Fraktionierte Fällung

Proteine I
Fällung
Konzentrationsbestimmung
Dr. Richard Weiss
Praktikumsaufbau
„
Tag 1:
Konzentrieren
Denaturierende und native Fällung
Protein Konzentrationsbestimmung
„
Tag 2:
Entsalzen
Gelchromatographie
Dialyse
„
Tag 3:
Elektrophorese
SDS-PAGE
Proteinreinigung
„
Bereits Anfang des 19. Jahrhunderts waren drei einfache Methoden zur
Proteinreinigung bekannt:
„
Extraktion zur Anreicherung
„
Ansäuerung zur Ausfällung
„
Kristallisation beim einfachen Stehenlassen einer Lösung
Fällung von Proteinen
„
Proteinfällung wird normalerweise als grobe Vorreinigung verwendet, um
Kontaminationen (z.B. Salz, Lösungsmittel, Nukleinsäuren, Lipide, etc.), die bei
einer späteren Proteinanalysemethode wie SDS-PAGE stören würden, zu
entfernen.
„
Außerdem können zu niedrig konzentrierte Proben durch Fällung einkonzentriert
werden.
„
Fällung (Präzipitation) von Proteinen tritt auf, wenn Monomere oder kleine
Komplexe von gelöstem Protein sich zu großen Aggregaten zusammenschließen
→ die Proteine interagieren eher miteinander als mit dem Lösungsmittel (Wasser).
Löslichkeit von Proteinen
„
Wie leicht oder schwer sich ein Protein fällen läßt hängt von seiner Löslichkeit ab:
„
Gut löslich:
Schlecht löslich:
„
„
intrazelluläre Proteine (z.B. Enzyme)
strukturbildende Proteine (z.B. Cytoskelett,
Membranproteine)
Besonders schlecht in wässrigen Medien handhabbar sind die sehr hydrophoben,
integralen Membranproteine → können nur mit Detergenzien gelöst werden.
Löslichkeit von Proteinen
„
Proteine haben polare, apolare und geladene Aminosäuren.
Sie lösen sich in Wasser, weil ihre polaren und geladenen Gruppen an der
Oberfläche mit den Wassermolekülen interagieren und Wasserstoffbrücken bilden.
Amidgruppen (Wasserstoffdonor) und
Carbonylgruppen (Wasserstoffakzeptor) der
Peptidbindung können zu einem
Wassermolekül Wasserstoffbrücken ausbilden
„
Außerdem können die Seitenketten von 11 der 20 Aminosäuren an
Wasserstoffbrücken beteiligt sein.
Löslichkeit von Proteinen
„
Wasser ist ein Dipol. Der Sauerstoffkern zieht die Bindungselektronen von den
Wasserstoffkernen zu sich heran und bewirkt so, daß die Redion um die
Wasserstoffkerne eine positive Nettoladung erhält.
Aufgrund seine Polarität bildet Wasser eine
„Hydrathülle“ um geladene Gruppen und
vermindert dadurch elektrostatische
Wechselwirkungen zwischen geladenen
Molekülen.
Säure/Base-Eigenschaften
„
Proteine haben auf Grund ihrer Aminosäurezusammensetzung saure oder basische
Eigenschaften. Bei neutralem pH sind die Seitenketten von 3 Aminosäuren positiv
geladen und von 2 Aminosäuren negativ.
Basische Aminosäuren
Saure Aminosäuren
Säure/Base-Eigenschaften
„
Die Nettoladung eine Proteins hängt vom pH der umgebenden Lösung ab:
pH < pI des Proteins → positive Nettoladung
… pH = pI des Proteins → neutrale Nettoladung
… pH > pI des Proteins → negative Nettoladung
…
pI = isolektrischer Punkt
Verhalten apolarer Reste
Unpolare Moleküle oder Gruppen von Molekülen schließen
sich in Wasser zu größeren Aggregaten zusammen =
hydrophobe Wechselwirkung
Ein unpolares Molekül erzeugt einen „Hohlraum“ im
Wasser, der einige Wasserstoffbrücken zwischen den
Wassermolekülen zerbricht.
