Dokument_35.

Immunmodulation durch orale Applikation von
Antigen kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Katja Goldmann
aus Kulmbach
1
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
16.04.2012
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Thomas Winkler
Zweitberichterstatter:
PD Dr. Bernd Spriewald
2
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung......................................................................................................................... 1
1.1 Selbsttoleranz.............................................................................................................. 1
1.2 Orale Toleranz............................................................................................................. 1
1.2.1 Das Darmimmunsystem........................................................................................ 1
1.2.2 Mechanismen der oralen Toleranz........................................................................ 3
1.3 Gentherapie mit Chitosan-DNA Nanopartikeln............................................................. 5
1.4 Transplantatabstoßung................................................................................................ 7
1.4.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) und die allogene Immunantwort..... 7
1.4.2 Formen der Transplantatabstoßung...................................................................... 8
1.4.3 Die Transplantatarteriosklerose als Hauptmanifestation der chronischen
Abstoßung ..................................................................................................................... 9
1.4.4 Induktion von Transplantat-Toleranz durch Alloantigen........................................10
1.5 Zielsetzung .................................................................................................................11
2. Materialien und Methoden .............................................................................................13
2.1 Material.......................................................................................................................13
2.1.1 Chemikalien.........................................................................................................13
2.1.2 Puffer und Lösungen............................................................................................13
2.1.2.1 Lösungen für die X-Gal-Färbung ...................................................................13
2.1.2.2 Erythrozyten-Lyse-Puffer...............................................................................14
2.1.2.3 Blockierungspuffer für die Durchflusszytometrie............................................14
2.1.2.4 ELISA-Lösungen und -Puffer ........................................................................14
2.1.3 Medien für die Zellkultur.......................................................................................14
2.1.4 Primer und Sonden für die qRT-PCR...................................................................15
2.1.5 Vektoren ..............................................................................................................15
2.1.6 Antikörper ............................................................................................................16
2.1.7 Mäuse..................................................................................................................16
2.2 Methoden ...................................................................................................................17
2.2.1 Herstellung von Chitosan-DNA Nanopartikeln.....................................................17
2.2.1.1 Herstellung der Chitosan-Lösung ..................................................................17
2.2.1.2 Plasmide .......................................................................................................17
2.2.1.3 Partikelherstellung.........................................................................................18
2.2.2 Zellkulturexperimente mit der humanen embryonalen Nierenzellinie 293T...........18
2.2.2.1 Kultivierung und Splitten der 293T-Zellen.....................................................18
2.2.2.2 Transfektion von 293T-Zellen mit Chitosan-DNA Nanopartikeln....................18
2.2.2.3 Analyse der transfizierten Zellen im Durchflusszytometer .............................19
2.2.2.4 Analyse der transfizierten Zellen im Fluoreszenzmikroskop ..........................19
III
Inhaltsverzeichnis
2.2.3 Nachweis der Genexpression in vivo ...................................................................19
2.2.3.1 X-Gal Färbung ..............................................................................................19
2.2.3.2 Analyse der EGFP-Expression in den MLK und PP ......................................19
2.2.3.2.1 RNA-Isolation und c-DNA-Synthese.......................................................19
2.2.3.2.2 qRT-PCR ...............................................................................................20
2.2.4 Induktion von oraler Toleranz durch Chitosan-DNA Nanopartikel.........................21
2.2.4.1 Fütterung und Immunisierung .......................................................................21
2.2.4.2 Messung der OVA-spezifischen Delayed-Type-Hypersensitivity (DTH)Reaktion ...................................................................................................................21
2.2.4.3 Bestimmung der OVA-spezifischen Antikörper im Serum..............................21
2.2.4.4 Proliferationsassay........................................................................................22
2.2.4.5 Bestimmung der Zytokin-Konzentration im Zellkulturüberstand.....................23
2.2.4.6 Transferexperimente .....................................................................................23
2.2.4.6.1 Isolierung und Transfer von Milzzellen ...................................................23
2.2.4.6.2 Isolierung und Transfer von unterschiedlichen Milzzellpopulationen.......23
2.2.4.7 Analyse der Foxp3-Expression nach OVA-NP Applikation ............................24
2.2.4.7.1 RNA-Isolation und qRT-PCR..................................................................25
2.2.4.7.2 Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie....................................25
2.2.5 Behandlung der Transplantatabstoßung durch MHC kodierende Chitosan-DNA
Nanopartikel nach abdominaler Aortentransplantation..................................................26
2.2.5.1 Abdominale Aortentransplantation ................................................................26
2.2.5.2 Analyse der Intimaproliferation......................................................................26
2.2.5.2.1 Anfertigung und Färbung von histologischen Präparaten .......................26
2.2.5.2.2 Auswertung der histologischen Präparate ..............................................27
2.2.5.3 Analyse der gebildeten Alloantikörper im Serum ...........................................27
2.3 Statistik.......................................................................................................................28
3. Ergebnisse......................................................................................................................29
3.1 Transfektion in vitro ....................................................................................................29
3.2 Transfektion in vivo.....................................................................................................31
3.2.1 ß-Galaktosidase (ß-Gal) Expression im Dünndarm nach oraler Applikation von ßGal kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln (ß-Gal-NP)...........................................31
3.2.2 Kinetik der EGFP-Expression in Payer’schen Plaques (PP) und mesenterialen
Lymphknoten (MLK) nach oraler Applikation von EGFP- kodierenden Nanopartikeln
(EGFP-NP) ...................................................................................................................32
3.3 Immunmodulation durch orale Applikation von Chitosan-DNA Nanopartikeln .............34
3.3.1 Ovalbumin kodierende Chitsoan-DNA Nanopartikel supprimieren die OVAspezifische DTH-Antwort ..............................................................................................34
IV
Inhaltsverzeichnis
3.3.2 OVA-NP reduzieren die OVA-spezifische Antikörperbildung ................................36
3.3.3 OVA-NP unterdrücken die OVA-spezifische Milzzellenproliferation......................38
3.3.4 OVA-NP führen zu einer Verschiebung der Th1- in Richtung Th2/Th3-Antwort....39
3.3.5 Die durch OVA-NP induzierte Toleranz ist transferierbar .....................................42
3.3.6 Die durch OVA-NP induzierte Toleranz wird von CD4+CD25+T-Zellen vermittelt..43
3.3.7 OVA-NP führen zu einer verstärkten Foxp3 Expression......................................48
3.4 Toleranzinduktion mit OVA-NP in CCR7-/- Mäusen ....................................................50
3.4.1 Orale Applikation von OVA-NP führt in CCR7-/- Mäusen zu keiner Suppression
der humoralen und nur zu einer partiellen Reduktion der zellulären Immunantwort .....50
Abb. 20. OVA-NP supprimieren die humorale Immunantwort in CCR7-/- Mäusen
nicht. .....................................................................................................................52
3.4.2 In Wildtyp-Mäusen induzierte Toleranz kann auf CCR7-/- Mäuse übertragen
werden..........................................................................................................................53
3.5 Modulation der Transplantatabstoßung durch orale Applikation von MHC kodierenden
Chitosan-DNA Nanopartikeln in einem Maus-Aorten-Transplantationsmodell...................55
3.5.1 Kb kodierende Chitosan-DNA Nanopartikel reduzieren die TransplantatArteriosklerose..............................................................................................................55
3.5.2 Kb-NP supprimieren die Alloantikörperbildung .....................................................59
4. Diskussion ......................................................................................................................62
4.1. Chitosan-DNA Nanopartikel als orale Gencarrier .......................................................63
4.2. Orale Toleranzinduktion mittels Chitosan-DNA Nanopartikeln ...................................66
4.3 Reduktion der Transplantabstoßung durch MHC kodierende Chitosan-DNA
Nanopartikel .....................................................................................................................69
4.4 Ausblick ......................................................................................................................71
5. Zusammenfassung.........................................................................................................72
6. Summary.........................................................................................................................74
7. Anhang............................................................................................................................76
7.1 Literaturverzeichnis.....................................................................................................76
7.2 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................88
7.3 Abkürzungsverzeichnis ...............................................................................................89
V
Einleitung
1. Einleitung
1.1 Selbsttoleranz
Eine der Hauptaufgaben des humanen Immunsystems ist es den Körper vor
Krankheitserregern zu schützen. Neben dieser schützenden Immunantwort stellen
jedoch auch Mechanismen, die den Körper vor überschießenden oder fehlerhaften
Immunreaktionen gegenüber körpereigenen Strukturen schützen, eine zentrale
Funktion
des
Immunsystems
dar
[1].
Eine
Fehlfunktion
dieser
Regulationsmechanismen kann zu Allergien oder Autoimmunerkrankungen führen
[2].
Die Toleranz des Immunsystems gegenüber körpereigenen Antigenen wird als
Selbsttoleranz bezeichnet [3]. Neben der negativen Selektion im Thymus durch die
der größte Teil autoreaktiver T-Zellen eliminiert wird (zentrale Toleranz) [4, 5] stellt
die periphere Toleranz einen entscheidenden Mechanismus der Selbsttoleranz dar.
Hierbei führt der Kontakt von T-Zellen in der Peripherie mit hohen Mengen ihres
Antigens oder ohne kostimulierende Signale zur Anergie oder Deletion der T-Zellen
[6, 7]. Anerge T-Zellen können von ihrem Antigen nicht mehr aktiviert werden [8].
Deletion mündet in einer Fas-vermittelten Apoptose der T-Zellen [9]. Neben Anergie
und Deletion autoreaktiver T-Zellen spielt auch die Bildung regulatorischer T-Zellen
für die Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz eine wichtige Rolle [10]. Regulatorische
T-Zellen können die Aktivität von autoreaktiven T-Zellen unterdrücken [11]. Darüber
hinaus sind sie in der Lage auch die humorale Immunantwort zu regulieren [12].
1.2 Orale Toleranz
1.2.1 Das Darmimmunsystem
Das Immunsystem des Darms ist das Größte und das Komplexeste im menschlichen
Körper. Das Darm assoziierte lymphatische Gewebe (GALT: gut associated lymphoid
tissue) besteht aus einer Vielzahl von Immunzellen, die über das Epithelium und die
Lamina Propria der Darmmukosa verteilt sind, aber auch aus organisierten
immunologischen Kompartimenten wie den Payer’schen Plaques (PP) und den
mesenterischen Lymphknoten (MLK) [13].
1
Einleitung
Das Darmimmunsystem steht vor der Herausforderung einerseits auf aufgenommene
Pathogene mit einer schützenden Immunantwort zu reagieren, aber andererseits die
natürliche Bakterienflora und harmlose Nahrungsmittelantigene zu tolerieren.
Dementsprechend gibt es 3 Hauptstrategien mit denen das Immunsystems des
Darms auf oral administrierte Antigene reagieren kann: eine lokale IgA Sekretion,
eine protektive Immunantwort und die Induktion immunologischer Toleranz [14]. Da
harmlose
Nahrungsmittelproteine
und
die
natürliche
Bakterienflora
die
Hauptantigenlast des Darms darstellen, reagiert das Darmimmunsystem auf oral
aufgenommene Antigene für gewöhnlich mit einer systemischen Unempfindlichkeit
(Toleranz). Die spezifische Suppression der zellulären und/oder humoralen
Immunantwort gegenüber einem Antigen durch vorherige Aufnahme des Antigens
über die orale Route wird als orale Toleranz bezeichnet. Hierbei stellt der Darm eine
natürliche anti-inflammatorische Umgebung dar, in der Antigene in einer tolerogenen
Weise präsentiert werden. Bakterien und Nahrungsmittelantigene stellen aufgrund
ihres kontinuierlichen Kontakts zur Darmmukosa eine Grenze zwischen fremden und
körpereigenen Antigenen dar. Somit kann die orale Toleranz auch als eine Form der
peripheren Toleranz betrachtet werden [14]. Orale Toleranz kann insbesondere für
lösliche Antigene induziert werden [15, 16]. Dabei ist die Toleranzinduktion am
effektivsten, wenn das Antigen allein und nicht zusammen mit anderen Antigenen in
einem Antigengemisch appliziert wird [17].
In zahlreichen Studien konnte im Tiermodell das Phänomen der oralen Toleranz für
die Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, rheumatische
Arthritis, Typ-1 Diabetes und Myasthenia gravis sowie in Transplantationsabstoßungsmodellen erfolgreich genutzt werden [18-24]. Weitere klinische Studien
haben gezeigt dass auch im humanen System orale Toleranz induziert werden kann
[25]. Allerdings sind Anzahl und Umfang der humanen Studien bislang sehr gering.
So führte die Behandlung von rheumatischer Arthritis mit Collagen zu einem
signifikanten Ansprechen [26, 27]. Auch im Bereich Nahrungsmittelallergien konnten
Erfolge erzielt werden [28, 29]. In anderen Studien führte die orale Applikation des
Antigens (Insulin, Myelin) für die Behandlung von Diabetes oder Multiple Sklerose
bislang zu keinem signifikanten Effekt [30, 31].
2
Einleitung
1.2.2 Mechanismen der oralen Toleranz
Die Mechanismen der oralen Toleranz sind sehr komplex und noch nicht vollständig
aufgeklärt. Bislang ist sich die Literatur jedoch einig, dass es sich um einen T-Zell
abhängigen Prozess handelt [14]. Es existieren 2 Hauptmechanismen über die orale
Toleranz vermittelt werden kann, erstens über klonale Anergie oder Deletion von
Antigen-spezifischen T-Zellen und zweitens über die Induktion von regulatorischen TZellen. Welcher dieser Mechanismen abläuft hängt hauptsächlich von der Dosis des
Antigens ab [32], allerdings schließen sich die beiden Formen der Toleranzinduktion
nicht aus sondern greifen häufig ineinander [14]. Eine hohe Antigendosis
(Hochdosistoleranz) führt aufgrund einer hohen Menge präsentierten Antigens ohne
kostimulierende Signale zur Anergie oder einer in Apoptose resultierenden Deletion
von Antigen-spezifischen T-Zellen im Darm, gefolgt von einer systemischen
Antigenpräsentation nachdem das Antigen den Darm passiert hat [33-36]. Eine
niedrige Antigendosis (Niedrigdosistoleranz) führt dagegen eher zur Bildung von
Antigen-spezifischen regulatorischen T-Zellen [37]. Darm assozierte antigenpräsentierende Zellen (APC), vermutlich spezialisierte dendritische Zellen (DC) aus
der Lamina Propria, nehmen das Antigen auf, transportieren es zu den
mesenterischen Lymphknoten (MLK) und präsentieren es naiven T-Zellen [38].
Diese
Präsentation
resultiert
in
der
Induktion
von
Antigen-spezifischen
regulatorischen T-Zellen. Die induzierten T-Zellen wirken systemisch, indem sie zu
weiteren Lymphorganen migrieren und dort die Bildung von Antigen-spezifischen
Effektor-T-Zellen inhibieren.
Auf der Suche nach dem Phänotyp der regulatorischen T-Zellen konnte in frühen
Studien die Bildung von TGF-beta produzierenden regulatorischen CD8+T-Zellen
nach Fütterung von Myelin basischen Protein (MBP) in einem Rattenmodell der
experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) demonstriert werden [39]. In
weiteren Studien wurde ebenfalls die Induktion von regulatorischen CD8+T-Zellen
nach oraler Antigen Administration nachgewiesen [40-42]. Allerdings konnte durch
die Depletion von CD8+-Zellen die Induktion oraler Toleranz im Tiermodell nicht
verhindert werden [43-45]. Dies deutet daraufhin, dass regulatorische CD8+T-Zellen
zwar in einzelne Prozesse der oralen Toleranz involviert sein können, nicht aber
unerlässlich dafür sind. Bei der Untersuchung regulatorischer NKT-Zellen und ihrem
Einfluss auf die Induktion oraler Toleranz wurden widersprüchliche Beobachtungen
gemacht. Nachdem in einigen Modellen ihre Beteiligung an den regulatorischen
3
Einleitung
Prozessen der oralen Toleranz aufgezeigt wurde [46, 47], demonstrierte Ishimitsu et
al., dass in NKT-Zell defizienten Mäusen orale Toleranz normal induziert werden
konnte [48]. Im Gegensatz zu den NKT-Zellen erscheint die Rolle der γδ-T-Zellen
klarer [49, 50]. So verhindert ihre Depletion im Mausmodell die erfolgreiche
Toleranzinduktion gegenüber Ovalbumin (OVA) [50]. Hierbei scheinen intraepitheliale
γδ-T-Zellen in die Induktion von regulatorischen CD4+CD25+T-Zellen nach oraler
Antigen Administration involviert zu sein [51].
Die Population, die am deutlichsten mit der Induktion der oralen Toleranzinduktion in
Zusammenhang gebracht wird, sind regulatorische CD4+T-Zellen. So wurde in
zahlreichen Depletions- und Transferexperimenten nachgewiesen, dass CD4+TZellen unerlässlich für die Induktion bzw. den Transfer der oralen Toleranz sind [43,
44, 52]. Die in die orale Toleranz involvierten, regulatorischen CD4+T-Zellen lassen
sich in 3 Subgruppen einteilen: CD4+CD25+T-Zellen (Tregs), Th3-T-Zellen und Tr1-TZellen [53]. Die im Thymus gereiften CD4+CD25+T-Zellen (Tregs) sind in der Lage
über
Zell-Zell-Kontakt
oder
anti-inflammatorische
Zytokine
die
Aktivierung,
Proliferation und Effektorfunktion anderer Immunzellen zu supprimieren [11, 12]. Sie
exprimieren
den
Transkriptionsfaktor
forkhead-box-p3
(Foxp3),
der
für
die
Entwicklung und die Funktion der Tregs entscheidend ist, konstitutiv [54-56]. Eine
Mutation im Foxp3-Gen löst beim Menschen die Autoimmunkrankheit IPEX (immune
dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) aus [57]. Neben
den im Thymus gereiften Tregs können CD4+CD25+T-Zellen auch in der Peripherie
aus naiven CD4+T-Zellen induziert werden. Dieser Prozess wird durch TGF-beta, das
die Expression von Foxp3 induzieren kann, ausgelöst [58, 59]. Die so entstandenen
CD4+CD25+T-Zellen sind in der Lage, die Aktivierung anderer CD4+T-Zellen zu
unterdrücken. Eine weitere regulatorische Population sind die Th3-T-Zellen. Th3-TZellen werden aus naiven CD4+T-Zellen induziert und exprimieren hohe Mengen
TGF-beta, sowie geringe Mengen Interleukin-10 (IL-10) und Interleukin-4 (IL-4) [37,
60]. Ihre suppressive Aktivität vermitteln sie über diese Zytokine. Das von den Th3-TZellen sezernierte TGF-beta fördert wiederum die Differenzierung von naiven CD4+TZellen zu Foxp3+CD4+CD25+T-Zellen im Darm [61]. Retinolsäure, die von intestialen
dentritischen Zellen (DC) produziert wird, fördert ebenfalls die Umwandlung von
naiven T-Zellen in Foxp3+CD4+CD25+Tregs [62]. Tr1-T-Zellen supprimieren ähnlich
wie Th3-T-Zellen über die Bildung eines anti-inflammatorischen Zytokins [63]. Im Fall
der Tr1–T-Zellen handelt es sich dabei um Interleukin-10 (IL-10). Alle diese T-Zell4
Einleitung
Subpopulationen scheinen in die regulatorischen Prozesse der oralen Toleranz
involviert zu sein, allerdings ist noch weitgehend unklar, welche Rolle die einzelnen
Subgruppen bezügliche der Induktion und Aufrechterhaltung der lokalen und/oder
systemischen Toleranz übernehmen [53].
Die
hier
aufgeführten
regulatorischen
T-Zellen
teilen
sich
jedoch
eine
Gemeinsamkeit, sie werden zwar Antigen-spezifisch aktiviert, können jedoch
aufgrund ihres Wirkmechanismus über anti-inflammatorische Zytokine und/oder ZellZell-Kontakt auch die Immunantwort gegenüber einem anderen unabhängigen
Antigen, das zum gleichen Zeitpunkt und in räumlichem Zusammenhang dem
Immunsystem
präsentiert
wird,
supprimieren.
So
konnte
in
verschiedenen
Tiermodellen nachgewiesen werden, dass die orale Vorbehandlung mit einem
Antigen zur Suppression der Immunantwort gegen ein zweites unabhängiges Antigen
führte, wenn eine Mischung aus beiden Antigenen für die Immunisierung verwendet
wurde [64-66]. Dieses Phänomen wird als „Bystander-Suppression“ bezeichnet. Der
Vorteil hierbei liegt im Hinblick auf eine therapeutische Anwendung darin, dass bei
mehreren krankheitsinduzierenden Antigenen die Toleranzinduktion gegenüber nur
einem dieser Antigene ausreicht, um im Zielorgan auch eine Immunsuppression
gegenüber den restlichen Antigenen herbeizuführen. Dies ist sinnvoll, da häufig nicht
alle krankheitsinduzierenden Antigene bekannt sind. So gelang es durch die orale
Vorbehandlung mit Myelin basischem Protein (MBP) eine mit Proteolipidprotein
(PLP) induzierte experimentelle Enzephalomyelits (EAE) im Mausmodell zu
supprimieren [67].
1.3 Gentherapie mit Chitosan-DNA Nanopartikeln
Gentherapie bezeichnet das Einfügen von Genen in Zellen eines Individuums zu
therapeutischen Zwecken. Ziel dabei ist es defekte Gene in betroffenen Zellen
auszuschalten und/oder durch fehlerfreie zu ersetzen, um dadurch hereditäre oder
erworbene Gendefekte, Infektionskrankheiten oder Krebs zu behandeln. Um das
genetische Material in die Zielzellen einzubringen, benötigt man einen Gencarrier.
