Dissertation von VictoriaStanuch

Vergleichende immunhistochemische Analyse der
M2-Makrophagenmarker CD163 und CD206 in oralen
Plattenepithelkarzinomen
Der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent.
vorgelegt von
Victoria Stanuch
aus
Nürnberg
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
07. September 2015
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. med. Dr. h. c. Jürgen Schüttler
Gutachter:
PD Dr. Dr. F. Wehrhan
Prof. Dr. Dr. Dr. F. Neukam
Meinen Eltern in
Liebe und Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung ............................................................................................ 1
2
Einleitung ........................................................................................................... 5
2.1 Klinischer Hintergrund ................................................................................... 5
2.2 Stand der Forschung ..................................................................................... 7
2.2.1 Das orale Plattenepithelkarzinom (OSCC) .............................................. 7
2.2.1.1 Ätiologie und Risikofaktoren ............................................................. 7
2.2.1.2 TNM- Klassifikation .......................................................................... 9
2.2.1.3 Therapie und Prognose ...................................................................10
2.2.2 Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM) .................................................12
2.2.2.1 Makrophagenpolarisation ................................................................12
2.2.2.2 M2-Makrophagenphänotyp ..............................................................13
2.2.2.3 Monozyteninfiltration und TAM-Entstehung .....................................13
2.2.2.4 Aufgaben der TAM ..........................................................................15
2.2.3 Makrophagenmarker ..............................................................................17
2.2.3.1 Das Oberflächenantigen CD68 ........................................................17
2.2.3.2 Der Makrophagen-Scavengerrezeptor CD163 .................................18
2.2.3.2.1 Aufbau ......................................................................................18
2.2.3.2.2 Vorkommen ..............................................................................19
2.2.3.2.3 Aufgaben ..................................................................................19
2.2.3.2.4 Regulierung ..............................................................................21
2.2.3.3 Der Mannoserezeptor CD206/MRC1 ...............................................22
2.2.3.3.1 Aufbau ......................................................................................22
2.2.3.3.2 Vorkommen ..............................................................................23
2.2.3.3.3 Aufgaben ..................................................................................23
2.2.3.3.4 Regulierung ..............................................................................25
2.2.4 TAM als prognostische Tumormarker ....................................................25
2.3 Ziele der Arbeit und Fragestellung ................................................................28
3
Material und Methode ......................................................................................29
3.1 Material ........................................................................................................29
3.1.1 Geräte....................................................................................................29
3.1.2 Verbrauchsmaterialien ...........................................................................31
3.1.3 Reagenzien............................................................................................32
3.1.4 Puffer und Lösungen..............................................................................33
3.1.5 Antikörper ..............................................................................................34
3.1.6 Software ................................................................................................35
3.2 Methode .......................................................................................................36
3.2.1 Patienten- und Probenauswahl ..............................................................36
3.2.2 Aufbewahrung........................................................................................37
3.2.3 Schneiden der Proben am Rotationsmikrotom .......................................37
3.2.4 Aufziehen und Trocknen der Paraffinschnitte .........................................37
3.2.5 Entparaffinieren der Paraffinschnitte ......................................................38
3.2.6 Immunhistochemische Nachweisreaktion ..............................................38
3.2.6.1 LSAB-Methode ................................................................................38
3.2.6.2 Immunhistochemische Färbung .......................................................39
3.2.7 Eindecken der gefärbten Proben............................................................40
3.2.8 Quantitative immunhistochemische Analyse ..........................................41
3.2.9 Statistische Analyse ...............................................................................43
3.2.10 Visueller Vergleich der Marker CD163 und CD206/MRC1 ...................43
3.2.11 Ethische Genehmigung .........................................................................44
4
Ergebnisse ........................................................................................................45
4.1 Korrelation der Marker CD163 und MRC1 in LK-Präparaten ........................45
4.2 Korrelation der Marker CD68 und CD163 in LK-Präparaten .........................48
4.3 Korrelation der Marker CD68 und MRC1 in LK-Präparaten ..........................51
4.4 Korrelation der Marker CD68, CD163 und MRC1 in IFZ ...............................54
4.5 Ergebnis des visuellen Vergleichs der Marker CD163 und CD206/MRC1 ....57
5
Diskussion ........................................................................................................63
6
Literaturverzeichnis ...........................................................................................71
7
Abbildungsverzeichnis ......................................................................................87
8
Tabellenverzeichnis ..........................................................................................88
9
Abkürzungsverzeichnis .....................................................................................89
10
Danksagung....................................................................................................91
11
Curriculum vitae ..............................................................................................92
1
1
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: In der Literatur werden verschiedene Marker für M2polarisierte Makrophagen beschrieben. Häufig werden die Antigene CD163
und CD206/MRC1 zur Markierung von M2-Makrophagen herangezogen. Ziel
des vorliegenden Dissertationsprojektes war es, die Expression der beiden
M2-Makrophagenmarker CD163 und CD206/MRC1, sowie dem generischen
Makrophagenmarker CD68 zu vergleichen. Dabei wurde auch untersucht,
inwieweit
durch
anti-CD163
und
anti-CD206/MRC1
die
identische
Zellpopulation markiert wird.
Methoden: Es wurden Lymphknoten- (LK-) und Lymphknotenmetastasen(LKM-) Präparate von 34 Patienten mit T1 und T2 OSCC entnommen und
immunhistochemisch mit den Antikörpern anti-CD68, anti-CD163 und antiCD206 inkubiert. Die Proben wurden eingescannt und virtuell mikroskopiert.
Je Schnitt wurden drei repräsentative Gesichtsfelder des lymphatischen
Probengewebes ausgewählt und die Zellanzahl monozytärer Zellen/mm² in
den LK-Bereichen: Sinus, Perisinus, Sinus ges. und Interfollikuläre Zone
(IFZ)
quantitativ
und
statistisch
analysiert
und
der
Pearson-
Korrelationskoeffizient (r) berechnet. Die Marker CD163 und CD206/MRC1
wurden hinsichtlich der gefärbten Zellanzahl und Farbintensität verglichen
und eine digitale Überlagerung der Färbungen durchgeführt.
Ergebnisse: Die quantitative Auswertung der Marker CD68, CD163 und
CD206/MRC1 ergab in allen beschriebenen Fällen eine signifikante positive
lineare Korrelation. Die Korrelation der Marker CD163 und CD206/MRC1
ergab einen besonders starken Zusammenhang im Sinus ges. und es waren
stets mehr CD206/MRC1+ Zellen/mm² zu finden. Der Vergleich der Marker
CD68 und CD163 im Sinus ges. ergab eine moderate Korrelation. Im
Perisinus und Sinus ges. waren mehr CD68+ Zellen/mm² zu finden, im Sinus
mehr CD163+ Zellen/mm². Die Korrelation der Marker CD68 und
CD206/MRC1 ergab in allen Bereichen einen moderaten Zusammenhang. Im
Sinus und Sinus ges. war die CD206/MRC1+ Zellanzahl/mm² höher. Die
Korrelation der Marker in der IFZ war stets moderat. Die CD68+
2
Zellanzahl/mm² war im Vergleich zur CD163+ Zellanzahl/mm² fast 3,5-mal so
hoch und im Vergleich zur CD206/MRC1+ Zellanzahl/mm² mehr als doppelt
so hoch. Die Mittelwerte der CD163+ und CD206/MRC1+ Zellen waren
annähernd gleich. Die CD206/MRC1-Färbung ergab im Vergleich zur
CD163-Färbung in 97,22% eine höhere Zellanzahl und in einem Großteil der
Gesichtsfelder eine stärkere Farbintensität. Die digitale Überlagerung der
Färbungen zeigte Unterschiede hinsichtlich der gefärbten Zellpopulation.
Schlussfolgerungen: Eine hohe CD68-Expression ist mit einer hohen
Expression
der
M2-Makrophagenmarker
CD163
und
CD206/MRC1
assoziiert. Weiterhin sind die Marker CD163 und CD206/MRC1 durch ihre
stets positive lineare signifikante Korrelation vergleichbar. Steigt die
Expression eines Markers, steigt auch die Expression des jeweils anderen in
den untersuchten Proben. Es zeigen sich große Unterschiede hinsichtlich der
markierten Zellanzahl/mm² sowie der Färbung der identischen Zellpopulation
der Marker CD163 und CD206/MRC1. Um einen besseren Vergleich der
beiden Marker zu erhalten, wird die Durchführung von Doppelfärbungen
vorgeschlagen.
.
3
Summary
Objective:
Literature
describes
several
markers
for
M2-polarized
macrophages. The antigens CD163 and CD206/MRC1 are frequently used to
mark M2-macrophages. The goal of this thesis was to compare the
expression of both M2-macrophage markers CD163 and CD206/MRC1, as
well as the generic macrophage marker CD68. To what extend anti-CD163
and anti-CD206/MRC1 are marking the identical cell population was also
investigated.
Methods: Lymph node and metastatic lymph node samples were taken from
34 patients with T1 and T2 oscc and immunhistochemically incubated with
the antibodies anti-CD68, anti-CD163 and anti-CD206. The samples were
scanned and digitally microscoped. For each sample, three representative
visual fields of the lymphatic tissue samples were selected and the number of
cells with a monocytic lineage per mm² in the lymph node areas: sinus,
perisinus, entire sinus and interfollicular zone were quantitatively and
statistically analyzed and the Pearson correlation coefficient (r) was
determined. The number of stained cells and the color intensity of the
markers CD163 and CD206/MRC1 were compared and a digital overlap of
the staining was applied.
Results: In all observed instances the quantitative analysis of the markers
CD68, CD163 and CD206/MRC1 resulted in a significant positive correlation.
The correlation of the markers CD163 and CD206/MRC1 showed a particular
strong link within the entire sinus and here were always more CD206/MRC1+
cells per mm². The comparison of the markers CD68 and CD163 within the
entire sinus showed a moderate correlation. There was a higher number of
CD68+ cells per mm² present in the perisinus and the entire sinus, in the
sinus were more CD163+ cells per mm². The correlation of the markers
CD68 and CD206/MRC1 showed a moderate link in all areas of investigation.
The number of CD206/MRC1+ cells per mm² was higher in the sinus and the
entire sinus. The correlation of the markers in the interfollicular zone was
consistently moderate. The number of CD68+ cells per mm² was 3,5 times as
4
high as the CD163+ cell number per mm² and respectively more than twice
as high compared to CD206/MRC1+ cells per mm². The averages of CD163+
and CD206/MRC1+ cells were almost identical. The CD206/MRC1-staining
resulted in a 97.22% higher number of cells and a higher color intensity in the
better part of the visual fields compared to the CD163-staining. The digital
overlap of the stainings revealed differences of the stained cell population.
Conclusion: A high expression of CD68 is associated with a high expression
of the M2-macrophage markers CD163 and CD206/MRC1. The markers
CD163 and CD206/MRC1 are comparable due to their continuous significant
positive linear correlation. If the expression of one marker increases, the
expression of the other marker increases respectively in the analysed
samples. Significant differences in terms of number of cells per mm² and the
staining of the identical cell population of the markers CD163 and
CD206/MRC1 can be observed. To achieve more detailed results of
comparability of these two markers it is recommended to apply a method of
double-staining.
5
2
Einleitung
2.1 Klinischer Hintergrund
Das orale Plattenepithelkarzinom (OSCC) gehört weltweit zu den acht
häufigsten malignen Tumoren und ist die am häufigsten vorkommende
maligne orale Neoplasie [68,167,214]. Die Entstehung unterliegt einem
komplexen Prozess in Abhängigkeit verschiedener endogener und exogener
Faktoren [68,198]. Diagnostiziert wird das OSCC meist in fortgeschrittenen
Stadien [25,167,202]. Das Vorkommen von Lymphknotenmetastasen ist der
stärkste prognostische Faktor des OSCC ([50]; [204] zitiert nach [206]). In
50% der Fälle sind sie bereits zum Zeitpunkt der Diagnose vorhanden ([189]
zitiert
nach
[39]).
Die
schlechte
Prognose
und
geringe
Überlebenswahrscheinlichkeit ([189] zitiert nach [39]) sowie die steigende
Inzidenz [25,90,140] zeigen die Notwendigkeit einer frühzeitigen Diagnose.
Auch das Erlangen eines genauen Verständnisses der Tumorimmunologie
des OSCC gewinnt an Bedeutung, denn wie in der Literatur beschrieben,
spielt
sie
eine
wichtige
Rolle
bei
der
Lymphknotenmetastasierung
[94,110,152]. Um ein OSCC sicherzustellen, bedarf es immer einer Biopsie
und einer histologischen Untersuchung ([168] zitiert nach [11]). Hierzu gehört
zur
Grundlage
gewonnenem
der
Tumordiagnostik
Probenmaterial
in
die
Bewertung
einem
von
operativ
formalinfixierten
und
paraffineingebetteten Zustand [211]. Anhand dieser Proben kann auch an
der Tumorimmunologie geforscht werden. Ein besonderes Augenmerk wird
hier auf tumor-assoziierte Makrophagen (TAM) gerichtet. Sie sind die im
Tumorstroma am häufigsten vorkommenden Immunzellen ([110,145,150]
zitiert
nach
[183])
und
spielen
in
der
Tumorimmunologie
und
Tumorentwicklung eine entscheidende Rolle. Die Immunsuppression, das
Tumorwachstum,
die
Tumorausbreitung,
die
Neoangiogenese
und
Metastasierung werden von ihnen beeinflusst [72,176]. Eine hohe Anzahl an
TAM im Tumorgewebe wird mit einer höheren Rezidivrate und einer
schlechteren Prognose assoziiert [94,121,183]. Um TAM zu identifizieren,
werden
in
spezifische
der
Immunhistopathologie
Oberflächenantigene
der
Antikörper
TAM
eingesetzt,
binden
und
die
an
durch
6
immunhistochemische
Färbungen
sichtbar
gemacht
werden
können
[36,44,96,105,120]. Die meisten TAM zeigen M2-Charakteristika und können
durch die M2-makrophagenspezifischen Oberflächenantigene CD163 und
CD206/MRC1 identifiziert werden [76,94,112,176]. Durch CD68 werden
Makrophagen mit sowohl M1- als auch M2-Phänotyp markiert [52,101,103].
Studien zeigten, dass bei Gewebeproben mit starker CD163-Expression
unterschiedlicher Tumoren eine höhere Rezidivwahrscheinlichkeit und eine
kürzere Überlebenswahrscheinlichkeit besteht [28,88,94,169,183,200,218].
Diese Daten sind ein Hinweis darauf, dass nicht die absolute Zahl der
tumorinfiltrierenden Makrophagen, sondern deren Polarisation und damit
deren Zytokinprofil, sowie deren Wechselwirkungen mit Tumorzellen für die
Prognose von Tumoren von Bedeutung sind. Es ist naheliegend, dass durch
ein genaueres Verständnis der Makrophagenpolarisation in humanen
Tumoren wichtige neue Einsichten in die Tumorimmunologie gewonnen
werden können. Die Makrophagenpolarisation sollte besonders in oralen
Plattenepithelkarzinomen Beachtung finden, da in diesen im Gegensatz zu
vielen anderen soliden Tumoren die Makrophagenpolarisation in Richtung
eines M2-Makrophagenphänotyps noch weitestgehend ungeklärt ist.
Durch
den
differenzierten
Vergleich
der Wertigkeit der beiden
zu
untersuchenden M2-Marker CD163 und CD206/MRC1 im immunhistochemischen Einsatz wird ein Gewinn an methodischem Wissen erwartet, von
dem künftige Projekte auf diesem Gebiet profitieren würden.
7
2.2 Stand der Forschung
2.2.1 Das orale Plattenepithelkarzinom (OSCC)
Kopf-
und
Halstumoren
gehören
aktuell
mit
weltweit
390.000
Neuerkrankungen pro Jahr zu den acht häufigsten malignen Tumoren [214].
Darunter befindet sich mit 263.000 Neuerkrankungen pro Jahr ([212] zitiert
nach [39]) das orale Plattenepithelkarzinom (OSCC). Es ist die mit 90% aller
oralen Karzinome [27,202] am häufigsten vorkommende maligne Neoplasie
[68,167]. 127.000 Betroffene sterben jährlich an den Folgen dieses Tumors
([212] zitiert nach [39]). Das Vorkommen von Lymphknotenmetastasen ist
der stärkste prognostische Faktor des OSCC ([50]; [204] zitiert nach [206]).
2.2.1.1 Ätiologie und Risikofaktoren
Die Entstehung eines oralen Plattenepithelkarzinoms unterliegt einem
komplexen Prozess und bildet sich in Abhängigkeit vieler verschiedener
endogener und exogener Faktoren [68,198]. Die entscheidende Rolle dabei
spielen
Geschlecht,
gewohnheiten
wie
Alter,
genetische
beispielsweise
[8,31,34,51,68,90,157,198].
Im
Prädisposition
Tabak-
Weiteren
führt
und
die
und
Lebens-
Alkoholkonsum
Literatur
den
ökonomischen und sozialen Staus als Einflussfaktoren an. Bevölkerungen
mit geringerem Einkommen sowie sozial benachteiligte Schichten tendieren
in höherem Maße dazu ein Karzinom zu entwickeln [31].
Männer erkranken häufiger an einem oralen Plattenepithelkarzinom als
Frauen (1,5:1 [202]) [90]. Dies ist vor allem auf die unterschiedliche
Lebensweise zurückzuführen [90,202]. Der Großteil der Betroffenen befindet
sich in einem Alter oberhalb der fünften Lebensdekade [54,90,202]. Nur 6%
sind jünger als 45 Jahre [34]. Jedoch steigt die Anzahl junger Patienten
zunehmend ([141] zitiert nach [34]).