Die Wassermoleküle bilden einen „Wasserkäfig“ um das
ungeladene Molekül = energetisch ungünstig!
Unpolare Moleküle treten in wässriger Lösung nicht primär
deshalb zusammen, weil sie eine große Affinität
zueinander haben, sondern weil Wassermoleküle
untereinander starke Bindungen eingehen.
Verhalten apolarer Reste
Apolare Reste verringern die
Wasserlöslichkeit – es bilden
sich Komplexe aus Proteinen
die ihre apolaren Oberflächen
aneinanderlegen.
= thermodynamisch günstig
Fällungstechniken
„
„
„
„
I)
II)
III)
IV)
…
Bei niedriger Salzkonzentration am pI
Durch anorganische Salze in hoher Konzentration
Durch selektive Denaturierung
Durch organische Lösungsmittel
Parameter, die beachtet werden müssen:
„
„
„
„
„
Proteinkonzentration
pH Wert
Erhalt der biologischen Aktivität (→Denaturierung)
Größe des Proteins
Temperatur
I) Fällung am isoelektrischen Punkt
„
Am isoelektischen Punkt ist die Nettoladung des Proteins null und seine
Löslichkeit am geringsten.
„
Beruht auf elektrostatischen Wechselwirkungen
„
Moleküle mit ähnlichem pI interagieren bevorzugt miteinander → Anreicherung
bestimmter Proteine
I) Fällung am isoelektrischen Punkt
I) Effekt geringer Ionenkonzentration
H2PO4- Na+
Bei physiologischer
Ionenstärke
werden die
Ladungen der
Proteine durch
Salzionen
kompensiert
„
„
Je geringer die Ionenkonzentration im Lösungsmittel ist, umso eher neigen die
Proteine dazu, ihre Oberflächenladungen gegenseitig durch Aggregatbildung zu
kompensieren. Große Aggregate fallen aus.
Praxis: Verdünnen oder Dialyse gegen Wasser
II) Fällung mit anorg. Salzen
„
Beruht auf hydrophoben Wechselwirkungen
„
Die Eigenschaft eines Salzes, Proteine zu fällen, ist in der Hofmeister-Serie
beschrieben.
„
Antichaotrope Salze sind gute und schonende Fällungsmittel (vergrößern
hydrophobe Effekte)
„
Chaotrope Salze halten Protein in Lösung (vermindern hydrophobe Effekte)
II) Fällung mit Ammoniumsulfat
„
Weit verbreitetes, nicht denaturierendes
Fällungsverfahren
„
Prinzip: Stark geladene Ammonium
Ionen (NH4+) und Sulfat Ionen (SO42-)
hydratisieren und entziehen den
Proteinen die Hydrathülle. Dies führt zur
Aggregatbildung der Proteine durch
hydrophobe Wechselwirkung.
„
Parameter: Anzahl und Position der
polaren und apolaren Gruppen, MW der
Proteine, pH-Wert und Temperatur.
„
Fraktionierte Fällung: Verschiedene
Proteine fallen bei unterschiedlichen
(NH4)2SO4 Konzentrationen aus.
II) Fraktionierte Fällung
„
Durch hintereinander gereihte Fällungen mit ansteigenden
Salzkonzentrationen kann ein Proteingemisch anhand der unterschiedlichen
Löslichkeit der Proteine fraktioniert werden.
II) Ammoniumsulfat - Durchführung
„
Praktikumsbeispiel: Ausfällen von Immunglobulinen (=Antikörper) aus
Kaninchenserum.
„
Serum besteht zu 90% aus Wasser, in dem verschiedene Salze, Mineralien,
Proteine, Fette, Zucker u.a. gelöst sind.
„
Das häufigste im Serum gelöste Protein ist das Albumin, weiters sind
Immunglobuline, Fibrinogen, Gerinnungsfaktoren u.v.a. Proteine enthalten.
