Physikalisch-chemische und biologische Eigenschaften des

Physikalisch-chemische und biologische Eigenschaften
des gereinigten ,,löslichen Antigens" der klassischen Geflügelpest
Von WERNER
SCHÄFER, KLAUS M Ü N K * u n d M A N F R E D MUSSGAY * *
Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen
(Z. Naturforschg. 11 b. 330—338 [1956]; e i n g e g a n g e n am 10. April 1956)
Herrn Professor Dr. M a x H a r t ma n n zum 80. Geburtstag
gewidmet
Das „lösliche Antigen" der klassischen Geflügelpest ist ein kugelförmiges Teilchen mit einem
Durchmesser von 10—15 mu, das kettenförmige Aggregate bildet und nach seinem spektrophotometrischen Verhalten Nueleoproteid-Charakter hat. Es ist physikalisch-chemisch nicht von
dem „gebundenen Antigen" des Virus-Elementarteilchens zu unterscheiden.
Auch serologisch bestehen enge Beziehungen zwischen den beiden Partikeln. Das „lösliche
Antigen" reagiert nur mit den virus-spezifischen Seren, mit denen auch das „gebundene Antigen" eine Reaktion eingeht. Von Kaninchen-Serum gegen intakte Elementarteilchen werden
beide nicht präzipitiert.
Eine Immunität gegen eine Infektion mit KP-Virus vermag das gereinigte „lösliche Antigen"
beim Huhn nicht zu erzeugen.
B
ei der klassischen Geflügelpest (KP) kommt ebenso
wie bei einer Reihe anderer Virusinfektionen eine
antigen-wirksame Einheit vor, die nicht an die infektiösen Elementarteilchen gebunden ist und als „lösliches Antigen" bezeichnet wird 1 . Um genauere
Kenntnisse über die Natur dieser Einheit gewinnen
zu können, war es notwendig, sie in weitgehend reiner Form darzustellen. Ein dafür geeignetes Verfahren wurde bereits in früheren Veröffentlichungen beschrieben 2 ' 3 .
Inzwischen konnten größere Mengen von gereinigtem „löslichen Antigen" bereitgestellt werden. Dadurch wurde es möglich, sein physikalisch-chemisches
und biologisches Verhalten eingehender zu studieren. Es ist geplant, diese Untersuchungen später noch
durch chemische Analysen zu ergänzen.
A. Material und Methoden
I. V i r u s
Als KP-Virus wurde ausschließlich der Stamm „Rostock"
verwendet, von dem wir einen Zweig in embryonierten
Hühnereiern, einen anderen in intracerebralen Passagen
bei weißen Mäusen weiterführen.
II. R e i n i g u n g d e s „ l ö s l i c h e n A n t i g e n s "
Das „lösliche Antigen" wurde auch für die hier beschriebenen Untersuchungen wieder aus Homogenaten
von Eihäuten KP-infizierter Hühnerembryonen gewonGegenwärtige Anschriften: * II. Med. Klinik, München.
** Bundesforschungsanstalt f. Viruskrankheiten cl. Tiere,
Tübingen.
1 W. S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 6b, 207 [1951],
2 W. S c h ä f e r
u. K. M u n k , Z. Naturforschg. 7 b,
573 [1952],
nen, aus denen die Elementarteilchen sowie andere an
Erythrocyten adsorbierbare Partikel vorher weitgehend
entfernt waren. Zur Infektion der Hühnerembryonen
wurden 102—10:i MLD- 0 des KP-Eipassage-Stammes verwendet. Näheres über das Antigen-Reinigungsverfahren
kann aus Tab. 1 entnommen werden, die den Verlauf
einer unserer Aufarbeitungen wiedergibt.
Wie kürzlich festgestellt wurde, läßt sich eine dem
„löslichen Antigen" ähnliche Einheit, die als „gebundenes
Antigen" bezeichnet wird, aus den infektiösen Elementarteilehen der KP durch Ausschütteln mit Äther in Freiheit
setzen 4 . Da die Elementarteilchen aus unserem Ausgangsmaterial weitgehend entfernt wurden, war nicht damit zu rechnen, daß es sich bei dem von uns isolierten
Antigen um diesen Bestandteil der Elementarpartikel
handelte. Außerdem ging das auch noch aus zwei Kontroll-Versuchen hervor, in denen wir einmal ein gereinigtes Konzentrat von Elementarpartikeln und weiterhin ein
Homogenat von normalen Eihäuten, welchem eine größere Menge von infektiösen Virusteilchen zugesetzt
wurde, den auch sonst angewendeten chemischen Reinigungsschritten (Säurefällung, Ausschütteln mit Butanol
und Äther, Fällung mit Ammonsulfat) unterwarfen. Teilchen mit virus-spezifiseher antigener Aktivität waren danach in beiden Fällen nicht mehr nachzuweisen.
Durch das angewendete Reinigungsverfahren wird
demnach nicht das „gebundene Antigen" des Elementarteilchens, sondern das in freier Form in der infizierten
Zelle vorliegende „lösliche Antigen" isoliert.
III. P h y s i k a l i s c h - c h e mis c h e U n t e r such un g sm e t h o d en
Für die elektrophoretischen
Untersuchungen wurde eine
Apparatur nach Tiselius benutzt. Die Präparate wurden
3 W. Sc h ä f e r u. K. M ü n k , Atti VI. Congr. int.
Microbiol. 3, 138 [1953].
4 W. S c h ä f e r u. W. Z i 11 i g , Z. Naturforschg. 9 b,
779 [1954],
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Material und Behandlung
Eihauthomogenat, gereinigt:
5' 3000 U/Min., 60' 15000 U/Min.
