in der Lage sind die Ausbildung einer T-Zellvermittelten
Entzündung
im
Darm
zu
inhibieren.
Wurden
TLSEC
mit
den
entzündungsauslösenden naiven CD4+ T-Zellen in Rag1-/- Mäuse transferiert, wurde
eine teilweise signifikante Milderung der Pathogenese der Colitis beobachtet. Der
alleinige Transfer von TLSEC führte nicht zur Entstehung einer Darmentzündung und
demonstriert, dass TLSEC nicht in pro-inflammatorische T-Zellen differenzieren.
Regulatorische T-Zellen sind durch die Expression zahlreicher Markerproteine
gekennzeichnet, die im Zusammenhang mit deren regulatorischen Eigenschaften
stehen. Eine Analyse der TLSEC ergab, dass die Zellen zu einem hohen Anteil Helios
exprimierten, ein Transkriptionsfaktor spezifisch für Treg (Thornton, Korty et al. 2010,
Himmel, MacDonald et al. 2013). Des Weiteren wurde für TLSEC eine verstärkte
102
Diskussion
Expression von ENTPD-1, sowie der zytolytisch-wirkenden Moleküle Granzym B und
Perforin ermittelt.
Regulatorische T-Zellen supprimieren die Aktivierung und Proliferation von naiven TZellen, können aber auch pro-inflammatorische CD4+ T-Zellen und zytotoxische CD8+
T-Zellen regulieren (Levings, Sangregorio et al. 2001, Suvas, Kumaraguru et al. 2003).
In der hier vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Suppression der Effektorfunktion
CD8+ T-Zellen durch TLSEC demonstriert. Die Suppression von CD8+ T-Zellen durch
leberaktivierte regulatorische T-Zellen könnte eine große Bedeutung für die
Pathogenese einer Autoimmunhepatitis haben, wie durch vorangegangene Studien
unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt wurde (Kruse, Neumann et al. 2009). Für die
Suppression von Th Zellen durch Treg wurde gezeigt, dass die Treg Th-spezifische
Transkriptionsfaktoren exprimieren um die entsprechenden Th Zellen zu supprimieren
(Chaudhry, Rudra et al. 2009, Koch, Tucker-Heard et al. 2009, Zheng, Chaudhry et al.
2009). Für CD8+ T-Zellen ist eine transkriptionelle Anpassung von Treg nicht
beschrieben. Es kann spekuliert werden, ob evtl. das Organ der Entzündung relevant
ist für die Suppression der CD8+ T-Zellen und demzufolge nur durch Treg erfolgen kann
die in dem entsprechenden Organ aktiviert worden sind. Die Pathogenese einer
Autoimmunhepatitis ist bisher nur unzureichend aufgeklärt. Es wird vermutet, dass die
Enzündung durch eine mangelnde Regulation von autoreaktiven Zellen des adaptiven
Immunsystems entsteht (Oo, Hubscher et al. 2010). Demzufolge könnte man in
weiterführenden Studien zum einen die Zytotoxizität der TLSEC inhibierten CD8+ TZellen analysieren und die Entstehung von leberaktivierten regulatorischen T-Zellen in
vivo untersuchen.
Für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Darm sind regulatorische T-Zellen enorm
wichtig (Barnes and Powrie 2009). Dies wird besonders deutlich, wenn eine Mutation
im FoxP3 Gen die Ausbildung von funktionellen Treg verhindert, wie beim IPEXSyndrom, und zur Ausbildung von schweren intestinalen Entzündungen führt (Powell,
Buist et al. 1982). In zahlreichen murinen Krankheitsmodellen für Darmentzündung
wurde gezeigt, dass der adoptive Transfer von Treg den Verlauf einer Colitis mildern
kann (Mottet, Uhlig et al. 2003, Hadis, Wahl et al. 2011). In der hier durchgeführten
Studie zeigte der Ko-Transfer von TLSEC zusätzlich zu den naiven CD4+ T-Zellen eine
103
Diskussion
signifikante Reduktion eines Großteils der analysierten Krankheitsparameter. Den
größten Einfluss hatten die TLSEC beim Ko-Transfer mit naiven CD4+ T-Zellen auf die
Anzahl der Lymphozyten der Lamina propria, die aus dem Colon isoliert wurden und
auf die Frequenz der CD4+ Zellen im Colongewebe selbst. Die Daten deuten darauf
hin, dass entweder die Einwanderung oder die Proliferation der CD4+ T-Zellen, bzw.
eine Kombination aus beiden Faktoren unterdrückt wurde. Eine Suppression der
Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine der CD4+ T-Zellen durch TLSEC könnte
weiterführend durch in vitro Suppressionsassays bzw. ex vivo über die Quantifizierung
von Zytokinen in Kulturüberständen entzündeter Colonabschnitte erfolgen. Die
Ergebnisse dieser Arbeit zeigten aber auch, dass durch den Ko-Transfer von TLSEC
zusätzlich zu naiven CD4+ T-Zellen die Colonlänge und der histopathologische Score
nicht verändert wurde. Diese Beobachtung könnte in einer zeitlichen Versetzung
zwischen Zellinfiltration und Gewebeschädigung bzw. -reparatur begründet sein.
