vts_9801_14910 - OPARU
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Universität Ulm Klinik für Innere Medizin III Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. H. Döhner Spezifische Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene vor und nach allogener Stammzelltransplantation Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Myrjam Weißschuh geb. in Stuttgart 2015 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. J. Greiner 2. Berichterstatter: Prof. Dr. F. Keller Tag der Promotion: 19. Juni 2015 2 INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................. 5 1. EINLEITUNG .................................................................................................... 11 1.1. Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation.......................... 11 1.1.1. Einteilung der hämatologischen Neoplasien ....................................... 13 1.1.2. Indikationen für eine allogene Stammzelltransplantation .................... 14 1.1.3. Biologische Grundlagen und Durchführung einer allogenen Stammzelltransplantation .............................................................................. 16 1.1.4. Immunrekonstitution nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation .............................................................................. 23 1.2. Immuntherapien ......................................................................................... 35 1.2.1. Allgemeine Aspekte............................................................................. 35 1.2.2. Leukämie-assoziierte Antigene ........................................................... 37 1.2.3. Vakzinierung gegen Leukämie-assoziierte Antigene ........................... 41 1.3. Zielsetzung ................................................................................................ 42 2. MATERIAL UND METHODEN ......................................................................... 44 2.1. Material ...................................................................................................... 44 2.1.1. Grundausstattung ................................................................................ 44 2.1.2. Pufferlösungen .................................................................................... 47 2.1.3. Zelllinien, Antikörper und Zytokine ...................................................... 48 2.1.4 Zellkulturmedien ................................................................................... 49 2.1.5. Peptide ................................................................................................ 50 2.1.6. Blutproben ........................................................................................... 51 2.1.7. Patientenverläufe ................................................................................ 53 2.2. Methoden ................................................................................................... 53 2.2.1. Anlage und Kultur von T2-Zellen ......................................................... 53 3 2.2.2. PBMNC-Isolierung und Archivierung ................................................... 53 2.2.3. Typisierung der HLA-Oberflächenantigene mittels Durchflusszytometrie ...................................................................................................................... 56 2.2.4. Zellseparation ...................................................................................... 58 2.2.5. Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur ............................................... 59 2.2.6. ELISPOT-Assay .................................................................................. 61 3. ERGEBNISSE .................................................................................................. 67 3.1. Bestimmung des Oberflächenantigens HLA-A2 durch FACS-Analyse ...... 67 3.2. Zelluläre Immunantworten ......................................................................... 68 3.2.1. Zelluläre Immunantworten gegen LAAs bei gesunden Probanden ..... 69 3.2.2. Zelluläre Immunantworten gegen LAAs bei Patienten......................... 75 3.2.3. Übersicht über die zellulären Immunantworten ................................... 91 3.3. Klinische Verläufe der Patienten und Korrelation mit deren Immunantwort im ELISPOT ...................................................................................................... 94 4. DISKUSSION ................................................................................................. 108 4.1. Verwendung von ELISPOT-Assays zur Darstellung zytotoxischer Immunantworten ............................................................................................. 109 4.2. Nachweis spezifischer zytotoxischer Immunantworten gegen Leukämieassoziierte Antigene vor und nach allogener Stammzelltransplantation ......... 110 4.3. Patientenverläufe ..................................................................................... 114 4.4. Die allogene Stammzelltransplantation mit Peptidvakzinierung gegen LAAs ........................................................................................................................ 117 5. ZUSAMMENFASSUNG.................................................................................. 119 6. LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................... 121 DANKSAGUNG .................................................................................................. 154 LEBENSLAUF .................................................................................................... 155 4 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abb. Abbildung A.dest Aqua destillata aGvHD Akute Graft-versus-host disease AID Auto immune disease = Autoimmunerkrankung ALL Akute lymphatische Leukämie alloHSCT Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation alloSCT Allogene Stammzelltransplantation AMIDA Autoantibody mediated identification of antigens AML Akute myeloische Leukämie APC Antigen-präsentierende Zelle ATRA All-trans-Retinoinsäure Aura (A2, B1, B2) Aurorakinase (A2, B1, B2) BAGE B melanoma antigen BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat BCL-2 B-cell lymphoma-2 Bcr-abl BMF BMT Breakpoint cluster region- Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 Bone marrow failure = Knochenmarkversagen Bone Marrow Transplantation = Knochenmarktransplantation Bu Busulfan CA IX Carbonic anhydrase IX CD Cluster of Differentiation = Unterscheidungsgruppe 5 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS cDNA Complementary-Desoxyribonukleinsäure = Komplementäre Desoxyribonukleinsäure CEBPA CCAAT enhancer binding protein alpha CLL Chronische lymphatische Leukämie CML Chronische myeloische Leukämie CML 28 Chronic myelogenous leukemia 28 (Antigen) CMML Chronische myelomonozytäre Leukämie CMV Cytomegalievirus CR Komplette Remission CsA Cyclosporin A CTA Cancer testis antigen CTL Cytotoxischer T-Lymphozyt Cy Cyclophosphamid DC Dendritische Zelle DLI DNA EBMT Donor lymphocyte infusion = Spenderlymphozytengabe Desoxyribonukleinsäure European group for blood and marrow transplantation EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISPOT Enzyme linked immuno spot assay Et al. Und Mitarbeiter Fa. Firma FAB French-American-British-Group Klassifikation FAB M3 Akute Promyelozytenleukämie (FAB-Klassifikation) 6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS FACS Fluorescence-activated cell sorting FCS Fetal calf serum = Fetales Kälberserum FITC Fluorescein-Isothiocyanat FLAMSA Fludarabin, Cytarabin, Amsacrin FLT3-ITD FLT3-TKD Fms-related tyrosine kinase 3-internal tandem duplication Fms-related tyrosine kinase 3-tyrosine kinase domain FSC-Height Forward Scatter-Height G250 Renal cell carcinoma-associated antigen G250 G-CSF Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor GI Gastrointestinaltrakt GM-CSF Granulozyten-Makrophagen stimulierender Faktor GranzB Granzyme B GvHD Graft-versus-Host Diseae = Graft versus HostErkrankung GvLE Graft-versus-Leukemia Effekt GvTE Graft-versus-Tumor-Effekt HAGE Helicase Antigen HD Hodgkin-Erkrankung Hemo/thal Hämoglobinopathien/Thalassämien HLA Humanes Leukozyten Antigen HPE Homeostatic peripheral expansion = Homöostatische periphere Expansion HSCT Hämatopoetische Stammzelltransplantation hTert/hTERT Telomerase katalysierende Untereinheit 7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS HV Healthy Volunteer = Gesunder Proband Il-2 Interleukin-2 Il-7 Interleukin-7 IDM Inherited metabolic disorder = Angeborene metabolische Erkrankung IFN-γ Interferon gamma, Interferon-γ Ig Immunglobulin IgG Immunglobulin G IMP Influenza Matrix Protein Inv Inversion ITP Immunthrombozytopenie KIR Killer Immunoglobulin-like-Receptor KM Knochenmark KMT Knochenmarktransplantation LAA Leukämie-assoziiertes Antigen LD-Ara-C Low-dose Zytosin-Arabinosid M Männlich MACS Magnetic Cell Sorting of Human Leukocytes MDS Myelodysplastisches Syndrom MgCl2 Magensiumchlorid MHags Minor histocompatibility antigens MHC Major histocompatibility complex MLL Mixed-lineage-leukemia Mixed Lymphozyte Peptide Culture = Gemischte MLPC Lymphozyten Peptid Kultur 8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS MM Multiples Myelom MPP11 M-phase phosphoprotein 11 Minimal residual disease = Minimale MRD Residualerkrankung MUC 1 Mucin 1 NHL Non-Hodgkin-Lymphom NK-Zelle Natürliche Killerzelle NPM1 Mutated region of nucleophosmin 1 NT Not tested = Nicht getestet OFA-iLRP Oncofetal antigen-immature laminin receptor protein p/p-value P-Wert = Irrtumswahrscheinlichkeit PASD1 PAS domain containing 1 PBMCs PBS PCR Peripheral blood mononuclear cells = Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes Phosphate buffered saline Polymerase Chain Reaction = PolymeraseKettenreaktion PH Potentia hydrogenii PID Primärer Immundefekt PR3 Proteinase 3 PRAME Preferentially expressed antigen of melanoma RAEB2 Refractory anemia with excess blasts RAGE-1 Renal tumor antigen-1 RAR Retinoic acid receptor RHAMM/R3 Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy 9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS RIT Radioimmuntherapie RPMI Ein am Roswell Park Memorial Institute entwickeltes Zellkulturmedium RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion SCT Stammzelltransplantation SEREX Serological identification of antigens by recombinant expression cloning/ Serological screening of recombinantly expressed antigens SSC Height Side Scatter Height SSX2IP Synovial Sarcoma, X Breakpoint 2 Interacting Protein T Tag TAA Tumor-assoziiertes Antigen TBI Total body irradiation = Ganzkörperbestrahlung TCR T-Zellrezeptor TH1 Cell T-Helferzelle 1 TRM Therapy related Mortality = Behandlungsassoziierte Mortalität TSA Tumor-spezifisches Antigen Tx Transplantation U.S. United States W Weiblich WHO World Health Organisation = Weltgesundheitsorganisation WT Wildtyp WT1/WT-1 Wilms-Tumor-Gen-1 10 1. EINLEITUNG 1. EINLEITUNG 1.1. Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation Als Transplantationspionier Dr. Georges Mathé 1958 vier Physikern, die in einem Reaktorunfall im damaligen Jugoslawien schwer strahlengeschädigt wurden, zum ersten Mal Knochenmark transplantierte, läutete dies für Patienten mit hämatologischen Erkrankungen eine neue Ära in der Behandlung ein [132]. Neben der Chemo- und Strahlentherapie existierte nun erstmals eine Therapieoption, die nicht nur symptomatisch wirkte, sondern vollständige Heilung versprach. Die Möglichkeit hämatopoetische Stammzelltransplantationen (HSCTs) durchzuführen hat seitdem die Behandlung vieler hämatologischer und auch anderer Erkrankungen revolutioniert. Durch kontinuierliche Forschung und zahlreiche klinische Studien konnten in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte in der Anwendung der HSCT erzielt und so das Komplikationsrisiko deutlich gesenkt werden. Sowohl in der Auswahl von Patientengut und geeignetem Spenderkollektiv, der Gewinnung von Stammzellen als auch der Anwendung weniger toxischer Vorbereitungsprotokolle konnten große Entwicklungsschritte verzeichnet werden [76]. So hat in den letzten 30 Jahren die Zahl der hämatopoetischen Stammzellspenden in den USA stetig zugenommen [152]. In Deutschland ist diese Entwicklung seit 1998 dokumentiert [150]. Anfang des Jahres 2013 wurde die einmillionste HSCT weltweit durchgeführt [64]. Im Jahr 2011 wurden weltweit mehr als 60.000 Patienten mit hämatopoetischen Stammzelltransplantationen behandelt. 35.660 HSCTs wurden in diesem Jahr in Europa durchgeführt, davon handelte es sich in 41% um allogene und in 59% um autologe Transplantationen [64]. 11 1. EINLEITUNG Abbildung 1: Dargestellt ist das Transplantationsaufkommen in den USA in den Jahren 1980-2011. Zu sehen sind die dort durchgeführten hämatopoetischen Stammzelltransplantationen, aufgeteilt in autologe (gelbe Kurve) und allogene Transplantationen mit einem verwandten (grüne Kurve) bzw. nicht verwandten (blaue Kurve) Spender. Auf der waagrechten Achse zu sehen sind die jeweiligen Jahreszahlen, auf der senkrechten Achse die zugehörige Anzahl der durchgeführten Transplantationen. Die Anzahl der durchgeführten Transplantationen in den USA ist seit 1980 deutlich gestiegen. HCT= Hämatopoetische Stammzelltransplantation; U.S.= United States[152]. Diese Abbildung wurde veröffentlicht in Pasquini MC, Zhu X. Current uses and outcomes of hematopoietic stem cell transplantation: 2014 CIBMTR Summary Slides Eine Stammzelltransplantation stellt hohe Anforderungen an die Behandler und das Gesundheitssystem und ist sehr kostenintensiv. Staatliche Ausgaben für das Gesundheitssystem, die Anzahl der verfügbaren Transplantationsteams gerechnet auf die Einwohnerzahl, der Index der menschlichen Entwicklung und das nationale Pro-Kopf-Einkommen waren laut einer weltweiten Studie von Gratwohl et al. aus dem Jahr 2006 die Faktoren, die mit der Häufigkeit durchgeführter HSCTs am ehesten korrelierten [65]. 2006 wurden laut selbiger Studie 48% aller HSCTs in Europa durchgeführt, gefolgt von den Nord-und Südamerikanischen Staaten, wo 36% und Asien, wo 14% der HSCTS stattfanden. Das Schlusslicht bildeten der östliche Mittelmeerraum und Afrika mit nur 2% [65]. 12 1. EINLEITUNG Abbildung 2: Übersicht über das durchschnittliche weltweite Aufkommen von hämatopoetischen Stammzelltransplantationen (HSCTs) in den Jahren 2006-2008. Zu sehen ist, dass in Europa in diesem Zeitraum die meisten HSCTs durchgeführt wurden, gefolgt von den Nord- und Südamerikanischen Staaten. Die Farbschattierung entspricht der Transplantationsrate im jeweiligen Gebiet. Die Farben und deren zugehörige Transplantationsraten sind in der Legende im unteren linken Bereich der Abbildung erläutert. HSCT = hämatopoetische Stammzelltransplantation, N = Anzahl; TR = Transplantationsrate pro 10 Millionen Einwohner [66]. 1.1.1. Einteilung der hämatologischen Neoplasien Maligne neoplastische Erkrankungen sind nach den Herz-Kreislauf-Erkrankungen die zweithäufigste Todesursache in Deutschland [90]. Im Jahr 2008 erkrankten 469.800 Menschen in Deutschland neu an Krebs. Bei 7% dieser Neuerkrankungen handelte es sich um Leukämien, Plasmozytome, Hodgkin-, oder Non-HodgkinLymphome [92]. Diese Erkrankungen werden zur großen Gruppe der hämatologischen Neoplasien gerechnet. Es handelt sich bei diesen um benigne oder maligne Neubildungen, die von den Zellen des Blutes, der Lymphknoten, oder des Knochenmarkes ausgehen. Erstmals im Jahr 1997 wurde von der Society for Hematopathology und der European Association of 13 1. EINLEITUNG Hematopathologists eine Klassifikation dieser vielfältigen Krankheiten für die World Health Organisation (WHO) erstellt, die zuletzt im Jahr 2008 aktualisiert wurde [79]. Entscheidendes Kriterium war hierbei der jeweilige Ursprung der Erkrankung. Es wird demnach heute zunächst unterschieden zwischen myeloiden, lymphoiden, und histiozytären Neoplasien und Erkrankungen der Mastzellen. In diesen vier Kategorien finden sich wiederum eine Vielzahl unterschiedlicher Krankheiten wieder, die über eine Kombination ihrer jeweiligen Morphologie, ihrer genetischen Faktoren, ihres Immunphänotyps und der klinischen Symptome definiert werden [79]. 1.1.2. Indikationen für eine allogene Stammzelltransplantation Dank großer Fortschritte in der Anwendung der hämatopoetischen Stammzelltransplantation konnte die Therapie mittlerweile auf eine Vielzahl von Krankheiten ausgeweitet werden. Die Indikationsstellung erfolgt meist individuell nach Auswertung verschiedener Faktoren wie Art und Schweregrad der Erkrankung, Patientenalter, Remissionsstatus, sowie der Verfügbarkeit eines geeigneten Spenders. Insbesondere für Patienten mit malignen hämatologischen Stammzellerkrankungen, also den Leukämien, Lymphomen und dem Multiplen Myelom stellt die Stammzelltransplantation oft die einzige Chance zur Heilung dar. Grundsätzlich können Patienten mit angeborenen oder erworbenen Stammzellerkrankungen wie Hämoglobinopathien, schweren Immundefekten, der aplastischen Anämie oder der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie dank der HSCT heute dauerhaft von ihrem Leiden befreit werden [154]. Die große Mehrheit an allogenen Stammzelltransplantationen findet mit 70% bei den malignen hämatologischen Erkrankungen statt. Davon stellten die Leukämien mit 8685 Fällen und damit einem Anteil von 65 Prozent an den allogenen Gesamttransplantationen des Jahres 2010 die Hauptindikation in europäischen Ländern. In dieser Gruppe ist mit einem Anteil von 32% an den allogenen Transplantationen die akute myeloische Leukämie (AML) der Spitzenreiter, gefolgt von der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) und dem myelodysplastischen Syndrom mit einem jeweiligen Anteil von 16% [153]. Eine Zusammenfassung über die häufigsten Indikationen für allogene Stammzelltransplantationen des Jahres 2010 in Europa gibt Abbildung 3. 14 1. EINLEITUNG Abbildung 3: Hauptindikationen für allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen in Europa im Jahr 2010. Dargestellt sind jeweils die absoluten Transplantationszahlen gefolgt von den prozentualen Anteilen an allen allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantationen insgesamt, separat dargestellt für die jeweilige Erkrankung. Die akute myeloischeLeukämie (AML) stellte 2010 die häufigste Indikation für eine hämatopoetische Stammzelltransplantation. Das myelodysplastische/myeloproliferative Syndrom (MDS/MPS) und die akute lymphatische Leukämie (ALL) waren die zweit und dritt häufigste Indikation. AID = Autoimmunerkrankung; ALL = Akute lymphatische Leukämie; AML = Akute myeloische Leukämie; BMF = Knochenmarkversagen; CLL = Chronische lymphatische Leukämie; CML = Chronische myeloische Leukämie; HD = Morbus Hodgkin; Hemo/thal = Hämoglobinopathien/Thalassämien; IDM= Inherited metabolic disorder = Angeborene metabolische Erkrankung; MDS/MPS= Myelodysplastisches Syndrom/Myeloproliferative Erkrankung; NHL= Non-Hodgkin-Lymphom; Others = Andere Erkrankungen; PCD = Plasmazellerkrankung; PID = Primärer Immundefekt; Solid Tumors = Solide Tumoren [153]. 15 1. EINLEITUNG 1.1.3. Biologische Grundlagen und Durchführung einer allogenen Stammzelltransplantation 1.1.3.1. Die hämatopoetische Stammzelle Blutzellen gehören zu den kurzlebigsten Zellen des menschlichen Körpers. Ein Erythrozyt beispielsweise hat eine Lebenserwartung von nur 120 Tagen, wohingegen ein Thrombozyt sogar nur eine Überlebenszeit von fünf bis zwölf Tagen erreicht. So verwundert es nicht, dass das Blut eines der am stärksten regenerativen Organe des menschlichen Körpers ist. Um eine konstante Menge Blut aufrecht zu erhalten müssen bei einem Erwachsenen etwa eine halbe Billion neuer Blutzellen täglich neu gebildet werden. Für diese wichtige und das gesamte Leben andauernde Aufgabe ist die hämatopoetische Stammzelle verantwortlich. Diese „Mutterzelle“ ist im adulten Organismus neben einem geringen Vorkommen in Blut, Leber und Milz hauptsächlich in den sogenannten Stammzellnischen im Knochenmark zu finden und durch zwei maßgebliche Eigenschaften definiert. Erstens kann die Blutstammzelle unbegrenzt identische Tochterzellen generieren, welche wiederum ebenfalls Stammzelleigenschaften aufweisen. Zweitens kann sie sich zu mehreren anschließend durch verschiedenen weitere Vorläuferzellen spezifische differenzieren, Reifemechanismen welche zu den unterschiedlichen, hoch differenzierten Zelllinien heranwachsen [39, 167, 194]. Hämatopoetische Stammzellen sind sogenannte multipotente Vorläuferzellen. Dies bedeutet, dass sie alle Zelltypen des Blutes bilden können. Sie sind so weit determiniert, dass sie über das gesamte Entwicklungspotenzial der Zellarten des blutbildenden Gewebes verfügen, aber nicht die Differenzierungsprogramme anderer Gewebe realisieren können. Unter den hämatopoetischen Stammzellen können zwei verschiedene Formen unterschieden werden: Die sogenannten Langzeit- und die kurzfristigen Blutstammzellen. Erstere proliferieren über die gesamte Lebenszeit eines Menschen und zeichnen sich durch ein hohes Vorkommen an Telomerase-Aktivität aus, welche ein Charakteristikum undifferenzierter, sich teilender Zellen ist [39, 208]. Letztere proliferieren nur für eine beschränkte Zeitspanne, möglicherweise ein paar Monate. Sie sind für die rasche Rekonstitution nach einer Stammzelltransplantation zuständig. Sie entstehen aus den Langzeit-Stammzellen und differenzieren sich zu zwei 16 1. EINLEITUNG verschiedenen Vorläuferzellen: Die lymphoide und die myeloide Vorläuferzelle. Aus den lymphoiden Vorläuferzellen entstehen durch weitere Reifungsschritte die T- und B-Zellen, sowie die natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Die myeloiden Vorstufen reifen zu Monozyten, Granulozyten, Megakaryozyten und Erythrozyten heran [209]. Hämatopoetische Stammzellen reagieren sehr effizient auf Stressfaktoren wie Blutverlust, Infektionen oder Exposition gegenüber zytotoxischen Substanzen [172]. Kontrolliert wird die Homöostase sowohl durch Zell-intrinsische als auch -extrinsische Regulatoren, verschiedene Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktionswege, Nischenfaktoren und epigenetische Regulatoren [39]. 1.1.3.2. Patienten-und Spenderauswahl Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation steht heute grundsätzlich einem großen Patientenklientel zur Verfügung. Ob es im individuellen Setting jedoch sinnvoll ist, diese tatsächlich auch durchzuführen bleibt eine komplexe Entscheidung und hängt von vielen Faktoren ab. Grundsätzlich sollten das Risiko der Erkrankung, die Heilungschancen eines nicht transplantativen Konzepts und das individuelle Transplantationsrisiko gegeneinander abgewogen werden. Mittels eines Risikoscores der European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT), der die Einflussgrößen Krankeitsstatus, Krankheitsdauer, verfügbarer Spendertyp Patientenalter (passendes und Geschwisterteil Geschlecht des versus Spenders unverwandter (gleiches Spender), versus anderes Geschlecht) berücksichtigt, kann die Entscheidungsfindung, ob ein Patient eine Transplantation oder alternative Therapieverfahren bekommen soll, vereinfacht werden [67]. Auch genetische Alterationen, die das maligne Potenzial einer leukämischen Erkrankung reflektieren können und eventuell vorhandene Komorbiditäten finden Berücksichtigung bei der individuellen Abwägung des Nutzen-/Risikoprofils. Verglichen mit der Transplantation solider Organe ist die Kompatibilität der Humanen Leukozyten Antigene (HLA) im Falle einer allogenen HSCT von weit größerer Bedeutung und hat bei der Suche nach einem geeigneten Spender einen hohen Stellenwert. Bei den HLA-Antigenen handelt es sich um Oberflächenproteine, die die individuelle immunologische Signatur einer Zelle bilden und bei der Unterscheidung zwischen körpereigenen und körperfremden 17 1. EINLEITUNG Strukturen durch das Immunsystem eine Schlüsselrolle spielen. Die gefürchtete Abstoßungsreaktion findet im Setting einer allogenen HSCT nicht nur im Sinne einer Empfängerreaktion gegen das Spenderorgan (Host-versus-Graft Disease), sondern auch andersherum als eine Reaktion des Spender-Immunsystems gegen die Empfängerzellen statt (Graft-versus-Host Disease). Aus diesem Grund wird versucht, einen in den HLA-Merkmalen möglichst identischen Spender zu finden. