Dendritische Zellen - Gastroenterologie Wintertreffen
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From Bench to bedside Immuntherapie mit dendritischen Zellen bei soliden Tumoren ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Gastroenterologisches Wintertreffen Obergurgl 2008 „Spontanvortrag“ Anton Stift Universitätsklinik für Chirurgie Begriffsdefinition ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Verabreichung von Zellen 1. Stimulation der Anti Tumoraktivität (Tumorzellen oder dendritische Zellen) 2. intrinsische Anti Tumoraktivität (autologe, allogene Lymphozyten) Zusammenhang Immunsystem –Tumor __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ KEINER ! Oder doch? Anekdoten (unkontrolliert) STRESS ABWEHRSCHWÄCHE INKURABLER TUMOR HAPPY THOUGHTS DIÄT KREBS GEHEILT GEHEILT Immuntherapeutische Grundlagen zur zellulären Immuntherapie ______________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Primäre Aufgabe des Immunsystems KAMPF GEGEN INFEKTIONEN Interne Überwachung (surveillance) SUPPRESSOR GENE Externe Überwachung IMMUNSYSTEM „unbeabsichtigte“ Konsequenz als Folge der Fähigkeit Infektionskrankheiten zu beherrschen Zusammenhang Immunsystem und Malignom ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ erhöhte Inzidenz von Lymphomen und virusassoziierten Tumoren bei Immunsuppression gut dokumentiert (AIDS, Chemotherapy) Zur Zeit KEIN Beweis bei soliden Karzinomen ! • HTX- Lungen CA • NTX- ? • TX- Melanom (Cyclosporin) • kein Cyclosporin – keine erhöhte Melanominzidenz Immunsystem - KEIN effizienter Verteidiger gegen Malignome - WARUM? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Voraussetzungen für eine effektive Immunüberwachung Information - „Feind“ vorhanden - AKTIVIERUNG ERKENNUNG normal - abnormal fehlende Rezeptoren an immunkompetenten Zellen zur Tumorerkennung Probleme der Immuntherapie ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ • unzureichende VERFÜGBARKEIT von Tumor assoziierten Antigenen • ANTIGENVERLUST an der Tumorzelle / self antigens • hohe MUTATIONSRATE von Karzinomzellen (moving target - one step ahead) • VERLUST des MHC I, II -Komplexes • EXPRESSION von immunsuppressiven Substanzen (Cytokine IL 10, 8, 6) • WACHSTUMSFAKTOREN (VEGF, TGF alpha/beta) Tricking the Immunsystem _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ WIE ? ex vivo Generierung von immunkompetenten Zellen Zelluläre Immuntherapie __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Immuntherapie mittels Zelltransfer • • • • • LAK-Zell Therapie NK-Zell Therapie MAK-Zell Therapie TILs CTLs • DC - Therapie T - Zell AKTIVIERUNG Antigen Presenting Cell (APC) MHC I Lymphocytes Cytotoxic CD8 T - cell receptor MHCII Antigen tumor cell Transplantation Antigen, MHC T Helper TH1 Cellmediated defence T CD4 TH2 Antibody-mediated defence Zellentwicklung Monozyt GM-CSF + IL-4 M-CSF CD14+ CD34+CL A- GM-CSF + TNFa CD14+, CD1a-, CD83-, CD86CD1a14+ Stammzelle GM-CSF + TNFa CD 34+ GM-CSF + TNFa CD34+CLA+ Makrophagen Gewebe DC CD14-, CD1a+, CD83+,CD86+ GM-CSF + TNFa CD1a+ 14- Langerhans DC CD14-, CD1a+, CD83+, CD86+ ANTIGEN UPTAKE PROCESSING PRESENTATION Zellmorphologie pseudopodenartig Endosomen Lysosomen Birbeck Granules ELMI-DC Phänotypische Merkmale Klasse I CD 11a (LFA-1) MHC Klasse II Adhäsionsmoleküle CD 58 (LFA-3) CD 54 (ICAM-1) CD 80 Costimulatorische Moleküle CD 86 CD 83 CD 40 DC Marker CMRF-44 Mannose Rezeptor Antigenrezeptoren DEC-205 CD 16, CD 32, CD 35, CD 36 FACS-Analyse Isotyp CD 80/86 CD 1a CD 11c CD 83 HLA- ABC CD 40 HLA- DR TILs TILs wurden aus primären Lebertumoren isoliert und in X-vivo Medium unter Zusatz von rhIL2 kultiviert TILs (mean 52 Tage) wurden dann mit Tumorlysat beladenen DCs für 7 Tage ko kultiviert Cytotoxicity assay (4 h LDH assay) zur Bestimmung der Lysekapazität DC Generierung: DCs wurden mittels CD14 magnetic beads aus PBMC isoliert Unreifen DCs wurde für 24 h Tumorlysat zugestezt und diese anschließend für 2 Tage mit GM-CSF/TNF ausgereift Kokultur für 7 Tage mit Tils Results Effector:TIL+DC Effector: LAK 75 75 K562 K562 DAUDI DAUDI allogen allogen 50 50 25 25 0 0 1:5 1:10 1:20 E:T-ratio 1:5 1:40 1:10 Effector:TIL 75 1:40 Effektor:TIL+pDC 75 K562 K562 DAUDI DAUDI allogen allogen 50 50 25 25 0 0 1:5 1:20 E:T-ratio 1:10 1:20 E:T-ratio 1:40 1:5 1:10 1:20 E:T-ratio 1:40 Ist eine Immunantwort auch gegen autologe Tumorzellkulturen unter Verwendung dendritischer Zellen in vitro induzierbar ? autologe MTC-Zellen autologe DCs autologe T-Zellen Proliferations-Test 80 70 % spont prolifera 60 50 T + Dc 0 40 T + Dc p 30 20 10 0 1458:1 486:1 162:1 54:1 T:Dc R atio 18:1 6:1 2:1 Klinische Phase I Studie DC01 Einbringung von 20 Patientin durch Ethikkommissionsbeschluß genehmigt Behandlung inkurabler Tumore: Pankreaskarzinom medulläres Schilddrüsenkarzinom hepatozelluläres Karzinom cholangiozelluläres Karzinom Patientenauswahl Einschlußkriterien inkurable, chirurgisch und konservativ nicht sinnvoll behandelbare Patienten chirurgischeExploration Lebensalter 19-75 adäquate Knochenmarksreserve adäquate Nierenfunktion ausreichende Leberfunktion Lebenserwartung > 3 Monate Karnofsky Index >70 Einwilligung zur Studienteilnahme Ausschlußkriterien resektable oder potentiell kurable Karzinome Autoimmunerkrankungen St.p.Organtransplantation Schwangerschaft oder Laktation schwere Leber,-Nierenfunktionsstörung schwerwiegende Begleiterkarnkungen mangelnde Compliance gleichzeitig medikamentöse/stahlentherapeutische Behandlung Herstellung der Tumorlysat-gepulsten dendritischen Zellen Monozytenisolierung Gewinnung von TU-Lysat 100 ml Vollblut (peripher) Tumorgewebe 1 cm3 Standardzentrifugation mechanische Zerkleinerung CD14 positiv Selektion mittels magnetischemAntikörper single-cell Suspension Nährmedium mit GMCSF/IL 4 5 Tage Lyse durch Frieren und Tauen Proteinbestimmung Bakteriologische Untersuchung des Impfstoffes Zellsuspension 1x107 in 0,5ml PBS Phänotopische Kontrolle mittels Flowcytoemtrie 100-200μg/1 Mill. Zellen 12 Stunden GM-CSF / IL-4 Impfstoff 36 h GM-CSF / TNFα Intranodale sonografisch gezielte Injektion in einen unbeteiligetn Lymphknoten IFN-g/PE CD69/PE Figure 2 T0 with Lysate T4 with Lysate CD3/isotype-PE CD3/isotype-PE