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Ex vivo Analyse antigen-spezifischer CD4+ T-Zell-Antworten im Infektionsmodell der murinen Listeriose Von der Fakultät für Chemie und Physik der Technischen Universität Bergakademie Freiberg genehmigte DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium Dr. rer. nat. vorgelegt von Diplom Chemiker Matthias Schiemann geboren am 12.01.1967 Gutachter: in Hennigsdorf Prof. Dr. Michael Schlömann, Freiberg Prof. Dr. Klaus Pfeffer, Düsseldorf Prof. Dr. Dirk H. Busch, München Tag der Verleihung: 10.06.2005 Wesentliche Teile der vorliegenden Arbeit flossen in folgende Publikation ein: Schiemann M, Busch V, Linkemann K, Huster KM, Busch DH. Differences in maintenance of CD8+ and CD4+ bacteria-specific effector-memory T cell populations. Eur J Immunol 2003; 33 (10), 2875-85 2 1 Inhaltsverzeichnis 1 INHALTSVERZEICHNIS......................................................................................... 3 2 VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN ................................................................... 6 3 EINLEITUNG UND HINTERGRUND....................................................................... 8 3.1 AUFBAU DES IMMUNSYSTEM .................................................................................. 9 3.2 T-ZELLREZEPTOR ZUR ANTIGENERKENNUNG UND DIE KOREZEPTOREN CD4/CD8 ... 10 3.3 ANTIGEN-PRÄSENTATION UND MHC-RESTRIKTION ................................................ 12 3.4 ANTIGEN-PROZESSIERUNG UND -ERKENNUNG DURCH ANTIGEN-SPEZIFISCHE TZELLEN ............................................................................................................... 16 3.5 EFFEKTORFUNKTIONEN VON ANTIGEN-SPEZIFISCHEN CD8+ UND CD4+ T- ZELLEN... 18 3.6 EX VIVO ANALYSE ANTIGEN-SPEZIFISCHER IMMUNREAKTIONEN .............................. 20 3.6.1 FUNKTIONSABHÄNGIGE DETEKTION .................................................................... 21 3.6.2 FUNKTIONSUNABHÄNGIGE DETEKTION................................................................ 22 3.6.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ................................................................................. 24 3.7 EXPERIMENTELLES SYSTEM DER MURINEN LISTERIOSE .......................................... 26 3.8 CD4+ TH-ZELLEN UND CD8+ T-ZELLEN WÄHREND LISTERIEN-INFEKTION ................ 28 4 MATERIAL UND METHODEN.............................................................................. 32 4.1 LISTERIA MONOCYTOGENES STÄMME ................................................................... 32 4.2 INFEKTION VON MÄUSEN MIT LISTERIA MONOCYTOGENES ...................................... 32 4.2.1 INFEKTION VON C57BL/6- UND C57BL/10-MÄUSEN............................................ 32 4.2.2 INFEKTION VON BALB/C-, CB6- UND B10.D2-H2D-M ÄUSEN ................................ 32 4.2.3 HITZEINAKTIVIERUNG VON BAKTERIEN ................................................................ 33 4.3 ORGANENTNAHME UND ZELLPRÄPARATION........................................................... 33 4.4 MHC-KLASSE-I-MULTIMER REAGENZIEN .............................................................. 34 4.4.1 PROTEINEXPRESSION UND AUFREINIGUNG.......................................................... 34 4.4.2 IN VITRO FALTUNG VON MHC-I-MOLEKÜLEN ....................................................... 35 4.4.3 BIOTINYLIERUNG UND MULTIMERISIERUNG.......................................................... 35 4.5 4.5.1 MHC-KLASSE-II-REAGENZIEN.............................................................................. 36 ZELL-KULTUREN UND ZELL-LINIEN ..................................................................... 36 3 4.5.2 EXPRESSIONSVEKTOREN ................................................................................... 37 4.5.3 TRANSFEKTION DER KONSTRUKTE IN DROSOPHILA MELANOGASTER..................... 37 4.5.4 PROTEINEXPRESSIONSSYSTEM UND PROTEINAUFREINIGUNG ............................... 38 4.5.5 BIOTINYLIERUNG ............................................................................................... 39 4.6 FÄRBUNG VON T-ZELLEN ..................................................................................... 39 4.6.1 DIREKTE EX VIVO FÄRBUNG VON OBERFLÄCHENMARKERN BEI T-ZELLEN .............. 39 4.6.2 DIREKTE EX VIVO - FÄRBUNG VON ANTIGEN-SPEZIFISCHEN T-ZELLEN MITTELS MHC-TETRAMEREN ............................................................................. 40 4.6.3 4.7 INTRAZELLULÄRE ZYTOKINFÄRBUNG................................................................... 40 EPITOPSUCHE DURCH INTRAZELLULÄRE ZYTOKINFÄRBUNG UND PEPTIDBIBLIOTHEKEN .......................................................................................... 41 4.8 GENERIERUNG VON EPITOP-SPEZIFISCHEN T ZELL-LINIEN ...................................... 42 4.9 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE UND AUSWERTUNG ................................. 43 5 ERGEBNISSE ...................................................................................................... 44 5.1 BEKANNTE IMMUNDOMINANTE LISTERIEN-EPITOPE IN BALB/C- UND C57BL/6-MÄUSEN .............................................................................................. 44 5.1.1 SUCHE NACH NEUEN IMMUNDOMINANTEN LISTERIEN-SPEZIFISCHEN MHC-KLASSE-II-RESTRINGIERTEN T-ZELL-EPITOPEN .......................................... 45 5.1.2 SUCHE NACH NEUEN IMMUNDOMINANTEN LISTERIEN-SPEZIFISCHEN MHC-KLASSE-IA-RESTRINGIERTEN T-ZELL-EPITOPEN ......................................... 51 5.1.3 5.2 MODELLSYSTEM MIT OVALBUMIN SEZERNIERENDEN LISTERIA MONOCYTOGENES .. 56 KINETIKEN ANTIGEN-SPEZIFISCHER CD8+ UND CD4+ T-ZELL-ANTWORTEN NACH INFEKTION MIT OVALBUMIN SEZERNIERENDEN LISTERIA MONOCYTOGENES ............. 58 5.2.1 FREQUENZANALYSE CD4+ UND CD8+ T-ZELL-ANTWORTEN NACH PRIMÄRINFEKTION............................................................................................. 59 5.2.2 FREQUENZANALYSE CD8+ UND CD4+ T-ZELL-ANTWORTEN NACH WIEDERHOLUNGSINFEKTION .............................................................................. 63 5.2.3 UNTERSUCHUNG DER VERÄNDERUNG ABSOLUTER POPULATIONSGRÖßEN CD4+ UND CD8+ T-ZELLEN NACH PRIMÄR- UND WIEDERHOLUNGSINFEKTION ........ 66 5.3 ABNAHME DER CD4+ EFFEKTOR-GEDÄCHTNIS-ZELL-POPULATIONSGRÖßE ............. 71 5.4 CD8+ UND CD4+ T-ZELL-POPULATIONSGRÖßEN IN VIVO IN UNTERSCHIEDLICHEN ORGANEN ........................................................................... 72 4 DOSISABHÄNGIGKEIT DER ANTIGEN-SPEZIFISCHEN CD8+ UND CD4+ T-ZELL- 5.5 ANTWORT NACH WIEDERHOLUNGSINFEKTION ....................................................... 74 KONKURRENZVERHALTEN ZWISCHEN CD8+ UND CD4+ T-ZELLEN WÄHREND EINER 5.6 INFEKTION MIT OVALBUMIN-EXPRIMIERENDEN LISTERIA MONOCYTOGENES .............. 76 5.7 FUNKTIONSUNABHÄNGIGE DETEKTION VON ANTIGEN-SPEZIFISCHEN CD4+ T-ZELLEN................................................................................................... 79 5.7.1 GENERIERUNG VON KLASSE-II-MULTIMEREN ...................................................... 80 5.7.2 FEINMAPPING DES IMMUNDOMINANTEN KLASSE-II EPITOPS LLO190-201 .................. 83 6 DISKUSSION ....................................................................................................... 86 6.1 ETABLIERUNG DES EXPERIMENTELLEN SYSTEMS ................................................... 87 6.2 KINETIKEN ANTIGEN-SPEZIFISCHER CD4+ UND CD8+ T-ZELLEN WÄHREND INFEKTION MIT LISTERIA MONOCYTOGENES ........................................................... 89 6.3 ZYTOKINEXPRESSIONSMUSTER VON LISTERIEN-SPEZIFISCHEN CD4+ UND CD8+ T-ZELLEN................................................................................................... 90 6.4 REEXPANSION VON ANTIGEN-SPEZIFISCHEN CD4+ UND CD8+ EFFEKTORT-ZELLEN NACH WIEDERHOLUNGSINFEKTION ........................................................ 91 6.5 DOSISABHÄNGIGKEIT DER REEXPANSION CD4+ GEDÄCHTNIS-T-ZELLEN ................ 92 6.6 KOMPETITION ZWISCHEN CD8+ UND CD4+ T-ZELLEN ............................................. 92 6.7 ERHALT DER ANTIGEN-SPEZIFISCHEN ZELLEN IM KÖRPER ...................................... 94 6.8 MHC-MULTIMER-REAGENZIEN ............................................................................. 96 7 ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................ 99 8 VERZEICHNIS DER WISSENSCHAFTLICHEN VERÖFFENTLICHUNGEN ...... 101 9 DANKSAGUNG.................................................................................................. 102 10 LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................. 103 5 2 Verzeichnis der Abkürzungen Ab ActA Ag APC AS ATP Antikörper (antibody) actin-assembly-inducing protein Antigen Allophycocyanin Aminosäure Adenosin Triphosphat β2m BHI BirA BSA beta-2-Mikroglobulin brain-heart infusion Medium d-Biotin Ligase bovines Serum Albumin CD Con A CTL clusters of differentiation Concanavalin A zytotoxische T Lymphozyten (cytotoxic T lymphocyte) DC DNA Denditic Cells Desoxyribonukleinsäure EDTA ELISPOT EMA ER Ethylen Diamin Tetraessigsäure Enzyme-linked Immunosorbent Spot assay Ethidium Monoazid Bromid endoplasmatisches Retikulum FACS FCS FITC fMet Fmoc FSC fluoreszenz-aktivierte Zell (cell ) Sortierung fötales Kälberserum (fetal calf serum) Fluorescein Isothiocyanat N-formyl Methionin 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl Vorwärtsstreulicht (forward scatter) HC HKB HKL HLA Schwerekette (heavy chain) hitzeinaktivierte Bacillus subtilis hitzeinaktivierte Listeria mocytogenes human leukocyte antigen IFN IL InlA InlB IPTG Interferon Interleukin Internalin A Internalin B Isopropyl-D-Thiogalactopyranosid kDa kilo Dalton LB Luria Bertoni Medium 6 LLO L.m. LPS Listeriolysin O Listeria monocytogenes Lipopolysaccharid M m µ mAb MHC min Mpl molar milli (10-3) mikro (10-6) monoklonaler Antikörper (monoclonal antibody) major histocompatibility complex Minuten Metalloprotease NK Natürliche Killer-(Zelle) OD optische Dichte p60 PBS PCR PE perCP PI PI-PLC PMT murine Hydrolase Phosphat Puffer (phosphate-buffered saline) Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction) R-Phycoerythrin Peridinin Chlorophyll Protein Propidiumjodid (propidium iodide) Phosphatidyl-Inositol-spezifische Phospholipase C photomultiplier tube RNA rpm Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) Umdrehungen pro Minute SA SB SDS-PAGE Streptavidin FACS-Färbepuffer (staining buffer) sodium dodecyl sulfatate polyacrylamide gel electrophoresis TAP TCR TCM TEM TH T H0 T H1 T H2 transporter associated with antigen processing T-Zell-Rezeptor (T cell receptor) zentrale Gedächtnis-T-Zelle (central memory T-cell) Effektor-Gedächtnis-T-Zelle (effector momory T-cell) T Helfer-(Zelle) T Helfer-(Zelle) Typ 0 T Helfer-(Zelle) Typ 1 T Helfer-(Zelle) Typ 2 U Einheiten (units) Vβ V beta Segment des T-Zell-Rezeptors 7 3 Einleitung und Hintergrund Es wird generell angenommen, dass antigen-reaktive CD4+ T-Zellen wichtige Funktionen bei der Entwicklung schützender Immunreaktionen übernehmen, obwohl viele der genauen Zusammenhänge bisher nicht bekannt sind. Erreger-spezifische Immunität kann z.B. gegen wiederholte Infektionen desselben Pathogens schützen und ist wesentliche Grundlage für die Wirksamkeit von Impfstoffen. Kenntnisse über die Bildung CD4+ T-Helferzellen für diese zentralen Immunfunktionen sind möglicherweise bedeutend für die Entwicklung verbesserter Impfstoffe und neuer Therapieansätze bei akuten und chronischen Infektionserkrankungen. Mit dieser Arbeit wurde im experimentellen Infektionsmodell der murinen Listeriose eine genaue Charakterisierung der CD4+ T-Zellantwort gegen intrazelluläre Bakterien vorgenommen. Dazu wurde ein experimentelles System etabliert, das die direkte ex vivo Analyse antigen-spezifischer T-Helfer Zellen (T helper cell, TH) im direkten Vergleich zu CD8+ T-Zellen möglich macht. Hauptaufgabe der TH-Zellen ist es, die Antikörperbildung durch B-Zellen anzuregen und wahrzunehmen. modulatorische Funktionen CD8+ können T-Zellen auf spezifische dagegen T-Zellantworten infizierte Zellen mittels unterschiedlicher Mechanismen direkt abtöten, deshalb werden diese T-Zellen vielfach als zytotoxische T-Zellen bezeichnet (Killerzellen, cytotoxic T cell, CTL). In den vergangenen Jahren wurde das Wissen um CD8+ T-Zellen durch die Entwicklung neuer Untersuchungstechniken revolutioniert [1-3], demgegenüber weiß man über TH-Zellen vergleichsweise wenig. Hieraus ergeben sich folgende spezielle Fragestellungen für die vorliegende Arbeit: 1. Wie unterscheiden sich antigen-spezifische TH- und CD8+ T-Zellantworten in vivo? 2. Lassen sich hieraus möglicherweise spezifische Funktionen von TH-Zellen bei der Ausbildung und Erhaltung schützender Immunität ableiten? 3. Welche Einflüsse üben TH-Zellen und CD8+ T-Zellen untereinander während einer Infektion aus? 8 4. Ist es möglich, die Technik der Multimer-Technologie auf T-Helfer Zellen zu übertragen? Als experimentelle Ansätze zur Untersuchung antigen-spezifischer T-Zellen wurden zwei Möglichkeiten getestet. Zum einem die Charakterisierung über funktionsunabhängige Untersuchungsmethoden (z.B. T-Zell-Rezeptorfärbungen mittels MHC Multimeren), zum anderen funktionsabhängige Untersuchungsmethoden (z.B. Detektion der Zytokinproduktion von antigen-spezifischen T-Zellen). Zur weiteren Charakterisierung von antigen-spezifischen T-Zellen wurden vielfarbendurchflusszytometrische Analyseprotokolle etabliert. 3.1 Aufbau des Immunsystem Das Immunssystem ist ein komplexer Verbund von Molekülen und Zellen, die in ihrem Zusammenspiel in der Lage sind, Krankheitserreger zu bekämpfen. Prinzipiell lassen sich zwei funktionelle Untereinheiten unterscheiden, das angeborene (innate) und das erworbene (adaptive) Immunsystem [4]. Das angeborene Immunsystem stellt die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger dar. Dazu gehören das Komplementsystem, anti-mikrobielle Enzymsysteme und Moleküle (Defensine), sowie Entzündungsmediatoren wie Interferone und/oder Interleukine. Zellulär können Granulozyten, Monozyten, Makrophagen und natürliche Killer Zellen als Komponenten des innaten Immunsystems Pathogene angreifen. Gelingt es Krankheitserregern, dieses erste Verteidigungssystem zu überwinden, so wird das adaptive Immunsystem auf den Plan gerufen [4]. Bei der adaptiven oder erworbenen Immunität werden die Immunreaktionen hochspezifisch gegen definierte Erregermoleküle (so genannte Antigene) ausgebildet. B-Zellen, der humorale Anteil der adaptiven Immunität, bilden nach Antigenerkennung Antikörper und können so Krankheitserreger in den Extrazellulärräumen und im Blut erreichen, worauf auch viele Immunisierungsstrategien aufbauen [5]. Wenn sich jedoch Erreger (Parasiten, Bakterien oder Viren) innerhalb von Zellen verstecken, sind sie durch Antikörper nicht mehr aufzuspüren. Allerdings werden Anteile der Erreger auf der Oberfläche intrazellulär infizierter Zellen durch MHC (major histocombatibility complex antigen, MHC) Moleküle „gezeigt“ 9 (präsentiert). Diese werden durch T-Zellen (zellulärer Anteil der adaptiven Immunität), erkannt. So können z.B. CD8+ T-Zellen spezifisch auf Krankheitserreger reagieren und infizierte Zellen zerstören [6, 7]. Spezifische Zellen der erworbenen Immunität werden durch genetische Veränderungen auf Einzelzellebene und verschiedene in vivo Selektionsvorgänge individuell gebildet (Neuordnung von Gensequenzen1 und Hypermutationen), wodurch die Entwicklung speziell auf den Erreger ausgerichteter Immunreaktionen möglich wird. Ein besonderes Charakteristikum des adaptiven Immunsystems ist dazu in bestimmten Fällen, das spezifische Erkennungsmuster in Erinnerung behalten zu können und somit ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen, was bedeutend für die Entwicklung protektiver Immunität ist [8]. Hierbei werden bestimmte langlebige B- und T-Zellen nach erstem Antigenkontakt gebildet, die bei wiederholtem Antigenkontakt schneller und effizienter reagieren können. 3.2 T-Zellrezeptor zur Antigenerkennung und die Korezeptoren CD4/CD8 Die eigentliche Antigen-Spezifität ist definiert durch den T-Zellrezeptor (T Cell Receptor – TCR). Jede T-Zelle trägt etwa 100.000 TCRs auf ihrer Oberfläche, wobei jeder Rezeptor aus zwei verschiedenen Polypeptidketten besteht. Die TCR-α-Kette und die TCR-β-Kette sind durch eine Disulfidbrücke zu einer heterodimeren Struktur verbunden (Abbildung 1) und für die Antigenerkennung durch die meisten T-Zellen verantwortlich [4]. Abbildung 1 Vereinfachte Struktur des T-Zell-Rezeptors 1 Rearrangement 10 Eine kleine Gruppe von T-Zellen (etwa 1%) trägt statt des α/β− TCR einen γ/δTCR. Diese T-Zellen werden auch als γ/δ-T-Zellen bezeichnet. Die Funktion von γ/δT-Zellen innerhalb der Immunantwort ist noch nicht vollständig geklärt2 [9]. Während der T-Zellreifung im Thymus werden zunächst unterschiedliche βKetten und ein Prä-T-Zell-Rezeptor gebildet, welcher permanent auf Funktionalität getestet wird. Zu diesen entstandenen funktionellen β-Ketten werden dann nacheinander verschiedene α-Ketten produziert und mit ein und derselben β-Kette als Partner getestet, ob sie den körpereigenen MHC erkennen [10]. Diese Selektion ist erst beendet, wenn der Rezeptor schwache Wechselwirkungen mit einem bestimmten Selbst-MHC Molekül eingehen kann, und hierdurch Überlebenssignale erhält, die zur „positiven Selektion“ führen und mit der Emigration aus dem Thymus in die Peripherie oder dem Zelltod endet [11-13]. T-Zellen mit Rezeptoren die keine Wechselwirkung mit Selbst-MHC Molekülen eingehen können sterben ab („Neglect“). T-Zellen mit starker Affinität für Selbst-MHC Moleküle, also potentiell autoreaktive TZellen, werden ebenfalls durch Zelltod (Apoptose) eliminiert („negative Selektion“). Durch unterschiedlichste Kombinationen der Loci für die β- und α-Ketten wird eine enorme Vielfalt an T-Zell-Rezeptoren generiert. Jeder dieser so generierten TCR ist spezifisch für ein im Kontext von MHC präsentiertes Antigen (MHC-Restriktion) [4], wobei eine direkte Vorhersage welche TCR Sequenz spezifisch für ein Antigen ist zurzeit noch nicht möglich ist [14]. T-Zellen werden nach dieser Selektion im Thymus als reife T-Zellen in die Zirkulation zwischen Blut und lymphatischem System entlassen. Hier zirkulieren sie als naive T-Zellen bis zu einem eventuellen Antigenkontakt. Erst durch Antigenkontakt werden naive T-Zellen zu Effektor T-Zellen aktiviert und können an einer adaptiven Immunreaktion teilnehmen. So können wenige T-Zellen aus dem naiven Repertoire hochspezifisch auf das jeweilige Antigen reagieren und klonal expandieren, wodurch eine effektive Effektor-Antwort sowie die Generierung von Gedächtniszellen möglich wird. 2 Im Rahmen dieser Arbeit wurden nur Untersuchungen an α/β-T-Zellen durchgeführt, so dass bei der Begriffsverwendung „T-Zellen“ immer α/β-T-Zellen zu verstehen sind. 11 In der Gruppe der T-Zellen werden im Wesentlichen zwei Hauptgruppen unterschieden – CD8+ T-Zellen und CD4+ T-Helferzellen. CD8+ T-Zellen exprimieren an ihrer Oberfläche den Korezeptor CD8 (Differenzierungskluster3) – und werden deshalb auch als CD8+ T-Zellen bezeichnet. TH-Zellen exprimieren den Korezeptor CD4 – und tragen so auch den Namen CD4+ T-Zellen. CD4 und CD8 sind Korezeptoren, welche während der Antigenerkennung strukturell durch Bindung und funktionell durch Signaltransduktion mit dem T-Zell-Rezeptor kooperieren. Gemeinsames Merkmal von CD8+ und CD4+ T-Zellen ist, dass beide einen TCR (T-Zell-Rezepor) besitzen und damit Strukturen der Erreger auf der Oberfläche infizierter Zellen erkennen können. Eine prozentuale Verteilung der T-Zellen im Blut ist in Abbildung 2 dargestellt. + + Abbildung 2 Prozentuale Verteilung von CD4 , CD8 und γ:δ-T-Zellen 3.3 Antigen-Präsentation und MHC-Restriktion Zur Präsentation von Antigen an T-Zellen werden Peptidfragmente des pathogenen Proteins durch spezielle Glykoproteine, die MHCs, an die Oberfläche der infizierten Zelle gebracht. MHC-Moleküle wurden durch ihre starke Wirkung auf die Immunantwort bei allogen-transplantiertem Gewebe entdeckt und sind, wie sich zeigte, durch eine große Gruppe von Genen kodiert. Anhand von Tierexperimenten bei Transplantationsuntersuchungen wurde festgestellt, dass bei genetisch nicht identischen Tieren Transplantate abgestoßen wurden. Dafür wurden die MHC verantwortlich gemacht. In den 50er Jahren gelang es, auch beim Menschen die entsprechenden Strukturen zu entdecken. Da im humanen System nach Transplantationen Antikörper gegen humane Leukozyten technisch am einfachsten dargestellt werden konnten, wurden die so definierten MHC-Antigene als „humane 3 Differenzierungskluster (cluster of differentation – CD) 12 Leukozyten – Antigene“ (HLA) bezeichnet, obwohl man mittlerweile weiß, dass sie auf nahezu allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden [15]. Die zentrale immunologische Bedeutung von MHC-Molekülen wurde jedoch erst durch spätere Untersuchungen bekannt. Der erste Beweis, dass T-Zellen die MHC-Moleküle selbst erkennen, stammt aus Untersuchungen von virus-spezifischen CD8+ T-Zellen, für die Peter Doherty und Rolf Zinkernagel 1996 den Nobel-Preis für Medizin erhielten [11]. Die Präsentation von Peptidfragmenten intrazellulärer Bakterien und Viren infizierter Zellen ist in der Regel ein Nachteil für den Erreger, weshalb viele Pathogene Strategien entwickelt haben, der Erkennung über MHC Moleküle zu entkommen. Zwei Mechanismen machen es den Krankheitserregern allerdings schwer, sich der Immunreaktion des Körpers zu entziehen. Zum einem ist der MHC polygen, d.h. es gibt mehrere MHC Gene (Abbildung 3) - wodurch unterschiedliche Peptidbindungsspezifitäten in jedem Individium vorhanden sind. Zum anderen ist der MHC extrem polymorph – es gibt für jedes Gen mehrere Allele. Die Kombination an MHC Allelen eines Individuums wird als „MHC Haplotyp“ bezeichnet [4]. Diese beiden Eigenschaften des MHC führen dazu, dass ein so breites individual-spezifisches Spektrum von Peptiden gebunden und somit präsentiert werden kann, die ein einzelner Erreger in ihrer Gesamtheit nur selten blockieren kann. Für die Untersuchung antigen-spezifischer Immunreaktionen bereiteten aber gerade diese polygenen und polymorphen Eigenschaften des MHC große technische Probleme. Um diese Probleme für experimentelle immunologische Untersuchungen zu überwinden, werden Tierversuche bevorzugt in Inzuchtstämmen durchgeführt, bei denen alle Tiere den gleichen MHC-Haplotyp aufweisen. Auf Basis der hohen genetischen und physiologischen Übereinstimmung mit dem Menschen und vieler praktischer Vorzüge bezüglich Zucht, Größe und Verfügbarkeit von Untersuchungsreagenzien sind insbesondere Mausmodelle in der Immunologie sehr weit verbreitet. Beim Menschen4 befindet sich der HLA-kodierende Locus auf Chromosom 6 und bei der Maus5 auf Chromosom 17. Zum besseren Verständnis der in dieser 4 Im humanen System nicht MHC, sondern human leukocyte antigens - HLA. 5 In der Maus wird nicht MHC, sondern Histocompatibility Locus H-2. 13 Arbeit verwendeten Nomenklatur, ist in Abbildung 3 die genetische Organisation des MHC-Komplexes der Maus vereinfacht dargestellt6. Abbildung 3 Vereinfachte Genomische Organisation des MHC in der Maus MHC Als Beispiel seien an dieser Stelle BALB/c- und C57BL/6-Mäuse zu nennen. Die weiße BALB/c-Maus (H-2d) hat den Haplotyp d und demzufolge die MHC-Moleküle H2Dd, H-2Ld, H-2Kd, I-Ad und I-Ed. Die schwarze C57BL/6-Maus (H-2b) hat den Haplotyp b und demzufolge die MHC-Moleküle H-2Db, H-2Kb und I-Ab. H-2Lb und I-Eb kommen auf Grund eines Defekts der α-Kette dieser beiden MHC-Moleküle in der C57BL/6-Maus nicht vor. MHC-Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer schweren Kette (α-Kette) von 44 kDa und der leichten Kette von 12 kDa, dem β2-Mikroglobulin [16]. Die α-Kette ist ein Transmembranprotein mit den drei Domänen α1, α2 und α3 (jeweils etwa 90 Aminosäuren - AS), sowie einem transmembranen (25 AS) und einem intrazellulären Anteil (30 AS). Die α1- und α2-Domäne bilden die Bindungsgrube zur Peptidpräsentation (Abbildung 4A). Neben den „klassischen“ MHC-I-Molekülen (sogenannte MHC-Klasse-IaMoleküle) gibt es weitere Gene, die mit hoher Homologie zu MHC-Klasse-IaMolekülen kodieren, die zum Teil mit β2-Mikroglobulin assoziiert und wenig polymorph sind. Man bezeichnet diese „nicht-klassischen“ MHC-Moleküle als MHCKlasse-Ib. Im Gegensatz zu den MHC-Klasse-I-Molekülen, deren α-Ketten alle mit der gleichen leichten Kette eine Bindung eingehen, zeichnen sich MHC-Klasse-IIMoleküle durch jeweils zwei „schwere“ Ketten, der α-Kette mit 33 – 35 kDa und der β-Kette mit 26 – 28 kDa aus. Beide Ketten bestehen aus je zwei extrazellulären 6 d d z.B. beschreibt H2-K das d-Allel des Klasse-I K-Gens oder I-A das d-Allel des Klasse II I-A-Gens 14 Domänen von je 90 – 100 AS (bezeichnet als α1, α2 und β1, β2), an die sich jeweils ein transmembraner Teil von 20 – 25 AS und ein intrazellulärer Teil von 8 – 15 AS anschließen (Abbildung 4B). Abbildung 4 MHC Moleküle (4a) MHC-Klasse-I-Molekül mit den drei Domänen α1, α2 und α3 assoziiert mit β2-Mikroglobulin. (4b) MHC-Klasse-II-Molekül bestehend aus zwei Domänen (α1, α2 und β1, β2). Bei beiden Abbildungen ist im oberen Teil die Bindungsgrube (aus [4]) aus Sicht von oben gezeigt. Im Gegensatz zu den konservierten α2- und β2-Domänen sind die α1- und β1Domänen hochpolymorph und bilden die Peptid-Bindungsgrube [17-19]. In der Bindungsgrube sind, sowohl im MHC-Klasse-I- als auch im Klasse-II-Molekül, bestimmte Bindungsmotive hoch konserviert. Diese Bindungspositionen (BindungsAnker), befinden sich bei MHC-Klasse-I-Molekülen an beiden Enden der Bindungsgrube und deshalb haben die meisten Peptide, die durch MHC-Klasse-I präsentiert werden, einen hydrophoben (oder manchmal basischen) Verankerungsrest am Carboxylende [20, 21]. So können zahlreiche Peptide mit passender Länge und den richtigen Verankerungsresten an das entsprechende MHC-Klasse-I-Molekül binden (die übrige Peptidsequenz ist meist unerheblich). Dies führt dazu, dass ein einzelnes MHC Molekül ein breites Spektrum verschiedener Peptide binden kann. Bei der Präsentation über das MHC-Klasse-II-Molekül dagegen sind die Bindungsankerstellen über die gesamte Länge des Peptides verteilt. Bedingt dadurch, dass die Bindungsgrube zu beiden Seiten offen ist, gibt es keine klare Längenbegrenzung für Peptide, die an MHC-Klasse-II binden. MHC-Klasse-I-Moleküle werden auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert, wogegen MHC-Klasse-II-Moleküle nur auf professionellen antigen-präsentierenden Zellen (Dendritische Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Thymusepithelzellen) gefunden 15 werden. Der Grad an Expresssion von MHC-Klasse-I- und -Klasse-II-Molekülen kann z.B. durch Zytokine, die während einer Infektion freigesetzt werden (z.B. IFN-γ), reguliert werden [22, 23]. CD8+ T-Zellen erkennen mit ihrem TCR Epitope, die zumeist von Viren bzw. intrazellulären Bakterien stammen. CD4+ T-Zellen erkennen Epitope, die insbesondere für die Erkennung von extrazellulär angebotenen Proteinen (z.B. von Bakterien) von Bedeutung sind. Eine Konsequenz dieser Antigen-Erkennung ist, dass eine T-Zelle, die spezifisch für ein bestimmtes Epitop ist, dieses Epitop nur dann erkennt, wenn es an eine bestimmte allelische Variante eines MHC-Moleküls gebunden ist; es werden keine andere Assoziationen von Peptid und MHC-Molekülen werden erkannt (MHC Restriktion). 