Diesbezüglich unterscheidet man zwischen viraler und nicht-viraler Gentherapie. Bei
der viralen Gentherapie werden Viren (z.B. Adeno-, Herpes- oder Retroviren) als
Gencarrier verwendet. Da das Einbringen von genetischem Material in Wirtszellen
ein Teil des natürlichen Lebenszyklus von Viren ist, kann mit dieser Methode eine
5
Einleitung
hohe Transfektionseffizienz erreicht werden. Allerdings birgt die Verwendung von
Viren als Gencarrier auch Gefahren wie durch das Virus ausgelöste Mutationen oder
Immunreaktionen des Körpers bis hin zu einem erhöhten Krebsrisiko. Aus diesem
Grund nimmt die nicht-virale Gentherapie, eine weitaus sicherere Variante,
wenngleich auch mit einer deutlich geringeren Transfektionseffizienz [68], eine
zunehmende Bedeutung im Bereich der Gentherapieforschung ein. Bei der nichtviralen Therapie wird das genetische Material neben physikalischen Verfahren vor
allem mit Hilfe chemischer Transportsysteme wie Liposomen, kationischen Lipiden
oder kationischen Polymeren in die Zielzelle eingebracht. Ein erfolgversprechendes
kationisches Polymer für die nicht-virale Gentherapie ist Chitosan [69]. Chitosan, die
deacetylierte Form von Chitin, ist ein langes positiv geladenes Polymer. Es ist nichttoxisch, biodegradierbar, gering immunogen und wird - aufgrund seiner Fähigkeit
Lipide zu binden - bereits als Diätetikum klinisch eingesetzt [70-72]. Chitosan kann
durch Koazervation seiner positiv geladenen Aminogruppen mit den negativ
geladenen Phosphatgruppen von DNA Nanopartikel bilden und in dieser Form als
Gencarrier eingesetzt werden. Als DNA Molekül wird dabei meist ein Plasmid als
Expressionsvektor verwendet. In in vitro Studien konnte die Aufnahme von ChitosanDNA Nanopartikel in unterschiedlichen Zelllinien und die daran anschließende
Expression
des
Zielgens
demonstriert
werden
[73].
Darüber
hinaus
sind
Nanopartikel, aufgrund ihrer Stabilität während der Magen-Passage und ihren
mukosal-adhäsiven Eigenschaften, auch für den in vivo Einsatz als orale Gencarrier
geeignet [74-77]. So führte die orale Applikation der Nanopartikel an Mäuse zur
Genexpression im Magen und Dünndarm. Überdies konnte die Plasmid-DNA nach
oraler Verabreichung der Nanopartikel auch systemisch in unterschiedlichen
Geweben nachgewiesen werden [78]. Die Fütterung von Gerinnungsfaktor VIII
kodierenden Nanopartikeln an Hämophilie A Mäuse resultierte in einem Anstieg der
Faktor VIII Konzentration im Plasma und einer deutlichen phänotypischen
Verbesserung [78, 79]. Eine weitere therapeutische Anwendung im Bereich der
Gensubstitution fanden Chitosan-DNA Nanopartikeln, die für das Gen des murinen
Erythropoietins
(mEPO)
kodierten.
Erythropoietin
fördert
die
Bildung
von
Erythrocyten und wird zur Anämie Behandlung bei Dialysepatienten oder nach
Chemotherapien eingesetzt. Nach der oralen Applikation von mEPO kodierenden
Nanopartikeln an Mäuse wurde ein signifikanter Anstieg der Hämatokrit-Werte im
Serum nachgewiesen [74]. Weiterhin führte die gastrointestinale Administration von
6
Einleitung
Insulin kodierenden Nanopartikeln in diabetischen Ratten zu einem Anstieg des
Plasma Insulins und signifikant verminderten Blutglucosespiegeln [80, 81]. Neben
den Anwendungsmöglichkeiten der Nanopartikel im Bereich der Gensubstitution
konnten auch Erfolge im Bereich der Immunmodulation mit Nanopartikeln sowohl
hinsichtlich Immunstimulation als auch Toleranzinduktion erzielt werden. So konnte
durch die intranasale Verabreichung von Pneumokokken-Oberflächenantigen A
kodierenden
Chitosan-DNA
Nanopartikeln
an
Balb/c-Mäuse
ein
Impfschutz
gegenüber der nasopharyngealen Kolonisierung mit Streptococcus pneumoniae
hergestellt werden [82]. In einer weiteren Studie konnte durch pulmonale
Verabreichung von Nanopartikeln, die für 8 verschiedene HLA-A*0201-restriktierte TZell-Epitope von Mycobacterium tuberculosis kodierten, in HLA-A2 transgenen
Mäusen eine Immunisierung gegen die Bakterien induziert werden [83]. Im Bereich
der immunologischen Toleranzinduktion konnte Roy et. al durch orale Gabe von
Chitosan-DNA Nanopartikeln, die für das dominante Erdnuss-Allergen Arah2
kodierten, die Produktion von sekretorischem IgA und Serum IgG2 steigern, die
Bildung von IgE unterdrücken und somit das Risiko eines anaphylaktischen Schocks
der Mäuse reduzieren [77]. Auf ähnliche Weise führte die Behandlung von Mäusen
mit für das Hausstaubmilben-Allergen Der p 2 kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln zu einer verstärkten IFN-γ Bildung im Serum, wodurch die für eine
allergische Reaktion entscheidende IgE-Antwort unterdrückt werden konnte [74, 84].
Aufgrund dieser erfolgreichen Anwendungen der Nanopartikel im Bereich der
Immunmodulation war es das Ziel dieser Arbeit die orale Gentherapie für eine
Toleranzinduktion gegenüber bekannten Antigenen zu nutzen, um dadurch
Autoimmunerkrankungen oder Transplantatabstoßung behandeln zu können.
1.4 Transplantatabstoßung
1.4.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) und die allogene
Immunantwort
Eines der Hauptprobleme bei der allogenen Transplantation ist eine starke
Immunantwort
Ursächlich
des
dafür
Empfängers
sind
gegenüber
hauptsächlich
dem
fremden
Unterschiede
Spendergewebe.
im
Haupthisto-
kompatibiltätskomplex (MHC) von Spender und Empfänger. Der MHC bezeichnet
7
Einleitung
eine Gruppe von Genen, die beim Menschen auf dem kurzen Arm des Chromosoms
6 lokalisiert sind [3]. Als Genprodukt entstehen Proteinkomplexe auf der
Zelloberfläche, die für die Immunantwort eine entscheidende Rolle spielen. Diese
Proteinkomplexe binden Antigenfragmente und präsentieren sie spezifischen TZellen. Die Präsentation der Antigenfragmente in Kombination mit kostimulierenden
Signalen führt zur Aktivierung der für das Antigenfragment spezifischen T-Zellen.
Nach einer Transplantation wird das MHC des Spenders selbst als Fremd-Antigen
erkannt und eine starke Immunantwort ausgelöst. Die Alloantigenerkennung kann
hierbei direkt oder indirekt erfolgen [85, 86]. Bei der direkten Erkennung reagieren
die T-Zellen auf vollständige MHC-Moleküle, die auf der Zelloberfläche von
Spenderzellen oder -gewebe exprimiert werden. Da ca. 1-10% aller T-Zellen eines
Individuums alloreaktiv sind, d.h. auf fremde MHC-Moleküle direkt reagieren, erfolgt
dadurch eine heftige Immunreaktion in der frühen postoperativen Phase [3, 87]. Bei
der
indirekten
Erkennung
werden
allogene
MHC-Moleküle
von
antigenpräsentierenden Zellen (APC) des Empfängers aufgenommen und als
Antigenfragmente auf Empfänger-MHC-Molekülen präsentiert [88, 89]. Diese Form
der Abstoßung dominiert häufig in der späteren Phase der Abstoßung [87]. Sowohl
die indirekte als auch die direkte Präsentation können zur Abstoßung führen [86].
1.4.2 Formen der Transplantatabstoßung
Es werden drei Formen der Abstoßung unterschieden:
•
Die hyperaktute/perakute Abstoßung erfolgt innerhalb von Minuten bis
Stunden nach der Transplantation. Aufgrund von präformierten Alloantikörpern
die gegen Blutgruppenantigene oder den Haupthistokompatibiltätskomplex
(MHC) des Spenders gerichtet sind, kommt es zur Aktivierung der
Komplement- und Blutgerinnungskaskade, wodurch die Transplantatgefäße
koagolieren. Als Folge muss das Transplantat sofort explantiert werden [3].
Durch Antikörperscreenings und Kreuzproben von Spender und Empfänger
kann das Risiko einer hyperakuten Abstoßung heutzutage auf ein Minimum
reduziert werden [90].
•
Die akute Abstoßung tritt während der frühen postoperativen Phase, innerhalb
von Tagen bis Wochen nach der Transplantation auf und ist meist durch eine
Infiltration des Organs mit zytotoxischen T-Lymphozyten (CD8+T-Zellen)
gekennzeichnet. Neben CD8+T-Zellen tragen aber häufig auch CD4+T-Zellen
8
Einleitung
oder Makrophagen entscheidend zur akuten Abstoßung bei [91, 92]. Diese
Form der Abstoßung ist derzeit gut behandelbar.
•
Die chronische Abstoßung tritt meist erst im Langzeitverlauf innerhalb von
Monaten bis Jahren nach der Transplantation auf. Diese Form der Abstoßung
ist noch nicht kurativ therapierbar und stellt derzeit das größte Hindernis für
das erfolgreiche Langzeitüberleben in der soliden Organtransplantation dar [3,
87]. Eine der Hauptmanifestationen der chronischen Abstoßung ist die
Transplantatarteriosklerose, worauf im nächsten Abschnitt näher eingegangen
wird.
1.4.3 Die Transplantatarteriosklerose als Hauptmanifestation der chronischen
Abstoßung
Eine Arterie ist aus 3 Hauptschichten, der Intima, Media und Adventitia aufgebaut,
wobei die Intima die ans Lumen angrenzende Schicht darstellt. Die Intima,
bestehend aus einem Monolayer aus Endothelzellen, befindet sich auf einer dünnen
Schicht
extrazellulärerer
Matrix
und
glatten
Muskelzellen.
Die
Transplantatarteriosklerose ist durch eine Verkleinerung des arteriellen Lumens
aufgrund einer Verdickung der Intima charakterisiert. Diese Verdickung resultiert aus
der Migration oder Proliferation von glatten Muskelzellen aus der Media oder der
extrazellulären Matrix in die Intima (Intimaproliferation). Gleichzeitig sind in der
verdickten Intima zahlreiche Effektorleukozyten zu finden [87]. Die zunehmende
Gefäßverengung führt zu einer chronischen Transplantatischämie, was in einer
Funktionseinschränkung
des
Transplantats
bis
hin
zum
vollkommenen
Funktionsverlust resultiert.
Zahlreiche Faktoren tragen zur Pathogenese der Transplantatarteriosklerose bei. Die
genaue Abfolge der einzelnen Prozesse ist jedoch noch unklar. Die meisten Modelle
gehen davon aus, dass vor Beginn der chronischen Abstoßung eine Schädigung des
vaskulären Endothels steht, was zu einer chronischen Entzündung in den Gefäßen
führt [93, 94]. Neben nicht-immunologischen Faktoren wie beispielsweise der
Freisetzung
unterschiedlicher
Entzündungsmediatoren
beim
Gehirntod
des
Spenders, der kalten Ischämie/Reperfusion sowie operationsbedingten Verletzungen
des Endothels, spielen vor allem immunologische Faktoren für die Pathogenese der
Transplantatarteriosklerose
eine
entscheidende
Rolle
[95-97].
Drei
wichtige
immunologische Effektormechanismen sind in die chronische Abstoßung involviert:
9
Einleitung
alloreaktive CD4+T-Zellen, CD8+T-Zellen und Alloantikörper [87]. CD4+T-Zellen
vermitteln Signale, die die Aktivierung und Differenzierung von zytotoxischen CD8+TLymphozyten und Alloantikörper produzierenden B-Zellen unterstützen. Daneben
fördern
sie
Makrophagen,
die
Aktivierung
die
Sauerstoffmetabolite
das
und
von
Antigen
Gewebe
Enzyme
unabhängigen
durch
zerstören.
die
Effektorzellen
Sezernierung
CD8+T-Zellen
wie
reaktiver
schädigen
das
Transplantat in erster Linie durch die direkte Zytolyse von parachymalen und
vaskulären Zellen. Alloantikörper können zur Transplantatabstoßung beitragen,
indem sie fremde MHC-Moleküle auf den Endothelzellen des Transplantats erkennen
und das Komplementsystem aktivieren.
1.4.4 Induktion von Transplantat-Toleranz durch Alloantigen
Die chronische Abstoßung stellt derzeit eines der Hauptprobleme in der soliden
Organtransplantation dar. Die erforderliche lebenslange Immunsuppression ist mit
schwerwiegenden Nebenwirkungen wie einer verstärkten Infektneigung und einem
erhöhten Krebsrisiko verbunden [98-100]. Deshalb stellen neue Therapieansätze zur
Induktion von immunologischer Toleranz gegenüber dem Transplantat eines der
Hauptziele in der Transplantationsimmunologie dar. In zahlreichen Studien wurde
gezeigt, dass die Applikation von Alloantigen unter immunologisch günstigen
Bedingungen einen erfolgversprechenden Ansatz für die Induktion von TransplantatToleranz
darstellt
[101].
Immunologisch
günstige
Bedingungen
beinhalteten
beispielsweise eine Kombination aus Alloantigen mit therapeutischen Agenzien, die
in der Lage sind die Effektorfunktion von T-Zellen zu modulieren [102, 103]. Aber
auch die orale Behandlung mit Alloantigen allein führte im Tiermodell zu einer
Reduktion der Abstoßung [104]. Neben dem Einsatz von Spenderzellen oder MHCPeptiden in der Mehrzahl der Studien, erwies sich auch die Verwendung MHC
kodierender DNA als erfolgreich [105, 106].
Eine wichtige Entdeckung im Hinblick auf die klinische Anwendung von Alloantigen
war, dass die Vorbehandlung mit nur einem MHC-Alloantigen ausreicht, damit ein
komplett allogenes Transplantat akzeptiert werden kann [107]. Ursächlich dafür sind
Alloantigen-spezifische regulatorische oder anerge T-Zellen, die während der
Alloantigen Vorbehandlung induziert werden. Diese regulatorischen T-Zellen können
auf andere T-Effektorzellen, die reaktiv gegenüber den restlichen MHC-Antigenen
10
Einleitung
der gleichen Zelle oder Gewebes sind, Einfluss nehmen, indem sie ihre Aktivierung
über Zell-Zell-Kontakt oder anti-inflammatorische Zytokine unterdrücken (Abb. 1).
Dieser Prozess wird als „linked unresponsiveness“ bezeichnet.
Toleranzinduziertes
MHC-Antigen
spezifische
Treg
Zell-Zell
Kontakt
Zytokine
allogene
Zelle
naive
alloreaktive
T-Zelle
andere
Alloantigene
Abb. 1. Schematische Darstellung der „linked unresponsiveness“-Hypothese.
Verändert aus: Wong. et al., Transplantation 63(10):1490-4, 1997 May 27 [107].
1.5 Zielsetzung
Die orale Aufnahme eines Antigens führt zu einer systemischen Unempfindlichkeit
des Immunsystems gegenüber dem Antigen (orale Toleranz). Das darin enthaltene
therapeutische Potential kann dazu genutzt werden Autoimmunerkrankungen,
Allergien oder Transplantatabstoßung zu behandeln. Jedoch unterliegt die
Behandlung mit Protein-Antigen, aufgrund der Magen-Darm-Passage, einigen
Limitationen. Eine viel versprechende Alternative stellt die orale Gentherapie mit
Chitosan-DNA Nanopartikeln dar. Hierbei kann jede beliebige, für ein Antigen
kodierende Nukleotidsequenz in ein Plasmid eingefügt werden. Die anschließende
orale Applikation der Nanopartikel, die während der Magen-Darm-Passage stabil
bleiben, führt zu einer direkten Antigenexpression im Darm. Als zusätzlicher positiver
Nebeneffekt entfällt die aufwendige und teure Aufreinigung des Proteins bzw.
Antigens. Aufgrund dieser potentiellen Vorteile der Nanopartikel war es das Ziel
dieser Arbeit eine neue Form der oralen Toleranzinduktion über orale Gentherapie
11
Einleitung
mit Chitosan-DNA Nanopartikeln zu etablieren und den zugrundeliegenden
Mechanismus zu untersuchen. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Immunmodulation
mit
Alloantigen
kodierenden
Nanopartikeln
in
einem
murinen
Aortentransplantationsmodell analysiert werden, um dadurch das therapeutische
Potential
von
Chitosan-DNA
Nanopartikeln
Transplantatabstoßung zu überprüfen.
12
für
die
Behandlung
von
Materialien und Methoden
2. Materialien und Methoden
2.1 Material
Zur Herstellung von Verdünnungen und Lösungen wurde Wasser aus einer
Wasserdeionisierungsanlage (MilliQ-PureAqua, Millipore, Eschborn) oder LiChrosolv
(Wasser für die Chromatographie, Merck) verwendet.
2.1.1 Chemikalien
Die während der Arbeit verwendeten Chemikalien wurden von folgenden Firmen
bezogen: Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma Aldrich (Taufkirchen).
2.1.2 Puffer und Lösungen
2.1.2.1 Lösungen für die X-Gal-Färbung
Phosphatpuffer 0,1M (pH 7,3)
115ml NaH2PO4
385ml Na2HPO4
Fixierungslösung
0,4ml 25% Glutaraledhyd
2,5ml 100mM EGTA pH 7,3
0,1ml 1M MgCl2
42ml 0,1M Phosphatpuffer pH 7,3
Waschpuffer
0,4ml 1M MgCl2
2ml NP-40 (Igepal)
197,6ml 0,1M Phosphatpuffer pH 7,3
Färbelösung
2ml 50mg/ml X-Gal (Sigma Aldrich)
0,106g Kaliumhexacyanidoferrat(II) (Sigma Aldrich)
0,082g Kaliumhexacyanidoferrat(III) (Sigma Aldrich)
48ml Waschpuffer
13
Materialien und Methoden
2.1.2.2 Erythrozyten-Lyse-Puffer
8,3g NH4Cl
1,0g KHCO3
1,8ml of 5% EDTA
ad. 1000ml H2Odest.
2.1.2.3 Blockierungspuffer für die Durchflusszytometrie
10% FCS
2% Mäuseserum (Invitrogen, Darmstadt)
in GIBCO Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) (Invitrogen)
2.1.2.4 ELISA-Lösungen und -Puffer
Beschichtungslösung
100µg/ml Ovalbumin in PBS
Wachpuffer
0,05% Tween20 in PBS
Blockierungspuffer
3% BSA (Sigma Aldrich) in PBS
Verdünnungspuffer
1% BSA in PBS
Substratlösung
1mg/ml Para-Nitrophenylphosphat (Sigma
Aldrich) in 1 M Diethanolaminpuffer
2.1.3 Medien für die Zellkultur
R10+-Medium
GIBCO RPMI-Medium 1640
hinzugefügt: 10% FCS
5ml Penicillin/Streptomycin (10000U/ml Penicillin;
10000µg/ml Streptomycin)
5ml Non essential amino acid solution (100x)
5ml L-Glutamin (200mM)
5ml Na-Pyruvat (100mM)
DMEM+-Medium
GIBCO Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x)
hinzugefügt: 10% FCS
2ml Penicillin/Streptomycin (10000U/ml Penicillin;
10000µg/ml Streptomycin)
5ml L-Glutamin (200mM)
14
Materialien und Methoden
Alle Medien und Zusätze für die Zellkultur wurden von Invitrogen (Darmstadt)
bezogen.
2.1.4 Primer und Sonden für die qRT-PCR
mGAPDH-for
5’- TTC ACC ACC ATG GAG AAG GC -3’
mGAPDH-rev
5’- GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA -3’
mGAPDH-Sonde
5’- TGC ATC CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG -3’
mFoxp3-for
5’- CCC AGG AAA GAC AGC AAC CTT -3’
mFoxp3-rev
5’- TTC TCA CAA CCA GGC CAC TTG -3’
mFoxp3-Sonde
5’- CTA CCC ACT GCT GGC AAA TGG AGT C -3’
m18SrRNA-for
5’- CGC CGC TAG AGG TGA AAT TC -3’
m18SrRNA-rev
5’- CGA ACC TCC GAC TTT CGT TCT -3’
m18SrRNA-Sonde
5’- CCG GCG CAA GAC GGA CCA GA -3’
EGFP-for
5’- CGA CGG CAA CTA CAA GAC -3’
EGFP-rev
5’- TAG TTG TAC TCC AGC TTG TGC -3’
EGFP-Sonde
5’- ACT TCA AGG AGG ACG GCA ACA TCC T -3’
Alle Primer und Sonden wurden bei Eurofins MWG GmbH (Ebersberg) synthetisiert.
