Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung dendritischer Zellen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Boris Sülzle aus Loose Hannover 2004 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann 1. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann 2. Gutachter: Prof. Dr. W. Baumgärtner, PhD Tag der mündlichen Prüfung: 28.05. 2004 Meinen lieben Eltern gewidmet 1. Einleitung 1 2. Literaturübersicht 2 2.1 Dendritische Zellen 2 2.1.1 Entwicklung immaturer DCs und DC-Vorläufer im Knochenmark 3 2.1.2 Phänotyp und Funktion der unterschiedlichen DCs 5 2.1.2.1 Langerhans-Zellen und interstitielle DCs 5 2.1.2.2 Myeloide und lymphoide DCs 7 2.2 Allergische Kontaktdermatitis 8 2.2.1 Haptene 8 2.2.2 Sensibilisierung 9 2.2.2.1 Rolle der Langerhans-Zellen 9 2.2.2.2 Priming der T-Lymphozyten 11 2.2.2.3 Th1- und Th2-Polarität der Immunantwort 12 2.2.3 Auslösephase 13 2.3 Untersuchungen im TDI-Kontaktallergiemodell 15 2.4 Verwendete Pharmaka 17 2.4.1 Cilomilast 17 2.4.1.1 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vivo 20 2.4.1.2 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vitro 21 2.4.2 Takrolimus (FK506) 22 2.4.2.1 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vivo 24 2.4.2.2 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vitro 25 2.4.3 Rapamycin 27 2.4.3.1 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vivo 28 2.4.3.2 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vitro 29 3 Material und Methoden 31 3.1 Geräte und Reagenzien 31 3.1.1 Geräte für Zellkulturversuche 31 3.1.2 Reagenzien für Zellkulturversuche 31 3.1.3 Geräte für Zymographie 32 3.1.4 Reagenzien für Zymographie 33 3.1.5 Geräte für TNF-α/IL-12 ELISA 34 3.1.6 Geräte für FACS-Analyse 34 3.1.7 Geräte für Densitometrie 34 3.1.8 Hergestellte Puffer und Lösungen 35 3.1.9 Versuchstiere 35 3.2. Versuchsübersicht 36 3.3. Beeinflussung der DCs in vitro 37 3.3.1 Generierung von DCs 37 3.3.2 Gewinnung von murinen T-Lymphozyten 38 3.3.3 Messung von TNF-α und IL-12 39 3.3.4 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) 39 3.3.5 Heterologe Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR) 42 3.4 In-vivo-Versuche zur allergischen Kontaktdermatitis 44 3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell 44 3.4.2 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im allergischen Entzündungsgeschehen 45 3.4.3 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im nicht-inflammatorischen Modell 47 3.4.5 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST) 47 3.4.6 Skin-Migration-Assay 48 3.4.7 Local-Lymphnode-Assay (LLNA) 49 3.4.8 Aufbereitung der Zymographie-Proben 50 3.4.9 Biorad-Proteinbestimmung 50 3.4.10 Zymographie 51 3.5 Statistische Auswertung 52 4. Ergebnisse 53 4.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration dendritischer Zellen 53 4.1.1 Nicht-Inflammatorisches Modell 53 4.1.2 TDI-Kontaktallergiemodell 54 4.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die MMP-9-Expression 58 4.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell 58 4.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell 59 4.3 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Vorversuche 61 4.4 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Hauptversuche 62 4.5 Ergebnisse des Local-Lymphnode-Assays der In-vivo-Hauptversuche 63 4.6 Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die DC-induzierte T-Lymphozyten-Proliferation in der MLR 4.6.1 Koinkubation von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus 65 65 4.6.2 Konzentrationsabhängige Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus 65 4.6.3 Prä-Inkubation von Cilomilast 65 4.7 Ergebnisse der FACS-Analyse 70 4.7.1 Identifizierung der in vitro generierten dendritischen Zellen 70 4.7.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle in vitro generierter DCs 71 4.7.2.1 Einfluß auf die CD80-Expression 71 4.7.2.2 Einfluß auf die CD86-Expression 72 4.8 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPS-induzierte Produktion von TNF-α und IL-12 dendritischer Zellen 73 4.8.1 Einfluß auf die TNF-α-Produktion 73 4.8.2 Einfluß auf die IL-12-Produktion 73 5 Diskussion 75 5.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration dendritischer Zellen 75 5.1.1 Nicht-inflammatorisches Modell 75 5.1.2 TDI-Kontaktallergiemodell 77 5.1.3.1 Einfluß von MIP-3β auf die DC-Migration 78 5.1.3.2 Cilomilast 78 5.1.3.3 Takrolimus 79 5.2 Densitometrische Zymographieauswertung 81 5.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell 81 5.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell 82 5.3 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im MEST 82 5.4 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im LLNA 83 5.5 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus in der MLR 84 5.7 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPS-induzierte Produktion von TNF-α und IL-12 dendritischer Zellen 86 5.7.1 Einfluß auf TNF-α 86 5.7.2 Einfluß auf IL-12 86 6 Zusammenfassung 88 7 Summary 90 8 Literaturverzeichnis 92 9. Anhang 118 9.1 Anhangstabellen 118 9.2 Veröffentlichungen 134 Abkürzungsverzeichnis Abb. bzw. c-AMP CCR CD CLA CLP CMP DC ELISA Fc FLT-3 g GM-CSF i.p. ICAM IFN IgE IL LLNA Ln. LPS MCP MEST mg MHC MIP-3-β ml MMP n.b. nmol p.o. PDE4 s. S.D. Tab. TDI Th TLR TNF-α top. TRANCE µl µmol Abbildung beziehungsweise cyclisches Adenosinmonophosphat Chemokine Receptor Cluster of Differentiation Cutaneous Lymphocyte Antigene Common Lymphoid Progenitors Common Myeloid Progenitors Dendritic Cell Enzyme-Linked-Immunosorbant-Assay Fragment Crystallizable Fms-Like-Tyrosinekinase-3 Gramm Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor intraperitoneal Intercellular Adhesion Molecule Interferon Immunglobulin E Interleukin Local-Lymphnode-Assay Lymphonodus Lipopolysaccharide Monocyte-Chemoattractant-Proteins Mouse-Ear-Swelling-Test Milligramm Major-Histocompatibility-Complex Macrophage-Inflammatory-Protein-3-β Milliliter Matrix-Metalloproteinase nicht bestimmt Nanomol per os Phosphodiesterase 4 siehe Standard Deviation Tabelle Toluendiisocyanat T-Helferzelle Toll-like-receptor Tumor-Nekrose-Faktor-α topisch TNF-Related Activation-Induced Cytokine Mikroliter Mikromol 1. Einleitung Dendritische Zellen (DCs) nehmen in der adaptiven Immunantwort eine Schlüsselrolle ein: Nach Aufnahme und Prozessierung von Antigenen sind es alleine DCs, die nach erfolgter Migration im regionalen Lymphknoten T-Lymphozyten das spezifische Antigen präsentieren und eine zellvermittelte Immunantwort einleiten (BANCHEREAU u. STEINMAN 2000). So sind es auch im Falle der Kontaktallergie DCs, die das Allergen präsentieren und die unerwünschte allergische Immunreaktion initiieren (KRASTEVA et al. 1999a). Ziel dieser Arbeit ist die pharmakologische Beeinflussung der DC-Funktion. Als Testsubstanzen kommen die immunmodulatorisch wirksamen Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus zum Einsatz. In vivo werden die Testsubstanzen im Toluendiisocyanat eingesetzt. Zu (TDI)-induzierten untersuchende Kontaktallergiemodell Parameter stellen hier an BALB/c-Mäusen die Inhibition der Entzündungsreaktion der Haut (gemessen an der Ohrschwellung), die Beeinflussung der DC-Migration und nachfolgende T-Lymphozyten-Proliferation im regionalen Lymphknoten (gemessen am Lymphknotengewicht) dar. In-vitro-Untersuchungen sollen dabei die In-vivo-Studien ergänzen; für diese Untersuchungen werden aus murinem Knochenmark generierte DCs verwendet. So soll in der Mixed-LeukocyteReaction (MLR) der proliferationssuppressive Effekt der Testsubstanzen untersucht werden. Weiterhin sollen durchflußzytometrische Untersuchungen der in vitro gewonnen DCs Aufschluß über eine Regulation kostimulatorischer Oberflächenmoleküle nach LPS-Stimulation und Inkubation der Testsubstanzen ergeben. 1 2 Literaturübersicht 2.1 Dendritische Zellen Der Begriff „Dendritische Zelle“ beschreibt eine heterogene Zellfamilie leukozytären Ursprungs, deren Hauptaufgabe die Regulation des Immunsystems beinhaltet. Kurz zusammengefasst nehmen diese Zellen - in der Peripherie des Körpers sessil - Antigene auf, prozessieren diese, migrieren zum regionalen Lymphknoten und initiieren bzw. regulieren nachfolgend die Immunantwort (BANCHEREAU und STEINMAN 1998, CAUX et al. 2000). Erstmals beschrieben wurde dieser Zelltyp von STEINMAN und COHN (1973) in der Milz einer Maus. Obwohl die Langerhans-Zelle in der Haut bereits 1868 entdeckt wurde (LANGERHANS 1868), sollte man jedoch erst 1985 zur Erkenntnis kommen, daß die Langerhans-Zelle einen epidermal lokalisierten Subtyp der DC-Familie darstellt (SCHULER und STEINMAN 1985). Bis zu diesem Zeitpunkt war die Funktion und Position dieses Zelltyps innerhalb des Systems hämapoetischer Zellen ungewiß. Zunächst dem Nervensystem zugerechnet (LANGERHANS 1868), brachten erst Untersuchungen von BIRBECK et al. (1961), WOLFF (1963), sowie BRADSHAW et al. (1963) die Langerhans-Zelle in den Fokus immunologischer Betrachtungen. SILBERBERG et al. (1976) diskutierten erstmals die herausragende Rolle der Langerhans-Zelle in der allergischen Kontaktdermatitis; KLARESKOG et al. (1977) sowie ROWDEN et al. (1977) beschrieben erstmals das MHC-II-Molekül auf Langerhans-Zellen. Nachdem die Verbindung zwischen Langerhans-Zelle und deren Zugehörigkeit zur DC-Familie hergestellt war (SCHULER und STEINMAN 1985), stellte die Langerhans-Zelle ein bevorzugtes Modell zur Untersuchung der Biologie dendritischer Zellen dar. Nachfolgend soll nun näher auf die Ontogenese, Morphologie und die Funktion dendritischer Zellen (DCs) eingegangen werden. 2 2.1.1 Entwicklung immaturer DCs und DC-Vorläufer im Knochenmark Aufgrund der ausgesprochenen Plastizität der DCs sowie der im ständigen Fluß befindlichen Entwicklung stellt die folgende Übersicht lediglich den status quo des derzeitigen Erkenntnisstands dendritischer Zellen dar. Im Knochenmark werden von hämatopoetischen Stammzellen kontinuierlich immature DCs (imDCs) produziert; der fms-like-tyrosinekinase-3 (FLT-3)-Ligand und GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) nehmen dabei in der Proliferation und weiteren Differenzierung der DCs eine Schlüsselrolle ein (BJORCK 2001, PULENDRAN et al. 2001). Ausgangspunkt der DC-Entwicklung sind CD34+ hämatopoetische Stammzellen (s. Abb. 1-2). Die weitere Entwicklung erfolgt dichotom, so bilden sich aus den CD34+ Stammzellen zum Einen common lymphoid progenitors (CLP), zum Anderen common myeloid progenitors (CMP). Die myeloiden DC-Vorläuferzellen differenzieren sich weiter in Abhängigkeit von den erworbenen Oberflächenantigenen: So bildet ein Teil der Zellpopulation als skin-homing-receptor das cutaneous lymphocyte antigen (CLA) aus und differenziert sich weiter in eine CD11c+ CD1a+ immature DC-Population, während die CD34+ CLA- imDCs sich zu CD11c+ CD1a- immaturen DCs weiterentwickeln (STRUNK et al. 1997). CD11c+ CD1a+ imDCs migrieren in die Epidermis und bilden dort schließlich immature Langerhans-Zellen, während die CD11c+ CD1a- imDCs in die Dermis und weitere Gewebe migrieren; man bezeichnet sie dort auch als immature interstitielle DCs (CAUX et al. 2000). Neben den immaturen Langerhanszellen und immaturen interstitiellen DCs existieren zwei plasmazytoide weitere DCs DC-Vorläuferformen, (pre-DC2). CMPs dienen Monozyten dabei den (pre-DC1) Monozyten und als Vorläuferzellen, die sich unter dem Einfluß von GM-CSF und IL-4 reversibel in immature myeloide DCs (imDC1) differenzieren (AKAGAWA et el. 1996). Diese Gruppe der DCs wird auch als monocyte-derived-DCs bezeichnet. Im Gegensatz zu den drei beschriebenen DC-Gruppen entwickeln sich die plasmazytoiden DCs aus den lymphoiden Vorläuferzellen im Knochenmark. Die Vorläuferzellen der plasmazytoiden DCs entwickeln sich unter Einfluß von IL-3 zu immaturen DCs (im DC2). Die beiden beschriebenen DC-Subtypen verlassen schließlich als immature DCs das Knochenmark und migrieren über die Blutbahn in die lymphatischen Organe (LIU 2001). 3 CD34+ Stammzelle CMP CD34+CLA+ CD11c+CD1a+ CLP CD34+CLA- CD11c+CD1a- pre-DC1 pre-DC2 Antigen-abhängige Differenzierung: Langerhans-Zelle Interstitielle DC Bakterien Steady state Antigen Inflammation Phagozytose Keine Maturation Viren Maturation IFN-Produktion Maturation Migration in regionalen Lymphknoten immature DCs mature DCs Myeloide DC1 Lymphoide DC2 (plasmazytoide DCs) Toleranz Immunität Adaptive Immunantwort Abb. 1-2: Entwicklung, Differenzierung, Maturation und Funktion dendritischer Zellen nach LIU (2001) 4 2.1.2 Phänotyp und Funktion der unterschiedlichen DCs Allen vier DC-Subtypen gemeinsam ist die charakteristische Morphologie der Zellen im maturen Zustand, woher schließlich die Bezeichnung „dendritisch“ (gr. δενδροs, Baum) rührt. In situ, so z. B. in der Haut und den lymphatischen Organen, besitzen DCs eine sternenförmige Morphologie. Typisch und namensgebend sind die langen (> 10 µm) und dünnen, „dendritiformen“ zytoplasmatischen Zellfortsätze. Die so beschaffene Morphologie gewährt den DCs eine effiziente Antigenaufnahme und Interaktion mit weiteren Zellen des Immunsystems, insbesondere T-Lymphozyten (BANCHEREAU und STEINMAN 2000). Die unterschiedlichen DC-Typen unterscheiden sich, und zwar besonders in ihrem Immunphänotyp und in der Funktion, die sie im Organismus ausüben. Neben generellen Unterschiede zwischen immaturen und maturen DCs bestehen spezielle Unterschiede zwischen den einzelnen DC-Typen. 2.1.2.1 Langerhans-Zellen und interstitielle DCs Ein Charakteristikum immaturer DCs stellt die Unfähigkeit dar, T-Zellen zu stimulieren. Dies geht einher mit der Tatsache, daß immature DCs auf ihrer Zelloberfläche kaum antigenpräsentierende MHC-Molküle sowie wenig kostimulatorische Oberflächenmoleküle wie CD25, CD40, CD54, CD80 und CD86 exprimieren. Immature DCs exprimieren in diesem Stadium jedoch zahlreiche Rezeptoren zur Antigenaufnahme wie Fcγ-, Fcε- und im Fall der Langerhans-Zellen, Langerinrezeptoren (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994, CAUX et al. 1995, CAUX und BANCHEREAU 1996, FIGDOR 2002). Im Gegensatz zu den myeloiden und plasmazytoiden DC-Vorläufern sind immature Langerhans-Zellen und immature interstitielle DCs fähig, antigenunabhängig zu migrieren (steady state) und immunregulatorische Funktionen wahrzunehmen. Während der Migration nehmen diese nur kurzlebigen DCs (3-4 Tage) Selbstantigene und apoptotische Zellen auf und präsentieren diese T-Zellen, ohne dabei Maturationsvorgängen zu unterlaufen und T-Zellen zu aktivieren (SHORTMAN 2000, STEINMAN et al. 2000). Bei diesem Vorgang differenzieren sich naive CD4+ und CD8+ T-Zellen in IL-10 produzierende TSuppressorzellen, so daß eine Immunantwort gegenüber Selbstantigenen ausbleibt; 5 dies wird weithin als periphere Toleranz bezeichnet (JONULEIT et al. 2000, DHODAPKAR et al. 2001). Im Entzündungsgeschehen bzw. nach Aufnahme und Prozessierung von Antigenen unterlaufen immature DCs zügigen Veränderungen ihres Immunphänotyps und ihrer Funktion. Dieser als Maturation bezeichnete Vorgang induziert eine Heraufregulation von Adhäsions- und kostimulatorischen Molekülen (CD40, CD54, CD80, CD86), Expression antigenpräsentierender MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche sowie eine Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IL-1, IL-6, IL-12 und IL-18. Gleichzeitig verlieren die maturen DCs die Fähigkeit zur Antigenaufnahme durch die Herrunteregulation der Fcγ-, Fcε- bzw. Langerinrezeptoren (CAUX et al. 1994, INABA et al. 1994). Ausgelöst durch die Expression des Chemokinrezeptors 7 (CCR7) auf der Zelloberfläche der DCs und die Bildung der CCR7-Liganden MIP-3β (macrophage-inflammatory-protein-3-beta) und SLC (secondary-lymphoid-tissue-chemokine) seitens der lymphatischen Endothelzellen migrieren die DCs chemotaktisch in den regionalen Lymphknoten und initiieren dort nach Aktivierung der T-Lymphozyten die Immunantwort (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 2000). Im Vergleich zur steady-state-migration ist die Migrationsrate bzw. der turn-over dendritischer Zellen unter inflammatorischen Bedingungen stark erhöht, da die von aktivierten T-Zellen produzierten Zytokine CD40L und TRANCE (TNF-related activation-induced cytokine) den Efflux dendritischer Zellen in den regionalen Lymphknoten verstärken und zudem der Influx an DC-Vorläuferzellen in das Entzündungsgebiet zunimmt (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1999). In der Haut vermitteln die von Keratinozyten produzierten monocyte-chemoattractant-proteins 1 und 3 (MCP-1, MCP-3) sowie TNF-α und IL-1β diesen Vorgang (KRASTEVA et al. 1999a, LUCAS und MACPHERSON 2002). 6 2.1.2.2 Myeloide und lymphoide DCs Die Vorläuferzellen dieser DC-Subtypen unterscheiden sich morphologisch und funktionell von den oben bereits beschriebenen DCs: Weder pre-DCs1 und pre-DCs2 weisen dendritische Zellausläufer aus, noch sind sie unter steady-state Bedingungen fähig, zu migrieren (LIU et al. 2001). Myeloide pre-DCs exprimieren typische myeloide Oberflächenantigene wie CD11b, CD11c, CD13, CD14 und CD33; preDCs2 hingegen exprimieren lymphozytenassoziierte Antigene wie den Transkriptionsfaktor Spi-B und das T-Zell-Rezeptor-Glykoprotein pre-Tα. Beide Zelltypen nehmen wichtige Aufgaben innerhalb der unspezifischen sowie adaptiven Immunantwort bei bakteriellen bzw. viralen Infektionen wahr. So übernehmen pre-DCs1 den Part der Immunabwehr gegenüber Bakterien und Pilzen, indem sie diese Antigene Mannoserezeptor-vermittelt phagozytieren und abtöten; dieser Vorgang und der Einfluß von IL-4 induzieren die weitere Differenzierung über immature DC1 in schließlich mature DC1, die in der nachfolgenden adaptiven Immunantwort eine Th1-Polarisation bewirken. Dies geht einher mit der Beobachtung, daß DCs1 große Mengen an IL-12 produzieren und so geprimte TZellen sich zu zytotoxischen und IFN-γ produzierenden T-Zellen ausdifferenzieren (RISSOAN et al. 1999, ITO et al. 2001). Plasmazytoide DCs dagegen stellen das Bindeglied zwischen der unspezifischen und spezifischen Immunabwehr bei viralen Infektionen dar. Pre-DCs2 produzieren nach viraler Infektion große Mengen der antiviral wirksamen IFN-α und IFN-β und differenzieren sich dabei unter dem Einfluß der Interferone und autokriner TNF-α Produktion weiter in mature DCs2 (LIU et al. 2001). Diese maturen DCs2 induzieren nun eine ebenso wie die DCs1 eine adaptive Th1-Immunantwort, die jedoch IL-12 unabhängig erfolgt und zu IFN-γ und IL-10 produzierenden T-Zellen führt (RISSOAN et al. 1999, ITO et al. 2001). 7 2.2 Allergische Kontaktdermatitis In Abhängigkeit vom Allergen manifestiert sich eine allergische Kontaktdermatitis entweder als IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion vom Typ I oder zellvermittelte Reaktion vom Spättyp (Typ IV Reaktion). Beide Überempfindlichkeitsreaktionen setzten eine spezifische Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen voraus. Nachfolgend soll nun die Pathophysiologie der allergischen Kontaktdermatitis und besonders die Bedeutung der dendritischen Zellen erläutert werden. 2.2.1 Haptene Für die Auslösung einer Kontaktallergie sind bestimmte stoffliche Eigenschaften des potentiellen Allergens Vorraussetzung (BASKETTER et al. 1995): Bei Kontaktallergenen handelt es sich meist um niedermolekulare, organische Verbindungen mit Molekulargewichten zwischen 100 und 1000 Dalton, die ausreichend lipophil sind, die Haut zu penetrieren. Herkunft und Struktur der Allergene sind dabei vielfältig, so handelt es sich um Pflanzenstoffe, Kunststoffe, Farbstoffe, Detergentien und Arzneimittel. Diese Stoffe fungieren lediglich als nichtimmunogene Haptene und müssen mit Proteinen erst zu einem Vollantigen bzw. Hapten-Carrier-Komplex reagieren. So sind z. B viele pflanzliche Kontaktallergene elektrophile Substanzen, die mit Amino- und SH-Gruppen der Hautproteine reagieren und kovalente Bindungen eingehen, so daß sich ein Vollantigen bildet (LEPOITTEVIN und LEBLOND 1997). Von nicht-elektrophilen Stoffen – so genannten Prohaptenen - nimmt man an, daß diese in vivo zunächst in elektrophile Substanzen konvertiert werden müssen, an Hautproteine binden und schließlich allergenisierend wirksam sind (KALERGIS et al. 1997, MERK 1997). Dies ist der Fall z. B bei aromatischen Derivaten und photosensibilisierenden Substanzen, die durch UV-Strahlung aktiviert werden und schließlich an Hautproteine binden können (BASKETTER et al. 1995). Metalle hingegen wie zum Beispiel Nickel gehen keine kovalente Verbindung mit Hautproteinen ein, sondern formieren sich zu MetallProtein-Komplexen, deren Bindungskräfte schwächer ausgeprägt sind (SALOGA et al. 1988). 