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BBraun Stiftung
Abschlussbericht für den Zeitraum
01.01.2011 bis 31.08.2012:
Thema:
Die Bedeutung des mTOR Signalweges bei
posttraumatischer Immundysfunktion des alten Menschen
Sponsor:
Studienverantwortliche:
BBraun Stiftung
Dr. Sabrina Ehnert & Prof. Dr. Andreas K. Nüssler
Stadtwaldpark 10
Abt. für Unfallchirurgie MRI
34212 Melsungen
Ismaningerstr. 22, 81675 München und,
Unfallchirurgische Klinik der Eberhard
Universität Tübingen(BG Unfallklinik)
Karls
Schnarrenbergstr. 95
D-72076 Tübingen
Mitarbeiter des Projekts:
Dr. Zhiyong Wang, Angela Wottge, Prof. Andreas Nüssler - MRI
Dr. Stefan Pscherer (Klinikum Traunstein),
Natascha Nüssler (Klinikum Neuperlach)
Dr. Sabrina Ehnert, Yasmin Bergmann, Dr. Thomas Freude, Prof.
Nüssler Uni Tübingen
Initiale Projektdauer:
01.01.2011 bis 31.03.2011
Datum: 06/09/2012
Dieser Bericht besteht aus 13 Seiten
-V E R T R A U L I C H –
___________________________________
Prof. Dr. Andreas K. Nüssler
Stellvertretend für alle Mitarbeiter
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1. Inhaltsverzeichnis
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................................. 2
Abbildungsverzeichnis .......................................................................................................................... 2
Häufig verwendete Abkürzungen ......................................................................................................... 2
Hintergrund und Stand der Forschung ................................................................................................. 3
Ziele der vorliegende Studie ................................................................................................................. 4
Ergebnisse und Diskussion anhand der Arbeitspakete ........................................................................ 4
Ausblick .............................................................................................................................................. 13
2. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Demographische Entwicklung der Bevölkerung in Deutschland bis 2060. ............................. 3
Abbildung 2: Entwicklung der Anzahl von proximalen Femurfrakturen bis zum Jahr 2050 in Abhängigkeit
vom Alter....................................................................................................................................................... 3
Abbildung 3: TNF-β Serumspiegel. .............................................................................................................. 6
Abbildung 4: GCSF Serumspiegel. .............................................................................................................. 6
Abbildung 5: GM-CSF Serumspiegel. .......................................................................................................... 6
Abbildung 6: GRO und GRO-α Serumspiegel. ............................................................................................. 7
Abbildung 7: IL-1α Serumspiegel. ................................................................................................................ 7
Abbildung 8: Serumspiegel von IL-2, IL-3 und IL-5. ..................................................................................... 7
Abbildung 9: IL-6 Serumspiegel. .................................................................................................................. 8
Abbildung 10: Serumspiegel von IL-7, IL-8 und IL-13. ................................................................................. 8
Abbildung 11: IL-19 und IL-15 Serumspiegel. .............................................................................................. 8
Abbildung 12: MIG Serumspiegel. ................................................................................................................ 9
Abbildung 13: IFN-γ Serumspiegel. .............................................................................................................. 9
Abbildung 14: Serumspiegel von MCP-1, MCP-2 und MCP-3. .................................................................... 9
Abbildung 15: TNF-α Serumspiegel. .......................................................................................................... 10