2.1.5 Vektoren
OVA/pcDNA3
EGFP/pcDNA3.1
•
Insert: OVA kodierende Region (1139bp)
•
zur Verfügung gestellt von Dr. Vabulas [108]
•
Vektor: pcDNA3.1 (Invitrogen, Darmstadt)
•
Insert: EGFP kodierende Region (764bp),
Restriktionsenzyme: BamHI, EcoRI
pSVKb
•
kloniert von Martina Pöhner
•
Vektor: pSVK3 (Amersham)
•
Insert: mH2-Kb kodierende Region (1580bp),
Restriktionsenzym: EcoRI
•
pCMVß
Zu Verfügung gestellt von PD Dr. Bernd Spriewald
kommerziell erworben (Invitrogen, Darmstadt)
15
Materialien und Methoden
2.1.6 Antikörper
•
Antikörper für die Durchflusszytometrie:
Spezifität
Maus-CD4
Maus-CD3e
Maus-CD3e
Maus-CD25
Maus-Foxp3
•
Klon
RM4-5
eBio500A2
17A2
nicht angegeben
Konjugation
PerCP-Cy5.5
Pacific Blue
FITC
PE
Hersteller
eBioscience, Frankfurt
eBioscience, Frankfurt
BD, Heidelberg
Miltenyi, Bergisch Gladbach
FJK-16s
FITC
eBioscience, Frankfurt
Antikörper zum Nachweis von Alloantikörpern mittels Durchflusszytometrie:
Anti-Mouse IgG (Fc-specific) F(ab’)2 fragment-FITC (Sigma Aldrich,
Taufkirchen)
•
Antikörper zum Blockieren der Fc-Rezeptoren:
Anti-Maus CD16/CD32; Herkunft: Ratte (BD, Heidelberg)
•
ELISA-Antikörper:
Anti-Mouse IgG (Fc-specific)-Alkaline Phosphatase (Sigma Aldrich,
Taufkirchen)
2.1.7 Mäuse
Balb/c, C57BL/6 und CBA.J Mäuse wurden von Charles River (Sulzbach) oder
Janvier (St. Berthevin Cedex, Frankreich) bezogen und im Alter von 6-12 Wochen für
die Versuche eingesetzt. CCR7-/- Mäuse wurden von Prof. Reinhold Förster (MHHannover)
zur
Verfügung
gestellt.
Die
Mäuse
wurden
unter
speziellen
pathogenfreien Bedingungen und gemäß institutionellen und staatlichen Richtlinien
gehalten und behandelt.
16
Materialien und Methoden
2.2 Methoden
2.2.1 Herstellung von Chitosan-DNA Nanopartikeln
2.2.1.1 Herstellung der Chitosan-Lösung
Vom Hersteller bezogenes Chitosan (MMW, Sigma Aldrich, Taufkirchen) wurde
zunächst aufgereinigt. Dazu wurde es aus einer 0,5%-igen Chitosan-Lösung in 1%iger Essigsäure mit Ammoniak repräzipitiert. Das Fällungsprodukt wurde 2-mal mit
H2Odest. gewaschen, bei -20°C über Nacht eingefroren und ans chließend im Vakuum
getrocknet. 37mg des aufgereinigten Chitosans wurden in 200ml Essigsäure (25mM)
gelöst, wodurch sich eine N/P-Ratio, die sich aus den Phosphatgruppen der DNA (P)
und den freien Aminogruppen des Chitosans (N) errechnet, von 3 ergab.
Anschließend wurde mit Natronlauge (2M) der pH-Wert auf 5,5 eingestellt und die
Lösung sterilfiltriert (Minisart Sterilfilter, Sartorius Stedim Biotech, Göttingen). Die
Lösung wurde bei 4°C maximal für 4 Wochen aufbewahr t.
2.2.1.2 Plasmide
Die Vektoren EGFP/pcDNA3.1, pSVKb, pCMVß und OVA/pcDNA3 wurden für die
Herstellung der unterschiedlichen Chitosan-DNA Nanopartikel verwendet. Die
Plasmide wurden in Form von Glycerolstocks in TOP10F’E.coli (Invitrogen,
Darmstadt) bei -80°C aufbewahrt. Zur Vermehrung der Plasmide
wurden 50ml
Falcon-Röhrchen mit 5ml LB-Medium (Sigma Aldrich, Taufkirchen) und 250µg
Ampicillin (Merck, Darmstadt) als Vorkultur mit den entsprechenden Glycerolstocks
angeimpft und bei 37°C unter Schütteln für ca. 6-8h inkubiert. Daraufhin wurden die
Vorkulturen in einen mit 250ml LB-Medium befüllten 1l Erlenmeyerkolben gegeben
und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Das LB-Medium enthielt 50µg/ml Ampicillin. Am
nächsten Tag erfolgte die Aufreinigung der Plasmide aus der gewachsenen
Bakteriensuspension mit dem Qiagen-Plasmid-Maxi-Kit (Qiagen, Hilden). Die
Plasmide wurden in 500ml H2OHPLC gelöst und die DNA-Konzentration photometrisch
(Bio Photometer, Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Anschließend wurde die DNAKonzentration auf 1000µg/ml eingestellt und die Plasmid-Lösung bei -20°C oder 4°C
aufbewahrt.
17
Materialien und Methoden
2.2.1.3 Partikelherstellung
Die Nanopartikelherstellung erfolgte durch komplexe Koazervation [77]. Die
Plasmidlösung wurde auf eine Konzentration von 200µg/ml eingestellt und 1:1 mit
einer 90mM NaSO4-Lösung gemischt. Anschließend wurde die Lösung auf 55°C
erwärmt. Die zuvor hergestellte Chitosan-Lösung wurde getrennt davon ebenfalls auf
55°C erhitzt. Die beiden erwärmten Lösungen wurden daraufhin im Verhältnis 1:1
zusammengefügt und sofort für 30s kräftig gevortext. Die Partikel wurden bei RT für
maximal 12h aufbewahrt.
2.2.2 Zellkulturexperimente mit der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293T
2.2.2.1 Kultivierung und Splitten der 293T-Zellen
293T-Zellen wurden in 20ml Gewebekulturflaschen (Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen) in 8ml DMEM10+-Medium bei 37°C unter 5%-iger CO 2-Atmosphäre
in einem Begasungsbrutschrank kultiviert. Bei konfluentem Wachstum der Zellen
wurde die Kultur gesplittet. Dazu wurde das alte Medium abgenommen und die
Zellen mit 5ml PBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, Invitrogen) gewaschen.
Nach Zugabe von weiteren 5ml PBS und 2-minütiger Inkubation lösten sich die
Zellen von der Kulturflasche. 2x105 Zellen wurden entnommen und für die Beimpfung
einer neuen Kulturflasche verwendet.
2.2.2.2 Transfektion von 293T-Zellen mit Chitosan-DNA Nanopartikeln
Zum
Erhalt
einer
genügend
hohen
Zellausbeute
wurden
125ml
Gewebekulturenflaschen (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) mit 20ml
DMEM10+-Medium mit 6x105 Zellen beimpft und im Begasungsbrutschrank bei 37°C
inkubiert. Nach ca. 72h wurden die Zellen in frischem DMEM10+-Medium in eine 12Well Zellkulturplatte (Costar Corning GmbH, Wiesbaden) (7,5x104 Zellen/Well)
ausgesät. 24h später wurde das Medium gewechselt und jeweils 300µl einer zuvor
hergestellten und sterilfiltrierten Chitosan-DNA Nanopartikel Lösung (enthaltend:
16µg EGFP/pcDNA3.1 Plasmid-DNA) (EGFP-NP) vorsichtig in die einzelnen Wells
getropft.
Als
Negativkontrolle
wurden
80µl
EGFP-Plasmidlösung
(≅
16µg
EGFP/pcDNA3.1 Plasmid-DNA) anstelle der 300µl EGFP-NP zu den Zellen getropft.
Als Positiv-Kontrolle wurden 92µl serumfreies Medium mit 3µl EGFP-Plasmidlösung
18
Materialien und Methoden
und 3µl Fugene-Transfektionsreagenz (Roche, Mannheim) für 10min bei RT inkubiert
und anschließend die Zellen damit transfiziert.
2.2.2.3 Analyse der transfizierten Zellen im Durchflusszytometer
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion wurden die 293T-Zellen von der
12-Well Zellkulturplatte in FACS-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) überführt und mit
PBS gewaschen. Anschließend wurde im Durchflusszytometer (FACSCantoTM II, BD,
Heidelberg) der Anteil an transfizierten Zellen bestimmt. Dazu wurde die EGFPExpression der Zellen im FITC-Kanal analysiert.
2.2.2.4 Analyse der transfizierten Zellen im Fluoreszenzmikroskop
48h nach der Transfektion wurden die Zellkulturplatten bei 200-facher Vergrößerung
unter dem Fluoreszenzmikroskop (Observer. A1 Axio, Zeiss, Jena) analysiert und
anschließend mit der Power Shot A650 IS (Canon, Krefeld) fotografiert.
2.2.3 Nachweis der Genexpression in vivo
2.2.3.1 X-Gal Färbung
CBA.J-Mäuse wurden mit ß-Galaktosidase kodierende Chitosan-DNA Nanopartikeln
(enthaltend: 50µg pCMVß-Plasmid-DNA) mit einer Schlundsonde gefüttert. 24h
später wurde der Dünndarm der Mäuse entnommen, gründlich mit PBS durchspült
und für 30min in eine Fixierlösung eingelegt. Daraufhin wurde die Darmstücke 3-mal
für jeweils 5min in Waschpuffer gewaschen, in eine X-Gal-Färbelösung überführt und
für 24h bei RT gelagert. Anschließend wurde die entstandene Blaufärbung mit einer
Digitalkamera (Samsung L73) dokumentiert. Als Negativkontrolle wurden Mäuse mit
PBS oder mit 50µg pCMVß-Plasmid-DNA anstelle der Nanopartikel gefüttert.
2.2.3.2 Analyse der EGFP-Expression in den MLK und PP
2.2.3.2.1 RNA-Isolation und c-DNA-Synthese
CBA.J-Mäuse
wurden
mit
EGFP
kodierenden
Chitosan-DNA
Nanopartikeln
(enthaltend: 50µg Plasmid-DNA) mit einer Schlundsonde gefüttert. Als Kontrolle
19
Materialien und Methoden
wurde eine weitere Gruppe mit 50µg EGFP-Plasmid gefüttert. Zu verschiedenen
Zeitpunkten (t = 0h, 3h, 6h, 12h, 24h und 48h) nach der oralen Behandlung wurden
die mesenterischen Lymphkonten (MLK) und die Payer’schen Plaques (PP) der
Mäuse steril entnommen und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C aufbewahrt.
Für die RNA-Isolation wurden die MLK und PP zunächst im Lysepuffer des QiagenRNeasy-Mini-Kits (Qiagen, Hilden) manuell homogenisiert, woraufhin im Anschluss
entsprechend den Vorschriften des Herstellers die RNA gewonnen wurde. Die
Konzentration der RNA wurde daraufhin photometrisch bestimmt.
Für die cDNA-Synthese wurden jeweils 22µl RNA (90ng/µl) mit 4µl Oligo dT-Primern
(Roche, Mannheim) gemischt, 5min bei 60°C inkubiert und dann für 3min auf Eis
abgekühlt. Anschließend wurden 4µl dNTPS (10mM) (PAN Biotech GmbH,
Aidenbach), 8µl MLV-Puffer und 1µl M-MLV Reverse Transkriptase (Promega
GmbH, Mannheim) hinzugefügt. Daraufhin wurde die cDNA-Synthese bei 37°C für 2h
und anschließenden 10min bei 70°C gestartet.
2.2.3.2.2 qRT-PCR
Zur
Bestimmung
der
EGFP-mRNA-Expression
in
den
Proben
wurde
die
synthetisierte cDNA in den folgenden qRT-PCR-Ansatz eingesetzt:
qRT-PCR (1 x)
cDNA
1µl
Taqman-Gene-Expression Mastermix
5µl
(Applied Biosystems, Darmstadt )
Primerforward
0,375µl
Primerreverse
0,375µl
Sonde
0,25µl
H2OHPLC
3µl
Der Reaktionsansatz wurde in eine 48-Well qRT-PCR-Platte (Applied Biosystems,
Darmstadt) pipettiert, mit Folie (Applied Biosystems, Darmstadt) verschlossen, für
1min bei 1500rpm abzentrifugiert und im StepOne-RT-PCR System (Applied
Biosystems, Darmstadt) mit folgendem PCR-Programm gestartet.
20
Materialien und Methoden
20 Sek. 95°C
1 Sek. 95°C
20 Sek. 60°C
40 Zyklen
Für jeden durchgeführten Lauf wurde eine Standardkurve mit EGFP-Plasmid mit
bekannter Kopienzahl erstellt. Die StepOne 2.0 Software berechnet anhand der
Standardkurve die Kopienzahlen der EGFP-Transkripte in den einzelnen Proben.
GAPDH
wurde
als
Referenz-Gen
für
die
Quantifizierung
verwendet.
Dementsprechend wurde die Kopienzahl der GAPDH-Transkripte für jede Probe
mitbestimmt, sodass die EGFP-Expression darauf normiert werden konnte.
2.2.4 Induktion von oraler Toleranz durch Chitosan-DNA Nanopartikel
2.2.4.1 Fütterung und Immunisierung
Die orale Applikation von Chitosan-DNA Nanopartikeln oder Kontrollsubstanzen
erfolgte mittels Schlundsonde. In allen Versuchen enthielt eine Einzel-/Tagesdosis
Nanopartikel 50µg Plasmid-DNA. Die jeweiligen Behandlungsschemas sind bei den
dazugehörigen Versuchen im Ergebnisteil dargestellt. Für die Immunisierung gegen
Ovalbumin (OVA) (Sigma Aldrich, Taufkirchen) erhielten die Mäuse eine subcutane
Injektion von 100µl CFA (Freund’s Adjuvant) (Sigma Aldrich, Taufkirchen) 1:1
gemischt mit OVA in PBS (2µg/µl).
2.2.4.2 Messung der OVA-spezifischen Delayed-Type-Hypersensitivity (DTH)Reaktion
Nach der Immunisierung gegen OVA erhielten die Mäuse eine s.c. Injektion von 50µg
OVA in 30µl PBS in die rechte Ohrmuschel. In die linke Ohrmuschel wurden 30µl
PBS injiziert. Vor und 24h nach der Injektion wurde die Dicke der Ohrmuscheln mit
einem elektronischen Messgerät (Kroepplin, Schlüchtern) vermessen. Die OVAspezifische Ohrschwellung wurde mittels folgender Formel berechnet: Ohrschwellung
= (Ohr rechts24h – Ohr rechts0h) - (Ohr links24h – Ohr links0h).
2.2.4.3 Bestimmung der OVA-spezifischen Antikörper im Serum
Um OVA-spezifische Antikörper im Serum zu detektieren wurden 96-Well ELISAPlatten (Thermo Scientific, Roskilde, Dänemark) mit OVA in PBS (100µg/ml;
21
Materialien und Methoden
100µl/Well) beschichtet und über Nacht bei 4°C ink ubiert. Anschließend wurden die
Kavitäten 3-mal mit Tween/PBS (200µl/Well) gewaschen und daraufhin mit 3% BSA
in PBS (100µl/Well) für 2h bei RT blockiert. Die Serumproben wurden 500-fach mit
1% BSA in PBS verdünnt. Nach 3-maligem Waschen der blockierten Kavitäten
wurden jeweils 100µl der verdünnten Proben auf die einzelnen Wells verteilt und für
1h bei RT inkubiert. Nach weiterem 3-maligem Waschen mit Tween/PBS
(200µl/Well) wurden 100µl eines 1:10000 verdünnten, Alkaline-Phosphatase
konjungierten anti-Maus IgG–Antikörpers (Sigma Aldrich, Taufkirchen) in die
Kavitäten pipettiert. Eine Stunde später wurden die Wells 6-mal gewaschen bevor
100µl einer Substratlösung (Para-Nitrophenyl-Phosphat in 1M Diethanolaminpuffer;
1mg/ml) zugefügt wurde. Nach 30-minütiger Inkubation bei RT wurde die Reaktion
durch die Zugabe von 3M NaOH (100µl/Well) gestoppt. Anschließend wurde die
Intensität der Farbreaktion bei 405nm (Referenz OD: 490nm) mit einem ELISAReader gemessen.
2.2.4.4 Proliferationsassay
Balb/c-Mäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg
pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder PBS gefüttert. Eine weitere Mäusegruppe erhielt
25mg OVA-Protein an Tag 0 und 2. An Tag 12 und 26 wurden die Mäuse gegen
OVA immunisiert. 13 Tage später (Tag 39) wurden die Milzen der Mäuse steril
entnommen und in mit PBS gefüllte 1,5ml Eppendorfgefäße auf Eis transferiert.
Anschließend wurden die Milzen durch ein Sieb (70µm) (Cell strainer, BD Falcon,
Heidelberg) gedrückt und mit PBS nachgespült. Die erhaltenen Milzzellsuspensionen
wurden daraufhin abzentrifugiert (1400rpm; 7min; 4°C), mit 5ml eines ErythrozytenLysepuffers für 2min inkubiert und anschließend die Erythrozyten-Lyse durch die
Zugabe von 25ml PBS abgestoppt. Nach erneuter Zentrifugation (1400rpm; 7min;
4°C)
wurden
Zellkulturplatte
die
Zellen
(Costar
in
R10 +Medium
Corning
aufgenommen,
GmbH, Wiesbaden)
als
in
eine
Tripletts
96-Well
ausgesät
(200µl/Well; 2,5x106 Zellen/ml) und in der Anwesenheit verschiedener OVAKonzentrationen (0, 5, 25 und 50µg/ml) für 72h bei 37°C in einer 5%-igen CO 2Atmosphäre kultiviert. Daraufhin wurde H3-Thymidin (GE Healthcare Europe GmbH,
Freiburg) zugefügt (1µCi/Well) und die Milzzellen für weitere 18h kultiviert.
Anschließend wurde der Einbau des radioaktiven Tritiums in die Zellen mit einem
1205 Betaplate Szintillationszähler (Wallac Pharmacia) gemessen.
22
Materialien und Methoden
2.2.4.5 Bestimmung der Zytokin-Konzentration im Zellkulturüberstand
Balb/c-Mäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg
pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder PBS gefüttert und an Tag 12 gegen OVA
immunisiert. 8 Tage später wurden die Milzen der Mäuse steril entnommen und in mit
PBS gefüllte, auf Eis gelagerte 1,5ml Eppendorfgefäße transferiert. Anschließend
wurde aus den Milzen eine Milzzellsuspension hergestellt und die Zellen in eine 96Well Platte ausgesät (entsprechend Abschnitt 2.2.4.4). Die Zellen wurden in der
Anwesenheit von 20µg/ml OVA für 48h in einer 5%-igen CO2-Atmosphäre kultiviert.
Anschließend wurden die Zellkulturüberstände entnommen und bei -20°C bis zur
Analyse aufbewahrt. Die Zytokin-Konzentration in den Überständen wurde
anschließend mittels Cytometric-Bead-Assay (BD, Heidelberg) entsprechend den
Angaben des Herstellers im Durchflusszytometer (FACSCantoTM II, BD, Heidelberg)
bestimmt. Die Bestimmung der TGF-beta Konzentration erfolgte mittels TGF-beta
ELISA-Kit entsprechend den Herstellervorschriften (eBioscience, Frankfurt).
2.2.4.6 Transferexperimente
2.2.4.6.1 Isolierung und Transfer von Milzzellen
Nach oraler Vorbehandlung (die jeweiligen Behandlungsschemas sind bei den
dazugehörigen Versuchen im Ergebnisteil dargestellt) mit OVA-NP, OVA-Protein
oder PBS wurden die Milzen der Mäuse steril entnommen. Die Milzen einer
Behandlungsgruppe wurden vereinigt und eine Milzzellsuspension hergestellt. Nach
der Erythrozyten-Lyse (siehe Abschnitt 2.2.4.4) wurden die Milzzellen mit PBS
gewaschen und in der gewünschten Konzentration erneut in PBS aufgenommen.
Jeweils
200µl
der
einzelnen
Suspensionen
wurden
anschließend
in
die
Schwanzvene von naiven Empfänger-Mäusen injiziert.
2.2.4.6.2 Isolierung und Transfer von unterschiedlichen Milzzellpopulationen
Für
den
Transfer
aufgereinigter
CD4+T-Zellen
und
der
CD4-negativen
Milzzellenfraktion wurde zunächst eine Milzzellsuspension aus Milzen OVA-NP
vorbehandelter
Mäuse
hergestellt.
Mit
Hilfe
des
MACs-Beads
CD4+CD25+Regulatory-T-Cell-Isolation Kits (Miltenyi, Bergisch Gladbach) konnten
daraus CD4+T-Zellen durch Negativselektion aufgereinigt werden. Die an die Beads
23
Materialien und Methoden
gebundenen CD4-negativen Zellen wurden anschließend von der Säule eluiert. Die
beiden erhaltenen Zellfraktionen, die CD4+T-Zellen und die CD4-negative Fraktion,
wurden anschließend mit PBS gewaschen und wieder in PBS aufgenommen (5x106
bzw. 1,5x107 Zellen/ml). 200µl der erhaltenen Fraktionen wurden in die
Schwanzvenen naiver Empfänger-Mäusen injiziert.