Ein OSCC findet man vor allem an der Zunge, dem Mundboden, der Wange,
der Gingiva sowie dem weichen und harten Gaumen [11,119,137,202].
Zu den allgemein anerkannten Hauptrisikofaktoren des OSCC zählen der
Tabak- und Alkoholkonsum [213]. Rauchen verursacht die weltweit höchste
8
Krebsmortalitätsrate (2004 waren 1,6 von 7,4 Millionen Krebstoten Raucher)
[213], und 22% der Krebstoten pro Jahr sind auf den vermeidbaren Konsum
von Tabak zurückzuführen [213]. Das relative Risiko, an einem oralen
Karzinom,
einem
Pharynx-
bzw.
Larynxkarzinom
oder
einem
Plattenepithelkarzinom des Ösophagus zu erkranken, ist bei Rauchern im
Vergleich zu Nichtrauchern um das Sechsfache erhöht [214]. Alkoholkonsum
ist für 3,6% aller Krebserkrankungen [213] und zu 7-19% für das OSCC
[73,142,156] verantwortlich. Patienten, die sich den oben genannten
Risikogewohnheiten aussetzen, entwickeln deutlich häufiger ein OSCC als
Abstinenzler
(94,3%
Patienten
mit
Risikofaktoren
zu
5,7%
ohne
Risikofaktoren) [90]. Das Erkrankungsrisiko hängt außerdem von der
konsumierten Menge ab und steigt bei regelmäßiger Einnahme [80,131,182].
Durch das unterschiedliche Konsumverhalten waren bei Männern 22% der
Krebserkrankungen im Bereich des Mundes und Oropharynx auf Alkohol
zurückzuführen, bei Frauen nur 9% [213]. Besonders die Patienten, die
Tabak und Alkohol zu sich nehmen, haben ein erhöhtes Risiko [90]. So ist
die Mehrheit der Tumorpatienten auf den kombinierten Konsum von Tabak
und Alkohol zurückzuführen [12,68].
Als
weitere
Risikofaktoren
des
OSCC
werden
in
der
Literatur
tumorinduzierende Viren genannt. Bereits in der zweiten Hälfte des 20.
Jahrhunderts wurde ihre Rolle in der Ätiologie humaner Karzinome allgemein
anerkannt ([79] zitiert nach [68]). Zu den OSCC induzierenden Viren gehören
das Hepatitis-C-Virus [132], die Humanen Papillomaviren (HPV) [35,186]
HPV-16 [35,75,207] und HPV-18 [82], die Herpesviren Ebstein-Barr Virus
(EBV) [1], Humanes-Herpesvirus 8 (HHV8) und das Zytomegalie-Virus
(CMV) ([147] zitiert nach [68]). Das OSCC entsteht jedoch in bis zu 15-20%
auch durch andere Faktoren ([108] zitiert nach [198]). In der Literatur werden
genetische Prädisposition, ungesunde Diäten, erhöhter Body Mass Index,
schlechte Mundhygiene und das Bakterium ‚Helicobacter pylori‘ ebenfalls als
induzierende Faktoren diskutiert [2,68,90].
9
2.2.1.2 TNM- Klassifikation
Die TNM- Klassifikation des oralen Plattenepithelkarzinoms der UICC (Union
internationale contre le cancer) kann Tabelle 1 entnommen werden [209].
Tabelle 1: TNM-Klassifikation des oralen Plattenepithelkarzinoms der UICC nach
Wittekind, 2010
TNM-Klassifikation
Primärtumor (T)
TX
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
Kein Hinweis auf Primärtumor
Tis
Carcinoma in situ
T1
Tumor ≤ 2cm in größter Ausdehnung
T2
Tumor > 2cm,aber ≤ 4cm in größter Ausdehnung
T3
Tumor > 4cm in größter Ausdehnung
T4
Tumor infiltriert Nachbarstrukturen (Knochen, Muskulatur, Haut)
Regionäre
Lymphknoten (N)
NX
Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0
keine regionären Lymphknotenmetastasen
N1
Metastase(n) in solitärem ipsilateralem Lymphknoten, ≤ 3cm in größter
Ausdehnung
N2a
Metastase(n) in solitärem ipsilateralem Lymphknoten, > 3cm aber ≤ 6cm in
größter Ausdehnung
N2b
Metastasen in multiplen ipsilateralen Lymphknoten, keiner > 6cm in größter
Ausdehnung
N2c
Metastasen in bilateralen oder kontralateralen Lymphknoten, keiner > 6cm
N3
Metastase(n) in Lymphknoten > 6cm in größter Ausdehnung
Metastasen (M)
MX
Vorkommen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden
M0
keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastasen
Grading (G)
GX
Differenzierungsgrad kann nicht beurteilt werden
G1
gut differenziert
G2
mäßig differenziert
G3/4
schlecht differenziert/undifferenziert
10
2.2.1.3 Therapie und Prognose
Die Prognose des OSCC hängt von vielen verschiedenen Faktoren ab,
welche in der TNM-Klassifikation zusammengefasst werden. Entscheidend
sind die Lokalisation des Tumors, das Stadium, der Grad der Differenzierung
und das Vorkommen von Metastasen. Nicht zuletzt beeinflussen auch die
Therapie
und
der
Patient
selbst
die
Prognose
[38,167].
Die
Tumorimmunologie spielt ebenfalls eine wichtige Rolle, denn sie beeinflusst
die Lymphknotenmetastasierung [94,110,152]. Zum Zeitpunkt der Diagnose
befindet sich die Mehrheit der oralen Plattenepithelkarzinome bereits in
einem fortgeschrittenen Stadium (Stadium III, IV) [25,167,202] und bei 50%
der
Patienten
verschlechtert
sind
sich
Lymphknotenmetastasen
die
Prognose
erheblich
vorhanden.
und
die
Dadurch
Überlebens-
wahrscheinlichkeit sinkt ([189] zitiert nach [39]). Die 5-Jahresüberlebensrate
liegt derzeit bei nur 50% [39,43]. Frauen mit OSCC haben im Gegensatz zu
erkrankten Männern eine höhere Lebenserwartung. Ebenso jüngere
Patienten sowie Patienten mit einem höheren sozioökonomischen Status
[51,171,202,203]. Generell gilt, je eher man ein OSCC diagnostiziert und es
keine Metastasen gebildet hat, desto besser ist die Therapierbarkeit und
Prognose [38,50,167,195].
Obwohl es für das OSCC neue
diagnostische
Möglichkeiten
und
Operationstechniken gibt, steigt die Anzahl der Inzidenzen und die
Mortalitätsrate stetig an [25,67,90,140]. Auch die Prognose konnte in den
vergangenen Jahrzehnten nicht verbessert werden [92]. Operationen werden
bei einem Großteil der Patienten durchgeführt. Des Weiteren stehen Radiound/oder Chemotherapie zur Auswahl. Welche Therapie letztendlich gewählt
wird, ist jedoch tumor- und patientenabhängig [167,170].
Postoperativ sind die Patienten in ihrer Lebensqualität stark eingeschränkt
[83]. Sie klagen über Schmerzen, Probleme beim Essen, Trinken, Schlucken
und Sprechen [202]. Auf Grund der Lokalisation des Tumors und den meist
radikalen Therapien zieht das OSCC größere psychosoziale Konsequenzen
nach sich als andere maligne Erkrankungen ([202], [136] zitiert nach [39]).
Um die Diagnose eines OSCC sicherzustellen, sind klinische Zeichen
unzureichend. Es bedarf immer einer Biopsie und einer histologischen
11
Untersuchung ([168] zitiert nach [11]). Hierbei gehört die Bewertung von
operativ gewonnenem Probenmaterial zur Tumordiagnostik [211]. Da die
Lymphknotenmetastasierung der stärkste prognostische Faktor oraler
Plattenepithelkarzinome ist ([50]; [204] zitiert nach [206]) und durch die
Tumorimmunologie beeinflusst wird [94,110,152], ist es von großer
Bedeutung sie und die Tumorentstehung besser zu verstehen, um die
Prognose und Überlebenswahrscheinlichkeit des OSCC zu verbessern und
durch
eine
schneller
einsetzende
Therapie
die
Mortalitätsrate,
die
postoperative Einschränkung der Lebensqualität sowie psychosoziale
Konsequenzen zu minimieren.
12
2.2.2 Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM)
Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM) sind die im Tumorstroma am
häufigsten vorkommenden Immunzellen ([110,145,150] zitiert nach [183]).
Sie stammen von Monozyten ab, die sich zu Makrophagen differenzieren und
anschließend durch verschiedene Stimuli zu M1- oder M2-Makrophagen
polarisiert
werden.
Makrophagenphänotyp
Immunsuppression,
das
TAM
ähneln
[112,176].
überwiegend
dem
M2-
Aufgaben
betreffen
die
Ihre
Tumorwachstum,
die
Tumorausbreitung,
die
Neoangiogenese sowie die Metastasierung [72,176].
2.2.2.1 Makrophagenpolarisation
Makrophagen wurden erstmals 1905 durch Elie Metchnikoff beschrieben
[133]. Heute sind ihre Aufgaben im Bereich des Immunsystems allgemein
anerkannt [72].
Makrophagen entstehen aus Vorläuferzellen, den Monozyten. Werden diese
aus dem Blutkreislauf in peripheres Gewebe rekrutiert, differenzieren sie als
Antwort auf unterschiedliche Signale
zu
verschiedenartigen
reifen
Makrophagentypen und erfüllen spezifische immunologische Aufgaben
([111,113]; [62] zitiert nach [126]).
Unterschieden werden zwei Hauptklassen, die ‚klassisch‘ aktivierten M1- und
die ‚alternativ‘ aktivierten M2- Makrophagen [113]. M1-Makrophagen zeigen
eine proinflammatorische Aktivität ([37] zitiert nach [174]). Sie aktivieren das
Immunsystem, schützen vor viralen und bakteriellen Infektionen, dienen der
Tumorabwehr und produzieren eine große Anzahl an proinflammatorischen
Zytokinen ([113,117] zitiert nach [176]). M2-Makrophagen hingegen fördern
die
Gewebereparatur,
Neoangiogenese, Tumorprogression
sowie
die
Beseitigung von Detritus und sie produzieren antiinflammatorische Zytokine
([113];[30,117,146] zitiert nach [176]). Makrophagen kommen in nahezu allen
Gewebearten vor [72]. Tumorgewebe besteht bis zu 50% aus Makrophagen
([128] zitiert nach [129]). Dort interagieren sie mit einer Vielzahl von Zelltypen
wie Fibroblasten und Endothelzellen und sind entscheidend für das
Einwandern, die Invasion und die Metastasierung von Tumorzellen [114,176].
13
Studien
konnten
aufzeigen,
dass
der
Makrophagenphänotyp
sich
beispielsweise im Tumorwachstum von einem klassischen zu einem
alternativen ändern kann. Es ist jedoch noch nicht geklärt, ob sich
bestehende Makrophagen ändern oder ob es zu einer Invasion des anderen
Phänotyps kommt ([172] zitiert nach [72]). Studien belegten hierzu eine
Änderung des Typs auf Grund von Stimuli ([126] zitiert nach [72]).
2.2.2.2 M2-Makrophagenphänotyp
Alle Makrophagen, die nicht der Hauptklasse der ‚klassisch‘ aktivierten
Makrophagen
angehören,
werden
unter
dem
Oberbegriff
der
M2-
Makrophagen zusammengefasst. Dazu gehören Monozyten die durch
antiinflammatorische Moleküle wie IL-4 und IL-13 stimuliert werden und
dadurch zu M2-Makrophagen differenzieren [61,113,169,180]. Auch IL-6, IL10, LPS, TGF-β, PGE-2, Glukokortikoide und secosteroide Hormone
begünstigen die M2- Polarisation [7,58,113,176]. Die Produktion von IL-10,
IL-12, IL-1ra, die Sekretion von CCL17 und CCL22, eine hohe Expression
von Mannose-, Scavanger- und Galaktoserezeptoren und mangelhafte
antigen-präsentierende Fähigkeiten definieren M2-Makrophagen [176]. M2Makrophagen kommen auch im Tumorgewebe vor und fördern dort die
Tumorentwicklung, die Gewebereparatur und das Remodelling ([217] zitiert
nach [113]).
2.2.2.3 Monozyteninfiltration und TAM-Entstehung
Bindegewebszellen sowie neoplastische Zellen eines Tumors bilden
Moleküle, welche Monozyten aus dem Blutkreislauf in das Tumorgewebe
locken [19,176], die später zu tumor-assoziierten Makrophagen (TAM) mit
einem M2-Makrophagenphänotyp umgewandelt werden
[176] (s.Abb.1
[176]). Zu diesen Molekülen zählen verschiedene Signalproteine wie das
Chemokin CCL2, M-CSF und VEGF [7]. Ebenfalls involviert in die
Monozytenrekrutierung sind die Chemokine CCL5, CCL7, CXCL8 und
CXCL12 sowie der Wachstumsfaktor PDGF [7,13,176]. Eine besondere
Stellung in der Rekrutierung wird jedoch dem Faktor CCL2, auch bekannt als
14
‚monocyte chemotactic protein‘ (MCP), zugeschrieben ([33] zitiert nach
[175]). CCL2 wird von Tumorzellen, Fibroblasten und Makrophagen gebildet
([109] zitiert nach [175]). TAM sind in der Lage, CCL2 selbst zu produzieren
und somit die Rekrutierung von weiteren Makrophagen aus dem Blutkreislauf
zu verstärken. So korreliert ein hohes Aufkommen von CCL2
in
verschiedenen Karzinomen mit einer hohen Anzahl von TAM und einer
schlechteren Prognose [134,153,164,175].
Abbildung 1: Überblick der TAM Entstehung und ihrer Folgen nach Solinas et al.,2009
Werden die rekrutierten Monozyten in das Tumorgewebe aufgenommen,
erfolgt durch die umgebenden Signalmoleküle IL-3 und M-CSF die
Differenzierung zu ausgereiften Makrophagen, ab diesem Zeitpunkt TAM
genannt [176]. Durch die Sezernierung von TGF-β und IL-10 durch
neoplastische Zellen, Fibroblasten und Tregs werden die TAM weiter zu dem
antiinflammatorischen M2-Makrophagenphänotypen umgewandelt [6,176].
Die Abwesenheit von M1 induzierendem IFN-γ wirkt sich ebenfalls positiv auf
eine M2-Polarisierung aus [176]. Es konnte gezeigt werden, dass TAM eine
Reihe
M2-makrophagenspezifischer Gene
exprimieren.
Darunter den
Scavengerrezeptor CD163, Fc Fragmente des IgG, C-Typ Lektin-Domänen
und Hitzeschockproteine [15,18,72,159,173,176].
15
2.2.2.4 Aufgaben der TAM
Die
Hauptaufgaben
tumor-assoziierter
Makrophagen
betreffen
die
Tumorentwicklung, denn die Immunsuppression, das Tumorwachstum, die
Tumorausbreitung, die Neoangiogenese und die Metastasierung werden von
TAM beeinflusst [72,176].
Bereits 1970 wurde erkannt, dass TAM eine Schlüsselrolle im Wachstum
eines Tumors spielen ([14] zitiert nach [72]).
Durch die Produktion des Zytokins IL-10 sowie der Sekretion verschiedener
Chemokine, wie beispielsweise CCL17 und CCL22, mittels TAM, wird die
Immunogenität des Tumors herabgesetzt und somit das Tumorwachstum
entscheidend beeinflusst [72,176]. Als weiterer Faktor der Immunsuppression
gilt TGF-β [16,72]. Das Zytokin IL-23 fördert das Tumorwachstum, indem es
die Produktion des wachstumssteigernden Enzyms MMP-9 erhöht [72]. TAM
setzen außerdem die Zytotoxizität herab, wodurch das Tumorwachstum
begünstigt wird [69,72].
Die Neoangiogenese spielt die wichtigste Rolle im Zusammenhang mit dem
Wachstum und der Metastasierung eines Tumors. Denn nur durch ein
vaskularisiertes Tumorgewebe können sich maligne Tumorzellen im Körper
ausbreiten [72] und sich an einer anderen Stelle niederlassen. In der Literatur
werden Studien beschrieben, die erkennen lassen, dass TAM eine
besondere Stellung in der Neoangiogenese eines Tumors einnehmen und
diese fördern [72]. So konnte in verschiedenen Tumorarten wie in Gliomen,
in Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus und in Brust-, Cervix-, Prostata-,
sowie Blasenkrebs nachgewiesen werden, dass TAM durch die Absonderung
von Wachstumsfaktoren wie VEGF, PDGF und TGF-β sowie Mitgliedern der
FGF-Gruppe zur Gefäßneubildung beitragen und das Tumorwachstum und
die Tumorausbreitung fördern. [17,84,98,114,169,173,176,188]. TAM bilden
außerdem Angiogenese fördernde Enzyme wie MMP-1, MMP-2, MMP-3,
MMP-7, MMP-9 und MMP-12 [57,72,176] sowie Angiogenese fördernde
Chemokine CCL2, CCL5, CXCL1, CXCL8, und CXCL13 [13,176].
Es konnte vor einigen Jahren belegt werden, dass TAM auch die
Metastasierung von Tumoren fördern ([63] zitiert nach [72]). Der von ihnen
produzierte ‚epidermal growth factor‘ (EGF) interagiert mit dem von
16
Tumorzellen produzierten ‚colony stimulating factor-1‘ (CSF-1), und dadurch
werden
wiederum Tumorzellen angeregt zu metastasieren
[64,215].