8 Nicht alle Haptene jedoch sind zwingend immunogen: Neben den aufgeführten stofflichen Voraussetzungen zur Ausbildung einer Kontaktallergie spielt auch der metabolische Status des Organismus eine wichtige Rolle; unterbleibt so zum Beispiel die Konvertierung der Prohaptene in Haptene, entwickelt sich keine Kontaktallergie. Hierin liegt einer der Gründe, warum die Ausbildung einer Kontaktallergie individuell unterschiedlich ist (KRASTEVA et al. 1999a). Hinsichtlich ihres Sensibilisierungspotentials lassen sich die Haptene in stark und schwach immunogen wirksame Haptene einteilen; so löst der Kontakt mit starken Haptenen (z. B. Oxazolon, Dinitrofluorbenzen) fast immer eine Kontaktallergie aus, schwache Haptene hingegen führen nur bei einem kleinem Prozentsatz der Individuen (z. B. 5% bei Metallsalzen) zu Kontaktallergien (KRASTEVA et al. 1999a). 2.2.2 Sensibilisierung Ätiopathogenetisch unterscheidet man bei der Kontaktallergie zwischen der Sensibilisierung gegenüber dem Antigen und der Auslösephase bei erneutem Antigenkontakt (SCHULER 1993). 2.2.2.1 Rolle der Langerhans-Zellen Während der Sensibilisierungsphase penetriert ein lipidlösliches Allergen nach Hautkontakt die Epidermis, wo es sich mit Hautproteinen zu einem Hapten-CarrierKomplex verbindet. Eine Schlüsselrolle nehmen hier immature Langerhans-Zellen ein: In den suprabasalen Schichten der Epidermis gelegen, formen sie ein dreidimensionales Netzwerk. Dabei wird die Adhäsion der Langerhans-Zellen untereinander sowie die Adhäsion zwischen Langerhans-Zellen und umliegenden Keratinozyten durch das Adhäsionsmolekül E-Cadherin vermittelt (RIEDL et al. 2000a, RYAN et al. 2000,). In diesem Geflecht werden eingedrungene Antigene „aufgefangen“ und von Langerhans-Zellen per rezeptorvermittelter Endozytose internalisiert (FIGDOR et al. 2002). Nach erfolgter Antigenaufnahme finden immunphänotypische, funktionelle und morphologische Veränderungen der Langerhans-Zellen statt; dies wird weithin als Maturation bezeichnet. 9 Immunphänotypisch weisen immature Langerhans-Zellen nur eine geringe Anzahl von MHC- sowie kostimulatorischen Moleküle (CD25, CD40, CD80, CD86) (NIJMAN et al. 1995, PIERRE et al. 1997), jedoch eine große Anzahl an Antigen-Rezeptoren (Fcγ-, Fcε-, Langerin-Rezeptor) und intrazellulär lokalisierten MHC-II-Molekülen auf (BANCHEREAU und STEINMAN 1998). Ebenso ist das Adhäsionsmolekül ECadherin auf der Zelloberfläche stark exprimiert (RIEDL et al. 2000b). Die Aufnahme von Antigenen - speziell die von Haptenen – sowie die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine (IL-1β, TNF-α) aus Keratinozyten - induziert bei Langerhans-Zellen folgende Veränderungen: Antigenpräsentierende MHC-II- Moleküle, kostimulatorische Oberflächenmoleküle (CD25, CD40, CD80, CD86) sowie der CCR7-Rezeptor werden heraufreguliert (AIBA und KATZ 1990, AIBA et al. 1997, CAUX et al. 2000); Endozytose-Rezeptoren und das Adhäsions-Molekül E-Cadherin werden herrunterreguliert (RIEDL et al. 2000a). Die Veränderungen des Immunphänotyps von Langerhans-Zellen gehen einher mit funktionellen Alterationen: Zeichnet sich die immature Langerhans-Zelle vornehmlich durch Antigenaufnahme und Immobilität aus, so prozessieren mature Langerhans-Zellen das aufgenommene Antigen. Sie sind fähig, in den regionalen Lymphknoten zu migrieren und naiven T-Lymphozyten das Antigen via MHC zu präsentieren (BANCHEREAU und STEINMAN 1998). Die Initiierung der Migration wird einerseits von den Langerhans-Zellen selbst, andererseits durch die Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1β, TNF-α) aus Keratinozyten nach Antigenkontakt gesteuert (WANG et al. 1997, CAUX 1998). Die Freisetzung dieser Zytokine bewirkt eine Modulation der interzellulären Adhäsionsmoleküle, insbesondere von ECadherin. Während der Maturation wird dieses Adhäsionsmolekül herunterreguliert, so daß die Langerhans-Zellen sich von den sie umgebenen Keratinozyten lösen; α6Integrine vermitteln anschließend die Adhäsion der Langerhans-Zellen an der epidermalen Basalmembran. Die Überquerung der Basalmembran geht mit dem Abbau extrazellulärer Matrix einher; dieser Vorgang wird durch die vermehrte Ausschüttung des Enzyms Matrix-Metalloproteinase-9 seitens der Langerhans-Zellen gesteuert (KOBAYASHI 1997, KIMBER et al. 1999, KIMBER et al. 2000, RIEDL et al. 2000a, JAKOB et al. 2001). Die weitere Migration über Lymphgefäße zum regionalen 10 Lymphknoten reguliert der exprimierte Rezeptor CCR7. Die Expression dieses Oberflächenmoleküls führt zu einer Chemotaxis der Langerhans-Zellen gegenüber den Chemokinen SLC und MIP-3β, die in der T-Zell-Region des regionalen Lymphknotens produziert werden (GUNN et al. 1998, DIEU-NOSJEAN et al. 1999, KELLERMANN et al. 1999). 2.2.2.2 Priming der T-Lymphozyten Im regionalen Lymphknoten präsentieren Langerhans-Zellen in der paracorticalen Region naiven T-Zellen das Antigen; diesen Vorgang bezeichnet man als priming. Die Antigen-Erkennung stellt hierbei die Interaktion zwischen spezifischem T-ZellRezeptor von CD8+ bzw. CD4+ T-Zellen und dem prozessiertem Antigen-Peptid – assoziiert mit MHC-I bzw. MHC-II-Molekülen – dar. Dabei konnte im Trinitrophenyl (TNP)-Kontaktallergiemodell bei der Maus gezeigt werden, daß der T-Zell-Rezeptor das Hapten samt des kovalent gebundenen Peptids als strukturelle Einheit in der Grube des MHC-Moleküls erkennt (CAVANI et al. 1995, WELTZIEN et al. 1996). Naive T-Lymphozyten zirkulieren kontinuierlich vom Blut in die lymphatischen Organe und wieder zurück. Die fortdauernde Passage der naiven T-Zellen vorbei an den dendritischen Zellen ist essentiell für die Initiierung der primären Immunantwort. Besteht eine spezifische Kohärenz zwischen T-Zell-Rezeptor und präsentiertem Antigen, beenden die T-Zellen ihre Wanderung und beginnen, mit den dendritischen Zellen zu interagieren. Den ersten Schritt dieser Wechselwirkung stellt hierbei die Zell zu Zell-Bindung dar, die durch Leukozytenintegrine auf der Zelloberfläche vermittelt wird (TILNEY und GOWANS 1971, HOGG und LANDIS 1993) Die nun folgende Aktivierung der T-Zelle erfordert zwei unabhängige Signale: Das erste Signal wird durch die Interaktion von T-Zell-Rezeptor und antigenpräsentierendem MHC-Molekül vermittelt, das zweite Signal durch die Wechselwirkung von kostimulatorischen Oberflächenmolekülen der dendritischen Zellen (CD80 und CD86) sowie deren Rezeptoren auf der T-Zell-Seite (CD28 und CTLA-4)(LIU und JANEWAY 1992, RUDD 1996). Letztlich führen beide Signale zu einer IL-2Produktion und Sekretion seitens der T-Zellen, welches durch die autokrine Wirkung auf den hochaffinen IL-2 Rezeptor zu einer hapten-spezifischen, klonalen Proliferation führt. Dabei bewirkt das erste stimulierende Signal die Aktivierung des 11 IL-2-Transkriptionsfaktors NF-AT (nuclear factor of activation in T cells), dies allein führt jedoch nicht zu einer IL-2-Produktion; erst im Zusammenwirken mit dem kostimulatorischen Signal kommt es zu einer Stabilisierung der IL-2 mRNA und zu einer wirkungsvollen IL-2-Synthese (LINDSTEN et al. 1989). Die klonale Expansion der T-Zellen mündet schließlich in der Ausbildung zweier T-Zell-Typen: Zum Einen werden T-Effektorzellen gebildet, zum Anderen TGedächtniszellen. Im Gegensatz zu naiven T-Zellen benötigen diese Zellen bei spezifischer Antigen-Erkennung keine Kostimulation (WONG et al. 1996). Die haptenspezifischen T-Zellen verlassen schließlich den Lymphknoten und treten in den Blutstrom ein. Im Falle der Kontaktallergie erlangen die T-Zellen das CLAAntigen (cutaneous lymphocyte antigen). Das CLA-Antigen fungiert als skin-homingreceptor für haptenspezifische T-Zellen, so daß CLA+-T-Zellen nach transendothelialer Migration nun vornehmlich die Dermis besiedeln (PICKER et al. 1993). 2.2.2.3 Th1-und Th2-Polarität der Immunantwort In Abhängigkeit vom Allergen und vom jeweilig dominierenden Zytokinmilieu wird während der Sensibilisierungsphase entweder eine Th1-oder Th2-vermittelte Immunantwort ausgelöst. Eine Th1-vermittelte zelluläre Immunantwort entsteht, wenn das Hapten MHC-Irestringiert naiven CD8+ T-Zellen in Abwesenheit von T-Helferzellen präsentiert wird. In der Folge werden CD8+ Effektor- und Gedächtniszellen produziert. Dabei ist von dendritischen Zellen produziertes IL-12 das dominierende Zytokin, welches für das priming naiver CD8+ T-Zellen und somit Entwicklung des Th1-Phänotyps verantwortlich zeichnet (CARTER und DUTTON 1996 ). Beispiele für Th1-assoziierte Kontaktallergene sind Oxazolon, Dinitrofluorbenzen (DNFB), Trinitrophenyl (TNP) sowie Nickel (KRASTEVA et al. 1999a). Wird hingegen das Allergen via MHC-II präsentiert und wird das Zytokinmilieu während der Antigenpräsentation von IL-4, Histamin und PGE2 dominiert, so werden vornehmlich CD4+ T-Zellen geprimt und eine Th2-mediierte, humorale Immunantwort eingeleitet (HILKENS et al. 1996, KAPSENBERG et al. 1998, VIEIRA et al. 2000, CARON et al. 2001, LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2001). Dies hat zur Folge, daß Th2–Effektor-Zellen mit antigenspezifischen B-Lymphozyten interagieren und 12 diese unter dem Einfluß von IL-4 und Stimulation durch CD40L zur IgE-Produktion anregen. Sobald die IgE-Produktion eingeleitet ist, wird diese durch basophile und eosinophile Granulozyten sowie Mastzellen weiter verstärkt. Alle drei Zelltypen exprimieren den Rezeptor FcεRI, an den sich nun das gebildete IgE bindet (GAUCHAT et al. 1993, YOSHIMOTO et al. 1995). Beispiele für Kontaktallergene, die eine Th2-Antwort induzieren, sind Trimellitanhydrid (TMA) und Toluendiisocyanat (TDI) (DEARMAN et al. 1996). Die oben beschriebenen Vorgänge während der Sensibilisierungsphase verlaufen ohne klinische Symptome. Der Zeitraum der Sensibilisierung beträgt beim Menschen, ca. 8-15 Tage bei der Maus 5-7 Tage (KRASTEVA et al. 1999a). CUMBERBATCH et al. (2003) sehen als eine mögliche Erklärung der Th1-/Th2Polarisation die unterschiedliche Migrationskinetik von Langerhanszellen in Abhängigkeit vom Allergen mit nachfolgender Beeinflussung der Zytokinproduktion der Langerhans-Zellen. So können sie zeigen, daß das Th1-assoziierte Kontaktallergen DNFB schneller in den regionalen Lymphknoten transportiert wurde als das Th2-assoziierte Kontaktallergen TMA. Da bekannt ist, daß die Antigeninduzierte IL-12-Produktion von DCs zeitlich limitiert ist (LANGENKAMP et al. 2000, LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000), wird in diesem Zusammenhang diskutiert, daß mit unterschiedlicher Migrationsgeschwindigkeit der Langerhans-Zellen nur ein begrenztes Zeitfenster zur IL-12-abhängigen Th1-Polarisierung naiver T-Zellen im Lymphknoten besteht. 2.2.3 Auslösephase Die Auslöse- oder Challenge-Phase beschreibt den erneuten Antigenkontakt nach abgeschlossener Sensibilisierungsphase und ist von den klinischen Symptomen der Kontaktdermatitis gekennzeichnet. Beim Menschen kommt es etwa 3 Tage (Maus: 1-2 Tage) nach Exposition am Ort des Allergenkontaktes zur Ausbildung von erythematösen Papeln, Ödemen und Bläschen in der Epidermis des Menschen bzw. der Dermis der Maus. Im weiteren Verlauf geht die akute allergische Kontaktdermatitis in ein chronisches Stadium über, das durch synchrone Polymorphie der klinischen Symptomatik, insbesondere einer ausgesprochenen 13 Lichenifikation der Haut, gekennzeichnet ist (KRASTEVA et al. 1999b). Die Pathophysiologie der allergisch-entzündlichen Reaktion unterscheidet sich hier in Abhängigkeit der jeweils initiierten T-Zell-Polarisation (Th1 versus Th2) während der Sensibilisierungsphase. Im Th1-dominierten Geschehen nehmen CD8+ CLA+ T-Gedächtniszellen der Dermis eine zentrale Rolle ein: Nach erneutem Antigenkontakt der Haut wird diesen Zellen das Hapten via Langerhans-Zellen und/oder dermalen dendritischen Zellen präsentiert, was zu einer Aktivierung der T-Zellen und Zytokinproduktion, insbesondere IL-1, IL-2, IFN-γ und TNF-α, führt (KASPENBERG et al. 1992, CAVANI et al. 1997). Durch die Produktion und Sekretion dieser inflammatorischen Zytokine werden speziell Keratinozyten und Endothelzellen aktiviert; Keratinozyten werden zusätzlich direkt durch den Antigenkontakt aktiviert. Aktivierte Keratinozyten produzieren ihrerseits pro-inflammatorische Zytokine und regulieren zusammen mit dem aktivierten Endothel den Influx haptenspezifischer T-Zellen aus dem Blut in die Haut. Die Aktivierung des Endothels geht mit einer Alteration der endothelialen Adhäsionsmoleküle für Leukozyten (Selektine, Integrine) einher und dient der Rekrutierung neutrophiler Granulozyten und Monozyten aus dem Blut in die Haut, um das Entzündungsgeschen zu initiieren (SMITH und BARKER 1993). Außerdem üben CD8+ T-Zellen einen direkten zytotoxischen Effekt in der Haut aus (KEHREN et al. 1999). Im Th2-vermittelten Allergiegeschehen läuft das Entzündungsgeschen nach wiederholtem Antigenkontakt in zwei Phasen ab: Man unterscheidet die Sofortreaktion von der Spätreaktion. Die allergische Sofortreaktion wird durch die Antigen-induzierte IgE-Quervernetzung auf kutanen Mastzellen initiiert. Die nachfolgende Mastzelldegranulation löst eine Entzündungskaskade aus, zu deren Vermittlern Histamin, Prostaglandine, IL-1β sowie TNF-α gehören (AUSTEN 1995). Die Spätreaktion hingegen ist von einem Influx inflammatorischer Leukozyten und antigenspezifischen Gedächtniszellen der CD4+ Haut T-Zellen zeichnen gekennzeichnet. hierbei für das CD4+ T- Aufrechterhalten der Aktivierte Entzündungsreaktion verantwortlich: Nach Aktivierung produzieren und sezernieren sie IL-4, IL-5 und IL-10, wodurch die IgE-Produktion vorangetrieben sowie ein 14 fortdauernder Influx inflammatorischer Leukozyten aus dem Blut in die Haut reguliert wird (FINKELMAN et al. 1988, WERFEL et al 1995). 2.3 Untersuchungen im TDI-Kontaktallergiemodell Toluendiisocyanat (TDI) zählt zur Stoffgruppe der Diisocyanate und hat ein Molekulargewicht von 174,16 Dalton. Diisocyanate sind hochreaktive Stoffe, die bei der industriellen Herstellung von Elastomeren, Farben und Klebstoffen verwendet werden. Sie stellen eine der häufigsten Ursachen des berufsbedingten Asthmas dar. In Tierversuchen mit Diisocyanaten wurden in Kurzzeittests Genmutationen und Chromosomenschädigungen beobachtet, weshalb Diisocyanate möglicherweise als potentiell kanzerogen einzustufen sind (BOLOGNESI et al. 2001). YASUDA et al. (1980) beschreiben erstmals das Auftreten der dermalen Kontaktallergie nach TDI-Sensibilisierung im Mausmodell. Seither wurden eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt, die dieses Modell charakterisieren und den Einfluß verschiedener Pharmaka in diesem Entzündungsmodell untersuchen. TOMINAGA et al. (1985) benutzen das TDI-Kontaktallergiemodell für pharmakologische Untersuchungen zur Beeinflussung des Entzündungsgeschehens. Sie berichten von einer Inhibition der TDI-induzierten Ohrschwellung nach Gabe von Dexamethason und Indometacin. DEARMAN et al. (1991, 1996) führen Charakterisierungsstudien mit Kontaktallergenen durch und berichten von der Th2dominierenden Immunantwort im TDI-Kontaktallergiemodell: So messen sie erhöhte IgE-Serumspiegel im Blut TDI-sensibilisierter Mäuse sowie eine erhöhte IL-4 und IL10 Zytokinproduktion TDI-aktivierter Lymphknotenzellen. Ebenso berichten SCHEERENS et al. (1999) von einer Produktion TDI-spezifischer IgE-AntikörperProduktion bei Mäusen nach einer sechswöchigen Sensibilisierungsphase. EHINGER et al. (2000) untersuchen den Einfluß des PDE4-Inhibitors Piclamilast im TDI-Kontaktallergiemodell; dabei zeigt sich eine wirksame Inhibition der allergischen Ohrschwellung nach topischer und intraperitonealer Verabreichung von Piclamilast. Weitere Untersuchungen zur Wirksamkeit von PDE4-Inhibitoren bei allergischen Dermatitiden an BALB/c-Mäusen schließen sich an. Die topischer Applikation von 15 Cilomilast und AWD 12-281 kann die an den Ohren durch TDI geboosterte allergische Entzündungsreaktion wirkungsvoll inhibieren; zudem weisen die behandelten Ohren einen verminderten Gehalt des pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β sowie einen drastisch reduzierten Influx neutrophiler Granulozyten auf. Nach präventiver topischer Applikation von Cilomilast und AWD 12-281 können BÄUMER et al. (2002, 2003a) 24 Stunden nach TDI-Challenge eine Reduktion der TDIinduzierten Produktion von IL-4, IL-6 sowie des Makrophagen-InflammatorischenProteins-2 (MIP-2) im Ohrhomogenat messen. In eigenen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit soll der Fragestellung nachgegangen werden, welchen Einfluß die Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf das allergische Entzündungsgeschehen im TDI-Kontaktallergiemodell nehmen. 16 2.4. Verwendete Pharmaka 2.4.1 Cilomilast Cilomilast (cis-4-cyano-4-[3-cyclopentoxyl-4-methoxphenyl]-Cyclohexa-Carbon- säure) ist ein Phosphodiesterase-4 (PDE4)-Inhibitor der 2. Generation; zur Zeit befindet sich der Stoff in der klinischen Phase III der Arzneimittelzulassung als Humanpräparat für die Asthma-Therapie (GRISWOLD et. al. 1998) bzw. in Phase II zur Therapie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung, COPD (GIEMBYCZ 2000). Die Phosphodiesterase (PDE) ist ein intrazellulär lokalisiertes, ubiquitär vorkommendes Enzym, welches second-messenger-Nukleotide der Zelle (cAMP und cGMP) hydrolytisch spaltet (SUTHERLAND und RALL 1958). Heute sind mehr als 11 PDE-Enzyme bekannt, wobei die unterschiedlichen Gewebe und Zellen ein differierendes Muster der Enzymausstattung aufweisen; so sind z.B. die PDE3 und besonders PDE4 charakteristisch für Immun- bzw. Entzündungszellen (DCs, TZellen, neutrophile Granulozyten) (GIEMBYCZ et al. 1997). Sie nehmen dort im cAMP-Abbau die zentrale Rolle ein. Genetisch codiert wird die PDE4 von vier unterschiedlichen Gen-Loci, so daß die PDE4 vier Subtypen (PDE4A, PDE4B, PDE4C und PDE4D) aufweist (GIEMBYCZ 2000). Die jeweilige Expression des PDE4-Isoenzyms entspricht unterschiedlichen mRNA splicing-Varianten, die der Feinregulierung des intrazellulären cAMPHaushalts dienen (HOUSLAY et al. 1997). Die Verteilung dieser Isoenzyme differiert dabei in Abhängigkeit von Körpergewebe und Zelltypus; PDE4A ist ubiquitär verteilt und der dominierende Subtyp in DCs (HEYSTEK et al. 2003), wohingegen PDE4C vornehmlich in Nervengewebe vorkommt und in Entzündungszellen fehlt; PDEB wird in der Lunge, Herz und Skelettmuskulatur exprimiert. Die Wirkung von Cilomilast auf die Funktion von Immun- und Entzündungszellen basiert auf der spezifischen Hemmung der PDE4 (Abb. 2-2): Hieraus resultiert ein intrazellulärer Anstieg von cAMP. Dieses bindet und aktiviert die Proteinkinase A (PKA). Die PKA phosphoryliert Transkriptionsfaktoren, die für die Inflammationskaskade eine Schlüsselrolle spielen. Durch den pleiotropen Effekt der intrazellulären 17 cAMP-Akkumulation wechselt der Funktionszustand der Zellen vom pro- inflammatorischen zum anti-inflammatorischen Zustand. Beim Menschen erfolgt die Absorption von Cilomilast nach oraler Verabreichung zügig, mit einer maximalen Plasmakonzentration (Cmax) eine Stunde nach Verabreichung. Die Bioverfügbarkeit nach oraler Gabe beträgt 96%. Als Halbwertzeit (t 0,5) werden sieben Stunden angegeben (ZUSSMAN et al. 2000). Die Nebenwirkungen der PDE4-Inhibitoren sind im Zusammenhang mit der Molekularstruktur des PDE4-Enzyms zu betrachten. Die PDE4 existiert sterisch gesehen in zwei unterschiedlichen Konformationen, PDE4-H und PDE4-L. Für diese besitzt der PDE4-Inhibitor der 1. Generation, Rolipram, eine hohe (High) bzw. niedrige (Low) Bindungsaffinität (SCHNEIDER et al. 1986). PDE4-H wird bereits durch geringe Konzentrationen von Rolipram inhibiert, PDE4-L erst durch hohe Konzentrationen von Rolipram. Anti-inflammatorische Effekte werden der PDE4-L Bindung zugeschrieben (BARNETTE et al. 1996), wohingegen Nebenwirkungen wie Vomitus, Nausea und Dyspepsie (gastrische H+-Hypersekretion) durch eine Bindung an PDE4-H verursacht werden (GIEMBYCZ 2000). Die PDE4-H/PDE4-L-Ratio von Rolipram liegt bei 0,1; durch die damit verbundene höhere Affinität zu PDE4L überwiegen die Nebenwirkungen, bzw. werden therapeutische Effekte erst in höheren Dosierungen erreicht. Im Vergleich hierzu beträgt die PDE4-H/PDE4-L-Ratio von Cilomilast 1,1 (BARNETTE et al. 1998): Trotz des im Vergleich zu Rolipram höheren therapeutischen Index kommt es auch bei Cilomilast zu Nebenwirkungen. So berichten CHOMPTON und NIEMAN (1999) von Emesis als häufigster Nebenwirkung nach Behandlung mit Cilomilast (15 mg/kg), gefolgt von Nausea und Dyspepsie. 