3.4 Antigen-Prozessierung und -Erkennung durch antigen-spezifische TZellen Zellvermittelte Reaktionen basieren auf einer direkten Wechselwirkung zwischen T-Zellen und antigen-präsentierenden Zellen, die das von den T-Zellen erkannte Antigen tragen. Diese Antigene können zum einen von intrazellulären Bakterien oder Viren stammen (Replikation innerhalb der Zelle), zum anderen aber auch von Pathogenen oder deren Produkten, welche durch Endozytose aus der extrazellulären Flüssigkeit aufgenommen wurden (Abbildung 5). Intrazelluläre Proteine werden zunächst über große multikatalytische Proteasen (Proteasomen) in Fragmente zerlegt, welche nach Translokation über einen speziellen Transporter (transporter associated with antigen presentation – TAP) in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums gelangen, um von dort mittels Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle auf die Zelloberfläche zu gelangen [7]. Exogene Antigene können entweder über spezielle Oberflächen-Rezeptoren oder über Pinozytose in endosomale Vesikel eingeschleust werden. Diese Vesikel bilden sich aus Teilen der internalisierten Zellmembran. Im sauren pH-Milieu der Endosomen werden aufgenommene Mikroorganismen bzw. internalisierte Proteine durch Proteasen, z.B. Kathepsine [24] in 10 bis 20 AS große Peptide verdaut. Die Endosomen verschmelzen dann mit Vesikeln, welche neu synthetisierte MHCKlasse-II-Moleküle enthalten. Diese wurden im endoplasmatischen Retikulum 16 synthetisiert, wo durch Anlagerung einer invarianten Kette die Bindung von intrazellulären Peptiden bzw. partiell gefalteten Proteinen verhindert wird. Die invariante Kette dirigiert dazu das Ausschleusen von MHC-II-Molekülen durch den Golgi-Apparat. Die zunächst vorhandene „Schutzkette“ in der Bindungsgrube wird schrittweise abgespalten und das in der Bindungsgrube verbleibende Peptid (classII-associated invariant-chain peptide, CLIP) gegen ein entsprechendes Antigenfragment (Epitop) ausgetauscht. Diese werden dann als MHC-PeptidKomplexe auf die Zelloberfläche transportiert (Abbildung 5) [6]. Abbildung 5 Antigenprozessierung und Erkennung durch Listerien-spezifische T-Zellen Die MHC-Moleküle werden durch die Peptidbindung stabilisiert; „leere“ MHCMoleküle (d.h. auch ohne CLIP) können nur kurze Zeit auf der Zellmembran existieren. Peptide, die nicht an MHC-Moleküle binden konnten, werden in Lysosomen vollständig degradiert. Die Antigenerkennung der MHC Moleküle mit den dazugehörigen Peptiden ist das erste Signal zur Aktivierung (+) von TH-Zellen (MHC-Klasse-II) bzw. CD8+ TZellen (MHC-Klasse-I). Neben den klassischen Präsentationswegen kann es auch zu einer so genannten Kreuzpräsentation (Cross-Presentation) kommen, bei der bestimmte exogene Proteine auch in den endogenen MHC-Klasse-I-Weg eingeschleust werden 17 [25, 26]. Ferner sind für MHC-Klasse-Ib-Moleküle weitere alternative Präsentationswege bekannt, die denen für MHC-Klasse-II-Moleküle ähnlich sind. Bei Mäusen kann eines dieser MHC-Klasse-Ib-Moleküle (H2-M3) Peptide mit Nformylierten Aminoenden präsentieren. Das ist interessant, weil alle Bakterien ihre Proteinsynthese mit N-Formyl-Methionin beginnen. Zellen, welche H2-M3 beladene Moleküle tragen, können durch CD8+ T-Zellen, die diesen Komplex erkennen, ebenfalls abgetötet werden. Leider konnte bisher noch kein Homolog für H2-M3 im Humansystem gefunden werden. 3.5 Effektorfunktionen von Antigen-spezifischen CD8+ und CD4+ T- Zellen Werden naive CD8+ T-Zellen durch Kontakt mit Antigen im Kontext von MHC- Klasse-I aktiviert, so differenzieren sie zu CTLs und können die infizierten, ErregerEpitop-präsentierenden Zellen, durch zytotoxische Effektormoleküle wie Perforin, Granzyme und Fas-Ligand abtöten, oder durch Freisetzung von spezifischen Proteinen (z.B. Granulysin) [27] oder durch Sezernierung von Zytokinen wie z.B. INFγ und TNF (Abbildung 6, [28]) den Erreger direkt attackieren oder andere Immunzellen stimulieren. Es sind verschiedene Situationen bekannt, bei denen CD8+ T-Zellen Virus-infizierte Zellen des Organismus nicht direkt abtöten [29], sondern über andere Effektormechanismen die Virusreplikation negativ beeinflussen. + Abbildung 6 Effektorfunktionen von CD8 T-Zellen. Die Initiierung der Zell-Lyse wird als "Todestoß" (lethal hit) bezeichnet [30]. Minuten nach der Bindung von CTL mit der Zielzelle bewegen sich Golgi und Granula der T-Zelle an die Kontaktstelle. Die Granula werden freigesetzt und die Perforine und Granzyme aus den Vesikeln entlassen. Die Perforine polymerisieren und bilden 18 als Polyperforine einen ähnlichen Komplex wie bei der Komplement-Lyse. Durch diese "Röhre" treten Ionen und Wasser in die Zelle, was eine osmotische Lyse zur Folge haben kann. Über diese Poren können auch andere Proteine Apoptose induzieren, z.B. können Granzyme in die Zielzelle gelangen. Daneben können auch andere Signale Apoptose induzieren, wie z.B. durch Stimulation über den „CD95 (Fas) pathway“. Das transmembrane Glycoprotein CD95 (Fas) ist ein Schlüsselelement in der Apoptose. Wenn CD95 von einem TNF-ähnlichen Protein (CD95L; Fas-Ligand), dem Killerfaktor, ligiert wird, kann es zur Einleitung der Selbstzerstörung der Zelle kommen. Stimulierte CTLs besitzen auf Ihrer Oberfläche viele CD95L (FAS-Ligand)-Proteine und können so FAS-exprimierende Zellen abtöten. Auch die Produktion von IFN-γ bzw. TNF-α durch antigen-spezifische CD8+ T-Zellen kann unter bestimmten Bedingungen den Zelltod der infizierten Zelle zur Folge haben [4]. Werden CD4+ T-Zellen durch Kontakt mit Antigen im Kontext mit MHC-KlasseII aktiviert, so liegt ihre Hauptfunktion darin, die Antikörperbildung von B-Zellen oder die Effektor-Funktion von CD8+ T-Zellen zu kontrollieren [31]. TH-Zellen können zu verschiedenartigen Effektor-Zellen differenzieren, die sich insbesondere auf Grund ihrer verschiedenen Zytokinsekretionen in TH0, TH1 und TH2 T-Zellen unterscheiden [32]. TH0 sind naive bzw. schwach aktivierte CD4+ T-Zellen, welche noch nicht in andere TH Untergruppen eingeteilt werden können. Für die Differenzierung sind sowohl Art und Menge des Antigens als auch Zytokine, die von den antigenpräsentierenden Zellen während der Präsentation gebildet werden entscheidend. Wird durch antigen-präsentierende Zellen während der Präsentation IL-12 und/oder IL-18 sezerniert, werden vorrangig TH1 Zellen gebildet, welche vor allem IFN-γ und TNF-α sezernieren. Dies sind wichtige Zytokine, die z.B. über MakrophagenAktivierung vor allem das Abtöten von intrazellulären Erregern unterstützen können [33]. In Gegenwart von IL-4 erfolgt während der Antigenpräsentation vorrangig die Differenzierung in TH2 Zellen, welche vor allem IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 sezernieren. Dies kann primär B-Zellen zur Produktion von Antikörpern aktivieren (Abbildung 7). 19 Abbildung 7 Effektorfunktionen von T-Helfer-ZellenTH1. Zellen exprimieren den CD40- und/oder den FAS-Liganden. Sie sezernieren INF-γ und andere Zytokine und sorgen so für den Zelltod (meist Makrophagen). TH2 Zellen binden ebenfalls über CD40-Ligand an B-Zellen und sezernieren die B-ZellWachstumsfaktoren IL-4 und IL-5, was B-Zellen zur Antikörper-Produktion anregt. 3.6 Ex vivo Analyse antigen-spezifischer Immunreaktionen Die Untersuchung natürlicher antigen-spezifischer T-Helfer-Zell-Antworten unter in vivo Bedingungen ist durch den Mangel an entsprechenden Untersuchungstechniken limitiert. Die ersten ex vivo Experimente mit antigen-spezifischen T-Zellen wurden durch adoptiven Transfer von T-Zellen TCR-transgener Mäuse möglich [34, 35]. Bei der Verwendung von TCR transgenen Systemen erfolgt die Identifizierung CD4+ und CD8+ T-Zellen anhand der Expression eines definierten TCR, dessen Peptid/MHC Spezifität bekannt ist. In der Regel werden nach adoptivem Transfer die uniform antigen-spezifischen Zellen mit Hilfe von weiteren Markern von den endogenen TZellpopulationen unterschieden [34, 35]. Transgene Mausmodelle, wie zum Beispiel in der DO11.107-, OT-I8-, und OT-II9-Maus haben allerdings den Nachteil, dass sie nur einen einzigen identischen TCR besitzen und so nur eine Subpopulation natürlicher antigen-spezifischer T-Zellpopulationen repräsentiert. Ergebnisse dieser 7 d C.Cg-Tg(DO11.10) (H-2I-A ) mit spezifischem TCR für die Peptidsequenz ISQAVHAA HAEINEAGR des Modellepitopes Ovalbumin (ova323-339) 8 b C57BL/6-Tg(TcraTcrb) ist H-2K restringiert mit spezifischem TCR für die Peptidsequenz SIINFEKL des Modellepitopes Ovalbumin (ova257-264) 9 b C57BL/6-Tg(TcraTcrb) wie DO11.10, aber H-2 restringiert 20 Untersuchungsansätze können somit nicht immer mit der Immunantwort normaler polyklonaler antigen-spezifischer T-Zellen gleichgesetzt werden, welche häufig durch ein hohes Maß an TCR Polyklonalität und funktionelle Heterogenität charakterisiert sind [36-40]. In den vergangenen Jahren wurden deshalb bessere Techniken zur Untersuchung antigen-spezifischer T-Zell Antworten ex vivo entwickelt, die erlauben, antigen-spezifische T-Zellen auch in ihrer Polyklonalität zu erfassen. Als experimentelle Ansätze dienen im Wesentlichen zwei Möglichkeiten: 1. Charakterisierung über funktionsabhängige Assays, wie zum Beispiel der Detektion der Zytokinproduktion von antigen-spezifischen T-Zellen 2. Charakterisierung über funktionsunabhängige Assays, wie zum Beispiel über T-Zell-Rezeptorfärbungen mittels MHC Multimeren. 3.6.1 Funktionsabhängige Detektion 3.6.1.1 ELISPOT und intrazelluläre Zytokinfärbung Beide Detektionsmöglichkeiten stellen sogenannte funktionelle Assays dar und erfassen somit nur antigen-spezifische Zellen, welche nach Antigenstimulation mit einer definierten Effektorfunktion reagieren. Zellpopulationen, welche für die gewählte funktionelle Detektionsmethode inaktiv sind, können hiermit nicht erfasst werden. Durch intrazelluläre Zytokinfärbung und ELISPOT-Assays können antigen- spezifische T-Zellen direkt ex vivo über ihre Zytokinsekretion nachgewiesen werden. Beim ELISPOT Assay können nach kurzzeitiger Antigen- bzw. Epitop-Stimulation in vitro spezifische T-Zellen auf Basis der induzierten Zytokinproduktion erkannt werden. Hierzu wird ein mit spezifischen Antikörpern gegen entsprechende Zytokine beschichtetes Trägermaterial verwendet. Zytokine, welche durch eine Zelle nach kurzer Antigenstimulation sezerniert werden, binden an diese Antiköper und so kann mit einer Sekundärfärbung der vorhergehende Ort der zytokinproduzierenden Zellen (Punkte) bestimmt werden [41]. Bei der intrazellulären Zytokinfärbung werden nach Isolation aus den betreffenden Organen die T-Zellen in vitro mit Peptid stimuliert. Durch Zerstörung des Golgi-Apparates verbleiben die gebildeten Zytokine innerhalb der Zelle und können so direkt intrazellulär nachgewiesen werden. In Kombination mit verschiedenen Oberflächenmarkern können so wichtige Informationen über die 21 Funktion der T-Zellen generiert werden [42]. Nachteil dieser Methoden ist aber, dass die antigen-spezifischen Zellen nicht weiter charakterisiert werden können, da die Zellen bei diesen Untersuchungen abgetötet werden. 3.6.1.2 Affinitäts-Matrix „cytokine capture assay“ Bei dieser Detektionsmöglichkeit werden sezernierte Zytokine detektiert, welche nach Antigenstimulation an einer künstlichen Affinitäts-Matrix an der Zelloberfläche binden [43]. Diese Matrix wird durch einen bispezifischen Antikörper erzeugt, welcher zum einem an der Zelloberfläche an (z.B. CD45) bindet, zum anderem spezifisch für unterschiedliche Zytokine sein kann. Die so gebundenen Zytokine können nun in einem weiteren Färbeschritt mit einem fluoreszenzmarkierten Antiköper detektiert werden. Im Gegensatz zu 3.6.1.1 werden die Zellen hierbei nicht abgetötet und können somit für weitere Untersuchungen verwendet werden. Nachteil dieser Methode ist allerdings, dass ein relativ starkes unspezifisches Hintergrundsignal erzeugt werden kann, welches von gebundenen Zytokinen von Zellen aus unmittelbarer Umgebung stammen könnte. Weiterhin können auch funktionelle Beeinträchtigungen durch die künstliche Affinitäts-Matrix geschaffen werden. 3.6.2 Funktionsunabhängige Detektion 3.6.2.1 Oligoklonale antigen-spezifische T-Zellpopulationen Einige antigen-spezifische T-Zellen desselben TCR-Vβ Gensegmentes können nach Antigenkontakt selektiv expandieren und so zu starker Oligoklonalität führen. In solchen Fällen kann die Färbung auf bestimmte TCR-Segmente (z.B. TCRVβ-Segment) als eine Art „antigen-spezifischer“ Marker verwendet werden. Bei dieser Untersuchungsmethode ist allerdings zu beachten, dass die markierten T-Zell Populationen nicht alle antigen-spezifischen T-Zellen erfassen müssen und häufig Mischpopulationen mit nicht antigen-spezifischen T-Zellen aus dem natürlichen TCRVβ-Repertoire darstellen [44]. Dies ist insbesondere bei sehr kleinen Populationsgrößen problematisch. Dazu kommt, dass die meisten natürlichen antigen-spezifischen Immunantworten polyklonal und damit für diesen Ansatz nicht zugänglich sind. 22 3.6.2.2 MHC-Multimere Durch den T-Zell-Rezeptor wird die Antigen-Spezifität einer T-Zelle bestimmt. In der Regel werden durch Peptid-Präsentation verschiedene T-Zell-Klone aktiviert, welche alle das gleiche präsentierte Epitop erkennen, sich jedoch in der Struktur ihres TCR unterscheiden (komplexe epitop-spezifische T-Zell Populationen). Die daraus resultierende Vielfalt (Polyklonalität) macht die direkte Darstellung (z.B. über TCR-Vβ Gensegmente) schwierig. Zur direkten Identifizierung/Selektion wäre es daher am günstigsten, den MHC-Peptid-Komplex selber zur Erkennung MHC epitopspezifischer T-Zellen zu nutzen. Dagegen spricht jedoch eine geringe Affinität (insbesondere eine schnelle Dissoziation) zum TCR. Durch Multimerisierung kann die relative Avidität der MHC-TCR-Interaktion jedoch soweit angehoben werden, dass solche Reagenzien zur direkten Identifizierung/Selektion von antigen-spezifischen TZellen verwendet werden können (MHC-Tetramer-Technologie, Abbildung 8, [3, 44]). Abbildung 8 MHC-Klasse-I-Tetramer Die Selektion antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen mittels MHC-Tetrameren kann aber auch Probleme bereiteten, da es durch temperaturabhängige Stimulation bzw. Bindung von Tetrameren an den TCR zu funktionellen Veränderungen kommen kann, wie z.B. Internalisierung, Aktivierung, Überstimulation bis hin zum Zelltod [4548]. Durch Generierung von so genannten MHC-Streptameren konnten diese Probleme durch ablösbare Multimer-Reagenzien gelöst werden [48]. Auf dem Gebiet von MHC-Klasse-I hat diese Technik zu einer Revolution innerhalb der ex vivo Analyse von zytotoxischen T-Zellen geführt und ist mittlerweile bestens etabliert. Versuche diese Methoden direkt auf MHC-Klasse-II-Komplexe für 23 ex vivo Untersuchungen zu übertragen waren bisher wenig erfolgreich, jedoch gibt es in ersten Studien humane virus-spezifische CD4+ Gedächtszellen, welche direkt ex vivo durch MHC-Klasse-II-Tetramere detektiert werden können [49]. Erste Versuche zur Etablierung der MHC-Klasse-II-Tetramertechnologie wurden in bakteriellen Expressionssystemen durchgeführt. Aufgrund der höheren Komplexität der Molekülstruktur erfolgt hier aber oftmals eine nicht korrekte Faltung, so dass nur eine sehr geringe Effizienz der in vitro Rückfaltung erreicht werden konnte [50]. Höhere Mengen an MHC-Klasse-II-Molekülen konnten im Insektenzellsystem generiert werden (z.B. für Strukturanalysen, [51, 52]). Besonders hilfreich war hierbei, durch direkte kovalente Bindung des Peptides/Epitopes an die β-Kette (über einen flexiblen Linker), die Komplexe noch während der in vivo Expression zu stabilisieren. Eine Übertragung dieses Ansatzes auf die Herstellung von Reagenzien zur Darstellung von T-Zellen könnte jedoch problematisch sein, da der Linker zu Interferenzen bei der Interaktion zum TCR führen könnte. Über die Fusion der α- und β-Kette mit C-terminalen Stabilisierungssequenzen (Leucin-reiche „Zipper“) konnte sogar die Expression von leeren MHC-Klasse-II-Molekülen erreicht werden [51, 53, 54]. Mit der Technik der in vitro Biotinylierung können die hergestellten MHC-Klasse-II-Moleküle über Streptavidin multimerisiert werden [55]. Färbungen durch MHC-Klasse-II-Tetramere konnten zunächst bei Linien und Klonen [56] und seit kurzer Zeit auch in einigen wenigen Beispielen im humanen System direkt ex vivo erreicht werden [53, 55, 57, 58]. 3.6.3 Durchflusszytometrie Bis auf den ELISPOT-Assay (3.6.1.1) beruhen alle vorab beschriebenen Detektionsmöglichkeiten auf der Analyse von physikalischen und molekularen Eigenschaften von Partikeln in einem Flüssigkeitsstrom – der Durchflusszytometrie. Die hierbei detektierten optischen Eigenschaften werden in zwei Kategorien unterteilt: das Streulicht und die Fluoreszenz. Beim Streulicht handelt es sich um eine Lichtbrechung in Richtung des Laserstrahls (Forward-Scatter, FSC), sowie in eine Brechung orthogonal auf die Richtung des Laserstrahls und auf die Richtung des Flüssigkeitsstroms (Side-Scatter, SSC). Die Vorwärtsstreuung wird über Photodioden gemessen und gibt Auskunft über die Zellgröße, während das Seitwärtsstreulicht 24 über Lichtdetektoren (photomultiplier tubes, PMT) aufgenommen wird und Aussagen über die Granularität und Membranfaltung möglich macht. Bei der zweiten optischen Eigenschaft, der Fluoreszenz, handelt es sich um die Lichtenergie, welche nach Strahlungsabsorption durch ein Fluorochrom in Form von Emission wieder freigesetzt wird. Diese Emission wird von den PMTs gemessen und ist aufgrund des Stokes- Shift immer etwas langwelliger und energieärmer als die Absorptionsenergie. Da sowohl die Absorption als auch die Emission substanzspezifische Spektren aufweisen, kann durch die Wahl verschiedener Fluorochrome mit ähnlichem Absorptionsspektrum - aber unterschiedlichen Emissionsspektren, mit einer einzigen Lichtquelle gearbeitet werden. Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Grundlage ist die spezifische Erkennung von Antigenen, z.B. mittels einer AntigenAntikörper-Reaktion mittels Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern. Zur Analyse werden die Zellen einer Einzelzellsuspension durch hydrodynamische Fokussierung wie an einer Perlenkette an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet. Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen Laserstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben. Nach dem Laserpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie (in Form von Photonen) auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die emittierte Photonenkonzentration, die durch einen Photodetektor registriert wird, verhält sich proportional zur Menge an gebundenen Antikörpern je Zelle. Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und -streuung Informationen über die Zellgröße und die Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas, Größe des Zellkerns usw.) der Zellen gewonnen. Eine gleichzeitige FACS-Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen Wellenlänge anregen lassen aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff charakteristische, Emissionsspektren verfügen. Aufgrund der Fluoreszenzanregung des Farbstoffs emittiert jede Zelle ein Lichtsignal proportional zur stöchiometrisch gebundenen Fluorochrommenge, welches in einem PMT verstärkt und in ein elektrisches Signal umgewandelt wird. Die so gewonnenen Daten werden in Form 25 von Histogrammen und Zweiparameterdarstellungen (Dotplots) visualisiert und abgespeichert. 3.7 Experimentelles System der murinen Listeriose Ein geeignetes Modell, um antigen-spezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen zu untersuchen, ist die Infektion mit dem Gram+, fakultativ intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes (L.m.). Dieses Bakterium wurde erstmals 1925 aus einem Gerbil-Affen in Südafrika isoliert, welcher an akuten Leber- und Milznekrosen verstorben war („Tiger River Disease“) [59]. In Gedenken an Lord Josef Lister wurde es zunächst Listerella hepatolytica genannt. Etwa zur gleichen Zeit wurde in England aus Kaninchen, die durch septische Krankheitszeichen mit einer charakteristischen Monozytose auffielen, das Bacterium monocytogenes isoliert [60]. Später stellte sich heraus, dass beide Erreger identisch sind und die neue Bezeichung Listeria monocytogenes (L.m.) wurde festgelegt. Die Infektion mit diesem Bakterium induziert besonders starke CD8+ T-Zellantworten und vermittelt lang schützende Immunität, aber auch CD4+ T-Zellen scheinen wichtige Funktionen zur Qualität und Langlebigkeit Listerien-spezifischer Immunität beizutragen. Nach i.v. Infektion mit einer sublethalen Dosis von L.m. sind BALB/c- als auch C57BL/6-Mausstämme in der Regel in der Lage, die Infektion gut zu kontrollieren. Im Modell der murinen Listeriose besteht nach überstandener Erstinfektion mit L.m. eine spezifische protektive Immunität, welche sehr effektiv und langlebig ist [61]. Auch Infektionsdosen von 10 x LD50 (für naive BALB/c-Mäuse) werden praktisch ohne Krankheitsentwicklung toleriert. Verschiedene Säugetier-Organismen können durch L.m. infiziert werden. Beim Menschen spielt L.m. insbesondere eine Rolle bei Neugeborenen, Schwangeren und immunsupprimierten Patienten [62]. Typische Symptome sind Sepsis und Hirnhautentzündung (Meningitis). Bei gesunden Menschen wird nach Infektion der Erreger schnell beseitigt und nur selten kommt es zu meist nur sehr milden Krankheitszeichen. L.m. wird in der Normalflora vieler Säugetiere, Vögel und Fische gefunden. Der natürliche Übertragungsweg verläuft oral, meist über kontaminierte Lebensmittel (z.B. kontaminierte Fleisch oder Milchprodukte). Besondere epidemiologische Bedeutung kommt hierbei der hohen Widerstandsfähigkeit von 26 L.m. gegenüber Hitze, Gefrieren und Trocken, sowie der Fähigkeit, bei niedrigen Temperaturen wachsen zu können, zu. Im Labor wird L.m. in nährstoffreichen Medium (z.B. „brain heart infusion - BHI“) kultiviert und teilt sich bei 37 °C etwa alle 30-35 min. Als ein fakultativ intrazelluläres Bakterium kann L.m. auch außerhalb einer infizierten Wirtszelle überleben. Allerdings scheint in vivo die intrazelluläre Lokalisation von besonderem Vorteil für L.m. zu sein, da sie sich somit der Wirkung früher und Antikörper-vermittelter Immunantworten zu entziehen. Phagozytierende Zellen (z.B. Makrophagen) können L.m. aufnehmen [63]. Da diese Zellen allerdings in der Lage sind, Bakterien direkt abzutöten und weitere Anteile des Immunsystems zu aktivieren, ist die Infektion nicht-phagozytierender Zellen von besonderer Bedeutung für das verlängerte Vorhandensein der Bakterien im Wirtsorganismus [64, 65]. Um sich nach Aufnahme dem phagolysosomalem Kompartiment entziehen zu können, bedarf es der Expression des Poren-bildenen Proteins Listeriolysin O (LLO) [66, 67]. Hierdurch gelangt L.m. direkt in das Zytosol infizierter Zellen, in denen es sich durch polarisiertes Aktin aktiv fortbewegen kann [68-71]. Durch fingerförmiges Vorschieben in benachbarte Zellen kann L.m. durch Aufbrechen der in diesem Fall doppelten Membran (hierzu ist die Expression von LLO [72], einer Metalloprotease (Mpl) und der aktivierten Phosphatidyl-Inositol-spezifischen Phospholipase C (PIPLC) notwendig [73, 74]), benachbarte Zellen infizieren, ohne jemals die geschützte intrazelluläre Lokalisation verlassen zu müssen. Weiterhin zeigten Untersuchungen von Listerien-spezifischen CD8+ T-Zellen, dass manche dieser Zellen scheinbar MHC unabhängig sind. Nachfolgende Untersuchungen konnten aufzeigen, dass es sich dabei nicht um einen "MHCunabhängigen" Mechanismus handelt, sondern um L.m.