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei beliebige Geschwister HLA-identisch sind, liegt bei 25%. Ist dies der Fall, sind sie Spender erster Wahl. Spender zweiter Wahl sind HLA-identische Fremdspender, also nicht verwandte Personen. Die Wahrscheinlichkeit einen HLA-identischen Fremdspender mittels entsprechender Spenderdatenbanken zu finden liegt weltweit aktuell bei 76-97%, je nach ethnischer Zugehörigkeit [86]. Patienten, für die kein HLA-identischer Spender gefunden werden kann, bleibt die Möglichkeit Stammzellen eines haploidentischen, also zur Hälfte passenden Familienmitglieds zu verwenden. Diesbezüglich ist zu berücksichtigen, dass ein HLA-Mismatch unter anderem sowohl Inzidenz als auch Schwere einer GvHD erhöht [3, 15, 151]. Ebenso ist das Risiko eines Transplantatversagens umso höher, je signifikanter das Mismatch der HLA-Allele ist [3, 151]. Mit verschiedenen Verfahren zur T-Zelldepletion kann im Falle eines Mismatches versucht werden diesem gesteigerten GvHD-Risiko und der erhöhten Rate an Transplantatversagen zu begegnen. Verlängerte Immundefizienz, ein damit erhöhtes Infektionsrisiko und erhöhte Rückfallraten stellen hierbei bislang die größten Probleme dar [1, 6, 18, 114, 126]. 18 1. EINLEITUNG Tabelle 1: Zu sehen sind das prozentuale Transplantatversagen (Incidence of graft- failure) in Abhängigkeit vom Ausmaß des Mismatches der Humanen Leukozyten-Antigene (HLAMismatch) jeweils zwischen verwandten (related doner) und nicht verwandten (unrelated donor) Spendern. Die Patienten, die eine Spende von einem verwandten Spender erhielten, litten an verschiedenen hämatologischen malignen Erkrankungen, die Patienten, die eine Spende eines nicht verwandten Spenders erhielten, waren an einer chronisch myeloischen Leukämie (CML) erkrankt. Die Tabelle zeigt, dass ein multilokulärer HLA-Mismatch die Wahrscheinlichkeit eines Transplantatversagens erhöht. A, B, C, DRB1, DQB1 und DR bezeichnen hierbei jeweils verschiedene Allele. HLA= Humanes Leukozyten-Antigen; CML= Chronische myeloische Leukämie ; NT= not tested; p-value = p-Wert = Irrtumswahrscheinlichkeit [158]. 1.1.3.3. Formen der Stammzelltransplantation und Stammzellquellen Bei einer Stammzelltransplantation unterscheidet man grundsätzlich zwischen zwei verschiedenen Formen. Erhält ein Patient seine eigenen Stammzellen, die ihm zu einem früheren Zeitpunkt entnommen wurden zurück, bezeichnet man dies als autologe Stammzelltransplantation. Handelt es sich bei Spender und Empfänger jedoch um genetisch verschiedene Individuen spricht man von einer allogenen Transplantation. Diese ist in der Anwendung aufwendiger und mit einem höheren Risiko behaftet als die autologe Transplantation, da die körperfremden 19 1. EINLEITUNG Spenderstammzellen dauerhaft vom Empfängerorganismus toleriert werden müssen. Durch den Graft-versus-Tumor-Effekt (GvTE), der nur durch körperfremde, immunkompetente Zellen erzielt werden kann, zeigt sie aber auch eine stärkere tumorreduktive Aktivität. Die allogene HSCT (alloHSCT) zeigt demnach eine geringere Rezidivrate, geht aber mit einer erhöhten Mortalität als die autologe Transplantation einher [22, 37, 99, 103]. Die Blutstammzellen können dem Empfänger entweder in Form einer Knochenmarktransplantation (KMT) oder auch mittels Leukapherese aus dem peripheren Blut eines Spenders durch Transfusion übertragen werden. Bei einer Knochenmarktransplantation wird dem Spender in Vollnarkose durch Punktion meist des Beckenkammes Knochenmark entnommen. Aus dem gewonnenen BlutKnochenmark-Gemisch werden die Stammzellen isoliert, gegebenenfalls weiter aufgereinigt und dem Empfänger später transfundiert. Bei der peripheren Blutstammzellspende, auch Leukapherese, wird der Spender zunächst über einige Tage mit Granulozyten-Kolonie stimulierendem Faktor (G-CSF) behandelt. Bei diesem handelt es sich um einen Wachstumsfaktor, der zu einer kontrollierten übermäßigen Produktion der Stammzellen führt und zudem bewirkt, dass vermehrt Blutstammzellen in den Blutkreislauf gelangen. Die Spende erfolgt dann mittels einer Apheresemaschine, die das Blut nach seiner Dichte auftrennt und die Stammzellen herausfiltert. Der Spender wird mittels zweier Venenkanülen an diese Maschine angeschlossen und erhält sein so gefiltertes Blut zurück. Die so gewonnenen Blutstammzellen werden später dem Empfänger transfundiert. Letztere Methode findet heute bevorzugt Verwendung, da sie nicht nur in der Anwendung angenehmer für den Spender ist, sondern weil die Blutstammzellen auch ein schnelleres Engraftment zeigen. Damit wird eine kürzere Aplasiephase erreicht, was wiederum eine Reduktion der Behandlungs-assoziierten Mortalität zur Folge hat [156]. Unmittelbar nach der Geburt ist es auch möglich, Stammzellen aus dem Nabelschnurblut zu gewinnen und diese einem geeigneten Empfänger zur Verfügung zu stellen [8, 26, 33]. 20 1. EINLEITUNG 1.1.3.4. Konditionierung und Durchführung einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation Für die positiven Effekte der allogenen HSCT ist nach heutigem Wissensstand neben der zytotoxischen Konditionierung auch der sogenannte Graft-versusLeukämie Effekt (GvLE) der transplantierten Stammzellen verantwortlich [108]. Die in den 1990ern aufgekommene Hypothese dieses Effekts, der nicht durch die vorangegangene Chemo- und Strahlentherapie erklärt werden kann, sondern Resultat der Aktivität des transplantierten Immunsystems sein muss, trieb die Entwicklungen im Bereich der HSCT stark voran [85]. Die ehemalige Annahme, dass eine hochdosierte Radiochemotherapie unbedingt nötig ist, da nur diese die malignen Zellen beseitigen kann, war damit hinfällig und musste dem neuen Konzept, in dem die maligne Grunderkrankung durch alloimmune Effektorzellen besiegt werden sollte, Platz machen. Neue, weniger toxische Konditionierungsprotokolle, die nicht-myeloablativ und von reduzierter Stärke waren kamen dadurch zur Anwendung. Diese neuen, milderen Konditionierungsprotokolle schufen die Möglichkeit die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation nun auch vermehrt älteren und medizinisch instabileren Patienten mit beispielsweise verschiedenen Komorbiditäten anzubieten, die zuvor zum überwiegenden Teil nicht von diesem Verfahren hatten profitieren können. Versuche, wie die von Giralt et al., die Patienten mit schlechten Chancen für eine konventionelle myeloablative Therapie aufgrund ihres körperlichen Zustandes einer sanfteren Konditionierung mit Fludarabin und Melphalan unterzogen waren Wegbereiter für das wachsende Anwenderspektrum der alloHSCT [205]. Auch das größer werdende Verständnis bezüglich der Verträglichkeit von alternativen Spendern trug dazu bei, die alloHSCT immer häufiger als Therapieoption zur Verfügung zu haben. Durch die Verwendung von nicht verwandten Spendern mit vertretbarem Humanem haploidentischen Spendern Leukozyten und Antigen Nabelschnurblut (HLA)-Mismatch, kann heute HLAfür die überwiegenden Mehrheit der Patienten eine Stammzellquelle gefunden werden [141]. 21 1. EINLEITUNG Eine Stammzelltransplantation beinhaltet grundsätzlich 3 Schritte: 1) Im ersten Schritt werden zunächst durch die Anwendung verschiedener Konditionierungsmethoden, wie Chemo-, Strahlen, oder Immuntherapien, die malignen aber auch residuellen normalen hämopoetischen Stammzellen aus den Stammzellnischen des Knochenmarks möglichst vollständig beseitigt. Wird das alte Knochenmark des Empfängers dabei durch die Chemo- und/oder Strahlentherapie nahezu vollständig zerstört spricht man von einer myeloablativen, im Falle einer teilweisen Elimination durch eine niedrigere Dosierung von einer myeloablativen Konditionierung mit reduzierter Toxizität. Beide Ansätze sollen langfristig einen kompletten Chimärismus, d. h. vollständigen Ersatz der Empfänger- durch die Spenderhämatopoese bewirken [173]. In bestimmten Fällen kann auch eine zusätzliche Bestrahlung des Knochenmarks mit radioaktiv markierten Antikörpern zum Einsatz kommen. Diese intensivierte Konditionierung vermindert das Rezidivrisiko zusätzlich [89]. Je intensiver das jeweilige Konditionierungsregime, desto mehr Knochenmark und damit maligne Stammzellen werden zerstört. Damit sinkt das Rezidivrisiko und das Transplantat hat eine bessere Chance gut anzuwachsen. Die Komplikationsrate, besonders durch das erhöhte Infektionsrisiko, steigt allerdings. 2) Vor allem im Falle eines dosisreduzierten Konditionierungsregimes hat die Ablation des Empfänger-Immunsystems durch Immunsuppressiva eine wichtige Bedeutung. Damit das Spendergewebe optimal in den Stammzellnischen anwachsen kann, ist es erforderlich, dass verbliebene Immunzellen im Empfänger durch Gabe immunosuppressiv wirksamer Medikamente in ihrer Funktion gehemmt werden. Damit wird eine Alloreaktivität gegen den Spender, die sogenannte Host-versus-Graft-Reaktion verhindert. 3) Im Anschluss an die Konditionierung wird das Stammzelltransplantat dem Empfänger zugeführt und die freien Stammzellnischen werden durch gesunde hämatopoetische Stammzellen des Spenders besiedelt. So wächst ein neues, gesundes blutbildendes System im Empfänger heran. 22 1. EINLEITUNG Tabelle 2: Überblick über die unterschiedlichen Behandlungsoptionen im Bereich der hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Dargestellt sind hier die Vor- und Nachteile verschiedener Formen der Konditionierung, der Stammzellquellen, des Spendertyps und des Umgangs mit einer Graft-versus-host-disease. HLA = Humanes Leukozyten Antigen [89]. 1.1.4. Immunrekonstitution nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation 1.1.4.1. Immunologische Grundlagen Das Immunsystem hat neben der Bekämpfung von Infektionen auch die Aufgabe den Körper vor Tumoren zu schützen, indem es maligne Zellen rechtzeitig erkennt und beseitigt. Als Grundlage der heutigen Tumorimmunologie gilt die bereits über 100 Jahre alte, von Paul Ehrlich postulierte Theorie der Immunüberwachung von Tumoren. Paul Ehrlich ging bereits damals davon aus, dass maligne 23 1. EINLEITUNG Veränderungen einer Zelle vom Immunsystem im Normalfall als körperfremd und damit gefährlich erkannt und deshalb auch angegriffen würden [40]. Burnet und Thomas spannen in den 50er Jahren diesen Gedanken weiter und prägten den Begriff der Immunosurveillance, mit dem die Überwachung von Tumoren durch das Immunsystem gemeint ist [28]. Heute gilt es als gesichert, dass das Immunsystem aktiv gegen Tumoren vorgehen kann [55, 180, 186]. Dieser Prozess der Tumorkontrolle durch das Immunsystem wird auch als Cancer-Immunoediting bezeichnet und wird in drei Phasen untergliedert. Während der Eliminierungsphase versuchen die Immunzellen die Tumorzellen zu zerstören. In der Gleichgewichtsphase persistieren die Tumorzellen zwar im Körper, ihr Wachstum wird aber durch das Immunsystem kontrolliert. In der Phase des Entkommens vermehren sich die Tumorzellen unkontrolliert, weil sie entweder nur noch eine reduzierte Immunogenität aufweisen und/oder ein höheres Potenzial besitzen, die Immunität des Wirts zu überwinden [178]. Während eines malignen Krankheitsgeschehens durchlaufen die Interaktionen zwischen Tumor und Immunsystem diese verschiedenen Phasen. Das Resultat dieser Prozesse bestimmt schlussendlich das Outcome des Patienten. Entweder das Immunsystem behält die Oberhand und der Tumor wird zerstört, er bleibt zunächst in einem stabilen Zustand ohne weiter zu wachsen, oder das Immunsystem scheitert und die Tumorzellen vermehren sich. Das Immunsystem fungiert dabei als Tumosuppressor-System, das den Körper vor den zerstörerischen Aktivitäten maligner Zellen schützen kann, indem es die Anzahl der malignen Zellen begrenzt. Folge dieses Kampfes gegen entartete Zellen ist nach der Theorie des Cancer-Immunoediting auch eine Beeinflussung der Immunogenität dieser Zellen [178, 180]. Hauptakteure in diesem Kampf gegen entartete Zellen sind nach heutigem Kenntnisstand die zytotoxischen CD8+ T-Zellen und CD4+ Th1-Zellen (CD4-positive T-Helferzelle 1), wobei den zytotoxischen CD8-positiven T-Lymphozyten (CTLs) die Rolle der klassischen Effektorzelle zugesprochen wird [180, 186]. Ihre Aufgabe besteht darin, abnormale oder infizierte Zellen zu beseitigen, um die Entwicklung von Krebserkrankungen oder Infektionen zu verhindern. Ein funktionsfähiges Immunsystem ist dabei auf ein Gleichgewicht aus stimulierenden und inhibierenden Faktoren angewiesen. Auch die sogenannte periphere Toleranz, durch die die Immunzellen davon abgehalten werden, den 24 1. EINLEITUNG eigenen Körper anzugreifen spielt eine entscheidende Rolle. Ein Versagen dieser Toleranz gegenüber körpereigene Zellen mündet typischerweise in den diversen bekannten Autoimmunkrankheiten und kann sehr gefährlich sein. Da es sich bei Krebszellen aber um körpereigene, entartete Zellen handelt, stellen sie eine besondere Herausforderung für das Immunsystem dar. Damit diese entarteten Zellen also nicht vom Körper als eigen und damit ungefährlich, sondern als immunogen erkannt werden und eine effektive CD8+-T-Zell-vermittelte Immunantwort ausgelöst werden kann, müssen die Krebszellen idealerweise spezifische Tumorantigene exprimieren, die diese als fremd und potenziell gefährlich markieren. Für eine potente und anhaltende Immunantwort benötigen die T-Zellen auch zusätzlich die Hilfe anderer Zellen, die ihnen Fragmente dieser Antigene auf einem Major Histocompatibility-Komplex (MHC) präsentieren. Für die Erkennung der speziellen Tumorantigene, den Leukämie-assoziierten bzw. Tumor-assoziierten Antigenen (LAAs/TAAs), spielt besonders die Interaktion der CTLs mit den tumordrainierenden professionellen antigenpräsentierenden dendritischen Zellen (DCs) eine entscheidende Rolle. Dieses Zusammenspiel findet hauptsächlich in den Lymphknoten statt. Teil dieses Aktivierungsprozesses ist die Kreuzpräsentation der DCs an die beiden T-Zell-Typen [144]. Dabei prozessieren und präsentieren ausschließlich reife DCs ihre Antigene sowohl den CD4-positiven (CD4+) T-Zellen über MHC Klasse II-Moleküle als auch den CD8+ T-Zellen über MHC Klasse I- und weitere verschiedene kostimulatorische Moleküle. Eine Antigenpräsentation durch unreife DCs, die nicht über kostimulatorische Moleküle verfügen, oder durch andere Zellen, die diese ebenfalls nicht exprimieren, wie z. B. Tumorzellen, löst bei naiven T-Zellen Toleranz aus und resultiert in einem Stadium von T-Zellanergie [133]. Eine erfolgreiche T-Zellaktivierung entsprechenden Antigens beinhaltet an den also stets T-Zellrezeptor das und Binden zusätzlich eines das Vorhandensein weiterer kostimulatorischer Stoffe [213]. Sind die genannten Voraussetzungen erfüllt proliferieren die naiven T-Zellen nach Antigenkontakt und differenzieren zu zytotoxischen T-Zellen, die in der Lage sind Tumorzellen anzugreifen, indem sie Zytotoxine aus lytischen Granula freisetzen. Diese induzieren in der Zielzelle dann den programmierten Zelltod, die Apoptose. Einmal ausdifferenzierte und aktivierte CD8+ T-Zellen benötigen bei erneutem Antigenkontakt keine weitere Kostimulation. Einige von ihnen werden im Weiteren 25 1. EINLEITUNG zu Gedächtnis-T-Zellen, die eine schnelle und effektive Immunantwort ermöglichen, sobald ein Antigen erneut in den Organismus eindringt. CD4+ THelferzellen unterstützen die zytotoxischen T-Zellen durch die Sekretion von TZell-Wachstumsfaktoren und die Aktivierung weiterer antigenpräsentierender Zellen. Abbildung 4: Die Abbildung gibt einen Überblick über das zelluläre Immunsystem. Naive CD4-positive- (CD4+) und CD8-positive (CD8+) T-Zellen erkennen Peptidantigene, die ihnen von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) über ihren Major histocompatibility-Komplex (MHC) in Lymphknoten (grün) präsentiert werden. Daraufhin werden sie aktiviert, proliferieren und differenzieren sich zu Effektor- (Effector T cell) und Gedächtniszellen (Memory T cell), die in Blutgefäßen zirkulieren und dort infizierte Zellen über die Sekretion von Zytokinen töten und andere Immunzellen aktivieren können. APC= Antigen-präsentierende Zelle, CTL= cytotoxische T-Zelle, IL-2= Interleukin-2, IL-2-R= Interleukin-2-Rezeptor; TH1 Cell = T-Helferzelle 1 [113]. Diese Abbildung wurde veröffentlicht in Robbins Basic Pathology, 8. Auflage, Kumar, V., Abbas, A.K., Fausto, N. und R.N. Mitchell, Diseases of the Immune System, S. 114-119, Copyright Saunders Elsevier (2007) 26 1. EINLEITUNG 1.1.4.2. Ablauf der Immunrekonstitution nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation Der Begriff der Immunrekonstitution beschreibt den Reifungsprozess transplantierter hämatopoetischer Stammzellen zu Zellen der spezifischen und der unspezifischen Immunabwehr. Nach einer allogenen HSCT ist die erfolgreiche und möglichst rasche Wiederherstellung der Immunität ein entscheidender Faktor für die Prognose der Patienten, da diese sonst durch ihre Immundefizienz einer Vielzahl opportunistischer Infektionen durch Bakterien, Pilze oder Viren wehrlos gegenüberstehen. Obwohl die Konsolidierungstherapien in ihrer Intensität heute stark variieren und auf den einzelnen Patienten mit seinen jeweiligen Bedürfnissen abgestimmt werden haben sie immer noch immense Auswirkungen auf das Immunsystem. Die Immunzellen des Empfängers, die das Konditionierungsregime überlebt haben, werden nach der Stammzelltransplantation von den alloreaktiven Spender-T-Zellen vernichtet, zumeist bis ein vollständiger Chimärismus erreicht ist. In der Übergangszeit ist es möglich, dass beide Zellpopulationen miteinander interagieren. So ist bekannt, dass Spender-T-Zellen in hohem Maß von APCs des Empfängers stimuliert werden können, indem sie von diesen Antigene präsentiert bekommen [182]. Als erfolgreiches Anwachsen des Transplantats, auch Engraftment genannt, gilt eine absolute Neutrophilenanzahl von mindestens 500/µl, die über die Dauer von mindestens drei Tagen gemessen werden kann [91]. Dieser Effekt tritt meist 10-20 Tage nach der Transplantation auf. Wegen ihrer unterschiedlichen Entwicklungswege variiert die Dauer bis eine vollständige Rekonstitution erreicht ist je nach Zellart. Nach der aplastischen Phase erholen sich die Zellen der zellulären angeborenen Immunabwehr als erste. Natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Monozyten und Neutrophile erreichen bei Zellzählungen schon nach etwa einem Monat normale Werte. Das erworbene Immunsystem braucht hingegen etwas länger um sich zu erneuern. Nach im Mittel etwa vier bis sechs Monaten entwickeln sich aus B-Zellvorläufern erste funktionsfähige BZellen, die Immunglobulin M produzieren können. Nach etwa sechs Monaten können normale Zellzahlen gemessen werden [191]. Die vollständige Regeneration mit einem kompletten Immunglobulin-Repertoire dauert noch einige Monate länger und kann bis zu einem Jahr dauern [189, 190]. Im Kompartiment der T-Zellen liegt eine besonders große Inhomogenität vor was die Dauer der 27 1. EINLEITUNG Erholungsphasen betrifft. Für CD8-Zellen wurde in Studien eine Dauer von einem Monat, für CD4-Zellen von 24 Monaten gefunden, bis normale Zellzahlen erreicht wurden [191]. Baron et al. veröffentlichten sogar eine Dauer von etwa sechs Monaten bis normale CD8-Zellzahlen gefunden werden konnten [12]. Laurenti et al. berichteten über eine insgesamt bis zu fünf Jahre andauernde Änderung des CD4/CD8-Verhältnisses, im Sinne einer Erhöhung der CD8- und Erniedrigung der CD4-Zellzahlen [116]. Das adaptive Immunsystem ist relativ anfällig dafür, Schwierigkeiten in der Regenerationsphase zu haben. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das erworbene Immunsystem zum einen eine spezielle Umgebung benötigt um sich optimal zu entwickeln, wie zum Beispiel einen funktionsfähigen Thymus. Ein zusätzlicher Faktor, der Probleme bei der Rekonstitution bereiten kann, ist die Sensibilität der Immunzellen gegenüber den Immunsuppressiva, die nach einer allogenen Stammzelltransplantation oft verabreicht werden müssen, um die negativen Effekte der oftmals auftretenden Graft-versus-Host-Disease abzumildern. Herkunft der transplantierten Stammzellen -Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBSCT) oder Knochenmark (BMT)-, Grunderkrankung, Konditionierungsregime, Grad der MHC-Kompatibilität und Alter sind Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Dauer der Rekonstitution ebenfalls beeinflussen [62, 185, 191]. Die Lymphozytenzahlen nach PBSCT-Transplantation erholen sich schneller als nach der Transplantation von Knochenmark [168]. Intensive Chemotherapien vor der Transplantation führen zu höheren T-Zellzahlen nach der Transplantation als wenn diese nicht durchgeführt wurden. Derzeit wird angenommen, dass die Geschwindigkeit der Immunrekonstitution nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation wahrscheinlich mit dem klinischen Outcome der Patienten assoziiert ist [148]. Patienten mit lymphoiden Erkrankungen, oder solche die an akuter myeloischer Leukämie (AML) erkrankt sind tendieren eher dazu höhere T-Zellchimärismen zu zeigen als Patienten mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS) oder einer chronischen myeloischen Leukämie (CML). Empfänger von Stammzellspendern, die mit ihnen verwandt sind zeigen ebenfalls einen höheren T-Zellchimärismus als wenn nicht verwandte Spender eingesetzt werden. Mit steigendem Spender-TZellchimärismus steigt auch die Wahrscheinlichkeit eine GvHD zu entwickeln [10]. 28 1. EINLEITUNG Der Einfluss von Sexualhormonen auf das Engraftment ist ein weiterer Gegenstand aktueller Forschung [58, 59, 169]. Periphere T-Zellen können sich in stammzelltransplantierten Patienten sowohl über einen Thymus-abhängigen Weg als auch unabhängig von diesem rekonstituieren. Die verzögerte Erholung der T-Zellen ist bei Erwachsenen hauptsächlich auf die mit dem Alter einhergehende Atrophie des Thymus und seine eingeschränkte bis aufgehobene Funktionsweise zurückzuführen [31, 77]. Die frühe Rekonstitution der T-Zellen erfolgt bei dem Thymus-unabhängigen Weg oligonal als Vermehrung reifer Spender-T-Zellen, was einen Verlust vieler AntigenSpezifizierungen zur Folge hat. Dieser Homeostatic peripheral Expansion (HPE) genannte Prozess führt zu einem Repertoire, das abhängig ist von den TZellrezeptoren (TCR), die bereits im Transplantat enthalten waren und von den Antigenen, die den Prozess stimulieren [127]. Die Thymus-unabhängige TZellrekonstitution führt zu sowohl qualitativen als auch quantitativen Beeinträchtigungen und resultiert in einem beeinträchtigten T-Zellrepertoire [127]. Phänotypisch naive T-Zellen mit einem kompletten TCR-Repertoire brauchen für ihre Entwicklung aus Stammzellen die Hilfe des Thymus [30, 170]. Eine GvHD wirkt sich toxisch auf das Thymusgewebe aus und trägt auf diese Weise stark dazu bei, dass die Thymus-abhängige Regeneration der T-Zellen beeinträchtigt wird [49]. Alloreaktive T-Zellen sind in diesem Zusammenhang direkt verantwortlich für eine Schädigung des Thymus [80]. Eine suffiziente Funktion des Thymus wirkt sich insgesamt positiv auf das Outcome aus [211]. 1.1.4.2. Graft-versus-Leukemia Effekt Im Rahmen der Behandlung einer malignen hämatologischen Erkrankung mit Spenderzellen bewirken allogene Lymphozyten einen starken Graft-versusLeukemia Effekt, der für die Zerstörung von Tumorzellen benötigt wird und die Grundlage für einen langfristigen Heilerfolg bietet [34, 41, 44, 48, 82, 85, 105, 188,]. Dieser Effekt wurde schon vor mehr als 50 Jahren von Barnes und Loutit entdeckt, die als erste feststellten, dass es nach einer Knochenmarktransplantation einen Antitumoreffekt gibt, der nicht allein auf die vorangegangene Chemo- und Strahlentherapie zurückgeführt werden kann [9]. Maßgeblich beteiligt an diesem 29 1. EINLEITUNG Geschehen sind nach heutigem Wissensstand Spender T-Zellen, die verbliebene leukämische Zellen im Empfänger erkennen und töten können [5, 48, 85, 110, 111, 146, 165]. Außerdem mitwirkend sind zunächst auch dendritische Zellen des Empfängers, die den GvLE aufrecht erhalten können, indem sie die Spender-TZellen kontinuierlich stimulieren [120, 182]. Erkannt werden die Tumorzellen von den CTLS über Minor-Histokompatibilitätsantigene (mHags), überexprimierte Differenzierungsantigene und Y-chromosom-codierte Antigene [41, 42, 108, 130]. 