Dokument_15.

Untersuchungen zur Interaktion von Herpes Simplex Virus Typ 1
mit reifen Dendritischen Zellen
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Jutta Isolde Eisemann
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:17.09.2007
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Winkler
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Eckhart Kämpgen
…Sieh, wir liegen und warten ganz mit Ruh
von Agnes Miegel
Für meine Eltern
und „meine“ Zwerge Luca und Silja
Inhaltsverzeichnis
A Zusammenfassung
1
A Summary
3
B Einleitung
5
B.1. Das Immunsystem
5
B.1.1. Die angeborene Immunantwort
5
B.1.2. Die adaptive Immunantwort
6
B.2. Dendritische Zellen
7
B.2.1. Herkunft und DZ-Subtypen
7
B.2.2. Antigenaufnahme, Prozessierung und Reifung
8
B.2.3. T-Zell-Aktivierung
9
B.3. IFNγ-Signalweg, Proteasom und Immunoproteasom
10
B.3.1. Interferone
10
B.3.2. Das Proteasom
11
B.3.3. Das Immunoproteasom
13
B.4. Herpes Simplex Virus Typ 1
15
B.4.1. Allgemeines
15
B.4.2. Morphologie und Genom
16
B.4.3. Übertragung und Krankheitsformen
16
B.4.4. Immun-Evasionsmechanismen
17
B.5. Fragestellung
C Material und Methoden
C.1. Material
C.1.1. Zellen
18
19
19
19
C.1.1.1. Bakterienstämme
19
C.1.1.2. Eukaryonte Zelllinien
19
C.1.2. Viren
19
C.1.3. Nukleinsäuren
20
C.1.3.1. Oligonukleotide für die Klonierung
20
C.1.3.2. Oligonukleotide für die Sequenzierung
20
C.1.3.3. Oligonukleotide für semiquantitative RT-PCR
20
C.1.3.4. Oligonukleotide für quantitative Real Time PCR
21
C.1.3.5. Plasmide
21
C.1.3.5.1. Neu konstruierte Plasmide
21
C.1.3.5.2. Zur Verfügung gestellte Plasmide
C.1.4. Enzyme
21
21
C.1.4.1. restriktionsenzyme
21
C.1.4.2. Sonstige Enzyme
22
C.1.5. Antikörper
22
C.1.6. Medien
23
C.1.6.1. Medien für Bakterienkulturen
23
C.1.6.2. Medien für Zellkultur
23
C.1.7. Puffer und Lösungen
24
C.1.7.1. Puffer und Lösungen für Gelelektrophorese
24
C.1.7.1.1. Elektrophorese von Nukleinsäuren
24
C.1.7.1.2. Elektrophorese von Proteinen
24
C.1.7.2. Puffer und Lösungen für Western Blot
25
C.1.7.3. Puffer und Lösungen für Transfektion
25
C.1.7.4. Puffer und Lösungen für Plaque-Assay
25
C.1.7.5. Puffer und Lösungen für Durchflußzytometrie
25
C.1.8. Reagenzien und Chemikalien
25
C.1.8.1. Fertige Reagenzsysteme (Kits)
25
C.1.8.2. Chemikalien
26
C.2. Methoden
26
C.2.1. Zellen und Viren
26
C.2.1.1. Zellkultur
26
C.2.1.2. Virusvermehrung
27
C.2.1.3. Plaque-Assay
27
C.2.2. Nukleinsäuremethoden
28
C.2.2.1. DNA-Reinigung
28
C.2.2.2. DNA-Klonierung
28
C.2.2.3. Polymerasekettenreaktion
29
C.2.2.4. RNA Isolierung und reverse Transkription
29
C.2.2.5. Real Time-PCR und relative Quantifizierung
29
C.2.3. Biochemische und immunologische Methoden
30
C.2.3.1. Transiente Transfektion mit DEAE Dextran
30
C.2.3.2. Transiente Transfektion mit Amaxa
30
C.2.3.3. Immunopräzipitation
30
C.2.3.4. Western Blot
31
C.2.3.5. Durchflußzytometrie
31
D Ergebnisse
D.1. Einfluss der HSV-1 Infektion auf die Immunountereinheit LMP7
33
33
D.1.1. Die LMP7-spezifische mRNA ist in reifen DZ nach HSV-1 Infektion
reduziert
34
D.1.2. Die LMP7-spezifische mRNA wird nach HSV-1 Infektion scheinbar
nicht aktiv abgebaut
37
D.1.3. Die LMP7-Expresion in HSV-1-infizierten reifen DZ ist nicht
beeinflusst
38
D.1.4. Der Einbau von LMP7 in das Proteasom ist durch die HSV-1 Infektion
nicht beeinflusst
39
D.1.5. Das LMP7-Protein ist in reifen DZ sehr stabil
40
D.2. VP16 und das Proteasom
41
D.3. Einfluss der HSV-1 Infektion auf den IFNγ-Signalweg
45
D.3.1. Die mRNA der IFNγ-Rezeptor α-Kette ist in reifen DZ nach HSV-1
Infektion deutlich reduziert
45
D.3.2. Die Expression des IFNγ-Rezeptors an der Zelloberfläche von reifen
DZ ist nach HSV-1 Infektion reduziert
46
D.3.3. HSV-1 Infektion blockiert die IFNγ-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung
von STAT1
48
D.3.4. Die IRF-1-Expression ist in reifen DZ nach HSV-1 Infektion stark
reduziert und nicht mehr länger durch IFNγ induzierbar
E Diskussion
50
53
E.1. Untersuchungen zum LMP7-Protein nach HSV-1 Infektion
53
E.2. Untersuchungen zu möglicher Interaktion zwischen LMP7 und VP16
58
E.3. HSV-1 Infektion beeinflusst den IFNγ-Signalweg
59
F Abkürzungen
63
G Literaturverzeichnis
66
H Persönliche Veröffentlichungen
73
H.1. Wissenschaftliche Originalveröffentlichungen
73
H.2. Posterpräsentationen
73
I Lebenslauf
75
Zusammenfassung/Summary
1
A. Zusammenfassung
DZ spielen eine zentrale Rolle bei der Immunantwort. Aufgrund ihrer Lokalisation in den
peripheren Geweben ist es ihnen möglich, eindringende Pathogene aufzunehmen, Antigene zu
prozessieren und in den T-Zell-Arealen der Lymphknoten über MHC-Moleküle zu
präsentieren. Reife DZ sind die potentesten APZ, da sie als einzige APZ naive T-Zellen
stimulieren können und somit eine Immunantwort initiieren. Um sich einer potenten
antiviralen Immunantwort zu entziehen, haben Viren Mechanismen entwickelt, welche unter
anderem auch die Funktion von DZ beeinträchtigen. Dies gilt auch für einige Vertreter der
Herpesviren.
Das humanpathogene HSV-1 gehört zu den α-Herpesviren und etabliert im TrigeminusGanglion eine latente Infektion. HSV-1 unterdrückt durch einige, bereits beschriebene
Mechanismen, eine spezifische Immunantwort. Diese tragen dazu bei, dass das Immunsystem
die Viruspartikel nicht vollständig eliminieren, und somit eine persistente Infektion etabliert
werden kann. HSV-1 reduziert unter anderem die Antigenpräsentation über MHC-I-Moleküle,
indem die TAP-Funktion durch das virale ICP47 beeinflusst wird. Dadurch ist eine CTLvermittelte antivirale Immunantwort stark verzögert. Die Prozessierung von Peptiden, die
über MHC-I-Moleküle präsentiert werden, erfolgt größtenteils im Proteasom bzw.
Immunoproteasom. Von HCMV ist bekannt, dass es neben der TAP-Funktion auch die
Expression der Immunountereinheiten beeinflusst. Dies könnte auch für HSV-1 einen
wichtigen Immun-Evasions-Mechanismus darstellen. In dieser Arbeit wurde daher die
Expression der Immunountereinheit LMP7, die für den korrekten Zusammenbau des
Immunoproteasoms nötig ist, nach einer HSV-1 Infektion untersucht. Es konnte gezeigt
werden, dass nach der Infektion reifer DZ mit HSV-1 die Transkription des LMP7-Genes
unterbunden wird. Die hohe Stabilität des LMP7-Proteins in reifen DZ führt allerdings dazu,
dass nach Virusinfektion sowohl im Immunoproteasom als auch frei in der Zelle eine
konstante Menge dieser Immunountereinheit vorhanden ist.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine mögliche Interaktion des viralen Transaktivators VP16
mit LMP7 untersucht. Für andere persistierende Viren, wie HIV oder HCV, konnten direkte
Interaktionen von viralen Proteinen mit LMP7 gezeigt werden. Dadurch wurde die
proteolytische Aktivität des Immunoproteasoms so verändert, dass die MHC-I-Präsentation
Zusammenfassung/Summary
2
generierter Peptide reduziert war. Mit den in dieser Arbeit verwendeten Methoden konnte
jedoch keine direkte Interaktion von VP16 und LMP7 gezeigt werden.
Da die Expression der Untereinheiten des Immunoproteasoms nach einem IFNγ-Stimulus
induziert wird, wurde im dritten Teil der Arbeit der Einfluss der HSV-1 Infektion auf den
IFNγ-Signalweg untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die HSV-1 Infektion die
Signalkaskade an verschiedenen Stellen beeinflusst. Zum ersten Mal wurde hier infolge einer
HSV-1 Infektion eine reduzierte Expression der IFNγ-Rezeptor α-Kette sowohl auf mRNAals auch auf Proteinebene gezeigt. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass im Verlauf
der HSV-1 Infektion reife DZ immer weniger in der Lage sind, auf den IFNγ-Stimulus zu
reagieren und STAT1 zu phosphorylieren. Die direkte Folge war die deutlich reduzierte
Expression des Transkriptionsfaktors IRF-1, der unter anderem auch für die Transkription der
Immunountereinheiten verantwortlich ist. Experimente mit einer Virusmutante, in der das
vhs-Gen deletiert war, zeigten, dass die Inhibierung der STAT1-Phosphorylierung deutlich
reduziert war. Die Infektion der Zellen mit einem UV-inaktivierten wildtyp-Virus beeinflusste
jedoch die STAT1-Phosphorylierung nicht, was darauf hindeutet, dass die virale GenExpression für den beschriebenen Effekt notwendig ist.
Zusammenfassend konnte in dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass HSV-1 den IFNγSignalweg in reifen DZ an verschiedenen Stellen beeinflusst, und dass das virale vhs-Protein
an dem Mechanismus der Inhibierung der STAT1-Phosphorylierung beteiligt ist. Die
reduzierte IRF-1 Expression als Folge der verringerten STAT1-Phosphorylierung erklärt die
reduzierte LMP7-Transkription, wobei die Protein-Menge von LMP7 aufgrund der hohen
Stabilität konstant bleibt. Die Beeinflussung des IFNγ-Signalwegs stellt somit einen neuen
Mechanismus von HSV-1 dar, um eine antivirale Immunantwort zu modulieren.
Zusammenfassung/Summary
3
A. Summary
DC play a central role in the immune system. Due to their localization in the peripheral
tissues, they are able to take up invading pathogens, to process antigens and to present these
antigens on MHC-molecules to T-cell in the lymphnodes. Mature DC are the most potent
APC known today, as they can also stimulate naive T-cells and thus initiate immune
responses. Interference with essential functions of these extraordinary important immune cells
is a very potent mechanism for viruses to escape specific immune responses. For several
members of the herpesviruses examples for such strategies have been reported.
The human pathogenous HSV-1, a member of the α-herpesviridae, is able to establish latency
within the trigeminus ganglia. HSV-1 suppresses specific immune responses by several
mechanisms, and as a consequence the immune system fails to eliminate virus particles and
enables them to establish a persistent infection. Amongst others, HSV-1 reduces the antigenpresentation on MHC-I-molecules by interfering with the TAP function, so that a CTLmediated antiviral immune response is strongly reduced. The peptides presented on MHC-Imolecules are generated in the proteasome or immunoproteasome. For HCMV it is known,
that it not only interferes with the TAP function, but also with the expression of the
immunosubunits. This could also be true for HSV-1. As LMP7 is essential for the correct
assembly of the immunoproteasome, the expression of this immunosubunit has been
investigated in HSV-1-infected mature DC. Although the transcription of LMP7 is strongly
suppressed following HSV-1 infection, no influence on LMP7 protein-levels, neither
incorporated in the immunoproteasome nor free in the cell could be detected, due to the high
stability of the LMP7 protein.
In the second part of this work a possible interaction between the viral transactivator VP16
and LMP7 has been examined. For other persistent viruses, such as HIV or HCV, direct
interactions of viral proteins with LMP7 have been shown. As a consequence of these
interactions the proteolytic activity of the immunoproteasome was changed, so that the MHCI-presentation of generated peptides was reduced. However, with the methods used here, we
could not reveal a direct interaction between VP16 and LMP7.
As the expression of the immunosubunits can be induced by IFNγ, the third part of this thesis
focused on the influence of HSV-1 on the IFNγ signalling pathway in mature DC. So far, the
Zusammenfassung/Summary
4
effect of HSV-1 infection on IFNγ signalling has only been investigated in cell lines. Here we
report for the first time, that HSV-1 infection reduces IFNγ receptor α-chain expression on
mRNA and protein levels in mature DC. Furthermore, an inhibition of STAT1
phosphorylation following HSV-1 infection has been observed. As a direct consequence of
this inhibition, the expression of the transcription factor IRF-1, which is vital for the
transcription of the immunosubunits, was strongly reduced. Experiments using a virus with a
deleted vhs-gene showed a reduced inhibition of the STAT1 phosphorylation. Infection with a
UV-inactivated replication incompetent virus did not influence the STAT1 phosphorylation,
indicating that viral gene expression is neccessary to exert these effects.
In summary, we could show that HSV-1 blocks IFNγ-induced signal transduction in mature
DC, and that the viral vhs protein is involved in the inhibition of STAT1 phosphorylation.
The reduced IRF-1 levels could explain the reduced LMP7 transcription, however as the
protein is very stable in mature DC the protein levels of LMP7 remained constant. Thus the
influence on the IFNγ signalling pathway is a new mechanism of HSV-1 to delay an antiviral
immune response.
Einleitung
5
B. Einleitung
B.1. Das Immunsystem
Das Immunsystem ist ein hochkomplexes System, welches aus einer Vielzahl von Organen,
Zellen und Molekülen besteht. Alle Aufgaben des Immunsystems dienen dem Schutz des
Organismus. Typische Krankheitserreger sind Bakterien, Viren, Pilze oder Parasiten. Aber
auch Veränderungen im Inneren des Organismus, z.B. entartete Zellen, die sich unkontrolliert
teilen, stellen eine Bedrohung dar. Die Zellen des Immunsystems stammen von Stammzellen
des Knochenmarks ab. Fast alle Immunzellen zirkulieren in den Blutgefäßen und
Lymphbahnen des Körpers. So gelangen sie in alle Gewebe, einschließlich der Schleimhäute.
Aufgrund der unterschiedlichen Funktionen und Aufgaben unterscheidet man die angeborene
von der erworbenen bzw. adaptiven Immunantwort.
B.1.1. Die angeborene Immunantwort
Die angeborene Immunabwehr ist unspezifisch und für die ersten Abwehrreaktionen auf
Infektionen verantwortlich. Zu den angeborenen oder unspezifischen Abwehrmechanismen
zählen anatomische und physiologische Barrieren wie der Säuremantel der Haut oder die
intakte Epidermis sowie inflammatorische Antworten durch Interferone und Interleukine. Zu
den Zellen der unspezifischen Immunantwort gehören Monozyten, Makrophagen,
Granulozyten, Dendritische Zellen (DZ) und Natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Ein Teil
dieser Zellen, z. B. Makrophagen und NK-Zellen, kann die Erreger selbst eliminieren.
Außerdem sind die Zellen der angeborenen Immunantwort in der Lage, bestimmte, in der
Evolution hoch konservierte Strukturen zu erkennen (Janeway, 1997). Beispiele dieser
Strukturen, auch Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs) genannt, sind
Lipopolysaccharide (LPS), Peptidoglykane (PG), Lipoteichonsäuren (LTA), Mannane,
Glykane, bakterielle DNA und doppelsträngige RNA (Aderem et al., 2000; Medzhitov et al.,
2000). Erkannt werden die Strukturen von bestimmten Rezeptoren, sogenannte Pattern
Recognition Receptors (PRRs), die auf verschiedenen antigenpräsentierenden Zellen, wie
Makrophagen, Dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert werden (Janeway, Jr., 1989;
Medzhitov et al., 1997). Zu den PRRs gehören die Rezeptoren der Toll-Familie, die
sogenannten Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLR). Nachdem die TLR Pathogene erkannt haben,
Einleitung
6
wird das Signal in die Zelle weitergeleitet und am Ende der Signalkaskade die Expression
verschiedener Gene der Immunantwort induziert.
B.1.2. Die adaptive Immunantwort
Die adaptive oder erworbene Immunabwehr zeichnet sich durch das spezifische Erkennen von
körperfremden Antigenen aus. Dadurch werden gezielte zelluläre Abwehrmechanismen
ausgelöst, d.h. entweder werden Antikörper gebildet oder es findet eine T-Zell-vermittelte
Immunantwort statt. Neben antigenpräsentierenden Zellen (APZ) wie DZ, sind die
maßgeblichen Zellen der adaptiven Immunantwort die B- und T-Lymphozyten. Beide
Zelltypen stammen von lymphatischen Stammzellen aus dem Knochenmark ab, aber die
Differenzierung und Vermehrung findet in zwei unterschiedlichen primären Lymphorganen
statt. Die Entwicklung der B-Lymphozyten erfolgt im Knochenmark, während TLymphozyten im Thymus ausreifen und selektioniert werden. Nach Reifung der Zellen
gelangen diese über die Blutbahn und die Lymphe zu den sekundären Lymphorganen, wo sie
in den so genannten B- und T-Zellarealen akkumulieren (Janeway, 1997).
Die Aufgabe der B-Lymphozyten besteht darin, mit ihren B-Zell-Rezeptoren körperfremde
Antigene zu erkennen und daraufhin entsprechende Antikörper zu produzieren. Im
menschlichen Organismus gibt es rund 109 bis 1010 verschiedene spezifische B-Zellen, die
sich in ihren durch V(D)J-Rekombination entstandenen Rezeptoren unterscheiden. Nach
Bindung eines Antigens an den Rezeptor kommt es zur Aktivierung der B-Zelle. Derart
aktivierte
B-Lymphozyten
proliferieren
stark
und
differenzieren
zu
Antikörper-
produzierenden Plasmazellen oder Gedächtniszellen. Aufgabe der Gedächtniszellen ist es, bei
erneutem Kontakt mit ihrem Antigen die Ausschüttung spezifischer Antikörper schneller und
in hohen Konzentrationen zu induzieren. Die Produktion Pathogen-spezifischer Antikörper
wird auch als humorale Immunität bezeichnet. Im Gegensatz zu T-Lymphozyten sind BZellen in der Lage, auch freie Antigene zu binden und eine Immunantwort auszulösen, was
vor allem bei Toxinen eine wichtige Rolle spielt (Janeway, 1997).
Im Unterschied dazu induzieren T-Lymphozyten eine zellvermittelte Immunantwort. T-Zellen
tragen einen T-Zell-Rezeptor auf ihrer Oberfläche. Dieser erkennt ein prozessiertes Peptid nur
im Komplex mit einem körpereigenen Molekül, dem Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC). Hierbei unterscheidet man zwischen MHC-Molekülen der Klasse I (MHC-I-
Einleitung
7
Moleküle), welche sich auf der Oberfläche jeder kernhaltigen Zelle befinden, und MHCMolekülen der Klasse II (MHC-II-Moleküle), die fast ausschließlich von professionellen APZ
exprimiert werden. Zu den professionellen APZ gehören Makrophagen, B-Zellen und DZ. Die
Präsentation von Fremdantigenen über MHC-I-Moleküle führt zur Aktivierung CD8+
zytotoxischer T-Zellen. Zur vollständigen Aktivierung sind jedoch noch weitere Interaktionen
zwischen den Zellen notwendig. Dadurch kommt es zur Eliminierung der Fremdantigenpräsentierenden Zellen. Im Gegensatz dazu werden Peptide, die auf MHC-II-Molekülen
präsentiert werden, von CD4+ T-Helfer-Zellen (Th-Zellen) erkannt. Durch diesen Kontakt
und weitere kostimulatorische Zell-Zell-Interaktionen sowie lösliche Faktoren, nämlich den
Zytokinen, werden die Th-Zellen aktiviert; differenzieren und können ihre Effektorfunktion
ausführen (Janeway, 1997).