Abbildung 16: RANTES Serumspiegel. ...................................................................................................... 10
Abbildung 17: Serumspiegel von gesamtem TGF-β1. ................................................................................ 10
Abbildung 18: Serumspiegel von aktivem TGF-β....................................................................................... 11
Abbildung 19: Western Blot des mTOR Signalweges. ............................................................................... 11
Abbildung 20: Aktivierung der JNK in Granulozyten. ................................................................................. 11
Abbildung 21: Aktivierung von ERK1/2 in Granulozyten. ........................................................................... 12
Abbildung 22: Aktivierung von p38 in Granulozyten. ................................................................................. 12
Abbildung 23: SOD-1 Expression in Granulozyten. ................................................................................... 13
3. Häufig verwendete Abkürzungen
AF – alt Fraktur, AG – alt gesund, GCSF – Granulocyte Colony-Stimulating Factor, GM-CSF –
Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor, GRO und GRO-α – Growth Regulated Proteins, HO1 – heme-oxygenase 1, IL - Interleukin, IFN-γ – Interferon-γ, JG – jung gesund, JF – jung Fraktur, MIG –
Monokine Induced by Interferon-γ, MCB-1, -2 und -3 – Monocyte Chemotactic Proteins 1, -2 und -3, pAKT – phophorylierte Protein Kinase B, p-ERK1/2 - phosphorylierte extracellular signal-regulated protein
kinases 1 und 2, p-JNK – phosphorylierte c-Jun N-terminal kinase, p-p38 – phosphorylierte p38, RANTES
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– Regulation upon Activation Normal T cell Express Sequence, SOD-1 – superoxide-dismutase 1, TGF-β1
– Transforming Growth Factor β1, TNF-α und -β – Tumor Necrosis Factors α und –β
4. Hintergrund und Stand der Forschung
Die Beeinträchtigung des Immunsystems nach Trauma, wie zum Beispiel einer Fraktur ist insbesondere
beim alten Menschen gravierend und führt aufgrund einer erhöhten Infektanfälligkeit zu schweren
Komplikationen. Die häufigsten Komplikationen sind dabei Pneumonien, Harnwegsinfekte,
Wundheilungsstörungen, Sepsis und Tod. Insbesondere das Management von Schenkelhalsfrakturen
wird durch die Komplikationsrate beim alten Menschen erheblich erschwert. Trotz allen Fortschritts in der
Medizin hat sich die Letalität nach Schenkelhalsfraktur in den letzten 20 Jahren nicht geändert [1]. Die
postoperative Komplikationsrate liegt bei 26,1%, die Klinikletalität bei 6,6% und die Mortalität innerhalb
eines Jahres nach Operation bei ca. 30% [2]. Aufgrund unserer alternden Gesellschaft, steigt der Anteil
Menschen über 60 Jahre in der Bevölkerung rapide an (siehe Abbildung 1) [3], sodass sich die Inzidenz
der Schenkelhalsfraktur bereits im Jahre 2050 verdoppelt haben wird (siehe Abbildung 2).
Abbildung 1: Demographische Entwicklung der Bevölkerung in Deutschland bis 2060.
Quelle: Statistisches Bundesamt, Deutschland – Land und Leute, 2009
Abbildung 2: Entwicklung der Anzahl von proximalen Femurfrakturen bis zum Jahr 2050 in Abhängigkeit vom Alter.
Abbildung aus [1]
Die Immunsystemdysfunktion des alten Menschen führt in diesem Zusammenhang zu einer erhöhten
Krankheitsanfälligkeit, verlängerten Klinikaufenthalten und einer damit einhergehenden Verringerung der
Lebensqualität sowie einer erschwerten Rekonvaleszenz [4-6]. Diverse Studien haben versucht, das
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Phänomen der Immundysfunktion im Alter näher zu charakterisieren. Hierbei konnte eine Malfunktion
sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems festgestellt werden.
Bisher ist bekannt, dass neutrophile Granulozyten (PMN) im Alter einen Funktionsabbau zeigen, was
Phagozytose, Chemotaxis und Degranulation betrifft [8,9]. Ferner ist die Abwehrfunktion der Zellen durch
eine Überproduktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verschlechtert [10]. Die intrazellulären
Regelmechanismen die dieser zellulären Dysfunktion zu Grunde liegen sind bislang jedoch nur
unzureichend erforscht.