-Peptide, die durch das MHC-Klasse-Ib-Molekül H2-M3 an CD8+ T-Zellen präsentiert werden. H2-M3 ist ein hoch-konserviertes MHC-Ib Molekül, das von den meisten Labormäusen in identischer Form exprimiert wird. Antikörper-vermittelte Mechanismen spielen für Immunantworten auf eine Infektion mit Listeria monocytogenes keine wichtige Rolle [61, 75, 76], Immunantworten werden hauptsächlich durch spezifische T-Zellen vermittelt [77]. Zahlreiche Listerien-spezifische Epitope, welche während der Infektion über T-Zellen 27 erkannt werden, wurden bisher identifiziert; die meisten hierbei für Mäuse mit H-2dMHC-Allelen. Abbildung 9 Zellbiologie einer Listerien-Infektion Aufgrund der besonderen experimentellen Vorteile des bakteriellen Infektionssystems konnten über die letzten Jahre die Effizienz bzw. Kinetik der Antigenprozessierung und –präsentation sowie die Stabilitäten der Bindung zu H2-Kd Molekülen auf der Oberfläche von Listerien-infizierten Zellen bestimmt werden. Die Beobachtung, dass manche Epitope zu einer deutlichen Immunantwort führen, wohingegen auf andere nur eine sehr schwache Reaktion erfolgt, wird durch die Begriffe "Immundominanz" und "Subdominanz" beschrieben. 3.8 CD4+ TH-Zellen und CD8+ T-Zellen während Listerien-Infektion Am Infektionsmodell der murinen Listeriose konnte erstmals die zelluläre Basis der adaptiven Immunität gezeigt werden [61]. So scheinen CD8+ T-Zellen die Hauptaufgabe bei der Vermittlung langanhaltender, protektiver Immunität zu tragen [78]. Weitere Untersuchungen in adaptiven Transferexperimenten von CD4+ und CD8+ T-Zellen zeigten aber, dass auch CD4+ T-Zellen protektive Immunität vermitteln können [79, 80]. Bei den CD8+ T-Zellen spielen ebenfalls - in Abhängigkeit vom Mausstamm die über H2-M3 MHC-Klasse-Ib restringierten T-Zell Antworten eine wichtige Rolle [81, 82] und können protektive Immunität vermitteln. 28 Es zeigte sich aber auch, dass nur nach einer Infektion mit lebenden Listerien protektive Immunität induziert wurde. So konnte beispielsweise durch eine Immunisierung mit Hitze-inaktivierten Listerien (HKL) keine Protektion erreicht werden [83]. Eine mögliche Erklärung ist, dass HKL nicht in das Zytosol von Makrophagen bzw. DCs gelangen können, was eine unzureichende AntigenPräsentation zur Folge hat. Makrophagen scheinen das Hauptreservoir für lebende Listerien zu sein. Allerdings sind Makrophagen keine „optimalen“ antigenpräsentierenden Zellen, obwohl sie sowohl MHC-Klasse-I- als auch –Klasse-II antigen-spezifische Listerien-Epitope präsentieren können. Dendritische Zellen scheinen die essentielle Zellpopulation zu repräsentieren, die ein „Priming“ von CD8+ T-Zellen während einer Infektion mit Listeria monocytogenes möglich machen. Dies konnte durch transiente ex vivo Depletion von CD11c+ Zellen gezeigt werden [84]. Da Dendritische Zellen (DC) allerdings nur schlecht mit Listerien infizierbar sind, ist es möglich, dass der Hauptanteil an Listerien-Antigenen durch so genannte „Kreuzpräsentation“ (Cross-Presentation) an Dendritische Zellen weitergeleitet wird, um so CD4+ und CD8+ T-Zellen zu aktivieren [25, 26]. Die Expansion MHC-Klasse-Iarestringierter CD8+ T-Zellen während einer Wiederholungsinfektion mit L.m. scheint hingegen unabhängig von DC-vermittelter Antigen-Präsentation ablaufen zu können. Über MHC-Klasse-Ib-(H2-M3)-restringierte CD8+ T-Zellen benötigen allerdings unbedingt die Antigen-Präsentation über DC [85]. Für die Effektivität der AntigenPräsentation scheint eine Abhängigkeit vorhanden zu sein, woher das präsentierte bakterielle Protein stammt ([86], sezerniert bzw. nicht sezerniert). Überraschenderweise hat die Dauer von Infektion und Antigen-Präsentation allerdings kaum Einfluss auf die Kinetik von antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen während einer Infektion mit L.m [87]. Einige Untersuchungen vermuten, dass antigen-spezifische CD4+ T-Zellen mehr Zeit für die Aktivierung nach AntigenExposition, im Vergleich zu CD8+ T-Zellen, benötigen [87]. Auch konnte kürzlich gezeigt werden, dass nach erfolgter Immunisierung und sehr schnell darauf folgender Reimmunisierung beide antigen-spezifischen T-Zell Kompartimente in vitro nicht in der Lage sind, sofort wieder ihre vollen Effektorfunktionen auszuüben. Ob dies in vivo ebenso der Fall ist, kann zur Zeit nicht ausgeschlossen werden [88]. 29 Bei Abwesenheit von CD4+ T-Zellen verläuft zwar die primäre CD8+ T-Zell Antwort normal, die Generierung von CD8+ Gedächtnis-Zellen nach Infektion ist aber beeinträchtigt [89, 90]. So ist in einer Wiederholungsinfektion mit L.m. kaum protektive Immunität zu registrieren [91]. CD4+ T-Zellen scheinen also eine wichtige Rolle innerhalb der initialen Prägung von CD8+ T-Zellen zu spielen [91, 92] und für die Generierung von CD8+ Gedächtnis T-Zellen verantwortlich zu sein [93]. CD8+ Gedächtnis T-Zellen stellen allerdings keine phenotypisch homogene Zellpopulation dar, sondern setzen sich aus verschiedenen Subpopulationen zusammen [94-96]. Dies konnte z.B. durch die Expression des Differenzierungsmarker CCR7 oder CD127 (α-Kette des IL-7 Rezeptors) gezeigt werden [97]. Wie CD4+ T-Zell-Hilfe für Gedächtnis-T-Zell-Generierung funktioniert, ist im Detail zurzeit noch unklar. Es wird vermutet, dass T-Zell Hilfe über ein komplexes Netzwerk kostimulatorischer Moleküle auf antigen-präsentierenden Zellen und TZellen vermittelt wird. Hierbei scheinen insbesondere Moleküle der TNF/TNFRezeptor Familie eine wichtige Rolle zu spielen (CD40, CD40L, Ox40, 4-1BB) [98100]. So hat z.B. die CD40 – CD40/Ligand Interaktion einen starken Einfluss auf CD8+ T-Zell „Priming“ nach einer Infektion mit L.m.. Die Abwesenheit von CD4+ T-Zell Hilfe oder CD40-vermittelter Signale vermindert die Generierung von CD8+ Effektor- Gedächtnis T-Zellen [97]. Genauso kommt es in Mäusen, denen der CD137-Ligand (Bindungsligand für 4-1BB – CD137) fehlt, zu einer verminderten Aktivierung von CD8+ T-Zellen [89]. Im Gegensatz zum positiven Einfluss von konventionellen CD4+ T-Zellen auf CD8+ Gedächtnis T-Zellen sind aber auch Daten bekannt, dass eine andere Subpopulation von CD4+ T-Zellen, so genannte natürliche regulatorische CD4+ TZellen, die Aktivierung von CD8+ T-Zellen nach Infektion mit L.m. supprimieren können. So konnte gezeigt werden, dass eine Depletion von CD4+CD25+ T-Zellen die CD8+ Gedächtnis T-Zell Antwort erhöht [101]. CD62L (L-Selektin) wird zur Differenzierung von naiven (TH0-Zellen) gegenüber aktivierten CD4+ oder CD8+ T-Zellen verwendet, da CD62L nach Aktivierung der TZelle an der Zelloberfläche herunterreguliert wird. Über die Verminderung von CD62L an der Zelloberfläche wird es den T-Zellen ermöglicht, das lymphatische System zu 30 verlassen. So werden naive T-Zellen definiert als CD4+CD62L+ bzw. CD8+CD62L+. Demgegenüber stehen aktivierte T-Zellen als CD4+CD62L- bzw. CD8+CD62L- [102]. Ein weiterer T-Zell Aktivierungsmarker ist CD44 (pgp-1), welcher wie CD62L die (Zellzirkulation) Migration reguliert. CD44 erlaubt die Bindung von T-Zellen an Hyaluronsäure und somit den Eintritt von T-Zellen in verschiedenste Gewebearten. Im Gegensatz zu CD62L ist die Expression von CD44 nach Aktivierung der T-Zellen hochreguliert. Antigen-spezifische Gedächtnis T-Zellen stellen keine homogene Population dar, sondern werden in zentrale Gedächtnis T-Zellen (central memory T-cells, TCM) und periphere Effektor Gedächtnis T-Zellen (effector memory T-cells, TEM) unterschieden [103]. Beim Menschen können diese beiden Subpopulationen von Gedächtnis T-Zellen durch die CCR7- und CD45RA-Expression unterschieden werden [103]. Im murinen Modellsystem kann diese Diskriminierung durch eine Kombination der Oberflächenmarker CD127 (α-Kette des IL-7 Rezeptor) und CD62L erfolgen. So werden TCM definiert als CD127+CD62L+ und TEM als CD127+CD62L- [97]. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass das experimentelle Modell der murinen Listeriose besonders geeignet ist für die Untersuchung von Mechanismen, die zur Ausbildung effektiver T-Zell vermittelter Immunität führen. Die zahlreichen Vorarbeiten bzgl. Epitop-Identifizierungen und Untersuchungen zur in vivo AntigenPräsentation waren notwendige Grundlage für die genaue Analyse antigenspezifischer T-Zell Antworten. 31 4 Material und Methoden 4.1 Listeria monocytogenes Stämme Für Experimente mit Wildtyp-Listerien wurden das hochvirulente Isolat L.m. 10403s (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) und der rekombinante Stamm L.m.-Ova, der das Modellantigen Ovalbumin sezerniert (Hao Shen, Philadelphia, USA), verwendet. Zum Erhalt optimaler Virulenz wurden die rekombinanten L.m.-Ova zunächst dreimal über Mausinfektionen passagiert, bevor Aliquots der Kultur für die weiteren Infektionsexperimente bei –80°C eingefroren wurden. 4.2 Infektion von Mäusen mit Listeria monocytogenes Zur Infektion wurden 10 ml BHI Medium mit 10 µl L.m. 10403s bzw. L.m.-Ova (direkt aus bei -80°C gelagerten Stocks) geimpft und ca. 5 Stunden bei 37°C im Inkubator bis zu einer von OD600 0,05 - 0,1 geschüttelt. Zur Dosiskontrolle wurden Proben der Ansätze auf BHI-Platten ausplattiert, bei 37°C inkubiert und nach 24 h ausgezählt. 4.2.1 Infektion von C57BL/6- und C57BL/10-Mäusen Für Primärinfektionen wurde 6 - 8 Wochen alten naiven C57BL/6- oder C57BL/10-Mäusen (Harlan, Blackthorn, United Kingdom) eine sublethale Dosis von 3x103 L.m. Ova (ca. 0.15 x LD50) in 200 µl PBS direkt in die Schwanzvene injiziert. Reimmunisierungen wurden i.d.R. 5 Wochen nach der Primärinfektion mit 2x105 L.m. Ova (ca. 10 x LD50) i.v. durchgeführt. 4.2.2 Infektion von BALB/c-, CB6- und B10.D2-H2d-Mäusen Unter Berücksichtigung der höheren Empfindlichkeit gegenüber L.m. wurde die Infektion mit deutlich reduzierter Dosis als bei C57BL/6- und C57BL/10-Mäusen durchgeführt. Für Primärinfektionen wurde 6-8 Wochen alten naiven BALB/c-, CB6bzw. B10.D2-H2d-Mäusen (Harlan, Blackthorn, United Kingdom) eine subletale Dosis von 2 x 103 L.m. 10403s bzw. L.m.-Ova (in 200 µl PBS, entspricht ca. 0.1 x LD50) direkt in die Schwanzvene injiziert. Reimmunisierungen erfolgten i.d.R. 5 Wochen 32 nach Primärinfektion unter Gabe von 1 x 105 L.m. 10403s bzw. L.m.-Ova ( ca. 5 x LD50 ) i.v.. 4.2.3 Hitzeinaktivierung von Bakterien 4.2.3.1 Hitzeinaktivierte Listerien Zur Stimulation mit hitzeinaktivierten Listerien (heat killed Listeria, HKL) wurden 10 ml BHI-Medium mit 50 µl aus Stock L.m. 10403s inokuliert und ca. 4,5 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert bis zu einer OD600 von 0,25. Danach wurden die Bakterien abzentrifungiert (3500 rpm, 15 min., 4°C), zweimal mit 5 ml PBS gewaschen und das Pellet in 1 ml PBS aufgenommen und 1h bei 65°C im Wasserbad inkubiert. Abschließend wurden 10 Aliquots zu je 100 µl abgefüllt (Lagerung bei -20°C). 10 µl Proben der HKL wurden auf die Effizienz der Abtötung durch erneutes Ausplattieren auf BHI-Platten und Inkubation für mind. 24h bei 37°C getestet. 4.2.3.2 Bacillus subtilis Zur Stimulation mit B. subtilis wurde von BHI-Platten Kolonien in 22 ml BHI inokuliert und bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Nach ca. 4 h bei 37°C wurde eine OD600 von 0,3 erreicht und für weitere Experimente 5 Stock`s angelegt (BHI/20% Glyzerol). Der verbleibende Rest wurde bei 3.000 rpm, 20 min. zentrifugiert und zweimal mit 15 ml kaltem PBS gewaschen. Danach wurde das Pellet in 1,4 ml PBS aufgenommen (Kryo-Tube) und 1 h bei 65 °C im Wasserbad inkubiert (wobei das Tube komplett unter Wasser gebracht wird). Abschließend wurden 14 Aliquots zu je 100 µl abgefüllt (Lagerung bei -20°C). Proben der B.subtilis wurden auf die Effizienz der Abtötung durch erneutes Ausplattieren auf BHI-Platten und Inkubation für mind. 24 h bei 37°C getestet. 4.3 Organentnahme und Zellpräparation Am gewählten Tag nach Primärinfektion bzw. nach Reimmunisierung wurden die infizierten Mäuse getötet und Milzen mit sterilem Präparationsbesteck entnommen und in 5ml RP10+ (= RPMI 1640 Medium [Life Technologies, Gaithersburg MD] mit 10% FCS, L-Glutamin, HEPES [pH 7.5], β-Mercaptoethanol, 33 Penicillin [100 U/ml], Streptomycin [100 µg/ml) und Gentamicin [50µg/ml]) gegeben und 2 x in 5 ml RP10+ gewaschen. Danach wurden die Zellen über ein Stahlnetz homogenisiert und die Erythrozyten über 5 ml NH4CL-Tris lysiert (0.17 M NH4Cl, 0.3 M Tris pH 7.5, 7 min bei RT) lysiert. Zum Stoppen der Reaktion wurden weitere 5 ml RP10+ zugegeben und die Milzzellen pelletiert (1500 rpm, 7 min, RT). Anschließend wurde das Pellet in 10 ml RP10+ aufgenommen, über ein Nylonnetz filtriert und die Zellen über eine Neubauerkammer ausgezählt. Je nach Versuchsansatz wurden mindestens 2 x 106 Zellen pro Färbeansatz oder 1 x 107 Zellen je Stimulation verwendet. Bei den vergleichenden Experimenten aus unterschiedlichen Organen wurden zusätzlich das Knochenmark, peripheres Blut, die intestinalen und peripheren Lymphknoten, die Leber, die Lunge und der Darm mit sterilem Präparationsbesteck entnommen. Dabei wurden Isolierungsprotokolle aus „Current Protocols in Immunology“ verwendet [104]. 4.4 MHC-Klasse-I-Multimer Reagenzien Nach bereits gut etablierten Protokollen wurden die Proteine H2-Kd, H2-Kb, H2- M3 (jeweils ohne Transmembranregion und ohne intrazelluläre Domäne, aber mit Biotinilierungssequenz am C-terminalen Ende) und Maus β2m rekombinant in E.coli exprimiert, aufgereinigt und in vitro zu MHC-I Molekülen gefaltet. 4.4.1 Proteinexpression und Aufreinigung Expressionsvektoren für H2-Kd H2-Kb, H2-M3 und Maus β2m in pET 3a bzw. pET 27b standen bereits im Labor zur Verfügung. Nach Transformation in BL21(DE3) E. coli (Novagen) erfolgte die Expression der Proteine in 6L Kulturen (LB, 0,4% Glukose, Carbenicillin 100 µg/ml). Hierzu wurde bei Erreichen einer optischen Dichte (OD600) von 0,7 –1,0 durch Zugabe von 0,4 mM IPTG 3 h die Expression induziert. Die Aufreinigung der unlöslichen, rekombinant exprimierten Proteine (inclusion bodies) wurde mittels mechanischer und enzymatischer Lyse (Lysozym, Ultraschall, Triton X-100, Einfrieren und Auftauen) im Rahmen der Laborroutine durchgeführt. Die damit erzielte Reinheit lag in der Regel bei > 85 %. 34 4.4.2 in vitro Faltung von MHC-I-Molekülen Die Schwere Kette- und mβ2m- „inclusion bodies“ wurden in 8 M Harnstoff dissoziiert und nachfolgend in einem L-Arginin-reichen Faltungspuffer mit hohen Konzentrationen der synthetischen Epitope (12 µg/200 ml) verdünnt. Hierzu wurden Aliquots der schweren Kette und murines β2-m in 8 h Abständen unter starkem Vortexen direkt in die Lösung injiziert und über insgesamt 48 h unter permanentem Rühren bei 10°C inkubiert. Dem Faltungspuffer wurde zusätzlich ein GluthathionRedoxsystem zugegeben, um die optimale Ausbildung von Disulfidbrücken zu unterstützen. Die für diese Studie verwendeten Peptide waren: LLO91-99 (GYKDGNEYI), Ova257-264 (SIINFEKL), p60217-225 (KYGVSVQDI) und f-MIGWII (fMIGWII(A)) (alle Affina, Berlin). 4.4.3 Biotinylierung und Multimerisierung Zur Biotinylierung der korrekt gefalteten MHC Moleküle wurde der Faltungspuffer gegen einen niedrig salzhaltigen Puffer ausgetauscht (20 mM TrisHCl), und das Volumen auf 1 ml konzentriert (Amicon-Konzentrator/Membran mit MWCO von 10kD). Durch Zugabe des Enzyms „Biotin Ligase“ (AVIDITY/Colorado oder eigene Herstellung, auch „BirA“ genannt, 15 µg/[mg MHC Komplexe]), ATP (10 mM), und d-Biotin (80 µM) kann das Lysin innerhalb der Biotinylierungssequenz am C-terminalen Ende spezifisch biotinyliert werden (über Nacht bei Raumtemperatur). Nachfolgend wurden die löslichen MHC-I Moleküle mittels Gelfiltration (Superdex 200HR, Pharmacia) über ein FPLC System (FPLC Basic, Pharmacia) aufgereinigt. Hierdurch wird gleichzeitig ungebundenes Biotin entfernt, welches die wurde der Multimerisierungsreaktion stören würde. Zur Bestimmung der Effizienz der Biotinylierungsreaktion Streptavidin-Shift Assay angewendet: Inkubiert man biotinylierte MHC-Komplexe (ca. 20 µg) mit Avidin (50 µg, 2 h bei 4°C) und trägt die Proben anschließend zusammen mit einer nicht-Avidin-behandelten Kontrolle und ohne Kochen unter nichtreduzierenden Bedingungen auf ein 10% SDS-PAGE Gel auf, so entsteht durch die Avidin-Bindung ein Shift der HC-Bande auf ein höheres Molekulargewicht. Verbleibt HC bei seiner ursprünglichen Größe, ist es nicht biotiniliert. 35 Anschließend erfolgte die schrittweise Zugabe von fluoreszenz-markierten SA (Molecular Probes) in einem molaren Verhältnis von 5:1 SA zu biotinylierten MHC Molekülen. Die schrittweise Zugabe des SA sollte bewirken, dass die MHC-Moleküle immer im Überschuss vorhanden sind, und alle 4 Bindungsstellen des zugegebenen SA abgesättigt werden. Dies soll die Ausbildung von Mono-, Di- und Trimeren verhindern. Überschüssige MHC-Moleküle wurden danach durch Zentrifugation über eine 100-kD-Membran (Millipore) entfernt, und gleichzeitig der Pufferaustausch zu PBS pH 8,0 (+ 2 µl 0,5M NaEDTA, 1 µl 30 % NaN3, 0,5 µl Leupeptin (2 mg/ml) und 0,5 µl Pepstatin (2 mg/ml) pro ml MHC-Molekül-Lösung) durchgeführt. Zusätzlich erfolgte die Zugabe von 1 mM des jeweils eingesetzten Peptides. Die so generierten Tetramere wurden lichtgeschützt bei 4°C aufbewahrt. Detailiertere Informationen über die Herstellung von MHC-Klasse-I-MultimerReagenzien können über die 'Busch lab' Webseite (www.mikrobio.med.tu- muenchen.de) abgefragt werden. 4.5 MHC-Klasse-II-Reagenzien Zur Darstellung der MHC-Klasse-II-Multimere wurde das Schneider-Zell- Expressionssystem verwendet [105]. Hier kann eine korrekte in vitro Faltung auch von „komplizierten“ Proteinstrukturen erfolgen [106]. 4.5.1 Zell-Kulturen und Zell-Linien Nicht-transfizierte Drosophila melanogaster S2 Zellen (Invitrogen, [107]) wurden in Drosophila Medium (Gibco) mit Zusatz von 10% FCS, L-Glutamin, HEPES [pH 7.5], β-Mercaptoethanol, Penicillin [100 U/ml], Streptomycin [100 µg/ml) und Gentamicin [50µg/ml] kultiviert. Zum Erhalt der Zellkulturen wurden diese bei einer Dichte von 6 – 20 x 106 in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:10 alle 5-7 Tage gesplittet. Die Kultivierung erfolgte bei 25°C in T25 Flaschen. Zur Langzeitlagerung wurden die S2 Zellen in DMSO (1 ml je Tube, 1 x 107 Zellen/ml) in flüssigem N2 aufbewahrt. Transfizierte Zellen erhielten als Zusatz zur Selektion, je nach verwendetem Vektor zur Transfektion, G418 (Gibco) oder Blasticidin (Invitrogen). Nach erfolgreichen Transfektionstest wurden die S2-Kulturen an serumfreies SchneiderMedium X-Press (Gibco) adaptiert. Die Expansion von S2 Kulturen wurde durch 36 tägliche Splittung im Verhältnis 1:1 im Rollinkubator (Bellco, USA) in 1-Liter-Flaschen (Millipore) bei 25°C durchgeführt. 4.5.2 Expressionsvektoren Der Expressionssvektor pRmHa3 wurde freundlicherweise von Luc Teyton (Scripps, USA) zur Verfügung gestellt. Der durch CuSo4 induzierbare Expressionsvektor (Induktion über Metall-Thionin-Promoter) [108, 109] stellt ein einfaches System zur stabilen Protein-Expression in Schneider-Zellen dar [110]. Durch den ebenfalls im Expressionsvektor enthaltenen His-Tag kann durch NickelNTA (Ni-NTA) - Beads eine weitere Affinitäts-Aufreinigung erfolgen [111]. Im Anschluss an die Signalsequenz zur Proteinexpression (Drosophila Bip; MKLCILLAVVAFVGLSLG [112]) kann durch die Enzymschnittstellen EcoRI und SalI die jeweilige Sequenz der α- und β-Kette des MHC-Klasse-II-Moleküls durch Standard-Klonierungsmethoden eingefügt werden. Die Sequenz der α-Kette des MHC-Klasse-II-Moleküls enthält zusätzlich einen „Zipper“ (zur späteren Stabilisierung bei der in vitro Faltung, [113]), eine Biotinylierungssequenz (zur späteren in vitro Biotinylierung, [114]) und ein His-Tag zur Proteinaufreinigung, [111]). Die Sequenz der β-Kette des MHC-Klasse-IIMoleküls enthält ebenfalls einen „Zipper“ [113]. Vor der ersten Aminosäure des „reifen“ Moleküls befinden sich nach einem „Linker“ (GSGSGS) die Schnittestellen SacII und BglII, um beliebige Oligo-Nukleotid-Paare über einen doppelten Verdau einfügen zu können. Zur Selektion wurden die Plasmide pCoNeo (freundlicherweise von Luc Teyton, Scripps, USA zur Verfügung gestellt) und pCoBlast (Invitrogen) verwendet. Beide Selektionsvektoren haben eine Größe von ca. 3,9 kb und erlauben durch eine Kotransfektion mit den jeweiligen Expressionsvektoren eine Generierung von stabil exprimierenden S2-Zelllinien. 4.5.3 Transfektion der Konstrukte in Drosophila melanogaster Die generierten Konstrukte wurden durch Dreifach-Transfektion der Plasmide von α- und β- Kette sowie einer Selektionskassette (Neomycin-Kassette (pCoNeo) zur späteren Selektion mit G418 oder Blasticidin-Kassette (pCoBlast) zur Selektion 37 mit Blasticidin) in Schneider-Zellen von Drosophila melanogaster eingebracht. Zur Transfektion wurde eine stabile Calziumphosphat-Transfektion ([115], Kit Invitrogen) oder CellFectin (Gibco) benutzt. Jeweils 4 Wochen nach erfolgter Transfektion wurde durch Induktion von 1 ml transfizierter S2 Zell-Kultur mit Kupfersulfat ein Expressionstest durchgeführt. 4.5.4 Proteinexpressionssystem und Proteinaufreinigung Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 500 – 750 mM CuSo4 (Merck) eingeleitet [110]. Während einer 3-tägigen Induktionszeit und permanenter Expansion der S2-Zellkultur erfolgte die Akkumulation des gewünschten rekombinanten Produktes im Mediumüberstand. Für Tests zur Überprüfung der Tansfektion erfolgte die Induktion eines Kulturvolumens von 2 – 25 ml. Zur Proteindarstellung positiv-transfizierter Ansätze wurde im Durchschnitt bis zu einem Kulturvolumen von 6 - 12 Liter expandiert. Zur Aufreinigung wurde, mittels eines Tangential-Flow-Konzentrators („Centramate“ Pall Filtron), das Volumen auf 250 ml reduziert und im Anschluss daran wurden Ni-NTA Beads (Qiagen) zugegeben. Zur Bindung der Ni-NTA Beads an das His-Tag der α-Kette des MHC-Klasse-II-Moleküls wurde über Nacht bei 4°C eine Überkopfrotation durchgeführt und anschließend durch Affinitätschromatographie [116, 117] über eine FPLC-Anlage das Protein aufgereinigt [111]. Dazu wurde zunächst während des FPLC-Durchlaufes eine Reinigung des an die Ni-NTA Beads gebundenen Proteins mit 10% Durchflussanteil einer 200 mM Lösung Imidazol (in dH2O gelöst; Merck) durchgeführt. Zur Eluation wurde dann ein Konzentrationsgradient von bis 100% 200 mM Imidazol gefahren. Die Fraktionen des eluierten Proteins wurden in 1 ml Schritten aufgefangen und zur weiteren Verwendung über Konzentratoren (Millipore) mit einem molekularen Durchbruch von 10 kD auf ein Endvolumen von 1 ml aufkonzentriert. Die Proteinkonzentration wurde durch die Färbebindungsmethode nach Bradford [118] bestimmt. Zur weiteren Protein-Analyse wurde, unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen, eine SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese durchgeführt. Die Entwicklung erfolgte durch direkte Coomassie Blue Färbung oder durch Western-Analyse nach Elektroblotting auf Nitrozellulosemembranen. 38 4.5.5 Biotinylierung Das in 4.5.4 erhaltene Protein wurde in vitro durch Zugabe von BirA ([55] und 4.4.3) biotinyliert, erneut über FPLC aufgereinigt und die Biotinylierungseffizienz über einen Avidin-Shift-Assay bestimmt (siehe Ergebnisteil Abbildung 32). 4.6 Färbung von T-Zellen 4.6.1 Direkte ex vivo Färbung von Oberflächenmarkern bei T-Zellen Durchflußzytometrische Untersuchungen von direkt ex vivo gewonnenen Zellen wurden nach Standardmethodik unter Verwendung von meist direkt fluoreszenzkonjugierten monoklonalen Antikörpern (mAbs) durchgeführt. Alle Antikörper wurden austitriert und in sättigender Konzentration eingesetzt. Vor der Färbung mit fluoreszenz-konjugierten spezifischen mAbs wurden Zellproben mit Fc-block Reagens (blockierender Antikörper für Fc-Rezeptor [CD32/CD16], BD PharMingen) behandelt, um unspezifische Bindungen zu minimieren. Zur Identifikation von toten Zellen in den Proben wurde entweder Propidiumjodid (PI) (Zugabe von 2 µg/ml direkt vor der Analyse, hierbei dürfen die Zellen nicht fixiert sein) oder Ethidium Monazid (EMA, Molecular Probes) eingesetzt. Die EMA-Färbung [119] wird vor der mAb Färbung durchgeführt: hierbei wurden die Zellen zunächst in Dunkelheit in der Gegenwart von 2µg/ml EMA (EMA-Stock: 2 mg/ml in DMF, Lagerung bei –20°C) auf Eis für 20 min inkubiert und anschließend 2-6 x 106 Zellen je Probe auf eine 96-well Platte verteilt und 10 min dem Licht ausgesetzt (40 W Lampe, ca. 20 cm Abstand). Nach zweimaligem Waschen konnten dann die eigentlichen Oberflächenfärbungen durchgeführt werden. Dazu erfolgte die Färbung 20 min. dunkel auf Eis und abschließend wird, um nicht gebunde AB zu entfernen, 2-3 -mal gewaschen. PI und EMA wurden bei Vielfarben-Untersuchungen über FL-2 gegen FL-3 Dot Plot Darstellung "ausgegatet", um die Wahrscheinlichkeit von kompensationsbedingten Artefakten zu minimieren. Besonderer Vorteil der EMA-Methode ist, dass die Zellen nach Färbung fixiert werden können. Alle Färbe- und Waschschritte wurden in FACSPuffer (PBS pH 7.45, 0.5% BSA, 0.02% NaN3) durchgeführt, alle Fixierungen erfolgten in 1% Paraformaldehyd (PFA). 39 Für den funktionellen Einsatz der Zellen in vitro nach Aufreinigung durch Zellsortierung wurde FACS-Puffer ohne Natriumazid verwendet. 4.6.2 Direkte ex vivo - Färbung von antigen-spezifischen T-Zellen mittels MHC-Tetrameren Milzzellen bzw. periphere Lymphozyten wurden wie oben beschrieben gewonnen (Homogenisierung und Erythrozyten-Lyse: siehe 4.3), dabei wurden die Zellen nach Entnahme kontinuierlich auf Eis gehalten, um in vitro induzierte phänotypische Veränderungen zu vermeiden. Für ex vivo Untersuchungen wurden i.d.R. 6 x 106 Zellen pro Färbeansatz in eine Vertiefung einer 96-well-Platte gegeben und nach Fc-block Behandlung (siehe 4.6.1) 45 min in 50 µl Färbecocktail (MHC Tetramer und mAbs für weitere Zellmarker in sättigender Konzentration in FACSPuffer) bei 4°C inkubiert. Für die kinetischen Untersuchungen wurde eine Dreifachfärbung mit anti-CD62L-FITC (Klon MEL-14, BD PharMingen), PEkonjugiertem Tetramer und anti-CD8α-APC (Klon 53-6.7, BD PharMingen) durchgeführt. Die folgenden MHC-Tetramere wurden aus eigener Herstellung (siehe 4.4) für die Untersuchungen benutzt: H2-Kd/LLO91-99, H2-Kd/p60217-225, H2- Kb/SIINFEKL und H2M3/f-MIGWII. Alle MHC Tetramere wurden regelmäßig mit Hilfe von Zellinien auf ihre Funktionalität hin getestet und genau austitriert. Alle Antikörper/MHC Tetramer-Kombinationen wurden unter Verwendung von geeigneten T Zell-Linien auf mögliche Interferenzen hin getestet. Nach dreimaligem Waschen in FACS-Puffer wurden die Zellen entweder direkt im Durchflußzytometer eingelesen (hier eignete sich die Kombination mit einer PIFärbung) oder aber in 1% PFA/PBS (pH 7.45) fixiert (Lebend/Tot-Diskriminierung in diesem Fall mit EMA durchführbar). 