Für den Transfer von CD4+CD25+ bzw. CD4+CD25-T-Zellen wurden die Milzzellen
einer
Behandlungsgruppe
vereinigt
und
anschließend
daraus
mittels
CD4+CD25+Regulatory-T-Cell-Isolation Kits entsprechend den Anweisungen des
Herstellers die CD4+CD25+T-Zellen aufgereinigt. Hierbei wird nach Aufreinigung der
CD4+T-Zellen eine Positivselektion der CD25+T-Zellen durchgeführt. Die während
dieses Schrittes durch die Säule laufenden CD25-T-Zellen wurden über eine weitere
Säule nochmals aufgereinigt und anschließend als CD4+CD25-T-Zell-Fraktion
eingesetzt. Daraufhin wurden die beiden erhalten Fraktionen gewaschen, in PBS
aufgenommen und davon jeweils 2x105 Zellen in naive Mäuse transferiert.
Der
Erfolg
(FACSCanto
der
TM
einzelnen
Aufreinigungen
wurde
im
Durchflusszytometer
II, BD, Heidelberg) bestimmt. Dazu wurden zwischen 1x105 und 1x106
Zellen der zu analysierenden Fraktionen in FACS-Röhrchen überführt, bei 1400rpm
für 7min bei 4°C abzentrifugiert und in 50µl Blocki erungspuffer aufgenommen. Um
zusätzlich die Fc-Rezeptoren zu blockieren, wurden 0,5µl eines anti-MausCD16/CD32 Antikörpers pro Röhrchen hinzupipettiert. Nach einer 30-minütigen
Inkubation
bei
4°C
wurden
fluoreszenzmarkierte
Anti körper
gegen
die
Oberflächenantigene CD4, CD25 und CD3 hinzugefügt. Nach weiteren 20min bei
4°C
wurden
die
Zellen
gewaschen,
in
PBS
aufgenommen
und
im
Durchflusszytometer analysiert. Die erhaltenen Rohdaten wurden mit der FlowJo
Software (Tree Star, Ashland, USA) ausgewertet.
2.2.4.7 Analyse der Foxp3-Expression nach OVA-NP Applikation
Balb/c-Mäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg
pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder PBS gefüttert. An Tag 12 wurden die Milzzellen
der Mäuse entsprechend Abschnitt 2.2.4.4 in R10+Medium aufgenommen und in eine
96-Well Zellkultur-Platte als Tripletts ausgesät (200µl/Well; 2,5x106 Zellen/ml). Die
Milzzellen wurden daraufhin in der Anwesenheit von 500µg/ml OVA für 72h in einer
5%-igen CO2-Atmosphäre kultiviert.
24
Materialien und Methoden
2.2.4.7.1 RNA-Isolation und qRT-PCR
Die RNA wurde mit Hilfe des Qiagen-RNeasy-Mini Kits (Qiagen, Hilden)
entsprechend den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Menge und Qualität der
erhalten RNA wurde photometrisch sowie mittels Agarosegel bestimmt. 1µg RNA
wurden daraufhin für die cDNA-Synthese mit dem Quantitect-Reverse-Transkription
Kit (Qiagen, Hilden) eingesetzt. Im Anschluss daran wurde die mRNA-Expression
mittels
quantitativer RT-PCR über das
StepOne-RT-PCR System
(Applied
Biosystems, Darmstadt) bestimmt. Der verwendete Reaktionsansatz sowie das PCRProgramm sind in Abschnitt 2.2.3.2.2 beschrieben. 18SrRNA wurde als ReferenzGen verwendet. Die Auswertung erfolgte mit der StepOne 2.0 Software.
2.2.4.7.2 Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie
In einem zweiten Ansatz wurden die Zellen nach der 72-stündigen Inkubation von der
Zellkulturplatte in FACS-Röhrchen überführt. Die Triplett-Ansätze einer Maus wurden
dabei vereinigt, d.h. ins gleiche FACS-Röhrchen transferiert. Die Zellen wurden
daraufhin mit PBS gewaschen, in 50µl Blockierungspuffer plus 0,5µl anti-CD16/CD32
Antikörper aufgenommen und für 30min bei 4°C inkubi ert. Anschließend wurde ein
PerCP-Cy5.5 konjungierter anti-CD4 Antikörper zugefügt. Nach 20min bei 4°C
wurden die Zellen mit PBS gewaschen, in 100µl Fixierungs/PermeabilisierungsLösung (BD, Heidelberg) aufgenommen und für 30min bei 4°C fixiert. Danach
wurden die permeabilisierten Zellen 2-mal mit BD Perm/Wash-Lösung (BD,
Heidelberg) gewaschen und anschließend zusammen mit 1µl eines FITC-markiertem
anti-Foxp3-Antikörpers für 30min bei 4°C inkubiert. Nach erneutem 2-maligem
Waschen mit Perm/Wash-Lösung wurden die Zellen in PBS aufgenommen und im
Durchflusszytometer (FACSCantoTM II, BD, Heidelberg) analysiert. Die erhaltenen
Rohdaten wurden mit der FlowJo Software (Tree Star, Ashland, USA) ausgewertet.
25
Materialien und Methoden
2.2.5
Behandlung der Transplantatabstoßung durch MHC kodierende
Chitosan-DNA Nanopartikel nach abdominaler Aortentransplantation
2.2.5.1 Abdominale Aortentransplantation
Abb. 2. Abdominale Aortentransplantation. Aus: Jiang et al., Microsurgical
Techniques, Springer, 1998 [109]
Die abdominale Aortentransplantation wurde von Julia Hofmann und Sebastian Eckl
(Abteilung: Experimentelle Herzchirurgie Erlangen, Leiter: Prof. Dr. med. S.
Ensminger) nach der von Koulack beschriebenen Technik durchgeführt [110]. Hierbei
wird ein ca. 2mm langes Segment der Aorta thoracalis der Spendermaus entnommen
und in die Aorta abdominalis der Empfängermaus eingesetzt.
2.2.5.2 Analyse der Intimaproliferation
2.2.5.2.1 Anfertigung und Färbung von histologischen Präparaten
Die transplantierten Aorten wurden an Tag 30 nach Transplantation entnommen, mit
einer
NaCl-Lösung
durchgespült
und
in
Einbettmedium
(Sakura
Finetek,
Zoeterwoude, Niederlande) in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Anschließend
wurde
von den Aorten 8µm dicke Kryoschnitte (Kryostat Frigocut 2800,
Reichert&Jung) angefertigt, die nach Elastin van Gieson gefärbt wurden.
26
Materialien und Methoden
2.2.5.2.2 Auswertung der histologischen Präparate
Für die Bestimmung der Intimaproliferation wurden mehrere EvG-gefärbte Schnitte
aus
verschiedenen
Bereichen
des
jeweiligen
Transplantats
unter
einem
Lichtmikroskop fotografiert. Die digitalen Bilder wurden daraufhin mit der ANAlysis®
Image Analysis Software (Olympus, Hamburg) analysiert. Dazu wurde die Fläche des
Gefäßlumens sowie die Fläche innerhalb der Media nachgezeichnet und vermessen.
Aus den beiden Flächen konnte anschließend die Intimaproliferation berechnet
werden. Intimaproliferation (%) = 100 - (100 : Fläche innerhalb der Media x Fläche
innerhalb des Gefäßlumen).
Abb. 3. Quantifikation der Intimaproliferation. Verhälnis von Neointima und Fläche
innerhalb der Media. Bild zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. med. S. Ensminger
(Experimentelle Herzchirurgie Erlangen).
2.2.5.3 Analyse der gebildeten Alloantikörper im Serum
Die Seren der transplantierten Mäuse wurden bis zur Analyse bei -20°C aufbewahrt.
Zur Herstellung der Zielzellen für die durchflusszytometrischen Analysen, wurden
zwei naive C57BL/6-Milzen durch ein Sieb (70µm) gedrückt und mit PBS
nachgespült. Die erhaltene Milzzellsuspension wurden daraufhin abzentrifugiert
(1400rpm; 4°C; 7min), mit 5ml eines Erythrozyten-Ly sepuffers für 2min inkubiert und
anschließend die Erythrozyten-Lyse durch die Zugabe von 25ml PBS abgestoppt.
Nach erneuter Zentrifugation (1400rpm; 4°C, 7min) w urden die Zellen in 1% BSA in
PBS aufgenommen (7,5x106 Zellen/ml). Nach 30-minütiger Inkubation bei 4°C
wurden 50µl der Zellsuspension mit jeweils 50µl Serum in einem FACS-Röhrchen
vermischt und für 30min bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 3-mal mit
27
Materialien und Methoden
1% BSA in PBS gewaschen. Daraufhin wurde 1µl eines FITC-markierten, Fcspezifischen anti-Maus IgG-Antikörpers (Sigma Aldrich, Taufkirchen) und 50µl 1%
BSA in PBS pro Ansatz hinzugefügt und für weitere 20min bei 4°C inkubiert. Die
Ansätze wurden anschließend mit 1% BSA in PBS gewaschen, in PBS
aufgenommen und im Durchflusszytometer (FACSCantoTM II, BD, Heidelberg)
analysiert. Hierbei wurde die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Zellen
bestimmt.
2.3 Statistik
Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Die
statistischen Signifikanzberechnungen basieren auf dem zweiseitigen ungepaarten tTest nach Student. P-Werte von ≤ 0,05 wurden als signifikant betrachtet.
28
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 Transfektion in vitro
In der vorliegenden Arbeit sollte mit Hilfe oraler Gentherapie eine gezielte Modulation
des Immunsystems erreicht werden. Dafür wurden Chitosan-DNA Nanopartikel als
nicht-virale Gencarrier ausgewählt. Diese Partikel sind aus Chitosan und PlasmidDNA als Expressionsvektor, der für das Zielantigen kodiert, aufgebaut. In zahlreichen
Publikationen konnte der erfolgreiche Einsatz von Chitosan-DNA Nanopartikeln
sowohl für die Transfektion in vitro als auch in vivo demonstriert werden [73, 74, 77].
Aufgrund ihrer nicht-toxischen und bio-degradierbaren Struktur stellen sie ein viel
versprechendes Mittel zur Gentherapie in vivo dar.
Zunächst sollte die Funktionalität der hergestellten Chitosan-DNA Nanopartikel
überprüft werden. Dazu wurde deren Transfektionseffizienz in der humanen Zelllinie
293T untersucht. Die Transfektion mit für das „Enhanced Green Fluoreszence“
Protein (EGFP) kodierenden Nanopartikeln (EGFP-NP) führte zu einem sichtbaren
Anteil grün-fluoreszierender Zellen in der Zelllinie (Abb. 4).
Plasmid
Fugene
Nanopartikel
Abb. 4. Transfektion einer 293T-Zelllinie mit EGFP kodierenden Chitosan-DNA
Nanopartikeln (EGFP-NP). Nach 24-stündiger Kultivierung wurden die Zellen mit EGFPPlasmid (pcDNA3.1/EGFP), Fugene + EGFP-Plasmid oder EGFP-NP transfiziert. 48h nach
Transfektion wurden die Kulturen unter dem Fluoreszenzmikroskop analysiert (Vergrößerung
200x).
29
Ergebnisse
Bereits 24h nach Transfektion mit EGFP-NP konnte ein Anteil von 5±0,2%
fluoreszierender Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden (Abb. 5). Die
stärkste Transfektionsrate mit einem Anteil von 26,2±5,8 % transfizierter Zellen
wurde nach 72h erreicht. Reines EGFP-Plasmid, das nicht mit Chitosan zu
Nanopartikeln komplexiert war, führte zu keiner Transfektion (Abb. 4 und 5). Das
kommerzielle Transfektionsreagenz Fugene (Roche) wurde als Positivkontrolle
verwendet und erreichte 72h nach Transfektion eine maximale Effizienz von
84,4±0,9% (Abb. 5). Die Transfektionsrate mittels Nanopartikel lag damit im Bereich
anderer Studien [111].
Anteil transfizierter Zellen (%)
100
90
EGFP-Nanopartikel
80
EGFP-Plasmid + Fugene
70
EGFP-Plasmid
60
50
40
30
20
10
0
NP
Fu Plasmid
24
NP
Fu Plasmid
48
NP
Fu Plasmid
72
NP
Fu Plasmid
96
Zeit (h)
Abb. 5. Transfektionseffizienz von EGFP kodierenden Chitsoan-DNA Nanopartikeln
(EGFP-NP) in 293T-Zellen. Nach 24-stündiger Kultivierung wurden 293T-Zellen mit EGFPPlasmid (pcDNA3.1/EGFP), Fugene + EGFP-Plasmid oder EGFP-NP transfiziert. 24, 48, 72
und 96 h nach Transfektion wurde der Anteil an fluoreszierenden Zellen mittels
Durchflusszytometrie bestimmt. In der Abbildung ist das Ergebnis von 3 unabhängigen
Versuchen zusammengefasst. Bei jedem Versuchdurchgang wurden Duplikate gemessen.
30
Ergebnisse
3.2 Transfektion in vivo
3.2.1 ß-Galaktosidase (ß-Gal) Expression im Dünndarm nach oraler Applikation
von ß-Gal kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln (ß-Gal-NP)
Um Chitosan-DNA Nanopartikel auf ihre Funktionalität als orale Gencarrier in vivo zu
untersuchen, wurden Balb/c-Mäuse mit ß-Galaktosidase kodierenden Chitosan-DNA
Nanopartikeln (ß-Gal-NP) gefüttert. 24h später wurde der Dünndarm der Mäuse
entnommen und in eine 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)
enthaltende Färbelösung eingelegt. Die Spaltung von X-Gal durch die ßGalaktosidase führt zu einem blauen Spaltprodukt, wodurch die Expression der ßGalaktosidase im Gewebe anhand einer Blau-Färbung nachgewiesen werden kann.
ß-GalNanopartikel
ß-GalPlasmid
PBS
Abb. 6. ß-Galaktosidase Expression im Dünndarm nach oraler Nanopartikel
Applikation. Balb/c-Mäuse erhielten eine orale Gabe von ß-Galaktosidase kodierenden
Nanopartikeln (enthaltend: 50µg pCMVß-Plasmid-DNA), 50 µg pCMVß-Plasmid-DNA oder
PBS. 24h später wurde der Dünndarm entnommen, für 24h in eine eine X-Gal enthaltende
Färbelösung eingelegt und anschließend fotografiert.
Der Darm der mit ß-Gal-NP gefütterten Maus wies im Vergleich zu den mit PBS oder
ß-Gal-Plasmid gefütterten Mäusen eine eindeutige Blau-Färbung auf (Abb.6). Dies
zeigt, dass die Nanopartikel nach oraler Applikation das saure Milieu der Magen-
31
Ergebnisse
Passage überwinden konnten und im Dünndarm zur Genexpression führten, wodurch
ihre Eignung als oraler Gencarrier bestätigt wird.
3.2.2 Kinetik der EGFP-Expression in Payer’schen Plaques (PP) und
mesenterialen Lymphknoten (MLK) nach oraler Applikation von EGFPkodierenden Nanopartikeln (EGFP-NP)
Die mesenterialen Lymphknoten (MLK) und die Payer’schen Plaques (PP) stellen
den Hauptteil des Darm assoziierten lymphatischen Gewebes (GALT) und damit
entscheidende Strukturen des Darmimmunsystems dar. Im Hinblick auf das
Vorhaben durch orale Gabe von Chitosan-DNA Nanopartikel eine gezielte
Modulation des Immunsystems herbeizuführen, wurde die Kinetik der in vivo
Transfektion in den MLK und PP genauer untersucht. Dazu wurde zu verschiedenen
Zeitpunkten nach oraler EGFP-NP Applikation die MLK und PP von Mäusen
entnommen und nach RNA-Isolation und cDNA-Synthese mittels quantitativer RTPCR die EGFP-Expression analysiert.
A
Payer’sche Plaques (PP)
relative EGFP-Expression
160000
140000
EGFP-Nanopartikel
120000
EGFP-Plasmid
100000
80000
60000
40000
20000
0
0
3
6
12
Zeit (h)
32
24
48
Ergebnisse
Mesenteriale Lymphknoten (MLK)
B
relative EGFP-Expression
12000
0
10000
0
EGFP-Nanopartikel
EGFP-Plasmid
8000
0
6000
0
4000
0
2000
0
0
0
3
6
12
24
48
Zeit (h)
Abb. 7. Kinetik der EGFP-Expression in Payer’schen Plaques (PP) und mesenterialen
Lymphknoten (MLK) nach oraler Applikation von EGFP kodierenden Nanopartikeln
(EGFP-NP). CBA-Mäuse erhielten eine orale Gabe von EGFP-NP (enthaltend 50µg
pcDNA3.1/EGFP-Plasmid-DNA) oder 50µg EGFP-Plasmid-DNA. Nach verschiedenen
Zeitpunkten wurden PP (A) und MLK (B) entnommen und die RNA isoliert. Nach reverser
Transkription in cDNA wurde diese mittels quantitativer RT-PCR auf die EGFP-Exression
untersucht. Die erhaltenen Werte wurden auf GAPDH als externe Kontrolle normalisiert.
Bereits 3h nach EGFP-NP Gabe konnte die Bildung von EGFP-mRNA in den PP und
den MLK nachgewiesen werden (Abb. 7A und B). Nach 6h war die maximale EGFPExpression in beiden Kompartimenten erreicht. Mit EGFP-Plasmid gefütterte Mäuse
dienten als Kontrolle und zeigten kaum EGFP-Expression.
33
Ergebnisse
3.3 Immunmodulation durch orale Applikation von Chitosan-DNA
Nanopartikeln
Orale Applikation von Antigenen führt gewöhnlich zu einer Antigen-spezifischen
Nichtreaktion des Immunsystems. Dieses Phänomen wird als orale Toleranz
bezeichnet [14]. Dabei handelt es sich um einen T-Zell abhängigen Prozess bei dem
nach Präsentation des Antigens im GI-Trakt antigen-spezifische T-Zellen anerg
werden, in Apoptose treten oder in einen regulatorischen Phänotyp übergehen. Die
orale Toleranz bietet in Bereichen wie Autoimmunerkrankung, Allergie und
Transplantatabstoßung zahlreiche therapeutische Anwendungsmöglichkeiten [28, 29,
112], allerdings auch Begrenzungen. So ist die Synthese bzw. Aufreinigung vieler
Antigene mit hohem Aufwand und Kosten verbunden. Daneben ist nicht jedes
Antigen aufgrund der Magen-Darm-Passage für die orale Applikation geeignet. Wie
im vorherigen Abschnitt gezeigt wurde, führt die orale Gabe von Chitosan-DNA
Nanopartikeln zur Expression des kodierenden Antigens direkt im GI-Trakt. Somit
kann die orale Gentherapie mit Chitosan-DNA Nanopartikeln eine viel versprechende
Alternative darstellen.
Im nachfolgenden Teil der Arbeit wurde untersucht, ob die orale Applikation von
Chitosan-DNA Nanopartikeln zur Induktion von oraler Toleranz führt. In zahlreichen
Studien wurde bereits gezeigt, dass durch die orale Gabe von Ovalbumin (OVA) als
Protein, dem Hauptbestandteil des Hühnereiweiß, eine Suppression der zellulären
wie auch der humoralen Immunantwort möglich ist [17, 113, 114]. Somit wurde OVA
für die folgenden Versuche als Modellantigen ausgewählt und OVA kodierende
Chitosan-DNA Nanopartikel (OVA-NP) hergestellt.
3.3.1 Ovalbumin kodierende Chitosan-DNA Nanopartikel supprimieren die OVAspezifische DTH-Antwort
Zunächst wurde untersucht, ob die orale Applikation von OVA kodierenden ChitosanDNA Nanopartikeln (OVA-NP) Einfluss auf die zelluläre Immunantwort nimmt. Dazu
wurde die OVA-spezifische Delayed-Type-Hypersensitivity(DTH)-Reaktion analysiert.
Die sog. DTH-Reaktion stellt einen in vivo Assay für die zellvermittelte Immunantwort
dar. Zur Bestimmung der DTH-Reaktion wird eine Maus zunächst gegen das zu
analysierende Antigen immunisiert. 6-14 Tage später erhält die sensibilisierte Maus
eine Injektion des gelösten Antigens in die Ohrmuschel. Dies führt nach vorange34
Ergebnisse
A
Tag
0 2
5 7 9
12
19 20 21
DTH Ak
Immunisierung
bzw. PBS, EGFP-NP, gegen OVA
OVA-NP
Chitosan oder
25 mg OVA-Protein
an Tag 0 und 2
OVA-spezifische Ohrschwellung (µm)
B
200
*
180
*
*
*
160
140
120
100
80
n.s.
60
40
20
0
PBS
OVAPlasmid
Chitosan
EGFP-NP
OVAProtein
OVA-NP
Abb. 8. OVA-NP supprimieren die OVA-spezifische DTH-Antwort. Balb/c-Mäuse wurden
an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) gefüttert
und an Tag 12 immunisiert. Kontrollmäuse erhielten eine vergleichbare Menge an PBS,
OVA-Plasmid (50µg), Chitosan-Lösung oder EGFP-NP. Eine weitere Kontrollgruppe erhielt
25mg OVA-Protein an Tag 0 und 2. An Tag 19 wurde den Mäusen 50µg OVA in 30µl PBS in
die rechte und zur Kontrolle 30µl PBS in die linke Ohrmuschel injiziert (A). 24h später wurde
die Ohrschwellung analysiert (B). Die Abbildung zeigt das Ergebnis von n=4-8 Tieren pro
Gruppe und ist für die OVA-NP, OVA-Protein und PBS-Gruppe repräsentativ für 2
unabhängige Versuchsdurchgänge (*p≤0,05, OVA-NP verglichen mit PBS, OVA-Plasmid,
Chitosan, EGFP-NP; n.s.:p>0,05; OVA-NP verglichen mit OVA-Protein).