18 PDE4-Inhibitor ATP cAMP 5`-AMP PKA inaktiv PKA aktiv Protein Protein-PO4 Inflammatorische Zellaktivität ↓ Abb. 2-2: Wirkmechanismus von PDE4-Inhibitoren (nach TORPHY 1998) O OH O N O Abb. 3-2: Strukturformel von Cilomilast 19 2.4.1.1 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vivo Über die In-vivo-Effekte von Cilomilast geben die Ergebnisse aus klinischen Untersuchungen sowie aus verschiedenen tierexperimentellen Allergiestudien Aufschluß (s. Tab. 1-2). In Phase-II-Studien zu asthmatischen Atemwegserkrankungen des Menschen wird Cilomilast (15 mg/kg) erfolgreich eingesetzt. COMPTON et al. (2000) beschreiben eine Reduktion der typischen Asthma-Symptome wie Husten, Atemnot und Brustschmerzen. In einem Bericht zur Phase-III-Studie der klinischen Wirksamkeit von Cilomilast bei COPD des Menschen beschreiben EDELSON et al. (2001) positive Effekte hinsichtlich einer Lungenfunktionsbesserung und des allgemeinen Gesundheitszustands. Im Dinitrochlorobenzen (DNCB)- und Toluendiisocyanat (TDI)-induzierten Kontaktallergiemodell zeigen EHINGER et al. (2000) an BALB/c-Mäusen die Wirksamkeit eines weiteren PDE4-Inhibitors, Piclamilast (RPR 73401). Nach intraperitonealer und topischer Applikation von Piclamilast kann die mit Ohrschwellung einhergehende Entzündungsreaktion signifikant gehemmt werden. BÄUMER et al. (2002) zeigen weiterhin im gleichen Tier- und Allergiemodell (TDI) eine entsprechende Wirksamkeit von Cilomilast; zudem berichten sie von einer signifikanten Reduktion der TDI- induzierten Produktion von Interleukin-1β (IL-1β), welches in den behandelten Ohren gemessen wird. In den beiden zitierten Versuchen wurden die Tiere aktiv sensibilisiert. Von einer passiven Sensibilisierung der BALB/c-Mäuse mittels Injektion TDI-„gepulster“ - also mit TDI beladenen – DCs berichten BÄUMER et al. (2003b); hier wird der Effekt von Cilomilast auf die DCs untersucht, indem die DCs vor der Injektion mit Cilomilast prä-inkubiert wurden. Es zeigt sich kein Effekt hinsichtlich einer Inhibition der durch TDI-beladene DCs hervorgerufenen Ohrschwellung. Die systemische Gabe von Cilomilast vermag jedoch die Ohrschwellung zu inhibieren. BELLGUIC et al. (2000) berichten, daß die MMP-9-Expression - im Ovalbumininduzierten Entzündungsmodell der Lunge an BALB/-Mäusen – in der Bronchoalveolären Lavage durch Gabe von Rolipram reduziert wird. Hier werden als Quelle der MMP-9 neutrophile Granulozyten und Alveolarmakrophagen angesehen. 20 2.4.3.1.2 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vitro Ein häufig angewendetes In-vitro-Modell, um die pharmakologische Beeinflussung von DCs zu untersuchen, ist die Stimulation von DCs mit Lipopolysacchariden (LPS) und anschließender Messung proinflammatorischer Zytokine. Zusätzlich stellt die Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR) stellt ein In-vitroModell dar, in dem die DC-Eigenschaft, T-Zellen zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen, näher untersucht wird; durch FACS-Analysen von DCs lassen sich Aussagen über die Modulation von Zelloberflächenmolekülen treffen. HATZELMANN und SCHUDT (2000) zeigen an LPS-stimulierten, humanen, monocyte-derived DCs eine wirkungsvolle Inhibition der TNF-α-Synthese durch Cilomilast. Weiterhin beschreiben sie den Einfluß von Cilomilast auf humane CD4+ TLymphozyten. Nach Proliferationsstimulation der T-Zellen mit anti-CD3/anti-CD28 monoklonalen Antikörpern kann die Proliferation der T-Zellen und Synthese von IL-2, IL-4, IL-5 und Interferon-γ durch Inkubation mit Cilomilast inhibiert werden. BARNETTE et al. (1998) erhalten ähnliche Ergebnisse an humanen Monozyten und T-Zellen. BILLAH et al. (2002) zeigen an humanen, peripheral blood monocytes (PBMCs) einen hemmenden Effekt des PDE4-Inhibitors SCH 351591 auf die Produktion von IL-12 nach Stimulation der Zellen mit Pansorbin. HEYSTEK et al. (2003) beschreiben in FACS-Analysen eine Heraufregulation des chemotaktisch bedeutsamen Oberflächenmoleküls CXCR4 auf monocyte-derived DCs durch Cilomilastgabe während der LPS-induzierten DC-Maturation. Untersuchungen zur Beeinflussung des Immunphänotyps antigenpräsentierender Zellen (APCs; Monozyten, B-Lymphozyten) durch Rolipram – ein PDE4-Inhibitor der 1. Generation – zeigen eine Modulation der Oberflächenmoleküle CD80 und CD86 sowie von MHC-I und MHC-II. So wird CD86 heraufreguliert, CD80, MHC-I und MHC-II jedoch herunterreguliert (BIELEKOVA et al. 2000). 21 Tab. 1-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Cilomilast. Literatur s. Text. Zelltyp in vivo in vitro DCs Inhibition der Kontaktallergie im TDI-Modell IL-1β u. TNF-α↓ CXCR4↑ epidermale DCs Migration↓ (eigene Untersuchungen) T-Zellen Inhibition der Kontaktallergie im TDI-Modell Ohrhomogenat Proliferation↓ IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ↓ IL-1β↓ im TDI-Modell MMP-9 Aktivität↓ (eigene Untersuchungen) Asthma-u. COPD-Therapie 2.4.2 Takrolimus (FK 506) Takrolimus wurde 1984 aus der Kulturbouillon einer in Tsukuba (Japan) entdeckten Streptomyces-Spezies isoliert. Der Name Takrolimus ist ein Kunstwort, zusammengesetzt aus den Bestandteilen Tsukuba, Makrolid und Immunosupressant (KINO et al. 1987). Strukturell zählt FK506 zur Gruppe der Makrolid-Laktone mit einem Molekulargewicht von 822,05 Dalton, pharmakologisch zählt es zur Gruppe der Calcineurin-Inhibitoren. Es gilt neben dem Peptid Cyclosporin A als Leitsubstanz immunsuppressiv wirksamer Arzneimittel. Takrolimus findet seine klinische Anwendung in der Transplantationsmedizin zur Prophylaxe und Therapie der manifesten Transplantatabstoßung nach Leber- und Nierentransplantationen (PrografR) sowie in der Dermatologie als Therapeutikum (ProtopicR-Salbe) der atopischen Dermatitis des Menschen. Gute Wirksamkeit kann bei topischer Applikation auch beim allergischen Kontaktekzem im Meerschweinchenmodell (ALAITI et al. 1998) sowie beim Menschen gezeigt werden (BOGNIEWIECZ et al. 1998). 22 HO CH3 CH3 O H3CO O O OH CH2 CH3 O CH3 OH O O H3C OCH3 OCH3 Abb. 4-2: Strukturformel von Takrolimus (FK 506) Takrolimus übt seine biologischen Effekte nach Bindung an zytoplasmatische Makrophiline aus; diese auch als FK506-bindende Proteine (FKBP-12) bezeichnete Substanzen sind den Immunophilinen zuzurechnen. Nach erfolgter Bindung von Takrolimus an FKBP-12 entsteht ein Komplex, der nun die Funktion der Ca2+abhängigen Serin-/Threonin-Phosphatase Calcineurin hemmt (LIU et. al. 1991). Dies führt über eine Translokationshemmung des Nuklearfaktors NF-ATp letztlich zu einer Transkriptionshemmung NF-ATp-abhängiger Zytokine, insbesondere IL-2, TNF-α, GM-CSF. Hierdurch lassen sich die beschriebenen Effekte auf verschiedene Zelltypen der Haut und des Immunsystems erklären (siehe 2.2.3, Abb. 6-2 und Tab. 2-2). Takrolimus kann oral, parenteral und topisch appliziert werden. Aufgrund einer nur mäßigen Absorptionsrate nach oraler Applikation beträgt die durchschnittliche orale Bioverfügbarkeit beim Menschen ca. 27% (PETERS et al. 1993). Topisch aufgetragenes Takrolimus penetriert die Haut in Abhängigkeit von der verwendeten Konzentration, der ausgewählten Grundlage und der Integrität der epidermalen Barriere in unterschiedlichem Maß. Hierin liegt die Basis für die Anwendbarkeit in dermatologischen Externa zur gezielten topischen, immunsuppressiven Behandlung 23 entzündlicher Dermatitiden. Bei Einarbeitung von Takrolimus in eine sehr lipophile Salbengrundlage können somit auch bei äußerlicher Anwendung therapeutische Konzentrationen in befallenen Hautarealen ohne systemische Akkumulation des Wirkstoffes erreicht werden (WOLLENBERG und BIEBER 1997; RUZICKA et al. 1997; BIEBER 1998). Als Nebenwirkungen nach systemischer Verabreichung stehen die stark ausgeprägte Nephrotoxozität und allgemeine Immunsuppression im Vordergrund, gefolgt von gastrointestinalen (Vomitus, Nausea) und neurologischen Effekte (Tremor) (BORNHÖVD et al. 2000). Die wichtigste unerwünschte Nebenwirkung nach topischer Takrolimus- Anwendung ist ein von Patienten als „Brennen“ oder „Hitzegefühl“ beschriebene transientes Mißempfinden am Applikationsort (RUZICKA et al. 1997). Diese Erscheinungen klingen jedoch nach 30-90 Minuten von selbst ab. Dauer und Intensität des Brennens nehmen nach 5-10 tägiger Behandlung ab und verlieren sich schließlich. Topisch angewendetes Takrolimus beeinflußt weder die Kollagensynthese der Haut, noch kommt es zu einer Hautatrophie (REITAMO et al. 1998). 2.4.3.2.1 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vivo In entzündlich veränderten Hautarealen werden Keratinozyten, LangerhansZellen, inflammatorische dendritische Zellen und T-Lymphozyten in ihrer biologischen Funktion und im Immunphänotyp verändert; nachfolgend sind die Effekte von Takrolimus auf diese Zellen aufgeführt. Untersuchungen zur Takrolimuswirkung in psoriatisch veränderten Hautarealen des Menschen ergeben, daß der Interleukin-8 (IL-8)-Rezeptor von Keratinozyten dosisabhängig herunterreguliert wird (SCHULZ et al. 1993). Untersuchungen von WOLLENBERG et al. (1996) zum atopischen Ekzem ergeben, daß LangerhansZellen durch topische Takrolimus-Behandlung beeinflußt werden: So berichten sie von einer Herunterregulation des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) auf dendritischen Zellen der Haut. Der Anteil von dendritischen Zellen fällt unter die 24 Nachweisgrenze und deren Stimulationskapazität gegenüber autologen T- Lymphozyten wird reduziert (WOLLENBERG et al. 1996). Häufig verwendete und gut studierte In-vivo-Modelle zur zellmediierten Immunantwort sind Kontaktallergie-Modelle bei der Maus. In einem Trinitrochlorobenzen (TNCB)- vermittelten Kontaktallergie-Modell untersuchen SALERNO et al. (1998) Effekte von Takrolimus: Nach Injektion von Lymphknotenzellen TNCB-sensibilisierter und Takrolimus behandelter Tiere in naive Empfängertiere entwickeln diese im Vergleich zur Kontrolle keine Kontaktallergie, gemessen an der Ohrschwellung. Ferner arbeiten SALERNO et al. (1998) den Einfluß von Takrolimus auf bestimmte T-Zell-Subpopulationen heraus: αβ+ und γδ+ TLymphozyten sind für die Etablierung einer Kontaktsensitivität essentiell; unter dem Einfluß von Takrolimus vermögen diese Zellen jedoch keine Kontaktsensitivität im Vergleich zu Kontrolltieren zu induzieren. Des weiteren werden die Produktion von IL-2 und die T-Zell-Proliferation nach DC-vermittelter Antigenstimulation (TNBC) durch systemische Behandlung der Tiere verhindert. Im Oxazolon induzierten Kontaktallergiemodell untersuchen HOMEY et al. (1998) die Zytokinexpression epidermaler Zellen und von Lymphknotenzellen sowie deren Immunphänotyp: Durch Behandlung mit Takrolimus wird die Lymphknotenproliferation inhibiert und eine Abnahme der inflammatorischen Zytokine IL-1β, TNF-α und IFN-γ in der Haut erreicht. FACS-Analysen epidermaler Zellen behandelter Tiere ergeben eine Abnahme von CD4+ T-Zellen in der Haut. 2.4.3.2.2 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vitro Die DC-vermittelte Antigenpräsentation gegenüber T-Lymphozyten verläuft unter dem Einfluß zahlreicher Zytokine und exprimierter Zelloberflächenmoleküle. Murine, in vitro generierte DCs und T-Lymphozyten werden bei der bidirektionalen Interaktion während der Antigenpräsentation durch Takrolimus in unterschiedlicher Art und Weise beeinflußt. MATSUE et al. (2002) finden bei DCs eine Herunterregulation der von DCs produzierten Interleukine 6 und 12, sowie der T-Zell-Zytokine IL-2, IL-4 und IFN-γ. TIEFENTHALER et al. (2004) berichten von einer Inhibition der IL-12Produktion durch Takrolimus bei humanen monocyte-derived DCs. Zudem weisen 25 mit Takrolimus generierte DCs eine verminderte Allostimulationsfähigkeit gegenüber T-Lymphozyten in der MLR auf (SZABO et al 2001). WOLTMAN et al. (2000) berichten von einer lediglich partiellen TNF-α Inhibition durch Takrolimus bei CD40L stimulierten DCs. Untersuchungen des DC-Immunphänotyp ergeben eine Herunterregulation von CD69 nach LPS-Stimulation und Takrolimus-Inkubation der Zellen während der DC/T-Zell-Interaktion (MATSUE et al. 2002). In vitro unter Takrolimus-Einfluß generierte DCs zeichnen sich im Immunphänotyp durch eine Abnahme der CD1a+, CD40 und CD86 Oberflächenmoleküle aus. Gegensätzliches zur Beeinflussung des Immunphänotyps von DCs berichten COS et al. (2002) und WOLTMAN et al. (2000). So finden sie keine Unterschiede nach Takrolimus-Behandlung im Vergleich zu Kontrollzellen nach LPS- bzw. CD40L-Stimulation der DCs. Ebenso finden SZABO et al. keinen Einfluß von Takrolimus auf die Expression von CD80, CD86, MHC-I und MHC-II Oberflächenmolekülen. Untersuchungen zum Immunphänotyp isolierter epidermaler Langerhanszellen wiederum ergeben eine Oberflächenmoleküle: Während der Maturation zu DCs inhibiert Alteration der Takrolimus die Expression von CD25, CD40 und CD80 ebenso wie die von MHC-I und MHC-II. Tab. 2-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Takrolimus. Literatur s. Text Zelltyp in vivo in vitro Keratinozyten Down-Regulation IL-8 Rezeptor Langerhans-Zellen Down-Regulation FcεRI DCs Down-Regulation FcεRI T-Zell Allostimulation↓ T-Lymphozyten Lymphknotengewichte (eigene Untersuchungen) αβ+/γδ+ T-Zellen Inhibition der Kontaktallergie im TNCB-Modell CD4+ T -Zellen Reduktion der Zellzahl in der Haut im TNCB-Modell 26 CD25, CD40, CD80, MHC-I, MHC-II↓ IL-6 und IL-12↓ T-Zell Allostimulation↓ IL-2, IL-4, IFN-γ↓ Proliferation↓ 2.4.3.3 Rapamycin Rapamycin ist ein natürliches Fermentationsprodukt der Actinomyces-Art Streptomyces hygroscopicus, das vor 25 Jahren aus einer Bodenprobe der Osterinsel Rapa Nui isoliert wurde und als putatives Fungizid den Namen Rapamycin erhielt. Bei Rapamycin handelt es sich um ein weiteres Immunsuppressivum aus der Gruppe der Makrolide mit einem Molekulargewicht von 914 Dalton; es zählt pharmakologisch zur Gruppe der mTOR (mammalian target of rapamycin)-KinaseInhibitoren (ABRAHAM und WIEDERRECHT 1996). Rapamycin (RapamuneR) ist zugelassen zur Prophylaxe der Organabstoßung bei Patienten, die ein Nierentransplantat erhalten. Nach Aufnahme in die Zelle erfolgt – analog zu Takrolimus – eine Bindung an FKBP-12; der entstandene Komplex hemmt dann allerdings nicht die Phosphatase Calcineurin und damit die Ca2+ -abhängige Transkription der Gene für die Synthese von IL-2. Angriffspunkt dieses Komplexes ist die Kinase mTOR (siehe Abb. 2-2). Durch die Inhibition dieser Kinase wird der Zellzyklus in einer späten Phase (G1 zu S) blockiert. Im Gegensatz zu Takrolimus, welches den Zellzyklus in einer frühen Phase moduliert und die IL-2 Synthese hemmt (frühe G1-Phase), wird also durch Rapamycin die Zellantwort auf produzierte Zytokine unterdrückt (VASQUEZ 2000). Maximale Blutspiegel werden beim Menschen nach einer Stunde erreicht, die Bioverfügbarkeit nach oraler Aufnahme beträgt nur 15%. Die mittlere Halbwertzeit wird mit 62 ± 16 Stunden angegeben. Als klinisch Hyperlipidämien, bedeutsame eine höhere Nebenwirkungen Infektanfälligkeit werden für (verursacht Rapamycin durch die Immunsuppression) und ein erhöhtes Risiko für maligne Syndrome, insbesondere Lymphome und Hautkrebs angegeben. 27 OCH3 OH CH3 H 3C O N O O O H3CO O HO H3C OH O H3C OCH3 O H3C CH3 CH3 Abb. 5-2: Strukturformel von Rapamycin 2.4.3.3.1 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vivo Den Einfluß Rapamycin auf die Funktion dendritischer Zellen untersuchen HACKSTEIN et al. (2002): In vitro generierte und in vivo injizierte murine DCs weisen eine herabgesetzte Antigenaufnahme auf; dies äußert sich in einer Reduktion der Makropinozytose und Mannose-Rezeptor-vermittelten Endozytose von Fluorescinisothicyanat (FITC)-Albumin bzw. FITC-Dextran. Die Hemmung der Endozytose wird dabei nicht durch Apoptose verursacht. In weiteren Untersuchungen berichten HACKSTEIN et al. (2003) von einer beeinträchtigten Generierung und Mobilisation von DCs unter dem Einfluß von Rapamycin sowie einer Modulation kostimulatorischer Oberflächenmoleküle (CD80 und CD86), pro-inflammatorischer Zytokine (TNF-α) und der T-Zell Allostimulation (s. Tab. 3-2). Analog zur Takrolimuswirkung im TNCB-Modell berichten SALERNO et al. (1998) über eine wirkungsvolle Hemmung der Kontaktsensitivität durch systemische 28 Verabreichung von Rapamycin; auch hierfür wird ein direkter Einfluß auf αβ+ und γδ+ T-Lymphozyten diskutiert. Allerdings wurde die IL-2 Synthese nicht gehemmt. FK 506 RAPA FK 506 RAPA FKBP-12 FKBP-12 Zellkern Transkription: IL-2, TNF-α Mitogenese GM-CSF NF-ATp mTOR Abb. 6-2: Wirkmechanismen der Makrolid-Immunsuppressiva Takrolimus und Rapamycin (RAPA) nach BORNHÖVD et al. (2000) 2.4.3.3.2 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vitro In-vitro- Untersuchungen von MONTI et al. (2003) können die In-vivo-Ergebnisse (HACKSTEIN et al. 2002) hinsichtlich einer Beeinflussung der DC-Antigen-Aufnahme bestätigen. Durch Inkubation mit Rapamycin weisen humane monocyte-derived DCs eine verminderte Oberflächenmoleküle FITC-Dextran CD1a, Endozytose MHC-I, MHC-II, 29 auf. Weiterhin CD80, CD86 werden und die CD40 herunterreguliert. Anders als In-vivo-Untersuchungen gezeigt, induziert Rapamycin jedoch die Apoptose von DCs (WOLTMAN et al. 2001, MONTI et al. 2003). Die apoptotische Wirkung von Rapamycin wirkt sich dabei exklusiv auf DCs aus, was WOLTMAN et al. (2003) in Untersuchungen an monocyte-derived DCs zeigen. Diskutiert wird eine Interruption der GM-CSF-Signalkaskade mit nachfolgender Überexpression des pro-apoptotischen Zellzyklus-Inhibitors p27, vermittelt durch die mTOR-Inhibition durch Rapamycin. Den suppressiven Einfluß von Rapamycin auf die DC-Aktivierung untersuchen (HACKSTEIN et al. 2003); Rapamycin hemmt danach die IL-4 abhängige Maturation der DCs und deren Fähigkeit zur T-Zell-Allostimulation sowie die Produktion von TNF-α. Posttranskriptional sind die beobachteten Effekte bei DCs mit einer DownRegulation der zwei IL-4 Rezeptor-Untereinheiten CD124 und CD132 verbunden. Den Effekt von Rapamycin auf die DC/T-Zell Interaktion untersuchen MATSUE et al. (2002). Rapamycin inhibiert wirkungsvoll die DC-vermittelte T-Zell Proliferation, hat jedoch keinen Einfluß auf die Zytokinproduktion der DCs (IL-6 und IL-12 p40) und der T-Lymphozyten (IL-2, IL-4, IFN-γ). Das DC-Oberflächenmolekül CD40 wird durch Rapamycin in seiner Expression während der Antigenpräsentation gehemmt. Tab. 3-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Rapamycin. Literatur s. Text Zelltyp in vivo in vitro DCs Antigen-Aufnahme↓ Generierung, Mobilisation↓ CD80, CD86, TNF-α↓ T-Zell-Allostimulation↓ T-Zellen Inhibition der Kontaktallergie (αβ+ + γδ+ T-Zellen) 30 Antigen-Aufnahme↓ CD1a, CD40, CD80, CD86, MHC-I, MHC-II↓ Apoptose-Induktion T-Zell-Allostimulation↓ IL-4 abhängige Maturation, IL-4 Rezeptor-Komplex (CD124, CD123)↓ TNF-α↓ Proliferation↓ 3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Reagenzien 3.1.1 Geräte für Zellkulturversuche Kühlzentrifuge Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburg Brutschrank US AutoFlow, Zapf, Sarstedt Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Jena Sterilfilter Minisart, Sartorius, Göttingen Polypropylen-Röhrchen, 15 ml/50 ml Greiner, Frickenhausen Petrischalen, tissue culture dish cell+, Sarstedt 100mm x 20mm 6-,12-,24,-96-well-plates Greiner, Frickenhausen Pipettenspitzen, 10 ml Greiner, Frickenhausen 96-well-plates, round-bottom Greiner, Frickenhausen Einmalspritzen, 2/10 ml Omnifix, Braun, Melsungen Einmal-Injektions-Kanüle, Nr 14 Terumo, Leuven, Belgien Einmal-Injektions-Kanüle, Nr 20 Omnifix, Braun, Melsungen Feinwaage Sartorius 2002 