3-mal je 100 ccm gewaschene, gepackte
Hühnererythrocyten zugefügt, jeweils
nach 10' durch Zentrifugation entfernt
Ansäuern mit HCl auf pH 4,5. Sediment
abzentrifugiert und gelöst in NaClLösung, pH 8,5
Gereinigt 30' 15000 U/Min.
Ausgeschüttelt mit /i-Butanol, ILO-Phase
anschließend 2-mal mit Äther kurz geschüttelt, Äther unter vermindertem
Druck abgedampft
4 0 % Ammonsulfat, Sediment gelöst in
gepufferter 0,9-proz. NaCl-Lösung pH
7,2, Dialyse gegen das gleidie Lösungsmittel
Gereinigt 10' 12500 U/Min.
Zentrifugierung 1 Stde. 30000 U/Min.
Sediment in gepufferter NaCl-Lösung
gelöst
Wie vorher
Gereinigt 12' 3000 U/Min.
30' 12000 U/Min.
Men^e N/cm3
[cm3] [mg]
K. B . > ( + + )
AntigenVerdiinnung
N/ + +
K.B.
[".']
MLD,o2
— log-
HA-Titer
1:1000
Anreicherung
theor. prakt.
-fach -fach
1100
3,22
1/128
6,3
9,75
1100
3,36
1 128
6,56
6,82
290
3,1
1/500
1,55
250
135
1,24
0,76
1/500
<1/256
0,62
<0,75
0
0
0
0
12
1,86
<1/1000
<0,46
0
0
11
12
0
2,0
0
1/1000
0
0,5
0
0
0
0
0
—
—
—
—
0,68
0,20
1/1000
1/1000
0,17
0,05
0
0
0
0
3,4
3,4
K.B. mit KP-Maus-Serum.
Berechnet nach L. J . R e e cl u. H. M u e n c h . Amer. J . Hvg.
27, 493 [1935].
1
2
—
—
—
—
4
0
4
—
—
1
4
1
3,5
—
—
Nach Bebrütung mit R D E bestimmt.
0 = Nicht bestimmt.
:1
Tab. 1. Reinigung des „lösliehen Antigens" der klassischen Geflügelpest.
vor Ansatz der Versuche 24—48 Stdn. gegen 4 / Pufferlösung dialysiert. Sie bestand aus einem Phosphatpuffer
von pn 7,2, der durch Zugabe von NaCl (etwa 0,5%) auf
eine Ionenstärke von 0,1 gebracht wurde.
Die analytische Ultrazentrifugierung
führten wir in
einer Phvwe-Ultrazentrifuge durch, in der die Sichtbarmachung der Sedimentationsgradienten mit dem Skalenverfahren nach Lamm erfolgt 5 .
Als Elektronenmikroskop
stand ein elektrostatisches Gerät der Firmen AEG/Zeiss zur Verfügung. Die Präparate
wurden im Osmiumdampf fixiert, nach dem Eintrocknen
mit H.,0 gewaschen und mit Platin-Rhodium unter einem
Winkel von 25° bedampft.
Die spektropliotometrische
Untersuchung im ultravioletten Licht erfolgte mit einer Beckman-Apparatur.
Der Stickstoff-Gehalt wurde mit der Kjeldahl-Methode
bestimmt.
IV. B i o l o g i s c h e
Untersuchungsmethoden
Die Technik der in bebrüteten Hühnereiern durchgeführten Infektiositäts-Bestimmungen,
der Hämagglutinations-Proben sowie der serologischen Reaktionen (Komplementbindungs- [K.B.-] und Präzipitations-Probe) ist
5 G. B e r g o l d , Z. Naturforschg. 1, 100 [1946],
an anderer Stelle 4 bereits ausführlich beschrieben worden.
Die K.B.-Probe wurde auch dieses Mal mit zwei 100proz. lösenden Komplement-Einheiten angesetzt. Die komplement-bindenden Anti-Seren gewannen wir von Mäusen
bzw. Hamstern, die eine Infektion mit dem für die Immunisierung benutzten Virusstamm überstanden hatten.
Die präzipitierenden Antiseren stammten von Kaninchen,
welche wir mit verhältnismäßig großen Mengen Antigen
immunisierten, ohne daß sie irgendwelche Krankheitserscheinungen zeigten.
Komplement bind ende
1.
Antiseren
KP-Mäuse-Serum
Die Spendertiere wurden mit dem der Maus adaptierten KP-Stamm insgesamt viermal in Abständen von 10
Tagen subcutan und intraperitoneal geimpft und das Serum 8 Tage nach der letzten Impfung durch Herzpunktion gewonnen. Es reagiert — wie in anderen Untersuchungen gezeigt werden konnte — mit den VirusElementarteilchen der KP dem aus diesen gewonnenen
„Hämagglutinin" und „gebundenen Antigen" 4 sowie mit
den „Inkompletten Formen" 6 in der Komplementbindungs-Reaktion.
e W. S c h ä f e r , W. Z i 11 i g u. K. M u n k , Z. Naturforschg. 9 b, 329 [1954],
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2. FMI ^-Mäuse-Serum
Die Tiere wurden mit einem in Mäuse-Lungen fortgeführten Influenza-FM/j-Virus zweimal im Abstand von
14 Tagen intranasal infiziert und 8 Tage nach der letzten
Infektion entblutet. Von den Spaltprodukten des VirusElementarteilchens der KP reagiert nur das nucleinsäurehaltige „gebundene Antigen", nicht aber das „Hämagglutinin" mit dem so gewonnenen Serum
3. AP-Hamster-Serum
Zur Erzeugung eines gegen die atypische Geflügelpest
(AP) eingestellten Antiserums wurde ein AP-Virus verwendet (Stamm „Italien"), das drei intracerebrale Passagen im Goldhamster durchlaufen hatte. Mit dem frisch
gewonnenen virushaltigen Gehirnmaterial wurden die
Spendertiere im Abstand von 15 Tagen zweimal subcutan infiziert; danach starben von 17 Tieren 5 an APInfektion. Von den überlebenden Tieren wurde das Serum 17 Tage nach der letzten Impfung gewonnen.