Die Dysfunktion der Monozyten älterer Menschen spiegelt sich ebenfalls in gestörter
Phagozytosefähigkeit, unzureichender Aktivierung und inadäquater Inflammationsreaktion wider. Ferner
ist eine Fehlproduktion von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen bekannt. Hierbei sind
insbesondere Interleukin (IL)-1, -6, -8 und -12 sowie Interferon (IFN)-α erhöht [8,9].
Die Übermittlung der extrazellulären Stimuli auf die Zellen wird dabei teilweise durch intrazelluläre
Kinasen und Phosphatasen reguliert. Zu der Gruppe von Kinasen, die insbesondere durch
Stressinduktoren oder Inflammationsparameter initiiert wird und grundlegende zelluläre Prozesse steuert,
gehören die MAP-Kinasen (Mitogen Activated Kinases). Dazu zählt man die Extracellular Regulated
Kinases (ERK), die c-Jun N-Terminal Activated oder Stress Activated Protein Kinases (JNK/SAPK), die
ERK5/big MAP Kinase (BMK1) und die p38 Gruppe der Proteinkinasen. Diese Mediatoren sind unter
anderem an grundlegenden Prozessen des Zellzyklus wie beispielsweise der Proliferation, der Apoptose
und der Abwehr beteiligt. Über den sogenannten TSC-Komplex, bestehend aus den Protein Tuberin
(TSC1), Harmatin (TSC2) und Pam, regulieren diese die Proliferation via mTOR (mammalian Target of
Rapamycin). Bonawitz und Kollegen zeigten darüber hinaus, dass mTOR in direktem Zusammenhang mit
der mitochondrialen Respiration und Genexpression steht, wodurch die zelluläre Antwort auf oxidativen
Stress durch SOD2 reguliert wird (Bonawitz et al 2007). Neuere Veröffentlichungen geben zudem
Hinweise darauf, dass durch MAP-Kinasen Signalwege aktiviert werden, welche ausschlaggebend an
alterungs-spezifischen Prozessen beteiligt sind. So führen die für die Alterung charakteristische, DNA
schädigenden Prozesse beispielsweise zu einer Erhöhung der Basisaktivität von JNK [15].
5. Ziele der vorliegende Studie
Ziel des beantragten Projekts war die Analyse der Aktivität und Regulation des mTOR Signalweges und
der daran beteiligten MAP-Kinasen (z.B. AKT, ERK, p38-MAP-Kinase und JNK) in Monozyten und
Granulozyten des peripheren Blutes von jungen und alten Menschen nach Schenkelhalsfraktur.
Die Untersuchungen verfolgten dabei drei Teilziele:
1. Charakterisierung der Inflammationsreaktion im alten Menschen anhand der Expression von
proinflammatorischen Parametern
2. Analyse der mTOR Aktivität und dessen Expressionsprofil
3. Bottom-up Analyse der daran beteiligten MAP-Kinasen via TSC1 und TSC2.
• Identifikation der beteiligten MAP-Kinasen
• sowie deren Aktivität
6. Ergebnisse und Diskussion anhand der Arbeitspakete
Probenakquise
Patientengruppe 1: mind. 10 Patienten mit einer Fraktur der langen Röhrenknochen ≥ 70 Jahre
Patientengruppe 2: mind. 10 Patienten mit einer Fraktur der langen Röhrenknochen ≤ 40 Jahre
Einschlusskriterien für die Patienten:
• Alter: ≥ 70 Jahre (Gruppe 1) sowie ≥ 18 Jahre und ≤ 40 Jahre (Gruppe 2)
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•
•
•
Einwilligung in die Studie
Fraktur der langen Röhrenknochen
Osteosynthese mittels Marknagel, Platte oder Schraubenosteosynthese
Ausschlusskriterien für die Patienten:
• Offene und periprothetische Frakturen und Polytrauma
• Patienten mir systemischen Erkrankungen, z.B. Infektionen, Malignome, Radio- Chemotherapie
• Immunmodulierende Medikation, z.B. Cortison, MTX
• Patienten, die zur Einwilligung nicht fähig sind
Kontrollgruppe 1: mind. 10 gesunde Probanden ≥ 70 Jahre
Kontrollgruppe 2: mind. 10 gesunde Probanden ≤ 40 Jahre