MP1, Sartorius, Göttingen Digitalkamera PowerShot A70, Canon Inc., Malaysia 3.1.2 Reagenzien für Zellkulturversuche RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin, Deutschland Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe 10% FKS Biochrom, Berlin, Deutschland 31 β-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim GM-CSF R&D-Systems, Minneapolis, USA MIP-3β R&D-Systems, Minneapolis, USA Polyvidon-Iod-Lösung Braunol, Braun, Melsungen NH4Cl Merck, Darmstadt EDTA Aldrich, Steinheim KHCO3 Merck, Darmstadt LPS E. coli O127 B8, Sigma, Steinheim Na2-EDTA Merck, Darmstadt NaHCO3 Merck, Darmstadt Cilomilast Elbion AG, Radebeul Rapamycin Wyeth-Agent Research Lab., Princeton, USA Takrolimus In-vivo-Versuche: freundliche Gabe von Prof. Dr. Wozel, Dresden In-vitro-Versuche: Calbiochem, Darmstadt ProtopicR Fujisawa Healthcare, Japan TDI Sigma, Steinheim Trypan-Blau Sigma, Steinheim 3 Hartmann Analytic, Braunschweig H-Thymidin (1mCi) 3.1.3 Geräte für Zymographie Netzanschlußgerät PowerSupplyUnit 1200/200, Desaga, Heidelberg Elektophoresekammer Penguin Water-Cooled Dual-Gel Electrophoresis System, Peqlab, Erlangen Gelgießstand Multiple Gradient Caster, Peqlab, Erlangen Hamilton-Spritze, 10 µl Microliter, Hamilton-Bonaduz, Schweiz 32 Schüttler Diffusions-Entfärbe-Apparatur, Desaga, Heidelberg Elektrophorese-Kühlung Multiwash, Eheim Zellglas Einmach-Fix, Folia Magnetrührer Magnetomix, Colora, Lorach Tischzentrifuge Centrifuge 5415 C, Eppendorf, Hamburg Tischschüttler Reax top, Heidolph 3.1.4 Reagenzien für Zymographie Coomassie Brillant Blau g 250 Merck, Darmstadt ProSieve 50 gel solution BMA, Rockland, USA Temed (N,N,N`,N`Tetramethylethylenediamine) Sigma, Steinheim Methanol LAB Scan Ltd., Dublin, Ireland Ammoniumperoxidisulfat (APOS) Merck, Darmstadt Ethanol absolut Riedel de Haën Essigsäure 100 % Appli Chem, Darmstadt Glycerin 1-Butanol Merck, Darmstadt Calciumchlorid-dihydrat Merck, Darmstadt NaCl Merck, Darmstadt Tris-Base Merck, Darmstadt (Tris-(hydromethyl)-aminomethan) Tris-HCl Merck, Darmstadt (Tris-(hydroxymethy)aminomethanhydrochlorid) Natriumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt Gelatine, Typ A from porcine skin Sigma, Steinheim Elektrophorese kD-Marker Precision Plus Protein, Dual Color Standards, Biorad, München 33 3.1.5 Geräte für TNF-α/IL-12-ELISA DuoSet Mouse TNF-α-ELISA R&D-Systems, Minneapolis, USA DuoSet Mouse IL-12-ELISA R&D-Systems, Minneapolis, USA Biorad Protein Assay Biorad, München Photometer MicroplateReader MRX, Dynatech Drucker LC 24-100,star 3.1.6 Geräte für FACS-Analyse FACSscan flow cytometer Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA CellQuest Software CD11c–Antikörper Pharmingen, Hamburg, Deutschland MHC–II–Antikörper Pharmingen, Hamburg, Deutschland Red 670–Streptavidin Gibco, Gaitherburg, MD, USA CD80-Antikörper Pharmingen, Hamburg, Deutschland CD86-Antikörper Pharmingen, Hamburg, Deutschland 3.1.7 Geräte für Densitometrie Hp Scan Jet 7400 Scanner Hewlett Packard, USA Photo-Impact 4.0 Software Ulead Systems, USA Scion Image Software Scion, Frederick, MD, USA 34 3.1.8 Hergestellte Puffer und Lösungen PBS–Puffer: 8g NaCl 0,2 g KCl 1,44 g Na2PO4 0,2 g KH2PO4 bidest. Wasser ad 1000 ml pH 7,2 mit 1M HCl/1 M NaOH Hämolyse–Puffer: 8,29 g NH4CL 0,037 g Na2 EDTA 0,839 g NaHCO3 bidest. Wasser ad 1000 ml pH 7,3 DC–Medium: RPMI 1640 10 % FKS 50 µM β-Mercaptoethanol 3.1.9 Versuchstiere Für die Versuche wurden weibliche BALB/c-Mäuse verwendet (Alter der Tiere 8 Wochen; Körpergewicht ca. 20 g). Alle Tiere waren klinisch gesund. Die Mäuse wurden in Käfigen zu je 6 Tieren in einem 12-h Hell/Dunkel-Lichtzyklus gehalten. Wasser und Futter wurden ad libitum angeboten. Der Tierversuch wurde bei der Bezirksregierung Hannover angezeigt (Az. 509i-42502-98A839). 35 3.2 Versuchsübersicht In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der immunwirksamen Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Funktion in vitro generierter dendritischer Zellen (DCs) und DCs dermaler und epidermaler Herkunft untersucht. In vivo wurde im nicht-inflammatorischen als auch im TDI-Kontaktallergiemodell die Beeinflussung von dermalen/epidermalen DCs hinsichtlich ihres Migrationsverhaltens und ihrer Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren durch oben aufgeführte Pharmaka untersucht. Hierfür wurden die Inhibition einer Ohrschwellung per Kutimeter als funktioneller Entzündungsparameter und die Anzahl ausgewanderter dermaler/epidermaler DCs in einem Skin-Migration-Assay bestimmt. Als Parameter für die T-Zell-Stimulation durch Langerhans-Zellen bzw. dermale DCs wurde das Gewicht und die Zellzahl der Lnn. auriculares sensibilisierter Mäuse im Local-Lymphnode-Assay bestimmt. In vitro wurden DCs generiert und folgende Versuche durchgeführt: In Zellkulturversuchen wurde der Einfluß der Testsubstanzen auf die LPS-induzierte Sekretion proinflammatorischer Zytokine (TNF-α, IL-12) von DCs untersucht. Die Zytokinmessung erfolgte mittels ELISA. Weiterhin wurde in vitro in der MixedLeukocyte-Reaction (MLR) die Fähigkeit der DCs zur T-Zell-Stimulation und deren Inhibition durch oben aufgeführte Pharmaka untersucht. Mittels Durchflußzytometrie wurden die in vitro generierten DCs anhand ihrer charakteristischen Oberflächenmoleküle (MHC-II, CD11c) identifiziert und deren prozentualer Anteil in der Kultur bestimmt. Zusätzlich wurde in der Durchflußzytometrie der Einfluß der Testsubstanzen auf die LPS-induzierte Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle (CD80 und CD86) der DCs untersucht. Die FACS-Analysen wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von PD. Dr. Tschernig in der Medizinische Hochschule Hannover durchgeführt. Die Durchführung des LLNA und Messung der MLR geschah in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Braun, Fraunhofer-Gesellschaft Hannover. 36 3.3 Beeinflussung der DCs in vitro 3.3.1 Generierung von DCs Die Gewinnung von DC-Vorläuferzellen aus murinem Knochenmark erfolgte mit der von LUTZ et al. (1999) beschriebenen Methodik. Zur Gewinnung von DCVorläuferzellen (Stammzellen) aus dem Knochenmark wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet und der Femur mit sterilem Instrumentarium (Schere, Pinzette) freipräpariert und ausgelöst. Anschließend wurde der so präparierte Knochen für 5 Minuten in Alkohol (70%) desinfiziert und danach in PBS überführt. In einer Petrischale wurde mit einem Skalpell der Knochen an beiden Enden eröffnet; der Inhalt der Markhöhle wurde mit sterilfiltriertem PBS (5 ml) mittels Spritze und Kanüle in eine Petrischale gespült. Nach Vereinzelung des Markhöhleninhalts mittels Pipette wurden die Zellen zentrifugiert (220 g, 4°C, 10 Minuten). Der Überstand wurde nach der Zentrifugation verworfen und das Zellpellet in 1 ml RPMI 1640 (mit Zusatz von 10% FKS, 50 I.U./ml Penicillin und 50 mg/ml Streptomycin) resuspendiert. Um die Zellzahl bestimmen zu können, wurden 100 µl der resuspendierten Zellen mit 100 µl eines Erythrozyten-Lysepuffers (Schwinzer-Lyse) 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit Trypanblau im Verhältnis 1:3 gefärbt und in einer Neubauer-Kammer gezählt. Die Zellzahl errechnete sich nach der Formel: gezählte Zellen/4x3x10.000= Zellen/ml 2x106 Zellen wurden in 10 ml Medium (5 ml RPMI mit Zusatz von FKS 10%, Pen/Strep, 5 ml sterilfiltriertes DC-Medium und 200 ng GM-CSF) aufgenommen und in eine Petrischale (cell+) überführt. Die Zellkultur wurde für 10 Tage im Brutschrank inkubiert. Während dieser Zeit erfolgte ein mehrmaliger Mediumwechsel mit GMCSF-Gabe (s. Tab 1-3). 37 Tab. 1-3.: Übersichtsdarstellung der DC-Kultivierung nach LUTZ et al. (1999) Tag der Zellkultur Mediumgabe Tag 3: Zugabe von 5 ml RPMI mit Zusatz von FKS 10%, Pen/Strep, 5 ml DC-Medium und 200 ng GM-CSF Tag 6 u. 8: Zentrifugieren der Zellen (200 g, 4°C, 10 Minuten); Abnahme von 10 ml Medium, Zugabe von 10 ml neuem Medium Tag 10: wie Tag 6 u. 8, GM-CSF-Gabe 100 ng 3.3.2 Gewinnung von murinen T-Lymphozyten Die Gewinnung von murinen T-Lymphozyten erfolgte in Anlehnung an GUNZER et al. (2001). Als Spendertiere wurden weibliche NMRI-Mäuse benutzt. Nachdem die Tiere getötet worden waren, wurde die Milz mit sterilem Instrumentarium (Schere, Pinzette) entnommen und in sterilfiltriertes PBS überführt. Anschließend wurde die Milz mit 10 ml PBS mittels Spritze und Kanüle gespült und die Spülflüssigkeit in einem 50 ml Falcon-Röhrchen aufgefangen. Die so gewonnenen Milzzellen wurden zentrifugiert (1000g, 4°C, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 5 ml Hämolysepuffer resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktion abgebrochen, indem 45 ml PBS hinzugegeben wurde. Es folgte ein weiteres Zentrifugieren; nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 10 ml RPMI 1640 (mit Zusatz von FKS 10% und Pen/Strep) resuspendiert und die Zellen in eine cell+ Petri-Schale überführt. Nach einer Inkubation von 2 Stunden im Brutschank wurden die nicht adhärenten Zellen aus der Petrischale abgenommen; man erhielt so eine T-LymphozytenPopulation in einer Reinheit von ca. 60-70% (GUNZER et al. 2001), da Monozyten und Stromazellen während der Inkubation am Plastik ädherierten. 38 3.3.3 Messung von TNF-α und IL-12 Die Bestimmung erfolgte mit einem quantitativen Sandwich-ELISA: Auf eine mit polyklonalen anti-Maus-IL-12-Antikörpern beschichtet Mikroplatte wurden jeweils Standard, Kontrolle und Probenüberstände aufgetragen und bei Raumtemperatur inkubiert; vorhandenes IL-12 wurde durch den Antikörper gebunden. Durch einen anschließenden Waschvorgang wurden ungebundene Substanzen entfernt und anschließend ein enzymgekoppelter anti-Maus-IL-12-Antikörper hinzugegeben. Nach weiterer Inkubation wurden durch Waschen ungebundene Antikörper entfernt und die Substratlösung für den enzymgekoppelten Antikörper hinzugegeben. Durch die stattgefundene Enzymreaktion wechselte die Farbe von blau zu gelb nach Zugabe der Stop-Lösung. Die Intensität der Enzymreaktion und der damit korrespondierenden Farbintensität war proportional zum Gehalt an IL-12. Die Auswertung erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm. Durch den Vergleich mit einer angelegten Kalibrationsreihe konnten die absoluten IL-12Gehalte der Proben erfaßt werden. Der durchgeführte TNF-α-ELISA basierte auf der gleichen Grundlage. 3.3.4 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörpern durchgeführt wird (s. Tab. 2-3). Zur Analyse werden die Zellen in einer Einzelzellsuspension durch hydrodynamische Fokussierung wie an einer Perlenkette an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge (Argonlaser, λ=588nm) vorbeigeleitet (s. Abb. 1-3). Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen Laserstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben. Nach dem Laserpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen) auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die emittierte Photonenkonzentration, die durch einen Photodetektor (Photomultiplier) registriert wird, verhält sich proportional zur Menge 39 an gebundenen Antikörpern/ Zelle. In der Regel stehen drei Sensoren für 530 nm (Fluoreszenzkanal 1), 585 nm (Fl 2), und >650 nm (Fl 3) zur Verfügung. Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und –Streuung Informationen über die Zellgröße und die Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas, Größe des Zellkerns usw.) der Zellen gewonnen: Das in einem geringen Winkel (3-10°) gestreute Licht wird als Vorwärtsstreuung („forward scatter“, FSC) mit einer Beeinflussung durch die Zellgröße und im rechten Winkel dazu als Seitwärtsstreuung („side scatter“, SSC) mit einer Abhängigkeit der intrazellulären Granularität erfasst. Mit Hilfe dieser beiden Messparameter sind unterschiedliche Zellpopulationen zu identifizieren (z.B. Lymphozyten, dendritische Zellen). Nach einer Verstärkung wird das optische Signal zuerst in ein elektrisches Signal, anschließend in ein digitales Signal umgewandelt. Eine gleichzeitige FACS-Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen Wellenlänge anregen lassen aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff charakteristische Emmissionsspektren verfügen. In der vorliegenden Arbeit wurden in vitro generierte DCs an Tag 10 der Kultur hinsichtlich ihrer Reinheit und der Einfluss der Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPS-induzierte Induktion kostimulatorischer Oberflächenmoleküle der DCs durchflußzytometrisch untersucht (s. Tab. 2-3 und 3-3). Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten überführt und zweimal mit PBS (enthält 1% BSA und 0,1% NaN3) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit den Antikörpern für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde die FACS-Analyse der Zellen durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit der CellQuest Research Software. Die Ergebnisse wurden als Histogramme dargestellt. Dendritische Zellen wurden durch Detektion von CD11c und MHC-II identifiziert; als kostimulatorische Oberflächenmoleküle wurden CD80 und CD86 untersucht. 40 Tab. 2-3: Verwendete fluoreszierende Antikörper Oberflächenmolekül prim. Antikörper sek. Antikörper CD11c hamster IgG1, PE-konjugiert MHC-II rat IgG2a, Biotin-konjugiert Isotypkontrolle hamster IgG1, PE–konjugiert red 670-Streptavidin rat IgG2a, Biotin–konjugiert CD80 mouse IgG1, FITC-konjugiert CD86 mouse IgG1, FITC-konjugiert red 670-Streptavidin Tab. 3-3: Durchflußzytometrische Untersuchungen: 1) DCs an Tag 9 der Kultur, LPS–Konz. 1 µg/ml; 2) Inkubation der DC-Kultur mit Cilomilast (10µM), Takrolimus (100nM) und Rapamycin (1µM) an Tag 8 und 9; Inkubation an Tag 9 30 min vor LPSStimulation Zellmaterial funktioneller Parameter Oberflächenmolekül DCs Tag 10 Reinheit der Kultur an DCs CD11c; MHC–II Stimulation von DCs CD80/CD86; MHC–II Inhibition der DC-Stimulation CD80/ CD86; MHC–II 1) DCs + LPS DCs + Cilomilast 2) + Takrolimus2) + Rapamycin 2) Zellsuspension FL 1 FL 2 FL 3 FSC Argon-Laser 588nm SSC Abb. 1-3: Schematische Darstellung der Durchflußzytometrie 41 3.3.5 Heterologe Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR) Funktionelle Grundlage der MLR ist die Interaktion von Leukozyten zweier verschiedener Organismen: Naive T–Lymphozyten des einen Organismus erkennen via T–Zell–Rezeptor einen allelen Polymorphismus von Fremd-MHC-II–Molekülen dendritischer Zellen. Daraufhin werden die T–Lymphozyten zur Proliferation angeregt. Als Stimulatorzellen wurden in den eigenen Untersuchungen DCs von BALB/c–Mäusen verwendet, T–Lymphozyten von NMRI–Mäusen dienten als Responderzellen. T-Lymphozyten und dendritische Zellen wurden wie bereits beschrieben generiert (s. 3.3.1 und 3.3.2) Die hier angewandte heterologe MLR wurde in Anlehnung an STEINMAN et al. (1978) und GUNZER et al. (2001) durchgeführt (s. Abb. 2-3); es wurden die Immunmodulatoren Cilomilast, Takrolimus und Rapamycin eingesetzt und ihr Einfluß auf die DC–induzierte T-Lymphozytenproliferation untersucht. Folgende Versuchsansätze wurden in der MLR durchgeführt: Für eine Koinkubation der MLR mit Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus wurden zunächst 100.000 T-Zellen/100 µl RPMI in eine round-bottom Mikrotiterplatte vorgelegt. Anschließend wurden DCs in verschiedenen Verdünnungsstufen (10.000, 5000, 2500, 1250, 625, 312/100 µl RPMI) hinzugegeben; schließlich wurden die oben aufgeführten Pharmaka hinzugegeben (s. Tabelle 4-3). In einem weiteren Versuchsansatz wurde eine Prä-Inkubation von DCs bzw. TZellen mit Cilomilast vorgenommen: DCs bzw. T-Zellen wurden zunächst für eine Stunde mit Cilomilast prä-inkubiert und anschließend gewaschen. Anschließend wurde die MLR wie oben beschrieben durchgeführt. Weiterhin sollte für Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus eine Konzentratiosabhängigkeit hinsichtlich der Inhibition der T-Zellproliferation gezeigt werden: Dazu wurden DCs und T-Zellen in einer Ratio von 8000/100.000 Zellen inkubiert und log10 Verdünnungsreihen von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus eingesetzt (s. Tabelle 4-3). In allen Versuchen wurden parallel unbehandelte Kontroll-MLR angesetzt. Die Mikrotiterplatten wurden für 5 Tage im Brutschank inkubiert; zur MLR wurde für die letzten 18 Stunden der Inkubation 3H-markiertes Thymidin hinzugegeben 42 (0,005 mCi). Während der Zellproliferation wurde das 3H-Thymidin in die DNA sich teilender T-Lymphozyten eingebaut. Die Auswertung der Zellproliferation erfolgte im Scintillationszähler: Hiermit wurde die vom inkorporierten 3 H-Thymidin ausgehende β-Strahlung als Maß für die stattgefundene T-Lymphozytenproliferation.gemessen. Tab. 4-3: Versuchsübersicht MLR; Konzentration der verwendeten Pharmaka in nmol/l bzw. µmol/l Prä-Inkubation Koinkubation Dosis-Wirkung 10 µmol/l 10 µmol/l 10, 100,10-1,10-2,10-3,10-4 µmol/l Rapamycin 1 µmol/l 1, 10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5 µmol/l Takrolimus 100 nmol/l 100, 10, 1, 10-1,10-2,10-3 nmol/l Cilomilast Cilomilast Rapamycin Takrolimus 3 H-Thymidin (Tag 5) T-Lymphozyten Dendritische Zellen Messung 18 h der Proliferation Abb. 2-3: Schematische Darstellung der MLR 43 3.4 In-vivo-Versuche zur allergischen Kontaktdermatitis 3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell Eine Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen TDI (Toluen-2,4- diisocyanat) erfolgte über eine topische Applikation von TDI (in Aceton gelöst) auf die rasierte Bauchhaut an 4 aneinanderfolgenden Tagen (s. Abb. 3-3). An Tag 1 wurden 100 µl der 5% TDI-Lösung topisch appliziert, an den Tagen 2-4 jeweils 50 µl. Zusätzlich wurde an den Tagen 1-3 die Hornschicht der Epidermis der rasierten Bauchhaut vor TDI-Applikation mittels Adhäsiv-Klebestreifen abgestrippt, um ein besseres Eindringen des TDI in die Haut zu gewährleisten. An Tag 21 erfolgte die Challenge der sensibilisierten Mäuse; hierfür wurden 20 µl einer 0,5% TDI-Lösung auf die äußere und innere Ohrseite appliziert. Die Mäuse wurden dann in Abhängigkeit von der Stärke der inflammatorischen Reaktion des Ohres in low-und high-responder gleichmäßig aufgeteilt, so daß in jeder Versuchsgruppe die Anzahl der low-und high-responder-Tiere identisch war. Die Challenge des kontralateralen Ohres erfolgte an Tag 28. Parallel wurde eine Vehikelkontrolle durchgeführt. Tage 1-4:Sensibilisierung Tag 21: Challenge I; MEST I Tag 27: Challenge II; Behandlung I Tag 28: Behandlung II; MEST II; Organkultur Entnahme der Lnn. Auriculares für LLNA Abb. 3-3: Schematische Darstellung des TDI-Modells 44 3.4.2 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im allergischen Entzündungsgeschehen Durch die Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen TDI und Challenge der allergischen Reaktion wurde eine allergische, aseptische Entzündungsreaktion der Ohren hervorgerufen. In Vorversuchen wurden Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf den Applikationswegen topisch, intraperitoneal und per os vergleichend verabreicht (Tabellen 5-, 6-, 7-, 8-3). In den darauf folgenden Hauptversuchen wurde Cilomilast topisch, Takrolimus topisch und intraperitoneal verabreicht (Tabellen 9- und 10-3). Um zu untersuchen, welchen Einfluß der Immunstatus der Versuchstiere auf die Wirksamkeit der Pharmaka ausübt, wurden für den 1. Hauptversuch bereits aus vorherigen TDI-Versuchen die Versuchstiere geboostert, während für den 2. Hauptversuch die Versuchstiere erstmalig mit TDI sensibilisiert wurden. Die Behandlung der Tiere erfolgte an den Tagen 27 und 28 des Allergiemodells; die Behandlung an Tag 28 erfolgte 2 Stunden vor der TDI-Challenge (Ausnahme: Applikation von ProtopicR 30 Minuten nach TDI-Challenge, da die Salbe sonst die TDI-Penetration verhindert). 