1.1.4.3. Graft-versus-Host Disease Der heutige Stand der Forschung geht davon aus, dass nach einer alloHSCT das transplantierte Immunsystem maßgeblich an der Eradizierung der Tumorzellen beteiligt ist. Besonders zytotoxische T-Zellen werden für diesen Graft-versusTumor-Effekt verantwortlich gemacht. Unglücklicherweise tritt durch diese Zellen neben diesem erwünschten meist auch ein zusätzlicher, negativer Effekt auf. Denn zwar bekämpfen die CTLs entartete Zellen, schützen den Empfänger vor Infektionen und tragen dazu bei, die Spenderzellen im Körper zu etablieren. Zum anderen sind sie aber leider auch verantwortlich für die gefürchtete Graft-versusHost-Disease (GvHD). Dieser komplexe pathophysiologische Komplex ist eine oftmals schwer verlaufende und häufige Komplikation der HSCT [14, 45, 123, 182, 188, 207]. Die Immunzellen des Spenders richten sich bei dieser Krankheit gegen das Gewebe des Empfängers, da sie dieses als fremd und damit als potenziell gefährlich einstufen und verursachen so oft beträchtliche Schäden im Körper der transplantierten Patienten. Die verantwortlichen Mechanismen hierfür sind bislang noch unzureichend verstanden und es bleibt zu untersuchen, wie die beiden Effekte Graft-versus-Host Disease und Graft-versus-Leukämie Effekt künftig gezielt kontrolliert und voneinander separiert werden können. Durch die bislang noch vielfach bestehende Notwendigkeit die GvHD mittels Immunsuppressiva zu mildern wird auch der GvLE herabgesetzt. Dieser reicht deshalb in vielen Fällen nicht mehr aus die malignen Zellen zu töten, was als Folge in einem Rückfall der Erkrankung mündet. Strategien, mit denen man den GvLE steigern kann, ohne dabei aber gleichzeitig die GvHD zu verschlimmern, werden daher dringend benötigt und sind Gegenstand der aktuellen Forschung. 30 1. EINLEITUNG Abbildung 5: Die allogenen Spenderzellen sind nach der hämatopoetischen Transplantation sowohl gegen Leukämiezellen aktiv (lila), die sie über Leukämie-assoziierte Antigene erkennen, als auch gegen Alloantigene (blau), sie sich sowohl auf hämatopoetischen als auch auf anderen Geweben befinden. Graft-versus-Leukemia-Effekt (GvLE) und Graft-versus Host Disease (GvHD) laufen damit gleichzeitig ab. GvHD = Graft-versus-Host Disease, GvL= Graft-versus-Leukemia [214]. Die GvHD war ursprünglich unterteilt in zwei Formen, die akute GvHD, die definitionsgemäß vor dem hundertsten Post-Transplantationstag eintritt und die chronische GvHD, die sich danach einstellt [46]. Eine aktuellere Klassifikation schließt nun eine spät einsetzende akute GvHD und ein Überlappungssyndrom ein, welches Charakteristiken der akuten und chronischen GvHD aufweist und verzichtet auf ein Zeitlimit für die Diagnose einer chronischen GvHD [47]. Die klinischen Manifestationen stellen bei der akuten GvHD in erster Linie Haut, Gastrointestinaltrakt und Leber dar [94]. Symptome einer chronischen GvHD können unterschiedlicher Natur sein und nahezu jedes Organ betreffen, wie in Abbildung 6 anschaulich gemacht werden soll [46, 171]. Die chronische GvHD ist die führende Ursache des späten, nicht Rückfall-assoziierten Todes nach einer HSCT [118]. Höheres Lebensalter der Transplantatempfänger und eine 31 1. EINLEITUNG vorausgegangenene akute GvHD (aGvHD) sind die größten Risikofaktoren für das Auftreten der chronischen Graft-versus-Host Disease [29]. Bereits im Jahr 1957 prägten Billingham und Brent den Begriff der Graft-versushost-Disease in Anlehnung an Experimente mit Transplantationen an Mäusen [21]. Billingham definierte im folgenden die Voraussetzungen für eine GvHD folgendermaßen: Erstens soll das Transplantat immunologisch kompetente Zellen enthalten, zweitens soll der Empfänger auf seinem Gewebe Antigene exprimieren, die im Spender nicht vorhanden sind und drittens muss der Empfänger ein derart beeinträchtigtes Immunsystem aufweisen, dass es seinem Körper unmöglich ist, die transplantierten Zellen zu töten [20]. Abbildung 6: Übersicht über mögliche Symptome, die im Verlauf einer chronischen Graftversus-Host-Disease (GvHD) in unterschiedlicher Ausprägung auftreten können. Eine GvHD kann je nach Schwere eines oder mehrere der genannten Organe betreffen. GI= Gastrointestinal [46]. Damit eine GvHD auftritt, müssen die funktionstüchtigen Spender-T-Zellen, die verantwortlich sind für die GvHD also zunächst definierten Proteinen auf der Oberfläche der Empfängerzellen begegnen, diese als fremd erkennen und auf sie reagieren [102, 143, 188]. Bei den genannten Proteinen handelt es sich zum einen um den Major histocompatibility complex (MHC) und zum anderen um die Minor histocompatibility antigens (mHags) [112; 63, 93, 145, 200]. Bei den mHags handelt es sich um HLA-restringierte Peptide, die von autosomalen oder Geschlechtschromosomen kodiert werden. Deren Verschiedenheit in HLA32 1. EINLEITUNG passenden Transplantationen erhöht das Risiko der GvHD [42, 184]. Untergruppen dieser Oberflächenantigene sind auf allen Körperzellen vertreten und können damit als Zielscheibe für die alloreaktiven Spender T-Zellen dienen, die über diese Antigene den Empfängerorganismus als fremd erkennen und deshalb beginnen ihn zu attackieren [46]. Während einer GvHD existieren grundsätzlich zwei verschiedene Wege wie genau die Spender-T-Zellen aktiviert werden können. Sie können die Antigene entweder auf eigenen MHCs erkennen, was einer indirekten Alloerkennung entsprechen würde oder auf allogenen MHCs von antigenpräsentierenden Zellen des Transplantat-Empfängers also mittels einer direkten Alloerkennung [16, 84, 124]. Die Aktivierung einer akuten GvHD läuft in einem dreistufigen Prozess ab, in dem angeborene und erworbene Immunantworten zusammen spielen. Zu Beginn entstehen durch die Konditionierungstherapien, also Bestrahlung und/oder Chemotherapie multiple Gewebeschäden, die zur Ausschüttung einer Reihe inflammatorischer Zytokine führt. In diesem proinflammatorischen Milieu werden im zweiten Schritt Antigenpräsentierende Zellen besonders leicht aktiviert, was wiederum zu einer Amplifizierung der inflammatorischen Zytokine und weiterer zellulärer Faktoren führt. Dies gipfelt im dritten Schritt in einer Aktivierung der Spender T-Zellen und erneuten Ausschüttung entzündungsfördernder Faktoren. Damit entsteht eine Art Teufelskreis aus Zytokinen und T-Zell-Attacken gegen Empfängerzellen, indem die GvHD gewaltige Ausmaße erreichen kann [45]. Versuche an Mausmodellen geben Hinweise darauf, dass APCs des Empfängers maßgeblich für die Initiierung der GvHD verantwortlich sind, während diese im Verlauf der GvHD wahrscheinlich zunehmend von Spender-APCs abgelöst werden [182, 199]. Eine höhere Diskrepanz im Matching der HLAs geht mit einer größeren Schwere der GvHD einher und hat einen negativen Effekt auf das Überleben der Patienten [125]. Im Gegensatz dazu wird bei syngenetischen, also bei Transplantationen zwischen eineiigen Zwillingen oder autologen Transplantationen, über weitaus weniger GvHDs berichtet [57, 83]. Aus diesem Grund ist bei der Wahl der Spender darauf zu achten, eine möglichst hohe Kompatibilität der HLAs zwischen den Transplantationspartnern zu erreichen, um damit das GvHD-Risiko und die –Schwere zu senken. Es ist bekannt, dass durch die Transplantation von T-Zell- depletierten allogenen Stammzellen diese Erkrankung verhindert und dennoch ein erfolgreiches 33 1. EINLEITUNG Engraftment ermöglicht werden kann [32, 60, 131, 181, 201]. Das Risiko einen Leukämierückfall zu erleiden erhöht und die Leukämie-freie Überlebenszeit verkürzt sich dabei [131]. Immunsuppressiva reduzieren die Aktivität des Immunsystems im Ganzen und können damit die negativen Auswirkungen der GvHD verhindern. Parallel dazu wird der GvLE allerdings ebenfalls eingeschränkt, was wiederrum eine erhöhte Rückfallgefahr nach sich zieht und ebenfalls das Infektionsrisiko erhöht. 1.1.4.4. Chimärismus Der Begriff Chimäre stammt aus dem Griechischen (Chímaira = Ziege) und betitelte ursprünglich ein Mischwesen aus der griechischen Mythologie [87]. In der Medizin benutzt man das Wort Chimäre um einen Organismus zu beschreiben, der aus genetisch unterschiedlichen Zellen bzw. Geweben aufgebaut ist, aber trotzdem ein einheitliches Individuum darstellt. Ein kompletter Chimärismus liegt dann vor, wenn alle blutbildenden Zellen eines Transplantat-Empfängers vom Spender stammen. Im Gegensatz dazu finden sich beim gemischten Chimärismus sowohl Blutzellen vom Spender als auch vom Empfänger [121]. Neben einer Normalisierung des Blutbilds gilt auch der Chimärismus als ein Zeichen für die Funktionsfähigkeit des Transplantats. Ein kompletter Chimärismus wird vor allem beim Vorliegen von malignen Erkrankungen angestrebt. In diesem Fall wird befürchtet, dass noch vorhandene Empfängerzellen das Wachstum maligner Zellen erleichtern können, indem sie immunokompetente Spenderzellen hemmen. Bei nicht malignen Erkrankungen werden hingegen auch gemischte Chimärismen akzeptiert. Laut einer Studie von Baron et al. wurden bei Patienten mit verschiedenen hämatologischen Malignomen 14 Tage nach einer allogenen Stammzelltransplantation T-Zellchimärismen von durchschnittlich 69,4% gefunden [10]. Der gemischte Chimärismus ist sowohl mit einem erhöhten Risiko des Transplantat-Versagens [19, 95, 100] als auch mit einem höheren Rückfallrisiko assoziiert [11, 136]. Momentan ist die Short Tandem Repeat PolymeraseKettenreaktion der Goldstandard für die quantitative Bestimmung des Chimärismus nach Stammzelltransplantationen. Sie wird je nach Patient in regelmäßigen Abständen nach der Transplantation durchgeführt und erlaubt 34 1. EINLEITUNG prinzipiell Aussagen über das Rückfallrisiko, den Remissions-Status und den Erfolg des Transplantat-Anwachsens zu treffen [159]. 1.2. Immuntherapien 1.2.1. Allgemeine Aspekte Standard-Therapien für maligne hämatologische Erkrankungen beinhalten im Regelfall die Chemo- und Strahlentherapie. Während diese konventionellen Therapieansätze jedoch immer noch meist unzureichende Langzeiterfolge in der Behandlung vieler hämatologischer Malignitäten erzielen und durch ihre toxischen Nebenwirkungen in ihrem Behandlungsspektrum eingeschränkt sind, stellen immuntherapeutische Konzepte nun einen viel versprechenden Ansatz dar. Patienten mit einer primär Chemotherapie refraktären Erkrankung oder einem Rezidiv und vor allem auch ältere Patienten, die für eine intensive Chemotherapie oder eine Stammzelltransplantation nicht in Frage kommen profitieren besonders von dieser Therapieoption. Zielgerichtete Immuntherapien sind gegenwärtig Gegenstand intensiver Forschung. Sie sind bereits in vielen Mausmodellen erfolgreich durchgeführt worden und auch in klinischen Studien bereits effizient gewesen. Ziel hierbei ist es, das körpereigene Immunsystem des Patienten derart zu modifizieren und zu stimulieren, dass es in der Lage ist die Tumorzellen selbst beseitigen zu können, oder körperfremde Immunzellen von außen zuzuführen, die diese Aufgabe übernehmen können. Mittlerweile stehen eine Vielzahl verschiedener Therapieoptionen zur Verfügung. Auf der einen Seite ist es möglich, den entarteten Zellen mit humoralen Mitteln wie monoklonalen Antikörpern oder Adjuvantien zu begegnen, auf der anderen Seite stehen verschiedene zelluläre Strategien zur Verfügung, wie der adoptive Transfer von T-Zellen und verschiedene Vakzinierungsformen. Ausgehend von den Erfahrungen, die mit der allogenen Stammzelltransplantation gemacht wurden und dem Wissen um den bereits vorgestellten GvLE schien es naheliegend, sich die positiven Effekte körperfremder Immunzellen auf verbliebene Tumorzellen zu Nutzen zu machen. Die von Kolb et al. im Jahr 1990 35 1. EINLEITUNG erstmals an CML-Erkrankten erfolgreich eingesetzte Spenderlymphozyteninfusion (DLI) war die erste effektive Form der zellulären Immuntherapie [110]. Dabei werden der Stammzellspende zwar vorübergehend die Spender-T-Zellen entnommen, diese werden dann aber einige Zeit nach erfolgter HSCT dem Empfänger als sogenannte Delayed Lymphocyte Infusion (DLI) zugeführt. Vielen Patienten, die nach einer allogenen Stammzelltransplantation nur einen inkompletten Chimärismus aufzeigen, einen Rückfall erleiden, oder an einer Resterkrankung leiden, kann mit dieser erneuten Gabe von Lymphozyten des ehemaligen Stammzellspenders und deren bewirktem GVL-Effekt geholfen werden [36, 85]. Die Potenz dieser Behandlung ist dabei je nach Erkrankung unterschiedlich [36, 111]. Neben dieser T-Zell-basierten Immuntherapie gibt es noch eine Vielzahl weiterer Strategien, mit denen versucht wird, das Immunsystem selektiv gegen Tumorzellen vorgehen zu lassen. Beispielsweise wird versucht mit Hilfe rekombinanter Zytokine, wie dem Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor eine unspezifische Stimulation des Immunsystems zu erreichen und die Expression von Tumorantigenen zu steigern um damit eine gegen hämatologische Vorläuferzellen gerichtete Immunreaktion zu induzieren [25, 198]. Eine weitere Möglichkeit in der Therapie maligner hämatologischer Erkrankungen liegt in der Verwendung monoklonaler Antikörper. Besonderer Beliebtheit erfreuen sich auch beispielsweise gegen das Antigen CD33 gerichtete Immunglobuline. Dieses Antigen ist auf einer Vielzahl myeloischer Zellen zu finden, aber nicht auf Granulozyten, hämatologischen Vorläuferzellen, oder normalen Geweben, was es zu einem idealen Angriffsziel einer adaptiven Immuntherapie macht [2, 4, 115]. Die Gabe allogener NK-Zellen kann ebenfalls eine Option sein. Tumorzellen, die über kein HLA-Molekül für den Killer Immunoglobulin-like-Receptor (KIR) auf den Spender-NK-Zellen verfügen, können von den NK-Zellen ausfindig gemacht und vernichtet werden [135, 196]. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dem Empfänger nur ausgewählte T-Zellen zukommen zu lassen, die ihm für die Bekämpfung seiner Erkrankung von Nutzen sein werden. Mittels verschiedener Multimer-Techniken, Tetramere, Pentamere oder Streptamere können spezifische CTLs aus dem Spenderblut isoliert werden. Dem Empfänger werden dann vorrangig CTLs verabreicht, die spezifisch gegen seine jeweilige Erkrankung gerichtet sind und seine gesunden Zellen verschonen [140, 174]. 36 1. EINLEITUNG 1.2.2. Leukämie-assoziierte Antigene Ausgehend von der Tatsache, dass ein Teil der Tumoren nur dadurch entsteht, dass das Immunsystem versagt und zu schwach ist deren Wachstum zu verhindern, liegt es wie bereits erläutert nahe, für die Therapie eine Strategie zu wählen, die die Stärkung und Aktivierung der tumorspezifischen Immunantwort zum Ziel hat. Als Zielstrukturen für diese Zwecke wurde bereits eine große Zahl an sogenannten Tumorantigenen und –assoziierten Antigenen (TAAs) gefunden. Dabei handelt es sich um körpereigene oder virale Proteine, die in der Tumorzelle exprimiert werden und im Verlauf der Erkrankung eine Immunreaktion beim Patienten auslösen. Werden diese speziellen Proteine bei einer Vielzahl von Patienten exprimiert, können sie sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie Verwendung finden. Im Jahr 1995 legten Sahin et al. mit SEREX (Serological identification of antigens by recombinant expression cloning/ Serological screening of recombinantly expressed antigens) den Grundstein zur Identifizierung einer großen Menge dieser TAAs in verschiedenen soliden Tumoren [171]. Kurze Zeit später folgte mit Proteomex eine weitere Methode Tumor-assoziierte Antigene zu identifizieren, die mittels 2D-Gelelektrophorese und einem Immunoblotverfahren Tumorantigene detektieren konnte [106]. AMIDA (Autoantibody Mediated Identification of Antigens), ein Verfahren, das auf der Immunopräzipitation von Antigenen aus primären Tumorbiopsien mittels immobilisierter autologer Serumantikörper beruht stellt eine weitere Möglichkeit hierfür dar [56]. Um sich die therapeutischen Möglichkeiten der Immuntherapie auch bei malignen hämatologischen Erkrankungen zunutze machen zu können wurden in den letzten Jahren eine Reihe von Leukämie-assoziierten Antigenen (LAAs) charakterisiert, die das hämatologische Korrelat zu den TAAs darstellen. So spielen LAAs heute eine Rolle als Zielstruktur für gerichtete Immuntherapien nach Chemotherapien oder Stammzelltransplantationen und finden Verwendung als Biomarker für den Erkrankungsstatus und -grad, sowie für das Ansprechen auf die Therapien [75]. Die meisten bisher bekannten Tumorantigene sind an zentralen Regulationsmechanismen der Zellproliferation beteiligt. Sie können entsprechend ihres Expressionsverhaltens weiter in zwei Gruppen unterteilt werden: In die Tumor-spezifischen (TSA) und die Tumor-assoziierten Antigene (TAA). 37 1. EINLEITUNG Abbildung 7: Leukämie-assoziierte Antigene sind in zentrale Mechanismen der Zellproliferation involviert. Diese Abbildung zeigt exemplarisch einige bekannte Leukämieassoziierte Antigene (orange) und deren Beteiligung an unterschiedlichen zellulären Mechanismen (blau) und den entsprechenden Folgen (grün). BAGE =B melanoma Antigen; BCL-2 = B-cell lymphoma-2; Bcr-abl = Breakpoint cluster region- abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1; FLT3-ITD = Fms-related tyrosine kinase 3-internal tandem duplication; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; HAGE = Helicase antigen; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; MPP11 = M-phase phosphoprotein 11; PASD1 = PAS domain containing 1; PR3 = Proteinase 3; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RAR = Retinoic acid receptor; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; RAGE-1 = Renal Tumor Antigen-1; SSX2IP = Synovial Sarcoma, X Breakpoint 2 Interacting Protein ; WT-1 = Wilms-Tumor-Gen 1 [68]. Tumorspezifisch bedeutet, dass das entsprechende Antigen nahezu ausschließlich von Krebszellen gebildet wird, während Tumor-assoziierte Antigene dagegen zwar auch von gesunden Zellen produziert werden, in Krebszellen aber meist überexprimiert werden. Bei den tumorspezifischen Antigenen handelt es sich um virale Antigene, Translokalisations- und sogenannte Cancer testis Antigene (CTA), oder um tumorspezifische Mutationen, wie Punktmutationen oder 38 1. EINLEITUNG Translokationen. Diese treten in Neoplasien häufig auf und ergeben oft neuartige immunogene Peptide, wie beispielsweise das auch als Philadelphia-Chromosom bekannte Breakpoint cluster region- abelson Murine leukemia viral oncogene homolog 1 (Bcr-abl). Die Tumor-assoziierten Antigene wiederum sind im allgemeinen Differenzierungs- oder Amplifizierungsantigene. Sie werden von den Tumoren der meisten Patienten gebildet, es ist aber zu beachten, dass sie nicht tumorspezifisch sind. Hierzu gehören zum Beispiel Antigene des Melanoms, des Prostata-Krebses und Antigene verschiedener Epithel-Karzinome. Wenn TAAs also als Zielstruktur für Therapien genutzt werden, kann dies daher auch immer zu erheblichen Nebenwirkungen im gesunden Gewebe führen. Die meisten bisher bekannten Tumorantigene werden über den MHC-I-Komplex auf der Zellmembran präsentiert und von CD4+-, CD8+- und auch von B-Zellen erkannt [68]. Tumoassoziierte Antigene können zudem direkt assoziiert sein mit einem besseren Outcome in hämatologischen oder soliden Krebserkrankungen [27, 68, 72, 73, 82]. Unsere Gruppe konnte erst kürzlich zeigen, dass T-Zellantworten gegen Mutated region of nucleophosmin 1 (NPM1) assoziiert waren mit einem längeren Überleben und einem besseren Outcome, wie im Folgenden auch in Abbildung 8 dargestellt wird [73, 82]. Tumor-assoziierte Antigene können damit Zielstrukturen sein für spezifische Immuntherapien. Das ideale Antigen hierfür sollte zum einen möglichst immunogen sein und von den Zellen auf der Oberfläche exprimiert werden um überhaupt eine T-Zell-Antwort auslösen zu können. Zum anderen sollte es möglichst nur von leukämischen Zellen exprimiert werden um eine unnötige Reaktion gegen gesundes Gewebe zu vermeiden. Gut geeignet ist das Antigen auch dann, wenn es eine Schlüsselrolle im Zellzyklus spielt und an der Proliferation und dem Überleben der Zelle beteiligt ist. 39 1. EINLEITUNG Abbildung 8: Zu sehen sind die durchschnittlichen Überlebenszeiten von Patienten mit akuter myleoischer Leukämie und Mutated region of nucleophosmin 1- (NPM1-) Mutation. Die Daten dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass das Vorhandensein spezifischer TZell-Reaktionen gegen die von NPM1 abgeleiteten Peptide #1 und #3 mit einem längeren Überleben assoziiert ist. A: Kaplan Meier Plots mit dem durchschnittlichen Überleben (blaue Kurve) von 25 Patienten mit NPM1-Mutation. B: Durchschnittliches Überleben von Patienten mit (blau) spezifischen Immunantworten gegen mindestens 1 getestetes Peptid und (grün) ohne detektierbare spezifische Immunantwort. C: Durchschnittliches Überleben von Patienten je nach Immunantwort gegen ein jeweiliges Peptid. Blau: Peptid 1; Grün: Peptid 3; Gelb: Peptide 1 und 3; Lila: Kein Peptid. Die senkrechte Achse stellt jeweils die Wahrscheinlichkeit des Überlebens dar, die waagrechte Achse die durchschnittliche Überlebenszeit in Monaten NPM1= Mutated region of nucleophosmin 1; P = Irrtumswahrscheinlichkeit [73]. 40 1. EINLEITUNG 1.2.3. Vakzinierung gegen Leukämie-assoziierte Antigene Die Vakzinierung mit spezifischen Antigen-Epitopen, die von LAAs abgeleitet wurden ist Gegenstand diverser aktueller Studien. Ziel ist es, eine Immunantwort im Patienten auszulösen, die spezifisch gegen eines oder mehrere Tumorantigene gerichtet ist. Die Vakzine können in zwei Gruppen unterteilt werden: Die Impfungen, die spezifisch gegen definierte minor histocompatibility antigens oder LAAs gerichtet sind und solche, die ein breites Spektrum antileukämischer Aktivität zeigen [161]. Erstere Impfstoffe beinhalten Peptide und DNA oder Ribonukleinsäure (RNA), die Sequenzen von Tumorprotein kodieren. Letztere bestehen aus leukämischen DCs, Zelllysaten oder Tumorzellen, die GM-CSF sezernieren und eine breite Stimulation des Immunsystems bewirken sollen [161]. Nach Injektion eines Impfstoffes wie er an erster Stelle genannt wurde, nehmen Antigen-präsentierende Zellen die Peptid-Epitope auf und präsentieren diese an naive T-Zellen. Treffen die hiermit aktivierten und im Anschluss weiter differenzierten T-Zellen dann auf eine maligne entartete Zelle, die ein LAA präsentiert, das dem geimpften Peptid entspricht, wird sie von der T-Zelle erkannt und in Folge dessen lysiert. Mit einer Impfung gegen LAAs könnte nicht nur eine Immunantwort neu erzeugt sondern auch beispielsweise eine bereits bestehende Immunantwort gestärkt und damit eine MRD kontrolliert werden. Es gibt bereits eine Vielzahl Untersuchungen und klinische Studien über derartige Impfungen, die sowohl in vivo als auch in vitro T-Zellantworten gegen verschiedene TAAs induziert haben und zum Teil auch klinische Ergebnisse erzielen konnten [53, 71, 101, 119, 163, 164, 175]. Die besondere Herausforderung in diesem Verfahren besteht darin, die Immunantwort des Patienten zu amplifizieren und in ein langanhaltendes Gedächtnis zu überführen um eine kontinuierliche Überwachung eventueller Krebszellen zu ermöglichen ohne dabei aber eine nicht zu beherrschende Autoimmunität zu induzieren, wie sie üblicherweise von der GvHD erzeugt wird. Idealerweise wird deshalb mit dem Impfstoff auf ein Tumorantigen abgezielt, das möglichst ausschließlich auf Tumorzellen exprimiert wird um gesunde Zellen zu schonen und so fehlgerichtete Reaktionen zu vermeiden. 