B.2. Dendritische Zellen
DZ spielen eine zentrale Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort. Sie
haben eine wichtige Funktion bei der Antigenprozessierung und –präsentation. DZ gelten als
die potentesten APZ (Banchereau et al., 1998), da sie als einzige APZ naive T-Zellen
aktivieren können und somit eine adaptive Immunantwort induzieren.
B.2.1. Herkunft und DZ-Subtypen
Erstmals wurden DZ im Jahre 1973 beschrieben, als Steinman und Cohn aus der Milz von
Mäusen Zellen isolierten und sie aufgrund ihrer lang gestreckten Fortsätze als „dendritische
Zellen“ bezeichneten (Steinman et al., 1973). Bereits 100 Jahre zuvor entdeckte der
Medizinstudent Paul Langerhans spezielle Zellen in der Epidermis, die so genannten
„Langerhanszellen“ (LZ) (Langerhans, 1868), welche später ebenfalls als eine Subpopulation
der DZ charakterisiert wurden (Schuler et al., 1985; Schuler et al., 1993). Sowohl alle DZSubpopulationen, als auch die übrigen Leukozyten, entstehen aus CD34+ hämatopoietischen
Stammzellen im Knochenmark (Shortman et al., 2002). Allerdings bilden sie keine homogene
Population, sondern unterscheiden sich untereinander sowohl phänotypisch als auch
funktionell. In Abhängigkeit von verschiedenen Wachstumsfaktoren und Zytokinen erfolgt
die Differenzierung der verschiedenen DZ-Subpopulationen. Im peripheren Blut des humanen
Systems unterscheidet man die klassischen bzw. konventionellen DZ von den plasmazytoiden
Einleitung
8
DZ (pDZ). Die Hauptaufgabe der pDZ besteht vor allem in der Sekretion von antiviralen TypI Interferonen. Außerdem sind sie an der Ausbildung Virus-spezifischer T-Zell-Antworten
beteiligt (Zhang et al., 2005). Die klassischen DZ übernehmen eine entscheidende Rolle in der
Immunabwehr, da sie effiziente Mechanismen zur Antigenaufnahme besitzen. Auch die in der
Epidermis im unreifen Zustand lokalisierten Langerhans Zellen (LZ), eine weitere
Subpopulation, können sehr effizient Antigene aufnehmen (Banchereau et al., 2000). LZ
werden vor allem durch Birbeck-Granula und E-Cadherin-Expression charakterisiert. Ein
weiteres Charakteristikum dieser Zellen ist deren Abhängigkeit von Transforming Growth
Factor β (TGFβ), bezogen auf ihre Differenzierung (Herbst et al., 1996; Strunk et al., 1996;
Tang et al., 1993).
B.2.2. Antigenaufnahme, Prozessierung und Reifung
Dendritische Zellen zeichnen sich durch ihre hohe Effizienz bei der Phagozytose von
Pathogenen, der Prozessierung von Antigenen und der Präsentation von Peptiden über MHCMolekülen der Klassen I und II aus. Unreife dendritische Zellen sind in der Peripherie
lokalisiert. Dabei ist der unreife Zustand dadurch gekennzeichnet, dass wenige MHC-IIMoleküle, wenige kostimulatorische Moleküle, wie CD80 und CD86, und kein CD83 an der
Oberfläche vorhanden sind (Banchereau et al., 1998).
Die
Aufnahme
von
Antigenen
durch
unreife
DZ
erfolgt
mittels
Phagozytose,
Makropinozytose oder rezeptorvermittelter Endozytose (Thery et al., 2001). Durch die
Aufnahme werden DZ aktiviert und wandern innerhalb der lymphatischen Gefäße zu den
regionalen Lymphknoten und über das Blut zu den peripheren Lymphorganen. Während
dieser Migration reifen DZ aus. Nach Induktion der Reifung werden die exogen
aufgenommenen Proteine in den Lysosomen abgebaut. Die dadurch entstandenen Peptide
werden auf MHC-II-Moleküle geladen , die, wie bereits beschrieben, fast ausschließlich auf
der Oberfläche von APZ zu finden sind (Inaba et al., 2000) und deren Expression während der
DZ-Reifung stark erhöht wird (Turley et al., 2000). Die beladenen MHC-II-Moleküle
verlassen die Lysosomen, akkumulieren schließlich auf der Zelloberfläche und werden dort
über mehrere Tage stabil exprimiert (Cella et al., 1997).
Zusätzlich werden während der Reifung und der Migration zu den Lymphknoten in DZ auch
die notwendigen Untereinheiten der Immunoproteasomen exprimiert, welche für die
Einleitung
9
effektivere Prozessierung von Fremd-Antigenen notwendig sind (Macagno et al., 1999). Die
Expression von MHC-I-Molekülen wird deutlich verstärkt (Rescigno et al., 1998), um noch
mehr Antigene präsentieren zu können. Ebenso wie jede andere kernhaltige Zelle,
exprimieren auch DZ MHC-I-Moleküle mit endogenen Antigenen auf ihrer Oberfläche.
Allerdings besteht ihre Aufgabe, neben der Präsentation von Selbst-Antigenen, eher darin,
Peptide viraler Herkunft oder aus Tumoren zu präsentieren. Die Beladung der MHC-IMoleküle findet im Endoplasmatischen Reticulum (ER) statt. Die im Proteasom und
Immunoproteasom prozessierten Peptide werden mit Hilfe des Transporter assoziiert mit
Antigenprozessierung (TAP) in das ER geschleust (Howard, 1995) und binden dort stabil an
MHC-I-Moleküle. Nach erfolgreicher Peptidbeladung werden die MHC-I-Moleküle zur
Zelloberfläche transportiert.
DZ sind zusätzlich in der Lage, exogen aufgenommene Antigene über MHC-I-Moleküle zu
präsentieren (Shen et al., 1997). Diese Art der Präsentation wird als „Kreuz-Präsentation“
oder „Cross-Priming“ bezeichnet. Dadurch wird eine Antwort von CD8+ zytotoxischen TZellen auch gegen extrazelluläre Antigene ermöglicht (Thery et al., 2001).
Der Prozess der Reifung wird durch Antigenaufnahme oder Infektion initiiert. Bei reifen DZ
ändert sich deren Morphologie und Funktion. Unter anderem verlieren reife DZ ihre Fähigkeit
Antigene zu phagozytieren (Sallusto et al., 1995). Allerdings exprimieren reife DZ unter
anderem sehr stark kostimulatorische Moleküle, wie CD80 und CD86, und den ChemokinRezeptor CCR7. Durch eine deutlich verstärkte CCR7-Expression an der Oberfläche finden
die DZ ihren Weg entlang des Chemokingradienten MIP3β in die Lymphknoten. Auch die
Expression von MHC-Molekülen der Klasse I und II wird stark erhöht. Vor allen Dingen
zeichnet sich eine reife DZ durch die Oberflächenexpression von CD83 aus. Zusätzlich zu den
phänotypischen kann man auch morphologische Veränderungen beobachten, wie zum
Beispiel die Ausbildung langer zytoplasmatischer Fortsätze, welche als „Dendriten“
bezeichnet werden. Außerdem besitzen reife DZ eine hohe Kapazität, Antigen zu präsentieren
und naive T-Zellen zu Effektorzellen differenzieren zu lassen und diese zu expandieren.
B.2.3. T-Zell-Aktivierung
Nachdem die DZs im Lymphknoten angelangt sind, ist es ihre Aufgabe T-Lymphozyten zu
aktivieren. In den T-Zellarealen des regionalen Lymphknotens präsentieren DZs die antigenen
Einleitung
10
Strukturen auf MHC-Molekülen. Die Präsentation auf MHC-II-Molekülen führt zur
Erkennung des Antigens durch CD4+ T-Helfer-Zellen (Th-Zellen) mittels T-Zellrezeptoren.
Es kommt nachfolgend zu Proliferation und Differenzierung der Th-Zellen. Diese spielen
unter anderem bei der Aktivierung von B-Zellen und der daraus folgenden Differenzierung zu
Antikörper-produzierenden Plasmazellen eine entscheidende Rolle. Die Präsentation
endogener Peptide oder die Kreuzpräsentation exogener Antigene über MHC-I-Moleküle
führt zur Aktivierung CD8+ zytotoxischer T-Zellen, woraus eine Eliminierung dieser Zellen
resultiert.
B.3. IFNγ-Signalweg, Proteasom und Immunoproteasom
B.3.1. Interferone
Interferone (IFN) sind Proteine oder Glykoproteine, die bei der Immunantwort auf virale
Infektionen eine wichtige Rolle spielen. Typ I Interferone, also IFNα und IFNβ, werden bei
einer viralen Infektion von verschiedenen Zelltypen produziert. Ein Beispiel dafür sind
plasmazytoide DZs, eine DZ-Subpopulation, die große Mengen Typ I Interferone produzieren
kann (Liu, 2005). IFNα und IFNβ haben eine nahezu gleichwertige antivirale Wirkung. Die
nach einer Virusinfektion ausgeschütteten Interferone aktivieren umliegende, sowohl bereits
infizierte als auch noch nicht infizierte Zellen. Dadurch werden in den aktivierten Zellen
Proteine gebildet, die zum einen in diesen Zellen eine weitere Proteinsynthese hemmen. Zum
anderen bewirken sie den Abbau von viraler und zellulärer RNA. Außerdem werden in
IFNα− bzw. IFNβ−aktivierten Zellen vermehrt MHC-I-Moleküle und Proteasomen
exprimiert. Dadurch können verstärkt CD8+ zytotoxische T-Zellen aktiviert werden.
Typ II Interferon, IFNγ, spielt ebenfalls eine wichtige Rolle während der Immunantwort auf
virale Infektionen, weil es die Transkription von Genen, die an der Immunantwort beteiligt
sind, induziert. IFNγ ist ein dimeres, zweifach glykolisiertes Protein und wird von CD4+ und
CD8+ T-Zellen sowie aktivierten Natürliche Killer Zellen (NK-Zellen) gebildet. Der IFNγRezeptorkomplex besteht aus zwei Untereinheiten, der α- und der ß-Kette und die
Signaltransduktion wird über die Jak/STAT-Kaskade vermittelt (Abb. 1). Die Bindung des
IFNγ−Dimers an die α-Kette des IFNγ−Rezeptors führt zu einer Dimerisierung der α- und βKette des Rezeptors. Beide Ketten sind konstitutiv assoziiert mit Mitgliedern der Janus
Einleitung
11
Kinasen (Jak), die α-Kette mit Jak1 und die β-Kette mit Jak2. Die Zusammenlagerung des
Rezeptor-Komplexes führt zur Transphosphorylierung und somit zur Aktivierung von Jak1
und Jak2. Durch diese Phosphorylierung entsteht eine Bindestelle für Signal transducer and
activator of transcription 1 (STAT1). Es folgt eine Tyrosin-Phosphorylierung von STAT1
durch Jak1/2. Phosphoryliertes STAT1 löst sich vom Rezeptor-Komplex ab, homodimerisiert
und gelangt so in den Zellkern. Dort bindet es als Transkriptions-Aktivator-Komplex an die
gamma-activated sequences (GAS) in der Promotorregion von IFNγ-induzierbaren Genen.
(Darnell, Jr. et al., 1994). Eines dieser Gene ist Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1),
welches wiederum als Transkriptionsfaktor für eine Vielzahl von Genen dient, die an der
IFNγ-vermittelten Immunantwort beteiligt sind (Pine, 1997).
Abb. 1: Schematische Darstellung der IFNγ−Signalkaskade. Nach Bindung von IFNγ an die αKette des IFNγ−Rezeptors bildet sich der Rezeptorkomplex, bestehend aus α- und β-Kette. Die αKette ist assoziiert mit Jak1, die β-Kette mit Jak2. Durch die Komplexbildung werden Jak1/2 durch
Phosphorylierung aktiviert. Es folgt eine Phosphorylierung von STAT1 durch Jak1/2. Phosphoryliertes
STAT1 homodimerisiert, gelangt in den Kern und bindet dort an die GAS-Region in Promotoren von
IFNγ-induzierbaren Genen.
B.3.2. Das Proteasom
Das Proteasom spielt eine zentrale Rolle in jeder Säugerzelle, da es den wichtigsten
Abbauweg intrazellulärer Proteine darstellt (Rock et al., 1994). Abgebaut werden zum einen
defekte, falsch gefaltete oder unvollständige Proteine und zum anderen spielt das Proteasom
Einleitung
12
eine wichtige Rolle bei der Antigenpräsentation. Im Rahmen des Ubiquitin-abhängigen
Proteinabbaus werden Peptide generiert, die auf MHC-I-Molekülen präsentiert werden.
Abb. 2: Schematische Darstellung der Ubiquitinkonjugation an Substrate, welche abgebaut
werden sollen. Freies Ubiquitin wird durch Interaktion mit einem E1-Enzym aktiviert und
anschließend kovalent an ein E2-Enzym gebunden. Die Substraterkennung erfolgt durch E3-Ligasen,
welche nach Bindung an den Ubiquitin-E2-Komplex die Übertragung des Ubiquitin auf das Substrat
vermitteln. Nach Polyubiquitinylierung wird das Substrat im 26S-Proteasom degradiert. E1: E1aktivierendes Enzym; E2: Ubiquitin-carrier-protein E2; E3: E3-Ubiquitin-Protein-Ligase.
Proteine, die zum Abbau bestimmt sind, werden mit einer Kette aus mindestens vier
Ubiquitin-Molekülen markiert (Voges et al., 1999) (Abb. 2). Die Markierung erfolgt mit Hilfe
einer Enzymkaskade bestehend aus E1-, E2- und E3-Enzymen. Das Enzym E1 aktiviert in
einem ATP-abhängigen Prozess das Ubiquitin, ein hochkonserviertes 8 kDa schweres
Einleitung
13
Polypeptid, und überträgt es auf das Ubiquitin carrier protein E2. Eine Ubiquitin-ProteinLigase E3 bindet sowohl E2 als auch das Substrat und überträgt das Ubiquitin auf dieses bzw.
auf ein bereits an das Protein gebundenes Ubiquitin (Glickman et al., 2002). Eukaryontische
Zellen enthalten dabei möglicherweise mehrere hundert E3-Ligasen, die charakteristische
Degradations-Signale der Proteine erkennen und so die Spezifität des Markierungswegs
ermöglichen (Kisselev et al., 2001). Vor dem Abbau der Proteine durch das Proteasom
werden die Ubiquitin-Moleküle entfernt und stehen so dann wieder zur Verfügung.
Das 26S Proteasom ist eine multikatalytische Peptidase, die polyubiquitinierte Proteine
schnell in kleine Peptide spaltet. Das 20S Proteasom, das sogenannte core-Partikel, ist der
katalytische Kern und besteht aus vier heptameren Ringen, die übereinander angeordnet sind
(Zwickl et al., 1992). Dabei sind die beiden äußeren α-Ringe und die beiden inneren β-Ringe
identisch. Während die α-Untereinheiten eine strukturgebende Funktion erfüllen, tragen die
β-Untereinheiten β1 (Y), β2 (Z) und β5 (X) die proteolytische Aktivität (Tanaka et al., 1992).
Durch diese werden dem Proteasom zugeführte Proteine in Oligopeptide von 7 bis 11
Aminosäuren Länge gespalten (Akopian et al., 1997; Zwickl et al., 1994). Die proteolytische
Aktivität des Proteasoms schneidet Proteine nach hydrophoben, basischen und sauren
Aminosäureresten (Orlowski, 1990; Rivett, 1989).
An die α-Ringe bindet der 19S Regulatorkomplex. Das 20S core-Partikel bildet zusammen
mit je einem 19S Regulatorkomplex pro α-Ring das 26S Proteasom (Abb. 3). Die zum Abbau
bestimmten Proteine werden vom 19S Regulator des 26S Proteasoms gebunden, entfaltet und
vom 20S core-Partikel abgebaut (Goldberg et al., 2001). Vermutlich wird, mit Hilfe einer
Isopeptidase-Aktivität, durch den 19S Regulator die Polyubiquitinkette vom Substrat
abgespalten (van Nocker et al., 1996)
B.3.3. Das Immunoproteasom
Das von aktivierten T- oder NK-Zellen sezernierte IFNγ führt in MHC-I-Peptidpräsentierenden Zellen zur Expression zahlreicher an der Immunantwort beteiligter Proteine.
Unter anderem werden per de novo-Assemblierung Immunoproteasomen gebildet. Ein
wesentlicher Unterschied zum konstitutiven 26S Proteasom besteht darin, dass die
Untereinheiten β1 (Y), β2 (Z) und β5 (X) gegen die Immunountereinheiten β1i (low
molecular weight protein 2 [LMP2]), β2i (multicatalytic endopeptidase complex-like 1
Einleitung
14
[MECL1]) und β5i (LMP7) ausgetauscht werden (Frentzel et al., 1994) (Abb. 3). Die
Transkription der Untereinheiten des Immunoproteasoms werden durch IFNγ-induziertes IRF1 reguliert (Namiki et al., 2005). Außerdem wird der zusätzliche Regulator-Komplex 11S,
auch PA28 genannt, gebildet. Die proteolytische Aktivität des Immunoproteasoms ist durch
den Einbau der Immunountereinheiten verändert, denn nun werden Proteine verstärkt nach
basischen, hydrophoben und verzweigten Aminosäureresten geschnitten. Die gebildeten
Peptide besitzen eine höhere Affinität zu TAP- und MHC-I-Molekülen (Kuckelkorn et al.,
1995). Der Regulator-Komplex PA28 dient vermutlich der schnelleren Peptidfreisetzung
(Tanahashi et al., 2000). Dass die Immunountereinheiten für die Antigenpräsentation sehr
wichtig sind, konnte auch in vivo gezeigt werden. LMP7-knockout Mäuse konnten einige
Antigene deutlich schlechter präsentieren und wiesen zusätzlich eine reduzierte MHC-IExpression auf (Fehling et al., 1994). Mäuse, denen das LMP2-Protein fehlte, hatten zwar
eine normale MHC-I-Expression, allerdings eine reduzierte Zahl an CD8+ T-Zellen und somit
eine schlechtere Immunantwort der zytotoxischen T-Zellen auf virale Peptide (Van Kaer et
al., 1994). Die IFNγ-induzierte Expression des Immunoproteasoms steigert somit die AntigenPräsentation auf MHC-I-Molekülen und dadurch die Immunantwort gegen infizierte bzw.
maligne entartete Zellen durch zytotoxische T-Zellen.
Abb. 3: Schematische Darstellung des Umbaus vom 26S Proteasom zum Immunoproteasom. Der
20S Kern (core) setzt sich aus zwei äußeren Ringen mit jeweils sieben α-Untereinheiten und zwei
inneren Ringe aus jeweils sieben ß-Untereinheiten zusammen. Diese beherbergen das katalytische
Zentrum. Für die katalytischen Aktivitäten sind ß1, ß2 und ß5 verantwortlich. Der 19S RegulatorKomplex besteht aus zwei Subkomplexen: dem Basis-Komplex (Base) und dem Deckel-Komplex
(Lid). Das 20S Proteasom mit zwei gebundenen 19S Regulator-Komplexen bildet das 26S Proteasom.
Nach IFNγ−Stimulus werden die Immunountereinheiten LMP2, MECL1 und LMP7 gebildet und
anstelle der Untereinheiten Y, Z und X während einer de novo Synthese eingebaut. Das so entstandene
Immunoproteasom setzt sich zusammen aus einem 20S Kern, einem 19S regulatorischen Komplex
und einem 11S Komplex (Aktivator).