CD3/isotype-PE a a a a b b b c c c d d d DC/TO DC/T4 T0 T4 CD3/isotype-PE CD3/isotype-PE CD3/isotype-PE a a b c d CD3/FITC b b c c d d Ergebnisse 206 Vaccinierungen (4-30) klinisches Ansprechen: 13 Patienten zeigten eine SD über 3 Monate davon 9 Patienten SD über 6 Monate davon 5 Patienten SD über 12 Monate davon 2 Patienten SD über 24 Monate DTH -Test und Tumormarker: 18 von 20 Patienten positiver DTHTest 8 Patienten Rückgang der TU-Marker Toxiziät: bis dato keine Nebenwirkungen Zusammenfassung Die Immuntherapie mit Tumorlysat gepulsten dendritischen Zellen scheint eine sichere und nebenwirkungsarme Therapieform zu sein. Ein in vitro Nachweis von tumorspezifischen zytotoxischen T-Zellen konnte erfolgreich etabliert werden. Auch bei Stadium IV Patienten klinischer / Tumormarker Response Klinisch Phase I Studie DC02 (40 Patienten) offen für alle inoperablen Karzinome Zusatz von γIFN 12 h vor der Applikation isotype CD1a CD 11c CD40 GM-CSF +IL-4 +TNF-a A PE Phänotyp ohne γIFN CD80 FITC/86 PE HLA-DR HLA-ABC CD83 FITC isotype CD1a CD 11c CD40 GM-CSF +IL-4 +TNF-a + IFN-g B PE Phänotyp mit γIFN CD80 FITC/86 PE HLA-ABC HLA-DR FITC CD83 Table 2: Intracytoplasmic staining of interferon gamma and surface staining of CD69 in CD3+ cells after coculture with mature, pulsed dendritic cells before the first vaccination (T0/DC) and after the fourth vaccination (T4/DC). Pat.no. 5 6 8 9 10 T0 T0/DC T4 c T4/DCim T4/DCwo T4/DC CD69 19 24 39 n.d. 40,3 40 IFN-γ 0 0,3 0,9 n.d. 1,3 1,9 CD69 6,1 19,8 44 40,9 n.d. 56 IFN-γ 0,2 0,2 1,1 1 n.d. 3,8 CD69 2,2 5,2 12,9 26 n.d. 55 IFN-γ 0 0,1 0,4 0,8 n.d. 2,4 CD69 6,5 11,3 36,7 n.d. 40 61,2 IFN-γ 0,1 0,2 1,6 n.d 2,2 3,7 CD69 16 15,8 23 25,2 n.d. 35 IFN-γ 0,1 0,1 0,3 0,5 n.d. 1,7 T0 T4/DCwo T4 T4/DC Isotype T0/DC 0,2 % 1,6 % 11,3 % 36,7 % 2,2 % 3,7 % 40 % 61,2 % IFN-γ PE 0,1 % CD69 PE 6,5 % CD3 FITC Ergebnisse _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 10 Patienten mit MTC (115 VACC 3 - 30) • 3 Pat. partieller Response • 3 Pat. stable disease • 7 Pat. Tumor Marker Response MTC – semicystische Läsion Hals MTC – Leber-, Milzmetastasen G.C.1946, w, Cholangiozelluläres Karzinom Mai 01 Aug 01 A T cell response against AsPc-1 100 mean % specific lysis T7 T 14 80 60 40 20 0 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 E:T ratio B T cell response against BxPc-3 mean % specific lysis 100 T7 T14 80 60 40 20 0 1:10 1:20 1:40 E:T ratio 1:80 1:160 Table 1. Patient characteristics, therapy and response Patient no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Age/ Outcome/time (mo) No. of Sex to progression vaccinations 73m 60/m 57/m 57/m 59/m 67/f 72/m 69/f 63/m 62/m 70/m 61/f 62/m 54/m 71/f 74/m 56/m 46/f 54/m 56/m PD SD>12 SD>12 SD>18 SD>12 SD>12 SD>18 PD PD PD SD>24 SD>12 PD SD>12 PD PD SD>18 SD>18 SD>12 PD 6 7 23 6 22 8 20 7 8 6 8 14 11 11 7 8 6 10 6 6 Intracytoplasmic IFNγ assay neg. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. neg. pos. pos. pos. pos. Cytotoxic assay Survival (mo) n.d. pos. pos. pos. pos. neg. pos. neg. neg. neg. pos. neg. neg. pos. neg. neg. pos. pos. pos. neg. 4 19 17 28 18 15 24 10 11 12 30 16 7 20 12 7 25 24 23 11 Ergebnisse 12 Patienten SD 5 Patienten SD > 12 mon > 18 mon 18 Patienten pos. IFNγ− Τest 10 Patienten pos. Zytotoxizitätstest IFN-γ and CD69 expression in T cells prior vaccination Fig.1 CD3-FITC CD4-ECD CD69-PE IFNγ-PE CD69-PE T0 + DC (Panc1) T0 IFNγ-PE Isotype CD8-PC5 FITC 0 0 0 5,9 1,9 3,9 1,5 0,7 0,7 42 19 23 ECD PC5 IFNγ and CD69 Expression in T cells after ten vaccinations Fig.2a IFN-γ-PE CD4-ECD CD69-PE 0,3 IFN-γ-PE 0,2 22 9 4,1 3,1 1 20,9 55 FITC CD8-PC5 0,1 31 CD69-PE T 10 + DC (Panc 1) T 10 cells CD3-FITC ECD 34,9 PC5 IFNγ and CD69 expression in T cells cocultured with unpulsed mature DC´s (Dc woLy) or pulsed DCs (Panc1) after 10 vaccinations Fig.2b CD3-FITC CD4-ECD 0,9 10,5 23,6 IFN-γ-PE 0,7 34 CD69-PE T10 + DC wo Ly 1,6 CD8-PC5 FITC ECD PC5 A target BxPC3 50,00% 50,00% 40,00% 40,00% fTo- 30,00% fTo AsPC1 20,00% 10,00% 40,00% 30,00% fTofTo BxPC3 20,00% 10,00% 30,00% fTo20,00% 32:1 16:1 8:1 4:1 2:1 effector:target 0,00% 32:1 16:1 8:1 1:1 4:1 2:1 1:1 32:1 16:1 8:1 effector:target b fTo Panc1 10,00% 0,00% 0,00% a target Panc1 %cytotoxicity 60,00% %cytotoxicity %cytotoxicity target AsPC1 4:1 2:1 1:1 effector:target B target BxPC3 target AsPC1 %cytotoxicity 50,00% fT5- 40,00% c d 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% fT5 AsPC1 %cytotoxicity 60,00% 100,00% 100,00% 80,00% 80,00% 60,00% fT5- 40,00% fT5 BxPC3 20,00% 4:1 effector:target 2:1 1 60,00% fT5- 40,00% fT5 Panc1 20,00% 0,00% 0,00% 32:1 16:1 8:1 %cytotoxicity 70,00% target Panc1 32:1 16:1 8:1 4:1 effector:target 2:1 1:1 32:1 16:1 8:1 4:1 effector:target 2:1 1:1 Fig 4. Kaplan-Meier survival curve 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 -,2 0 10 over all survival (months 16,35) 20 30 40 Verbesserung der Immunantwort Heat shock von DCs (J Clin Endocrin Meta 2006) Heat shock von DCs und Tumorzellen (Clinical cancer Research in Review) Allogener Tumor als Ersatz für FCS (Cancer Immuno Immun 2007) Elutrationsmethode zur Generierung großer Mengen dendritischer Zellen etabliert (Transfusion in Review) The realistic goal of this approach is to treat the „minimum residual disease“ that remains after the surgeon has removed the primary tumor- and we can all hope that these experiments will be successful. But in the meantime, eat right, be careful what you take into your lungs, and get plenty of the rest. Lauren Sompayrac Adjuvante Therapie des nicht kleinzelligen Bronchus CA Immun-versus Chemotherapie Ethikkommissions genehmigt 11/2007 WWTF Grant (800.000€) abgelehnt 12/2007 Der Tod ist das Ende der Mühsal, und wen er heut trifft, der braucht ihn nicht morgen zu scheuen (F. Rückert) Mit tränenreichen Augen nehmen wir Abschied vom „ExperimentellenChirurgischen Forschungslabor“, welches im 11. Lebensjahr, nach langer schwerer, mit Geduld ertragener Krankheit von uns gegangen ist. Erfüllt war Dein Leben durch harte Arbeit, Visionen, Mut zu Neuem und dem ständigen Kampf ums Überleben zum Wohle deiner Patienten We did our best but we guess our best was not good enough! Die Beisetzung findet im engsten Familienkreis unter Ausschluss der Universität statt. Von Kommentaren jedweder Art bitten wir höflichst Abstand zu nehmen Toni & Josef (im Namen der Mitarbeiter) Arbeitsreich war Dein Leben Original papers 1. Tumor antigen pulsed dendritic cells enhance the cytolytic activity of tumor infiltrating lymphocytes in human hepatocellular cancer. Cancer Biother Radiopharm. 