Sämtliche für die K.B. benutzten Seren wurden 30 Min.
bei 56° C inaktiviert und durch Zugabe von 0.5% Phenol
konserviert.
Präzipitierende Antiseren
1. KP-Kaninchen-Serum
Immunisierungs-Versuch
Die Prüfung des „löslichen Antigens" auf immunisierende Eigenschaften erfolgte an 10—12 Wochen alten
Leghornhähnen. Die Tiere wurden mit fallenden Mengen
(Verdünnungen nach Potenzen von 4) einer aus gereinigtem „löslichen Antigen" hergestellten Formolvakzine
(Formaldehyd-Gehalt etwa 0,4%) intramuscular geimpft,
wobei je Verdünnung drei Tiere eingesetzt waren. Jeder
Hahn erhielt im Abstand von 12 Tagen zwei Injektionen
einer jeweils gleich großen Dosis Impfstoff. Die Prüfung
auf Immunität erfolgte 7 Tage nach der letzten Impfung
durdi intramusculäre Injektion von etwa 10" MLD_0
(Eitest) des KP-Virus.
B. Ergebnisse
I. P h y s i k a l i s c h - c h e m i s c h e
s c h a f t e n des „ l ö s l i c h e n
EigenAntigens"
In unseren gereinigten Präparaten wurde bei fünf
elektrophoretischen
Untersuchungen
stets nur ein
Gradient gefunden, der sich auch bei Wanderungszeiten bis zu 94 Min. nicht auflöste (s. Abb. 1). Eine
genaue Bestimmung der Wanderungsgeschwindigkeit
war nicht möglich, weil die Versudie wegen Material-
Das für die Erzeugung dieses Antiserums herangezogene Kaninchen wurde mit hochgradig gereinigten Konzentraten von Virus-Elementarteildien der KP immunisiert, die aus infizierter Eiflüssigkeit gewonnen waren.
~Da das Antiserum neben den virus-spezifisdien Antikörpern nodi solche gegen normales Wirtsantigen (NK) aus
Eiflüssigkeit enthielt, wurde es mit der entspredienden
aus nonnaler Eiflüssigkeit gewonnenen Komponente abgesättigt 8. Nähere Angaben über die Herstellung dieses
Serums s. 1. c. 8.
2. „Gebundenes
Antigen'-Kaninchen-Serum
Als Antigen für die Immunisierung des Serum-Spenders wurde das aus dem Virus-Elementarteilchen der KP
in weitgehend reiner Form isolierte „gebundene Antigen"
benutzt 4 . Dem Tier wurden bei einer subcutanen und
neun intravenösen Injektionen (Abstand je 1 Tag) insgesamt ~ 10 mg Protein injiziert, das größtenteils zur
Verstärkung des Immunisierungs-Effektes an frischgefälltes Aluminiumhydroxyd adsorbiert war. 8 Tage nach der
letzten Injektion wurde das Serum gewonnen. Nach Zugabe von NK zu diesem Serum bildete sich kein Präzipitat, ein Zeichen, daß es keine gegen NK gerichteten Antikörper enthielt.
3. NK (Normalkomponente)-
Kaninchen-Serum
Genauere Angaben über die Herstellung dieses Serums
finden sich an anderer Stelle 8 . Die zur Immunisierung
benutzte NK stammte wiederum aus normaler Eiflüssigkeit.
Sämtliche für die Präzipitation benutzten Antiseren
wurden durch Zugabe von 0,5% Phenol konserviert.
7 W. S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 10b, 81 [1955].
K. M u n k u. W. S c h ä f e r , Z. Naturforsdig. 6 b,
372 [1951].
8
Abb. 1. Elektrophorese-Diagramm von „löslichem Antigen". Wanderungszeit: 34 Minuten. Anodischer und kathodischer Schenkel.
mangels aussdiließlich in einer kleinen, nur 2 cm 3 fassenden Tiselius-Zelle durchgeführt wurden. Der am
besten gesidierte Wert liegt bei 6,2 • 10" 5 cm 2 Volt' 1
sec -1 .
Obwohl die Präparate elektrophoretisdi homogen
erschienen, enthielten sie nach den Ergebnissen der
analytischen
Ultrazentrifugierung
Teilchen mit verschiedenen Sedimentations-Eigenschaften. Es bildeten sich teilweise bis zu drei Gradienten aus (s.
Abb. 2, 3 a), deren Sedimentations-Konstanten zwischen ~ 20 und 60 S lagen. Die Hauptmasse des Materials sedimentierte in der Regel mit Konstanten von
30 bis 50 S. In Präparaten mit niedrigeren Antigenkonzentrationen setzten sich die einzelnen Gradienten nicht voneinander ab. Man beobachtete dann,
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wie es auch in früher beschriebenen Versudien geschah
nur einen Gradienten, der jedodi verhältnismäßig breit ist und schnell verflacht (s. Abb. 3 b).