16 Stunden nach der letzten Behandlung der Mäuse wurden die Ohren im Skin-Migration-Assay kultiviert. Tab. 5-3: Übersicht über die Lösungsvermittlung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus; Vehikelkontrolle entspricht der jeweiligen Lösungsvermittlung ohne Zusatz von Pharmaka 1)Bäumer et al. (2003a) ; 2)Carlson et al. (1993) ;3)Duncan (1994) ; 4)Hackstein et al. (2003) ; 5)Salerno et al. (1998) per os intraperitoneal Cilomilast Rapamycin Takrolimus Miglyol (10 ml/kg)1 Ethanol/Olivenöl Ethanol/Olivenöl (1:9)2 (1:9)3 gelöst in: gelöst in: 10% PEG 300, 0,5% Hydroxyethyl- Ethanol+Tween 80, Ethanol+Tween 80, topisch zellulose PEG 300, H2O PEG 300, H2O (10 ml/kg)1 (1:2:20:19)4 (1:2:20:19)5 Aceton/DMSO gelöst in Ethanol; gelöst in Ethanol; (1:9)1 Aceton/DMSO (1:1) Aceton/DMSO (1:1) 45 Tab. 6-3: Behandlungsschema Vorversuch, perorale Applikation Vehikelkontrolle Cilomilast Rapamycin Takrolimus Tag 27 Vehikel 20 mg/kg p.o. 20 mg/kg p.o. 2,5 mg/kg p.o. Tag 28 Vehikel 20 mg/kg p.o 20 mg/kg p.o 2,5 mg/kg p.o Tab. 7-3: Behandlungsschema Vorversuch, intraperitoneale Applikation Vehikelkontrolle Cilomilast Rapamycin Takrolimus Tag 27 Vehikel 20 mg/kg i.p. 20 mg/kg i.p. 2,5 mg/kg i.p. Tag 28 Vehikel 20 mg/kg i.p. 20 mg/kg pi.p. 2,5 mg/kg i.p. Tab. 8-3: Behandlungsschema Vorversuch, topische Applikation Vehikelkontrolle Rapamycin Takrolimus Tag 27 Vehikel 3% Lösung topisch Tag 28 Vehikel 1% Lösung topisch ProtopicR 0,1% Vehikelkontrolle Cilomilast Takrolimus Tag 27 Vehikel 3% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p. Tag 28 Vehikel 3% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p. Tab. 9-3: Behandlungsschema Hauptversuch 1 0,5% Lösung topisch 46 Tab. 10-3: Behandlungsschema Hauptversuch 2 Vehikelkontrolle Cilomilast Takrolimus Tag 27 Vehikel 5% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p. Tag 28 Vehikel 5% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p. und 0,5% Lösung topisch; ProtopicR 0,1%; 2 h nach TDIChallenge Vehikel vor Kultivierung 5% Lösung topisch 3.4.3 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im nichtinflammatorischen Modell In diesem Versuchsansatz wurden Mausohren mit 20 µl 3%iger Cilomilast-Lösung behandelt, auf die Innen- und Außenfläche der Ohren der Kontrolltiere wurden jeweils 10 µl Vehikel-Lösung (Aceton/DMSO 9:1) appliziert. 2 Stunden später wurden die Tiere getötet und die Ohren im Skin-Migration-Assay kultiviert. Unmittelbar vor der Organkultur wurden die Ohren nochmals mit 20 µl 3%iger Cilomilast-Lösung behandelt. 3.4.5 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST) Prinzip des MEST ist die Erfassung der TDI-induzierten allergischen Entzündungsreaktion am Ohr. Dabei wurde die Ohrdicke mit einem Kutimeter (Mitutoyo, Neuss) gemessen. Die Durchführung des MEST erfolgte in Anlehnung an GAD et al. (1986). Zunächst erfolgte eine Messung an Tag 21 vor und nach TDI-Challenge, um die Mäuse einzuteilen: high-responder-Tiere waren solche, die eine starke Entzündungsreaktion (gemessen an der Ohrschwellung) aufwiesen, low-responderTiere solche mit einer entsprechend geringeren Ohrschwellung. Low- und High- 47 responder-Tiere wurden somit erfaßt und anschließend gleichmäßig auf die Versuchsgruppen aufgeteilt. Die nächste Messung erfolgte an Tag 28, 16 Stunden nach der 2. TDI-Challenge, um einen Effekt der verwendeten Pharmaka hinsichtlich der Inhibition der Ohrschwellung und somit der Entzündungsreaktion zu zeigen. 3.4.6 Skin-Migration-Assay Prinzip dieses Assays ist es, dermale und epidermale DCs der Maushaut zu gewinnen und ihr Migrationsverhalten unter Einfluss von Immunmodulatoren zu untersuchen. Die Durchführung erfolgte in Anlehnung an ORTNER et al. (1996). Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet, die Ohren abgetrennt und für ca. 10 min. in 70% Ethanol-Lösung desinfiziert und anschließend luftgetrocknet. Mittels zweier Pinzetten wurden die dorsale und ventrale Ohrhälfte voneinander getrennt. Die dorsale, knorpelfreie Ohrhälfte wurde - mit der Epidermis nach oben zeigend - auf ein dreibeiniges Edelstahlnetz in eine 24-well Platte gelegt und das well mit 1,3 ml Kulturmedium (RPMI-Medium mit Zusatz von FKS 10%, Pen-Strep und 50 ng/ml MIP-3β) gefüllt (s. Abb. 4-3). Diese Organkultur wurde über 3 Tage im Brutschank bei 37°C inkubiert. Die Ohrexplantate wurden täglich in eine neue Platte mit frischem Medium umgesetzt. Am 3. Tag wurden die Medien von Tag 2 und 3 gepoolt und zentrifugiert (1000 g, 4°C, 10Minuten), die Überstände verworfen und die ausgewanderten Zellen in der Neubauer-Kammer ausgezählt. Die Mausohren wurden anschließend gewogen und bei –80°C eingefroren. Die Anzahl ausgewanderter Zellen bzw. ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe errechnete sich nach folgenden Formeln: Anzahl ausgewanderter Zellen = gez. Zellen/4 x 3 x 10.000 x (Restvolumen/1000) Anzahl ausgewanderter Zellen/mg Ohrgewebe = ausgewanderte Zellen/Ohrgewicht 48 Haut-Explantat Epidermis Metall-Tisch Medium Langerhans-Zelle/DCs der Haut Abb. 4-3: Schematische Darstellung des Skin-Migration-Assays 3.4.7 Local-Lymph-Node-Assay (LLNA) Der LLNA ist eine Methode, um die Proliferationsrate von T-Lymphozyten eines regionalen Lymphknotens nach Stimulation durch antigenpräsentierende dendritische Zellen post mortem zu messen. Die Durchführung dieser Methode erfolgte in Anlehnung an KIMBER und WEISENBERGER (1989). Funktioneller Parameter ist hier das gemessene Lymphknotengewicht, welches ein Maß für die durch DCs induzierte stattgefundene T-Zellproliferation ist. Die zu untersuchenden regionalen Lymphknoten wurden entnommen und anschließend deren Gewicht bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lnn. auriculares der TDIsensibilisierten Mäuse verwendet. 49 3.4.8 Aufbereitung der Zymographie-Proben Die tiefgefrorenen Mausohren (s. 3.4.6) wurden in einer Keramikreibschale mit flüssigen Stickstoff überschichtet und zerrieben; das Ohrhomogenat wurde anschließend in Eppendorfgefäße überführt, in 150 µl PBS aufgenommen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden anschließend durchmischt und zentrifugiert (3000 x g, 10 Minuten, 4°C). Die Überstände wurden entnommen und eine Proteinbestimmung durchgeführt. Alle Proben wurden auf die gleiche Proteinkonzentration eingestellt. 3.4.9 Biorad-Proteinbestimmung Prinzip der verwendeten Protein-Bestimmung ist eine Farbänderung der Proteinlösung nach Zugabe eines Farbstoffes: Gelöstes Protein wurde in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und mit der Reaktionsreagenz vermischt. Die Wellenlänge des Absorbtionsmaximum des sauren Farbstoffs verschiebt sich von 465 nm nach 595 nm, wenn der Farbstoff an vorhandenes Protein bindet. Nach fünfminütiger Inkubation auf einem Horizontalschüttler wurden die Proben photometrisch bei 595 nm Wellenlänge ausgewertet. Der Vergleich zu einer angelegten Kalibrationsreihe erlaubt eine Berechnung der absoluten Proteinkonzentration der Proben. Durchführung des Biorad-Assay: • Ansetzen einer Kalibrationsreihe in 1:2 Verdünnungsschritten aus ProteinStandard (1 mg Protein/ml), ausgehend von 80 µg Protein/ml; je 160 µl Proteinlösung wurden in die Mikroititerplatte pipettiert • 1 µl der Probenlösung wurden in die Mikrotiterplatte pipettiert, 159 µl RPMIMedium zugeben und mit der Pipette gemischt • zu jeder Probe bzw. Kalibrationspunkt wurden 40 µl Biorad-Reagenz hinzugeben und mit der Pipette gemischt • die Platte wurde für 5-10 Minuten inkubiert und danach im Microplate-Reader bei 570 nm Wellenlänge ausgelesen 50 3.4.10 Zymographie Zum Nachweis der proteolytischer Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen in den Überständen der Mausohr-Homogenate wurde in Anlehnung an KLEINER und STELER-STEVENSON (1993) eine Zymographie mit Gelatine als Substrat im SDSPolyacrylamid-Gel durchgeführt Die Zymographie entspricht einer Elektrophorese unter nicht–reduzierenden Bedingungen mit Zusatz von 1 mg/ml Gelatine zum 7,5%Acrylamid haltigen Gel. Das Zymographie-Gel wurde im Gradienten-Gießstand gegossen und bei Raumtemperatur bis zur Polymerisation inkubiert. Anschließend wurde das Gel in die Elektrophoresekammer eingespannt und die Kammer mit Elektrodenpuffer gefüllt. Die Probentaschen des Gels wurden mit jeweils 20 µl Probe und 20 µl Probenpuffer gefüllt. Zur Darstellung des Molekulargewichts der aufgetrennten Proben wurde zusätzlich zu den Proben ein Molekulargewichtsstandard auf das Gel aufgetragen. Die Proben wurden anschließend bei einer Spannung von 200 mV in 2 Stunden aufgetrennt. Nach Beenden der Elektrophorese wurde das Gel 30 Minuten in Triton X (2,5 %) auf einem Schüttler zur Entfernung des SDS aus dem Gel gewaschen. Anschließend wurde das Gel für weitere 30 Minuten auf dem Schüttler mit dem Entwicklungspuffer inkubiert und danach mit frischem Entwicklungspuffer 16 Stunden bei 37°C im Hybridisierungsofen inkubiert, wobei die als Proteolyse-Substrat angebotene Gelatine verdaut wurde. Das Gel wurde nun mit Coomassie-Brillantblau (5 %) 30 Minuten auf dem Schüttler gefärbt und viermal für 30 Minuten mit Entfärbelösung gewaschen, bis sich weiße Banden gegen den blauen Hintergrund des Gels abzeichneten. Das Gel wurde für 10 Minuten in Geltrocknungslösung gelegt und zwischen 2 Streifen Einmachhaut in einem Kunstoffrahmen 3 Tage unter dem Abzug getrocknet. Zur quantitativen, Zymographie–Gele gespeichert. eingescannt Anschließend Grauwertbestimmung der densitometrischen Auswertung und erfolgte wurden die in einem Fotoverarbeitungsprogramm mit einer Auswertungssoftware gelatinolytischen Banden des Gels und eine des Gelhintergrundes. Die ermittelten Grauwerte wurden schließlich in optische Dichte (OD) umgerechnet (OD = log10 [255/Grauwerte]) und als Grauwertdichte dargestellt. 51 Die Subtraktion der OD des Hintergrundes von der OD der gelatinolytischen Banden ergab die Netto-OD und war somit ein Maß für die gelatinolytische Aktivität der MMP-9. 3.5 Statistische Auswertung Die Ergebnisse der Migrations-Versuche wurden graphisch als Median-Boxen dargestellt, mit Angabe des Median, 1. und 3. Quartils sowie der oberen und unteren Extremwerte. Die Anzahl (n) nennt den Stichprobenumfang verwendeter MausohrExplantate, die einer identischen Behandlung unterzogen wurden. Die übrigen Ergebnisse (Mouse-Ear-Swelling-Test, Lymphknotengewichte, MixedLeukocyte-Reaktion, TNF-α- und IL-12-ELISA) wurden mit Angabe von Mittelwert ± S.D dargestellt. Je nachdem, ob eine oder mehrere Behandlungsgruppen mit der Kontrollgruppe verglichen wurden, erfolgte die statistische Auswertung der Ergebnisse in unterschiedlicher Art und Weise: Beim Vergleich einer Behandlungsgruppe mit der Kontrolle wurden die Ergebnisse mit Hilfe des Rangsummen-Tests für ungepaarte Stichproben nach Mann und Whitney (U-Test) auf signifikante Unterschiede hin überprüft. Bei einem „many-one“-Vergleich wurde zunächst eine Varianz-Analyse (ANOVA) durchgeführt; als post-hoc-Test wurde schließlich der Rangsummen-Test eingesetzt, der eine Adjustierung des α-Fehlers mittels Bonferroni-Korrektur beinhaltete. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm SigmaStatR; dabei galt eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% als schwach signifikant, eine von 1% als signifikant und eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,1% als hoch signifikant. Die Einzelwerte der dargestellten Ergebnisse sind in den Anhangstabellen aufgeführt. 52 4 Ergebnisse 4.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration dendritischer Zellen 4.1.1 Nicht-Inflammatorisches Modell Im nicht-inflammatorischen Modell des Skin-Migration-Assays wurde eine 3%ige Cilomilast-Lösung topisch appliziert. Der Vergleich mit der Vehikelkontrolle zeigt, daß die Migration von DCs aus den Ohr-Explantaten durch Cilomilast-Behandlung in 4 unabhängigen Experimenten signifikant gehemmt wurde (1-4). Abbildung 1-4: Signifikante Hemmung der DC-Migration in vier unabhängigen Versuchen im nichtinflammatorischen Modell durch topische Cilomilast-Applikation (3%ige Lösung); a) Vehikelkontrolle, b) Cilomilast behandelte Ohren; Zusatz von MIP-3β zur Organkultur; Einzelwerte siehe Tab. 1-9; ** p< 0,01; n=6; 53 4.1.2 TDI–Kontaktallergiemodell In diesem Inflammationsmodell wurden in Vorversuchen zunächst Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus jeweils oral und intraperitoneal appliziert; weiterhin wurden die Makrolide Rapamycin und Takrolimus in ihrer topischen Wirkung miteinander verglichen. Keiner der Vorversuche zeigte einen Effekt der eingesetzten Pharmaka hinsichtlich einer Migrationsinhibition von dendritischen Zellen (Abb. 2-, 3-, 4-4). In den anschließenden Hauptversuchen wurden Cilomilast und Takrolimus eingesetzt. Cilomilast (3%ige Lösung) und Takrolimus zeigent keinen Effekt, wohingegen Cilomilast als 5%ige Lösung die DC-Migration im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikant (p<0,01) inhibierte (Abb. 5-, 6-, 7-und 9-4). ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Vehikel Cilomilast Tacrolimus Rapamycin Abbildung 2-4: Vorversuch im TDI-Modell; perorale Applikation von Cilomilast (20mg/kg), Takrolimus (2,5 mg/kg) und Rapamycin (20mg/kg); keine signifikante Hemmung der DC-Migration; Einzelwerte siehe Tab. 2-9; n=3; 54 ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Vehikel Cilomilast Tacrolimus Rapamycin Abbildung 3-4: Vorversuch; intraperitoneale Applikation von Cilomilast (20mg/kg), Takrolimus (2,5 mg/kg) und Rapamycin (20mg/kg); keine signifikante Hemmung der Migration, jedoch tendentielle Migrationshemmung durch Cilomilast und Takrolimus; Einzelwerte siehe Tab. 2-9; n=3; ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Vehikel Rapamycin Tacrolimus Abbildung 4-4: Vorversuch; topische Applikation von Rapamycin (3%-Lösung) und Takrolimus (ProtopicR 0,1%); keine signifikante Hemmung der Migration; Einzelwerte siehe Tab. 2-9; n=3; 55 ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Vehikel Cilomilast Tacrolimus Abbildung 5-4: 1. Hauptversuch; topische Applikation von 3%iger Cilomilast-Lösung; Takrolimus intraperitoneal (2,5 mg/kg) und topisch (0,5%) appliziert; keine signifikante Hemmung der Migration; Einzelwerte siehe Tab. 3-9; n=8 ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 ** 400 200 0 Vehikel Cilomilast Tacrolimus Abbildung 6-4: 2. Hauptversuch; topische Applikation von 5%iger Cilomilast-Lösung; Takrolimus intraperitoneal (2,5 mg/kg) und topisch (ProtopicR 0,1% und 0,5%ige Lösung) appliziert; Zusatz von MIP-3β zur Organkultur; signifikante Hemmung der Migration durch Cilomilast; Einzelwerte siehe Tab. 4-9; ** P< 0.01; n=6 56 DCs Abbildung 7-4 DCs Abbildung 8-4 DCs Abbildung 9-4 Abbildungen 7-, 8-, 9-4: Lichtmikroskopische Aufnahmen von ausgewanderten DCs an Tag 3 der Organkultur des 2. Hauptversuchs; 7-4) Vehikelkontrolle; 8-4) Takrolimus behandelte Ohren; 9-4) Cilomilast behandelte Ohren; deutlich sichtbar weniger ausgewanderte DCs bei Cilomilast behandelten Ohren; Vergrößerung x 200 57 4.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die MMP-9-Expression 4.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell Durch die topische Behandlung der Ohren mit Cilomilast-Lösung (3%) wurde neben der Migration der DCs auch die Expression der MMP-9 beeinflußt. Im Vergleich zur Vehikelkontrolle war die Expression der aktiven MMP-9 Form im zymographischen Bild kaum sichtbar. Die densitometrische Auswertung der Banden der aktiven MMP-9-Form ergab im Vergleich zur Vehikelkontrolle eine signifikante Hemmung durch Cilomilast (s. Abb. 10-4 und 11-4). Pro-MMP-9 Aktive MMP-9 Kontrolle Cilomilast Abbildung 10-4: Ausschnitt aus gescanntem Zymographie-Gel, inverse Darstellung der Banden; sichtbare Hemmung der Expression der aktiven Form der MMP-9 durch Cilomilast; repräsentatives Bild von 3 durchgeführten Zymographien 58 ** Grauwert-Dichte 60 50 40 30 20 10 0 Kontrolle Cilomilast Abbildung 11-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele; signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Cilomilast; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 7-9; **p< 0,05; n=6; 4.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell In den durchgeführten Vorversuchen zeigte sich keine Modulation der MMP-9Aktivität durch orale, intraperitoneale und topische Applikation von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus (Abb. 12-4). Abb. 13-4 stellt die Aktivität der MMP-9 im 1. Hauptversuch dar. Die densitometrische Auswertung ergab, daß durch die topische Applikation von Cilomilast-Lösung (3%) und Applikation von Takrolimus (systemisch und topisch) die Expression der aktiven Form der MMP-9 schwach signifikant bzw. signifikant gehemmt wurde. Im 2. Hauptversuch wurde die aktive MMP-9-Form nur durch topisch applizierte Cilomilast-Lösung (5%), jedoch nicht durch Applikation von Takrolimus (systemisch und topisch) schwach signifikant gehemmt (Abb. 14-4). 59 90 80 Grauwertdichte 70 60 50 40 30 i.p. p.o. topisch 20 10 0 Vehikel Rapamycin Takrolimus Cilomilast Abbildung 12-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele der Vorversuche; keine Hemmung der MMP-9-Aktivität durch Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 7-9; n=6 ** * 60 Grauwertdichte 50 40 30 20 10 0 Vehikel Cilomilast Takrolimus Abbildung 13-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele des 1. Hauptversuchs; signifikante bzw. schwach signifikante Hemmung der aktiven MMP-9 Form durch Takrolimus und Cilomilast; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 8-9; *p< 0,05; **p< 0,01; n=6 60 * 10 Grauwertdichte 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Vehikel Cilomilast Takrolimus Abbildung 14-4: Densitometrische Auswertung von MMP-9-Banden der Zymographie-Gele des 2. Hauptversuchs; schwach signifikante Hemmung der aktiven MMP-9 Form durch 5%ige CilomilastLösung; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 8-9; *p< 0,05; n=6 4.3 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Vorversuche In den beschriebenen Vorversuchen wurden Rapamycin und Takrolimus systemisch (i.p. und p.o.) und topisch, Cilomilast nur systemisch verabreicht. Wie aus Abb. 15-4 ersichtlich, wurde die Ohrschwellung durch die verwendeten Pharmaka im Vergleich zur Vehikelkontrolle nach 16 Stunden nicht signifikant gehemmt; dies gilt für sowohl für die systemische als auch die topische Applikation. Allein Takrolimus führte zu einer tendentiellen Inhibition der Ohrschwellung. 61 180.00 Ohrschwellung [µm] 160.00 140.00 120.00 100.00 80.00 i.p. Appl. 60.00 p.o. Appl. 40.00 top. Appl. 20.00 0.00 Vehikel Rapamycin Takrolimus Cilomilast Abbildung 15-4: Messung der Ohrschwellung [µm] 16 h nach TDI-Challenge und Behandlung; keine signifikante Hemmung der Ohrschwellung durch die eingesetzten Pharmaka (Rapamycin 20mg/kg systemisch, 3%ige Lösung topisch; Takrolimus 2,5 mg/kg systemisch, 0,1% ProtopicR; Cilomilast 20 mg/kg systemisch); Einzelwerte siehe Anhangstabelle 4-9 4.4 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Hauptversuche Wie aus der Abb. 16-4 ersichtlich, kommt es nach kombinierter systemischer und topischer Verabreichung von Takrolimus zu einer hoch signifikanten Inhibition der TDI-induzierten Ohrschwellung; durch topische Gabe der Cilomilast-Lösung (3%) wurde die Ohrschwellung nicht signifikant gehemmt. Im 2. Hauptversuch konnte die Inhibition der Ohrschwellung durch Gabe von Takrolimus reproduziert werden; des weiteren wird aus Abb. 16-4 ersichtlich, daß Cilomilast topisch als 5%ige Lösung die Ohrschwellung signifikant hemmt. 62 ** *** 180.00 Ohrschwellung [µm] 160.00 ** 140.00 120.00 100.00 80.00 60.00 40.00 1. Hauptversuch 20.00 2. Hauptversuch 0.00 Vehikel Cilomilast FK 506 Abbildung 16-4: Einfluß von Cilomilast und Takrolimus auf die TDI-induzierte Ohrschwellung; hoch signifikante bzw. signifikante Inhibition der Ohrschwellung durch Takrolimus im 1. und 2. Hauptversuch; keine signifikante Hemmung der Ohrschwellung durch 3% Cilomilast-Lösung im 1. Hauptversuch; signifikante Hemmung der Ohrschwellung durch 5% Cilomilast-Lösung im 2. Hauptversuch; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 5-9; **p< 0,01; ***p< 0,001; 1. Hauptversuch n=8, 2. Hauptversuch n=6 4.5 Ergebnisse des Local-Lymphnode-Assays der In-vivo-Hauptversuche Abb. 17-4 zeigt die Lymphknotengewichte der TDI-sensibilisierten Tiere nach Cilomilast bzw. Takrolimus Behandlung im Vergleich zur Vehikelkontrolle. In diesem Versuchsansatz wurde das Gewicht beider Lnn. auriculares bestimmt, da beide Ohren behandelt wurden; allein Takrolimus führte zu einem hoch signifikant niedrigerem Lymphknotengewicht im Vergleich zur Vehikelkontrolle. Im 2. Hauptversuch wurde die Kontaktallergie am Ohr nur einer Körperhälfte provoziert, daher wurde für den LLNA nur der regionale Lymphknoten des behandelten Ohres einer Körperhälfte untersucht. Im Vergleich zur Vehikelkontrolle waren die Lymphknoten mit Takrolimus behandelter Tiere signifikant, die von Cilomilast behandelten Tieren schwach signifikant leichter. 