35
Ergebnisse
gangener Immunisierung der Maus zu einer Antigen-spezifischen Mobilisierung des
Immunsystems und damit zu einer starken Immunzellinfiltration, was sich im
Anschwellen
der
Ohrmuschel
mit
Hilfe
eines
elektronischen
Messgerätes
untersuchen lässt. Eine erfolgreiche immunologische Tolerisierung gegen das
Antigen lässt sich anhand einer verminderten Ohrschwellung überprüfen.
Um zu untersuchen, ob die orale Applikation von OVA-NP zur Toleranzinduktion
gegenüber OVA führt, wurden Balb/c-Mäuse wie in Abb. 8A dargestellt mit OVA-NP
oder Kontrollsubstanzen gefüttert und anschließend gegen OVA immunisiert. 7 Tage
später wurde die OVA-spezifische Ohrschwellung gemessen. Die Vorbehandlung mit
OVA-NP führte zu einer signifikanten Suppression der DTH-Reaktion im Vergleich
zur der mit PBS behandelten Kontrollgruppe (Abb. 8B). Die Intensität der
Suppression war mit der nach OVA-Protein Applikation vergleichbar. Um einen
Antigen-unspezifischen
immunsuppressiven
Effekt
des
Chitosans
bzw.
der
Nanopartikel auszuschließen, erhielten Kontrollmäuse entweder pure Chitosanlösung
oder EGFP kodierende Nanopartikel (EGFP-NP), wobei EGFP das Kontrollantigen
darstellte. Beide Kontrollgruppen zeigten eine unverändert starke DTH-Antwort (Abb.
8B). Dies macht einerseits deutlich, dass der suppressive Effekt nach OVA-NP
Applikation nicht auf das Chitosan zurückgeführt werden kann und andererseits
Antigen-spezifisch war. Um zu untersuchen, ob die Verpackung des Plasmids mit
Chitosan zu Nanopartikeln notwendig ist, erhielt eine weitere Kontrollgruppe OVA
kodierendes Plasmid als „Encapsulation“-Kontrolle. Mäuse die nur mit OVA
kodierenden Plasmid gefüttert wurden, zeigten keine Reduktion der DTH-Antwort.
Die Ergebnisse zeigen, dass die orale Gabe von OVA-NP zu einer Antigenspezifischen Suppression der zellulären Immunantwort führt.
3.3.2 OVA-NP reduzieren die OVA-spezifische Antikörperbildung
Neben der zellulären- sollte nun auch der Einfluss der Nanopartikel Applikation auf
die humorale Immunantwort untersucht werden. Nach Messung der DTH-Reaktion
wurde das Serum der behandelten Mäuse gesammelt (Abb. 8A), um darin die OVAspezifische Antikörperbildung, als Folge der gegen OVA gerichteten Immunisierung,
zu analysieren. Mittels ELISA-Technik wurden die gegen OVA gerichteten IgGAntiköper im Serum detektiert. Die orale Gabe von OVA-NP führte zu einer
signifikanten Reduktion der OVA-spezifischen IgG-Bildung im Vergleich zu den
36
Ergebnisse
Kontrollgruppen (Abb. 9). Die Suppression war Antigen-spezifisch, da auch die
Applikation von EGFP-NP als Antigen-Kontrolle zu keiner Reduktion des anti-OVA
IgG-Titers führte. Das Ergebnis zeigt, dass neben der zellulären auch die humorale
Immunantwort durch OVA-NP Behandlung supprimiert wird und dies mit einer
vergleichbaren Intensität wie nach OVA-Protein Gabe.
OVA-spezifische Antikörper (OD)
4
*
*
*
*
3
n.s.
2
1
0
PBS
OVAPlasmid
Chitosan
EGFP-NP
OVAProtein
OVA-NP
Abb. 9. OVA-NP supprimieren die OVA-spezifische Antikörperbildung. Balb/c-Mäuse
wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA)
gefüttert und an Tag 12 immunisiert. Kontrollmäuse erhielten eine vergleichbare Menge an
PBS, OVA-Plasmid (50µg), Chitosan-Lösung oder EGFP-NP. Eine weitere Kontrollgruppe
erhielt 25mg OVA-Protein an Tag 0 und 2. An Tag 21 wurde den Mäusen Serum entnommen
und der anti-OVA Antikörpertiter mittels ELISA-Technik bestimmt. Die Abbildung zeigt das
Ergebnis von n=4-8 Tieren pro Gruppe und ist für die OVA-NP, OVA-Protein und PBSGruppe repräsentativ für 2 unabhängige Versuchsdurchgänge (*p≤0,05, OVA-NP verglichen
mit PBS, OVA-Plasmid, Chitosan, EGFP-NP; n.s.:p>0,05; OVA-NP verglichen mit OVAProtein).
37
Ergebnisse
3.3.3 OVA-NP unterdrücken die OVA-spezifische Milzzellenproliferation
Um zu überprüfen, ob der Antigen-spezifische immunsuppressive Effekt von OVA-NP
auch
ex
vivo
beobachtet
werden
kann,
wurde
die
OVA-induzierte
Milzzellenproliferation untersucht. Der Test beruht auf einer klonalen Expansion
OVA-spezifischer Lymphozyten. Antigenpräsentierende Zellen (APC) nehmen das
dem Kulturmedium zugegebene OVA auf und präsentieren es OVA-spezifischen TZellen, die durch eine vorangegangene Immunisierung gegen OVA bereits
vorstimuliert wurden. Dies führt zur Aktivierung und damit Proliferation dieser TZellen, die im Proliferationsassay gemessen werden kann.
Nach oraler Applikation von OVA-NP, OVA-Protein oder PBS und anschließender
Immunisierung gegen OVA wurden die Milzzellen der behandelten Mäuse isoliert
(Abb. 10A). Kultivierung der Milzzellen ohne OVA-Stimulation führte in den 3
Behandlungsgruppen zu einer vergleichbaren unspezifischen Proliferation (Abb.
10B). Eine steigende Zugabe von OVA in das Kulturmedium resultierte in einer
starken Zunahme der Proliferation in der PBS-Kontrollgruppe, wohingegen die mit
OVA-NP
und
OVA-Protein
behandelten
Mäuse
eine
deutlich
schwächere
Proliferation aufzeigten (Abb. 10B). Zwischen den mit OVA-NP und OVA-Protein
behandelten Gruppen war kein signifikanter Unterschied erkennbar. Dies bestätigt,
dass auch ex vivo ein mit OVA-Protein vergleichbarer suppressiver Einfluss von
OVA-NP auf die OVA-spezifische T-Zellproliferation erzielt werden kann.
A
Tag
0 2
5 7 9
12
26
1. Immunisierung
OVA-NP
bzw. PBS
oder
25 mg OVA-Protein
an Tag 0 und 2
38
2. Immunisierung
39
ProliferationsAssay
Ergebnisse
B
70
Proliferation (cpm x 103)
60
PBS
OVA-Protein
OVA-NP
50
40
*
*
25
50
30
20
10
0
5
OVA-Konzentration (µg/ml)
Abb. 10. OVA-NP reduzieren die OVA-spezifische Milzzellenproliferation. Balb/c-Mäuse
wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA)
oder PBS gefüttert (A). Eine weitere Mäusegruppe erhielt 25mg OVA-Protein an Tag 0 und
2. An Tag 12 und 26 wurden die Mäuse gegen OVA immunisiert. 13 Tage später wurden die
Milzzellen der Mäuse isoliert und in Anwesenheit verschiedener OVA-Konzentrationen (0, 5,
25 und 50µg/ml) für 72h kultiviert. Anschließend wurde H3-Thymidin zugefügt und 18h später
der Einbau des radioaktiven Tritiums in die Zellen gemessen (B). Die Abbildung zeigt das
Ergebnis von einem Versuchdurchgang mit n=3-4 Tieren pro Gruppe (*p≤0,05, OVA-NP bzw.
OVA-Protein verglichen mit PBS).
3.3.4 OVA-NP führen zu einer Verschiebung der Th1- in Richtung Th2/Th3Antwort
Nachdem in den vorangegangenen Versuchen gezeigt wurde, dass die orale Gabe
von OVA-NP eine Antigen-spezifische, suppressive Wirkung auf das Immunsystem
hat, zielte die Fragestellung nun darauf ab den Mechanismus der Toleranzinduktion
mit OVA-NP aufzuklären. Dazu wurde zunächst der Einfluss der oralen Applikation
von Nanopartikeln auf das Muster der produzierten Zytokine in einer Milzzellenkultur
analysiert. Milzzellen von OVA-NP und PBS gefütterten und im Anschluss gegen
39
Ergebnisse
OVA immunisierten Mäusen wurden in der Anwesenheit von 20 µg/ml OVA für 72 h
kultiviert (Abb. 11A). Daraufhin wurde im Überstand die Konzentration verschiedener
Zytokine mittels Cytometric Bead Assay im Durchflusszytometer bestimmt. Die
Tumornekrosefaktor (TNF) sowie Interferon-gamma (IFN-γ) Produktion war in der mit
OVA-NP behandelten Gruppe im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe deutlich
reduziert. Dagegen stiegen die Interleukin-10 (IL-10) sowie Transformig-GrowthFaktor-beta (TGF-beta) Spiegel signifikant an (Abb. 11B). Interleukin-4 (IL-4) konnte
nur
in
geringen
Mengen
detektiert
werden,
jedoch
konnte
eine
Konzentrationszunahme dieses Zytokins in der OVA-NP Gruppe beobachtet werden.
Die nach OVA-NP Applikation beobachtete reduzierte Produktion der typischen Th1Zytokine TNF und IFN-γ, sowie die Zunahme typischer Th2- und Th3-Zytokine wie IL4, IL-10 und TGF-beta deuten somit auf eine durch Antigen kodierende Nanopartikel
induzierte Verschiebung der Th1- in Richtung Th2/Th3-Immunantwort hin.
A
Tag 0 2
5 7 9
OVA-NP
bzw. PBS
12
20
Immunisierung
23
Kultivierung der
Milzzellen mit
20µg/ml OVA
ZytokinBestimmung
IL-4
12
IL-10 Konzentration (pg/ml)
IL-4 Konzentration (pg/ml)
B
10
8
6
4
2
0
PBS
350
IL-10
*
300
250
200
150
100
50
0
PBS
OVA-NP
40
OVA-NP
Ergebnisse
IFN-γ
1200
600
IFN-γ Konzentration (pg/ml)
TNF Konzentration (pg/ml)
TNF
1000
800
600
400
200
0
TGF-beta Konzentration (pg/ml)
PBS
OVA-NP
500
400
300
200
100
0
PBS
OVA-NP
TGF-beta
400
*
350
300
250
200
150
100
50
0
PBS
OVA-NP
Abb. 11. OVA-NP führen zu einer Verschiebung der Th1- in Richtung Th2-/Th3Immunantwort. Balb/c-Mäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend:
50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder PBS gefüttert (A). An Tag 12 wurden die Mäuse
gegen OVA immunisiert. 8 Tage später wurden die Milzzellen der Mäuse isoliert und bei
einer OVA-Konzentration von 20µg/ml für 72h kultiviert. Anschließend wurde im Überstand
die Konzentration der Zytokine TNF, IFN-γ, IL-10, IL-4 und TGF-beta bestimmt (B). Die
Abbildung zeigt das Ergebnis mit n=4-5 Tieren pro Gruppe (*p≤0,05, OVA-NP verglichen mit
PBS).
41
Ergebnisse
3.3.5 Die durch OVA-NP induzierte Toleranz ist transferierbar
Für die Induktion oraler Toleranz nach Proteinapplikation spielt die Bildung
regulatorischer T-Zellen eine entscheidende Rolle [14]. Um zu überprüfen, ob auch
die Nanopartikel induzierte Toleranz durch regulatorische Zellen vermittelt wird,
wurden Experimente mittels adoptiven Transfers durchgeführt. Dazu wurden
Milzzellen von mit PBS oder OVA-NP gefütterten und damit tolerisierten Balb/cMäusen in naive syngene Mäuse übertragen. Für die Empfänger-Mäuse wurde
anschließend die OVA-spezifische DTH-Reaktion untersucht (Abb. 12A).
A
Donor
Tag 0
3
5
7 10
11
naiver
Empfänger
Zelltransfer
OVA-NP
bzw. PBS
12
11
Immunisierung
19 20
DTH
OVA-spezifische
Ohrschwellung (µm)
B
DTH
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
PBS
OVA-NP
Abb. 12. Die durch OVA-NP induzierte Toleranz ist transferierbar. Balb/c-Mäuse wurden
an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder
PBS gefüttert (A).
An Tag 11 wurden die Milzzellen der Mäuse isoliert und in die
Schwanzvene von naiven Empfänger-Mäusen injiziert (2x107 Zellen in 200µl PBS).
Anschließend wurden die Empfänger-Mäuse gegen OVA immunisiert und die OVAspezifische DTH-Reaktion analysiert (B). Die Abbildung zeigt das Ergebnis von n=5 Tieren
pro Gruppe (*p≤0,05, OVA-NP verglichen mit PBS).
42
Ergebnisse
Abbildung 12B zeigt, dass durch den Transfer der Milzzellen tolerisierter Mäuse, die
OVA-spezifische Immunantwort im Vergleich zu PBS-Kontrollmäusen signifikant
supprimiert wurde. Dies deutet daraufhin, dass nach oraler Nanopartikel Applikation
regulatorische Zellen induziert wurden, die nach der Übertragung in die EmpfängerMäuse die Toleranz vermitteln konnten.
3.3.6 Die durch OVA-NP induzierte Toleranz wird von CD4+CD25+T-Zellen
vermittelt
Insbesondere die Induktion von CD4-positiven regulatorischen T-Zellen konnte in
zahlreichen Studien zur Protein-basierten oralen Toleranz beobachtet werden [43,
44, 52, 115]. Um den Phänotyp der induzierten regulatorischen Zellen nach
Nanopartikel Applikation aufzuklären, konzentrierte sich die Untersuchung daher
zunächst auf die CD4+T-Zellpopulation. Milzzellen von OVA-NP vorbehandelten
Mäusen wurden in CD4+T-Zellen und eine CD4-negative Fraktion separiert.
Anschließend wurden die beiden Fraktionen in die Schwanzvenen naiver syngener
Mäuse injiziert (Abb. 13). Nur diejenigen Empfänger-Mäuse, die CD4+T-Zellen
erhielten, zeigten eine signifikant reduzierte DTH-Reaktion (Abb. 14). Im Vergleich
dazu führte die Injektion der CD4-negativen Fraktion zu keiner Suppression der
Immunantwort. Dies deutet darauf hin, dass sich die für die Vermittlung der oralen
Toleranz verantwortliche Population innerhalb der CD4+T-Zellen befindet.
43
Ergebnisse
Donor
3
5
7 10
OVA-NP
bzw. PBS
11
Milzzellen
CD4--Fraktion
CD3
Tag 0
Empfänger
Milzzellen
CD3
CD4
CD4+-Fraktion
CD3
CD4
Empfänger
CD4
Abb. 13. Adoptiver Transfer von CD4+T-Zellen und CD4--Zellen. Balb/c-Mäuse wurden an
Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) gefüttert.
An Tag 11 wurden die Milzzellen der Mäuse isoliert und mit MACs-Beads über eine CD4Negativselektion in CD4+T-Zellen und eine CD4--Fraktion separiert. Anschließend wurden
jeweils 1x106 (CD4+) bzw. 3x106 (CD4-) Zellen in 200µl PBS in die Schwanzvenen naiver
Empfänger-Mäuse injiziert. Die dargestellten Dot Plots zeigen die durchflusszytometrische
Nachanalyse der Zellen und zeigen eine repräsentative Aufreinigung.
44
OVA-spezifische Ohrschwellung (µm)
Ergebnisse
*
*
250
200
150
n.s.
100
50
0
OVA-NP
3x106
Milzzellen
PBS
3x106
Milzzellen
OVA-NP
OVA-NP
6
3x106
1x10
CD4+ T-Zellen CD4 Zellen
Abb. 14. Die durch OVA-NP induzierte Toleranz wird von CD4+T-Zellen vermittelt. Ein
Tag nach dem Transfer von CD4+T-Zellen oder der CD4--Fraktion aus der Milz von OVA-NP
vorbehandelten Mäusen, wurden die Empfänger-Mäuse gegen OVA immunisiert. Sieben
Tage später wurde die OVA-spezifische DTH-Reaktion bestimmt. Als Kontrolle erhielten zwei
weitere Gruppen von Empfänger-Mäusen anstelle der beiden aufgereinigten Fraktionen die
gesamte Milzfraktion von OVA-NP oder PBS vorbehandelten Donor-Mäusen. Die Abbildung
zeigt das Ergebnis von n=4-5 Tieren pro Gruppe (*p≤0,05; n.s.:p>0,05).
Um zu untersuchen, ob die induzierte regulatorische CD4+-Population auch CD25
positiv ist, wurde anschließend das Transferexperiment mit isolierten CD4+CD25+
und CD4+CD25-T-Zellen erneut durchgeführt (Abb.15). Nur der Transfer von
CD4+CD25+T-Zellen führte zu einer signifikanten Suppression der OVA-spezifischen
Ohrschwellung
(Abb.
16).
Als
Kontrolle
wurde
in
+
einem
zusätzlichen
+
Transferexperiment gezeigt, dass der Transfer von CD4 CD25 T-Zellen PBS oder
EGFP-NP gefütterter Mäuse die OVA-spezifische DTH-Reaktion nicht supprimieren
konnte (Abb. 17).
45
Ergebnisse
Donor
Tag 0
3
5
7 10
11
CD4+CD25--Fraktion
OVA-NP
bzw. PBS
CD4
Milzzellen
Empfänger
Milzzellen
CD4
CD25
CD4+CD25+-Fraktion
CD4
CD25
Empfänger
CD25
Abb. 15. Adoptiver Transfer von CD4+CD25+T-Zellen und CD4+CD25--T-Zellen . Balb/cMäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend: 50 µg pcDNA3/OVAPlasmid-DNA) gefüttert. An Tag 11 wurden die Milzzellen der Mäuse isoliert und daraus mit
MACs-Beads
eine
CD4+CD25+-
und
eine
CD4+CD25-T-Zellfraktion
aufgereinigt.
5
Anschließend wurden jeweils 2x10 Zellen in 200µl PBS der beiden Fraktionen in die
Schwanzvene
von
naiven
Empfänger-Mäusen
injiziert.
Die
Abbildung
zeigt
eine
repräsentative Aufreinigung. Die dargestellten Dot Plots zeigen die durchflusszytometrische
Nachanalyse der Zellen und sind auf CD4+-Zellen gegated.
46
Ergebnisse
OVA-spezifische Ohrschwellung (µm)
*
250
*
200
150
n.s.
100
50
0
PBS
3x106
Milzzellen
OVA-NP
3x106
Milzzellen
OVA-NP
2x105
CD4+CD25+
T-Zellen
OVA-NP
2x105
CD4+CD25T-Zellen
Abb. 16. Die durch OVA-NP induzierte Toleranz wird von CD4+CD25+T-Zellen vermittelt.
Einen Tag nach dem Transfer von CD4+CD25+- oder CD4+CD25-T-Zellen aus der Milz von
OVA-NP vorbehandelten Mäusen wurden die Empfänger-Mäuse gegen OVA immunisiert.
Sieben Tage später wurde die OVA-spezifische DTH-Reaktion bestimmt. Als Kontrolle
erhielten zwei weitere Gruppen von Empfänger-Mäusen anstelle der beiden aufgereinigten
Fraktionen die gesamte Milzfraktion von OVA-NP oder PBS vorbehandelten Donor-Mäusen.
Die Abbildung zeigt das Ergebnis von n=4-6 Tieren pro Gruppe (*p≤0,05; n.s.:p>0,05).
Dieses Ergebnis deutet daraufhin, dass nach oraler Applikation von Chitosan-DNA
Nanopartikeln regulatorische CD4+CD25+T-Zellen induziert werden, die in der Lage
sind die Antigen-spezifische DTH-Reaktion zu unterdrücken.
47
Ergebnisse
OVA-spezifische Ohrschwellung (µm)
n.s.
*
n.s.
250
200
150
100
50
0
Negativ
Kontrolle
EGFP-NP
2x105
CD4+CD25+
T-Zellen
OVA-NP
PBS
2x105
2x105
+
+
CD4+CD25+ CD4 CD25
T-Zellen
T-Zellen
Abb. 17. Der Transfer von CD4+CD25+T-Zellen EGFP-NP oder PBS behandelter Mäusen
supprimiert die OVA-spezifische DTH-Antwort nicht. Einen Tag nach dem Transfer von
CD4+CD25+T-Zellen aus der Milz mit OVA-NP (Positivkontrolle), EGFP-NP oder PBS
vorbehandelter Mäuse wurden die Empfänger-Mäuse gegen OVA immunisiert. Sieben Tage
später wurde die OVA-spezifische DTH-Reaktion bestimmt. Als Negativkontrolle dienten
unbehandelte Mäuse, die gegen OVA immunisiert und die DTH-Antwort gemessen wurde.
Die Abbildung zeigt das Ergebnis von einem Versuchdurchgang mit n=4-5 Tieren pro Gruppe
(*p≤0,05; n.s.:p>0,05, Negativkontrolle verglichen mit PBS, EGFP-NP und OVA-NP).