Weiterführende Studien sollten demzufolge Analysen mehrerer Zeitpunkte der
Erkrankung einschließen. Für Treg ist beschrieben, dass die Suppression von
Effektorzellen erst relativ spät staffindet, um zuvor eine ausreichende Proliferation der
Treg zu gewährleisten (Klein, Khazaie et al. 2003). Diese Daten würden den Schluss
zulassen,
dass
die
pro-inflammatorischen
Th
Zellen
bereits
einen
großen
Gewebeschaden verursacht haben, bevor eine Regulation durch TLSEC stattfindet und
eine mögliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen den unterschiedlich regulierten
Krankheitsparametern liefen. In dem hier durchgeführten Versuch führte der alleinige
Transfer von naiven CD4+ T-Zellen zu einem schwereren Krankheitsverlauf, als für das
Modell beschrieben ist (Griseri, Asquith et al. 2010). Das Mausmodell der
Transfercolitis ist stark von den hygienischen Bedingungen der Tierhaltung und der
damit verbundenen Zusammensetzung der Mikrobiota im Darm abhängig. Die sehr
starke Entzündung und der schnellere Krankheitsverlauf muss bei der Suppression
durch TLSEC berücksichtigt werden. Um die Stärke der suppressiven Kapazität der TLSEC
einzuordnen, könnte man parallel FoxP3+ Treg applizieren und die regulatorischen TZellen miteinander vergleichen. Wenn für die Treg eine vergleichbare Suppression der
Darmentzündung ermittelt würde, dann wäre auch die inhibitorische Kapazität der TLSEC
als besonders hoch einzuschätzen.
104
Diskussion
Die suppressive Fähigkeit regulatorischer T-Zellen kann sowohl durch lösliche, als
auch durch zellgebundene Effektormoleküle vermittelt werden (Übersicht in (Wing and
Sakaguchi 2012)). Die inhibitorischen Moleküle wirken zum einen direkt auf die zu
supprimierende Zellpopulation, bzw indirekt, in dem z.B. die T-Zell-Aktivierung durch
antigenpräsentierende Zellen unterdrückt wird. In Vitro Studien dieser Arbeit zeigten
erstmals, dass LSEC aktivierte CD4+ T-Zellen (TLSEC) zu einem Großteil den
Transkriptionsfaktor Helios exprimieren. Somit könnten die TLSEC, erweitert zu den
vorhergehenden Untersuchungen, als CD25-FoxP3-Helios+ bezeichnet werden. In der
hier vorliegenden Arbeit erfolgte erstmals eine Analyse der Expression von ENTPD-1,
Granzym und Perforin. Es wurde gezeigt, dass T LSEC diese Moleküle stärker
exprimieren als TSAPC. Die Mechanismen über die TLSEC suppressiv wirken sind bisher
noch nicht identifiziert. Frühere Studien zeigten bereits, dass für die Suppression durch
TLSEC Zell-Zell-Kontakt notwendig ist, da eine Trennung der TLSEC von den Responder
Zellen mittels Transwell in vitro eine Aufhebung der Inhibition bewirkte (Kruse,
Neumann et al. 2009). Für die Relevanz der analysierten Moleküle würde sprechen,
dass die Wirkung dieser Effektormoleküle direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Mittels
spezifischer Inhibitoren könnte man weiterführend die Induktion von Apotose durch
Granzym und Perforin verhindern und deren Notwendigkeit für die TLSEC bestätigen
(Trapani and Smyth 2002). Zusätzlich sollte man die Relevanz der detektierten
Effektormoleküle mittels knockout Mäusen bestätigen.
Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit können zur Aufklärung der Mechanismen
der Regulation einer Autoimmunhepatitis beitragen, und zeigen, dass auch in der Leber
selbst induzierte TLSEC einen Einfluss auf die Pathogegese eine T-Zell-vermittelten
Hepatitis haben könnten. Für die Therapie einer Autoimmunhepatitis müssen zunächst
die Ursachen für die mangelnde Regulation der auto-reaktiven T-Zellen aufgeklärt
werden um anschließend z.B. eine Induktion von regulatorischen T-Zellen zu fördern
bzw. deren Funktionalität zu unterstützen. Die Migration von leberaktivierten
regulatorischen CD4+ T-Zellen in den Darm und das GALT demonstriert, dass nicht nur
im Darm selbst generierte Treg wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen
Homöostase sind, sondern, verbunden über den enterohepatischen Kreislauf, auch Treg
der Leber notwendig sind.
Dennoch sind weitere Analysen der Entstehung und
Wirkweise der TLSEC für das Verständnis der Toleranzentstehung essentiell.
105
Diskussion
5.3.2
LSEC induzieren suppressive IL-10+ Th1 Zellen abhängig vom
Notchsignalweg
Im vorangegangenen Kapitel wurde die suppressive Kapazität von CD4+ T-Zellen
beschrieben, die unter homöstatischen Bedingungen durch LSEC aktiviert wurden. Für
diese Arbeit war es auch von großem Interesse, welchen Einfluss LSEC auf die
Aktivierung von CD4+ T-Zellen haben, wenn in der Leber selbst bereits eine
Entzündung vorliegt. Demzufolge wurden CD4+ T-Zellen analysiert, die unter Th1polarisierenden Bedingungen, d.h. in Gegenwart von IL-12, durch LSEC aktiviert
wurden. Die Limitierung von Th1-vermittelten Entzündungsreaktionen ist notwendig um
Gewebeschädigung und die Entstehung von Autoimmunität zu verhindern. Das antiinflammatorische Zytokin IL-10 kann die Proliferation dieser pro-inflammatorischen Th
Zellen inhibieren und damit zu T-Zell Homöostase beitragen. Interessanterweise wird
IL-10 durch Th1 Zellen selbst exprimiert und trägt damit zur Autoregulation von Th1vermittelten
Entzündungreaktionen
während
einer
Vielzahl
von
infektiösen
Erkrankungen bei (Anderson, Oukka et al. 2007, Jankovic, Kullberg et al. 2007, Sun,
Madan et al. 2009). In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass LSEC auf Th1 Zellen
(Th1LSEC) verstärkt das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 hochregulieren, während
SAPC (Th1SAPC) dazu nur in geringem Umfang in der Lage waren. Die Expression von
IFNγ war hingegen bei Th1SAPC und Th1LSEC vergleichbar.
