Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung

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Aus dem
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung
dendritischer Zellen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Boris Sülzle
aus Loose
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Prof. Dr. W. Baumgärtner, PhD
Tag der mündlichen Prüfung: 28.05. 2004
Meinen lieben Eltern
gewidmet
1. Einleitung
1
2. Literaturübersicht
2
2.1 Dendritische Zellen
2
2.1.1 Entwicklung immaturer DCs und DC-Vorläufer
im Knochenmark
3
2.1.2 Phänotyp und Funktion der unterschiedlichen
DCs
5
2.1.2.1 Langerhans-Zellen und interstitielle DCs
5
2.1.2.2 Myeloide und lymphoide DCs
7
2.2 Allergische Kontaktdermatitis
8
2.2.1 Haptene
8
2.2.2 Sensibilisierung
9
2.2.2.1 Rolle der Langerhans-Zellen
9
2.2.2.2 Priming der T-Lymphozyten
11
2.2.2.3 Th1- und Th2-Polarität der Immunantwort
12
2.2.3 Auslösephase
13
2.3 Untersuchungen im TDI-Kontaktallergiemodell
15
2.4 Verwendete Pharmaka
17
2.4.1 Cilomilast
17
2.4.1.1 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vivo
20
2.4.1.2 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vitro
21
2.4.2 Takrolimus (FK506)
22
2.4.2.1 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vivo
24
2.4.2.2 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vitro
25
2.4.3 Rapamycin
27
2.4.3.1 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vivo
28
2.4.3.2 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vitro
29
3 Material und Methoden
31
3.1 Geräte und Reagenzien
31
3.1.1 Geräte für Zellkulturversuche
31
3.1.2 Reagenzien für Zellkulturversuche
31
3.1.3 Geräte für Zymographie
32
3.1.4 Reagenzien für Zymographie
33
3.1.5 Geräte für TNF-α/IL-12 ELISA
34
3.1.6 Geräte für FACS-Analyse
34
3.1.7 Geräte für Densitometrie
34
3.1.8 Hergestellte Puffer und Lösungen
35
3.1.9 Versuchstiere
35
3.2. Versuchsübersicht
36
3.3. Beeinflussung der DCs in vitro
37
3.3.1 Generierung von DCs
37
3.3.2 Gewinnung von murinen T-Lymphozyten
38
3.3.3 Messung von TNF-α und IL-12
39
3.3.4 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
39
3.3.5 Heterologe Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR)
42
3.4 In-vivo-Versuche zur allergischen Kontaktdermatitis
44
3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell
44
3.4.2 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs
im allergischen Entzündungsgeschehen
45
3.4.3 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs
im nicht-inflammatorischen Modell
47
3.4.5 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST)
47
3.4.6 Skin-Migration-Assay
48
3.4.7 Local-Lymphnode-Assay (LLNA)
49
3.4.8 Aufbereitung der Zymographie-Proben
50
3.4.9 Biorad-Proteinbestimmung
50
3.4.10 Zymographie
51
3.5 Statistische Auswertung
52
4. Ergebnisse
53
4.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
auf die Migration dendritischer Zellen
53
4.1.1 Nicht-Inflammatorisches Modell
53
4.1.2 TDI-Kontaktallergiemodell
54
4.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
auf die MMP-9-Expression
58
4.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen
Migrationsmodell
58
4.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell
59
4.3 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Vorversuche
61
4.4 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Hauptversuche
62
4.5 Ergebnisse des Local-Lymphnode-Assays der
In-vivo-Hauptversuche
63
4.6 Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
auf die DC-induzierte T-Lymphozyten-Proliferation in der MLR
4.6.1 Koinkubation von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
65
65
4.6.2 Konzentrationsabhängige Wirkung von Cilomilast,
Rapamycin und Takrolimus
65
4.6.3 Prä-Inkubation von Cilomilast
65
4.7 Ergebnisse der FACS-Analyse
70
4.7.1 Identifizierung der in vitro generierten
dendritischen Zellen
70
4.7.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die
Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle
in vitro generierter DCs
71
4.7.2.1 Einfluß auf die CD80-Expression
71
4.7.2.2 Einfluß auf die CD86-Expression
72
4.8 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf
die LPS-induzierte Produktion von TNF-α und IL-12
dendritischer Zellen
73
4.8.1 Einfluß auf die TNF-α-Produktion
73
4.8.2 Einfluß auf die IL-12-Produktion
73
5 Diskussion
75
5.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
auf die Migration dendritischer Zellen
75
5.1.1 Nicht-inflammatorisches Modell
75
5.1.2 TDI-Kontaktallergiemodell
77
5.1.3.1 Einfluß von MIP-3β auf die DC-Migration
78
5.1.3.2 Cilomilast
78
5.1.3.3 Takrolimus
79
5.2 Densitometrische Zymographieauswertung
81
5.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell
81
5.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell
82
5.3 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im MEST
82
5.4 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im LLNA
83
5.5 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus in der MLR
84
5.7 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
auf die LPS-induzierte Produktion von TNF-α und IL-12
dendritischer Zellen
86
5.7.1 Einfluß auf TNF-α
86
5.7.2 Einfluß auf IL-12
86
6 Zusammenfassung
88
7 Summary
90
8 Literaturverzeichnis
92
9. Anhang
118
9.1 Anhangstabellen
118
9.2 Veröffentlichungen
134
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
bzw.
c-AMP
CCR
CD
CLA
CLP
CMP
DC
ELISA
Fc
FLT-3
g
GM-CSF
i.p.
ICAM
IFN
IgE
IL
LLNA
Ln.
LPS
MCP
MEST
mg
MHC
MIP-3-β
ml
MMP
n.b.
nmol
p.o.
PDE4
s.
S.D.
Tab.
TDI
Th
TLR
TNF-α
top.
TRANCE
µl
µmol
Abbildung
beziehungsweise
cyclisches Adenosinmonophosphat
Chemokine Receptor
Cluster of Differentiation
Cutaneous Lymphocyte Antigene
Common Lymphoid Progenitors
Common Myeloid Progenitors
Dendritic Cell
Enzyme-Linked-Immunosorbant-Assay
Fragment Crystallizable
Fms-Like-Tyrosinekinase-3
Gramm
Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor
intraperitoneal
Intercellular Adhesion Molecule
Interferon
Immunglobulin E
Interleukin
Local-Lymphnode-Assay
Lymphonodus
Lipopolysaccharide
Monocyte-Chemoattractant-Proteins
Mouse-Ear-Swelling-Test
Milligramm
Major-Histocompatibility-Complex
Macrophage-Inflammatory-Protein-3-β
Milliliter
Matrix-Metalloproteinase
nicht bestimmt
Nanomol
per os
Phosphodiesterase 4
siehe
Standard Deviation
Tabelle
Toluendiisocyanat
T-Helferzelle
Toll-like-receptor
Tumor-Nekrose-Faktor-α
topisch
TNF-Related Activation-Induced Cytokine
Mikroliter
Mikromol
1. Einleitung
Dendritische Zellen (DCs) nehmen in der adaptiven Immunantwort eine
Schlüsselrolle ein: Nach Aufnahme und Prozessierung von Antigenen sind es alleine
DCs, die nach erfolgter Migration im regionalen Lymphknoten T-Lymphozyten das
spezifische Antigen präsentieren und eine zellvermittelte Immunantwort einleiten
(BANCHEREAU u. STEINMAN 2000). So sind es auch im Falle der Kontaktallergie
DCs, die das Allergen präsentieren und die unerwünschte allergische Immunreaktion
initiieren (KRASTEVA et al. 1999a).
Ziel dieser Arbeit ist die pharmakologische Beeinflussung der DC-Funktion. Als
Testsubstanzen kommen die immunmodulatorisch wirksamen Pharmaka Cilomilast,
Rapamycin und Takrolimus zum Einsatz. In vivo werden die Testsubstanzen im
Toluendiisocyanat
eingesetzt.
Zu
(TDI)-induzierten
untersuchende
Kontaktallergiemodell
Parameter
stellen
hier
an
BALB/c-Mäusen
die
Inhibition
der
Entzündungsreaktion der Haut (gemessen an der Ohrschwellung), die Beeinflussung
der DC-Migration und nachfolgende T-Lymphozyten-Proliferation im regionalen
Lymphknoten (gemessen am Lymphknotengewicht) dar. In-vitro-Untersuchungen
sollen dabei die In-vivo-Studien ergänzen; für diese Untersuchungen werden aus
murinem Knochenmark generierte DCs verwendet. So soll in der Mixed-LeukocyteReaction (MLR) der proliferationssuppressive Effekt der Testsubstanzen untersucht
werden. Weiterhin sollen durchflußzytometrische Untersuchungen der in vitro
gewonnen
DCs
Aufschluß
über
eine
Regulation
kostimulatorischer
Oberflächenmoleküle nach LPS-Stimulation und Inkubation der Testsubstanzen
ergeben.
1
2 Literaturübersicht
2.1 Dendritische Zellen
Der
Begriff
„Dendritische
Zelle“
beschreibt
eine
heterogene
Zellfamilie
leukozytären Ursprungs, deren Hauptaufgabe die Regulation des Immunsystems
beinhaltet. Kurz zusammengefasst nehmen diese Zellen - in der Peripherie des
Körpers sessil - Antigene auf, prozessieren diese, migrieren zum regionalen
Lymphknoten und initiieren bzw. regulieren nachfolgend die Immunantwort
(BANCHEREAU und STEINMAN 1998, CAUX et al. 2000).
Erstmals beschrieben wurde dieser Zelltyp von STEINMAN und COHN (1973) in
der Milz einer Maus. Obwohl die Langerhans-Zelle in der Haut bereits 1868 entdeckt
wurde (LANGERHANS 1868), sollte man jedoch erst 1985 zur Erkenntnis kommen,
daß die Langerhans-Zelle einen epidermal lokalisierten Subtyp der DC-Familie
darstellt (SCHULER und STEINMAN 1985). Bis zu diesem Zeitpunkt war die
Funktion und Position dieses Zelltyps innerhalb des Systems hämapoetischer Zellen
ungewiß. Zunächst dem Nervensystem zugerechnet (LANGERHANS 1868),
brachten erst Untersuchungen von BIRBECK et al. (1961), WOLFF (1963), sowie
BRADSHAW et al. (1963) die Langerhans-Zelle in den Fokus immunologischer
Betrachtungen. SILBERBERG et al. (1976) diskutierten erstmals die herausragende
Rolle der Langerhans-Zelle in der allergischen Kontaktdermatitis; KLARESKOG et al.
(1977) sowie ROWDEN et al. (1977) beschrieben erstmals das MHC-II-Molekül auf
Langerhans-Zellen. Nachdem die Verbindung zwischen Langerhans-Zelle und deren
Zugehörigkeit zur DC-Familie hergestellt war (SCHULER und STEINMAN 1985),
stellte die Langerhans-Zelle ein bevorzugtes Modell zur Untersuchung der Biologie
dendritischer Zellen dar. Nachfolgend soll nun näher auf die Ontogenese,
Morphologie und die Funktion dendritischer Zellen (DCs) eingegangen werden.
2
2.1.1 Entwicklung immaturer DCs und DC-Vorläufer im Knochenmark
Aufgrund der ausgesprochenen Plastizität der DCs sowie der im ständigen Fluß
befindlichen Entwicklung stellt die folgende Übersicht lediglich den status quo des
derzeitigen Erkenntnisstands dendritischer Zellen dar.
Im Knochenmark werden von hämatopoetischen Stammzellen kontinuierlich
immature DCs (imDCs) produziert; der fms-like-tyrosinekinase-3 (FLT-3)-Ligand und
GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) nehmen dabei in der
Proliferation und weiteren Differenzierung der DCs eine Schlüsselrolle ein (BJORCK
2001, PULENDRAN et al. 2001). Ausgangspunkt der DC-Entwicklung sind CD34+
hämatopoetische Stammzellen (s. Abb. 1-2). Die weitere Entwicklung erfolgt
dichotom, so bilden sich aus den CD34+ Stammzellen zum Einen common lymphoid
progenitors (CLP), zum Anderen common myeloid progenitors (CMP). Die myeloiden
DC-Vorläuferzellen differenzieren sich weiter in Abhängigkeit von den erworbenen
Oberflächenantigenen: So bildet ein Teil der Zellpopulation als skin-homing-receptor
das cutaneous lymphocyte antigen (CLA) aus und differenziert sich weiter in eine
CD11c+ CD1a+ immature DC-Population, während die CD34+ CLA- imDCs sich zu
CD11c+ CD1a- immaturen DCs weiterentwickeln (STRUNK et al. 1997). CD11c+
CD1a+ imDCs migrieren in die Epidermis und bilden dort schließlich immature
Langerhans-Zellen, während die CD11c+ CD1a- imDCs in die Dermis und weitere
Gewebe migrieren; man bezeichnet sie dort auch als immature interstitielle DCs
(CAUX et al. 2000).
Neben den immaturen Langerhanszellen und immaturen interstitiellen DCs
existieren
zwei
plasmazytoide
weitere
DCs
DC-Vorläuferformen,
(pre-DC2).
CMPs
dienen
Monozyten
dabei
den
(pre-DC1)
Monozyten
und
als
Vorläuferzellen, die sich unter dem Einfluß von GM-CSF und IL-4 reversibel in
immature myeloide DCs (imDC1) differenzieren (AKAGAWA et el. 1996). Diese
Gruppe der DCs wird auch als monocyte-derived-DCs bezeichnet. Im Gegensatz
zu den drei beschriebenen DC-Gruppen entwickeln sich die plasmazytoiden DCs aus
den
lymphoiden
Vorläuferzellen
im
Knochenmark.
Die
Vorläuferzellen
der
plasmazytoiden DCs entwickeln sich unter Einfluß von IL-3 zu immaturen DCs (im
DC2). Die beiden beschriebenen DC-Subtypen verlassen schließlich als immature
DCs das Knochenmark und migrieren über die Blutbahn in die lymphatischen Organe
(LIU 2001).
3
CD34+ Stammzelle
CMP
CD34+CLA+
CD11c+CD1a+
CLP
CD34+CLA-
CD11c+CD1a-
pre-DC1
pre-DC2
Antigen-abhängige Differenzierung:
Langerhans-Zelle Interstitielle DC
Bakterien
Steady state
Antigen
Inflammation
Phagozytose
Keine Maturation
Viren
Maturation
IFN-Produktion
Maturation
Migration in regionalen Lymphknoten
immature DCs
mature DCs
Myeloide DC1
Lymphoide DC2
(plasmazytoide DCs)
Toleranz
Immunität
Adaptive Immunantwort
Abb. 1-2: Entwicklung, Differenzierung, Maturation und Funktion dendritischer Zellen
nach LIU (2001)
4
2.1.2 Phänotyp und Funktion der unterschiedlichen DCs
Allen vier DC-Subtypen gemeinsam ist die charakteristische Morphologie der
Zellen im maturen Zustand, woher schließlich die Bezeichnung „dendritisch“ (gr.
δενδροs, Baum) rührt. In situ, so z. B. in der Haut und den lymphatischen Organen,
besitzen DCs eine sternenförmige Morphologie. Typisch und namensgebend sind die
langen (> 10 µm) und dünnen, „dendritiformen“ zytoplasmatischen Zellfortsätze. Die
so beschaffene Morphologie gewährt den DCs eine effiziente Antigenaufnahme und
Interaktion mit weiteren Zellen des Immunsystems, insbesondere T-Lymphozyten
(BANCHEREAU und STEINMAN 2000).
Die unterschiedlichen DC-Typen unterscheiden sich, und zwar besonders in
ihrem Immunphänotyp und in der Funktion, die sie im Organismus ausüben. Neben
generellen Unterschiede zwischen immaturen und maturen DCs bestehen spezielle
Unterschiede zwischen den einzelnen DC-Typen.
2.1.2.1 Langerhans-Zellen und interstitielle DCs
Ein Charakteristikum immaturer DCs stellt die Unfähigkeit dar, T-Zellen zu
stimulieren. Dies geht einher mit der Tatsache, daß immature DCs auf ihrer
Zelloberfläche
kaum
antigenpräsentierende
MHC-Molküle
sowie
wenig
kostimulatorische Oberflächenmoleküle wie CD25, CD40, CD54, CD80 und CD86
exprimieren. Immature DCs exprimieren in diesem Stadium jedoch zahlreiche
Rezeptoren zur Antigenaufnahme wie Fcγ-, Fcε- und im Fall der Langerhans-Zellen,
Langerinrezeptoren (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994, CAUX et al. 1995,
CAUX und BANCHEREAU 1996, FIGDOR 2002). Im Gegensatz zu den myeloiden
und plasmazytoiden DC-Vorläufern sind immature Langerhans-Zellen und immature
interstitielle DCs fähig, antigenunabhängig zu migrieren (steady state) und
immunregulatorische Funktionen wahrzunehmen. Während der Migration nehmen
diese nur kurzlebigen DCs (3-4 Tage) Selbstantigene und apoptotische Zellen auf
und präsentieren diese T-Zellen, ohne dabei Maturationsvorgängen zu unterlaufen
und T-Zellen zu aktivieren (SHORTMAN 2000, STEINMAN et al. 2000). Bei diesem
Vorgang differenzieren sich naive CD4+ und CD8+ T-Zellen in IL-10 produzierende TSuppressorzellen, so daß eine Immunantwort gegenüber Selbstantigenen ausbleibt;
5
dies wird weithin als periphere Toleranz bezeichnet (JONULEIT et al. 2000,
DHODAPKAR et al. 2001).
Im Entzündungsgeschehen bzw. nach Aufnahme und Prozessierung von
Antigenen
unterlaufen
immature
DCs
zügigen
Veränderungen
ihres
Immunphänotyps und ihrer Funktion. Dieser als Maturation bezeichnete Vorgang
induziert eine Heraufregulation von Adhäsions- und kostimulatorischen Molekülen
(CD40, CD54, CD80, CD86), Expression antigenpräsentierender MHC-Moleküle auf
der Zelloberfläche sowie eine Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IL-1, IL-6,
IL-12 und IL-18. Gleichzeitig verlieren die maturen DCs die Fähigkeit zur
Antigenaufnahme
durch
die
Herrunteregulation
der
Fcγ-,
Fcε-
bzw.
Langerinrezeptoren (CAUX et al. 1994, INABA et al. 1994). Ausgelöst durch die
Expression des Chemokinrezeptors 7 (CCR7) auf der Zelloberfläche der DCs und die
Bildung der CCR7-Liganden MIP-3β (macrophage-inflammatory-protein-3-beta) und
SLC
(secondary-lymphoid-tissue-chemokine)
seitens
der
lymphatischen
Endothelzellen migrieren die DCs chemotaktisch in den regionalen Lymphknoten
und initiieren dort nach Aktivierung der T-Lymphozyten die Immunantwort
(SALLUSTO und LANZAVECCHIA 2000). Im Vergleich zur steady-state-migration ist
die Migrationsrate bzw. der turn-over dendritischer Zellen unter inflammatorischen
Bedingungen stark erhöht, da die von aktivierten T-Zellen produzierten Zytokine
CD40L
und
TRANCE
(TNF-related
activation-induced
cytokine)
den
Efflux
dendritischer Zellen in den regionalen Lymphknoten verstärken und zudem der Influx
an DC-Vorläuferzellen in das Entzündungsgebiet zunimmt (SALLUSTO und
LANZAVECCHIA 1999). In der Haut vermitteln die von Keratinozyten produzierten
monocyte-chemoattractant-proteins 1 und 3 (MCP-1, MCP-3) sowie TNF-α und IL-1β
diesen Vorgang (KRASTEVA et al. 1999a, LUCAS und MACPHERSON 2002).
6
2.1.2.2 Myeloide und lymphoide DCs
Die Vorläuferzellen dieser DC-Subtypen unterscheiden sich morphologisch und
funktionell von den oben bereits beschriebenen DCs: Weder pre-DCs1 und pre-DCs2
weisen dendritische Zellausläufer aus, noch sind sie unter steady-state Bedingungen
fähig, zu migrieren (LIU et al. 2001). Myeloide pre-DCs exprimieren typische
myeloide Oberflächenantigene wie CD11b, CD11c, CD13, CD14 und CD33; preDCs2
hingegen
exprimieren
lymphozytenassoziierte
Antigene
wie
den
Transkriptionsfaktor Spi-B und das T-Zell-Rezeptor-Glykoprotein pre-Tα.
Beide Zelltypen nehmen wichtige Aufgaben innerhalb der unspezifischen sowie
adaptiven Immunantwort bei bakteriellen bzw. viralen Infektionen wahr. So
übernehmen pre-DCs1 den Part der Immunabwehr gegenüber Bakterien und Pilzen,
indem sie diese Antigene Mannoserezeptor-vermittelt phagozytieren und abtöten;
dieser Vorgang und der Einfluß von IL-4 induzieren die weitere Differenzierung über
immature DC1 in schließlich mature DC1, die in der nachfolgenden adaptiven
Immunantwort
eine
Th1-Polarisation
bewirken.
Dies
geht
einher
mit
der
Beobachtung, daß DCs1 große Mengen an IL-12 produzieren und so geprimte TZellen sich zu zytotoxischen und IFN-γ produzierenden T-Zellen ausdifferenzieren
(RISSOAN et al. 1999, ITO et al. 2001).
Plasmazytoide DCs dagegen stellen das Bindeglied zwischen der unspezifischen
und spezifischen Immunabwehr bei viralen Infektionen dar. Pre-DCs2 produzieren
nach viraler Infektion große Mengen der antiviral wirksamen IFN-α und IFN-β und
differenzieren sich dabei unter dem Einfluß der Interferone und autokriner TNF-α
Produktion weiter in mature DCs2 (LIU et al. 2001). Diese maturen DCs2 induzieren
nun eine ebenso wie die DCs1 eine adaptive Th1-Immunantwort, die jedoch IL-12
unabhängig erfolgt und zu IFN-γ und IL-10 produzierenden T-Zellen führt (RISSOAN
et al. 1999, ITO et al. 2001).
7
2.2 Allergische Kontaktdermatitis
In Abhängigkeit vom Allergen manifestiert sich eine allergische Kontaktdermatitis
entweder als IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion vom Typ I oder zellvermittelte
Reaktion vom Spättyp (Typ IV Reaktion). Beide Überempfindlichkeitsreaktionen
setzten eine spezifische Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen voraus.
Nachfolgend soll nun die Pathophysiologie der allergischen Kontaktdermatitis und
besonders die Bedeutung der dendritischen Zellen erläutert werden.
2.2.1 Haptene
Für die Auslösung einer Kontaktallergie sind bestimmte stoffliche Eigenschaften
des potentiellen Allergens Vorraussetzung (BASKETTER et al. 1995): Bei
Kontaktallergenen
handelt
es
sich
meist
um
niedermolekulare,
organische
Verbindungen mit Molekulargewichten zwischen 100 und 1000 Dalton, die
ausreichend lipophil sind, die Haut zu penetrieren. Herkunft und Struktur der
Allergene sind dabei vielfältig, so handelt es sich um Pflanzenstoffe, Kunststoffe,
Farbstoffe, Detergentien und Arzneimittel. Diese Stoffe fungieren lediglich als nichtimmunogene Haptene und müssen mit Proteinen erst zu einem Vollantigen bzw.
Hapten-Carrier-Komplex reagieren. So sind z. B viele pflanzliche Kontaktallergene
elektrophile Substanzen, die mit Amino- und SH-Gruppen der Hautproteine reagieren
und
kovalente
Bindungen
eingehen,
so
daß
sich
ein
Vollantigen
bildet
(LEPOITTEVIN und LEBLOND 1997). Von nicht-elektrophilen Stoffen – so
genannten Prohaptenen - nimmt man an, daß diese in vivo zunächst in elektrophile
Substanzen konvertiert werden müssen, an Hautproteine binden und schließlich
allergenisierend wirksam sind (KALERGIS et al. 1997, MERK 1997). Dies ist der Fall
z. B bei aromatischen Derivaten und photosensibilisierenden Substanzen, die durch
UV-Strahlung aktiviert werden und schließlich an Hautproteine binden können
(BASKETTER et al. 1995). Metalle hingegen wie zum Beispiel Nickel gehen keine
kovalente Verbindung mit Hautproteinen ein, sondern formieren sich zu MetallProtein-Komplexen, deren Bindungskräfte schwächer ausgeprägt sind (SALOGA et
al. 1988).