3.3.7 OVA-NP führen zu einer verstärkten Foxp3 Expression
Ein Marker für die klassischen Tregs ist die Expression des Transkriptionsfaktors
Foxp3 [54]. Um zu überprüfen, ob die nach OVA-NP Applikation induzierten
CD4+CD25+T-Zellen Foxp3 positiv sind, wurden Milzzellen von mit OVA-NP oder
PBS behandelten Mäusen isoliert und in der Anwesenheit von 500µg/ml OVA für 72h
kultiviert (Abb. 18A). Bei der anschließenden Analyse der Milzzellen konnte auf
mRNA Ebene (Abb. 18B) eine signifikante Steigerung der Foxp3-Expression in der
OVA-NP Gruppe beobachtet werden. Die Untersuchung auf Proteinebene erfolgte
48
Ergebnisse
mittels Durchflusszytometrie. Hierbei konnten innerhalb der CD4+T-Zellen vermehrt
Foxp3+-Zellen nach Nanopartikel Behandlung nachgewiesen werden (Abb.18C und
D). Dies deutet daraufhin, dass durch die orale Applikation von OVA-NP
B
A
Tag
0
3
5 7 10
OVA-NP
oder PBS
11 13
Stimulation der
Milzzellen mit OVA
→ Analyse der
Foxp3 Expression
relative Foxp3 Expression
regulatorische CD4+CD25+T-Zellen induziert werden, die Foxp3 positiv sind.
4,5
*
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
C
PBS
CD4+ Foxp3+ Zellen (%)
8
*
7
OVA-NP
D
6
PBS
OVA-NP
Foxp3
Foxp3
5
4
3
2
1
0
PBS
OVA-NP
Abb. 18. OVA-NP führen zu einer verstärkten Foxp3 Expression. Balb/c-Mäuse wurden
an Tag 0, 3, 5, 7 und 10 mit OVA-NP (enthaltend: 50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder
PBS gefüttert (A). An Tag 11 wurden die Milzzellen der Mäuse isoliert und bei einer OVAKonzentration von 500µg/ml für 72h kultiviert. Anschließend wurde die RNA der Zellen
isoliert und die Foxp3-Expression der mRNA analysiert (B). In einem weiteren Ansatz wurde
der Anteil Foxp3-exprimierender Zellen auf Proteinebene im Durchflusszytometer untersucht
(C und D). C und D stellen den Anteil an Foxp3+Zellen innerhalb der CD4+T-Zellen der mit
OVA stimulierten Milzzellen dar. Die Abbildung zeigt das Ergebnis von einem
Versuchsdurchgang mit n=4-5 Tieren pro Gruppe (*p≤0,05, OVA-NP verglichen mit PBS).
49
Ergebnisse
3.4 Toleranzinduktion mit OVA-NP in CCR7-/- Mäusen
Die Arbeitsgruppe von Prof. R. Förster (MH Hannover) zeigte, dass die
mesenterischen Lymphknoten (MLK) den Ort der oralen Toleranzinduktion darstellen,
an dem naiven T-Zellen Antigen präsentiert wird und von dem aus sich die Toleranz
systemisch verbreitet [38]. Als nächstes stellten sie sich die Frage auf welchem Weg
das Antigen vom Darm zu den MLK gelangen muss, um Toleranz zu induzieren.
Denkbar wäre entweder ein Zell-gebundener Transport des Antigens an eine
antigenpräsentierende Zelle (APC) oder die freie Diffusion des Antigens zu den MLK.
Diese Fragestellung wurde mittels CCR7-/- Mäusen beantwortet. Der Phänotyp von
CCR7-/- Mäusen ist u.a. durch eine verschlechterte Immigration von B-Zellen, TZellen und dentritische Zellen (DC) in die Lymphknoten charakterisiert [116]. In
CCR7-/- Mäusen sind die DC innerhalb der Lamina Propria (LP) normal verteilt,
wohingegen in den MLK kaum DC aus der LP zu finden sind. Der Chemokinrezeptor
CCR7 scheint somit eine entscheidende Rolle bei der Migration von DC in die MLK
zu spielen. Bei dem Versuch orale Toleranz mit OVA-Protein in CCR7-/- Mäusen zu
induzieren, war dies nicht möglich. Daraus wurde geschlossen, dass ein Zellgebundener,
CCR7-abhängiger
Transport
des
Antigens
zu
den
MLK
die
Voraussetzung für orale Toleranzinduktion darstellt [38].
Nach oraler Applikation von Chitosan-DNA Nanopartikeln wurden die Nanopartikel
von Zellen innerhalb des Darms aufgenommen und das Antigen exprimiert. Auch
innerhalb der PP und der MLK konnte die Expression des Antigens nachgewiesen
werden (Abschnitt 3.2). Daraus ergab sich die Frage, ob auch für die Induktion oraler
Toleranz mittels Nanopartikeln ein Zell-gebundener Transport zu den MLK von
entscheidender Bedeutung ist.
3.4.1 Orale Applikation von OVA-NP führt in CCR7-/- Mäusen zu keiner
Suppression der humoralen und nur zu einer partiellen Reduktion der
zellulären Immunantwort
Um zu untersuchen, ob die Toleranzinduktion mittels Chitosan-DNA Nanopartikeln
auf einen DC-gebundenen, CCR7-abhängigen Transport des Antigens zu den MLK
angewiesen ist, wurden CCR7-/- und Wildtyp-Mäuse mit OVA-NP gefüttert,
anschließend gegen OVA immunisiert und die induzierte Toleranz gegenüber OVA
mittels DTH-Reaktion analysiert (Abb. 19A).
50
Ergebnisse
A
Tag
0 2
5 7 9
OVA-NP
bzw. PBS;
oder
25 mg OVA an
Tag 0 und 2
12
19 20 21
Immunisierung
gegen OVA
DTH Ak
B
*
*
*
200
180
Ohrschwellung (µm)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
PBS
OVA- OVA-NP
Protein
PBS
OVA- OVA-NP
Protein
Wildtyp
CCR7-/-
Abb. 19. OVA-NP supprimieren partiell die zelluläre Immunantwort in CCR7-/- Mäusen.
CCR7-/- und Wildtyp-Balb/c-Mäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend:
50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder PBS gefüttert. Eine weitere Gruppe erhielt 25mg
OVA an Tag 0 und 2. An Tag 12 wurden die Mäuse gegen OVA immunisiert und 7-14 Tage
später die DTH-Reaktion bestimmt. Die Abbildung zeigt das Ergebnis von n=6 Tieren pro
Gruppe für die Wildtyp-Mäuse und n=19-21 Tieren pro Gruppe für die CCR7-/- Mäuse
(*p≤0,05, OVA-NP/CCR7-/- verglichen mit OVA-Protein/CCR7-/-, PBS/CCR7-/- und OVANP/Wildtyp).
51
Ergebnisse
Zwei weiteren Mäusegruppen wurde PBS oder OVA-Protein appliziert. Wie in
Abbildung 19B zu erkennen ist, führte die orale Applikation von OVA-NP im Vergleich
zu PBS oder OVA-Protein zu einer signifikanten Suppression der zellulären
Immunantwort. Allerdings war diese Suppression von einer deutlich geringeren
Intensität als in Wildtyp-Mäusen.
n.s.
n.s.
*
Anti-OVA IgG im Serum (OD)
2
1,5
1
0,5
0
PBS
OVA- OVA-NP
Protein
PBS
OVA- OVA-NP
Protein
Wildtyp
CCR7-/-
Abb. 20. OVA-NP supprimieren die humorale Immunantwort in CCR7-/- Mäusen nicht.
CCR7-/- und Wildtyp-Balb/c-Mäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend:
50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder PBS gefüttert. Eine weitere Gruppe erhielt 25mg
OVA an Tag 0 und 2. An Tag 12 wurden die Mäuse gegen OVA immunisiert und 9 Tage
später die OVA-spezifische Antikörperbildung im Serum bestimmt. Die Abbildung zeigt das
Ergebnis von n=3 Tieren pro Gruppe für die Wildtyp-Mäuse und n=8-10 Tieren pro Gruppe
für die CCR7-/- Mäuse und ist representativ für 2 unabhängige Versuchsdurchgänge
(*p≤0,05; n.s.:p>0,05, OVA-NP/CCR7-/- verglichen mit OVA-Protein/CCR7-/-, PBS/CCR7-/und OVA-NP/Wildtyp).
52
Ergebnisse
Bei der Analyse der OVA-spezifischen Antikörperbildung im Serum der Mäuse
konnte für die drei unterschiedlichen Behandlungsgruppen der CCR7-/- Mäuse keine
Reduktion des Antikörpertiters gemessen werden (Abb. 20). Im Vergleich dazu wurde
bei den mit OVA-NP oder OVA-Protein behandelten Wildtyp-Mäusen eine deutliche
Suppression der humoralen Immunantwort beobachtet. Die Ergebnisse deuten
darauf hin, dass der Hauptweg der Toleranzinduktion mittels Nanopartikeln, im
Hinblick auf den Antigen-Transport zu den MLK, dem der Protein-induzierten
Toleranz entspricht. Allerdings scheint daneben noch ein weiterer Mechanismus zu
existieren, der für die beobachtete Immunmodulation verantwortlich ist.
3.4.2 In Wildtyp-Mäusen induzierte Toleranz kann auf CCR7-/- Mäuse
übertragen werden
Zur Kontrolle der Ergebnisse sollte ausgeschlossen werden, dass die in CCR7-/Mäusen nur schwach oder nicht supprimierte DTH-Antwort bzw. Antikörperbildung
auf
eine
im
CCR7-/- Phänotyp
begründete
verschlechterte
Migration
von
regulatorischen T-Zellen in die systemischen Lymphknoten zurückzuführen ist,
sondern ursächlich mit der Toleranzinduktion in den MLK in Zusammenhang steht.
Dazu wurden Milzzellen von mit OVA-NP tolerisierten Wildtyp-Mäusen in CCR7-/Mäuse adoptiv transferiert (Abb. 21A). Der Milzzellentransfer von OVA-NP
behandelten Mäusen in CCR7-/- Mäuse führte zu einer signifikanten Suppression der
DTH-Antwort, die mit der von Wildtyp-Mäusen vergleichbar war (Abb. 21B). Dies
zeigt, dass die Übertragung von regulatorischen Zellen in CCR7-/- Mäuse
grundsätzlich eine Suppression der Immunantwort induzieren kann. Dies bestätigt,
dass die Ursache für die in CCR7-/- Mäusen beobachtete abgeschwächte Wirkung
der
Nanopartikel
auf
eine
verschlechterte
zurückzuführen war.
53
Toleranzinduktion
in
den
MLK
Ergebnisse
A
Wildtyp
Tag 0
3
5
7 10
11
CCR7-/OVA-NP
bzw. PBS
Milzzelltransfer 11
2x107 in 200µl PBS
12
19 20
Immunisierung
DTH
B
n.s.
*
Ohrschwellung (µm)
250
200
150
100
50
0
PBS
OVA-NP
CCR7-/-
PBS
OVA-NP
Wildtyp
Abb. 21. In Wildtyp-Mäusen induzierte Toleranz kann auf CCR7-/- Mäusen übertragen
werden. Wildtyp-Balb/c-Mäuse wurden an Tag 0, 2, 5, 7 und 9 mit OVA-NP (enthaltend:
50µg pcDNA3/OVA-Plasmid-DNA) oder PBS gefüttert. An Tag 11 wurden die Milzzellen der
Mäuse isoliert und in die Schwanzvene von naiven Wildtyp- oder CCR7-/- EmpfängerMäusen injiziert. Am darauf folgenden Tag wurden die Mäuse gegen OVA immunisiert und 7
Tage später die DTH-Reaktion bestimmt. Die Abbildung zeigt das Ergebnis von n=3-5 Tieren
pro Gruppe (n.s.:p>0,05; OVA-NP/CCR7-/- verglichen mit PBS/CCR7-/- und OVANP/Wildtyp).
54
Ergebnisse
3.5 Modulation der Transplantatabstoßung durch orale Applikation von
MHC kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln in einem Maus-AortenTransplantationsmodell
Nachdem im vorangegangen Teil der Arbeit der Mechanismus der Toleranzinduktion
mit Chitosan-DNA Nanopartikeln analysiert wurde, sollte nun die Funktionalität der
Nanopartikel
für
eine
mögliche
therapeutische
Anwendung
in
einem
Transplantationsmodell getestet werden. Als Transplantationsmodell wurde die
abdominale Aortentransplantation nach Koulak [110] ausgewählt. In diesem Modell
wird ein 2 mm langes Segment der thorakalen Aorta einer Spendermaus in die
abdominale Aorta einer allogenen Empfängermaus transplantiert. Aufgrund der
MHC-Inkompatibilität von Spender und Empfänger kommt es im Transplantat zu
einer Alloimmunreaktion, die sich in einer verstärkten Intimaproliferation äußert. Die
so entstehende Transplantatarteriosklerose weist große Übereinstimmungen mit der
humanen, chronischen Abstoßung in Koronararterien auf [117].
Die Idee war es, durch orale Applikation von MHC kodierenden Nanopartikeln,
Empfänger-Mäuse gegen den MHC der Spender-Mäuse zu tolerisieren, um dadurch
die Entwicklung der Transplantatarteriosklerose zu mildern bzw. zu verhindern. Als
Empfänger-Mäuse wurden CBA.J-Mäuse mit dem MHC-Phänotyp H2k und als
Spender-Mäuse C57BL/6 Mäuse mit dem MHC H2b verwendet. Somit wurde ein sog.
„Full-Mismatch“ transplantiert, d.h. keines der MHC-Klasse I und II Moleküle von
Spender und Empfänger stimmten überein. Die Empfänger-Mäuse wurden mit Kb
kodierenden Nanopartikeln vorbehandelt und damit gegen Kb, einem der MHCKlasse I Moleküle des Spenders, tolerisiert. Aufgrund des Phänomens der „linked
unresponsiveness“ [107] wurde davon ausgegangen, dass die Immunreaktion
gegenüber den verbleibenden Mismatchen durch die Tolerisierung gegenüber Kb
ebenfalls reduziert wird und somit die Toleranzinduktion gegenüber einem MHCMolekül ausreichend ist.
3.5.1 Kb kodierende Chitosan-DNA Nanopartikel reduzieren die Transplantatarteriosklerose
CBA.J-Mäuse (H2k) wurden zwischen Tag -28 und Tag 23 in regelmäßigen
Abständen mit Kb kodierenden Nanopartikeln (Kb-NP) gefüttert, um sie dadurch
gegenüber dem MHC-Molekül Kb immunologisch zu tolerisieren. An Tag 0 erhielten
55
Ergebnisse
die Mäuse ein Aortentransplantat von C57BL/6 (H2b) Spender-Mäusen. Die
Transplantationen wurden von der Abteilung für experimentelle Herzchirurgie
Erlangen (Leiter: Prof. Ensminger) durchgeführt. 30 Tage später wurde der Erfolg der
Nanopartikel
Behandlung
anhand
der
Intimaproliferation
der
eingebauten
Transplantate analysiert (Abb. 22). Neben der mit Kb-NP behandelten Gruppe
wurden
für
weitere
Kontrollgruppen
nach
identischem
Behandlungsschema
Transplantationen durchgeführt (Tabelle 1).
Spender
MHC Kl.-I: Kb, Db, Lb
MHC Kl.-II: I-Eb, I-Ab
Cd4
C57BL/6
donorTcell
Tag -28 -26 -24 -21 -19
-12
-5
0 2
9
16
23
NP NP NP NP NP
NP
NP
Tx NP
NP
NP
NP
30
b
K -NP
Kb-NP
Analyse der Intimaproliferation und der
Alloantikörperbildung
CBA
Empfänger
MHC Kl.-I: Kk, Dk, Lk
MHC Kl.-II: I-Ek, I-Ak
Abb. 22. Behandlungsprotokoll der abdominalen Aortentransplantation. CBA.J-Mäuse
wurden zwischen Tag -28 und Tag 23 in regelmäßigen Abständen mit Kb kodierenden
Chitosan-DNA Nanopartikeln (NP) gefüttert. An Tag 0 erhielten die Mäuse ein
Aortentransplantat von C57BL/6 Spender-Mäusen. An Tag 30 wurde das Serum auf
Alloantikörperbildung analysiert und die Intimaproliferation der Transplantate histologisch
untersucht.
56
Ergebnisse
Tabelle 1: Behandlungsgruppen der abdominalen Aortentransplantation
Gruppenbezeichnung
Spender
Empfänger
Behandlung
Isograft
CBA.J (H2k)
CBA.J (H2k)
unbehandelt
Allograft
C57BL/6 (H2b)
CBA.J (H2k)
unbehandelt
„3rd-party“
Balb/c (H2d)
CBA.J (H2k)
Kb-Nanopartikel
OVA-NP
C57BL/6 (H2b)
CBA.J (H2k)
OVA-Nanopartikel
Kb-NP
C57BL/6 (H2b)
CBA.J (H2k)
Kb-Nanopartikel
Wie in Abb. 23 und 24 zu erkennen ist, führte die Behandlung mit Kb-NP zu einer
Reduktion der Intimaproliferation von 71,9±4,8% in der unbehandelten AllograftKontrollgruppe auf 39,9±10%. Die Isograft-Kontrollgruppe in der Spender und
Empfänger
jeweils
MHC-identisch
waren,
zeigte
wie
zu
erwarten
keine
Abstoßungsreaktion.
Um einen Kb- bzw. Antigen-unspezifischen Einfluss der Nanopartikel auf die
Intimaproliferation auszuschließen, erhielt eine Kontrollgruppe OVA-NP anstelle von
Kb-NP. OVA stellte somit das Kontrollantigen dar. Die Behandlung mit OVA-NP
führte mit einer durchschnittlichen Proliferation von 66,7±0,6% zu keiner relevanten
Reduktion der Abstoßungsreaktion, was die Antigen-spezifische Wirkung der
Nanopartikel deutlich macht. Diese Antigen-spezifische Wirkung konnte durch eine
weitere, die sog. „3rd-party“-Kontrollgruppe bestätigt werden. Die „3rd-party“Kontrollgruppe wurde mit Kb-NP behandelt, erhielt allerdings das Transplantat einer
Balb/c anstelle einer C57BL/6 Maus. Der MHC eines Balb/c-Transplantats ist H2d
anstelle von H2b. In dieser Gruppe führte die Behandlung mit Kb-NP zu einer
Intimaproliferation von 70,6±7,6% und unterschied sich somit nicht gegenüber der
Allograft- bzw. OVA-NP-Kontrollgruppe.
57
Ergebnisse
A
B
C
D
E
Abb. 23. Histologische Analyse der Intimaproliferation. 30 Tage nach Transplantation
wurden die Aorten explantiert und in Einbettmedium mit flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Anschließend wurden Kryoschnitte (8µm) angefertigt, mit Elastica-van-Gieson (EvG) gefärbt
und unter dem Mikroskop analysiert (Vergrößerung: 200-fach). A: Isograft; B: Allograft; C:
OVA-NP; D: „3rd-party“-Kontrolle; E: Kb-NP.
58
Ergebnisse
n.s.
Intimaproliferation (%)
100
n.s.
*
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Isograft
Allograft
„3rd-party“Kontrolle
OVA-NP
Kb-NP
Abb. 24. Kb-NP reduzieren die Intimaproliferation. Die EvG-gefärbten Kryoschnitte der
explantierten Aorten wurden unter dem Mikroskop digital aufgenommen. Anschließend
wurden die Fläche des Gefäßlumens sowie die Fläche innerhalb der Media mittels
ANAlysis® Image Analysis Software vermessen. Aus den gemessenen Flächen wurde die
Intimaproliferation berechnet. Für jedes Transplantat wurden mind. 5 unterschiedliche
Schnitte ausgewertet. Der Versuch wurde mit n=8 Tieren für die Kb-NP- und AllograftGruppe, n=3 Tieren für die OVA-NP-Gruppe sowie mit n=5 Tieren für die restlichen
Vergleichsgruppen durchgeführt (*p≤0,05; n.s.:p>0,05, unbehandelte Allograft-Kontrolle
verglichen mit Kb-NP, OVA-NP und 3rd-party-Kontrolle).
3.5.2 Kb-NP supprimieren die Alloantikörperbildung
Neben der Intimaproliferation als Maß für die Transplantatarteriosklerose stellt auch
die Bildung von gegen das fremde MHC-gerichtete Alloantikörper ein wichtiges
Kriterium für die Abstoßungsreaktion dar. Für die Untersuchung der gebildeten
Alloantikörper im Serum der transplantierten Tiere wurde ein Crossmatch mit
Spendermilzzellen
und
Empfängerserum
durchgeführt
und
mittels
Durchflusszytometrie analysiert. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen führte die
Behandlung mit Kb-NP zu einer deutlichen Reduktion der Alloantikörperbildung (Abb.
25). Dies deutet daraufhin, dass eine supprimierte humorale Immunantwort die
59
Ergebnisse
reduzierte Intimaproliferation begünstigt hat. Zwischen der OVA-NP behandelten und
der
unbehandelten
Allograft-Gruppe
war
kein
Unterschied
bezüglich
des
Alloantikörpertiters erkennbar. In der „3rd-party“-Kontrollgruppe war ebenfalls eine
deutliche Produktion von Donor-spezifischen Antikörpern zu beobachen. Dies
bestätigt die Kb- bzw. Antigen-spezifische Wirkung der Nanopartikel auf die
Abstoßungsreaktion auch auf humoraler Ebene.
*
n.s.