In einem DTH Model entwickelten adoptiv transferierte und in vivo re-aktivierte Th1LSEC
keine
Entzündungsreaktion,
sondern
supprimierten
sogar
eine Th1-induzierte
Inflammation. Die Blockade des IL-10 Signals mittels anti-IL-10 Rezeptor Antikörper
resultierte in der Aufhebung der Suppression durch Th1LSEC. Die suppressive Wirkung
von IL-10 beruht unter anderem auf der Inhibition der Zytokinsekrektion sowie der
Expression von MHCII und ko-stimulatorischen Rezeptoren auf Makrophagen und DC
(de Waal Malefyt, Abrams et al. 1991, Ding, Linsley et al. 1993, Allavena, Piemonti et
al. 1998). Demzufolge kann vermutet werden, dass die Th1LSEC durch ihr sekretiertes
IL-10 die in vivo Re-aktivierung der entzündungsauslösenden Th1SAPC unterdrückten
und somit die Entstehung der DTH-Reaktion verhinderten.
106
Diskussion
Die Analyse der Mechanismen, die für die Hochregulation der IL-10 Expression in
Th1LSEC verantwortlich sein könnten, ergab, dass IL-27 und ICOS hier keine Rolle
spielten, obwohl für beide Molküle eine Relevanz für die Induktion von IL-10 in einem
anderen Kontext belegt ist (Witsch, Peiser et al. 2002, Kroczek, Mages et al. 2004,
Fitzgerald, Zhang et al. 2007). Arbeitsgruppeneigene Studien belegten bereits den
Einfluss des Notch-Signalweges auf die IL-10 Expression von Th1 Zellen (Rutz, Janke
et al. 2008, Kassner, Krueger et al. 2010, Neumann, Heinrich et al. 2014). In der hier
durchgeführten Studie wurde ex vivo und tw. in situ gezeigt, dass LSEC konstitutiv die
vier
Notch-Liganden
Dll1,
Dll4,
Jagged1
und
Jagged2
exprimieren.
In
vorangegangenen Studien bewirkte der Signalweg über die Liganden Dll1 und Dll4 die
höchste IL-10 Expression auf Th1 Zellen, während die Liganden der Jagged Familie
nur beschränkt dazu in der Lage waren (Rutz, Janke et al. 2008, Kassner, Krueger et
al. 2010). Dementsprechend erfolgte zunächst eine Blockade von Dll1 und Dll4 in den
Th1LSEC Kulturen, doch dies resultierte nur in einer teilweisen Inhibition der IL-10
Expression. Die Ergebnisse könnten zum einen in einer nicht vollständigen Blockade
der Dll Liganden durch die Antikörper begründet sein, oder zum anderen den Schluss
zulassen, dass die Jagged Liganden den Mangel an Dll teilweise kompensieren
können und folglich auch eine Rolle für die hohe IL-10 Expression in Th1LSEC spielen.
Übereinstimmend mit dieser Schlußfolgerung demonstrierten Burghardt et al, dass
Hepatozyten über Jagged1 IL-10 in Th1 Zellen hochregulieren (Burghardt, Erhardt et
al. 2013). Eine vollständige Blockade des Notch-Signalweges, und damit des Signals
über alle Liganden, in Th1LSEC Kulturen mittels γ-Sekretaseinhibitor, inhibierte selektiv
die Expression von IL-10. Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch die Verwendung
von Notch1/2ko CD4+ T-Zellen für die Ko-Kultur mit LSEC, bei denen die
Hochregulation der IL-10 Expression im Vergleich zu den Notch1/2wt T-Zellen
aufgehoben war. Demzufolge erfolgte die Induktion von IL-10 über die Notchmoleküle 1
und 2, andere Notch-Rezeptoren konnten die Notch1/2 Defizienz nicht kompensieren.
Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die IL-10 Expression in Th1LSEC über den
Notch-Signalweg vermittelt wird.
Welche Notchliganden auf den LSEC im Einzelnen für die IL-10 Hochregulation in TZellen notwendig sind, könnte man fortführend mit einer selektiven Deletion einzelner
Liganden auf Endothelzellen in vivo analysieren. Als funktionelle Analyse könnte man
107
Diskussion
daraufhin eine Infektion mit Toxoplasma gondii durchführen, ein Mausmodel, bei dem
IL-10 einen regulierenden Einfluss auf die entstehende Leberentzündung hat
(Jankovic,
Kullberg
et
al.
2007,
Neumann,
Heinrich
et
al.
2014).
Mittels
Intravitalmikroskopie der Leber und die Verwendung von Notch-Reporter Mäusen, die
bei einem Notch-Signal Luciferase exprimieren und bei systemisch vorliegenden
Luciferin daraufhin ein Lichtsignal generieren, könnte die Interaktion von T-Zellen mit
LSEC über Notch nachgewiesen werden.