8
Nicht alle Haptene jedoch sind zwingend immunogen: Neben den aufgeführten
stofflichen Voraussetzungen zur Ausbildung einer Kontaktallergie spielt auch der
metabolische Status des Organismus eine wichtige Rolle; unterbleibt so zum Beispiel
die Konvertierung der Prohaptene in Haptene, entwickelt sich keine Kontaktallergie.
Hierin liegt einer der Gründe, warum die Ausbildung einer Kontaktallergie individuell
unterschiedlich ist (KRASTEVA et al. 1999a).
Hinsichtlich ihres Sensibilisierungspotentials lassen sich die Haptene in stark und
schwach immunogen wirksame Haptene einteilen; so löst der Kontakt mit starken
Haptenen (z. B. Oxazolon, Dinitrofluorbenzen) fast immer eine Kontaktallergie aus,
schwache Haptene hingegen führen nur bei einem kleinem Prozentsatz der
Individuen (z. B. 5% bei Metallsalzen) zu Kontaktallergien (KRASTEVA et al. 1999a).
2.2.2 Sensibilisierung
Ätiopathogenetisch unterscheidet man bei der Kontaktallergie zwischen der
Sensibilisierung gegenüber dem Antigen und der Auslösephase bei erneutem
Antigenkontakt (SCHULER 1993).
2.2.2.1 Rolle der Langerhans-Zellen
Während der Sensibilisierungsphase penetriert ein lipidlösliches Allergen nach
Hautkontakt die Epidermis, wo es sich mit Hautproteinen zu einem Hapten-CarrierKomplex verbindet. Eine Schlüsselrolle nehmen hier immature Langerhans-Zellen
ein: In den suprabasalen Schichten der Epidermis gelegen, formen sie ein
dreidimensionales Netzwerk. Dabei wird die Adhäsion der Langerhans-Zellen
untereinander sowie die Adhäsion zwischen Langerhans-Zellen und umliegenden
Keratinozyten durch das Adhäsionsmolekül E-Cadherin vermittelt (RIEDL et al.
2000a, RYAN et al. 2000,). In diesem Geflecht werden eingedrungene Antigene
„aufgefangen“ und von Langerhans-Zellen per rezeptorvermittelter Endozytose
internalisiert (FIGDOR et al. 2002).
Nach erfolgter Antigenaufnahme finden immunphänotypische, funktionelle und
morphologische Veränderungen der Langerhans-Zellen statt; dies wird weithin als
Maturation bezeichnet.
9
Immunphänotypisch weisen immature Langerhans-Zellen nur eine geringe Anzahl
von MHC- sowie kostimulatorischen Moleküle (CD25, CD40, CD80, CD86) (NIJMAN
et al. 1995, PIERRE et al. 1997), jedoch eine große Anzahl an Antigen-Rezeptoren
(Fcγ-, Fcε-, Langerin-Rezeptor) und intrazellulär lokalisierten MHC-II-Molekülen auf
(BANCHEREAU und STEINMAN 1998). Ebenso ist das Adhäsionsmolekül ECadherin auf der Zelloberfläche stark exprimiert (RIEDL et al. 2000b). Die Aufnahme
von Antigenen - speziell die von Haptenen – sowie die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine (IL-1β, TNF-α) aus Keratinozyten - induziert bei
Langerhans-Zellen
folgende
Veränderungen:
Antigenpräsentierende
MHC-II-
Moleküle, kostimulatorische Oberflächenmoleküle (CD25, CD40, CD80, CD86) sowie
der CCR7-Rezeptor werden heraufreguliert (AIBA und KATZ 1990, AIBA et al. 1997,
CAUX et al. 2000); Endozytose-Rezeptoren und das Adhäsions-Molekül E-Cadherin
werden herrunterreguliert (RIEDL et al. 2000a).
Die Veränderungen des Immunphänotyps von Langerhans-Zellen gehen einher
mit funktionellen Alterationen: Zeichnet sich die immature Langerhans-Zelle
vornehmlich durch Antigenaufnahme und Immobilität aus, so prozessieren mature
Langerhans-Zellen das aufgenommene Antigen. Sie sind fähig, in den regionalen
Lymphknoten zu migrieren und naiven T-Lymphozyten das Antigen via MHC zu
präsentieren (BANCHEREAU und STEINMAN 1998). Die Initiierung der Migration
wird einerseits von den Langerhans-Zellen selbst, andererseits durch die Freisetzung
pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1β, TNF-α) aus Keratinozyten nach Antigenkontakt gesteuert (WANG et al. 1997, CAUX 1998). Die Freisetzung dieser Zytokine
bewirkt eine Modulation der interzellulären Adhäsionsmoleküle, insbesondere von ECadherin. Während der Maturation wird dieses Adhäsionsmolekül herunterreguliert,
so daß die Langerhans-Zellen sich von den sie umgebenen Keratinozyten lösen; α6Integrine vermitteln anschließend die Adhäsion der Langerhans-Zellen an der
epidermalen Basalmembran. Die Überquerung der Basalmembran geht mit dem
Abbau extrazellulärer Matrix einher; dieser Vorgang wird durch die vermehrte
Ausschüttung des Enzyms Matrix-Metalloproteinase-9 seitens der Langerhans-Zellen
gesteuert (KOBAYASHI 1997, KIMBER et al. 1999, KIMBER et al. 2000, RIEDL et al.
2000a, JAKOB et al. 2001). Die weitere Migration über Lymphgefäße zum regionalen
10
Lymphknoten reguliert der exprimierte Rezeptor CCR7. Die Expression dieses
Oberflächenmoleküls führt zu einer Chemotaxis der Langerhans-Zellen gegenüber
den Chemokinen SLC und MIP-3β, die in der T-Zell-Region des regionalen
Lymphknotens produziert werden (GUNN et al. 1998, DIEU-NOSJEAN et al. 1999,
KELLERMANN et al. 1999).
2.2.2.2 Priming der T-Lymphozyten
Im regionalen Lymphknoten präsentieren Langerhans-Zellen in der paracorticalen
Region naiven T-Zellen das Antigen; diesen Vorgang bezeichnet man als priming.
Die Antigen-Erkennung stellt hierbei die Interaktion zwischen spezifischem T-ZellRezeptor von CD8+ bzw. CD4+ T-Zellen und dem prozessiertem Antigen-Peptid –
assoziiert mit MHC-I bzw. MHC-II-Molekülen – dar. Dabei konnte im Trinitrophenyl
(TNP)-Kontaktallergiemodell bei der Maus gezeigt werden, daß der T-Zell-Rezeptor
das Hapten samt des kovalent gebundenen Peptids als strukturelle Einheit in der
Grube des MHC-Moleküls erkennt (CAVANI et al. 1995, WELTZIEN et al. 1996).
Naive T-Lymphozyten zirkulieren kontinuierlich vom Blut in die lymphatischen
Organe und wieder zurück. Die fortdauernde Passage der naiven T-Zellen vorbei an
den dendritischen Zellen ist essentiell für die Initiierung der primären Immunantwort.
Besteht eine spezifische Kohärenz zwischen T-Zell-Rezeptor und präsentiertem
Antigen, beenden die T-Zellen ihre Wanderung und beginnen, mit den dendritischen
Zellen zu interagieren. Den ersten Schritt dieser Wechselwirkung stellt hierbei die
Zell zu Zell-Bindung dar, die durch Leukozytenintegrine auf der Zelloberfläche
vermittelt wird (TILNEY und GOWANS 1971, HOGG und LANDIS 1993) Die nun
folgende Aktivierung der T-Zelle erfordert zwei unabhängige Signale: Das erste
Signal wird durch die Interaktion von T-Zell-Rezeptor und antigenpräsentierendem
MHC-Molekül vermittelt, das zweite Signal durch die Wechselwirkung von
kostimulatorischen Oberflächenmolekülen der dendritischen Zellen (CD80 und
CD86) sowie deren Rezeptoren auf der T-Zell-Seite (CD28 und CTLA-4)(LIU und
JANEWAY 1992, RUDD 1996). Letztlich führen beide Signale zu einer IL-2Produktion und Sekretion seitens der T-Zellen, welches durch die autokrine Wirkung
auf den hochaffinen IL-2 Rezeptor zu einer hapten-spezifischen, klonalen
Proliferation führt. Dabei bewirkt das erste stimulierende Signal die Aktivierung des
11
IL-2-Transkriptionsfaktors NF-AT (nuclear factor of activation in T cells), dies allein
führt jedoch nicht zu einer IL-2-Produktion; erst im Zusammenwirken mit dem
kostimulatorischen Signal kommt es zu einer Stabilisierung der IL-2 mRNA und zu
einer wirkungsvollen IL-2-Synthese (LINDSTEN et al. 1989).
Die klonale Expansion der T-Zellen mündet schließlich in der Ausbildung zweier
T-Zell-Typen: Zum Einen werden T-Effektorzellen gebildet, zum Anderen TGedächtniszellen. Im Gegensatz zu naiven T-Zellen benötigen diese Zellen bei
spezifischer Antigen-Erkennung keine Kostimulation (WONG et al. 1996). Die
haptenspezifischen T-Zellen verlassen schließlich den Lymphknoten und treten in
den Blutstrom ein. Im Falle der Kontaktallergie erlangen die T-Zellen das CLAAntigen (cutaneous lymphocyte antigen). Das CLA-Antigen fungiert als skin-homingreceptor für haptenspezifische T-Zellen, so daß CLA+-T-Zellen nach transendothelialer Migration nun vornehmlich die Dermis besiedeln (PICKER et al. 1993).
2.2.2.3 Th1-und Th2-Polarität der Immunantwort
In Abhängigkeit vom Allergen und vom jeweilig dominierenden Zytokinmilieu wird
während der Sensibilisierungsphase entweder eine Th1-oder Th2-vermittelte
Immunantwort ausgelöst.
Eine Th1-vermittelte zelluläre Immunantwort entsteht, wenn das Hapten MHC-Irestringiert naiven CD8+ T-Zellen in Abwesenheit von T-Helferzellen präsentiert wird.
In der Folge werden CD8+ Effektor- und Gedächtniszellen produziert. Dabei ist von
dendritischen Zellen produziertes IL-12 das dominierende Zytokin, welches für das
priming naiver CD8+ T-Zellen und somit Entwicklung des Th1-Phänotyps
verantwortlich zeichnet (CARTER und DUTTON 1996 ). Beispiele für Th1-assoziierte
Kontaktallergene sind Oxazolon, Dinitrofluorbenzen (DNFB), Trinitrophenyl (TNP)
sowie Nickel (KRASTEVA et al. 1999a).
Wird hingegen das Allergen via MHC-II präsentiert und wird das Zytokinmilieu
während der Antigenpräsentation von IL-4, Histamin und PGE2 dominiert, so werden
vornehmlich CD4+ T-Zellen geprimt und eine Th2-mediierte, humorale Immunantwort
eingeleitet (HILKENS et al. 1996, KAPSENBERG et al. 1998, VIEIRA et al. 2000,
CARON et al. 2001, LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2001). Dies hat zur Folge,
daß Th2–Effektor-Zellen mit antigenspezifischen B-Lymphozyten interagieren und
12
diese unter dem Einfluß von IL-4 und Stimulation durch CD40L zur IgE-Produktion
anregen. Sobald die IgE-Produktion eingeleitet ist, wird diese durch basophile und
eosinophile Granulozyten sowie Mastzellen weiter verstärkt. Alle drei Zelltypen
exprimieren den Rezeptor FcεRI, an den sich nun das gebildete IgE bindet
(GAUCHAT et al. 1993, YOSHIMOTO et al. 1995). Beispiele für Kontaktallergene,
die eine Th2-Antwort induzieren, sind Trimellitanhydrid (TMA) und Toluendiisocyanat
(TDI) (DEARMAN et al. 1996). Die oben beschriebenen Vorgänge während der
Sensibilisierungsphase verlaufen ohne klinische Symptome. Der Zeitraum der
Sensibilisierung beträgt beim Menschen, ca. 8-15 Tage bei der Maus 5-7 Tage
(KRASTEVA et al. 1999a).
CUMBERBATCH et al. (2003) sehen als eine mögliche Erklärung der Th1-/Th2Polarisation
die
unterschiedliche
Migrationskinetik
von
Langerhanszellen
in
Abhängigkeit vom Allergen mit nachfolgender Beeinflussung der Zytokinproduktion
der
Langerhans-Zellen.
So
können
sie
zeigen,
daß
das
Th1-assoziierte
Kontaktallergen DNFB schneller in den regionalen Lymphknoten transportiert wurde
als das Th2-assoziierte Kontaktallergen TMA. Da bekannt ist, daß die Antigeninduzierte IL-12-Produktion von DCs zeitlich limitiert ist (LANGENKAMP et al. 2000,
LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000), wird in diesem Zusammenhang diskutiert,
daß mit unterschiedlicher Migrationsgeschwindigkeit der Langerhans-Zellen nur ein
begrenztes Zeitfenster zur IL-12-abhängigen Th1-Polarisierung naiver T-Zellen im
Lymphknoten besteht.
2.2.3 Auslösephase
Die Auslöse- oder Challenge-Phase beschreibt den erneuten Antigenkontakt
nach
abgeschlossener
Sensibilisierungsphase
und
ist
von
den
klinischen
Symptomen der Kontaktdermatitis gekennzeichnet. Beim Menschen kommt es etwa
3 Tage (Maus: 1-2 Tage) nach Exposition am Ort des Allergenkontaktes zur
Ausbildung von erythematösen Papeln, Ödemen und Bläschen in der Epidermis des
Menschen bzw. der Dermis der Maus. Im weiteren Verlauf geht die akute allergische
Kontaktdermatitis in ein chronisches Stadium über, das durch synchrone
Polymorphie der klinischen Symptomatik, insbesondere einer ausgesprochenen
13
Lichenifikation der Haut, gekennzeichnet ist (KRASTEVA et al. 1999b). Die
Pathophysiologie der allergisch-entzündlichen Reaktion unterscheidet sich hier in
Abhängigkeit der jeweils initiierten T-Zell-Polarisation (Th1 versus Th2) während der
Sensibilisierungsphase.
Im Th1-dominierten Geschehen nehmen CD8+ CLA+ T-Gedächtniszellen der
Dermis eine zentrale Rolle ein: Nach erneutem Antigenkontakt der Haut wird diesen
Zellen das Hapten via Langerhans-Zellen und/oder dermalen dendritischen Zellen
präsentiert, was zu einer Aktivierung der T-Zellen und Zytokinproduktion,
insbesondere IL-1, IL-2, IFN-γ und TNF-α, führt (KASPENBERG et al. 1992, CAVANI
et al. 1997). Durch die Produktion und Sekretion dieser inflammatorischen Zytokine
werden speziell Keratinozyten und Endothelzellen aktiviert; Keratinozyten werden
zusätzlich direkt durch den Antigenkontakt aktiviert. Aktivierte Keratinozyten
produzieren ihrerseits pro-inflammatorische Zytokine und regulieren zusammen mit
dem aktivierten Endothel den Influx haptenspezifischer T-Zellen aus dem Blut in die
Haut. Die Aktivierung des Endothels geht mit einer Alteration der endothelialen
Adhäsionsmoleküle für Leukozyten (Selektine, Integrine) einher und dient der
Rekrutierung neutrophiler Granulozyten und Monozyten aus dem Blut in die Haut, um
das Entzündungsgeschen zu initiieren (SMITH und BARKER 1993). Außerdem üben
CD8+ T-Zellen einen direkten zytotoxischen Effekt in der Haut aus (KEHREN et al.
1999).
Im Th2-vermittelten Allergiegeschehen läuft das Entzündungsgeschen nach
wiederholtem
Antigenkontakt
in
zwei
Phasen
ab:
Man
unterscheidet
die
Sofortreaktion von der Spätreaktion. Die allergische Sofortreaktion wird durch die
Antigen-induzierte
IgE-Quervernetzung
auf
kutanen
Mastzellen
initiiert.
Die
nachfolgende Mastzelldegranulation löst eine Entzündungskaskade aus, zu deren
Vermittlern Histamin, Prostaglandine, IL-1β sowie TNF-α gehören (AUSTEN 1995).
Die Spätreaktion hingegen ist von einem Influx inflammatorischer Leukozyten und
antigenspezifischen
Gedächtniszellen
der
CD4+
Haut
T-Zellen
zeichnen
gekennzeichnet.
hierbei
für
das
CD4+
T-
Aufrechterhalten
der
Aktivierte
Entzündungsreaktion verantwortlich: Nach Aktivierung produzieren und sezernieren
sie IL-4, IL-5 und IL-10, wodurch die IgE-Produktion vorangetrieben sowie ein
14
fortdauernder Influx inflammatorischer Leukozyten aus dem Blut in die Haut reguliert
wird (FINKELMAN et al. 1988, WERFEL et al 1995).
2.3 Untersuchungen im TDI-Kontaktallergiemodell
Toluendiisocyanat (TDI) zählt zur Stoffgruppe der Diisocyanate und hat ein
Molekulargewicht von 174,16 Dalton. Diisocyanate sind hochreaktive Stoffe, die bei
der industriellen Herstellung von Elastomeren, Farben und Klebstoffen verwendet
werden. Sie stellen eine der häufigsten Ursachen des berufsbedingten Asthmas dar.
In Tierversuchen mit Diisocyanaten wurden in Kurzzeittests Genmutationen und
Chromosomenschädigungen beobachtet, weshalb Diisocyanate möglicherweise als
potentiell kanzerogen einzustufen sind (BOLOGNESI et al. 2001).
YASUDA et al. (1980) beschreiben erstmals das Auftreten der dermalen
Kontaktallergie nach TDI-Sensibilisierung im Mausmodell. Seither wurden eine Reihe
von Untersuchungen durchgeführt, die dieses Modell charakterisieren und den
Einfluß verschiedener Pharmaka in diesem Entzündungsmodell untersuchen.
TOMINAGA
et
al.
(1985)
benutzen
das
TDI-Kontaktallergiemodell
für
pharmakologische Untersuchungen zur Beeinflussung des Entzündungsgeschehens.
Sie berichten von einer Inhibition der TDI-induzierten Ohrschwellung nach Gabe von
Dexamethason
und
Indometacin.
DEARMAN
et
al.
(1991,
1996)
führen
Charakterisierungsstudien mit Kontaktallergenen durch und berichten von der Th2dominierenden Immunantwort im TDI-Kontaktallergiemodell: So messen sie erhöhte
IgE-Serumspiegel im Blut TDI-sensibilisierter Mäuse sowie eine erhöhte IL-4 und IL10
Zytokinproduktion
TDI-aktivierter
Lymphknotenzellen.
Ebenso
berichten
SCHEERENS et al. (1999) von einer Produktion TDI-spezifischer IgE-AntikörperProduktion
bei
Mäusen
nach
einer
sechswöchigen
Sensibilisierungsphase.
EHINGER et al. (2000) untersuchen den Einfluß des PDE4-Inhibitors Piclamilast im
TDI-Kontaktallergiemodell; dabei zeigt sich eine wirksame Inhibition der allergischen
Ohrschwellung nach topischer und intraperitonealer Verabreichung von Piclamilast.
Weitere Untersuchungen zur Wirksamkeit von PDE4-Inhibitoren bei allergischen
Dermatitiden an BALB/c-Mäusen schließen sich an. Die topischer Applikation von
15
Cilomilast und AWD 12-281 kann die an den Ohren durch TDI geboosterte
allergische
Entzündungsreaktion
wirkungsvoll
inhibieren;
zudem
weisen
die
behandelten Ohren einen verminderten Gehalt des pro-inflammatorischen Zytokins
IL-1β sowie einen drastisch reduzierten Influx neutrophiler Granulozyten auf. Nach
präventiver topischer Applikation von Cilomilast und AWD 12-281 können BÄUMER
et al. (2002, 2003a) 24 Stunden nach TDI-Challenge eine Reduktion der TDIinduzierten Produktion von IL-4, IL-6 sowie des Makrophagen-InflammatorischenProteins-2 (MIP-2) im Ohrhomogenat messen.
In eigenen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit soll der Fragestellung
nachgegangen werden, welchen Einfluß die Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und
Takrolimus auf das allergische Entzündungsgeschehen im TDI-Kontaktallergiemodell
nehmen.
16
2.4. Verwendete Pharmaka
2.4.1 Cilomilast
Cilomilast
(cis-4-cyano-4-[3-cyclopentoxyl-4-methoxphenyl]-Cyclohexa-Carbon-
säure) ist ein Phosphodiesterase-4 (PDE4)-Inhibitor der 2. Generation; zur Zeit
befindet sich der Stoff in der klinischen Phase III der Arzneimittelzulassung als
Humanpräparat für die Asthma-Therapie (GRISWOLD et. al. 1998) bzw. in Phase II
zur Therapie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung, COPD (GIEMBYCZ
2000).
Die Phosphodiesterase (PDE) ist ein intrazellulär lokalisiertes, ubiquitär
vorkommendes Enzym, welches second-messenger-Nukleotide der Zelle (cAMP und
cGMP) hydrolytisch spaltet (SUTHERLAND und RALL 1958). Heute sind mehr als 11
PDE-Enzyme bekannt, wobei die unterschiedlichen Gewebe und Zellen ein
differierendes Muster der Enzymausstattung aufweisen; so sind z.B. die PDE3 und
besonders PDE4 charakteristisch für Immun- bzw. Entzündungszellen (DCs, TZellen, neutrophile Granulozyten) (GIEMBYCZ et al. 1997). Sie nehmen dort im
cAMP-Abbau die zentrale Rolle ein.
Genetisch codiert wird die PDE4 von vier unterschiedlichen Gen-Loci, so daß die
PDE4 vier Subtypen (PDE4A, PDE4B, PDE4C und PDE4D) aufweist (GIEMBYCZ
2000). Die jeweilige Expression des PDE4-Isoenzyms entspricht unterschiedlichen
mRNA splicing-Varianten, die der Feinregulierung des intrazellulären cAMPHaushalts dienen (HOUSLAY et al. 1997). Die Verteilung dieser Isoenzyme differiert
dabei in Abhängigkeit von Körpergewebe und Zelltypus; PDE4A ist ubiquitär verteilt
und der dominierende Subtyp in DCs (HEYSTEK et al. 2003), wohingegen PDE4C
vornehmlich in Nervengewebe vorkommt und in Entzündungszellen fehlt; PDEB wird
in der Lunge, Herz und Skelettmuskulatur exprimiert.
Die Wirkung von Cilomilast auf die Funktion von Immun- und Entzündungszellen
basiert auf der spezifischen Hemmung der PDE4 (Abb. 2-2): Hieraus resultiert ein
intrazellulärer Anstieg von cAMP. Dieses bindet und aktiviert die Proteinkinase A
(PKA). Die PKA phosphoryliert Transkriptionsfaktoren, die für die Inflammationskaskade eine Schlüsselrolle spielen. Durch den pleiotropen Effekt der intrazellulären
17
cAMP-Akkumulation
wechselt
der
Funktionszustand
der
Zellen
vom
pro-
inflammatorischen zum anti-inflammatorischen Zustand.
Beim Menschen erfolgt die Absorption von Cilomilast nach oraler Verabreichung
zügig, mit einer maximalen Plasmakonzentration (Cmax) eine Stunde nach
Verabreichung. Die Bioverfügbarkeit nach oraler Gabe beträgt 96%. Als Halbwertzeit
(t 0,5) werden sieben Stunden angegeben (ZUSSMAN et al. 2000).
Die Nebenwirkungen der PDE4-Inhibitoren sind im Zusammenhang mit der
Molekularstruktur des PDE4-Enzyms zu betrachten. Die PDE4 existiert sterisch
gesehen in zwei unterschiedlichen Konformationen, PDE4-H und PDE4-L. Für diese
besitzt der PDE4-Inhibitor der 1. Generation, Rolipram, eine hohe (High) bzw.
niedrige (Low) Bindungsaffinität (SCHNEIDER et al. 1986). PDE4-H wird bereits
durch geringe Konzentrationen von Rolipram inhibiert, PDE4-L erst durch hohe
Konzentrationen von Rolipram. Anti-inflammatorische Effekte werden der PDE4-L
Bindung zugeschrieben (BARNETTE et al. 1996), wohingegen Nebenwirkungen wie
Vomitus, Nausea und Dyspepsie (gastrische H+-Hypersekretion) durch eine Bindung
an PDE4-H verursacht werden (GIEMBYCZ 2000). Die PDE4-H/PDE4-L-Ratio von
Rolipram liegt bei 0,1; durch die damit verbundene höhere Affinität zu PDE4L
überwiegen die Nebenwirkungen, bzw. werden therapeutische Effekte erst in
höheren Dosierungen erreicht. Im Vergleich hierzu beträgt die PDE4-H/PDE4-L-Ratio
von Cilomilast 1,1 (BARNETTE et al. 1998): Trotz des im Vergleich zu Rolipram
höheren therapeutischen Index kommt es auch bei Cilomilast zu Nebenwirkungen.