4.6.3 Intrazelluläre Zytokinfärbung Für intrazelluläre Zytokinfärbungen direkt ex vivo wurden jeweils 2 x 107 Milzzellen in eine Vertiefung einer 24-well-Platte gegeben (in 2 ml RP10+). Für epitopspezifische Stimulationen wurde zu den jeweiligen Vertiefungen 1 µM Peptid (gelöst in DMSO) zugegeben, Positivkontrollen wurden mit anti-CD3 (BD, Pharmingen) 40 stimuliert und Negativkontrollen erhielten nur DMSO (Sigma). Hierbei kamen folgende Peptide bzw. Proteine zur Anwendung: • Klasse I: OVA257-264(SIINFEKL), OVA323-339, LLO4-11, LLO91-99, LLO296-304, p60217-225, p60476-484, p60449-457, mpl84-92 • Klasse 1a: f-MIVIL, f-MIGWII, f-MIVTLF • Klasse II: p60301-312, LLO190-201, LLO188-201, LLO253-264, LLO318-329 • Klasse Ib und II: HKL (4.2.3.1) und B. subtilis (4.2.3.2) Alle vorstehenden Peptide wurden durch die Fa. Affina, Berlin gefertigt und als Stock in 1 ml DMSO 1 mM gelöst. Die Peptid-Bibliotheken (Fa. Jerini, Berlin) wurden direkt in einer 96-well-Platte gefertigt und zur Stimulation von 1 x 106 Zellen (Tag 7 nach Primärinfektion) zur Analyse verwendet. Nach 2 Stunden Inkubation im Zellkulturschrank (37°C) wurde allen Ansätzen 2 µl Brefeldin A (GolgiPlug) zugegeben und die Inkubation für weitere 3 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurden die Zellen jedes Ansatzes in 15-ml-Falcon-Tubes transferiert, EMA und Fc-block behandelt (siehe 4.6.1) und dann zunächst auf Oberflächenmarker-Expression gefärbt (in der Regel anti-CD8α-PE- und anti-CD4PerCP-Konjugat). Nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen (Cytofix und Cytoperm, BD PharMingen) wurde jede Probe in 3 Färbeansätze aufgeteilt. Dann wurden nach Standardprotokoll für die Kinetik folgende intrazelluläre Färbungen durchgeführt (20 min bei 4°C): (1) anti-IFN-γ FITC und anti-IL-4 APC (2) anti-TNF-α FITC und anti-IL-4 APC (3) Isotypkontrolle FITC und APC Nach zweimaligen Waschen der Zellen in Saponin-haltigem Puffer (Cytoperm) und einmaligen Waschen in FACS-Puffer wurden die Zellen in 100 µl FACS-Puffer in 1,5 ml FACS Röhrchen transferiert und in einem Gesamtvolumen von 200 µl in 1% PFA fixiert. Das Einlesen am Durchflußzytometer erfolgte innerhalb von 24 Stunden. 4.7 Epitopsuche durch intrazelluläre Zytokinfärbung und Peptidbibliotheken Hierzu wurden H2-Kd oder H2-Db restringierte Epitope in die Suche einbezogen (Vorhersage mittels des SYNPEITHI Algorithmus [120]). Epitope aus folgenden Listerien-spezifischen Proteinen wurden in die Suche einbezogen: LLO, p60, ActA, 41 plcB, plcA und mpl. Peptide mit einem hohen Bindungsindex (>20) wurden für die Generierung der „PepSpot“ Peptid-Bibliothek (Jerini, Berlin) ausgewählt. Insgesamt wurden 90 unterschiedliche Epitopkandidaten und 3 Kontroll-Epitope (LLO91-99, p60217225 und SIINFEKL) in die Untersuchung einbezogen. Die generierten Peptide wurden in DMSO gelöst und für eine in vitro Stimulation von Milzzellen (2 x 106 Zellen je Vertiefung einer 96-well Platte) primär infizierter (Tag 7) und wiederholt infizierter (Tag 5) C57BL/6-Mäuse benutzt. Als Negativkontrolle wurden Milzzellen von Listerien-infizierten BALB/c-Mäusen herangezogen. Die intrazelluläre Zytokinfärbung wurde wie unter 4.6.3 durchgeführt. 4.8 Generierung von epitop-spezifischen T Zell-Linien Epitop-spezifische T-Zellinien wurden durch in vitro Peptid-Restimulation generiert. Hierzu wurde Listerien-infizierten Mäusen 7 Tage nach Primärinfektion Milzen entnommen und wie unter Punkt 4.3 beschrieben gewaschen, lysiert und in einem Volumen von 5 ml in T25 Zellkulturflaschen gegeben. Als Stimulatorzellen wurden syngene Milzzellen verwendet (naive Mäuse), die wie oben beschrieben gewonnen (Homogenisierung und nachfolgende Erythrozyten-Lyse) und dann mit einer Dosis von 2000 rad bestrahlt wurden. Anschließend erfolgte die Peptidbeladung der MHC-Moleküle durch Inkubation der Zellen in Gegenwart des jeweiligen Peptides (10-6 bis 10-12 M) in RP10+ bei 37°C. Danach wurden die Zellen mehrfach gewaschen, um ungebundenes Peptid zu entfernen, und dann 3 x 107 peptid-beladene Stimulatorzellen in 5 ml RP10+ zu jeder Zellkulturflasche mit „Responder“ Zellen gegeben (Gesamtvolumen = 10 ml). Die Zellkulturen wurden wöchentlich mit 3 x 107 Peptid-beladenen Stimulatorzellen restimuliert. Dazu wurden Milzzellen von naiven Mäusen wie unter 4.3 präpariert (Homogenisierung und Erythrozytenlyse) und anschließend mit 25 Gy bestrahlt. Danach erfolgte die Inkubation mit dem jeweiligen Peptidepitop, LLO190-201 in 10-8 M, LLO91-99 in 10-9 M, p60 217-225 in 10-7 M und SIINFEKL in 10-7 M Konzentration, 1 Stunde bei 37°C. Nach dreimaligem Waschen in RP10+ (um freies, ungebundenes Peptid zu entfernen), wurden je 3 x 107 Stimulatorzellen in 5 ml pro Zellkulturflasche zu den Responderzellen gegeben. Alle 7 Tage erfolgte eine weitere Restimulation durch Zugabe von in gleicher Weise generierten Stimulatorzellen. Ab der zweiten in vitro 42 Restimulation wurde das Medium mit Ratten-ConA Überstand (5 % T-Stim, Becton Dickinson; Inaktivierung des ConA durch 5 % α-Mannose) supplementiert. 4.9 Durchflusszytometrische Analyse und Auswertung Beim Einlesen der Daten mit dem FACSCalibur (BD) oder CyAN (DakoCytomation) wurden mindestens 5 x 105 CD4+ bzw. CD8+ T-Zellereignisse aufgenommen; dabei wurden alle detektierbaren Zellereignisse gespeichert. Die Auswertung der Daten erfolgte mit CellQuest (Becton Dickinson), Summit (DakoCytomation) bzw. FlowJo-Software (Treestar). 43 5 Ergebnisse Zunächst galt es, ein Modellsystem zu etablieren, welches die parallele Detektion von antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen ermöglicht. Als Ansatz wurde das Modell der murinen Listeriose gewählt [121]. Zum einem stellt die Maus ein ideales Versuchstier für immunologische Fragestellungen dar [122], zum anderem zeigten erste Studien mit dem Erreger bereits frühzeitig auf, dass gerade für die Untersuchung von zellulären adaptiven Immunantworten die murine Listeriose besonders geeignet ist [61, 123-125]. 5.1 Bekannte immundominante Listerien-Epitope in BALB/c- und C57BL/6Mäusen MHC Peptide Sequenz MHC T-Zell-Antwort Allel Klasse Ia LLO91-99 +++ [126] d ++ [127] d ++ [128] d + [129] d + [130] H2-K KYGVSVQDI H2-K p60476-484 YLVGFGRV H2-K p60449-457 IYVGNGQMI H2-K Mpl84-92 GYLTDNDEI H2-K b VAYGRQVYL H2-K f-MIVIL H2-M3 f-MIGWII f-MIGWII(A) f-MIVTLF p60301-312 Klasse Ib f-MIVIL + [128] + ++ [131] H2-M3 + ++ [132] Primär > Recall Infektion f-MIVTLF H2-M3 + ++ [133] EAAKPAPAPSTN I-A d + +++ [128] b ++ [128] b + [128] NEKYAQAYPNVS I-A LLO253-264 QIYYNVNVNEPT AFDAAVSGKSVS [134] b LLO190-201 LLO318-329 C57BL/6 d p60217-225 LLO296-304 Klasse II GYKDGNEYI Balb/c Referenz I-A I-A Tabelle 1: Bekannte MHC-Klasse-Ia-, Klasse-Ib- und Klasse-II-restringierte, aus Listerien stammende d b T-Zell-Epitope für H2 - und H2 -Allele. Die relative Größe der T-Zell-Antwort gegenüber diesen Epitopen während einer Infektion mit Listerien ist mit den Referenzen für die Quelle in der Literatur angegeben (“+++“ = immundominant, “++“ = intermediär, “+“ = wenig/subdominant). Um Untersuchungen spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zell-Antworten gegen Antigene eines einzelnen Erregers zu ermöglichen, müssen definierte Antigenfragmente (Epitope) und die zugehörigen MHC-Restriktionselemente (MHC) bekannt sein. In den vergangenen Jahren wurden verschiedene von L.m. stammende T-Zell-Epitope in BALB/c- und C57BL/6-Mäusen identifiziert (Tabelle 1). 44 Um antigen-spezifische CD4+ und CD8+ T-Zell-Populationen in direkten Vergleichen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Infektion mit L.m. gut verfolgen zu können, sollten Epitope gewählt werden, gegen die in vivo relativ große T-ZellPopulationen gebildet werden (immundominante T-Zell-Antworten). Bisher konnten allerdings immundominante MHC-Klasse-I-Epitope nur in Mäusen mit H-2d-MHCAllelen (z.B. BALB/c-Mäuse) [135, 136] und im Gegensatz dazu immundominante MHC-Klasse-II-Epitope nur in Mäusen mit H-2b-MHC-Allelen (C57BL/6-Mäuse) identifiziert werden (Tabelle 1). Mit dieser Verteilung immundominanter T-ZellEpitope für das CD4+ bzw. CD8+ T-Zell-Kompartiment fällt es experimentell schwer, eine gleichzeitige Detektion antigen-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen nach Infektion mit Listeria monocytogenes durchzuführen. Auf Basis dieser Recherche stellte sich zunächst die Frage, ob sich möglicherweise weitere bisher nicht identifizierte immundominante T-Zell-Epitope in der BALB/c- bzw. C57BL/6-Maus finden lassen. 5.1.1 Suche nach neuen immundominanten Listerien-spezifischen MHCKlasse-II-restringierten T-Zell-Epitopen Für BALB/c-Mäuse ist das immundominante MHC-Klasse-Ia-restringierte Epitop LLO91-99 bestens beschrieben, dazu sind zwei weitere intermediär dominante H-2KdEpitope (p60217-225 und p60476-484) bekannt (Tabelle 1). Da in der BALB/c-Maus bisher keine immundominanten MHC-Klasse-II-restringierten Epitope identifiziert worden sind, wurde nach einem Lösungsansatz gesucht, um weiteren Aufschluss über eventuell vorhandene, aber noch nicht detektierte H2d-restringierte TH-Zell-Epitope zu erhalten. Hierzu bot sich an, für einen ersten Versuch die Gesamtheit an ListerienProteinen für in vitro Restimulationexperimente von Milzzellen aus primär Listerieninfizierten BALB/c-Mäusen zu verwenden. Antigen-reaktive CD4+ T-Zellen können anschließend durch intrazelluläre Zytokinfärbung z.B auf IFN-γ sichtbar gemacht werden. Da lebende Listerien auf Grund ihrer Toxizität für Lymphozyten [137] nur schwierig für solche Versuchsansätze verwendbar sind, wurden die Bakterien zuvor hitze-inaktiviert (heat killed Listeria monocytogenes, HKL). Es ist bekannt, dass zumindest MHC-Klasse-II-restringierte Epitope unter in vitro Bedigungen effektiv aus hitze-inaktivierten Bakterien generiert und an T-Zellen präsentiert werden können 45 [138, 139]. Problematisch ist möglicherweise, dass hitze-inaktivierte Bakterien eine Vielzahl an immunstimulatorischen Substanzen enthalten, z.B. Liganden für Toll-like Rezeptoren, die auf Immunzellen exprimiert werden (einschließlich CD4+ T-Zellen, [140, 141]); demnach könnte die induzierte Zytokin-Freisetzung von CD4+ T-Zellen nach Restimulation möglicherweise auch durch nicht-TCR-abhängige Signale vermittelt werden. Um sicherzustellen, dass es sich bei in vitro Stimulation mit HKL wirklich um eine Listerien-spezifische T-Zell-Restimulation handelt, wurden deshalb hitzeinaktivierte Bacillus subtilis Bakterien (heat killed Bacillus subtilis, HKB) als Kontrolle herangezogen. Bacillus subtilis ist wie L.m. ein Gram+ Bakterium und sollte ein sehr ähnliches Muster an immunstimmulatorischen Substanzen (z.B. Peptidoglykan, bakterielle DNA) wie Listerien besitzen. Würde nach in vivo Infektion mit L.m. und anschließender in vitro Restimulation eine Zytokin-Antwort CD4+ TZellen auf HKL ähnlich stark ausfallen wie auf HKB, so wäre dies ein Hinweis auf mögliche nicht TCR-abhängige Stimulationseffekte. Als zusätzliche Kontrolle wurden Milzzellen naiver Mäuse mit HKL bzw. HKB stimuliert, um die Abhängigkeit der Zytokin-Antwort CD4+ T-Zellen von der vorangegangenen L.m.-Infektion aufzuzeigen. + Abbildung 10 Zytokin-Produktion CD4 T-Zellen nach Restimulation auf hitzeinaktivierte Listeria monocytogenes (HKL) bzw. hitzeinaktivierte Bacillus subtilis (HKB) in naiven bzw. primärinfizierten + BALB/c-Mäusen. Milzzellen wurden in vitro mit HKL bzw. HKB restimuliert und auf CD4 T-Zellen (yAchse) und ihre IFN-γ Produktion (x-Achse) analysiert. (A) Intrazelluläre Zytokinfärbung einer naiven BALB/c-Maus bzw. (B) einer BALB/c-Maus am Tag 7 nach Primärinfektion. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten; die Prozentzahlen beziehen sich auf T-Zellen der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Diese Daten sind repräsentativ für 2 unabhängige Experimente. 46 Wie in Abbildung 10 gezeigt, lässt sich mit naiven Milzzellen weder bei Restimulation mit HKL noch mit HKB eine Zytokin-Produktion CD4+ T-Zellen nachweisen. Bei vorangegangener Listerien-Infektion reagiert eine klar abgrenzbare Subpopulation CD4+ T-Zellen mit IFN-γ Expression auf Restimulation mit HKL (0,34 % aller CD4+ T-Zellen), im Kontrollexperiment unter Verwendung der gleichen Ausgangszellen lassen sich bei HKB-Restimulation nur wenige zytokin- produzierende CD4+ T-Zellen nachweisen (0,06 % aller CD4+ T-Zellen). Diese Daten zeigen auf, dass sich mit dem gewählten experimentellen Ansatz (in vitro Restimulation mit hitze-inaktivierten Bakterien) in der Tat erreger-spezifische CD4+ TZellen darstellen lassen. Die Kontrollexperimente unter Zuhilfenahme von HKB zeigen, dass es sich hierbei im Wesentlichen um Listerien-spezifische Reaktivität handelt. Der geringe Anteil an zytokin-produzierenden Zellen nach HKB Stimulation könnte Antigene umfassen, die zwischen Listerien und B.s. konserviert sind und gegen die T-Zellen kreuzreagieren. Auf Basis dieser Daten wurde nach Primär (Tag 7)- und Wiederholungsinfektion (Tag 5) mit L.m. und nachfolgender in vitro Restimulation mit HKL eine vergleichende Untersuchung von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Der Zeitpunkt der Wiederholungsinfektion wurde gewählt, da für CD8+ T-Zellen in diesem Modell bekannt ist, dass sich hierdurch die Frequenzen antigen-reaktiver Zellen im Vergleich zur Primärantwort deutlich vergrößern lassen. Wie in Abbildung 11 dargestellt, zeigten die Untersuchungen mit BALB/cMäusen ein ähnliches Bild wie in den Vorversuchen (Abbildung 10). Milzzellen von naiven Mäusen zeigen praktisch keine Zytokinproduktion auf Restimulation mit HKL, wohingegen sich nach vorangegangener Primärinfektion mit L.m. eine zwar sehr kleine, aber dennoch deutlich abgrenzbare CD4+ IFN-γ+ T-Zell-Population darstellen lässt (Abbildung 11, zweite Reihe rechts). Für CD8+ T-Zellen lassen sich durch HKLRestimulation praktisch keine IFN-γ+ Zell-Populationen (Abbildung 11, zweite Reihe links) nachweisen, obwohl zu diesem Zeitpunkt zahlreiche MHC-Klasse-Iarestringierte Listerien-spezifische CD8+ T-Zellen vorhanden sind (z.B. spezifisch für das immundominante Epitop LLO91-99 (Tabelle 1, Abbildung 12 und [126]). Diese Beobachtung zeigt, dass unter Verwendung von hitze-inaktivierten Bakterien MHC47 Klasse-Ia-restringierte Epitope nur unzureichend generiert und präsentiert werden können, um erreger-spezifische CD8+ T-Zellen zu detektieren. Abbildung 11 HKL-spezifische T-Zell-Reaktivität in BALB/c- und C57BL/6-Mäusen nach Listerien+ + Infektion. CD4 bzw. CD8 Milzzellen (y-Achse) aus BALB/c- und C57BL/6-Mäusen wurden nach Stimulation mit HKL am Tag 7 nach Primärinfektion bzw. am Tag 5 nach Wiederholungsinfektion mit Listeria monocytogenes auf ihre IFN-γ Produktion (x-Achse) analysiert. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten; die Prozentzahlen beziehen sich auf T-Zellen der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Diese Daten sind repräsentativ für 2 unabhängige Experimente. Interessanterweise sind nach Wiederholungsinfektion die ohnehin sehr schwachen Listerien-spezifischen CD4+ T-Zell-Antworten in der BALB/c-Maus im Vergleich zur Primärantwort nicht erhöht. C57BL/6-Mäusen, bei denen sich Ein ganz anderes Bild zeigt sich bei sowohl nach Primär- als auch nach Wiederholungsinfektion hohe Frequenzen Listerien-spezifischer CD4+ T-Zellen nachweisen lassen. Dieses Ergebnis korreliert gut mit den bereits bekannten immundominanten I-Ab-restringierten T-Zell-Epitopen in diesem Mausmodell. Allerdings zeigt sich auch in der C57BL/6-Maus, dass die Frequenzen Listerienspezifischer CD4+ T-Zellen bei Wiederholungsinfektion nicht erhöht zu sein scheinen. Im Gegenteil, die gemessen Frequenzen lagen sogar deutlich unter denen am Tag 7 48 nach Primärinfektion (Primärinfektion 1,25%, Wiederholungsinfektion 0,64 %). Zusätzlich fällt in der C57BL/6 Maus auf, dass auch eine relativ große CD8+ T-ZellPopulation auf Restimulation mit HKL IFN-γ produziert. Diese Effektorantwort kann durch die bekannten MHC-Klasse-Ib-restringierten CD8+ T-Zell-Antworten erklärt werden, insbesondere H2-M3-restringierte Listerien-Epitope. Diese können bekannterweise sehr effektiv über einen alternativen Antigen-Präsentationsweg aus hitze-inaktivierten Bakterien generiert und an CD8+ T-Zellen präsentiert werden [131133]. Ganz ähnlich wie für die CD4+ T-Zellen sind die Frequenzen MHC-Klasse-Ibrestringierter CD8+ T-Zellen bei Wiederholungsinfektion nicht erhöht (diese Beobachtung konnte auch mit H2-M3 Tetramer-Untersuchungen, also nicht funktionsabhängigen Untersuchungsmethoden, bestätigt werden, [81]). + Abbildung 12 LLO91-99-spezifische CD8 T-Zellen in BALB/c-Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes. Milzzellen einer BALB/c-Maus wurden am Tag 7 nach primärer Listerien-Infektion auf + CD8 T-Zellen (y-Achse) und LLO91-99-reaktiver T-Zellen (x-Achse) analysiert. Gezeigt werden links die d ungefärbte Kontrolle und rechts die antigen-spezifische H2-K /LLO91-99-Tetramerfärbung. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten; die Prozentzahlen beziehen sich auf T-Zellen der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Diese Daten sind repräsentativ für 2 unabhängige Experimente. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass BALB/c-Mäuse generell durch eine deutlich schwächere CD4+ T-Zell-Antwort bei Listerien-Infektion charakterisiert sind als C57BL/6-Mäuse. Auf Basis dieser Beobachtung ist es unwahrscheinlich, dass sich durch aufwendige Epitop-Mapping-Experimente überhaupt immundominante MHC-Klasse-II-Listerien-Epitope für die BALB/c-Maus identifizieren lassen. Zusätzlich weisen diese Vorversuche auf eine erste Besonderheit von CD4+ T-ZellAntworten hin, da diese nach Wiederholungsinfektion nicht weiter expandiert zu werden scheinen. Der eindrucksvolle Unterschied zwischen BALB/c- und C57BL/6-Mäusen in Hinblick auf Listerien-spezifische T-Zell-Antworten könnte zum einem dadurch erklärt werden, dass für H-2d-MHC-Klasse-II-Allele keine geeigneten Listerien-Epitope 49 vorhanden sind bzw. generiert werden können, oder zum anderem könnten genetische Faktoren außerhalb des mhc-Locus diesen immunologischen Phänotyp bedingen. Um diesen Hypothesen nachzugehen, wurde ein kongener Mausstamm, die B10.D2-H2d-Maus, herangezogen. B10.D2-H2d-Mäuse tragen den mhc-Locus der BALB/c-Maus (H-2d-MHC-Moleküle), entsprechen aber sonst im Wesentlichen einer C57BL/6-Maus. Als Kontrolle wurden C57BL/10-Mäuse herangezogen, welche wie die C57BL/6-Maus nur H2b-MHC-Moleküle zur Antigen-Präsentation verwenden können (Abbildung 13). + + Abbildung 13 HKL- (heat killed Listeria) und epitop-spezifische CD4 bzw. CD8 T-Zell-Reaktivität in d B10.D2-H2 - und C57BL/10-Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes (L.m.). C57BL/10 und d B10.D2-H2 wurden mit einer sublethalen Dosis L.m. infiziert und 7 Tage später auf LLO91-99-, LLO190+ + 201- bzw. HKL-spezifische CD4 bzw. CD8 T-Zellen mittels intrazellulärer Zytokinfärbung untersucht + (x-Achse: INF-γ Färbung, y-Achse: TNF-α Färbung). Dargestellt werden exklusiv lebende CD4 bzw. + CD8 Lymphozyten; die Negativkontrolle DMSO bzw. Peptide, die in der in vitro Stimulation verwendet wurden, sind neben den Darstellungen genannt; gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis aus 5 + unabhängigen Experimenten; die Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtanzahl der CD4 bzw. + CD8 T-Zellen der Milz in den korrespondierenden Quadranten. 50 Gezeigt wird eine intrazelluläre Zytokindoppelfärbung auf TNF-α und INF-γ Produktion nach Infektion mit Listeria monocytogenes. In der C57BL/10-Maus zeigt sich wie erwartet keine Zytokinproduktion nach Restimulation mit dem H2-Kdrestringiertem LLO91-99-Peptid, aber eine deutliche Immunantwort (1,2 % IFNγ und 0,54 % TNF-α) nach Restimulation mit dem I-Ab-restringierten LLO190-201Peptid. Die Zytokinproduktion nach in vitro Restimulation mit HKL zeigt ein ähnliches Bild wie in Abbildung 11 für C57BL/6-Mäuse gezeigt; ist also deutlich stärker als in der BALB/c-Maus. In der B10.D2-H2d-Maus erfolgt eine Immunantwort gegen das H2-Kd-restringierte LLO91-99 (1,05 % IFN-γ und 0,27 % TNF-α). Gegen das I-Abrestringierten LLO190-201 lassen sich wie erwartet keine zytokin-produzierende Zellen nachweisen. Höchsteindrucksvoll lassen sich durch Restimulation mit HKL in der B10.D2-H2d-Maus hohe Frequenzen an Listerien-spezifischen CD4+ T-Zellen nachweisen. Dabei übersteigen die gemessenen Frequenzen sogar die starken Listerien-spezifischen CD4+ T-Zell-Antworten in der C57BL/6- und C57BL/10-Maus (12,11 % IFN-γ und 11,15 % TNF-α). Diese Daten weisen darauf hin, dass die schwachen Listerien-spezifischen TH-Antworten in der BALB/c-Maus nicht durch den mhc-Locus determiniert sind, sondern durch Gene außerhalb des mhc beeinflusst werden. Die hierbei involvierten Gene sind leider bisher nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, antigen-spezifische CD4+ und CD8+ T-Zell-Antworten vergleichend während einer Listerien-Infektion zu untersuchen. Auf Basis der oben beschriebenen Vorversuche scheint die Durchführbarkeit eines solchen Ansatzes in der BALB/c Maus limitiert zu sein, da sich in diesem Modell mit hoher Wahrscheinlichkeit keine immundominanten MHC-Klasse-II-Epitope finden lassen. 5.1.2 Suche nach neuen immundominanten Listerien-spezifischen MHCKlasse-Ia-restringierten T-Zell-Epitopen Wenn also in der BALB/c-Maus keine immundominanten MHC-Klasse-IIrestringierten T-Zell-Epitope detektierbar sind, so könnte möglicherweise die Identifikation neuer immundominanter MHC-Klasse-Ia-restringierter T-Zell-Epitope in der C57BL/6-Maus helfen, ein Modellsystem zur Untersuchung CD4+ und CD8+ TZell-Antworten zu etablieren. 51 Mit Hilfe des SYFPEITHI-Algorithmus [120] zur Vorhersage von Epitopen für definierte MHC-Allele wurden Peptidbibliotheken für H-2b-restringierte T-Zell-Epitope generiert. Nur potentielle Epitope mit einer hohen Bindungswahrscheinlichkeit (Bindungsindex > 20) stammend von den Listerien-Proteinen LLO, p60, ActA, PlcB, PlcA und Mpl wurden in die Bibliothek aufgenommen. Diese Listerien-Antigene wurden ausgewählt, weil sie von L.m. direkt ins Zytosol der infizierten Wirtszelle sezerniert werden. Bisher stammen alle MHC-Klasse-Ia-restringierten T-Zellepitope von sezernierten Proteinen. Mehr als 80 dieser Peptide wurden in in vitro Restimulationen und anschließender intrazellulärer Zytokinfärbung getestet. Diese Vorgehensweise konnte bereits in anderen experimentellen Systemen erfolgreich umgesetzt werden [142]. Protein Sequenz Protein Sequenz Protein Sequenz ActA14-22 FITANCITI LLO 231-239 SLNVNFGAI p60116-125 TTESNGWHKI ActA14-24 FITANCITINP LLO 27-35 ASAFNKENL p60132-140 TGFVNGKYL ActA257-265 SEEVNASDF LLO 27-36 ASAFNKENLI p60132-141 TGFVNGKYL ActA397-404 TSEEFSSL LLO 27-39 ASAFNKENSISSM p60203-211 HAVKSGDTI ActA397-409 TSEEFSSLNSGDF LLO 284-293 VNAENPPAYI p60217-225 KYGVSVQDI ActA401-409 FSSLNSGDF LLO 299-306 GRQVYLKL p60235-242 SIYVGQKL ActA435-443 KHSRNAGFL LLO 30-39 FNKENLISSI p60385-394 SWGGNGPTTF ActA435-445 KHSRNAGFLPL LLO 391-400 FLKDNELAVI p60449-457 IYVGNGQMI ActA438-445 RNAGFLPL LLO 398-407 AVIKNNSEYI p60449-458 IYVGNGQMIN ActA476-485 TPFKNPSQPL LLO 399-407 VIKNNSEYI p60462-469 NGVKYDNI ActA522-530 VLRENKTPF LLO 4-11 IMLVFITL pclA248-256 SKADNKLFL ActA522-531 VLRENKTPFI LLO 452-461 NWSENNKSKL pclA267-275 TPRQYAAAL ActA534-542 QAETNKQSI LLO 453-461 WSENNKSKL pclA50-58 SALPDTTSL ActA534-547 QAETNKQSINMPSL LLO 469-477 YLPGNARNI plcA116-124 GPIFLNASL ActA539-547 KQSINMPSL LLO 479-487 VYAKECTGL plcA128-137 LAKFNDFSIN ActA580-590 ANGKNRSAGIE LLO 502-511 PLVKNRNISI plcA206-215 FYVQNLDYLK ActA606-614 EEPGNHTTL LLO 91-99 GYKDGNEYI plcA273-281 AALNNKVEQ ActA81-89 VRNTNKADL mpl112-122 GQLRITNQIKI plcA50-58 SISENGTIM ActA81-91 VRNTNKADLIA mpl162-171 KRLVYNIKLI plcA77-88 ETSVGYYNLEVI LLO 107-114 SINQNNAD mpl205-213 DTHKDFQAL plcA89-96 TMSLYQQL LLO 107-115 SINQNNADI mpl227-236 VMKINDLFYL plcA98-105 AGIRYIDI LLO 115-124 IQVVNAISSL mpl260-268 KVVSNKTNM plcB157-164 FDTAFYKL LLO 136-145 ELVENQPDVL mpl381-391 YFIAPNHWLIG plcB177-186 PMHANNFTAI LLO 159-168 PGMTNQDNKI mpl418-425 HMKDYESL plcB194-204 CAYENYVDTIK LLO 176-185 SNVNNAVNTL mpl445-454 KAAYNTITKL plcB59-68 NTDVNTHYWL LLO 195-204 QAYPNVSAKI mpl459-467 TEQLYFRAL plcB82-94 HMRANLMNELKKF LLO 226-234 KAVNNSLNV mpl57-64 FYKNFKIL LLO 226-240 KAVNNSLNVNFGAIS mpl95-104 HVTPDNKITF Tabelle 2: Mittels des SYFPEITHI Algorithmus generierte Peptid-Bibliothek zur Suche von Listerienb + Epitopen, die im Kontext über H-2 /MHC-Klasse-Ia an CD8 T-Zellen präsentiert werden könnten. Als d Kontrollpeptide wurden die über H2-K präsentierten Epitope LLO91-99 und p60217-225 integriert. Die gelisteten Peptide stellen eine Auswahl der vorhergesagten Epitope mit den höchsten Bindungswahrscheinlichkeiten (Bindungsindex > 20) dar. Diese Peptid-Bibliothek wurde von Fa. Jerini 52 (Berlin) durch Mikropeptidsynthese (PepSpots) hergestellt. Synthesebedingt sind diese Peptide CTerminal modifiziert (zusätzliches Glycin in der Aminosäuresequenz). Für diese Untersuchungen wurde durch die Firma Jerini (Berlin) eine Peptid„Bibliothek“ mittels Mikropeptidsynthese (Pepspots) generiert, wobei diese Peptide den vorhergesagten Aminosäuresequenzen entsprechen, aber synthesebedingt Cterminal modifiziert sind. Hierbei wird über eine Zellulosemembran, die mit OHGruppen versehen ist, an 4-[4-(1-(Fmocamino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)Butansäure zur Photoabspaltung und ein Glycin die eigentliche Aminosäuresequenz synthetisiert. Die Peptide dieser „Bibliothek“ wurden nach Photoabspaltung (Bestrahlung bei 365 nm) in DMSO aufgenommen, um auch relativ hydrophobe Peptide sicher in Lösung bringen zu können, und dann für in vitro Restimulationsexperimente für C57BL/6- und BALB/c-Mäuse (Kontrolle) nach Primärinfektion mit L.m. am Tag 7 verwendet. Nach Angabe der Hersteller zur Syntheseffizienz wurde eine Menge von ca. 1,5 nM Peptid je Stimulationsansatz eingesetzt. Zunächst wurde in Kontrollexperimenten unter Verwendung von Milzzellen von BALB/c-Mäusen (7 Tage nach Primärinfektion mit L.m.) getestet, ob mit Hilfe solcher Peptidbibliotheken bekannte Epitop-Sequenzen wieder gefunden werden können (dies war insbesondere wichtig wegen der C-terminalen Modifikation) und ob die gegen H-2b vorhergesagten Epitope auf einem H-2d Background tatsächlich immunologisch stumm sind. Wie in Abbildung 14A gezeigt, lassen sich in der Negativkontrolle (Inkubation mit DMSO) praktisch keine IFN-γ-produzierenden Zellen nachweisen, d.h. das experimentelle System arbeitet auf einem sehr geringen Hintergrund und erlaubt die spezifische Detektion auch von sehr kleinen T-ZellPopulationen. Nach Restimulation mit LLO91-99 bzw. p60217-225 aus der Peptidbibliothek lassen sich deutlich IFN-γ-produzierende Subpopulationen identifizieren, was darauf hinweist, dass mit Hilfe des Peptidbibliotheksystem bekannte Epitop-Reaktivitäten gefunden werden können. Allerdings sind die gemessenen Frequenzen etwas geringer als die Frequenzen bei Restimulation mit dem nicht modifizierten Epitop (Abbildung 14B), was auf eine gewisse Störung durch die Epitop-Elongation am Cterminalen Ende hindeutet. Gegen keines der vorhergesagten H-2b/MHC-Klasse-Ia53 Epitope ließen sich in der BALB/c-Maus IFN-γ-produzierende CD8+ T-Zellen nach Listerien-Infektion nachweisen (exemplarisch ist dies für das Peptid LLO4-11 gezeigt). + Abbildung 14 Epitop-spezifische CD8 T-Zell-Reaktivitäten von BALB/c-Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes (L.m.). Milzzellen von BALB/c-Mäusen wurden mittels intrazellulärer Zytokinfärbung auf Epitop-spezifische T-Zell-Populationen 7 Tage nach Primärinfektion mit L.m. untersucht. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis aus 3 unabhängigen Experimenten (x-Achse: anti-IFN-γ Färbung, y-Achse: anti-CD8α Färbung). Peptide, die in der in vitro Stimulation verwendet wurden, sind unter den Dot-Plots genannt. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten; die Prozentzahlen beziehen sich auf T-Zellen der Milz in den korrespondierenden Quadranten. (A) Mit Hilfe des SYFPEITHI Algorithmus wurden Epitope der von Listerien stammenden Proteine LLO, p60, ActA, PlcB, PlcA und Mpl vorhergesagt und durch Mikropeptidsynthese (Jerini) hergestellt. “DMSO“ bezeichnet die unstimulierte Kontrolle; LLO91-99 und p60217-225 wurden als Positivkontrolle verwendet; LLO4-11 wird als repräsentatives Beispiel der eingesetzten Peptide gezeigt. (B) Zur in vitro Restimulation wurde LLO91-99 (Affina) ohne C-terminale Modifikation verwendet. Nach diesen Vorexperimenten zur Funktionalität und Spezifität der Peptidbibliothek wurden C57BL/6-Mäuse nach Primär- und Wiederholungsinfektion mit L.m. untersucht. Einzig für die Aminosäure-Sequenz IMLVFITL-(G) des LLO4-11, einer aus der Leader-Sequenz von Listeriolysin O stammenden Peptid-Sequenz, konnte eine deutlich abgrenzbare IFN-γ-produzierende Subpopulation gefunden werden. Ergebnisse des Gesamtexperiments sind exemplarisch in Abbildung 15 gezeigt; nur Epitope, für die überhaupt IFN-γ-produzierende Zellen gefunden wurden, sind dargestellt. CD8+ T-Zell-Epitope stammend von „leader-Sequenzen“ sind in der Literatur beschrieben [143, 144], interessanterweise können diese zum Teil TAP-unabhängig auf MHC-Klasse-Ia-Moleküle beladen werden. Die mit der Peptidbibliothek gemessenen LLO4-11-spezifischen Frequenzen weisen nur auf ein subdominantes Epitop hin. Allerdings könnte die C-terminale Modifikation die tatsächlichen Frequenzen unterschätzen. Um dies zu überprüfen, wurde die Aminosäuresequenz des LLO4-11 ohne Modifikation synthetisiert (Affina) und in in vitro Restimulationsexperimenten getestet. 54 + Abbildung 15 Epitop-spezifische CD8 T-Zell-Reaktivität von C57BL/6-Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes. Mit Hilfe des SYFPEITHI Algorithmus wurden Epitope der von Listerien stammenden Proteine LLO, p60, ActA, PlcB, PlcA und Mpl vorhergesagt und durch Mikropeptidsynthese (Jerini) hergestellt. Milzzellen von C57BL/6-Mäusen wurden mittels intrazellulärer Zytokinfärbung auf Epitop-spezifische T-Zell-Populationen 7 Tage nach Primärinfektion mit Listeria monocytogenes untersucht. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis aus 3 unabhhängigen Experimenten (x-Achse: anti-IFN-γ Färbung, y-Achse: CD62L). Peptide, die in der in vitro Stimulation verwendet wurden, sind unter den Dot-Plots genannt; “DMSO“ bezeichnet die unstimulierte Kontrolle; als Positivkontrolle wurde eine Stimulation mit αCD3 durchgeführt. Dargestellt werden exklusiv + + lebende CD8 Lymphozyten. Die Prozentzahlen beziehen sich auf die CD8 T-Zellen der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Wie in Abbildung 16 gezeigt, konnte bei Verwendung des nicht modifizierten Epitops LLO4-11 keine Zunahme der IFN-γ-produzierenden Zellen beobachtet werden. Abbildung 16 Antigen-spezifische T-Zell-Antwort in C57BL/6-Mäusen auf das Epitop LLO4-11 nach Infektion mit Listeria monocytogenes. Milzzellen aus C57BL/6-Mäusen wurden mittels intrazellulärer Zytokinfärbung 7 Tage nach Primärinfektion mit Listeria monocytogenes untersucht. Gezeigt wird ein repräsentative Ergebnis aus 3 unabhängigen Experimenten (x-Achse: anti-IFN-γ Färbung, y-Achse: anti-CD8α ). Gezeigt werden links “ø“ die unstimulierte Kontrolle und rechts die LLO4-11-spezifische + CD8 T-Zell-Antwort auf ein nicht modifiziertes Peptid. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten; die Prozentzahlen beziehen sich auf T-Zellen der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Zusammengefasst konnte mit Hilfe der Peptidbibliotheken kein neues immundominantes MHC-Klasse-Ia-Listerien-Epitop für die C57BL/6-Maus identifiziert 55 werden, allerdings konnte mit LLO4-11 eine neues (wahrscheinlich H2-Kb- restringiertes) subdominantes Epitop beschrieben werden. Möglicherweise werden in Analogie zu MHC-Klasse-II-Listerien-Epitopen in der BALB/c-Maus und in der C57BL/6-Maus überhaupt keine immundominanten MHC-Klasse-Ia-Listerien-Epitope gebildet bzw. präsentiert. Leider fehlen zur Zeit die experimentellen Möglichkeiten, dieser Hypothese genauer nachzugehen, da ein vergleichbarer experimenteller Ansatz, wie die Verwendung von HKL zur Charakterisierung von CD4+ T-Helfer-ZellAntworten, für das MHC-Klasse-Ia-System nicht zur Verfügung steht. Abbildung 17 fasst die stärksten mittels intrazellulärer Zytokinfärbung messbaren T-Zell-Antworten für definierte Epitope beider T-Zell-Kompartimente im Listerien-Modell für BALB/c- bzw. C57BL/6-Mäuse zusammen. Abbildung 17 Epitop-spezifische T-Zell-Reaktivitäten in BALB/c- und C57BL/6-Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes. Milzellen aus der BALB/c- bzw. C57BL/6-Maus wurden mittels intrazellulärer Zytokinfärbung auf Epitop-spezifische T-Zell-Populationen 7 Tage nach Primärinfektion mit Listeria monocytogenes untersucht. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis aus 3 unabhhängigen Experimenten (x-Achse: anti-IFN-γ Färbung, y-Achse: anti-CD8α oder anti-CD4 Färbung). Peptide, die in der in vitro Stimulation verwendet wurden, sind über den Dot-Plots genannt; “ø“ bezeichnet die unstimulierte Kontrolle. Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtlymphocyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten. 5.1.3 Modellsystem mit Ovalbumin sezernierenden Listeria monocytogenes Wenn keine „natürlichen“ immundominanten MHC-Ia-restringierten T-ZellEpitope bekannt sind, kann eventuell ein über H2-Kb-präsentiertes Modellepitop eine immundominante CD8+ T-Zell-Antwort in der C57BL/6-Maus generieren? Und wäre mit einem Modellantigen die Detektion antigen-spezifischer CD8+ T-Zell-Antworten in 56 der C57BL/6-Maus möglich, ohne negativen Einfluss auf die starke Listerienspezifische CD4+ T-Zell-Antwort zu haben? Zur Beantwortung dieser Fragen wurde für das folgende Experiment ein Ovalbumin-serzernierender Listerien-Stamm (L.m.-Ova) verwendet [145], dieser Listerien-Stamm wurde freundlicherweise von Hao Shen (University of Pennsylvania, Philadelphia) zur Verfügung gestellt. Infektion mit L.m.-Ova resultiert in einer immundominanten H2-Kb-restringierten T-Zell-Antwort gegen das Modellepitop Ova257-264 (SIINFEKL), die gut durch intrazelluläre Zytokinfärbung (Abbildung 18) oder MHC-Tetramerfärbung (siehe z.B. Abbildung 29) detektiert werden kann. + + Abbildung 18 Epitop-spezifische CD8 und CD4 T-ZellAntwort in der C57BL/6-Maus nach Infektion mit Ovalbuminsezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova). Milzzellen aus C57BL/6-Mäusen wurden 7 Tage nach Primärinfektion mit L.m.-Ova auf SIINFEKL- bzw. LLO190-201-spezifische T-Zellen mittels intrazellulärer Zytokinfärbung untersucht (x-Achse: antiIFN-γ Färbung, y-Achse: anti-CD8α oder anti-CD4 Färbung). Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtlymphozyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten. Dieser Befund zeigt, das C57BL/6-Mäuse zumindest keinen generellen Defekt aufweisen, um gegenüber Listerien-exprimierten Antigenen immundominante CD8+ T-Zell-Antworten zu entwickeln Die parallele Untersuchung der immundominanten Antwort von CD4+ T-Zellen für das MHC-Klasse-II-restringierte Epitop LLO190-201 zeigt ferner (Abbildung 18), dass die zusätzliche Induktion der starken SIINFEKL-spezifischen CD8+ T-ZellPopulation keinen starken negativen Einfluss auf die CD4+ T-Zell-Antwort zu haben scheint. Da es sich bei L.m.-Ova um einen gentechnisch veränderten Bakterienstamm handelt, war es wichtig, die Kinetiken des in vivo Bakterienwachstums und der Eliminierung der Bakterien mit dem Wildtyp-Listerien-Stamm zu vergleichen. Hierzu wurden C57BL/6 mit einer Dosis von 2.500 (0,1 x LD50) Bakterien pro Maus primär infiziert und nachfolgend die bakterielle „Last“ in Milz und Leber (Hauptorgane der Listerien-Infektion) durch Ausplattieren von Gewebe-Homogenaten zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. Ähnlich wurde die Bakterien-„Last“ in Leber 57 und Milz nach einer wiederholten Infektion mit einer deutlich höheren Infektionsdosis (10 x LD50) bestimmt. Wie in Abbildung 19 für die Milz gezeigt, weist die Kinetik der Infektion von Mäusen mit L.m.-Ova einen sehr vergleichbaren Verlauf mit den gut beschriebenden Infektionsverläufen für Wildtyp-Listerien auf [94, 146]. So wurde in beiden getesteten Organen ein Maximum der bakteriellen „Last“ am Tag 3 nach Primär- und am Tag 1 nach Wiederholungsinfektion gemessen. Innerhalb von 5 Tagen nach Primärinfektion sind die Erreger in der Regel vollständig eliminiert. Auf Grund der Entwicklung sehr effektiver und langlebiger Immunität nach Primärinfektion [61], lassen sich bei Wiederholungsinfektion mit einer hohen Infektionsdosis nur innerhalb der ersten 2 Tage lebende Bakterien in Organen nachweisen. Insgesamt unterscheidet sich der rekombinante Listerien-Stamm in seinen Eigenschaften und seiner Virulenz damit nur wenig vom Wildtyp-Listerien-Stamm (möglicherweise ist die Virulenz etwas erniedrigt, Daten nicht gezeigt). Mit diesem neuem experimentellen Modell unter Verwendung von L.m.-Ova war es nun möglich, zumindest mit Hilfe von intrazellulären Zytokinfärbungen beide T-Zell-Kompartimente gleichzeitig und parallel während einer bakteriellen Infektion zu beobachten. Abbildung 19 Anzahl lebender Listerien in der Milz während Primär- und Wiederholungsinfektion mit Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes. Zur primären Infektion wurden C57BL/6 mit 2.500 Bakterien pro Maus infiziert, für die Wiederholungsinfektion erhielten die Mäuse 100.000 Bakterien. Die Anzahl der lebenden Bakterien wurde durch Ausplattieren des Organhomogenats (2 Mäuse je Zeitpunkt) bestimmt. 5.2 Kinetiken antigen-spezifischer CD8+ und CD4+ T-Zell-Antworten nach Infektion mit Ovalbumin sezernierenden Listeria monocytogenes Mit dem in 5.1.3 beschriebenen Modellsystem für die gleichzeitige Untersuchung antigen-spezifischer CD8+ und CD4+ T-Zell-Populationen war nun die Möglichkeit vorhanden, beide T-Zell-Populationen an verschiedenen Zeitpunkten nach Primär- und Wiederholungsinfektion zu vergleichen. Dazu wurde eine große Gruppe von C57BL/6-Mäusen mit einer sublethalen Dosis von L.m.-Ova infiziert (0,1 x LD50) und nach 5 Wochen mit einer signifikant höheren Dosis (10 x LD50) L.m.-Ova reinfiziert. 58 Antigen-spezifische T-Zell-Populationen wurden mit Hilfe von intrazellulären Zytokinfärbungen gegen IFN-γ, TNF-α und IL-4 untersucht. Je Zeitpunkt nach Infektion mit L.m.-Ova wurden mindestens zwei C57BL/6-Mäuse analysiert. Neben den T-Zell-Untersuchungen wurde zusätzlich die bakterielle „Last“ in Milz- und LeberHomogenaten gemessen. Folgende in vitro Restimulationen von Milzzellen für intrazelluläre Zytokinfärbungen wurden durchgeführt: Kontrollen (DMSO, α-CD3), Stimulation antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen (SIINFEKL) und Stimulation Listerienspezifischer CD4+ T-Zellen (LLO190-201, LLO253-264, LLO318-329). Parallel dazu wurden die SIINFEKL-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten mittels H2-Kb/SIINFEKL- Tetrameren funktionsunabhängig nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). MHC-KlasseII-Tetramere standen zu diesem Zeitpunkt nicht zur Verfügung. 5.2.1 Frequenzanalyse CD4+ und CD8+ T-Zell-Antworten nach Primärinfektion In Abbildung 20 sind primäre FACS-Daten gezeigt, wie sie zur Untersuchung der T-Zell-Kinetiken nach Listerien-Infektion generiert wurden. Auf der linken Seite sind die Ergebnisse für MHC-Klasse-Ia-restringierte Zytokinantworten nach in vitro Restimulation mit SIINFEKL dargestellt. Auf der rechten Seite sind MHC-Klasse-IIabhängige Zytokinantworten LLO190-201-spezifischer CD4+ T-Zell-Antworten gezeigt. Zu jedem Zeitpunkt sind repräsentative Dot-Plots für IFN-γ und TNF-α Färbungen von unstimulierten Kontrollen und Peptidstimulationen abgebildet. Die Produktion von IL-4 wurde ebenfalls gemessen, war aber zu keinem Zeitpunkt, weder für CD4+ noch CD8+ T-Zellen, positv (Daten nicht gezeigt). Am Tag 0 (naive Maus) kann durch die Kontrolle (DMSO) und die in vitro Restimulation mit SIINFEKL- bzw. LLO190-201-Peptid bestätigt werden, dass nur ein sehr geringer experimenteller Background in diesem Detektionssystem vorhanden ist. Die Negativkontrolle (DMSO) an den untersuchten Tagen nach Primärinfektion mit L.m.-Ova zeigte für CD4+ wie für CD8+ T-Zellen in der Regel nur wenig spontane Zytokinbildung. 59 + + Abbildung 20 Epitop-spezifische CD8 und CD4 T-Zell-Antworten in C57BL/6-Mäusen nach Primärinfektion mit Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova). C57BL/6-Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis an L.m.-Ova infiziert. Die Frequenzen und Zytokinproduktionen antigen-spezifischer T-Zellen wurden durch intrazelluläre Zytokinfärbung während des Verlaufs der primären Infektion verfolgt (Zeitpunkte der Messung an der linken Seite der y-Achse vermerkt). Es werden repräsentative FACS-Färbungen gezeigt (x-Achse: anti-IFN-γ oder anti-TNF-α Färbung, yAchse: anti-CD8α oder anti-CD4 Färbung). Peptide, die während der in vitro Stimulation verwendet wurden, sind über den Dot-Plots genannt; “ø“ markiert die unstimulierte Kontrolle. Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtlymphozyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Die einzelnen Zeitpunkte der Kinetik wurden bis zu 5-mal wiederholt und zeigen vergleichbare Ergebnisse. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten. 60 Eine Ausnahme stellt allerdings Tag 3 dar, hier konnten insbesondere CD8/CD4- IFN-γ+ bzw. TNF-α+ T-Zellen detektiert werden, die möglicherweise in vivo aktivierte Zellen des innaten Immunsystems, z.B. NK-Zellen, darstellen könnten. Es ist bekannt, dass zu diesem frühen Zeitpunkt nach Listerien-Infektion ein starker NKZell-Influx und NK-Zell-Aktivierung stattfindet [147, 148]. Dieser Effekt wurde in dieser Arbeit nicht im Detail weiter untersucht. Unabhängig von diesen geringen „Störfaktoren“ lassen sich epitop-reaktive T-Zellen deutlich abgrenzen und im weiteren Verlauf nach Infektion verfolgen. An den untersuchten Tagen nach in vitro Restimulation mit SIINFEKL zeigen antigen-spezifische CD8+ T-Zellen typische Frequenzveränderungen über die Zeit (Kinetiken). Beginnend am Tag 3 (hier können erstmals gut abgrenzbare antigenspezifische CD8+ T-Zell-Populationen detektiert werden (IFN-γ 0,045 % und TNF-α 0,027 %) nimmt die Größe der SIINFEKL-spezifischen CD8+ T-Zell-Populationen kontinuierlich zu, um ca. am Tag 7 ihr Maximum zu erreichen (IFN-γ 0,92 %, TNF-α 0,36 % aller antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen). Nach dem Höhepunkt der Immunantwort schrumpft die SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zell-Population wieder. Diese Beobachtung ist in guter Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen für MHC-Klasse-Ia-restringierte T-Zell-Antworten mit unterschiedlichen Epitop- Spezifitäten [1, 42, 149], in denen eine ähnliche Kinetik beobachtet wurde. Wenn man sich hierzu die Kinetiken Listerien-spezifischer CD4+ T-Zellen betrachtet, ist ein sehr ähnlicher Verlauf wie bei den antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen zu beobachten. LLO190-201-spezifische CD4+ T-Zellen lassen sich ebenfalls erstmals am Tag 3 als gut abgrenzbare Population darstellen, erreichen am Tag 7 den Höhepunkt (0,37 % IFN-γ und 0,31 % TNF-α) und schrumpfen dann wieder zusammen (Abbildung 20). Dieser erstmalige direkte Vergleich des zeitlichen Verlaufes der Frequenzveränderung von Populationen in beiden T-Zell-Kompartimenten weist darauf hin, dass die generelle Kinetik antigen-spezifischer CD4+ als auch CD8+ TZellen nach Primärinfektion mit L.m.-Ova synchronisiert verläuft. 61 + Abbildung 21 Epitop-spezifische CD4 T-Zell-Reaktivitäten in C57BL/6-Mäusen nach Primärinfektion mit Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova). C57BL/6-Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis an L.m.-Ova infiziert. Es wird eine repräsentative Darstellung am Tag 7 der Primärinfektion für die LLO190-201-, LLO318-329- und LLO253-264-spezifischen CD4+ T-Zellen gezeigt (xAchse: anti-IFN-γ Färbung, y-Achse: anti-CD4 Färbung). Peptide, die während der in vitro Stimulation verwendet wurden, sind über den Dot-Plots genannt; „DMSO“ markiert die unstimulierte Kontrolle. Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtlymphozyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Dieser Zeitpunkt der Kinetik wurde bis zu 5-mal wiederholt und zeigt immer gleiche Ergebnisse. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten. Neben LLO190-201 wurden auch subdominante MHC-Klasse-II-restringierte Epitope (LLO253-264 und LLO318-329) in dieser Studie untersucht. Die Frequenzen waren allerdings zu vielen Zeitpunkten der Kinetik (z.B. frühe Effektor- und späte Gedächtnisphase) so gering, dass die Populationen nicht deutlich vom experimentellen Hintergrund abgegrenzt werden konnten (Daten nicht gezeigt). Eindeutig beurteilbar war allerdings, dass sich für beide subdominanten Epitope am Tag 7 nach Primärinfektion die größten Frequenzen nachweisen lassen (Abbildung 21), was vermuten lässt, dass auch diese TH-Zell-Populationen einer ähnlichen in vivo Kinetik folgen wie T-Zellen, die spezifisch für die immundominanten Epitope SIINFEKL und LLO190-201 sind. Diese Beobachtung stützt die Annahme, dass Synchronie ein generelles Charakteristikum der T-Zell-Antworten aus verschiedenen T-Zell-Kompartimenten im Listerien-System ist. Betrachtet man die Messdaten für IFN-γ und TNF-α genauer, fallen aber auch deutliche Unterschiede zwischen beiden T-Zell-Kompartimenten auf. So sind in der Effektorphase die Frequenzen SIINFEKL-spezifischer CD8+ T-Zellen bei Messung von IFN-γ deutlich größer als bei Färbung auf TNF-α (z.B. Abbildung 20, Tag 5 IFNγ 0,051 % > TNF-α 0,023 %). Dieser Unterschied ist am deutlichsten am Maximum der Immunantwort (Tag 7 nach Primärinfektion) zu beobachten. Bei den MHCKlasse-II-restringierten LLO190-201-spezifischen CD4+ T-Zellen resultiert die Färbung auf IFN-γ bzw. TNF-α zu annähernd gleichen Frequenzen (z.B. Abbildung 20, Tag 62 5 IFN-γ 0,022 % ≈ TNF-α 0,026 %). In der Gedächtnisphase sind die Unterschiede zwischen IFN-γ+- und TNF-α+-Frequenzen zwischen CD4+ und CD8+ T-ZellKompartiment weniger stark ausgeprägt (> Tag 14 beobachtet). Diese Daten könnten darauf hinweisen, dass alle antigen-spezifischen CD4+ Effektor-T-Zellen während des gesamten Untersuchungszeitraumes in der Lage sind, nach kurzer in vitro Restimulation beide Zytokine gleichzeitig zu produzieren. Dagegen scheinen antigen-spezifische CD8+ Effektor-T-Zellen eine heterogenere Verteilung in ihrem Zytokinexpressionsmuster (insbesondere in der Effektorphase) aufzuweisen. Allerdings erlauben separate Messungen von IFN-γ und TNF-α keine Aussagen darüber, welche Zellen diese Zytokine gleichzeitig produzieren können und welche nicht. Diese Information könnte z.B. durch Zytokin-Doppel-Färbungen auf IFN-γ und TNF-α gewonnen werden (wie auch zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt – siehe 5.2.3). 5.2.2 Frequenzanalyse CD8+ und CD4+ T-Zell-Antworten nach Wiederholungsinfektion Nach erneuter Infektion 35 Tage nach Primärinfektion mit demselben Pathogen (L.m.-Ova – Infektionsdosis 10 x LD50) konnte ein ähnliches Verhalten antigen-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen beobachtet werden, wie bei der Untersuchung der T-Zell-Kinetiken nach primärer Listerien-Infektion (Abbildung 22). Im Gegensatz zur Primärinfektion sind LLO190-201-spezifische CD4+ T-Zellen und SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen bereits von Beginn an detektierbar. So können am Tag 0 (35 Tage nach Primärinfektion), d.h. direkt vor Wiederholungsinfektion 0,072 % (IFN-γ) bzw. 0,054 % (TNF-α) LLO190-201-spezifische CD4+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen und 0,12 % (IFN-γ) bzw. 0,08 % (TNF-α) SIINFEKL-spezifische CD8+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen nachgewiesen werden. Am Tag 1 nach Wiederholungsinfektion ist eine höhere spontane Zytokinproduktion (DMSO Kontrolle) in beiden T-Zell-Kompartimenten erkennbar. Dabei handelt es sich, ähnlich wie nach Tag 3 während der Primärinfektion (Abbildung 20) um einen geringen Anteil an CD4/CD8 negativen Zellen (möglicherweise aktivierte NK-Zellen 0,38 % IFN-γ Produktion für CD8- T-Zellen und 0,58 % IFN-γ Produktion für CD4- TZellen). Aber auch ein substantieller Anteil CD4+/CD8+ T-Zellen produziert zu diesem 63 Zeitpunkt spontan Zytokine (0,28 % IFN-γ Produktion aller CD8+ T-Zellen und 0,10 % IFN-γ Produktion aller CD4+ T-Zellen). Spontan zytokin-produzierende antigenspezifische T-Zellen wurden bisher selten beobachtet, was durch ein sehr schnelles Abschalten der Zytokin-Sekretion und -Produktion nach in vivo oder in vitro Separation der Lymphozyten von antigen-präsentierenden Zellen erklärt wird [88]. Von daher könnte die spontane Zytokin-Produktion CD8+ und CD4+ T-Zellen am Tag 1 nach Wiederholungsinfektion ein Hinweis darauf sein, dass bereits ohne in vitro Peptid-Zugabe substanzielle Antigen- bzw. Epitop-Mengen in den Milzpräparationen vorhanden sind. Auch bei der Wiederholungsinfektion zeigten SIINFEKL-reaktive CD8+ T-Zellen typische Frequenzveränderungen [1, 42, 149]. Bereits am Tag 1 ist eine Zunahme der SIINFEKL-spezifischen Populationen zu erkennen (0,39 % IFN-γ und 0,078 % TNF-α). Die Expansion SIINFEKL-spezifischer CD8+ T-Zellen erreicht am Tag 7 nach Wiederholungsinfektion ihre maximale Größe (5,19 % IFN-γ und 0,78 % TNF-α), um dann wieder schnell auf niedrigere Frequenzen zu schrumpfen. Listerien-spezifische CD4+ T-Zellen zeigen auch hier einen sehr ähnlicher Verlauf wie antigen-spezifische CD8+ T-Zellen. Aus dem Gedächtnis-T-Zell-Pool heraus nehmen die Frequenzen LLO190-201-spezifischer CD4+ T-Zellen schnell zu (Tag 1 IFN-γ 0,28 % und TNF-α 0,044 %), erreichen ihre maximale Größe am Tag 7 (1,24 % IFN-γ und 0,93 % TNFα) und kontrahieren dann wieder (Abbildung 22). Auch für die subdominanten MHC-Klasse-II-restringierten Epitope LLO253-264 und LLO318-329 konnte eine maximale Immunantwort am Tag 7 nach Wiederholungsinfektion gemessen werden. Die Populationen LLO253-264- und LLO318-spezifischer CD4+ T-Zellen sind in der Wiederholungsinfektion in der späten 329 Expansionsphase, am Maximum der Immunantwort und in der frühen Kontraktionsphase abgrenzbar, und zeigen in diesem Bereich (Tag 5 – 14) eine ähnliche Kinetik wie für LLO190-201-spezifische CD4+ T-Zellen. Damit zeigen alle untersuchten antigen-spezifischen T-Zell-Populationen, egal ob CD8+ oder CD4+, auch nach Wiederholungsinfektion, synchronisierte in vivo Kinetiken. Auffälliger Unterschied zwischen SIINFEKL- und LLO190-201-spezifischen TZell-Antworten bei Reinfektion ist allerdings, dass die antigen-spezifischen CD4+ T64 Zellen nicht zu solchen Populationsgrößen expandiert werden, wie es für antigenspezifische CD8+ T-Zell-Populationen typisch ist. + + Abbildung 22 Epitop-spezifische CD8 und CD4 T-Zell-Antworten in C57BL/6-Mäusen nach Wiederholungsinfektion mit Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova). C57BL/6Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis L.m.