Einleitung
15
B.4. Herpes Simplex Virus Type 1
B.4.1. Allgemeines
Herpesviren, Familie Herpesviridae, zeichnen sich durch ein relativ großes, lineares DNAGenom, ein umhülltes ikosaedrisches Kapsid und die Fähigkeit aus, lebenslang in ihrem Wirt
zu persistieren. Das virale Genom wird unter permissiven Bedingungen vermutlich nach dem
rolling-circle-Mechanismus repliziert; das persistierende virale Genom bleibt als nicht
integrierte, zirkuläre episomale DNA erhalten und wird in stabiler Kopienzahl an die
Tochterzellen weitergegeben. Unter den humanen Herpesviren, die in drei Subfamilien Alpha,
Beta- und Gammaherpesviridae eingeteilt werden, finden sich zum Beispiel Herpes Simplex
Virus Typ 1 und 2, Varizella-Zoster-Virus (Alphaherpesviridae), Cytomegalovirus
(Betaherpesviridae) und Ebstein-Barr-Virus (Gammaherpesviridae). Herpesviren sind weit
verbreitet. Bei Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) geht man von einer Durchseuchungsrate der
Bevölkerung von über 90% aus.
Abb. 4: Schematische Darstellung des Viruspartikels und des linearen Genoms des Herpes
Simplex Virus 1. (A) Das virale Partikel setzt sich zusammen aus Lipidhülle, Tegument und Kapsid
mit viraler DNA. (B) Das Genom umfasst etwa 150 kb, zusammengesetzt aus den für die Genprodukte
kodierenden UL- und US-Segmenten und den flankierenden terminalen (TRL bzw. TRS) und internen
(IRL bzw. IRS) Sequenzwiederholungen.
Einleitung
16
B.4.2. Morphologie und Genom
Ein HSV-1 -Partikel besteht aus einer Lipid-Doppelmembran, in der zahlreiche virale
Glykoproteine verankert sind. Diese Hülle umschließt ein dicht amorphes Proteingel, das so
genannte Tegument, welches das Kapsid enthält. Mit seiner robusten ikosaedrischen
Proteinstruktur umhüllt das Kapsid die virale DNA (Abb. 4A). Das lineare, doppelsträngige
DNA-Genom von HSV-1 umfasst etwa 150 kb und besteht aus zwei Segmenten, dem langen
singulären UL-Segment und dem kurzen ebenfalls singulären US-Segment, von denen jedes
von terminalen (TRL bzw. TRS) und internen (IRL bzw. IRS) Sequenzwiederholungen flankiert
ist. Die UL- und US-Segmente kodieren insgesamt für mindestens 72 Genprodukte, die je nach
Zeitpunkt ihrer Expression im Lebenszyklus klassifiziert sind. Die Genexpression lässt sich in
drei Phasen unterteilen: zuerst werden die sehr frühen Gene (Immediate Early, IE) exprimiert,
deren Genprodukte als Transaktivatoren für die Expression der frühen (Early, E), und deren
Genprodukte für die späten (Late, L) Gene essenziell sind. Die schematische Organisation des
viralen Genoms ist in Abb. 4B dargestellt.
B.4.3. Übertragung und Krankheitsformen
Die Ansteckung mit HSV-1 erfolgt durch Tröpfcheninfektion. Zunächst werden Haut- oder
Schleimhautzellen
infiziert.
Während
dieser
Primärinfektion
findet
der
lytische
Replikationszyklus statt. Die neu entstandenen, freigesetzten Viren gelangen über sensorische
Axone in das Trigeminus-Ganglion. Hier etabliert das Virus eine latente Infektion, wobei die
virale DNA als Episom im Zellkern vorliegt. Eine Reaktivierung des latenten Virus durch
bestimmte Einflüsse wie Stress, Hormonschwankungen, Krankheit oder UV-Strahlung, führt
erneut zu einer lytischen Replikation. Hierbei werden Nervenzellen zerstört und die dann
freigesetzten Viren infizieren wieder Epithelzellen, so dass eine akute Herpeserkrankung mit
den typischen Herpesbläschen auftritt (Herpes labialis) (Daheshia et al., 1998; Whitley et al.,
2001). Außerdem können nach HSV-Infektionen Erkrankungen der Augenhornhaut (Herpes
corneae) und des zentralen Nervensystems (Herpes enzephalitis, Herpes meningitis) auftreten
(Whitley et al., 2001).
Einleitung
17
B.4.4. Immun-Evasionsmechanismen
Obwohl DZ in der Lage sind durch Peptidpräsentation über MHC-Moleküle eine antivirale
Immunantwort zu induzieren (Ludewig et al., 1998), kann das Immunsystem im Falle von
HSV-1 die Viruspartikel nicht eliminieren, und somit eine persistente Infektion nicht
verhindern (Becker, 2002; Becker, 2003; Whitley et al., 2001). Das Virus entzieht sich in der
Latenz einer Immunantwort, indem das virale Genom zwar als Episom in den Nervenzellen
vorliegt, durch eine Komplexbildung mit Histonen aber keine Proteinsynthese stattfindet
(Maillet et al., 2006). Somit werden keine Peptide generiert, die über MHC-Moleküle
präsentiert werden können. Auch die DZ-Funktion der Antigenpräsentation ist durch HSV-1
beeinflusst (Kobelt et al., 2003).
Einige Mechanismen, mit denen HSV-1 eine spezifische Immunantwort unterdrückt, sind
bereits beschrieben. Das virale Infected Cell Protein (ICP) 47 beeinflusst die TAP-Funktion
und verhindert so einen Transport von Peptiden in das ER. Dabei bindet ICP47 mit einer
hohen Affinität an TAP und blockiert somit die Bindestellen für die generierten Peptide.
Dadurch ist die Erkennung der HSV-1-infizierten Zellen durch CD8+ zytotoxische T-Zellen
inhibiert (Ahn et al., 1996; Goldsmith et al., 1998; Hill et al., 1995). Die Infektion von reifen
DZ mit HSV-1 hat eine signifikant reduzierte Expression von CD83 auf der Zelloberfläche
zur Folge (Kruse et al., 2000). Dabei spielt ICP0, ein IE-Protein von HSV-1, eine
entscheidende Rolle (Kummer et al., 2007). Durch die deutlich verringerte CD83 Expression
auf der Zelloberfläche von infizierten DZ ist die Fähigkeit der Zellen, T-Zellen zu stimulieren,
stark reduziert (Kruse et al., 2000).
Außerdem spielt die RNase Aktivität des HSV-1 virion host shut off (vhs) Proteins eine Rolle
bei der generellen Destabilisierung von zellulären RNAs. Vhs ist eine mRNA-spezifische
RNase, die sehr schnell zelluläre RNAs abbaut, aber auch beteiligt ist an der Blockierung der
zellulären Protein-Synthese und an der Zerstörung von polyribosomalen Komplexen. (Smiley,
2004). Desweiteren ist die CCR7 Expression auf reifen, mit HSV-1 infizierten DZ signifikant
vermindert, was eine Reduktion der Migrationsfähigkeit zur Folge hat. Dadurch sind reife DZ
nicht mehr in der Lage, zu den Lymphknoten zu migrieren um dort eine antivirale
Immunantwort auszulösen (Prechtel et al., 2005). Ebenso ist bekannt, dass das virale ICP27
Protein die Aktivierung von IRF-3 und NFκB behindert. Dadurch wird die Expression von
Genen mit antiviraler Aktivität, wie IFNα, IFNβ oder IL-29 unterbunden (Melchjorsen et al.,
Einleitung
18
2006). Eine weitere Veröffentlichung zur Strategie von HSV-1, eine Immunantwort zu
verhindern, zeigt, dass nach HSV-1 Infektion das Oberflächenmolekül CD1d herunterreguliert wird. CD1-Moleküle präsentieren den T-Zellen spezifische Lipid-Antigene.
Erkennen T-Zellen ein Fremdantigen werden die betreffenden Zellen eliminiert. Durch eine
nach HSV-1 Infektion deutlich reduzierte CD1d Expression sind natürliche Killer T-Zellen
nicht mehr in der Lage die infizierten Zellen zu erkennen (Raftery et al., 2006; Yuan et al.,
2006).
B.5. Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit sollten weitere Mechanismen aufgeklärt werden, durch welche
HSV-1 in der Lage ist, sich einer effektiven Immunantwort zu entziehen. Aus Experimenten
in Zelllinien, die mit anderen Herpesviren infiziert waren, war bekannt, dass diese Infektion
die vollständige Bildung des Immunoproteasoms verzögert und somit die Antigenpräsentation
über MHC-I-Moleküle verringert. Da über den Einfluss von HSV-1 auf das Proteasom bzw.
Immunoproteasom gerade in primären Zellen noch keine Erkenntnisse vorlagen, sollte die
Expression der Immunountereinheit LMP7 in HSV-1-infizierten reifen DZ analysiert werden.
Mittels Gen Chip-Analysen konnte nämlich bereits gezeigt werden, dass in HSV-1-infizierten
DZ die LMP7-spezifische mRNA-Synthese deutlich reduziert war. Weiterhin sollte die
Möglichkeit einer direkten Interaktion der Immunountereinheit LMP7 mit dem viralen
Transaktivator VP16 untersucht werden. Von anderen viralen Proteinen ist die Interaktion mit
LMP7 bereits bekannt, wodurch die Aktivität des Proteasoms und dadurch ebenso die
Antigenpräsentation über MHC-I-Moleküle beeinflusst sind. Im dritten Teil der vorliegenden
Arbeit wurde der Einfluss der HSV-1 Infektion auf den IFNγ-Signalweg untersucht. Aus
Experimenten mit Zelllinien war bekannt, dass HSV-1 die Signalkaskade an verschiedenen
Stellen beeinflusst. Es war jedoch völlig unbekannt, ob dies auch in primären DZ von
Relevanz ist.
Material und Methoden
19
C. Material und Methoden
C.1. Material
C.1.1.Zellen
C.1.1.1.Bakterienstämme
Escherichia coli Top10F’ One shotTM: F´{lacIq Tn10 (TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1araD139 Δ(ara-leu)7697
galU galK rpsL endA1 nupG (Invitrogen, Groningen)
Escherichia coli XL1-Blue:
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´
proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] (stratagene)
C.1.1.2.Eukaryonte Zelllinien
293T:
humane epitheliale Nierenzell-Linie, die mit Adenovirus Typ 5 transformiert
wurde und zusätzlich das große T-Ag des SV40 (simian virus 40) exprimiert
(DuBridge et al. 1987)
BHK-21:
Hamster Fibroblasten Zelllinie aus Mesocricetus auratus (ATCC-Nr.: CCL-10)
COS-7 :
Nieren-Zelllinie CV-1 aus Cercopithecus aethiops, transformiert mit
replikationsdefizientem SV40-Virus (Gluzman et al. 1981; ATCC-Nr.: CRL1651)
HeLa:
humane Cervix Karzinom-Zelllinie (Gey et al. 1952 ; ATCC-Nr. : CCL-2)
Vero :
Affen Nierenepithel Zelllinie aus Cercopithecus aethiops (ATCC-Nr. : CCL81)
C.1.2. Viren
HSV 17+/CMV-GFP/UL43 : Ein Herpes simplex Typ 1 Virus, welches abgeleitet ist vom
Laborstamm 17+. Es enthält das Green Fluorescent Protein,
welches in das UL43 Gen eingebaut ist und unter der Kontrolle
des CMV Promotors steht. („wild type“)
HSV 17+/vhspR20.5 :
Ein Herpes simplex Typ 1 Virus, welches abgeleitet ist vom
Laborstamm 17+, dem das vhs Gen fehlt. Dieses ist durch eine
Expressionskassette ersetzt, welche für die Marker GFP und
LacZ kodiert. („Δvhs“)
Material und Methoden
20
C.1.3. Nukleinsäuren
C.1.3.1.Oligonukleotide für die Klonierung
Tagv-for
AAG CTT ATG GAT ACT TAT CGT TAC ATT GCG CTA CTA
Tagv-rev
GGA TCC TTA TTG ATT GGC TTC CCG
Tagh-for
AAG CTT ATG GCG CTA CTA GAT GTA
Tagh-rev
GGA TCC TTA AAT GTA ACG ATA AGT ATC TTG ATT GGC
Die Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme sind markiert.
C.1.3.2. Oligonukleotide für die Sequenzierung
VP16-mi-for CTGGTTGCCATGCAGGGTG
VP16-mi-rev GTAAATTCCTATCAACGCTG
C.1.3.3. Oligonukleotide für semiquantitative Reverse Transkriptase Polymerase Ketten
Reaktion (PCR)
Act3-for
CAGGAAGTGAAGCTCAAGG
Act3-rev
GATTCCTCAGCTCTGATATG
Alpha1-for
CAATGATGTCACTGTTTGGAGC
Alpha1-rev
TCATCAGCAGGTTGAGCAGG
Alpha7-for
CTCTTCCAAGTGGAGTACGC
Alpha7-rev
GATTGATCTCGCCTCATG
Beta8-for
GAACGTTCAGATTGAGATGG
Beta8-rev
CCTTCATGTGGTACATATTG
Beta10-for
TCGAGAACTGCCAAAGAAATG
Beta10-rev
GTTTCCTCCACTAGCTCCAG
Rpn10-for
GAATGGAGACTTCTTACCC
Rpn10-rev
CATAGCATTTCGAATGGCTTC
UbSP7-for
GACTATCGGTCTGATAGAAG
UbSP7-rev
GGTAGAGATCTCGGAAATAC
Beta3-for
GAAGAACTGTGTGGCCATCG
Beta3-rev
GTCCTTCTCGATGATGTGG
Rpn2-for
GACATGGAGTTGGTAGAAG
Rpn2-rev
GATGTGCTCCCATGTCAGC
Alpha3-for
CTCCAGAAGGTCGCTTATAC
Material und Methoden
Alpha3-rev
CTCAGCTTTGGCTTCTTC
S14-for
GGCAGACCGAGATGAATCCTCA
S14-rev
CAGGTCCAGGGGTCTTGGTCC
21
C.1.3.4. Oligonukleotide für quantitative Real Time PCR
RT-Beta8-for AATGCAGGCTGTACTATCTGCG
RT-Beta8-rev TGCAGCAGGTCACTGACATCTG
S14-for
GGCAGACCGAGATGAATCCTCA
S14-rev
CAGGTCCAGGGGTCTTGGTCC
Die aufgeführten Oligonukleotide wurden von MWG-Biotech AG (Martinsried) bezogen.
C.1.3.5. Plasmide
C.1.3.5.1. Neu konstruierte Plasmide
pcDNA3.1VP16: enthält das virale VP16 Protein von HSV-1
pcDNA3.1LMP7tag5’: enthält das humane LMP7 Protein, welches am 5’ Ende mit einem
AU1-Epitop versehen wurde
pcDNA3.1LMP7tag3’: enthält das humane LMP7 Protein, welches am 3’ Ende mit einem
AU1-Epitop versehen wurde
C.1.3.5.2. Zur Verfügung gestellte Plasmide
pcDNA3.1LMP7: kodiert für das humane LMP7 Protein (zur Verfügung gestellt von Elke
Krüger aus dem Labor P. Kloetzel)
pEGFP: Expressionsplasmid für das Enhanced Green Fluorescent Protein von Clontech
pGAS-LUC: Expressionsplasmid für das Luziferase Protein unter Kontrolle eines
Minimalpromotors mit GAS Erkennungssequenzen von Stratagene
C.1.4. Enzyme
C.1.4.1. Restriktionsenzyme
BamHI
G/GATCC
EcoRI
G/AATTC
HindIII
A/AGCTT
NotI
GC/GGCCGC
Material und Methoden
XhoI
22
C/TCGAG
Die verwendeten Enzyme wurden von New England Biolabs (Frankfurt/Main) bezogen und in
den zugehörigen Puffersystemen verwendet
C.1.4.2. Sonstige Enzyme
DNaseI (Rneasy Mini Kit, Rnase free Dnase Set; Quiagen)
Thermostabile Taq-DNA-Polymerase (Expand Long Template PCR System; Roche)
Topoisomerase (Topo TA Cloning Kit; Invirtogen)
T4-Ligase (Gibco/BRL; Eggenstein)
C.1.5. Antikörper
Tab.1: Antikörper gegen humane Zelloberflächenantigene
(FITC = Fluoreszein-Isothiocyanat, PE = Phycoerythrin)
(BD Pharmingen, Heidelberg)
Antigen
Konjugat
Isotyp
Verdünnung
CD3
FITC
mouse IgG1
1:50
BD Pharmingen
CD14
PE
mouse IgG2a
1:50
BD Pharmingen
CD25
PE
mouse IgG1
1:50
BD Pharmingen
CD80
PE
mouse IgG1
1:50
BD Pharmingen
CD83
PE
mouse IgG1
1:50
BD Pharmingen
CD86
PE
mouse IgG2b
1:50
BD Pharmingen
MHC II
PE
mouse IgG2a
1:50
BD Pharmingen
CD119 (IFNγ Rezeptor
α Kette)
PE
mouse IgG1
1:25
BD Pharmingen
Tab.2: Isotypkontroll-Antikörper
(BD Pharmingen, Heidelberg)
Isotyp
Konjugat
Verdünnung
Bezugsquelle
mouse IgG1
FITC
1:100
BD Pharmingen
mouse IgG1
PE
1:100
BD Pharmingen
mouse IgG2a
PE
1:100
BD Pharmingen
mouse IgG2b
PE
1:100
BD Pharmingen
Bezugsquelle
Material und Methoden
23
Tab.3: Antikörper gegen humane zelluläre Proteine
(HISS Diagnostics, Freiburg ; Biomol, Hamburg; Santa Cruz Biotechnology; California; BD
Pharmingen, Heidelberg)
Antigen
Klonalität
Herkunft
AU1
monoklonal
Maus
1:1000
HISS Diagnostics
HC3 (Untereinheit α2 des
20S Proteasoms)
IRF-1
monoklonal
Maus
1:1000
Biomol
polyklonal
Hase
1:500
LMP7 (Untereinheit β5i
des 20S Proteasoms)
LMP7
polyklonal
Hase
1:1000
Santa Cruz
Biotechnology
Biomol
polyklonal
Hase
1:2500
Gabe von P. Klötzel
STAT1
monoklonal
Maus
1 :1000
BD Pharmingen
Phospho-STAT1 (Tyr701)
monoklonal
Maus
1:1000
BD Pharmingen
Phospho-STAT2 (Tyr690)
monoklonal
Maus
1:800
BD Pharmingen
VP16
polyklonal
Hase
1:1000
BD Pharmingen
Verdünnung
Bezugsquelle
Tab.4: Sekundär-Antikörper
(Promega, Heidelberg)
Antigen
Konjugat
Verdünnung
Bezugsquelle
mouse IgG
HRP
1:5000
Promega
rabbit IgG
HRP
1:5000
Promega
C.1.6. Medien
C.1.6.1. Medien für Bakterienkultur
LB-Medium: DifcoTM LB Broth, Miller (Luria-Bertani)
LBampAgar: 15g Agar und 100mg Ampicillin auf 1 Liter LB-Medium
LBkanaAgar: 15g Agar und 30mg Kanamycin auf 1 Liter LB-Medium
C.1.6.2. Medien für Zellkultur
DMEM (BioWhittaker, Verviers, Belgium) unter Zusatz von Glutamin (0,35 g/l); Penicillin
(0,12 g/l); Streptomycinsulfat (0,12 g/l) und 10% fötales Kälberserum (FKS)
DC-Medium: RPMI 1640 unter Zusatz von Glutamin (0,35 g/l); Penicillin (0,12 g/l);
Streptomycinsulfat (0,12 g/l); HEPES und 1% autologes Serum, steril filtriert
10% Aqua Citrat Dextrose (ACD) in PBS
Material und Methoden
24
PBS-EDTA: 1mM EDTA pH 8,0 in PBS
Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway)
Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco)
Hepes Puffer 1M (BioWhittaker, Verviers, Belgium)
100x Non Essential Amino Acids (NEAA) (BioWhittaker, Verviers, Belgium)
C.1.7. Puffer und Lösungen
C.1.7.1. Puffer und Lösungen für Gelelektrophorese
C.1.7.1.1. Elektophorese von Nukleinsäuren
Agarosegele: 0,8-1% Agarose in 1x TBE-Puffer (Zugabe von 10 µl Ethidiumbromid-Lösung
in 100 ml Agarose)
10x TBE-Puffer: 900 mM Tris; 900 mM Borsäure; 20 mM EDTA pH 8,0
10x DNA-Ladepuffer: 50% Glycerin; 10 mM EDTA pH 8,0; 0,2% Bromphenolblau
Ethidiumbromid-Lösung: 1 mg/ml in Aq dest
C.1.7.1.2. Elektophorese von Proteinen
2M Tris-HCl pH 8,8
1M Tris-HCl pH 6,8
30% Acrylamid (Roth): Verhältnis 37,5:1
10% APS
10% SDS
Sammelgel: 885 µl H2O; 155 µl 1M Tris-HCl pH 6,8; 208 µl 30% Acrylamid; 6,25 µl
10% SDS; 6,25 µl 10% APS; 2,5 µl TEMED
12% Trenngel: 2,22 ml H2O; 1 ml 2M Tris-HCl pH 8,8; 2,2 ml 30% Acrylamid; 55 µl 10%
SDS; 20,6 µl 10% APS; 4,13 µl TEMED
10x Proteingel-Laufpuffer: 250 mM Tris ; 1,9 M Glycin ; 37,7 mM SDS
Lysispuffer: 10% Glycerol; 2 mM EDTA pH 8,0; 137 mM NaCl; 50 mM Tris pH 8,0;
0,5% NP40; 1 mM PMSF; 100 mM Natriumfluorid; 20 mM Natriumvanadat
Proteingel-Marker: PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot)
5x Page-Ladepuffer: 400 mM Tris pH 6,8; 50% Glycerin; 10% SDS; 10%
2-Mercaptoethanol; 0,1% Bromphenolblau
Material und Methoden
25
C.1.7.2. Puffer und Lösungen für Western Blot
1x Transfer-Puffer: 25 mM Tris ; 192 mM Glycin ; 20% Methanol
10x TBS: 200 mM Tris ; 1,5 M NaCl ; pH 7,4
Blockierlösung: 5% Milchpulver in TBS unter Zusatz von 0,1% Tween 20
Waschlösung: 0,1% Tween 20 in TBS
Stripping-Puffer: 62,5 mM Tris-HCl pH 7,6 ; 2% SDS ; 100 mM 2-Mercaptoethanol (3,52
ml)
C.1.7.3. Puffer und Lösungen für Transfektion
DPBS (Cambrex)
DEAE-Dextran: 20 mg/ml in PBS; steril filtriert
Fungizone (Gibco)
Chloroquin: 100 mM in Aq dest
FC-Medium: 20 ml DMEM-Medium unter Zusatz von 10% FKS, Glutamin, Penicillin und
Streptomycinsulfat; 2% Fungizone ; 100 µM Chloroquin
10% Dimethy Sulphoxid (DMSO) in PBS
C.1.7.4. Puffer und Lösungen für Plaque-Assay
Infektionsmedium: RPMI 1640 unter Zusatz von 0,1% BSA und 20 mM HEPES
Medium mit humanen IgG-AK: DMEM mit 10% FKS, Glutamin, Penicillin,
Streptomycinsulfat und 1x NEAA; unter Zusatz von 10µg/ml humane IgG
Fixierlösung: 37% Formaldehyd in PBS
Kristallviolettlösung: 50% Kristallviolett in 100% EtOH; als Gebrauchslösung 1:50
verdünnt
C.1.7.5. Puffer und Lösungen für Durchflußzytometrie (FACS-Analyse)
Inkubationspuffer: PBS mit 2% FKS
10x FACS-Puffer: 137 mM NaCl ; 2,7 mM KCl ; 4,3 mM Na2HPO4x2 H2O; 1,4 mM H2PO4;
20 g Na-Azid
C.1.8. Reagenzien und Chemikalien
C.1.8.1. Fertige Reagenzsysteme (Kits)
Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega),
Material und Methoden
26
Expand Long Template PCR System (Roche),
First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas),
Pierce ECL Western Blotting Substrate (Pierce),
Protein G Immunoprecipitation Kit (Sigma),
QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden),
Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden),
Rapid DNA Ligation Kit (Roche),
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer (Pierce),
RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden),
TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen),
C.1.8.2. Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien wurden von den Firmen Fluka (Buchs, Schweiz), Merck
(Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (München) bezogen.