So berichten CHOMPTON und NIEMAN (1999) von Emesis als häufigster
Nebenwirkung nach Behandlung mit Cilomilast (15 mg/kg), gefolgt von Nausea und
Dyspepsie.
18
PDE4-Inhibitor
ATP
cAMP
5`-AMP
PKA inaktiv
PKA aktiv
Protein
Protein-PO4
Inflammatorische Zellaktivität ↓
Abb. 2-2: Wirkmechanismus von PDE4-Inhibitoren (nach TORPHY 1998)
O
OH
O
N
O
Abb. 3-2: Strukturformel von Cilomilast
19
2.4.1.1 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vivo
Über die In-vivo-Effekte von Cilomilast geben die Ergebnisse aus klinischen
Untersuchungen sowie aus verschiedenen tierexperimentellen Allergiestudien
Aufschluß (s. Tab. 1-2).
In Phase-II-Studien zu asthmatischen Atemwegserkrankungen des Menschen
wird Cilomilast (15 mg/kg) erfolgreich eingesetzt. COMPTON et al. (2000)
beschreiben eine Reduktion der typischen Asthma-Symptome wie Husten, Atemnot
und Brustschmerzen. In einem Bericht zur Phase-III-Studie der klinischen
Wirksamkeit von Cilomilast bei COPD des Menschen beschreiben EDELSON et al.
(2001) positive Effekte hinsichtlich einer Lungenfunktionsbesserung und des
allgemeinen Gesundheitszustands.
Im
Dinitrochlorobenzen
(DNCB)-
und
Toluendiisocyanat
(TDI)-induzierten
Kontaktallergiemodell zeigen EHINGER et al. (2000) an BALB/c-Mäusen die
Wirksamkeit eines weiteren PDE4-Inhibitors, Piclamilast (RPR 73401). Nach
intraperitonealer
und
topischer
Applikation
von
Piclamilast
kann
die
mit
Ohrschwellung einhergehende Entzündungsreaktion signifikant gehemmt werden.
BÄUMER et al. (2002) zeigen weiterhin im gleichen Tier- und Allergiemodell (TDI)
eine entsprechende Wirksamkeit von Cilomilast; zudem berichten sie von einer
signifikanten Reduktion der TDI- induzierten Produktion von Interleukin-1β (IL-1β),
welches in den behandelten Ohren gemessen wird. In den beiden zitierten
Versuchen wurden die Tiere aktiv sensibilisiert. Von einer passiven Sensibilisierung
der BALB/c-Mäuse mittels Injektion TDI-„gepulster“ - also mit TDI beladenen – DCs
berichten BÄUMER et al. (2003b); hier wird der Effekt von Cilomilast auf die DCs
untersucht, indem die DCs vor der Injektion mit Cilomilast prä-inkubiert wurden. Es
zeigt sich kein Effekt hinsichtlich einer Inhibition der durch TDI-beladene DCs
hervorgerufenen Ohrschwellung. Die systemische Gabe von Cilomilast vermag
jedoch die Ohrschwellung zu inhibieren.
BELLGUIC et al. (2000) berichten, daß die MMP-9-Expression - im Ovalbumininduzierten Entzündungsmodell der Lunge an BALB/-Mäusen – in der Bronchoalveolären Lavage durch Gabe von Rolipram reduziert wird. Hier werden als Quelle
der MMP-9 neutrophile Granulozyten und Alveolarmakrophagen angesehen.
20
2.4.3.1.2 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vitro
Ein
häufig
angewendetes
In-vitro-Modell,
um
die
pharmakologische
Beeinflussung von DCs zu untersuchen, ist die Stimulation von DCs mit
Lipopolysacchariden (LPS) und anschließender Messung proinflammatorischer
Zytokine. Zusätzlich stellt die Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR) stellt ein In-vitroModell dar, in dem die DC-Eigenschaft, T-Zellen zu stimulieren und zur Proliferation
anzuregen, näher untersucht wird; durch FACS-Analysen von DCs lassen sich
Aussagen über die Modulation von Zelloberflächenmolekülen treffen.
HATZELMANN und SCHUDT (2000) zeigen an LPS-stimulierten, humanen,
monocyte-derived DCs eine wirkungsvolle Inhibition der TNF-α-Synthese durch
Cilomilast. Weiterhin beschreiben sie den Einfluß von Cilomilast auf humane CD4+ TLymphozyten. Nach Proliferationsstimulation der T-Zellen mit anti-CD3/anti-CD28
monoklonalen Antikörpern kann die Proliferation der T-Zellen und Synthese von IL-2,
IL-4, IL-5 und Interferon-γ durch Inkubation mit Cilomilast inhibiert werden.
BARNETTE et al. (1998) erhalten ähnliche Ergebnisse an humanen Monozyten und
T-Zellen.
BILLAH et al. (2002) zeigen an humanen, peripheral blood monocytes (PBMCs)
einen hemmenden Effekt des PDE4-Inhibitors SCH 351591 auf die Produktion von
IL-12 nach Stimulation der Zellen mit Pansorbin.
HEYSTEK et al. (2003) beschreiben in FACS-Analysen eine Heraufregulation des
chemotaktisch bedeutsamen Oberflächenmoleküls CXCR4 auf monocyte-derived
DCs
durch
Cilomilastgabe
während
der
LPS-induzierten
DC-Maturation.
Untersuchungen zur Beeinflussung des Immunphänotyps antigenpräsentierender
Zellen (APCs; Monozyten, B-Lymphozyten) durch Rolipram – ein PDE4-Inhibitor der
1. Generation – zeigen eine Modulation der Oberflächenmoleküle CD80 und CD86
sowie von MHC-I und MHC-II. So wird CD86 heraufreguliert, CD80, MHC-I und
MHC-II jedoch herunterreguliert (BIELEKOVA et al. 2000).
21
Tab. 1-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Cilomilast. Literatur s. Text.
Zelltyp
in vivo
in vitro
DCs
Inhibition der Kontaktallergie im TDI-Modell
IL-1β u. TNF-α↓
CXCR4↑
epidermale DCs
Migration↓ (eigene Untersuchungen)
T-Zellen
Inhibition der Kontaktallergie im TDI-Modell
Ohrhomogenat
Proliferation↓
IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ↓
IL-1β↓ im TDI-Modell
MMP-9 Aktivität↓
(eigene Untersuchungen)
Asthma-u. COPD-Therapie
2.4.2 Takrolimus (FK 506)
Takrolimus wurde 1984 aus der Kulturbouillon einer in Tsukuba (Japan)
entdeckten Streptomyces-Spezies isoliert. Der Name Takrolimus ist ein Kunstwort,
zusammengesetzt
aus
den
Bestandteilen
Tsukuba,
Makrolid
und
Immunosupressant (KINO et al. 1987). Strukturell zählt FK506 zur Gruppe der
Makrolid-Laktone mit einem Molekulargewicht von 822,05 Dalton, pharmakologisch
zählt es zur Gruppe der Calcineurin-Inhibitoren. Es gilt neben dem Peptid
Cyclosporin A als Leitsubstanz immunsuppressiv wirksamer Arzneimittel.
Takrolimus findet seine klinische Anwendung in der Transplantationsmedizin zur
Prophylaxe und Therapie der manifesten Transplantatabstoßung nach Leber- und
Nierentransplantationen (PrografR) sowie in der Dermatologie als Therapeutikum
(ProtopicR-Salbe) der atopischen Dermatitis des Menschen. Gute Wirksamkeit kann
bei
topischer
Applikation
auch
beim
allergischen
Kontaktekzem
im
Meerschweinchenmodell (ALAITI et al. 1998) sowie beim Menschen gezeigt werden
(BOGNIEWIECZ et al. 1998).
22
HO
CH3
CH3
O
H3CO
O
O
OH
CH2
CH3
O
CH3
OH
O
O
H3C
OCH3
OCH3
Abb. 4-2: Strukturformel von Takrolimus (FK 506)
Takrolimus übt seine biologischen Effekte nach Bindung an zytoplasmatische
Makrophiline aus; diese auch als FK506-bindende Proteine (FKBP-12) bezeichnete
Substanzen sind den Immunophilinen zuzurechnen. Nach erfolgter Bindung von
Takrolimus an FKBP-12 entsteht ein Komplex, der nun die Funktion der Ca2+abhängigen Serin-/Threonin-Phosphatase Calcineurin hemmt (LIU et. al. 1991). Dies
führt über eine Translokationshemmung des Nuklearfaktors NF-ATp letztlich zu einer
Transkriptionshemmung NF-ATp-abhängiger Zytokine, insbesondere IL-2, TNF-α,
GM-CSF. Hierdurch lassen sich die beschriebenen Effekte auf verschiedene
Zelltypen der Haut und des Immunsystems erklären (siehe 2.2.3, Abb. 6-2 und Tab.
2-2).
Takrolimus kann oral, parenteral und topisch appliziert werden. Aufgrund einer
nur mäßigen Absorptionsrate nach oraler Applikation beträgt die durchschnittliche
orale Bioverfügbarkeit beim Menschen ca. 27% (PETERS et al. 1993). Topisch
aufgetragenes Takrolimus penetriert die Haut in Abhängigkeit von der verwendeten
Konzentration, der ausgewählten Grundlage und der Integrität der epidermalen
Barriere in unterschiedlichem Maß. Hierin liegt die Basis für die Anwendbarkeit in
dermatologischen Externa zur gezielten topischen, immunsuppressiven Behandlung
23
entzündlicher Dermatitiden. Bei Einarbeitung von Takrolimus in eine sehr lipophile
Salbengrundlage können somit auch bei äußerlicher Anwendung therapeutische
Konzentrationen in befallenen Hautarealen ohne systemische Akkumulation des
Wirkstoffes erreicht werden (WOLLENBERG und BIEBER 1997; RUZICKA et al.
1997; BIEBER 1998).
Als Nebenwirkungen nach systemischer Verabreichung stehen die stark
ausgeprägte Nephrotoxozität und allgemeine Immunsuppression im Vordergrund,
gefolgt von gastrointestinalen (Vomitus, Nausea) und neurologischen Effekte
(Tremor) (BORNHÖVD et al. 2000).
Die
wichtigste
unerwünschte
Nebenwirkung
nach
topischer
Takrolimus-
Anwendung ist ein von Patienten als „Brennen“ oder „Hitzegefühl“ beschriebene
transientes Mißempfinden am Applikationsort (RUZICKA et al. 1997). Diese
Erscheinungen klingen jedoch nach 30-90 Minuten von selbst ab. Dauer und
Intensität des Brennens nehmen nach 5-10 tägiger Behandlung ab und verlieren sich
schließlich.
Topisch
angewendetes
Takrolimus
beeinflußt
weder
die
Kollagensynthese der Haut, noch kommt es zu einer Hautatrophie (REITAMO et al.
1998).
2.4.3.2.1 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vivo
In entzündlich veränderten Hautarealen werden Keratinozyten, LangerhansZellen,
inflammatorische
dendritische
Zellen
und
T-Lymphozyten
in
ihrer
biologischen Funktion und im Immunphänotyp verändert; nachfolgend sind die
Effekte von Takrolimus auf diese Zellen aufgeführt.
Untersuchungen zur Takrolimuswirkung in psoriatisch veränderten Hautarealen
des Menschen ergeben, daß der Interleukin-8 (IL-8)-Rezeptor von Keratinozyten
dosisabhängig herunterreguliert wird (SCHULZ et al. 1993). Untersuchungen von
WOLLENBERG et al. (1996) zum atopischen Ekzem ergeben, daß LangerhansZellen durch topische Takrolimus-Behandlung beeinflußt werden: So berichten sie
von
einer
Herunterregulation
des
hochaffinen
IgE-Rezeptors
(FcεRI)
auf
dendritischen Zellen der Haut. Der Anteil von dendritischen Zellen fällt unter die
24
Nachweisgrenze
und
deren
Stimulationskapazität
gegenüber
autologen
T-
Lymphozyten wird reduziert (WOLLENBERG et al. 1996).
Häufig
verwendete
und
gut
studierte
In-vivo-Modelle zur zellmediierten
Immunantwort sind Kontaktallergie-Modelle bei der Maus.
In einem Trinitrochlorobenzen (TNCB)- vermittelten Kontaktallergie-Modell
untersuchen SALERNO et al. (1998) Effekte von Takrolimus: Nach Injektion von
Lymphknotenzellen TNCB-sensibilisierter und Takrolimus behandelter Tiere in naive
Empfängertiere entwickeln diese im Vergleich zur Kontrolle keine Kontaktallergie,
gemessen an der Ohrschwellung. Ferner arbeiten SALERNO et al. (1998) den
Einfluß von Takrolimus auf bestimmte T-Zell-Subpopulationen heraus: αβ+ und γδ+ TLymphozyten sind für die Etablierung einer Kontaktsensitivität essentiell; unter dem
Einfluß von Takrolimus vermögen diese Zellen jedoch keine Kontaktsensitivität im
Vergleich zu Kontrolltieren zu induzieren. Des weiteren werden die Produktion von
IL-2 und die T-Zell-Proliferation nach DC-vermittelter Antigenstimulation (TNBC)
durch systemische Behandlung der Tiere verhindert.
Im Oxazolon induzierten Kontaktallergiemodell untersuchen HOMEY et al. (1998)
die Zytokinexpression epidermaler Zellen und von Lymphknotenzellen sowie deren
Immunphänotyp:
Durch
Behandlung
mit
Takrolimus
wird
die
Lymphknotenproliferation inhibiert und eine Abnahme der inflammatorischen
Zytokine IL-1β, TNF-α und IFN-γ in der Haut erreicht. FACS-Analysen epidermaler
Zellen behandelter Tiere ergeben eine Abnahme von CD4+ T-Zellen in der Haut.
2.4.3.2.2 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vitro
Die DC-vermittelte Antigenpräsentation gegenüber T-Lymphozyten verläuft unter
dem Einfluß zahlreicher Zytokine und exprimierter Zelloberflächenmoleküle. Murine,
in vitro generierte DCs und T-Lymphozyten werden bei der bidirektionalen Interaktion
während der Antigenpräsentation durch Takrolimus in unterschiedlicher Art und
Weise beeinflußt. MATSUE et al. (2002) finden bei DCs eine Herunterregulation der
von DCs produzierten Interleukine 6 und 12, sowie der T-Zell-Zytokine IL-2, IL-4 und
IFN-γ. TIEFENTHALER et al. (2004) berichten von einer Inhibition der IL-12Produktion durch Takrolimus bei humanen monocyte-derived DCs. Zudem weisen
25
mit Takrolimus generierte DCs eine verminderte Allostimulationsfähigkeit gegenüber
T-Lymphozyten in der MLR auf (SZABO et al 2001). WOLTMAN et al. (2000)
berichten von einer lediglich partiellen TNF-α Inhibition durch Takrolimus bei CD40L
stimulierten DCs.
Untersuchungen des DC-Immunphänotyp ergeben eine Herunterregulation von
CD69 nach LPS-Stimulation und Takrolimus-Inkubation der Zellen während der
DC/T-Zell-Interaktion (MATSUE et al. 2002). In vitro unter Takrolimus-Einfluß
generierte DCs zeichnen sich im Immunphänotyp durch eine Abnahme der CD1a+,
CD40 und CD86 Oberflächenmoleküle aus. Gegensätzliches zur Beeinflussung des
Immunphänotyps von DCs berichten COS et al. (2002) und WOLTMAN et al. (2000).
So finden sie keine Unterschiede nach Takrolimus-Behandlung im Vergleich zu
Kontrollzellen nach LPS- bzw. CD40L-Stimulation der DCs. Ebenso finden SZABO et
al. keinen Einfluß von Takrolimus auf die Expression von CD80, CD86, MHC-I und
MHC-II Oberflächenmolekülen. Untersuchungen zum Immunphänotyp isolierter
epidermaler
Langerhanszellen
wiederum
ergeben
eine
Oberflächenmoleküle: Während der Maturation zu DCs inhibiert
Alteration
der
Takrolimus die
Expression von CD25, CD40 und CD80 ebenso wie die von MHC-I und MHC-II.
Tab. 2-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Takrolimus. Literatur s. Text
Zelltyp
in vivo
in vitro
Keratinozyten
Down-Regulation
IL-8 Rezeptor
Langerhans-Zellen
Down-Regulation FcεRI
DCs
Down-Regulation FcεRI
T-Zell Allostimulation↓
T-Lymphozyten
Lymphknotengewichte
(eigene Untersuchungen)
αβ+/γδ+ T-Zellen
Inhibition der Kontaktallergie
im TNCB-Modell
CD4+ T -Zellen
Reduktion der Zellzahl in
der Haut im TNCB-Modell
26
CD25, CD40, CD80,
MHC-I, MHC-II↓
IL-6 und IL-12↓
T-Zell Allostimulation↓
IL-2, IL-4, IFN-γ↓
Proliferation↓
2.4.3.3 Rapamycin
Rapamycin ist ein natürliches Fermentationsprodukt der Actinomyces-Art
Streptomyces hygroscopicus, das vor 25 Jahren aus einer Bodenprobe der
Osterinsel Rapa Nui isoliert wurde und als putatives Fungizid den Namen Rapamycin
erhielt. Bei Rapamycin handelt es sich um ein weiteres Immunsuppressivum aus der
Gruppe der Makrolide mit einem Molekulargewicht von 914 Dalton; es zählt
pharmakologisch zur Gruppe der mTOR (mammalian target of rapamycin)-KinaseInhibitoren (ABRAHAM und WIEDERRECHT 1996). Rapamycin (RapamuneR) ist
zugelassen
zur
Prophylaxe
der
Organabstoßung
bei
Patienten,
die
ein
Nierentransplantat erhalten.
Nach Aufnahme in die Zelle erfolgt – analog zu Takrolimus – eine Bindung an
FKBP-12; der entstandene Komplex hemmt dann allerdings nicht die Phosphatase
Calcineurin und damit die Ca2+ -abhängige Transkription der Gene für die Synthese
von IL-2. Angriffspunkt dieses Komplexes ist die Kinase mTOR (siehe Abb. 2-2).
Durch die Inhibition dieser Kinase wird der Zellzyklus in einer späten Phase (G1 zu
S) blockiert. Im Gegensatz zu Takrolimus, welches den Zellzyklus in einer frühen
Phase moduliert und die IL-2 Synthese hemmt (frühe G1-Phase), wird also durch
Rapamycin die Zellantwort auf produzierte Zytokine unterdrückt (VASQUEZ 2000).
Maximale Blutspiegel werden beim Menschen nach einer Stunde erreicht, die
Bioverfügbarkeit nach oraler Aufnahme beträgt nur 15%. Die mittlere Halbwertzeit
wird mit 62 ± 16 Stunden angegeben.
Als
klinisch
Hyperlipidämien,
bedeutsame
eine
höhere
Nebenwirkungen
Infektanfälligkeit
werden
für
(verursacht
Rapamycin
durch
die
Immunsuppression) und ein erhöhtes Risiko für maligne Syndrome, insbesondere
Lymphome und Hautkrebs angegeben.
27
OCH3
OH
CH3
H 3C
O
N
O
O
O
H3CO
O
HO
H3C
OH
O
H3C
OCH3
O
H3C
CH3
CH3
Abb. 5-2: Strukturformel von Rapamycin
2.4.3.3.1 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vivo
Den Einfluß Rapamycin auf die Funktion dendritischer Zellen untersuchen
HACKSTEIN et al. (2002): In vitro generierte und in vivo injizierte murine DCs weisen
eine herabgesetzte Antigenaufnahme auf; dies äußert sich in einer Reduktion der
Makropinozytose
und
Mannose-Rezeptor-vermittelten
Endozytose
von
Fluorescinisothicyanat (FITC)-Albumin bzw. FITC-Dextran. Die Hemmung der
Endozytose wird dabei nicht durch Apoptose verursacht. In weiteren Untersuchungen
berichten HACKSTEIN et al. (2003) von einer beeinträchtigten Generierung und
Mobilisation von DCs unter dem Einfluß von Rapamycin sowie einer Modulation kostimulatorischer Oberflächenmoleküle (CD80 und CD86), pro-inflammatorischer
Zytokine (TNF-α) und der T-Zell Allostimulation (s. Tab. 3-2).
Analog zur Takrolimuswirkung im TNCB-Modell berichten SALERNO et al. (1998)
über eine wirkungsvolle Hemmung der Kontaktsensitivität durch systemische
28
Verabreichung von Rapamycin; auch hierfür wird ein direkter Einfluß auf αβ+ und γδ+
T-Lymphozyten diskutiert. Allerdings wurde die IL-2 Synthese nicht gehemmt.
FK 506
RAPA
FK 506
RAPA
FKBP-12
FKBP-12
Zellkern
Transkription:
IL-2, TNF-α
Mitogenese
GM-CSF
NF-ATp
mTOR
Abb. 6-2: Wirkmechanismen der Makrolid-Immunsuppressiva Takrolimus und Rapamycin
(RAPA) nach BORNHÖVD et al. (2000)
2.4.3.3.2 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vitro
In-vitro- Untersuchungen von MONTI et al. (2003) können die In-vivo-Ergebnisse
(HACKSTEIN et al. 2002) hinsichtlich einer Beeinflussung der DC-Antigen-Aufnahme
bestätigen. Durch Inkubation mit Rapamycin weisen humane monocyte-derived DCs
eine
verminderte
Oberflächenmoleküle
FITC-Dextran
CD1a,
Endozytose
MHC-I,
MHC-II,
29
auf.
Weiterhin
CD80,
CD86
werden
und
die
CD40
herunterreguliert. Anders als In-vivo-Untersuchungen gezeigt, induziert Rapamycin
jedoch die Apoptose von DCs (WOLTMAN et al. 2001, MONTI et al. 2003). Die
apoptotische Wirkung von Rapamycin wirkt sich dabei exklusiv auf DCs aus, was
WOLTMAN et al. (2003) in Untersuchungen an monocyte-derived DCs zeigen.
Diskutiert wird eine Interruption der GM-CSF-Signalkaskade mit nachfolgender
Überexpression des pro-apoptotischen Zellzyklus-Inhibitors p27, vermittelt durch die
mTOR-Inhibition durch Rapamycin.
Den suppressiven Einfluß von Rapamycin auf die DC-Aktivierung untersuchen
(HACKSTEIN et al. 2003); Rapamycin hemmt danach die IL-4 abhängige Maturation
der DCs und deren Fähigkeit zur T-Zell-Allostimulation sowie die Produktion von
TNF-α. Posttranskriptional sind die beobachteten Effekte bei DCs mit einer DownRegulation der zwei IL-4 Rezeptor-Untereinheiten CD124 und CD132 verbunden.
Den Effekt von Rapamycin auf die DC/T-Zell Interaktion untersuchen MATSUE et
al. (2002). Rapamycin inhibiert wirkungsvoll die DC-vermittelte T-Zell Proliferation,
hat jedoch keinen Einfluß auf die Zytokinproduktion der DCs (IL-6 und IL-12 p40) und
der T-Lymphozyten (IL-2, IL-4, IFN-γ). Das DC-Oberflächenmolekül CD40 wird durch
Rapamycin in seiner Expression während der Antigenpräsentation gehemmt.