Einschlusskriterien für die Probanden:
• Alter ≥ 70 Jahre für Gruppe 1 und für Gruppe 2 älter 18 Jahre und jünger 40 Jahre
• Einwilligung in die Studie
• keine Fraktur in den letzten 12 Wochen
Ausschlusskriterien für die Probanden:
• Patienten mir systemischen Infektionserkrankungen
• andere Systemerkrankungen, Malignomen und Radio- Chemotherapie
• Immunmodulierende Medikation, z.B. Cortison, MTX
• Patienten, die zur Einwilligung nicht fähig sind
Probenübersicht
Patientengruppe 1
Patientengruppe 2
Kontrollgruppe 1
Kontrollgruppe 2
Anzahl
12
8
12
12
Durchschnittsalter
81 Jahre
32 Jahre
74 Jahre
28 Jahre
Statistik
Die Daten werden als „box & whiskers“ Diagramme dargestellt. Die Daten wurden mittels „one-way
analysis of variance (ANOVA)” gefolgt von einer Bonferroni Postanalyse ausgewertet (GraphPad Prism
Software). P < 0,05 wurde als geringstes Signifikanzlevel festgelegt. Die statistische Signifikanz wird in
den Graphiken mittel * angezeigt wobei * p < 0,05, ** p < 0,01, und *** p < 0,001 bedeutet.
Zu Arbeitspaket 1: Charakterisierung der Inflammationsreaktion im alten Menschen anhand der
Expression von pro-inflammatorischen Parametern
Zur Identifikation möglicher pro- und anti-inflammatorischer Parameter welche im Serum wurden die
gewonnenen Seren mittels eines sogenannten Zytokinarrays analysiert. Dieser Array ermöglicht es die
relativen Serumspiegel von 23 pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen (bzw. Chemokinen) zu
ermitteln. Die so untersuchten Zytokine sind: Granulocyte Colony-Stimulating Factor (GCSF),
Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF), Growth Regulated Proteins (GRO und
GRO-α), Interleukine IL-1α, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13 und IL-5, Interferon (IFN)-γ,
Monokine Induced by Interferon-γ (MIG), Monocyte Chemotactic Proteins (MCP)-1, -2 und -3, Regulation
upon Activation Normal T cell Express Sequence (RANTES), Transforming Growth Factor (TGF)-β1,
Tumor Necrosis Factors (TNF)-α und –β.
Im Allgemeinen stiegen die Serumspiegel vieler der so untersuchten Zytokine mit zunehmendem Alter
der Spender signifikant an. Die Regulation der Zytokine nach Fraktur schwankte zum Teil stark in den
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zwei unterschiedlichen Altersgruppen. Lediglich TNF-β zeigte keine Regulation im Alter oder nach Fraktur
(siehe Abbildung 3).
Im Falle des Granulocyte Colony-Stimulating Factor
(GCSF) waren die basalen Serumspiegel in älteren
Spendern erhöht. In Folge der Fraktur sanken die GCSF
Serumspiegel nur in den jungen Patienten. In den älteren
Patienten blieben die bereits erhöhten GCSF
Serumspeigel unverändert (siehe Abbildung 4).
Abbildung 3: TNF-β Serumspiegel.
TNF-β Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70
Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen mittels
eines Zytokinarrays bestimmt.
Abbildung 4: GCSF Serumspiegel.
GCSF Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70
Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen
mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
Im Falle des Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating
Factor (GM-CSF) waren die basalen Serumspiegel in
älteren Spendern zwar auch erhöht, allerdings sanken
diese in beiden Altersgruppen nach Fraktur ab.
Besonders hervorzuheben ist jedoch, dass das Absinken
der GM-CSF Serumspiegel in den älteren Patienten
ausgeprägter war (siehe Abbildung 5).
Abbildung 5: GM-CSF Serumspiegel.