„
Durch seine hohe Löslichkeit fällt Albumin erst bei sehr hohen Salzkonzentrationen
aus.
II) Ammoniumsulfat - Durchführung
„
„
„
Durchführung: Für die Präzipitation von AK variiert die Konzentration an
Ammoniumsulfat geringfügig von Spezies zu Spezies. So werden die meisten
Kaninchen-Ak bereits bei 40%-Sättigung ausgefällt, während Maus-Ak 45-50%Sättigung benötigen. Daher ist die 50%-ige Sättigung ein üblicher Bereich, um Ak
auszufällen.
Durch Zugabe von gesättigter Ammoniumsulfatlösung (4.1M bei 25°C) soll eine
Endkonzentration von 2.05M erreicht werden.
Die Immunglobuline fallen aus, während ein Großteil des Albumins im Überstand
bleibt.
II) Ammoniumsulfat - Durchführung
„
Beispiel: Wieviel ml einer gesättigten (4.1M) Ammoniumsulfatlösung müssen zu
1ml Serum zugegeben werden, um eine Endkonzentration von 1.37M zu
erreichen?
c1 × v1 = c2 × v2
4.1 × x = 1.37 × (1+x)
2.73x = 1.37
x = 0.5
II) Ammoniumsulfat - Durchführung
„
Beispiel: Wieviel ml einer gesättigten (4.1M) Ammoniumsulfatlösung müssen zu
1ml Serum zugegeben werden, um eine Endkonzentration von 1.33M zu
erreichen?
Serum
0
2.73 Anteile = 1ml
1.37
Amm.Sulf.
4.1
1.37 Anteile = x
x = 0.5
III) Selektive Denaturierung
„
Denaturierung kann durch Änderungen der Temperatur, des pHs oder durch
Zugabe von organischen Lösungsmitteln erreicht werden.
„
Die Tertiärstruktur des Proteins wird zerstört → random coil Struktur →
Aggregatbildung
„
Aggregatbildung hängt ab von pH und Ionenstärke und findet leichter nahe am pI
des Proteins und bei geringer Ionenstärke statt
III) TCA Fällung
„
Trichloressigsäure: Irreversible, sehr effiziente Fällung
„
Schnell und einfach:
„
Methode der Wahl für analytische Zwecke
„
Wird vor allem zur Einkonzentrierung einer Probe vor der Gelelektrophorese
verwendet.
TCA wird der Proteinlösung zugegeben,
bis eine Endkonzentration von 10% erreicht ist.
30 min auf Eis, abzentrifugieren
IV) Organische Lösungsmittel
„
Beruht auf elektrostatischen Wechselwirkungen
„
Erzeugen ein weniger polares Milieu in der Lösung und reduzieren dadurch die
Löslichkeit der Proteine
„
Parameter ähnlich wie bei der Fällung am pI: pH, Proteingröße, Temperatur.
„
Hydrophobe Proteine (Membranproteine) werden durch organische Lösungsmittel
jedoch gelöst und nicht ausgefällt!
„
Beispiele: Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol,....
„
z.B. Kohn-Fraktionierung von Plasmaproteinen mit kaltem Ethanol
Proteinbestimmung
„
Durch komplexen Aufbau der Proteine
keine „perfekte“ Proteinbestimmung
möglich (Zucker, Prosthetische
Gruppen, Nebengruppeneffekte)
„
Verschiedene Ergebnisse bei
verschiedenen Tests der gleichen
Lösung
„
Gleiche Konzentrationen verschiedener
Proteine liefern unterschiedliche
Ergebnisse im selben Test.