Tab. 3-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Rapamycin. Literatur s. Text
Zelltyp
in vivo
in vitro
DCs
Antigen-Aufnahme↓
Generierung, Mobilisation↓
CD80, CD86, TNF-α↓
T-Zell-Allostimulation↓
T-Zellen
Inhibition der Kontaktallergie
(αβ+ + γδ+ T-Zellen)
30
Antigen-Aufnahme↓
CD1a, CD40, CD80, CD86,
MHC-I, MHC-II↓
Apoptose-Induktion
T-Zell-Allostimulation↓
IL-4 abhängige Maturation,
IL-4 Rezeptor-Komplex
(CD124, CD123)↓
TNF-α↓
Proliferation↓
3 Material und Methoden
3.1 Geräte und Reagenzien
3.1.1 Geräte für Zellkulturversuche
Kühlzentrifuge
Centrifuge
5804
R,
Eppendorf,
Hamburg
Brutschrank
US AutoFlow, Zapf, Sarstedt
Mikroskop
Axiovert 25, Zeiss, Jena
Sterilfilter
Minisart, Sartorius, Göttingen
Polypropylen-Röhrchen,
15 ml/50 ml
Greiner, Frickenhausen
Petrischalen,
tissue culture dish cell+, Sarstedt
100mm x 20mm
6-,12-,24,-96-well-plates
Greiner, Frickenhausen
Pipettenspitzen, 10 ml
Greiner, Frickenhausen
96-well-plates, round-bottom
Greiner, Frickenhausen
Einmalspritzen, 2/10 ml
Omnifix, Braun, Melsungen
Einmal-Injektions-Kanüle, Nr 14
Terumo, Leuven, Belgien
Einmal-Injektions-Kanüle, Nr 20
Omnifix, Braun, Melsungen
Feinwaage
Sartorius 2002 MP1, Sartorius,
Göttingen
Digitalkamera
PowerShot A70, Canon Inc., Malaysia
3.1.2 Reagenzien für Zellkulturversuche
RPMI-1640-Medium
Biochrom, Berlin, Deutschland
Penicillin
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Streptomycin
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
10% FKS
Biochrom, Berlin, Deutschland
31
β-Mercaptoethanol
Sigma, Steinheim
GM-CSF
R&D-Systems, Minneapolis, USA
MIP-3β
R&D-Systems, Minneapolis, USA
Polyvidon-Iod-Lösung
Braunol, Braun, Melsungen
NH4Cl
Merck, Darmstadt
EDTA
Aldrich, Steinheim
KHCO3
Merck, Darmstadt
LPS
E. coli O127 B8, Sigma, Steinheim
Na2-EDTA
Merck, Darmstadt
NaHCO3
Merck, Darmstadt
Cilomilast
Elbion AG, Radebeul
Rapamycin
Wyeth-Agent
Research
Lab.,
Princeton, USA
Takrolimus
In-vivo-Versuche:
freundliche
Gabe
von Prof. Dr. Wozel, Dresden
In-vitro-Versuche:
Calbiochem,
Darmstadt
ProtopicR
Fujisawa Healthcare, Japan
TDI
Sigma, Steinheim
Trypan-Blau
Sigma, Steinheim
3
Hartmann Analytic, Braunschweig
H-Thymidin (1mCi)
3.1.3 Geräte für Zymographie
Netzanschlußgerät
PowerSupplyUnit 1200/200, Desaga,
Heidelberg
Elektophoresekammer
Penguin
Water-Cooled
Dual-Gel
Electrophoresis System, Peqlab,
Erlangen
Gelgießstand
Multiple Gradient Caster, Peqlab,
Erlangen
Hamilton-Spritze, 10 µl
Microliter, Hamilton-Bonaduz, Schweiz
32
Schüttler
Diffusions-Entfärbe-Apparatur,
Desaga, Heidelberg
Elektrophorese-Kühlung
Multiwash, Eheim
Zellglas
Einmach-Fix, Folia
Magnetrührer
Magnetomix, Colora, Lorach
Tischzentrifuge
Centrifuge 5415 C, Eppendorf,
Hamburg
Tischschüttler
Reax top, Heidolph
3.1.4 Reagenzien für Zymographie
Coomassie Brillant Blau g 250
Merck, Darmstadt
ProSieve 50 gel solution
BMA, Rockland, USA
Temed
(N,N,N`,N`Tetramethylethylenediamine)
Sigma, Steinheim
Methanol
LAB Scan Ltd., Dublin, Ireland
Ammoniumperoxidisulfat (APOS)
Merck, Darmstadt
Ethanol absolut
Riedel de Haën
Essigsäure 100 %
Appli Chem, Darmstadt
Glycerin
1-Butanol
Merck, Darmstadt
Calciumchlorid-dihydrat
Merck, Darmstadt
NaCl
Merck, Darmstadt
Tris-Base
Merck, Darmstadt
(Tris-(hydromethyl)-aminomethan)
Tris-HCl
Merck, Darmstadt
(Tris-(hydroxymethy)aminomethanhydrochlorid)
Natriumhydrogencarbonat
Merck, Darmstadt
Gelatine, Typ A from porcine skin
Sigma, Steinheim
Elektrophorese kD-Marker
Precision Plus Protein, Dual Color
Standards, Biorad, München
33
3.1.5 Geräte für TNF-α/IL-12-ELISA
DuoSet Mouse TNF-α-ELISA
R&D-Systems, Minneapolis, USA
DuoSet Mouse IL-12-ELISA
R&D-Systems, Minneapolis, USA
Biorad Protein Assay
Biorad, München
Photometer
MicroplateReader MRX, Dynatech
Drucker
LC 24-100,star
3.1.6 Geräte für FACS-Analyse
FACSscan flow cytometer
Becton Dickinson, Mountain View,
CA, USA
CellQuest Software
CD11c–Antikörper
Pharmingen, Hamburg, Deutschland
MHC–II–Antikörper
Pharmingen, Hamburg, Deutschland
Red 670–Streptavidin
Gibco, Gaitherburg, MD, USA
CD80-Antikörper
Pharmingen, Hamburg, Deutschland
CD86-Antikörper
Pharmingen, Hamburg, Deutschland
3.1.7 Geräte für Densitometrie
Hp Scan Jet 7400 Scanner
Hewlett Packard, USA
Photo-Impact 4.0 Software
Ulead Systems, USA
Scion Image Software
Scion, Frederick, MD, USA
34
3.1.8 Hergestellte Puffer und Lösungen
PBS–Puffer:
8g
NaCl
0,2 g
KCl
1,44 g Na2PO4
0,2 g
KH2PO4
bidest. Wasser ad 1000 ml
pH 7,2 mit 1M HCl/1 M NaOH
Hämolyse–Puffer:
8,29 g NH4CL
0,037 g Na2 EDTA
0,839 g NaHCO3
bidest. Wasser ad 1000 ml
pH 7,3
DC–Medium:
RPMI 1640
10 % FKS
50 µM β-Mercaptoethanol
3.1.9 Versuchstiere
Für die Versuche wurden weibliche BALB/c-Mäuse verwendet (Alter der Tiere 8
Wochen; Körpergewicht ca. 20 g). Alle Tiere waren klinisch gesund. Die Mäuse
wurden in Käfigen zu je 6 Tieren in einem 12-h Hell/Dunkel-Lichtzyklus gehalten.
Wasser und Futter wurden ad libitum angeboten. Der Tierversuch wurde bei der
Bezirksregierung Hannover angezeigt (Az. 509i-42502-98A839).
35
3.2 Versuchsübersicht
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der immunwirksamen Pharmaka
Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Funktion in vitro generierter
dendritischer Zellen (DCs) und DCs dermaler und epidermaler Herkunft untersucht.
In vivo wurde im nicht-inflammatorischen als auch im TDI-Kontaktallergiemodell
die
Beeinflussung
von
dermalen/epidermalen
DCs
hinsichtlich
ihres
Migrationsverhaltens und ihrer Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren durch oben
aufgeführte Pharmaka untersucht. Hierfür wurden die Inhibition einer Ohrschwellung
per
Kutimeter
als
funktioneller
Entzündungsparameter
und
die
Anzahl
ausgewanderter dermaler/epidermaler DCs in einem Skin-Migration-Assay bestimmt.
Als Parameter für die T-Zell-Stimulation durch Langerhans-Zellen bzw. dermale DCs
wurde das Gewicht und die Zellzahl der Lnn. auriculares sensibilisierter Mäuse im
Local-Lymphnode-Assay bestimmt.
In vitro wurden DCs generiert und folgende Versuche durchgeführt: In
Zellkulturversuchen wurde der Einfluß der Testsubstanzen auf die LPS-induzierte
Sekretion proinflammatorischer Zytokine (TNF-α, IL-12) von DCs untersucht. Die
Zytokinmessung erfolgte mittels ELISA. Weiterhin wurde in vitro in der MixedLeukocyte-Reaction (MLR) die Fähigkeit der DCs zur T-Zell-Stimulation und deren
Inhibition durch oben aufgeführte Pharmaka untersucht.
Mittels Durchflußzytometrie wurden die in vitro generierten DCs anhand ihrer
charakteristischen Oberflächenmoleküle (MHC-II, CD11c) identifiziert und deren
prozentualer
Anteil
in
der
Kultur
bestimmt.
Zusätzlich
wurde
in
der
Durchflußzytometrie der Einfluß der Testsubstanzen auf die LPS-induzierte
Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle (CD80 und CD86) der DCs
untersucht.
Die FACS-Analysen wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von PD. Dr.
Tschernig in der Medizinische Hochschule Hannover durchgeführt. Die Durchführung
des LLNA und Messung der MLR geschah in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe
von Dr. Braun, Fraunhofer-Gesellschaft Hannover.
36
3.3 Beeinflussung der DCs in vitro
3.3.1 Generierung von DCs
Die Gewinnung von DC-Vorläuferzellen aus murinem Knochenmark erfolgte mit
der von LUTZ et al. (1999) beschriebenen Methodik. Zur Gewinnung von DCVorläuferzellen (Stammzellen) aus dem Knochenmark wurden die Mäuse durch
zervikale Dislokation getötet und der Femur mit sterilem Instrumentarium (Schere,
Pinzette) freipräpariert und ausgelöst. Anschließend wurde der so präparierte
Knochen für 5 Minuten in Alkohol (70%) desinfiziert und danach in PBS überführt.
In einer Petrischale wurde mit einem Skalpell der Knochen an beiden Enden
eröffnet; der Inhalt der Markhöhle wurde mit sterilfiltriertem PBS (5 ml) mittels Spritze
und Kanüle in eine Petrischale gespült. Nach Vereinzelung des Markhöhleninhalts
mittels Pipette wurden die Zellen zentrifugiert (220 g, 4°C, 10 Minuten). Der
Überstand wurde nach der Zentrifugation verworfen und das Zellpellet in 1 ml RPMI
1640 (mit Zusatz von 10% FKS, 50 I.U./ml Penicillin und 50 mg/ml Streptomycin)
resuspendiert.
Um die Zellzahl bestimmen zu können, wurden 100 µl der resuspendierten Zellen
mit 100 µl eines Erythrozyten-Lysepuffers (Schwinzer-Lyse) 5 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit Trypanblau im
Verhältnis 1:3 gefärbt und in einer Neubauer-Kammer gezählt. Die Zellzahl
errechnete sich nach der Formel:
gezählte Zellen/4x3x10.000= Zellen/ml
2x106 Zellen wurden in 10 ml Medium (5 ml RPMI mit Zusatz von FKS 10%,
Pen/Strep, 5 ml sterilfiltriertes DC-Medium und 200 ng GM-CSF) aufgenommen und
in eine Petrischale (cell+) überführt. Die Zellkultur wurde für 10 Tage im Brutschrank
inkubiert. Während dieser Zeit erfolgte ein mehrmaliger Mediumwechsel mit GMCSF-Gabe (s. Tab 1-3).
37
Tab. 1-3.: Übersichtsdarstellung der DC-Kultivierung nach LUTZ et al. (1999)
Tag der Zellkultur
Mediumgabe
Tag 3:
Zugabe von 5 ml RPMI mit Zusatz von FKS 10%,
Pen/Strep, 5 ml DC-Medium und 200 ng GM-CSF
Tag 6 u. 8:
Zentrifugieren der Zellen (200 g, 4°C, 10 Minuten);
Abnahme von 10 ml Medium, Zugabe von
10 ml neuem Medium
Tag 10:
wie Tag 6 u. 8, GM-CSF-Gabe 100 ng
3.3.2 Gewinnung von murinen T-Lymphozyten
Die Gewinnung von murinen T-Lymphozyten erfolgte in Anlehnung an GUNZER
et al. (2001). Als Spendertiere wurden weibliche NMRI-Mäuse benutzt.
Nachdem die Tiere getötet worden waren, wurde die Milz mit sterilem
Instrumentarium (Schere, Pinzette) entnommen und in sterilfiltriertes PBS überführt.
Anschließend wurde die Milz mit 10 ml PBS mittels Spritze und Kanüle gespült und
die Spülflüssigkeit in einem 50 ml Falcon-Röhrchen aufgefangen. Die so
gewonnenen Milzzellen wurden zentrifugiert (1000g, 4°C, 10 Minuten). Der
Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 5 ml Hämolysepuffer resuspendiert.
Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktion
abgebrochen, indem 45 ml PBS hinzugegeben wurde. Es folgte ein weiteres
Zentrifugieren; nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 10 ml RPMI
1640 (mit Zusatz von FKS 10% und Pen/Strep) resuspendiert und die Zellen in eine
cell+ Petri-Schale überführt.
Nach einer Inkubation von 2 Stunden im Brutschank wurden die nicht adhärenten
Zellen aus der Petrischale abgenommen; man erhielt so eine T-LymphozytenPopulation in einer Reinheit von ca. 60-70% (GUNZER et al. 2001), da Monozyten
und Stromazellen während der Inkubation am Plastik ädherierten.
38
3.3.3 Messung von TNF-α und IL-12
Die Bestimmung erfolgte mit einem quantitativen Sandwich-ELISA: Auf eine mit
polyklonalen anti-Maus-IL-12-Antikörpern beschichtet Mikroplatte wurden jeweils
Standard, Kontrolle und Probenüberstände aufgetragen und bei Raumtemperatur
inkubiert; vorhandenes IL-12 wurde durch den Antikörper gebunden. Durch einen
anschließenden Waschvorgang wurden ungebundene Substanzen entfernt und
anschließend ein enzymgekoppelter anti-Maus-IL-12-Antikörper hinzugegeben. Nach
weiterer Inkubation wurden durch Waschen ungebundene Antikörper entfernt und die
Substratlösung für den enzymgekoppelten Antikörper hinzugegeben. Durch die
stattgefundene Enzymreaktion wechselte die Farbe von blau zu gelb nach Zugabe
der
Stop-Lösung.
Die
Intensität
der
Enzymreaktion
und
der
damit
korrespondierenden Farbintensität war proportional zum Gehalt an IL-12.
Die Auswertung erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm. Durch
den Vergleich mit einer angelegten Kalibrationsreihe konnten die absoluten IL-12Gehalte der Proben erfaßt werden. Der durchgeführte TNF-α-ELISA basierte auf der
gleichen Grundlage.
3.3.4 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur
quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen.
Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörpern durchgeführt wird (s. Tab. 2-3). Zur Analyse werden die
Zellen in einer Einzelzellsuspension durch hydrodynamische Fokussierung wie an
einer Perlenkette an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge
(Argonlaser, λ=588nm) vorbeigeleitet (s. Abb. 1-3). Bei exakter Anregung der
Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen Laserstrahl
werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben. Nach dem Laserpuls fallen
die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen) auf ihr
Ursprungsniveau zurück. Die emittierte Photonenkonzentration, die durch einen
Photodetektor (Photomultiplier) registriert wird, verhält sich proportional zur Menge
39
an gebundenen Antikörpern/ Zelle. In der Regel stehen drei Sensoren für 530 nm
(Fluoreszenzkanal 1), 585 nm (Fl 2), und >650 nm (Fl 3) zur Verfügung. Zusätzlich
werden durch die Lichtbeugung und –Streuung Informationen über die Zellgröße und
die Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas, Größe des Zellkerns usw.) der
Zellen gewonnen: Das in einem geringen Winkel (3-10°) gestreute Licht wird als
Vorwärtsstreuung („forward scatter“, FSC) mit einer Beeinflussung durch die
Zellgröße und im rechten Winkel dazu als Seitwärtsstreuung („side scatter“, SSC) mit
einer Abhängigkeit der intrazellulären Granularität erfasst. Mit Hilfe dieser beiden
Messparameter sind unterschiedliche Zellpopulationen zu identifizieren (z.B.
Lymphozyten, dendritische Zellen). Nach einer Verstärkung wird das optische Signal
zuerst in ein elektrisches Signal, anschließend in ein digitales Signal umgewandelt.
Eine gleichzeitige FACS-Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist
möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen
Wellenlänge anregen lassen aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff
charakteristische Emmissionsspektren verfügen.
In der vorliegenden Arbeit wurden in vitro generierte DCs an Tag 10 der Kultur
hinsichtlich ihrer Reinheit und der Einfluss der Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und
Takrolimus auf die LPS-induzierte Induktion kostimulatorischer Oberflächenmoleküle
der DCs durchflußzytometrisch untersucht (s. Tab. 2-3 und 3-3).
Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten überführt und zweimal mit PBS (enthält 1%
BSA und 0,1% NaN3) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit den
Antikörpern für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt
wurde die FACS-Analyse der Zellen durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgte
mit der CellQuest Research Software. Die Ergebnisse wurden als Histogramme
dargestellt.
Dendritische Zellen wurden durch Detektion von CD11c und MHC-II identifiziert;
als kostimulatorische Oberflächenmoleküle wurden CD80 und CD86 untersucht.
40
Tab. 2-3: Verwendete fluoreszierende Antikörper
Oberflächenmolekül
prim. Antikörper
sek. Antikörper
CD11c
hamster IgG1, PE-konjugiert
MHC-II
rat IgG2a, Biotin-konjugiert
Isotypkontrolle
hamster IgG1, PE–konjugiert
red 670-Streptavidin
rat IgG2a, Biotin–konjugiert
CD80
mouse IgG1, FITC-konjugiert
CD86
mouse IgG1, FITC-konjugiert
red
670-Streptavidin
Tab. 3-3: Durchflußzytometrische Untersuchungen:
1) DCs an Tag 9 der Kultur, LPS–Konz. 1 µg/ml; 2) Inkubation der DC-Kultur mit Cilomilast (10µM),
Takrolimus (100nM) und Rapamycin (1µM) an Tag 8 und 9; Inkubation an Tag 9 30 min vor LPSStimulation
Zellmaterial
funktioneller Parameter
Oberflächenmolekül
DCs Tag 10
Reinheit der Kultur an DCs
CD11c; MHC–II
Stimulation von DCs
CD80/CD86; MHC–II
Inhibition der DC-Stimulation
CD80/ CD86; MHC–II
1)
DCs + LPS
DCs + Cilomilast
2)
+ Takrolimus2)
+ Rapamycin
2)
Zellsuspension
FL 1
FL 2
FL 3
FSC
Argon-Laser
588nm
SSC
Abb. 1-3: Schematische Darstellung der Durchflußzytometrie
41
3.3.5 Heterologe Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR)
Funktionelle Grundlage der MLR ist die Interaktion von Leukozyten zweier
verschiedener Organismen: Naive T–Lymphozyten des einen Organismus erkennen
via T–Zell–Rezeptor einen allelen Polymorphismus von Fremd-MHC-II–Molekülen
dendritischer Zellen. Daraufhin werden die T–Lymphozyten zur Proliferation
angeregt. Als Stimulatorzellen wurden in den eigenen Untersuchungen DCs von
BALB/c–Mäusen verwendet, T–Lymphozyten von NMRI–Mäusen dienten als
Responderzellen. T-Lymphozyten und dendritische Zellen wurden wie bereits
beschrieben generiert (s. 3.3.1 und 3.3.2)
Die hier angewandte heterologe MLR wurde in Anlehnung an STEINMAN et al.
(1978) und GUNZER et al. (2001) durchgeführt (s. Abb. 2-3); es wurden die
Immunmodulatoren Cilomilast, Takrolimus und Rapamycin eingesetzt und ihr Einfluß
auf die DC–induzierte T-Lymphozytenproliferation untersucht.
Folgende Versuchsansätze wurden in der MLR durchgeführt:
Für eine Koinkubation der MLR mit Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
wurden zunächst 100.000 T-Zellen/100 µl RPMI in eine round-bottom Mikrotiterplatte
vorgelegt. Anschließend wurden DCs in verschiedenen Verdünnungsstufen (10.000,
5000, 2500, 1250, 625, 312/100 µl RPMI) hinzugegeben; schließlich wurden die
oben aufgeführten Pharmaka hinzugegeben (s. Tabelle 4-3).
In einem weiteren Versuchsansatz wurde eine Prä-Inkubation von DCs bzw. TZellen mit Cilomilast vorgenommen: DCs bzw. T-Zellen wurden zunächst für eine
Stunde mit Cilomilast prä-inkubiert und anschließend gewaschen. Anschließend
wurde die MLR wie oben beschrieben durchgeführt.
Weiterhin
sollte
für
Cilomilast,
Rapamycin
und
Takrolimus
eine
Konzentratiosabhängigkeit hinsichtlich der Inhibition der T-Zellproliferation gezeigt
werden: Dazu wurden DCs und T-Zellen in einer Ratio von 8000/100.000 Zellen
inkubiert und log10 Verdünnungsreihen von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
eingesetzt (s. Tabelle 4-3). In allen Versuchen wurden parallel unbehandelte
Kontroll-MLR angesetzt.
Die Mikrotiterplatten wurden für 5 Tage im Brutschank inkubiert; zur MLR wurde
für die letzten 18 Stunden der Inkubation 3H-markiertes Thymidin hinzugegeben
42
(0,005 mCi). Während der Zellproliferation wurde das 3H-Thymidin in die DNA sich
teilender T-Lymphozyten eingebaut.
Die Auswertung der Zellproliferation erfolgte im Scintillationszähler: Hiermit wurde
die vom inkorporierten
3
H-Thymidin ausgehende β-Strahlung als Maß für die
stattgefundene T-Lymphozytenproliferation.gemessen.
Tab. 4-3: Versuchsübersicht MLR; Konzentration der verwendeten Pharmaka in nmol/l bzw.
µmol/l
Prä-Inkubation
Koinkubation
Dosis-Wirkung
10 µmol/l
10 µmol/l
10, 100,10-1,10-2,10-3,10-4 µmol/l
Rapamycin
1 µmol/l
1, 10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5 µmol/l
Takrolimus
100 nmol/l
100, 10, 1, 10-1,10-2,10-3 nmol/l
Cilomilast
Cilomilast
Rapamycin
Takrolimus
3
H-Thymidin (Tag 5)
T-Lymphozyten
Dendritische
Zellen
Messung
18 h
der
Proliferation
Abb. 2-3: Schematische Darstellung der MLR
43
3.4 In-vivo-Versuche zur allergischen Kontaktdermatitis
3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell
Eine
Sensibilisierung
gegenüber
dem
Kontaktallergen
TDI
(Toluen-2,4-
diisocyanat) erfolgte über eine topische Applikation von TDI (in Aceton gelöst) auf die
rasierte Bauchhaut an 4 aneinanderfolgenden Tagen (s. Abb. 3-3). An Tag 1 wurden
100 µl der 5% TDI-Lösung topisch appliziert, an den Tagen 2-4 jeweils 50 µl.
Zusätzlich wurde an den Tagen 1-3 die Hornschicht der Epidermis der rasierten
Bauchhaut vor TDI-Applikation mittels Adhäsiv-Klebestreifen abgestrippt, um ein
besseres Eindringen des TDI in die Haut zu gewährleisten.
An Tag 21 erfolgte die Challenge der sensibilisierten Mäuse; hierfür wurden 20 µl
einer 0,5% TDI-Lösung auf die äußere und innere Ohrseite appliziert. Die Mäuse
wurden dann in Abhängigkeit von der Stärke der inflammatorischen Reaktion des
Ohres in low-und high-responder gleichmäßig aufgeteilt, so daß in jeder
Versuchsgruppe die Anzahl der low-und high-responder-Tiere identisch war. Die
Challenge des kontralateralen Ohres erfolgte an Tag 28. Parallel wurde eine
Vehikelkontrolle durchgeführt.
Tage 1-4:Sensibilisierung
Tag 21: Challenge I; MEST I
Tag 27: Challenge II; Behandlung I
Tag 28: Behandlung II; MEST II; Organkultur
Entnahme der Lnn. Auriculares für LLNA
Abb. 3-3: Schematische Darstellung des TDI-Modells
44
3.4.2 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im allergischen
Entzündungsgeschehen
Durch die Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen TDI und Challenge
der allergischen Reaktion wurde eine allergische, aseptische Entzündungsreaktion
der Ohren hervorgerufen.
In Vorversuchen wurden Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf den
Applikationswegen topisch, intraperitoneal und per os vergleichend verabreicht
(Tabellen 5-, 6-, 7-, 8-3). In den darauf folgenden Hauptversuchen wurde Cilomilast
topisch, Takrolimus topisch und intraperitoneal verabreicht (Tabellen 9- und 10-3).