Weiterhin stellt sich die Frage, welche Signale für die Hochregulation von IL-10 auf TZellen durch LSEC notwendig sind und ob diese gleichzeitig oder unabhängig
voneinander erfolgen können. Studien unserer Arbeitsgruppe zeigten die Abhängigkeit
der IL-10 Expression in Notch-modulierten T-Zellen von einem STAT4 Signal, wie es
IL-12 und IL-27 induzieren (Rutz, Janke et al. 2008). Übereinstimmend mit diesen
Daten, konnte ohne die Zugabe von IL-12 kein IL-10 in T-Zell-LSEC Kokulturen
induziert werden. Auch das von LSEC sezernierte IL-27 war nicht ausreichend, um ein
starkes STAT4 Signal zu generieren und damit sowohl IFNγ und IL-10 hochregulieren
zu können. Während einer Leberentzündung wird IL-12 allerdings von Leber DC
exprimiert und würde demnach auch in den Sinusoiden bzw. dem Parenchym vorliegen
(O'Connell, Son et al. 2003, Bosma, Metselaar et al. 2006). Zusätzlich zu IL-12 ist ein
gleichzeiges Signal über den T-Zell-Rezeptor und Notch notwendig (persönliche
Mitteilung von Jonas Ahlers und Derk Amsen). Das bedeutet, dass für die Entstehung
von IL-10+ Th1LSEC das Antigen in der Leber vorliegen muss, um durch die LSEC
präsentiert zu werden. Über die Visualisierung der immunologischen Synapsenbildung
bei der Aktivierung einer T-Zelle, könnte man überprüfen, ob beide Rezeptoren kolokalisieren.
Unabhängig von den Zellen des Immunsystems ist der Notch-Signalweg für
Endothelzellen hauptsächlich im Rahmen der Regulation der Angiogenese beschrieben
(Hellstrom, Phng et al. 2007, Lobov, Renard et al. 2007, Suchting, Freitas et al. 2007).
Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit. Die Notwendigkeit
der Expression von Notch1 und Jagged1 wurde während der Leberregeneration in
Ratten analysiert (Kohler, Bell et al. 2004). Kohler et al. demonstrierten, dass bereits
kurze Zeit nach partieller Hepatektomie beide Moleküle stark hochreguliert werden und
108
Diskussion
damit zur Zelldifferenzierung und –wachstum beitragen könnten. Eine Deletion von
Notch 1 führte hingegen zu einer spontanen Hyperplasie von Gefäßzellen
(Dill,
Rothweiler et al. 2012), während eine Überexpression von Dll4 in Endothelzellen eine
diffuse Gefäßneubildung veranlasst (Izumi, Helker et al. 2012). In der überwiegenden
Zahl, der an dem Alagille Syndrom erkrankten Patienten, wird eine Mutation von
Jagged-1 detektiert. Eine Erkrankung, die unter anderem durch eine chronische
Leberentzündung gekennzeichnet ist (Krantz, Piccoli et al. 1999). Möglicherweise wird
diese
Entzündung
durch
eine
mangelnde
Regulation
durch
leberaktivierte
regulatorische T-Zellen begünstigt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren erstmals die Modulation von CD4+ T-Zellen
durch LSEC über den Notch-Signalweg. Die Daten lassen den Schluß zu, dass die
Notch-abhängige
Induktion von IL-10+ Th1 Zellen durch LSEC einen weiteren
Mechanismus zur Entstehung von Toleranz in der Leber darstellt und dazu beitragen
könnte, T-Zell-vermittelte Entzündungen in der Leber zu begrenzen (Abbildung 17).
Erst kürzlich wurde die Jagged1-abhängige IL-10 Induktion in Th1 Zellen durch
Hepatozyten beschrieben (Burghardt, Erhardt et al. 2013). Auch pDC, die in der Leber
in einer höheren Frequenz vorliegen, als in anderen Organen, sind in der Lage über
Dll4 die IL-10 Expression in Th1 Zellen hochzuregulieren (Kassner, Krueger et al.
2010). Die Daten belegen, dass die Hochregulation von IL-10 auf Th1 Zellen eine
Eigenschaft mehrerer Leber APC ist und davon abhängt, durch welche APC die T-ZellAktivierung stattfindet. Unter der Berücksichtigung der hier ermittelten Ergebnisse zur
spezifischen Migration von Th1LSEC Zellen in Darm und GALT, ermöglicht durch die
hohe Retimolsäure-abhängige Expression des darmspezifischen Homingrezeptors
α4β7-Integrin, ist es sehr wahrscheinlich, dass die suppressorischen Th1LSEC auch zur
T-Zell-Homöostase im Darm beitragen. Die Kombination der migratorischen und
suppressorischen Eigenschaften der Th1LSEC verdeutlicht die herausragende Stellung
der Lebersinusendothelzellen in der Leber bei der Induktion von Toleranz.
109
Diskussion
Abbildung 17: Schematische Darstellung der Differenzierung und suppressorischen
Eigenschaften von Th1LSEC in der Leber und Darm.