GM-CSF Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70
Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen mittels
eines Zytokinarrays bestimmt.
Growth Regulated Proteins (GRO und GRO-α) verhielt sich ähnlich wie GM-CSF. Die basalen GRO und
GRO-α Serumspiegel waren in älteren Spendern erhöht. In Folge der Fraktur sanken diese in beiden
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Altersgruppen wobei die gemessene Veränderung in der älteren Patientengruppe ausgeprägter war
(siehe Abbildung 6).
Abbildung 6: GRO und GRO-α Serumspiegel.
GRO und GRO-α Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen
Röhrenknochen mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
Die Serumspiegel von Interleukin-1α verhielten sich ähnlich des
GCSF. Die basalen IL-1α Serumspiegel waren in den älteren
Spendern signifikant erhöht und sanken nach Fraktur
besonders in der jüngeren Patientengruppe ab während die
ältere Patientengruppe leicht erhöht blieb (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: IL-1α Serumspiegel.
IL-1α Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre
Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen mittels eines
Zytokinarrays bestimmt.
Im Falle der IL-2, IL-3 und IL-5 waren die basalen Serumspiegel in der älteren Spendergruppe zwar nicht
signifikant erhöht im Vergleich zu der jüngeren Spendergruppe. Allerdings sanken diese Serumspiegel in
der jüngeren Patientengruppe nach Fraktur tendenziell ab, wohingegen sie in der älteren
Patientengruppe unverändert blieben (siehe Abbildung 8).
Abbildung 8: Serumspiegel von IL-2, IL-3 und IL-5.
IL-2, IL-3 und IL-5 Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen
Röhrenknochen mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
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Im Falle von IL-6 waren die basalen Serumspiegel
zwischen jungen und alten Spendern zwar auch nicht
signifikant verschieden. Allerdings zeigten die jüngeren
Patienten
tendenziell
eher
verminderte
IL-6
Serumspiegel, während die älteren Patienten tendenziell
eher erhöhte IL-6 Serumspiegel aufwiesen (siehe
Abbildung 9).
Abbildung 9: IL-6 Serumspiegel.
IL-6 Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre
Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen mittels eines
Zytokinarrays bestimmt.
Die Serumspiegel von IL-7, IL-8 und IL-13 verhielten sich ähnlich der Serumspiegel von GRO-α. Die
basalen Serumspiegel der älteren Spender waren erhöht und sanken nach Fraktur. Wobei das Absinken
in der jüngeren Patientengruppe sehr viel ausgeprägter war (siehe Abbildung 10).
Abbildung 10: Serumspiegel von IL-7, IL-8 und IL-13.
IL-7, IL-8 und IL-13 Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen
Röhrenknochen mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
Im Falle von IL-10 und IL-15 waren die basalen Serumspiegel in der älteren Spendergruppe zwar nur
leicht erhöht. Allerdings sanken diese nach Fraktur nur in der jungen Patientengruppe stark ab und
blieben in der älteren Patientengruppe unverändert (siehe Abbildung 11).
Abbildung 11: IL-19 und IL-15 Serumspiegel.
IL-10 und IL-15 Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen
Röhrenknochen mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
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Genau umgekehrt verhielt es sich im Falle von Monokine
Induced by Interferon-γ (MIG). Auch hier unterschieden sich
die basalen Serumspiegel zwischen jungen und alten
Spendern kaum. Jedoch konnten wir einen signifikanten
Anstieg des MIG im Serum junger Patienten nach Fraktur
messen.
Dieser
Anstieg
blieb
in
der
älteren
Patientengruppe vollständig aus (siehe Abbildung 12).
Abbildung 12: MIG Serumspiegel.
MIG Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre
Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen mittels eines
Zytokinarrays bestimmt.
Interessanterweise verhielt sich das Interferon (IFN)-γ sehr
verschieden zu MIG. Die basalen Serumspiegel von IFN-γ
waren in der älteren Spendergruppe erhöht. Die
Serumspiegel sanken tendenziell in der älteren
Patientengruppe nach Fraktur ab während die
Serumspiegel
in
der
jüngeren
Patientengruppe
unverändert blieben (siehe Abbildung 13).