Um zu untersuchen, welchen Einfluß der Immunstatus der Versuchstiere auf die
Wirksamkeit der Pharmaka ausübt, wurden für den 1. Hauptversuch bereits aus
vorherigen TDI-Versuchen die Versuchstiere geboostert, während für den 2.
Hauptversuch die Versuchstiere erstmalig mit TDI sensibilisiert wurden.
Die Behandlung der Tiere erfolgte an den Tagen 27 und 28 des Allergiemodells;
die Behandlung an Tag 28 erfolgte 2 Stunden vor der TDI-Challenge (Ausnahme:
Applikation von ProtopicR 30 Minuten nach TDI-Challenge, da die Salbe sonst die
TDI-Penetration verhindert). 16 Stunden nach der letzten Behandlung der Mäuse
wurden die Ohren im Skin-Migration-Assay kultiviert.
Tab. 5-3: Übersicht über die Lösungsvermittlung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus;
Vehikelkontrolle entspricht der jeweiligen Lösungsvermittlung ohne Zusatz von Pharmaka
1)Bäumer et al. (2003a) ; 2)Carlson et al. (1993) ;3)Duncan (1994) ; 4)Hackstein et al. (2003) ;
5)Salerno et al. (1998)
per os
intraperitoneal
Cilomilast
Rapamycin
Takrolimus
Miglyol (10 ml/kg)1
Ethanol/Olivenöl
Ethanol/Olivenöl
(1:9)2
(1:9)3
gelöst in:
gelöst in:
10% PEG 300,
0,5% Hydroxyethyl- Ethanol+Tween 80, Ethanol+Tween 80,
topisch
zellulose
PEG 300, H2O
PEG 300, H2O
(10 ml/kg)1
(1:2:20:19)4
(1:2:20:19)5
Aceton/DMSO
gelöst in Ethanol; gelöst in Ethanol;
(1:9)1
Aceton/DMSO (1:1) Aceton/DMSO (1:1)
45
Tab. 6-3: Behandlungsschema Vorversuch, perorale Applikation
Vehikelkontrolle Cilomilast
Rapamycin
Takrolimus
Tag 27
Vehikel
20 mg/kg p.o.
20 mg/kg p.o.
2,5 mg/kg p.o.
Tag 28
Vehikel
20 mg/kg p.o
20 mg/kg p.o
2,5 mg/kg p.o
Tab. 7-3: Behandlungsschema Vorversuch, intraperitoneale Applikation
Vehikelkontrolle Cilomilast
Rapamycin
Takrolimus
Tag 27
Vehikel
20 mg/kg i.p.
20 mg/kg i.p.
2,5 mg/kg i.p.
Tag 28
Vehikel
20 mg/kg i.p.
20 mg/kg pi.p.
2,5 mg/kg i.p.
Tab. 8-3: Behandlungsschema Vorversuch, topische Applikation
Vehikelkontrolle
Rapamycin
Takrolimus
Tag 27
Vehikel
3% Lösung topisch
Tag 28
Vehikel
1% Lösung topisch
ProtopicR 0,1%
Vehikelkontrolle
Cilomilast
Takrolimus
Tag 27
Vehikel
3% Lösung topisch
2,5 mg/kg i.p.
Tag 28
Vehikel
3% Lösung topisch
2,5 mg/kg i.p.
Tab. 9-3: Behandlungsschema Hauptversuch 1
0,5% Lösung
topisch
46
Tab. 10-3: Behandlungsschema Hauptversuch 2
Vehikelkontrolle
Cilomilast
Takrolimus
Tag 27
Vehikel
5% Lösung topisch
2,5 mg/kg i.p.
Tag 28
Vehikel
5% Lösung topisch
2,5 mg/kg i.p. und
0,5% Lösung
topisch;
ProtopicR 0,1%;
2 h nach TDIChallenge
Vehikel
vor Kultivierung
5% Lösung topisch
3.4.3 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im nichtinflammatorischen Modell
In diesem Versuchsansatz wurden Mausohren mit 20 µl 3%iger Cilomilast-Lösung
behandelt, auf die Innen- und Außenfläche der Ohren der Kontrolltiere wurden
jeweils 10 µl Vehikel-Lösung (Aceton/DMSO 9:1) appliziert. 2 Stunden später wurden
die Tiere getötet und die Ohren im Skin-Migration-Assay kultiviert. Unmittelbar vor
der Organkultur wurden die Ohren nochmals mit 20 µl 3%iger Cilomilast-Lösung
behandelt.
3.4.5 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST)
Prinzip
des
MEST
ist
die
Erfassung
der
TDI-induzierten
allergischen
Entzündungsreaktion am Ohr. Dabei wurde die Ohrdicke mit einem Kutimeter
(Mitutoyo, Neuss) gemessen. Die Durchführung des MEST erfolgte in Anlehnung an
GAD et al. (1986).
Zunächst erfolgte eine Messung an Tag 21 vor und nach TDI-Challenge, um die
Mäuse
einzuteilen:
high-responder-Tiere
waren
solche,
die
eine
starke
Entzündungsreaktion (gemessen an der Ohrschwellung) aufwiesen, low-responderTiere solche mit einer entsprechend geringeren Ohrschwellung. Low- und High-
47
responder-Tiere wurden somit erfaßt und anschließend gleichmäßig auf die
Versuchsgruppen aufgeteilt.
Die nächste Messung erfolgte an Tag 28, 16 Stunden nach der 2. TDI-Challenge,
um einen Effekt der verwendeten Pharmaka hinsichtlich der Inhibition der
Ohrschwellung und somit der Entzündungsreaktion zu zeigen.
3.4.6 Skin-Migration-Assay
Prinzip dieses Assays ist es, dermale und epidermale DCs der Maushaut zu
gewinnen und ihr Migrationsverhalten unter Einfluss von Immunmodulatoren zu
untersuchen. Die Durchführung erfolgte in Anlehnung an ORTNER et al. (1996).
Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet, die Ohren abgetrennt und für
ca. 10 min. in 70% Ethanol-Lösung desinfiziert und anschließend luftgetrocknet.
Mittels zweier Pinzetten wurden die dorsale und ventrale Ohrhälfte voneinander
getrennt. Die dorsale, knorpelfreie Ohrhälfte wurde - mit der Epidermis nach oben
zeigend - auf ein dreibeiniges Edelstahlnetz in eine 24-well Platte gelegt und das well
mit 1,3 ml Kulturmedium (RPMI-Medium mit Zusatz von FKS 10%, Pen-Strep und 50
ng/ml MIP-3β) gefüllt (s. Abb. 4-3).
Diese Organkultur wurde über 3 Tage im Brutschank bei 37°C inkubiert. Die
Ohrexplantate wurden täglich in eine neue Platte mit frischem Medium umgesetzt.
Am 3. Tag wurden die Medien von Tag 2 und 3 gepoolt und zentrifugiert (1000 g,
4°C, 10Minuten), die Überstände verworfen und die ausgewanderten Zellen in der
Neubauer-Kammer ausgezählt. Die Mausohren wurden anschließend gewogen und
bei –80°C eingefroren.
Die Anzahl ausgewanderter Zellen bzw. ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe
errechnete sich nach folgenden Formeln:
Anzahl ausgewanderter Zellen = gez. Zellen/4 x 3 x 10.000 x (Restvolumen/1000)
Anzahl ausgewanderter Zellen/mg Ohrgewebe = ausgewanderte Zellen/Ohrgewicht
48
Haut-Explantat
Epidermis
Metall-Tisch
Medium
Langerhans-Zelle/DCs der Haut
Abb. 4-3: Schematische Darstellung des Skin-Migration-Assays
3.4.7 Local-Lymph-Node-Assay (LLNA)
Der LLNA ist eine Methode, um die Proliferationsrate von T-Lymphozyten eines
regionalen
Lymphknotens
nach
Stimulation
durch
antigenpräsentierende
dendritische Zellen post mortem zu messen. Die Durchführung dieser Methode
erfolgte in Anlehnung an KIMBER und WEISENBERGER (1989). Funktioneller
Parameter ist hier das gemessene Lymphknotengewicht, welches ein Maß für die
durch DCs induzierte stattgefundene T-Zellproliferation ist. Die zu untersuchenden
regionalen Lymphknoten wurden entnommen und anschließend deren Gewicht
bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lnn. auriculares der TDIsensibilisierten Mäuse verwendet.
49
3.4.8 Aufbereitung der Zymographie-Proben
Die tiefgefrorenen Mausohren (s. 3.4.6) wurden in einer Keramikreibschale mit
flüssigen Stickstoff überschichtet und zerrieben; das Ohrhomogenat wurde
anschließend in Eppendorfgefäße überführt, in 150 µl PBS aufgenommen und für 1
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden anschließend durchmischt
und zentrifugiert (3000 x g, 10 Minuten, 4°C). Die Überstände wurden entnommen
und eine Proteinbestimmung durchgeführt. Alle Proben wurden auf die gleiche
Proteinkonzentration eingestellt.
3.4.9 Biorad-Proteinbestimmung
Prinzip der verwendeten Protein-Bestimmung ist eine Farbänderung der
Proteinlösung nach Zugabe eines Farbstoffes: Gelöstes Protein wurde in einer
Mikrotiterplatte vorgelegt und mit der Reaktionsreagenz vermischt. Die Wellenlänge
des Absorbtionsmaximum des sauren Farbstoffs verschiebt sich von 465 nm nach
595 nm, wenn der Farbstoff an vorhandenes Protein bindet. Nach fünfminütiger
Inkubation auf einem Horizontalschüttler wurden die Proben photometrisch bei 595
nm Wellenlänge ausgewertet. Der Vergleich zu einer angelegten Kalibrationsreihe
erlaubt eine Berechnung der absoluten Proteinkonzentration der Proben.
Durchführung des Biorad-Assay:
•
Ansetzen einer Kalibrationsreihe in 1:2 Verdünnungsschritten aus ProteinStandard (1 mg Protein/ml), ausgehend von 80 µg Protein/ml; je 160 µl
Proteinlösung wurden in die Mikroititerplatte pipettiert
•
1 µl der Probenlösung wurden in die Mikrotiterplatte pipettiert, 159 µl RPMIMedium zugeben und mit der Pipette gemischt
•
zu jeder Probe bzw. Kalibrationspunkt wurden 40 µl Biorad-Reagenz
hinzugeben und mit der Pipette gemischt
•
die Platte wurde für 5-10 Minuten inkubiert und danach im Microplate-Reader
bei 570 nm Wellenlänge ausgelesen
50
3.4.10 Zymographie
Zum Nachweis der proteolytischer Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen in den
Überständen der Mausohr-Homogenate wurde in Anlehnung an KLEINER und
STELER-STEVENSON (1993) eine Zymographie mit Gelatine als Substrat im SDSPolyacrylamid-Gel durchgeführt Die Zymographie entspricht einer Elektrophorese
unter nicht–reduzierenden Bedingungen mit Zusatz von 1 mg/ml Gelatine zum 7,5%Acrylamid haltigen Gel.
Das Zymographie-Gel wurde im Gradienten-Gießstand gegossen und bei
Raumtemperatur bis zur Polymerisation inkubiert. Anschließend wurde das Gel in die
Elektrophoresekammer eingespannt und die Kammer mit Elektrodenpuffer gefüllt.
Die Probentaschen des Gels wurden mit jeweils 20 µl Probe und 20 µl Probenpuffer
gefüllt. Zur Darstellung des Molekulargewichts der aufgetrennten Proben wurde
zusätzlich zu den Proben ein Molekulargewichtsstandard auf das Gel aufgetragen.
Die Proben wurden anschließend bei einer Spannung von 200 mV in 2 Stunden
aufgetrennt.
Nach Beenden der Elektrophorese wurde das Gel 30 Minuten in Triton X (2,5 %)
auf einem Schüttler zur Entfernung des SDS aus dem Gel gewaschen. Anschließend
wurde das Gel für weitere 30 Minuten auf dem Schüttler mit dem Entwicklungspuffer
inkubiert und danach mit frischem Entwicklungspuffer 16 Stunden bei 37°C im
Hybridisierungsofen inkubiert, wobei die als Proteolyse-Substrat angebotene
Gelatine verdaut wurde. Das Gel wurde nun mit Coomassie-Brillantblau (5 %) 30
Minuten auf dem Schüttler gefärbt und viermal für 30 Minuten mit Entfärbelösung
gewaschen, bis sich weiße Banden gegen den blauen Hintergrund des Gels
abzeichneten. Das Gel wurde für 10 Minuten in Geltrocknungslösung gelegt und
zwischen 2 Streifen Einmachhaut in einem Kunstoffrahmen 3 Tage unter dem Abzug
getrocknet.
Zur
quantitativen,
Zymographie–Gele
gespeichert.
eingescannt
Anschließend
Grauwertbestimmung
der
densitometrischen
Auswertung
und
erfolgte
wurden
die
in
einem
Fotoverarbeitungsprogramm
mit
einer
Auswertungssoftware
gelatinolytischen
Banden
des
Gels
und
eine
des
Gelhintergrundes. Die ermittelten Grauwerte wurden schließlich in optische Dichte
(OD) umgerechnet (OD = log10 [255/Grauwerte]) und als Grauwertdichte dargestellt.
51
Die Subtraktion der OD des Hintergrundes von der OD der gelatinolytischen
Banden ergab die Netto-OD und war somit ein Maß für die gelatinolytische Aktivität
der MMP-9.
3.5 Statistische Auswertung
Die Ergebnisse der Migrations-Versuche wurden graphisch als Median-Boxen
dargestellt, mit Angabe des Median, 1. und 3. Quartils sowie der oberen und unteren
Extremwerte. Die Anzahl (n) nennt den Stichprobenumfang verwendeter MausohrExplantate, die einer identischen Behandlung unterzogen wurden.
Die übrigen Ergebnisse (Mouse-Ear-Swelling-Test, Lymphknotengewichte, MixedLeukocyte-Reaktion, TNF-α- und IL-12-ELISA) wurden mit Angabe von Mittelwert ±
S.D dargestellt.
Je nachdem, ob eine oder mehrere Behandlungsgruppen mit der Kontrollgruppe
verglichen wurden, erfolgte die statistische Auswertung der Ergebnisse in
unterschiedlicher Art und Weise: Beim Vergleich einer Behandlungsgruppe mit der
Kontrolle wurden die Ergebnisse mit Hilfe des Rangsummen-Tests für ungepaarte
Stichproben nach Mann und Whitney (U-Test) auf signifikante Unterschiede hin
überprüft. Bei einem „many-one“-Vergleich wurde zunächst eine Varianz-Analyse
(ANOVA) durchgeführt; als post-hoc-Test wurde schließlich der Rangsummen-Test
eingesetzt, der eine Adjustierung des α-Fehlers mittels Bonferroni-Korrektur
beinhaltete. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm SigmaStatR;
dabei galt eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% als schwach signifikant, eine von
1% als signifikant und eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,1% als hoch signifikant.
Die Einzelwerte der dargestellten Ergebnisse sind in den Anhangstabellen
aufgeführt.
52
4 Ergebnisse
4.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration
dendritischer Zellen
4.1.1 Nicht-Inflammatorisches Modell
Im nicht-inflammatorischen Modell des Skin-Migration-Assays wurde eine 3%ige
Cilomilast-Lösung topisch appliziert. Der Vergleich mit der Vehikelkontrolle zeigt, daß
die Migration von DCs aus den Ohr-Explantaten durch Cilomilast-Behandlung in 4
unabhängigen Experimenten signifikant gehemmt wurde (1-4).
Abbildung 1-4: Signifikante Hemmung der DC-Migration in vier unabhängigen Versuchen im nichtinflammatorischen Modell durch topische Cilomilast-Applikation (3%ige Lösung); a) Vehikelkontrolle,
b) Cilomilast behandelte Ohren; Zusatz von MIP-3β zur Organkultur; Einzelwerte siehe Tab. 1-9;
** p< 0,01; n=6;
53
4.1.2 TDI–Kontaktallergiemodell
In diesem Inflammationsmodell wurden in Vorversuchen zunächst Cilomilast,
Rapamycin und Takrolimus jeweils oral und intraperitoneal appliziert; weiterhin
wurden die Makrolide Rapamycin und Takrolimus in ihrer topischen Wirkung
miteinander verglichen. Keiner der Vorversuche zeigte einen Effekt der eingesetzten
Pharmaka hinsichtlich einer Migrationsinhibition von dendritischen Zellen (Abb. 2-, 3-,
4-4). In den anschließenden Hauptversuchen wurden Cilomilast und Takrolimus
eingesetzt. Cilomilast (3%ige Lösung) und Takrolimus zeigent keinen Effekt,
wohingegen Cilomilast als 5%ige Lösung die DC-Migration im Vergleich zur
Vehikelkontrolle signifikant (p<0,01) inhibierte (Abb. 5-, 6-, 7-und 9-4).
ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Vehikel
Cilomilast
Tacrolimus
Rapamycin
Abbildung 2-4: Vorversuch im TDI-Modell; perorale Applikation von Cilomilast (20mg/kg),
Takrolimus (2,5 mg/kg) und Rapamycin (20mg/kg); keine signifikante Hemmung der DC-Migration;
Einzelwerte siehe Tab. 2-9; n=3;
54
ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Vehikel
Cilomilast
Tacrolimus
Rapamycin
Abbildung 3-4: Vorversuch; intraperitoneale Applikation von Cilomilast (20mg/kg), Takrolimus
(2,5 mg/kg) und Rapamycin (20mg/kg); keine signifikante Hemmung der Migration, jedoch tendentielle
Migrationshemmung durch Cilomilast und Takrolimus; Einzelwerte siehe Tab. 2-9; n=3;
ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Vehikel
Rapamycin
Tacrolimus
Abbildung 4-4: Vorversuch; topische Applikation von Rapamycin (3%-Lösung) und Takrolimus
(ProtopicR 0,1%); keine signifikante Hemmung der Migration; Einzelwerte siehe Tab. 2-9; n=3;
55
ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Vehikel
Cilomilast
Tacrolimus
Abbildung 5-4: 1. Hauptversuch; topische Applikation von 3%iger Cilomilast-Lösung; Takrolimus
intraperitoneal (2,5 mg/kg) und topisch (0,5%) appliziert; keine signifikante Hemmung der Migration;
Einzelwerte siehe Tab. 3-9; n=8
ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe
2400
2200
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
**
400
200
0
Vehikel
Cilomilast
Tacrolimus
Abbildung 6-4: 2. Hauptversuch; topische Applikation von 5%iger Cilomilast-Lösung; Takrolimus
intraperitoneal (2,5 mg/kg) und topisch (ProtopicR 0,1% und 0,5%ige Lösung) appliziert; Zusatz von
MIP-3β zur Organkultur; signifikante Hemmung der Migration durch Cilomilast; Einzelwerte siehe Tab.
4-9; ** P< 0.01; n=6
56
DCs
Abbildung 7-4
DCs
Abbildung 8-4
DCs
Abbildung 9-4
Abbildungen 7-, 8-, 9-4: Lichtmikroskopische Aufnahmen von ausgewanderten DCs an Tag 3
der Organkultur des 2. Hauptversuchs; 7-4) Vehikelkontrolle; 8-4) Takrolimus behandelte Ohren; 9-4)
Cilomilast behandelte Ohren; deutlich sichtbar weniger ausgewanderte DCs bei Cilomilast
behandelten Ohren; Vergrößerung x 200
57
4.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die
MMP-9-Expression
4.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell
Durch die topische Behandlung der Ohren mit Cilomilast-Lösung (3%) wurde
neben der Migration der DCs auch die Expression der MMP-9 beeinflußt. Im
Vergleich zur Vehikelkontrolle war die Expression der aktiven MMP-9 Form im
zymographischen Bild kaum sichtbar. Die densitometrische Auswertung der Banden
der aktiven MMP-9-Form ergab im Vergleich zur Vehikelkontrolle eine signifikante
Hemmung durch Cilomilast (s. Abb. 10-4 und 11-4).
Pro-MMP-9
Aktive MMP-9
Kontrolle
Cilomilast
Abbildung 10-4: Ausschnitt aus gescanntem Zymographie-Gel, inverse Darstellung der
Banden; sichtbare Hemmung der Expression der aktiven Form der MMP-9 durch Cilomilast;
repräsentatives Bild von 3 durchgeführten Zymographien
58
**
Grauwert-Dichte
60
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
Cilomilast
Abbildung 11-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele;
signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Cilomilast; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 7-9;
**p< 0,05; n=6;
4.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell
In den durchgeführten Vorversuchen zeigte sich keine Modulation der MMP-9Aktivität durch orale, intraperitoneale und topische Applikation von Cilomilast,
Rapamycin und Takrolimus (Abb. 12-4). Abb. 13-4 stellt die Aktivität der MMP-9 im 1.
Hauptversuch dar. Die densitometrische Auswertung ergab, daß durch die topische
Applikation von Cilomilast-Lösung (3%) und Applikation von Takrolimus (systemisch
und topisch) die Expression der aktiven Form der MMP-9 schwach signifikant bzw.
signifikant gehemmt wurde. Im 2. Hauptversuch wurde die aktive MMP-9-Form nur
durch topisch applizierte Cilomilast-Lösung (5%), jedoch nicht durch Applikation von
Takrolimus (systemisch und topisch) schwach signifikant gehemmt (Abb. 14-4).
59
90
80
Grauwertdichte
70
60
50
40
30
i.p.
p.o.
topisch
20
10
0
Vehikel
Rapamycin
Takrolimus
Cilomilast
Abbildung 12-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele der
Vorversuche; keine Hemmung der MMP-9-Aktivität durch Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus;
Einzelwerte siehe Anhangstabelle 7-9; n=6
**
*
60
Grauwertdichte
50
40
30
20
10
0
Vehikel
Cilomilast
Takrolimus
Abbildung 13-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele des
1. Hauptversuchs; signifikante bzw. schwach signifikante Hemmung der aktiven MMP-9 Form durch
Takrolimus und Cilomilast; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 8-9; *p< 0,05; **p< 0,01; n=6
60
*
10
Grauwertdichte
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Vehikel
Cilomilast
Takrolimus
Abbildung 14-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele des
2. Hauptversuchs; schwach signifikante Hemmung der aktiven MMP-9 Form durch 5%ige CilomilastLösung; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 8-9; *p< 0,05; n=6
4.3 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Vorversuche
In den beschriebenen Vorversuchen wurden Rapamycin und Takrolimus
systemisch (i.p. und p.o.) und topisch, Cilomilast nur systemisch verabreicht.
Wie aus Abb. 15-4 ersichtlich, wurde die Ohrschwellung durch die verwendeten
Pharmaka im Vergleich zur Vehikelkontrolle nach 16 Stunden nicht signifikant
gehemmt; dies gilt für sowohl für die systemische als auch die topische Applikation.
Allein Takrolimus führte zu einer tendentiellen Inhibition der Ohrschwellung.
61
180.00
Ohrschwellung [µm]
160.00
140.00
120.00
100.00
80.00
i.p. Appl.
60.00
p.o. Appl.
40.00
top. Appl.
20.00
0.00
Vehikel
Rapamycin
Takrolimus
Cilomilast
Abbildung 15-4: Messung der Ohrschwellung [µm] 16 h nach TDI-Challenge und Behandlung;
keine signifikante Hemmung der Ohrschwellung durch die eingesetzten Pharmaka (Rapamycin
20mg/kg systemisch, 3%ige Lösung topisch; Takrolimus 2,5 mg/kg systemisch, 0,1% ProtopicR;
Cilomilast 20 mg/kg systemisch); Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4-9
4.4 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Hauptversuche
Wie aus der Abb. 16-4 ersichtlich, kommt es nach kombinierter systemischer und
topischer Verabreichung von Takrolimus zu einer hoch signifikanten Inhibition der
TDI-induzierten Ohrschwellung; durch topische Gabe der Cilomilast-Lösung (3%)
wurde die Ohrschwellung nicht signifikant gehemmt. Im 2. Hauptversuch konnte die
Inhibition der Ohrschwellung durch Gabe von Takrolimus reproduziert werden; des
weiteren wird aus Abb. 16-4 ersichtlich, daß Cilomilast topisch als 5%ige Lösung die
Ohrschwellung signifikant hemmt.
62
**
***
180.00
Ohrschwellung [µm]
160.00
**
140.00
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
1. Hauptversuch
20.00
2. Hauptversuch
0.00
Vehikel
Cilomilast
FK 506
Abbildung 16-4: Einfluß von Cilomilast und Takrolimus auf die TDI-induzierte Ohrschwellung;
hoch signifikante bzw. signifikante Inhibition der Ohrschwellung durch Takrolimus im 1. und 2.