63 Lymphknotengewicht [mg] *** 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 Vehikel Cilomilast Takrolimus Abbildung 17-4: Gewichte der Lnn. auriculares TDI-sensibilisierter Tiere, 1. Hauptversuch; hoch signifikant niedrigeres Gewicht bei Takrolimus behandelten Tieren (topisch und systemisch) im Vergleich zur Vehikelkontrolle; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 6-9; ***p< 0,001; n=8 ** * Lymphknotengewicht [mg] 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 Vehikel Cilomilast Takrolimus Abbildung 18-4: Gewichte der Lnn. auriculares TDI-sensibilisierter Tiere, 2. Hauptversuch; signifikant niedrigere Gewichte bei Takrolimus (topisch und systemisch) behandelten Tieren, schwach signifikant niedrigere Gewichte bei Cilomilast (5%ige Lösung topisch) behandelten Tieren; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 6-9; *p< 0,05; **p< 0,01; n=6 64 4.6 Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die DC-induzierte T-Lymphozyten-Proliferation in der MLR 4.6.1 Koinkubation von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle konnte durch eine Koinkubation der MLR mit Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus eine signifikante Hemmung der TZell-Proliferation erzeugt werden (Abbildungen 19-, 20- und 21-4). 4.6.2 Konzentrationsabhängige Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus In den Abbildungen 22-, 23- und 24-4 ist die jeweilige KonzentrationsWirkungskurve der benutzten Pharmaka hinsichtlich der Hemmung der T-ZellProliferation dargestellt: Cilomilast hemmte die T-Zell-Proliferation schwach signifikant ab einer Konzentration von 10 µmol/l, bei Rapamycin und Takrolimus war die Inhibition der T-Zell-Proliferation bei allen eingesetzten Konzentrationen signifikant. 4.6.3 Prä-Inkubation von Cilomilast Der Effekt der Präinkubation von DC und T-Zellen mit Cilomilast ist in den Abbildungen 25- und 26-4 dargestellt. Der Versuchsansatz mit präinkubierten TZellen zeigte bei jeder eingesetzten DC/T-Zell Ratio eine signifikante Inhibition der T-Zell Proliferation, wohingegen durch die Präinkubation der DCs eine signifikante Hemmung erst ab einer DC/T-Zell Ratio von 2500/100.000 auftrat. 65 ** 80 Kontrolle Cilomilast ** 3 H-Thymidin [cpm] x 10 3 70 60 50 ** 40 30 20 * * 10 0 312 625 1250 Anzahl DCs 2500 5000 10000 Abbildung 19-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Cilomilast (10 µmol/l); schwach signifikanter bzw. signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Koinkubation der MLR mit Cilomilast (10 µmol/l); Einzelwerte siehe Anhangstabelle 9-9a; dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte siehe Anhangstabellen 9-9b, c); *p< 0,05; **p< 0,01; n=5 50 3 H-Thymidin [cpm] x 10 3 Kontrolle Rapamycin 40 ** 30 20 10 0 312 625 1250 Anzahl DCs 2500 5000 10000 Abbildung 20-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Rapamycin (1 µmol/l); signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Koinkubation der MLR mit Rapamycin; Einzelwerte s. Tab. 11-9; dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s. Tab. 11-9b, c); **p< 0,01; n=5 66 A 50 3 H-Thymidin [cpm] x 10 3 Kontrolle Takrolimus 40 30 ** ** 20 10 0 312 625 1250 Anzahl DCs 2500 5000 10000 Abbildung 21-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Takrolimus (100 nmol/l); signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Koinkubation der MLR mit Takrolimus; Einzelwerte siehe Anhangstabelle 10-9a; dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte siehe Anhangstabellen 10-9b,c); **p< 0,01; n=5 3 3 H-Thymidin [cpm] x 10 24 20 16 12 8 * 4 0 Kontrolle 10 -3 10 -2 10 -1 Konzentration Cilomilast [µmol/l] 1 10 Abbildung 22-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen Cilomilast; schwach signifikante Inhibition ab einer Konzentration von 10 µmol/l Cilomilast (Einzelwerte s. Tab. 12-9a); dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (s. Tabellen 12-9b, c); *p=0,0317; n=5 67 60 40 30 ** ** 20 ** ** 3 H-Thymidin [cpm] x 10 3 50 ** 10 0 Kontrolle 10 - 4 10 - 3 10 - 2 Konzentration Rapamycin [µmol/l] 10 - 1 1 Abbildung 23-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen Rapamycin; signifikante Inhibition bei allen Konzentrationen; Einzelwerte s. Tab. 13-9a; dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s. Tabellen 13-9 b, c); **p< 0,01; n=5 80 3 H-Thymidin [cpm] x 10 3 70 60 50 40 30 ** ** 20 ** 10 ** ** 10 10 2 0 Kontrolle 10 - 2 10 - 1 1 Konzentration Takrolimus [nmol/l] Abbildung 24-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen Takrolimus; signifikante Inhibition bei allen eingesetzten Konzentrationen (Einzelwerte s. Tab. 13-9a);dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte siehe Tabellen 13-9b,c); **p<0,01; n=5 68 110 Kontrolle Cilomilast 90 80 70 60 50 40 30 ** 3 H-Thymidin [cpm] x 10 3 100 20 10 ** ** 0 312 625 1250 Anzahl DCs 2500 5000 10000 Abbildung 25-4: 3H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei DC-Prä-Inkubation mit Cilomilast (10 µmol/l, 1 Stunde); signifikante Inhibition der T-Zell-Proliferation ab einer DC/T-Zell Ratio von 2500/100.000 (Einzelwerte s. Tab. 15-9a); dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s. Anhangstabellen 15-9b, c); **p< 0,01; n=5 70 3 3 H-Thymidin [cpm] x 10 60 Kontrolle Cilomilast 50 40 30 ** 20 10 0 312 Abbildung 26-4: 625 1250 Anzahl DCs 2500 5000 10000 3 H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei T-Zell-Prä-Inkubation mit Cilomilast (10 µmol/l, 1 Stunde); signifikante Inhibition der T-Zell-Proliferation bei jeder DC/T-Zell Ratio (Einzelwerte s. Tab. 16-9a); dieser Versuch wurde zweimal reproduziert (Einzelwerte s. Anhangstabellen 16-9b, c); **p< 0,01; n=5 69 4.7 Ergebnisse der FACS-Analyse 4.7.1 Identifizierung der in vitro generierten dendritischen Zellen Um zu überprüfen, welchen Gehalt an DCs die in Anlehnung an LUTZ et al. (1999) generierten Zellen aufweisen, wurde eine FACS-Analyse der Zellen an Tag 10 der Kultivierung durchgeführt. CD11c- und MHC-II-positive Zellen wurden dabei als DCs identifiziert (s. Abb. 27-4). MHC II CD11c Abbildung 27-4: FACS-Analyse bone-marrow-derived DCs nach 10 tägiger Kultur; gefüllte Histogramme stellen den Anteil CD11c+ bzw. MHC-II+ DCs, die offenen Histogramme die Isotypkontrolle dar; der hohe Anteil CD11c+ - und MHC-II+ -Zellen verdeutlicht die Reinheit der DC-Kultur 70 4.7.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle in vitro generierter DCs 4.7.2.1 Einfluß auf die CD80-Expression An Tag 10 der Kultur exprimierent 48,18% der unbehandelten Zellen das CD80Oberflächenmolekül, nach LPS-Stimulation erhöhte sich der Anteil auf 75,46%. Die mit Cilomilast (10 µmol/l) behandelten und mit LPS stimulierten DCs exprimierten zu 74,78% CD80, bei Rapamycin (1 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l) waren es 88,33% bzw. 70,73% der DCs (s. Abb. 28-4). LPS Takrolimus Kontrolle Cilomilast Rapamycin Abbildung 28-4: Histogramm CD80+ DCs; Darstellung von Kontroll-DCs sowie LPS, Takrolimus, Cilomilast und Rapamycin behandelter DCs; deutliche Zunahme CD80+ DCs nach LPS-Stimulation, keine Beeinflussung von CD80 durch Testsubstanzen (Einzelwerte s. Anhangstabelle 17-9) 71 4.7.2.2 Einfluß auf die CD86-Expression Die Ergebnisse hinsichtlich der Beeinflussung der CD86-Expression sind ähnlich; auch hier erzeugte LPS eine Heraufregulation von CD86 (71,63% der DCs) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (29,39%). 68,29% der mit Cilomilast behandelten DCs exprimierten CD86, bei Rapamycin und Takrolimus waren es 82,84% bzw. 58,94% der DCs (s. Abb. 29-4). Takrolimus Kontrolle LPS Rapamycin Cilomilast Abbildung 29-4: Histogramm CD86+ DCs; Darstellung von Kontroll-DCs sowie LPS, Takrolimus, Cilomilast und Rapamycin behandelter DCs; deutliche Zunahme CD86+ DCs nach LPS-Stimulation, keine Beeinflussung von CD86 durch Testsubstanzen (Einzelwerte s. Anhangstabelle 17-9) 72 4.8 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPSinduzierte Produktion von TNF-α und IL-12 dendritischer Zellen Um den Einfluß der Testsubstanzen auf die Zytokinproduktion dendritischer Zellen von TNF-α und IL-12 zu untersuchen, wurden in vitro generierte DCs an den Tagen 9 und 10 der Kultivierung mit den Testsubstanzen inkubiert. Eine Stimulation der DCs mit LPS erfolgte an Tag 10, 30 Minuten vor der Inkubation der Testsubstanzen. Die Zytokinmessung in den Überständen erfolgte 24 Stunden später mittels ELISA. 4.8.1 Einfluß auf die TNF-α-Produktion Wie aus Abb. 30-4 ersichtlich, wurde die Produktion von TNF-α durch Gabe von LPS signifikant heraufreguliert. Durch Inkubation der DCs mit Cilomilast (10 µmol/l) und Rapamycin (1 µmol/l) wurde die LPS-induzierte TNF-α-Produktion der DCs signifikant inhibiert. Takrolimus (100 nmol/l) führte zu keiner signifikanten Hemmung der TNF-α-Produktion. 4.8.2 Einfluß auf die IL-12-Produktion Die Produktion von IL-12 seitens der DCs wurde durch LPS signifikant heraufreguliert. Durch Inkubation der DCs mit Cilomilast (10 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l) wurde die LPS-induzierte IL-12-Produktion der DCs signifikant inhibiert. Der Zusatz von Rapamycin (1 µmol/l) bewirkte keine Inhibition der IL-12-Produktion (s. Abb. 31-4). 73 ** ** ** 1200 TNF-alpha [pg/ml] 1000 800 600 400 200 0 Kontrolle LPS Cilomilast Rapamycin Takrolimus Abbildung 30-4: TNF-α-Produktion in vitro generierter DCs nach Stimulation mit LPS; signifikante Induktion der TNF-α-Produktion nach LPS-Stimulation; signifikante Inhibition der LPSinduzierten TNF-α-Produktion durch Cilomilast (10 µmol/l) und Rapamycin (1 µmol/l); Einzelwerte siehe Anhangstabelle 18-9; **p < 0,01; n=6 ** ** 200 IL-12 [pg/ml] 180 160 ** 140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrolle LPS Cilomilast Takrolimus Rapamycin Abbildung 31-4: IL-12-Produktion in vitro generierter DCs nach Stimulation mit LPS; signifikante Induktion der IL-12-Produktion nach LPS-Stimulation; signifikante Inhibition der LPS-induzierten IL-12Produktion durch Cilomilast (10 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l); Einzelwerte siehe Anhangstabelle 19-9; **p < 0,01; n=6 74 5 Diskussion Ziel dieser Arbeit war es die, pharmakologische Beeinflussung dendritischer Zellen zu bestimmen. Als Testsubstanzen kamen die immunmodulatorisch wirksamen Pharmaka Cilomilast, Takrolimus und Rapamycin zum Einsatz, deren Wirkung auf dendritische Zellen sowohl in vivo als auch in vitro untersucht werden sollte. Dabei sollten die In-vitro-Versuche zum besseren Verständnis der In-vivoVersuche beitragen und diese ergänzen. 5.1. Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration dendritischer Zellen 5.1.1 Nicht-inflammatorisches Modell Bereits TURNBULL und MACPERSON (2001) beschrieben eine In-vivo-SteadyState-Migration dendritischer Zellen. Die Migrationsergebnisse an unbehandelten Ohrexplantaten aus den eigenen Untersuchungen sind mit Angaben von ORTNER et al. (1996) vergleichbar. Die während der Trennung der dorsalen und ventralen Ohrhälfte einwirkenden Scherkräfte und die damit einhergehende Mikroinflammation verursachen eine Aktivierung der im Ohrgewebe vorhandenen Immun- und Entzündungszellen. Dies bewirkt schließlich die Migration von Langerhans-Zellen und dermalen DCs (ORTNER et al. 1996, RATZINGER et al. (2002), was im nichtinflammatorischen Migrations-Modell untersucht wurde. Ob es sich bei den migrierten DCs überwiegend um Langerhans-Zellen aus der Epidermis oder um dermale DCs handelt, ist in der Literatur nicht beschrieben. Versuche an humanen Haut-Explantaten jedoch zeigen, daß überwiegend Langerhanszellen und nicht dermale DCs migrieren (RATZINGER et al. 2002). Durch die topische Applikation des PDE4-Inhibitors Cilomilast (Lösung, 3%) wird die DC-Migration im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikant gehemmt. Die Gründe hierfür sind in der Inhibition der aktiven Form der MMP-9 (s. 4.2.1) und der Inhibition 75 der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNF-α (BÄUMER et al. 2003b), welche die Expression der MMPs regulieren (s. 2.2.2.1), durch Cilomilast zu sehen. Dabei ist anzunehmen, daß als Quelle der MMP-9 zum einen durch Scherkräfte aktivierte Keratinozyten (MAKELA et al. 1998), zum anderen Langerhanszellen und dermale dendritische Zellen in Frage kommen (KOBAYASHI 1997, RATZINGER et al. 2002). Die Expression und Aktivierung der MMP-9 dieser Zellen wird unter dem Einfluß von IL-1β und TNF-α heraufreguliert. Als Quelle der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNF-α werden Keratinozyten und dendritische Zellen diskutiert (WANG et al. 1997). Somit kommen als Zielzellen zur Vermittlung der Migrationsinhibition durch Cilomilast dendritische Zellen und Keratinozyten in Betracht, da sie beide PDE4 exprimieren (TENOR et al. 1995, GANTNER et al. 1999, CHUJOR et al. 1998). Aufgrund der beschriebenen Zusammenhänge wäre es denkbar, daß Cilomilast bereits an einem frühen Kontrollpunkt der Migration wirkt und durch Hemmung der PDE4 in aktivierten Keratinozyten (TENOR et al. 1995) deren Zytokinproduktion (TNF-α und IL-1β) inhibiert, mit der Folge, daß Adhäsionsmoleküle wie E-Cadherin nicht herunterreguliert und MMPs zur enzymatischen Proteolyse nicht heraufreguliert werden. Langerhanszellen und dermale DCs würden demnach nicht aktiviert und blieben an Ort und Stelle. Hinsichtlich der Hemmung der Zytokinproduktion und Regulation von E-Cadherin und MMPs ist für DCs ein gleichsinniger Wirkmechanismus für Cilomilast denkbar. Ob jedoch Cilomilast die Expression von MMP-9 direkt durch eine PDE4-Inhibition hemmt, kann mit den eigenen Assays nicht ausreichend untersucht werden. Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen lassen somit darauf schließen, daß der PDE4-Inhibitor Cilomilast die Migration dendritischer Zellen der Haut bereits unter nicht-inflammatorischen Bedingungen wirksam beeinflußt. 76 5.1.2 TDI–Kontaktallergiemodell In diesem Modell sollte unter inflammatorischen Bedingungen der Einfluß der immunwirksamen Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration dendritischer Zellen der Haut untersucht werden. Mit diesem Versuchsmodell verbunden sind zudem der LLNA, der MEST sowie die densitometrische Auswertung der MMP-9-Aktivität (Zymographie); diese Assays dienen als funktionelle Parameter einer erfolgten DC-Migration und anschließend erfolgter Induktion bzw. Auslösephase der dermalen Kontaktallergie. In Vorversuchen werden die Testsubstanzen oral und intraperitoneal appliziert, zudem erfolgt ein Vergleich von Rapamycin und Takrolimus nach topischer Applikation. Keine der verwendeten Substanzen kann in die durch TDI induzierte Migration dendritischer Zellen inhibieren. Dies geht einher mit den Ergebnissen zymographischer Untersuchungen (s. 4.2.2), denn die densitometritische Auswertung ergibt keine sichtbare Inhibition der MMP-9-Aktivität durch die verwendeten Pharmaka. Die Ergebnisse des MEST verdeutlichen zudem, daß auch die DC-T-ZellInteraktion nicht wirksam beeinflußt wird, da die allergische Immunreaktion in der Auslösephase durch den Einsatz der Testsubstanzen nicht verhindert wird und sich das klinische Bild der Kontaktallergie ungehindert entwickelt. Im Vergleich der Substanzen ergeben sich jedoch Unterschiede: Während Cilomilast und Rapamycin hinsichtlich einer Beeinflussung der Ohrschwellung keinen Effekt zeigen, ist bei Takrolimus ein inhibitorischer Einfluß zu erkennen, wenn auch nur tendentiell. Vermutlich ist die ausbleibende Wirkung der Pharmaka in den Vorversuchen durch die pharmakokinetischen Eigenschaften der Testsubstanzen sowie das Behandlungsschema zu erklären. So ließe sich bei Rapamycin die fehlende Wirkung durch die schlechten Bioverfügbarkeit nach oraler Aufnahme (15%) erklären. Der ausgebliebene Effekt von Cilomilast und Takrolimus nach alleiniger systemischer Verabreichung könnte mit der verwendeten Dosis erklärt werden. Der Einsatz höherer, eventuell wirksamer Dosierungen birgt das Risiko der Arzneimittelunverträglichkeit und wurde nicht durchgeführt. Im Vergleich zum SkinMigration-Assay unter nicht-inflammatorischen Bedingungen zeigen sich im TDIModell bei den unbehandelten Vehikelkontrollen 77 höhere Migrationsraten dendritischer Zellen. Dies bestätigt, daß die DC-Migration unter inflammatorischen Bedingungen heraufreguliert wird (KOBAYASHI 1997). In Hauptversuchen wurden Cilomilast und Takrolimus verwendet. Da Rapamycin in den im TDI-Modell eingesetzten Dosierungen unabhängig von der Applikationsart (per os, topisch, intraperitoneal) – anders als im TNCB-Modell beschrieben (SALERNO et al. 1998) – keinen wirksamen Effekt zeigte, wurde es nicht weiter mit einbezogen. 5.1.3.1 Einfluß von MIP-3β auf die DC-Migration KELLERMANN et al. (1999) postulieren einen chemotaktischen Effekt von MIP-3β während der Migration auf dendritische Zellen. Dies kann durch die eigenen Untersuchungen bestätigt werden: Vergleicht man die Migrationsraten der Vehikelkontrollen, so fällt auf, daß diese in den Hauptversuchen höher ausfielen als in den Vorversuchen. Vermutlich ist dieser Effekt in den Hauptversuchen auf den Zusatz von MIP-3β zur Organkultur zurückzuführen. 5.1.3.2 Cilomilast Die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays, der Zymographie, MEST sowie LLNA des 2. Hauptversuches geben Hinweise auf den Effektormechanismus von Cilomilast im TDI-Modell. Vermutlich beeinflußt Cilomilast die Funktion von Keratinozyten, DCs und T-Zellen. Die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays lassen den Schluß zu, daß die Funktion der DCs durch Cilomilast an einem frühen Punkt der Challenge-Phase beeinflußt wird. Überträgt man die ex vivo gezeigte Inhibition der DC-Migration auf In-vivo-Verhältnisse, wird durch die ausbleibende DC-Migration (s. Abb. 6-4) in den regionalen Lymphknoten eine Aktivierung der haptenspezifischen T-Zellen und somit der allergischen Reaktion verhindert. Des weiteren wird vermutlich die Funktion von T-Lymphozyten, insbesondere die der CLA+ TGedächtniszellen in der Haut, durch Cilomilast moduliert. Diese Zellen können ohne DC-Kostimulation durch frei diffundierende Antigene aktiviert werden und tragen 78 somit zur allergischen Reaktion bei (KRASTEVA et al. 1999a, PIOR et al. 1999). Es ist daher möglich, daß diese Zellen durch topisch aufgetragenes Cilomilast in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Zudem lassen die In-vitro-Ergebnisse der MLR (PräInkubation der T-Zellen, s. Abb. 26-4) einen direkten Einfluß von Cilomilast auf TZellen erkennen. Den hemmenden Einfluß von Cilomilast auf die Produktion des Th2-Zytokins IL-4 sowie die Hemmung von IL-6 aus aktivierten Keratinozyten beschreiben bereits BÄUMER et al. (2003a) und runden somit das Bild des pleiotropen anti-inflammatorischen Effekts von Cilomilast ab. Im Vergleich zum 1. Hauptversuch müssen jedoch zwei Dinge berücksichtigt werden, welche die hier lediglich tendentiell zu erkennende Inhibition der Ohrschwellung durch Cilomilast erklären. Zum einen ist die verwendete CilomilastKonzentration im 2. Hauptversuch höher, zum anderen wurden für den 2. Hauptversuch naive Versuchstiere sensibilisiert. Die Versuchstiere des 1. Hauptversuchs dagegen sind aus vorherigen Versuchen bereits TDI-sensibilisiert bzw. geboostert und wurden für die Durchführung des 2. Hauptversuchs erneut sensibilisiert. Die Ergebnisse des MEST, des Skin-Migration-Assays, des LLNA sowie der Zymographie verdeutlichen den nur geringen Effekt von Cilomilast im 1. Hauptversuch auf die Funktion der DCs. Dies läßt sich einerseits sicherlich durch die geringere Cilomilast-Konzentration erklären, andererseits ist der Immunstatus der Versuchstiere zu berücksichtigen. Da die Versuchstiere des 1. Hauptversuchs bereits in anderen TDI-Versuchen standen, erhöht sich für diese Tiere somit die Zeitdauer der Allergenexposition, verbunden mit einer zunehmenden Immunantwort – insbesondere der haptenspezifischen T-Zellen – während der Auslösephase. Es läßt sich die Hypothese aufstellen, daß T-Gedächtniszellen in der Haut nicht ausreichend supprimiert werden. Dies könnte den nur schwachen Effekt von Cilomilast im 1. Hauptversuch erklären. 