Abbildung 13: IFN-γ Serumspiegel.
IFN-γ Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre
Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen mittels eines
Zytokinarrays bestimmt.
Im Falle der Monocyte Chemotactic Proteins MCP-1, -2 und -3 waren die Serumspiegel sehr
unterschiedlich reguliert. Lediglich die basalen Serumspiegel von MCP-1 und MCP-3 waren in der älteren
Spendergruppe erhöht. Die basalen Serumspiegel von MCP-2 waren innerhalb der zwei Altersgruppen
unverändert. In der jungen Patientengruppe stiegen die Serumspiegel von MCP-1 und MCP-2 nach
Fraktur signifikant an wohingegen die Serumspiegel von MCP-3 in der jungen Patientengruppe nach
Fraktur tendenziell sanken. In der älteren Patientengruppe sanken stattdessen die Serumspiegel von
MCP-1 nach Fraktur. Die Serumspiegel von MCP-2 und MCP-3 blieben in dieser Altersgruppe nach
Fraktur unverändert (siehe Abbildung 14).
Abbildung 14: Serumspiegel von MCP-1, MCP-2 und MCP-3.
MCP-1, MCP-2 und MCP-3 Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der
langen Röhrenknochen mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
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Tumor Necrosis Factor (TNF)-α verhielt sich ähnlich zu
MCP-3. Die basalen Serumspiegel waren in der älteren
Spendern erhöht und sanken nach Fraktur nur in der
jungen Patientengruppe ab (siehe Abbildung 15).
Abbildung 15: TNF-α Serumspiegel.
TNF-α Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70
Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen
mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
Interessanterweise war das sogenannte „Regulation upon
Activation Normal T cell Express Sequence“ (RANTES),
welches die chemokine Rekrutierung von Monozyten und
T-Zellen reguliert, in den beiden Altersgruppen komplett
gegensätzlich reguliert.
Die basalen RANTES Serumspiegel waren tendenziell in
der älteren Spendergruppe leicht erhöht. Nach Fraktur
stiegen die RANTES Serumspiegel in der jungen
Patientengruppe stark an, während sie in der älteren
Patientengruppe tendenziell sanken (siehe Abbildung 16).
Abbildung 16: RANTES Serumspiegel.
RANTES Serumspiegel wurden bei jungen (≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70
Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der langen Röhrenknochen
mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
Das multifunktionelle Zytokin Transforming Growth Factor
(TGF)-β1, welches von fast jeder Zelle im Körper gebildet
wird, ist in der älteren Spendergruppe stark erhöht. Zu
unserem gemessenen Zeitpunkt sinkt das TGF-β1 nach
Fraktur in beiden Altersgruppen ab (siehe Abbildung 17).
Abbildung 17: Serumspiegel von gesamtem TGF-β1.
Die Serumspiegel von aktivem und inaktivem TGF-β1 wurden bei jungen
(≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der
langen Röhrenknochen mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
Dabei muss man allerdings beachten, dass das im Zytokinarray bestimmte TGF-β1 das gesamte im Blut
zirkulierende TGF-β1 darstellt, da bedeutet sowohl die aktive als auch die inaktive Form. Um
herauszufinden, wie sich die Menge an aktivem TGF-β verändert haben wir die Seren zusätzlich mit Hilfe
sogenannter MFB-F11 Reporterzellen untersucht. Diese Zellen erkennen ausschließlich aktives TGF-β,
wobei es allerdings nicht zwischen deren drei Iso-formen (TGF-β1-3) unterschieden kann.
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Diese Analyse zeigte, dass die Menge an aktivem TGF-β
in der älteren Spendergruppe stark erhöht ist und nach
Fraktur in beiden Altersgruppen stark ansteigt (siehe
Abbildung 18).