-Ova infiziert und nach 35 Tagen mit L.m.-Ova reimmunisiert. Die Frequenzen und Zytokinproduktionen antigen-spezifischer T-Zellen wurden durch 65 intrazelluläre Zytokinfärbung während des Verlaufs der primären Infektion verfolgt (Zeitpunkte der Messung an der linken Seite der y-Achse vermerkt). Es werden repräsentative FACS-Färbungen für jeden Zeitpunkt gezeigt (x-Achse: anti-IFN-γ oder anti-TNF-α Färbung, y-Achse: anti-CD8α oder antiCD4 Färbung). Peptide, die während der in vitro Stimulation verwendet wurden, sind über den DotPlots genannt; “ø“ markiert die unstimulierte Kontrolle. Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtlymphozyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Die einzelnen Zeitpunkte der Kinetik wurden bis zu 5-mal wiederholt und zeigen gleiche Ergebnisse. Dargestellt werden exklusiv lebende Lymphozyten. Bei Betrachtung des Verhältnisses der gemessenen Frequenzen IFN-γ- bzw. TNF-α-produzierenden T-Zellen zeigen LLO190-201-spezifische CD4+ T-Zellen und SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen eine ähnliche Tendenz wie nach Primärinfektion. Auch hier sind die Frequenzen LLO190-201-spezifischer CD4+ T-Zellen für IFN-γ- und TNF-α annähernd gleich, wohingegen für SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen deutlich mehr Zellen IFN-γ positiv sind. In der Gedächtnis-Zell-Phase misst man in beiden T-Zell-Kompartimenten für IFN-γ und TNF-α wieder sehr ähnliche Frequenzen. Die gezeigten Ergebnisse für Primärinfektion (5.2.1) und Wiederholungsinfektion zeigen, dass antigen-spezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen nach bakterieller Infektion einer gemeinsamen synchronisierten Kinetik folgen; sie expandieren zur selben Zeit, erreichen ein Maximum der Immunantwort und kontrahieren koordiniert. Allerdings sind in Abhängigkeit vom gefärbten Zytokin in den FACS-Daten die gemessenen Frequenzen in beiden T-Zell-Kompartimenten teilweise unterschiedlich; für LLO190-201-spezifische CD4+ T-Zellen erhält man zu allen Zeitpunkten sehr ähnliche Frequenzen für IFN-γ und TNF-α, wogegen für SIINFEKLspezifische CD8+ T-Zellen die Populationsgrößen IFN-γ bzw. TNF-α-exprimierender Zellen in der Effektorphase stark differieren. 5.2.3 Untersuchung der Veränderung absoluter Populationsgrößen CD4+ und CD8+ T-Zellen nach Primär- und Wiederholungsinfektion Die bisherige Analysen der FACS-Primärdaten (5.2.1 und 5.2.2) erlauben nur Aussagen über die in den untersuchten Proben enthaltenen prozentualen Verteilungen der Populationen bezogen auf eine definierte untersuchte Zellzahl (in den durchgeführten Experimenten i.d.R. 3 x 106 Lymphozyten). Es wird allerdings immer wieder strittig diskutiert, ob diese Art der Auswertung der FACS-Daten die tatsächlichen Veränderungen antigen-spezifischer T-Zell-Populationen in einem 66 bestimmten Organ korrekt abbildet. Alternativ wird vorgeschlagen, die absoluten Zahlen aller zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem Organ vorhandenen antigenspezifischen Zellen zu bestimmen. Eine solche quantitative Bestimmung berücksichtigt auch massive Organveränderungen, wie sie häufig bei entzündlichen Reaktionen beobachtet werden. Z.B. nimmt die Gesamtzahl an Milzzellen bis zum Tag 7 nach Listerien-Infektion dramatisch zu (oft mehr als das doppelte), was zu deutlichen Verschiebungen der Frequenzwerte von Lymphozyten-Subpopulationen führen kann. Deshalb wurden auf Basis der gewonnenen FACS-Daten nach Primär- und Wiederholungsinfektion (5.2.1 und 5.2.2) in Berücksichtigung der zu jedem Zeitpunkt gemessenen Gesamtzahl von Milzzellen die absoluten Zellzahlen antigenspezifischer T-Zellen je Organ berechnet. Die folgenden Ergebnisse beziehen sich auf den Mittelwert mindestens zweier Versuchstiere zu den jeweiligen Zeitpunkten. Betrachtet man die Veränderung der Populationsgrößen antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen in Abbildung 23A, dann lassen sich die generellen Kinetiken, wie sie bei den vorangegangenen Frequenzanalysen beschrieben wurden, bestätigen. IFN-γ+als auch TNF-α+-LLO190-201-spezifische CD4+ T-Zellen expandieren in der Frühphase bis zum Tag 7 nach Primärinfektion (IFN-γ ≈ 1 x 106 und TNF-α ≈ 0,8 x 106 CD4+ TZellen in der Milz) und schrumpfen danach wieder (Tag 35 nach Primärinfekion IFN-γ ≈ 4 x 104 und TNF-α ≈ 3,5 x 104 CD4+ T-Zellen in der Milz). Nach Wiederholungsinfektion expandieren IFN-γ+- wie auch TNF-α+-LLO190-201-spezifische CD4+ T-Zell-Populationen sehr schnell aus dem Gedächtnis-Zell-Pool heraus und erreichen nach 7 Tagen ihre maximale Größe (IFN-γ ≈ 1,2 x 106 und TNF-α ≈ 0,9 x 106 CD4+ T-Zellen in der Milz). Danach nimmt die Zellzahl LLO190-201-spezifischer CD4+ Effektor-T-Zell-Populationen wieder kontinuierlich ab (Tag 35 nach Wiederholungsinfektion IFN-γ ≈ 1 x 105 und TNF-α ≈ 7 x 104 CD4+ T-Zellen in der Milz). Auffällig ist, wie zuvor bereits bei der Frequenzanalyse beschrieben, dass antigen-spezifische CD4+ Effektor-T-Zellen nach wiederholten Antigenkontakt nur annähernd gleich große Populationsgrößen wie nach Primärinfektion erreichen. Um zu evaluieren, ob es sich bei den IFN-γ- bzw. TNF-α-produzierenden CD4+ T-Zellen um ein und dieselbe oder separate Zell-Populationen handelt, wurden 67 Zytokin-Doppel-Färbungen auf IFN-γ und TNF-α durchgeführt. In Abbildung 23B wird repräsentativ Tag 7 nach Primärinfektion gezeigt. Das Ergebnis zeigt, dass nahezu alle Listerien-reaktiven CD4+ T-Zellen gleichzeitig INF-γ und TNF-α produzieren. Nur ein kleiner Teil (0,41 % aller CD4+ T-Zellen) produziert exklusiv IFN-γ. Es konnten keine antigen-spezifische CD4+ T-Zellen detektiert werden, die nur TNF-α produzieren. Die Veränderungen der absoluten Populationsgrößen IFN-γ- bzw. TNF-αproduzierender SIINFEKL-spezifischer CD8+ T-Zellen während der Primär- und Wiederholungsinfektion sind in Abbildung 24A zusammengefasst. Die Kinetik verläuft auch auf Basis der absoluten Zellzahlen in Vergleich mit LLO190-201-spezifischen CD4+ T-Zellen synchronisiert, d.h. in Primär- bzw. Wiederholungsinfektion verlaufen Expansionsphase, maximale Immunantwort am Tag 7 und Kontraktionsphase zeitgleich. + Abbildung 23 In vivo Kinetik von LLO190-201-spezifischen CD4 T-Zellen nach Infektion mit Ovalbuminserzernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova) nach Primär- und Wiederholungsinfektion. (A) C57BL/6-Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis von L.m.-Ova infiziert und nach 35 Tagen mit + L.m.-Ova reimmunisiert. Die Frequenzen und Zytokinproduktionen der LLO190-201-spezifischen CD4 TZellen aus der Milz wurden durch intrazelluläre Zytokinfärbung an unterschiedlichen Zeitpunkten der Primär- und Wiederholungsinfektion bestimmt ( IFN-γ, TNF-α). Es wurden die absoluten Zellzahlen in der Milz berechnet (y-Achse) und über die Zeit der Infektion (x-Achse) dargestellt. Für jeden Zeitpunkt wurde das Ergebnis aus 2 Mäusen berücksichtigt. (B) Repräsentative Darstellung für intrazelluläre Doppelfärbungen von TNF-α und IFN-γ am Tag 7 der Primärinfektion; gezeigt werden + exklusiv lebende CD4 Lympozyten aus der Milz. Die Prozentzahlen beziehen sich auf antigen+ spezifische CD4 T-Zellen. IFN-γ+- wie auch TNF-α+-SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen erreichen am Höhepunkt der Primärantwort Populationsgrößen (IFN-γ ≈ 2,8 x 106 und TNF-α ≈ 1 x 68 105 CD8+ T-Zellen in der Milz), die in etwa doppelt so groß wie die LLO190-201spezifischen sind (Abbildung 23). Nach Wiederholungsinfektion expandieren IFN-γ+als auch TNF-α+-SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zell-Populationen sehr schnell aus dem Gedächtnis-Zell-Pool heraus und erreichen nach 7 Tagen ihre maximale Immunantwort (IFN-γ ≈ 1,3 x 107 und TNF-α ≈ 3 x 106 CD8+ T-Zellen in der Milz). Zu diesem Zeitpunkt ist die INF-γ+-SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zell-Population im Durchschnitt 6 - 8-mal größer als nach Primärinfektion. Dagegen nimmt die TNF-α+SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zell-Population im Vergleich zur Primärinfektion nur unmerklich zu, ähnlich wie antigen-spezifische CD4+ T-Zellen insgesamt. Auch SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen wurden durch Zytokin-DoppelFärbungen daraufhin untersucht, welche CD8+ T-Zellen IFN-γ und/oder TNF-α produzieren. In Abbildung 24B wird repräsentativ Tag 7 nach Primärinfektion dargestellt, wobei dieses Ergebnis aufzeigt, dass praktisch alle SIINFEKLspezifischen CD8+ T-Zellen IFN-γ produzieren; davon ≈ 44 % aller antigen-reaktiven CD8+ T-Zellen gleichzeitig INF-γ und TNF-α. Exklusiv TNF-α-produzierende Zellen sind nicht nachweisbar. Diese Unterschiede im Verteilungsmuster INF-γ und TNF-α produzierender CD8+ T-Zellen deuten darauf hin, dass während der Effektorphase innerhalb des CD8+ T-Zell-Kompartiments deutlich abgrenzbare funktionell- unterschiedliche Subpopulationen vorhanden sind, die sich in vergleichbarer Form nicht im CD4+ Kompartiment finden lassen. Zusammengefasst zeigen die bisherigen Beobachtungen folgende Ergebnisse: 1. Durch Verwendung von L.m.-Ova und intrazellulären Zytokinfärbungen konnten erstmals die allgemeinen Kinetiken von antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ Effektor-T-Zellen während der Expansions-, Kontraktions- und Gedächtnisphase miteinander verglichen werden. Dabei stellte sich heraus, dass antigen-spezifische CD4+ und CD8+ Effektor-T-Zellen in vivo sehr ähnlichen Kinetiken folgen, also zu gleicher Zeit expandieren, ihre maximale Größe erreichen und wieder schrumpfen. 2. L.m.-spezifische CD4+ TH-Zellen unterscheiden sich während der Effektorphase im Vergleich zu CD8+ T-Zellen in ihrem ZytokinExpressionsmuster. L.m.-spezifische CD4+ TH-Zellen sind funktionell 69 homogen und produzieren gleichzeitig IFN-γ und TNF-α, antigenspezifische CD8+ T-Zellen sind dagegen durch variable Expressionsmuster von IFN-γ und TNF-α charakterisiert. 3. L.m.-spezifische CD4+ Effektor-TH-Zellen werden im Vergleich zu CD8+ T-Zellen während Reinfektion mit L.m.-Ova zu geringeren Populationsgrößen expandiert. + Abbildung 24 In vivo Kinetik von SIINFEKL-spezifischen CD8 T-Zellen nach Infektion mit Ovalbuminserzernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova) nach Primär- und Wiederholungsinfektion. (A) C57BL/6-Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis von L.m.-Ova infiziert und nach 35 Tagen mit + L.m.-Ova reimmunisiert. Die Frequenzen und Zytokinproduktionen der SIINFEKL-spezifischen CD8 T-Zellen wurden durch intrazelluläre Zytokinfärbung an unterschiedlichen Zeitpunkten der Primär- und Wiederholungsinfektion bestimmt ( IFN-γ, TNF-α). Es wurden die absoluten Zellzahlen in der Milz berechnet (y-Achse) und über die Zeit der Infektion (x-Achse) dargestellt. Für jeden Zeitpunkt wurde das Ergebnis von 2 Mäusen dargestellt. (B) Repräsentative Darstellung für intrazelluläre Doppelfärbungen von TNF-α und IFN-γ am Tag 7 der Primärinfektion; gezeigt werden exklusiv + lebende CD8 Lympozyten aus der Milz. Die Prozentzahlen beziehen sich auf antigen-spezifische + CD8 T-Zellen. Aus diesen Beobachtungen ergeben sich folgende Fragestellungen: • Zeigen CD4+ und CD8+ Effektor-T-Zellen Unterschiede in ihrem Erhalt als Gedächtniszellen über die Zeit? • Werden antigen-spezifische CD4+ und CD8+ Gedächtnis-T-Zellen in einzelnen Organen unterschiedlich erhalten oder kann die kontinuierliche Abnahme CD4+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen z.B. durch Migrationsunterschiede erklärt werden? 70 • Sind unterschiedliche „Schwellenwerte“ an Antigen für die Reexpansion von antigen-spezifischen CD4+ oder CD8+ Gedächtnis-T-Zell-Populationen notwendig? • Findet durch die starke immundominante MHC-Klasse-Ia-restringierte CD8+ TZell-Antwort eine Behinderung oder aktive Suppression für die Entwicklung von CD4+ Gedächtnis-T-Zell-Antworten statt? • Können durch MHC-Klasse-II-Tetramere eventuell CD4+ T-Zellen detektiert werden, die nicht durch die bisher gemessenen Zytokine identifiziert werden können? 5.3 Abnahme der CD4+ Effektor-Gedächtnis-Zell-Populationsgröße Zeigen CD4+ und CD8+ T-Zellen Unterschiede in ihrem Erhalt als Gedächtniszellen über die Zeit? Wie in Abbildung 23 zu sehen, nehmen die CD4+ Effektor-Gedächtnis-Zellen in der Milz kontinuierlich über die Zeit ab, wohingegen die Anzahl der Epitop-spezifischen CD8+ T-Zellen über die Zeit relativ konstant zu bleiben scheint. Da die Frequenzen der CD4+ und CD8+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen nach Wiederholungsinfektion relativ gering und daher auch schwer nachzuweisen sind, wurden die absoluten Zellzahlen von INF-γ produzierenden CD4+ und CD8+ TZellen am Tag 14 bis 35 nach Primär-Infektion genauer untersucht (Abbildung 25). + Abbildung 25 Rapide Abnahme der Epitop-spezifischen CD4 T-Zellen nach Primärinfektion mit Ovalbumin-exprimierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova) in der Milz. C57BL/6-Mäuse wurden + + i.v. mit L.m.-Ova infiziert und die Frequenzen der Epitop-spezifischen CD8 (-SIINFEKL) und CD4 (-LLO190-201) T-Zellen während der Kontraktions- und Gedächtnisphase bestimmt. Die absoluten Zahlen von INF-γ produzierenden Zellen in der Milz wurden berechnet (y-Achse) und über die Zeit des Infektionsverlaufes (x-Achse, Tage nach Infektion) dargestellt. Die gezeigten Mittelwerte (mit Standardabweichungen) sind repräsentativ für 4 individuelle Mäuse je Zeitpunkt der Infektion. 71 Wie in Abbildung 25 gezeigt, bleibt die Populationsgröße von CD8+ Gedächtniszellen über die Zeit nahezu konstant, wohingegen die Frequenz von CD4+ Effektor-Gedächtnis-Zellen kontinuierlich über die Zeit abnimmt. Diese drastische Abnahme der CD4+ Effektor-Gedächtnis-Zellen könnte auch die relativ niedrigen Populationsgrößen nach einer wiederholten Infektion erklären (Abbildung 23). 5.4 CD8+ und CD4+ T-Zell-Populationsgrößen in vivo in unterschiedlichen Organen Werden antigen-spezifische CD4+ und CD8+ Gedächtnis-T-Zellen in einzelnen Organen unterschiedlich erhalten oder kann die kontinuierliche Abnahme CD4+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen möglicherweise durch Migrationsunterschiede erklärt werden? Wie gezeigt, nehmen antigen-spezifische CD4+ Effektor-Gedächtnis T-ZellPopulationen, im Gegensatz zu antigen-spezifischen CD8+ Gedächtnis T-Zellen, nach bakterieller Infektion in der Milz kontinuierlich ab. Um zu evaluieren, ob die Abnahme antigen-spezifischer CD4+ Effektor-Gedächtnis T-Zell-Populationen auf Migration in andere Organe zurück zu führen ist und möglicherweise die Milz als Organ für diese Art von Gedächtnis-Zell-Untersuchungen ungeeignet ist, wurden in Zusammenarbeit mit Verena Busch epitop-spezifische CD4+ und CD8+ GedächtnisZellen in unterschiedlichen Organen der Maus zu verschiedenen Zeitpunkten der Primär- und Sekundärimmunantwort nach spezifischer in vitro Restimulation mit LLO190-201 oder SIINFEKL auf die Expression von IFN-γ untersucht (Abbildung 26). Hierbei zeigte sich, dass am Tag 7 nach Primärinfektion und Wiederholungsinfektion in den meisten Organen große Populationen von antigenspezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen existieren. Auffällig ist, dass besonders in Blut und Lunge während der Wiederholungsinfektion hohe Zellzahlen von beiden Zelltypen zu finden sind. Im weiteren Verlauf der Immunantwort verhalten sich CD8+ und CD4+ T-Zellen allerdings unterschiedlich. Während die antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen bis in die Gedächtnis-Phase auf hohem Niveau erhalten bleiben, nehmen gerade in nicht-lymphatischen Organen wie z.B. der Lunge die antigenspezifischen CD4+ T-Zellen in allen untersuchten Organen dramatisch ab (Tabelle 3). Eine Ausnahme bildet nur das Knochenmark, wo die Anzahl an antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen relativ konstant bleibt. Allerdings sind die Frequenzen in diesem 72 Organ generell sehr niedrig. Eine spezielle Akkumulation von CD4+ T-Zellen ist in keinem Organ nachweisbar. + + Abbildung 26 In vivo Kinetik CD4 und CD8 T-Zellen nach Wiederholungsinfektion mit Ovalbuminsezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova) in verschiedenen Organen. C57BL/6-Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis an L.m.-Ova infiziert. Die Frequenzen der Epitop-spezifischen + + CD8 (SIINFEKL) und CD4 (LLO190-201) wurden am Tag 7 und 35 nach Wiederholungsinfektion in 73 unterschiedlichen Organen durch intrazelluläre IFN-γ Färbung detektiert. Die entsprechenden Organe sind an der linken Seite vermerkt. Dargestellt werden repräsentativ aus zwei unabhängigen + + Experimenten exklusiv lebende CD8 bzw. CD4 Lymphozyten (y-Achse) gegen IFN-γ Färbung (x+ + Achse). Die Prozentzahlen beziehen sich auf die CD8 bzw. CD4 Lymphozyten der Organe in den korrespondierenden Quadranten. + + Tabelle 3: Mittelwerte der Prozentzahlen IFN-γ-produzierender CD4 (LLO190-201) und CD8 (SIINFEKL) T-Zellen mit Standardabweichungen. Die Zahlen sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente von jeweils zwei Mäusen vereinigt an Tag 7 und 35 nach Wiederholungsinfektion (N=4). Die prozentuale Abnahme über die Zeit entspricht der Formel 100 - (Mittelwert Tag 35 / Mittelwert Tag 7 x 100). *Werte für ein Experiment von jeweils zwei Mäusen gepoolt an Tag 7 und 35 nach Wiederholungsinfektion (N=2). Lymphknoten entsprechen peripheren Lymphknoten. Insgesamt zeigt sich, dass CD4+ Effektor-T-Zellen nach Erreichen ihrer maximalen Immunantwort kontinuierlich im gesamten Körper in ihrer Frequenz abnehmen und weder in lymphatischen noch in nicht-lymphatischen Organen auf hohem Niveau erhalten bleiben. Hiermit können in vivo Migrationeffekte weitestgehend ausgeschlossen werden. Dagegen werden antigen-spezifische CD8+ Gedächtnis-T-Zellen auf relativ hohem Niveau im gesamten Körper erhalten. 5.5 Dosisabhängigkeit der antigen-spezifischen CD8+ und CD4+ T-ZellAntwort nach Wiederholungsinfektion Sind unterschiedliche Antigen-Mengen für die Reexpansion von antigen- spezifischen CD4+ oder CD8+ Gedächtnis-T-Zell- Populationen notwendig? Um zu testen, ob sich das Verhältnis antigen-spezifischer CD4+ zu CD8+ Effektor-T-Zellen nach Reinfektion in Abhängigkeit von der Antigenmenge/Infektionsdosis verändert, 74 wurden C57BL/6-Mäuse zunächst mit einer sublethalen Dosis von L.m.-Ova infiziert und 35 Tage später mit unterschiedlichen Mengen von L.m.-Ova reinfiziert. Abbildung 27 Dosisabhängigkeit der Expansionsgröße von epitop+ + spezifischen CD4 und CD8 T-ZellPopulationen nach Wiederholungsinfektion mit Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova). C57BL/6Mäuse wurden i.v. primär mit einer sublethalen Dosis L.m.-Ova infiziert und 4 mit unterschiedlichen Dosen (1x10 , 5 5 1x10 , 2.5x10 ) pro Maus 35 Tage nach Primärinfektion mit L.m.-Ova reimmunisiert; die Frequenzen der Epitop+ + spezifischen CD8 und CD4 T-Zellen wurden am Tag 7 nach Wiederholungsinfektion bestimmt. (A) Die Frequenzen der LLO190-201-spezifischen + CD4 T-Zellen wurden durch intrazelluläre Zytokinfärbung bestimmt. Berechnet wurden die absoluten Zahlen Epitop-spezifischer IFN-γ (Balken) und TNF-α (-Balken) - produzierenden Zellen in der Milz, gezeigt werden die Mittelwerte und Standardabweichungen von 3 Mäusen je Gruppe. (B) Darstellung von repräsentativen H2b K /SIINFEKL Tetramer Färbungen von Milzzellen aus jeweils demselben Infektionsexperiment wie in + (A) gezeigt. Die dargestellten Zellpopulationen zeigen exklusiv lebende CD8 Lymphozyten; MHCTetramer Färbung (y-Achse) wird dargestellt gegen CD62L Expression (x-Achse); die korrespondierende Dosis der Infektion ist oberhalb jeder Darstellung gezeigt. Die Prozentzahlen + beziehen sich auf CD8 Lymphozyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten. Die Untersuchung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen nach in vitro Restimulation mit LLO190-201 mittels intrazellulärer Zytokinfärbung auf IFN-γ und TNF-α zeigt, dass mit zunehmender Infektionsdosis bei Wiederholungsinfektion die Populationsgröße der antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit der Antigenmenge/Infektionsdosis ansteigt. (Abbildung 27A). Aber selbst bei höchster Infektionsdosis von 2,5 x 105 L.m.-Ova nähert sich die Größe der antigenspezifischen CD4+ T-Zell-Populationen nicht der Größe der antigen-spezifischen CD8+ T-Zell-Populationen an. In Abbildung 27B wurden antigen-spezifische CD8+ T-Zell-Populationen bei steigenden Infektionsdosen untersucht, hier am Beispiel einer Kb/SIINFEKLTetramer-Färbung gezeigt. Die Populationsgrößen antigen-spezifischer CD8+ TZellen zeigen eine deutliche Abhängigkeit von der Antigendosis. Beeindruckend ist z.B., dass nach Reinfektion mit 250.000 L.m.-Ova rund 44 % aller CD8+ T-Zellen antigen-spezifisch für dieses Peptid sind. Dieses Ergebnis steht in guter Übereinstimmung mit anderen Arbeiten für das gut untersuchte CD8+ T-ZellKompartiment [150, 151], und lassen vermuten, dass die Infektionsdosis keinen 75 direkten Einfluss auf das Verhältnis der absoluten Größen induzierter antigenspezifischer CD4+ zu CD8+ T-Zellen bei Reinfektion mit L.m.-Ova hat. 5.6 Konkurrenzverhalten zwischen CD8+ und CD4+ T-Zellen während einer Infektion mit ovalbumin-exprimierenden Listeria monocytogenes Findet durch eine starke immundominante MHC-Klasse-Ia-restringierte CD8+ T- Zell-Antwort eine Behinderung oder aktive Suppression der Entwicklung der CD4+ TZell-Antwort statt? CD8+ T-Zell-Antworten gegen MHC-Klasse-Ia-restringierte Listerien-spezifische Epitope können während einer Wiederholungsinfektion sehr stark sein. Wie z.B. in Abbildung 27B gezeigt sind bis zu rund 44 % aller CD8+ T-Zellen spezifisch für das Epitop SIINFEKL. Deshalb wurde die Möglichkeit in Erwägung gezogen, dass eine sehr starke antigen-spezifische CD8+ T-Zell-Antwort während einer Wiederholungsinfektion die Expansion von Listerien-spezifischen CD4+ T-Zellen behindert. Eine solche Kompetition könnte sich z.B. auf Ebene der antigenpräsentierenden Zellen abspielen, dass heißt, nur eine limitierte Anzahl von T-Zellen (hier die „Übermacht“ der CD8+ T-Zellen) ist in der Lage, sich synchron Kontaktzonen an den antigen-präsentierenden Zellen für eine ausreichende T-Zell-Aktivierung und weitergehende Proliferation zu schaffen. Zusätzlich können antigen-präsentierende Zellen durch aktivierte antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen abgetötet werden, wodurch zusätzlich eine weitere Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen verhindert würde. Vorstellbar ist auch, dass starke CD8+ T-Zell-Antworten wichtige Wachstumsfaktoren (z.B. IL-2) so sehr aufbrauchen, dass sie nicht mehr in ausreichender Menge zur Verfügung stehen. Um diese Hypothesen zu überprüfen, wurden Infektionsexperimente mit unterschiedlichen Dosen von Listerien in An- bzw. Abwesenheit des Modell-Antigens Ovalbumin durchgeführt. So wurde zunächst in einer Primärinfektion mit L.m.-Ova eine starke SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zell-Antwort generiert. Die folgende Wiederholungsinfektion erfolgte wahlweise mit Wildtyp-Listerien (keine weitere SIINFEKL-Stimulation) bzw. L.m.-Ova (SIINFEKL-Stimulation vorhanden). In vitro Restimulation mit SIINFEKL zeigt wie erwartet nach Wiederholungsinfektion mit Wildtyp-L.m. keine Zunahme der SIINFEKL-spezifischen T-Zell-Frequenzen 76 (Abbildung 28). In vitro Restimulation mit SIINFEKL nach Wiederholungsinfektion mit L.m.-Ova zeigt eine sehr starke Immunantwort der SIINFEKL-spezifischen CD8+ T-Zellen. Für Listerien-spezifische Wiederholungsinfektion mit CD4+ T-Zellen Wildtyp-Listerien, in kann welcher im Falle also der keine immundominanten SIINFEKL-spezifischen T-Zell-Antworten vorhanden ist, im Vergleich zu einer Wiederholungsinfektion mit L.m.-Ova kein Unterschied in der Größe der CD4+ Listerien-spezifischen T-Zell-Antwort festgestellt werden. Diese Beobachtung legt nahe, dass eine negative Beeinflussung der Epitop-spezifischen CD4+ T-Zell-Populationen durch eine immundominante SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zell-Antwort sehr unwahrscheinlich ist. Abbildung 28 Immunisierung in An- bzw. Abwesenheit des Modell-Antigens Ovalbumin. C57BL/6Mäuse wurden zur Primärinfektion mit einer sublethalen Dosis von Ovalbumin-serzernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova) und 35 Tage später mit L.m.-Ova oder Wildtyp-Listerien (L.m.-wt) + + reimmunisiert; die Frequenzen der epitop-spezifischen CD8 und CD4 T-Zellen wurden am Tag 7 nach Wiederholungsinfektion durch intrazelluläre Zytokinfärbung bestimmt. Berechnet wurden die absoluten Zahlen der epitop-spezifischen T-Zellen nach Wiederholungsinfektion mit L.m.-wt (Balken) bzw. L.m.-Ova (- Balken) von IFN-γ-produzierenden Zellen in der Milz, gezeigt werden die Mittelwerte und Standardabweichungen von 3 Mäusen je Gruppe. Mit diesem experimentellen Ansatz konnte aber nicht die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass in Abwesenheit einer dominanten SIINFEKLspezifischen CD8+ T-Zell-Antwort eine andere MHC-Klasse-I-restringierte T-ZellAntwort diese Rolle übernimmt, die ihrerseits die CD4+ T-Zell-Antwort suppremieren könnte. Zusätzlich zeigen die bisherigen Daten nicht einmal, ob Epitop-Kompetition unter den gegebenen Vorraussetzungen im Listerien-Modell überhaupt stattfinden kann. Um dies zu untersuchen, wurden für die folgenden Experimente CB6 Mäuse (BALB/c x C57BL/6 – F1) verwendet. Hierbei handelt es sich um einen experimentellen Modellansatz, in dem eine große Variation von MHC-Klasse-Ia 77 Listerien-Epitopen präsent ist und sowohl H2d- und H2b-restringierte T-Zell-Antworten simultan detektiert werden können [26]. Wahlweise wurde eine Primärinfektion mit L.m.