41 1. EINLEITUNG 1.3 Zielsetzung Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist nach wie vor die effektivste Therapiemethode um eine Tumorimmunität zu erzielen und Patienten dauerhaft von ihrer Erkrankung zu heilen. Die Entwicklung der GvHD, Krankheitsrückfälle durch eine Residualerkrankung und opportunistische Infektionen stellen jedoch leider nach wie vor Risiken dar, die sich nicht bei jedem Patienten als kontrollierbar erweisen und deren Prognose verschlechtern. Mit der Entdeckung einer immer größer werdenden Anzahl Leukämie-assoziierter Antigene und dem neuen Konzept der Immuntherapien bieten sich nun Therapieoptionen, die durch ihre Spezifität und geringeren Nebenwirkungen vielen Patienten, die bislang nur eingeschränt von einer allogenen HSCT haben profitieren können helfen sollen. Der Gedanke, die eigenen Ressourcen des Körpers zu nutzen um hämatologische und solide Tumoren effektiv bekämpfen zu können ohne dabei gefährliche oder stark beeinträchtigende Nebenwirkungen riskieren zu müssen, wird mehr und mehr zur realen Option. Die Vakzinierung gegen LAAs mit einer Stammzelltransplantation zu kombinieren erscheint dabei als ein besonders interessantes Konzept. Lymphopenie und die Ausschüttung von Wachstumsfaktoren formen ein einzigartiges Umfeld mit immensen Möglichkeiten eine effektive Immuntherapie durchzuführen. Nach einer alloHSCT ist neben einem massiven und sehr schnellen Lymphozytenwachstum auch eine erhöhte Empfindlichkeit gegen unter anderem Tumorantigene zu erwarten. Dieser Zustand erscheint als ideales Milieu um den GvL-Effekt der zytotoxischen Spender-TZellen zusätzlich um ein vielfaches zu steigern und optimal zu nutzen. Transplantierte Patienten könnten mit einem Impfstoff vor einem Rückfall durch verbliebene Tumorzellen bewahrt werden, wenn es gelingt ihr Immunsystem zielsicher gegen diese zu rüsten. Um dieses Ziel erreichen zu können, ist es jedoch zunächst notwendig, mehr über die Vorgänge, die nach einer Stammzelltransplantation im Körper ablaufen zu erfahren. Das Wissen um den genauen Vorgang der Immunrekonstitution ist bislang noch sehr beschränkt und die Manipulation dieser Abläufe zur Optimierung der Behandlung stellt nach wie vor eine immense Herausforderung dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mittels ELISPOT-Assays zytotoxische T-Zellen sowohl von gesunden Probanden als auch von Patienten mit hämatologischen 42 Neoplasien, die eine alloHSCT erhalten hatten auf ihre Aktivität gegen LAAs getestet und diese quantifiziert. Ziel war es, herauszufinden, ob und in welchem Ausmaß die allogenen Spender-T-Zellen zu einer gezielten Immunantwort gegen die getesteten LAAs in der Lage sind um einen Anhaltspunkt zu erhalten, in wie fern eine Vakzinierung nach Erhalt einer Stammzelltransplantation eine zukünftige Therapieoption sein kann. Desweiteren interessierten wir uns dafür, ob es zwischen den verschiedenen getesteten LAAs Unterschiede betreffend der Häufigkeit der von ihnen ausgelösten Immunreaktionen gibt. Zusätzlich stellten wir eine Übersicht über den Post-Transplantationsverlauf unserer Patienten dar um neue Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie sich das Immunsystem nach der Stammzelltransplantation verhält und eventuell bestehende Zusammenhänge zwischen LAA-Erkennung und anderen Faktoren aufzuzeigen. 43 2. MATERIAL UND METHODEN 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. Material 2.1.1. Grundausstattung 2.1.1.1. Allgemeine Laborgeräte Brutschrank Steri-Cult Incubator: Forma Scientific, Marietta, Ohio, USA B 5042 E: Heraeus Instruments, Hanau, Germany ELISPOT-Reader FACScan: Fa. Becton Dickinson Heidelberg, Germany FACS Immuno Spot : C.T.L. Europe, Reutlingen, Germany Gefrierschrank -20° C: Bosch GmbH, München, Deutschland -80° C: Ultra Low Sanyo Fischer GmbH, München, Deutschland Magnetständer MACS MultiStand: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Mikroskop Vergrößerung 3,2-, 10-, 16- und 100fach: Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland Pipetten 0,5 – 10 µl; 10 – 100 µl; 50 – 250 µl und 200 – 1000 µl: Eppendorf Reference, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Pipettierhilfe Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark Sterile Arbeitsbank Hera-Safe HS-18 und HLB 2448: Heraeus 44 2. MATERIAL UND METHODEN Instruments, Hanau, Deutschland Wasserbad Beckmann GS-6R und GS-15R: Beckmann Instruments, Fullerton, CA, USA Zentrifugen Julabo U3/7: Julabo Labortechnik GmbH Seelbach/West, Deutschland 2.1.1.2. Plastikwaren Einfrier-Röhrchen Nunc Cryo TubeTM Vials 1,8 ml: Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark ELISPOT-Platten MultiScreen-IP, MultiScreen 96-well Filtration and Assay Plate: Millipore, Bedford, MA, USA Gewebekulturflaschen NUNCLONTM Surface 40, 160 und 400 ml: Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark Pipetten FALCON® Serologische Pipetten 2, 5, 10, 25 und 50 ml: Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA Pipettenspitzen EpT.I.P.S. Standard 0,1 – 10 µl, 2 – 200 µl und 50 – 1000 µl : Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Platten NUNCLON TM Surface 12, 24, 48 und 96 well: Nalge Nunc International, Roskilde, Dänemark Reaktionsgefäße Safe-Lock Tube 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml und 2 ml: Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Röhrchen FALCON® Polypropylen Tubes 15 ml und 50 ml: Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 45 2. MATERIAL UND METHODEN Sterilfilter Minisart RC 15: Sartorius AG, Göttingen, Deutschland Trennsäule MACS MS+ Separation Columns: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland Alle verwendeten Plastikwaren wurden von den Firmen steril bezogen. 2.1.1.3. Chemikalien Sämtliche Laborchemikalien wurden in höchstmöglicher Reinheit von folgenden Firmen bezogen: Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland Becton Dickinson, Sparks, USA Cambrex Bio Science, Rockland, USA USB Corporation, Cleveland, USA Invitrogen, Carlsbad, USA Dela Select GmbH, Pfullingen, Deutschland 2.1.1.4. Spezielle Chemikalien AB-Serum Deutsches Rotes Kreuz, Ulm, Deutschland Aqua Destillata Braun, Melsungen, Deutschland AEC-Substratset BD Biosciences, USA β2-Mikroglobulin Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland 46 2. MATERIAL UND METHODEN Dimethylformaldehyd Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland Färbetabletten BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat) und NBT(Nitroblue Tetrazolium Chloride) Färbetabletten, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA Fötales Kälberserum GibcoBRLTM, Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland Ficoll Seperating Solution Seromed-Biochrom AG, Berlin, Deutschland L-Glutamin Seromed-Biochrom AG, Berlin, Deutschland MicroBeads CD8 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland Penicillin/Streptomycin GibcoBRLTM, Karlsruhe, Deutschland RPMI 1640 Seromed-Biochrom AG, Berlin, Deutschland Tryptanblau-Lösung 0,4% Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen 2.1.2. Pufferlösungen Blockierungslösung für Granzyme B-ELISPOT 500 ml 1640 RPMI-Medium enthält 50 ml hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum, 5 ml Penicillin/Streptomycin sowie 5 ml L-Glutamin. Blockierungslösung für IFN-γ-ELISPOT In 500 ml PBS wurden 5 ml hitzeinaktiviertes AB-Serum gelöst. Coating-Puffer In 100 ml Aqua bidest wurden 318 mg Natriumcarbonat, 580 mg Natriumhydrogencarbonat und 49 mg Natrium-Azid gelöst. Die Lösung wurde auf 47 2. MATERIAL UND METHODEN einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und steril filtriert. Dilution-Puffer In 500 ml PBS wurden 50 ml FCS (fötales Kälberserum) gelöst. Der Dilution-Puffer enthält 10% FCS. PBS (Phosphate buffered Saline) 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid, 1,44 gNatriumhydrogenphosphat sowie 0,24 g Kaliumhydrogenphosphat wurden in 1l Aqua bidest gelöst. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und steril filtriert. PBS/Tween-Puffer In 1 l PBS-Puffer wurden 0,5 ml Tween-20-Lösung gelöst. Separations-Puffer 500 ml Separations-Puffer enthält 2 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und 0,5% hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum. Substrat-Puffer In 500 ml Aqua bidest wurden 0,1 M Tris-Aminomethan (TRIS) (6,05 g/500 ml), 0,1 M NaCl (2,9 g/500ml) sowie 5 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) (237 g/500 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und steril filtriert. 2.1.3. Zelllinien, Antikörper und Zytokine FACS-Antikörper Zur Fluorescence associated cell sorting-Analyse (FACS) wurden FluoresceinIsothiocyanat (FITC) konjugierter Maus IgG1 Antikörper (Isotypenkontrolle) und FITC konjugierter α-Human HLA-A2 Antikörperder der Fa. Becton-Dickison verwendet. Granzyme B-Antikörper Für die ELISPOT-Assays wurden Granzyme B-Antikörper der Fa. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA verwendet. 48 2. MATERIAL UND METHODEN IFN-γ-Antikörper Für die ELISPOT-Assays wurden Interferon-γ-Antikörper (IFN-γ) der Fa. Mabtech, Cincinnati, OH, USA verwendet. Interleukin-2 Sigma-Aldrich Chemicals, Deisenhofen, Deutschland Interleukin-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor und stimuliert darüber hinaus die Differenzierung von T-Zellen, B-Zellen, Monozyten und Makrophagen. Interleukin-7 Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland Interleukin-7 ist ein T- und B-Zell-Wachstumsfaktor. Auch Interleukin-7 stimuliert die Differenzierung von T-Zellen, B-Zellen und außerdem auch von Thymozyten. Es hemmt die Differenzierung von CTL. T2-Zellen Die in dieser Arbeit verwendeten T2-Zellen stammen von der ATCC, Manassas, USA, und werden dort unter der Nummer CRL-1992 geführt. Die Zelllinie dient typischerweise der Untersuchung der Antigen-Verarbeitung und T-Zell-Erkennung von MHC-Klasse I-Antigenen. Die Zellen synthetisieren, exprimieren jedoch nicht HLA-B5. Die Zelllinie exprimiert das Antigen HLA-A2 und CD7+. T2-Zellen sind durch externe Zugabe von Peptiden zu deren Präsentation auf der Zelloberfläche fähig. 2.1.4 Zellkulturmedien Kulturmedium Die T- und CD8-Zellen wurden in einem Kulturmedium kultiviert. Dafür wurden zu 500 ml 1640 RPMI-Medium 10% hitzeinaktiviertes, steril filtriertes, humanes ABSerum, 1% L-Glutamin und 1%Penicillin/Streptomycin gegeben. 49 2. MATERIAL UND METHODEN Einfriermedium Als Einfriermedium wurde RPMI-Medium verwendet. Diesem wurden 20% ABSerum, 10% Dimethylsulfoxid, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin zugesetzt. 2.1.5. Peptide Die im Versuch verwendeten Peptide stammen von der GL Biochem (Shanghai) Ltd. Um eine Konzentration von 4-5 µg/µl zu erreichen wurden sie jeweils mit DMSO 50% H2O verdünnt. Zum Pulsen wurden die Peptide in einer Konzentration von 20µg/ml Zellsuspension verwendet. Für die Untersuchungen in dieser Arbeit wurden ausschließlich HLA-A*0201 restringierte Peptide verwendet, da in der kaukasischen Bevölkerungsgruppe über 40% der Patienten HLA-A2 positiv sind und sich dadurch eine breite Anwendbarkeit der entsprechend restringierten Peptide ergibt. Tabelle 3 zeigt die Peptide, die für die Positivkontrollen verwendet wurden. Eine Übersicht über alle in den MLPCs verwendeten Peptide zeigt Tabelle 4. Tabelle 3: Peptide, die in den MLPCs zum Pulsen der Positivkontrollen benutzt wurden, ihre jeweilige Peptidsequenz und Restriktion. CMV = Cytomegalievirus; HLA= Humanes Leukozyten Antigen; IMP = Influenza Matrix Protein Peptid Sequenz Restriktion CMV NLVPMVATV HLA-A*0201 IMP GILGFVFTL HLA-A*0201 50 2. MATERIAL UND METHODEN Tabelle 4: Peptide, die in den MLPCs zum Pulsen benutzt wurden, deren jeweilige Peptidsequenz und Restriktion. G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; HLA= Humanes Leukozyten Antigen; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; WT-1 = Wilms-Tumor-Gen 1 Peptid Sequenz Restriktion RHAMM 3 ILSLELMKL HLA-A*0201 PRAME 3 (P3) ALYVDSLFFL HLA-A*0201 G250 -2 (G2) QLLLSLLLL HLA-A*0201 WT1 -1 RMFPNAPYL HLA-A*0201 Survivin 2 ELTLGEFLKL HLA-A*0201 HTert ILAKFLHWL HLA-A*0201 Aurorakinase A2 KIADFGWSV HLA-A*0201 Aurorakinase B1 TLCGTLDYL HLA-A*0201 Aurorakinase A1 YLILEYAPL HLA-A*0201 2.1.6. Blutproben Für diese Arbeit wurden sowohl Blutproben von gesunden Spendern (HVs) sowie von Patienten mit unterschiedlichen hämatologischen Malignitäten verwendet. Die Proben von gesunden HLA2-positiven Spendern wurden von der Blutbank des Deutschen Roten Kreuzes Ulm, Deutschland, Abteilung Transfusionsmedizin in Form von Buffy-Coats bezogen. Bei diesen handelt es sich um aufkonzentrierte, zelluläre Bestandteile des Blutes (90 ml entsprechen einem Äquivalent von 450 ml Vollblut einer Blutspende). Die Separation der PBMCs aus Blut wird im Folgenden für Buffy-Coat-Blut beschrieben. Die Vorgehensweise für die Vollblutproben der Patienten erfolgte analog. Die Patientenproben stammen von Menschen, die alle eine Stammzelltransplantation erhielten und in der Universitätsklinik Ulm (Klinik für Innere Medizin III) behandelt wurden. Ihnen wurden mittels peripherer Venenpunktion Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach ihrer 51 2. MATERIAL UND METHODEN Transplantation entnommen und diese unmittelbar heparinisiert (1:10, NatriumHeparin). Alle Patienten waren über die Freiwilligkeit der Teilnahme aufgeklärt und haben eine Einverständniserklärung unterzeichnet, die von der Ethikkommission der Universität Ulm approbiert war. Alle Patienten waren HLA2 positiv. Patient Geschlecht Alter bei Transplantation Diagnose WHOKlassifikation; Karyotyp Tabelle 5: Übersicht über Patienten, deren PBMCs in der Arbeit verwendet wurden mit Informationen über das Patientengeschlecht, -alter und den detaillierten Diagnosen nach der WHO-Klassifikation; Anmerkung: Patient 2 wurde zweimal transplantiert. AML=Akute myeloische Leukämie, BCR-ABL = breakpoint cluster region- abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1; CEBPA = CCAAT enhancer binding protein alpha ; CML= Chronische myeloische Leukämie, CMML: Chronische myelomonozytäre Leukämie; EBMT = European group for blood and marrow ransplantation; FAB = French-AmericanBritish-Group Klassifikation; FAB M3 = Akute Promyelozytenleukämie; FLT3-ITD = Fmsrelated tyrosine kinase 3-internal tandem duplication; FLT3-TKD = Fms-related tyrosine kinase 3- tyrosine kinase domain; Inv = Inversion; M = männlich; MDS: myelodysplastisches Syndrom, MLL = Mixed-lineage-leukemia ; NKL: Natürliche Killerzellen Leukämie, NPM1 = Mutated-region-of-nucleophosmin 1; W = weiblich; WHO=World Health Organisation; WT = Wildtyp. 1 w 70 AML Komplexer Karyotyp 2 m 28,31 AML Normaler Karyotyp 4 w 28 AML 45, XX, inv (3) (q21q26),-7[40] 6 m 55 CMML 45,XY, -7[19] 7 m 69 AML NPM 1 WT, FLT3-ITD neg., FLT3-TKD WT, CEBPA WT 8 m 39 CML Philadelphia positiv, bcr-abl positiv; del 9q34 9 w 51 MDS, AML MDS mit Übergang in sek. AML 10 m 34 AML FAB M3 11 m 45 AML Multilineäre Dysplasie (WHO); norm. Karyotyp, FLT3-,NPM1-, MLL-und CEBPAWildtyp 12 w 32 CML Bcr/abl positiv; Hasford-Score intermediar mit 817; EBMT-Score 1 52 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1.7. Patientenverläufe Die Analyse der Patientenverläufe erfolgte auf Basis der Dokumentation, die von Ärzten der Abteilung Innere 3 des Universitätsklinikum Ulms im Rahmen der Patientenbehandlung erstellt wurde. Die Immunstatus wurden mittels Durchflusszytometrie von den Mitarbeitern der diagnostischen Laboratorien des Universitätsklinikums Ulm erstellt. Diese übernahmen auch die Auswertung der Knochenmarkausstriche zur Abklärung des Krankheitsstatus und die Analysen der MRD-Status. Chimärismusanalysen erfolgten aus Knochenmarkpunktaten oder peripherem Blut durch das Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm. 2.2. Methoden 2.2.1. Anlage und Kultur von T2-Zellen Die T2-Zelllinie wurde in T-Zell-Medium bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank kultiviert. Zwei- bis dreimal pro Woche wurde je nach Bedarf die gesamte Kultur oder Teile dieser zentrifugiert und in neues T-Zell-Medium gegeben. Die Zellzahl wurde wöchentlich in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. 2.2.2. PBMNC-Isolierung und Archivierung Humane Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMNCs) sind alle rundkernigen Blut-Zellen, also hauptsächlich Lymphozyten und Monozyten, aber auch Makrophagen. Um diese Zellen aus humanem Vollblut zu isolieren wurde eine Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Ficoll ist ein synthetisch hergestelltes, hydrophiles Polymer aus Saccharosemonomeren und Epichlorhydrin, das in der Lage ist, das Blut in verschiedene Schichten entsprechend den Sedimentationskoeffizienten seiner Bestandteile zu separieren und so Monozyten und Lymphozyten in einer Schicht, der Interphase zu gruppieren. Außerdem bewirkt es die Agglutination von Erythrozyten und beschleunigt so deren Sedimentation. Aufgrund ihrer spezifischen Dichte lagern sich die PBMCs während der Zentrifugation als deutlich milchige Grenzschicht 53 2. MATERIAL UND METHODEN zwischen Plasma und Ficoll-Lösung Ficoll Lösung als sogenannte „Interphase“ oder auch „Buffy Coat“ ab, während die Erythrozyten und meisten Granulozyten wegen ihrer höheren Dichte nach unten auf den Boden der Tubes sinken.. Die Thrombozyten verbleiben hierbei zum größten Teil im Plasma, was auf ihr geringes Zellvolumen, das eine langsame Sedimentation bedingt, bedingt zurückzuführen ist. Abbildung 9:: Blutprobe nach Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation Dichtegradientenzentrifugation. Das Blut wurde in vier verschiedene Schichten aufgeteilt. Die von uns verwendeten PBMNCs befinden sich in der Interphase. Gelbe Schicht: Plasma; Grüne G Schicht: hicht: Interphase mit PBMNCs; Beige Schicht: FicollFicoll Hypaque, Orangene rangene Schicht: Erythrozyten, Granulozyten PBMNCs = Peripheral blood mononuclear cells = Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes Durchführung: Das antikoagulierte periphere Blut wurde zuerst im Volumenverhältnis 2:1 mit PBS verdünnt um eine höhere Reinheit der Zellpräparation zu erzielen. Anschließend wurden 21- 30ml auf 15--18ml Ficoll-Lösung Lösung in einem 50ml Falcon geschichtet und bei 2000 Umdrehungen pro Minute 20 Minuten lang zentrifugiert. Im Sinne der Schärfe des Gradienten wurde auf a die Bremse verzichtet um einer Vermischung der zuvor getrennten Phasen beim Bremsvorgang Bremsvorgang vorzubeugen. Der Buffy Coat wurde daraufhin vorsichtig abpipettiert, abpipettiert, um möglichst kein Ficoll versehentlich versehentlic mit 54 2. MATERIAL UND METHODEN zu überführen, da dieses zytotoxisch wirken kann. Anschließend wurden die PBMNCs in 50 ml PBS aufgenommen und durch dreimaliges Zentrifugieren, Abschütten des Überstandes und Aufnahme des Pellets in 50 ml PBS gewaschen. Bestimmen der Zellzahl Bei der Bestimmung der Zellzahlen wurde stets auf eine Neubauer-Zählkammer zurück gegriffen. Bei diesem Zählinstrument handelt es sich um eine etwa 30 mm x 80 mm große und etwa 5 mm dicke Glasplatte mit einer vertieften Mittelfläche auf die quadratische Felder einer definierten Größe eingraviert wurden. Sie kann zum Zählen aller Arten von Teilchen dienen, insbesondere findet sie Anwendung zur Bestimmung der Anzahl von Mikroorganismen und verschiedenen Zellen. Das Zählgitter der Neubauer-Kammer besteht aus 3 x 3 Quadraten gleicher Größe. Das Volumen unter einem dieser Quadrate entspricht jeweils 0,1 µl und ergibt sich aus der Fläche von 1 mm2 und einer Tiefe von 0,1mm unter der Bedingung, dass das Deckglas stets ordnungsgemäß auf der Zählkammer haftet, was an der Ausbildung der Newtonschen Ringe zu erkennen ist. Die Zellzahl eines Großquadrats entspricht somit stets der Zellzahl in 0,1 µl. Zur Bestimmung der Gesamtzellzahl müssen in der Formel das Gesamtvolumen, die jeweilige Verdünnung durch Tryptanblau und weitere eventuelle Verdünnungen berücksichtigt werden. Es gilt ebenfalls zu beachten, dass bei der Zählung von Leukozyten immer die vier Eckquadrate ausgezählt werden. Die Zellpellets wurden jeweils in wenigen ml PBS gelöst und davon 10 µl zum Zählen entnommen. Diese 10 µl wurden in einer 1 : 10 oder 1 : 2 Verdünnung mit Tryptanblau-Lösung gemischt. Dieser Farbstoff besitzt die Eigenschaft schnell in tote Zellen einzudringen und diese unter dem Mikroskop schwach bis tiefblau erscheinen zu lassen, wohingegen lebende Zellen den Farbstoff nur langsam aufnehmen und sich erst nach mehreren Minuten anfärben. Die auszuzählende Zellsuspension wurde bei aufgelegtem Deckglas seitlich aufpipettiert. Unter dem Lichtmikroskop wurden die Zellen innerhalb der 4 Eckquadrate bei geeigneter Vergrößerung -meist 100-fach- ausgezählt. Zur anschließenden Berechnung der Zellzahlen fand folgende Formel Anwendung: 55 2. MATERIAL UND METHODEN N ×V ×104 × v n Hierbei handelt es sich bei den Faktoren jeweils um: N = Zahl der gezählten Zellen n = Zahl der ausgezählten Großquadrate V = Verdünnungsfaktor 104 = Kammerfaktor (wegen der 0,1 µm Volumen in einem Quadrat) v = Volumen in dem die Zellen gelöst sind Kryokonservierung der Zellen Unter Kryokonservierung versteht man die Lagerung von biologischen Proben wie Zellen und Gewebe bei Temperaturen unter -130 °C. Die Herausforderung dabei besteht darin, die Vitalität der Zellen zu erhalten, obwohl deren biologisches System durch den Vorgang des Einfrierens in den Aggregatzustand eines Festkörpers übergeht. Dies setzt die Zellen einem großen Stress aus, was bei unsachgemäßem Vorgehen zum Zelltod durch Apoptose führen kann. Um dem vorzubeugen wurden Kryoröhrchen mit je 1 x 106 bis 5 x 107 Zellen gelöst in 1,5 ml Einfriermedium zusammen in einen speziellen Freezing Container gegeben. Dieser ist mit Alkohol gefüllt und kann so eine schonende Einfrierrate von -1°C/min gewährleisten. Nach einer Mindestzeitspanne von 24 Stunden im -80°C-Tiefkühlschrank wurden die Kryoröhrchen anschließend in Flüssigstickstoff überführt. 2.2.3. Typisierung der HLA-Oberflächenantigene mittels Durchflusszytometrie Die im Versuch verwendeten Tumor-assoziierten Antigene sind alle HLA-A2 restringiert. Somit konnten also nur Zellen von Patienten verwendet werden, die ebenfalls HLA-A2 auf ihrer Oberfläche exprimieren, also HLA-A2 positiv sind. Die verwendeten Patientenproben wurden deshalb vom HLA-Labor des Instituts für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm auf ihren HLA-Status untersucht, bei Bedarf konnte dies auch in unserem Labor mittels FACS-Analyse 56 2. MATERIAL UND METHODEN geschehen. Der Begriff FACS kommt aus dem Englischen und steht für Fluorescence-activated cell sorting. Bei dem Akronym handelt es sich eigentlich nur um die geschützte Handelsmarke der Firma Becton Dickinson (BD), mittlerweile hat es sich jedoch als Synonym für die Durchflusszytometrie eingebürgert. Grundlage dieser Untersuchung ist die Detektion optischer Signale von Zellen, die hintereinander in einem Sensormodul einzeln einen Laserstrahl passieren und Licht emittieren. Das von den Zellen gestreute Licht wird dann von Detektoren (Photomultiplier) eingefangen. Sowohl die Vorwärts- als auch die Seitwärtsstreuung wird von diesen gemessen und kann anschließend mit Hilfe eines Computersystems ausgewertet werden. Auf diese Weise können Zellen bezüglich mehrerer Parameter gleichzeitig untersucht werden. Die Vorwärtslichtstreuung (FSC) korreliert hierbei mit der relativen Zellgröße und die seitliche Lichtstreuung (SSC, im 90° Winkel gemessen) mit der Granularität bzw. internen Komplexität. Als weiterer messbarer Parameter kann die Fluoreszenz von Zellen bestimmt werden. Hierfür werden an Antikörper gekoppelte, fluoreszierende Farbstoffe verwendet, die nach Bestrahlung durch den Laser spezifische Wellenlängen emittieren, die von den Detektoren erfasst werden können. So kann der Nachweis für das Vorkommen spezifischer Zellen erbracht werden. Um die gewünschten HLA A2-Moleküle nachzuweisen wurde auf Antikörper zurück gegriffen, die mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) gekoppelt sind und an HLA A2 binden. Durchführung: Jeweils 0,5 x 106 – 1 x 106 PBMCs des Patienten wurden in 2 ml AB-Medium gelöst und in zwei Röhrchen gegeben, die daraufhin mit FACS-Puffer aufgefüllt und bei 1200 bis 1400 Umdrehungen pro Minute zehn Minuten lang zentrifugiert und anschließend dekantiert wurden. 