Hauptversuch; keine signifikante Hemmung der Ohrschwellung durch 3% Cilomilast-Lösung im 1.
Hauptversuch; signifikante Hemmung der Ohrschwellung durch 5% Cilomilast-Lösung im
2. Hauptversuch; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5-9; **p< 0,01; ***p< 0,001; 1. Hauptversuch n=8,
2. Hauptversuch n=6
4.5 Ergebnisse des Local-Lymphnode-Assays der In-vivo-Hauptversuche
Abb. 17-4 zeigt die Lymphknotengewichte der TDI-sensibilisierten Tiere nach
Cilomilast bzw. Takrolimus Behandlung im Vergleich zur Vehikelkontrolle. In diesem
Versuchsansatz wurde das Gewicht beider Lnn. auriculares bestimmt, da beide
Ohren behandelt wurden; allein Takrolimus führte zu einem hoch signifikant
niedrigerem
Lymphknotengewicht
im
Vergleich
zur
Vehikelkontrolle.
Im
2.
Hauptversuch wurde die Kontaktallergie am Ohr nur einer Körperhälfte provoziert,
daher wurde für den LLNA nur der regionale Lymphknoten des behandelten Ohres
einer Körperhälfte untersucht. Im Vergleich zur Vehikelkontrolle waren die
Lymphknoten mit Takrolimus behandelter Tiere signifikant, die von Cilomilast
behandelten Tieren schwach signifikant leichter.
63
Lymphknotengewicht [mg]
***
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
Vehikel
Cilomilast
Takrolimus
Abbildung 17-4: Gewichte der Lnn. auriculares TDI-sensibilisierter Tiere, 1. Hauptversuch; hoch
signifikant niedrigeres Gewicht bei Takrolimus behandelten Tieren (topisch und systemisch) im
Vergleich zur Vehikelkontrolle; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 6-9; ***p< 0,001; n=8
**
*
Lymphknotengewicht [mg]
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
Vehikel
Cilomilast
Takrolimus
Abbildung 18-4: Gewichte der Lnn. auriculares TDI-sensibilisierter Tiere, 2. Hauptversuch;
signifikant niedrigere Gewichte bei Takrolimus (topisch und systemisch) behandelten Tieren, schwach
signifikant niedrigere Gewichte bei Cilomilast (5%ige Lösung topisch) behandelten Tieren; Einzelwerte
siehe Anhangstabelle 6-9; *p< 0,05; **p< 0,01; n=6
64
4.6 Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die
DC-induzierte T-Lymphozyten-Proliferation in der MLR
4.6.1 Koinkubation von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle konnte durch eine Koinkubation der
MLR mit Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus eine signifikante Hemmung der TZell-Proliferation erzeugt werden (Abbildungen 19-, 20- und 21-4).
4.6.2 Konzentrationsabhängige Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und
Takrolimus
In den Abbildungen 22-, 23- und 24-4 ist die jeweilige KonzentrationsWirkungskurve der benutzten Pharmaka hinsichtlich der Hemmung der T-ZellProliferation
dargestellt:
Cilomilast
hemmte
die
T-Zell-Proliferation
schwach
signifikant ab einer Konzentration von 10 µmol/l, bei Rapamycin und Takrolimus war
die Inhibition der T-Zell-Proliferation bei allen eingesetzten Konzentrationen
signifikant.
4.6.3 Prä-Inkubation von Cilomilast
Der Effekt der Präinkubation von DC und T-Zellen mit Cilomilast ist in den
Abbildungen 25- und 26-4 dargestellt. Der Versuchsansatz mit präinkubierten TZellen zeigte bei jeder eingesetzten DC/T-Zell Ratio eine signifikante Inhibition der
T-Zell Proliferation, wohingegen durch die Präinkubation der DCs eine signifikante
Hemmung erst ab einer DC/T-Zell Ratio von 2500/100.000 auftrat.
65
**
80
Kontrolle
Cilomilast
**
3
H-Thymidin [cpm] x 10
3
70
60
50
**
40
30
20
*
*
10
0
312
625
1250
Anzahl DCs
2500
5000
10000
Abbildung 19-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Cilomilast (10
µmol/l); schwach signifikanter bzw. signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Koinkubation der
MLR mit Cilomilast (10 µmol/l); Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-9a; dieser Versuch wurde zweimal
reproduziert (Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-9b, c); *p< 0,05; **p< 0,01; n=5
50
3
H-Thymidin [cpm] x 10
3
Kontrolle
Rapamycin
40
**
30
20
10
0
312
625
1250
Anzahl DCs
2500
5000
10000
Abbildung 20-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Rapamycin (1
µmol/l); signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Koinkubation der MLR mit Rapamycin;
Einzelwerte s. Tab. 11-9; dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s. Tab. 11-9b, c);
**p< 0,01; n=5
66
A
50
3
H-Thymidin [cpm] x 10
3
Kontrolle
Takrolimus
40
30
**
**
20
10
0
312
625
1250
Anzahl DCs
2500
5000
10000
Abbildung 21-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Takrolimus (100
nmol/l); signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Koinkubation der MLR mit Takrolimus;
Einzelwerte siehe Anhangstabelle 10-9a; dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte
siehe Anhangstabellen 10-9b,c); **p< 0,01; n=5
3
3
H-Thymidin [cpm] x 10
24
20
16
12
8
*
4
0
Kontrolle
10 -3
10 -2
10 -1
Konzentration Cilomilast [µmol/l]
1
10
Abbildung 22-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit unterschiedlichen
Konzentrationen Cilomilast; schwach signifikante Inhibition ab einer Konzentration von 10 µmol/l
Cilomilast (Einzelwerte s. Tab. 12-9a); dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (s. Tabellen 12-9b,
c); *p=0,0317; n=5
67
60
40
30
**
**
20
**
**
3
H-Thymidin [cpm] x 10
3
50
**
10
0
Kontrolle
10 - 4
10 - 3
10 - 2
Konzentration Rapamycin [µmol/l]
10 - 1
1
Abbildung 23-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit unterschiedlichen
Konzentrationen Rapamycin; signifikante Inhibition bei allen Konzentrationen; Einzelwerte s. Tab.
13-9a; dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s. Tabellen 13-9 b, c); **p< 0,01; n=5
80
3
H-Thymidin [cpm] x 10
3
70
60
50
40
30
**
**
20
**
10
**
**
10
10 2
0
Kontrolle
10 - 2
10 - 1
1
Konzentration Takrolimus [nmol/l]
Abbildung 24-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit unterschiedlichen
Konzentrationen Takrolimus; signifikante Inhibition bei allen eingesetzten Konzentrationen
(Einzelwerte s. Tab. 13-9a);dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte siehe Tabellen
13-9b,c); **p<0,01; n=5
68
110
Kontrolle
Cilomilast
90
80
70
60
50
40
30
**
3
H-Thymidin [cpm] x 10
3
100
20
10
**
**
0
312
625
1250
Anzahl DCs
2500
5000
10000
Abbildung 25-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei DC-Prä-Inkubation mit Cilomilast
(10 µmol/l, 1 Stunde); signifikante Inhibition der T-Zell-Proliferation ab einer DC/T-Zell Ratio von
2500/100.000 (Einzelwerte s. Tab. 15-9a); dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s.
Anhangstabellen 15-9b, c); **p< 0,01; n=5
70
3
3
H-Thymidin [cpm] x 10
60
Kontrolle
Cilomilast
50
40
30
**
20
10
0
312
Abbildung 26-4:
625
1250
Anzahl DCs
2500
5000
10000
3
H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei T-Zell-Prä-Inkubation mit
Cilomilast (10 µmol/l, 1 Stunde); signifikante Inhibition der T-Zell-Proliferation bei jeder DC/T-Zell
Ratio (Einzelwerte s. Tab. 16-9a); dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s.
Anhangstabellen 16-9b, c); **p< 0,01; n=5
69
4.7 Ergebnisse der FACS-Analyse
4.7.1 Identifizierung der in vitro generierten dendritischen Zellen
Um zu überprüfen, welchen Gehalt an DCs die in Anlehnung an LUTZ et al.
(1999) generierten Zellen aufweisen, wurde eine FACS-Analyse der Zellen an Tag
10 der Kultivierung durchgeführt. CD11c- und MHC-II-positive Zellen wurden dabei
als DCs identifiziert (s. Abb. 27-4).
MHC II
CD11c
Abbildung 27-4: FACS-Analyse bone-marrow-derived DCs nach 10 tägiger Kultur; gefüllte
Histogramme stellen den Anteil CD11c+ bzw. MHC-II+ DCs, die offenen Histogramme die
Isotypkontrolle dar; der hohe Anteil CD11c+ - und MHC-II+ -Zellen verdeutlicht die Reinheit der
DC-Kultur
70
4.7.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Expression
kostimulatorischer Oberflächenmoleküle in vitro generierter DCs
4.7.2.1 Einfluß auf die CD80-Expression
An Tag 10 der Kultur exprimierent 48,18% der unbehandelten Zellen das CD80Oberflächenmolekül, nach LPS-Stimulation erhöhte sich der Anteil auf 75,46%. Die
mit Cilomilast (10 µmol/l) behandelten und mit LPS stimulierten DCs exprimierten zu
74,78% CD80, bei Rapamycin (1 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l) waren es
88,33% bzw. 70,73% der DCs (s. Abb. 28-4).
LPS
Takrolimus
Kontrolle
Cilomilast
Rapamycin
Abbildung 28-4: Histogramm CD80+ DCs; Darstellung von Kontroll-DCs sowie LPS, Takrolimus,
Cilomilast und Rapamycin behandelter DCs; deutliche Zunahme CD80+ DCs nach LPS-Stimulation,
keine Beeinflussung von CD80 durch Testsubstanzen (Einzelwerte s. Anhangstabelle 17-9)
71
4.7.2.2 Einfluß auf die CD86-Expression
Die Ergebnisse hinsichtlich der Beeinflussung der CD86-Expression sind ähnlich;
auch hier erzeugte LPS eine Heraufregulation von CD86 (71,63% der DCs) im
Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (29,39%). 68,29% der mit Cilomilast
behandelten DCs exprimierten CD86, bei Rapamycin und Takrolimus waren es
82,84% bzw. 58,94% der DCs (s. Abb. 29-4).
Takrolimus
Kontrolle
LPS
Rapamycin
Cilomilast
Abbildung 29-4: Histogramm CD86+ DCs; Darstellung von Kontroll-DCs sowie LPS, Takrolimus,
Cilomilast und Rapamycin behandelter DCs; deutliche Zunahme CD86+ DCs nach LPS-Stimulation,
keine Beeinflussung von CD86 durch Testsubstanzen (Einzelwerte s. Anhangstabelle 17-9)
72
4.8 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPSinduzierte Produktion von TNF-α und IL-12 dendritischer Zellen
Um den Einfluß der Testsubstanzen auf die Zytokinproduktion dendritischer
Zellen von TNF-α und IL-12 zu untersuchen, wurden in vitro generierte DCs an den
Tagen 9 und 10 der Kultivierung mit den Testsubstanzen inkubiert. Eine Stimulation
der DCs mit LPS erfolgte an Tag 10, 30 Minuten vor der Inkubation der
Testsubstanzen. Die Zytokinmessung in den Überständen erfolgte 24 Stunden später
mittels ELISA.
4.8.1 Einfluß auf die TNF-α-Produktion
Wie aus Abb. 30-4 ersichtlich, wurde die Produktion von TNF-α durch Gabe von
LPS signifikant heraufreguliert. Durch Inkubation der DCs mit Cilomilast (10 µmol/l)
und Rapamycin (1 µmol/l) wurde die LPS-induzierte TNF-α-Produktion der DCs
signifikant inhibiert. Takrolimus (100 nmol/l) führte zu keiner signifikanten Hemmung
der TNF-α-Produktion.
4.8.2 Einfluß auf die IL-12-Produktion
Die Produktion von IL-12 seitens der DCs wurde durch LPS signifikant
heraufreguliert. Durch Inkubation der DCs mit Cilomilast (10 µmol/l) und Takrolimus
(100 nmol/l) wurde die LPS-induzierte IL-12-Produktion der DCs signifikant inhibiert.
Der Zusatz von Rapamycin (1 µmol/l) bewirkte keine Inhibition der IL-12-Produktion
(s. Abb. 31-4).
73
**
**
**
1200
TNF-alpha [pg/ml]
1000
800
600
400
200
0
Kontrolle
LPS
Cilomilast
Rapamycin
Takrolimus
Abbildung 30-4: TNF-α-Produktion in vitro generierter DCs nach Stimulation mit LPS;
signifikante Induktion der TNF-α-Produktion nach LPS-Stimulation; signifikante Inhibition der LPSinduzierten TNF-α-Produktion durch Cilomilast (10 µmol/l) und Rapamycin (1 µmol/l); Einzelwerte
siehe Anhangstabelle 18-9; **p < 0,01; n=6
**
**
200
IL-12 [pg/ml]
180
160
**
140
120
100
80
60
40
20
0
Kontrolle
LPS
Cilomilast
Takrolimus
Rapamycin
Abbildung 31-4: IL-12-Produktion in vitro generierter DCs nach Stimulation mit LPS; signifikante
Induktion der IL-12-Produktion nach LPS-Stimulation; signifikante Inhibition der LPS-induzierten IL-12Produktion durch Cilomilast (10 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l); Einzelwerte siehe
Anhangstabelle 19-9; **p < 0,01; n=6
74
5 Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es die, pharmakologische Beeinflussung dendritischer
Zellen zu bestimmen. Als Testsubstanzen kamen die immunmodulatorisch
wirksamen Pharmaka Cilomilast, Takrolimus und Rapamycin zum Einsatz, deren
Wirkung auf dendritische Zellen sowohl in vivo als auch in vitro untersucht werden
sollte. Dabei sollten die In-vitro-Versuche zum besseren Verständnis der In-vivoVersuche beitragen und diese ergänzen.
5.1. Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration
dendritischer Zellen
5.1.1 Nicht-inflammatorisches Modell
Bereits TURNBULL und MACPERSON (2001) beschrieben eine In-vivo-SteadyState-Migration dendritischer Zellen. Die Migrationsergebnisse an unbehandelten
Ohrexplantaten aus den eigenen Untersuchungen sind mit Angaben von ORTNER et
al. (1996) vergleichbar. Die während der Trennung der dorsalen und ventralen
Ohrhälfte einwirkenden Scherkräfte und die damit einhergehende Mikroinflammation
verursachen eine Aktivierung der im Ohrgewebe vorhandenen Immun- und
Entzündungszellen. Dies bewirkt schließlich die Migration von Langerhans-Zellen
und dermalen DCs (ORTNER et al. 1996, RATZINGER et al. (2002), was im nichtinflammatorischen Migrations-Modell untersucht wurde.
Ob es sich bei den migrierten DCs überwiegend um Langerhans-Zellen aus der
Epidermis oder um dermale DCs handelt, ist in der Literatur nicht beschrieben.
Versuche an humanen Haut-Explantaten jedoch zeigen, daß überwiegend
Langerhanszellen und nicht dermale DCs migrieren (RATZINGER et al. 2002).
Durch die topische Applikation des PDE4-Inhibitors Cilomilast (Lösung, 3%) wird
die DC-Migration im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikant gehemmt. Die Gründe
hierfür sind in der Inhibition der aktiven Form der MMP-9 (s. 4.2.1) und der Inhibition
75
der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNF-α (BÄUMER et al. 2003b), welche
die Expression der MMPs regulieren (s. 2.2.2.1), durch Cilomilast zu sehen. Dabei ist
anzunehmen, daß als Quelle der MMP-9 zum einen durch Scherkräfte aktivierte
Keratinozyten (MAKELA et al. 1998), zum anderen Langerhanszellen und dermale
dendritische Zellen in Frage kommen (KOBAYASHI 1997, RATZINGER et al. 2002).
Die Expression und Aktivierung der MMP-9 dieser Zellen wird unter dem Einfluß von
IL-1β und TNF-α heraufreguliert. Als Quelle der proinflammatorischen Zytokine IL-1β
und TNF-α werden Keratinozyten und dendritische Zellen diskutiert (WANG et al.
1997). Somit kommen als Zielzellen zur Vermittlung der Migrationsinhibition durch
Cilomilast dendritische Zellen und Keratinozyten in Betracht, da sie beide PDE4
exprimieren (TENOR et al. 1995, GANTNER et al. 1999, CHUJOR et al. 1998).
Aufgrund der beschriebenen Zusammenhänge wäre es denkbar, daß Cilomilast
bereits an einem frühen Kontrollpunkt der Migration wirkt und durch Hemmung der
PDE4 in aktivierten Keratinozyten (TENOR et al. 1995) deren Zytokinproduktion
(TNF-α und IL-1β) inhibiert, mit der Folge, daß Adhäsionsmoleküle wie E-Cadherin
nicht herunterreguliert und MMPs zur enzymatischen Proteolyse nicht heraufreguliert
werden. Langerhanszellen und dermale DCs würden demnach nicht aktiviert und
blieben an Ort und Stelle. Hinsichtlich der Hemmung der Zytokinproduktion und
Regulation
von
E-Cadherin
und
MMPs
ist
für
DCs
ein
gleichsinniger
Wirkmechanismus für Cilomilast denkbar. Ob jedoch Cilomilast die Expression von
MMP-9 direkt durch eine PDE4-Inhibition hemmt, kann mit den eigenen Assays nicht
ausreichend untersucht werden.
Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen lassen somit darauf schließen, daß
der PDE4-Inhibitor Cilomilast die Migration dendritischer Zellen der Haut bereits
unter nicht-inflammatorischen Bedingungen wirksam beeinflußt.
76
5.1.2 TDI–Kontaktallergiemodell
In diesem Modell sollte unter inflammatorischen Bedingungen der Einfluß der
immunwirksamen Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration
dendritischer Zellen der Haut untersucht werden. Mit diesem Versuchsmodell
verbunden sind zudem der LLNA, der MEST sowie die densitometrische Auswertung
der MMP-9-Aktivität (Zymographie); diese Assays dienen als funktionelle Parameter
einer
erfolgten
DC-Migration
und
anschließend
erfolgter
Induktion
bzw.
Auslösephase der dermalen Kontaktallergie.
In Vorversuchen werden die Testsubstanzen oral und intraperitoneal appliziert,
zudem erfolgt ein Vergleich von Rapamycin und Takrolimus nach topischer
Applikation. Keine der verwendeten Substanzen kann in die durch TDI induzierte
Migration dendritischer Zellen inhibieren. Dies geht einher mit den Ergebnissen
zymographischer Untersuchungen (s. 4.2.2), denn die densitometritische Auswertung
ergibt keine sichtbare Inhibition der MMP-9-Aktivität durch die verwendeten
Pharmaka. Die Ergebnisse des MEST verdeutlichen zudem, daß auch die DC-T-ZellInteraktion nicht wirksam beeinflußt wird, da die allergische Immunreaktion in der
Auslösephase durch den Einsatz der Testsubstanzen nicht verhindert wird und sich
das klinische Bild der Kontaktallergie ungehindert entwickelt. Im Vergleich der
Substanzen ergeben sich jedoch Unterschiede: Während Cilomilast und Rapamycin
hinsichtlich einer Beeinflussung der Ohrschwellung keinen Effekt zeigen, ist bei
Takrolimus ein inhibitorischer Einfluß zu erkennen, wenn auch nur tendentiell.
Vermutlich ist die ausbleibende Wirkung der Pharmaka in den Vorversuchen
durch die pharmakokinetischen Eigenschaften der Testsubstanzen sowie das
Behandlungsschema zu erklären. So ließe sich bei Rapamycin die fehlende Wirkung
durch die schlechten Bioverfügbarkeit nach oraler Aufnahme (15%) erklären. Der
ausgebliebene Effekt von Cilomilast und Takrolimus nach alleiniger systemischer
Verabreichung könnte mit der verwendeten Dosis erklärt werden. Der Einsatz
höherer,
eventuell
wirksamer
Dosierungen
birgt
das
Risiko
der
Arzneimittelunverträglichkeit und wurde nicht durchgeführt. Im Vergleich zum SkinMigration-Assay unter nicht-inflammatorischen Bedingungen zeigen sich im TDIModell
bei
den
unbehandelten
Vehikelkontrollen
77
höhere
Migrationsraten
dendritischer Zellen. Dies bestätigt, daß die DC-Migration unter inflammatorischen
Bedingungen heraufreguliert wird (KOBAYASHI 1997).
In Hauptversuchen wurden Cilomilast und Takrolimus verwendet. Da Rapamycin
in den im TDI-Modell eingesetzten Dosierungen unabhängig von der Applikationsart
(per os, topisch, intraperitoneal) – anders als im TNCB-Modell beschrieben
(SALERNO et al. 1998) – keinen wirksamen Effekt zeigte, wurde es nicht weiter mit
einbezogen.
5.1.3.1 Einfluß von MIP-3β auf die DC-Migration
KELLERMANN et al. (1999) postulieren einen chemotaktischen Effekt von MIP-3β
während der Migration auf dendritische Zellen. Dies kann durch die eigenen
Untersuchungen
bestätigt
werden:
Vergleicht
man
die
Migrationsraten
der
Vehikelkontrollen, so fällt auf, daß diese in den Hauptversuchen höher ausfielen als
in den Vorversuchen. Vermutlich ist dieser Effekt in den Hauptversuchen auf den
Zusatz von MIP-3β zur Organkultur zurückzuführen.
5.1.3.2 Cilomilast
Die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays, der Zymographie, MEST sowie LLNA
des 2. Hauptversuches geben Hinweise auf den
Effektormechanismus von
Cilomilast im TDI-Modell. Vermutlich beeinflußt Cilomilast die Funktion von
Keratinozyten, DCs und T-Zellen. Die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays lassen
den Schluß zu, daß die Funktion der DCs durch Cilomilast an einem frühen Punkt
der Challenge-Phase beeinflußt wird. Überträgt man die ex vivo gezeigte Inhibition
der DC-Migration auf In-vivo-Verhältnisse, wird durch die ausbleibende DC-Migration
(s. Abb. 6-4) in den regionalen Lymphknoten eine Aktivierung der haptenspezifischen
T-Zellen und somit der allergischen Reaktion verhindert. Des weiteren wird
vermutlich die Funktion von T-Lymphozyten, insbesondere die der CLA+ TGedächtniszellen in der Haut, durch Cilomilast moduliert. Diese Zellen können ohne
DC-Kostimulation durch frei diffundierende Antigene aktiviert werden und tragen
78
somit zur allergischen Reaktion bei (KRASTEVA et al. 1999a, PIOR et al. 1999). Es
ist daher möglich, daß diese Zellen durch topisch aufgetragenes Cilomilast in ihrer
Funktion beeinträchtigt werden. Zudem lassen die In-vitro-Ergebnisse der MLR (PräInkubation der T-Zellen, s. Abb. 26-4) einen direkten Einfluß von Cilomilast auf TZellen erkennen. Den hemmenden Einfluß von Cilomilast auf die Produktion des
Th2-Zytokins IL-4 sowie die Hemmung von IL-6 aus aktivierten Keratinozyten
beschreiben bereits BÄUMER et al. (2003a) und runden somit das Bild des
pleiotropen anti-inflammatorischen Effekts von Cilomilast ab.
Im Vergleich zum 1. Hauptversuch müssen jedoch zwei Dinge berücksichtigt
werden, welche die hier lediglich tendentiell zu erkennende Inhibition der
Ohrschwellung durch Cilomilast erklären. Zum einen ist die verwendete CilomilastKonzentration im 2. Hauptversuch höher, zum anderen wurden für den 2.
Hauptversuch
naive
Versuchstiere
sensibilisiert.
Die
Versuchstiere
des
1.
Hauptversuchs dagegen sind aus vorherigen Versuchen bereits TDI-sensibilisiert
bzw. geboostert und wurden für die Durchführung des 2. Hauptversuchs erneut
sensibilisiert. Die Ergebnisse des MEST, des Skin-Migration-Assays, des LLNA
sowie der Zymographie verdeutlichen den nur geringen Effekt von Cilomilast im 1.
