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Gentechnik und Enzymtechnologie 5. Proteinbasierte Techniken 10/5/2006 Gliederung • Grundlagen der Antigen-Antikörperreaktion • Herstellung monoklonaler Antikörper • Rekombinante Antikörper und Phage Display • PAGE und 2-D-Gelelektrophorese • Massenspektroskopie • Proteinsequenzierung • Proteinchips 5.1 Antigen-Antikörperreaktion Antikörper - Struktur Antigene und Epitope • Antigene: Körperfremde Moleküle, die von einem Antikörper erkannt werden • Epitop: Bestimmter Teilbereich eines Antigens (Protein, Nukleinsäure, Polysaccharide) der von der Antigenbindungsstelle des Antikörpers erkannt wird (=Paratop) • Nur bestimmte Bereiche eines Antigens lösen effektiv die Produktion von Antikörpern aus (immunodominante Regionen) Paratop Epitop Antikörperspezifität • Spezifität: Antikörper erkennt spezifisch ein bestimmtes Antigen „passt gut“ „passt schlecht“ Antigenbindungsstelle Epitop starke Anziehung geringe Abstossung geringe Anziehung starke Abstossung Antikörperaffinität • Affinität: Stärke der Bindung zwischen einer Antigenbindung und dem Antigen Affinität = Anziehungskräfte - Abstoßungskräfte Hohe Affinität - starke Bindung „passt gut“ Geringe Affinität - schwache Bindung „passt schlecht“ Affinität <-> Avidität • Affinität: Stärke der Bindung zwischen einer Antigenbindungsstelle und einem Epitop • Avidität: Stärke der Bindung zwischen einem multivalenten Antikörper und einem multivalenten Antigen Die antigene Erbsünde • 2. Antikörperantwort kann nur mehr auf solche Epitope reagieren, die bereits bei der 1. Immunantwort vorhanden waren. • Sich schnell verändernde Viren (HIV, Influenza) ändern stetig ihre Epitope; auf neue Epitope des selben Krankheitserregers reagiert des Immunsystem unterdurchschnittlich 5.2 Polyklonale und Monoklonale Antikörper Polyklonale Antikörper • Bei einer ersten Infektion werden vom Immunsystem i.R. mehrere Epitope erkannt => resultierende Antikörper stellen eine Mischung aus Antikörpern unterschiedlicher Spezifität dar • Polyklonale Seren lassen sich aus Tieren (Kaninchen, Schaf, Ziege, Pferd) nach Antigengabe und Blutentnahme gewinnen • Die Aufreinigung erfolgt durch Fällung, chromatographische Verfahren oder bei Bedarf an hochreinen Präparaten über Affinitätschromatographie mit dem Protein A (Staphylococcus aureus) • Antikörperfraktion wird steril abgefüllt und lyophilisiert (Trocknen im Vakuum) => gekühlt mehrere Jahre haltbar • GMP (Good manufacturing practice) Kommerziell gewonnene polyklonale Antikörper Antikörper gewonnen aus Tetanus-Antitoxin Pferdeserum Schlangengift-Antiseren Pferdeserum Masernvirus-Immunglobulin menschliches Serum Immunglobulin G menschliches Serum Probleme mit polyklonalen Antikörpern • Tier-Antikörper werden vom Immunsystem des Patienten als fremd erkannt und es werden Antikörper produziert (v.a. beim zweiten Kontakt) • Bei Verwendung humaner Seren besteht die Gefahr der Übertragung von Krankheiten (HIV, Hepatitis C, u.a.) • Polyklonale Antiseren zeigen häufig Kreuzreaktivitäten Entwicklung monoklonalen Antikörpern • Faktoren für die Vermehrung von B-Zelle im Reagenzglas waren nicht bekannt • Multiples Myelom: Tumorerkrankung, die B-Zellen oder Plasmazellen betrifft => Große Mengen eines Antikörpers werden produziert • 