+
Naive CD4 T-Zellen oder pro-inflammatorische Th1 Zellen immigrieren in die Leber, transmigrieren bei einer Leberentzündung verstärkt durch das Endothel in das Parenchym. Die
antigenspezifische Reaktivierung durch Lebersinusendothelzellen (LSEC) und der Bindung von
Notch-Liganden Dll und Jagged in der Präsenz von IL-12 induziert die verstärkte Expression
des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in LSEC-aktivierten Th1 Zellen (Th1LSEC). Über
Retinolsäure (RA) der LSEC wird die Hochregulation des darmspezifischen Homingrezeptors
α4β7-Integrin in Th1LSEC induziert und ermöglicht eine Migration der T-Zellen in den Darm und
GALT. Die Th1LSEC wirken durch IL-10 suppressorisch und könnten so einen regulatorischen
Einfluss auf die Entstehung und Verlauf von Entzündungsreaktionen in Leber und Darm haben.
110
6.
111
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Leber verfügt über einzigartige immunregulatorische Funktionen, die eher zur
Induktion von Toleranz führen, als eine Immunantwort auszulösen. Durch die
Expression von von koinhibitorischen Rezeptoren und immunsupprimierenden
Mediatoren übt die Leber einen entscheidenden Einfluss auf die Homöostase des
gesamten Organismus aus. Das spezielle Milieu der Leber wird durch die
Zusammensetzung und charakteristischen Eigenschaften der Zellpopulationen in den
Sinusoiden und dem Parenchym bestimmt. Durch den geringen Durchmesser der
Sinusoide haben passierende T-Zellen aus dem Blutstrom intensiven Kontakt mit den
Lebersinusendothelzellen (LSEC), Kupffer Zellen und dendritischen Zellen der Leber.
LSEC und die anderen leberresidenten antigenpräsentierenden Zellen (LAPC) nehmen
Antigen aus dem Blutstrom auf und präsentieren diese über MHC Moleküle an TZellen. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, auf welche Art und Weise eine
Antigenpräsentation durch LSEC an CD4+ T-Zellen zur Induktion von Toleranz beiträgt
und inwieweit sich die LSEC dabei von den anderen Leber APC unterscheiden.
Der tolerogene Einfluss der Leber ist nicht nur auf das Organ selbst beschränkt,
sondern spielt auch eine Rolle in peripheren Geweben. Damit T-Zellen lokal wirken
können, müssen sie in die entsprechenden Gewebe migrieren. In dieser Arbeit wurde
gezeigt, dass LSEC bei einer antigenspezifischen Aktivierung von naiven CD4+ TZellen und Th1 Zellen in vitro die darmspezifischen Homingrezeptoren α4β7-Integrin
und z.T. CCR9 auf den T-Zellen hochregulierten, während die LAPC nicht dazu in der
Lage waren. Die Induktion der Darmhoming-Repetoren war abhängig von LSECeigener Retinolsäure. In in vivo Homingassays wurde für LSEC-re-aktivierte Th1 Zellen
eine präferentielle Einwanderung in den Darm und das darmassoziierte lymphatische
Gewebe (GALT) nachgewiesen.
Die Modulation der Effektorfunktion von T-Zellen bzw. die Induktion von Apoptose sind
wichtige Mechanismen der Toleranzentstehung in der Leber. In vitro Kokulturen von
LSEC bzw. LAPC mit naiven CD4+ T-Zellen bzw. Th1 Zellen zeigten, dass LSEC die
Induktion
bzw.
Expression
des
pro-inflammatorischen
verringerten, während die LAPC vorrangig Apotose induzierten.
112
Zytokins
Interferon-γ
Zusammenfassung
Die Aktivierung von CD4+ T-Zellen durch LSEC unter homöostatischen Bedingungen
führt zur Induktion von FoxP3-Helios+ regulatorischen T-Zellen (TLSEC). Mittels in vitro
Suppressionsassays wurde die Suppression der Proliferation und Expression von
Effektorzytokinen von CD8+ T-Zellen analysiert. TLSEC waren gleichermaßen suppressiv,
wie ex vivo-isolierte regulatorische T-Zellen. Im Zusammenhang mit den darmspezifischen Migrationseigenschaften wurde in einem Transfercolitismodel in vivo die
regulatorische Kapazität der TLSEC auf die Entstehung einer Darmentzündung
untersucht und ansatzweise bestätigt.
Wurden CD4+ T-Zellen unter Th1-polarisierenden Bedingungen durch LSEC in vitro
aktiviert, dann entstanden Th1 Zellen, die neben dem pro-inflammatorischen IFNγ
zusätzlich das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 exprimierten. Diese Th1LSEC wirkten
nicht mehr pro-inflammatorisch, sondern supprimierten sogar eine Th1-vermittelte
Entzündung in vivo. Die Induktion von IL-10+ Th1 Zellen durch den Notch-Signalweg ist
beschrieben. Hier wurde gezeigt, dass LSEC die Notch-Liganden der Dll- und JaggedFamilie auf einem hohen Niveau exprimierten. Die Blockade des Notch-Signalwegs
mittels eines γ-Sekretaseinhibitors bzw. die Verwendung von Notch-defizienten CD4+
T-Zellen resultierten in einer spezifischen Inhibition der IL-10 Expression in Th1LSEC.
Aus den Ergebnissen folgt, dass LSEC, abhängig vom Notch-Signalweg, suppressive
IL-10+ Th1 Zellen induzieren.
Zusammenfassend wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass LSEC in vitro
sowohl unter homöostatischen, als auch unter inflammatorischen Bedingungen
regulatorische CD4+ T-Zellen induzieren. Zusätzlich haben LSEC in der Leber die
einzigartige Fähigkeit, durch die Hochregulation von darmspezifischen Homingrezeptoren auf CD4+ T-Zellen, nicht nur zur Immunregulation in der Leber selbst,
sondern auch im Darm beizutragen.