Die Bezugsquellen aller sonstigen Reagenzien wurden bei den entsprechenden Methoden
angegeben.
C.2. Methoden
C.2.1. Zellen und Viren
C.2.1.1. Zellkultur
Zelllinien
Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2-Gehalt und 95% relativer Luftfeuchtigkeit im Brutschrank inkubiert. Adhäsionskulturen der humanen Nierenzell-Linie 293T, der AffenNierenepithelzellderivaten COS-7, Vero sowie der Hamster Fibroblasten Zelllinie BHK-21
und der humanen Cervix Karzinom-Linie HeLa wurden unter Zusatz von Penicillin (0,12 g/l);
Streptomycinsulfat (0,12 g/l), Glutamin (0,35 g/l) und 10% (v/v) hitzeinaktiviertem (56°C, 30
min) FKS in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, BioWhittaker, Verviers, Belgium)
gehalten. Zweimal pro Woche wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und im Verhältnis
1:10 verdünnt.
Material und Methoden
27
DZ-Kulturen
Periphere Blut-mononukleäre Zellen (PBMC) wurden von einem gesunden Spender isoliert
und durch Dichtegradienten-Zentrifugation über einen Ficollgradienten aufgereinigt. Dazu
wurde das Blut zuerst mit 10% ACD in PBS verdünnt. Das verdünnte Blut (30 ml) wurde
vorsichtig auf die Lymphoprep-Lösung (10 ml) überschichtet und anschließend für 30 min bei
350 x g zentrifugiert. Die aus der Interphase gewonnenen Zellen wurden mehrfach mit PBS
gewaschen und in 175 cm2 Zellkulturflaschen (Nunc, Wiesbaden) ausgesät. Nach 1h wurde
die nicht-adhärente Fraktion mit RPMI 1640 abgewaschen. Die Zellen entwickelten sich in
DZ-Medium (RPMI-1640, 1% autologes Serum, 10mM Hepes, 0,35g/l Glutamin, Penicillin
0,12 g/l; Streptomycinsulfat 0,12 g/l, 800U/ml Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating
Factor (GMCSF, Wyeth, Pennsylvania, USA) und 250U/ml Interleukin-4 (IL-4, Strathmann,
Hamburg) innerhalb von fünf Tagen zu unreifen DZ, die geerntet und für weitere
Experimente genutzt wurden. Durch Zugabe von 10ng/ml Tumor Necrosis Factor alpha
(TNFα, Strathmann, Hamburg), 1μg/ml Prostaglandin E2 (PGE2, Sigma), 200U/ml
Interleukin-1β (IL-1β, Strathmann), 40U/ml GMCSF und 250U/ml Interleukin-4 in das
Medium reiften sie nach zwei Tagen aus, was durch phänotypische Charakterisierung
überprüft wurde (C.2.3.5).
C.2.1.2. Virusvermehrung
Als permissives System zur Virusvermehrung standen Hamster BHK-21-Zellen zur
Verfügung. HSV-1 (Herpes simplex virus 1) wurde in purem RPMI 1640 mit 20 mM Hepes
verdünnt (MOI 0,01) und für 2h auf die Zellen gegeben. Anschließend wurde frisches DMEM
unter Zusatz von Glutamin (0,35 g/l); Penicillin (0,12 g/l); Streptomycinsulfat (0,12 g/l) und
10% FKS zugegeben. Nach zwei bis drei Tagen war die Kultur vollständig lysiert. Das im
Überstand der lysierten Zellkultur befindliche Virus wurde bei 14000 rpm für 90 min bei 4°C
abzentrifugiert und über Nacht bei 4°C mit MNT-Puffer stehen gelassen. Am folgenden Tag
wurde das Virus in 100 µl-Aliquots aufgeteilt und bei -80°C eingefroren.
C.2.1.3. Plaque Assay
Die Titer-Bestimmung von HSV-1 wurde in Vero Zellen durchgeführt. Zunächst wurden
Virusverdünnungen von 10-2 bis 10-10 in RPMI 1640 und 20 mM Hepes hergestellt. Diese
wurden in zweifach Ansätzen auf die Zellen gegeben und für 1h bei RT inkubiert.
Anschließend wurde das Inokulum abgezogen und Zellkulturmedium (DMEM, 10% FKS,
Material und Methoden
28
Glutamin (0,35 g/l); Penicillin (0,12 g/l); Streptomycinsulfat (0,12 g/l) und 1 x NEAA)
zugegeben. Außerdem wurden humane IgG Antikörper (10 µg/ml) zugegeben, die eine
Infektion der Zellen mit den neu entstehenden Viruspartikeln verhindern. Nach 4 bis 5 Tagen
färbte man die Zellen mit Kristallviolett und zählte anschließend die entstandenen Plaques
aus.
C.2.2. Nukleinsäuremethoden
C.2.2.1. DNA-Reinigung
Zur Analyse der verschiedenen Klonierungsprodukte wurde die präparative alkalische
Plasmid-Extraktion nach der Methode von Birnboim und Doly (1979) angewandt. Bakterien
einer 5 ml-Übernachtkultur wurden 5 min bei 6.300 x g zentrifugiert. Daraufhin wurden die
Bakterien in 200 µl Lösung I (50 mM Glucose; 25 mM Tris-HCl pH 8,0; 10 mM EDTA)
resuspendiert und durch Zugabe von 200 µl Lösung II (0,2 M NaOH; 1% SDS) für 5 min bei
Raumtemperatur lysiert. Die Beimischung von 200 µl Lösung III (3 M K-Acetat pH 4,8) und
eine Inkubation auf Eis für 5 min bewirkte die Präzipitation von Proteinen, ZellwandBestandteilen und chromosomaler DNA. Nach Zentrifugation (10 min, 17.500 x g) wurde die
im Überstand befindliche Plasmid-DNA durch Zugabe von 500 µl Isopropanol gefällt und
durch 20 minütige Zentrifugation (17.500 x g) sedimentiert. Nach einem Waschschritt mit
70% Ethanol wurde die Plasmid-DNA sowohl restriktionsendonukleolytisch als auch durch
Sequenzierungen bestätigt. Die präparative Reinigung von größeren Mengen Plasmid-DNA
aus einer 250 ml-Übernachtkultur erfolgte mit Maxi-Präparations-Säulen nach Anleitung des
Herstellers (Qiagen, Hilden).
C.2.2.2. DNA-Klonierung
Die grundlegenden Schritte der DNA-Klonierung erfolgten nach Standardprotokollen
(Sambrook et al., 1989). In der Regel wurden der Vektor und die zu inserierende DNA mit
geeigneten Restriktionsendonukleasen gespalten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die für
die Ligation einzusetzenden DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel mit dem
QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) gewonnen. Die Ligation erfolgte unter
Verwendung des rapid ligation kits (Roche) in einem Gesamtvolumen von 20 µl, wobei das
molare Verhältnis zwischen linearisiertem Vektor und zu inserierender DNA ca. 1:4 betrug.
Material und Methoden
29
Die Transformation der Ligationsprodukte in kompetente Bakterien wurde chemisch mit
kommerziell erhältlichen, kompetenten XL1-blue-Zellen nach Vorschrift des Herstellers
durchgeführt (Stratagene, Amsterdam). Resultierende Bakterien-Klone wurden nach
analytischer Plasmidisolierung auf die gewünschten Modifizierungen untersucht.
C.2.2.3. Polymerasenkettenreaktion
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ermöglicht die spezifische Amplifikation eines
DNA-Fragmentes, welches zwischen zwei bekannten Sequenzen liegt (Saiki et al., 1985).
Dabei wurden die Oligonukleotid-Primer so gewählt, dass passende RestriktionsSchnittstellen zur Klonierung erzeugt wurden. Als Matrizen-DNA wurden Plasmide
verwendet. Ein typischer Reaktionsansatz von 50 µl enthielt 10 ng DNA, 20 mM
Nukleotidgemisch, 5 µl 10 x PCR-Puffer, 40 pmol Oligonukleotidprimer und 2 U Taq DNAPolymerase. Eine typische PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 2 min
94°C, 30 s 94°C, 30 s 56°C, 1 min 72°C, 30 Zyklen. Die Anlagerungs-Temperaturen und
Elongations-Zeiten sind je nach Primer und Fragment spezifisch. Für die Amplifikation von
Leserahmen zur späteren Expressionsklonierung wurden Polymerasen mit KorrekturleseFunktion bevorzugt, wie z.B. Pwo-Polymerase allein oder im Gemisch mit Taq-Polymerase
(z. B. High Fidelity PCR Kit, Roche).
C.2.2.4. RNA Isolierung und reverse Transkription
Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des RNeasy® Mini Kit und QIAshredder spin columns
(Qiagen, Hilden) isoliert. Reste von genomischer DNA wurden durch Zugabe von DNaseI aus
dem RNase- free DNase set (Qiagen) abgebaut. Anschließend wurde 1 µg RNA durch reverse
Transkription mit First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) in einzelsträngige cDNA
umgeschrieben.
C.2.2.5. Real time-PCR und relative Quantifizierung
Die Real time-Polymerase Ketten Reaktion (RT-PCR) im LightCycler® (Roche Diagnostics)
wurde in Glaskapillaren in einem Volumen von 20 µl durchgeführt. Ein Ansatz enthielt
typischerweise 2 µl 10x Reaktionspuffer (Taq polymerase, dNTPs, MgCl2, SYBR Green,
Roche Diagnostics), 1 µl cDNA und 11,25 pmol von jedem Oligonukleotidprimer. Eine RTPCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 15 min 95°C, 20 s 94°C, 60 s 57°C,
Material und Methoden
30
30 s 72°C, 50 Zyklen. Am Ende jedes Zyklus wurde das eingebaute, fluoreszierende SYBR
Green gemessen. Nach Beendung aller Zyklen wurden mit Hilfe der LightCycler® Software
eine Schmelzkurvenanalyse und die relative Quantifizierung durchgeführt.
C.2.3. Biochemische und immunologische Methoden
C.2.3.1. Transiente Transfektion mit DEAE Dextran
293 T-Zellen wurden mittels DEAE-Dextran-Methode transfiziert. Dazu wurden 5 x 105
Zellen pro well in einer 6-well Schale ausgesät. Am nächsten Tag wurden 2,5 µg der zu
transfizierenden DNA zu 6,25 µl DEAE-Dextran (20 mg/ml) gegeben und mit PBS auf ein
Gesamtvolumen von 250 µl aufgefüllt. Der Transfektionscocktail wurde auf die Zellen
gegeben und 30 min inkubiert. Anschließend wurde vorsichtig 2,5 ml/well FC-Medium
(DMEM mit 2% Fungizone und 100mM Chloroquin) zugegeben. Nach 2,5 h erfolgte ein
Medienwechsel. Nach zwei Tagen wurden die Zellen geerntet und analysiert.
C.2.3.2. Transiente Transfektion mit Amaxa
Pro Ansatz wurden 2 x 106 DZ abzentrifugiert (1500 Upm, 3 min), in 100 µl Human
Dendritic Cell Nucleofector solution (Amaxa, Köln) aufgenommen und mit 5 µg der zu
transfizierenden DNA gemischt. Das Gemisch wurde in eine mitgelieferte Küvette überführt
und mit dem Programm U-02 (Amaxa) elektroporiert. Danach wurden die Zellen sofort in
DZ-Medium (RPMI 1640 mit Supplementen sowie GM-CSF und IL-4) überführt. Zwei Tage
später wurden die DZ geerntet und analysiert.
C.2.3.3. Immunopräzipitation
Für eine Immunpräzipitation wurden 2 x 106 DZ zunächst durch Zugabe von 100 µl
Lysispuffer (10% Glycerol; 2 mM EDTA pH 8,0; 137 mM NaCl; 50 mM Tris pH 8,0; 0,5%
NP40; 1 mM PMSF; 100 mM Natriumfluorid; 20 mM Natriumvanadat) aufgeschlossen.
Danach wurden sie für 10 min bei 4°C und 11000 Upm abzentrifugiert. Anschließend wurde
eine Proteinbestimmung nach dem Bradford-Protokoll durchgeführt. Gleiche Mengen Protein
und 2 µg Antikörper wurden in eine Säule aus dem Protein G Immunoprecipitation Kit
(Sigma) gegeben und mit 1 x IP-Puffer (Protein G Immunoprecipitation Kit; Sigma) auf 600
µl aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte für mindestens 1 h bei 4°C unter Rotation.
Material und Methoden
31
Anschließend wurden pro Reaktion 30 µl nach Protokoll gewaschene Protein-G-Agarose
beads (Protein G Immunoprecipitation Kit; Sigma) zugegeben. Nach einer Inkubation von
mindestens 2 h bei 4°C unter Rotation, wurden die Säulen 6 x mit 1 x IP-Puffer gewaschen.
Im Anschluss wurde 40 µl 5x Page-Ladepuffer auf die Säulen gegeben und bei 95°C für 5
min aufgekocht. Durch eine Zentrifugation von 30 sec bei 12000 Upm wurde das
immunpräzipitierte Protein aus der Säule gewonnen.
C.2.3.4. Western Blot
Die Zell-Lyse erfolgte wie unter C.2.3.3. beschrieben. Vor dem Auftragen auf ein
diskontinuierliches SDS-Polyacrylamid-Gel wurden die mit 5 x Page-Ladepuffer gemischten
Lysate bei 95°C denaturiert. Nachdem eine Proteinbestimmung nach dem Bradford-Protokoll
durchgeführt wurde, wurden je 20µg Lysat auf das Gel aufgetragen. Nach der
Gelelektrophorese für 1 h bei 185 V wurden die Proteine durch halbtrockenen Elektrotransfer
(Biometra, Göttingen) auf eine Nitrozullulose-Membran (Protran®; Schleicher&Schuell
BioScience GmbH; Dassel) übertragen (0,8 mA/cm2). Unspezifische Proteinbindungsstellen
auf der Membran wurden für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C in PBS mit
0,05% Tween 20 und 5% Magermilchpulver geblockt. Darauf folgten die Inkubation mit dem
primären Antikörper in einer vom Hersteller vorgeschlagenen Verdünnung für 1 h bei
Raumtemperatur und drei Waschschritte für 5 min in PBS und 0,05% Tween 20. Die
Inkubation mit dem sekundären Antikörper (1:5000 verdünnt in PBS, 0,05% Tween 20 und
5% Magermilchpulver) wurde für 45 min bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von
einem erneuten Waschschritt für fünf mal 5 min in PBS und 0,05% Tween 20. Für die
Chemolumineszenz-Reaktion wurde die Membran nach dem letzten Waschgang in je 1,5 ml
ECL-Lösung (Pierce ECL Western Blotting Substrate; Pierce) für 1 min inkubiert. Die
Exposition des Röntgenfilms erfolgte je nach Bedarf von 10 Sekunden bis 20 Minuten. Die
IRF1 Western Blots wurden zusätzlich mit der AIDA Image Analyzer Software analysiert
(raytest, Straubenhardt, Deutschland), um die Banden zu quantifizieren.
C.2.3.5. Durchflusszytometrie
Die phänotypische Charakterisierung reifer DZ erfolgte nach Fluoreszenzmarkierung im
FACSCalibur-Durchflusszytometer (Becton-Dickinson, Heidelberg). Jeweils 2x 105 Zellen
wurden in 100 µl Inkubationspuffer (PBS mit 2% FKS) aufgenommen. Jeweils 2 µl
Primärantikörper wurde zugegeben und für 20 min bei 4° inkubiert. Nach zweimaligem
Material und Methoden
32
Waschen (1200 Upm, 5 min) mit FACS-Puffer (PBS mit 2% FKS) wurde in einem Volumen
von 100 µl Inkubationspuffer 0,5 µl Sekundärantikörper zugegeben und 20 min bei 4°C
inkubiert. Nach zwei Waschschritten wurden die Zellen in 200 µl PBS mit 2% FKS
aufgenommen und gemessen. Mit Virus infizierte Zellen wurden nach der Färbung mit 2%
Formaldehyd fixiert.