*
35000
30000
MFI
25000
20000
15000
10000
5000
0
Isograft
3rd-partyKontrolle
Allograft
OVA-NP
Kb-NP
Abb. 25. Kb-NP reduzieren die Bildung von Alloantikörpern. 30 Tage nach
Transplantation wurde den Mäusen Serum entnommen und auf die Bildung von
Alloantikörpern untersucht. Dazu wurde ein Crossmatch mit naiven C57BL/6-Milzzellen
durchgeführt (Für die 3rd-party-Kontrollgruppe, die ein Balb/c-Transplantat erhielt, wurde das
Crossmatch entsprechend mit Balb/c-Milzzellen durchgeführt). Nach Blockierung der FcRezeptoren wurden die Milzzellen mit den zu analysierenden Seren inkubiert. Anschließend
gewaschen und ein gegen den Fc-Teil von IgG-Antikörpern gerichteter, FITC-gelabelter
Sekundärantikörper hinzugefügt. Die unterschiedlichen Milzzellenansätze wurden daraufhin
mittels Durchflusszytometer analysiert und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) bestimmt.
Die Messung der einzelnen Seren erfolgte in Duplikaten (*p≤0,05; n.s.:p>0,05, AllograftKontrolle verglichen mit Kb-NP, OVA-NP und 3rd-party-Kontrolle).
60
Ergebnisse
Zusammenfassend macht das Ergebnis deutlich, dass selbst in diesem stringenten
Modell der chronisch-vasculären Abstoßung die Behandlung von Empfänger-Mäusen
mit Spender-MHC kodierenden Nanopartikeln in der Lage war, die Intimaproliferation
und Bildung Donor-spezifischer Antikörper zu reduzieren.
61
Diskussion
4. Diskussion
Das Immunsystems des Darms reagiert auf oral aufgenommene Antigene für
gewöhnlich mit einer immunologischen Unempfindlichkeit (Toleranz). Dieses
Phänomen ist bereits seit längerem bekannt und wird als orale Toleranz bezeichnet
[14]. Die Möglichkeit über eine orale Therapie mit Antigenen das Immunsystem zu
beeinflussen,
um
dadurch
Autoimmunerkrankungen,
Allergien
oder
Transplantatabstoßung zu behandeln, wurde und wird derzeit in zahlreichen Studien
untersucht. Trotz vieler Erfolge in Tiermodellen und einigen klinischen Studien (siehe
Abschnitt 1.2.1), ist die Therapie im klinischen Bereich bislang noch nicht etabliert.
Dementsprechend sind hinsichtlich der Weiterentwicklung zur klinischen Anwendung
noch
Fragen,
insbesondere
die
Auswahl
der
Antigendosis,
die
Art
und
Applikationsform des Antigens selbst sowie die beteiligten immunologischen
Zielzellen zu klären.
Die hier vorgelegte Arbeit zielte darauf ab, orale Gentherapie als eine Alternative
zum Protein-basierten Antigen zur Induktion von immunologischer Toleranz zu
nutzen. Als Gencarrier wurden dafür Chitosan-DNA Nanopartikel eingesetzt. Ein
entscheidender
Vorteil
der
Gentherapie
gegenüber
der
Protein-basierten
Administration ist im Hinblick auf eine klinische Anwendung die Unabhängigkeit vom
MHC-Typ
des
Patienten.
Extrazelluläre
Proteine
werden
von
antigen-
präsentierenden Zellen (APC) aufgenommen, zerlegt und meist als ca. 13-17
Aminosäuren lange Peptide auf MHC-Klasse II Molekülen an T-Zellen präsentiert [3,
118, 119]. Zur Präsentation intrazellulärer Proteine dienen hingegen hauptsächlich
MHC-Klasse I Moleküle [120]. In Abhängigkeit des MHC-Genotyps eines Individuums
können nur bestimmte, zur peptidbindenden Furche des MHC-Moleküls passende
Peptide eines Proteins präsentiert werden (MHC-Restriktion) [3]. Dadurch kann das
gleiche Protein bei verschiedenen Individuen unterschiedlich starke Immunantworten
auslösen. Für den Einsatz der Protein-induzierten oralen Toleranz im klinischen
Bereich empfiehlt es sich daher kein komplettes Protein, sondern eine auf den MHCTyp des Patienten abgestimmte Peptid-Mischung zu verwenden. Dies könnte vor
allem deshalb sinnvoll sein, weil Peptide im Vergleich zum kompletten Protein
einerseits die Magen-Darm-Passage besser überstehen und andererseits vermutlich
effektiver von DC im Darm aufgenommen und präsentiert werden können, was in
einer deutlich wirksameren Immunerkennung resultieren würde. Die aufwändige
Suche nach geeigneten Peptiden für jeden einzelnen Patienten entfällt bei der
62
Diskussion
Verwendung von Antigen kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln. Hierbei kodiert
die enthaltene DNA für das komplette Antigen, das in der Zielzelle exprimiert wird.
4.1. Chitosan-DNA Nanopartikel als orale Gencarrier
Die nach X-Gal-Färbung eingetretene Blaufärbung des murinen Dünndarmgewebes
nach vorheriger oraler Applikation von ß-Galaktosidase (ß-Gal) kodierenden
Nanopartikeln demonstriert die Funktionalität der hergestellten Nanopartikel und
bestätigt damit die Beobachtungen von Chen et al. und Roy et. al, die ebenfalls eine
Genexpression im Dünndarmepithelium nach oraler Chitosan-DNA Nanopartikel
Applikation nachweisen konnten [74, 77]. Die orale Gabe der Plasmid-DNA, nicht
koazerviert mit Chitosan zu Nanopartikeln, führt zu keiner Genexpression im
Dünndarm. Dies zeigt, dass die Magenpassage nur durch die Koazervation der DNA
mit Chitosan stabil überwunden werden kann. Koazervation beschreibt im
Allgemeinen die Trennung eines kolloidalen Systems in zwei flüssige Phasen, wobei
die kolloidreiche Phase als Koazervat bezeichnet wird. Bezogen auf Chitosan
Nanopartikel führt die Zugabe von NaSO4 in eine Chitosan-Lösung zur Herabsetzung
deren Löslichkeit, was die Grundlage der Partikelbildung bildet. Der schützende
Effekt der Partikelbildung auf die DNA wird von Studien unterstützt, die zeigen
konnten, dass die Koazervation mit Chitosan die Plasmid-DNA vor einem Verdau
durch Nukleasen effektiv schützen kann [73, 74].
Für die Aufnahme von Nanopartikeln im Darm sind grundsätzlich drei verschiedene
Wege vorstellbar: über die M-Zellen der Payer’schen Plaques (PP), über dentritische
Zellen, deren Dentriten durch interepitheliale Zwischenräume ins Darmlumen
vordringen oder durch transepithelialen Transport [121, 122]. Die ß-Gal-Expression
im Dünndarmepithelium deutet in unserem Modell auf eine Aufnahme der
Nanopartikel in die epithelialen Zellen selbst hin. Möglicherweise erleichtern dabei
die mukosal-adhesiven Eigenschaften der Nanopartikel sich an das interstinale
Epithelium anzuheften und von den Zellen aufgenommen zu werden [75, 76]. Bei
einem Vergleich zwischen transepithelalen Transport und der Aufnahme von
Chitosan-DNA Nanopartikel über die M-Zellen der PP, konnte eine 5-fach stärkere
Aufnahme über die M-Zellen in einem in vitro Modell gemessen werden [121]. Neben
der Aufnahme der Nanopartikel über das Dünndarmepithelium deutet ist eine
63
Diskussion
Aufnahme über die M-Zellen auch in unserem System wahrscheinlich. So wurde auf
m-RNA Ebene eine deutliche Genexpression in den Payer’schen Plaques, die
Partikel hauptsächlich über die M-Zellen aufnehmen, und in den mesenterischen
Lymphknoten bereits 3h nach oraler Nanopartikel Applikation beobachtet. Die
Expression erreichte sowohl in den MLK als auch in den PP ihr Maximum nach 6h
und fiel bereits nach 12h deutlich auf ein niedrigeres Expressionsniveau herab, dass
auch 48h nach Applikation noch nachgewiesen werden konnte.
Der Nachweis einer Genexpression in den MLK spielt hinsichtlich der Induktion von
oraler Toleranz eine entscheidende Rolle. Worbs & Förster et. al demonstrierten,
dass sowohl die initiale Antigenerkennung nach oraler Gabe in den MLK stattfindet
als auch, dass in MLK-restriktierten Mäusen keine orale Toleranz induziert werden
kann [38]. Zusammen mit anderen Studien, in denen orale Toleranzinduktion in PPdefizienten Mäusen beobachtet wurde, konnte damit die ursprüngliche Theorie nach
der die PP den Ort der initialen Toleranzinduktion darstellen [123], widerlegt und
gleichzeitig die zentrale Rolle der MLK für die Toleranzinduktion verdeutlicht werden.
Daher stellte sich die Frage, über welchen Weg Antigen zu den MLK gelangen kann,
damit orale Toleranz induziert wird. Möglich wäre einerseits ein Zell-gebundener
Transport des Antigens an APC oder andererseits die passive Diffusion des Antigens
zu den MLK. Zur Beantwortung dieser Frage wurden von Worbs & Förster et al.
CCR7-/- Mäuse eingesetzt. Der CCR7-/- Phänotyp ist durch eine verschlechterte
Migration von T-Zellen, B-Zellen und DC in sekundäre Lymphorgane charakterisiert
[116]. In CCR7-/- Mäusen konnte keine orale Toleranz mit OVA als Modellantigen
induziert werden, obwohl in den Lymphknoten eine stabile OVA-spezifische TZellproliferation nach systemischer Antigen Administration beobachtet werden
konnte. Dies deutet auf eine entscheidende Rolle für einen DC-gebundenen, CCR7abhängigen Transport des Antigens vom Darm zu den MLK hin. Freies Antigen das
vom
Darm
Zell-ungebunden
zu
den
MLK
gelangt,
führt
zu
keinem
immunmodulatorischen Effekt [38].
Nach oraler Applikation von Chitosan-DNA Nanopartikeln besteht einerseits die
Möglichkeit, dass das vom Darmepithelium nach Nanopartikel Aufnahme exprimierte
Antigen freigesetzt wird. Dies könnte anschließend entweder frei zu den MKL
gelangen oder von DC aufgenommen und zu den MLK transportiert werden. Dies
würde dem Ablauf nach einer oralen Administration von Protein entsprechen.
Andererseits könnten die Nanopartikel aber auch direkt von DC aus den Payer’schen
64
Diskussion
Plaques oder der Lamina propria aufgenommen und zu den MLK transportiert
werden. Dabei würde das Antigen als intrazelluläres Protein der DC exprimiert. Als
dritte Möglichkeit könnten die Nanopartikel auch Zell-ungebunden zu den MLK
gelangen und erst dort von DC oder Stromzellen aufgenommen, das Antigen
exprimiert und entsprechend präsentiert werden. Um zu untersuchen, ob auch die
durch Chitosan-DNA Nanopartikel induzierte Toleranz von einem DC-gebundenen
Transport abhängig ist, wurde die Toleranzinduktion mit Nanopartikeln in CCR7-/Mäusen analysiert. Die humorale Immunantwort kann durch die Gabe der
Nanopartikel nicht unterdrückt werden. Die zelluläre Immunantwort hingegen wird
supprimiert, allerdings mit einer deutlich geringeren Intensität als in Wildtyp-Mäusen.
Der adoptive Transfer von Milzzellen aus tolerisierten Wildtyp-Mäusen in CCR7-/Mäuse bestätigt, dass in CCR7-/- Mäuse grundsätzlich eine vollständige Suppression
der
DTH-Antwort
herbeigeführt
werden
kann
und
dementsprechend
die
eingeschränkte Suppression auf die Induktion der Toleranz im MLK zurückzuführen
ist. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass auch in unserem Modell der Zellgebundene Transport des Antigens bzw. der Nanopartikel vermutlich durch DC in die
MLK eine entscheidende Rolle für die Toleranzinduktion spielt. Allerdings deutet die
im Vergleich zur Protein Administration beobachtete, wenn auch schwache
Suppression der DTH-Antwort an, dass daneben noch ein CCR7-unabhängiger, Zellungebundener Weg an der Nanopartikel-induzierten Toleranzinduktion beteiligt ist.
Denkbar wäre, dass Nanopartikel die Zell-ungebunden in die MLK gelangen und erst
dort von DC oder Stromazellen aufgenommen werden, anders als freies Antigen, in
der Lage sind Toleranz zu induzieren. Möglicherweise handelt es sich dabei um
einen quantitativen Effekt. So könnte die Menge des Antigens in den MLK aufgrund
der anhaltenden Genexpression der Nanopartikel
im Vergleich zur Protein
Applikation deutlich erhöht sein.
Analysen zur Aufnahme von Fluoreszenz markierten PLA (poly-lactic-acid)Nanopartikeln im murinen Darm zeigten, dass die fluoreszierenden Partikel
hauptsächlich über die M-Zellen der PP und von dort von DC und B-Zellen
aufgenommen wurden [124]. Ob dies entsprechend für Chitosan-DNA Nanopartikel
gilt, muss in weiteren Untersuchungen gezeigt werden. Dennoch bestärkt dieses
Ergebnis die Vermutung, dass die DC eine Hauptzielzelle der Nanopartikel im Darm
darstellt und damit eine zentrale Rolle bei der Toleranzinduktion durch Chitosan-DNA
Nanopartikel spielen könnte. DC spielen auch im Rahmen der Protein-induzierten
65
Diskussion
oralen Toleranz vor allem in Hinblick auf ihre Beteiligung an der Induktion
regulatorsicher T-Zellen im GALT eine bedeutende Rolle. Dabei scheinen
CD103+DC maßgeblich an der Induktion regulatorischer T-Zellen im Darm beteiligt zu
sein [62, 125]. Coombes et. al zeigte, dass CD103+DC aus den MLK in Abhängigkeit
von TGF-beta und Retinolsäure regulatorische Foxp3+T-Zellen im Mausmodell
induzieren können [126]. Aber auch CD11b+DC scheinen für die Induktion oraler
Toleranz entscheidend zu sein, da in CD11b-defizienten Mäusen keine orale
Toleranz induziert werden kann [127]. Daneben fördert die Behandlung von Mäusen
mit Ftl3-Ligand, einem Wachstumsfaktor, der die Expansion von DC in vivo stimuliert,
die orale Toleranzinduktion [128].
4.2. Orale Toleranzinduktion mittels Chitosan-DNA Nanopartikeln
Die Fütterung von Ovalbumin (OVA) an Mäuse vor oder nach einer Immunisierung
gegen OVA führte in zahlreichen Studien zu einer OVA-spezifischen Suppression der
humoralen und zellulären Immunantwort [17, 113, 114]. Die Verwendung von OVA
kodierenden Nanopartikeln anstelle von OVA-Protein supprimiert die OVAspezifische DTH-Antwort, IgG-Antikörperbildung und Milzzellenproliferation in einem
zum Kontrollprotein vergleichbaren Ausmaß. Somit stellt die orale Gentherapie mit
Chitosan-DNA Nanopartikeln eine viel versprechende Alternative für die Induktion
von oraler Toleranz dar. Die Fütterung von Nanopartikeln, die EGFP als irrelevantes
Antigen kodieren, kann keine Toleranz gegenüber OVA induzieren, was zeigt, dass
die Suppression Antigen-spezifisch war. Diese Antigen-Spezifität wird auch bei der
Protein-induzierten oralen Toleranz beobachtet [129].
Die Kultivierung von mononukleären Zellen der Milz OVA-NP behandelter Mäuse
führte nach OVA-Stimulation im Vergleich zur PBS behandelten Kontrolle zu einer
verstärkten Bildung von Th2- und Th3 Zytokinen wie TGF-beta, IL-10 und IL-4. Im
Gegensatz dazu war die Bildung von Th1-Zytokinen wie IFN-γ und TNF reduziert,
was auf eine durch die Nanopartikel ausgelöste Verschiebung der Th1 in Richtung
Th2/Th3-Immunantwort hindeutet. Eine vergleichbare Verschiebung wurde auch in
anderen
Studien
zur
oralen
Toleranz
nach
einem
OVA-Niedrigdosis
Fütterungsregime mit wiederholter Antigen Applikation beobachtet, was auf ähnliche
Mechanismen
zwischen
der
OVA-NP-induzierten
Niedrigdosistoleranz hindeutet [33, 130, 131].
66
und
einer
OVA-
Diskussion
Im Gegensatz hierzu zeigte die orale Applikation von für Allergene kodierende
Chitosan-DNA Nanopartikeln in den Modellen von Roy et al. und Chen et al. eine
immunologische Verschiebung der Th2 in Richtung Th1-Antwort, kombiniert mit
reduzierten IgE-Spiegeln im Serum [74, 77]. Möglicherweise nimmt die Art des
kodierenden Antigens oder das zugrundeliegende Modellsystem Einfluss auf den
induzierten Suppressionsmechanismus und das Zytokinmilieu. Ein ähnliches
Phänomen wird im Bereich der Protein-induzierten Toleranz beobachtet. So ist die
Toleranzinduktion gegenüber klassischen Th1-Modellen (EAE, Diabetes) eher mit
einer
Verschiebung
der
Immunantwort
in
Th2
Richtung
und
gegenüber
Allergiemodellen eher mit einer Suppression der Th2-Antwort korreliert [132-136].
Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen angelehnt an van Oosterhout et. al
[137] wäre, dass nicht die Verschiebung in Richtung Th1- oder Th2-Antwort, sondern
viel eher die Induktion regulatorischer Zellen, die in der Lage sind die dominierende
Immunantwort im jeweiligen Modell zu regulieren, für die Toleranzinduktion
ursächlich ist. Die Verschiebung der Immunantwort in Th1- oder Th2-Richtung wäre
damit nur eine Folge der Regulation.
Die Fütterung einer hohen Antigendosis (Hochdosistoleranz) führt verstärkt zur
Anergie oder Deletion der antigenreaktiven T-Zellen, wohingegen die wiederholte
Applikation einer niedrigen Dosis eher aktive Suppression induziert, die durch die
Bildung von regulatorischen T-Zellen charakterisiert ist [32]. Um herauszufinden, ob
die
orale
Applikation
Suppressionsmechanismus
von
Chitosan-DNA
induziert,
wurden
Nanopartikeln
adoptive
einen
aktiven
Transferexperimente
durchgeführt. Die Übertragung von Milzzellen kann die durch Nanopartikel induzierte
Toleranz in naive Mäuse transferieren. Dies lässt vermuten, dass die durch
Nanopartikel induzierte Toleranz von regulatorischen Zellen vermittelt wird. In
weiteren Transferexperimenten wurde gezeigt, dass nur die Übertragung von
CD4+CD25+T-Zellen der Milz OVA-NP behandelter Mäuse die OVA-spezifische DTHAntwort in den naiven Empfänger-Mäusen reduziert. Die Vorbehandlung mit EGFPNP oder PBS anstelle von OVA-NP sowie der Transfer von CD4+CD25-T-Zellen
führen zu keiner Suppression. Dies deutet daraufhin, dass durch die Nanopartikel
Behandlung Antigen-spezifische CD4+CD25+T-Zellen induziert werden, die in der
Lage sind die OVA-spezifische Immunantwort zu supprimieren. Des Weiteren wurde
bei der Analyse von Milzzellen OVA-NP behandelter Mäuse nach OVA-Stimulation in
67
Diskussion
vitro ein erhöhter Anteil von CD4+Foxp3+T-Zellen nachgewiesen, was die Annahme
unterstützt, dass es sich bei der induzierten regulatorischen CD4+CD25+T-ZellPopulation
um
die,
auch
im
Zusammenhang
mit
oraler Toleranz
häufig
beschriebenen, CD4+CD25+Foxp3+T-Zellen (Tregs) handelt. Es konnte gezeigt
werden, dass das in hohem Maße im Darm exprimierte TGF-beta in der Lage ist die
Expression von Foxp3 in naïven T-Zellen zu induzieren, um sie in CD4+CD25+Tregs
umzuwandeln [58, 59]. Zhang et al. beobachtete einen Anstieg von CD4+CD25+TZellen
zusammen
mit
einem
Abfall
von
CD4+CD25-T-Zellen
nach
oraler
Administration von OVA an OVA TCR-transgene Mäuse. Diese CD4+CD25+T-Zellen
produzierten hohe Mengen an IL-10 and TGF-beta und der adoptive Transfer an
Balb/c-Mäuse supprimierte die DTH-Antwort [138]. Da in unserem Modell auch eine
verstärkte IL-10 und TGF-beta Bildung nach Nanopartikel Applikation beobachtet
wird, könnten ähnliche Mechanismen zugrunde liegen. Hauet-Broere et. al
demonstrierte die Induktion sowohl von CD25- als auch CD25+ regulatorischen TZellen in den mesenterischen Lymphknoten (MLK) innerhalb von 48 h nach oraler
Antigen Applikation an OVA TCR-transgene Mäuse. Der adoptive Transfer sowohl
von CD25- als auch von CD25+T-Zellen aus den MLK führte hier anders als in
unseren Versuchen mit Milzzellen zur Suppression der DTH-Antwort [139]. Die
Tatsache, dass bei Hauet-Broere et. al auch der Transfer CD25-T-Zellen in der Lage
war die DTH-Reaktion zu unterdrücken, könnte daran liegen, dass in seinem Modell
Zellen aus den MLK anstelle von Milzzellen wie in unserem Modell übertragen
wurden. Da die MLK den Hauptinitiationsort der oralen Toleranzinduktion darstellen,
könnten dort neben CD25+T-Zellen auch regulatorische CD25-T-Zellen, z.B. Th3Zellen, induziert worden sein. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch
nach Nanopartikel Applikation regulatorische CD25-T-Zellen in den MLK gebildet
werden, die dann allerdings vermutlich auf die Induktion und Aufrechterhaltung einer
lokalen Toleranz im intestinalen Bereich beschränkt sind und dort durch ihre TGFbeta Produktion die Umwandlung von naiven T-Zellen in CD4+CD25+Foxp3+T-Zellen
fördern.