2 µl des Fluoreszenzantikörpers HLA-A2 FITC wurden auf das Pellet im ersten Röhrchen gegeben. Auf das Pellet im zweiten Röhrchen wurden als Negativkontrolle 5 µl des Fluoreszenzantikörpers ISO-FITC (Anti-Mouse) zugegeben. Nach 20 minütiger Inkubation bei 4°C im Dunkeln wurden die Röhrchen mit 1 ml PBS aufgefüllt und zentrifugiert. Für die FACS-Auswertung wurden die Zellen daraufhin wieder in 200 µl PBS aufgenommen und dem Gerät zugeführt. Als Positivkontrolle dienten HLA-A2 57 2. MATERIAL UND METHODEN positive T2-Zellen und als Negativkontrolle Zellen der Zelllinie K562, die kein HLAA2 exprimieren. Die Messungen wurden gemäß den Bedienungsanleitungen der verwendeten Hard- und Software durchgeführt (FACS-Calibur Durchfluß- zytometer, Becton Dickinson). Die Auswertung erfolgte mittels der CellQuestsowie CellQuestPro-Software von Becton Dickinson. 2.2.4. Zellseparation Auftauen der Zellen Das Einfrierröhrchen wurde aus dem Stickstofftank entnommen und im 37°CWasserbad vorsichtig erwärmt. Sobald die Zellen getaut waren wurden sie sofort in 15 ml Plain-Medium aufgenommen und die Zellen bei 1200 rpm 5-10 Minuten lang abzentrifugiert. Anschließend wurden sie je nach Anzahl getauter Zellen in 35 ml Separationspuffer überführt, eine Zellprobe zum Zählen wurde entnommen und die Zellsuspension wurde noch einmal bei 1200 rpm 10 min lang zentrifugiert. Zellseparation einer PBMNC-Fraktion: Positivselektion mit CD8-Microbeads Zur Separation der PBMCs in CD8-positive und CD8-negative Zellen wurden paramagnetische Partikel, sogenannte Microbeads in einem Magnetic Cell Sorting (MACS) Verfahren verwendet. Diese Microbeads sind an verschiedene Antikörper gekoppelt erhältlich, die an spezifische Strukturen auf der Zelloberfläche binden und somit ganze Zellpopulationen in einem Ansatz magnetisch markieren können. In einer Trennsäule, an der ein magnetisches Feld angebracht ist können die mit den Microbeads inkubierten Zellen anschließend separiert werden. Die durch die magnetischen Partikel direkt markierten Zellen bleiben durch das Magnetfeld in der Säule hängen, während die unmarkierten diese passieren und als Negativfraktion unter der Säule aufgefangen werden. Die Positivfraktion kann nach Entnahme der Säule aus dem Magneten eluiert werden. Bei dieser Arbeit wurden anti-CD8-Microbeads zur Separation von CD8+-T-Zellen verwendet. Zellseparation: Auf das Zellpellet wurden pro 107 Zellen je 80 µl Separationspuffer und 20 µl Microbeads zugegeben und die Suspension im Anschluss für 15 Minuten bei 4°C 58 2. MATERIAL UND METHODEN inkubiert. Das Inkubat wurde danach mit Separationspuffer auf eine Menge von 500 µl aufgefüllt. Dies wurde in die zuvor mit 500 µl Separationspuffer angefeuchteten Trennsäulen gegeben und nach erfolgtem Durchfließen je drei Mal mit 500 µl Separationspuffer nachgespült. Das Eluat, welches die CD8-negativen Zellen enthielt, wurde in einem 50 ml Falcon aufgefangen und je nach Zellzahl mit 5-10 ml AB-Medium aufgefüllt. Danach wurde die Trennsäule vom Magneten entfernt und nach Zugabe von 1 ml AB-Medium mit einem Stempel über einem 15m l Falcon ausgedrückt. Zu diesem, die CD8-positiven Zellen enthaltenden Eluat wurden 2 ml AB-Medium gegeben. Beiden Lösungen wurden je 20 µl zum Zählen entnommen und im Folgenden ausgezählt. 2.2.5. Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur Die Gemischte Lymphozyten-Peptid-Kultur ist das in vitro Korrelat einer in vivo ablaufenden Immunantwort von T-Zellen gegen ein Fremdpeptid. In der Zellkultur wird eine klonale T-Zell-Expansion simuliert, die durch die Präsentation eines Fremdpeptids über das Oberflächenmolekül MHC-1 professioneller Antigenpräsentierender Zellen ausgelöst wird. In der MLPC wurden CD8-positive und CD8-negative Zellen 8 Tage lang zusammen kultiviert. Die CD8-negativen Zellen waren zuvor mit verschiedenen Peptiden gepulst worden um in der Patientenprobe potenziell vorhandene Peptid-spezifische CD8-positive Zellen zur Expansion anzuregen. Sie fungierten als Antigen-präsentierende Zellen und präsentierten den CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen die aufgenommenen Peptide auf ihrem HLA-A2 Oberflächenmolekül. Durch Zugabe von Interleukin-2 und -7 wurde diese Reaktion zusätzlich verstärkt. MLPC Tag 0 Induktion Peptid-spezifischer CTL Die ausgezählten CD8-positiven Zellen wurden in einer entsprechenden Menge AB-Medium aufgenommen und in einer 24-Well-Zellkulturplatte auf verschiedene Näpfe aufgeteilt, so dass pro Napf je 2,5 x 105 Zellen in 500 µl gelöst suspendiert waren. Waren Zellen im Überschuss vorhanden, wurden bis zu 5x105 Zellen in 500 µl pro Napf verwendet. Die übrigen Näpfe wurden mit 1 ml PBS befüllt um einer ungleichen Verdunstung entgegenzuwirken. Die CD8-negativen Zellen 59 2. MATERIAL UND METHODEN wurden für die Dauer von 30 Minuten mit 30 Gray einer Caesium-37-Quelle bestrahlt. Dies geschah um eine Aktivierung und Proliferation der mononukleären Zellen als Reaktion auf die T-Zellen zu verhindern. Die Bestrahlung wurde freundlicherweise vom Deutschen Roten Kreuz Ulm für uns durchgeführt. Die bestrahlten Zellen wurden anschließend zentrifugiert, dekantiert und mit ABMedium aufgefüllt bis sich eine Konzentration von 1 x 106 bis 2 x 106 Zellen je nach Anzahl CD8-positiver Zellen pro 500 µl AB-Medium einstellte. Im Folgenden wurde die Suspension mit 2,5 µg β2-Mikroglobulin pro ml versetzt. Die Mischung wurde auf 15 ml Falcons aufgeteilt, so dass je 500 µl mit β2-Mikroglobulin versetzten Zellen pro Falcon enthalten waren. Anzumerken ist, dass aufgrund der schlechten Immunkonstitution der Patienten die Anzahl der zur Verfügung stehenden CD8-positiven T-Lymphozyten meist sehr eingeschränkt war. Die konkreten Zellzahlen in den Wells variierten deshalb zwischen den einzelnen MLPCs. Bei allen Versuchen wurde jedoch stets ein Verhältnis von 4 : 1 zwischen CD8-positiven und CD8-negativen Zellen in den Wells verwendet. Die Anzahl der CD8-positiven bewegte sich immer zwischen 2,0 und 5,0 x 105 pro Well. Es wurde jeweils angestrebt die höchstmögliche Anzahl CD8-positiver Zellen zur Verwendung zu bringen. Die Anzahl CD8-negativer Zellen wurde den CD8positiven angepasst. Pulsen der CD8-negativen Zellen Von den zu untersuchenden Peptiden wurden je 10 µg in jeweils ein Röhrchen mit den CD8-negativen Zellen gegeben. Als Positivkontrolle dienten 10 µg IMP und/oder CMV in jeweils einem Falcon. Als Negativkontrolle wurde einer Probe kein Peptid zugegeben. Die Zellen wurden 1,5 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert und anschließend zentrifugiert und dekantiert um nicht-gebundene Peptide auszuwaschen. Sie wurden dann in je 500 µl AB-Medium aufgenommen und zu den CD8-positiven Zellen in die 24-Well-Zellkulturplatte gegeben. Die Zellkulturplatte wurde bei 37°C im Brutschrank über Nacht inkubiert MLPC Tag 1 Um die T-Zellen zur Proliferation und Differenzierung anzuregen wurde jedem Napf eine Lösung aus 2,5 ng Interleukin-2, 20 ng Interleukin-7 und 100 µl AB60 2. MATERIAL UND METHODEN Medium zugegeben. Nach dem Versiegeln der MLPC-Platten mit gasdurchlässigem Papier wurden die Zellen anschließend für weitere 7 Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. 2.2.6. ELISPOT-Assay MLPC Tag 8 Nachweis der T-Zell-Antwort Um eine Reaktion der T-Zellen auf die ihnen präsentierten verschiedenen Leukämie-assoziierten Antigene nachzuweisen wurde ein sogenannter Enzymelinked Immunospot-Assay (ELISPOT) verwendet. Mit diesem extrem sensitiven Test ist es möglich Zellaktivierung auf Einzelzellniveau zu messen, indem nachgewiesen wird, dass eine Zelle als Reaktion auf ein Antigen ein Zytokin exprimiert hat. Zusätzlich können Rückschlüsse auf die Menge der aktivierten Zellen in der Versuchspopulation gezogen werden [210]. Aktivierte T-Zellen schütten verschiedene Botenstoffe aus, unter anderem Interferon-γ und Granzyme B. Diese können mit dem ELISPOT durch monoklonale Antikörper detektiert werden, die unterschiedliche Epitope des Zytokins erkennen. Das Prinzip des ELISPOT gleicht einem Festphasen-ELISA, da einer der beiden Antikörper an den Plattenboden gebunden ist und so das Zytokin an diesem fixiert. Ein zweiter ebenfalls zytokinspezifischer Antikörper, der Detection-Antibody, wird zugegeben und bindet an die fixierten Zytokine. Der Fc-Teil des Detection-Antibody ist biotinyliert und wird im nächsten Schritt von Streptavidin, einem konjugierten Enzym, welches mit hoher Affinität Biotin bindet, gebunden. Ein Substrat wird zugegeben, aus welchem das Enzym ein unlösliches farbiges Präzipitat bildet. An jeder Stelle, an der Granzyme B oder Interferon-γ gebunden wurde wird so ein Punkt, der sogenante Spot sichtbar. Diese Spots können anschließend mit Hilfe eines ELISPOT-Readers ausgezählt werden. Bei diesem handelt sich um ein System aus Auflichtmikroskop, Motortisch, Farbkamera und einem angeschlossenen Auswertungssystem. Es werden automatisch alle Spots auf dem Plattenboden mit einer Kamera aufgenommen, digitalisiert und per Mustererkennungssoftware anschließend ausgewertet. 61 2. MATERIAL UND METHODEN Abbildung 10: Bildhafte, schrittweise Darstellung der im Text erläuterten Abfolge der Durchführung eines ELISPOT-Assays, wie wir ihn zur Quantifizierung der Zytokinsekretion von T-Zellen durchführten.T-Zellen, die zuvor mit dem zu untersuchenden Antigen gepulst wurden, werden in die mit Anti-Zytokin-Antikörpern präparieten ELISPOT-Wells gegeben.Nach der Inkubationszeit werden die Wells gewaschen und anschließend ein zweiter Enzym-gekoppelter Antikörper in die Wells zugegeben. Haben die T-Zellen zuvor Zytokine sezerniert, kann der zweite Antikörper, die in den Wells gebundenen Zytokine binden. Im nächsten Schritt können mittels Zugabe eines speziellen Farbstoffs, der an den Enzymteil des zweiten Antikörper bindet, die von den T-Zellen ausgeschütteten Zytokine sichtbar gemacht werden. ELISPOT = Enzyme Linked Immuno Spot Assay; Ig= Immunglobulin [88]. 62 2. MATERIAL UND METHODEN ELISPOT Tag 1 Für die ELISPOT-Assays wurden 96-Well-Platten mit Nitrozelluloseböden benutzt. Für jedes zu testende Peptid, sowie für die Negativ- und Positivkontrollen wurden je 3 ELISPOT-Näpfe angesetzt, deren Böden am ersten Tag des Assays mit dem Capture-Antibody beschichtet wurden (Coating). Hierfür wurden zwei verschiedene Antikörper-Lösungen hergestellt. Für den Granzyme B-ELISPOT wurde der Antikörper im einem Verhältnis von 1 : 200 mit PBS verdünnt und je 100 µl der Lösung pro Napf pipettiert. In die Näpfe des IFN-γ-ELISPOT wurden je 60 µl einer Lösung pipettiert, die 15 µl Antikörper auf 1 ml Coating Buffer enthielt. Beide Platten wurden im Anschluss bei 4°C über Nacht im Laborkühlschrank inkubiert. ELISPOT Tag 2 Zunächst wurden die CD8-Zellen aus der 24-Well-Platte entnommen, in 15 ml Falcons gegeben und die Näpfe anschließend gründlich mit 1 ml AB-Medium gespült. Den Proben wurde zur Bestimmung der Zellzahl je 20 µl Lösung entnommen und diese ausgezählt, um die CD8-Zellen nach Zentrifugation auf eine Konzentration von 1 x 105 Zellen pro 500 µl AB-Medium zu bringen. Anschließend wurden die Zellsuspensionen erst einmal bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Pulsen der T2-Zellen Um im Folgenden die Zytotoxizität der CD8-Zellen beurteilen zu können wurden sie zunächst restimuliert. Für die erneute Antigenpräsentierung kamen dabei Zellen der T2-Zelllinie zur Anwendung. Diese wurden zunächst zentrifugiert, dekantiert, ausgezählt und mit AB-Medium auf eine Konzentration von 4 x 104 Zellen pro 500 µl AB-Medium aufgefüllt. Pro ml Volumen wurden die Zellen mit 2,5 µg β2-Mikroglobulin pro ml versetzt und anschließend die benötigte Anzahl 15 ml Falcons mit 500 µl der Lösung befüllt. Jedem Falcon wurden 10 µl der zu untersuchenden Peptide beigegeben. Als Positivkontrollen wurden außerdem wieder 10 µg CMV und/oder IMP verwendet und einem Falcon wurde als Negativkontrolle kein Peptid beigegeben. Die folgende Inkubationszeit betrug 1,5 Stunden bei 37°C im Brutschrank. Nach Ablauf wurden die Zellen zentrifugiert, 63 2. MATERIAL UND METHODEN dekantiert und die Pellets in je 500 µl AB-Medium resuspendiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Zellen bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Blocken der ELISPOT Platten Bevor die Platten mit den T2- und CD8-Zellen beladen werden konnten, war es notwendig diese zu blocken um eventuellen unspezifischen Bindungen vorzubeugen. Die ELISPOT-Platte, die für die Detektion von Granzyme B vorgesehen war wurde hierfür mit Granzyme-B-Blocklösung gewaschen und mit 200 µl Blocklösung pro Napf geblockt. Die ELISPOT-Platte für die Interferon-γBestimmung wurde zweimal mit PBS gewaschen und mit 100 µl IFN-γBlocklösung pro Napf geblockt. Beide Platten wurden bei Raumtemperatur für zwei Stunden gelagert. Beladen der Platten Nach Ablauf der Inkubationszeit der ELISPOT-Platten wurde die Granzyme BPlatte einmal, die Interferon-γ-Platte sechsmal mit PBS-Lösung gewaschen. Nun konnten die CD8- und T2-Zellen zusammengeführt werden. Dazu wurden jeweils 500 µl der vorbereiteten CD8-Zelllösungen zu den T2-Zellen hinzugegeben. Auf diese Weise wurde versucht das Verhältnis der Antigen-präsentierenden T2-Zellen zu den T-Lymphozyten in den ELISPOT-Näpfen immer auf 4 : 1 einzustellen. Die Zielkonzentration in den Näpfen betrug also stets 4 x 104 T2-Zellen auf 1 x 104 CD8-Zellen. Diese Konzentrationen konnten nicht in allen Versuchen erreicht werden, da die Immunitätslage der Patienten und damit die uns zur Verfügung stehenden Zellzahlen dies nicht immer zuließen. Von den Zellsuspensionen wurden jeweils dreimal 100 µl pro Napf auf die vorbereiteten ELISPOT-Platten pipettiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. ELISPOT Tag 3 Als Reaktion auf die Restimulation waren die vorhandenen Peptid-spezifischen TZellen aktiviert worden und hatten IFN-γ und GranzB freigesetzt, das von den spezifischen Antikörpern gebunden werden konnte. Um diese Zytokine nun 64 2. MATERIAL UND METHODEN sichtbar zu machen folgte jetzt das Aufbringen von Detektionsantikörpern, einem Enzymkonjugat und zum Schluss einer chromogenen Substratlösung. Zunächst mussten die beiden ELISPOT-Platten jedoch durch Auswaschen von den Zellen befreit werden. Die Platte für die Detektion von Granzyme B wurde zweimal mit 200 µl destilliertem H2O und dreimal mit 200 µl PBS/Tween20 gewaschen. Das destillierte Wasser wirkte vor dem Ausklopfen der Platte jeweils 3-5 min auf diese ein. Die Interferon-γ-Platte wurde fünfmal mit 200 µl PBS und danach fünfmal mit 200 µl PBS/Tween gewaschen. Aufbringen des Detektionsantikörpers Der Detektionsantikörper für den Granzyme B-Assay wurde 1:250 mit DilutionBuffer verdünnt und je 100 µl dieser Lösung wurde in jeden Napf pipettiert. Der Detektionsantikörper für den Interferon-γ-Nachweis wurde im Verhältnis von 1:1000 mit PBS/Tween angemischt und 100 µl der Lösung in jeden Napf pipettiert. Beide Platten wurden anschließend für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Aufbringen des Enzymkonjugats Die Granzyme B-Platte wurde dreimal mit 200 µl PBS/Tween gewaschen und je 100 µl des 1:100 mit Dilution-Buffer verdünnten Streptavidins in jeden Napf pipettiert. Die Interferon-γ-Platte wurde sechsmal mit 200 µl PBS/Tween gewaschen. Streptavidin wurde 1:1000 mit PBS/Tween verdünnt und je 100 µl davon in jeden Napf pipettiert. Nun wurden beide Platten für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Färbung mit chromogener Substrat-Lösung Granzyme B Die Granzyme B-Platte wurde viermal mit 200 µl PBS/Tween und zweimal mit 200 µl PBS gewaschen. Die benötigte Färbelösung wurde hergestellt indem je 1 ml AEC-Substrat mit 20 µl AEC-Chromogen versetzt wurden. 100 µl dieser chromogenen Substratlösung wurden in je einen Napf der ELISPOT-Platten pipettiert. Die Färbung wurde für 3-30 Minuten im Dunkeln inkubiert und nach 65 2. MATERIAL UND METHODEN Erreichen eines zufriedenstellenden Färbegrades durch dreimaliges Waschen mit H2O gestoppt. Interferon- γ Eine Tablette 5-Bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphat (BCIP) wurde in 500µl Dimethylformamid und eine Nitroblue-Tetrazolium-Chlorid (NBT) Tablette in 1 ml H2O gelöst und nachfolgend durch 0,45 µm Filter filtriert. Auf 10 ml Substratpuffer wurden je 330 µl der NBT-Lösung und 33 µl der BCIP-Lösung gegeben. 100 µl der Färbelösung wurde rasch in jeden Napf pipettiert. Die Reaktion wurde nach etwa 1-5 Minuten Inkubationszeit im Dunkeln durch dreimaliges Waschen mit H2O gestoppt. Beide Platten wurden bei Raumtemperatur getrocknet und frühestens nach Ablauf von 24 Stunden durch den ELISPOT-Reader mit Hilfe des Programms ImmunoSPOT automatisch ausgezählt. 66 3. ERGEBNISSE 3. ERGEBNISSE 3.1. Bestimmung des Oberflächenantigens HLA-A2 durch FACS-Analyse Für die MLPCs und die folgenden ELISPOT-Assays wurden Proben von Patienten und von gesunden Probanden untersucht. Für diese Versuche war es Bedingung, dass die zu untersuchenden Zellen das Oberflächenantigen HLA-A2 exprimieren. Die Bestimmung dieses Oberflächenantigens erfolgte, wenn dies nicht durch das HLA-Labor des Instituts für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm bereits geschehen war zum Teil auch mittels FACS-Analyse in unserem Labor. Abbildung 11 zeigt hierzu eine exemplarische Patientenprobe, bei der die leukämischen Blasten HLA-A2 exprimieren. GATE ISO (Negativkontrolle) HLA-A2 Abbildung 11: Exemplarische Fluorescence-activated cell sorting (FACS–) -Messung der peripheren Blutmonozyten (PBMC) einer Humanes Leukozytenantigen-A2- (HLA-A2) positiven Patienten-Probe. GATE: Gesamtpopulation mit Lymphozyten und Monozyten (Granulozyten wurden bereits bei der Ficoll–Separation entfernt); ISO: Negativkontrolle zum Ausschluss unspezifischer Bindungen; HLA-A2: Darstellung des HLA–A2 positiven Anteils der Population. FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; FSC-Height = Forward Scatter-Height; HLA-A2 = Humanes Leukozytenantigen A2; IgG = ImmunglobulinG; SSC-Height = Side Scatter Height. Im Gegensatz hierzu erfolgt in Abbildung 12 die Darstellung einer Patientenprobe, bei der die leukämischen Blasten HLA-A2 nicht exprimieren. 67 3. ERGEBNISSE GATE ISO (Negativkontrolle) HLA-A2 Abbildung 12: Exemplarische Fluorescence-activated cell sorting (FACS–) -Messung der peripheren Blutmonozyten (PBMC) einer Patienten-Probe. Die Blutzellen dieses Patienten exprimieren kein Oberflächenantigen Humanes Leukozytenantigen-A2 (HLA-A2). GATE: Gesamtpopulation mit Lymphozyten und Monozyten (Granulozyten wurden bereits bei der Ficoll–Separation entfernt); ISO: Negativkontrolle zum Ausschluss unspezifischer Bindungen; HLA-A2: Darstellung der HLA–A2 negativen Population FITC = Fluorescein-Isothiocyanate; FSC-Height = Forward Scatter-Height; HLA-A2 = Humanes Leukozytenantigen A2; IgG = ImmunglobulinG; SSC-Height = Side Scatter Height. 3.2. Zelluläre Immunantworten ELISPOT-Assays ermöglichen es spezifische, zelluläre Immunantworten bis auf Einzelzellniveau hin nachzuweisen. Es ist ein sehr sensitives Testverfahren und damit besonders gut geeignet Antigen-spezifische Immunantworten in ex vivo stimulierten T-Zellen nachzuweisen. Granzyme B gehört zur Familie der Serinproteasen und kommt in Granula der zytotoxischen T-Lymphozyten vor. Seine Freisetzung bewirkt eine Aktivierung intrinsischer Zelltod-Proteasen in der Zielzelle, sogenannter Caspasen. Granzyme B wird von den zytotoxischen T-Zellen im Rahmen der Immunantwort gegen unter anderem Tumorzellen ausgeschüttet und kann als Indikator für die Aktivität zytotoxischer T-Lymphozyten genutzt werden. Interferon-γ, ein Glykoprotein, gehört zu den Typ II-Interferonen und spielt eine große Rolle in der Verständigung, Aktivierung und Koordinierung innerhalb des Immunsystems. Es wird von T-Zellen und natürlichen Killerzellen gebildet und bewirkt unter anderem eine Verstärkung der zytolytischen Aktivität, Zellaktivierung und Differenzierung und eine Hochregulierung der MHC-Expression. 68 3. ERGEBNISSE Mit den ELISPOT-Assays sollte dargestellt werden, ob in den PBMCs der gesunden Probanden und der Patienten spezifische CTLs gegen LAAs vorhanden und ob diese auch funktionell waren. Sämtliche Assays wurden hierzu als Dreifach-Assays durchgeführt. Es wurden außerdem jeweils eine Positiv- sowie eine Negativkontrolle mitgeführt. Als Positivkontrolle fanden das Influenza-MatrixPeptid (IMP), ein intravirales Protein und/oder Zytomegalievirus (CMV), ein Virus aus der Familie der Herpesviren Verwendung. Die Durchseuchung der Bevölkerung mit diesen Viren ist sehr hoch. Sie boten sich deshalb als ideale Kontrolle an, die Validität der einzelnen Assays sicher zu stellen. Für die Negativkontrolle wurde jeweils ein Ansatz ohne Zugabe von Peptiden inkubiert. 3.2.1. Zelluläre Immunantworten gegen LAAs bei gesunden Probanden Für diese Arbeit wurden Granzyme B- und Interferon-γ-Elispots von sieben gesunden Probanden angefertigt. Im Folgenden werden die Elispots zweier gesunder Spender exemplarisch vorgestellt. 3.2.1.1. Granzyme B-ELISPOT-Assay bei gesunden Probanden Im Granzyme B-ELISPOT des gesunden Probanden Nr. 359 sind die beiden Positivkontrollen aufgrund ihrer hohen Spotzahlen definitiv als positiv zu bewerten. In der Negativkontrolle blieb eine Reaktion aus. Der Test ist damit gültig. Die weiteren LAAs zeigen eine unspezifische bzw. ausbleibende Reaktion und wurden damit negativ gewertet. 69 3. ERGEBNISSE Abbildung 13: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines gesunden Probanden (Nr.359) Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. Die getesteten Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) zeigten eine unspezifische bzw. ausbleibende Reaktion und wurden damit negativ gewertet. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. 70 3. ERGEBNISSE Abbildung 14: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines gesunden Probanden (Nr.838). Alle getesteten Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) waren hier negativ. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOTMessplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. Im Granzyme B- Elispot des gesunden Probanden Nr. 838 sind die Positiv- und Negativkontrolle den Vorgaben entsprechend ausgefallen. Auf die getesteten LAAs konnten nur unspezifische Reaktionen gemessen werden, diese wurden alle negativ gewertet. 71 3. ERGEBNISSE 3.2.1.2. IFN-γ-ELISPOT-Assay bei gesunden Probanden Der gesunde Spender Nr. 359 zeigt im gültigen ELISPOT nur unspezifische Reaktionen auf alle getesteten LAAs, die negativ gewertet wurden. Abbildung 15: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines gesunden Probanden (Nr.359). Alle getesteten Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) waren hier negativ. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. Der gesunde Proband Nr.838 zeigt ebenfalls keine Reaktion auf die getesteten LAAs. 72 3. ERGEBNISSE Abbildung 16: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines gesunden Probanden (Nr.838). Bei diesem Probanden konnten keine spezifischen Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene (LAAs) gefunden werden. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. Die folgenden Tabellen 6 und 7 sollen eine Übersicht geben über die Ergebnisse der Assays, die mit den T-Zellen unserer gesunden Spender durchgeführt wurden. In den Granzyme B-Assays war nur bei dem HV 991 das LAA hTert (Telomerase katalysierende Untereinheit) positiv. Die Interferon-γ-Assays zeigten mehrfach als positiv zu wertende Reaktionen und zeigten bei drei HVs spezifische CTLReaktionen gegen LAAs. Insgesamt zeigten vier von sieben Probanden Immunantworten gegen die getesteten Peptide. 