Ergebnisse
33
D. Ergebnisse
D.1. Einfluss der HSV-1 Infektion auf die Immunountereinheit LMP7
Einige Mechanismen, mit denen HSV-1 eine spezifische Immunantwort unterdrückt, sind
bereits beschrieben. Nach HSV-1 Infektion konnte z.B. eine reduzierte Expression von CCR7
(Prechtel et al., 2005) oder CD83 (Kruse et al., 2000; Kummer et al., 2007) auf der
Zelloberfläche von reifen DZ gezeigt werden. Um weitere Strategien der Immun Evasion
aufzuklären, wurden in der vorliegenden Arbeit primär-isolierte reife DZ untersucht. Diese
sind die potentesten APZ, und somit könnten Beeinflussungen des Virus auf Gene, die für
eine antivirale Immunantwort wichtig sind, zu einer Beeinträchtigung der Antigenpräsentation
oder T-Zell-Stimulation führen. Um Hinweise darauf zu erhalten, wie sich die DZ-spezifische
Genexpression nach einer HSV-1 Infektion verändert, wurden vorab Gen Chip Analysen
(Affymetrix Chips) durchgeführt. Dazu wurde die Gesamt-RNA von mock-infizierten reifen
DZ und von HSV-1-infizierten reifen DZ zu unterschiedlichen Zeitpunkten isoliert und
anschließend vergleichend analysiert. Diese vorausgehenden Arbeiten der Arbeitsgruppe
zeigten, dass die Expression verschiedener Gene durch die HSV-1 Infektion beeinflusst ist.
Besonders deutlich war unter anderem die Reduzierung der mRNA der Immunountereinheit
LMP7 in HSV-1-infizierten DZ bereits 8 Stunden nach Infektion. Daher wurde dies im
Anschluss genauer untersucht.
Die Generation der DZ erfolgte aus einer Monozyten-Präparation. Nachdem die Generierung
zu reifen DZ abgeschlossen war, wurde die Oberflächen-Expression von CD14-, CD83-,
CD80-, CD86-, MHC-I- und MHC-II-Molekülen durch Fluorescence-Activated Cell Sorting
(FACS) analysiert. In Abb. 5A ist eine typische FACS-Analyse reifer DZ gezeigt. Die
Expression des Monozyten-Markers CD14 ist auf reifen DZ wie zu erwarten nicht mehr
nachweisbar. CD80, CD86, MHC I und II werden stark exprimiert, ebenso CD83, das auf
reifen DZ, nicht aber auf unreifen DZ, nachweisbar ist. Anschließend wurden die reifen DZ
mock oder mit HSV-1 (MOI von 1) infiziert. Folgende Laborstämme wurden zur Infektion
verwendet: HSV 17+/CMV-GFP/UL43 (HSV-1 wt) und HSV 17+/pR20.5/vhs (HSV-1 Δvhs).
Diese Viren exprimieren jeweils das Green Fluorescent Protein (GFP), welches im FACS zur
Kontrolle der Infektionseffizienz nachweisbar ist. In der Regel waren bereits 8 Stunden nach
Infektion über 90% der DZ GFP-positiv (Abb. 5B).
Ergebnisse
34
200
CD14
100
0
10
1
2
10 10
FL2-H
3
10
4
CD86
Count
Count
0
10
1
2
10 10
FL2-H
3
10
4
10
1
2
3
10
4
2
3
10
4
3
10
4
10 10
FL2-H
10
0
10
1
2
10 10
FL2-H
3
10
4
MHC-I
50
HSV-1 wt
10
100
0
10
1
10 10
FL2-H
HSV-1 Δvhs
75
Count
Count
0
0
0
75
50
25
0
10
0
10
100
50
100
50
150
100
B
50
200
150
10
100
0
0
MHC-II
150
100
50
200
200
150
Count
Count
150
10
CD83
200
Count
A
50
25
0
0
10
1
2
10 10
FL1-H
3
10
4
10
0
10
1
2
10 10
FL1-H
Abb.: 5: FACS-Analyse von reifen DZs. (A) Phänotypische Charakterisierung reifer DZ. Es
wurde die Expression von CD14-, CD83-, CD80-, CD86-, MHC-I- und MHC-II-Molekülen (schwarze
Linie) vergleichend mit den jeweiligen Isotyp-Kontrollen (graue Linie) dargestellt. (B) GFPExpression von HSV-1 wt- und Δvhs-infizierten DZ. Die verwendeten Viren exprimieren GFP,
welches im FACS gemessen werden kann. Die Fluoreszenz der infizierten Zellen (schwarze Linie)
wurde vergleichend mit den mock-infizierter Zellen (graue Linie) dargestellt.
D.1.1. Die LMP7-spezifische mRNA ist in reifen DZ nach HSV-1 Infektion reduziert
Zunächst wurden die Daten der Gen Chip Analyse mittels semiquantitativer RT-PCR
überprüft. Dazu wurden reife DZ mock- oder mit HSV-1 wt mit einer MOI von 1 infiziert. Zu
den angegebenen Zeitpunkten nach Infektion wurde je ein Teil der mock- bzw. der HSV-1infizierten Zellen für 30 Minuten mit 1000 U/ml IFNγ inkubiert. Hierdurch wurden die
Untereinheiten des Immunoproteasoms induziert. Der restliche Teil blieb unbehandelt.
Anschließend wurde die zelluläre mRNA isoliert, im Spektralphotometer gemessen und
jeweils 1µg revers transkribiert. Die so erhaltene cDNA diente als Matrize für eine Standard-
Ergebnisse
35
PCR, die einen semiquantitativen Nachweis der LMP7-mRNA erlaubt (Abb. 6A). Die Spuren
1 bis 4 zeigen die unbehandelten Zellen, die Spuren 5 bis 7 dagegen die IFNγ-behandelten
Zellen. Zum Zeitpunkt 0 Stunden wurden nur unbehandelte reife DZ analysiert, da die Zellen
direkt nach Infektion lysiert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass in HSV-1 wt-infizierten
Zellen die für LMP7 kodierende mRNA mit zunehmender Dauer der Infektion deutlich
reduziert war, während in mock-infizierten Zellen kein Rückgang der Transkription
nachweisbar war. Der Rückgang konnte bereits 8 Stunden nach Infektion gezeigt werden.
Noch deutlicher nachweisbar war der Effekt 16 bzw. 24 Stunden nach Infektion. Dagegen
waren die mRNA-Mengen in der Ladekontrolle S14 über die Infektionsdauer konstant (Abb.
6B). Daraus konnte geschlossen werden, dass eine HSV-1 Infektion von reifen DZ nicht
generell zu einem Abbau oder einer reduzierten Transkription von zellulären mRNAs führt.
Eine Induktion der mRNA-Menge nach IFNγ−Zugabe ließ sich nicht deutlich zeigen.
Abb. 6: RT-PCR der Immunoproteasom-Untereinheit LMP7. Zeitkinetik von mock- und von
HSV-1 wt-infizierten reifen DZ. Nach Isolierung der zellulären mRNA wurde 1µg revers transkribiert.
(A) Rückgang der LMP7-spezifischen mRNA. Mit LMP7-spezifischen Primern konnte ein
deutlicher Rückgang der mRNA in HSV-1 wt-infizierten reifen DZ beobachtet werden. (B) S14Ladekontrolle. Die S14-mRNA-Mengen blieben konstant.
Ergebnisse
36
Um die Induktion der LMP7-mRNA nach IFNγ-Zugabe und den Rückgang der mRNAMenge nach HSV-1 Infektion zu quantifizieren, wurden Real Time RT-PCR-Analysen mit
LMP7-spezifischen Primern durchgeführt. S14 diente als interne Ladekontrolle. Reife DZ
wurden mit HSV-1 wt- oder mit HSV-1 Δvhs-infiziert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten
nach Infektion wurde die Infektionseffizienz im FACS überprüft und ein Teil der Zellen mit
1000 U/ml IFNγ für 30 Minuten behandelt, während der übrige Teil unbehandelt blieb.
Anschließend wurde die zelluläre RNA isoliert, mit DNaseI verdaut und jeweils 1µg revers in
cDNA transkribiert. Das Verhältnis der gemessenen LMP7-mRNA verglichen mit der
internen Kontrolle S14 wurde von der LightCycler® Software berechnet. Kalibriert wurde auf
das LMP7/S14-Verhältnis der mock-infizierten reifen DZ ohne IFNγ, die direkt nach VirusZugabe geerntet wurden.
Abb. 7: Real Time RT-PCR der LMP7-mRNA. Spezifische LMP7- und S14-Primer für die Real
Time-PCR wurden zur Analyse verwendet. S14 diente als interner Standard, um die gemessenen
Werte in Relation zur internen Kontrolle zu setzen. Es zeigt sich eine quantitative Abnahme der
LMP7-mRNA in wt-infizierten Zellen und ein verzögerter Rückgang in Δvhs-infizierten DZ. Eine
leichte Induktion der LMP7-mRNA konnte nach IFNγ-Zugabe in mock-infizierten, aber nicht in HSV1-infizierten Zellen gezeigt werden.
Ergebnisse
37
Wie in Abb. 7 ersichtlich, kam es zu einem deutlichen Rückgang der LMP7-spezifischen
mRNA in HSV-1 wt- und Δvhs-infizierten Zellen. Da der Rückgang der LMP7-mRNA auch
in Δvhs-infizierten Zellen gezeigt werden konnte, beruht der Effekt nicht auf der allgemeinen
Destabilisierung zellulärer RNAs durch das virale vhs Protein. Die LMP7-mRNA-Expression
konnte in mock-infizierten reifen DZ durch den IFNγ-Stimulus leicht gesteigert werden. In
den HSV-1 wt- und Δvhs-infizierten reifen DZ ist die Induktion der LMP7-mRNA kaum noch
nachweisbar. Somit konnte sowohl der Rückgang der LMP7-mRNA nach HSV-1 Infektion
als auch die Induktion der mRNA-Menge nach IFNγ-Zugabe quantifiziert werden.
D.1.2. Die LMP7-spezifische mRNA wird nach HSV-1 Infektion scheinbar nicht aktiv
abgebaut
Um zu untersuchen, ob nach HSV-1 Infektion die LMP7-mRNA aktiv abgebaut oder aber die
Transkription
unterbunden
wird,
wurden
Stabilitäts-Experimente
mit
dem
Transkriptionsinhibitors Actinomycin D durchgeführt. Dazu wurden reife DZ mit 1 µg/ml
Actinomycin D behandelt. Die Kontrollzellen wurden nur mit DMSO behandelt. Zu den
angegebenen Zeitpunkten nach Actinomycin D-Zugabe wurde die zelluläre mRNA isoliert
und in cDNA revers transkribiert. Anschließend wurde eine semiquantitative RT-PCR mit
LMP7-spezifischen Primern durchgeführt. Wie Abbildung 8 zeigt, ist bereits acht Stunden
nach Zugabe des Transkriptionsinhibitors die mRNA-Menge von LMP7 reduziert. Noch
deutlicher nachweisbar war der Effekt 16 bzw. 24 Stunden nach Zugabe. Die Actinomycin Dbehandelten reifen DZ zeigen, verglichen mit HSV-1-infizierten Zellen, einen vergleichbaren
LMP7-mRNA-Rückgang (s. Abb. 6A). Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass eine
HSV-1 Infektion nicht zu aktiven Abbau der LMP7-mRNA führt, sondern die Transkription
unterbindet.
Abb. 8: Abbau der LMP7-mRNA nach Actinomycin D-Behandlung in reifen DZ. Ein Teil der
Zellen wurde mit 1 µg/ml Actinomycin D behandelt, die Kontrollzellen wurden nur mit DMSO
behandelt. Die zelluläre RNA wurde 0, 4, 8, 16 und 24 Stunden nach Zugabe isoliert und in cDNA
revers transkribiert. Anschließend erfolgte eine semiquantitative RT-PCR mit LMP7-Primern.
Ergebnisse
38
D.1.3. Die LMP7-Expression in HSV-1-infizierten reifen DZ ist nicht beeinflusst
Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob die Abnahme der mRNA-Menge nach HSV-1
Infektion auch zu einer verringerten Proteinexpression von LMP7 führt.
Abb. 9: Effekt der HSV-1-Infektion auf das LMP7-Protein. Reife DZ wurden sowohl mockinfiziert, als auch mit HSV-1 wt oder HSV-1 Δvhs mit einer MOI von 1. Zu den angegebenen
Zeitpunkten wurde ein Teil der Zellen mit 1000 U/ml IFNγ für 30 min inkubiert. Der andere Teil blieb
unbehandelt. Die Zelllysate wurden mittels Western Blot analysiert. (A) Dazu wurde ein LMP7Antikörper benutzt (B) β-Aktin diente als Ladekontrolle. (nd=nicht durchgeführt).
Ergebnisse
39
Hierzu wurde mittels Western Blot-Analysen eine Zeitreihe mit mock -, HSV-1 wt- oder
HSV-1 Δvhs-infizierten reifen DZ durchgeführt. Als zusätzliche Kontrolle wurden reife DZ
mit einem UV-inaktivierten HSV-1 wt-Virus infiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach
Infektion wurden die reifen DZ zur Hälfte mit 1000 U/ml IFNγ für 30 min behandelt, die
restlichen Zellen blieben unbehandelt. Anschließend erfolgte die Lyse der Zellen. Eine nach
dem Bradford-Protokoll durchgeführte Proteinbestimmung ermöglichte den Abgleich der
einzusetzenden Proteinmengen. Die Proteine wurden anschließend auf eine NitrozelluloseMembran transferiert, und mit einem LMP7-spezifischen Antikörper analysiert (Abb. 9A).
Als Ladekontrolle diente ein β-Aktin-Antikörper (Abb. 9B).
Spuren 1 bis 4 zeigen mock bzw. HSV-1-infizierte reife DZ, die Spuren 5 bis 8 dieselben
Zellen, welche aber zusätzlich mit IFNγ behandelt wurden. Für den Zeitpunkt 0 Stunden
wurden nur unbehandelte Zellen analysiert, da sie direkt nach Virus-Zugabe lysiert wurden.
Die LMP7-Proteinexpression zeigte während des Zeitverlaufs nach Infektion keine Änderung,
sowohl in den mock- und UV-inaktivierten HSV-1-infizierten, als auch in den HSV-1 wt und
Δvhs-infizierten Zellen (Abb. 9A, Spuren 1-4). Auf IFNγ-Zugabe erfolgte keine zusätzliche
Induktion des Proteins (Spuren 5-8). Die gleichmäßige Beladung wurde mit einem β-Aktinspezifischen Antikörper nachgewiesen (Abb. 9B). Obwohl in HSV-1-infizierten reifen DZ
eine Reduktion der LMP7-mRNA gezeigt wurde, war kein Einfluss der Virus-Infektion auf
die Proteinexpression nachweisbar.
D.1.4. Der Einbau von LMP7 in das Proteasom ist durch die HSV-1 Infektion nicht
beeinflusst
In den folgenden Experimenten wurde untersucht, ob sich, trotz gleichbleibender LMP7Gesamtmenge, der Einbau von LMP7 ins Immunoproteasom nach HSV-1 Infektion ändert.
Dazu wurde eine Immunopräzipitation (IP) der Proteasomen durchgeführt. Reife DZ wurden
mock-infiziert, HSV-1 wt oder HSV-1 Δvhs-infiziert (MOI von 1). Die eine Hälfte der Zellen
wurde 12 h nach Infektion mit 1000U/ml IFNγ behandelt, die andere Hälfte blieb während des
gesamten Experiments unbehandelt. Nach weiteren 12 h wurden alle Zellen geerntet. Mit
einem Antikörper gegen die α2-Untereinheit (UE) des Proteasoms wurden die Proteasomen
aus den Zelllysaten mit dem Protein G Immunoprecipitation Kit (Sigma) präzipitiert. Nach
Auftrennung der gebundenen Proteine über ein Acrylamidgel erfolgte der Transfer auf eine
Nitrozellulose-Membran. Anschließend wurde mittels Western Blot-Analyse die LMP7-
Ergebnisse
40
Expression untersucht (Abb. 10). Als Kontrolle der erfolgreichen Immunopräzipitation diente
der α2-UE-spezifische Antikörper. In den präzipitierten Proteasomen konnte kein Rückgang
in der LMP7-Proteinmenge in HSV-1 wt- oder Δvhs-infizierten reifen DZ gezeigt werden
(Abb. 10). Die Western Blot-Analyse zeigt in der Kontrolle mit dem α2-UE-spezifischen
Antikörper neben der spezifischen α2-UE-Bande auch noch die unspezifische Bande der
leichten Kette des Antikörpers. Außerdem zeigt die Western Blot-Analyse mit dem KontrollAntikörper, dass die Proteinmengen nicht einheitlich sind, was auch die unterschiedlichen
Proteinmengen von LMP7 erklärt.
Abb. 10: Immunopräzipitation der Proteasomen aus mock-infizierten und HSV-1-infizierten
reifen DZs. Proteasomen wurden mit einem α2-UE-Antikörper immunopräzipitiert. Gebundene
Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend wurde mittels Western Blot-Analyse
die LMP7- bzw. α2-UE-Expression analysiert.
D.1.5. Das LMP7-Protein ist in reifen DZ sehr stabil
Da auch in weiteren IP-Experimenten kein deutlicher Rückgang der LMP7-Protein-Menge
gezeigt werden konnte, wurde die Stabilität des Proteins in reifen DZ untersucht. Dazu
wurden die Zellen mit 100 µg/ml Cycloheximid behandelt, um die Synthese neuer Proteine zu
blockieren. Die Kontrollzellen blieben unbehandelt. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach
Cycloheximid-Zugabe wurden die Zellen lysiert, eine Proteinbestimmung nach Bredfort
durchgeführt und gleiche Mengen des Lysats durch Elektrophorese aufgetrennt. Mittels
Ergebnisse
41
anschließender Western Blot-Analyse wurde die LMP7-Expression untersucht. Wie Abb. 11
zeigt, ist auch 24 Stunden nach Zugabe von Cycloheximid kein Rückgang des LMP7-Proteins
nachweisbar. Als Kontrolle wurde β-Aktin untersucht, da es bekanntlich eine hohe Stabilität
hat. Dies führt zu dem Schluss, dass LMP7 in reifen DZ sehr stabil ist und dass die HSV-1
Infektion zu keinem direkten Abbau des Proteins führt. Die HSV-1 Infektion bewirkt zwar
eine deutliche Reduktion der LMP7 spezifischen RNA-Transkription, da das Protein aber sehr
stabil ist, lassen sich in vitro keine Unterschiede in den HSV-1-infizierten DZ auf
Proteinebene nachweisen.
Abb. 11: Nachweis des LMP7-Proteins nach Cycloheximid-Zugabe in reifen DZs. Die Zellen
wurden mit 100 µg/ml Cycloheximid behandelt, die Kontrollzellen blieben unbehandelt. Zu den
angegebenen Zeitpunkten nach Cycloheximid-Zugabe erfolgte die Zelllyse. Die Lysate wurden mittels
Western Blot-Analyse mit einem LMP7-spezifischen Antikörper analysiert. β-Aktin diente als
Kontrolle.
D.2. VP16 und das Proteasom
Bei der Immunopräzipitation der Proteasomen war nach der Western Blot-Analyse eine
weitere Bande zu erkennen, die unspezifisch mit dem verwendeten LMP7-Antikörper
reagierte. Die Größe des Proteins suggerierte, dass es sich dabei um das virale VP16 Protein
handeln könnte. VP16 ist im Tegument des Viruspartikels lokalisiert. Es agiert als
Transaktivator, indem es die Transkription der viralen immediate-early Gene stimuliert. VP16
benötigt für seine Funktion als Transkriptionsaktivator ein intaktes Proteasom (Zhu et al.,
2004). Wie auch bei zellulären Transkriptionsaktivatoren muss VP16 ubiquitinyliert und im
Proteasom degradiert werden, dass die anschließende Transkription der viralen IE-Gene
stattfinden kann. Ist das Proteasom durch Zugabe eines Inhibitors blockiert, ist die
Trankriptions-Aktivität von VP16 deutlich eingeschränkt (Zhu et al., 2004).