1975: Cesar Milstein und Georges Köhler fusionieren erfolgreich eine Maus-MyelomZelle mit B-Zellen, die sie nach der Immunisierung einer Maus mit einem bestimmten Antigen gewonnen hatten. • Antikörper mit definierter Spezifität und Affinität waren von nun an in unbegrenzrten Mengen herstellbar Produktion monoklonaler Antikörper Selektionsmechanismus • Milstein und Köhler haben eine Myelomzelllinie erzeugt, die aus extern zugegebenem Hypoxanthin keine Purine mehr synthetisieren konnte (Enzymdefekt). • Normalerweise ist dieses Enzym nicht nötig, da Säugerzellen auch auf einem alternativen Weg Purine synthetisieren können. • Die Verbindung Aminopterin blockiert diesen Weg aber => Zellen sind auf den Hypoxanthin-Weg angewiesen • HAT-Medium enthält (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) • Myelomzelle kann wegen Aminopterin auf normalem Weg keine Nukleotide herstellen; Da auch die Nutzung von Hypoxanthin wegen des Enzymdefektes ausfällt => kein Wachstum auf HAT • Milzzellen können nicht auf Nährmedien kultiviert werden => kein Wachstum auf HAT • Hybridomzellen wachsen auf künstlichen Nährmedien und können den Aminopterin-Block durch Nutzung von Hypoxanthin umgehen => Wachstum auf HAT Immunoassay Großtechnische Produktion von mAK • Zur Gewinnung großer Mengen mAK werden Hybridoma-Zellen in Bioreaktoren in einem komplex zusammengesetzten Medium gezüchtet (Glucose, Glutamin, fötales Kälberserum - Cytokine u. Wuchsstoffe) Anwendung von Antikörpern • Western-Blot • In situ Immunlokalisation • Antigennachweis im Mikrotiterplattenformat (ELISA, RIA, EIA) nach Konjugation mit Markermolekülen (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme) • Therapeutische Antikörper • Katalytische Antikörper: Abzyme 5.3 Kombinatorische Antikörper Antikörpervariation • Gene für die V-Domäne der Antikörperketten liegen zunächst (embryonale DNA) in mehreren unterschiedlichen Ausführungen zur Verfügung. • Bei der Entwicklung von B-Zellen wird willkürlich eine Ausführungsform ausgewählt und mit dem Gen für die C-Domäne verknüpft. Embryonale Zellen: Reife B-Zellen: • Zwei unterschiedliche V-Domänen-Varianten => 2 reife B-Zellen, die zwei unterschiedliche Antikörper produzieren L-Kettenvariation • In embryonalen Zelle finden sich etwa 150 verschiedenen VAbschnitte für die L-Kette • Zusätzlich finden sich 5 etwa 40 Basenpaare lange Abschnitte, die als J(oining)-Abschnitte bezeichnet werden (ebenfalls unterschiedlich) • Während der B-Zell-Reifung werden durch ortsspezifische Rekombination willkürlich ein V- mit einem J- und schließlich mit einem C-Segment verknüpft. H-Kettenvariation • In embryonalen Zellen finden sich etwa 200 verschiedenen VAbschnitte für die H-kette • 50 sogenannte D(iversity)-Abschnitte werden durch ortsspezifische Rekombination bei der B-Zellreifung mit einem der V und einem der 4 J(oining) - Abschnitte verknüpft Antikörpervariation L-Kette: H-Kette: • 150 V-Segmente • 5 J-Segmente • 3 Leserahmen für jede V- und J-Kettenverknüp. • • • • 200 V-Segmente 50 D-Segmente 4 J-Segmente 3 Leserahmen für jede V- und J-Kettenverknüp. • 2250 verschiedene L-Ketten • 120.000 Ketten verschiedene Kombinatorische Möglichkeiten (Komplexität): • 2250 x 120.000 = 2,7 x 108 Kombinationsmöglichkeiten H- Humanisierte Antikörper • Seit der