Hauptversuch auf die Funktion der DCs. Dies läßt sich einerseits sicherlich durch die
geringere Cilomilast-Konzentration erklären, andererseits ist der Immunstatus der
Versuchstiere zu berücksichtigen. Da die Versuchstiere des 1. Hauptversuchs bereits
in anderen TDI-Versuchen standen, erhöht sich für diese Tiere somit die Zeitdauer
der Allergenexposition, verbunden mit einer zunehmenden Immunantwort –
insbesondere der haptenspezifischen T-Zellen – während der Auslösephase. Es läßt
sich die Hypothese aufstellen, daß T-Gedächtniszellen in der Haut nicht ausreichend
supprimiert werden. Dies könnte den nur schwachen Effekt von Cilomilast im 1.
Hauptversuch erklären.
5.1.3.3 Takrolimus
Vergleicht man die Effekte von Takrolimus und Cilomilast im MEST, SkinMigration-Assays, LLNA sowie in der Zymographie, so ergeben sich hieraus im
Vergleich zu Cilomilast andere Erklärungsansätze für die Wirkung von Takrolimus im
79
TDI-Modell. So erfolgt durch die Applikation von Takrolimus keine Beeinflussung des
Migrationsverhaltens der dendritischen Zellen (s. Abb. 5-4 und 6-4). Es ist zu folgern,
daß durch die Applikation von Takrolimus auch die In-vivo-Migration nicht beeinflußt
wird. Takrolimus inhibiert jedoch wirkungsvoll die Auslösung der Kontaktallergie. Da
trotz erfolgter Migration dendritischer Zellen in den regionalen Lymphknoten dort kein
Proliferationsprozeß von T-Lymphozyten stattfindet (s. Abb. 17-4), ist davon
auszugehen, daß als primäre Zielzelle für Takrolimus T-Lymphozyten in Frage
kommen. Die Ergebnisse der FACS-Analyse (s. 4.7.2) untermauern diese
Hypothese, da die CD80- und CD86-Expression auf DCs durch Takrolimus nur
marginal beeinflußt wird. Die hemmende Wirkung von Takrolimus auf die
Proliferation von T-Zellen geht einher mit den MLR-Ergebnissen der eigenen
Untersuchungen
(s.
4.6.2).
Die
durch
Takrolimus
hervorgerufene
Proliferationshemmung von T-Lymphozyten im regionalen Lymphknoten entspricht
Angaben von SALERNO et al. (1998) sowie von HOMEY et al. (1998) für das TNCBbzw. Oxazolon-Modell. Weiterhin zeigen sich zwischen Cilomilast und Takrolimus
Unterschiede bezüglich der Wirkstärke; im Gegensatz zu Cilomilast bewirkt
Takrolimus auch bei den länger sensibilisierten Versuchstieren eine wirkungsvolle
Inhibition der Kontaktallergie, wie aus den Ergebnissen des MEST und LLNA
ersichtlich. Zudem zeigt Takrolimus im MEST und LLNA im Vergleich zu Cilomilast
eine stärkere inhibitorische Wirkung.
Abschließend betrachtet lassen die Resultate der eigenen Untersuchungen den
Schluß zu, daß mit dem PDE4-Inhibitor Cilomilast und dem Calcineurin-Inhibitor
Takrolimus
zwei
wirksame
Pharmaka
Kontaktallergie zur Verfügung stehen.
80
zur
Prävention
der
Th2-mediierten
5.2 Densitometrische Zymographieauswertung
5.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell
In Verbindung mit den Ergebnissen der Migrationsinhibition durch Cilomilast
unterstreicht das Ergebnis der densitometrischen Erfassung der MMP-9-Aktivität die
Bedeutung dieses Enzyms hinsichtlich der Migration dendritischer Zellen, die
KOBAYASHI et al. (1997) und RATZINGER et al. (2002) postulieren, da die
Hemmung der DC-Migration mit der Inhibition der aktiven Form der MMP-9 korreliert.
Ebenso wird durch dieses Ergebnis der Einfluß von PDE4-Inhibitoren auf die MMP-9Aktivität, den bereits BELLEGUIC et al. (2000) und CORBEL et al. (2002) für den
PDE4-Inhibitor Rolipram beschreiben, bestätigt. Dort werden unter den gegebenen
Versuchsbedingungen influierende neutrophile Granulozyten als Hauptquelle der
MMP-9 diskutiert. In eigenen Untersuchungen an isolierten Ohrexplantaten können
diese Zellen als Quelle der MMP-9 ausgeschlossen werden. Es ist anzunehmen, daß
die Aktivierung der MMP-9 durch die Trennung der Ohrhälften post mortem induziert
wird, da die hier einwirkenden Scherkräfte eine Aktivierung der (Entzündungs-)
Zellen mit nachfolgender MMP-9-Alteration und Migrations-Induktion bewirken. Es ist
jedoch auch möglich, daß die ermittelten Migrationsergebnisse lediglich die SteadyState-Verhältnisse der kontinuierlich erfolgten Migration darstellen. Als Hauptquelle
der MMP-9-Sekretion kommen Keratinozyten, Langerhanszellen und dermale DCs in
Frage.
Die Ergebnisse der Untersuchungen lassen den Schluß zu, daß eine Aktivierung
der MMP-9 mit anschließender DC-Migration auch unter nicht-inflammatorischen
Bedingungen (steady-state) erfolgt. Diese wird durch topische Applikation von
Cilomilast inhibiert.
81
5.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell
In Vorversuchen zeigen die eingesetzten Pharmaka keine Modulation der MMP9-Aktivität, was durch die Ergebnisse des Skin-Migration-Assays gestützt wird, da
sich hier ebenfalls keine Beeinflussung der DC-Migration zeigt. Die Gründe der
Wirkungslosigkeit der Testsubstanzen in den Vorversuchen wurde bereits unter 5.1.3
diskutiert.
Hinsichtlich der MMP-9 Beeinflussung sind für Takrolimus Unterschiede sichtbar:
Im Gegensatz zum 2. Hauptversuch wird die Expression der aktiven MMP-9-Form im
1. Hauptversuch signifikant gehemmt. Dieses Ergebnis korreliert jedoch nicht mit
einer Beeinflussung der DC-Migration. Als zelluläre MMP-9-Quelle kommen hier
wahrscheinlich Keratinozyten, neutrophile Granulozyten und T-Lymphozyten in
Frage. Aufgrund des bereits diskutierten unterschiedlichen Immunstatus der
Versuchstiere könnte es in diesen Zellen zu einer Heraufregulation der MMP-9Aktivität gekommen sein, die wiederum durch Takrolimus gehemmt wird. Es ist
denkbar, daß dieser Effekt durch eine Reduktion pro-inflammatorischer Zytokine
durch Takrolimus – allen voran TNF-α als Hauptregulator der MMP-9-Expression –
zu erklären ist. Cilomilast hingegen moduliert in beiden Hauptversuchen die MMP-9Aktivität. So wird durch topische Applikation von Cilomilast-Lösungen eine sichtbare
Hemmung der MMP-9-Aktivität erreicht. Dies korreliert mit den Ergebnissen des
Skin-Migration-Assays,
in
denen
durch
eine
3%ige
Cilomilast-Lösung
eine
tendenzielle, durch eine 5%ige Lösung eine signifikante Migrationsinhibition
hervorgerufen wird.
Durch die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays und der Zymographie bestätigt
sich die funktionelle Bedeutung der MMP-9 für der DC-Migration.
5.3 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im MEST
Die verwendeten Pharmaka erzielen in den Vorversuchen keine signifikante
Reduktion
der
TDI-induzierten
inflammatorischen
Takrolimus zeigt eine tendentielle Inhibition.
82
Ohrschwellung.
Lediglich
Die Inhibition der Ohrschwellung in den Hauptversuchen durch Cilomilast kann
erklärt werden durch die Reduktion der DC-Migration und nachfolgend verminderter
Stimulation von T-Zellen im regionalen Lymphknoten. Auch hier ist die stärkere
Wirkung von Cilomilast in dem bereits unter 5.1.3.2. diskutierten unterschiedlichen
Immunstatus zu suchen. Dagegen ist der inhibitorische Effekt von Takrolimus auf die
gemessene Ohrschwellung nicht auf eine verminderte DC-Migration, sondern auf
den proliferationssupressiven Effekt auf haptenspezifische T-Zellen zurückzuführen.
5.4 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im LLNA
Die im Vergleich zur Kontrolle niedrigeren Lymphknotengewichte der behandelten
Tiere lassen darauf schließen, daß durch eine Behandlung die DC-induzierte TLymphozyten-Proliferation inhibiert wurde. Takrolimus zeigt dabei im 1. und 2.
Hauptversuch
einen
proliferationshemmenden
Effekt,
was
sich
im
Lymphknotengewicht widerspiegelt. Zusammen mit den Migrations-, Zymographieund
MEST-Ergebnissen
zeigt
sich
hier,
daß
Takrolimus
die
allergische
Kontaktdermatitis über Beeinflussung der T-Zell-Funktion wirkungsvoll inhibiert. Der
in dieser Arbeit im TDI-Modell durch Takrolimus gezeigte proliferationshemmende
Effekt auf Lymphknotenzellen entspricht der von SALERNO et al. (1998) und
HOMEY et al. (1998) beschriebenen Takrolimuswirkung im TNCB- bzw. OxazolonModell
Die durch Cilomilast (Lösung, 3%) im 1. Hauptversuch nicht wirksam inhibierte TZell-Proliferation des Lymphknotens erklärt die Ergebnisse des MEST. Es ist
anzunehmen, daß DCs der Haut in ihrem Migrationsverhalten nicht beeinflußt
werden und im regionalen Lymphknoten nach Antigenpräsentation die allergische
Reaktion in Form der Ohrschwellung induzieren. Erst mit einer 5%igen CilomilastLösung zeigen sich proliferationssuppressive Effekte im regionalen Lymphknoten, da
hierdurch vermutlich auch die Migration der DCs in den regionalen Lymphknoten
unterbunden wurde.
83
5.5 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus in der MLR
Die proliferationssupressiven Effekte von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus
bei der Koinkubation entsprechen den Ergebnissen von BARNETTE et al. (1998),
HACKSTEIN et al. (2003) und SZABO et al. (2001). Die mit steigender DC/T-ZellRatio zunehmende Zellproliferation der Responderzellen läßt die Bedeutung der DCs
für
die
T-Zellstimulation
proliferationshemmende
erkennen.
Effekt
von
Es
ist
Rapamycin
anzunehmen,
und
Takrolimus
daß
der
über
die
Beeinflussung des Zellzyklus der T-Zellen abläuft, wie bereits in 2.4 beschrieben.
Die Ergebnisse aus den Prä-Inkubations-Versuche (s. 4.6.4) mit Cilomilast lassen
den Schluß zu, daß der proliferationshemmende Effekt in der MLR über eine
Beeinflussung der DCs und T-Zellen vermittelt wird. Ein Vergleich der DC- und TZell-Prä-Inkubation zeigt jedoch, daß eine Prä-Inkubation der T-Zellen mit Cilomilast
einen stärkeren proliferationshemmenden Effekt zur Folge hat. Für Cilomilast ist also
davon auszugehen, daß die Interaktion zwischen DCs und T-Zellen durch Hemmung
der PDE4 in DCs und T-Zellen bidirektional beeinflußt wird. Die Wirkung der DC-PräInkubation mit Cilomilast läßt sich wahrscheinlich durch eine Modulation der
kostimulatorischen und antigenpräsentierenden Oberflächenmoleküle CD80, CD86,
MHC-I und MHC-II erklären und würde die für Rolipram gezeigten Ergebnisse
bestätigen (BIELOVKA et el. 2000). Der direkte Effekt auf T-Lymphozyten durch PräInkubation mit Cilomilast bestätigt auch die Ergebnisse von HATZELMANN und
SCHUDT
(2000),
die
an
anti-CD3
stimulierten
T-Zellen
einen
proliferationshemmenden und IL-2 hemmenden Effekt von Cilomilast zeigen. Für den
PDE4-Inhibitor Cilomilast kann also eine Beeinflussung sowohl von DCs als auch
von T-Zellen durch Hemmung der PDE4 gezeigt werden.
In MLR-Versuchen zur Konzentrationsabhängigkeit ist bei Cilomilast eine
fortschreitendende Abnahme und eine schwach signifikante Inhibition erst in der
höchsten (und klinisch unrelevanten) Konzentration (10 µmol/l) zu erkennen,
während Rapamycin und Takrolimus bereits in der jeweils niedrigsten (und klinisch
relevanten) Konzentration die T-Zell-Proliferation signifikant inhibierten. Höhere
Konzentrationen zeigen keinen stärkeren supressiven Effekt.
84
Festzuhalten bleibt, daß die T-Zell-Proliferationshemmung durch Cilomilast,
Rapamycin und Takrolimus bislang nur für eine allogene MLR gilt; wollte man das
TDI-Kontaktallergiemodell durch In-vitro-Versuche in der MLR simulieren, so müßte
eine homologe MLR mit TDI-„gepulsten“-DCs durchgeführt werden. Die hier
durchgeführte allogene MLR fungiert letztlich als „dirty tool“ und soll grundsätzlich die
Funktion der DCs auf die Initiierung einer T-Zellantwort (Zellproliferation) und die
generellen supressiven Effekte der Testsubstanzen zeigen.
5.6 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die
Expression von CD80 und CD86
Die Heraufregulation der kostimulatorischen Oberflächenmoleküle CD80 und
CD86 auf dendritischen Zellen nach Stimulation mit LPS wurde bereits von HERTZ
et al. (2001) und SCHWARZ et al. (2003) gezeigt. Eine Heraufregulation dieser
Oberflächenmoleküle gilt als Kriterium einer stattgefundenen DC-Maturation, die mit
Antigenpräsentation, Zytokinsekretion und T-Zellstimulation durch DCs einhergeht.
Vermittelt wird diese Modulation der Oberflächenmoleküle durch toll-like-receptors
(TLR), die auf Zellen des angeborenen Immunsystems als Rezeptoren für Antigene
mikrobieller und viraler Herkunft fungieren (pattern recognition receptors). Als
Rezeptoren für LPS und Promotoren der DC-Maturation sind TLR-2 und TLR-4 auf
DCs beschrieben (HOSHINO et al. 1999, HERTZ et al. 2001). Nach Aktivierung des
TLR wird eine (der IL-1-Rezeptor ähnliche) Signaltransduktion in Gang gesetzt, die
letztlich über die Aktivierung der im Zellkern lokalisierten Transkriptionsfaktoren NFκB und c-Jun die Zelle in einen proinflammatorischen Funktionszustand versetzt. Die
Produktion proinflammatorischer Zytokine und eine Modulation stimulatorischer und
antigenpräsentierender Oberflächenmoleküle werden dabei induziert (ADEREM und
ULEVITCH 2000, SCHWARZ et al. 2003).
Eine Beeinflussung der Expression von CD80 und CD86 durch Cilomilast,
Rapamycin und Takrolimus, wie es BIELOVKA et al. (2000), WOLTMANN et al.
(2001)
und
MATSUE
et
al.
(2002)
beschreiben,
kann
in
den
eigenen
Untersuchungen nicht gezeigt werden. Lediglich Takrolimus zeigt einen mäßigen
85
Effekt auf die CD86 Expression. Da die verwendeten Konzentrationen denen der in
der MLR verwendeten entsprechen, ist davon auszugehen, daß T-Lymphozyten
während der DC/T-Zellinteraktion das primäre Ziel der Pharmaka sind. Ob sich
hieraus ein Effekt auf die Interaktion unter In-vivo-Bedingungen ableiten läßt, müssen
nachfolgende Untersuchungen zeigen.
5.7 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPSinduzierte Produktion von TNF-α und IL-12 dendritischer Zellen
5.7.1 Einfluß auf TNF-α
Durch Inkubation der Zellkultur mit Cilomilast (10 µmol/l) und Rapamycin (1µmol/l)
kann die LPS-induzierte Produktion von TNF-α signifikant gehemmt werden. Der
Zusatz von Takrolimus (100 nmo/l) zeigt keinen inhibitorischen Effekt. Dies bestätigt
die Ergebnisse von HATZELMANN und SCHUDT (2000), WOLTMAN et al. (2000)
und HACKSTEIN et al. (2003).
Als frühes Signal einer Entzündung spielt TNF-α eine Rolle bei der Aktivierung
und Maturation dendritischer Zellen mit nachfolgender Initiierung der Immunantwort
(BANCHEREAU und STEINMAN 2000) sowie bei der Regulation und Aktivierung der
MMP-9. Es ist dabei anzunehmen, daß die Inhibition der TLR-vermittelten TNF-αProduktion im Falle von Cilomilast durch eine direkte Beeinflussung der PDE4 in den
dendritischen Zellen vermittelt wird. Die hier in vitro gezeigte Hemmung der TNF-αProduktion von DCs unterstreicht die durch Cilomilast demonstrierten antiinflammatorischen Effekte in den In-vivo-Versuchen.
5.7.1 Einfluß auf IL-12
In eigenen Untersuchungen kann ein inhibitorischer Effekt von Cilomilast und
Takrolimus auf die LPS-induzierte IL-12-Produktion von DCs gezeigt werden.
86
Rapamycin zeigte dagegen keinen Effekt. Dies bestätigt die Ergebnisse von BILLAH
et al. (2002), TIEFENTHALER et al. (2004) und CHIANG et al. (2004).
Die Funktion des IL-12 besteht Vermittlung einer Th1-mediierten Immunantwort;
so werden natürliche Killerzellen durch IL-12 aktiviert und naive T-Zellen im
Lymphknoten durch IL-12 sezernierende DCs so geprimt, daß sie sich im weiteren
Verlauf zu CD8+ T-Zellen differenzieren (CARTER und DUTTON 1996). Es ist
denkbar, daß die hier gezeigte IL-12-Inhibition durch Cilomilast und Takrolimus durch
eine Beeinflussung der PDE4 bzw. des FKBP-12 vermittelt wird.
Das hier gezeigte Ergebnis verdeutlicht, daß Cilomilast und Takrolimus sowohl in
Th1- als auch Th2-vermittelten Kontaktallergiemodellen wirksam sind (SALERNO et
al. 1998, EHINGER et al. 2000) und die Funktion dendritischer Zellen direkt
beeinflussen.
87
6 Zusammenfassung
Boris Sülzle
Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung dendritischer Zellen
In der vorliegenden Arbeit ist die pharmakologische Beeinflussung dendritischer
Zellen in In-vivo- und In-vitro-Modellen untersucht worden. Als Testsubstanzen
wurden der PDE4-Inhibitor Cilomilast sowie die Immunsuppressiva Rapamycin und
Takrolimus verwendet.
In vivo wurde die Wirkung der Pharmaka im TDI-Kontaktallergiemodell an
BALB/c-Mäusen untersucht. Als funktionelle Parameter wurden die Ohrschwellung
(Mouse-Ear-Swelling-Test, MEST) und post mortem die DC-Migration (SkinMigration-Assay) sowie die DC-induzierte T-Zell-Proliferation, gemessen am Gewicht
des
regionalen
Weiterhin
Lymphknotens
erfolgte
post
mortem
(Local-Lymphnode-Assay,
die
Untersuchung
der
LLNA),
verwendet.
MMP-9-Aktivität
in
Ohrexplantaten der Tiere mit Hilfe der Zymographie.
Die Ergebnisse der In-vivo-Untersuchungen verdeutlichen die Funktion der DCs
bei der Initiierung einer adaptiv-zellvermittelten Immunantwort. Im TDI-Modell konnte
für Rapamycin, unabhängig von der Applikationsart, keine Wirkung zur Inhibition der
Kontaktallergie
gezeigt
werden.
Durch
Cilomilast
(topisch)
und
Takrolimus
(systemisch und topisch) konnte die Induktion der Kontaktallergie dagegen verhindert
werden, wie signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe im MEST,
Skin-Migration-Assay, Zymographie und LLNA dies belegen. Für Cilomilast ist ein
direkter Einfluß auf DCs zu erkennen (Migrationshemmung), während dies bei
Takrolimus nicht der Fall ist. Hier ist als Effektormechanismus zur Inhibition der
Kontaktallergie eine direkte Wirkung auf T-Lymphozyten bzw. die Interaktion
zwischen DCs und T-Zellen in Betracht zu ziehen.
Für die In-vitro-Untersuchungen wurden dendritische Zellen aus murinem
Knochenmark gewonnen. Untersucht wurde die T-Zell-Allostimulationsfähigkeit
dendritischer Zellen und deren Suppression durch Cilomilast, Rapamycin und
88
Takrolimus in der Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR); dabei ergab sich eine
signifikante
Suppression
der
T-Zell-Proliferation
durch
den
Einsatz
der
Testsubstanzen, die auch in unterschiedlichen Konzentrationen in der MLR getestet
wurden. Hierbei zeigte Cilomilast lediglich in der höchsten Konzentration (10 µmol/l)
eine schwach signifikante Hemmung, während Rapamycin (10-4 µmol/l - 1 µmol/l)
und Takrolimus (10-2 nmol/l – 100 nmol/l) in allen verwendeten Konzentrationen die
DC-induzierte T-Zell-Proliferation inhibierten. Zusätzlich wurden in der MLR DCs und
T-Zellen
mit
Cilomilast
prä-inkubiert,
um
Unterschiede
hinsichtlich
des
Effektormechanismus von Cilomilast abzuleiten. In diesen Ansätzen zeigte sich ein
direkter Einfluß von Cilomilast auf DCs und T-Zellen.
In FACS-Analysen wurde schließlich der Einfluß der Testsubstanzen auf die LPSinduzierte Heraufregulation der kostimulatorischen Oberflächenmoleküle CD80 und
CD86 untersucht. Es zeigte sich jedoch bis auf einen schwachen Einfluß von
Takrolimus
auf
die
CD86
Regulation
keine
Modulation
der
untersuchten
Oberflächenmoleküle durch den Einsatz der Testsubstanzen.
Weiterhin erfolgten Messungen der Zytokine TNF-α und IL-12 nach LPSStimulation der DCs mittels ELISA. Dabei konnte die LPS-induzierte Produktion von
TNF-α durch Cilomilast und Rapamycin signifikant gehemmt werden; Takrolimus
zeigte hier keinen Effekt. Die LPS-induzierte IL-12-Produktion der DCs wurde
dagegen durch Takrolimus und Cilomilast signifikant gehemmt; Rapamycin zeigte
hier keinen Effekt.
Abschließend läßt sich sagen, daß sich Cilomilast und Takrolimus durch
Beeinflussung der Funktion dendritischer Zellen und T-Zellen in den durchgeführten
Untersuchungen zur Prävention einer dermalen Kontaktallergie bei Mäusen wirksam
erwiesen.
89
7 Summary
Boris Sülzle
Studies on pharmacological influence on dendritic cells
In the presented study pharmacological influence on dendritic cells was examined
using in vivo and in vitro models. Test substances were the PDE4-inhibitor cilomilast,
and the immunosuppressive compounds rapamycin and tacrolimus.
In vivo efficacy of the adopted pharmaca was analysed in TDI-induced contact
allergy in mice (balb/c). Allergen induced ear-swelling were used as functional
parameter (Mouse-Ear-Swelling-Test, MEST). Additionally, post mortem DCmigration (Skin-Migration-Assay) as well as DC-induced T cell proliferation, as
measured by lymphnode weights (Local-Lymphnode-Assay, LLNA). Furthermore,
MMP-9 activity was determined in mouse ear explants by zymography.
The results of the in vivo studies point up the role of dendritic cells in initiating
adaptive cell-mediated immunity. Adopted pharmaceuticals in the TDI-model showed
differences regarding the efficacy and its intervention. Rapamycin did not impair the
induction of contact allergy, independent of any administration route, while
application of cilomilast (topical) and tacrolimus (systemical and topical) inhibited the
induction of contact allergy. This is clarified by significant differences in MEST, SkinMigration-Assay and LLNA by comparison to control groups. In term to effect
mechanism differences between cilomilast and tacrolimus became apparent. In
contrast to tacrolimus, a direct influence on dendritic cells by cilomilast (inhibition of
migration) is evident. For tacrolimus, a direct influence on T cell function respectively
DC/T cell interaction is contemplable for inhibition of contact allergy.
For in vitro studies murine bone marrow-derived dendritic cells were used. DCs T
cell allostimulatory capacity and its suppression by cilomilast, rapamycin and
tacrolimus was tested in the Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR). MLR performed with
different drug concentrations indicated differences among the used test substances.
Only in highest exerted concentration cilomilast (10 µmol/l) inhibited T cell
90
proliferation weak but significantly, while rapamycin (10-4 µmol/l - 1 µmol/l) and
tacrolimus (10-2 nmol/l – 100 nmol/l) did so in all tested concentrations. A direct
influence on the function of DCs as well as T cells by cilomilast was found by preincubation of DCs and T cells with cilomilast.