73 3. ERGEBNISSE Tabelle 6: Übersicht über durchgeführte Enzyme linked immuno spot assays (ELISPOTs) bei gesunden Spendern. Für jeden Healthy Volunter = Gesunden Spender (HV) ist aufgeführt, ob und gegen welche Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) spezifische Immunantworten im Granzyme B- und/oder Interferon-γ- ELISPOT gemessen wurden. - = keine positiven Peptide im ELISPOT, HV= gesunder Spender; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. Granzyme B positiv für HV Interferon-γ positiv für - 359 - - 363 G250, Survivin - 838 - - 927 RHAMM, PRAME, G250 WT1, Survivin, hTert - 433 RHAMM, PRAME, G250 WT1, Survivin, hTert - 667 Nicht auswertbar hTert 991 Nicht auswertbar 74 3. ERGEBNISSE Tabelle 7: Übersicht über die durchgeführten Enzyme linked immuno spot assays (ELISPOTs) bei gesunden Spendern. Zu sehen sind die absoluten Zahlen der positiven ELISPOT-Assays und die prozentualen Anteile, jeweils pro Peptid und aufgeteilt in Granzyme B- und Interferon-γ-Assays. In der letzten Spalte ist zu sehen wie oft insgesamt eine spezifische Immunantwort gegen das jeweilige Peptid gemessen wurde, dargestellt in Prozent von allen durchgeführten Assays gegen das jeweilige Peptid. G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. Peptid Positive Granzyme B-Assays Positive Interferon- γAssays Gesamt RHAMM 0/7 (0%) 2/5 (40%) 17% PRAME 0/7 (0%) 2/5 (40%) 17% G250 0/7 (0%) 3/5 (60%) 25% WT1 0/7 (0%) 2/5 (40%) 17% Survivin 0/7 (0%) 3/5 (60%) 25% hTert 1/7 (14%) 2/5 (40%) 25% 3.2.2. Zelluläre Immunantworten gegen LAAs bei Patienten Wie schon bereits bei den gesunden Probanden gezeigt, wurden auch hier mit Hilfe von ELISPOT-Assays spezifische, zelluläre Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene nachgewiesen. Es wurden die Ergebnisse der ELISPOT-Assays von 10 Patienten verwendet, deren CTLs auf ihre Granzyme Bund IFN-γ-Freisetzung untersucht wurden. Von neun dieser Patienten lagen Proben von Zeitpunkten vor und nach deren allogener Stammzelltransplantation vor. Bei einem Patienten standen nur Proben, die bereits nach dessen Transplantation entnommen wurden zur Verfügung. Insgesamt konnten so 25 verschiedene Zellproben der 10 Patienten mit den ELISPOT-Assays ausgewertet werden. Bei drei der Assays konnten wir nur unspezifische, bei zwei Assays gar keine Immunantworten feststellen. Aufgrund der komplexen Immunsituation der Patienten standen die verwendeten Zellproben meist nur in sehr begrenzter 75 3. ERGEBNISSE Anzahl zur Verfügung und reichten mehrfach nicht zum Testen aller neun LAAs aus. Sofern das der Fall war wurden jeweils in absteigender Wichtigkeit RHAMM R3 (Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy), PRAME P3 (Preferentially expressed antigen of melanoma), G250 (Renal cell carcinoma-associated antigen G250), WT1 (Wilms-Tumor-Gen-1), Survivin2, hTert (Telomerase katalysierende Untereinheit) und die Aurorakinasen A1, B1 und A2 getestet. Es wurde zusätzlich in allen Versuchen eine Positivkontrolle mit IMP und/oder CMV und eine Negativkontrolle in Form dreier nicht gepulster Näpfe mitgeführt. Nur wenn mindestens eine der Positiv- und auch die Negativkontrolle gültig waren wurde der jeweilige Assay ausgewertet. 3.2.2.1. Granzyme B-ELISPOT-Assay bei Patienten In den folgenden Abbildungen sind beispielhaft die Messwerte für die Granzyme B-Freisetzung aus MLPCs und die zugehörigen fotographischen Abbildungen von drei verschiedenen Patienten nach Stimulation mit verschiedenen LAAs dargestellt. Zu sehen sind Messwerte sowohl von Proben vor als auch von Proben nach allogener Stammzelltransplantation. 76 3. ERGEBNISSE Patient 7 Patient 7 zeigte im Assay 2 Wochen vor Transplantation (Tx) deutlich erhöhte Spotzahlen für alle drei getesteten LAAs und wurde damit positiv gewertet für RHAMM, PRAME und G250. Abbildung 17: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 7) 2 Wochen vor allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM), Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) und Renal cell carcinoma-associated antigen (G250) wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. 77 3. ERGEBNISSE Abbildung 18: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 7) 3,5 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) und Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. 3,5 Monate nach seiner Stammzelltransplantation zeigt Patient 7 wieder erhöhte Spotzahlen für RHAMM und PRAME und wurde für diese positiv gewertet. 78 3. ERGEBNISSE Patient 8 Die hohe Granzyme B-Freisetzung und die daraus resultierende hohe Spotzahl ergibt in allen drei Assays eine gelungene Positiv-Kontrolle für Patient 8. Im ELISPOT, der die CTL-Aktivität vor der Transplantation wiedergibt waren RHAMM und G250 als positiv zu werten. Die weiteren LAAs zeigen eine unspezifische Reaktion, die als negativ gewertet wurde. Abbildung 19: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 8) 5 Monate vor allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) und Renal cell carcinoma-associated antigen (G250) wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. AuraA2 = Aurorakinase A2; CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. 79 3. ERGEBNISSE Im ELISPOT-Assay der Patienten-Probe, die 20 Monate nach der Transplantation entnommen wurde sind außer RHAMM alle anderen LAAs negativ gewertet worden. In einem weiteren Granzyme B-Assay mit T-Zellen die 40 Monate nach Transplantation entnommen wurden, zeigt sich überhaupt keine als positiv zu wertende Reaktion gegen LAAs. Abbildung 20: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 8) 20 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) wurde positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. AuraA2; Aurorakinase A2; CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. 80 3. ERGEBNISSE Abbildung 21: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 8) 40 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Es konnten keine spezifischen Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene (LAAs) detektiert werden. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme-B ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. AuraA2 = Aurorakinase A2; CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. 81 3. ERGEBNISSE Patient 11 Im folgenden Assay 20 Monate vor der allogenen Stammzelltransplantation zeigt Patient 11 keine Granzyme B-Freisetzung gegen die getesteten LAAs. Abbildung 22: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 11) 20 Monate vor allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Es konnten keine spezifischen Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene (LAAs) detektiert warden. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. 82 3. ERGEBNISSE Abbildung 23: Granzyme B-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 11) 2 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Es konnten keine spezifischen Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene (LAAs) detektiert werden. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Granzyme B auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Granzyme B-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. Im Assay des Patienten 11, 2 Monate nach Tx wurde kein Peptid positiv gewertet. Die spezifischen T-Zellreaktionen sind insgesamt sehr schwach ausgefallen. CMV als Positivkontrolle ist dennoch knapp positiv und der Assay somit gültig. 83 3. ERGEBNISSE 3.2.2.2. IFN-γ-ELISPOT-Assays bei Patienten Patient 7 RHAMM und G250 sind im ELISPOT vor Transplantation noch positiv während danach G250 durch PRAME ersetzt wird und dieses neben RHAMM als positiv zu werten ist. Abbildung 24: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 7) 2 Wochen vor allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) und Renal cell carcinoma-associated antigen (G250) wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. 84 3. ERGEBNISSE Abbildung 25: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 7) 3,5 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) und Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. 85 3. ERGEBNISSE Patient 8 Im Interferon-γ-Assay von Patient 8, fünf Monate vor Transplantation, sind die LAAs RHAMM, PRAME und G250 positiv gewertet. 20 Monate nach der Transplantation konnte bei Patient 8 eine Interferon-γ-Ausschüttung für PRAME, G250, Survivin und die Aurorakinase A2 nachgewiesen werden, während 40 Monate nach Transplantation RHAMM und hTert im Elispot positiv waren. Abbildung 26: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 8) 5 Monate vor allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM), Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) und Renal cell carcinoma-associated antigen G250 (G250) wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. Aura A2 = Aurorakinase A2; CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. 86 3. ERGEBNISSE Abbildung 27: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 8) 20 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) und Renal cell carcinomaassociated antigen G250 (G250), Survivin und die Aurorakinase A2 wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. Aura A2 = Aurorakinase A2; CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. 87 3. ERGEBNISSE Abbildung 28: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 8) 40 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) und Telomerase katalysierende Untereinheit (hTert) wurden positiv gewertet. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. Aura A2 = Aurorakinase A2; CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. 88 3. ERGEBNISSE Patient 11 Im Elispot für Patient 11 war keine positive Reaktion auf die getesteten LAAs nachzuweisen. Erst im Assay 2 Monate nach Transplantation waren RHAMM und PRAME positiv zu werten. Abbildung 29: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 11) 20 Monate vor allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Es konnten keine spezifischen Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene (LAAs) gemessen werden. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOT-Messwerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. 89 3. ERGEBNISSE Abbildung 30: Interferon-γ-Enzyme linked immuno spot assay (ELISPOT) eines Patienten (Patient 11) 2 Monate nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) und Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) sind hier positiv. Im unteren Bildbereich Darstellung der Spots für Interferon-γ auf der ELISPOT-Messplatte einer Mixed Lymphocyte Peptide Culture (MLPC) nach Stimulation mit den Peptiden. Im oberen Bereich sind die Interferon-γ-ELISPOTMesswerte der MLPC dargestellt. Auf der senkrechten Achse kann die detektierte Spotzahl abgelesen werden. Es wurden dafür die Mittelwerte aus den dreifachen Messwerten ermittelt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISPOT-Reader. CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy. 90 3. ERGEBNISSE 3.2.3. Übersicht über die zellulären Immunantworten Tabelle 8 gibt eine Übersicht über alle ELISPOT-Assays von Patienten, in denen erfolgreich Immunantworten gegen verschiedene Peptide nachgewiesen werden konnten. In den Versuchen konnte festgestellt werden, dass es sowohl vor als auch nach allogener Stammzelltransplantation spezifische Immunantworten von zytotoxischen T-Zellen gegen LAAs gibt. Die Leukämie-assoziierten Antigene RHAMM mit einer Häufigkeit von 53% in den Assays vor Tx und 56% nach Tx, PRAME mit 41% vor Tx und 39% nach Tx und G250 mit 53% vor Tx und 22% nach Tx waren hierbei am häufigsten positiv. 91 3. ERGEBNISSE Tabelle 8: Übersicht über alle Assays, mit denen spezifische Immunantworten von Patienten gegen verschiedene Leukämie-assoziierte Antigene (LAAs) nachgewiesen werden konnte, jeweils vor und nach allogener Stammzelltransplantation und aufgeteilt nach Interferon-yund Granzyme-B-Assays. Zu sehen sind auch die spezifischen Immunantworten gegen die beiden Positivkontrollen Influenza Matrix Protein (IMP) und Cytomegalievirus (CMV). Zum einen sind die Absolutzahlen positiver Assays, zum Anderen auch der prozentuale Anteil positiver Assays an den insgesamt gegen das genannte Peptid durchgeführten Assays zu sehen. Gegen Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM), Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) und Renal cell carcinoma-associated antigen (G250) wurden am häufigsten spezifische Immunantworten gemessen. AuraA2 = Aurorakinase A2; CMV = Cytomegalievirus; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; IMP = Influenza Matrix Protein; MW = Mittelwert; Neg = Negativkontrolle; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1. Vor allogener Nach allogener Stammzelltransplantation Stammzelltransplantation Positive Positive Granzyme InterferonB-Assays γ -Assays Positive Assays insge- Positive Peptid samt Positive Granzyme InterferonB-Assays γ-Assays Positive Assays insgesamt 7/8 (88%) 6/7 (86%) 87% IMP 8/9 (89%) 7/8 (88%) 88% 3/5 (60%) 4/5 (80%) 70% CMV 2/6 (33%) 5/5(100%) 64% 5/9 (56%) 4/8 (50%) 53% RHAMM 7/9 (78%) 3/9 (33%) 56% 3/9 (33%) 4/8 (50%) 41% PRAME 3/9 (33%) 4/9 (44%) 39% 4/9 (44%) 5/8 (63%) 53% G250 2/9 (22%) 2/9 (22%) 22% 0/4 (0%) 2/4 (50%) 25% WT1 0/4 (0%) 0/5 (0%) 0% 0/4 (0%) 3/4 (75%) 38% Survivin 0/4 (0%) 1/5 (20%) 11% 0/4 (0%) 1/4 (25%) 13% hTert 0/4 (0%) 1/5 (20%) 11% 0/4 (0%) 1/4(25%) 13% AuraA2 0/4 (0%) 2/5 (40%) 22% 1/3 (33%) 1/3 (33%) 33% AuraB1 0/2 (0%) 0/3 (0%) 0% 0/3 (0%) 1/3 (33%) 17% AuraA1 0/2 (0%) 0/3 (0%) 0% 92 3. ERGEBNISSE Tabelle 9: Übersicht über alle Enzyme-linked immuno spot Assays, mit denen Immunantworten von Patienten nachgewiesen werden konnte, dargestellt pro jeweiligem Patient. In der ersten Spalte von links sind die Peptide aufgelistet, gegen die in den Assays aus den Proben vor der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (alloHSCT) spezifische Immunantworten von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) gemessen wurden. In der vierten Spalte von links sind die Peptide, aufgelistet, gegen die nach der alloHSCT spezifische Immunantworten im Enzyme-linked immuno spot assay (ELISPOT) vorhanden waren. Von Patient 8 konnten wir 2 Proben nach alloHSCT auswerten, von Patient 10 lagen uns nur 3 Proben nach alloHSCT und keine vor alloHSCT vor, die wir ausgewertet haben. AuraA2 = Aurorakinase A2; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; Surv = Survivin; WT1 = Wilms-Tumor-Gen 1 Im Granzyme B- und/oder Interferon-γ-Elispot positiv gewertete Peptide Vor Stammzelltransplantation PRAME G250 WT1 Survivin RHAMM Survivin RHAMM PRAME RHAMM PRAME G250 WT1 Survivin hTert Aura-A2 Aura-B1 Aura-A1 RHAMM PRAME G250 RHAMM PRAME G250 gesamt Patient Nach Stammzelltransplantation 4 1 Keine Immunantwort messbar 2 2 2 4 2 2 G250 RHAMM 9 6 2 Aura A2 3 3 RHAMM PRAME G250 PRAME G250 RHAMM gesamt 3 7 8 RHAMM PRAME RHAMM PRAME G250 Survivin Aura A2 RHAMM hTert 9 2 5 2 1 G250 Fortsetzung Tabelle 9 auf nächster Seite 93 3. ERGEBNISSE Im Granzyme B- und/oder Interferon-γ-Elispot positiv gewertete Peptide Vor Stammzelltransplantation gesamt Nur Assays mit Proben nach der Transplantation Patient 10 - 0 11 RHAMM PRAME G250 3 12 Nach Stammzelltransplantation RHAMM PRAME RHAMM PRAME G250 PRAME G250 RHAMM PRAME gesamt 2 3 2 2 Versuch nicht auswertbar Von neun unserer zehn Patienten lagen uns Blutproben vor, die sowohl Zeitpunkten vor, als auch nach ihrer Transplantation entstammten. Bei einem Patienten konnten wir nach Transplantation gar keine Immunantworten messen, ein Patient zeigte im Assay nur unspezifische Immunantworten, die wir nicht werten konnten. Verglichen wir die nachgewiesenen spezifischen Immunantworten unserer Patienten vor der Transplantation mit denen nach der Transplantation konnten wir bei drei Patienten nach der alloHSCT weniger (Patient 6, 7 und 9), bei zwei Patienten gleich viele (Patient 2 und 4) und bei zwei Patienten mehr Immunantworten (Patient 8 und 11) gegen die getesteten LAAs feststellen (gemessen an der Anzahl an LAAs gegen die spezifische Immunantworten gefunden wurden). Bei einem Patient (Patient 10) lagen uns nur Blutproben von Zeitpunkten nach der Transplantation vor. Er wies zu allen drei untersuchten Zeitpunkten Immunantworten auf. Bei vier unserer Patienten (Patient 1, 2, 4 und 12) konnten wir nach der Transplantation nicht alle bzw. gar keinen Assay auswerten da entweder die in den Assays feststellbaren CTL-Antworten sehr unspezifisch waren, oder gar keine Immunantworten zu detektieren waren. 3.3. Klinische Verläufe der Patienten und Korrelation mit deren Immunantwort im ELISPOT Wir trugen anhand der Dokumentation, die von den behandelnden Ärzten der Abteilung Innere 3 des Universitätsklinikums Ulm erstellt wurde Informationen über 94 3. ERGEBNISSE die Behandlungsverläufe unserer 10 Patienten zusammen, um aus diesen Gesamtverläufen gemeinsam mit den ELISPOT-Analysen neue Erkenntnisse über eventuelle Zusammenhänge zwischen dem Vorhandensein spezifischer Immunantworten gegen LAAs und klinischen Resultaten gewinnen zu können und um Einblicke in die Immunrekonstitution nach einer allogenen Transplantation zu gewinnen. Für Patient 7 und Patient 8 wurden jeweils alle verfügbaren Informationen über deren Behandlungsverläufe nach ihrer allogenen Stammzelltransplantation zusammengetragen, ausgewertet und eine detaillierte Übersicht erstellt. Für diese beiden Patienten wurden mittels FACS-Analyse ermittelte CD3+, CD3+CD4+ und CD3+CD8+-Zellzahlen zu verschiedenen Zeitpunkten zusammen mit Stichpunkten über den Krankheitsverlauf, Informationen über therapeutische Maßnahmen wie immunsuppressive Therapien, aufgetretene GvHD und Hinweise auf den Chimärismus-Stand in einer Graphik abgebildet. Bei Patient 7 war es zusätzlich möglich, eine separate Graphik mit mehreren Chimärismus-Analysen über den zeitlichen Verlauf zu erstellen. Wir konnten so eine Übersicht über den Verlauf der Immunrekonstitution nach einer allogenen Stammzelltransplantation demonstrieren. Für Patient 7 war dies für einen Zeitraum von 863 Tagen nach seiner allogenen Stammzelltransplantation und für Patient 8 für 2562 Tage der Fall. In Tabelle 10 sind kurze Zusammenfassungen der Verläufe der übrigen Patienten mit Informationen über deren Konditionierungsregime, eventueller immunsuppressiver Therapien, dem klinischen Outcome, dem Immunsstatus zum Zeitpunkt der Probenentnahme und den Ergebnissen der ELISPOT-Analysen zu sehen. Im Folgenden werden nun die klinischen Verläufe unserer Patienten kurz beschrieben. Patient 1 befand sich 1700 Tage nach Tx dauerhaft in Remission. Er hatte als Folge einer zunächst fehlenden GvHD DLI erhalten und zeigte im ELISPOT keine messbaren Immunreaktionen. Die Chimärismusanalyse zeigte zum Zeitpunkt der Probenentnahme nur einen 95-prozentigen Spenderchimärismus. Patient 2 zeigte zu keinem Zeitpunkt eine GvHD und erlitt drei Rezidive seiner AML. Zunächst wurde das erste Rezidiv, welches 500 Tage nach der ersten Tx auftrat, mit einem Stammzell-Top-Up behandelt, welches den Patienten nur kurzfristig stabilisierte. Nach dem zweiten Rezidiv erfolgte eine zweite alloHSCT von einem anderen Spender. Diese zeigte ebenfalls keinen Erfolg, der Patient verstarb schließlich im dritten Rezidiv. 285 Tage nach der ersten Transplantation 95 3. ERGEBNISSE zum Zeitpunkt seiner Remission zeigte er Immunantworten gegen 2 LAAs: PRAME und G250. Vor der ersten Transplantation zeigte er Immunantworten gegen RHAMM und Survivin. Es fand diesbezüglich also eine deutliche Veränderung statt. 83 Tage nach der ersten Tx in der Remission und 226 Tage nach der zweiten Tx zum Zeitpunkt seines dritten Rezidivs konnten wir nur sehr geringe und unspezifische Immunantworten feststellen, die wir nicht auswerten konnten. Patient 4 sprach nicht auf die Tx an und verstarb 18 Monate nach der Transplantation. Der Patient zeigte eine GvHD und 100 Tage nach Tx konnten wir gegen RHAMM und G250 Immunantworten feststellen, vor der Tx waren die CTLS gegen RHAMM und PRAME aktiv. 393 Tage nach Tx unter starker zytostatischer Behandlung mit Hydroxyurea, Thalidomid und Arsentrioxid konnten wir keine spezifischen Immunantworten mehr im ELISPOT darstellen. Patient 6 zeigte vor Tx gegen alle getesteten Peptide Immunantworten. 494 Tage nach Tx, im MDS-Rezidiv und nach 2 maliger zusätzlicher Spenderlymphozytengabe zeigte er nur noch gegen RHAMM und AuraA2 Immunantworten. Eine GvHD lag nicht vor, der Patient starb 40 Monate nach Tx. Patient 7, ein Mann der an einer AML erkrankt war, erhielt sieben Monate nach Erstdiagnose im Alter Blutstammzelltransplantation von von 69 Jahren einem eine HLA-identen allogene periphere Fremdspender in Komplettremission. Er erhielt eine Behandlung im Rahmen der AMLSG 06-04 Studie (zwei Zyklen Cytarabin, Idarubicin und All-trans-Retinoinsäure (ATRA) zur Induktion und anschließend jeweils einen Zyklus zweier Konsolidierungstherapien. Zunächst ein Zyklus Cytarabin, Mitoxantron und ATRA und im Anschluss ein Zyklus Etoposid, Idarubicin und ATRA). Eine Komplettremission konnte nach dem zweiten Zyklus erreicht werden. Das Konditionierungsregime wurde nach dem dosisreduzierten Mini-RIT-Protokoll durchgeführt (Fludarabin, Busulfan, Campath und Radioimmunablation des Knochenmarks). Es erfolgte eine medikamentöse GvHD-Prophylaxe mit CyclosporinA ab dem letzten Tag vor der Transplantation für die Dauer von 18 Tagen. Der Posttransplantationsverlauf gestaltete sich komplikationsarm, mit zeitgerechter peripherer Regeneration. 11 Tage nach Tx (+11) konnten Leukozytenzahlen > 1,0/nl und Granulozyten >1,0/nl ermittelt werden. Lediglich die Thrombozyten erreichten nicht die gewünschte Anzahl von >100/nl, sodass diese durch Transfusion von Thrombozytenkonzentraten 96 3. ERGEBNISSE aufgefüllt wurden. Im ersten Monat nach Transplantation fand sich eine akute Graft-versus-Host Disease Grad 3, aus diesem Grund wurden zusätzlich zur Gabe von CyclosporinA noch Steroide und Mykophenolat zur Immunsuppression verabreicht. Darunter ging die GvHD zurück. An Tag+91 war keine aGvHD mehr feststellbar. Es imponierte ein guter Take des Transplantats. Der Patient befand sich zu diesem Zeitpunkt in kompletter Remission, es lag ein kompletter Spenderchimärismus vor. 118 Tage nach Transplantation herrschte nach wie vor eine sekundäre Leukopenie vor, am ehesten aufgrund der antiviralen Behandlung mit Valganciclovir wegen wiederkehrenden CMV-Infektionen. Ab Tag +119 lag eine residuelle chronische GvHD mit gastrointestinalem Fokus vor, es erfolgte an Tag+227 die Umstellung von CyclosporinA auf Tacrolimus. Darunter stellte sich jedoch kein stabiler Verlauf ein, sondern es stellte sich an Tag+266 der Verdacht auf eine GvDH-Reaktivierung und zusätzlichen Leberbefall. Daher erfolgte eine zusätzliche Immunsuppression mit Everolimus und Steroiden. 