Abbildung 18: Serumspiegel von aktivem TGF-β.
Die Serumspiegel von aktivem und inaktivem TGF-β1 wurden bei jungen
(≤ 40 Jahre) und alten ≥ 70 Jahre Spendern mit und ohne Fraktur der
langen Röhrenknochen mittels eines Zytokinarrays bestimmt.
Zu Arbeitspaket 2 & 3: Analyse der mTOR Aktivität und dessen Expressionsprofil sowie Bottomup Analyse der daran beteiligten MAP-Kinasen via TSC1 und TSC2
Aufgrund technischer Schwierigkeiten waren wir gezwungen diese Arbeitspakete etwas zu verändern.
Trotz funktionierender Positivkontrolle konnten wir keine Western Blot Signale für den mTor Signalweg
(phospho-mTOR, phospho-p70S6K und verschiedene phospho-TSC2 Antikörper) in den Monozyten und
Granulozyten detektieren (siehe Abbildung 19).
Immune cells
1
2
3
4
5
6
7
8
+
p-mTOR (Ser2448)
p-p70S6K
p-TSC2
GAPDH
phospho-JNK
[rel protein levels]
3
2
1
0
JG
JF
ns
**
AG
***
AF
***
ns
ns
JG
1
2
JF
1
2
AF
AG
1
2
1
2
+
phospho-JNK
GAPDH
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Abbildung 19: Western Blot des mTOR
Signalweges.
Die Positivkontrolle (HEK Zellen) zeigten ein
starkes Signal für die angewendeten Antikörper. In
Monozyten und Granulozyten konnte kein Signal
detektiert werden.
Aus diesem Grund mussten wir die MAPKinasen
direkt untersuchen und konnten keine Vorauswahl
durch eine „bottom-up“ Analyse treffen. So haben
wir mittel Western Blot die Aktivierung der Protein
Kinase B (phospho-AKT), der c-Jun N-terminal
kinases (phospho-JNK), die extracellular signalregulated protein kinases 1 und 2 (phosphoERK1/2) und phopsho-p38. Phospho-AKT war in
den Immunzellen nicht nachweisbar. Die basale
Aktivierung von JNK (phospho-JNK) war in den
Granulozyten der älteren Spender stark erhöht und
sank nach Fraktur in beiden Altersgruppen
signifikant ab (siehe Abbildung 20).
Abbildung 20: Aktivierung der JNK in Granulozyten.
Repräsentativer Western Blot für phospho-JNK in Granulozyten
junger und alter Spender mit und ohne Fraktur. Sowie die
densitometrische Auswertung der Western Blot Signal aller
Spender.
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Im Gegensatz dazu war die basale Aktivierung der
extracellular signal-regulated protein kinases 1 und
2 (phospho-ERK1/2) in der älteren Spendergruppe
deutlich
geringer
als
in
der
jüngeren
Spendergruppe. Nach Fraktur sanken die phosphoERK1/2 Spiegel in den Granulozyten der jüngeren
Spender stark ab wohingegen die phospho-ERK1/2
Spiegel in den älteren Spendern durch die Fraktur
unbeeinflusst blieben (siehe Abbildung 21).
phospho-ERK1/2
[rel protein levels]
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
JG
JF
***
AG
***
AF
ns
ns
*** ns
JG
JF
AG AF
1 2 1 2 1 2 1 2 +
p-ERK1/2
GAPDH
phospho-p38
Die Aktivierung von p38 (phospho-p38) verhielt sich
genau gegensätzlich zur Aktivierung von ERK1/2
(phospho-ERK1/2). Die basale Aktivierung der p38
war in der älteren Spendergruppe verstärkt im
Vergleich zur jüngeren Spendergruppe. Nach
Fraktur stiegen die phospho-ERK1/2 Spiegel in den
Granulozyten beider Altersgruppen stark an (siehe
Abbildung 22).
20
[rel protein levels]
Abbildung 21: Aktivierung von ERK1/2 in Granulozyten.