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass TAM den Eintritt von Tumorzellen in
Blut- und oder Lymphgefäße begünstigen [216].
17
2.2.3 Makrophagenmarker
Bei Makrophagenmarkern handelt es sich um spezifische Antigene auf Zellen
monozytärer Herkunft. Zur immunhistochemischen Identifizierung von
Monozyten, Makrophagen und TAM werden Antikörper eingesetzt, die an die
Antigene binden und durch immunhistochemische Färbungen sichtbar
gemacht werden können [36,96,120]. In der Literatur werden verschiedene
Marker
beschrieben.
Alle
Makrophagen
lassen
sich
durch
die
Oberflächenrezeptoren CD68 und CD11b markieren [130]. CD163, CD204,
CD206/MRC1 und CCL22 werden als spezifische M2-Marker beschrieben
[24,76,95]. Spezifische M1-Marker werden selten erwähnt, jedoch wird in
einer Studie der Marker CD11c als solcher definiert [76].
2.2.3.1 Das Oberflächenantigen CD68
Das Oberflächenantigen CD68 ist ein transmembranes Glykoprotein mit
einem Molekulargewicht von 110kDa [123,149] und gehört zur Gruppe der
lysosomenassoziierten Membranglykoproteine ‘lamp‘ [78]. Das CD68Antigen wird auf einer Vielzahl von Zellen, unter anderem auf Zellen
monozytärer Abstammung, Lymphozyten, Neutrophilen Granulozyten
und
Fibroblasten exprimiert [93,149,158]. Auch auf Zellen nicht hämatopoetischer
Herkunft konnte CD68 nachgewiesen werden [149]. Das Antigen ist unter
normalen und pathologischen Bedingungen der beste und am häufigsten
verwendete immunhistochemische Marker zur Identifizierung monozytärer
Zellen [41,78,149,183]. Er dient in gleichem Maße der Identifizierung von M1und
M2-Makrophagen
und
wird
zur
Kennzeichnung
von
TAM
in
Tumorgeweben verwendet [52,101,103]. Das durch den ‚Fourth Workshop
on Human Leucocyte Differentiation Antigens‘ benannte makrophagenassoziierte Antigen CD68 wird durch sechs Antikörper (Y1/82A, Y2/131, KP1,
Ki-M6, Ki-M7, EBM11) erkannt [123,149]. Da diese nicht ausschließlich an
CD68-Antigene von Monozyten und Makrophagen binden [93], sind weitere
Antikörper nötig, um diese Zellen zu kennzeichnen [74]. Die Funktionen des
CD68 sind nicht hinreichend bekannt. Diskutiert wird jedoch die Bindung an
18
gewebe- oder organspezifische Lectine oder Selectine [78]. Weitere
Informationen zu dem CD68-Antigen stehen noch aus.
2.2.3.2 Der Makrophagen-Scavengerrezeptor CD163
Der 1987 erstmals identifizierte ([219] zitiert nach [143]) transmembrane
Scavengerrezeptor CD163, auch bekannt als RM3/1, M130, p155 oder
Hämoglobin-Scavengerrezeptor
Proteinfamilie
der
(HbSR),
cysteinreichen
gehört
zur
Klasse
Scavengerrezeptoren
B
der
(SRCR)
[48,77,97,155]. Diese Proteinklasse findet sich hauptsächlich auf Zellen des
Immunsystems. Sie nimmt an der Entwicklung des Immunsystems und der
Regulierung der Immunantwort teil ([163] zitiert nach [193]). CD163 ist ein
M2-Makrophagen spezifisches Oberflächenantigen [48,169,173], welches
unter
anderem
die
Unterscheidung
zu
proinflammatorischen
M1-
Makrophagen ermöglicht [169] und antiinflammatorische Funktionen erfüllt
[3]. Gefunden wurde CD163 bei Menschen und Krallenaffen sowie Homologe
in Schweinen und Nagetieren [48,161,166,220].
2.2.3.2.1 Aufbau
Das humane Glykoprotein CD163 zeigt ein Molekulargewicht von 130kDa
[77,97,138]. Es besteht aus einem kurzen zytoplasmatischen Schwanz (Cterminaler Teil) aus 49 Aminosäuren, einem transmembranen Abschnitt (Nterminaler Teil) aus 24 Aminosäuren und einem großen extrazellulären Anteil
von 9 Typ B SRCR-Domänen [46,77,97,138]. Bis dato wurden fünf Varianten
des Proteins erfasst, welche sich in ihren Aufgaben der Länge ihres
zytoplasmatischen Anteils unterscheiden [3,97,138,154]. Die DNA-Sequenz
des CD163-Gens besitzt eine Spannweite von 35kDa und besteht aus 17
Exons und 16 Introns [97,155].
19
2.2.3.2.2 Vorkommen
Nur
Zellen
monozytärer
Abstammung
sind
in
der
Lage
das
Oberflächenantigen CD163 zu exprimieren [48,77,194]. Dazu gehören
beispielsweise Kupferzellen der Leber, Makrophagen der roten Pulpa der
Milz, Makrophagen des Thymus, des Knochenmarks und des zentralen
Nervensystems [48,194]. CD163 wird ferner als ein Merkmal der ‚alternativ‘
aktivierten M2-Makrophagen angesehen [94] und besonders auf diesen
ausgebildet [48,169]. Eine hohe Anzahl an CD163+ Makrophagen wurde in
Heilungsphasen von akut und chronisch entzündeten Geweben und in
Wundheilungsphasen gefunden ([199] zitiert nach [48]). Auf frisch isolierten
Monozyten des peripheren Blutes und in neu infiltrierenden Makrophagen ist
keine oder nur eine geringe CD163-Expression (5-30%) zu finden
[10,77,89,184]. Die Anzahl der CD163-Oberflächenantigene steigt jedoch mit
der Differenzierung von Monozyten zu ausgereiften Makrophagen [89,162].
Auf dendritischen Zellen, Langerhanszellen und Makrophagen der weißen
Pulpa der Milz wurden ebenfalls keine oder nur geringe Expressionen von
CD163 gefunden ([184]; [86],[148] zitiert nach [46]). Auch IFN-γ induzierte
Makrophagen exprimieren kein CD163 Oberflächenantigen ([86] zitiert nach
[21]).
2.2.3.2.3 Aufgaben
CD163 kann als prognostischer Marker in verschiedenen Erkrankungen, vor
allem in Entzündungen, eingesetzt werden und dient als diagnostischer
Parameter
zur
Überwachung
Antiinflammatorische
Funktionen
der
sowie
Makrophagenaktivierung
die
Beseitigung
von
[138].
freiem
Hämoglobin stellen zwei Hauptaufgaben des Oberflächenantigens dar.
Weitere Aufgaben werden diskutiert [3].
Da
die
Expression
des
CD163-Oberflächenantigens
besonders
in
Heilungsphasen akuter und chronischer Entzündungen zu finden ist und ihr
Vorkommen mit dem Rückgang der Entzündungsantwort sowie der
Angiogenese assoziiert ist [48,59,138,143,221], wird vermutet, dass CD163+
Makrophagen in entzündetem Gewebe eine antiinflammatorische Aufgabe
20
besitzen und eine hohe CD163-Expression mit dem Entzündungsrückgang
zusammenhängt [3,48,124]. Ferner konnte gezeigt werden, dass CD163+
Makrophagen antiinflammatorische und angiogenesefördernde Faktoren
produzieren ([70] zitiert nach [21]; [87]).
2001 wurde eine weitere wichtige Funktion des CD163 erkannt. Sie zeigten,
dass das Oberflächenantigen als Hämoglobin Scavengerrezeptor (HbSR)
fungiert
und somit ein spezifischer Rezeptor für Hämoglobin-Haptoglobin
Komplexe (Hb-Hp) ist, jedoch freies Hämoglobin oder Haptoglobin nicht
erkennt [91].
Besonders in akut entzündlichen Prozessen werden erhöhte Konzentrationen
an freiem Hämoglobin gefunden [165]. Dieses besitzt eine potentiell toxische
sowie proinflammatorische Wirkung und wird durch physiologische oder
pathologische Hämolyse aus Erythrozyten freigesetzt [46,60]. Unterschieden
wird die intravaskuläre Hämolyse (Erythrolyse), die zu 10-20% vorkommt und
in welcher Hämoglobin durch die Ruptur von roten Blutkörperchen freigesetzt
wird, von der extravaskulären Hämolyse. Diese findet in der Milz, in der
Leber und im Knochenmark statt. Dort werden überalterte Erythrozyten aus
dem Blut durch Makrophagen aufgenommen und anschließend abgebaut.
Das dabei freigesetzte Hämoglobin wird umgehend an Haptoglobin
gebunden und es entsteht ein stabiler Hb-Hp Komplex ([138]; [22] zitiert nach
[124]; [40] zitiert nach [65]). Anschließend bindet der Komplex an den
Hämoglobin-Scavengerrezeptor CD163 der Makrophagen, wird mittels
Endozytose aufgenommen und somit der Körper vor toxischen und
oxidativen Schäden bewahrt ([46,48,65,91]; [22] zitiert nach [124]).
Unterschieden werden zwei Hb-Hp Komplexe. Bindet CD163 an einen Hb-Hp
Komplex-1
wird
außerdem
die
Freisetzung
des
IL-10,
ein
antiinflammatorischer Mediator, angeregt. Bindet es an einen Hb-Hp
Komplex-2, wird die Zytokinproduktion nicht angeregt [66,138]. Durch das
Hämoxygenase Enzym (HO1), welches potente antiinflammatorische und
antioxidative
Eigenschaften
besitzt,
werden
die
Häm-Einheiten
des
Hämoglobin in Lysosomen zu den antiinflammatorischen Häm-Metaboliten
Biliverdin, Eisen und Carbonmonooxidase (CO) abgebaut ([46,139]; [201]
zitiert nach [3]). Biliverdin zeigt direkte antiinflammatorische Aktivitäten [205].
Die Expression von Ferritin, welches antioxidative Eigenschaften besitzt, wird
21
von Eisen stimuliert [46,139]. CO ist ein toxisches Gas und inhibiert
lipopolysaccharid-induzierte proinflammatorische Zytokine wie IL-1 und TNFα, zeigt jedoch auch eine Steigerung des antiinflammatorischen Zytokins IL10 ([104] zitiert nach [46]). IL-10 fördert die CD163 und HO1 Expression,
erhöht die Hb-Hp Komplexbindung an HbSR und erzeugt somit eine
Hämoglobin-Clearance und schützt vor freiem Hämoglobin. So besteht ein
Schutz vor freiem Hämoglobin nicht nur durch die Bindung an den HbSR,
sondern auch durch die Freisetzung antiinflammatorischer Mediatoren (IL-10
und CO) [66,89,143].
In einer Studie wurde festgestellt, dass die Oberfläche des CD163 Rezeptors
in der Lage ist, gramnegative sowie grampositive Bakterien zu erkennen und
zu binden [49]. Dies führt zu einer verstärkten bakterieninduzierten
Produktion der proinflammatorischen Mediatoren TNF-α, IL1β und IL-6 durch
Makrophagen, welche jedoch durch antagonistische CD-163 Antikörper
inhibiert werden kann [49,89]. Die Zytokinproduktion trägt zur Initialisierung
einer lokalen Entzündungsantwort bei und führt zur Elimination der Infektion
[49]. Des Weiteren ist CD163 in der Lage, das apoptoseinduzierende Protein
TWEAK [20] und Viren zu binden [161,196,197]. Dazu gehören das
Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) sowie das ‚Porcine reproductive and
respiratory syndrome virus‘ (PRRSV) [23,161,197]. Diese benutzen den
CD163-Rezeptor als Eintrittspforte in Schweinezellen [89,161,197].
Zusammenfassend kann gesagt werden: der SRC-Rezeptor CD163 trägt zur
Schutzfunktion des Körpers bei [49] und spielt in der Phagozytose sowie der
Immunantwort eine wichtige Rolle [21].
2.2.3.2.4 Regulierung
Die Expression von CD163 mRNA sowie des Proteins wird in Monozyten und
Makrophagen durch unterschiedliche Signale gesteuert. So wird die
Produktion durch IL-6, antiinflammatorische Mediatoren wie IL-10,
durch
die
Anwesenheit
des
M-CSF
und
Glukokortikoiden
sowie
(z.B.
Dexamethason) gefördert [21,77,184,208]. In vitro Untersuchungen mit
humanen Monozyten zeigten eine Steigerung der CD163-Produktion nach
Glukokortikoidgabe von 10-30% auf 90% [208]. Auch in vivo stieg die Anzahl
22
der CD163+ Makrophagen auf humanen peripheren Blutzellen nach
Glukokortikoidgabe
innerhalb
von
6
Stunden
um
80%
an
[219].
Proinflammatorische Mediatoren wie LPS, IFN-γ und der TNF-α zeigten den
gegenteiligen Effekt [21]. Die Anwesenheit dieser Mediatoren und deren
Verringerung der CD163-Expression könnte das Fehlen der CD163+
Makrophagen im Frühstadium von Entzündungen erklären [21]. Ebenfalls
gehemmt wird die Produktion von CD163 durch IL-4, IL-13 [21,184], den
‚granulocyte macrophage-colony stimulating factor‘ (GM-CSF) [21] und den
TGF-β [144]. Diese Zytokine können nicht nur die Herabregulierung von
CD163 steuern, sondern auch die IL-10 und glukokortikoidinduzierte CD163Expression dämpfen. Auch Chemokine wie CXCL-8 (IL-8) hemmen die
CD163 Produktion ([184] zitiert nach [89]). Des Weiteren konnten
Arbeitsgruppen zeigen, dass das Immunsuppressivum Cyclosporin A und der
Phorbolester (PMA) die CD163-Expression verringern [21,208].
2.2.3.3 Der Mannoserezeptor CD206/MRC1
Der Mannoserezeptor (CD206, MR, MRC1) ist ein kalziumabhängiges
transmembranes C-Typ1 Lektin, welcher überwiegend auf Makrophagen,
dendritischen Zellen, Endothelzellen und Epithelzellen vorkommt [47,85,115].
Auch auf Keratinozyten konnte CD206 nachgewiesen werden [187]. Er gilt
als zuverlässiger Indikator für M2-Makrophagen und TAM mit M2Makrophagenphänotyp [4,115,127,177].
2.2.3.3.1 Aufbau
CD206/MRC1 gehört mit Endo180 (CD280), M-Typ PLA2R und DEC205
(CD205) zu den C-Typ Lektin-1-Rezeptoren [42,47,115,192]. Hierbei handelt
es sich um endozytische Rezeptoren mit ähnlichem Aufbau [115]. Der
CD206/MRC1-Rezeptor ist ein 180kDa großes, aus fünf Domänen
aufgebautes Membranmolekül mit drei extrazellulären Anteilen [47,115,179].
Die N-terminale CR-Domäne, welche nur in diesem Rezeptor funktionsfähig
ist
([100] zitiert nach [115]),
bindet sulfatierte Zucker, luteinisierende
23
Hormone und das Katzenallergen Fel d 1 [45,115]. Die FNII-Domäne ist für
die Bindung der Kollagene I-IV zuständig und die aus acht Untereinheiten
aufgebaute CRD-Domäne bindet endogene und exogene Moleküle, wie
beispielsweise Allergene, mikrobielle Produkte und Pathogene. Auch
Glykokonjugate mit einem Mannose-, Fructose- oder N-AcetylglucosaminEnde werden kalziumabhängig aufgenommen ([115,179]; [178] zitiert nach
[191]). Es folgt ein hydrophober transmembraner Abschnitt und ein
zytoplasmatischer C-terminaler Schwanz [47,179].
2.2.3.3.2 Vorkommen
Der Mannoserezeptor befindet sich vor allem auf Makrophagen, unreifen
dendritischen Zellen, Endothelzellen der Leber und Milz, Epithelzellen und
Keratinozyten
[9,106,115].
Ein
besonders
hohes
Aufkommen
an
CD206/MRC1 wurde in pathologischen Geweben, vor allem auf TAM mit M2Polarisierung in Tumoren nachgewiesen [4,9]. Wohingegen sich keine
Expression von CD206/MRC1 auf zirkulierenden Granulozyten, epidermalen
Langerhanszellen und reifen dendritischen Zellen zeigte ([47,210]; [29],
[122], [160] zitiert nach [210]). Das Vorkommen des Rezeptors auf
Monozyten wurde als fehlend angesehen, jedoch zeigte sich in neuen
Studien in ihrem Reifeprozess eine steigende Anzahl an CD206/MRC1 [115].
Im Dünndarm wurde durch anti-CD206-Antikörper eine kleinere Form des
Rezeptors gefunden ([181] zitiert nach [115]). Weitere Informationen
hinsichtlich seines Vorkommens, der Regulierung und Funktion stehen noch
aus [115].
2.2.3.3.3 Aufgaben
In Abhängigkeit der CD206/MRC1 exprimierenden Zelle erfüllt der Rezeptor
eine Reihe von Aufgaben [210]. Die wichtigste ist die Fähigkeit mittels CRDs
zwischen körpereignen und körperfremden Molekülen unterscheiden zu
können [85]. Binden an CD206/MRC1 in Makrophagen verschiedene
Moleküle oder Pathogene, kommt es zur Aktivierung der Endozytose,
Phagozytose oder der Immunabwehr [9,47]. Er ist beispielsweise in der
24
Lage,
mittels
zweier
kalziumabhängig
unabhängiger
aufzunehmen
Bindungsstellen
[47,115].