ersten Herstellung von monoklonalen Ak wurde viel Hoffnung auf diese Moleküle zu Therapie von Erkrankungen gesetzt (smart bombs oder Lenkwaffen der Biotechnologie) • Hohe Spezifität der Antikörper erlaubt einen spezifischen Angriff auf entartetes Gewebe • Antikörper entfalten keine Eigenwirkung sondern lenken die Aufmerksamkeit des körpereigenen Immunsystems auf die Tumorzelle • Primärtumor und Metastasen gleichen sich molekularbiologisch kleinste Metastasen können von monoklonalen Antikörpern aufgespürt werden. • Bis 1994 wurde nur ein einziger monoklonaler Antikörper zur Therapie zugelassen • Probleme: Maus-Ak Immunreaktion aus lösen im menschlichen Körper eine Chimäre und humanisierte Antikörper: • Chimäre Antikörper: V-Domänen des Antikörpers stammen noch von der Maus, die C-Domänen von einem menschlichen Antikörper • Humanisierte Antikörper: CDR-Bereiche der V-Domänen des Antikörpers stammen noch von der Maus, Rest der V-Domänen und die C-Domänen von einem menschlichen Antikörper Humane Antikörper beliebiger Spezifität • Zellkultur von menschlichen Lymphozyten in Gegenwart eines Antigens und passender Wachstumsfaktoren (in-vitroImmunisierung) • Expansion und Antikörperproduktion menschlicher Lymphozyten in der Milz immundefizienter Mäuse. • Herstellung rekombinanter humaner Immunglobuline, die die Antigenbindungsstellen muriner Antikörper tragen (grafting) Therapeutische Antikörper: • Mittlerweile 15 therapeutische Antikörper in Europa zugelassen Therapeutische Antikörper: Markt für Therapeutische Antikörper: • Rekombinante Antikörper stellen eines der am dynamischsten wachsenden Segmente im Bereich rekombinante Therapeutika dar. Frost & Sullivan Report 3884 (04/03) Weltmarkt für therapeutische Antikörper Frost & Sullivan, BancBoston 11/2000 Herstellung kombinatorischer Ak-Banken • cDNA aus immunisierten Versuchstieren (Lymphozyten der Maus) oder naive menschliche B-Lymphozyten • Gene für die L- und H-Ketten über Reverse Transkription und PCR gewonnen Î Expressionsvektor • Solche Genbanken repräsentieren die gesamte Antikörpervielfalt der Ausgangsnukleinsäure (AntikörperBibliothek) • Ganze IgG-Antikörper lassen sich in eukaryotischen Zellkulturen, mit Baculoviren, in der Milch transgener Tiere und in transgenen Pflanzen (Plantibodies) herstellen Single-chain-Antikörper • In Bakterien werden dabei meist die Gene für VH und VL kombiniert und exprimiert (single-chain Antikörper - scFv) • Selektion auf antigenbindende scFvs ist in solchen Systemen oft schwierig Antikörper-Genbibliotheken • Natürliche Antikörperbibliothek: Von natürlichen Antikörpergenen abgeleiteten Bibliothek • Synthetische Antikörperbibliothek: Großteil des Antikörpers konstant; nur aneiner Stelle (z.B. CDR3) werden alle möglichen Zufallssequenzen eingebaut Filamentöse Bacteriophagen (M13, fd, f1) • Filamentöse Phagen weisen ein einzelsträngiges DNA-Genom auf und infizieren E. coli Zellen mit einem Sex-Pilus („männliche“ E. coli Zellen) Phagen-Display-Technik • c-DNA-Antikörperbibliothek in speziellem Expressionsvektoren, der in E. coli propagiert werden kann Phage-Display: Klonierung und Screeningtool • Wie beim ELISA können die Bacteriophagen in einer Mikrotiterplatte immobilisierte Antigene erkennen Î gebundene Phagen werden immobilisiert („Panning“) Phage-Display: Klonierung und Screeningtool Weitere kombinatorische Modifikationen • Bispezifische Antikörper: Zwei Antigenbindungsstellen, die über einen Linker verbunden sind • Bifunktionelle Antikörper: Neben einer Antigenbindungsstelle ist noch eine weitere Proteindomäne mit einer anderen Funktion vorhanden • Abzyme (katalytische Antikörper): Immunisierung eines Versuchstieres mit dem Übergangszustand einer Enzymreaktion => katalytisch aktive Antikörper (3-D-Struktur weist Ähnlichkeiten zu aktivem Zentrum auf) 5.4 Proteinreinigung Reinigung von Proteinen • Zunächst müssen die Zellen, die das gewünschte Protein enthalten aufgeschlossen und homogenisiert werden (Prozedur abhängig vom Zelltyp) • Fällung der Proteine mit verschiedenen Reagenzien (z.B. mit Ammoniumsulfat, Aceton oder Trichloressigsäure) => ziemlich unspezifisch, aber für erste Vorreinigung geeignet; • Chromatographische Trennverfahren: Auftrennung (Fraktionierung) der Proteine in einer Säule, die mit einem porösen oder nichtporösen, festen Füllstoff (Matrix) gefüllt ist. • Auftrennung erfolgt durch unterschiedliche Interaktion der Proteine mit der Säulenmatrix Chromatographie Probe auftragen Kontinuierlicher Fluss an Lösungsmittel aus einem großen Resevoir feste Matrix poröse Engstelle Reagenzgefäß Zeit Fraktionierte Proteine (eluiert + gesammelt) Arten der Chromatographie • Verwendete Matrix bestimmt das Trennprinzip • Gelpermeationchromatographie: Größe • Adsorptionschromatographie: hydrophile/hydrophobe Wechselwirkung • Ionenaustauschchromatographie: Ladung • Chromatofokussierung: isoelektrischer Punkt • Affinitätschromatographie: Bindung an einen speziellen Liganden Füllmaterialien • Partikel aus unterschiedlichen Polymeren werden als Füllmaterial verwendet (z.B. modifizierte Cellulose, Polyacrylamid oder Hydroxyapatit) • Partikelgröße (3 - 100 µm) Porengröße (10 - 100 nm) Funktionelle Gruppen • Funktionelle Moleküle werden an die Polymere gebunden => Festlegung des Trennprinzips Affinitätschromatographie • Immobilisierung eines Liganden an der polymeren Matrix => hochspezifische Interaktion zwischen Zellprotein und Ligand • Anschließend kann das Protein wieder vom Liganden gelöst werden Proteinreinigung Ionenaustausch-C. Fraktion poolen + auf nächste Säule Gelpermeations-C. relative Menge Fraktion poolen + auf nächste Säule Affinitäts-C. Fraktionen Adsorptionschromatographie • Traditionell verwendete Matrixmaterialen (Cellulose, Kieselgel) sind aufgrund von Hydroxylgruppen polar • Verethert man diese Hydroxylgruppen mit Alkylresten (C2 – C18) Î apolare Trägermaterialien (Reversed-Phase-Chromatographie) • In einem polaren Laufmittel werden die Peptide/Proteine durch hydrophobe Interaktionen festgehalten zu trennenden in der Matrix • Elution erfolgt meist in einem Polaritätsgradienten (Mischung eines polaren mit apolarem Elutionsmittel) Î Verdrängung des Proteins/Peptids durch das immer apolarer werdende Laufmittel • Anwendung der Reversed-Phase Chromatograpie ist eng mit der Entwicklung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verknüpft HPLC • Inhomogenitäten in der Matrix beschränken die Auflösung von Chromatographieverfahren => Kein gleichmäßiger Fluss durch die Säule • Fließgeschwindigkeit in konventionellen Chromatographiesystemen niedrig (1 