„
Empfindlich auf Detergenzien und
Ionen
Bradford Assay
„
Blauer Säurefarbstoff Coomassie-Brillantblue
„
In Gegenwart von Proteinen verschiebt sich das Adsorptions-maximum von
Coomassie-Brillantblue von 465 nach 595 nm
„
Stammlösung aus dem Farbstoff, Ethanol und Phosphorsäure wird im Verhältnis
50:1 mit der Proteinlösung gemischt. 10 min R.T. – dann Messung bei 595 nm
•
Bindet recht unspezifisch v.a. an
Arginin, weniger an Lysin,
Histidin, Tryptophan, Tyrosin und
Phenylalanin
•
Farbstoff wird dadurch in seiner
deprotonierten, anionischen
Sulfonatform stabilisiert
595nm
Beispiele für Prüfungsfragen
Sie wollen ein eher hydrophobes cytoplasmatisches Protein aus
einem Zellextrakt mittels einer Serie verschiedener Methoden, u.a.
Ammoniumsulfatfällung reinigen. Dazu würden Sie:
A) Den Zellextrakt zuerst einmal dialysieren
B) Als erstes bei niedriger Salzkonzentration fällen und mit dem Pellet
weiterarbeiten
C) Als erstes bei hoher Salzkonzentration fällen und mit dem
Überstand weiterarbeiten
D) Das Protein zuerst mit einer chromatographischen Technik
vorreinigen und die Fällung erst am Schluß machen.
E) Das Protein zuerst mit einem organischen Lösungsmittel in Lösung
bringen
Sie möchten eine Proteinlösung vor einer SDS-PAGE rasch und
unkompliziert einkonzentrieren. Welche Methode erscheint Ihnen
am geeingnetsten?
A)
B)
C)
D)
E)
Einstellen des pHs auf den pI
Fällung durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol
Fällung durch Zugabe von 1/10 Volumen TCA
Fällung mit hohen Konzentrationen an Ammoniumsulfat
Dialyse gegen Wasser
Ein Protein ist in Wasser gut löslich wenn:
A)
B)
C)
D)
E)
Es viele geladene Gruppen auf seiner Oberfläche hat
Es sehr groß ist
Es einen hohen pI hat
Bei niedriger Temperatur
Es in hoher Konzentration vorliegt
Wasser:
1)
2)
3)
4)
5)
ist ein Dipol
ist ein lineares Molekül
ist in der Lage Wasserstoffbrückenbindungen mit Amidresten einzugehen
ist in der Lage Wasserstoffbrückenbindungen mit Methylgruppen einzugehen
hat eine hohe Dielektrizitätskonstante
A) 1, 2, 4
B) 2, 4, 5
C) 1, 4, 5
D) 1, 3, 5
E) 2, 3, 5
Welche der folgenden Aminosäuren sind „basisch“?
1)
2)
3)
4)
5)
Lysin
Glycin
Arginin
Aspartat
Alanin
A) 1, 3
B) 2, 4
C) 2, 3, 5
D) 1, 2, 3
E) 1, 5
Wenn der pH kleiner als der pI eines Proteins ist, ist das Protein:
A)
B)
C)
D)
E)
positiv geladen
negativ geladen
ungeladen
Die Ladung des Proteins ist nicht vom pH abhängig
Fällt das Protein aus
Welche der folgenden Techniken sind „native“ Fällungsmethoden für Proteine?
1)
2)
3)
4)
5)
Fällung
Fällung
Fällung
Fällung
Fällung
A) 2, 3, 4
durch Ionenentzug am pI
mit Ammoniumsulfat
mit TCA
mit Ethanol
durch starke Ansäuerung des Mediums
B) 1, 2, 4
C) 1, 2, 5
D) 3, 4, 5
E) 1, 4, 5
Proteine können bei Dialyse gegen Wasser ausfallen, weil
A)
B)
C)
D)
E)
sie ihre Oberflächenladungen nicht mehr mit Salzionen kompensieren können
sie denaturieren und dadurch hydrophobe Bereiche freigelegt werden
sich der pH Wert der Lösung verändert
weil in reinem Wasser die hydrophoben Wechselwirkungen stärker sind
weil der isoelektrische Punkt sinkt