Repräsentativer Western Blot für phospho-ERK1/2 in
Granulozyten junger und alter Spender mit und ohne Fraktur.
Sowie die densitometrische Auswertung der Western Blot Signal
aller Spender.
15
10
5
0
JG
JF
AG
ns
ns
**
ns
***
AF
***
JG
JF AG AF
1 2 1 2 1 2 1 2 +
phopsho-p38
GAPDH
Abbildung 22: Aktivierung von p38 in Granulozyten.
Repräsentativer Western Blot für phospho-p38 in Granulozyten
junger und alter Spender mit und ohne Fraktur. Sowie die
densitometrische Auswertung der Western Blot Signal aller
Spender.
Abschließend haben wir noch die Expression von Enzymen welche an der zellulären oxidativen Abwehr
beteiligt sind untersucht. Unsere Zielenzyme waren die Hemeoxygenase 1 (HO-1) sowie die Superoxide
dismutase 1 (SOD-1). HO-1 konnte in Granulozyten kaum detektiert werden, sodass eine
densitometrische Auswertung der Daten sehr unzuverlässig war.
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Der basale SOD-1 Spiegel hingegen war in den
älteren Spendern erhöht. Nach Fraktur stiegen de
SOD-1 Spiegel in der jüngeren Spendergruppe
stark an. In der älteren Spendergruppe hatte die
Fraktur kaum einen Einfluss auf die SOD-1
Expression in den Granulozyten (siehe Abbildung
23).
SOD-1
[rel protein levels]
1.5
1.0
0.5
0.0
JG
JF
**
AG
ns
**
AF
ns
*** ns
JG
JF AG AF
1 2 1 2 1 2 1 2 +
SOD-1
GAPDH
Abbildung 23: SOD-1 Expression in Granulozyten.
Repräsentativer Western Blot für phospho-p38 in Granulozyten
junger und alter Spender mit und ohne Fraktur. Sowie die
densitometrische Auswertung der Western Blot Signal aller
Spender.
7. Ausblick/Schlussfolgerungen
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Immunantwort von alten Patienten nach einer proximalen
Femorfraktion teilweise eine höhere Stressantwort (p-p38 Expression und Anstieg von inflammatorischen
Zytokinen) zeigen als junge Patienten mit einer vergleichbaren Fraktur. Parallel zeigt sich aber auch,
dass die damit verbundene erhöhte ROS Bildung bei alten Patienten nicht durch eine verstärkte
antioxidative Antwort kompensiert wird, während junge Patienten eine erhöhte Stressantwort mit einer
signifikant verstärkten SOD Expression beantworten. Alte Patienten zeigen eine signifikant reduzierte
basal p-ERK-1/2 Antwort, die nach einer Fraktur noch weiter abfällt während bei jungen Patienten sieht
man einen eindeutigen Abfall.
Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse eindeutig, dass die basale veränderte posttraumatische
Immunantwort im alten Menschen wohl entscheidend dazu beiträgt, wie Sauerstoffradikale kompensiert
werden. Bei jungen Patienten kann die Stressantwort kurzfristig kompensiert werden während bei alten
Patienten es scheinbar zu Verzögerungen in der Antwort kommt. Somit können ROS weiter
Gewebeschäden verursachen. Auffällig ist, dass GM-CSF, welches für die Rekrutierung von
Granulozyten/Makrophagen zur Eliminierung von Bakterien ist, eindeutig reduziert ist. Dies geht einher
mit der veränderten MAP-Kinasen Expression, die Teil des mTOR Signalweges sind. Dies könnte eine
Erklärung dafür sein warum ältere Patienten nach einem initialen Trauma einen erneuten Infekt schlecht
oder gar nicht abwehren können.
Basierend auf den hier gezeigten Ergebnissen führen wir zurzeit letzte Versuche durch, um ein
Manuskript zu erstellen. Dieses werden wir ihnen zu gegebenem Zeitpunkt zukommen lassen.
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