Die bei der Elektrophorese und Ultrazentrifugierung erhobenen Befunde lassen sich miteinander vereinbaren, wenn man annimmt, daß in den Präparaten
Teilchen gleidier chemischer Besdiaffenheit vorhanden sind, welche zu Aggregaten untersdiiedlicher
Größe und damit unterschiedlicher SedimentationsEigenschaften zusammentreten. Entsprechende Aggregate wurden elektronenoptisch
tatsächlich nadigewiesen. Wie die in den Abb. 4 * und 5 wiedergegebenen Aufnahmen zeigen, findet man kleinste, offenbar
kugelförmige Grundeinheiten mit einem Durdimesser
von 10—15 mp, die zumeist zu kettenförmigen Gebilden mit Längen bis zu etwa 150 mp aneinandergereiht
sind. Ein Durchmesser von ~ 10 mp für die Grundeinheit ergibt sich auch aus den Sedimentations-Versuchen, wenn man dem Teilchen die niedrigste ermittelte s 20 von etwa 20 S zuordnet und von der Annahme ausgeht, daß es bei einem V 0 von 0,74 kugelförmig und nicht hydratisiert ist. Die elektronenoptisdi untersuchten Proben enthielten neben den beschriebenen Partikeln nur verhältnismäßig selten Gebilde anderer Form und Größe.
Es war nunmehr noch nachzuweisen, daß die physikalisch-chemisch
erfaßten
Teilchen tatsächlich
die
Träger der spezifischen
antigenen
Wirksamkeit
sind.
Dies war schon deshalb anzunehmen, weil — wie bereits früher mitgeteilt 2 — bei der Aufarbeitung normaler Eihäute keine entspredienden Partikel gefunden wurden. Außerdem ließ sich aber audi zeigen,
daß das antigen wirksame Prinzip im elektrischen
Feld mit dem sich hier ausbildenden Gradienten wandert. Der Versuch wurde in der Weise durchgeführt,
daß wir den Gradienten in einen verschiebbaren Abschnitt der Elektrophorese-Zelle hineinwandern ließen, präparativ abtrennten und dann die serologische
Aktivität sowie den N-Gehalt des abgetrennten und
des Ausgangsmaterials miteinander verglichen. Wie
aus Tab. 2 hervorgeht, besaß das abgetrennte Material eine hohe antigene Wirksamkeit. Sie lag trotz
Verdünnung durch die Pufferlösung nur etwa 5 0 %
unter der des Ausgangsmaterials. Die spezifischen Aktivitäten (bezogen auf N) der beiden Proben waren
nahezu gleich hodi.
Bei der Ultrazentrifugierung konnte ein entsprediender Nachweis nicht ohne weiteres geführt werden, weil sich hier — wie vorher besdirieben — zu* Abb. 4 u. 5 s. Tafel S. 336 c.
Geprüftes
Material
K. B.*
Antigen-Verdünnung
1/512
+ + +
1/1024
Ausgang
Abgetrennter
Gradient
1/256
+++
1/512
1/768
+ +
1/1536
1/384
+++
1/768
3
N/cm
* * N/K.B.
[7]
(+ )
["/]
396
0,09
160
0,08
* Mit KP-Maus-Serum.
** Mittelwert aus zwei Bestimmungen.
Tab. 2. Wanderung des antigen-wirksamen Prinzips in der
Elektrophorese.
meist mehrere Gradienten ausbildeten. Trotzdem
wurde wenigstens zu zeigen versucht, daß auch hier
der größte Teil des Antigens mit dem optisch festgestellten Hauptgradienten absinkt.
160
ß
e
-Ü
.5
«vi
m
120
100
80
60
HO
20
0
77
20
25
Z in Komparatorteilen
30
Abb. 2. Sedimentationsdiagramm des „löslichen Antigens".
Skalenabstand: 5 cm; Drehzahl: 18 000 U/Min.; N-Gehalt
des Präparates: 3,3 mg/cm3.
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SO
30
10
15
20
30
20
Z in Komparatorteilen
30
Abb. 3. a) Sedimentationsdiagramm des „löslichen Antigens". Skalenabstand: 10 cm; Drehzahl: 20 000 U/Min.
N-Gehalt des Präparates: 0,830 mg/cm», b) Wie a). Skalenabstand: 17,5 cm; Drehzahl: 30 000 U/Min.;
N-Gehalt des Präparates: 0,544 mg/cm3.
Dabei gingen wir so vor, daß wir den Gradienten unter
optischer Kontrolle bis zur Mitte der analytischen Zelle
abzentrifugierten und dann nach vorsichtigem Bremsen
des Rotors den Inhalt der Zelle bis auf eine ~ 2 mm über
dem Boden liegende Schicht abpipettierten. Aus dem
Rückgang der antigenen Aktivität des Überstandes gegenüber der des Ausgangspräparates wurde s.,0 (K.B.),
aus der Abnahme des N-Gehaltes s.,0 (N) und aus den
optischen Messungen s.,0 (opt.) bestimmt 9 . Wenn die im
Hauptgradienten enthaltenen Teilchen mit dem Träger
der antigenen Aktivität identisch sind, sollten s.,0 (opt.),
s.,0 (K.B.) und s.,0 (N) annähernd übereinstimmen.
Wie Tab. 3 zeigt, traf das in zwei unabhängigen
Experimenten zu.
Da sowohl bei den beschriebenen Elektrophoresewie bei den Ultrazentrifugen-Versuchen neben der
antigenen Aktivität gleichzeitig der N-Gehalt der Lösungen bestimmt wurde, können die Ergebnisse dieser Experimente auch für die Beurteilung der Reinheit der Präparate herangezogen werden. Sie lassen
erkennen (s. Tab. 2 und 3), daß die stickstoffhaltigen
Bestandteile bei beiden Verfahren im wesentlichen
mit dem antigenen Prinzip wanderten. Es können
demnach neben den Teilchen, die die physikalischdiemischen Eigenschaften der Antigen-Träger besit9 W. S c h ä f e r , G. S c h r a m m
Naturforschg. 4 b, 157 [1949],
u. E. T r a u b , Z.
zen, nur noch geringe Mengen anderer N-haltiger Bestandteile in den Proben vorgelegen haben. Weitere
Beweise für eine weitgehende Reinheit unserer Präparate lieferten die schon oben besprochenen analytisch-elektrophoretischen und elektronenoptischen Untersuchungen.