5.1.3.3 Takrolimus Vergleicht man die Effekte von Takrolimus und Cilomilast im MEST, SkinMigration-Assays, LLNA sowie in der Zymographie, so ergeben sich hieraus im Vergleich zu Cilomilast andere Erklärungsansätze für die Wirkung von Takrolimus im 79 TDI-Modell. So erfolgt durch die Applikation von Takrolimus keine Beeinflussung des Migrationsverhaltens der dendritischen Zellen (s. Abb. 5-4 und 6-4). Es ist zu folgern, daß durch die Applikation von Takrolimus auch die In-vivo-Migration nicht beeinflußt wird. Takrolimus inhibiert jedoch wirkungsvoll die Auslösung der Kontaktallergie. Da trotz erfolgter Migration dendritischer Zellen in den regionalen Lymphknoten dort kein Proliferationsprozeß von T-Lymphozyten stattfindet (s. Abb. 17-4), ist davon auszugehen, daß als primäre Zielzelle für Takrolimus T-Lymphozyten in Frage kommen. Die Ergebnisse der FACS-Analyse (s. 4.7.2) untermauern diese Hypothese, da die CD80- und CD86-Expression auf DCs durch Takrolimus nur marginal beeinflußt wird. Die hemmende Wirkung von Takrolimus auf die Proliferation von T-Zellen geht einher mit den MLR-Ergebnissen der eigenen Untersuchungen (s. 4.6.2). Die durch Takrolimus hervorgerufene Proliferationshemmung von T-Lymphozyten im regionalen Lymphknoten entspricht Angaben von SALERNO et al. (1998) sowie von HOMEY et al. (1998) für das TNCBbzw. Oxazolon-Modell. Weiterhin zeigen sich zwischen Cilomilast und Takrolimus Unterschiede bezüglich der Wirkstärke; im Gegensatz zu Cilomilast bewirkt Takrolimus auch bei den länger sensibilisierten Versuchstieren eine wirkungsvolle Inhibition der Kontaktallergie, wie aus den Ergebnissen des MEST und LLNA ersichtlich. Zudem zeigt Takrolimus im MEST und LLNA im Vergleich zu Cilomilast eine stärkere inhibitorische Wirkung. Abschließend betrachtet lassen die Resultate der eigenen Untersuchungen den Schluß zu, daß mit dem PDE4-Inhibitor Cilomilast und dem Calcineurin-Inhibitor Takrolimus zwei wirksame Pharmaka Kontaktallergie zur Verfügung stehen. 80 zur Prävention der Th2-mediierten 5.2 Densitometrische Zymographieauswertung 5.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell In Verbindung mit den Ergebnissen der Migrationsinhibition durch Cilomilast unterstreicht das Ergebnis der densitometrischen Erfassung der MMP-9-Aktivität die Bedeutung dieses Enzyms hinsichtlich der Migration dendritischer Zellen, die KOBAYASHI et al. (1997) und RATZINGER et al. (2002) postulieren, da die Hemmung der DC-Migration mit der Inhibition der aktiven Form der MMP-9 korreliert. Ebenso wird durch dieses Ergebnis der Einfluß von PDE4-Inhibitoren auf die MMP-9Aktivität, den bereits BELLEGUIC et al. (2000) und CORBEL et al. (2002) für den PDE4-Inhibitor Rolipram beschreiben, bestätigt. Dort werden unter den gegebenen Versuchsbedingungen influierende neutrophile Granulozyten als Hauptquelle der MMP-9 diskutiert. In eigenen Untersuchungen an isolierten Ohrexplantaten können diese Zellen als Quelle der MMP-9 ausgeschlossen werden. Es ist anzunehmen, daß die Aktivierung der MMP-9 durch die Trennung der Ohrhälften post mortem induziert wird, da die hier einwirkenden Scherkräfte eine Aktivierung der (Entzündungs-) Zellen mit nachfolgender MMP-9-Alteration und Migrations-Induktion bewirken. Es ist jedoch auch möglich, daß die ermittelten Migrationsergebnisse lediglich die SteadyState-Verhältnisse der kontinuierlich erfolgten Migration darstellen. Als Hauptquelle der MMP-9-Sekretion kommen Keratinozyten, Langerhanszellen und dermale DCs in Frage. Die Ergebnisse der Untersuchungen lassen den Schluß zu, daß eine Aktivierung der MMP-9 mit anschließender DC-Migration auch unter nicht-inflammatorischen Bedingungen (steady-state) erfolgt. Diese wird durch topische Applikation von Cilomilast inhibiert. 81 5.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell In Vorversuchen zeigen die eingesetzten Pharmaka keine Modulation der MMP9-Aktivität, was durch die Ergebnisse des Skin-Migration-Assays gestützt wird, da sich hier ebenfalls keine Beeinflussung der DC-Migration zeigt. Die Gründe der Wirkungslosigkeit der Testsubstanzen in den Vorversuchen wurde bereits unter 5.1.3 diskutiert. Hinsichtlich der MMP-9 Beeinflussung sind für Takrolimus Unterschiede sichtbar: Im Gegensatz zum 2. Hauptversuch wird die Expression der aktiven MMP-9-Form im 1. Hauptversuch signifikant gehemmt. Dieses Ergebnis korreliert jedoch nicht mit einer Beeinflussung der DC-Migration. Als zelluläre MMP-9-Quelle kommen hier wahrscheinlich Keratinozyten, neutrophile Granulozyten und T-Lymphozyten in Frage. Aufgrund des bereits diskutierten unterschiedlichen Immunstatus der Versuchstiere könnte es in diesen Zellen zu einer Heraufregulation der MMP-9Aktivität gekommen sein, die wiederum durch Takrolimus gehemmt wird. Es ist denkbar, daß dieser Effekt durch eine Reduktion pro-inflammatorischer Zytokine durch Takrolimus – allen voran TNF-α als Hauptregulator der MMP-9-Expression – zu erklären ist. Cilomilast hingegen moduliert in beiden Hauptversuchen die MMP-9Aktivität. So wird durch topische Applikation von Cilomilast-Lösungen eine sichtbare Hemmung der MMP-9-Aktivität erreicht. Dies korreliert mit den Ergebnissen des Skin-Migration-Assays, in denen durch eine 3%ige Cilomilast-Lösung eine tendenzielle, durch eine 5%ige Lösung eine signifikante Migrationsinhibition hervorgerufen wird. Durch die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays und der Zymographie bestätigt sich die funktionelle Bedeutung der MMP-9 für der DC-Migration. 5.3 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im MEST Die verwendeten Pharmaka erzielen in den Vorversuchen keine signifikante Reduktion der TDI-induzierten inflammatorischen Takrolimus zeigt eine tendentielle Inhibition. 82 Ohrschwellung. Lediglich Die Inhibition der Ohrschwellung in den Hauptversuchen durch Cilomilast kann erklärt werden durch die Reduktion der DC-Migration und nachfolgend verminderter Stimulation von T-Zellen im regionalen Lymphknoten. Auch hier ist die stärkere Wirkung von Cilomilast in dem bereits unter 5.1.3.2. diskutierten unterschiedlichen Immunstatus zu suchen. Dagegen ist der inhibitorische Effekt von Takrolimus auf die gemessene Ohrschwellung nicht auf eine verminderte DC-Migration, sondern auf den proliferationssupressiven Effekt auf haptenspezifische T-Zellen zurückzuführen. 5.4 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im LLNA Die im Vergleich zur Kontrolle niedrigeren Lymphknotengewichte der behandelten Tiere lassen darauf schließen, daß durch eine Behandlung die DC-induzierte TLymphozyten-Proliferation inhibiert wurde. Takrolimus zeigt dabei im 1. und 2. Hauptversuch einen proliferationshemmenden Effekt, was sich im Lymphknotengewicht widerspiegelt. Zusammen mit den Migrations-, Zymographieund MEST-Ergebnissen zeigt sich hier, daß Takrolimus die allergische Kontaktdermatitis über Beeinflussung der T-Zell-Funktion wirkungsvoll inhibiert. Der in dieser Arbeit im TDI-Modell durch Takrolimus gezeigte proliferationshemmende Effekt auf Lymphknotenzellen entspricht der von SALERNO et al. (1998) und HOMEY et al. (1998) beschriebenen Takrolimuswirkung im TNCB- bzw. OxazolonModell Die durch Cilomilast (Lösung, 3%) im 1. Hauptversuch nicht wirksam inhibierte TZell-Proliferation des Lymphknotens erklärt die Ergebnisse des MEST. Es ist anzunehmen, daß DCs der Haut in ihrem Migrationsverhalten nicht beeinflußt werden und im regionalen Lymphknoten nach Antigenpräsentation die allergische Reaktion in Form der Ohrschwellung induzieren. Erst mit einer 5%igen CilomilastLösung zeigen sich proliferationssuppressive Effekte im regionalen Lymphknoten, da hierdurch vermutlich auch die Migration der DCs in den regionalen Lymphknoten unterbunden wurde. 83 5.5 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus in der MLR Die proliferationssupressiven Effekte von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus bei der Koinkubation entsprechen den Ergebnissen von BARNETTE et al. (1998), HACKSTEIN et al. (2003) und SZABO et al. (2001). Die mit steigender DC/T-ZellRatio zunehmende Zellproliferation der Responderzellen läßt die Bedeutung der DCs für die T-Zellstimulation proliferationshemmende erkennen. Effekt von Es ist Rapamycin anzunehmen, und Takrolimus daß der über die Beeinflussung des Zellzyklus der T-Zellen abläuft, wie bereits in 2.4 beschrieben. Die Ergebnisse aus den Prä-Inkubations-Versuche (s. 4.6.4) mit Cilomilast lassen den Schluß zu, daß der proliferationshemmende Effekt in der MLR über eine Beeinflussung der DCs und T-Zellen vermittelt wird. Ein Vergleich der DC- und TZell-Prä-Inkubation zeigt jedoch, daß eine Prä-Inkubation der T-Zellen mit Cilomilast einen stärkeren proliferationshemmenden Effekt zur Folge hat. Für Cilomilast ist also davon auszugehen, daß die Interaktion zwischen DCs und T-Zellen durch Hemmung der PDE4 in DCs und T-Zellen bidirektional beeinflußt wird. Die Wirkung der DC-PräInkubation mit Cilomilast läßt sich wahrscheinlich durch eine Modulation der kostimulatorischen und antigenpräsentierenden Oberflächenmoleküle CD80, CD86, MHC-I und MHC-II erklären und würde die für Rolipram gezeigten Ergebnisse bestätigen (BIELOVKA et el. 2000). Der direkte Effekt auf T-Lymphozyten durch PräInkubation mit Cilomilast bestätigt auch die Ergebnisse von HATZELMANN und SCHUDT (2000), die an anti-CD3 stimulierten T-Zellen einen proliferationshemmenden und IL-2 hemmenden Effekt von Cilomilast zeigen. Für den PDE4-Inhibitor Cilomilast kann also eine Beeinflussung sowohl von DCs als auch von T-Zellen durch Hemmung der PDE4 gezeigt werden. In MLR-Versuchen zur Konzentrationsabhängigkeit ist bei Cilomilast eine fortschreitendende Abnahme und eine schwach signifikante Inhibition erst in der höchsten (und klinisch unrelevanten) Konzentration (10 µmol/l) zu erkennen, während Rapamycin und Takrolimus bereits in der jeweils niedrigsten (und klinisch relevanten) Konzentration die T-Zell-Proliferation signifikant inhibierten. Höhere Konzentrationen zeigen keinen stärkeren supressiven Effekt. 84 Festzuhalten bleibt, daß die T-Zell-Proliferationshemmung durch Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus bislang nur für eine allogene MLR gilt; wollte man das TDI-Kontaktallergiemodell durch In-vitro-Versuche in der MLR simulieren, so müßte eine homologe MLR mit TDI-„gepulsten“-DCs durchgeführt werden. Die hier durchgeführte allogene MLR fungiert letztlich als „dirty tool“ und soll grundsätzlich die Funktion der DCs auf die Initiierung einer T-Zellantwort (Zellproliferation) und die generellen supressiven Effekte der Testsubstanzen zeigen. 5.6 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Expression von CD80 und CD86 Die Heraufregulation der kostimulatorischen Oberflächenmoleküle CD80 und CD86 auf dendritischen Zellen nach Stimulation mit LPS wurde bereits von HERTZ et al. (2001) und SCHWARZ et al. (2003) gezeigt. Eine Heraufregulation dieser Oberflächenmoleküle gilt als Kriterium einer stattgefundenen DC-Maturation, die mit Antigenpräsentation, Zytokinsekretion und T-Zellstimulation durch DCs einhergeht. Vermittelt wird diese Modulation der Oberflächenmoleküle durch toll-like-receptors (TLR), die auf Zellen des angeborenen Immunsystems als Rezeptoren für Antigene mikrobieller und viraler Herkunft fungieren (pattern recognition receptors). Als Rezeptoren für LPS und Promotoren der DC-Maturation sind TLR-2 und TLR-4 auf DCs beschrieben (HOSHINO et al. 1999, HERTZ et al. 2001). Nach Aktivierung des TLR wird eine (der IL-1-Rezeptor ähnliche) Signaltransduktion in Gang gesetzt, die letztlich über die Aktivierung der im Zellkern lokalisierten Transkriptionsfaktoren NFκB und c-Jun die Zelle in einen proinflammatorischen Funktionszustand versetzt. Die Produktion proinflammatorischer Zytokine und eine Modulation stimulatorischer und antigenpräsentierender Oberflächenmoleküle werden dabei induziert (ADEREM und ULEVITCH 2000, SCHWARZ et al. 2003). Eine Beeinflussung der Expression von CD80 und CD86 durch Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus, wie es BIELOVKA et al. (2000), WOLTMANN et al. (2001) und MATSUE et al. (2002) beschreiben, kann in den eigenen Untersuchungen nicht gezeigt werden. Lediglich Takrolimus zeigt einen mäßigen 85 Effekt auf die CD86 Expression. Da die verwendeten Konzentrationen denen der in der MLR verwendeten entsprechen, ist davon auszugehen, daß T-Lymphozyten während der DC/T-Zellinteraktion das primäre Ziel der Pharmaka sind. Ob sich hieraus ein Effekt auf die Interaktion unter In-vivo-Bedingungen ableiten läßt, müssen nachfolgende Untersuchungen zeigen. 5.7 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPSinduzierte Produktion von TNF-α und IL-12 dendritischer Zellen 5.7.1 Einfluß auf TNF-α Durch Inkubation der Zellkultur mit Cilomilast (10 µmol/l) und Rapamycin (1µmol/l) kann die LPS-induzierte Produktion von TNF-α signifikant gehemmt werden. Der Zusatz von Takrolimus (100 nmo/l) zeigt keinen inhibitorischen Effekt. Dies bestätigt die Ergebnisse von HATZELMANN und SCHUDT (2000), WOLTMAN et al. (2000) und HACKSTEIN et al. (2003). Als frühes Signal einer Entzündung spielt TNF-α eine Rolle bei der Aktivierung und Maturation dendritischer Zellen mit nachfolgender Initiierung der Immunantwort (BANCHEREAU und STEINMAN 2000) sowie bei der Regulation und Aktivierung der MMP-9. Es ist dabei anzunehmen, daß die Inhibition der TLR-vermittelten TNF-αProduktion im Falle von Cilomilast durch eine direkte Beeinflussung der PDE4 in den dendritischen Zellen vermittelt wird. Die hier in vitro gezeigte Hemmung der TNF-αProduktion von DCs unterstreicht die durch Cilomilast demonstrierten antiinflammatorischen Effekte in den In-vivo-Versuchen. 5.7.1 Einfluß auf IL-12 In eigenen Untersuchungen kann ein inhibitorischer Effekt von Cilomilast und Takrolimus auf die LPS-induzierte IL-12-Produktion von DCs gezeigt werden. 86 Rapamycin zeigte dagegen keinen Effekt. Dies bestätigt die Ergebnisse von BILLAH et al. (2002), TIEFENTHALER et al. (2004) und CHIANG et al. (2004). Die Funktion des IL-12 besteht Vermittlung einer Th1-mediierten Immunantwort; so werden natürliche Killerzellen durch IL-12 aktiviert und naive T-Zellen im Lymphknoten durch IL-12 sezernierende DCs so geprimt, daß sie sich im weiteren Verlauf zu CD8+ T-Zellen differenzieren (CARTER und DUTTON 1996). Es ist denkbar, daß die hier gezeigte IL-12-Inhibition durch Cilomilast und Takrolimus durch eine Beeinflussung der PDE4 bzw. des FKBP-12 vermittelt wird. Das hier gezeigte Ergebnis verdeutlicht, daß Cilomilast und Takrolimus sowohl in Th1- als auch Th2-vermittelten Kontaktallergiemodellen wirksam sind (SALERNO et al. 1998, EHINGER et al. 2000) und die Funktion dendritischer Zellen direkt beeinflussen. 87 6 Zusammenfassung Boris Sülzle Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung dendritischer Zellen In der vorliegenden Arbeit ist die pharmakologische Beeinflussung dendritischer Zellen in In-vivo- und In-vitro-Modellen untersucht worden. Als Testsubstanzen wurden der PDE4-Inhibitor Cilomilast sowie die Immunsuppressiva Rapamycin und Takrolimus verwendet. In vivo wurde die Wirkung der Pharmaka im TDI-Kontaktallergiemodell an BALB/c-Mäusen untersucht. Als funktionelle Parameter wurden die Ohrschwellung (Mouse-Ear-Swelling-Test, MEST) und post mortem die DC-Migration (SkinMigration-Assay) sowie die DC-induzierte T-Zell-Proliferation, gemessen am Gewicht des regionalen Weiterhin Lymphknotens erfolgte post mortem (Local-Lymphnode-Assay, die Untersuchung der LLNA), verwendet. MMP-9-Aktivität in Ohrexplantaten der Tiere mit Hilfe der Zymographie. Die Ergebnisse der In-vivo-Untersuchungen verdeutlichen die Funktion der DCs bei der Initiierung einer adaptiv-zellvermittelten Immunantwort. Im TDI-Modell konnte für Rapamycin, unabhängig von der Applikationsart, keine Wirkung zur Inhibition der Kontaktallergie gezeigt werden. Durch Cilomilast (topisch) und Takrolimus (systemisch und topisch) konnte die Induktion der Kontaktallergie dagegen verhindert werden, wie signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe im MEST, Skin-Migration-Assay, Zymographie und LLNA dies belegen. Für Cilomilast ist ein direkter Einfluß auf DCs zu erkennen (Migrationshemmung), während dies bei Takrolimus nicht der Fall ist. Hier ist als Effektormechanismus zur Inhibition der Kontaktallergie eine direkte Wirkung auf T-Lymphozyten bzw. die Interaktion zwischen DCs und T-Zellen in Betracht zu ziehen. Für die In-vitro-Untersuchungen wurden dendritische Zellen aus murinem Knochenmark gewonnen. Untersucht wurde die T-Zell-Allostimulationsfähigkeit dendritischer Zellen und deren Suppression durch Cilomilast, Rapamycin und 88 Takrolimus in der Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR); dabei ergab sich eine signifikante Suppression der T-Zell-Proliferation durch den Einsatz der Testsubstanzen, die auch in unterschiedlichen Konzentrationen in der MLR getestet wurden. Hierbei zeigte Cilomilast lediglich in der höchsten Konzentration (10 µmol/l) eine schwach signifikante Hemmung, während Rapamycin (10-4 µmol/l - 1 µmol/l) und Takrolimus (10-2 nmol/l – 100 nmol/l) in allen verwendeten Konzentrationen die DC-induzierte T-Zell-Proliferation inhibierten. Zusätzlich wurden in der MLR DCs und T-Zellen mit Cilomilast prä-inkubiert, um Unterschiede hinsichtlich des Effektormechanismus von Cilomilast abzuleiten. In diesen Ansätzen zeigte sich ein direkter Einfluß von Cilomilast auf DCs und T-Zellen. In FACS-Analysen wurde schließlich der Einfluß der Testsubstanzen auf die LPSinduzierte Heraufregulation der kostimulatorischen Oberflächenmoleküle CD80 und CD86 untersucht. Es zeigte sich jedoch bis auf einen schwachen Einfluß von Takrolimus auf die CD86 Regulation keine Modulation der untersuchten Oberflächenmoleküle durch den Einsatz der Testsubstanzen. Weiterhin erfolgten Messungen der Zytokine TNF-α und IL-12 nach LPSStimulation der DCs mittels ELISA. Dabei konnte die LPS-induzierte Produktion von TNF-α durch Cilomilast und Rapamycin signifikant gehemmt werden; Takrolimus zeigte hier keinen Effekt. Die LPS-induzierte IL-12-Produktion der DCs wurde dagegen durch Takrolimus und Cilomilast signifikant gehemmt; Rapamycin zeigte hier keinen Effekt. Abschließend läßt sich sagen, daß sich Cilomilast und Takrolimus durch Beeinflussung der Funktion dendritischer Zellen und T-Zellen in den durchgeführten Untersuchungen zur Prävention einer dermalen Kontaktallergie bei Mäusen wirksam erwiesen. 