Säulenvolumen/h), damit sich zwischen den großen Matrixpartikeln und dem Lösungsmittel ein Gleichgewicht einstellen kann. • Säulen werden mit winzigen Partikeln (3 - 10 µm) hergestellt und unter Druck gepackt => extrem gleichmäßige und dichte Matrix => gleichmäßige Fließgeschwindigkeit => hohe Trennschärfe • Hoher Druck nötig, um Lösungsmittel durch das Säulenmaterial zu drücken => Fließgeschwindigkeit 1 Säulenvolumen / min • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) HPLC • Miniaturisierung der Chromatographiesäulen (Verkleinerung Flussrate und Säuleninnendurchmesser – 100 – 300 µm) • Kombination Koppelung von HPLC und Massenspektrometrie der (LC/MS- 5.5 Proteomanalyse HUGO => HUPO: • G. Venter: „Wir müssen uns von der Vorstellung verabschieden, dass ein Gen eine Krankheit auslöst“ • HUGO: Human Genome Organisation; HUPO: Human Proteom Organisation Proteomics: • Proteom: Gesamtheit der einer Zelle, einem Gewebe oder einem Gesamtorganismus vorhandenen Gene • Proteomics: Systematische Identifizierung und funktionelle Charakterisierung sämtlicher Proteine einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus • 35.000 – 40.000 Genen stehen 100.000 – 1.000.000 Proteine gegenüber Proteinnetzwerke (A) Störung der Proteininteraktionen durch eine einer Gal4-Deletionsmutante in einem Protein-Netzwerk. Kreise symbolisieren die die Gene; Gelbe Pfeile: Protein am Anfang des Pfeils beeinflusst Transkription des Proteins am Pfeilende; Blaue Linie: Physische Interaktion zwischen Proteinen. Kreisdurchmesser = Stärke der Veränderung; (B)Galactose-Abbau und (C) Aminosäuresynthese im Detail. Proteomics - Markt: • Erste Proteomics-basierte Medikamente frühestens 2005 • Zulieferer für Proteomics dürften deutlich früher profitieren • Frost & Sullivan: Weltmarkt für Proteomics-Ausrüster betrug 2002 bereits > 2 Mrd. US-$; Wachstumsrate 40 % Oxford Glycosciences: Führend bei 2-D Elektrophorese von Proteinen; Applied Biosystems: Weltmarktführer Sequenziermaschienen; Produzent von Massenspektrometern; SDS-PAGE • SDS („sodium dodecyl sulfate“/Natrium-Laurylsulfat) lagert sich an hydrophobe Teile des Proteins an => Oligomere werden getrennt, globuläre Proteine werden gestreckt und erhalten eine negative Nettoladung • Verbleibende Disulfidbrücken werden durch Verbindung (ß-Mercaptoethanol) gespalten. eine reduzierende • Polymerisierung von Acrylamidmonomeren sorgt für die Ausbildung eines eng vernetzten Gels (Polyacrylamid-Gel). • Langgestreckte, negativ geladene Proteine werden abhängig von ihrer Größe im elektrischen Feld aufgetrennt • Die Färbung der Proteinmoleküle erfolgt mit Coomassie-BrilliantBlau oder einer sensitiveren Silberfärbung ( 1 - 10 ng Protein detektierbar) SDS-PAGE - Ablaufschema Prinzip, Ablauf und Ergebnis einer SDS-PAGE (Taschenatlas der Biochemie, 3. Aufl., Koolman und Röhm; S 78. Abb. D) 2D-Gelelektrophorese • Von Patrick O‘Farrell voneinander entwickelt. und Joachim Klose 1975 unabhängig • Proteine werden mit ß-Mercaptoethanol Harnstoff und einem ungeladenen Detergens behandelt => Oligomere werden vereinzelt; Proteinketten gestreckt; Ladungen bleiben erhalten. 