Bei der spektrophotometrischen
Untersuchung
der
gereinigten Konzentrate im ultravioletten Licht wurde
ein ausgeprägtes Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 260 mp gefunden (s. Abb. 6), woraus
geschlossen werden kann, daß das isolierte Material
Nucleoproteid-Charakter hat.
Die bisher ermittelten physikalisch-chemischen
Eigenschaften des „löslichen Antigens" sind in Tab. 4
noch einmal kurz zusammengefaßt und denen des
„gebundenen Antigens" gegenübergestellt, welches
sich durch Behandlung mit Äther aus Elementarteilchen herauslösen läßt und früher schon eingehender
untersucht wurde 4 . Wie man aus der Gegenüberstellung ersehen kann, stimmen die beiden Einheiten
so weitgehend miteinander überein, daß ihre Differenzierung auf physikalisch-chemischem Wege nicht
möglich erscheint. Die weitere Untersuchung ergab,
daß sie sich auch in biologischer Hinsicht sehr ähnlich verhalten.
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Versuch
Nr.
Dauer der
Zentrifugation
[Min.]
U/Min.
20000
1
1/1000 1/2000
+ + + +
++
85
20000
85
1 '4000
—
1 500
1/1000
1 3000
+ + +
1/8000
1/4000 1/6000
++
+
1/12000
1/1000
1/1500
1/3000
1/6000
++++
2
KBN
Aktivität
[7/cm3]
[%]
K. B. mit KP-Serum
Antigen-Verdünnung
+++
++
1/2000
—
100
780
50
380
100
1660
N
[%]
100
48,6
100
yN /
K.B.
(++)
0,10
+
— 35
486
29,3
•9,>o
(N)
[S]
31,2
41
43
52
55
59
0,10
0,10
1/2000
++
(opt) (K.~B.)
[S]
[S]
0,08
Tab. 3. Vergleich von s20 (opt.), s2o (K.B.) und s2o (N).
^•0,900
und zeigte sich auch jetzt wieder bei der Prüfung
hochgereinigter Konzentrate in den entsprechenden
Testen.
In der Komplementhindungs-Prohe
hemmte das
„lösliche Antigen" nicht nur in Gegenwart von KP-,
sondern auch von FM/j-Maus-Serum die Hämolyse.
Das letztgenannte Serum reagierte — wie sdion eingangs erwähnt — bei der Untersuchung der VirusSpaltprodukte nicht mit dem „Hämagglutinin", wohl
aber mit dem „gebundenen Antigen" der K.P. Die
virus-spezifische antigene Aktivität des „löslichen
Antigens" war in den Ansätzen mit beiden Seren sehr
hoch und entsprach etwa der des „gebundenen Antigens" 4. Mit KP-Serum gaben in unserer Versuchsanordnung, wenn wir die in Vorversuchen ermittelte,
am besten geeignete Serum-Verdünnung (gewöhnlidi
1 : 5) benutzten, noch 0,07 ± 0,03 y * Antigen-Stickstoff (Mittel aus 12 Versuchen) eine eindeutig positive
K.B.-Reaktion.
-
0,800
0,100 0,600
0,500 0,100
0,300
-
0,200
0,100
200
Bei Verwendung von FM/j-Serum reichten — wie
der in Tab. 5 wiedergegebene Versuch zeigt — schon
0,04 y N für eine vollständige Ablenkung des Komplementes aus. In Kontrollansätzen mit AP-HamsterSerum und normalem Mäuse-Serum hemmte das
„löslidie Antigen" die Hämolyse nicht.
(
1
20
1
HO
1
60
1
80
300
20
X (mju)
Abb. 6. UV-Spektrum des „löslichen Antigens".
II. B i o l o g i s c h e
„löslichen
Eigenschaften
des
Antigens"
Ebenso wie das „gebundene Antigen" besitzt auch
das „lösliche Antigen" weder infektiöse
agglutinierende
noch
häm-
Eigenschaften. Dies wurde schon bei
der früher durchgeführten Untersuchung ungereinigter Präparate von „löslichem Antigen" festgestellt 2
Neben der K.B. wurde als weiterer serologischer
Test nodi die Präzipitations-Probe
herangezogen.
Audi hier reagierte das „lösliche Antigen" wieder nur
mit dem virus-spezifischen Serum, das audi gegen
das „gebundene Antigen" eingestellt ist („gebundenes Antigen"-Kaninchen-Serum, s. Abb. 7). KP-Kanin* = o (mittlere Abweichung).
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Elektrophoretische Wanderungs-Gesdiwindigkeit in
0,5ü/o NaCl, ml 100-Phosphatpuffer, pH 7,2
cm- V—1 sec 1
Art des Antigens
•S'20
„Lösliches Antigen"
~ 20—60
6,2 • 10-5 (?)
„Gebundenes
Antigen"
~ 20—60
6,1 • 10-5
[S]
UV-Spektrophotometrie
Elektronenoptisches
Aussehen
Grundeinheit:
kugelförmig, 10—15 m/'
Durchmesser.
Bildung kettenförmiger
Aggregate
starke Absorplion
bei 260 mp
Tab. 4. Physikaliseh-ehemisehe Eigenschaften des „löslichen" und „gebundenen Antigens" der KP.