89 7 Summary Boris Sülzle Studies on pharmacological influence on dendritic cells In the presented study pharmacological influence on dendritic cells was examined using in vivo and in vitro models. Test substances were the PDE4-inhibitor cilomilast, and the immunosuppressive compounds rapamycin and tacrolimus. In vivo efficacy of the adopted pharmaca was analysed in TDI-induced contact allergy in mice (balb/c). Allergen induced ear-swelling were used as functional parameter (Mouse-Ear-Swelling-Test, MEST). Additionally, post mortem DCmigration (Skin-Migration-Assay) as well as DC-induced T cell proliferation, as measured by lymphnode weights (Local-Lymphnode-Assay, LLNA). Furthermore, MMP-9 activity was determined in mouse ear explants by zymography. The results of the in vivo studies point up the role of dendritic cells in initiating adaptive cell-mediated immunity. Adopted pharmaceuticals in the TDI-model showed differences regarding the efficacy and its intervention. Rapamycin did not impair the induction of contact allergy, independent of any administration route, while application of cilomilast (topical) and tacrolimus (systemical and topical) inhibited the induction of contact allergy. This is clarified by significant differences in MEST, SkinMigration-Assay and LLNA by comparison to control groups. In term to effect mechanism differences between cilomilast and tacrolimus became apparent. In contrast to tacrolimus, a direct influence on dendritic cells by cilomilast (inhibition of migration) is evident. For tacrolimus, a direct influence on T cell function respectively DC/T cell interaction is contemplable for inhibition of contact allergy. For in vitro studies murine bone marrow-derived dendritic cells were used. DCs T cell allostimulatory capacity and its suppression by cilomilast, rapamycin and tacrolimus was tested in the Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR). MLR performed with different drug concentrations indicated differences among the used test substances. Only in highest exerted concentration cilomilast (10 µmol/l) inhibited T cell 90 proliferation weak but significantly, while rapamycin (10-4 µmol/l - 1 µmol/l) and tacrolimus (10-2 nmol/l – 100 nmol/l) did so in all tested concentrations. A direct influence on the function of DCs as well as T cells by cilomilast was found by preincubation of DCs and T cells with cilomilast. Test substances influence` on LPS upregulated costimulatory surface molecules (CD80, CD86) on DCs was examined by FACS analyses. There was no alteration of surface molecule expression by adopted pharmaceuticals except weak CD86 alteration by tacrolimus. At last ELISA measurements of TNF-α und IL-12 in supernatants of LPS stimulated DCs were performed beyond. Thereby cilomilast and rapamycin but not tacrolimus inhibited significantly LPS induced TNF-α production. IL-12 production of LPS stimulated DCs was significantly inhibited by cilomilast and tacrolimus, rapamycin did not influence IL-12 production. In conclusion, cilomilast and tacrolimus are effective in prevention of dermal contact allergy in mice by influencing dendritic cell respectively T cell function. 91 8 Literaturverzeichnis ABRAHAM, R.T. u. G.J. WIEDERRECHT (1996) Immunopharmacology of rapamycin. Annu. Rev. Immunol. 14, 483-510 ADEREM, A. u. R.J. ULEVITCH (2000) Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. Nature 406, 782-787 AIBA, S. u. S. KATZ (1990) Phenotypic and functional characteristics of in vivo-activated Langerhans cells. J. Immunol.145, 2791-2796 AIBA, S., A. TERUNUMA, H. MANOME u. H. 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Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Kontrolle Cilomilast Kontrolle Cilomilast Kontrolle Cilomilast Kontrolle Cilomilast 460.53 212.05 252.98 25.00 181.69 241.48 28.41 18.75 24.67 27.57 12.25 0.00 399.19 875.00 196.76 134.77 355.60 289.47 65.48 51.81 20.83 85.53 37.50 123.75 444.67 408.81 616.58 441.18 112.66 265.15 68.60 134.20 55.65 45.94 94.74 64.84 658.01 946.97 511.01 304.69 770.23 n.b. 103.49 0.00 22.96 23.34 38.40 110.29 Tab. 2-9: Zahl ausgewanderter DCs der Haut/mg Ohrgewebe nach intraperitonealer, oraler und topischer Gabe von Takrolimus, Rapamycin und Cilomilast im TDI-Kontaktallergiemodell (Vorversuche). Einzelwerte von 6 Mausohren. Applikation Applikation Applikation intraperitoneale topische orale Vehikel Takrolimus Rapamycin Cilomilast 179.64 282.17 87.96 426.54 98.03 816.87 349.81 304.69 1164.6 315.13 296.68 794.12 0 139.02 225 0 60.06 73.83 219.1 274.39 85.23 72.12 532.02 384.62 323.86 700.81 197.36 162.65 213.75 85.22 347.94 1028.95 700.39 496.4 590.75 1398.65 342.46 268.86 177.63 82.27 222.27 114.89 199.81 894.92 832.76 1153.5 923.51 1002.02 186.76 424.4 466.46 n.b. 111.43 67.34 127.04 n.b. 160.27 74.7 723.65 n.b. 507.02 0 572.52 n.b. 350.27 0 206.35 n.b. 190.55 420.4 219.83 n.b. 117 Tab. 3-9: Zahl ausgewanderter DCs der Haut/mg Ohrgewebe nach Gabe von Cilomilast und Takrolimus im 1. und 2. Migrations-Hauptversuch des TDI-Kontaktallergiemodells. Einzelwerte von 8 (1. Hauptversuch) bzw. 6 Mausohren (2. Hauptversuch). 1. Hauptversuch 2. Hauptversuch Vehikel Cilomilast Takrolimus Vehikel Cilomilast Takrolimus 425.10 628.21 1177.13 456.52 745.90 137.55 413.92 249.01 249.43 898.76 169.46 52.84 60.44 234.38 298.89 225.00 685.93 945.65 914.72 49.07 149.29 831.25 185.84 335.35 1110.48 1241.38 1205.06 1550.63 1607.14 1188.38 146.51 96.88 125.00 125.46 38.46 223.40 1708.12 1651.98 1552.78 1298.08 2100.00 1703.23 Tab. 4-9: Zunahme der Ohrschwellung [µm] 16 Stunden nach TDI-Challenge und Behandlung (i.p., oral und topisch) mit Takrolimus, Rapamycin und Cilomilast. Einzelwerte von 6 Mausohren aus Vorversuchen im TDI-Kontaktallergiemodell. Applikation Applikation Applikation intraperitoneale topische orale Vehikel 0 0 90 150 30 20 80 80 90 40 90 120 80 60 50 50 0 0 Takrolimus Rapamycin Cilomilast 60 40 10 40 20 20 -10 0 40 -10 70 100 -20 30 20 -20 -10 40 118 20 30 100 70 50 80 40 120 110 100 140 40 20 20 20 40 60 20 100 80 110 70 50 40 150 140 90 70 190 90 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. Tab. 5-9: Zunahme der Ohrschwellung [µm] 16 Stunden nach TDI-Challenge und Behandlung der Tiere mit Cilomilast und Takrolimus im 1. und 2. Hauptversuch des TDI-Kontaktallergiemodells. 2.Hauptversuch 1. Hauptversuch Einzelwerte von 6 bzw. 8 Mausohren. Vehikel 140 120 130 90 50 40 60 40 100 170 80 90 160 50 Cilomilast Takrolimus 80 10 70 30 20 -10 10 30 30 10 50 -10 90 30 70 20 10 40 -10 30 0 -10 10 10 10 20 -10 20 Tab. 6-9: Gewichte der Lnn. auriculares [mg] TDI-sensibilisierter und mit Cilomilast und Takrolimus behandelter BALB/c-Mäuse. Einzelwerte von 8 bzw. 6 Lymphknotengewichten. 2. Hauptversuch 1. Hauptversuch Vehikel Cilomilast Takrolimus 11.13 9.75 11.95 7.41 11.07 9.58 8.91 8.95 9.43 9.65 6.25 7.57 11.71 8.76 8.76 6.07 6.09 6.96 6.05 5.24 4.72 8.89 n.b. 5.81 6.8 4 4.6 4.8 3.6 5.6 4.4 3.1 3.3 4 1.4 3.4 2.3 1.3 2.1 3 1.7 1.8 119 Tab. 7-9: Grauwertdichte (densitometrische Auswertung) der zymographisch dargestellten MMP-9-Banden der aufbereiteten Ohrexplantate nach Behandlung mit Cilomilast (nicht- inflammatorisches Modell) sowie Takrolimus, Rapamycin und Cilomilast (Vorversuch im TDI- Modell Nicht-inflamm. Kontaktallergiemodell). Einzelwerte von jeweils 4 (i.p.) bzw. 6 Mausohrexplantaten. Vehikel Cilomilast 26.335 30.505 56.635 41.825 41.825 39.425 19.155 11.86 6.75 5.27 2.68 9.143 Applikation Applikation Applikation topische orale intraperitoneale Vehikel Takrolimus Rapamycin Cilomilast 16.69 48.86 26.13 1.64 42.46 85.3 16.82 12.24 39.33 32.48 23.81 20.78 55.21 72.85 8 13.74 3.54 24.39 0.14 10.69 17.06 38.78 4.47 7.09 23.96 37.54 29.73 53.28 2.82 1.69 39.08 89.05 95.98 9.89 20.78 18.68 23.59 n.b. 43.8 37.84 32.58 48.79 47.31 n.b. 49.2 29.74 55.48 n.b. 7.75 24.37 21.5 n.b. 27.05 8.05 26.33 n.b. 14.03 5 9.27 n.b. 23.18 14.98 12.72 n.b. 120 Tab. 8-9: Grauwertdichte (densitometrische Auswertung) der zymographisch dargestellten MMP-9-Banden der aufbereiteten Ohrexplantate nach Behandlung mit Cilomilast und Takrolimus im 1. und 2. Hauptversuch. Einzelwerte von jeweils 6 Mausohrexplantaten. 2.Hauptversuch 1.Hauptversuch Vehikel Cilomilast Takrolimus 44.71 35.2 48.19 41.8 39.98 59.1 4.35 12.95 2.7 3.84 6.1 1.47 19.54 35.63 36.94 11.67 18.4 24.33 -2.77 2.64 -0.3 2.4 -1.97 n.b. 30.38 36.14 28.16 30.8 30.75 29.66 1.53 2.49 2.43 4.89 7.38 9.54 Tab. 9-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Inkubation von Cilomilast (10 µmol/l). Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) Kontrolle Cilomilast 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 1213 1200 777 885 520 394 391 326 320 625 1198 6066 1773 6707 2663 1592 1669 1801 1236 1250 15603 4894 6577 7039 1717 1610 1487 1533 826 2500 19172 22604 13672 25757 47662 9927 6468 5785 4110 121 5000 53229 50357 55610 48614 54936 32142 13183 9378 9338 10000 84149 49501 60357 64650 59358 26344 14761 6943 14252 b) Kontrolle 312 1490 2204 3173 3402 1549 197 518 963 1064 801 Cilomilast 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 625 6733 3241 7470 3999 4101 920 1793 1288 773 1632 1250 20556 13980 24492 12963 30182 5476 6985 6474 10130 5297 2500 80100 47276 56675 46155 52090 15588 14859 19374 19396 21292 5000 72263 64944 55618 43893 72398 81690 30041 36015 36469 38314 10000 86411 76061 50756 79331 31 50108 40004 31691 33724 751 c) Cilomilast Kontrolle 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 4444 5626 1954 5391 1456 1014 1556 1203 625 6886 10387 26923 10224 2708 4427 2401 2349 1250 17784 30631 17968 14626 3035 3429 1864 2617 122 2500 34853 36457 35469 28711 3584 3391 2042 2403 5000 46851 37677 43265 40053 4952 3183 7896 3830 Tab. 10-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Inkubation von Takrolimus (100 nmol/l). Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) Kontrolle Takrolimus 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 9299 7191 6618 4790 10109 269 275 126 163 494 625 9330 6149 5976 7230 11142 508 519 684 532 403 1250 12591 13030 21529 7012 12126 673 488 1092 1048 752 2500 10071 23972 11024 10366 23631 951 519 1367 1235 1122 5000 18277 29326 34026 24772 24322 1393 1720 2731 2046 1651 10000 42947 50300 34515 37454 44468 3209 3271 5635 2788 5404 b) Takrolimus Kontrolle 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 6933 5966 6064 8157 7045 342 774 709 950 735 625 11462 11113 8730 11364 16343 1104 453 743 594 655 1250 2863 1209 1438 8659 881 1509 786 453 1338 1035 123 2500 20394 10565 15019 12689 16396 1872 1835 1622 2037 1166 5000 26685 20770 23353 20680 14264 5253 3058 2665 2861 2983 10000 20388 21077 26557 25470 19609 8175 3939 3670 5168 4712 c) Kontrolle Takrolimus 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 13393 6447 3962 3877 2845 312 530 123 109 877 625 2083 2535 10470 7742 6074 633 449 815 829 1431 1250 12333 9686 7557 6025 9021 765 481 2154 1032 994 2500 4706 4304 2863 12439 7653 2563 344 807 358 809 5000 20760 7679 12342 6132 7328 838 1061 632 556 694 10000 22963 18019 14818 20352 13075 1913 1797 1263 740 2958 Tab. 11-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Inkubation von Rapamycin (1 µmol/l). Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) Kontrolle Rapamycin 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 7859 3949 3608 4985 8490 661 1034 405 562 1497 625 5640 10194 6288 5523 6490 690 514 734 632 686 1250 6571 14222 15958 6345 13706 1652 654 1931 1450 606 124 2500 14609 17536 15516 15460 11323 824 878 634 666 805 5000 22923 26489 25223 17754 8753 3078 2951 1789 989 1312 10000 33587 22211 22507 16873 16447 1558 3303 7148 5563 2618 b) Kontrolle Rapamycin 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 10031 7344 19253 6540 3588 217 722 325 252 769 625 9569 11275 11987 5549 6250 282 318 400 626 595 1250 18979 6894 18110 11159 5886 697 909 416 702 646 2500 24334 8061 17853 14700 18208 1564 8619 4956 1675 740 5000 29248 27750 38342 36399 35943 15932 4984 14154 12185 9044 10000 31736 47229 32288 43541 47778 21913 25862 12688 18774 19615 c Kontrolle Rapamycin 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 4116 3767 5792 2985 3268 326 253 491 434 717 625 3687 11273 6249 6175 5498 226 148 136 225 318 1250 2842 8176 5820 7068 8112 317 228 788 287 730 2500 19829 6085 17818 8645 5992 264 355 859 1029 530 5000 12401 6832 8583 12760 13363 3527 3077 4144 5671 3862 10000 24610 7722 6956 13715 6380 10190 5453 3804 2547 2383 Tab. 12-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Inkubation von Cilomilast in unterschiedlichen Konzentrationen. Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) 3 [cpm] H-Thymidin Konzentration Cilomilast Kontrolle 10-3 µmol/l 10-2 µmol/l 10-1 µmol/l 1 µmol/l 10 µmol/l 19199 17797 14171 7125 7616 15521 21298 16243 14438 23548 22279 8898 19186 13715 23632 16143 17967 8163 17962 12644 17635 7764 10652 14380 11630 3172 6556 3200 3799 5323 125 b) [cpm] 3 H-Thymidin Konzentration Cilomilast Kontrolle 10-3 µmol/l 10-2 µmol/l 10-1 µmol/l 1 µmol/l 10 µmol/l 13037 9749 5250 5572 11544 7659 8905 5607 9153 9697 8205 5561 7714 8935 8111 7655 5241 10189 8485 10300 10019 3154 6295 7082 6289 4355 4656 2345 2783 5815 c) [cpm] 3 H-Thymidin Konzentration Cilomilast Kontrolle 10-3 µmol/l 10-2 µmol/l 10-1 µmol/l 1 µmol/l 10 µmol/l 12626 28817 5458 20766 18474 21593 23888 17742 15695 19515 22655 15270 27560 26215 18859 24361 21785 9223 10177 16974 8289 9987 6874 16913 13538 8585 7644 7249 1036 3746 Tab. 13-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Inkubation von Takrolimus in unterschiedlichen Konzentrationen. Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) 3 [cpm] H-Thymidin Konzentration Takrolimus Kontrolle 10-2 nmol/l 10-1 nmol/l 1 nmol/l 10 nmol/l 100 nmol/l 80730 59669 43607 49738 55175 5091 2345 2569 5753 5083 5744 5883 2683 5316 3625 7154 10489 9518 8968 6200 11323 13823 9332 9877 4224 17486 20197 8649 14878 18579 126 b) [cpm] 3 H-Thymidin Konzentration Takrolimus Kontrolle 10-2 nmol/l 10-1 nmol/l 1 nmol/l 10 nmol/l 100 nmol/l 9608 22827 14781 20671 22485 779 1748 2769 2989 5124 2141 2622 2757 2055 3082 1967 8541 26175 1440 2968 1738 2702 2694 1488 4483 2626 1473 1362 1700 1156 c) [cpm] 3 H-Thymidin Konzentration Takrolimus Kontrolle 10-2 nmol/l 10-1 nmol/l 1 nmol/l 10 nmol/l 100 nmol/l 7491 5933 5405 2549 8623 5944 4713 5959 6732 1176 5463 3275 3051 2993 3740 3345 1359 1103 2117 2859 4509 1646 2307 1066 1402 2983 1052 1946 1012 885 Tab. 14-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Inkubation von Rapamycin in unterschiedlichen Konzentrationen. Dieser Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) 3 [cpm] H-Thymidin Konzentration Rapamycin Kontrolle 10-4 µmol/l 10-3 µmol/l 10-2 µmol/l 10-1 µmol/l 1 µmol/l 50766 34221 47468 47407 45099 4872 21853 19380 4730 5572 6389 5196 19040 5572 15026 12036 5822 5221 3695 4155 16544 15735 5094 6542 13068 6215 4539 7835 2139 10406 127 b) [cpm] 3 H-Thymidin Konzentration Rapamycin Kontrolle 10-4 µmol/l 10-3 µmol/l 10-2 µmol/l 10-1 µmol/l 1 µmol/l 13254 9112 7252 5565 9232 3160 6384 4883 2671 3356 4310 2756 3169 4203 2807 2832 2551 4591 1491 4152 3572 2605 1582 2510 2707 2943 2344 2659 3622 2050 c) 10-4 µmol/l 10-3 µmol/l 10-2 µmol/l 10-1 µmol/l 1 µmol/l 18989 11171 7965 4546 34941 13174 3755 14540 6893 5765 10674 5106 16002 2263 6627 8824 6666 2685 2697 1441 4218 12267 5940 3961 5236 5959 6836 1841 3737 9298 [cpm] Kontrolle 3 H-Thymidin Konzentration Rapamycin Tab. 15-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Cilomilast Prä-Inkubation der DCs (10 µmol/l). Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) Kontrolle Präinkubation DC-Cilomilast 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 625 1250 2500 5000 10000 616 1277 1190 895 1041 3545 2862 8425 12502 9105 2114 1212 1233 2720 802 3161 3612 8790 13936 8461 5238 3697 3205 9950 2657 8079 5541 6111 18163 10507 22573 27708 38843 15486 16899 12607 16423 8786 9812 4517 61411 49409 52370 54859 68655 15178 12123 26749 36134 18733 114222 70848 78432 84023 57712 43882 55309 41275 46457 66341 128 b) Kontrolle 312 4218 2697 2200 2435 2877 1531 2203 1327 3865 1747 Präinkubation DC-Cilomilast 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 625 17157 3630 6483 4406 14660 12188 22935 8288 5080 10653 1250 42067 34610 38727 34175 40200 32982 21346 55151 29420 29304 2500 59392 54361 53372 50590 79782 55211 58225 57973 53982 39532 5000 74082 95989 49320 80050 105156 64708 69755 79440 59782 71472 10000 69014 94297 83699 71096 18 63977 56569 73132 59867 398 c) Kontrolle Präinkubation DC-Cilomilast 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 625 1250 2500 5000 4209 2859 4081 4022 1039 1737 1162 2043 11880 9946 6525 5954 6899 1629 4477 2460 15561 11644 26526 16579 4918 4328 5455 20042 20602 38389 24648 24134 5388 16013 8747 5952 12888 42687 39650 30864 7615 6752 15334 10092 129 Tab. 16-9 (a, b, c): MLR; 3H-Thymidin-Einbau [cpm] in T-Zellen nach allogener Stimulation durch DCs und Cilomilast Prä-Inkubation der T-Zellen (10 µmol/l). Versuchsansatz wurde dreimal durchgeführt; n=5 a) Kontrolle Präinkubation T-Zellen- 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 907 743 1047 842 763 260 361 447 396 470 625 3828 3260 3501 3384 2664 499 388 447 426 630 1250 18847 10318 1787 13282 7670 869 880 1204 635 470 2500 45647 43186 14267 20468 17772 3945 7831 7941 4595 6264 5000 53860 31341 37471 40805 58834 8156 6069 6500 10527 14255 10000 31529 46058 67598 55980 40086 6042 5970 13727 9486 8626 5000 255 58649 59873 1542 4403 55051 92149 62533 73481 68221 10000 9853 2620 91407 2405 29 84831 86757 65040 82525 45812 b) Kontrolle Präinkubation T-Zellen- 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 58 1057 1324 135 79 666 1500 1623 622 1325 625 104 1490 1771 315 52 4183 1539 5246 4852 3118 1250 280 4244 3688 1259 169 3132 4471 12788 2881 19452 130 2500 1982 24471 24788 566 2455 27640 37327 50523 32493 44624 c) Kontrolle Präinkubation T-Zellen- 3 H-Thymidin [cpm] Anzahl DCs/100.000 T-Zellen 312 625 1250 2500 5000 1557 3451 1668 6283 1109 3748 1749 1711 17570 16550 13470 4889 1755 3191 4434 3124 27697 18244 24611 28941 3533 4718 13273 12581 36170 34166 29664 38513 17179 19296 16675 6387 33028 28641 29799 38282 31947 10255 22150 21227 Tab. 17-9: FACS-Analyse dendritischer Zellen; Detektion CD80+/MHC-II+-DCs nach LPSStimulation und Inkubation mit Cilomilast (10µmol/l), Rapamycin (1µmol/l) und Takrolimus (1nmol/l) Kontrolle LPS Cilomilast Rapamycin Takrolimus Zellzahl 78175 82963 47186 77543 89462 CD86+/MHC-II+-Zellen 22978 59424 32222 64237 52729 29,39% 71,63% 68,29% 82,84% 58,94% Kontrolle LPS Cilomilast Rapamycin Takrolimus Zellzahl 88105 74919 35726 45082 58951 CD86+/MHC-II+-Zellen 42449 56534 26716 39821 41696 48,18% 75,46% 74,78% 88,33% 70,33% 131 Tab. 18-9: TNF-α-Produktion von DCs nach LPS-Stimulation und Inkubation mit Cilomilast (10 µmol/l), Rapamycin (1 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l); Messung erfolgte mittels ELISA; n=6 TNF-α-[pg/ml] Kontrolle 26.88 31.74 20.80 28.10 19.58 18.37 LPS 895.28 950.01 958.53 992.58 1041.23 890.42 Cilomilast 402.70 316.35 412.43 379.59 463.51 367.43 Rapamycin 630.14 529.19 664.19 572.97 560.81 591.22 Takrolimus 850.28 911.09 905.01 777.30 845.41 863.66 Tab. 18-9: IL-12-Produktion von DCs nach LPS-Stimulation und Inkubation mit Cilomilast (10 µmol/l), Rapamycin (1 µmol/l) und Takrolimus (100 nmol/l); Messung erfolgte mittels ELISA; n=6 IL-12 [pg/ml] Kontrolle -10.48 -7.83 -7.83 -8.59 -7.83 -11.24 LPS 123.06 132.90 122.31 127.98 121.17 104.15 Cilomilast 45.89 44.00 31.89 25.08 46.64 37.56 132 Rapamycin 177.92 153.71 149.92 127.60 159.38 173.00 Takrolimus 70.10 85.99 76.53 54.59 53.83 31.51 9.2 Veröffentlichungen Ein Teil der in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse und Untersuchungen liegt bereits in veröffentlichter Form vor: Zeitschriftenartikel: BÄUMER, W., T. TSCHERNIG, B. SÜLZLE, U. SEEGERS, A. LÜHRMANN, M. KIETZMANN (2003) Effects of cilomilast on dendritic cell function in contact sensitivity and dendritic cell migration through skin. Eur. J. Pharmacol. 481, 271-279 Tagunsposter: 44. Frühjahrstagung der DGPT in Mainz, 2003 KIETZMANN, M., B. SÜLZLE, U. SEEGERS, P. SANDER, M. BRAUN, T. TSCHERNIG u. W. BÄUMER Influence of dendritic cell function by the phosphodiesterase 4 inhibitor cilomilast 133 134 Hiermit erkläre ich, daß ich die Dissertation „Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung dendritischer Zellen“ selbständig verfaßt habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: Dr. H. Weigt und Dr. M. Hecht, Fraunhofer-Gesellschaft Hannover PD. Dr. T. Tschernig, Medizinische Hochschule Hannover. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgender Institution angefertigt: Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. 135 136 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die Überlassung des interessanten Themas und die jederzeit freundliche Unterstützung. Dr. Wolfgang Bäumer gebührt großer Dank für seine tatkräftige Unterstützung und zahlreichen Ratschläge rund um die „dendritische Zelle.“ Den Dres. Niedorf und Braun danke ich für ihre Hilfe bei der Lösung so mancher EDV-Probleme, die dann schnell keine mehr waren. Bei Wolle, Frank und Braunie möchte ich für die sehr angenehme Arbeitsatmosphäre und so manche äußerst kurzweilige Gespräche zwischen Tür und Angel bedanken. Allen weiteren Mitarbeitern des Instituts gilt mein herzlicher Dank für die immerwährende Hilfsbereitschaft und Unterstützung. Victor de Vries und Dr. Henning Weigt danke ich für die Durchführung der FACSAnalysen und β-Scintillationsmessung. Mein größter Dank gehört meiner Familie und Line, die mich während meiner Studienzeit immer unterstützt haben. 137