Ergebnisse
42
Um zu untersuchen, ob es sich tatsächlich um VP16 handelt, wurde die bereits zum Nachweis
für LMP7 benutzte Membran bezüglich der VP16-Expression untersucht. VP16 konnte
sowohl in den HSV-1 wt-infizierten als auch in den HSV-1 Δvhs-infizierten reifen DZ
nachgewiesen werden (Abb. 12).
Abb. 12: Immunopräzipitation der Proteasomen aus mock-infizierten und HSV-1-infizierten
reifen DZ. Proteasomen wurden mit einem α2-UE Antikörper immunopräzipitiert. Gebundene
Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mittels Western Blot mit einem
VP16- oder α2-UE-spezifischen Antikörper analysiert.
In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob eine direkte Interaktion zwischen VP16 und
LMP7
besteht.
Dazu
Immunountereinheit
wurde
LMP7
und
zunächst
dem
ein
Fusionsprotein
AU1-Epitop
unter
bestehend
Verwendung
aus
der
spezieller
Oligonukleotide generiert, welche spezielle Endonuklease-Schnittstellen zur erleichterten
Klonierung trugen. Das AU1-Epitop diente zum Nachweis in der IP. Es wurden zwei
Klonierungsstrategien verfolgt. Zum einen besteht das Fusionsprotein aus LMP7 mit dem
AU1-Epitop am 3’-Ende, zum anderen wurde das AU1-Epitop an das 5’-Ende des LMP7Leserahmens gesetzt. Die kompletten Expressionskassetten wurden in den Vektor pcDNA3.0
kloniert. Zur Klonierung in pcDNA3.0 dienten die singulären BamHI- und HindIIIRestriktionsschnittstellen. In Abb. 13 sind die beiden Fusionsproteine dargestellt.
Ergebnisse
43
Abb. 13: Schematische Darstellung der Fusionsproteine LMP7 mit AU1 Epitop. Der Leserahmen
des AU1 Epitops wurde mittels spezifischer Oligonukleotide entweder an das 5’- oder das 3’-Ende des
LMP7-Leserahmens gesetzt.
Die Expression der in den Vektor pcDNA3.0 klonierten Fusionsproteine wurde zunächst nach
Transfektion in 293T-Zellen im Western Blot überprüft. Dazu diente ein AU1-spezifischer
Antikörper. Die errechnete Größe des Fusionsproteins liegt bei ca 32 kDa. Es konnte nur das
Fusionsprotein mit dem AU1-Epitop am 3’-Ende des LMP7-Leserahmens nachgewiesen
werden (Abb. 14). Warum das Fusionsprotein mit dem Epitop am 5’-Ende des Leserahmens
nicht detektiert werden konnte, ist fraglich. Zum einen besteht die Möglichkeit, dass das
Epitop am 5’-Ende die Transkription oder Translation des Fusionsproteins verschlechtert oder
gar blockiert. Die zweite Möglichkeit könnte eine andere Faltung des entstandenen Proteins
sein, so dass der verwendete Antikörper nicht mehr an das Epitop binden kann.
Abb. 14: Überprüfung der Expression der LMP7-AU1 Fusionsproteine im Western Blot. Die in
den Vektor pcDNA3.0 eingefügten Expressionskassetten für das Fusionsprotein wurden in 293TZellen transfiziert. Zwei Tage nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, durch SDS-Page separiert
und anschließend mittels Western Blot mit einem AU1-spezifischen Antikörper analysiert.
Anschließend wurde das Fusionsprotein LMP7-AU1 zusammen mit einem Expressionsvektor,
der für VP16 kodiert, in 293T-Zellen cotransfiziert. Als Kontrollen wurden auch Ansätze
analysiert, die zum einen nur Beads und zum anderen den IP-AK nur in Lysispuffer
Ergebnisse
44
enthielten. Eine weitere Kontrolle waren Zellen, die ohne DNA transfiziert wurden. Auf die
Transfektion folgte eine Immunopräzipitation mittels AU1-spezifischen Antikörper. Die
gebundenen Proteine wurden über ein Acrylamidgel aufgetrennt und anschließend auf eine
Nitrozellulose-Membran transferiert. Mittels Western Blot-Analysen wurden die Ansätze
bezüglich der VP16- und, zur Kontrolle, der AU1-Expression untersucht (Abb. 15).
Abb. 15: Immunopräzipitation von LMP7 mit dem AU1-Epitop. Das LMP7-AU1-Fusionsprotein
wurde mit einem AU1-spezifischen Antikörper immunopräzipitiert. Gebundene Proteine wurden
durch SDS-PAGE separiert und anschließend durch Western Blot mit einem VP16- oder AU1spezifischen Antikörper analysiert.
Auf der zu erwartenden Höhe für VP16 konnte keine Bande nachgewiesen werden. Nur die
Antikörperbanden der schweren und leichten Kette des IP-Antikörpers waren erkennbar. In
den Spuren, in welchen das LMP7-AU1-Fusionsprotein aufgetragen wurde, konnte es mit
dem AU1-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden (Abb. 15). Der Antikörper reagierte
auch mit der leichten Kette. Deswegen sind in den beiden betreffenden Spuren zwei Banden
zu erkennen. Aus diesen Befunden schließen wir, dass die IP zwar funktioniert hat, aber
zumindest mit den hier verwendeten Methoden keine direkte Interaktion von VP16 mit LMP7
gezeigt werden konnte.
Ergebnisse
45
D.3. Einfluss der HSV-1 Infektion auf den IFNγ-Signalweg
Wie in den Abbildungen 6 und 7 gezeigt, nimmt die Menge an LMP7-mRNA nach HSV-1
Infektion deutlich ab. Um eine mögliche Erklärung für diese Abnahme zu finden, wurde
zusätzlich der IFNγ-Signalweg genauer untersucht. Die Transkription der LMP7-mRNA wird
über den IFNγ-Signalweg induziert. IFNγ ist ein Zytokin, welches eine wichtige Rolle bei der
zellvermittelten Immunantwort spielt. In erster Linie wird es von T-Zellen und aktivierten
NK-Zellen produziert. In Anwesenheit von IFNγ lagern sich die beiden Ketten des IFNγRezeptors zusammen. Jak1 und Jak2 sind mit dem zytoplasmatischen Teil der Ketten nichtkovalent assoziiert. Die Zusammenlagerung der Rezeptorketten führt zu einer TyrosinPhosphorylierung von Jak1/Jak2. Die aktivierten Jaks phosphorylieren den zytoplasmatischen
Teil des Rezeptors. Dadurch entsteht eine Bindungsstelle für die SH2 Domäne von STAT1.
Das an den Rezeptor gebundene STAT1 wird dann ebenfalls am Tyrosin phosphoryliert. Die
phosphorylierten STAT1-Moleküle bilden Homodimere und gelangen so in den Kern, wo sie
an DNA binden und die Transkription vieler zellulärer Gene, die an einer antiviralen
Immunantwort beteiligt sind, regulieren.
D.3.1. Die mRNA der IFNγ-Rezeptor α-Kette ist in reifen DZ nach HSV-1 Infektion deutlich
reduziert
Hinweise darauf, dass nach HSV-1 Infektion der IFNγ-Signalweg in reifen DZ beeinflusst ist,
ergaben sich aus den bereits erwähnten Gen Chip-Analysen. Die Auswertung der Analysen
zeigte in reifen DZ einen deutlichen Rückgang der IFNγ-Rezeptor-mRNA nach HSV-1
Infektion. Um die beobachteten Daten zu bestätigen und den Rückgang der IFNγ-Rezeptor αKette-mRNA nach Infektion zu quantifizieren, wurden Real Time RT-PCR-Analysen
durchgeführt. Reife DZ wurden mock- oder mit HSV-1 wt-infiziert (MOI von 1). Die
Isolation der zellulären mRNA erfolgte zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Infektion.
Nach DNase I-Verdau wurde jeweils 1µg RNA revers in cDNA transkribiert. Das Verhältnis
der gemessenen IFNγ-Rezeptor α-Kette-mRNA verglichen mit der internen Kontrolle S14,
wurde mittels LightCycler® Software berechnet. Kalibriert wurde auf das IFNγ α-Kette/S14
Verhältnis der mock-infizierten reifen DZ, die direkt nach Infektion geerntet wurden. Abb. 16
zeigt einen deutlichen Rückgang der IFNγ-Rezeptor α-Kette-mRNA in HSV-1 wt-infizierten
Zellen. Bereits 8 Stunden nach Infektion ist die RNA-Menge drastisch reduziert. Dagegen
Ergebnisse
46
stabilisierte sich die mRNA-Menge in mock-infizierten reifen DZ nach einer anfänglichen
relative Expression der IFNγ Rezeptor α-Kette
Reduzierung, und blieb über den weiteren Zeitverlauf konstant.
mock
HSV-1 wt
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
8
16
24
Stunden nach Infektion
Abb. 16: Real Time RT-PCR der IFNγ-Rezeptor α-Kette-mRNA. Spezifische Primer für die IFNγRezeptor α-Kette und S14 wurden für die Real Time RT-PCR verwendet. S14 diente als interner
Standard. Das normierte Verhältnis von IFNγ-Rezeptor α-Kette- zu S14-mRNA für mock-infizierte
DZ zum Zeitpunkt 0h wurde auf 1 gesetzt. Es zeigt sich eine quantitative Abnahme der IFNγ-Rezeptor
α-Kette-mRNA in HSV-1 wt-infizierten Zellen (weiße Säulen) verglichen mit mock-infizierten DZ
(schwarze Säulen). Gezeigt sind Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten.
D.3.2. Die Expression des IFNγ-Rezeptors an der Zelloberfläche von reifen DZ ist nach HSV1 Infektion reduziert
Die Bindung von IFNγ an den IFNγ-Rezeptor löst eine Signalkaskade aus, die am Ende zur
Transkription von vielen zellulären Genen führt, die an einer antiviralen Immunantwort
beteiligt sind. Die aktive Form des Rezeptors besteht aus je zwei α- und β-Ketten. Deswegen
wurde in einem nächsten Schritt untersucht, ob die Abnahme der mRNA-Menge auch zu einer
verringerten Expression des Rezeptors an der Zelloberfäche führt. Dazu wurde die konstitutiv
Ergebnisse
47
exprimierte α-Kette des Rezeptors an der Zelloberfläche von reifen DZ während der HSV-1
Infektion mittels FACS analysiert.
relative IFNγ Rezeptor α-Kette Expression (%)
A
*
*
120
*
*
**
**
mock
HSV-1 wt
HSV-1 Δvhs
**
**
100
80
60
40
20
0
0
8
16
24
Stunden nach Infektion
mock
HSV-1 wt
HSV-1 Δvhs
B
relative MHC II Expression (%)
120
100
80
60
40
20
0
0
8
16
24
Stunden nach Infektion
Abb. 17: IFNγ-Rezeptor-Expression ist in HSV-1-infizierten reifen DZ reduziert. (A)
Oberflächen-Expression von IFNγ-Rezeptor und (B) MHC-II-Molekülen. Die Mittelwerte von drei
unabhängigen Experimenten sind gezeigt. Mock-infizierte DZ zum Zeitpunkt 0h wurden auf 100
Prozent gesetzt. Von diesen drei Experimenten wurden Standardabweichung und Signifikantstest
berechnet Ein Stern zeigt ein nicht-signifikantes, zwei Sterne dagegen ein signifikantes Ergebnis
(p<0,05). Ein signifikanter Rückgang des IFNγ-Rezeptors war sowohl in HSV-1 wt- als auch Δvhsinfizierten Zellen verglichen mit mock-infizierten DZ 16 und 24 Stunden nach Infektion nachweisbar.
Die Expression von MHC-II-Molekülen war zu keinem Zeitpunkt deutlich beeinflusst.
Ergebnisse
48
Reife DZ wurden mock -, HSV-1 wt- oder HSV-1 Δvhs-infiziert und zu den angegebenen
Zeitpunkten nach Infektion analysiert. Wie Abb. 17A zeigt, war ein deutlicher Rückgang der
IFNγ-Rezeptor α-Kette auf der Zelloberfläche von reifen DZ bereits 16 Stunden und noch
deutlicher 24 Stunden nach Infektion sowohl mit dem Wildtyp- als auch mit dem mutierten
Δvhs-Virus messbar. Um nachzuweisen, dass eine HSV-1 Infektion nicht generell alle
Oberflächenmoleküle beeinflusst, wurde die MHC-II Expression untersucht (Abb. 17B). Es
konnte gezeigt werden, dass über den gesamten Zeitverlauf der Infektion die MHC-IIMolekül-Expression kaum beeinflusst wurde.
D.3.3. HSV-1 Infektion blockiert die IFNγ-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung von STAT1
Da die Tyrosin-Phosphorylierung von STAT1 eine direkte Folge der IFNγ-Bindung an den
IFNγ-Rezeptor ist, wurde in den folgenden Experimenten die STAT1-Phosphorylierung in
HSV-1-infizierten oder mock-infizierten reifen DZ untersucht. In verschiedenen EpithelZelllinien wurde bereits gezeigt, dass HSV-1 die STAT1-Phosphorylierung blockiert (Yokota
et al., 2001). Ob dies in primären reifen DZ ähnlich ist, war jedoch nicht bekannt. Daher
wurden reife DZ entweder mock-infiziert oder mit einer MOI von 1 mit HSV-1 wt- oder
Δvhs-infiziert. Zusätzlich wurden Zellen mit einem UV-inaktivierten wt-Virus infiziert. Zu
den angegebenen Zeitpunkten nach Infektion wurden die Zellen entweder mit 1000 U/ml
IFNγ für 30 Minuten behandelt oder blieben als Kontrolle während der gesamten Zeit
unbehandelt. Für die Kontrollzellen wurde erwartet, dass keine STAT1-Phosphorylierung
nachweisbar ist. Nach der Inkubation mit IFNγ für 30 Minuten wurden die Zellen geerntet,
lysiert, eine Proteinbestimmung nach dem Bradford-Protokoll durchgeführt und gleiche
Mengen Protein auf Polyacrylamidgele geladen. Anschließend wurden die Proteine auf eine
Nitrozellulose-Membranen transferiert und mit einem phosphoSTAT1- und STAT1spezifischen Antikörper untersucht (Abb. 18).
Die Spuren 1 bis 4 zeigen die unbehandelten reifen DZ, die Spuren 5 bis 8 dagegen die IFNγbehandelten Zellen. Für den Zeitpunkt 0 Stunden wurden nur unbehandelte Zellen analysiert,
da sie direkt nach Virus-Zugabe lysiert wurden. Die Spuren 2 und 3 (Abb. 18A) zeigten eine
STAT1-Aktivierung 8 Stunden nach Infektion mit Wildtyp-Virus (Spur 2) und der vhsMutante (Spur 3) auch ohne IFNγ-Stimulus. Dieser Effekt, allerdings in abgeschwächter
Form, konnte auch in reifen DZ, die mit UV-inaktiviertem HSV-1 wt (Spur 4) infiziert waren,
gezeigt werden. Während das Wildtyp-Virus dieser Aktivierung schnell entgegenwirkte,
Ergebnisse
49
konnte das vhs-mutierte Virus nur schwach die STAT1-Phosphorylierung inhibieren. Diese
Ergebnisse deuten auf eine entscheidende Rolle des vhs-Proteins in diesem Prozess hin.
Vermutlich beeinflusst das vhs-Protein die Signalkaskade, welche dann zur Blockierung der
STAT1-Phosphorylierung führt.
Abb. 18: Der Effekt der HSV-1 Infektion auf die Tyrosin-Phosphorylierung von STAT1. Reife
DZ wurden sowohl mock-infiziert, als auch mit HSV-1 wt und HSV-1 Δvhs mit einer MOI von 1. Zu
den angegebenen Zeitpunkten wurde ein Teil der Zellen mit 1000 U/ml IFNγ für 30 min inkubiert. Der
andere Teil blieb als Kontrolle unbehandelt. Die Zelllysate wurden mittels Western Blot analysiert.
(A) Analysen mit einem phosphoSTAT1-spezifischen Antikörper. (B) Ein STAT1-spezifischer
Antikörper diente als Kontrolle. Hiermit konnte gezeigt werden, dass die STAT1-Menge durch die
HSV-1 Infektion nicht beeinflusst ist. (nd=nicht durchgeführt).
Ergebnisse
50
Die IFNγ-induzierte Phosphorylierung von STAT1 war 16 Stunden nach HSV-1 wt Infektion
klar inhibiert (Abb. 18A Spur 6). Noch deutlicher war der Effekt 24 Stunden nach Infektion.
In HSV-1 Δvhs-infizierten reifen DZ war die Inhibierung der IFNγ-induzierten STAT1Phosphorylierung verglichen mit den Wildtyp-infizierten Zellen nur schwach reduziert (Spur
7). Auch dies deutet auf einen Einfluss des vhs-Proteins auf die Blockierung der
Phosphorylierung hin. Die mit UV-inaktiviertem HSV-1 wt-infizierten reifen DZ verhielten
sich wie die mock-infizierten Zellen (Spuren 5 und 8), was darauf hindeutet, dass die
Transkription viraler Gene notwendig ist, um die STAT1-Aktivierung zu blockieren. Die
STAT1-Menge zeigte während des untersuchten Zeitverlaufs keine Änderung (Abb. 18B).
Dadurch konnte gezeigt werden, dass die reduzierte STAT1-Phosphorylierung nicht auf eine
verringerte STAT1-Expression zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu,
dass HSV-1 die Phosphorylierung, und somit die Aktivierung von STAT1 in einer Weise
inhibiert, welche von der viralen Gen-Expression abhängt.
D.3.4. Die IRF-1-Expression ist in reifen DZ nach HSV-1 Infektion stark reduziert und nicht
mehr länger durch IFNγ induzierbar
Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob eine fehlende STAT1-Phosphorylierung zu
einer reduzierten Protein-Expression des Transkriptionsfaktor IRF-1 in HSV-1-infizierten DZ
führt. Bekannt ist, dass IRF-1 ein GAS-Element im Promotor besitzt und daher durch
aktiviertes STAT1 induzierbar ist. Reife DZ wurden mit HSV-1 wt, Δvhs oder mock-infiziert.
Die eine Hälfte der Zellen wurde 12 h nach Infektion mit 1000U/ml IFNγ behandelt, die
andere Hälfte blieb während des gesamten Experiments unbehandelt. Nach weiteren 12 h
wurden alle Zellen geerntet, lysiert und über ein SDS-Gel aufgetrennt. Anschließend wurden
die Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert und mit einem IRF-1-spezifischen
Antikörper analysiert. Als Ladekontrolle diente ein β−Αktin-spezifischer Antikörper (Abb.
19A). Zur zusätzlichen Quantifizierung wurden die Western Blots mit der AIDA Image
Analyzer Software ausgewertet (Abb. 19B).
Ergebnisse
51
Abb. 19: IRF-1-Expression in HSV-1 wt- bzw. Δvhs-infizierten reifen DZs. (A) Reife DZs wurden
mock- bzw. HSV-1 wt- oder Δvhs-infiziert (MOI=1). Ein Teil der Zellen wurde 12 Stunden nach
Infektion mit 1000U/ml IFNγ behandelt, der andere Teil blieb unbehandelt. Nach weiteren 12 Stunden
wurden die Zellen geerntet und mittels Western Blot analysiert. Dazu wurde ein IRF-1-spezifischer
Antikörper verwendet. Als Ladekontrolle diente ein β-Aktin-spezifischer Antikörper. (B) Die Western
Blot-Ergebnisse wurden zusätzlich mit AIDA Image Analyzer Software quantifiziert. Die Messwerte
wurden in Relation zur β-Aktin-Expression gesetzt und mock-infizierte reife DZ ohne IFNγ-Zugabe
auf 100 Prozent gesetzt.