Eingesetzte
AntigenMenge
[7 N]
Antigen
„Löslidies Antigen"
Kontroll-Antigen
[gereinigte „Inkomplette Formen" der
KP (6).11]
Serum-Verdünnung
1/5
1 10
+++ +
++++ + +
++++ + +
++
—
+
+
1,6
0,8
0,04
0,02
0,01
—
—
10
5
2,5
1,25
Serum-Kontrollen
1/20
1/40
—
—
—
—
AK*
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
AKOK**
+ ++ +
++++
++++
+ +++
+ ++ +
+ ++ +
++++
++++
++++
* AK = Antigen-Kontrolle ohne Serum mit Komplement.
** AKOK = Antigen-Kontrolle ohne Serum und ohne Komplement.
Tab. 5. Komplementbindungs-Versuch mit FM/i-Serum.
chen-Serum, welches durch Immunisierung eines Kaninchens mit intakten KP-Elementarteilchen erzeugt
wurde und mit Elementarpartikeln sowie ihrem
„Hämagglutinin" eindeutige Präzipitate bildete, vermochte dagegen das „lösliche" ebensowenig wie das
„gebundene Antigen" 4 zu präzipitieren (s. Abb. 7).
Ein abweichendes Verhalten zeigten unsere Präparate aus „gebundenem" und „löslichem Antigen"
lediglich in den Präzipitations-Versuchen,
die mit
NK-spezißschem
Kaninchen-Serum
angesetzt wurden.
Dabei ließen sich bei dem erstgenannten Antigen
keine oder nur sehr geringe 10, in den Präparaten mit
„löslichem Antigen" aber verhältnismäßig starke Präzipitate feststellen (s. Abb. 8). Die dadurch nachgewiesene Normale-Komponente kann entweder in irgendeiner Weise mit den Teilchen des „löslichen Antigens" verbunden sein oder aber in freier Form in
den Konzentraten vorgelegen haben. Das letztere ist
weniger wahrscheinlich. Die entstandenen Präzipi10
W. S c h ä f e r , unveröffentlichte Versuche.
täte sind nämlich so groß, daß man, wenn sie nur
aus NK und dem entsprechenden Antikörper bestehen würden, mit dem Vorliegen größerer Mengen
von freier NK in den Präparaten rechnen müßte. Ein
derartig starker Gehalt von freiem Wirtsantigen wäre
aber bei der physikalisch-chemischen Reinheitsprüfung wohl kaum dem Nachweis entgangen. Es ist deshalb eher anzunehmen, daß die Flocken aus NK-Antikörpern sowie „löslichen Antigen"-Partikeln, an welche NK gebunden ist, bestehen. Der NK-Anteil der
einzelnen Partikel ist offenbar so gering, daß er die
physikalisch-chemischen Eigenschaften des „löslichen
Antigens" gegenüber denen des „gebundenen Antigens" nicht wesentlich verändert.
Inwieweit sich das immunologische
Verhalten der
beiden virus-spezifischen Antigene deckt, kann auf
Grund der bisher durchgeführten Experimente noch
nicht entschieden werden. Weitgehend gesichert ist,
daß das gereinigte, mit Formol behandelte „lösliche
ii W. S c h ä f e r , Arcli. exp. Vet. Med. 9, 218 [1955],
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Abb. 3. Tropfen einer hochmolekularen RNS-Lösung. Vergrößerung 1 : 20 000.
WrMBWÜr
'//A
'/vl&T*'*
U-.Z7
•VAAbb. 4. Hochmolekulare RNS, Vergrößerung 1 : 90 000.
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:fJr<;
WM
Abb. 5. Hochmolekulare DNS aus Thymus, mit ?n/1000-Essigsäure gewaschen, Vergrößerung 1 : 9 0 000.
Abb. 6. RNS-Fäden und TMV-Partikel, mit m/1000-Essigsäure gewaschen, Vergrößerung 1 : 90 000.
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Abb. 7. RNS-Fäden, mit m/1000-Essigsäure gewaschen.
W.Schäfer,
K. Münk und M. Muss gay, Physikalisch-chemische
„löslichen Antigens" der klassischen Gefiiigelpest (S. 330)
Abb. 4. Elektronenoptische Aufnahme des „löslichen Antigens". Vergrößerung: 30 000-fach.
unci biologisdie
Eigenschaften
des
gereinigten
Abb. 5. Wie Abb. 4. Vergrößerung: 60 000-fach.
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H. Förster,
L. Wiese
eugametos (S. 315)
und G. Braunitzer,
Über das agglutinierend
wirkende
Gynogamon
von
Chlamydomonas
Abb. 2. Normale Gruppenbildung beim Zusammengeben männlicher und weiblicher Zellen. Vergr. 89 : 1.
Abb. 3. a) Suspension kopulationsbereiter männlicher Zellen, b) dieselben Zellen nach Zugabe des konzentrierten
Gynogamons. Hellfeld, Elektronenblitz. Lebendaufnahme. Neofluar 10/0.30, Okular K 6,3-fach, Contax, Vergr. 89 : 1.
5
4
Abb. 4 und Abb. 5. Isoagglutination von männlichen Zellen nach Zugabe von konzentriertem Gynogamon. Die Geißeln
sind deutlich sichtbar, sie zeigen alle nach dem Zentrum der Gruppe und sind mit den Enden seitlich verklebt. Phasenkontrast, Elektronenblitz, Lebendaufnahme. Neofluar Ph 100/1.30 Ölimm., Okular K 6,3-fach, Contax. Vergr. 1000: 1.
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.'io?
