Fällung von Proteinen

Die Fällung
Die Fällung (Präzipitation) von Proteinen ist eine der ersten Techniken, die zur Reinigung von
Proteinen eingesetzt wurde (mehr als 100 Jahre alt). Die Methode beruht auf der direkten oder
indirekten Interaktion von Agenzien mit den in Lösung befindlichen Proteinen. Diese
Agenzien können relativ unspezifisch sein und praktisch alle Proteine aus einer Lösung
ausfällen, was in den ersten Schritten eines Reinigungsgangs zur Gewinnung der Gesamtproteine aus einem Zelllysat eingesetzt wird. Die Fällung kann aber auch so geführt werden,
dass eine Fraktionierung der Einzelbestandteile einer Lösung möglich wird.
Je nach Fragestellung und Ausgangsmaterial kann die Fällung unter verschiedenen
Bedingungen durchgeführt werden. Dabei sollte nicht nur die Effizienz der Fällung allein,
sondern auch weitere Aspekte beachtet werden:
• Kann das Präzipitat wieder gelöst werden?
• Wird die biologische Aktivität der Zielsubstanz durch das Fällungsmittel oder die
Fällungsbedingungen beeinträchtigt?
• Unter welchen Bedingungen kann das Fällungsmittel wieder entfernt werden?
Aussalzen
Die Eigenschaft eines Salzes, Proteine zu fällen, wird durch die genannte Hofmeistersche
Reihe beschrieben. Die weiter links stehenden, so genannten antichaotropen oder kosmotropen Salze sind besonders gute und schonende Fällungsmittel. Sie vergrößern hydrophobe
Effekte in der Lösung und fördern Proteinaggregationen über hydrophobe Wechselwirkungen.
Die rechts stehenden, chaotropen Salze hingegen vermindern hydrophobe Effekte und halten
Proteine in Lösung. Sie eignen sich auch zur Solubilisierung ausgefallener Proteine.
Die älteste und am häufigsten angewandte Methode ist die Fällung mit Ammoniumsulfat. Die
Proteine sollen vor der Fällung in einer Konzentration zwischen 0,01 und 2 % vorliegen.
Ammoniumsulfat ist besonders gut geeignet, da es in Konzentrationen oberhalb von 0,5 M die
biologische Aktivität auch empfindlicher Proteine schützt. Durch Dialyse, Diafiltration oder
Ionenaustausch ist es leicht wieder von den Proteinen zu entfernen. Es ist überdies preiswert
und kann daher auch für größere Volumina (Large Scale) eingesetzt werden. Es wird
üblicherweise unter kontrollierten Bedingungen (Temperatur, pH-Wert) portionsweise zur
Proteinlösung gegeben, wodurch eine fraktionierte Fällung und damit eine Anreicherung des
interessierenden Proteins möglich wird. Achtung, eine vollständige Fällung kann Stunden
dauern! Die entstehenden Präzipitate sind normalerweise von hoher spezifischer Dichte und
gut durch Zentrifugation zu separieren (100 g).
Proteine, deren Aktivität von komplexierten Calciumionen abhängt, können mit
Ammoniumsulfat nicht gefällt werden, da unlösliches Calciumsulfat entsteht und so von den
Proteinen entfernt wird. Diese Proteine müssen mit anderen Salzen oder Agenzien gefällt
werden.
Isoelektrische Präzipitation
Eine verbleibende Nettoladung auf der Proteinoberfläche verursacht eine elektrostatische
Abstoßung der Proteine in Lösung. Zur Aggregation muss diese Abstoßung überwunden
werden. Die Barriere kann durch eine Verschiebung des pH-Wertes auf den isoelektrischen
Punkt (pI-Wert) eines Proteins verringert werden. Fast alle Proteine weisen bei ihrem pI-Wert
die geringste Löslichkeit auf, und in vielen Fällen kann eine Präzipitation beobachtet werden.
Es gibt aber auch Proteine, die an diesem Punkt gut löslich sind, z.B. die Albumine. Diese
Fällungsart ist kostengünstig, da nur Laugen oder Säuren benötigt werden; sie ist aber im
Allgemeinen nicht so selektiv, wie man erwarten würde.