Wird
er
auf
Kohlenhydrate
Makrophagen
exprimiert, dient er der Kollagenaufnahme [116], welche unabhängig einer
Glykolysierung stattfindet [81,115]. Innerhalb der C-Typ Lektin-Familie ist
ausschließlich der CD206/MRC1 Rezeptor in der Lage, die Phagozytose zu
aktivieren
[47].
Er
erkennt
Bakterien
(Mycobacterium
tuberculosis,
Streptococcus pneumonia, Yersinia pestis), Viren (HIV, Influenzavirus,
Denguevirus), Pilze (Candida albicans, Pneumocystis carinii, Cryptococcus
neoformans) und Parasiten und nimmt sie zusammen mit dem Rezeptor in
Makrophagen auf ([115]; [5], [192] zitiert nach [9]). Die Endozytose ist
clathrinabhängig ([55] zitiert nach [115]). Anschließend werden reaktive
Sauerstoffintermediate, Metaboliten der Arachidonsäure, Proteinasen und
Monokine wie IL-1 und TNF von den Makrophagen ausgeschüttet [47] und
der leere Rezeptor wandert wieder an die Zelloberfläche [115]. Ferner ist
CD206/MRC1 in der Lage, mannosehaltige oder fucosehaltige Glykoproteine
des Wirtes oder von Pathogenen zu phagozytieren [47,115,177]. Auch die
Fähigkeiten
des
Rezeptors,
Antigene
zu
präsentieren
und
die
Makrophagenaktivierung zu modulieren, wurden beschrieben [115,210]. Es
wird vermutet, dass Pathogene durch die Bindung an CD206/MRC1Rezeptoren in TAM die Aktivierung der Immunantwort umgehen können.
Durch die Erkennung und Bindung von Tumorliganden an CD206/MRC1 und
TAM, wird die IL-10-Produktion der TAM gesteigert und das für die T-Zell
Rekrutierung
zuständige
Zytokin
CCL3
gesenkt.
Dadurch
wird
die
Immunantwort geschwächt und der Tumor kann einer Tumorsuppression
ausweichen [4]. Außerdem kommt es durch die vermehrte IL-10Ausschüttung zu einer vermehrten M2-Polarisation und somit wie oben
beschrieben
zur
Tumorprogression
sowie
zur
weiteren
Produktion
antiinflammatorischer Zytokine [4]. Mannoserezeptoren sind auch auf
Lymphgefäßen zu finden, und es wurde nachgewiesen, dass sie zur
Tumorausbreitung entlang der Lymphbahnen beitragen [118].
25
2.2.3.3.4 Regulierung
Die CD206/MRC1 Expression wird durch die Makrophagenpolarisierung
positiv
beeinflusst,
denn
besonders
in
M2-Makrophagen
konnten
CD206/MRC1-Rezeptoren nachgewiesen werden [177]. Auch IL-4 und IL-13
führen zu einer höheren CD206/MRC1 Anzahl auf TAM ([180] zitiert nach
[177]). Eine Senkung der CD206/MRC1-Expression auf TAM wird durch LPS,
IFN-γ, Cytochalasin D und Latrunculin A verursacht [4,56,180].
2.2.4 TAM als prognostische Tumormarker
Wie in der Literatur beschrieben und allgemein anerkannt, beeinflussen und
fördern
TAM
in
erheblicher
Weise
das
Tumorwachstum
und
die
Tumorausbreitung [72,176]. In unterschiedlichen Tumorarten wurde das
Vorkommen von TAM mit einer schlechteren Prognose assoziiert und TAM
von verschiedenen Autoren als prognostische Tumormarker beschrieben. So
korrelieren hohe TAM-Zahlen in den meisten Karzinomen mit einer hohen
Tumorgröße,
positivem
N-Status,
einer
schlechteren
Prognose
und
gehäuften Rezidiven [94,121,183]. Wohingegen eine geringe Makrophageninfiltration mit der Regression von Tumorwachstum und Metastasierung
korreliert
[176].
formalinfixierte,
Hierzu
wurden
paraffineingebettete
von
verschiedenen
histologische
Arbeitsgruppen
Schnitte
von
OP-
Resektaten mittels immunhistochemischer Methoden untersucht [44,105]. In
Operationspräparaten von Pankreaskarzinomen wurden der unspezifische
Makrophagenmarker CD68 sowie die Marker der M2-Polarisierung CD163
und CD204 untersucht. Bei einer hohen Anzahl an tumorinfiltrierenden
CD163+
und
CD204+
Makrophagen
zeigten
sich
eine
höhere
Lymphgefäßdichte sowie häufigere Lymphknotenmetastasen und eine
schlechtere Prognose. Die Anzahl CD68+ Zellen stimmte dagegen nicht
signifikant
mit
diesen
klinischen
Parametern
überein.
Die
Anzahl
infiltrierender CD163+ und CD204+ Makrophagen war annähernd gleich,
jedoch niedriger als die Anzahl der CD68+ Makrophagen [94]. In einer
weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass die Infiltration von M2polarisierten TAM in Lymphknoten mit einer erhöhten Neoangiogenese
26
verbunden ist [95]. In Schilddrüsenkarzinomen korreliert eine steigende TAMDichte mit der Lymphknotenmetastasierung und dem TNM-Status. Es
wurden die Makrophagenmarker CD68 und CD163 untersucht und auch hier
zeigte sich eine M2-Makrophagenpolarisierung [151]. Bei Patienten mit
Follikulärem Lymphom, Hodgkin Lymphom und diffusem großzelligen B-Zell
Lymphom korreliert die Anzahl der CD163+ Zellen mit einer verringerten
Überlebensrate [28,183,200,218]. In kutanen T-Zell-Lymphomen ist die
Prognose schlechter, je höher die Anzahl an CD68+ und CD163+ Zellen
[183]. Untersucht wurden auch TAM in Präparaten von Mammakarzinomen.
CD163+ Makrophagen korrelierten hierbei positiv mit höherer Tumorgröße
und höherem Grading. CD68+ Makrophagen korrelierten ebenfalls positiv mit
der Tumorgröße und sie galten als unabhängiger Prognosefaktor für eine
verringerte Überlebenswahrscheinlichkeit der Brustkrebspatienten [121]. In
weiteren Studien wurde berichtet, dass eine hohe Anzahl an CD163+
Makrophagen, unabhängig von Metastasierungen, in Pankreas-, und
Rektumkarzinomen sowie in Gliomen mit einer höheren Rezidivtendenz und
einer schlechteren Prognose assoziiert ist [88,94,169]. Auch bei Patienten
mit Brust-, Cervix-, Prostata- und Blasenkrebs, malignen Melanomen und
Gliomen korreliert das Vorkommen von TAM mit einer schlechteren
Prognose [26,53,71,99,102,135]. CD163+ Rektum-, und Blasenkrebsbiopsien zeigten eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass Patienten an einem
Rezidiv erkranken und eine kürzere Überlebenswahrscheinlichkeit haben
[107,169]. Außerdem wurde beschrieben, dass Tumore, die präoperativ
mittels Radiatio behandelt wurden, eine signifikant höhere CD163Expression haben. Daraus kann geschlossen werden, dass die CD163Expression durch eine Radiotherapie möglicherweise gesteigert wird [169].
In oralen Plattenepithelkarzinomen wurde die Anzahl der TAM von
verschiedenen Arbeitsgruppen ebenfalls mit der Prognose in Verbindung
gebracht. Die Polarisierung der Makrophagen im OSCC ist dagegen anders
als bei anderen soliden Tumoren bisher nur unzureichend erforscht. Es
wurde festgestellt, dass die Anzahl OSCC infiltrierender Makrophagen ein
unabhängiger
Prognosefaktor
für
tumorfreies
Überleben
und
Gesamtüberleben ist [105]. So korrelieren verstärkt TAM-Infiltrate an der
Invasionsfront beziehungsweise im Tumorstroma von OSCC mit einem
27
höheren T- und N-Status [105], Lymphknotenmetastasen [105], einer
höheren Gefäßdichte [44] und einem höheren Grading [44,125]. Eine
geringere Überlebensrate bei hohem CD68+ Zellvorkommen und eine M2Polarisierung tumor-assoziierter Makrophagen im Tumorstroma von OSCC
wurde belegt [32]. In anderen Untersuchungen wurden CD163+ Zellen mit
dem Grading des OSCC assoziiert und es zeigte sich ebenfalls ein deutlicher
M2-Makrophagenphänotyp [125]. Auch die Anzahl CD68+ und CD163+
Makrophagen in OSCC wurde untersucht, mit dem Ergebnis, dass eine hohe
CD68+ Zellanzahl nicht mit dem Überleben der Patienten korreliert und auch
nicht mit dem histologischen Grad des Tumors [52,125]. Wissenschaftler
konnten darlegen, dass eine hohe Anzahl an CD163+ Makrophagen eine
bedeutend geringere Überlebenswahrscheinlichkeit für Patienten mit OSCC
darstellt und ein signifikanter und unabhängiger prognostischer Faktor des
oralen Plattenepithelkarzinoms ist [52]. Die exakte Aufgabe CD163+
Makrophagen in oralen Plattenepithelkarzinomen ist jedoch weiterhin
ungeklärt [52].
Diese Daten sind ein Hinweis darauf, dass nicht die absolute Zahl der
tumorinfiltrierenden Makrophagen, sondern deren Polarisation und damit
deren Zytokinprofil, sowie deren Wechselwirkungen mit Tumorzellen für die
Prognose von Tumoren von Bedeutung sind. Es ist naheliegend, dass durch
ein genaueres Verständnis der Makrophagenpolarisation in humanen
Tumoren wichtige neue Einsichten in die Tumorimmunologie gewonnen
werden können.
.
28
2.3 Ziele der Arbeit und Fragestellung
Um M2-polarisierte Makrophagen zu kennzeichnen, werden in der Literatur
verschiedene Marker beschrieben. Hierbei handelt es sich häufig um die
oben beschriebenen Antigene CD163 und CD206/MRC1. Eine vergleichende
Analyse dieser beiden Marker an immunhistochemischen Präparaten wurde
bis jetzt in der Literatur nicht beschrieben.
Ziel der Dissertation ist es, die Expression der beiden anerkannten M2Makrophagenmarker CD163 und CD206/MRC1 miteinander sowie mit dem
generischen Makrophagenmarker CD68 zu vergleichen. Insbesondere soll
untersucht werden, inwieweit durch anti-CD163 und anti-CD206/MRC1 die
identische Zellpopulation angefärbt wird.
Folgende
Fragestellungen
fassen
die
Ziele
des
vorliegenden
Dissertationsprojektes zusammen:
1. Korreliert die Expression der M2-Makrophagenmarker CD163 und
CD206/MRC1 miteinander und inwieweit korrelieren sie mit dem
generischen Makrophagenmarker CD68?
2. Wird durch anti-CD163 und anti-CD206/MRC1 die identische
Zellpopulation angefärbt?
29
3
Material und Methode
3.1 Material
3.1.1 Geräte
Tabelle 2: Geräteübersicht
Gerätetyp
Hersteller
Destillierapparat Typ 2004
Gesellschaft für Labortechnik (GFL),
Burgwedel, Germany
Gewebeeinbettautomat
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham,
Citadel 1000
MA, USA
Immunfärbeautomat
DakoCytomation Colorado Inc., Fort
Cytomation
Collins, CO, USA
Autostainer plus
Kamera AxioCam MRc5
Carl Zeiss AG, Göttingen, Germany
Lichtmikroskop Axio Imager 2
Carl Zeiss AG, Göttingen, Germany
MIRAX MIDI Scanner
3DHISTECH, Budapest, Ungarn
pH-Meter inoLab pH 730
WTW Wissenschaftlich-Technische
Werkstätten GmbH, Weilheim, Germany
Pipetten Eppendorf
Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Research®
Schlittenmikrotom Jung HN40 Leica Instruments GmbH, Nussloch,
Germany
30
Wärmeschrank Modell 200
Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach,
Germany
Wasserbad WNB14
Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach,
Germany
Zentrifuge MR 3001
Heidolph Instruments GmbH &Co.KG,
Schwabach, Germany
31
3.1.2 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 3: Materialübersicht
Materialtyp
Hersteller
D-Hartmetallmesser Winkel 0°-5° (3°)
Feather® Safety Razor Co. Ltd.,
Osaka, Japan
Deckgläser
Gerhard Menzel GmbH,
(18x18;20x20;22x40;24x32;24x60mm) Braunschweig, Germany
Eindeckmedium Aquatex®
Merck KGaA, Darmstadt,
Germany
Faltenfilter Rotilabo® Typ 113P
Carl Roth GmbH & Co. KG,
Karlsruhe, Germany
Objektträger Superfrost Plus®
Gerhard Menzel GmbH,
Braunschweig, Germany
Parafilm "M"
Bemis, Neenah, USA
Pipettenspitzen (10, 100, 200, 1000µl)
Sarsted AG & Co, Nümbrecht,
Germany
Rundfilter (185mm)
Schleicher & Schnell, Dassel,
Germany
32
3.1.3 Reagenzien
Tabelle 4: Reagenzienübersicht
Reagenzienart
Hersteller
Antikörper- Verdünnungsmittel DAKO
Dako Denmark A/S, Glostrup,
REAL™ Antibody Diulent
Denmark
Färbereagenzien Immunhistochemie,
Dako Denmark A/S, Glostrup,
Dako REAL™ Detection System,
Denmark
Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse:
-
Dako REAL™ Biotinylated
Secondary Antibodies (AB2) (A)
-
Dako REAL™ DAB+ Chromogen
(x50) (C)
-
Dako REAL™ HRP Substrate
Buffer (D)
-
Dako REAL™ Streptavidin
Peroxidase (HRP) (B)
Isopropanol ROTIPURAN® ≥99,8%
Carl Roth GmbH & Co. KG,
(100% / 95% / 90% / 70%)
Karlsruhe, Germany
Hematoxylin DAKO Automation
Dako N.A., Inc. Carpinteria, CA,
USA
Hematoxylin Histological Staining
Dako N.A., Inc. Carpinteria, CA,
Reagent
USA
Xylol (>98%, rein)
Carl Roth GmbH & Co. KG,
Karlsruhe, Germany
33
3.1.4 Puffer und Lösungen
Tabelle 5: Verwendete Puffer und Lösungen
Puffer und Lösungen
Hersteller
Citratpuffer PT Module Buffer, 100x,
LabVision Corp., Fremont,
pH 6,0
CA, USA
Citrat Puffer (pH 6,0; 1:100)
Citrat Puffer
5ml
Aqua dest.
495ml
Waschpuffer DAKO Wash Buffer, 10x,
Dako Denmark A/S, Glostrup,
pH 7,6
Denmark
Waschpuffer (pH 7,6; 1:10)
DekoWash
500ml
Aqua dest.
4500ml
PH 4,01 Technical Buffer
WTW, Weilheim, Germany
PH 7,0 Technical Buffer
WTW, Weilheim, Germany
34
3.1.5 Antikörper
Tabelle 6: Verwendete Antikörper
Konzentration des
Antikörpers
Primärantikörper
Hersteller
gewonnen
aus
Typus
gerichtet
gegen
anti-CD68
Dako,
Hamburg,
Germany
Maus
monoklonal
CD68
1:5.000
KanninAbnova,
Taipei City, chen
Taiwan
monoklonal
CD163
1:100
Maus
Abnova,
Taipei City,
Taiwan
monoklonal
CD206
1:250
(11081401,
clone KP1)
anti-CD163
(MAB1652,
clone K20-T)
anti-MRC1
(H000043601102,
clone 5C11)
35
3.1.6 Software
Tabelle 7: Softwareübersicht
Software
Hersteller
Adobe Photoshop CS
Adobe Systems Software Ireland Limited,
Dublin, Republic of Ireland
Biomas
MSAB, Erlangen, Germany
Microsoft Office Excel 2011
Microsoft, Redmond, WA, USA
Microsoft Office Word 2011
Microsoft, Redmond, WA, USA
Pannoramic Viewer 1.15
3DHISTECH, Budapest, Ungarn
SPSS Statistics 22.0 für
IBM Inc., New York, USA
Mac OS
36
3.2 Methode
Der experimentelle Teil des vorliegenden Dissertationsprojektes wurde im
Forschungslabor der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik des
Universitätsklinikums Erlangen und im Pathologischen Institut der Universität
Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
3.2.1 Patienten- und Probenauswahl
Für die Probenauswahl wurde nach Patienten gesucht, die im Jahre 2011 in
der Mund-, Kiefer und Gesichtschirurgischen Klinik des Universitätsklinikums
Erlangen an einem primären oralen Plattenepithelkarzinom (OSCC) operiert
wurden. Hierzu lag ein Ethikvotum vor (EK No. 45_12Bc). Insgesamt wurden
Gewebeproben von 34 Patienten ausgewählt, die im Rahmen der RoutinePathohistologie zur Diagnostik intraoperativ entnommen wurden. Hierbei
handelte es sich neben Tumorbiopsien um Gewebe, das im Rahmen der
Tumorresektion sowie der Lymphknotenchirurgie gewonnen wurde. Bei
jedem in die Arbeit einbezogenen humanen Probenmaterial wurde von einem
Pathologen sichergestellt, dass es sich um ein orales Plattenepithelkarzinom
handelt. So zeigten die verwendeten Proben die histopathologischen
Kriterien des OSCC, den T-Status pT1 und pT2 und das Grading G1, G2 und
G3. Die ausgewählten Patienten bekamen keine adjuvante präoperative
Radio- oder Chemotherapie und hatten zum Zeitpunkt der Diagnose keine
Fernmetastasen. Von den 34 Proben stammten 11 aus dem Zungengewebe,
11 Proben aus dem Mundboden, 8 Proben aus dem Alveolarkamm, 3 Proben
aus dem Gaumen und 1 Probe aus der Wangenschleimhaut.