303 Tage nach Transplantation fand sich bei Patient 7 eine sekundäre Bizytopenie mit schwerwiegender Neutropenie und Thrombozytopenie Grad 4. An Tag+309 wurde im Knochenmark ein Frührezidiv der AML festgestellt zusammen mit einem erstmals gemischten Chimärismus mit komplettem Spenderchimärismus in der Granulozyten- jedoch nur noch 95-prozentigem Chimärismus in der Lymphozytenfraktion. Zusätzlich fand eine erneute leichte Reaktivierung der cGvHD nach Steroidreduktion statt, die immunsuppressive Medikation wurde erneut angepasst und es fand eine Umstellung auf Tacrolimus anstelle Everolimus statt. Eine Panzytopenie bestand weiterhin. An Tag+367 fand der erste von drei Zyklen Polo-like Kinase 1-Inhibitor und niedrig dosiertem Cytosin Arabinosid im Rahmen der AML BI 1230.4 Studie statt. Es fand sich wieder ein anhaltender kompletter Spenderchimärismus ab Tag+449. An Tag+512 befand sich Patient 7 in anhaltender CRi (komplette Remission mit jedoch insuffizienter peripherer hämatologischer Regeneration) bei persistierender residueller GvHD-Aktivität. An Tag +750 wurde der Verdacht auf ein erneutes Rezidiv gestellt. Zu diesem Zeitpunkt fand sich bei Patient 7 keine aktive cGvHD, jedoch dafür eine unverändert schwere Trizytopenie Grad 4. Etwa 3,5 Monate nach Tx zeigten die CTLs des Patienten spezifische Immunantworten gegen die LAAs RHAMM und PRAME. Vor der Transplantation reagierten die CTLs positiv auf RHAMM, PRAME und G250 97 3. ERGEBNISSE Abbildung 31: Darstellung des klinischen Verlaufs von Patient 7 im zeitlichen Verlauf mit Informationen über Krankheitsverlauf, immunsuppressive Medikation und den Petiden, gegen die spezifische Immunantworten im Enzyme-linked immuno spot assay (ELISPOT) gemessen wurden. Die blauen Kurven entsprechen dem Immunstatus, aufgeteilt in Cluster of Differentiation 3-positive (CD3+), CD3+CD8+ und CD3+CD4+-T-Lymphozyten. Tag 0 entspricht dem Tag der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Auf der senkrechten Achse können die ermittelten Zellzahlen pro µl abgelesen werden, die waagerechte Achse beschreibt die Tage nach Transplantation. aGvHD= akute Graft versus Host Disease; AML= akute myeloische Leukämie; CR=komplette Remission; CRi=komplette Remission mit jedoch insuffizienter peripherer hämatologischer Regeneration; cGvHD= chronische graft versus Host Disease; LD-Ara-C = Low-dose Zytosin-Arabinoside; SpA= Spenderzellenanteil; T=Tag. 98 3. ERGEBNISSE Abbildung 32: Chimärismusanalysen nach Stammzelltransplantation von Patient 7. Tag 0 entspricht dem Tag der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation. Es sind Analysen im zeitlichen Verlauf von der Lymphozyten-und der Granulozytenfraktion zu sehen. Die senkrechte Achse beschreibt den Spenderchimärismus in Prozent, die waagerechte Achse die Tage nach Transplantation. Zu zwei Zeitpunkten lag ein gemischter Chimärismus vor, die übrige Zeit fand sich ein vollständiger Spenderchimärismus. Patient 8, ein Mann mit chronisch myeloischer Leukämie erhielt im Alter von 39 Jahren eine HLA-idente allogene periphere Blutstammzelltransplantation von dessen Bruder. Es wurde zunächst ein Therapieversuch mit einer zunächst zytoreduktiven Therapie mit Hydroxyurea und anschließender Imatinib-Therapie im Rahmen der CML 4-Studie versucht. Im weiteren Verlauf fand eine Randomisation in den Imatinib und AraC Arm (Arabinosylcytosin) statt. Darunter konnte eine komplette hämatologische jedoch nur partielle zytogenetische Remission erzielt werden mit einem Reverse Transkriptase- PolymeraseKettenreaktion- (RT-PCR-) Signal für bcr/abl von 0,5%. Es erfolgte daraufhin eine weitere Therapie mit Imatinib bis zum maximalen Ansprechen. Fünf Monate später erfolgte die komplikationslose PBSCT nach Konditionierung mit Campath, Fludarabin und Melphalan 480 Tage nach Erstdiagnose. 193 Tage nach 99 3. ERGEBNISSE Transplantation wurde in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein bcr-abl-Signal von 0,40% gemessen, 210 Tage nach Transplantation fand sich eine persistierende MRD der CML mit einem PCR-Signal von 0,60% für bcr-abl. Daraufhin wurden Patient 8 an Tag+273 erstmalig Spenderlymphozyten transfundiert (5 x 10E6 CD3+ T-Lymphozyten/kg). An Tag+287 sank das bcr-ablSignal auf 0,27%. In der Chimärismusanalyse zeigte sich ein Spenderchimärismus von 85% in der Lymphozyten- und 70% in der Granulozytenfraktion. An Tag+382 war wieder ein kompletter Spenderchimärismus in beiden Fraktionen gegeben. An Tag+321 präsentierte Patient 8 eine cGvHD ersten bis zweiten Grades. Es erfolgte zunächst ein Behandlungsversuch mit oralen Steroiden. Da sich der Zustand darunter jedoch nicht besserte wurde die Immunsuppression an Tag +500 um Mycophenolat-Mofetil und wegen erneut nur mangelhaftem Ansprechen an Tag+560 noch zusätzlich um Tacrolimus erweitert. Es traten bei später erfolgten Versuchen die Immunsuppression -insbesondere die Steroiddosen- zu reduzieren wiederholt Reaktivierungen der cGvHD auf. Deshalb erfolgte eine kontinuierliche spiegeladaptierte Tacrolimusgabe über den gesamten weiteren beobachteten Therapiezeitraum. An Tag+820 fand sich bcr-abl in der PCR negativ und Patient 8 befand sich in kompletter Remission. 950 Tage nach Transplantation entwickelte der Patient erstmals eine Immunthrombozytopenie (ITP). Diese trat nach dem Ausschleichen der Langzeitsteroidtherapie (über ein Jahr andauernde Steroidtherapie) auf. Behandelt wurde die ITP mit einem Dexamethasonstoß und nach einem Rezidiv an Tag+1010 auch viermaliger Rituximabgabe über einen Zeitraum von 23 Tagen. 1350 Tage nach Transplantation war Patient 8 wieder bcr-abl nested positiv. Er litt außerdem an einem im weiteren Verlauf substitutionsbedürftigen absoluten Immunglobulinmangel. An Tag+1413 fand sich in der PCR ein bcr-abl-Wert von 0,05. Ab Tag+1854 wurde eine Therapie mit Glivec begonnen aufgrund im weiteren Verlauf zweimalig positiver MRD. Die Therapie war erfolgreich mit erstmals wieder negativer MRD an Tag+1980. 2170 Tage nach Transplantation präsentierte der Patient ein erneutes Rezidiv der ITP, daraufhin erfolgten Dexamethasonstöße und die Gabe von Immunglobulinen. Bei erneutem raschen Thrombozytenabfall nach Absetzen der Steroide erfolgte erneut eine viermalige Rituximabgabe von Tag+2180 bis Tag+2201. Vor Tx zeigten die CTLs des Patienten spezifische Immunantworten gegen RHAMM, PRAME und 100 3. ERGEBNISSE G250, 20 Monate nach Tx gegen RHAMM, PRAME, G250, Survivin und AuraA2, 40 Monate nach Tx gegen RHAMM und hTert. Abbildung 33: Darstellung des klinischen Verlaufs von Patient 8 im zeitlichen Verlauf mit Informationen über Krankheitsverlauf, immunsuppressive Medikation und den Petiden, gegen die spezifische Immunantworten im Enzyme-linked immuno spot assay (ELISPOT) gemessen wurden. Tag 0 entspricht dem Tag der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (alloHSCT). Die Kurven entsprechen dem Immunstatus, aufgeteilt in CD3+, CD3+CD8+ und CD3+CD4+-T-Lymphozyten. Tag 0 entspricht dem Tag der alloHSCT. Auf der senkrechten Achse können die ermittelten Zellzahlen pro µl abgelesen werden, die waagerechte Achse beschreibt die Tage nach Transplantation. AuraA2 = Aurorakinase A2; CR=komplette Remission; cGvHD= Chronische Graft-versusHost Disease; G250 = Renal cell carcinoma-associated antigen G250; G-CSF=GranulozytenKolonie stimulierender Faktor; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; ITP=Immunthrombozytopenie; MRD=Minimale Resterkrankung; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; T=Tag. 101 3. ERGEBNISSE Patient 9 zeigte bereits 26 Tage nach Tx wieder eine spezifische Immunantwort gegen G250 unter leichter Immunsuppression mit Cyclosporin A. Es bestand eine cGvHD. 1800 Tage nach Tx befand er sich in Remission. Vor Tx zeigten die CTLs spezifische Immunantworten gegen RHAMM, PRAME und G250. Patient 10 zeigte 83 Tage nach Tx Antworten gegen RHAMM und PRAME, 150 Tage nach Tx gegen RHAMM, PRAME und G250 und 240 Tage nach Tx gegen PRAME und G250. Er zeigte eine GvHD und verblieb auch im Follow-Up 1800 Tage nach Tx in Remission. Bei diesem Patienten standen uns mehrere Proben zur Verfügung mit denen wir für einen Zeitraum von 157 Tagen eine kontinuierliche Aktivität der CTLs gegen LAAs nachweisen konnten, die sich interessanterweise im Verlauf veränderten und mit einem guten klinischen Ergebnis assoziiert waren. Patient 11 zeigte vor der Transplantation keine Immunreaktion gegen die getesteten LAAs, 70 Tage nach der Tx konnten wir spezifische Immunreaktionen gegen RHAMM und PRAME feststellen. Er zeigte eine GvHD, erlitt jedoch 430 Tage nach Tx ein Rezidiv und verstarb. Patient 12 zeigte vor Tx Immunantworten gegen 3 LAAs, 90 Tage nach Tx konnten wir keine spezifischen Immunantworten feststellen. Zu diesem Zeitpunkt stand der Patient unter Immunsuppression und verfügte nur über 0,1 Giga/l Lymphozyten, sodass das Fehlen der Immunantworten dadurch zu erklären ist. Eine GvHD war vorhanden, der Patient befand sich 1800 Tage nach Tx immer noch in Remission. Insgesamt befanden sich fünf unserer zehn untersuchten Patienten nach der alloHSCT in dauerhafter Remission, fünf erlitten ein Rezidiv. Acht Patienten zeigten eine Graft-versus-host Disease. Uns fiel auf, dass alle fünf Patienten, die sich nach der Transplantation in dauerhafter Remission befanden, eine GvHD zeigten, während die beiden Patienten, die keine GvHD zeigten beide ein Rezidiv erlitten. Drei Patienten zeigten eine GvHD und erlitten ein Rezidiv. Eine Medikation mit Immunsuppressiva hatte bei unseren Patienten keinen generellen Einfluss auf die nachweisbaren spezifischen CTL-Antworten. Alle Patienten von denen wir Immunantworten nachweisen konnten zeigten nach der alloHSCT spezifische Immunantworten gegen LAAs, zwei Patienten erhielten 102 3. ERGEBNISSE währenddessen keine immunsuppressive Medikation, sechs Patienten mit nachweisbaren spezifischen Immunantworten gegen LAAs erhielten Immunsuppressiva. Tabelle 10 ist eine Übersicht über die klinischen Verläufe der Patienten zu entnehmen. Ebenfalls abgebildet sind dort alle detektierten spezifischen Immunantworten gegen die getesteten LAAs. 103 3. ERGEBNISSE 233 Tage vor 1800 Tage nach Tx in Remission Spenderlymphozytengabe 160 und 300 Tage nach Tx 95%-iger Spenderchimärismus 235 Tage nach Tx Chronische GvHD 235 Tage nach 2 28 AML 19 Tage vor 62& 83 Tage nach 285 Tage nach 226 Tage nach 2. Tx AlloHSCT vom Fremdspender unmanipuliert in 1.CR, Konditionierung mit MINI-RIT Keine Immunsuppression Zunächst in Remission Keine GvHD 500 Tage nach 1.Tx: 1. Rezidiv 600 Tage nach 1. Tx: Stammzell-TOP-UP 770 Tage nach 1. Tx: 2.Rezidiv 815 Tage nach1.Tx : Erneute Tx mit anderem Spender 180 Tage nach 2. Tx: 3. Rezidiv Tod 42 Monate nach Diagnose und 10 Monate nach 2. Tx ELISPOT positiv für die LAAs Immunstatus AML Konditionierung vor Tx und Immunsuppression nach Tx Diagnose 70 Klinischer Verlauf Alter bei Tx 1 Tage vor/nach Tx Patient Tabelle 10: Übersicht über alle untersuchten Patienten mit Hinweisen auf deren klinische Verläufe nach der Stammzelltransplantation, deren Konditionierung, Immunstatus und die erhaltene Immunsuppression zum Zeitpunkt der Blutabnahme für die Enzyme-linked immunospot assays (ELISPOTS), sowie die im ELISPOT positiv ausgewerteten Peptide. aGvHD = akute Graft-versus-Host-Disease; allo HSCHT = allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation; AuraA2 = Aurorakinase A2; Bu = Busulfan; cGvHD = chronische Graft-versus-Host-Disease; CR = komplette Remission; Cy = Cyclophosphamid; Lymphos = Lymphozyten, Leukos = Leukozyten; AML = Akute myeloische Leukämie; CML = Chronische myeloische Leukämie; CMML = Chronische myelomonozytäre Leukämie; CsA = Cyclosporin A; DLI = Spenderlymphozyteninfusion; EBMT = European group for blood and marrow transplantation; FLAMSA = Fludarabin, Cytarabin, Amsacrin; G250 = Renal cell carcinomaassociated antigen G250; hTERT = Telomerase katalysierende Untereinheit; KM = Knochenmark; LAA = Leukämie-assoziiertes Antigen; MDS = Myelodysplastisches Syndrom; MRD = Minimal Residual Disease; PRAME = Preferentially expressed antigen of melanoma; RAEB2 = Refractory anemia with excess blasts 2; RHAMM = Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy; RIT = Radioimmuntherapy; TBI = Total body irradiation = Ganzkörperbestrahlung; Tx = allogene hämatopoetische Transplantation; WT1 = WilmsTumor-Gen 1. PRAME G250 WT1 Survivin Leukozyten 5,7 Giga/l, Lymphos rel. 32,0%, abs. 1,8 Giga/l AlloHSCT vom Fremdspender in CR, Intensivierte Konditionierung mit RIT/Bu/Cy Keine Immunantwort messbar RHAMM Survivin Keine Immunsuppression Leukos 5,8 Giga/l, Lymphos 1,6 Giga/l Nicht auswertbar Keine Immunsuppression Leukos 7,0 Giga/l, Lymphos abs. 1,2 Giga/l, Lymphos rel. 20,0% PRAME G250 Keine Immunsuppression Leukos 1,7 Giga/l, Lymphos rel.94%, absolut 1,6 Giga/l Nicht auswertbar Fortsetzung Tabelle 10 auf nächster Seite 104 6 55 CMML Kein Ansprechen auf Tx; Refraktäre AML 14 Tage nach Tx: aGvHD Tod in Blastenkrise 20 Monate nach Erstdiagnose und 18 Monate (550 Tage) nach Tx 69 AML RHAMM PRAME 100 Tage nach Tx Immunsuppression mit CsA , Decortin 15mg, Myfortic 720mg Leukos 5,3 Giga/l , Lym-phos abs. 0,9 Giga/l, rel. 18%, CD4 130/ul, CD8 411/ul RHAMM G250 393 Tage nach Tx Immunsuppression mit Hydroxyurea 4000mg; Zytostatische Therapie mit Thalidomid und Arsentrioxid Leukos 12,7 Giga/l, Lymphos abs. 5,1 Giga/l Keine Immunanwort messbar 34 Tage vor Tx Zunächst anhaltende CR der CMML Keine GvHD 420 Tage nach Tx MDS Rezidiv dreimalig DLI 430, 480 und 750 Tage nach Tx ohne Erfolg Tod 48 Monate nach Erstdiagnose und 40 Monate nach Tx; 494 Tage nach Tx 7 AlloHSCT vom Fremdspender in refraktärer AML, Konditionierung nach FLAMSAProtokoll ELISPOT positiv für die LAAs 18 Tage vor Tx Immunstatus AML Konditionierung vor Tx und Immunsuppression nach Tx Diagnose 28 Klinischer Verlauf Alter bei Tx 4 Tage vor/nach Tx Patient 3. ERGEBNISSE 13 Tage vor Tx 92 &106 &120 Tage nach Tx AlloHSCT vom HLA-identen Bruder, unmanipuliert, Konditionierung nach EBMTProtokoll Keine Immunsuppression AGvHD Grad III, cGvHD extensive disease Vorübergehend in Remission 310 Tage nach Tx Rezidiv der AML Tod 37 Monate nach Erstdiagnose und 29 Monate nach Tx RHAMM PRAME G250 WT1 Survivin hTert AuraA2 AuraB1 AuraA1 Leukozyten 39.2 Giga/l, Lymphozyten abs 3,1 Giga/l, rel. 8% AlloHSCT vom Fremdspender, unmanipuliert in 1. CR, Konditionierung nach Mini-RITProtokoll Immunsuppression Mit CsA 150mg,Myfortic 720mg, Prednison 2,5mg RHAMM AuraA2 RHAMM PRAME G250 Leukos 1,7 Giga/l, Lymphos abs 0,3 Giga/l, rel. 23%, CD4+:39,9/ul CD8+:15,9/ul RHAMM PRAME Fortsetzung Tabelle 10 auf nächster Seite 105 180 Tage nach Tx: Persistierende MRD der CML 275 Tage nach Tx: DLI 320 Tage nach Tx: CGvHD Grad 1-2 800 Tage nach Tx: CR 970 Tage nach Tx: Positive MRD 1490 Tage nach Tx: Beginn einer Therapie mit Glivec 1980 Tage nach Tx: MRD negativ 2300 Tage nach Tx: Anhaltende CR mit cGvHD 613 Tage nach 1210 Tage nach 9 51 MDS mit Übergang in sek. AML 130 Tage vor Tx Chronische GvHD 1800 Tage nach Tx in Remission 26 Tage nach Tx 10 34 AML Nur Verlauf nach Transplantation RHAMM PRAME G250 Immunsuppression mit Tacrolimus 3 mg, Prednisolon 40mg Leukos 7,4 Giga/l, Lymphos abs. 3,0 Giga/l, Lymphos rel. 40% RHAMM PRAME G250 Survivin Aura a2 Immunsuppression mit Tacrolimus 2mg, Rituximab, Dexamethason Leukos 2,3 Giga/l, Lymphos abs. 1,7 Giga/l, Lymphos rel.72% RHAMM hTert AlloHSCT vom Familienspende r in CR, Standardkonditi onierung mit TBI und Cyclophosphamid Immunsuppres sion mit Cyclosporin A 100mg GvHD der Haut Grad 1 1800 Tage nach Tx fortbestehende Remission 62& 83 Tage nach AlloHSCT vom Bruder, in partieller zytogenetischer Remission, Konditionierung mit Campath, Fludarabin und Melphalan ELISPOT positiv für die LAAs 149 Tage vor Tx Immunstatus CML Konditionierung vor Tx und Immunsuppression nach Tx Diagnose 39 Klinischer Verlauf Alter bei Tx 8 Tage vor/nach Tx Patient 3. ERGEBNISSE RHAMM PRAME G250 Leukos 3,7 Giga/l, Lymphos abs. 1,0 Giga/l, Lymphos rel. 26% G250 Unman. HLAident. Fremdspende in 3. CR Konditionierung mit TBI/Cyclophosp hamid Keine Probe zum Zeitpunkt vor Tx getestet Immunsuppression mit Prednisolon 40mg, 2160mg Mycophenolat, Tacrolimus 1mg RHAMM PRAME Fortsetzung Tabelle 10 auf nächster Seite 106 Nur Verlauf nach Transplantation 11 45 AML GvHD der Haut Grad 1 1800 Tage nach Tx fortbestehende Remission Immunsuppression mit Prednisolon 25mg 240 Tage nach Tx 610 Tage vor Tx 30 Tage nach Tx aGvHD der Haut Grad1 430 Tage nach Tx:Rezidiv MDS RAEB2; Tod durch Pneumonie in Trizytopenie 43 Monate nach Erstdiagnose und 14 Monate nach Tx 30 und 70 Tage nach Tx 12 32 CML 120 Tage vor Tx 60 und 90 Tage nach Tx Leukos 11,3 Giga/l, Lymphos abs. 0,6 Giga/l, Lymphos rel. 5,3%; RHAMM PRAME G250 Immunsuppression mit Prednisolon 12,5 mg Leukos 6,6 x 10^9/l Lymphos rel. 4,7% Lymphos abs. 400/ul PRAME G250 AlloHSCT vom Fremdspender bei 5% Blastenanteil im KM, Intensivierte Konditionierung:RIT,Bu/Cy Immunsuppression mit Cyclosporin A 225mg 1800 Tage nach Tx in fortbesteheder Remission cGvHD der Haut, Schleimhaut 410 Tage nach Tx: DLI ELISPOT positiv für die LAAs 150 Tage nach Immunstatus AML Konditionierung vor Tx und Immunsuppressi on nach Tx Diagnose 34 Klinischer Verlauf Alter bei Tx 10 Tage vor/nach Tx Patient 3. ERGEBNISSE Negativ für alle getestete n LAAs Leukos 4,3 Giga/l, Lymphos abs. 1,3 Giga/l, Lymphos rel. 31% AlloHSCT vom Bruder, Konditionierung mit Fludarabin/Mel phalan/Campat h Immunsuppression mit Decortin 10mg Ciclosporin A 200mg RHAMM PRAME RHAMM PRAME G250 Leukos 2,0 Giga/l Lymphos rel. 7,0% Lymphos abs. 0,1 Giga/l Nicht auswertbar 107 4. DISKUSSION 4. DISKUSSION Eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist für maligne Erkrankungen des blutbildenden Systems die Therapieoption mit der höchsten kurativen Rate und stellt noch immer die beste Behandlungsmöglichkeit dar. Neben den Konditionierungsregimes gilt der Graft-versus-Leukämie Effekt, der sowohl durch klinische Beobachtungen, als auch vor allem durch die erfolgreiche Behandlung von Rezidiverkrankungen mit Spenderlymphozyten zahlreich dokumentiert worden ist als wichtiger Faktor für den kurativen Effekt der Transplantation [13, 24, 82, 108, 111, 157]. Allerdings ist die alloHSCT trotz ständiger Verbesserungen in den Supportivtherapien noch immer mit einer hohen behandlungsassoziierten Morbidität und Letalität verbunden [67]. Infektionskrankheiten und Erkrankungsrückfälle sind nach wie vor Faktoren, die die Erfolgsrate dieses Verfahrens und das Anwendungsspektrum oft einschränken [155]. Auch insbesondere die Graft-versus-Host Disease ist nach wie vor ein limitierender Faktor wenn es darum geht den Graft-versus-Leukämie Effekt des transplantierten Immunsystems optimal zu nutzen. Zielsetzung aktueller Forschung ist es daher, sich den erfolgversprechenden GvL-Effekt stärker und spezifischer zu nutzen zu machen, ohne damit auch die GvHD zu verstärken. Wenn es gelingt, das Immunsystem gezielt gegen die gefährlichen Krebszellen zu richten, ohne dabei auch ungerichtet gesunde Empfängerzellen zu attackieren, könnte dies auch insbesondere für ältere oder vorerkrankte Patienten von Bedeutung sein, die bislang als besonders komplikationsträchtig galten. Als Hoffnungsträger, die es möglich machen könnten, die beiden Effekte zu separieren, gelten LAA-spezifische Therapien. Die Vakzinierung gegen das sich stetig vergrößernde Spektrum bekannter Leukämie-assoziierter Antigene ist dabei ein besonders interessantes Konzept, speziell wenn dies in Kombination mit allogenen Stammzelltransplantationen möglich sein sollte. Um evaluieren zu können inwiefern eine solche Impfung nach einer allogenen Stammzelltransplantation sinnvoll sein kann, galt das Interesse dieser Arbeit der Untersuchung spezifischer Immunantworten von zytotoxischen T-Lymphozyten gegen verschiedene LAAs vor und nach einer allogenen HSCT. Außerdem interessierten wir uns auch für den Krankheitsverlauf unserer Patienten nach der 108 4. DISKUSSION Transplantation im Gesamten, insbesondere auch dafür, ob sich eventuelle Zusammenhänge zwischen CTL-vermittelten Aktivitäten gegen LAAs, dem Auftreten einer GvHD und dem Remissionsstatus herstellen lassen würden. Es wurden dafür Blutproben von zehn Patienten gesammelt, die an verschiedenen malignen hämatologischen Erkrankungen litten und im Zuge dessen eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation erhielten. Diese Blutproben wurden mit ELISPOT-Assays auf Immunantworten zytotoxischer T-Zellen gegen LAAs untersucht. Außerdem erstellten wir eine Übersicht über die Krankheitsverläufe dieser Patienten, ausgehend von den Dokumentationen der jeweiligen behandelnden Ärzte. 4.1. Verwendung von ELISPOT-Assays zur Darstellung zytotoxischer Immunantworten In dieser Arbeit wurden für die Detektion der zytotoxischen T-Zellantworten ELISPOT-Assays verwendet. Dieses Verfahren war in unserem Labor bereits etabliert [69]. Bei dem ELISPOT-Assay handelt es sich um einen anerkannten, zuverlässigen Test zum Nachweis spezifischer zellulärer Immunantworten. Er ist heute einer der meist genutzten Immunoassays in der Evaluation von Impfversuchen und anderer Formen der Immuntherapie. Die Assays bieten eine bislang unübertroffene Sensitivität in der Detektion auch geringster Anzahlen Antigen-spezifischer T-Zellen und stellen dabei spezifische und hoch reproduzierbare Daten zur Verfügung. Der ELISPOT ermöglicht es dabei, auf die Frequenz Peptid-spezifischer CD8-positiver T-Zellen im peripheren Blut zu schließen [176]. Er war für diese Arbeit besonders geeignet, da uns aufgrund der schwierigen Immunitätslage der Patienten oft nur äußerst geringe Zellzahlen zur Verfügung standen und es deshalb besonders wichtig war, ein hoch sensitives Testverfahren zu benutzen. Die Sensibilität des Tests wird dadurch erreicht, dass auch geringste Mengen sezernierter Zytokine sofort durch entsprechende Antikörper aufgefangen und fest gebunden werden. Die Interferon-γ- und Granzyme B-Freisetzung ist hierfür ein idealer Marker. T-Lymphozyten können bei Antigenkontakt verschiedene Effektormechanismen ausführen. Wichtige antitumorale Antworten geschehen dabei über die Interferon-γ- und Granzyme B- 109 4. DISKUSSION Freisetzung der CTLs [38, 96, 186]. Granzyme B ist eine Serinprotease, die in sekretorischen Granula in CTLs und vielen anderen Zelltypen wie unter anderem Mastzellen und Neutrophilen vorkommt [193, 204]. Mit Hilfe von Perforin dringt das Granzyme B in die Zielzelle ein und führt dort zu deren Apoptose [203]. Interferonγ ist ein pleiotropes Zytokin und spielt eine tragende Rolle sowohl im natürlichen als auch im erworbenen Immunsystem [23, 43]. Es stellt die Basis für Tumorsuppressive Mechanismen des Immunsystems und trägt entscheidend dazu bei, das Tumorwachstum zu kontrollieren. Es wird von TH1-Zellen und natürlichen Killerzellen gebildet und erleichtert den Immunzellen das Erkennen entarteter Zellen [96, 192]. Shafer-Weaver et al. beschrieben die Granzyme B-Freisetzung von CTLs im ELISPOT als einen spezifischeren Indikator als die IFN-γ Sekretion [179]. Über die Möglichkeit die Zytokinsekretion bildhaft darzustellen kann gleichzeitig auch festgestellt werden, ob es sich bei den untersuchten TLymphozyten um funktionell aktive Zellen handelt und nicht etwa um inaktive oder anerge Zellen. Um letztlich sicherzustellen, dass die Immunantworten auch tatsächlich Antigen-gesteuert waren und nicht nur eine Folge unspezifischer, gegebenenfalls Lymphopenie verursachter Homöostasen, wurden als Positivkontrollen immer die Peptide IMP und/oder CMV mitgeführt. Mögliche unspezifische Reaktionen wurden erfasst, indem in allen Versuchen jeweils Negativkontrollen mit ungepulsten CD8-Zellen mitgeführt wurden. Häufig konnten so tatsächlich diskrete unspezifische Reaktionen detektiert werden. Wir führten diese auf die Proliferation von CD8-negativen und anderen Zellen in der MLPC zurück, die wahrscheinlich während der Zellseparation mit den MACS MircoBeads in der Fraktion der unbestrahlten CD8+ Zellen in geringem Maß verblieben waren. Zum anderen wurde allogenes AB-Medium in den Ansätzen verwendet. Dies könnte in einigen Fällen eine T-Zellaktivität gegen darin enthaltene Antigene induziert haben. 