1 Isoelektrische Fokusierung: Auftrennung nach isoelektrischem Punkt eines Proteins (= Nettoladung 0) 2 SDS-PAGE: Auftrennung nach Masse eines Proteins Scheren für Proteine: Proteasen • In der Regel sind ganze Proteine zu groß für eine Analyse in einem Stück => Gezieltes Zerlegen in Peptide mit spezifisch schneidenden Proteasen Enzym Aminosäure 1 Aminosäure 2 Trypsin Lys oder Arg beliebig Chymotrypsin Phe, Trp oder Tyr beliebig V8-Protease Glu beliebig Met beliebig beliebig Cys Chemikalien Cyanogen-Bromid 2-Nitro-5-Thiocyanobenzoat Spotanalyse mit Massenspektrometrie 2-D-Gelelektrophorese Einzelspot wird aus dem Gel ausgeschnitten Protein wird durch einen Proteaseverdau zerkleinert Untersuchung der Peptide mit Massenspektrometrie (z.B. MALDI-TOF) Abgleich mit einer Proteindatenbank Identifikation und Isolierung des zugehörigen Gens Proteinsequenzierung mit Massenspektrometrie Protein wird von anderen Proteinkomponenten getrennt (z.B. HPLC, Säulenchromatographie) Trypsinverdau des gereinigten Proteins Erste Runde im Massenspektrometer trennt Peptidfragmete auf Ein Fragment wird Peptidbindung für Peptidbindung verkürzt Massen der gebildeten Fragmente werden mit einem zweiten gekoppelten Massenspektrometer bestimmt N-terminale Leitersequenzierung • Edman-Abbau (klassische Peptidsequenzierung): N-terminale Aminosäure wird derivatisiert, abgespalten und als Phenylthiohydantion-(PTH-)Aminosäure über HPLC identifiziert • Anschließend wird der Zyklus wiederholt bis das gewünschte Peptid sequenziert ist • Peptide ladder sequencing mit einem Massenspektrometer • Mischung aus 5 % Phenylisocyanat (PIC) mit 95 % Phenylisothiocyanat (PITC) sorgt für die Erzeugung von Peptiden, die sich um eine As unterscheiden N-terminale Leitersequenzierung Schritte der Proteomanalyse Dickdarm mit Polypen übersät gesunder Dickdarm Proteinextraktion, Fraktionierung, Probenherstellung 2-D Gelelektrophorese, Proteinfärbung Proteinmuster: Scannen, Bildanalyse, Standardisierung, Auswertung Proteomdatenbank, Bioinformatik Spotpicken (Roboter) Proteinverdau, Probenpräparation Schritte der Proteomanalyse Proteinverdau, Probenpräparation Massenspektrometrie, Auswertung der Peptidmassenprofile, Proteinidentifizierung „protein sequence tags“ in Proteomdatenbank, Bioinformatik Markerprotein für bestimmte Krankheit 5.6 Proteomanalyse - Von der Struktur zur Funktion Von der Struktur zur Funktion • Sequenzabgleich (Proteine + Nukleinsäuren) mit öffentlich zugänglichen Datenbanken (BLAST und FASTA) => Sequenzähnlichkeiten mit Proteinen bekannter Funktion. • Herstellung von Fusionsgenen, die für Reporterproteine codieren („Epitop-tagging“ - z.B. Glutathion-S-Transferase oderGreen Fluorescent Protein - GFP) => Expression und Lokalisation in der Zelle • Gezieltes Ausschalten eines Genproduktes in einem transgenen Tier (Knock-outMaus) => Funktion eines Genproduktes im lebenden Tier. RNA-Interferenz • Doppelsträngige RNA wird in Eukaryonten durch das Enzym Dicer in kleine dsRNAFragmente verdaut (si-RNA) • si-RNA wird vom RISC zu komplementären mRNA-Molekülen geleitet Î Degradation • Zellen selbst können sogenannte miRNAs transkribiern, die ähnlich prozessiert werden und eine Translationsinhibition verursachen • Moderne Vektorsysteme erlauben die Verwendung beliebiger Sequenzen und eine stabile und dauerhafteExpression der siRNA Wer mit wem schlief ? • Fluorescence resonance energy transfer (FRET): Zwei Proteine werden mit zwei