Durch die orale Applikation von OVA sekretierenden Lactococcus lactis Bakterien in
speziellem Medium gelang es ebenfalls orale Toleranz zu induzieren [140].
Interessanterweise führt in diesem Modell ausschließlich der Transfer von
CD4+CD25-T-Zellen der Milz zur Suppression der DTH-Antwort in den Empfänger-
68
Diskussion
Mäusen. Dementsprechend scheint die Applikationsart des Antigens einen
entscheidenden Einfluss auf den Mechanismus der Toleranzinduktion zu nehmen.
4.3
Reduktion
der
Transplantatbstoßung
durch
MHC
kodierende
Chitosan-DNA Nanopartikel
Die Transplantation solider Organe ist inzwischen eine Standardtherapie für
verschiedene Formen des Organversagens. Trotz effektiver Immunsuppressiva stellt
die
durch
MHC-Antigen
Mismatche
hervorgerufene
Abstoßungsreaktion
ein
Hauptproblem dar. Die Modulation der Transplantatabstoßung durch Behandlung
des Empfängers mit Donor-MHC in geeigneter Form ist somit ein wichtiger Ansatz,
der sowohl experimentell als auch klinisch verfolgt wird.
Die Suppression der Abstoßungsreaktion durch orale Applikation von Alloantigen
konnte bereits in verschiedenen experimentellen Ansätzen gezeigt werden. So führte
die orale Applikation von Alloantigen in Form von Spender-Milzzellen sowohl im
Ratten- als auch im Mausmodell zu einem verlängerten Herztransplantatüberleben
[103, 104]. Daneben konnte auch in einer klinischen Studie die Suppression der
Alloreaktivität in Nieren-transplantierten Patienten nach oraler Applikation von MHCKlasse II Peptiden beobachtet werden [141].
In einer Weiterentwicklung dieser Ansätze wurde die Applikation von MHC
kodierenden Genen zur Verhinderung der Transplantatabstoßung untersucht. So
konnte gezeigt werden, dass die Injektion von Spender-MHC kodierendem Plasmid
in
den
Thymus
von
Mäusen
sowie
die
Behandlung
mit
syngenen
Knochenmarkszellen, die mit Spender-MHC kodierender DNA transduziert waren,
zur Reduktion der Transplantatabstoßung im Mausmodell führte [105, 106]. Dies
zeigt, dass auch die Verwendung MHC kodierender DNA anstelle von Peptid oder
Spenderzellen die Transplantatabstoßung beeinflussen kann. Auf dieser Grundlage
sollte der Einsatz von Chitosan-DNA Nanopartikeln für eine mögliche therapeutische
Anwendung in einem murinen allogenen Aortentransplantations-Modell untersucht
werden. Das Aortenmodell ermöglicht die Untersuchung der Intimaproliferation wie
sie auch in der klinisch besonders relevanten, weil therapeutisch kaum zu
beeinflussenden, chronischen Abstoßung vorkommt. In unserer Studie führte die
Behandlung der Empfänger-Mäuse mit Spender-MHC kodierenden Nanopartikeln zur
Reduktion der Transplantatarteriosklerose und Alloantikörperbildung. Die reduzierte
69
Diskussion
Immunreaktion war insofern Antigen-spezifisch, als die orale Applikation einer
Antigen-Kontrolle sowie die Behandlung einer „Third-party“-Kontrolle mit Kb-NP keine
Wirkung auf die Intimaproliferation und Alloantikörperbildung zeigte. Bemerkenswert
ist, dass die Empfänger-Mäuse mit Nanopartikeln behandelt wurden, die nur für ein
Einziges (Kb) der MHC-Klasse I Moleküle der Spender-Mäuse kodierten. Trotz der
verbleibenden
Mismatche führte die Behandlung zu einer Abschwächung der
allogenen Immunantwort. Für das Zustandekommen dieses Ergebnisses ist die sog.
„linked-unresponsiveness“ verantwortlich [107, 142]. Wie frühere Experiment gezeigt
haben, ist es für die „linked-unresponsiveness“ erforderlich, dass die MismatchAntigene im gleichen Kontext, d.h. auf der gleichen Zelle oder im räumlichen
Zusammenhang mit dem während der tolerogenen Vorbehandlung verwendeten
Antigen, in unserem Modell Kb, exprimiert bzw. präsentiert werden. Dadurch können
Kb-spezifische regulatorische Zellen über anti-inflammatorische Zytokine oder ZellZell-Kontakt auf die Effektorzellen, die gegen die restlichen Mismatch-Antigene
gerichtet sind, wirken [107, 143]. Dieser räumliche Zusammenhang war bei der
Transplantation der C57BL/6-Aorten (H2b) gegeben. Die Transplantate der Balb/cMäuse (H2d) hingegen, exprimieren kein Kb. Somit konnten die Kb-spezifischen
regulatorischen Zellen keinen suppressiven Einfluss auf die gegen H2d gerichteten
Effektorzellen nehmen. Dies erklärt, warum in dieser Behandlungsgruppe keine
Reduktion der Intimaproliferation zu beobachten war.
Für eine Beteiligung regulatorischer T-Zellen in unserem Transplantations-Modell
spricht außerdem, dass bereits in verschiedenen Studien die Beeinflussung der
allogenen Immunantwort durch die Induktion regulatorischer T-Zellen demonstriert
werden konnte. So führte der adoptive Transfer von in vivo, durch Donor-spezifische
Bluttransfusionen in Kombination mit einem immunmodulierenden Antikörper,
generierten, Spender-spezifischen CD4+CD25+T-Zellen in einem murinen Haut- und
Herztransplantatmodell zur Akzeptanz des Transplantats [144, 145]. Durch das
gleiche Behandlungsschema konnte zudem die Transplantatarteriosklerose in einem
murinen Aortentransplantationsmodel reduziert werden [146]. Neben in vivo
generierten regulatorischen T-Zellen führte auch der Transfer von in vitro
expandierten Alloantigen-spezifische CD4+CD25+T-Zellen zur Transplantattoleranz
im Mausmodell [147, 148].
70
Diskussion
4.4 Ausblick
Chitosan-DNA Nanopartikel sind weiterhin Gegenstand intensiver Forschung. Ein
Schwerpunkt sind pharmakologische Vorarbeiten zur Substitution von Insulin oder
Gerinnungsfaktor VIII [78-81]. So führte beispielsweise die Behandlung mit Insulin
kodierenden Chitosan-DNA Nanopartikeln in diabetischen Ratten zu signifikant
verminderten Blutglucosespiegeln.
Daneben scheint aber auch der immunologische Einsatz von Chitosan-DNA
Nanopartikeln viel versprechend. Ihr einfacher Aufbau aus Chitosan und PlasmidDNA erlaubt eine einfache und kostengünstige Herstellung. Darüber hinaus sind
vielfältige Modifikationen zur Optimierung ihre Wirkeffizienz möglich. So könnten auf
DNA-Seite Kombinationen aus geeigneten Zielsequenzen appliziert werden. Neben
dem
MHC-Antigen
könnten
die
Plasmide
beispielsweise
auch
für
immunmodulierende Moleküle wie TGF-beta oder CTLA-4 kodieren, um damit den
tolerogenen Effekt auf das Immunsystem zu verstärken. Auf Chitosan-Seite kann
durch Kopplung spezieller Rezeptorliganden eine zielgerichtete Aufnahme erreicht
werden [149].
Im Vergleich zur oralen Applikation von MHC-Peptiden hat die Verwendung MHC
kodierender Nanopartikel den Vorteil, dass neben der indirekten auch eine direkte
Alloantigenerkennung des kodierten MHC-Moleküls möglich ist. Die zusätzliche
direkte Alloantigenerkennung kann zu einem verstärkten suppressiven Effekt auf die
Abstoßung führen. Dieser potentielle Vorteil der Nanopartikel gegenüber MHCPeptiden sollte in weiteren Experimenten untersucht werden.
Im Bereich der Transplantationsmedizin wäre der Einsatz von Nanopartikeln im
Bereich der Lebendspende vorstellbar. So kann der Transplantatempfänger gezielt
mit Spender–MHC kodierenden Nanopartikeln vorbehandelt werden. Für die
Leichenorgantransplantation könnte man potentielle Transplantatempfänger mit
Nanopartikeln, die für häufig vorkommende MHC-Antigene kodieren, vorbehandeln,
um sie anschließend mit einem das Tolerogen exprimierenden Organ zu versorgen.
Eine weitere Einsatzmöglichkeit der MHC kodierenden Nanopartikel wäre bei haploidenten Stammzelltransplantationen. Hier könnte die Vorbehandlung des Spenders
für eine Suppression der möglichen GVHD (graft versus host disease) sinnvoll sein.
71
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer therapeutischer Ansatz zur Induktion von
immunologischer Toleranz durch orale Gentherapie mit Antigen kodierenden
Chitosan-DNA
Nanopartikeln
untersucht.
Um
die
Mechanismen
hinter
der
Toleranzinduktion mit Nanopartikeln zu beleuchten wurde Ovalbumin (OVA) als
Modellantigen verwendet. Die orale Administration von OVA kodierenden ChitosanDNA Nanopartikeln (OVA-NP) führte im Mausmodell zu einer signifikanten
Suppression der OVA-spezifischen Delayed-Type-Hypersensitivity (DTH)-Antwort
und anti-OVA Antikörperbildung. Die Applikation von Nanopartikeln, die für ein
Kontrollantigen kodierten, führte dagegen zu keiner Toleranzinduktion, was auf einen
Antigen-spezifischen Mechanismus hindeutet. Ein Vergleich der Zytokinprofile
isolierter Milzzellen von OVA-NP mit PBS gefütterten Mäusen zeigte in der OVA-NP
behandelten Gruppe nach OVA-Stimulation eine verminderte Produktion von Th1Zytokinen und gleichzeitig erhöhte Spiegel an Th2/Th3-Zytokinen, vor allem TGFbeta und IL-10. Um zu untersuchen, ob die durch Nanopartikel induzierte Toleranz
von regulatorischen Zellen vermittelt wird, wurden Milzzellen OVA-NP gefütterter
Mäuse in naive Empfänger-Mäuse transferiert. In den Empfänger-Mäusen konnte
daraufhin ebenfalls eine reduzierte zelluläre und humorale Immunantwort gegenüber
OVA beobachtet werden. Weitere adoptive Transferexperiment mit unterschiedlichen
Zellpopulationen zeigten, dass nur der Transfer von CD4+CD25+T-Zellen in der Lage
war, die Toleranz zu übertragen. Somit scheint die orale Applikation von OVA-NP zur
Induktion
von
OVA-spezifischen,
+
IL-10
und
TGF-beta
produzierenden,
+
regulatorischen CD4 CD25 T-Zellen zu führen.
Um das therapeutische Potential der Chitosan-DNA Nanopartikel zu testen, wurden
abdominale Aortentransplantationen im Mausmodell durchgeführt. C57BL/6 Mäuse
dienten als Spender und CBA.J (H2k) Mäuse als Empfänger, so dass ein komplettes
MHC-Mismatch transplantiert wurde. Die MHC-Inkompatibilität von Spender und
Empfänger führte zu einer gegen die Alloantigene gerichteten Immunantwort, die
sich in einer zunehmenden Intimaproliferation äußerte. Die
Empfänger-Mäuse mit Nanopartikeln, die für
Spenders
(Kb)
kodierten,
resultierte
in
72
Vorbehandlung der
ein MHC-Klasse I Molekül des
einer
signifikanten
Reduktion
der
Zusammenfassung
Intimaproliferation. Dieser Effekt war Antigen-spezifisch wie wir durch eine Antigenund „Third-party“-Kontrolle gezeigt haben. Die Analyse der Seren der transplantierten
Mäuse ergab eine signifikante Reduktion der Alloantikörperbildung in der Kb-NP
behandelten Gruppe.
Diese
Ergebnisse
zeigen,
dass
die
orale
Gentherapie
mit
Chitosan-DNA
Nanopartikeln eine vielversprechende Methode darstellt, um immunologische
Toleranz zu induzieren und Transplantatabstoßung zu reduzieren.
73
Zusammenfassung
6.Summary
In our research project, we investigated a novel therapeutic strategy for the induction
of immunological tolerance via antigen encoding chitosan-DNA nanoparticles. To
reveal the mechanism of tolerance induction via nanoparticles, Ovalbumin (OVA) was
used as model-antigen. We demonstrated that feeding mice with OVA encoding
chitosan-DNA nanoparticles (OVA-NP) resulted in a significant suppression of the
OVA-specific delayed-type-hypersensitivity (DTH)-response and anti-OVA IgG
formation indicating tolerance induction towards OVA. Using nanoparticles encoding
for a control antigen had no effect suggesting an antigen-specific mechanism.
Comparing the cytokine profiles of isolated splenocytes from OVA-NP fed mice with
PBS fed control mice after OVA-stimulation showed a reduced Th1-cytokine
production and elevated levels of Th2 and Th3 cytokines, especially IL-10 and TGFbeta, in the OVA-NP treated group. To investigate if nanoparticle induced tolerance
involves the generation of regulatory cells, we transferred splenocytes from OVA-NP
fed mice into naïve recipient animals. The recipients also showed a suppressed
cellular and humoral immune response to OVA. In addition, adoptive transfer
experiments using different cell subsets demonstrated that only the transfer of
CD4+CD25+T-cells was able to transmit tolerance. These results suggest that oral
application of OVA-NP led to the induction of OVA-specific CD4+CD25+regulatory Tcells producing the downmodulatory cytokines IL-10 and TGF-beta.
To test the therapeutic potency of chitosan-DNA nanoparticles, we performed
abdominal aortic transplants in a mouse model. C57BL/6 (H2b) mice were used as
donors and CBA.J (H2k) mice served as recipients, so that fully MHC-mismatched
grafts were transplanted. The MHC-incompatibility of donor and recipient led to an
allo-immune reaction which became apparent in an increased luminal occlusion due
to intima proliferation. Pre-treatment of recipient mice with nanoparticles encoding for
Kb (Kb-NP), one of the MHC-I molecules of the donor, resulted in a significant
reduction of the intima proliferation compared to untreated mice. This effect was
antigen-specific, as shown by antigen and third-party controls. Moreover, analyzing
the sera of the Kb-NP fed group harboured a significant lower amount of
alloantibodies.
74
Zusammenfassung
These results demonstrate the ability of chitosan-DNA nanoparticles to induce
immunological tolerance and to reduce transplant rejection.
75
Anhang
7. Anhang
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Anhang
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1. Schematische Darstellung der „linked unresponsiveness“-Hypothese………...11
Abbildung 2. Abdominale Aortentransplantation.....................................................................26
Abbildung 3. Quantifikation der Intimaproliferation………………………...…………………….27
Abbildung 4. Transfektion einer 293T-Zelllinie mit EGFP kodierenden Chitosan-DNA
Nanopartikeln (EGFP-NP)…………………………………………………………………………..29
Abbildung 5. Transfektionseffizienz von EGFP kodierenden Chitsoan-DNA Nanopartikeln
(EGFP-NP) in 293T-Zellen………………………………………………………………………....30
Abbildung 6. ß-Galaktosidase Expression im Dünndarm nach oraler Nanopartikel
Applikation……………………………………………………………………………………………31
Abbildung 7. Kinetik der EGFP-Expression in Payer’schen Plaques (PP) und mesenterialen
Lymphknoten (MLK) nach oraler Applikation von EGFP kodierenden Nanopartikeln (EGFPNP)…………………………………………………………………………………………………32/33
Abbildung 8. OVA-NP supprimieren die OVA-spezifische DTH-Antwort……………………...35
Abbildung 9. OVA-NP supprimieren die OVA-spezifische Antikörperbildung……………..….37
Abbildung 10. OVA-NP reduzieren die OVA-spezifische Milzzellenproliferation………….38/39
Abbildung 11. OVA-NP führen zu einer Verschiebung der Th1- in Richtung Th2-/Th3Immunantwort………………………………………………………………………….…………40/41
Abbildung 12. Die durch OVA-NP induzierte Toleranz ist transferierbar………………………42
Abbildung 13. Adoptiver Transfer von CD4+T-Zellen und CD4--Zellen……………………......44
Abbildung 14. Die durch OVA-NP induzierte Toleranz wird von CD4+T-Zellen vermittelt…...45
Abbildung 15. Adoptiver Transfer von CD4+CD25+T-Zellen und CD4+CD25--T-Zellen….......46
Abbildung 16. Die durch OVA-NP induzierte Toleranz wird von CD4+CD25+T-Zellen
vermittelt………………………………………………………………………………………………47
Abbildung 17. Der Transfer von CD4+CD25+T-Zellen EGFP-NP oder PBS behandelter
Mäusen supprimiert die OVA-spezifische DTH-Antwort nicht…………………………………..48
Abbildung 18. OVA-NP führen zu einer verstärkten Foxp3 Expression…………………….....49
Abbildung 19. OVA-NP supprimieren partiell die zelluläre Immunantwort in CCR7-/Mäusen………………………………………………………………………………………………..51
Abbildung 20. OVA-NP supprimieren die humorale Immunantwort in CCR7-/- Mäusen
nicht……………………………………………………………………………………………......….52
Abbildung 21. In Wildtyp-Mäusen induzierte Toleranz kann auf CCR7-/- Mäusen übertragen
werden……………………………………………………………………………………………......54
Abbildung 22. Behandlungsprotokoll der abdominalen Aortentransplantation………………..56
Abbildung 23. Histologische Analyse der Intimaproliferation………………………...……...….58
Abbildung 24. Kb-NP reduzieren die Intimaproliferation………………………………………..59
Abbildung 25. Kb-NP reduzieren die Bildung von Alloantikörpern…………………………......60
88
Anhang
7.3 Abkürzungsverzeichnis
Abb
Abbildung
APC
antigenpräsentierende Zelle
BSA
bovines Serumalbumin
°C
Grad Celsius
cDNA
complementary DNA
CD
cluster of differentiation
CO2
Kohlenstoffdioxid
CTLA-4
cytotoxic T-Lymphocyte antigen 4
DC
dentritische Zelle
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleotid-Triphosphat
dT
Desoxythymidin
DTH
Delayed-Type-Hypersensitivity
E.coli
Escheria coli
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGFP
Enhanced Green Floureszent Protein
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FACS
Fluoreszence activated cell sorting
Fc
fragment constant
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluorescein-5-isothiocyanat
Foxp3
forkhead-box-p3
g
Gramm
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GI-Trakt
Gastrointestinaler Trakt
GvHD
graft versus host disease
h
Stunde
HCL
Salzsäure
H2Odest.
Destilliertes Wasser
IgG
ImmunglobulinG
i.v.
intravenös
IL
Interleukin
k
kilo
l
Liter
LB
Luria Broth
89
Anhang
MMW
medium molecular weight
µ
mikro
M
Molar
m
milli
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität
MHC
Haupthistokompatibiltätskomplex
min
Minute
mRNA
messanger RNA
rRNA
ribosomale RNA
n
nano
NaCl
Natriumchlorid
NP
Nanopartikel
OD
optische Dichte
OVA
Ovalbumin
PBS
phosphate buffered saline
PE
Phycoerythrin
PerCP
Peridinin-Chlorophyll
PP
Payer’sche Plaques
qRT-PCR
quantitative real-time polymerase chain reaction
RNA
Ribonukleinsäure
Rpm
Umdrehungen pro Minute
RT
Raumtemperatur
s.c.
subkutan
TNF
Tumornekrosefaktor
TGF-beta
transforming growth-factor beta
90
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt PD Dr. Spriewald für die Vergabe des interessanten Themas, die
guten Ratschläge und die fürsorgliche Betreuung.
Ein großer Dank gilt auch meinen Kollegen aus dem HLA-Labor: Marlies Arnold, Martina
Geithner, Margarethe Herber, Birgit Lauer, Silvia Klöcker, Doris Roppelt, Heide Wiederschein
und vor allem Oliver Dummert, die mir während der gesamten Zeit mit Rat und Tat zur Seite
standen und stets für eine gute Arbeitsatmosphäre sorgten.
Bei der Abteilung für experimentelle Herzchirurgie: Prof. Ensminger, Martina RampsbergerGleixner, Nina Koch, Julia Hofmann und Sebastian Eckl bedanke ich mich für die gute
Zusammenarbeit beim Aortenprojekt und die weit darüber hinausgehende stetige
Hilfsbereitschaft.
Ich bedanke mich auch bei Prof. Mackensen und dem gesamten Team der Medizinischen
Klinik 5 Forschung für die Ermöglichung der Doktorarbeit sowie für die große Hilfs- und
Diskussionsbereitschaft. Darüber hinaus bedanke ich mich bei Prof. Winkler für die
Übernahme der naturwissenschaftlichen Betreuung.
Daneben gilt mein Dank dem interdisziplinären Zentrum für klinische Forschung (IZKF) für
die Bereitstellung der finanziellen Mittel für das Projekt.
Mein größter Dank gilt jedoch meinem Ehemann und meiner Familie für ihre Geduld sowie
ihre finanzielle und moralische Unterstützung während der gesamten Zeit meines Studiums
und Promotion. DANKE!