Dokument_26.

Aus dem Institut für Experimentelle und Klinische
Pharmakologie und Toxikologie
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
(Prof. Dr. med. Andreas Ludwig)
Die Bedeutung der Hämoxygenase-1 für
Proliferation und Suppressionsaktivität humaner
CD4+CD25+ regulatorischer T-Lymphozyten
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Mirjam Franziska Schädle
aus Donauwörth
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. rer. nat. G. Tiegs
Korreferent:
Prof. Dr. med. A. Ludwig
Tag der mündlichen Prüfung:
25.11.2009
meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung .......................................................................................................... 1
1
Hintergrund und Ziele........................................................................................... 1
2
Methoden .............................................................................................................. 1
3
Ergebnisse und Beobachtungen ............................................................................ 1
4
Praktische Schlussfolgerungen ............................................................................. 2
Summary.......................................................................................................................... 3
1
Einleitung................................................................................................................. 4
1.1
Das Immunsystem............................................................................................. 4
1.2
Immunität und Toleranz.................................................................................... 4
1.3
T-Zellen............................................................................................................. 6
1.3.1
Regulatorische T-Zellen............................................................................ 7
1.3.2
CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen ........................................................ 8
1.3.3
Die Bedeutung von FoxP3 in CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen ...... 9
1.3.4
Die Bedeutung der HO-1 in CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen....... 10
1.4
2
Ziel der Arbeit................................................................................................. 11
Material und Methoden........................................................................................ 13
2.1
Zellisolation .................................................................................................... 13
2.1.1
Dichtegradientzentrifugation .................................................................. 13
2.1.2
Zellzählung ............................................................................................. 14
2.1.3
Magnetische Sortierung von Zellen (MACS) ......................................... 14
2.2
Zellkultur ........................................................................................................ 16
2.2.1
Stimulation mit Anti-CD3/ Anti-CD28 .................................................. 16
2.2.2
Induktion und Inhibition der Hämoxygenase-1 ...................................... 17
2.2.2.1
Inhibition durch SnPP ......................................................................... 17
2.2.2.2
Induktion durch PGJ2 und CoPP......................................................... 17
2.3
Proteinnachweis .............................................................................................. 18
2.3.1
Proteinpräparation................................................................................... 18
2.3.2
Proteinbestimmung ................................................................................. 18
2.3.3
Gelektrophorese ...................................................................................... 19
2.3.4
Western-Blotting und immunologischer Proteinnachweis ..................... 21
2.4
2.4.1
CFSE-Markierung................................................................................... 23
2.4.2
PKH26-Markierung ................................................................................ 24
2.4.3
Kokultivierung der Zellen....................................................................... 25
2.4.4
Durchflusszytometrie.............................................................................. 25
2.4.5
IL-2-Nachweis durch ELISA .................................................................. 26
2.4.6
[3H]-Thymidin-Labeling ......................................................................... 28
2.5
3
Datenerfassung und -verarbeitung .................................................................. 29
Ergebnisse.............................................................................................................. 30
3.1
4
Messung der Zellproliferation und -suppression ............................................ 23
Bestätigung von HO-1-Expression und -Induktion ........................................ 30
3.1.1
HO-1-Expression in Tregs und stimulierten Responder-Zellen................ 30
3.1.2
HO-1-Induktion in Responder-Zellen durch CoPP und PGJ2................. 31
3.1.3
HO-1-Induktion führt nicht zu einer FoxP3-Expression ........................ 32
3.2
Analyse der Suppression im FACS durch
unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe .......................................................... 33
3.3
Einfluss der HO-1-Induktion auf die Proliferation von CD4+CD25T-Zellen........................................................................................................... 35