GFPVarianten fusioniert. Lichtemission des ersten fluoreszierenden Proteins überlappt mit dem Absorptiosspektrum des zweiten GFP => Bei engem räumlichen Kontakt (Interaktion) kann durch Anregung des ersten GFP eine Fluoreszenz des zweiten GFP erzielt werden. • Protein-Affinitätschromatographie: Protein, zu dem Interaktionspartner gesucht werden, wird auf Säule immobilisiert => alle interagierenden Moleküle werden gebunden und können charakterisiert werden • Co-Immunpräzipitation: Fest gebundene Proteine können mit einem Antikörper copräzipitiert,isoliert und charakterisiert werden. Yeast-Two-Hybrid-System (Y2H) • Transkriptionsaktivatoren sind bimodular aufgebaut Bindungs-Modul + RNA-Polymerase-Bindungsmodul) (DNA- • Gen für ein Protein, für das Interaktionspartner gesucht wird, wird mit der DNA-bindenden Region eines Transkriptionsaktivator fusioniert (Köder; „bait“). • Gene aus einer c-DNA-Klonbank werden mit dem Gen für die RNAPolymerase-Bindungsdomäne des selben Transkriptionsfaktors fusioniert => Fusionsprotein mit einer transkriptionsaktivierenden Domäne (Beute; „prey“) • Haploide Hefezellen, die die Information für das Köderfusionsprotein tragen, werden mit haploiden Hefezellen gekreuzt, die eines der Beutefusionsproteine exprimieren => Tochterzellen exprimieren beide Proteine => Bei Interaktion wird das Reportergen abgelesen Yeast-Two-Hybrid-System (Y2H) • Als Reporterproteine finden Enzyme Verwendung, die ein farbiges Substrat produzieren oder solche, die einen Stoffwechseldefekt wieder beheben • Das Verfahren ist sehr robust, eignet sich für das Screening ganzer Genbanken und ist leicht automatisierbar. Protein Interaction Maps Darstellung der Protein-Protein-Interaktionen zwischen verschiedenen funktionellen Gruppen von Hefeproteinen. Jeder Strich bedeutet mindestens 15 oder mehr Interaktionen zwischen den Gruppen Protein-Protein-Interaktion - weiter Methoden • Reverse Two-Hybrid-Technologie: Screening-System, dass das Auffinden von Stoffen erlaubt, die für eine Unterbrechung der Interaktion sorgen. • Viele Protein-Proteininteraktionen sind nur kurzzeitig => werden von Y2H oder anderen Methoden nicht erkannt • Die SPR-Technik (surface plasmon resonance) erlaubt es auch kurzzeitige Protein-Interaktionen zu erkennen. • Methode der Zukunft ist der Proteinarray, bei dem bis zu 1000 Proteine auf einem kleinen Glasträger immobilisiert werden können • DNA-Protein-Interaktionen können Techniken untersucht werden mit DNA-Footprinting- Surface Plasmon Resonance • Trifft polarisiertes Licht einer definierten Wellenlänge auf eine dünne Metallfolie, so werden die freien Elektronen in Schwingung versetzt • Die oszillierende Elektronen (Plasmonen) bewegen sich parallel zur Metalloberfläche Î produzieren ein elektrisches Feld, dass über die Goldoberfläche hinauswirkt (evaneszentes Feld) • Anregungslicht wird über ein Prisma auf die Metallfolie geleitet • Die Intensität, des in einem bestimmten Winkel reflektierten Lichtes, weist ein Minimum bei dem Winkel auf (Resonanzwinkel), bei dem die SPR erfolgt • Photodiode kann sowohl den Winkel des emittierten Lichtes als auch die Intensität messen • Umgebung, die sich in dem evaneszenten Feld befindet beeinflusst den Resonanzwinkel • Befindet sich innerhalb des evaneszenten Feldes ein