Das Durchschnittsalter der (23 männlichen und 11 weiblichen) Patienten
betrug 63 Jahre. Der N-Status der Patienten war in 19 Fällen N0 und in 15
Fällen N+. Das Grading war in 2 Fällen G1, in 26 Fällen G2 und in 6 Fällen
G3.
Patienten mit früherer Radio- oder Chemotherapie, sowie pT3 und pT4
Tumoren wurden in die Arbeit nicht miteinbezogen. Die Entnahme der
Proben erfolgte im Rahmen der Routinehistologie.
37
Das Probenmaterial lag zu Beginn des Dissertationsprojektes bereits
formalinfixiert und paraffineingebettet vor.
3.2.2 Aufbewahrung
Die Gewebeproben wurden in der Gewebebank des CCC Erlangen-Nürnberg
unter der Projektnummer 100035 aufbewahrt.
3.2.3 Schneiden der Proben am Rotationsmikrotom
Die formalinfixierten und paraffineingebetteten Probenblöcke wurden vor
dem Schneiden für mindestens eine Stunde bei ca. -10°C im Gefrierschrank
aufbewahrt, um eine härtere Oberfläche und somit dünnere Schnitte
herstellen zu können. Der zu schneidende Paraffinblock wurde dem
Gefrierschrank entnommen und in das Schlittenmikrotom (Jung HN40, Leica
Instruments GmbH, Nussloch, Germany) eingespannt. Zunächst erfolgte ein
Grobtrieb von ca. 10 µm, bis die Gewebefläche vollständig auf den Schnitten
zu sehen war. Anschließend erfolgte das Feinschneiden in einer Trimmstärke
von 2 µm. Verwendet wurden D-Hartmetallmesser mit einem Winkel von 0°5° (3°) (Feather® Safety Razor Co. Ltd., Osaka, Japan). Die erzeugten 2 µm
dünnen Schnittserien wurden in ein vorgewärmtes, mit Aqua dest. gefülltes
(ca. 46-48°C) Wasserbad (WNB14, Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach,
Germany) befördert. Von jeder Gewebeprobe wurden 10 Schnitte angefertigt
und
auf
Objektträger
(Superfrost
Plus®,
Gerhard
Menzel
GmbH,
Braunschweig, Germany) aufgezogen.
3.2.4 Aufziehen und Trocknen der Paraffinschnitte
Die im Wasserbad gestreckten und durch die Wärme geglätteten Schnitte
wurden einzeln der Länge nach auf Objektträger (Superfrost Plus®, Gerhard
Menzel GmbH, Braunschweig, Germany) aufgezogen. Anschließend mit der
jeweiligen Probennummer beschriftet und in einem Objektträgerständer zum
Trocknen aufbewahrt. Etwa 1-2 Stunden nach dem Schneiden und Aufziehen
38
wurden die Schnitte über Nacht im Wärmeschrank (Modell 200, Memmert
GmbH & Co. KG, Schwabach, Germany) bei ca. 60°C weiter getrocknet.
3.2.5 Entparaffinieren der Paraffinschnitte
Zur Vorbereitung auf die immunhistochemische Färbung wurden die Schnitte
gemäß Standardprotokoll entparaffiniert und somit von einem lipophilen in
einen hydrophilen Zustand gebracht, um eine Antigen-Antikörperbindung zu
erreichen.
Die Paraffinschnitte wurden zur Entparaffinierung drei Mal für je 15 Minuten
in Xylol gelegt. Danach zur Rehydrierung zweimal für je drei Minuten in 100%
Propanol, anschließend zweimal für je drei Minuten in 96% Propanol, einmal
für eine Minute in 90% Propanol und zweimal für je drei Minuten in 70%
Propanol. Zuletzt wurden die Gewebeschnitte für drei Minuten in Aqua dest.
eingetaucht. Zur Weiterbehandlung wurde das Material 30 Minuten in
Citratpuffer (pH 6,0, 1:100, 100°C, LabVision Corp., Fremont, CA, USA)
gekocht, anschließend 30 Minuten abgekühlt. Im weiteren Vorgehen wurden
die Proben aus dem Citratpuffer herausgenommen und bei Raumtemperatur
für 5 Minuten in DAKO Waschpuffer (pH 7,6, 1:10, Dako Denmark A/S,
Glostrup, Denmark) gelagert. Verdünnt wurden Citrat- und Waschpuffer
jeweils mit Aqua dest.
3.2.6 Immunhistochemische Nachweisreaktion
Zur Immunhistochemischen Nachweisreaktion wurde die LSAB-Methode
angewandt.
3.2.6.1 LSAB-Methode
Bei der LSAB-Methode (Labeled (Strept-)Avidin-Biotin-Methode) handelt es
sich um ein indirektes 3-Schritt Verfahren [36]. Es ist das heute am
häufigsten verwendete immunhistochemische Verfahren zum Nachweis von
Antigenen und bietet gegenüber anderen Methoden um Vielfaches höhere
Sensitivitäten [96]. Die Methode macht sich die starke Bindung des Vitamins
Biotin an das Glykoprotein Avidin bzw. Streptavidin zunutze [96]. Avidin wird
39
aus Hühnereiweiß gewonnen [190], Streptavidin aus dem Bakterium
Streptomyces
avidinii
aufeinanderfolgende
unkonjugierter
[36].
Das
Schritte.
Primärantikörper
Verfahren
Zunächst
wird
aufgetragen.
gliedert
auf
Dieser
das
sich
in
drei
Gewebe
bindet
an
ein
sein
entsprechendes Antigen. Danach wird ein biotinmarkierter sekundärer
Brückenantikörper hinzugefügt, welcher an den Primärantikörper bindet. Es
folgt die Bindung des an das Enzym Peroxidase gekoppelten Streptavidins
mit dem Biotin des Sekundärantikörpers. Der Antigen-Antikörperkomplex
wird mit Zugabe von Chromogen optisch sichtbar [36,120] (vgl. Abb. 2 [190]).
Abbildung 2: Schematische Darstellung der LSAB-Methode nach Taylor et al., 2013
3.2.6.2 Immunhistochemische Färbung
Die immunhistochemische Färbung der Proben und Bestimmung der
Oberflächenantigene CD68, CD163 und MRC1 wurde mit der LSAB-Methode
und einem vollautomatisierten Färbegerät (Cytomation Autostainer plus,
DakoCytomation Colorado Inc., Fort Collins, CO, USA), welches in
standardisierten Schritten Pipettierungen, Spülungen und das Einhalten von
Inkubationszeiten
übernimmt,
bei
Raumtemperatur
durchgeführt.
Die
entkalkten und entparaffinierten Objektträger sowie die nötigen Reagenzien
wurden vor Gebrauch in entsprechende Behälter des Autostainers
40
hinzugefügt. Für das Färbekit (Dako Real, Cat. K5001, DakoCytomation
Colorado Inc., Fort Collins, CO, USA) wurde das Standardprotokoll
verwendet.
Die Oberflächenantigene CD68, CD163 und MRC1 wurden markiert, indem
die
Gewebeproben
im
Autostainer
Antikörpern inkubiert wurden.
(21°C,
30min)
mit
spezifischen
Als primäre Antikörper dienten anti-CD68
(11081401, clone KP1, 1:5.000, Dako, Hamburg, Germany), anti-CD163
(MAB1652, clone K20-T, 1:100, Abnova, Taipei City, Taiwan) und anti-MRC1
(H00004360-1102, clone 5C11, 1:250, Abnova, Taipei City, Taiwan). Den
Proben wurden anschließend biotinylierte Sekundärantikörper (Dako REAL™
Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) (A), Dako Denmark A/S, Glostrup,
Denmark) und Streptavidin Peroxidase (HRP) (Dako REAL™ Streptavidin
Peroxidase (HRP) (B), Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark) zugeführt.
Zur Erzielung der optisch sichtbaren Rot-Braunfärbung wurden die Proben
mit DAB+ Chromogen (Dako REAL™ DAB+ Chromogen (x50) (C), Dako
Denmark A/S, Glostrup, Denmark), welches vor Gebrauch mit HRP
Substrate Buffer (Dako REAL™ HRP Substrate Buffer (D), Dako Denmark
A/S, Glostrup, Denmark) verdünnt wurde, behandelt. Um auch Zellkerne
einzufärben, wurden die Objektträger anschließend per Hand 3min in
Hämatoxylin (Hematoxylin Histological Staining Reagent, Dako N.A., Inc.
Carpinteria, CA, USA) gegengefärbt. Überflüssiger Farbstoff wurde mittels
Leitungswasser (10min) und Aqua dest. (5min) abgespült.
Zusätzlich zu den Proben wurden in jedem Färbedurchgang eine Negativund eine Positivkontrolle eingefügt. In der Negativkontrolle wurde der
Primärantikörper durch ein IgG-Isotyp des Primärantikörpers ersetzt, um
falsch positive Ergebnisse zu erkennen. Die Positivkontrolle reagierte auf die
hinzugefügten Antikörper positiv und diente somit der Kontrolle der Färbung.
3.2.7 Eindecken der gefärbten Proben
Die gefärbten Schnitte wurden einzeln aus dem mit Aqua dest. gefüllten
Behälter entnommen und getrocknet. Anschließend wurden zwei bis drei
Tropfen
des
wässrigen
Eindeckmediums
(Aquatex®,
Merck
KGaA,
41
Darmstadt, Germany) auf den Objektträger appliziert und ein der Größe des
Präparates entsprechendes Deckglas luftblasenfrei aufgelegt. Um eine
gleichmäßige Verteilung des Eindeckmittels zu erreichen, wurde mit einer
Pinzette ein leichter Druck auf das Deckglas ausgeübt. Zuletzt wurden die
eingedeckten Objektträger in einer offenen Präparatemappe zum Trocknen
aufbewahrt.
3.2.8 Quantitative immunhistochemische Analyse
Zur Schnittauswertung wurden die Präparate in Kooperation mit dem
Pathologischen Institut der Universität Erlangen-Nürnberg nach der Methode
des ‚whole slide imaging‘ eingescannt, digitalisiert (MIRAX MIDI Scanner,
3DHISTECH, Budapest, Ungarn) und am Computer virtuell mikroskopiert
(Pannoramic Viewer 1.15, 3DHISTECH, Budapest, Ungarn). In jedem Schnitt
wurde durch einen Pathologen sichergestellt, dass eine repräsentative
Region des diagnostizierten OSCC zu finden war. Anschließend wurden die
Bereiche des OSCC, einschließlich des Epithelgewebes und Tumorstromas
untersucht. Daraufhin erfolgte die Auswahl von drei repräsentativen
Gesichtsfeldern je Schnitt, mit einer Gesamtgröße zwischen 1,1mm² und
1,5mm² (Pannoramic Viewer 1.15, 3DHISTECH, Budapest, Ungarn). Zur
Bestimmung der Gesichtsfelder in Lymphknotenpräparaten wurden je
Präparat drei Gesichtsfelder mit der höchsten CD68-Expression erstellt und
als Bilddatei gespeichert. Für die Marker CD163 und MRC1 wurden die
jeweils korrespondierenden CD68-Gesichtsfelder gewählt. In der Auswertung
wurde zwischen den Bereichen des Sinus (Roi1) und Perisinus (Roi2)
unterschieden (s. Abb. 3). Die Abgrenzung der Bereiche erfolgte mit Biomas
(MSAB,
Erlangen,
Germany).
Weiterhin
unterschieden
wurde
im
Lymphknoten vom Sinus und Perisinus die Interfollikuläre Zone (IFZ) (Roi1)
(s. Abb. 4). In den Bereichen der IFZ wurden auch drei Gesichtsfelder pro
Präparat wie oben beschrieben erstellt. Alle standardisierten Gesichtsfelder
wurden als Bilddatei gespeichert und die quantitative Analyse der Antigene
CD68, CD163 und MRC1 mit Biomas (MSAB, Erlangen, Germany)
durchgeführt. Hierzu wurden nur Zellen monozytärer Morphologie sowie
42
Makrophagen als positive Zellen manuell gezählt und die Zellanzahl der
jeweiligen Region pro mm² durch Biomas ermittelt.
Abbildung 3: Gesichtsfeldausschnitt eines LK-Präparates mit CD206/MRC1-Färbung
Markierung aller Zellen monozytärer Morphologie (rote Kreise) innerhalb des Sinus (Roi1)
(oben) und Markierung aller Zellen monozytärer Morphologie (rote Kreise) innerhalb des
Perisinus (Roi2) unten.
43
Abbildung 4: Gesichtsfeldausschnitt der IFZ eines LK-Präparates mit CD206/MRC1Färbung
Markierung aller Zellen monozytärer Morphologie (rote Kreise) innerhalb der IFZ (Roi1).
3.2.9 Statistische Analyse
Die statistische Analyse erfolgt mittels SPSS Statistics 22.0 für Mac OS (IBM
Inc., New York, USA). Zuvor wurden die Daten aus mehreren Schnitten je
Probe und Untersuchungsgruppe aggregiert. Bestimmt wurde die Anzahl der
positiv markierten Zellen pro mm². Zur Darstellung der quantitativen Daten
wurden Punktdiagramme erstellt. Die statistische Signifikanz wurde mit dem
ANOVA-Test und dem Pearson-Korrelationskoeffizienten (r) bestimmt.
3.2.10 Visueller Vergleich der Marker CD163 und CD206/MRC1
Die
oben
beschriebenen
CD163
und
CD206/MRC1
gefärbten
und
digitalisierten Präparate wurden am Computer visuell untersucht (Adobe
Photoshop CS, Adobe Systems Software Ireland Limited, Dublin, Republic of
Ireland) und die Wahrnehmung der Zellanzahl und die Farbintensität der
gefärbten Zellen verglichen. Die Daten wurden in einer Tabelle (Microsoft
Office Excel 2011, Microsoft, Redmond, WA, USA) zusammengefasst und
44
die Ergebnisse prozentual dargestellt. Weiterhin wurde an einem Beispiel
mittels Photoshop CS (Adobe Systems Software Ireland Limited, Dublin,
Republic of Ireland) eine digitale Überlagerung der beiden Färbungen
durchgeführt. Es wurde nach einem Paar deckungsgleicher Gesichtsfelder
mit CD163- und CD206/MRC1-Färbung gesucht. Diese wurden mit Hilfe von
Adobe Photoshop CS (Adobe Systems Software Ireland Limited, Dublin,
Republic of Ireland) jeweils in ihrer Farbgebung (Farbe, Kontrast, Helligkeit)
geändert und anschließend übereinander gelagert und ausgewertet.
3.2.11 Ethische Genehmigung
Für die retrospektive Analyse von histologisch gewonnenem Routinematerial
lag von der Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der FriedrichAlexander Universität Erlangen-Nürnberg ein Ethikvotum (EK No. 45_12Bc)
vor.
45
4
Ergebnisse
4.1 Korrelation der Marker CD163 und MRC1 in LK-Präparaten
In 53 Lymphknotenpräparaten von oralen Plattenepithelkarzinomen (OSCC)
wurde die Zellanzahl/mm² der als positiv gewerteten CD163 und MRC1
Zellen mit monozytärer Morphologie in den Lymphknotenregionen ‚Sinus‘,
‚Perisinus‘ und ‚Sinus gesamt‘ bestimmt und anschließend der PearsonKorrelationskoeffizient (r) berechnet.
Vergleicht man im Sinus die Zellanzahl/mm² der CD163+ Zellen (M=1316,27,
SD=574,90) und MRC1+ Zellen (M=4279,11, SD=1976,64), ergibt sich ein
moderater linearer positiver Zusammenhang mit Signifikanz, r(51)=0,581,
p=0,000 (vgl. Tabelle 8,9; Abb. 5). Im Perisinus ergab der PearsonKorrelationskoeffizient eine starke positive lineare Korrelation, r(51)=0,741.
Der Test war auch hier signifikant, p=0,000. Die Zellanzahl/mm² der CD163+
(M=203,20, SD=120,50) und MRC1+ Zellen (M=263,78, SD=136,94) war im
Perisinus annähernd gleich (vgl. Tabelle 8,9; Abb. 6). Wird der gesamte
Sinus des LK betrachtet und die beiden Marker korreliert, findet man eine
starke positive lineare Beziehung (r(51)=0,809) mit Signifikanz (p=0,000). Die
Zellanzahl/mm² der MRC1+ Zellen (M=1458,60, SD=886,10) war deutlich
höher als die Zellanzahl CD163+ Zellen pro mm² (M=506,42, SD=251,44)
(vgl. Tabelle 8,9; Abb. 7).
In allen drei Fällen war die Beziehung der Marker linear positiv und die Tests
signifikant. Den stärksten Pearson-Korrelationskoeffizienten (r(51)=0,809)
zeigte der Zusammenhang zwischen MRC1+ Zellen/mm² und CD163+
Zellen/mm² im Sinus gesamt. Eine ebenfalls starke Korrelation (r(51)=0,741)
der beiden Marker war im Perisinus zu erkennen und eine moderate
Korrelation
(r(51)=0,581)
im
Sinus
der
LK
(vgl.