Antigen" keine Immunität gegen eine Infektion mit
Antikörper vor allem gegen die
KP-Virus bei Hühnern auszulösen vermag. Es reichte
Komponente des Virusteilchens geriditet sind 4 .
im angesetzten Immunisierungs-Versuch selbst eine
Komplementbindungs-Versuch
zweimalige Impfung mit je 80 • 10~(i g Antigen-Stick-
Antigen" nicht nur im Ansatz mit KP-, sondern auch
stoff nicht aus, um die Tiere gegen etwa 10° tödliche
in dem mit FM/ t -Maus-Serum das Komplement ab,
Virusdosen zu schützen, während bei
gleichartigen
Vakzinen aus Virus-Elementarteilchen bzw.
„Hämagglutinin"-
lenkte
das
Im
„lösliche
0,75
„Häm-
agglutinin" schon eine einmalige Injektion von < 2 •
10~6 g N 4 - 1 0 genügte, um 5 0 % der Hühner gegen
eine gleichstarke Testinfektion zu immunisieren. Die
0,10
Prüfung des „gebundenen Antigens" auf Immunisierungs-Vermögen
ist
nodi
nicht
abgesdilossen.
In
einem bisher durchgeführten Experiment, über das
in einer früheren Veröffentlidiung berichtet wurde 4 ,
/
/
/
besaß das verwendete Präparat zwar eine gewisse
0,05
/
X KP-E
lementarfeilchen
'
l-Antigen
/
l
r
...
/
/
/
/
/
/
/
/
X
.
/
/
immunisierende Fähigkeit, die aber geringer war als
die der Vakzinen aus Elementarteilchen und „Häm-
/KP-Eiemer
tar-T. 1-Antigen
agglutinin". Es ist nicht ausgeschlossen, daß das betreffende Präparat noch geringe Mengen von ande-
0.05
konzentrates, aus welchem es gewonnen
war,
ent-
hielt und daß diese und nicht das „gebundene Antig e n " für die schützende Wirkung der betreffenden
versucht,
in
umfangreicheren
0,15
Abb. 7. Präzipitation mit KP-Kaninchen- und „gebundenem Antigen"-Kaninchen-Serum.
— KP-Kan.-Serum.
geb. Antigen-Kan.-Serum.
0,15
Vakzine verantwortlich zu machen sind. Gegenwärtig
wird
0,10
mg Antigen-N
ren immunisierungs-fähigen Bestandteilen des Virus-
Versuchsreihen
eine Klärung dieser F r a g e herbeizuführen.
C. Besprechung der Ergebnisse
D i e Grundeinheit
des isolierten
£0,10
-9-
„löslichen
Anti-
gens" ist ein kugelförmiges Gebilde mit einem Durdimesser von etwa 1 0 — 1 5 m f x . Sie lagert sich zu kettenförmigen
Aggregaten
aneinander,
die
Längen
.N
£
0,05
bis zu 150 m// erreichen können. Dies hat zur Folge,
daß das Material — obwohl es elektrophoretisch einheitlich wandert — im Sdiwerefeld der Ultrazentrifuge in verschiedenen Gradienten, die den verschiedenen Aggregationsstufen entsprechen, sedimentiert.
Die
ermittelten
Sedimentations-Konstanten
liegen
zwisdien ~ 20 und 60 S. Nach dem UV-Absorptions-
0,05
0,10
0,15
mg Antigen-N
Abb. 8. Präzipitation mit NK-Kaninchen-Serum.
— NK-Kan.-Serum.
Norm. Kan.-Serum.
Spektrum ist das „lösliche Antigen" ein Nucleoproteid.
wozu von den Spaltprodukten des Elementarteilchens
In den beschriebenen physikalisch-chemischen Eigen-
wiederum lediglich das „gebundene Antigen" in der
sdiaften
Lage ist 7 .
hend
entspricht
dem
das „lösliche A n t i g e n "
„gebundenen
Antigen",
weitge-
das aus infek-
Ein untersdiiedliches Verhalten zeigten unsere Prä-
tiösen Elementarteilchen durch Behandlung mit Äther
parate von „gebundenem Antigen" und „löslidiem
herausgelöst werden kann.
Antigen" bisher nur im Immunisierungs-Versuch so-
Die serologische Untersuchung ergab, daß sich die
wie in der Präzipitations-Probe auf Normale-Kompo-
Ähnlichkeit der beiden Teilchen auch auf eine Reihe
nente. Während eine Formol-Vakzine
antigener Eigenschaften erstreckt. So wird das „lös-
triertem „gebundenem Antigen" Hühner gegen eine
liche Antigen" in der Präzipitations-Reaktion ledig-
nachfolgende Infektion mit KP-Virus zu immunisie-
lich vom Antiserum gegen
ren vermochte 4 , war dies mit einer entspredienden
„gebundenes
nicht aber vom KP-Antiserum
Antigen",
präzipitiert,
dessen
aus konzen-
Vakzine aus „löslichem Antigen" nicht möglich. Von
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dem NK-Kaninchen-Serum wurde das „lösliche Antigen", nicht aber das „gebundene Antigen" 10 präzipitiert. Es fragt sich jedoch, inwieweit diese Unterschiede als gesidiert bzw. entscheidend angesehen
werden können. Die Immunisierungs-Fähigkeit der
Vakzine aus einem Konzentrat von „gebundenem
Antigen" könnte u. U. darauf zurückzuführen sein,
daß diese als Verunreinigung nodi geringe Mengen
anderer immunisatorisch wirksamer Bestandteile der
Elementarteilchen, wie z. B. das „Hämagglutinin",
enthielt. Für eine solche Annahme spricht die Feststellung, daß die spezifische immunisatorische Wirksamkeit (bezogen auf Vakzine N) bei dem Impfstoff
aus „gebundenem Antigen" geringer ist als die der
Impfstoffe aus Virus-Elementarteilchen bzw. aus deren „Hämagglutinin" 4 ' 1 0 . Das normale Wirtsantigen,
das serologisdi beim „löslichen Antigen" festgestellt
wurde, ist möglicherweise kein eigentlicher Bestandteil desselben, sondern lediglidi aus dem Gewebehomogenat an seine Oberflädie adsorbiert*. Das „gebundene Antigen" hat hierzu keine Gelegenheit,
weil es aus gereinigten Virus-Elementarteilchen herausgelöst wurde. Zu prüfen bleibt noch, inwieweit
die NK an dem spektrophotometrisch festgestellten
Nucleinsäure-Gehalt des „löslichen Antigens" beteiligt ist.