IRF-1 war in mock-infizierten Zellen in hohen Konzentrationen nachweisbar und konnte
durch IFNγ-Zugabe noch weiter induziert werden (Abb. 19A, Spur 1 und 2, bzw. Abb. 19B,
Säule 1 und 2). Demgegenüber war die IRF-1-Expression in HSV-1 wt-infizierten DZ stark
reduziert bzw. kaum nachweisbar (Abb. 19A, Spur 3, und Abb. 19B, Säule 3) und nach IFNγZugabe konnte IRF-1 auch nicht mehr induziert werden (Abb. 19A, Spur 4, und Abb. 19B,
Säule 4). Im Vergleich zu den wt-infizierten Zellen war der Effekt in Δvhs-infizierten DZ
nicht ganz so deutlich (Abb. 19A, Spur 5 und 6, sowie Abb. 19B, Säule 5 und 6). Daraus kann
Ergebnisse
52
geschlossen werden, dass HSV-1 die IRF-1-Expression in einer STAT1/Jak-abhängigen
Weise blockiert. Dennoch würde man aufgrund der relativ starken STAT1-Aktivierung eine
höhere IRF-1-Menge in Δvhs-infizierten reifen DZ erwarten. Dieses Ergebnis deutet darauf
hin, dass HSV-1 eine weitere, bisher in DZ nicht beschriebene Strategie entwickelt hat, um in
diesen wichtigen Signalweg einzugreifen.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass nach HSV-1
Infektion der IFNγ-Signalweg in primären, reifen DZ an mehreren Stellen deutlich
beeinträchtigt ist. Da über diesen Signalweg die Transkription vieler Gene, die an einer
antiviralen
Immunantwort
beteiligt
sind,
induziert
wird,
zeigen
die
gefundenen
Beobachtungen eine bisher noch unbekannte Strategie von HSV-1, sich einer Immunantwort
zu entziehen. Zu Beginn der Infektion sind die Komponenten des Signalwegs noch nicht
beeinflusst, doch bereits 8 Stunden nach Infektion wirkt das Virus einer antiviralen Antwort
der Zelle entgegen. Somit wird im weiteren Verlauf der Infektion eine effektive
Signalweiterleitung unterbunden, was in der Folge auch zu einer reduzierten Expression
wichtiger, antiviraler Proteine wie z. B. IRF-1 führt.
Diskussion
53
E. Diskussion
E.1. Untersuchungen zum LMP7-Protein nach HSV-1 Infektion
HSV-1 ist ein sehr verbreitetes Virus, die Durchseuchungsrate innerhalb der Bevölkerung
beträgt über 90%. Wie alle Herpesviren etabliert auch HSV-1 eine latente Infektion und
persistiert ein Leben lang in den infizierten Individuen. Die latente Infektion wird in den
Nervenzellen des Trigeminus-Ganglions ausgebildet. Die Reaktivierung des latenten Virus
führt zur Lyse der Neuronen. Die dadurch freigesetzten Viren infizieren erneut Epithelzellen
und lösen somit eine akute Herpeserkrankung mit den typischen Herpesläsionen aus.
Virale Infektionen lösen ein Vielzahl von Gegenmaßnahmen des Immunsystems aus, um die
Viruspartikel zu eliminieren bzw. die Infektion zu kontrollieren. Im Fall von HSV-1 kann eine
persistente Infektion jedoch nicht verhindert werden, da das Virus Mechanismen entwickelt
hat, die eine völlige Eliminierung durch das Immunsystem verhindern. Auch in reifen DZ
beeinflusst HSV-1 einige essentielle Funktionen, wie z.B. die Antigenpräsentation und andere
mehr (Kobelt et al., 2003), die für eine antivirale Abwehr wichtig sind. DZ sind die
potentesten APZ und spielen, aufgrund ihrer herausragenden Fähigkeit, naive T-Zellen zu
stimulieren, eine entscheidende Rolle in der Induktion der T-Zell-vermittelten Immunantwort.
Einige Mechanismen, mit denen HSV-1 eine spezifische Immunantwort unterdrückt, sind
bereits beschrieben. So ist bekannt, dass nach einer HSV-1 Infektion der Chemokinrezeptor
CCR7 deutlich reduziert auf der Oberfläche reifer DZ exprimiert wird. Dadurch ist die
Migrationsfähigkeit der Zellen reduziert. Somit wären die Zellen in vivo nicht mehr in der
Lage, zu den Lymphknoten zu wandern und dort eine T-Zell-vermittelte Immunantwort
auszulösen (Prechtel et al., 2005). Außerdem beeinträchtigt das virale ICP47 Protein die TAPFunktion und verhindert somit eine erfolgreiche Beladung der MHC-I-Moleküle. Dabei bindet
ICP47 mit einer hohen Affinität an TAP und blockiert dadurch die Bindestellen für die
generierten Peptide. Somit ist die Erkennung der HSV-1-infizierten Zellen durch CD8+
zytotoxische T-Zellen inhibiert (Ahn et al., 1996; Goldsmith et al., 1998; Hill et al., 1995).
Desweiteren wird das Oberflächenmolekül CD83 speziell nach HSV-1 Infektion abgebaut.
Dabei spielt ICP0, ein IE-Protein von HSV-1, eine entscheidende Rolle (Kummer et al.,
2007). Durch die deutlich verringerte CD83-Expression auf der Zelloberfläche von infizierten
DZ ist die Fähigkeit der Zellen, T-Zellen zu stimulieren, stark reduziert (Kruse et al., 2000).
Ebenso ist bekannt, dass das virale ICP27 Protein die Aktivierung von IRF-3 und NFκB
Diskussion
54
behindert. Hierbei handelt es sich um einen viraler Mechanismus, der die Expression von
Genen mit antiviraler Aktivität unterbindet (Melchjorsen et al., 2006). Eine weitere Studie zur
Strategie von HSV-1, eine Immunantwort zu verhindern, zeigt, dass nach Infektion das
Oberflächenmolekül CD1d deutlich reduziert exprimiert wird, sodass natürliche Killer TZellen die infizierten Zellen nicht mehr erkennen können (Raftery et al., 2006; Yang et al.,
1992; Yuan et al., 2006). Außerdem spielt die RNase Aktivität des HSV-1 virion host shut off
(vhs) Proteins eine Rolle bei der generellen Destabilisierung von zellulären RNAs. Vhs ist
eine mRNA-spezifische RNase, die sehr schnell zelluläre RNAs abbaut, aber auch beteiligt ist
an der Blockierung der zellulären Protein-Synthese und an der Zerstörung von
polyribosomalen Komplexen (Smiley, 2004).
Ein wichtiger Schritt bei der T-Zell-vermittelten Immunantwort gegen virale Infektionen ist
die Antigenpräsentation über MHC-I-Moleküle. Eine ganz entscheidende Rolle spielt dabei
die Präsentation von viralen Peptiden durch reife DZ. Die Prozessierung der Peptide, die
anschließend auf die MHC-I-Moleküle geladen werden, erfolgt im Proteasom bzw. im
Immunoproteasom
reifer
DZ.
Der
Unterschied
zwischen
Immunoproteasom
und
konstitutivem 26S Proteasom besteht zum einen im Austausch der Untereinheiten Y, Z und X
gegen die Immunountereinheiten LMP2, MECL1 und LMP7. Zum anderen wird der
zusätzliche Regulator-Komplex PA28 gebildet. In der murinen RMA-Zelllinie wurde gezeigt,
dass nach Stimulierung mit IFNγ die Immuno- und Regulatoruntereinheiten exprimiert und
durch de novo-Assemblierung Immunoproteasomen gebildet werden (Frentzel et al., 1994).
Während der Reifung entstehen auch in DZ Immunoproteasomen (Macagno et al., 1999).
Zunächst wurde davon ausgegangen, dass in reifen DZ nur noch das Immunoproteasom
exprimiert wird (Morel et al., 2000). Inzwischen weiß man jedoch, dass in reifen DZ sowohl
konstitutive Proteasomen als auch Immunoproteasomen exprimiert werden (Macagno et al.,
2001). Das Immunoproteasom erhöht die Freisetzung von spezifisch prozessierten Peptiden
und verstärkt somit die Antigen-Präsentation auf MHC-I-Molekülen. Die Bedeutung der
Immunountereinheiten für die Antigenpräsentation konnte auch in vivo gezeigt werden. So
konnten z. B. LMP7-knockout Mäuse einige Antigene deutlich vermindert präsentieren und
zeigten zusätzlich eine verminderte MHC-I-Expression (Fehling et al., 1994). Mäuse, denen
das LMP2-Protein fehlte, besaßen zwar eine normale MHC-I-Expression, hatten allerdings
eine reduzierte Zahl an CD8+ T-Zellen und somit eine schlechtere CTL-vermittelte antivirale
Immunantwort (Van Kaer et al., 1994).
Diskussion
55
Das Immunoproteasom ist durch die erhöhte Freisetzung und somit verstärkte Präsentation
von Peptiden ein wichtiger zellulärer Komplex, der zur Erkennung von Virus-infizierten
Zellen durch das Immunsystem beiträgt. Um latent zu persistieren könnten daher Viren einen
Mechanismus entwickelt haben, welcher die Aktivität des Immunoproteasoms beeinflusst. In
humanen Fibroblasten konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit HCMV den Aufbau des
Immunoproteasoms verändert, indem der effektive Einbau aller drei Immunountereinheiten,
besonders LMP7 verhindert wird. Da LMP7 für den richtigen Zusammenbau des
Immunoproteasoms nötig ist (Griffin et al., 1998), war die Komplexbildung des
Immunoproteasoms nach CMV-Infektion so beeinträchtigt, dass sich die proteolytische
Aktivität deutlich verschlechterte. Im Gegensatz zu den in vitro Daten fand die gleiche
Arbeitsgruppe jedoch eine verstärkte Formation von Immunoproteasomen in Mäusen mit
akuter Maus-Cytomegalovirus (MCMV) Infektion (Khan et al., 2004).
Zu Beginn dieser Arbeit lagen bezüglich der Beeinflussung des Immunoproteasoms, nach
Infektion primärer DZ mit HSV-1, keine Erkenntnisse vor. Die Auswertung der Affymetrix
Chip Arrays gab jedoch Hinweise darauf, dass in HSV-1-infizierten reifen DZ die LMP7mRNA-Expression im Vergleich zu mock-infizierten DZ deutlich reduziert war. Dies deutete
darauf hin, dass in HSV-1-infizierten Zellen, ähnlich wie bei CMV-Infektion, das
Immunoproteasom beeinflusst ist. Die Affymetrix-Daten konnten anschließend mittels
semiquantitativer RT-PCR und Real Time RT-PCR bestätigt werden. Somit konnte gezeigt
werden, dass die Infektion von reifen DZ mit HSV-1 zu einer reduzierten LMP7Transkription führt. Nachdem IFNγ die Transkription der Immunountereinheiten induziert,
wurden die Zellen zusätzlich mit IFNγ behandelt. Dies führte zu einer leichten Zunahme der
LMP7-mRNA-Expression in mock-infizierten DZ, jedoch nicht in HSV-1-infizierten DZ.
Um zu untersuchen, ob die LMP7-mRNA nach HSV-1 Infektion aktiv abgebaut oder nur
nicht mehr transkribiert wird, wurden Experimente mit dem Transkriptionsinhibitor
Actinomycin D durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der Rückgang der LMP7mRNA in Actinomycin D-behandelten reifen DZ vergleichbar ist mit dem Rückgang der
LMP7-mRNA in HSV-1-infizierten Zellen. Dies deutet darauf hin, dass die LMP7-mRNA
nach HSV-1 Infektion nicht mehr transkribiert wird, aber wohl kein aktiver Abbau der mRNA
durch virale Proteine stattfindet.
Diskussion
56
Der gleiche Versuch wurde auch mit Viren, in welchen das vhs Gen deletiert ist, durchgeführt.
Das virale vhs Protein ist eine mRNA-spezifische RNase, die sehr schnell zelluläre RNAs
abbaut (Smiley, 2004). Um zu zeigen, dass der Rückgang der LMP7-mRNA nach HSV-1
Infektion nicht auf einen generellen Abbau zellulärer RNAs zurückzuführen ist, wurden reife
DZ mit dem mutierten Δvhs Virus infiziert. Der Rückgang der LMP7-mRNA konnte ebenfalls
in HSV-1 Δvhs-infizierten DZ gezeigt werden. Diese Beobachtung legte nahe, dass die
Abnahme der LMP7-mRNA nicht auf dem Einfluss des vhs Proteins beruht.
Der nächste Schritt war die Untersuchung der LMP7-Expression. Es wurde bereits
beschrieben, dass der Einbau des LMP7-Proteins die Kapazität des Immunoproteasoms
erhöht, Peptide zu prozessieren, die mit einer höheren Affinität an TAP und MHC-I-Moleküle
binden (Gaczynska et al., 1994). In in vivo-Studien mit Mäusen, die eine Deletion des LMP7
Genes hatten, wurde gezeigt, dass durch das fehlende LMP7 die Antigen-Präsentation sehr
ineffizient wurde (Fehling et al., 1994). Außerdem konnte gezeigt werden, dass LMP7 für den
richtigen Zusammenbau der Immunoproteasomen benötigt wird (Griffin et al., 1998). Daraus
könnte man schließen, dass eine in HSV-1-infizierten reifen DZ reduzierte LMP7-Menge, zu
einer verringerten Antigen-Präsentation führt. Die Reduktion konnte auf mRNA-Ebene auch
nachgewiesen werden, die Proteinmenge von LMP7 blieb allerdings nach in vitro-Infektion
der DZ konstant. Zu keinem untersuchten Zeitpunkt nach Infektion konnte ein Rückgang des
Proteins gezeigt werden. Ebenso hatte die Stimulierung mit IFNγ keine Auswirkung auf die
Proteinmenge. Erwartet wurde eine Zunahme der LMP7-Protein-Menge nach IFNγStimulation, wie es in der murinen RMA-Zelllinie bereits gezeigt wurde (Frentzel et al., 1994;
Yang et al., 1992). Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass in DZ bereits während der Reifung
Immunoproteasomen gebildet werden (Macagno et al., 1999) und eine weitere Induktion
durch IFNγ-Zugabe keinen zusätzlichen Effekt mehr hat.
Eine andere Möglichkeit wäre, dass zwar die Gesamtmenge an LMP7 konstant bleibt, der
Einbau ins Immunoproteasom nach HSV-1 Infektion jedoch nicht mehr effektiv genug ist.
Daher wurde die Effizienz des LMP7-Einbaus ins Immunoproteasom mittels IP überprüft.
Jedoch konnte auch hier nach HSV-1 Infektion kein Unterschied in der eingebauten LMP7Protein-Menge festgestellt werden. Im Gegensatz zur in vitro-Infektion mit HCMV, wie von
Kahn und Kollegen beschrieben, ist nach HSV-1 Infektion kein reduzierter Einbau von LMP7
ins Immunoproteasom zu beobachten. Das kann zum einen an den unterschiedlichen
Virustypen, HCMV und HSV-1, liegen, beide gehören zwar zu den Herpesviren, aber HSV-1
Diskussion
57
ist ein α- und HCMV ein β-Herpesvirus. Zum anderen kann es auch an den unterschiedlich
verwendeten Zellen liegen. Kahn und Kollegen haben eine Fibroblastenzelllinie verwendet,
während in der vorliegenden Arbeit mit primär-isolierten und generierten DZ gearbeitet
wurde.
Frühere Arbeiten zeigten, dass schon in unreifen DZ alle drei Immunountereinheiten LMP2,
MECL1 und LMP7 in großen Mengen gebildet werden (Macagno et al., 1999). Nach Reifung
blieben die Protein-Mengen der Immunountereinheiten weitestgehend konstant. Eine geringe
Zunahme aller drei Immunountereinheiten konnte erst nach IP der Proteasomen und
Auftrennung über 2D-Gelelektophorese gezeigt werden (Macagno et al., 1999). Diese
Ergebnisse zeigen, dass reife DZ sich anders verhalten als Zelllinien. Die Untereinheiten
LMP2, MECL1 und LMP7 werden bereits während der Reifung gebildet. Hauptsächlich wird
die Expression der Immunountereinheiten über den IFNγ-Signalweg induziert (Griffin et al.,
1998; Yang et al., 1992). Aber auch andere Zytokine können in Maßen die Expression von
LMP2, LMP7 oder MECL1 beeinflussen. Tumor Nekrosis Faktor alpha (TNFα) kann LMP7,
aber nicht MECL1 induzieren (Foss et al., 1998; Loukissa et al., 2000). IFNβ beeinflusst die
Transkription von LMP2, aber nicht von MECL1 (Hisamatsu et al., 1996). IFNα induziert in
primären Endothelzellen und humanen Krebszelllinien LMP2 (Raasi et al., 1999; Seliger et
al., 1996). Allerdings stützen sich alle hier aufgeführten Daten wieder „nur“ auf
Beobachtungen in Zelllinien. Ob in DZ während der Reifung die Untereinheiten durch andere
Zytokine induziert werden, ist noch nicht bekannt. Dennoch wäre dies eine Erklärung für die
Expression von LMP2, MECL1 und LMP7 in reifen DZ. Ebenso könnte eine hohe Stabilität
der Untereinheiten ein Argument sein, warum nach HSV-1 Infektion kein Rückgang der
LMP7-Protein-Menge in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte.
Um die Stabilität des Proteins zu untersuchen, wurden reife DZ mit dem Translationsinhibitor
Cycloheximid behandelt. Die Analyse der Cycloheximid-behandelten reifen DZs zeigte, dass
auch 24 Stunden nach Cycloheximid-Zugabe das Protein immer noch nachweisbar ist. Dieses
Ergebnis lässt den Schluss zu, dass in reifen DZ das LMP7-Protein in vitro eine relativ lange
Halbwertszeit besitzt. Einmal gebildet ist es über mehr als 24 Stunden stabil. Somit verhindert
eine
HSV-1
Infektion
in
reifen
DZ
zwar
eine
weitere
Transkription
der
Immunountereinheiten-RNA, baut aber nicht aktiv die untersuchten Proteine ab.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass in vitro der Aufbau und somit wohl auch die
Diskussion
58
Funktion der Immunoproteasomen in reifen DZ nach HSV-1 Infektion auf Proteinebene nicht
beeinträchtigt sind.
E.2. Untersuchungen zu möglicher Interaktion zwischen LMP7 und VP16
Eine Veröffentlichung von Zhu und Kollegen zeigte, dass das virale VP16-Tegumentprotein
ein intaktes Proteasom und eine intakte Ubiquitinylierungsmaschenerie benötigt, um seine
Transaktivator-Funktion auszuüben (Zhu et al., 2004). VP16 ist im Tegument des
Viruspartikels lokalisiert und ist ein Transkriptions-Aktivator für die IE-Genprodukte von
HSV-1. Wie auch bei zellulären Transkriptionsaktivatoren muss VP16 ubiquitinyliert und im
Proteasom degradiert werden, damit die anschließende Transkription der viralen IE-Gene
stattfinden kann. Ist das Proteasom durch Zugabe eines Inhibitors blockiert, ist die
Trankriptions-Aktivität von VP16 deutlich eingeschränkt (Zhu et al., 2004). Aufgrund der
beschriebenen Beobachtungen wurde vermutet, dass eine mögliche direkte oder indirekte
Interaktion zwischen einer Immunountereinheit und VP16 bestehen könnte. Deswegen wurde
das zusammen mit den Proteasomen immunopräzipitierte Protein auf die Anwesenheit von
VP16 hin analysiert. Tatsächlich konnte VP16 zusammen mit den Proteasomen in HSV-1 wtund Δvhs-infizierten reifen DZ nachgewiesen werden.
Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob VP16 direkt mit LMP7 interagiert. Für
andere persistierende Viren, wie dem humanen Immundefizienz-Virus (HIV) (Apcher et al.,
2003) oder dem Hepatitis C-Virus (HCV) (Khu et al., 2004), konnten direkte Interaktion mit
LMP7 gezeigt werden. Das Transaktivator-Protein Tat, das sehr früh nach Infektion
exprimiert wird und essentiell ist für die Genexpression, die Replikation und die Infektiosität
von HIV, interagiert unter anderem direkt mit LMP7 und blockiert somit die proteolytische
Aktivität des 20S cores, was zu einer Immun Evasion des Virus beiträgt (Apcher et al., 2003).
Ebenso interagiert das nicht-Struktur-Protein NS3 von HCV, ein Protein mit Helikase- und
Protease-Domäne, mit LMP7. NS3 spielt eine entscheidende Rolle bei der Prozessierung
viraler Polyproteine und bei der viralen Replikation. Die Interaktion mit LMP7 vermindert die
proteolytische Aktivität des Immunoproteasoms und schützt das Virus durch eine reduzierte
Präsentation von viralen Peptiden über MHC-I-Moleküle vor einer Immunantwort (Khu et al.,
2004). Um eine direkte Interaktion zwischen VP16 und LMP7 nachzuweisen, wurde zunächst
an LMP7 ein AU1-Epitop kloniert. Das AU1-Epitop sollte die IP ermöglich, da der uns zur
Verfügung stehende LMP7-spezifische Antikörper für diese Anwendung nicht geeignet war.
Diskussion
59
Das entstandene LMP7-AU1-Fusionsprotein wurde zusammen mit VP16 cotransfiziert. Es
konnte jedoch keine direkte Interaktion zwischen VP16 und LMP7 gezeigt werden. Ob VP16
mit anderen Untereinheiten des Proteasoms bzw Immunoproteasoms interagiert, muss in
zukünftigen Experimenten überprüft werden.
E.3. HSV-1 Infektion beeinflusst den IFNγ-Signalweg
Wie gezeigt werden konnte (siehe Abb. 6 und Abb. 7), nimmt die Menge an LMP7-mRNA
nach HSV-1 Infektion deutlich ab. Um eine Erklärung für diese Abnahme zu finden, wurde
der IFNγ-Signalweg genauer untersucht. LMP7 wird, wie eine Reihe weiterer Komponenten
der antviralen Immunantwort, über den IFNγ-Signalweg induziert. Die IFNγ-Ausschüttung ist
ein früher Schritt in der Immunantwort auf virale Infektionen. CD4+, CD8+ und NKT-Zellen
sind die Hauptproduzenten von IFNγ. Die Signalkaskade, die durch einen IFNγ-Stimulus in
Zellen ausgelöst wird, ist hinreichend untersucht. Das IFNγ-Dimer bindet an zwei IFNγRezeptor α-Ketten, die jeweils mit Jak1 assoziiert sind. Dadurch bieten sich Bindungsstellen
für die IFNγ-Rezeptor β-Ketten, die wiederum jeweils mit Jak2 assoziiert sind. Durch die
Zusammenlagerung des Rezeptors kommen die intrazellulären Domänen nahe zusammen,
was eine Aktivierung von Jak2 und dann von Jak1 zur Folge hat. Dadurch entstehen
Bindungsstellen für STAT1. Nach der Bindung wird STAT1 durch Jak1 am Tyrosin 701
phosphoryliert. Infolge dieser Phosphorylierung dimerisiert STAT1 und gelangt dann in den
Zellkern. Dort bindet das Dimer an GAS-Elemente, die in Promotor-Regionen von IFNγinduzierbaren Genen lokalisiert sind (Darnell, Jr. et al., 1994).
Aus Experimenten mit einer Epithel-Zelllinie war bekannt, dass eine HSV-1 Infektion die
STAT1-Phosphorylierung, nach Stimulierung der Zellen mit IFNγ, reduziert. Yokota und
Kollegen konnten zeigen, dass Jak1/2 in HSV-1-infizierten humanen FL-Zellen in geringerem
Maße phosphoryliert und somit schwächer aktiviert waren. Dies führte in der Folge dazu, dass
STAT1 nicht mehr phosphoryliert wurde (Yokota et al., 2001).
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass HSV-1 wt-infizierte reife DZ im
Verlauf der Infektion ebenfalls immer weniger in der Lage sind, auf den IFNγ-Stimulus zu
reagieren, und somit die STAT1-Phosphorylierung blockiert ist. Die schwächere Aktivierung
der Jaks könnte unter anderem an einer Reduktion der Jak1-Menge liegen (Chee et al., 2004).
Diskussion
60
Wie in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden konnte, war nach HSV-1 Infektion von reifen
DZ die IFNγ-Rezeptor α-Kette sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebene stark
reduziert. Da Jak1 direkt mit der α-Kette des IFNγ-Rezeptors assoziiert ist, könnte es sein,
dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Reduktion der α-Kette und Jak1 besteht. In
den Affymetrix Chip Daten finden sich Hinweise, die zeigen, dass die mRNA-Mengen von
Jak1 nach HSV-1 Infektion ebenfalls reduziert sind. Diese Beobachtung muss jedoch in
weiteren Experimenten noch genauer untersucht werden. Für diese Arbeit lässt sich aber
festhalten, dass die mRNA-Mengen der IFNγ-Rezeptor α-Kette in HSV-1 wt-infizierten
reifen DZ im Vergleich zu mock-infizierten Zellen deutlich verringert sind. Dies konnte
mittels quantitativer Real Time RT-PCR gezeigt werden. Daraus schließen wir, dass HSV-1
bereits die Transkription der IFNγ-Rezeptor α-Kette beeinflusst. Die reduzierte mRNAMenge der IFNγ-Rezeptor α-Kette wirkt sich dann auch in einer verminderten Expression des
Moleküls auf der Zelloberfläche aus. Durch diese reduzierte Expression des IFNγ-Rezeptors
an der Oberfläche können reife DZ nur noch schwach auf einen IFNγ-Stimulus reagieren, was
zu einer verminderten STAT1-Phosphorylierung führt. Die STAT1-Proteinmengen blieben
jedoch unbeeinflusst.
Ebenso konnte in dieser Arbeit in reifen DZ gezeigt werden, dass für die Blockade der
STAT1-Phosphorylierung virale Replikation notwendig ist. Ähnliche Ergebnisse wurden auch
in Experimenten mit Zelllinien beobachtet (Mossman et al., 2001; Nicholl et al., 2000).
Wurden reife DZ mit UV-inaktivierten HSV-1 infiziert, war die STAT1-Phosphorylierung
vergleichbar mit der in mock-infizierten reifen DZ. Allerdings war in den mit UVinaktiviertem HSV-1 infizierten DZ auch ohne IFNγ-Zugabe zunächst eine geringe STAT1Phosphorylierung nachweisbar. Diese Beobachtung zeigte sich auch in HSV-1 wt-infizierten
DZ. In den HSV-1 wt-infizierten Zellen konnte das Virus der Phosphorylierung aber schnell
entgegenwirken. Wie kürzlich gezeigt wurde, ist diese Aktivierung von Toll-like Rezeptoren
unabhängig (Paladino et al., 2006), kann aber durchaus durch virale Glykoproteine ausgelöst
werden. Für CMV konnte gezeigt werden, dass das Glykoprotein B ausreichend ist, um die
Transkription IFN-stimulierter Gene wie IRF-3 oder IRF-7 auszulösen. Dadurch wird die
Produktion von IFNα bzw. β in den betreffenden Zellen induziert, was eine antivirale
Antwort zur Folge hat (Boehme et al., 2004; Chin et al., 2001). Dies könnte im Fall von HSV1 ebenso zutreffen.
Diskussion
61
Um auch hier zu zeigen, dass der Rückgang der IFNγ-Rezeptor α-Kette-mRNA nicht auf der
RNase-Aktivität des vhs-Proteins beruht, wurden die reifen DZ mit der HSV-1 vhs-Mutante
infiziert. In diesem Fall war die Inhibierung der STAT1-Phosphorylierung stark verzögert.
Diese Beobachtungen passen gut zu den Daten der Gruppe um Roizman, die zeigen konnte,
dass HSV-1, in welchem vhs deletiert ist, sensitiver auf IFNγ reagiert (Chee et al., 2004).
Außerdem ist die Reduktion der Jak1-Mengen in HeLa-Zellen, die mit HSV-1 Δvhs infiziert
sind, langsamer im Vergleich zu HSV-1 wt-infizierten Zellen (Chee et al., 2004). Die starke
Aktivierung von STAT1 in reifen HSV-1 Δvhs-infizierten DZ lässt sich allerdings nicht mit
den Daten der IFNγ-Rezeptor α-Kette Oberflächenexpression erklären. Hier verhielt sich das
Δvhs-Virus vergleichbar mit dem Wildtyp-Virus, nämlich in einer deutlich verringerten
Expression der IFNγ-Rezeptor α-Kette. Dieses Ergebnis gab Hinweise darauf, dass HSV-1
den STAT1-Signalweg an verschiedenen Stellen in der Kaskade beeinflusst, und wohl auch
zusätzliche, noch nicht genau definierte, virale Genprodukte an der Blockierung dieses
Signalwegs beteiligt sind.
Eine
direkte
Konsequenz
der
STAT1-Phosphorylierung
ist
die
Expression
des
Transkriptionsfaktors IRF-1. IRF-1 reguliert eine große Anzahl von Genen, die am Aufbau
einer Immunantwort beteiligt sind. Unter anderen reguliert IRF-1 auf Transkriptionsebene die
Expression der Immunountereinheit LMP7. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach
HSV-1 Infektion eine deutlich reduzierte Expression von IRF-1 nachweisbar ist, welche auch
nach IFNγ-Zugabe nicht mehr induzierbar war. HSV-1 Δvhs-infizierte reife DZ zeigten
ebenfalls deutlich reduzierte IRF-1-Mengen, obwohl in diesen Zellen STAT1 sehr stark
aktiviert war. Diese Beobachtung gibt, wie bei der reduzierten Oberflächenexpression der
IFNγ-Rezeptor α-Kette, Hinweise darauf, dass das vhs-Protein zwar die Phosphorylierung
von STAT1 beeinflusst, für die deutlich reduzierte Expression der IFNγ-Rezeptor α-Kette und
von IRF-1 aber wohl weitere, noch nicht genau definierte, virale Genprodukte verantwortlich
sind. Ob das vhs-Protein direkt die STAT1-Phosphorylierung inhibiert oder indirekt die
Aktivierung beeinflusst, muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine HSV-1 Infektion den
STAT1-Signalweg an mehreren Stellen beeinflusst. Zum ersten Mal konnte nachgewiesen
werden, dass in DZ HSV-1 bereits die Oberflächenexpression der IFNγ-Rezeptor α-Kette
beeinflusst. Diese Reduzierung bewirkt eine verringerte STAT1-Phosphorylierung und als
Konsequenz daraus, auch eine verringerte IRF-1-Expression. Mit der letzen Beobachtung, der
Diskussion
62
reduzierten IRF-1-Expression, lässt sich nun auch die verringerte LMP7-mRNA-Menge in
HSV-1 infizierten DZ erklären, da IRF-1 ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die LMP7mRNA-Expression darstellt. Dass die STAT1-Kaskade von HSV-1 auch in reifen DZ
beeinflusst wird, zeigt einen neuen Mechanismus, mit dem das Virus eine antivirale
Immunantwort in diesen so bedeutenden APZ verzögert bzw. behindert.
Abkürzungen
63
F. Abkürzungen
Abb.
Abbildung
ACD
Aqua-Citrat-Dextrose
Ak
Antikörper
Ag
Antigen
APS
Ammonium Persulphat
APZ
antigenpräsentierenden Zelle
BSA
Bovines Serumalbumin
bp
Basenpaar
bzw
beziehundsweise
°C
Grad Celcius
CCR
“CC chemokine receptor”
CD
“cluster of determinants”
Oberflächenantigen-Nomenklatur
cDNA
kompementäre DNA
DMSO
Dimethylsufoxid
DNA
“desoxyribonucleic acid” (Desoxyribonukleinsäure)
ds
“double stranded” (doppelsträngig)
DZ
Dendritische Zelle
ECL
“enhanced chemiluminescence”
E.coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiamin-N, N, N’, N’-tetraacetat
EtBr
Ethidiumbromid
EtOH
Ethanol
FACS
“fluorescence-activated cell sorting”
FITC
Fluoreszein-Isothiocyanat
FKS
fötales Kälberserum
FSC
“forward scatter”
g
Gramm
GAS
“gamma-activated sequence”
GM-CSF
“granulocyte-macrophage colony stimulating factor”
(Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor)
h
Stunde
Abkürzungen
HRP
64
„horse-raddish-peroxidase“
(Streptavidin-gekoppelte Meerretichperoxidase)
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IFN
Interferon
IP
Immunopräzipitation
IRF-1
“interferon regulatory factor 1”
Jak
Janus kinase
k
Kilo
kD
Kilodalton
l
Liter
LB
Luria-Broth
LMP7
“low molecular weight protein 7”
Lsg.
Lösung
m
milli (10-3)
m
Meter
µ
mikro (10-6)
M
Mol = mol/Liter
mA
milliAmpere
MCS
“multiple cloning site”
ME
Mercaptoethanol
MECL1
“multicatalytic endopeptidase complex-like 1”
MFI
“mean fluorescence intensity”
MHC
“major histocompatibility complex”
(Haupthistokompatibilitätskomplex)
min
Minute
n
nano (10-9)
NEAA
Non essential aminoacids
NTP
Nukleotid-Triphosphat
OD
optische Dichte
PBS
“phosphate buffer saline” (Phosphatpuffer)
PCR
“polymerase chain reaction” (Polymerasekettenreaktion)
PE
Phycoerythrin
PGE2
Prostaglandin E2
Abkürzungen
pH
65
“potentia Hydrogeni”
negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
PMSF
Phenyl-methyl-sulfonyl-fluorid
RNA
“ribonucleinacid” (Ribonukleinsäure)
RNase
Ribunuklease
RT
Reverse Transkription
RT
Raumtemperatur
rpm
“rounds per minute” (Umdrehungen pro minute)
SDS
Sodium Dodecyl Sulfat
ss
“single stranded” (einzelstängig)
SSC
“side scatter”
STAT1
“signal transducers and activators of transcription 1”
Tab.
Tabelle
TAP
Transporter assoziiert mit Antigenprozessierung
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamine
Th
T-Helfer
TNFα
Tumornekrosefaktor α
Tris
Trishydroxymethylaminomethan
Tween20
Poly(oxyethylen)n-Sorbitant-Monolaurat
TZR
T-Zell-Rezeptor
U
Unit (Enzymeinheit)
ü.n.
über Nacht
V
Volt
v/v
“volume per volume”
WB
Western Blot
WT
Wildtyp
w/v
“weight per volume”
z. B.
zum Beispiel
z. T.
zum Teil
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Persönliche Veröffentlichungen
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H. Persönliche Veröffentlichungen
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M., Stewart, E. A., Eisemann, J., Steinkasserer, A., Suzuki-Inoue, K., Fuller, G. L.,
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Eisemann, J., Mühl-Zürbes, P., Steinkasserer, A. und Kummer, M. 2007. Infection of
mature dendritic cells with herpes simplex virus type 1 interferes with the interferon signaling
pathway. Immunobiology. Accepted.
H.2. Posterpräsentationen
Eisemann, J. I., Turza, N. M., Kobelt, D. J., Coffin, R. S., McGrath, Y., Hacker, C., Ju,
X., Zenke, M., Steinkasserer, A., und Prechtel, A. T. Infection of mature dendritic cells
with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated
migration. IZKF Erlangen, Erlangen (2005).
Eisemann, J. I., Turza, N. M., Kobelt, D. J., Coffin, R. S., McGrath, Y., Hacker, C., Ju,
X., Zenke, M., Steinkasserer, A., und Prechtel, A. T. Infection of mature dendritic cells
with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated
migration. 2nd International Meeting on Dendritic Cells at the Host-Pathogen Interface,USA
(2005).
Prechtel, A. T., Turza, N. M., Kobelt, D. J., Eisemann, J. I., Coffin, R. S., McGrath, Y.,
Hacker, C., Ju, X., Zenke, M. und Steinkasserer, A. Infection of mature dendritic cells
with herpes simplex virus type 1 dramatically reduces lymphoid chemokine-mediated
migration. 9th International Conference Dendritic Cells, Schottland (2006).
Persönliche Veröffentlichungen
74
Eisemann, J., Mühl-Zürbes, P., Steinkasserer, A. und Kummer, M. Infection of mature
dendritic cells with herpes simplex virus type 1 interferes with the interferon signaling
pathway. 5th International Meeting on Dendritic Cell Vaccination and other Strategies to tip
the Balance of the Immune System, Bamberg (2007)
Eisemann, J., Mühl-Zürbes, P., Steinkasserer, A. und Kummer, M. Infection of mature
dendritic cells with herpes simplex virus type 1 interferes with the interferon signaling
pathway. Third European Congress of Virology, Nürnberg (2007)
Lebenslauf
75
I. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Jutta Eisemann
Geburtsdatum
17.09.1976
Geburtsort
Nürnberg
Familienstand
ledig
Staatsangehörigkeit
Deutsch
Schulbildung
9/1983 – 5/1985:
Holzgartenschule in Nürnberg
5/1985 – 7/1987:
Luitpoldschule in Schwabach
9/1987 – 7/1996:
Adam-Kraft-Gymnasium in Schwabach
7/1996
Abschluss der allgemeinen Hochschulreife
Studium
11/1996 – 4/2002:
Diplombiologie an der Friedrich-Alexander Universität
Erlangen-Nürnberg
5/2001
mündlicher Teil der Diplomhauptprüfung
7/2001 – 4/2002
Diplomarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Frank
Kirchhoff am Lehrstuhl für Virologie der Friedrich-Alexander
Universität Erlangen-Nürnberg
Thema: Resistenzentwicklung bei HIV-1
Promotion
Seit 12/2002
Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Alexander
Steinkasserer am Lehrstuhl für Experimentelle Dermatologie
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Thema: Untersuchungen zur Interaktion von Herpes Simplex
Virus Type 1 mit reifen Dendritischen Zellen
Danksagung
76
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler für die freundliche Betreuung dieser Arbeit seitens
der Naturwissenschaftlichen Fakultät II.
Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Eckhart Kämpgen für die Übernahme des
Zweitgutachtens und für seine sehr nützlichen Ratschläge bedanken.
Besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Alexander Steinkasserer.
Während der Durchführung dieser Arbeit war er jederzeit für mich da und hat mich immer
unterstützt.
Mein Dank gilt auch der Arbeitsgruppe von Dr. Elke Krüger, für die Bereitstellung des
LMP7-Plasmids, für die hilfreichen Tips und die Diskussionsbereitschaft.
Weiterhin möchte ich mich bei meiner Arbeitsgruppe für die nette Zusammenarbeit bedanken,
ganz besonders aber bei Dr. Mirko Kummer und Petra Mühl-Zürbes, für Ihre ständige
Diskussions- und Hilfsbereitschaft und die überaus angenehme und sehr nette Atmosphäre im
Labor.
Auch den übrigen Kollegen aus dem „Container“ und „Schuppen“ danke ich für die kollegiale
Atmosphäre, ganz besonders aber Dipl.Biol. Daniela Kosmides, Dipl.Biol. Mira Rohmer und
Dipl.Biol. Stephan Schierer, weil es ohne Euch nur halb so lustig gewesen wäre.
Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei Dr. Niels Schaft und Dr. Jan Dörrie aus der RNAGruppe, für Ihre unermüdliche Hilfsbereitschaft und nette Unterstützung.
Natürlich möchte ich mich an dieser Stelle auch bei all meinen Freunden bedanken, ganz
besonders bei Pia, Elke und Bobby, Eva, Leila und Jutta, die mir mit Ihrer Geduld und Ihrem
Verständnis immer zur Seite standen und somit auch zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben.
Nicht zuletzt danke ich aber meinen Eltern von ganzem Herzen für die Selbstverständlichkeit,
mit der sie mir so vieles im Leben ermöglicht haben und dass sie immer für mich da gewesen
sind.
Am Ende gilt mein ganz besonderer Dank meinem Freund Oliver, der mich durch seine Liebe
und sein Verständnis sehr unterstützt hat.