4.2. Nachweis spezifischer zytotoxischer Immunantworten gegen Leukämieassoziierte Antigene vor und nach allogener Stammzelltransplantation Der Graft-versus-Leukämie Effekt, der nach einer Stammzellzelltransplantation beobachtet werden kann und der wesentlich zur langfristigen Heilung beiträgt, 110 4. DISKUSSION beruht auf dem Effekt der allogenen zytotoxischen T-Zellen [85, 108, 109, 110, 111, 146]. Diese erkennen neben den minor-histocompatibility-Antigenen auch Leukämie-assoziierte Antigene [42, 63, 137, 139]. Wir und andere Gruppen konnten bereits zeigen, dass sich die Expression von LAAs wie RHAMM, PRAME oder G250 positiv auf die Prognose hämatologischer Neoplasien auswirken kann [72, 74, 98, 187]. Andere Studien kamen zu dem Ergebnis, dass es jedoch auch LAAs gibt, die mit einem negativen Outcome assoziiert sind [17, 197]. Für viele Antigene, wie beispielsweise BAGE (B melanoma antigen), BCL-2 (B-cell lymphoma-2), OFA-iLRP (Oncofetal antigen-immature laminin receptor protein), FLT3-ITD (Fms-related tyrosine kinase 3-internal tandem duplication), hTert, Survivin, WT1, die Aurorakinasen A und B, NPM1 (Mutated region of nucleophosmin 1) und andere LAAs konnte bereits nachgewiesen werden, dass eine Erkennung durch CD8-positive T-Lymphozyten stattfindet [68, 81, 82, 177]. Peptidvakzinierungen mit guten klinischen Ergebnissen gegen das LAA WT1 konnten bereits durchgeführt werden [129, 149]. Das Vorhandensein LAAspezifischer CTLs nach einer allogenen Stammzelltransplantation im Rahmen einer hämatologischen malignen Erkrankung konnte bereits mit einer niedrigeren Rückfallrate in Korrelation gebracht werden. [97, 165]. Verschiedene Studien fanden zudem inverse Beziehungen zwischen dem Vorkommen spezifischer TZellen, die gegen mHags oder LAAs gerichtet sind und dem Auftreten von Resterkrankungen in Patienten mit Leukämien, nachdem sie eine alloHSCT erhalten hatten [130, 165]. Wir wählten für diese Arbeit die LAAs RHAMM, PRAME, G250, WT1, Survivin, hTert und die Aurorakinasen Aura A2, A1 und B1 aus. Von diesen Antigenen ist bekannt, dass gerichtete Immunantworten bei verschiedenen hämatologischen Erkrankungen nachgewiesen werden konnten [68]. Wenn zytotoxische T-Zellen residuelle maligne Zellen erkennen, aktiviert werden und diese töten, tragen sie maßgeblich zum Heilungserfolg bei. Wenn es nun gelingt, diesen Effekt gezielt zu steuern und zu verstärken, wäre es nicht nur möglich den therapeutischen Benefit nach einer HSCT zu steigern, man wäre auch in der Lage die behandlungsassoziierte Toxizität zu senken. Wir wollten mit unseren Versuchen feststellen, ob die CTLs unserer Patienten in der Lage waren gezielte Immunantworten gegen LAAs auszulösen und wie sich die Aktivitäten der T-Zellen gegen die Leukämie-assoziierten Antigene vor und nach einer allogenen 111 4. DISKUSSION Stammzelltransplantation unterscheiden. Dafür testeten wir Blutproben von zehn Patienten, die zur Therapie ihrer malignen hämatologischen Erkrankung alle mindestens eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation erhalten hatten auf spezifische zytotoxische Immunantworten gegen neun verschiedene LAAs. Zum Vergleich testeten wir auch sieben Blutproben von gesunden Spendern Bei den gesunden Probanden traten spezifische Immunreaktionen gegen die getesteten LAAs in einer geringeren Frequenz (vier von sieben Probanden) auf, als dies bei den Patientenproben (acht von neun Patienten vor Transplantation; zehn von zehn Patienten nach Transplantation) der Fall war. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit Untersuchungen von Rezvani et al., die in zehn von achtzehn untersuchten gesunden Spendern spezifische Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene nachweisen konnten [162] und entsprechen weiteren Versuchen, in denen ebenfalls LAA-spezifische TLymphozyten aus Blutproben von gesunden Menschen isoliert werden konnten [51, 138]. Im Weiteren gelang es uns, sowohl bei den Patientenproben, die vor den Transplantationen entnommen wurden (acht von neun Patienten), als auch bei denen, die Zeitpunkten nach den Transplantationen entstammten, Immunantworten gegen verschiedene Peptide nachzuweisen. Dabei zeigten alle Patienten, von denen wir gültige ELISPOT-Analysen nach der Transplantation erstellen konnten zu diesem Zeitpunkt Immunantworten gegen mindestens ein LAA (acht von acht Patienten). Getestet wurden bis zu neun verschiedene Peptide, je nach verfügbarer Zellzahl in den Proben. Von neun unserer zehn Patienten lagen Proben von Zeitpunkten vor und nach Stammzelltransplantation vor. Von diesen neun zeigten drei Patienten nach der Stammzelltransplantation Immunantworten gegen weniger LAAs, zwei Patienten gegen gleich viele und zwei Patienten Immunantworten gegen mehr Leukämie-assoziierte Antigene, als sie dies vor der Transplantation getan hatten. Patient 10, von dem uns keine Blutprobe zu einem Zeitpunkt vor der Stammzelltransplantation, sondern nur Proben von unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transplantation vorlagen, wies zu allen drei untersuchten Zeitpunkten Immunantworten gegen mindestens je zwei LAAs auf. Ein Patient zeigte nach der Transplantation gar keine messbaren Immunantworten, ein Patient nur unspezifische Immunreaktionen, die wir nicht auswerten konnten. Im Unterschied dazu fanden Kapp et al. hingegen nur bei 112 4. DISKUSSION einem Teil ihrer untersuchten Patienten positive Immunantworten gegen LAAs. Bei ihren Untersuchungen wurden genau bei dreizehn von insgesamt achtundzwanzig untersuchten Patienten spezifische Immunantworten gefunden [97]. Diese Gruppe testete allerdings nur drei verschiedene LAAs (MUC1 (Mucin 1), WT1 and Proteinase-3), wohingegen wir je nach verfügbarer Zellzahl bis zu neun verschiedene Peptide für die ELISPOTs verwendeten. Die Immunantworten, die wir vor und nach der Transplantation zeigen konnten fielen insgesamt sehr heterogen aus. Die Immunantworten die wir nach Transplantation fanden waren gegenüber den vor Transplantation detektierten verändert. Gegen RHAMM (53% vor / 56% nach alloHSCT), PRAME (41% vor / 39% nach HSCT) und G250 (53% vor / 22% nach HSCT) konnten wir insgesamt am häufigsten Immunantworten detektieren. Bei den beiden Patienten, bei denen mehrere Proben von Zeitpunkten nach Transplantation vorlagen und bei denen Immunantworten messbar waren zeigte sich, dass sich die Immunantworten im Post-Transplantations-Verlauf veränderten. Wir konnten nach einer Transplantation mehrfach Immunantworten gegen LAAs zeigen, die vor der Transplantation nicht nachweisbar waren. Wir nehmen an, dass die LAA-spezifischen CTL-Populationen, die wir mir den ELISPOT-Assays detektieren konnten aus einer Antigen-spezifischen Expansion resultierten und nicht nur eine Konsequenz einer generellen Immunrekonstitution waren. Unsere Versuche stehen dabei im Einklang mit bereits postulierten Thesen, laut denen sich die CD8-Lymphozyten, die auf LAAs reagieren in den Empfängern nach der Stammzelltransplantation ausbreiten und so zur Bekämpfung der entarteten Zellen und damit zur Genesung beitragen [134, 165, 206]. Wir fanden zudem zumeist T-Zellantworten gegen mehrere LAAs gleichzeitig. Dies bestätigt Erkenntnisse, die besagen, dass maligne hämatologische Erkrankungen wie beispielsweise Leukämien, diverse Epitope bieten, die sie angreifbar durch T-Zellen machen und die deshalb als Targets für Immuntherapien geeignet scheinen [70]. Unsere Ergebnisse ähneln Versuchen von Rezvani et al., die zu dem Ergebnis, kamen, dass bei deren untersuchten CML-Patienten nach Stammzelltransplantation eine höhere Frequenz LAA-spezifischer CD8-Zellen vorlag, als dies vor der Transplantation der Fall war [162]. Wir fanden bei unseren Patienten ebenfalls Immunantworten vor einen (acht diskreten von Unterschied neun in Patienten der Frequenz zeigten der spezifische 113 4. DISKUSSION Immunantworten gegen LAAs vor Transplantation; nach Transplantation acht von acht Patienten). Bei Patient 1, 2, 4 und 12 hatten wir Probleme mit der Auswertung einiger Assays nach der Transplantation. Entweder konnten wir (Patient 1 und 4) gar keine, oder (Patient 2 und 12) nur unspezifische Immunantworten detektieren. Wir führen diese Schwierigkeiten darauf zurück, dass unsere Patienten zum Zeitpunkt der Probenentnahme nach der Transplantation nur über ein funktionell stark eingeschränktes Immunsystem verfügten. Einige Patienten erhielten zur Behandlung der GvHD zum einen stark immunsuppressiv wirkende Medikamente. Zum anderen befand sich das „neue“ Immunsystem unserer Patienten meist noch im Wiederaufbau und wir nehmen an, dass zu den Zeitpunkten der Probenentnahme vielfach noch keine vollständigen T-Zell-Repertoires vorhanden waren. Im Blut der Patienten befanden sich auch in einigen Fällen nur sehr wenige Immunzellen und so war es nicht immer möglich jede Probe tatsächlich erfolgreich auszuwerten. 4.3. Patientenverläufe Bislang sind noch viele Aspekte über den genauen Ablauf der tumorspezifischen Immunrekonstitution nach einer Stammzelltransplantation ungeklärt. Bekannt ist, dass die Art des Konditionierungsregimes, Alter der Patienten, Art der Erkrankung, Stammzellquelle, Thymusfunktion und das Verabreichen T-Zell-depletierter Stammzellspenden Faktoren sind, die das Engraftment der Stammzellen und die Rekonstitution beeinflussen [62, 142, 170]. Sieben unserer Patienten waren an einer AML erkrankt, zwei Patienten an einer CML, ein Patient an einer CMML. Insgesamt zeigte sich bei den zehn Patienten ein recht heterogenes Bild bezüglich deren klinischer Verläufe. Im Folgenden werden die Krankheitsverläufe zweier Patienten detailliert beschrieben. Patient 7 befand sich nach der Transplantation zunächst in kompletter Remission und zeigte eine aGvHD. Nach der Transplantation reagierten CTLs im ELISPOT aktiv gegen die LAAs RHAMM und PRAME. Vor der Transplantation reagierten sie zusätzlich gegen G250. Für die AML ist es prognostisch besonders günstig, wenn mindestens eines dieser drei LAAs exprimiert wird [72]. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zuvor polyspezifische CTL-Antworten gegen LAAs in einem Patienten mit AML nachweisen. Dieser hatte während eines molekularen Rückfalls 114 4. DISKUSSION nach primär T-Zell-freier allo-HSCT DLIs erhalten. Die nachgewiesenen CTLAntworten waren in diesem Fall interessanterweise im Verlauf assoziiert gewesen mit negativer MRD [82]. Wegen einer erneut aufgeflammten cGvHD wurde Patient 7 im weiteren Verlauf wieder verstärkt immunsuppressiv behandelt, was nach 600 Posttransplantationstagen in einer sekundären Zytopenie gipfelte. Interessanterweise erlitt er daraufhin ein erneutes Rezidiv der AML mit erneut gemischtem Chimärismus. Von Patienten, die einen sich rasch verstärkenden gemischten Chimärismus zeigen ist bekannt, dass sie ein hohes Rückfallrisiko haben [7, 160]. Wir vermuten bei Patient 7 eine unzureichende Funktion des Immunsystems aufgrund der Immunsuppression und der vorangegangenen Chemotherapie und/oder Tumor-Escape-Mechanismen, gegen die das Immunsystem nicht reagieren konnte. Es wäre interessant gewesen weitere Blutproben von diesem Patienten im Verlauf zu analysieren. So hätten wir herausfinden können ob es weiterhin funktionsfähige und aktive CTLs gab, die gegen die LAAs gerichtet waren, oder ob diese im Lauf der Zeit ihre Aktivität gegen diese eingestellt hatten. Mehr ELISPOT-Analysen hätten Aufschluss geben können über die Aktivität des Immunsystems während und nach dem Rezidiv. Leider standen uns nicht mehr Blutproben des Patienten zur Verfügung. Anhand der vorhandenen Daten konnten wir jedoch darstellen, dass eine Assoziation nachgewiesener LAA-spezifischer Immuantworten mit einem guten klinischen Verlauf bestand. Bei Patient 8 fand sich 210 Tage nach Transplantation eine persistierende MRD der CML. Einige wenige maligne Zellen konnten wohl sowohl die zytotoxischen Therapien, als auch die Anwesenheit der CTLs überleben und persistierten im Knochenmark. Die MRD nach alloHSCT im Setting einer CML ist mit einem stark erhöhten Rückfallrisiko assoziiert [122]. Der Patient erhielt daraufhin Spenderlymphozyten. Im Falle eines erfolgten Rückfalls sind diese eine wichtige Therapieoption für die Reinduktion einer Remission [54, 128]. Nach der Gabe der Spenderlymphozyten zeigte der Patient erstmals eine cGvHD, es stellte sich ein 100%-iger Chimärismus ein (zuvor gemischt) und das bcr-abl-Signal sank. Dies sind starke Indizien für die Aktivität der transfundierten CTLs. Sie scheinen einen GvLE bewirkt zu haben, den das sinkende bcr-abl-Signal widerspiegelte. Wir konnten den GvLE bereits zuvor an einer Patientin mit AML zeigen. Auch bei ihr konnte durch die Gabe von DLI zum Zeitpunkt eines molekularen Rückfalls nach 115 4. DISKUSSION allo-HSCT eine komplette Remission erzielt werden und es konnten ebenfalls Aktivitäten der CTLs gegen verschiedene LAAs nachgewiesen werden [82]. 613 Tage nach Transplantation waren RHAMM, PRAME, G250, Survivin, und Aura A2 bei Patient 8 im ELISPOT positiv. In diesem Zeitraum imponierte eine cGvHD und der Patient befand sich in kompletter Remission (CR). Wir gehen davon aus, dass die Spenderlymphozyten die gezeigte in vitro-Aktivität auch im Empfängerorganismus in vivo gezeigt haben und die Tumorzellen im Sinne eines GvLE töteten. Im weiteren Verlauf 1211 Tage post-HSCT hatte eine Veränderung in der Aktivität der CTLs stattgefunden und es konnten nur noch RHAMM und hTert positiv ausgewertet werden. Kurz darauf wurde bei dem Patienten wieder eine MRD festgestellt. Mit dieser Zusammenschau konnten wir einen Graft-versusLeukämie Effekt im zeitlichen Verlauf assoziiert mit klinischen Resultaten darstellen. Aufgrund der geringen Probandenanzahl von nur zehn Patienten konnten wir keine statistisch signifikanten Aussagen über eventuelle Zusammenhänge zwischen LAA-spezifischen Immunantworten, dem Auftreten einer GvHD und dem Remissionsstatus erstellen. Unabhängig von ihrem Remissionsstatus zeigten alle Patienten, von denen wir nach der Transplantation Immunantworten darstellen konnten T-Zellantworten gegen mindestens eines der getesteten LAAs. Die CTLAntworten nach der Transplantation veränderten sich im Verlauf und unterschieden sich von denen, die wir vor der Transplantation gemessen hatten. Bei Patient 8 konnten wir einen Graft-versus-Leukämie Effekt im zeitlichen Verlauf darstellen. Die nachgewiesenen CTL-Aktivitäten gegen LAAs in den ELISPOTAnalysen waren bei unseren Patienten zum Teil assoziiert mit guten klinischen Resultaten. Kapp et al. konnten einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Fehlen einer CTL-Antwort gegen die getesteten LAAs Proteinase-3, WT1 und MUC 1 nach einer allgenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und einer erhöhten Rückfallrate aufzeigen [97]. Rezvani et al. beschrieben einen potenziellen Zusammenhang zwischen dem Nachweis WT1-positiver CTLs und dem Graft-versus-Leukemia-Effekt [165]. Nach wie vor ist nur unzureichend verstanden, ob und inwiefern sich GvHD und GvLE gegenseitig bedingen. Bekannt hingegen ist, dass das Auftreten einer akuten oder chronischen GvHD assoziiert ist mit einer niedrigeren Rückfallrate und das Gesamtüberleben verlängert. Dies wird auf den GvLE zurückgeführt, der 116 4. DISKUSSION im Falle des Auftretens der GvHD offenbar stärker ausgeprägt ist [85, 104, 107, 117, 147, 183]. In vitro konnten die beiden T-Zell-vermittelten Effekte bereits teilweise separiert werden [202]. Bezogen auf die in vivo-Situation im Patienten bleibt dies noch eine Aufgabe, die es zu lösen gilt. Bezogen auf unser Patientenkollektiv konnten wir einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer GvHD und einer niedrigeren Rückfallquote vermuten. Alle fünf Patienten mit einer andauernden Remission nach der Stammzelltransplantation zeigten eine GvHD, während nur drei von fünf Patienten mit einem Rückfall eine GvHD zeigten. Außerdem konnten wir feststellen, dass eine immunsuppressive Therapie, die im Rahmen einer GvHD verabreicht wurde, keinen generellen Effekt auf das Auftreten von spezifischen Immunantworten hatte. 4.4. Die allogene Stammzelltransplantation mit Peptidvakzinierung gegen LAAs Wenn maligne Zellen sich vermehren, kann es vorkommen, dass T-Zellen, die spezifisch sind für Antigene, die von der Tumorzelle exprimiert werden, selektiv durch den Prozess der klonalen Deletion eliminiert werden, ähnlich wie es bei der Reaktion auf virale Antigene oftmals der Fall ist [50]. Im Körper entwickelt sich dadurch eine Toleranz gegen die Tumorantigene. Neben einer Vielzahl weiterer Möglichkeiten können Krebszellen auf diese Weise das Immunsystem oftmals überlisten und den T-Zellen entkommen. Bekannt ist, dass im Setting einer allogenen Stammzelltransplantation die Spender-T-Zellen noch nicht tolerant gegenüber den Krebszellen sind, da davon auszugehen ist, dass die Spender zum Zeitpunkt ihrer Spende nicht selber unter einer Krebserkrankung litten und damit bislang keine Überexpression von Krebsantigenen stattgefunden hat. Das extrem lymphopene Milieu, das im Anschluss an eine Stammzelltransplantation zunächst vorherrscht, stellt dabei ideale Bedingungen für eine Expansion LAA-spezifischer T-Zellen. Die Aktivierungsschwelle der T-Lymphozyten ist in diesem Setting herabgesetzt und die homöostatische Proliferation, die Peptid-spezifisch erfolgt, wird gefördert [52, 61, 195]. Auch die Qualität der präsentierten Antigene ist entscheidend für die Proliferationsrate der T-Zellen. Besonders niedrig affinen Liganden und Selbst-Antigenen kommt bei der Aktivierung der T-Lymphozyten eine bedeutende Rolle zu [61]. Die erhöhte Proliferation von T-Zellen als Antwort auf schwache Antigene in lymphopenen Settings könnte durch 117 4. DISKUSSION Peptidvakzinierungen also optimal ausgenutzt werden, vor allem vor dem Hintergrund, dass Tumorantigene im allgemeinen nur schwach immunogen wirken [166]. Die funktionelle Rolle der Leukämie-assoziierten Antigene hat zwei Seiten: Zum einen nehmen viele Antigene eine kritische Rolle in der Proliferation und dem Zellzyklus der Tumorzellen ein und fördern damit deren Wachstum [78, 212]. Zum anderen stellen sie aber auch eine Zielstruktur für die spezifische zelluläre Immunantwort gegen die malignen Zellen dar. Aus diesem Grund befinden sich eine Vielzahl immuntherapeutischer Methoden in der Entwicklung, die versuchen, diesen spontanen Antitumoreffekt gezielt zu verstärken. So sind Vakzinierungsstudien gegen verschiedene LAAs Gegenstand aktueller Forschung. Klinische Studien unserer Arbeitsgruppe und auch von Schmitt et al. konnten bereits zeigen, dass mittels Vakzinierung gegen das LAA RHAMM sowohl immunologische als auch klinische Erfolge gegen verschiedene maligne hämatologische Erkrankungen erzielt werden können [71, 175]. Auch PeptidVakzinierungen gegen unter anderem WT1 und PR 1 zeigten bislang bereits immunologische und klinische Erfolge [101, 163, 164]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass auch nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation spezifische Immunantworten von zytotoxischen TLymphozyten gegen Leukämie-assoziierte Antigene vorhanden sind und dass diese damit prinzipiell vielversprechende Zielstrukturen für eine Immuntherapie darstellen können. Das Auftreten der von uns gezeigten LAA-spezifischen TZellantworten korrelierte bei einigen Patienten mit guten klinischen Ergebnissen. Gegenstand weiterer Forschung wird die genauere Untersuchung des Immunsystems in der Posttransplantationsphase sein, da bislang noch nicht abschließend geklärt ist, wie genau eine Stammzelltransplantation das Immunsystem des Empfängers verändert, wie funktionell es in dieser speziellen Phase nach der Transplantation arbeitet und von welchen Faktoren eine erfolgreiche und rasche Immunrekonstitution abhängt. Auch werden weitere klinische Studien zur Erprobung der LAA-Vakzine durchgeführt werden müssen. Es bleibt zukünftig auch herauszufinden, welches das geeignetste LAA, bzw. die geeignetste Kombination antigener Strukturen ist, welches das beste klinische Setting darstellt und welche Adjuvantien den Therapieerfolg am meisten sichern können. 118 5. ZUSAMMENFASSUNG 5. ZUSAMMENFASSUNG Für Patienten mit verschiedenen malignen hämatologischen Erkrankungen ist die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) oft die Therapie mit der höchsten kurativen Therapieoption. Die allogenen Spenderzellen bewirken dabei einen Graft-versus-Leukämie Effekt, welcher neben der zytostatischen und der Strahlentherapie ebenfalls wesentlich zur Zerstörung der Tumorzellen beiträgt und langfristig wirken kann. Die Kombination einer allogenen Stammzelltransplantation mit einer zusätzlichen Immuntherapie, wie etwa einer Vakzinierung gegen Leukämie-assoziierte Antigene (LAAs), könnte diesen Graftversus-Leukämie Effekt und somit den Therapieeffekt weiter steigern. Mittels Enzyme linked immuno spot Assays (ELISPOT-Assays) konnten wir spezifische T-Zell-Antworten gegen verschiedene LAAs bei Patienten mit hämatologischen Neoplasien, die eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation erhalten hatten, nachweisen. Vor der Transplantation zeigten acht von neun Patienten spezifische Immunantworten gegen die getesteten Peptide. Alle der untersuchten Patienten, die nach einer allogenen Stammzelltransplantation nachweisbare Immunantworten zeigten, wiesen TZellantworten gegen mindestens eines der getesteten LAAs auf. Von den zehn nach der allogenen Stammzelltransplantation untersuchten Patienten wiesen drei Patienten weniger, zwei Patienten gleich viele und zwei Patienten mehr Immunantworten gegen Leukämie-assoziierte Antigene auf, als sie vor der Stammzelltransplantation gezeigt hatten. Ein Patient von dem uns nur Blutproben von Zeitpunkten nach der Transplantation vorlagen wies zu allen drei untersuchten Zeitpunkten Immunantworten gegen mindestens zwei LAAs auf. Zwei Patienten zeigten nach der Transplantation keine messbaren Immunantworten. Receptor for hyaluronic acid-mediated motilitiy (RHAMM) (53% vor / 56% nach alloHSCT), Preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) (41% vor / 39% nach HSCT) und Renal cell carcinoma-associated antigen G250 (G250) (53% vor / 22% nach HSCT) waren bei den untersuchten Patienten die am häufigsten nachweisbaren LAAs. Vor und nach Transplantation zeigten sich Immunantworten gegen jeweils unterschiedliche Antigene. Die nachweisbaren LAA-spezifischen Immunantworten nach Transplantation veränderten sich im Laufe der Zeit. Wir 119 5. ZUSAMMENFASSUNG konnten bei einem Teil der Patienten eine Assoziation der spezifischen Immunantworten mit einem positiven klinischen Verlauf zeigen. Bei den untersuchten gesunden Probanden traten spezifische Immunreaktionen gegen LAAs in einer geringeren Frequenz auf, als dies bei den Patientenproben der Fall war. Alle unsere Patienten, die sich in dauerhafter Remission befanden, zeigten im Verlauf auch eine Graft-versus-Host Disease (GvHD), während nur drei von fünf Patienten, die einen Rückfall erlitten eine GvHD zeigten. Wenn zur Behandlung einer GvHD immunsuppressive Medikamente eingesetzt wurden, schien dies keinen generellen Einfluss auf die nachweisbaren spezifischen Immunantworten zu haben. Diese Ergebnisse zeigen, dass LAAs auch nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation prinzipiell interessante Zielstrukturen für eine Immuntherapie darstellen können. 120 6. LITERATURVERZEICHNIS 6. LITERATURVERZEICHNIS [1] Alshemmari, S., Ameen, R. und J. Gaziev: Haploidentical hematopoietic stemcell transplantation in adults. 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Mein besonderer Dank gilt: Herrn Prof. Dr. Jochen Greiner für die interessante Themenstellung, seine hervorragende wissenschaftliche Betreuung, seine Geduld, die vielen wertvollen Ratschläge und seine freundliche Unterstützung. Danken möchte ich auch allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Labore der Abteilung Innere Medizin III für das immer angenehme Arbeitsklima und die große Hilfsbereitschaft. Insbesondere möchte ich mich bei Frau Marlies Götz bedanken für die gute Einarbeitung, ihre stets tatkräftige und kompetente Hilfe bei der Durchführung meiner Experimente im Labor, ihr immer offenes Ohr und ihre geduldige und liebenswürdige Unterstützung. Außerdem möchte ich Frau Cornelia Herbst für die Hilfe bei meiner Arbeit im Labor herzlich danken und auch Frau Dr. med. Susanne Hofmann für die Bereitstellung und die Unterstützung bei der Auswahl von Patientenmaterial. Ein ganz besonderes Dankeschön gilt nicht zuletzt auch meiner Familie für die bedingungslose Unterstützung über all die Jahre. 154 LEBENSLAUF LEBENSLAUF Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt. 155 LEBENSLAUF Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt. 156