immobilisiertes Protein Î Bindung eines Liganden an das Protein Î Änderung des Resonanzwinkels Surface Plasmon Resonance Surface Plasmon Resonance • Bindung verändert Intensität/Winkel des reflektierten Lichtes Î keine Markierung nötig • Resonanzwinkel verändert sich sofort bei der Bindung Î On-lineMessung möglich • Auch transiente Bindungen werden erfasst • Zeitaufgelöste Analyse der Änderung des Resonanzwinkels ermöglicht die Erfassung der Bindungskinetik dieses Vorgangs • Sensitivität der Technik ist sehr hoch • Auch Interaktionen mit kleine Moleküle (bis zu Monosacchariden) sind möglich 5.7 Proteinarrays Proteinarrays - Marktentwicklung Weltumsatz - Proteinchips bis 2007 (Frost&Sullivan 06/2002) 800 665,9 150 528,9 600 406,6 297,4 400 200 100 82,7 19,6 41,2 169,7 50 0 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Umsatz in Millionen US-$ Umsatzw achstum in % Proteinarrays • Definition: Möglichst großer Satz an verschiedenen Proteinen wird rasterartig auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert (stark miniaturisierte und hochparallele Analyse von Proteininteraktionen) • Einteilung: • Protein-Expressions-Arrays: Hochaffine Capture Proteine (i.R. Antikörper) werden benutzt um in komplexen Stoffgemischen Vorkommen und Konzentration von Analyten zu messen • Protein-Funktion-Arrays: Verschiedene Proteine oder Proteindomänen auf der Oberfläche interagieren mit bekannten Analyten (neue Protein-Protein-WW, Medikamenten-WW, Substratumsetzungen, DNA-Bindungsdomänen) Proteinarrays - Immobilisierung • Ziel: möglichst viele Proteine in aktiver Form fest immobilisieren, geringes Signal/Rauschen-Verhältnis, Nutzung herkömmlicher Arrayer und Reader • Immobilisierung: • Diffusion in Polyacrylamid- und Agarosegele (Hydrogel) • Adsorption an Nitrozellulose) Glasoberfläche (PVDF, Poly-L-Lysin, • Bindung an funktionalisierte Glasoberfläche (Silane, Aldehyde, etc.) Î geringes Signal/Rauschen-Verhältnis • Affinitätst-tags: Fusionsproteine (z.B. GST, His-Tag) Proteinarrays - Immobilisierung Proteinarrays – Kovalente Bindung • Gerichte Immobilisierung auf Glasoberflächen: • Funktionalisierung • Aktivierung • Immobilisierung Proteinarrays – Detektion • Markierungen: • Fluoreszenzmarkierung • Radioaktive Markierung • Enzymmarkierung Proteinarrays – Detektion • Markierungsfreie Systeme: • SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization): • Auch: „Atomic Force“-Mikroskop oder Surface Plasmon Resonanz High Throughput Protein Production • Herstellung von His- Tag- FusionsProteinen – His Tag dient dabei: • Als Marker einer „inframe“ Fusion • Zur Aufreinigung des Proteins • Zur Immobilisierung auf Array • Erste in vitro Systeme – PISA (Protein In Situ Array) Produktion und Immobilisierung in einem Schritt PISA (Protein In Situ Array) Anwendungen funktioneller Chips • Erster Proteom Chip (2001): – 94% der Hefe ORFs in Proteine translatiert und auf Ni-NTA beschichteten Glasträger aufgetragen – Markiertes Calmodulin über Chip laufen lassen • Reguliert viele Pathways • Es wurden neben schon bekannten Bindungspartnern 33 neue gefunden Anwendung von Proteinarrays • Anwendungen dieser Technologie liegen im Bereich Diagnostik und beim Studium von Protein-Protein-Wechselwirkungen (v.a. bei HTP: high throughput processing - Anwendungen)