Das typische Löslichkeitsprofil zeigt eine V-Form in Abhängigkeit vom pH-Wert. Relativ
scharf abgegrenzt liegt zu beiden Seiten des pI-Werts eine bessere Löslichkeit vor. Allerdings
ist zu berücksichtigen, dass auch Proteine am pI-Wert zur Denaturierung oder, bei Enzymen,
zur Inaktivierung neigen können. Dies trifft insbesondere für solche Proteine zu, deren pIWert entweder im stark Alkalischen (> pH 10) oder Sauren (< pH 4) liegen.
Fällung mit organischen Lösungsmitteln
Proteine können mit kaltem Aceton oder kurzkettigen Alkoholen (in der Regel Ethanol)
gefällt werden. Längerkettige Alkohole – größer als C4 bei unverzweigten Alkoholen) – sind
in Wasser zu wenig löslich und würden durch die entstehende Phasengrenzfläche
denaturierend auf Proteine wirken; sie sind für die Fällung unbrauchbar. Welches
Lösungsmittel sich am besten für die Fällung eines spezifischen Proteins eignet, muss durch
das Experiment geklärt werden. Ethanol hat sich besonders für die Fällung von Plasmaproteinen bewährt. Sollen Lipide entfernt werden, so ist Aceton zu empfehlen, da neben der
Fällung gleichzeitig eine Extraktion der Lipide möglich ist. Das Lösungsmittel sollte langsam
zudosiert werden (vorsichtig am Rand zulaufen lassen oder tropfenweise), um hohe lokale
Konzentrationen zu vermeiden, was eine Denaturierung zur Folge haben kann – aber nicht
muss. Gute Kühlung ist ebenfalls zu empfehlen, da durch die nicht unerhebliche Mischungsenthalpie Wärme abgegeben wird, die im Zusammenhang mit dem organischen Lösungsmittel
zur Denaturierung führen kann; dies gilt speziell für Alkohole. Das Präzipitat wird durch
Zentrifugation pelletiert und wieder in wässrigen Puffern aufgenommen (in einem geringeren
Volumen als dem Ausgangsvolumen). Die Fällung mit organischen Lösungsmitteln, speziell
Aceton, empfiehlt sich auch zur Konzentrierung von verdünnten Proteinproben vor Durchführung einer Gelelektrophorese. Eine mögliche Denaturierung ist bei diesem Analyseverfahren, speziell bei SDS PAGE, in der Regel nicht von Bedeutung.
Fällung mit Trichloressigsäure
Proteine können mit 10%-iger Trichloressigsäure gefällt werden, wobei eine Endkonzentration von 3 bis 4 % erreicht werden sollte. Nach Abzentrifugieren wird das Präzipitat im
gewünschten Puffer resuspendiert und weiter verwendet, wobei der pH-Wert der Lösung
geprüft werden sollte. Diese Methode führt auf jeden Fall zur Denaturierung der Proteine. Sie
wird vor allem zur Konzentrierung für eine Gelelektrophorese oder vor enzymatischen
Spaltungen eingesetzt. Die minimale Proteinkonzentration sollte 5 µg ml-1 betragen.
Fällung mit Polymeren
Ungeladene wasserlösliche Polymere können sowohl zur Fällung als auch zur Stabilisierung
von Proteinlösungen eingesetzt werden.
Obwohl neben Polyethylenglykol (PEG) auch andere hydrophile Polymere eingesetzt werden,
hat vor allem PEG auf Grund seiner guten Löslichkeit und einer niedrigeren Viskosität große
Bedeutung erlangt. Ein zusätzlicher Gewinn ist in seiner für Proteine stabilisierenden
Wirkung zu sehen. Die Polymere können ohne Kühlung eingesetzt werden; für PEG wurden
bessere Ergebnisse bei 20°C als unterhalb 10°C beobachtet. Molekulargewichte zwischen
4000 und 6000 werden eingesetzt; längere Polymerketten verbessern die Fällung nur unwesentlich. PEG kann als 50%-ige (w/v) Lösung oder als Festkörper eingesetzt werden.
Fällung von Nucleinsäuren
Proteinlösungen von Zellaufschlüssen, speziell von Bakterien und Hefen, enthalten große
Mengen von Nucleinsäuren (DNA und RNA). Da diese bei einer Proteinreinigung stören,
sollten sie abgetrennt werden. Nucleinsäuren sind hoch negativ geladene Polyanionen. Sie
können daher mit stark basischen Substanzen (Polyaminen, Polyethylenimin, etc.), aber auch
mit sehr basischen Proteinen (Protaminen) gefällt werden. Hierbei muss beachtet werden, dass
nicht gleichzeitig saure Proteine mit ausgefällt werden.