Es wird erwartet, daß sidi aus der eingehenden
chemisdien Untersuchung des „löslichen Antigens",
über die in einer nächsten Mitteilung berichtet wird,
weitere Aufschlüsse über seine Beziehungen zum
„gebundenen Antigen" und damit zum Virus-Elementarteilchen ergeben.
Gegenwärtig werden drei verschiedene Möglichkeiten hinsichtlich der Bedeutung des „löslichen Antigens" in Erwägung gezogen (vgl. 1. c. 12 ): Es könnte
sich bei ihm einmal um ein bei der Virusvermehrung
auftretendes Nebenprodukt oder um das Erzeugnis
einer abnormalen Virus-Svnthese handeln. Weiterhin
könnte es eine Komponente sein, die bei der intracellulären Freilegung der eigentlichen reproduktionsfähigen Viruseinheit vom infizierenden Elementarteil-
chen abgelöst wird, und schließlich ist damit zu rechnen, daß es selbst die freigelegte vermehrungsfähige
Untereinheit des Virus darstellt. Unsere bisher bei der
klassischen Geflügelpest gewonnenen
Ergebnisse
sprechen bei diesem Virus am ehesten für eine Deutung im letztgenannten Sinne. Es wurde nicht nur
wahrscheinlidi gemacht, daß das „lösliche Antigen"
der KP wie alle übrigen selbstvermehrungs-fähigen
Einheiten Nucleinsäure enthält und mit dem nucleinsäure-haltigen Bestandteil des Virus-Elementarteildiens weitgehend übereinstimmt, sondern auch der
Nachweis erbracht, daß dieses Antigen bei der Vermehrung des Virus vor den infektiösen Elementarpartikeln in Erscheinung tritt 1 3 .
* Anm. b. d. Korr.: Inzwischen wurde ein Präparat gewonnen, in dem sich serologisch keine NK mehr nachweisen ließ.
12 R. D u l b e c c o , Physiol. Rev. 35, 301 [1955],
13 W. S c h ä f e r u. K. M ü n k , Z. Naturforschg. 7 b,
608 [1952],
14 M. W i e n e r , W. H e n l e u. G. H e n 1 e , J. exp.
Medicine 83, 259 [1946].
is G. L. A d a , M. D o n e 11 y u. J. P y e , Austral. \
exp. Biol. med. Sei. 29, 137 [1952],
iß G. L. A d a u. B. T. P e r r v , Austral. J. exp. Biol.
med. Sei. 32, 177 [1954],
* Nach neueren Untersuchungen von A d a [mitgeteilt
auf dem Symposium über Biophysik und Biochemie der
Viren, London (1956)] soll der RNS-Gehalt des „löslichen
Antigens" der Influenza wesentlich geringer sein als ursprünglidi angenommen. Außerdem soll sich das Basenverhältnis der RNS des „löslichen Antigens" von dem der
Elementarteilchen-RNS unterscheiden.
1- G. L. A d a , B. T. P e r r y u. J. P y e , Austral. J.
exp. Biol. med. Sei. 31, 391 [1953].
is J. E. S m a d e 1, Ch. W. H o a g 1 a n d u. Th.
S h e d l o v s k y , J. exp. Medicine 77, 165 [1943],
Ähnliche Eigenschaften wie das „lösliche Antigen"
der KP besitzt nach den bisher vorliegenden Untersuchungen das der Influenza, dessen Erreger mit
dem KP-Virus nahe verwandt ist 7 . Es hat etwa die
gleiche Größe 1 4 ' 1 5 und enthält Nucleinsäure 16 *. Bei
den Präzipitations-Versuchen in Agar, die A d a und
Mitarbb. 17 mit einem angereicherten „löslichen Antigen" von Influenza und spezifischem Antiserum
durchführten, wurden bis zu neun Trübungsringe gefunden. Dieses Ergebnis deutet auf eine Heterogenität des Antigenpräparates hin, die u. E. ebenso wie
beim „löslichen Antigen" der KP ihre Ursache in der
Aggregation der Teilchen haben kann. D a ß auch „lösliche Antigene" anderer Art als die bei Influenza und
KP beschriebenen vorkommen können, zeigten die
Untersuchungen am Vakzine-Virus, bei dem das in
freier Form im infizierten Gewebe auftretende LSAntigen keine Nucleinsäure enthalten soll 1 8 . Unter
dem Begriff „lösliches Antigen" werden demnach in
der Virusforsdiung Teilchen recht unterschiedlicher
Beschaffenheit und Bedeutung zusammengefaßt.
G. B e r g e r , I. B r o c k s , P. G i e b l e r , I. K l o e t z e l , U. L i l j e und L. P i s t e r danken wir für ihre
Mitarbeit. Die Untersuchungen wurden durdi das B u n desministerium
für E r n ä h r u n g ,
Landw i r t s c h a f t u n d F o r s t e n und die D e u t s c h e
F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t gefördert.
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