-Ova (SIINFEKL-Stimulation vorhanden) bzw. Wildtyp-L.m. (keine SIINFEKLStimulation) durchgeführt. + Abbildung 29 Kompetition von epitop-spezifischen CD8 T-Zellen in der CB6 Maus. CB6 Mäuse (BALB/c x C57BL/6 – F1) wurden zur Primärinfektion i.v. mit einer sublethalen Dosis von Ovalbuminsezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova) oder Wildtyp-Listerien (L.m.-wt) infiziert. 7 Tage nach Primärinfektion wurden die Frequenzen von MHC-Klasse-Ia-restringierten (SIINFEKL, LLO91-99, p60217-225) oder MHC-Klasse-II-(LLO190-201)-restringierten T-Zell-Antworten durch MHC-Tetramerund/oder intrazellulärer Zytokinfärbung in der Milz bestimmt. (A) Gezeigt werden repräsentative + Ergebnisse als MHC-Tetramerfärbung (obere 4 Darstellungen; exklusiv lebende CD8 Lymphozyten + dargestellt) und intrazellulare Zytokinfärbung (untere 2 Darstellungen; exklusiv lebende CD4 Lymphozyten dargestellt) infiziert mit L.m.-wt (linke Spalte) bzw. L.m.-Ova (rechte Spalte). Die MHCTetramer-Reagenzien oder Peptide (für die intrazelluläre Zytokinfärbung) sind an der linken Seite benannt. Dargestellt werden auf der x- und y-Achse MHC-Tetramer und CD62L (MHC-TetramerFärbung) oder INF-γ und TNF-α (intrazelluläre Zytokinfärbung). Die Prozentzahlen beziehen sich auf + + lebende CD4 bzw. CD8 Lymphozyten in den korrespondierenden Quadranten. (B) Die Frequenzen + + der epitop-spezifischen CD4 und CD8 T-Zellen wurden durch intrazelluläre Zytokinfärbung bestimmt. Berechnet wurden die absoluten Zahlen der epitop-spezifischen T-Zell-Populationen (y-Achse) nach Infektion mit L.m.-wt (-Balken) bzw. L.m.-Ova (- Balken) von IFN-γ-produzierenden Zellen. Peptide, die für die in vitro Stimulation verwendet wurden, sind auf der x-Achse genannt. Dargestellt sind die Mittelwerte mit den Standardabweichungen (Student`s t-Test) der signifikanten Werte zur Ermittlung der Unterschiede zwischen beiden Gruppen (n.s. – nicht signifikant). Dieses Ergebnis ist repräsentativ für 4 Mäuse je Gruppe. Gezeigt werden in Abbildung 29A FACS-Daten der Detektion antigenspezifischer T-Zell-Populationen. Eine Färbung mit Kb/SIINFEKL-Tetramer ist nach Infektion mit Wildtyp-L.m. (Abbildung 29A, oben links) nicht nachweisbar; dagegen ist nach Infektion mit L.m.-Ova eine klare SIINFEKL-spezifische CD8+ T-ZellPopulation abgrenzbar (3,61 % aller CD8+ T-Zellen, Abbildung 29A, oben rechts). 78 Die Färbung mit Kd/LLO91-99-Tetramer auf LLO91-99-spezifische CD8+ T-Zellen zeigt nach Infektion mit Wildtyp-L.m. und L.m.-Ova gut abgrenzbare LLO91-99-spezifische CD8+ T-Zell-Populationen. So können nach Infektion mit Wildtyp-L.m. 2,93 % der CD8+ T-Zellen als LLO91-99-spezifisch detektiert werden (Abbildung 29A, Mitte links); dagegen sind nach Infektion mit L.m.-Ova nur 0,91 % der CD8+ T-Zellen spezifisch für das Peptid LLO91-99 (Abbildung 29A, Mitte rechts). Listerien-spezifische CD4+ TZellen wurden durch in vitro Restimulation mit LLO190-201 und nachfolgender intrazellulIärer Zytokinfärbung detektiert. Dabei scheint es unerheblich zu sein, ob die vorangegangene Infektion mit Wildtyp-L.m. (1,04 % IFN-γ+/TNF-α+) oder L.m.-Ova (1,16 % IFN-γ+/TNF-α+) erfolgt ist (Abbildung 29A, unten rechts). In Abbildung 29B sind zusätzlich die absoluten Zellzahlen der Detektion unterschiedlicher antigen-spezifischer T-Zell-Population in Abhängigkeit der Infektion ohne Ovalbumin (Infektion mit Wildtyp-L.m.) bzw. mit Ovalbumin (Infektion mit L.m.- Ova) dargestellt. Die sehr starke SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zell-Antwort führt zu einer Kompetition innerhalb des CD8+ T-Zell-Kompartimentes. Diese Kompetition innerhalb des CD8+ T-Zell-Kompartiments wurde auch in anderen Studien beobachtet [152]. Unabhängig von der Präsenz oder der Abwesenheit von zusätzlichen immundominanten CD8+ T-Zell-Antworten bleibt aber die Größe der LLO190-201 spezifischen CD4+ T-Zell-Population unverändert (Abbildung 29B). Diese Daten lassen vermuten, dass sich CD8+ und CD4+ Listerien-spezifische T-Zell-Populationen relativ unabhängig voneinander entwickeln. 5.7 Funktionsunabhängige Detektion von antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen Können durch MHC-Klasse-II-Tetramere eventuell CD4+ T-Zellen detektiert werden, die durch die bisher gemessenen Effektorfunktionen nicht detektiert werden können? Durch intrazelluläre Zytokinfärbungen können nur antigen-spezifische TZellen detektiert werden, die auch nach in vitro Restimulation die untersuchten Zytokine produzieren. Unter der Betrachtung der Ergebnisse aus Untersuchungen von CD8+ T-Zellen wissen wir, dass die Messung zytokin-produzierender Zellen mit der Anzahl der durch MHC-Klasse-I-Tetramere sichtbar gemachten antigenspezifischen CD8+ T-Zellen nicht immer gut korreliert (Abbildung 30). Dargestellt ist die funktionsunabhängige Detektion durch Kb/SIINFEKL-Tetramerfärbung im direkten 79 Vergleich zu einer funktionsabhängigen Detektion mittels intrazellulärer Zytokinfärbung zur Detektion der IFN-γ und TNF-α-Produktion. + Abbildung 30 Vergleichende Detektion antigen-spezifischer CD8 T-Zell-Populationen durch Tetramer- und intrazelluläre Zytokinfärbung nach Infektion mit Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova). C57BL/6-Mäuse wurden primär i.v. mit einer sublethalen Dosis von L.m.Ova infiziert und 35 Tage später mit L.m.-Ova reimmunisiert. Am Tag 7 nach Wiederholungsinfektion + b wurden antigen-spezifische CD8 Milzzellen (y-Achse) durch Färbung mit H2-K /SIINFEKL Tetramer bzw. durch intrazelluläre Zytokinfärbung nach in vitro Restimmulation mit SIINFEKL auf IFN-γ und TNF-α untersucht (x-Achse). Gezeigt werden repräsentative Ergebnisse als MHC-Tetramerfärbung (links) und intrazelluläre Zytokinfärbung (IFN-γ - Mitte und TNF-α - rechts). In der oberen Reihe sind die korrespondieren ungefärbten bzw. Isotypkontrollen dargestellt. Dargestellt werden exklusiv + + lebende CD8 Lymphozyten. Die Prozentzahlen beziehen sich auf lebende antigen-spezifische CD8 Lymphozyten in den korrespondierenden Quadranten. In ähnlicher Weise könnten auch für die Untersuchung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen Zytokinfärbungen die Größe der tatsächlich gebildeten ZellPopulationen unterschätzen. Daher war es notwendig, an der Herstellung von MHCKlasse-II-Tetrameren zu arbeiten. Am besten wäre es, in Analogie zu MHC-KlasseIa, diese Detektionsmöglichkeit direkt auf das MHC-Klasse-II-System zu übertragen. 5.7.1 Generierung von Klasse-II-Multimeren In Kollaboration mit Luc Teyton (Scripps, USA) wurden die ersten Konstrukte durch Klonierung der α- und der β-Kette in den Expressionsvektor pRmHa3, synthetisiert (Abbildung 31). Luc Teyton verfügt durch seine Arbeiten im Bereich der Kristallstrukturanalyse über einen hohen Erfahrungsschatz im Bereich von MHCKlasse-II Molekülen [51, 52, 113]. Die Bindung der verwendeten Epitope erfolgte kovalent-gebunden an die βKette und das MHC-Klasse-II-Molekül wurde zusätzlich durch Anhängen von 80 sekundären Stabilisator-Sequenzen (sogenannte Leuzin-reiche „Zipper“ [54]) stabilisiert. Abbildung 31 Schematische Darstellung des MHC-Klasse-II-Konstruktes vor Multimerisierung. Gezeigt wird die, durch Leuzin-reiche „Zipper“, stabilisierte Form des MHC-Klasse-II-Konstruktes. An der α-Kette des Klasse II Moleküls befindet sich eine Biotinylierungssequenz zur in-vitro Biotinilierung und ein „His-tag“ zur Aufreinigung des Proteins. Das zu integrierende Epitop ist über einen Linker kovalent an die β-Kette des MHC-Klasse-II-Moleküls gebunden. Zunächst wurde versucht, die beiden MHC-I-Ad-Klasse-II-Moleküle mit kovalent gebunden Epitopen p60301-312 und OVA323-339 zu synthetisieren. Beide Konstrukte konnten in großem Maßstab aus Insektenzellkulturen synthetisiert und aufgereinigt werden. Die Effizienz der Biotinylierungs-Reaktion wurde durch einen StreptavidinShift Assay kontrolliert. Hierzu inkubiert man biotinylierte MHC-Komplexe und trägt die Proben anschließend zusammen mit einer nicht-Avidin-behandelten Kontrolle auf, so entsteht durch die Avidin-Bindung ein Verschiebung der Bande der Molekülkette auf ein höheres Molekulargewicht. Verbleibt das synthetisierte Molekül bei seiner ursprünglichen Größe, ist es nicht biotiniliert. Leider musste festgestellt werden, dass mit der verwendeten Biotinylierungsequenz nur eine unzureichende in vitro Biotinylierung der Konstrukte möglich war (Abbildung 32). Dass eine in vitro Biotinylierung von MHC-Klasse-IIMolekülen aus dem Insektenzellsystem unter Verwendung der Biotinilierungssequenz #45 [114] nicht effizient möglich ist, konnte auch durch Luc Teyton (Scripps, USA) bestätigt werden. So wurde durch eine Umklonierung die Biotinylierungssequenz zu #85 geändert [114] und gleichzeitig versucht, das durch Geginat et al. [128] beschriebene, über I-Ab restringierte MHC-Klasse-II-Epitop LLO190-201, in den entsprechenden Konstrukten in Schneider-Zellen chromosomal durch Kotransfektion zu integrieren. Auch unter Einsatz verschiedener Transfektionsmethoden gelang es allerdings nicht, eine erfolgreiche Kotransfektion zu erreichen. 81 Abbildung 32 Streptavidin-Shift Assay von MHC-Klasse-I- und II-Molekülen. Gezeigt wird mittels Proteingelchromatographie (10% SDS-PAGE) eine Coomassie-Färbung unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Hierzu werden biotinilierte MHC-Komplexe (A,D), biotinilierte MHC-Komplexe gemeinsam mit Avidin (B,E) und Avidin alleine (C,F) aufgetragen. Durch die Avidin-Bindung am MHCMolekül ergibt sich eine Verschiebung der Bande der Molekülkette auf ein höheres Molekulargewicht. Verbleibt das synthetisierte Molekül bei seiner ursprünglichen Größe, ist es nicht biotinyliert. Bei dem zu dieser Problematik durchgeführten Erfahrungsaustausch mit Luc Teyton wurde der Verdacht geäußert, dass es sich wahrscheinlich um ein Problem mit der Peptid-Sequenz von LLO190-201 handelt. So sind MHC-Klasse-II-Epitope sehr lang und vielfach nur ungenau auf die wirkliche minimale Epitopsequenz untersucht. Wenn das Peptid zu lang ist und nicht der eigentlichen Epitopsequenz entspricht, kann dies zu unterschiedlichen Bindungsmöglichkeiten in der Peptidbindungsgrube des MHC-Klasse-II-Moleküls führen. Eventuelle Peptid-„Überhänge“ können auch die Rückfaltung bei der Synthese von MHC-Klasse-II-Tetrameren bzw. die T-ZellErkennung stören. Verstärkt wird diese Annahme dadurch, dass in einigen wenigen Fällen die MHC-Tetramer-Technologie erfolgreich auf die Untersuchung von Epitopspezifischen TH Zell-Populationen übertragen [153-158] werden konnte. Hierbei war das exakte T-Zell-Epitop immer sehr gut bestimmt. So wurde der Entschluß gefasst, ein Feinmapping des immundominanten MHC-Klasse-II-Epitops LLO190-201 durchzuführen. 82 5.7.2 Feinmapping des immundominanten Klasse-II Epitops LLO190-201 Zunächst wurde überprüft, ob es sich bei dem publizierten Epitop tatsächlich um die minimale Epitop-Sequenz handelt. Dazu wurde eine Peptid-Bibliothek (Jerini), Berlin) generiert, wobei vom N- wie auch vom C- terminalen Ende der PeptidSequenz nacheinander jeweils eine Aminosäure entfernt wurde (Abbildung 33). Abbildung 33 Überprüfung der minimalen Epitop-Länge. Es wurde eine Peptid-Bibliothek (Jerini), Berlin) generiert, wobei jeweils vom N- als auch vom C- terminalen Ende der Peptid-Sequenz ausgehend nacheinander jeweils eine Aminosäure entfernt wurde. Die so generierten Peptide wurden auf ihre Funktionalität mittels intrazellulärer Zytokinfärbung getestet, wobei sich zeigte, dass eine „Wegnahme“ nur einer Aminosäure zu einer extremen Abnahme der in vitro Antwort führt (Abbildung 34). Abbildung 34 In vitro Antwort von Milzzellen auf verkürzte Peptidsequenzen. C57BL/6-Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis an Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes (L.m.-Ova) + infiziert. Die Frequenzen der epitop-spezifischen CD4 T-Zellen wurde am Tag 7 nach Primärinfektion durch intrazelluläre Färbung für IFN-γ (x-Achse) und TNF-α (y-Achse) bestimmt. + Dargestellt werden repräsentativ aus zwei unabhängigen Experimenten exklusiv lebende CD4 Lymphozyten. Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Gesamtlymphozyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten; zur in vitro Stimulation verwendete Peptid-Sequenzen sind oberhalb der jeweiligen Dot-Plots genannt. 83 Dieses Ergebnis ist nicht verwunderlich, da auch nach den publizierten Ergebnissen [128] gerade eine Sequenzverringerung am C- terminalen Ende zu einer drastischen Abnahme der INF-γ Detektion (ELISPOT) führte. Allerdings ist bereits hier der Hinweis zu finden, dass eine Verschiebung der Sequenz am N-terminalen Ende keine so großen Effekte wie am C-terminus zur Folge hat. So wurde weitergehend eine schrittweise Elongation der Peptid-Sequenz am Nterminalen Ende vorgenommen (Abbildung 35). Abbildung 35 Elongation der Peptid-Sequenz LLO190-201. Es wurde eine Peptid-Bibliothek (Jerini), Berlin) generiert, wobei durch Hinzufügen jeweils einer weiteren Aminosäure am N-Terminus eine Elongation erfolgte. Bei nachfolgender in vitro Stimulation von Milzzellen stellte sich heraus, dass eine Verlängerung der Peptid-Sequenz um zwei weitere Aminosäuren zu einem merklichen Anstieg der gemessenen antigen-spezifischen T-Zell-Populationsgrößen führt (Abbildung 36). Abbildung 36 Anstieg der IFN-γ-produzierenden Populationsgrößen nach Verlängerung der PeptidSequenz LLO190-201 am N-terminus. C57BL/6-Mäuse wurden i.v. mit einer sublethalen Dosis an Ovalbumin-sezernierenden Listeria monocytogenes infiziert. Die Frequenzen der epitop-spezifischen + CD4 T-Zellen wurde am Tag 7 nach Primärinfektion durch intrazelluläre Färbung für IFN-γ (x-Achse) und TNF-α (y-Achse) bestimmt. Dargestellt werden repräsentativ aus zwei unabhängigen + Experimenten exklusiv lebende CD4 Lymphozyten. Die Prozentzahlen beziehen sich auf die 84 Gesamtlymphozyten der Milz in den korrespondierenden Quadranten; zur in vitro Stimulation verwendete Peptid-Sequenzen sind jeweils oberhalb der Darstellung genannt. Mit dem Epitop LLO188-201 war die höchste Frequenz antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen detektierbar, bei weiterer Elongation der Sequenz war keine weitere Erhöhung der CD4+ T-Zell-Frequenzen erkennbar. Aus zeitlichen Gründen wurde die Generierung von MHC-Klasse-II-Multimeren innerhalb unserer Arbeitsgruppe abgegeben. Mit der Peptid-Sequenz LLO188-201 konnte Robert Knall (Institut für Mikrobiologie und Hygiene, TU-München) kürzlich erfolgreich MHC-Klasse-II-Tetramere herstellen. Erste Untersuchungen zeigen, dass mit diesen Reagenzien funktionelle Färbungen an antigen-spezifischen CD4+ TZellen möglich sind. Von daher waren die Epitop-Mapping-Studien wichtige Grundlage für die erfolgreiche Herstellung von I-Ab-Tetrameren für das ListerienInfektionsmodell. 85 6 Diskussion Unser Wissen über die Kinetiken und die Dynamiken komplexer krankheitserreger-spezifischer CD8+ T-Zell-Antworten und die Untersuchungen der in vivo Entwicklung CD8+ Gedächtnis-T-Zellen hat sich über die letzten Jahre wesentlich verbessert; im Vergleich dazu wissen wir nach wie vor relativ wenig über CD4+ T-Zell-Populationen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, in einer ex vivo Analyse das Verhalten von CD4+ TH-Zellen im Vergleich zu CD8+ T-Zellen im Verlauf einer adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Hierzu wurde ein experimentelles Modell entwickelt, dass die gleichzeitige Detektion von immundominanten epitop-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen während einer Infektion möglich macht. Es wurden erreger-spezifische T-Zellen im Verlauf einer bakteriellen Immunantwort mit Hilfe von MHC-Tetramer Reagenzien und intrazellulärer Zytokinfärbungen direkt ex vivo sichtbar gemacht. Phänotypische Veränderungen von CD4+ und CD8+ T-Zellen, welche über den Krankheitserreger Listeria monocytogenes exprimierte Antigene reagieren, wurden genau untersucht und miteinander verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die in vivo Kinetik der CD8+ und CD4+ TZellen während der Primär- als auch der Wiederholungsinfektion sehr ähnlich sind. Allerdings lassen sich auch deutliche Unterschiede zwischen den beiden T-ZellKompartimenten aufzeigen. So zeigen bakterien-spezifische T-Helfer Zellen gegenüber den MHC-Klasse-Ia-restringierten T-Zellen während der Effektorphase ein anderes Zytokin-Expressionsmuster und expandieren nach wiederholtem Antigenkontakt zu wesentlich geringeren Populationsgrößen. Die vergleichsweise geringe Expansion der Listerien-spezifischen CD4+ T-Zellen nach einer zweiten Infektion stellt aber keine wettbewerbsbedingte Folge aus einem Konkurrenzkampf der CD4+ und CD8+ T-Zellen - z.B. um antigen-präsentierende Zellen - dar, sondern scheint mehr eine Konsequenz einer unzureichenden Erhaltung von CD4+ Gedächtnis-T-Zellen zu sein. Diese Ergebnisse zeigen wichtige Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen diesen beiden T-Zell-Kompartimenten auf, die u.a. zum besseren Verständnis für die Entwicklung effektiverer Impfstrategien beitragen könnten. 86 6.1 Etablierung des experimentellen Systems Alle bekannten immundominanten Epitope, die für einen direkten Vergleich von CD4+ und CD8+ T-Zellen nach Infektion mit Listeria monocytogenes (L.m.) herangezogen werden könnten, befinden sich auf unterschiedlichen genetischen Hintergründen. So sind derzeit nur immundominante MHC-Klasse-Ia-Epitope in der BALB/c-Maus (H-2d) und nur immundominante MHC-Klasse-II-Epitope (H-2b) in der C57BL/6-Maus bekannt. Um sich zunächst einen Überblick über dieses System zu verschaffen, wurde nach Primärinfektion mit L.m. eine in vitro Restimulation mit hitzeinaktivierten Listerien (HKL) durchgeführt. Es ist bekannt, dass in der BALB/c-Maus nach in vitro Restimulation mit HKL - wenn überhaupt - nur eine sehr schwache CD8+ T-ZellAntwort dedektiert werden kann [138]. Dagegen zeigt eine in vitro Restimulation mit HKL nach Primärinfektion in der C57BL/6-Maus eine intermediär dominante CD8+ TZell-Antwort, die auch subdominant während der Wiederholungsinfektion zu detektieren ist. Diese Effektorantwort CD8+ T-Zellen kann durch die bereits bekannte über H2-M3 restringierte CD8+ T-Zell-Antwort erklärt werden, welche bei Primärinfektion wesentlich höher als bei Wiederholungsinfektion ist [131-133]. Hierbei werden Antigene aus HKL über einen alternativen Präsentationsweg über das MHCKlasse-Ib-Molekül H2-M3 präsentiert [138]. Antigen-spezifische CD4+ Effektor-TZellen zeigen nach Primärinfektion mit L.m. und folgender in vitro Restimulation mit HKL in der BALB/c-Maus nur eine sehr schwache CD4+ TH-Zell-Antwort. Nach Wiederholungsinfektion ist diese TH-Zellantwort häufig sogar geringer oder erreicht nur ähnlich niedrige Frequenzen im Vergleich zur Primärantwort. In der BALB/c-Maus ist bisher nur das im Kontext mit MHC-Klasse-II-(I-Ad)-präsentierte Epitop p60301-312 bekannt [134], welches aber wohl eher zu einer subdominanten antigen-spezifischen CD4+ T-Zell-Antwort führt. Somit scheinen keine immundominanten Epitope, die im Kontext mit MHC-Klasse-II präsentiert werden, in der BALB/c-Maus vorhanden zu sein. Die antigen-spezifische CD4+ T-Zell-Antwort nach Primärinfektion mit L.m. und folgender in vitro Restimulation mit HKL in der C57BL/6-Maus zeigt dagegen eine immundominante antigen-spezifische CD4+ T-Zell-Antwort, die in leicht verminderter Größe auch während der Wiederholungsinfektion zu detektieren ist. Diese antigenspezifische CD4+ T-Zell-Antwort in der C57BL/6-Maus kann den bekannten im 87 Kontext mit MHC-Klasse-II-präsentierten Epitopen LLO190-201, LLO253-264 und LLO318-329 zugeordnet werden [128]. Spielen vielleicht genetische Hintergründe bezüglich der unterschiedlichen immundominanten Antworten CD4+- und CD8+ T-Zell-Antworten in der BALB/c- bzw. der C57BL/6-Maus eine Rolle? Zur Beantwortung dieser Frage wurden Versuche in kongenen Mausstämmen durchgeführt (B10.D2-H2d), die ein sehr eindrucksvolles Ergebnis zeigten. In der B10.D2-H2d-Maus (die einer C57BL/6-Maus ähnlich ist, aber den Haplotyp d besitzt – daher H-2d) lässt sich nach Primärinfektion mit L.m. und folgender in vitro Restimulation mit HKL eine deutlich stärkere Immunantwort Listerien-spezifischer CD4+ T-Zellen nachweisen. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass der Grund einer verminderten CD4+ T-Zellantwort in der BALB/c-Maus nicht in einem generellen Fehlen von geeigneten immundominanten H-2d-MHC-Klasse-IIEpitopen im Listerien-Proteom zu suchen ist, sondern dass hierfür genetische Faktoren außerhalb des MHC-Klasse-II-Locus verantwortlich sind. Für MHC-KlasseIa-restringierte CD8+ T-Zell-Antworten bleibt die Frage nach dem Einfluß der genetischen Prädisposition offen, da eine Stimulation mit HKL für Epitope, die im Kontext mit MHC-Klasse-Ia präsentiert werden, nicht aussagekräftig ist. Da in der BALB/c Maus mit den vorliegenden Daten keine im Kontext mit MHC-Klasse-II präsentierten immundominanten Epitope aufgezeigt werden konnten, wurde die Suche nach H-2b restringierten MHC-Klasse-Ia-Epitopen in der C57BL/6Maus über ein Epitop-Sreening durchgeführt. Hierzu wurden vorhergesagte Epitope mit einer hohen Bindungswahrscheinlichkeit, die nach dem SYFPEITHI Algorithmus ermittelt wurden [120], verwendet. Leider konnte selbst mit diesen umfangreichen Untersuchungen nur das neue subdominante LLO4-11 aus der „leader Sequenz“ des Listeriolysin O stammend gefunden werden. So kann zwar nicht ausgeschlossen werden, dass weitere im Kontext mit MHC-Klasse-Ia-präsentierte Listerien – Epitope vorhanden sind, jedoch bleibt mit den bekannten Listerien-Epitopen eine parallele Detektion von listerien-spezifischen CD4+ - und CD8+ T-Zellantworten versagt. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde die Verwendung des bekannten ModellAntigens Ovalbumin zur Generierung antigen-spezifischer CD8+ T-Zellantworten in der C57BL/6-Maus in Erwägung gezogen [159]. Auf Basis der oben beschriebenen Ergebnisse, die möglicherweise auf verminderte MHC-Klasse-Ia-restringierte CD8+ T88 Zell-Antworten bei Listerien-Infektion von C57BL/6 Mäusen hinweisen, war zunächst unklar, ob in diesem Modell gegen Ovalbumin gut detektierbare CD8+ T-ZellPopulationen gefunden werden können. Dies konnte mit Hilfe eines Listerienstammes getestet werden, der rekombinantes Ovalbumin exprimiert und sezerniert (freundlicherweise durch Hao Shen - University of Pennsylvania, Philadelphia zur Verfügung gestellt, [145]). Wie sich zeigte, konnte mit diesem Listerien-Stamm eine immundominante ovalbumin-spezifische CD8+ T-Zellantwort erzeugt werden, welche eine gleichzeitige Listerien-spezifische CD4+ T-Zellantwort nicht behindert. Diese Ergebnisse zeigen, grundsätzlichen (genetischen) Defekt haben, dass C57BL/6-Mäuse immundominante keinen CD8+ T-Zell- Antworten gegen über Listerien-exprimierte Antigene zu entwickeln. Gleichzeitig konnte auf diese Art und Weise ein murines Listeriose-Modell-System etabliert werden, dass die gleichzeitige Detektion antigen-spezifischer CD4+ - und CD8+ TZellen ermöglichte. 6.2 Kinetiken antigen-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen während Infektion mit Listeria monocytogenes Mit dem in 5.1.3 etablierten experimentellen Modell konnten nun die Antworten antigen-spezifischer CD4+ und CD8+ Effektor-T-Zellen während einer bakteriellen Infektion erstmals gleichzeitig analysiert und verglichen werden. Die Untersuchung der in vivo Kinetiken der Immunantworten zeigte, dass die beiden T-Zell Kompartimente sich während der Primär- und Wiederholungsinfektion zeitlich sehr ähnlich verhalten. Die allgemeine Kinetik von antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen während der Expansions- und Kontraktionsphase verläuft, mit Blick auf detektierbare Effektorfunktionen (IFN-γ- und TNF-α-Produktion), synchronisiert. Über eine Synchronie innerhalb des CD8+ T-Zell Kompartimentes berichten bereits frühere Studien für unterschiedliche Listerien-Epitope im Kontext mit MHC-Klasse-Ia [1, 42]. Dies war zunächst überraschend, da angenommen wurde, dass die Präsenz des Antigens die bestimmende Komponente für die in vivo Kinetik CD8+ T-Zellen ist. Da sich die Halbwertszeiten von Listerien-Antigen massiv unterscheiden, waren die koordinierten in vivo Kinetiken CD8+ T-Zellen zunächst schwer verständlich. Spätere 89 Studien zeigten allerdings, dass die Expansions- und Kontraktionsphase auch in der frühen Phase der Immunantwort weitestgehend unabhängig vom Verlauf der Infektion, einschließlich Antigen-Prävalenz und Dauer der Infektion, sind [1, 150, 160162]. So weiß man mittlerweile, dass innerhalb der ersten 24-48 Stunden nach Antigenkontakt die initiale Prägung der antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen stattfindet und dass die nachfolgende Expansion und Kontraktion auch ohne weiteren Einfluss von Antigenkontakt abläuft [163, 164]. Kürzlich wurde zusätzlich berichtet, dass auch für antigen-spezifische CD4+ T-Zellen Dauer von Infektion und Antigen-Prävalenz kaum Einfluss auf die Kinetik während einer Infektion mit L.m. hat [87]. Die Resultate dieser Arbeit sind damit in guter Übereinstimmung mit früheren Studien an CD8+ T-Zellen und weisen darauf hin, dass die initiale Aktivierung und die Programmierung von Epitop-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen innerhalb eines ähnlichen Zeitrahmens während der Infektion statfinden. Diese Interpretation der vorliegenden Ergebnisse wird gestützt durch Arbeiten in anderen experimentellen Modellen, z.B. durch Studien mit CD4+ TCR transgenen Zellen [34], oder einer Publikation, in welcher die Autoren über synchronisierte in vivo Kinetiken CD8+ und CD4+ T-Zell Antworten während einer viralen Infektion (LCMV) berichten [165]. 