3.4
Einfluss der HO-1-Inhibition auf die Proliferation von Tregs ........................ 37
3.5
HO-1-Induktion ist nicht ausreichend zur Induktion
regulatorischer Fähigkeiten............................................................................. 38
3.6
Fehlender Einfluss der HO-1-Inhibition auf den immunsuppressiven
Phänotyp von Tregs........................................................................................... 41
Diskussion .............................................................................................................. 44
4.1
Immunsuppressivität vs. Proliferationsaverser Phänotyp ............................... 44
4.2
Fragliche Rolle der HO-1 für die Immunsuppressivität muriner Tregs ............ 45
4.3
Diskrepanz zu vorherigen Forschungsergebnissen ......................................... 45
4.4
Entscheidende Rolle der HO-1 für immunologische Toleranz im
murinen Modell............................................................................................... 46
4.4.1
Verlängertes Überleben von Allotransplantaten ..................................... 46
4.4.2
Verminderung von Abortraten ................................................................ 47
4.4.3
Suppression allergischer Atemwegsinfektionen ..................................... 47
4.5
HO-1 im Zusammenhang mit Antigen präsentierenden Zellen ...................... 48
4.5.1
Reduktion der Anzahl von DCs durch HO-1-Induktion in der Ratte ..... 48
4.5.2
Reduktion der Anzahl von DCs durch HO-1 im murinen
Diabetesmodell ....................................................................................... 49
4.5.3
Bestätigung der Rolle der HO-1 für die Aktivität von DCs
beim Menschen ....................................................................................... 49
4.6
Das Zusammenspiel Antigen präsentierender Zellen mit Tregs ....................... 50
4.6.1
HO-1-Expression dendritischer Zellen ................................................... 50
4.6.2
Vermittlung immunregulatorischer Effekte der HO-1 über APCs ......... 50
4.7
Ausblick .......................................................................................................... 51
5
Literaturverzeichnis ............................................................................................. 53
6
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 59
7
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis................................................................. 61
Anhang........................................................................................................................... 62
A
Chemikalien und Reagenzien ............................................................................. 62
B
Geräte und Materialien ....................................................................................... 65
Danksagung ................................................................................................................... 67
Lebenslauf ..................................................................................................................... 68
-1-
Zusammenfassung
______________________________________________________________________
1
Hintergrund und Ziele
HO-1 ist das einzige induzierbare dreier Isoenzyme, die den oxidativen Abbau von Häm
katalysieren. HO-1 wird durch eine Vielzahl von Situationen zellulären Stresses
induziert und hat eine zytoprotektive sowie immunmodulatorische Wirkung.
Publikationen zeigten kürzlich, dass HO-1 in Folge einer FoxP3-Transduktion induziert
wird und dass CD4+CD25+ T-Zellen (Tregs) FoxP3 konstitutiv exprimieren. In der
vorliegenden Arbeit wurde erforscht, ob die HO-1-Expression der Tregs für deren
immunsuppressive Wirkung in vitro erforderlich und ausreichend ist.
2
Methoden
Mittels Western-Blot wurde die Expression von HO-1 sowie FoxP3 in CD4+CD25- TZellen nach HO-1-Induktion durch CoPP und PGJ2 überprüft. In Kokultivation mit
unbehandelten CD4+CD25- Responder-T-Zellen wurde getestet, ob eine HO-1Induktion zur Suppression der Responder-Zellen befähigt. Das Ausmaß der Suppression
wurde mittels FACS sowie [³H]-Thymidin-Labeling und ELISA bestimmt. Der Einfluss
einer
HO-1-Inhibition
durch
SnPP
in
Tregs
auf
FoxP3-Expression
und
immunmodulatorische Wirkung wurde mit gleichen Methoden untersucht.
3
Ergebnisse und Beobachtungen
PGJ2 induzierte eine von FoxP3-Expression unabhängige ausgeprägte HO-1-Expression
in CD4+CD25- T-Zellen. Eine Behandlung von CD4+CD25- T-Zellen mit PGJ2
verminderte deren Proliferation, wohingegen eine Inhibition der HO-1 durch SnPP die
Proliferation HO-1 exprimierender Tregs steigern konnte, was vermuten lässt, dass HO-1
die Fähigkeit hat, die Proliferationskapazität von T-Lymphozyten zu modulieren. Eine
entsprechende HO-1-Modulation durch Behandlung von Tregs mit SnPP oder von
CD4+CD25- T-Zellen mit PGJ2 führte in diesen Zellen weder zu einer Suppression noch
zu einer Induktion immunmodulatorischer Fähigkeiten, gemessen anhand der
Proliferation, der IL-2-Produktion und der DNA-Syntheserate der Responder-Zellen.
-2-
4
Praktische Schlussfolgerungen
Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass die HO-1-Expression der Tregs zu
deren typischer Proliferationsträgheit beizusteuern scheint, jedoch nicht unabhängig
deren
immunsuppressive
Funktion
begründen
kann.
In
Anbetracht
kürzlich
veröffentlichter Daten aus anderen Versuchsmodellen könnte die immunregulatorische
Funktion der HO-1 eher in der durch Antigen präsentierende Zellen exprimierten HO-1
begründet sein.