Schlagwörter: Lebersinusendothezellen, CD4+ T-Zellen, Th1 Zellen, IL-10, Notch,
gewebespezifische Migration, Toleranz
113
7.
114
Summary
Summary
The liver has unique immune regulatory poperties that results in the induction of
tolerance rather than inflammatory responses to antigens. By the expression of
coinhibitory molecules and immunosuppressive mediators the liver plays an important
role for systemic homeostasis. The unique microenvironment and the cellular
constitution of the sinusoids and the parenchyma determine the outcome of hepatic
immune responses. Due to the small diameter of the blood vessels, passing T cells can
intensively interact with the liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), Kupffer cells and
dendritic cells. Nutrient- and hepatotrophic antigens are taken up by various liver
antigen presenting cells (APC) and are presented via major histocompatibility complex
class II molecules to CD4+ T cells. The present study addressed the question how the
antigen-specific activation of CD4+ T cells by LSEC contributes to tolerance induction
and analyzed the differences between LSEC and other liver APC during this
interaction.
The tolerogenic capacity of the liver is not restricted to the organ itself, but has rather
systemic relevance. To affect the local immune response, T cells have to migrate into
the respective tissues. Antigen-specific activation of naive CD4+ T cells and Th1 cells
by LSEC in vitro induced expression of the gut-specific homing receptors α4β7-integrin
and partially CCR9 on CD4+ T cells, whereas activation by LSEC-negative liver APC
(LAPC) failed to increase receptor expression. Induction of gut homing receptors
depended on retinoic acid, provided by LSEC. Consequently, LSEC-modulated Th1
cells migrated preferentially into the gut and gut-associated lymphoid tissue (GALT), as
confirmed by homing assays in vivo.
Both, the induction of apoptosis and the modulation of effector cell properties are
possible underlying mechanisms contributing to hepatic tolerance. By in-vitro-culture
systems, the capacity of LSEC to prevent or even inhibit expression of interferon (IFN)γ in CD4+ T cells was demonstrated. In contrast, LAPC induced or maintained IFNγ
expression in CD4+ T cells and promoted T cell apoptosis, in addition.
The antigen-specific activation of naive CD4+ T cells by LSEC under steady state
conditions induced the generation of regulatory FoxP3-Helios+CD4+ T cells (TLSEC).
115
Summary
TLSEC were able to suppress proliferation and cytokine secretion of CD8+ T cells in vitro,
to the same extent as ex vivo isolated regulatory T cells.
According to their gut-specific migratory capacities, TLSEC even suppress the
pathogenesis of a T cell-mediated intestinal inflammation in a transfer colitis model in
vivo.
When CD4+ T cells are primed by LSEC under Th1-polarizing conditions in vitro, IL-10+
Th1 cells were generated. Due to the expression of the anti-inflammatory cytokine IL10 LSEC-activated Th1 cells (Th1LSEC) failed to promote a delayed type hypersensitivity
(DTH) response, but rather suppressed a Th1-mediated inflammation in vivo. IL-10
expression in Th1 cells facilitates self-limitation of immune responses and prevents Th1
cell-induced pathology. IL-10+ Th1 cells can be induced via the Notch pathway.
Interestingly, LSEC express high levels of Notch ligands of the Dll and Jagged family.
When Notch signaling was blocked by γ-secretase inhibitor or by the usage of Notchdeficient CD4+ T cells in vitro IL-10 induction by LSEC was selectively impaired. In
conclusion, LSEC induce IL-10+ Th1 cells via the Notch pathway.
In the present study the induction of regulatory CD4+ T cells by LSEC under steady
state and inflammatory conditions was demonstrated. In addition, LSEC have the
outstanding capacity in the liver to induce gut-specific homing receptors on T cells and
thereby not only contributing to the immune regulation of the liver, but also to intestinal
homeostasis.
Keywords: liver sinusoidal endothelial cells, CD4+ T cells, Th1 cells, IL-10, Notch,
tissue-specific migration, tolerance
116
8.
117
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thymus-expressed chemokine-mediated chemotaxis." J Exp Med 190(9): 1241-1256.
Zheng, W. and R. A. Flavell (1997). "The transcription factor GATA-3 is necessary and
sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells." Cell 89(4): 587-596.
Zheng, Y., A. Chaudhry, A. Kas, P. deRoos, J. M. Kim, T. T. Chu, L. Corcoran, P.
Treuting, U. Klein and A. Y. Rudensky (2009). "Regulatory T-cell suppressor program
co-opts transcription factor IRF4 to control T(H)2 responses." Nature 458(7236): 351356.
145
9.