Tabelle
9).
Die
Zellanzahl/mm² der MRC1+ Zellen war in allen drei Bereichen stets größer
als die Anzahl der CD163+ Zellen/mm² (vgl. Tabelle 8), jedoch im Perisinus
annähernd gleich. Im Sinus und im Sinus ges. war die MRC1 Zellanzahl/mm²
fast dreimal höher.
46
Tabelle 8: Deskriptive Statistik der Marker CD163/MRC1
Mittelwert
CD163 Sinus LK
Standardabweichung
N
1316,27
574,902
53
CD163 Perisinus LK
203,20
120,502
53
CD163 Sinus ges. LK
506,42
251,443
53
4279,1111
1976,63772
54
MRC1 Perisinus LK
263,7778
136,94007
54
MRC1 Sinus ges. LK
1458,6019
886,10428
54
MRC1 Sinus LK
Tabelle 9: Korrelation der Marker CD163/MRC1
CD163
Pearson -Korrelation
Sinus LK
Sig. (2-seitig)
N
CD163
Pearson -Korrelation
Perisinus LK
Sig. (2-seitig)
N
CD163
Pearson -Korrelation
Sinus ges. LK
Sig. (2-seitig)
N
MRC1
Pearson -Korrelation
Sinus LK
Sig. (2-seitig)
N
MRC1
Pearson -Korrelation
Perisinus LK
Sig. (2-seitig)
N
MRC1
Pearson -Korrelation
Sinus ges. LK
Sig. (2-seitig)
N
CD163
CD163
CD163
MRC1
MRC1
MRC1
Sinus LK
Perisinus LK
Sinus ges.LK
Sinus LK
Perisinus LK
Sinus ges.LK
,608**
,757**
,581**
,373**
,544**
,000
,000
,000
,006
,000
53
53
53
53
53
53
,608**
1
,834**
,502**
,741**
,554**
,000
,000
,000
,000
1
,000
53
53
53
53
53
53
,757**
,834**
1
,718**
,608**
,809**
,000
,000
,000
,000
,000
53
53
53
53
53
53
**
**
**
1
**
,912**
,000
,000
,581
,502
,718
,577
,000
,000
,000
53
53
53
54
54
54
**
**
**
**
1
,648**
,373
,741
,608
,577
,006
,000
,000
,000
53
53
53
54
54
54
**
**
**
**
**
1
,544
,554
,809
,912
,000
,648
,000
,000
,000
,000
,000
53
53
53
54
54
**. Korrelation ist bei Niveau 0,01 signifikant (zweiseitig).
54
47
Abbildung 5: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation im Sinus von LK
Abbildung 6: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation im Perisinus von LK
Abbildung 7: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation im Sinus ges. von LK
48
4.2 Korrelation der Marker CD68 und CD163 in LK-Präparaten
Weiterhin
wurden
im
Sinus,
Perisinus
und
Sinus
ges.
von
53
Lymphknotenpräparaten die Marker CD68 und CD163 verglichen. Im Sinus
wurden die Zellanzahl/mm² der CD68+ Zellen (M=1210,36, SD=471,33) und
die Zellanzahl/mm² der CD163+ Zellen (M=1316,27, SD=574,902) bestimmt.
Der Pearson-Korrelationskoeffizient zeigte eine moderate positive lineare
Korrelation (r(51)=0,658) mit Signifikanz (p=0,000) (vgl. Tabelle 10,11; Abb.
8). Im Perisinus ergab sich ein schwacher positiver linearer Zusammenhang
der beiden Marker, r=0,301. Der Test war signifikant, p=0,029. Die
Mittelwerte
der
Marker
CD68
(M=456,60,
SD=195,05)
und
CD163
(M=203,20, SD=120,50) unterscheiden sich hier deutlich. Mehr als doppelt
so viele CD68+ Zellen/mm² sind im Perisinus zu finden (vgl. Tabelle 10,11;
Abb. 9). Auch im Sinus ges. wurde die Korrelation der Marker untersucht. Zu
sehen ist eine signifikante (p=0,000) und moderate positive Korrelation,
r(51)=0,555 (vgl. Tabelle 10,11; Abb.10). Der Vergleich der CD68+ und
CD163+ Zellen zeigt in allen oben beschriebenen Fällen eine positive lineare
Korrelation. Den stärksten Pearson-Korrelationskoeffizienten erreichte der
Zusammenhang der Marker im Sinus des LK mit r=0,658 im Vergleich zu den
Werten r=0,301 im Perisinus und r=0,555 im Sinus gesamt. Die Tests waren
stets signifikant (vgl. Tabelle 11). Die Mittelwerte ergaben in den Bereichen
Perisinus und Sinus ges. eine höhere CD68+ Zellanzahl/mm² im Vergleich
zur CD163+ Zellanzahl/mm². Im Sinus waren mehr CD163+ Zellen/mm² zu
finden als CD68+ Zellen/mm² (vgl. Tabelle 10).
Tabelle 10 : Deskriptive Statistik der Marker CD68/CD163
Mittelwert
CD68 Sinus LK
Standardabweichung
N
1210,3585
471,33346
53
CD68 Perisinus LK
456,6038
195,04904
53
CD68 Sinus ges. LK
663,3302
244,19442
53
1316,27
574,902
53
CD163 Perisinus LK
203,20
120,502
53
CD163 Sinus ges. LK
506,42
251,443
53
CD163 Sinus LK
49
Tabelle 11: Korrelation der Marker CD68/CD163
CD163
Pearson-Korrelation
Sinus LK
Sig. (2-eitig)
N
CD163
Pearson-Korrelation
Perisinus LK
Sig. (2-eitig)
N
CD163
Pearson-Korrelation
Sinus ges. LK
Sig. (2-eitig)
N
CD68
Pearson-Korrelation
Sinus LK
Sig. (2-eitig)
N
CD163
CD163
CD163
CD68
CD68
CD68
Sinus LK
Perisinus LK
Sinus ges. LK
Sinus LK
Perisinus LK
Sinus ges. LK
1
,608
**
,136
,333
**
**
,757
,658
*
,000
,000
,000
,330
,015
53
53
53
53
53
53
**
1
,608
,000
53
53
**
**
,757
,834
**
,834
**
,378
,000
,029
,005
53
53
53
53
1
**
*
,340
,555**
,000
,013
,000
53
53
53
1
**
,767**
,000
,000
,000
53
53
53
**
**
**
,489
*
,301
,000
,000
,658
**
,489
,657
,657
,515
,000
,000
,000
53
53
53
53
53
53
1
,875**
CD68
Pearson-Korrelation
,136
,301*
,340*
,515**
Perisinus LK
Sig. (2-eitig)
,330
,029
,013
,000
53
53
53
53
53
53
*
**
**
**
**
1
N
CD68
Pearson-Korrelation
,333
Sinus ges. LK
Sig. (2-eitig)
,015
,005
,000
,000
,000
53
53
53
53
53
N
,378
,555
,767
,000
,875
**. Korrelation ist bei Niveau 0,01 signifikant (zweiseitig).
*. Korrelation ist bei Niveau 0,05 signifikant (zweiseitig).
Abbildung 8 : Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation im Sinus von LK
53
50
Abbildung 9: Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation im Perisinus von LK
Abbildung 10: Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation im Sinus ges. von LK
51
4.3 Korrelation der Marker CD68 und MRC1 in LK-Präparaten
In 53 Lymphknotenpräparaten von OSCC wurde die Zellanzahl/mm² der als
positiv gewerteten CD68 und MRC1 Zellen korreliert. Gezählt wurden auch
hier nur Zellen monozytärer Morphologie im Sinus, Perisinus und im Sinus
ges. von LK. Im Sinus ergab sich ein moderater positiver linearer
Zusammenhang (r(51)=0,690) zwischen der Zellanzahl/mm² CD68+ Zellen
(M=1210,36,
SD=471,33)
und
der
Zellanzahl/mm²
MRC1+
Zellen
(M=4279,11, SD=1976,64) (vgl. Tabelle 12,13; Abb. 11). Auch im Perisinus
zeigte sich ein moderater positiver linearer Zusammenhang und eine
signifikante Korrelation, r(51)=0,400, p=0,003. Die Zellanzahl/mm² der
CD68+ Zellen (M=456,60, SD=195,05) ist hier annähernd doppelt so hoch
wie
die
bestimmte
Zellanzahl/mm²
der
MRC1+
Zellen
(M=263,78,
SD=136,94) (vgl. Tabelle 12,13; Abb. 12). Im Sinus ges. war eine deutlich
höhere Zellanzahl/mm² an MRC1+ Zellen (M=1458,60, SD=886,10) zu finden
im Vergleich zu CD68+ Zellen (M=663,33, SD=244,19). Der PearsonKorrelationskoeffizient ergab auch hier eine moderate positive lineare
Korrelation (r(51)=0,658) (vgl. Tabelle 12,13; Abb.13). Der Vergleich
zwischen CD68 und MRC1 war in allen oben beschriebenen Fällen
signifikant (p=0,000-0,003) (vgl. Tabelle 13). Die Korrelation zeigte stets eine
moderate positive lineare Beziehung zwischen den beiden Markern. Den
stärksten Wert (r(51)=0,690) erreichte die Korrelation der Marker im Sinus
(vgl. Tabelle 13). In den drei ausgewerteten Bereichen war lediglich der
Mittelwert der CD68+ Zellen im Perisinus des LK höher als der Mittelwert der
MRC1+ Zellen (vgl. Tabelle 12). Im Sinus und im Sinus ges. war eine
deutlich höhere MRC1+ Zellanzahl/mm² zu finden.
Tabelle 12: Deskriptive Statistik der Marker CD68/MRC1
Mittelwert
CD68 Sinus LK
Standardabweichung
N
1210,3585
471,33346
53
CD68 Perisinus LK
456,6038
195,04904
53
CD68 Sinus ges. LK
663,3302
244,19442
53
4279,1111
1976,63772
54
MRC1 Perisinus LK
263,7778
136,94007
54
MRC1 Sinus ges. LK
1458,6019
886,10428
54
MRC1 Sinus LK
52
Tabelle 13: Korrelation der Marker CD68/MRC1
MRC1
Pearson-Korrelation
Sinus LK
Sig. (2-seitig)
N
MRC1
Pearson-Korrelation
Perisinus LK
Sig. (2-seitig)
N
MRC1
Pearson-Korrelation
Sinus ges.LK
Sig. (2-seitig)
N
CD68
Pearson-Korrelation
Sinus LK
Sig. (2-seitig)
N
CD68
Pearson-Korrelation
Perisinus LK
Sig. (2-seitig)
N
CD68
Pearson-Korrelation
Sinus ges.LK
Sig. (2-seitig)
N
MRC1
MRC1
MRC1
CD68
CD68
CD68
Sinus LK
Perisinus LK
Sinus ges.LK
Sinus LK
Perisinus LK
Sinus ges.LK
1
**
,577
**
,912
**
,690
**
,495
**
,621
,000
,000
,000
,000
,000
54
54
54
53
53
53
**
1
,577
,000
**
,648
**
,441
**
,400
**
,429
,000
,001
,003
,001
54
54
54
53
53
53
,912**
,648**
1
,650**
,476**
,658**
,000
,000
,000
,000
,000
54
54
54
53
53
53
**
**
**
1
**
,767**
,000
,000
,690
,441
,650
,515
,000
,001
,000
53
53
53
53
53
53
**
**
**
**
1
,875**
,495
,400
,476
,515
,000
,003
,000
,000
,000
53
53
53
53
53
53
,621**
,429**
,658**
,767**
,875**
1
,000
,001
,000
,000
,000
53
53
53
53
53
**. Korrelation ist bei Niveau 0,01 signifikant (zweiseitig).
Abbildung 11: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation im Sinus von LK
53
53
Abbildung 12: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation im Perisinus von LK
Abbildung 13: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation im Sinus ges. von LK
54
4.4 Korrelation der Marker CD68, CD163 und MRC1 in IFZ
In 52 bzw. 53 Lymphknotenpräparaten von oralen Plattenepithelkarzinomen
wurde jeweils innerhalb der Interfollikulären Zone (IFZ) die Zellanzahl pro
mm² der als positiv gewerteten C68, CD163 und MRC1 Zellen mit
monozytärer Morphologie bestimmt. Die Ergebnisse wurden korreliert. Die
Auswertungen zeigen, dass in IFZ ausschließlich ein positiver linearer
Zusammenhang zwischen den Markern CD68/CD163, CD68/MRC1 und
MRC1/CD163 existiert (vgl. Tabelle 15). Vergleicht man die Zellanzahl/mm²
der CD68+ Zellen (M=416,55, SD=210,59) und CD163+ Zellen (M=120,49,
SD=92,701), ergibt sich eine moderate positive lineare Korrelation mit
Signifikanz, r(50)=0,311, p=0,025 (vgl. Tabelle 14,15; Abb. 14). CD68+
Zellen (M=416,55, SD=210,59) und MRC1+ Zellen (M=199,42, SD=109,26)
ergaben ebenfalls eine moderate signifikante positive lineare Korrelation,
r(51)=0,383, p=0,005 (vgl. Tabelle 14,15; Abb. 15). Auch zwischen den
Markern MRC1 (M=199,42, SD=109,26) und CD163 (M=120,49, SD=92,701)
ergab sich ein moderater positiver linearer Zusammenhang und eine
signifikante Korrelation, r(50)=0,387, p=0,005 (vgl. Tabelle 14,15; Abb. 16).
Ihr Wert war im Vergleich zu den anderen Markern mit stärkstem linearen
Zusammenhang (r(50)=0,387 im Vergleich zu r(50)=0,311 und r(51)=0,383)
(vgl. Tabelle 15). Zu sehen ist, dass eine höhere CD68+ Zellanzahl/mm² eine
höhere CD163+ Zellanzahl/mm² bzw. eine höhere MRC1+ Zellanzahl/mm²
bedeutet. Eine steigende Anzahl MRC1+ Zellen/mm² geht mit einer
steigenden CD163+ Zellanzahl/mm² einher (vgl. Abb. 14-16). Der PearsonKorrelationskoeffizient ergab in allen Fällen eine moderate positive
Korrelation. Alle Untersuchungen waren signifikant (vgl. Tabelle 15). Der
Mittelwert CD68+ Zellen war im Vergleich zu dem Mittelwert MRC1+ Zellen
mehr als doppelt so hoch und im Vergleich zu dem Mittelwert CD163+ Zellen
fast 3,5 mal höher. Die Mittelwerte der CD163+ und MRC1+ Zellen können
als annähernd gleich betrachtet werden (vgl. Tabelle 14).
55
Tabelle 14: Deskriptive Statistik der Marker CD68/CD163/MRC1
Mittelwert
CD68 IFZ LK
Standardabweichung
N
416,5472
210,59070
53
CD163 IFZ LK
120,49
92,701
52
MRC1 IFZ LK
199,4245
109,26042
53
Tabelle 15: Korrelation der Marker CD68/CD163/MRC1
CD163 IFZ LK
CD163 IFZ LK
Pearson-Korrelation
CD68 IFZ LK
,311*
,387**
,025
,005
52
52
52
*
1
,383**
1
Sig. (2-seitig)
N
CD68 IFZ LK
Pearson-Korrelation
,311
Sig. (2-seitig)
,025
N
MRC1 IFZ LK
Pearson-Korrelation
Sig. (2-seitig)
N
MRC1 IFZ LK
,005
52
53
53
**
**
1
,387
,383
,005
,005
52
53
*. Korrelation ist bei Niveau 0,05 signifikant (zweiseitig).
**. Korrelation ist bei Niveau 0,01 signifikant (zweiseitig).
Abbildung 14: Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation in IFZ
53
56
Abbildung 15: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation in IFZ
Abbildung 16: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation in IFZ
57
4.5
Ergebnis des visuellen Vergleichs der Marker CD163 und
CD206/MRC1
Um die Makrophagenmarker CD163 und CD206/MRC1 vergleichen zu
können, wurden 55 Präparate von LK und LKM mit 210 Gesichtsfeldern
untersucht. Um die Zellfärbungen der beiden Marker visuell zu vergleichen
und um somit zu beurteilen, inwieweit durch sie die gleiche Zellpopulation
angefärbt wird, wurden nur deckungsgleiche Gesichtsfelder berücksichtigt.
102
Gesichtsfelder
der
LK-
und
LKM-Präparate
mit
CD163-
und
CD206/MRC1-Färbung ergaben nur eine unzureichende Deckungsgleichheit.
108 Gesichtsfelder wurden visuell untersucht. Verglichen wurden die
Wahrnehmung der Zellanzahl und die Farbintensität der gefärbten Zellen
(vgl. Tabelle 16).
In 105 Gesichtsfeldern (97,22%) waren bei den CD206/MRC1 gefärbten
Proben visuell mehr Zellen zu erkennen als bei den CD163 gefärbten Proben
(s. Abb. 17). Nur in drei Gesichtsfeldern (2,78%) war kein eindeutiges
Ergebnis zu erkennen (s. Abb. 18). Die Zellanzahl der CD163 gefärbten
Zellen war in keinem Fall deutlich höher als die Zellanzahl der CD206/MRC1
gefärbten Zellen. In 85 Gesichtsfeldern (78,70%) erschien die Farbintensität
der CD206/MRC1-Zellfärbung dunkler im Vergleich zur CD163-Zellfärbung
(s. Abb. 17). Jedoch war in 23 der 108 ausgewerteten Gesichtsfeldern
(21,30%) die Farbintensität der beiden Färbungen gleich (s. Abb. 18). In
keinem der untersuchten Präparate war die CD163-Färbung dunkler als die
CD206/MRC1-Färbung. Die CD163-Färbung zeigten im Vergleich zur
CD206/MRC1-Färbung nahezu ausschließlich niedrigere Zellzahlen und in
der Mehrzahl der Proben eine hellere Farbintensität. Die CD206/MRC1Färbung ergab im Vergleich zur CD163-Färbung in 97,22% eine höhere
Zellanzahl und in einem Großteil der Gesichtsfelder eine stärkere
Farbintensität (vgl. Tabelle 16).