2000 Oct;15(5):477-86 IF: I,841. 2. Adoptive Cellular Immunotherapy Acta Chirurgica Austriaca, European Surgery Vol 32(6) :255-259; 2000 3. Heat Treatment of Hepatocellular Carcinoma Cells: Increased Levels of Heat Shock Proteins 70 and 90 Correlate with Cellular Necrosis Anticancer Res 2001 Jan-Feb;21(1A):295-300 IF: 1,604 4. Stimulation of autologous antitumor T-cell responses against medullary thyroid carcinoma using tumor lysate-pulsed dendritic cells J Clin Endocrinol Metab 2002 87: 1098-1104. IF: 6,020 5. Dendritic cell based Vaccination in Solid Cancer Journal of Clinical Oncology 2003 (21)1:135-142 IF: 11,810 6. In Vivo Induction of Dendritic Cell Mediated Cytotoxicity against Allogeneic Pancreatic Carcinoma Cells International Journal of Oncology 2003 (22)3:651-6 IF: 3,056 7. Hyperthermia improves cellular immune response to human hepatocellular carcinoma subsequent to co-culture with tumor lysate pulsed dendritic cells International Journal of Oncology 2003 (22)6:1397-1402 IF: 3,056 8. The early response of p53-dependent proteins during radiotherapy in human rectal carcinoma and in adjacent normal tissue International Journal of Oncology 2003 (23)5:1269-1276 IF: 3,056 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Future directions in the treatment of breast cancer-cellular interventions using dendritic cells Breast Cancer Research and Treatment 2003 (81): S119-S123 IF: 3,310 Monitoring of Circulating Angiogenic Factors in Dendritic Cell-Based Cancer Immunotherapy Cancer 2003 (98)10: IF: 4.800 Heat shock protein expression by percutaneous radiofrequency ablation of hepatocellular carcinoma in vivo International Journal of Oncology 2004 (24)3:609-613 IF: 3,056 Dendritic cell vaccination in medullary thyroid carcinoma Clinical Cancer Research 2004 (10): 2944-2953 IF: 6,511 Expression of heat shock proteins in human hepatocellular carcinoma after radiofrequeny ablation in an animal model. Oncology Reports 2004 12(3): 495-500 IF: 1,356 Medullary Thyroid Carcinomas: Autologous Tumor Cell Lines For Dendritic Cell Vaccination Anticancer Research 2005; 4225-20 IF: 1,604 Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase inhibition by mycophenolic acid impairs maturation and function of dendritic cells. Clinica Chimica Acta 2006; 364: 139-47 IF: I,961 Heat shock treatment of tumor lysate-pulsed DCs enhances their capacity to elicit antitumor T-cell responses against medullary thyroid carcinoma Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2006, 91(11):4571-7 IF: 6,020 Allogeneic Tumor Lysate Can Serve as Both Antigen Source and Protein Supplementation for Dendritic Cell Culture Cancer Immunol Immunother. 