I
Anhänge
Anhänge
9.1
Abkürzungsverzeichnis
AHR
Ahryl-Hydrocarbon-Rezeptor
AICD
activation-induced cell death
APC
antigenpräsentierende Zelle
BCR
B-Zellrezeptor
BSA
bovines Serumalbumin
CBA
cytometric bead assay
CCL
CC-Chemokinligand
CCR
CC-Chemokinrezeptor
CD
cluster of differentiation
CXCR
CXC-Chemokinrezeptor
cDMEM
Komplett-DMEM
CFDA-SE
5-,6-Carboxyfluorescein-diacetat-succinimidylester
CFSE
Carboxyfluorescein-succinimidylester
cRPMI
Komplett-RPMI
CRTh2
Prostaglandin D2-Rezeptor
CTLA-4
cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
DAPI
4-,6-Diamidin-2-phenylindol
DC
dendritische Zelle
Dll
Delta-like
DMEM
Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DRFZ
Deutsches Rheuma-Forschungszentrum
DTH
delayed type hypersensitivity
II
Anhänge
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
FACS
fluorescence activated cell sorting
FCS
Fötales Kälberserum
FEM
Forschungseinrichtung für experimentelle Medizin
der Charité
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FoxP3
Forkhead Box P3
FSC
Vorwärtsstreulicht
GALT
darmassoziiertes lymphatisches Gewebe
GARP
glycoprotein A repetititions predominant
gMean
geometrischer Mittelwert der Fluoreszenzintensität
GSI
γ-Sekretase-Inhibitor
HBSS
Hank´s balanced salt solution
HEPES
Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure-Puffer
Hes-1
hairly/enhancer of split-1
HPF
high power field; hochauflösendes Gesichtsfeld
ICAM
intercellular adhesion molecule
ICOS-L
inducible co-stimulator ligand
IFA
Inkomplettes Freund´sches Adjuvant
IFN
Interferon
IgG
Immunglobulin G
IL
Interleukin
IL-R
Interleukin-Rezeptor
IPEX
immune dysregulation, polyendocrinopathy, and Xlinked
III
Anhänge
i.v.
intravenös
ko
knockout
LAP
latency associated peptide
LAPC
LSEC-negative Leber APC
LPL
Lymphozyten der Lamina propria
LPS
Lipopolysaccharid
LSEC
Lebersinusendothelzellen
MACS
magnetic activated cell sorting
MAdCAM-1
Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1
mAk
monoklonaler Antikörper
MHC
major histocompatibility complex;
Haupthistokompatibilitätskomplex
MHCI
MHC-Moleküle der Klasse I
MHCII
MHC-Moleküle der Klasse II
mLN
mesenteriale Lymphknoten
N1/2ko
Notch1/2floxxCD4Cre+
N1/2wt
Notch1/2floxxCD4Cre-
NEAA
nicht-essentielle Aminosäuren
NK-Zelle
Natürliche Killer-Zelle
NKT-Zelle
Natürliche-Killer-T-Zelle
ns
nicht signifikant
NPC
nicht-parenchymatische Zellen
OT-I
OVA-spezifische CD8+ T-Zellen
OT-II
OVA-spezifische CD4+ T-Zellen
IV
Anhänge
OVA
Ovalbumin
OVA-Peptid
Peptid mit der Sequenz: ISQAVHAAHAEINEAGR
PAMP
pathogen associated molecular patterns
PBS
Phosphatgepufferte Salzlösung
PCR
polymerase chain reaction;
Polymerasekettenreaktion
PD-1
prgrammed death 1
PD-L1
programmed death ligand 1
PE
Phycoerythrin
PFA
Paraformaldehyd
PI
Propidiumiodid
P-Lig
P-Selektin-Ligand
pLN
periphere Lymphknoten
PMA
Phorbol- 12-Myristat-13-Acetat
PNAd
peripheral lymph node adressin
PP
Peyer`sche Plaques
PPR
pattern recognition Rezeptor
pTreg
Peripherie-induzierte Treg
RA
retinoic acid; Retinolsäure
RALDH
Retinaldehydrogenasen
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
RT
Raumtemperatur
SAPC
spleen derived antigen presenting cells; APC aus
Milz und Lymphknoten
s.c.
subkutan
V
Anhänge
SSC
Seitwärtsstreulicht
STAT
signal transducer and activator of transcription
TCR
T-Zellrezeptor
TGFβ
transfrorming growth factor-β; transformierender
Wachstumsfaktor
Th
T-Helfer
Th1LAPC
LAPC-aktivierte Th1 Zellen
Th1LSEC
LSEC-aktivierte Th1 Zellen
Th1SAPC
SAPC-aktivierte Th1 Zellen
TLAPC
LAPC-aktivierte CD4+ T-Zellen
TLR
Toll-like Rezeptor
TLSEC
LSEC-aktivierte CD4+ T-Zellen
tTreg
Thymus-induzierte Treg
Treg
regulatorische T-Zellen
TSAPC
SAPC-aktivierte CD4+ T-Zellen
TSDR
Treg-specific demethylated region
TNF
Tumor-Nekrose-Faktor
VCAM
vascular cell adhesion molecule
WT
Wildtyp
VI
Anhänge
9.2
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Komplexität der Th Zellpopulationen und regulatorischen TZellen. ......................................................................................................................... 12
Abbildung 2: Schematischer Aufbau der Leber............................................................ 17
Abbildung 3: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf CD4+
T-Zellen. ..................................................................................................................... 63
Abbildung 4: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose bei CD4+ TZellen. ......................................................................................................................... 65
Abbildung 5: In vitro Suppression von CD8+ T-Zellen durch TLSEC. .............................. 68
Abbildung 6: In Vivo Suppression einer Transfercolitis durch TLSEC. ............................ 70
Abbildung 7: Charakterisierung der suppressiven Eigenschaften der TLSEC. ................ 73
Abbildung 8: Expression gewebespezifischer Homingrezeptoren auf Th1
Zellen. ......................................................................................................................... 75
Abbildung 9: Expression von IFNγ und Induktion von Apoptose auf Th1
Zellen. ......................................................................................................................... 78
Abbildung 10: Induktion von IL-10 auf Th1 Zellen durch LSEC ................................... 79