6.3 Zytokinexpressionsmuster von Listerien-spezifischen CD4+ und CD8+ TZellen Obwohl die allgemeine Kinetik von CD4+ und CD8+ T-Zell Antworten während einer Infektion mit L.m. synchronisiert verläuft, deckten unsere Studien einige wichtige Unterschiede zwischen den verschiedenen T-Zell Kompartimenten auf. Listerien-spezifische TH Antworten sind durch eine erstaunliche hohe funktionale Homogenität gekennzeichnet, welche im Verlauf der Immunantwort bemerkenswert beständig bleibt. So produzieren nahezu alle Listerien-spezifischen CD4+ T-Zellen im Verlauf der Immunantwort gleichzeitig INF-γ und TNF-α. Im Gegensatz dazu sind Listerien-spezifische CD8+ T-Zell-Populationen insbesondere während der Effektorphase durch verschiedene Expressionsmuster von IFN-γ und TNF-α gekennzeichnet (Abbildung 24 und [166]). Die meisten Listerien-spezifischen CD8+ T-Zellen produzieren IFN-γ, dabei kann nur eine Subpopulation zusätzlich TNF-α produzieren. 90 Die funktionelle Aufsplittung innerhalb der epitop-spezifischen CD8+ T-Zellen wird besonders am Maximum der Immunantwort sichtbar. In der Expansions- und Kontraktionsphase werden die Zytokinexpressionsprofile zunehmend homogener. Diese Beobachtung unterscheidet sich von vielen viralen Infektionsmodellen, in denen IFN-γ und TNF-α Expressionsprofile während der unterschiedlichen Stadien der Immunantwort ähnlich sind [165]. Eine mögliche Interpretation für dieses heterogene Zytokinexpressionsprofil, das für bakterium-spezifische CD8+ Effektor-TZellen beobachtet wird, ist, dass sie die Diversität innerhalb der antigen-spezifischen T-Zell Populationen widerspiegelt und Subpopulationen aufzeigt, die sich in ihren Effektorfunktionen und/oder in vivo Proliferations-Eigenschaften und LangzeitÜberlebensfähigkeit (Gedächtnis) unterscheiden. Die weitere Charakterisierung dieser unterschiedlichen Subpopulationen kann von besonderem Interesse für weitere Studien sein, da diese T-Zellen möglicherweise unterschiedliche Aufgaben für die Vermittlung und Erhaltung schützender Immunität übernehmen. 6.4 Reexpansion von antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ Effektor-T-Zellen nach Wiederholungsinfektion Im Vergleich zu MHC-Klasse-Ia-restringierten T-Zellen expandieren Listerien- spezifische TH-Zellen nach Wiederholungsinfektion zu deutlich kleineren maximalen Populationsgrößen. Die vorliegenden Daten favorisieren die Interpretation, dass die verminderte Reexpansion der antigen-spezifischen TH-Zellen direkt mit den verminderten CD4+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellpopulationen in Zusammenhang steht. Eine weitere Möglichkeit für die verringerte CD4+ T-Zell-Antwort nach Wiederholungsinfektion wäre z.B., dass die Expression von MHC-Klasse-IIMolekülen durch die starke IFN-γ-Produktion der Listerien-spezifischen CD8+ TZellen herunterreguliert ist. So konnte nach Infektion mit Toxoplasma gondii kürzlich beobachtet werden, dass IFN-γ die Genexpression von MHC-Klasse-II-Molekülen stark herunterregulieren kann und dadurch die Antigen-Präsentation an CD4+ TZellen vermindert wird [167, 168]. Für Infektionen mit Listeria monocytogenes wurden solche Effekte bisher aber noch nicht gezeigt. 91 6.5 Dosisabhängigkeit der Reexpansion CD4+ Gedächtnis-T-Zellen Wie für das I-Ab-restringierte Epitop LLO190-201 in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, können bakterien-spezifische CD4+ T-Zell-Antworten nach Primärinfektion immundominant sein und Populationsgrößen erreichen, die mit immundominanten MHC-Klasse-Ia-restringierten T-Zell Populationen vergleichbar sind. Es konnte in unterschiedlichen experimentellen Systemen für das CD8+ T-Zell Kompartiment gezeigt werden, dass eine wiederholte Infektion mit unterschiedlich hohen Dosen des Erregers zu einer deutlich höheren Expansion antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen führt [42, 169]. Im Gegensatz hierzu zeigt eine Reimmunisierung mit hohen Infektionsdosen von L.m. keine substanzielle Änderung des Verhältnisses expandierender antigen-spezifischer TH-Zellen und CD8+ T-Zellen zueinander. Eine starke immundominante CD8+ Antwort könnte eine TH-Zellantwort behindern, und damit die niedrigeren Frequenzen Listerien-spezifischer CD4+ TZellen nach Wiederholungsinfektion erklären. Innerhalb des CD8+ T-Zell- Kompartiments konnte in verschiedenen früheren Studien gezeigt werden, dass eine stark immundominante CD8+ Antwort andere „schwächere“ MHC-Klasse-Ia- restringierte Epitope negativ beeinflussen kann [152, 170, 171]. Kompetition zwischen beiden T-Zell-Kompartimenten ist bisher in der Literatur nicht beschrieben worden. 6.6 Kompetition zwischen CD8+ und CD4+ T-Zellen Die Beobachtungen in 6.5 wurden zunächst als Konsequenz einer dominierenden antigen-spezifischen CD8+ T-Zellantwort interpretiert, die es den CD4+ Listerien-spezifischen T-Zellen nicht erlaubt aktiviert zu werden und in vivo zu expandieren. Durch Immunisierungen in An- und Abwesenheit des Modell-Antigens Ovalbumin konnte aber gezeigt werden, dass in diesem Modellsystem eine sehr starke antigen-spezifische CD8+ T-Zellantwort keinen signifikanten Einfluss auf die Expansion antigen-spezifischer CD4+ Effektor-T-Zellen hat. Dies ist ein sehr interessantes Ergebnis, insbesondere wenn man annimmt, dass dieselbe antigenpräsentierende Zelle das gesamte Spektrum von MHC-Klasse-I- und -Klasse-IIrestringierten Listerien-Epitopen an T-Zellen präsentiert. In diesem Fall würde man 92 eher erwarten, dass eine Kompetition unabhängig vom T-Zell-Kompartiment ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten von daher eher darauf hin, dass die entscheidenden antigen-präsentieren Zellen für das CD4+ und CD8+ T-Zell Kompartiment unterschiedlich sind. In einer kürzlich publizierten Studie, in welcher dasselbe bakterielle Infektionsmodell verwendet wurde, wurden ähnliche Ergebnisse so interpretiert, dass die Prägung der T-Zellen für MHC-Klasse-II-Epitope überwiegend von der sogenannten „Kreuzpräsentation (cross presentation)“ abhängig ist, wohingegen MHC-Klasse-I-Epitope direkt durch infizierte Zellen präsentiert werden [26]. Unterschiedliche in vivo Anforderungen an die Antigen-Präsentation und damit unterschiedlich spezialisierte antigenpräsentiere Zellen könnten erklären, warum sich antigen-spezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen im Listerien-Modell nicht gegenseitig behindern. Die Antworten auf die Frage möglicher Kompetition zwischen beiden T-Zell Kompartimenten ist von speziellem Interesse für das bessere Verständnis der in vivo Etablierung von effektiver T-Zell-vermittelter protektiver Immunität (eine Vorraussetzung für die Verbesserung T-Zell basierender Impfstrategien). So wird z.B. zur Zeit strittig diskutiert, welche Impfstrategie gegen verschiedene unterschiedliche Antigene benutzt werden sollte – ist es besser, gleichzeitig oder aufeinanderfolgend die Immunisierungen durchzuführen [170]? Eine sehr starke Dominanz in der T-ZellAntwort einzelner Kompartiments verhindern immundominanter kann [172]. die Diese Epitope gleichzeitige negative innerhalb Ausbildung Interferenz, des anderer welche CD8+ T-Zell T-Zell-Antworten kontraproduktiv für verschiedene Immunisierungsstrategien ist, wurde für CD8+ T-Zell-Antworten beobachtet und wird als Ergebnis einer Kompetition der einzelnen antigenspezifischen CD8+ T-Zell-Populationen untereinander erklärt, da Antigen- Präsentation durch dieselben Zellen erfolgt [152, 170, 171, 173, 174]. Die Daten dieser Arbeit lassen vermuten, dass solche negativen Effekte zwischen CD8+ und CD4+ T-Zellen weniger wahrscheinlich sind. Allerdings lassen diese Untersuchungen offen, ob sich verschiedene MHC-Klasse-II-restringierte Epitope ihreseits innerhalb des CD4+ Kompartimentes behindern können. 93 6.7 Erhalt der antigen-spezifischen Zellen im Körper Durch den direkten Vergleich der zellulären CD8+ und CD4+ Immunantworten gegen einen intrazellulären Erreger konnten unsere Untersuchungen aufzeigen, dass antigen-spezifische CD4+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen zwar nach Infektion rasch auf ein hohes Niveau expandierbar sind, ihre Zahl aber im Gegensatz zu den sehr stabilen CD8+ Gedächtnis-T-Zell Populationen über die Zeit im gesamten Körper abnimmt. Kürzlich publizierte Untersuchungen in viralen Infektionsmodellen beschreiben sehr ähnliche Verläufe für CD8+ und CD4+ Immunantworten, was auf einen generellen Unterschied der in vivo Kinetiken innerhalb dieser beiden T-ZellKompartimente hinweist [165, 175]. Allerdings war in diesen Studien die Analyse ausschließlich auf das Organ ‚Milz’ beschränkt, wodurch keine Aussage über den Mechanismus der kontinuierlichen Abnahme CD4+ T-Zellen gemacht werden konnte. Mögliche Erklärungsmodelle könnten z.B. Unterschiede in der in vivo Überlebensfähigkeit antigen-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen oder aber auch Unterschiede bezüglich des Migrationsverhaltens und die Verteilung von T-Zellen im Körper sein. Mit den Untersuchungen dieser Arbeit konnte erstmals klar aufzeigt werden, dass Listerien-spezifische CD4+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen im gesamten Körper, d.h. sowohl in lymphatischen wie auch nicht-lymphatischen Geweben, kontinuierlich in ihrer Frequenz abnehmen. CD8+ T-Zellen bleiben dagegen im gesamten Körper auf hohem Niveau erhalten und sind auch lang nach der Infektion nachweisbar. Lediglich im Knochenmark konnte keine markante Frequenzabnahme festgestellt werden. Es ist somit das einzige Organ, in dem die Frequenz CD4+ Gedächtnis TZellen bei unseren Untersuchungen relativ konstant bleibt, wenn auch die Menge an Gedächtnis-Zellen insgesamt nur sehr gering waren. Kürzlich wurde beschrieben, dass sich insbesondere im Knochenmark von Tumorpatienten substantielle Mengen an tumor-spezifischen Gedächtnis T-Zellen nachweisen lassen [176]. Möglicherweise resultiert aus den besonderen homöostatischen Aufgaben des Knochenmarks eine gewisse Sonderstellung dieses Organs, die auch Auswirkungen auf das Verteilungsmuster von antigen-spezifischen CD4+ Gedächtnis-T-Zellen hat. Unsere extensiven Untersuchungen der Migration antigen-spezifischer T-Zellen in 94 verschiedensten Organen des Körpers weisen jedoch nicht darauf hin, dass das Knochenmark ein spezielles Refugium für CD4+ T-Zellen darstellt. Warum sollten CD8+ und CD4+ Effektorgedächtnis-T-Zell-Populationen in vivo unterschiedlich erhalten werden? Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass es für die Erhaltung der Qualität wirkungsvoller schützender Immunität gegenüber intrazellulären Krankheitserregern ausreichend ist, nur wenige spezialisierte CD4+ Gedächtnis-T-Zell-Populationen mit hoher Funktionalität zu erhalten. Drei Beobachtungen in unserem bakteriellen Infektionmodell stützen diese Hypothese: 1. Trotz der abnehmenden Anzahl von bakterium-spezifischen CD4+ GedächtnisT-Zellen, wird die Qualität der schützenden Immunität nicht negativ beeinflusst; sogar nach kompletter Depletion der CD4+ T-Zellen nach Primärinfektion werden CD8+ Listerien-spezifische Gedächtnis-T-Zellen beibehalten und vermitteln wirkungsvolle schützende Immunität [89]. Da in dem hier verwendeten bakteriellen Infektionsmodell mit Listeria monocytogenes trotz der Abnahme erreger-spezifischer CD4+ T-Zellen die Qualität der sehr effektiven protektiven Immunität nicht messbar beeinträchtigt ist, scheint diese Zellpopulation auch kein wesentlicher Träger des spezifischen Immunschutzes zu sein. Diese Interpretation wird weiter dadurch unterstützt, dass besonders bei nicht-chronischen Infektionen mit intrazellulären Erregern die aktive Entfernung CD4+ T-Zellen den Aufbau bzw. den Erhalt schützender Immunität nicht negativ beeinflusst [92]. Interessanterweise erhöht die Depletion der CD4+ T-Zellen während Wiederholungsinfektionen sogar die CD8+ Gedächtnis-T-Zelle Antwort [177]. 2. Besonderheiten im Migrationsverhalten CD4+ T-Zellen im Vergleich zu CD8+ T-Zellen konnten als Erklärung für die Abnahme ausgeschlossen werden. Nach wiederholtem Antigenkontakt haben CD4+ T-Zellen das Potential, aus der kleinen Gedächtnis T-Zell-Population heraus schnell zu expandieren. Die Aufgabe, die antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen zu diesem Zeitpunkt während der Immunantwort zukommt, scheint eher immun-modulatorischer Natur zu sein. Leider sind zurzeit noch keine LLO190-201/MHC-Klasse-IITetramer-Reagenzien vorhanden, die ein sehr nützliches Werkzeug für die weitere Detektion der CD4+ Gedächtnis-T-Zellen sein würden. So könnten mit 95 MHC-Klasse-II-Tetramer-Reagenzien auch antigen-spezifische CD4+ T-Zellen detektiert werden, die zum Zeitpunkt der Analyse nicht über IFN-γ bzw. TNF-α Effektorfunktion definiert sind (z.B. zentrale Gedächtnis-T-Zellen). 3. Einige neuere Studien zeigen, dass die meisten Funktionen CD4+ T Zellen Einfluss auf die initiale Prägung für die Entwicklung und den Verbleib von CD8+ Gedächtnis-T-Zellen haben [90-92]. Diese Beobachtung erklärt auch, warum ein Verlust der CD4+ Effektor-Gedächtnis-T-Zellen später während der Gedächtnisphase die Qualität der schützenden Immunität während einer Infektion mit Listeria monocytogenes nicht negativ beeinflusst. Schützende Immunität scheint in diesen Modell im Wesentlichen antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen zuzukommen, deren Effektorfunktionen unabhängig von T-ZellHilfe während einer Sekundärantwort schnell reaktiviert werden können [175]. CD8+ Memory T-Zellen würde damit sozusagen die Rolle der ersten schützenden Abwehrlinie gegen bekannte Pathogene zukommen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass CD4+ Effektor-Gedächtnis TZellen nach bakterieller Infektion kontinuierlich über Zeit im Körper abnehmen und nicht auf hohen Niveaus in den lymphoiden und nicht-lymphoiden Organen erhalten werden, wie es für CD8+ Gedächtnis-T-Zell-Populationen charakteristisch ist. 6.8 MHC-Multimer-Reagenzien Um antigen-spezifische CD4+ T-Zellen funktionsunabhängig detektieren zu können, wurde parallel an Möglichkeiten der Herstellung von MHC-Klasse-IIMultimeren gearbeitet. Im MHC-Klasse-I-System ist diese Detektionsmöglichkeit von antigen- spezifischen Zellen bereits sehr gut etabliert. Hierbei wurde die Idee genutzt, den natürlichen Liganden (MHC/Peptid-Komplex) für die Detektion zu verwenden. Die Idee wurde ursprünglich durch Mark Davis (Stanford, USA [178]) aufgegriffen und mit der Möglichkeit der Herstellung rekombinanter MHC-Moleküle [16, 179] unter Verwendung spezifischer Biotinylierungssequenzen [114] in die Tat umgesetzt. Durch diese Technik ergibt sich eine für Ligand/Rezeptor-Interaktionen günstige Multimerisierung über die Biotin-bindenden Proteine Avidin oder Streptavidin (mit jeweils vier Biotin-Bindungsstellen) als „Rückgrat". Vorhergehende Messungen der 96 Bindungsenergien zwischen TCR und MHC/Peptid-Komplex in BiaCore- Experimenten zeigten bereits auf, dass man mit monomeren Liganden keine stabile Interaktion erwarten kann [180]. Durch die Multimerisierung kann die relative Bindungsavidität aber so weit erhöht werden, dass sie eine stabile T-Zell-Färbung unterstützt. Durch die spezifische Biotinilierung wird gewährleistet, dass die Multimerisierung ausschließlich über das C-terminale Ende der trunkierten Schwerekette erfolgt. Damit ist gleichzeitig eine optimale Ausrichtung des MHC Moleküls auf dem Streptavidin garantiert. Dazu ist die Affinität der Bindung von dBiotin an Avidin/Streptavidin extrem hoch (Kd = 10-14 M), wodurch eine hohe Stabilität der Reagenzien gewährleistet wird. Diese hohe Stabilität kann sich aber auch nachteilig auf funktionelle Eigenschaften, gerade nach Anreicherung der CD8+ antigen-spezifischen Zellen beispielsweise für weitere funktionelle Untersuchungen, auswirken. Viele dieser so aufgereinigten antigen-spezifischen Zellen scheinen funktionell inaktiv zu sein, d.h. sie können auch unter in vitro Bedingungen auf Antigen-Kontakt nicht mit typischer Effektorfunktion (z.B. Zytotoxizität) reagieren [181, 182]. So wurde in unserer Arbeitsgruppe sehr intensiv daran gearbeitet, die Funktionalität von zuvor mit MHC Multimer-Reagenzien behandelten T-Zellen zu erhalten [48]. Durch die Entwicklung einer modifizierten, reversiblen Multimer-Technik können die MHC-Multimer-Reagenzien nach T-Zell-Färbung und -Aufreinigung wieder monomerisiert werden. Monomerisierte MHC-Moleküle dissoziieren von der TZell-Oberfläche und können dann weggewaschen werden. Das System der reversiblen Multimere (so genannte MHC-Streptamere) basiert auf Zugabe eines weiteren Liganden, welcher mit 106-fach höherer Affinität an dem MultimerisierungsRezeptor bindet, und so sehr schnell und auch bei niedrigen Temperaturen eine vollständige Verdrängung (Kompetition) bewirken kann, die zur Monomerisierung der MHC-Multimer-Reagenzien führt. Da Internalisierung von MHC-Multimeren bei der TZell-Färbung die anschließende Monomerisierung erschwert, müssen bei dieser Technik alle Arbeitsschritte bei 4 °C durchgeführt werden. MHC-Streptamer behandelte Zellen unterscheiden sich in in vitro Funktionstests praktisch nicht mehr von nicht-Multimer-behandelten Zellen. Alle in dieser Arbeit gezeigten Daten zeigen Multimerfärbungen von CD8+ TZellen unter Verwendung von MHC-Klasse-I-Tetramer-Reagenzien. Dies ist 97 insbesondere dadurch zu erklären, dass sich die Übertragung der MHC TetramerTechnologie auf das MHC-Klasse-II-System zur Untersuchung von CD4+ TH-Zellen als relativ schwierig erwiesen hat. Für die bei der Herstellung von MHC-Klasse-II-Molekülen aufgetretenen Probleme könnten mehrere Möglichkeiten in Betracht kommen: • MHC-Klasse-II-Moleküle lassen sich nur schwer in präparativen Mengen durch in vitro Faltung gewinnen. • Durch Besonderheiten in der Peptid-Bindungsgrube (im Vergleich zu MHCKlasse-I-Molekülen) klafft die Peptid-Bindungsgrube auf beiden Seiten weiter auf und kann somit auch längere Peptid-Varianten aufnehmen. • Mögliche sterische Behinderung durch den eingefügten „Linker“. • Die verwendete Peptid-Sequenz von LLO190-201 entspricht nicht dem natürlich präsentierten Epitop, wodurch z.B. die notwendige Stabilisierung durch das Peptid in der Bindungsgrube nicht gegeben sein könnte. Zusätzlich können zu „lange“ Epitope unterschiedlich in der Bindungsgrube verankert werden (verschiedene „Bindungsraster“) und so zu einer funktionellen Heterogenität der rekombinanten MHC-Klasse-II-Moleküle führen. Es konnten aber wesentliche Vorarbeiten für die weitere Etablierung dieser Technik geleistet werden. So konnte durch Feinmapping des beschriebenen Epitops LLO190-201 [128] gezeigt werden, dass die N-terminal elongierte Sequenz LLO188-201 vermutlich das eigentliche, durch MHC-Klasse-II-Moleküle präsentierte Epitop, darstellt. Kürzlich gelang es in unserer Arbeitsgruppe (Arbeiten von Robert Knall), mit Hilfe des LLO188-201-Peptids lösliche MHC-Klasse-II-Moleküle in präparativen Mengen zu generieren und mit diesen LLO188-201-Multimeren spezifische CD4+ T-Zellen zu detektieren. Weitere Untersuchungen dazu bleiben abzuwarten. 98 7 Zusammenfassung Ziel dieser Arbeit war die ex-vivo Analyse des Verhaltens von CD4+ T-HelferZellen im Vergleich zu CD8+ zytotoxischen T-Zellen, ihres Phänotyps und ihrer Kinetik im Verlauf einer adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Diese Immunantwort ist im Gegensatz zur angeborenen Immunantwort antigen-spezifisch und kann zu einem „immunologischen Gedächtnis“ führen. In den vergangenen Jahren stieg das Wissen über Immunantworten von antigen-spezifischen CD8+ T Zellen und der in vivo Entwicklung von CD8+ T-Zellen durch die Entwicklung verschiedener Untersuchungsmethoden stetig an, im Vergleich dazu wissen wir jedoch nur sehr wenig über antigen-spezifische CD4+ TZell-Antworten. In dieser Arbeit sollten speziell pathogen-spezifische T-Zellen während einer Infektion mit dem Bakterium Listeria monocytogenes in der Maus untersucht werden. Dazu wurde mit Hilfe eines rekombinanten Listerien-Stammes zunächst ein experimentelles System entwickelt, das die direkte parallele ex vivo Analyse von antigen-spezifischen CD4+ Zellen im Vergleich zu CD8+ T-Zellen möglich macht. Die Detektion der antigen-spezifischen Zellen sollte, zum einem über funktionsunabhängige Untersuchungsmethoden, wie zum Beispiel über T-ZellRezeptorfärbungen mittels MHC Multimeren erfolgen, zum anderen über funktionsabhängige Untersuchungsmethoden, wie zum Beispiel durch Nachweis der Zytokinproduktion, oder auch als Regulation von Oberflächenmolekülen von antigenspezifischen T-Zellen erfolgen. Durch Etablierung und Einsatz von Vielparameteranalysen mittels Techniken der modernen Durchflußzytometrie wurden antigen-spezifische T Zellen auf die Regulation ihrer Oberflächenmoleküle untersucht und phänotypisch erfasst. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse bestätigen, dass CD8+ und CD4+ T Zellen während einer Infektion mit Listeria monocytogenes in der Effektorphase bezüglich der Expansion und Kontraktion der Populationen einer gemeinsamen synchronen Kinetik folgen. Im Vergleich der IFN-γ zu den TNF-α reaktiven T-Zellen zeigen sich aber auch drastische Unterschiede zwischen beiden T-Zell Kompartimenten. So ist die Zahl der reaktiven IFN-γ und TNF-α CD4+ T-Zellen annähernd identisch, hingegen zeigen die CD8+ T-Zellen deutliche Unterschiede 99 zwischen den beiden Zytokinexpressionen. Auch die Expansion der Antigenspezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen nach Reinfektion mit Listeria monocytogenes unterscheidet sich stark. So erreichen antigen-spezifische CD8+ T-Zellen oftmals eine bis zu 10-fach höhere Populationsgröße nach Reinfektion im Vergleich zur CD4+ T-Zell-Antwort, wohingegen die T-Helferzell-Antwort im Vergleich zur Primärantwort kaum an Größe zunimmt. Desweiteren bleiben in der späten Gedächtnisphase CD8+ T Zellen mit nahezu konstanter Frequenz erhalten, wogegen die Populationsgröße der CD4+ Effektor Gedächtniszellen in der Milz über die Zeit kontinuierlich abnimmt. Um auszuschließen, dass die Abnahme von CD4+ Effektor Gedächtniszellen in der Milz durch Migration in andere Gewebe bedingt ist, wurden unterschiedliche lymphatische und nicht-lymphatische Organe untersucht. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass die Zahl an CD8+ T-Zellen in der Gedächtnisphase im gesamten Körper auf höherer Zellzahl erhalten bleibt, hingegen aber die Zahl der CD4+ Effektor Gedächtniszellen im gesamten Körper abnimmt. Des Weiteren wurde aufgezeigt, dass zwischen beiden T-Zell-Kompartimenten kein Wettbewerb um antigenpräsentierende Zellen stattfindet, sondern dass nur innerhalb der CD4+ und CD8+ TZell-Kompartimente eine Kompetition nachweisbar ist. Auf Basis dieser Ergebnisse postulieren wir ein Modell zur Beschreibung von Gedächtnis-T-Zellen und protektiver Immunität, das CD8+ Effektor-Gedächtnis-Zellen eine zentrale Funktion als erste lokale Abwehrlinie gegen Reinfektionen mit intrazellulären Erregern bildet, während CD4+ Gedächtnis-Antworten erst bei systemischer Infektion aktiviert werden. 100 8 Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen 1. Knabel M, Franz TJ, Schiemann M, Wulf A, Villmow B, Schmidt B, Bernhard H, Wagner H, Busch DH. Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. Nat Med. 2002 Jun;8(6):631-7. 2. Schiemann M, Busch V, Linkemann K, Huster KM, Busch DH. Differences in maintenance of CD8+ and CD4+ bacteria-specific effector-memory T cell populations. Eur J Immunol. 2003 Oct;33(10):2875-85. 3. Heit A, Huster KM, Schmitz F, Schiemann M, Busch DH, Wagner H. CpGDNA aided cross-priming by cross-presenting B cells. 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Er hatte stets ein offenes Ohr für alle Fragen, die einem Chemiker beim Einstieg in die Immunologie kommen konnten. Auch möchte ich mich für sein großes Interesse, die ausgezeichnete Betreuung und die großzügige Förderung bedanken. Besonderer Dank gilt an dieser Stelle auch Evelin Heinl, die jederzeit versucht hat, mich in allen Fragen des Laboralltages zu unterstützen und großen Anteil bei der Realisierung der Experimente hatte. Auch möchte ich mich bei unserer Arbeitsgruppe und allen Kollegen des Institutes für Mikrobiologie und Hygiene der Technischen Universität München für die hilfreichen wissenschaftlichen Diskussionen und das sehr gute Arbeitsklima bedanken. Mein besonderer Dank gilt an dieser Stelle Katharina Huster, Verena Busch, Michael Knabel und Marcus Odendahl. Besonders herzlich möchte ich mich bei allen Mitarbeitern, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, bedanken. Alice Sijts (Humboldt Universität, Berlin) danke ich für die Hilfestellung bei der Generierung der Peptid-Bibliotheken, Luc Teyton (The Sripps Research Institute, La Jolla, USA) für die Unterstützung zu allen Fragen der MHC-Klasse-II-Multimere und Hao Shen (University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, USA) für die freundliche Überlassung der Ovalbumin sezernierenden Listeria monocytogenes. Nicht zuletzt danke ich meiner Familie für ihre Geduld und Hilfe bei der Anfertigung dieser Arbeit. Meinen Eltern möchte ich besonders dafür danken, dass sie mich bei der Verwirklichung meines wissenschaftlichen Werdeganges mit allen Kräften unterstützt haben. Ein ganz besonders lieber Dank gilt meiner Frau Priska, die mich bei dieser Arbeit tatkräftig unterstützte und mir immer liebevoll zur Seite stand. Auch hat meine Tochter Adina auf ihre Art zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. 102 10 Literaturverzeichnis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Busch, D. H., Pilip, I. 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