2007 Nov 21 IF: 4,313 Low telomerase activity: possible role in the progression of human medullary thyroid carcinoma European Journal of Cancer (accepted) IF: 4,167 GESAMTIMPACTFAKTOR: 69,541 Grants 1. Beeinflussung der in –vitro Zytotoxizität von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) aus hepatozellulären Karzinomen durch die Stimulierung von TILs mit autologen dendritischen Zellen (DC), welche mit autologem Tumorzell-Lysat gepulst werden. Komission Onkologie 1999 zuerkannt – ATS 150 000 2. Immunotherapy of incurable malignancies using autologous dendritic cells pulsed with tumor antigens Hygiene-Fonds der Universität Wien 1999 zuerkannt- ATS 3 000 000 3. Charakterisierung und Optimierung in vitro differenzierter Dendritischer Zellen in Hinblick auf spezifische T-Zell Aktivierung Bürgermeisterfonds der Stadt Wien zuerkannt 5/2000 –ATS 372 000 4. In vitro Evaluation der immunstimulatorischen Kapazität von Tumotlysat-gepulsten dendritischen Zellen anhand eines autologen medullären Schilddrüsenkarzinommodells Hans Plank-Moser Stiftung 2000 zuerkannt- ATS 120 000 5. A Prospective Randomized Trial of Adjuvant Immunotherapy of Patients with Pancreatic Cancer using Autologous Dendritic Cells Österreichische Nationalbank 2001 zuerkannt – 700 000 ATS 6. Der Effekt von g-Interferon auf dendritische Zellen in Bezug auf die Produktion von IL-12 und der Chemokine IP-10 (g-interferon inducible protein 10) und MIG (monokin induced by g-interferon). Zusammenhang zwischen Differenzierungsgrad der dendritischen Zellen und g-Interferonsensitivität. Bürgermeisterfonds der Stadt Wien 12/2001 zuerkannt – 240 000 ATS 7. Immuntherapie des inoperablen Pankreaskarzinoms durch Applikation autologer, mit allogenem Tumorlysat beladener, dendritischer Zellen Nationalbank Jubiläumsfonds 7/2003 zuerkannt - 70.000 € 8. "Heat Shock" Behandlung humaner medullärer Schilddrüsenkarzinomzellen (MTC) zur Steigerung der CD4+ und CD8+ abhängigen zellulären Immunantwort nach Kokultivierung mit MTC Lysat gepulsten, INF g stimulierten autologen dendritischen Zellen Fonds der Stadt Wien für innovative interdisziplinäre Krebsforschung-Forschungsentwicklungspreis (2003) 12/2003 zuerkannt – 25.000 € 9. "Heat Shock" treatment of monocyte derived dendritic cells to enhance CD4+- and CD8+-dependent cellular immune response via increased endogenous expression of heat shock proteins DDr. Karl Fellinger Preis-Krebsforschungsförderungsstipendium zuerkannt 2/2004- 15.000 € 10. Immuntherapie des inoperablen sowie des metastasierten medullären Schilddrüsenkarzinoms (MTC) durch Applikation autologer Tumorlysat beladener, dendritischer Zellen DDr. Karl Fellinger Preis-Krebsforschungsförderungsstipendium zuerkannt 6/2006- 20.000 € 11. Ex vivo Identifizierung, Isolierung, Analyse und Expansion von tumor-spezifischen, zytotoxischen T-Zellen bei Patienten mit inoperablen medullärem Schilddrüsenkarzinom (MTC) Fonds der Stadt Wien für innovative interdisziplinäre Krebsforschung-Forschungsentwicklungspreis (2063) 12/2006 zuerkannt – 20.000 € Gesamt: 482994 € Zahlreiche Preise, 8 Ethikkommissions genehmigte Studien, 2 Diplomarbeiten etc. ES WÄRE NOCH SOVIEL ZU TUN GEWESEN!