Abbildung 11: In vivo Suppression einer DTH-Reaktion durch Th1LSEC. ...................... 82
Abbildung 12: Einfluss von IL-27 und ICOS auf die IL-10 Expression von
Th1LSEC. ...................................................................................................................... 83
Abbildung 13: Expression der Notchliganden Dll1, Dll4, Jagged1 und
Jagged2 durch LSEC. ................................................................................................. 85
VII
Anhänge
Abbildung 14: Einfluss der Blockade von Dll1 und Dll4 auf die IL-10
Expression von Th1LSEC. ............................................................................................. 87
Abbildung 15: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC durch γSekretaseinhibitor. ...................................................................................................... 89
Abbildung 16: Inhibition der IL-10 Expression auf Th1LSEC aus NotchRezeptor-defizienten Mäusen. .................................................................................... 91
Abbildung
17:
Schematische
Darstellung
der
Differenzierung
und
suppressorischen Eigenschaften von Th1LSEC in der Leber und Darm....................... 110
VIII
Anhänge
9.3
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Sequenzen der Primer und Annealing-Temperatur ..................................... 34
Tabelle 2: Fluorochrome und ihre Adsorptions- und Emissionsmaxima ....................... 35
Tabelle 3: Antikörper für die Durchflusszytometrie, Spezies Maus .............................. 36
Tabelle 4: Antikörper für die Immunfluoreszenz und Immunpathologie ........................ 38
Tabelle 5: Antikörper für die Aktivierung und Blockade, Spezies Maus ........................ 39
Tabelle 6: Pipettieransatz reverse Transkription .......................................................... 52
Tabelle 7: Programm reverse Transkriptase PCR ....................................................... 53
Tabelle 8: Pipettieransatz real-time PCR ..................................................................... 54
Tabelle 9: Programm real-time PCR............................................................................ 55
Tabelle 10: Scoringübersicht Klinischer Score der Colitis ............................................ 58
IX
Anhänge
9.4
Erklärung
Hiermit erkläre ich, Christine Rudolph, geboren am 08.11.1981 in Dresden, die
vorliegende Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt zu haben
und alle verwendeten Hilfsmittel und Inhalte aus anderen Quellen als solche kenntlich
gemacht zu haben. Des Weiteren versichere ich, dass die vorliegende Arbeit nie in
dieser oder anderer Form Gegenstand eines früheren Promotionsverfahrens war. Die
dem angestrebten Promotionsverfahren an der Fakultät III der Technischen Universität
Berlin zugrunde liegende Promotionsordnung ist mir bekannt.
Berlin, 28.10.2014
Christine Rudolph
X
Anhänge
9.5
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich den Personen danken, ohne deren vielfältige
Unterstützung diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Katja Klugewitz danke ich für die Zurverfügungstellung des Promotionsthemas.
Mein besonderer Dank gilt Alexander Scheffold, Britta Siegmund und dem SFB 633,
die es mir ermöglicht haben, meine Dissertation auch nach dem Ausscheiden von Katja
Klugewitz fortzuführen.
Alexander Scheffold danke ich sehr für die thematische Neuausrichtung meines
Projektes, die sehr gute Betreuung und die zahlreichen anregenden Diskussionen
während meiner Arbeit in seiner Gruppe.
Britta Siegmund, Gerd Burmester und Andreas Radbruch danke ich, dass Sie mir die
Möglichkeit gaben dieses Projekt an ihren Kliniken bzw. Institut durchführen zu können.
Roland Lauster und Jens Kurreck danke ich für die Begutachtung meiner Dissertation
von Seiten der Technischen Universität Berlin und für die konstruktive Unterstützung
während des Promotionsverfahrens, besonders durch Roland Lauster.
Katrin Neumann, Marko Janke und Christian Neumann möchte ich für Ihre
Unterstützung während der tierexperimentellen Arbeiten danken.
Anja Kühl und Simone Spiekermann danke ich für die Durchführung der immunhistologischen und –pathologischen Untersuchungen dieser Arbeit.
Ute Hoffmann bin ich sehr dankbar für das akribische Korrekturlesen der
Dissertationsschrift und für die tolle Zusammenarbeit mit ihr und der AG Hamann im
Rahmen verschiedenster Anlässe. Ebenso danke ich Marko Janke für die Korrektur der
Dissertation.
XI
Anhänge
Allen jetzigen und früheren Mitarbeitern der AG Scheffold und der ehemaligen AG
Klugewitz möchte ich ganz herzlich für die freundliche und konstruktive Atmosphäre
innerhalb und außerhalb des Labors danken.
Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern der Gastroenterologie des CBF in Steglitz. Die
überaus freundliche und fruchtbare Zusammenarbeit aller Arbeitsgruppen auf der
dritten Etage des Karl-Landsteiner-Haus wird mir immer in Erinnerung bleiben.
Allen Kollegen des DRFZ und des RFL danke ich für den offenen und herzlichen
Umgang miteinander.
Mein tief empfundener Dank gilt meinem Mann für sein Vertrauen und seine Geduld.
Ich danke ihm sehr dafür, dass er mich dabei unterstützt hat meine Dissertation, fern
unserer Heimatstadt Radebeul, in Berlin durchzuführen.
XII