Weiterhin wurde an einem Beispiel eine digitale Überlagerung zweier
Färbungen durchgeführt (s. Abb. 19).
Die
CD163-
und
CD206/MRC1-Färbung
wurden
nach
veränderter
Farbgebung übereinander gelagert. Zu sehen ist in einem vergrößerten
Ausschnitt, dass einige Zellen von beiden Markern gefärbt wurden (s. Abb.
58
19, blaue Pfeile). Jedoch sind auch Zellen zu erkennen, die nur durch die
CD206/MRC1 Färbung markiert wurden (s. Abb. 19, grüne Pfeile).
Tabelle 16: Vergleich der Marker CD163 und CD206/MRC1 hinsichtlich Zellanzahl und
Farbintensität in LK- und LKM-Präparaten
CD163 Zellen
Gesichtsfeldnr.
weniger
CD163 Farbintensität
mehr
heller
dunkler
MRC1 Zellen
weniger
MRC1 Farbintensität
mehr
heller
dunkler
63 P8 1
X
x
x
x
2
X
x
x
x
3
X
x
x
x
66 P8 1
X
x
x
x
2
X
x
x
x
3
X
x
x
x
94 P11 1
X
x
x
x
2
X
x
x
x
3
X
x
x
x
96 P12 1
X
x
x
x
2
X
x
x
x
3
98 P12 1
X
X
x
x
x
x
x
x
2
3
X
X
x
x
x
x
x
x
104 P12 1
2
X
X
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
3
138 P17 1
X
nicht beurteilbar
x
Farbintensität gleich
2
3
nicht beurteilbar
nicht beurteilbar
Farbintensität gleich
Farbintensität gleich
139 P12 1
2
X
X
x
x
3
209 P27 1
X
X
x
Farbintensität gleich
x
x
2
X
Farbintensität gleich
x
3
X
Farbintensität gleich
x
216 P29 1
2
X
X
x
x
x
x
x
x
3
221 P29 1
X
X
x
x
x
x
x
x
2
3
X
X
x
x
x
x
x
x
233 P32 1
2
X
X
x
x
x
x
x
x
3
242 P34 1
X
X
x
x
x
x
x
x
2
3
X
X
x
x
x
x
x
x
248 P36 1
2
X
X
x
x
x
x
x
x
3
269 P38 1
X
X
x
x
x
x
x
x
2
3
X
X
x
x
x
x
x
x
269 P38 1
2
X
X
x
x
x
x
x
x
3
273 P39 1
X
X
x
x
x
x
x
x
2
3
X
X
x
x
x
x
x
x
278 P40 1
2
X
X
x
x
x
x
x
x
3
283 P41 1
X
X
x
x
x
x
x
x
59
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
289 P42 1
x
x
x
x
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
293 P43 1
x
Farbintensität gleich
x
2
x
Farbintensität gleich
x
3
x
Farbintensität gleich
x
298 P44 1
x
x
x
x
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
304 P45 1
x
x
x
x
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
304 P45 1
x
x
x
x
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
307 P46 1
x
Farbintensität gleich
x
2
x
Farbintensität gleich
x
3
x
Farbintensität gleich
x
308 P46 1
2
x
x
Farbintensität gleich
Farbintensität gleich
x
x
3
316 P49 1
x
x
Farbintensität gleich
Farbintensität gleich
x
x
2
x
Farbintensität gleich
x
3
x
Farbintensität gleich
x
320 P50 1
x
x
x
x
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
328 P52 1
x
x
x
x
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
340 P55 1
x
x
x
x
2
x
x
x
x
3
x
x
x
x
349 P58 1
x
Farbintensität gleich
x
2
x
Farbintensität gleich
x
3
x
Farbintensität gleich
x
64 P8 1
2
x
x
x
x
x
x
x
x
3
249 P36 1
x
x
x
x
x
x
x
x
2
3
x
x
x
x
x
x
x
x
132 P21 2
3
x
x
x
x
x
x
x
x
211 P28 1
2
x
x
x
x
x
x
x
x
277 P40 2
3
x
x
322 P50 1
2
x
x
x
x
x
x
x
x
55 P7 1
x
x
x
x
Farbintensität gleich
Farbintensität gleich
x
x
60
Abbildung 17: Gesichtsfeld eines LKM-Präparates mit CD163-Färbung (oben) und
CD206/MRC1-Färbung (unten)
Zu sehen ist der deutliche visuelle Unterschied zwischen der markierten Zellanzahl sowie
der Farbintensität der CD163-Färbung (oben) im Vergleich zur CD206/MRC1-Färbung
(unten).
61
Abbildung 18: Gesichtsfeld eines LK-Präparates mit CD163-Färbung (oben) und
CD206/MRC1-Färbung (unten)
Die visuelle Beurteilung der Zellanzahl und der Farbintensität kann in diesem Gesichtsfeld
kein eindeutiges Ergebnis liefern.
62
Abbildung 19: Digitale Überlagerung einer CD163- und CD206/MRC1-FärbungDie
CD163-Färbung (oben) sowie die CD206/MRC1-Färbung (Mitte) wurden in ihrer Farbgebung
geändert und übereinander gelagert (unten). In der Vergrößerung (unten) zeigen die blauen
Pfeile die Deckungsgleichheit der Färbungen, die grünen Pfeile zeigen Zellen, die nur durch
die CD206/MRC1-Färbung markiert wurden.
63
5
Diskussion
Das OSCC gehört weltweit zu den acht häufigsten malignen Tumoren und es
ist die am häufigsten vorkommende maligne orale Neoplasie [68,167,214].
Zum Zeitpunkt der Diagnose befindet sich die Mehrheit der OSCC in einem
fortgeschrittenen Stadium [25,167,202] und in 50% der Fälle sind bereits
Lymphknotenmetastasen vorhanden [39,189]. Diese sind der stärkste
prognostische Faktor oraler Plattenepithelkarzinome ([50]; [204] zitiert nach
[206]). Bei der Lymphknotenmetastasierung spielt die Tumorimmunologie
eine entscheidende Rolle. Sie genauer zu verstehen ist von großer
Bedeutung, um die Prognose und Überlebenswahrscheinlichkeit des OSCC
zu verbessern [94,110,152]. Ferner liefern die Ergebnisse einer Studie den
Hinweis, dass die Prognose von OSCC nicht alleine von den in der TNMKlassifikation
zusammengefassten
Faktoren
wie
Tumorgröße
und
Metastasierung abhängt, sondern die Tumorimmunologie ebenfalls einen
besonderen Stellenwert einnimmt [206]. Ein besonderes Augenmerkt wird
auch auf die Makrophagenpolarisation gerichtet. Makrophagen entstehen
aus Monozyten [111,113]. Diese werden durch Moleküle aus dem
Blutkreislauf beispielsweise in das Tumorgewebe rekrutiert [19,109,113,176].
Dort werden sie durch verschiedene Stimuli zu ausgereiften Makrophagen,
den ‚klassisch‘ aktivierten M1- oder den ‚alternativ‘ aktivierten M2Makrophagen bzw. zu TAM polarisiert. TAM ähneln überwiegend dem M2Makrophagenphänotyp [112,113,176]. Sie sind die im Tumorstroma am
häufigsten vorkommenden Immunzellen ([110,145,150] zitiert nach [183])
und
spielen
in
der
Tumorimmunologie
und
Tumorentstehung
eine
entscheidende Rolle [72,176]. Die Polarisation in Richtung eines M2Makrophagenphänotyps in OSCC ist im Gegensatz zu vielen anderen
Tumorarten weitestgehend ungeklärt. Um M2-Makrophagen und somit auch
TAM zu identifizieren, wurden in diesem Dissertationsprojekt die drei
Antikörper anti-CD68, anti-CD163 und anti-CD206/MRC1 verwendet, die an
spezifische Oberflächenantigene der TAM binden und anschließend durch
immunhistochemische
Färbungen
sichtbar
gemacht
wurden.
Das
Oberflächenantigen CD68 gilt als der beste und am häufigsten verwendete
Marker zur Identifizierung monozytärer Zellen [41,78,149,183]. M1- und M2-
64
Makrophagen exprimieren ihn in gleichem Maße. Außerdem dient er der
Identifizierung von TAM in Tumorgeweben [52,101,103]. Der MakrophagenScavengerrezeptor CD163 wird nur auf Zellen monozytärer Abstammung,
darunter auch TAM, exprimiert [48,77,194] und ist ein spezifisches
Oberflächenantigen
der
‚alternativ‘
aktivierten
M2-Makrophagen
[48,169,173]. Der Mannoserezeptor CD206/MRC1 gilt ebenfalls als ein
zuverlässiger
Indikator
für
M2-Makrophagen
und
TAM
mit
M2-
Makrophagenphänotyp [4,115,127,177]. Eine vergleichende Analyse der
beiden M2-Makrophagenmarker an immunhistochemischen Präparaten
wurde bis jetzt nicht publiziert. Ziel des vorliegenden Dissertationsprojektes
war es, die Expression der Marker zu vergleichen und festzustellen, inwiefern
durch anti-CD163 und anti-CD206/MRC1 die gleiche Zellpopulation markiert
wird.
Korreliert
wurden
Makrophagenmarker
in
hierzu
52
bzw.
die
53
drei
oben
beschriebenen
Lymphknotenpräparaten
oraler
Plattenepithelkarzinome. Die Zellanzahl/mm² der als positiv gewerteten
CD68, CD163 und CD206/MRC1 Zellen mit monozytärer Morphologie wurde
in den Lymphknotenregionen ‚Sinus‘, ‚Perisinus‘, ‚Sinus gesamt‘ und ,IFZ‘
bestimmt
und
anschließend
der
Pearson-Korrelationskoeffizient
(r)
berechnet.
Außerdem wurden die Marker CD163 und CD206/MRC1
hinsichtlich
der
gefärbten
Zellanzahl
und
Farbintensität
in
108
deckungsgleichen Gesichtsfeldern verglichen und eine digitale Überlagerung
der beiden Färbungen durchgeführt.
Da die beiden Antigene CD163 und CD206/MRC1 auf M2-Makrophagen
sowie TAM exprimiert werden [4,48,77,115,127,169,173,177,194], liegt die
Vermutung nahe, dass durch ihre jeweiligen Antikörper die gleiche
Zellpopulation
Zellanzahl/mm²
markiert
der
wird.
CD163+
Vergleicht
und
man
die
CD206/MRC1+
Mittelwerte
der
Zellen
den
in
ausgewerteten Lymphknotenbereichen, müssten diese übereinstimmen. Die
Daten dieser Arbeit weisen hingegen in der markierten Zellanzahl/mm²
deutliche Unterschiede auf. Die Zellanzahl/mm² der CD206/MRC1+ Zellen
war in den Bereichen des Sinus, Perisinus und des Sinus ges. stets größer
als die Anzahl der CD163+ Zellen/mm², wenn auch im Perisinus annähernd
gleich (vgl. Tabelle 8). In den Bereichen des Sinus und Sinus ges. war die
Zellanzahl/mm² der CD206/MRC1+ Zellen nahezu dreimal höher als die
65
CD163+ Zellanzahl/mm². Das CD206/MRC1-Antigen ist wie oben bereits
beschrieben ein zuverlässiger Indikator für M2-Makrophagen sowie TAM mit
M2-Phänotyp
[4,115,127,177].
In
Studien
konnten
besonders
viele
CD206/MRC1-Antigene auf TAM in Tumoren nachgewiesen werden [4,9].
Dieses Ergebnis korreliert mit den Daten dieser Arbeit. Eine weitere
Möglichkeit zur Erklärung der hohen CD206/MRC1-Anzahl könnte sein, dass
nach neueren Studien nicht nur Makrophagen sondern auch Monozyten
während ihres Reifeprozesses den Rezeptor exprimieren [115] und somit
eine höhere Zellanzahl durch die CD206/MRC1-Antikörper detektiert wird.
CD163-Antigene hingegen sind auf frisch isolierten Monozyten bzw. in neu
ins Gewebe infiltrierenden Makrophagen nicht oder nur in geringer
Expression (5-30%) zu finden [10,77,89,184]. Die höhere CD206/MRC1+
Zellanzahl/mm² zeigte sich vor allem in den Bereichen des Sinus der
ausgewerteten LK-Präparate. Diesem sollte deshalb besondere Beachtung
geschenkt werden. Der Sinus tritt als erste anatomische Region des vom
Tumor drainierten LK in direkten Kontakt zur afferenten Lymphe und dadurch
auch zum Tumor selbst [185]. Tumorantigene und Zytokine werden im Sinus
durch Makrophagen drainiert [185] und diese stehen im Verdacht, die
Makrophagenphysiologie
Antiinflammatorische
im
Sinus
M1-Makrophagen
zu
beeinflussen
könnten
hierdurch
[185].
zu
pro-
inflammatorischen und tumorfördernden M2-Makrophagen umgewandelt
werden. M2-Makrophagen könnten weiterhin zur Immuntoleranz führen und
das Metastasenwachstum fördern [206]. Weiterhin zeigt die hohe Anzahl der
CD206/MRC1+ Zellen die Makrophagenpolarisation in Richtung des M2Phänotyps im Sinus auf. Folglich könnte so die erhöhte CD206/MRC1+
Zellanzahl sowie M2-Makrophagenanzahl im Sinus begründet werden. In der
Literatur wird der CD163-Marker ebenfalls als M2-Makrophagenmarker
beschrieben [95]. TAM exprimieren den Scavengerrezeptor CD163. Geht
man davon aus, dass alle M2-Makrophagen einschließlich TAM mit M2Makrophagenphänotyp
durch
die
Antikörper
anti-CD163
und
anti-
CD206/MRC1 markiert wurden, muss die trotz dessen höhere MRC1+
Zellanzahl geklärt werden. Weitere Untersuchungen hierzu sind anzustreben.
Niedrigere CD163+ Zellzahlen/mm² könnten des Weiteren ein Hinweis darauf
sein, dass TAM möglicherweise trotz M2-Phänotyp bzw. auf Grund
66
verschiedener
Stimuli
unterschiedliche
CD163-
und
CD206/MRC1-
Antigenzahlen exprimieren bzw. weitere Zellen monozytärer Morphologie
durch
CD206/MRC1-Antikörper
markiert
werden.
Untersuchungen
diesbezüglich sollten in Erwägung gezogen werden. Eine weitere Vermutung
aufgrund der niedrigen Anzahl CD163+ Zellen ist, dass einige der
Bindungsstellen
der
CD163-Antigene
durch
Bakterien
[49],
Viren
[161,196,197] oder das apoptoseinduzierende Protein TWEAK [20] besetzt
wurden, die CD163-Antikörper nicht daran binden konnten und eine Färbung
der CD163-antigentragenden Zelle nicht zustande kam. Besonders in LK
scheint dies auf Grund der Drainagefunktion [185] plausibel.
Auch im Vergleich zur CD68+ Zellanzahl/mm² waren in den Bereichen des
Sinus und Sinus gesamt deutlich mehr MRC1+ Zellen/mm² zu finden.
Lediglich der Mittelwert der CD68+ Zellen im Perisinus des LK war höher als
der Mittelwert der MRC1+ Zellen (vgl. Tabelle 12). Diese und die bereits
diskutierten Daten sind ein Hinweis darauf, dass größtenteils TAM bzw. M2Makrophagen in Sinussen von LK zu finden sind. Daraus kann auch
geschlossen werden, dass im Sinus eine Makrophagenpolarisation in
Richtung des M2-Makrophagenphänotypen stattfindet. Die erhöhte CD68+
Anzahl im Perisinus kommt eventuell durch ein hohes Aufkommen an M1Makrophagen
zustande.
Anhand
von
Doppelfärbungen
könnte
herausgefunden werden, ob tatsächlich mehr CD206/MRC1+ Zellen/mm² zu
finden sind, oder ob weitere Zellen monozytärer Morphologie das
CD206/MRC1-Antigen exprimieren und diese ebenfalls angefärbt werden
bzw., ob TAM in geringerem Maße CD163-Antigene exprimieren im
Vergleich zu CD206/MRC1-Antigenen.
Im Vergleich zur Zellanzahl/mm² der CD68+ und CD163+ Zellen waren auch
hier im Sinus mehr CD163+ Zellen zu finden (vgl. Tabelle 10). Auch hier
zeigt
der
Vergleich
eine
Makrophagenpolarisation
in
Richtung
der
antiinflammatorischen M2-Makrophagen im Sinus. Außerdem wurde in der
Literatur beschrieben, dass die Anzahl der CD163-Oberflächenantigene mit
der Differenzierung von Monozyten zu ausgereiften Makrophagen zunimmt
[89,162]. Ob es sich allerdings bei den ausgewerteten Zellen in höherer
Anzahl um ausgereifte Makrophagen handelt und dies die Erklärung für eine
höhere CD163+ Zellanzahl/mm² ist, konnte nicht bestimmt werden.