Test substances influence` on LPS upregulated costimulatory surface molecules
(CD80, CD86) on DCs was examined by FACS analyses. There was no alteration of
surface molecule expression by adopted pharmaceuticals except weak CD86
alteration by tacrolimus.
At last ELISA measurements of TNF-α und IL-12 in supernatants of LPS
stimulated DCs were performed beyond. Thereby cilomilast and rapamycin but not
tacrolimus inhibited significantly LPS induced TNF-α production. IL-12 production of
LPS stimulated DCs was significantly inhibited by cilomilast and tacrolimus,
rapamycin did not influence IL-12 production.
In conclusion, cilomilast and tacrolimus are effective in prevention of dermal
contact allergy in mice by influencing dendritic cell respectively T cell function.
91
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116
9 Anhang
9.1 Anhangstabellen
Tab. 1-9: Zahl ausgewanderter DCs der Haut/mg Ohrgewebe nach topischer Applikation von
Cilomilast-Lösung (3%) im nicht-inflammatorischen Modell. Einzelwerte von 6 Mausohren.
Versuch 1
Versuch 2
Versuch 3
Versuch 4
Kontrolle
Cilomilast
Kontrolle
Cilomilast
Kontrolle
Cilomilast
Kontrolle
Cilomilast
460.53
212.05
252.98
25.00
181.69
241.48
28.41
18.75
24.67
27.57
12.25
0.00
399.19
875.00
196.76
134.77
355.60
289.47
65.48
51.81
20.83
85.53
37.50
123.75
444.67
408.81
616.58
441.18
112.66
265.15
68.60
134.20
55.65
45.94
94.74
64.84
658.01
946.97
511.01
304.69
770.23
n.b.
103.49
0.00
22.96
23.34
38.40
110.29
Tab. 2-9: Zahl ausgewanderter DCs der Haut/mg Ohrgewebe nach intraperitonealer, oraler und
topischer
Gabe
von
Takrolimus,
Rapamycin
und
Cilomilast
im
TDI-Kontaktallergiemodell
(Vorversuche). Einzelwerte von 6 Mausohren.
Applikation
Applikation
Applikation
intraperitoneale
topische
orale
Vehikel
Takrolimus Rapamycin Cilomilast
179.64
282.17
87.96
426.54
98.03
816.87
349.81
304.69
1164.6
315.13
296.68
794.12
0
139.02
225
0
60.06
73.83
219.1
274.39
85.23
72.12
532.02
384.62
323.86
700.81
197.36
162.65
213.75
85.22
347.94
1028.95
700.39
496.4
590.75
1398.65
342.46
268.86
177.63
82.27
222.27
114.89
199.81
894.92
832.76
1153.5
923.51
1002.02
186.76
424.4
466.46
n.b.
111.43
67.34
127.04
n.b.
160.27
74.7
723.65
n.b.
507.02
0
572.52
n.b.
350.27
0
206.35
n.b.
190.55
420.4
219.83
n.b.
117
Tab. 3-9: Zahl ausgewanderter DCs der Haut/mg Ohrgewebe nach Gabe von Cilomilast und
Takrolimus im 1. und 2. Migrations-Hauptversuch des TDI-Kontaktallergiemodells. Einzelwerte von 8
(1. Hauptversuch) bzw. 6 Mausohren (2. Hauptversuch).
1. Hauptversuch
2. Hauptversuch
Vehikel
Cilomilast
Takrolimus
Vehikel
Cilomilast
Takrolimus
425.10
628.21
1177.13
456.52
745.90
137.55
413.92
249.01
249.43
898.76
169.46
52.84
60.44
234.38
298.89
225.00
685.93
945.65
914.72
49.07
149.29
831.25
185.84
335.35
1110.48
1241.38
1205.06
1550.63
1607.14
1188.38
146.51
96.88
125.00
125.46
38.46
223.40
1708.12
1651.98
1552.78
1298.08
2100.00
1703.23
Tab. 4-9: Zunahme der Ohrschwellung [µm] 16 Stunden nach TDI-Challenge und Behandlung (i.p.,
oral und topisch) mit Takrolimus, Rapamycin und Cilomilast. Einzelwerte von 6 Mausohren aus
Vorversuchen im TDI-Kontaktallergiemodell.
Applikation
Applikation
Applikation
intraperitoneale
topische
orale
Vehikel
0
0
90
150
30
20
80
80
90
40
90
120
80
60
50
50
0
0
Takrolimus Rapamycin Cilomilast
60
40
10
40
20
20
-10
0
40
-10
70
100
-20
30
20
-20
-10
40
118
20
30
100
70
50
80
40
120
110
100
140
40
20
20
20
40
60
20
100
80
110
70
50
40
150
140
90
70
190
90
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
Tab. 5-9: Zunahme der Ohrschwellung [µm] 16 Stunden nach TDI-Challenge und Behandlung der
Tiere mit Cilomilast und Takrolimus im 1. und 2. Hauptversuch des TDI-Kontaktallergiemodells.
2.Hauptversuch
1. Hauptversuch
Einzelwerte von 6 bzw. 8 Mausohren.
Vehikel
140
120
130
90
50
40
60
40
100
170
80
90
160
50
Cilomilast Takrolimus
80
10
70
30
20
-10
10
30
30
10
50
-10
90
30
70
20
10
40
-10
30
0
-10
10
10
10
20
-10
20
Tab. 6-9: Gewichte der Lnn. auriculares [mg] TDI-sensibilisierter und mit Cilomilast und Takrolimus
behandelter BALB/c-Mäuse. Einzelwerte von 8 bzw. 6 Lymphknotengewichten.
2. Hauptversuch
1. Hauptversuch
Vehikel
Cilomilast Takrolimus
11.13
9.75
11.95
7.41
11.07
9.58
8.91
8.95
9.43
9.65
6.25
7.57
11.71
8.76
8.76
6.07
6.09
6.96
6.05
5.24
4.72
8.89
n.b.
5.81
6.8
4
4.6
4.8
3.6
5.6
4.4
3.1
3.3
4
1.4
3.4
2.3
1.3
2.1
3
1.7
1.8
119
Tab. 7-9: Grauwertdichte (densitometrische Auswertung) der zymographisch dargestellten
MMP-9-Banden
der
aufbereiteten
Ohrexplantate
nach
Behandlung
mit
Cilomilast
(nicht-
inflammatorisches Modell) sowie Takrolimus, Rapamycin und Cilomilast (Vorversuch im TDI-
Modell
Nicht-inflamm.
Kontaktallergiemodell). Einzelwerte von jeweils 4 (i.p.) bzw. 6 Mausohrexplantaten.
Vehikel
Cilomilast
26.335
30.505
56.635
41.825
41.825
39.425
19.155
11.86
6.75
5.27
2.68
9.143
Applikation
Applikation
Applikation
topische
orale
intraperitoneale
Vehikel
Takrolimus Rapamycin Cilomilast
16.69
48.86
26.13
1.64
42.46
85.3
16.82
12.24
39.33
32.48
23.81
20.78
55.21
72.85
8
13.74
3.54
24.39
0.14
10.69
17.06
38.78
4.47
7.09
23.96
37.54
29.73
53.28
2.82
1.69
39.08
89.05
95.98
9.89
20.78
18.68
23.59
n.b.
43.8
37.84
32.58
48.79
47.31
n.b.
49.2
29.74
55.48
n.b.
7.75
24.37
21.5
n.b.
27.05
8.05
26.33
n.b.
14.03
5
9.27
n.b.
23.18
14.98
12.72
n.b.
120
Tab. 8-9: Grauwertdichte (densitometrische Auswertung) der zymographisch dargestellten
MMP-9-Banden der aufbereiteten Ohrexplantate nach Behandlung mit Cilomilast und Takrolimus im
1. und 2. Hauptversuch. Einzelwerte von jeweils 6 Mausohrexplantaten.
2.Hauptversuch 1.Hauptversuch
Vehikel
Cilomilast Takrolimus
44.71
35.2
48.19
41.8
39.98
59.1
4.35
12.95
2.7
3.84
6.1
1.47
19.54
35.63
36.94
11.67
18.4
24.33
-2.77
2.64
-0.3
2.4
-1.97
n.b.
30.38
36.14
28.16
30.8
30.75
29.66
1.53
2.49
2.43
4.89
7.38
9.54
Tab. 9-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Inkubation von Cilomilast (10 µmol/l). Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5
a)
Kontrolle
Cilomilast
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
1213
1200
777
885
520
394
391
326
320
625
1198
6066
1773
6707
2663
1592
1669
1801
1236
1250
15603
4894
6577
7039
1717
1610
1487
1533
826
2500
19172
22604
13672
25757
47662
9927
6468
5785
4110
121
5000
53229
50357
55610
48614
54936
32142
13183
9378
9338
10000
84149
49501
60357
64650
59358
26344
14761
6943
14252
b)
Kontrolle
312
1490
2204
3173
3402
1549
197
518
963
1064
801
Cilomilast
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
625
6733
3241
7470
3999
4101
920
1793
1288
773
1632
1250
20556
13980
24492
12963
30182
5476
6985
6474
10130
5297
2500
80100
47276
56675
46155
52090
15588
14859
19374
19396
21292
5000
72263
64944
55618
43893
72398
81690
30041
36015
36469
38314
10000
86411
76061
50756
79331
31
50108
40004
31691
33724
751
c)
Cilomilast Kontrolle
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
4444
5626
1954
5391
1456
1014
1556
1203
625
6886
10387
26923
10224
2708
4427
2401
2349
1250
17784
30631
17968
14626
3035
3429
1864
2617
122
2500
34853
36457
35469
28711
3584
3391
2042
2403
5000
46851
37677
43265
40053
4952
3183
7896
3830
Tab. 10-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Inkubation von Takrolimus (100 nmol/l). Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5
a)
Kontrolle
Takrolimus
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
9299
7191
6618
4790
10109
269
275
126
163
494
625
9330
6149
5976
7230
11142
508
519
684
532
403
1250
12591
13030
21529
7012
12126
673
488
1092
1048
752
2500
10071
23972
11024
10366
23631
951
519
1367
1235
1122
5000
18277
29326
34026
24772
24322
1393
1720
2731
2046
1651
10000
42947
50300
34515
37454
44468
3209
3271
5635
2788
5404
b)
Takrolimus Kontrolle
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
6933
5966
6064
8157
7045
342
774
709
950
735
625
11462
11113
8730
11364
16343
1104
453
743
594
655
1250
2863
1209
1438
8659
881
1509
786
453
1338
1035
123
2500
20394
10565
15019
12689
16396
1872
1835
1622
2037
1166
5000
26685
20770
23353
20680
14264
5253
3058
2665
2861
2983
10000
20388
21077
26557
25470
19609
8175
3939
3670
5168
4712
c)
Kontrolle
Takrolimus
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
13393
6447
3962
3877
2845
312
530
123
109
877
625
2083
2535
10470
7742
6074
633
449
815
829
1431
1250
12333
9686
7557
6025
9021
765
481
2154
1032
994
2500
4706
4304
2863
12439
7653
2563
344
807
358
809
5000
20760
7679
12342
6132
7328
838
1061
632
556
694
10000
22963
18019
14818
20352
13075
1913
1797
1263
740
2958
Tab. 11-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Inkubation von Rapamycin (1 µmol/l). Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5
a)
Kontrolle
Rapamycin
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
7859
3949
3608
4985
8490
661
1034
405
562
1497
625
5640
10194
6288
5523
6490
690
514
734
632
686
1250
6571
14222
15958
6345
13706
1652
654
1931
1450
606
124
2500
14609
17536
15516
15460
11323
824
878
634
666
805
5000
22923
26489
25223
17754
8753
3078
2951
1789
989
1312
10000
33587
22211
22507
16873
16447
1558
3303
7148
5563
2618
b)
Kontrolle
Rapamycin
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
10031
7344
19253
6540
3588
217
722
325
252
769
625
9569
11275
11987
5549
6250
282
318
400
626
595
1250
18979
6894
18110
11159
5886
697
909
416
702
646
2500
24334
8061
17853
14700
18208
1564
8619
4956
1675
740
5000
29248
27750
38342
36399
35943
15932
4984
14154
12185
9044
10000
31736
47229
32288
43541
47778
21913
25862
12688
18774
19615
c
Kontrolle
Rapamycin
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
4116
3767
5792
2985
3268
326
253
491
434
717
625
3687
11273
6249
6175
5498
226
148
136
225
318
1250
2842
8176
5820
7068
8112
317
228
788
287
730
2500
19829
6085
17818
8645
5992
264
355
859
1029
530
5000
12401
6832
8583
12760
13363
3527
3077
4144
5671
3862
10000
24610
7722
6956
13715
6380
10190
5453
3804
2547
2383
Tab. 12-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Inkubation von Cilomilast in unterschiedlichen Konzentrationen. Dieser Versuchsansatz wurde
dreimal durchgeführt; n=5
a)
3
[cpm]
H-Thymidin
Konzentration Cilomilast
Kontrolle
10-3 µmol/l
10-2 µmol/l
10-1 µmol/l
1 µmol/l
10 µmol/l
19199
17797
14171
7125
7616
15521
21298
16243
14438
23548
22279
8898
19186
13715
23632
16143
17967
8163
17962
12644
17635
7764
10652
14380
11630
3172
6556
3200
3799
5323
125
b)
[cpm]
3
H-Thymidin
Konzentration Cilomilast
Kontrolle
10-3 µmol/l
10-2 µmol/l
10-1 µmol/l
1 µmol/l
10 µmol/l
13037
9749
5250
5572
11544
7659
8905
5607
9153
9697
8205
5561
7714
8935
8111
7655
5241
10189
8485
10300
10019
3154
6295
7082
6289
4355
4656
2345
2783
5815
c)
[cpm]
3
H-Thymidin
Konzentration Cilomilast
Kontrolle
10-3 µmol/l
10-2 µmol/l
10-1 µmol/l
1 µmol/l
10 µmol/l
12626
28817
5458
20766
18474
21593
23888
17742
15695
19515
22655
15270
27560
26215
18859
24361
21785
9223
10177
16974
8289
9987
6874
16913
13538
8585
7644
7249
1036
3746
Tab. 13-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Inkubation von Takrolimus in unterschiedlichen Konzentrationen. Dieser Versuchsansatz wurde
dreimal durchgeführt; n=5
a)
3
[cpm]
H-Thymidin
Konzentration Takrolimus
Kontrolle
10-2 nmol/l
10-1 nmol/l
1 nmol/l
10 nmol/l
100 nmol/l
80730
59669
43607
49738
55175
5091
2345
2569
5753
5083
5744
5883
2683
5316
3625
7154
10489
9518
8968
6200
11323
13823
9332
9877
4224
17486
20197
8649
14878
18579
126
b)
[cpm]
3
H-Thymidin
Konzentration Takrolimus
Kontrolle
10-2 nmol/l
10-1 nmol/l
1 nmol/l
10 nmol/l
100 nmol/l
9608
22827
14781
20671
22485
779
1748
2769
2989
5124
2141
2622
2757
2055
3082
1967
8541
26175
1440
2968
1738
2702
2694
1488
4483
2626
1473
1362
1700
1156
c)
[cpm]
3
H-Thymidin
Konzentration Takrolimus
Kontrolle
10-2 nmol/l
10-1 nmol/l
1 nmol/l
10 nmol/l
100 nmol/l
7491
5933
5405
2549
8623
5944
4713
5959
6732
1176
5463
3275
3051
2993
3740
3345
1359
1103
2117
2859
4509
1646
2307
1066
1402
2983
1052
1946
1012
885
Tab. 14-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Inkubation von Rapamycin in unterschiedlichen Konzentrationen. Dieser Versuchsansatz wurde
dreimal durchgeführt; n=5
a)
3
[cpm]
H-Thymidin
Konzentration Rapamycin
Kontrolle
10-4 µmol/l
10-3 µmol/l
10-2 µmol/l
10-1 µmol/l
1 µmol/l
50766
34221
47468
47407
45099
4872
21853
19380
4730
5572
6389
5196
19040
5572
15026
12036
5822
5221
3695
4155
16544
15735
5094
6542
13068
6215
4539
7835
2139
10406
127
b)
[cpm]
3
H-Thymidin
Konzentration Rapamycin
Kontrolle
10-4 µmol/l
10-3 µmol/l
10-2 µmol/l
10-1 µmol/l
1 µmol/l
13254
9112
7252
5565
9232
3160
6384
4883
2671
3356
4310
2756
3169
4203
2807
2832
2551
4591
1491
4152
3572
2605
1582
2510
2707
2943
2344
2659
3622
2050
c)
10-4 µmol/l
10-3 µmol/l
10-2 µmol/l
10-1 µmol/l
1 µmol/l
18989
11171
7965
4546
34941
13174
3755
14540
6893
5765
10674
5106
16002
2263
6627
8824
6666
2685
2697
1441
4218
12267
5940
3961
5236
5959
6836
1841
3737
9298
[cpm]
Kontrolle
3
H-Thymidin
Konzentration Rapamycin
Tab. 15-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Cilomilast Prä-Inkubation der DCs (10 µmol/l). Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5
a)
Kontrolle
Präinkubation
DC-Cilomilast
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
625
1250
2500
5000
10000
616
1277
1190
895
1041
3545
2862
8425
12502
9105
2114
1212
1233
2720
802
3161
3612
8790
13936
8461
5238
3697
3205
9950
2657
8079
5541
6111
18163
10507
22573
27708
38843
15486
16899
12607
16423
8786
9812
4517
61411
49409
52370
54859
68655
15178
12123
26749
36134
18733
114222
70848
78432
84023
57712
43882
55309
41275
46457
66341
128
b)
Kontrolle
312
4218
2697
2200
2435
2877
1531
2203
1327
3865
1747
Präinkubation
DC-Cilomilast
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
625
17157
3630
6483
4406
14660
12188
22935
8288
5080
10653
1250
42067
34610
38727
34175
40200
32982
21346
55151
29420
29304
2500
59392
54361
53372
50590
79782
55211
58225
57973
53982
39532
5000
74082
95989
49320
80050
105156
64708
69755
79440
59782
71472
10000
69014
94297
83699
71096
18
63977
56569
73132
59867
398
c)
Kontrolle
Präinkubation
DC-Cilomilast
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
625
1250
2500
5000
4209
2859
4081
4022
1039
1737
1162
2043
11880
9946
6525
5954
6899
1629
4477
2460
15561
11644
26526
16579
4918
4328
5455
20042
20602
38389
24648
24134
5388
16013
8747
5952
12888
42687
39650
30864
7615
6752
15334
10092
129
Tab. 16-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs
und Cilomilast Prä-Inkubation der T-Zellen (10 µmol/l). Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt;
n=5
a)
Kontrolle
Präinkubation
T-Zellen-
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
907
743
1047
842
763
260
361
447
396
470
625
3828
3260
3501
3384
2664
499
388
447
426
630
1250
18847
10318
1787
13282
7670
869
880
1204
635
470
2500
45647
43186
14267
20468
17772
3945
7831
7941
4595
6264
5000
53860
31341
37471
40805
58834
8156
6069
6500
10527
14255
10000
31529
46058
67598
55980
40086
6042
5970
13727
9486
8626
5000
255
58649
59873
1542
4403
55051
92149
62533
73481
68221
10000
9853
2620
91407
2405
29
84831
86757
65040
82525
45812
b)
Kontrolle
Präinkubation
T-Zellen-
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
58
1057
1324
135
79
666
1500
1623
622
1325
625
104
1490
1771
315
52
4183
1539
5246
4852
3118
1250
280
4244
3688
1259
169
3132
4471
12788
2881
19452
130
2500
1982
24471
24788
566
2455
27640
37327
50523
32493
44624
c)
Kontrolle
Präinkubation
T-Zellen-
3
H-Thymidin [cpm]
Anzahl DCs/100.000 T-Zellen
312
625
1250
2500
5000
1557
3451
1668
6283
1109
3748
1749
1711
17570
16550
13470
4889
1755
3191
4434
3124
27697
18244
24611
28941
3533
4718
13273
12581
36170
34166
29664
38513
17179
19296
16675
6387
33028
28641
29799
38282
31947
10255
22150
21227
Tab. 17-9: FACS-Analyse dendritischer Zellen; Detektion CD80+/MHC-II+-DCs nach LPSStimulation und Inkubation mit Cilomilast (10µmol/l), Rapamycin (1µmol/l) und Takrolimus (1nmol/l)
Kontrolle
LPS
Cilomilast
Rapamycin
Takrolimus
Zellzahl
78175
82963
47186
77543
89462
CD86+/MHC-II+-Zellen
22978
59424
32222
64237
52729
29,39%
71,63%
68,29%
82,84%
58,94%
Kontrolle
LPS
Cilomilast
Rapamycin
Takrolimus
Zellzahl
88105
74919
35726
45082
58951
CD86+/MHC-II+-Zellen
42449
56534
26716
39821
41696
48,18%
75,46%
74,78%
88,33%
70,33%
131
Tab. 18-9: TNF-α-Produktion von DCs nach LPS-Stimulation und Inkubation mit Cilomilast (10
µmol/l), Rapamycin (1 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l); Messung erfolgte mittels ELISA; n=6
TNF-α-[pg/ml]
Kontrolle
26.88
31.74
20.80
28.10
19.58
18.37
LPS
895.28
950.01
958.53
992.58
1041.23
890.42
Cilomilast
402.70
316.35
412.43
379.59
463.51
367.43
Rapamycin
630.14
529.19
664.19
572.97
560.81
591.22
Takrolimus
850.28
911.09
905.01
777.30
845.41
863.66
Tab. 18-9: IL-12-Produktion von DCs nach LPS-Stimulation und Inkubation mit Cilomilast (10
µmol/l), Rapamycin (1 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l); Messung erfolgte mittels ELISA; n=6
IL-12 [pg/ml]
Kontrolle
-10.48
-7.83
-7.83
-8.59
-7.83
-11.24
LPS
123.06
132.90
122.31
127.98
121.17
104.15
Cilomilast
45.89
44.00
31.89
25.08
46.64
37.56
132
Rapamycin
177.92
153.71
149.92
127.60
159.38
173.00
Takrolimus
70.10
85.99
76.53
54.59
53.83
31.51
9.2 Veröffentlichungen
Ein Teil der in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse und Untersuchungen liegt
bereits in veröffentlichter Form vor:
Zeitschriftenartikel:
BÄUMER, W., T. TSCHERNIG, B. SÜLZLE, U. SEEGERS, A. LÜHRMANN,
M. KIETZMANN (2003)
Effects of cilomilast on dendritic cell function in contact sensitivity and dendritic cell
migration through skin.
Eur. J. Pharmacol. 481, 271-279
Tagunsposter:
44. Frühjahrstagung der DGPT in Mainz, 2003
KIETZMANN, M., B. SÜLZLE, U. SEEGERS, P. SANDER, M. BRAUN,
T. TSCHERNIG u. W. BÄUMER
Influence of dendritic cell function by the phosphodiesterase 4 inhibitor cilomilast
133
134
Hiermit
erkläre
ich,
daß
ich
die
Dissertation
„Untersuchungen
zur
pharmakologischen Beeinflussung dendritischer Zellen“ selbständig verfaßt
habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Dr. H. Weigt und Dr. M. Hecht, Fraunhofer-Gesellschaft Hannover
PD. Dr. T. Tschernig, Medizinische Hochschule Hannover.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in
Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgender Institution angefertigt:
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
135
136
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die Überlassung
des interessanten Themas und die jederzeit freundliche Unterstützung.
Dr. Wolfgang Bäumer gebührt großer Dank für seine tatkräftige Unterstützung und
zahlreichen Ratschläge rund um die „dendritische Zelle.“
Den Dres. Niedorf und Braun danke ich für ihre Hilfe bei der Lösung so mancher
EDV-Probleme, die dann schnell keine mehr waren.
Bei Wolle, Frank und Braunie möchte ich für die sehr angenehme Arbeitsatmosphäre
und so manche äußerst kurzweilige Gespräche zwischen Tür und Angel bedanken.
Allen weiteren Mitarbeitern des Instituts gilt mein herzlicher Dank für die
immerwährende Hilfsbereitschaft und Unterstützung.
Victor de Vries und Dr. Henning Weigt danke ich für die Durchführung der FACSAnalysen und β-Scintillationsmessung.
Mein größter Dank gehört meiner Familie und Line, die mich während meiner
Studienzeit immer unterstützt haben.
137
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