67
Weiterhin waren im Perisinus und Sinus ges. mehr CD68+ Zellen zu finden
als CD163+ Zellen (vgl. Tabelle 10). Erklärt werden könnte dieses Ergebnis
dadurch, dass CD68-Antikörper in gleichem Maße CD68-Antigene auf M1sowie auf M2-Makrophagen binden [52,101,103] und somit eine höhere
Zellanzahl gefärbt wird. In dieser Arbeit wurden alle Zellen monozytärer
Morphologie als positiv gewertet. Eine Unterscheidung zwischen M1- und
M2-Makrophagen war nicht möglich.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Ergebnissen im Sinus, Perisinus
und im gesamten Sinus, zeigen die Ergebnisse der Zellanzahl/mm² der
Marker in IFZ Werte, die mit der gegenwärtigen Literatur übereinstimmen.
Betrachtet man die Zellanzahl/mm² der Marker in IFZ, zeigt der Mittelwert
CD68+ Zellen im Vergleich zu dem Mittelwert MRC1+ Zellen eine mehr als
doppelt so hohe Zellanzahl/mm² und im Vergleich zu dem Mittelwert CD163+
Zellen eine fast 3,5 mal höhere. Dies belegt, wie bereits in der Literatur
beschrieben, dass nicht nur M2-Makrophagen von CD68-Antikörpern
markiert werden, sondern auch weitere Zellen monozytären Ursprungs wie
M1-Makrophagen [52,101,103]. Da mehr als doppelt so viele CD68+ Zellen
im Vergleich zu MRC1+ Zellen gefunden wurden, sollte die Frage gestellt
werden, ob daraus abgeleitet in IFZ mehr M1-Makrophagen als M2Makrophagen zu finden sind. Dies könnte den Verdacht bestätigen, dass im
Sinus bereits eine Makrophagenpolarisation stattfindet [185,206], während in
anderen LK-Regionen zunächst eventuell noch M1-Makrophagen vorhanden
sind. Die Bestätigung dieser Vermutung wäre eine weitere Hilfe, die
Makrophagenpolarisation und Tumorimmunologie des OSCC besser zu
verstehen.
Die Mittelwerte der CD163+ und MRC1+ Zellen in der IFZ können als
annähernd gleich betrachtet werden (vgl. Tabelle 14). Anhand dieses
Ergebnisses kann man vermuten, dass die CD163- und CD206/MRC1Makrophagenmarker in IFZ die gleichen M2-Makrophagen anfärben. Stets zu
beachten ist, dass es sich bei den ausgewerteten Präparaten um
Schnittserien handelt. Dies bedeutet, dass nicht auf jedem Präparat die exakt
gleichen Zellen zu finden und die Ergebnisse somit kritisch zu betrachten
sind. Ferner war die Zellzählung der CD206/MRC1-Gesichtsfelder auf Grund
der dunklen Färbung, hoher Zellzahlen und einer hohen Zelldichte erschwert,
68
so dass Doppelzählungen einiger Zellen nicht ausgeschlossen werden
können.
Um ferner zu beurteilen, inwieweit durch die beiden Antikörper
anti-CD163 und anti-CD206/MRC1 die gleiche Zellpopulation markiert wird,
wurden in 108 deckungsgleichen Gesichtsfeldern die Wahrnehmung der
gefärbten Zellanzahl und die Farbintensität verglichen, sowie eine digitale
Überlagerung der beiden Färbungen durchgeführt.
In 97,22% der CD206/MRC1 gefärbten Proben waren mehr Zellen zu sehen
als in den CD163 gefärbten Proben. In nur 2,78% war kein eindeutiges
Ergebnis erkennbar. Die Zellanzahl der CD163 gefärbten Zellen war in
keinem Fall deutlich höher als die Zellanzahl der CD206/MRC1 gefärbten
Zellen. Da beide Antigene auf M2-Makrophagen exprimiert werden, liegt die
Vermutung nahe, dass durch anti-CD163- und anti-CD206-Antikörper die
gleiche Zellpopulation angefärbt wird. Die Ergebnisse dieser Dissertation
zeigen jedoch auch hier einen deutlichen Unterschied der Färbungen. Wie
oben bereits erwähnt, wurden in Studien CD206/MRC1+ Zellen besonders in
pathologischen Geweben, vor allem aber auf TAM mit M2-Polarisierung in
Tumoren gefunden [4,9]. Dies könnte das höhere Vorkommen der
CD206/MRC1+ Zellen in dieser Arbeit erklären, da es sich bei den
untersuchten Proben um LK und LKM oraler Plattenepithelkarzinome
handelt. CD163+ Zellen hingegen kommen in einer hohen Anzahl in
Heilungsphasen von akut oder chronisch entzündetem Gewebe und in
Wundheilungsphasen vor ([199] zitiert nach [48]). Eine weitere Erklärung der
niedrigeren CD163+ Zellanzahl könnte sein, dass wie beschrieben, neu ins
Gewebe infiltrierende Makrophagen keine oder nur geringe CD163-Antigene
exprimieren [10,77,89,184]. Inwiefern es sich in den Präparaten um neu
infiltrierende Makrophagen handelt, konnte hier jedoch nicht untersucht
werden.
In 78,80% war die MRC1-Zellfärbung dunkler im Vergleich zur CD163Zellfärbung. Die höhere MRC1+ Zellanzahl und die somit höhere Dichte der
markierten Zellen bzw. die niedrigere CD163+ Zellanzahl und die niedrigere
Dichte der markierten Zellen könnte die intensivere bzw. hellere Farbe in den
Präparaten erklären. Jedoch war in 21,30% die Farbintensität der beiden
Färbungen gleich und in keinem der untersuchten Präparate war die CD163Färbung dunkler als die MRC1-Färbung. Dies könnte wiederum durch die
69
geringere CD163+ Zellanzahl und damit geringere Zelldichte erklärt werden.
Weiterhin berücksichtigt werden muss, dass es sich bei den ausgewerteten
Präparaten um Schnittserien handelt.
Die digitale Überlagerung einer CD163- und CD206/MRC1-Färbung zeigt
ebenfalls, dass durch die Antikörper nicht ausschließlich die gleiche
Zellpopulation markiert wird (vgl. Abb. 19). Viele, aber nicht alle CD163+
Zellen waren deckungsgleich mit den CD206/MRC1+ Zellen. Zu sehen sind
ebenfalls einige ausschließlich CD/206MRC1+ Zellen. Auch hier muss
jedoch auf Grund der Schnittserien die Auswertung kritisch betrachtet
werden. Um die Frage, ob die beiden Marker die identische Zellpopulation
färben, präzise zu beantworten und die Marker besser vergleichen zu
können, wird daher die Durchführung von Doppelfärbungen vorgeschlagen.
Außerdem wurde in diesem Dissertationsprojekt die Expression der Marker
CD68, CD163 und CD206/MRC1 korreliert.
Die Korrelation ergab in allen im Ergebnissteil beschriebenen Fällen einen
positiven linearen Zusammenhang. Alle Tests waren signifikant (vgl. Tabelle
9,11,13,15). Dies zeigt, dass die Makrophagenmarker CD68, CD163 und
CD206/MRC1 vergleichbar sind. Steigt die Expression einer der drei Marker,
so erhöht sich auch die Expression der jeweils anderen. Die Ergebnisse
zeigen, dass die Antikörper durchaus die gleichen Zellen markieren, wenn
auch in unterschiedlichen Stärken.
Der Zusammenhang zwischen MRC1+ Zellen/mm² und CD163+ Zellen/mm²
zeigte den stärksten Pearson-Korrelationskoeffizienten (r(51)=0,809) im
gesamten Sinus. Eine ebenfalls starke Korrelation (r(51)=0,741) dieser
beiden Marker war im Perisinus zu erkennen und eine moderate Korrelation
(r(51)=0,581) im Sinus der LK (vgl. Tabelle 9). Den stärksten PearsonKorrelationskoeffizienten erreichte der Zusammenhang der Marker CD68 und
CD163 im Sinus des LK (vgl. Tabelle 11). Die Korrelation zwischen CD68
und MRC1 zeigte stets eine moderate positive lineare Beziehung. Den
stärksten Wert (r(51)=0,690) erreichte die Korrelation dieser Marker auch
hier im Sinus (vgl. Tabelle 13). Die Ergebnisse verdeutlichen, dass der Sinus
des LK einen entscheidenden Einfluss auf die Makrophagenpolarisation zu
nehmen scheint. Die Auswertungen der Marker in IFZ zeigen, dass auch hier
ausschließlich ein moderater positiver linearer Zusammenhang zwischen
70
CD68/CD163, CD68/MRC1 und MRC1/CD163 existiert (vgl. Tabelle 15) und
dass alle Untersuchungen signifikant waren (vgl. Tabelle 15). Der Wert der
CD163+ und MRC1+ Zellen war im Vergleich zu den anderen Markern mit
stärkstem linearen Zusammenhang (r(50)=0,387) (vgl. Tabelle 15).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine hohe CD68-Expression
mit einer hohen Expression der M2-Makrophagenmarker CD163 und
CD206/MRC1 assoziiert ist. Weiterhin sind die Marker CD163 und
CD206/MRC1 durch ihre stets positive lineare signifikante Korrelation
vergleichbar. Es zeigen sich jedoch große Unterschiede hinsichtlich der
gefärbten Zellpopulation durch die Antikörper anti-CD163 und antiCD206/MRC1. Um einen besseren Vergleich der beiden Marker zu erhalten
und
somit
auch
weitere
Erkenntnisse
zur
Tumorimmunologie
und
Makrophagenpolarisation in OSCC zu erhalten, wird die Durchführung von
Doppelfärbungen vorgeschlagen.
71
6
1.
2.
3.
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40.
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7
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Überblick der TAM Entstehung und ihrer Folgen nach Solinas et
al.,2009...................................................................................................................14
Abbildung 2: Schematische Darstellung der LSAB-Methode nach Taylor et al., 2013
...............................................................................................................................39
Abbildung 3: Gesichtsfeldausschnitt eines LK-Präparates mit CD206/MRC1Färbung ..................................................................................................................42
Abbildung 4: Gesichtsfeldausschnitt der IFZ eines LK-Präparates mit CD206/MRC1Färbung ..................................................................................................................43
Abbildung 5: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation im Sinus von LK ........47
Abbildung 6: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation im Perisinus von LK ...47
Abbildung 7: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation im Sinus ges. von LK .47
Abbildung 8: Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation im Sinus von LK .........49
Abbildung 9: Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation im Perisinus von LK ....50
Abbildung 10: Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation im Sinus ges. von LK 50
Abbildung 11: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation im Sinus von LK ........52
Abbildung 12: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation im Perisinus von LK ...53
Abbildung 13: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation im Sinus ges. von LK .53
Abbildung 14: Punktdiagramm der CD68/CD163 Korrelation in IFZ ........................55
Abbildung 15: Punktdiagramm der CD68/MRC1 Korrelation in IFZ .........................56
Abbildung 16: Punktdiagramm der MRC1/CD163 Korrelation in IFZ .......................56
Abbildung 17: Gesichtsfeld eines LKM-Präparates mit CD163-Färbung (oben) und
CD206/MRC1-Färbung (unten) ...............................................................................60
Abbildung 18: Gesichtsfeld eines LK-Präparates mit CD163-Färbung (oben) und
CD206/MRC1-Färbung (unten) ...............................................................................61
Abbildung 19: Digitale Überlagerung einer CD163- und CD206/MRC1-Färbung ....62
88
8
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: TNM-Klassifikation des oralen Plattenepithelkarzinoms der UICC nach
Wittekind, 2010 ...................................................................................................................... 9
Tabelle 2: Geräteübersicht ................................................................................................ 29
Tabelle 3: Materialübersicht .............................................................................................. 31
Tabelle 4: Reagenzienübersicht ....................................................................................... 32
Tabelle 5: Verwendete Puffer und Lösungen ................................................................. 33
Tabelle 6: Verwendete Antikörper .................................................................................... 34
Tabelle 7: Softwareübersicht ............................................................................................. 35
Tabelle 8: Deskriptive Statistik der Marker CD163/MRC1 ............................................ 46
Tabelle 9: Korrelation der Marker CD163/MRC1 ........................................................... 46
Tabelle 10: Deskriptive Statistik der Marker CD68/CD163 ........................................... 48
Tabelle 11: Korrelation der Marker CD68/CD163 .......................................................... 49
Tabelle 12: Deskriptive Statistik der Marker CD68/MRC1 ............................................ 51
Tabelle 13: Korrelation der Marker CD68/MRC1 ........................................................... 52
Tabelle 14: Deskriptive Statistik der Marker CD68/CD163/MRC1 .............................. 55
Tabelle 15: Korrelation der Marker CD68/CD163/MRC1 .............................................. 55
Tabelle 16: Vergleich der Marker CD163 und CD206/MRC1 hinsichtlich Zellanzahl
und Farbintensität in LK- und LKM-Präparaten .............................................................. 58
89
9
Abkürzungsverzeichnis
ANOVA-Test
Analysis of variance/ Varianzanalyse
Aqua dest.
Aqua destilliert
ASFV
Afrikanisches Schweinepestvirus
CCL
Chemokine (C-C motif) ligand
CMV
Zytomegalie-Virus
CO
Carbonmonooxidase
CR
Cysteine-rich
CRD
Carbohydrate recognition-like domain
CSF-1
Colony stimulating factor-1
CXCL
Chemokine (C-X-C motif) ligand
EBV
Ebstein-Barr Virus
EGF
Epidermal growth factor
Fel d 1
Katzenhaarallergen
FGF
Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
FNII
Fibronectin TypII
GM-CSF
Granulocyte macrophage-colony stimulating factor
Hb-Hp
Hämoglobin-Haptoglobin Komplex
HbSR
Hämoglobin Scavengerrezeptor
HHV8
Humanes-Herpesvirus 8
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
HO1
Hämoxygenase Enzym
HPV
Humanes Papillomavirus
IFN-γ
Interferon-γ
IFZ
Interfollikuläre Zone(n)
IgG
Immunglobulin G
IL
Interleukin
IL-1ra
Interleukin-1 Receptor-Antagonist
lamp
lysosomenassoziierte Membranglykoproteine
LK
Lymphknoten
LKM
Lymphknotenmetastase
LPS
Lipopolysaccharide
90
LSAB-Methode
Labeled (Strept-)Avidin-Biotin-Methode
MCP
Monocyte chemotactic protein
M-CSF
Macrophage colony stimulating factor
MMP
Matrix-Metalloproteasen
MRC1
Mannoserezeptor, C-Typ 1
mRNA
Messenger ribonucleic acid/ Boten-Ribonukleinsäure
N-Status
Regionärer Lymphknotenstatus
OSCC
Orales Plattenepithelkarzinom
p
Signifikanz
PDGF
Platelet derived growth factor
PGE
Prostaglandin
PMA
Phorbolester
PRRSV
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
r
Pearson-Korrelationskoeffizient
Roi
Region of interest
Sinus ges.
Sinus gesamt
SRCR
Scavenger receptor cysteine rich
SRC-Rezeptor
Scavenger receptor cysteine rich
TAM
Tumorassoziierte Makrophage(n)
TGF-β
Transforming Growth Factor-β
TNF-α
Tumornekrosefaktor-α
T-Status
Primärtumor-Status
TWEAK
TNF-alpha-like weak inducer of apoptosis
UICC
Union internationale contre le cancer
VEGF
Vascular endothelial growth factor
91
10
Danksagung
Zunächst möchte ich Herrn Prof. Dr. Dr. Dr. Friedrich-Wilhelm Neukam
danken, dass ich die Möglichkeit hatte in der Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg diese Dissertation schreiben zu können.
Mein weiterer besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Dr. Falk Wehrhan für die
Überlassung dieses Disserationsthemas sowie für seine fachliche Betreuung
und Unterstützung.
Bei Dr. Manuel Weber und ZA Patrick Möbius bedanke ich mich sehr herzlich
für wertvolle Tipps, ihre zahlreiche Hilfe und die immer engagierte Betreuung.
Auch meinen Kolleginnen ZÄ Carina Pirner, ZÄ Katharina Kaul, ZÄ Isabell
Konopka, ZÄ Katharina Schöps und ZÄ Katharina Loika möchte ich meinen
herzlichen Dank aussprechen.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern und Pateneltern, meiner Familie und
meinen Freunden für ihre große Unterstützung in allen Belangen.
Letztendlich danke ich Chris für seine Geduld und so vieles mehr.
92
11
Curriculum vitae
Persönliches
Victoria Stanuch
geboren am 8.Juni 1988 in Nürnberg
Eltern:
Alexander Stanuch, Schreinermeister und Holztechniker
Eugenia Stanuch, Dipl.Ing. für Holztechnik
Schulische Ausbildung
1999-2008
Christoph-Jacob-Treu Gymnasium, Lauf a. d. Pegnitz
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
1994-1999
Grundschule, Rückersdorf
Studium
2009-2014
Studium der Zahnmedizin an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg
05/2014
Staatsexamen der Zahnmedizin an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg und Approbation
11/2012
Beginn der Promotionsarbeit in der Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg mit dem Thema: „Vergleichende
immunhistochemische Analyse der M2-Makrophagenmarker
CD163 und CD206 in oralen Plattenepithelkarzinomen“
09/2011
Zahnmedizinische Vorprüfung
02/2010
Naturwissenschaftliche Vorprüfung
Beruflicher Werdegang
01/2015
Beginn der Assistenzzeit