-3-
Summary
______________________________________________________________________
HO-1 is the only inducible of three isoenzymes that catalyze oxidative degradation of
heme. HO-1 is inducible by a variety of cellular stresses and exerts cytoprotective and
immunomodulatory effects. Recent publications demonstrated that HO-1 is induced
upon FoxP3 transfection and constitutively expressed by CD4+CD25+ regulatory T cells
(Tregs). Here we investigated, whether HO-1 was essential and sufficient for human Tregs
to exert immunosuppression in vitro. Prostaglandin PGJ2 induced pronounced
expression of HO-1 in CD4+CD25- T cells independent from FoxP3 induction.
Treatment of CD4+CD25- T cells with PGJ2 decreased their proliferation, whereas HO-1
inhibitor SnPP could enhance proliferation of HO-1 expressing Tregs, suggesting that
HO-1 is able to modulate the proliferative capacity of T lymphocytes. HO-1 modulation
by SnPP-treatment of Tregs or PGJ2-treatment of CD4+CD25- T cells neither suppressed
nor induced immuno-modulatory function in these cells, respectively, as measured by
responder-cell proliferation, IL-2 production and rate of DNA synthesis. In summary,
these data suggest that HO-1 expression by Tregs might contribute to their typical
reluctance to proliferate, but does not independently account for their suppressive
functions. In consideration of recently published data from other models the important
immunoregulatory role of HO-1 might rather rely on HO-1 expressed by antigen
presenting cells than that by Tregs.
-4-
1 Einleitung
______________________________________________________________________
1.1 Das Immunsystem
Das Immunsystem von Vertebraten hat die Aufgabe, den Organismus vor Infektionen
durch Bakterien, Viren, Parasiten und Pilze zu bewahren, aber auch entartete
körpereigene Zellen zu eliminieren. Die Variabilität der Pathogene erfordert variable
Abwehrmechanismen; deswegen setzt sich das Immunsystem aus einer Vielzahl
unterschiedlicher
Komponenten
unterschiedlichen
Abwehrstrategien
zusammen,
die
die
im
Bekämpfung
Zusammenspiel
von
mit
Krankheitserregern
gewährleisten.
Die Immunität wird auf erster Stufe durch das angeborene Immunsystem vermittelt, das
unspezifisch Pathogene abwehrt. Zu den zahlreichen Komponenten der angeborenen
Immunität gehören neben Haut- und Schleimhautbarrieren, die Erregern das Eindringen
erschweren, Zellen wie natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Makrophagen, die in
der Lage sind, unspezifisch körperfremde Partikel zu phagozytieren und zu zerstören.
Um eine spezifischere Abwehr gegen ein bestimmtes Pathogen zu gewährleisten, kann
dieses durch Antigen präsentierende Zellen (APCs), die eine Zwischenstellung zwischen
dem angeborenen und adaptiven Immunsystem darstellen, prozessiert und anderen
immunologisch relevanten Zellen als Antigen präsentiert werden. Komponenten dieser
adaptiven oder erworbenen Immunität, die nur in höheren Organismen vorkommt, sind
B- und T-Zellen, die aufgrund spezifischer Rezeptoren auf jedes einzelne Pathogen
individuell reagieren können. Diese Populationen zeichnen sich durch das
„immunologische Gedächtnis“ aus, welches sie zu lebenslanger Immunität bei
Reinfektion mit einem Krankheitserreger befähigt. Zudem ist das adaptive
Immunsystem in der Lage, körpereigene von körperfremden Stoffen zu unterscheiden.
1.2 Immunität und Toleranz
Zentrale Aufgabe des Immunsystems ist es, eine ausgewogene Balance zwischen
Immunität und Toleranz zu halten, um einerseits möglichst effektiv Tumorzellen und
Krankheitserreger zu bekämpfen und andererseits körpereigenes Gewebe und harmlose
Fremdkörper zu tolerieren (Abb.1).
-5Eine Verschiebung des Gleichgewichts zu Gunsten zu hoher Immunität führt zu
mangelnder Selbsttoleranz und damit zu Autoimmunerkrankungen. Auch im Falle der
Verhinderung einer Transplantatabstoßung oder der Abstoßung des Fetus durch die
Mutter spielt die immunologische Toleranz des Immunsystems eine entscheidende
Rolle.
Abb. 1: Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz: Um den Organismus einerseits
vor schädlichen Einflüssen zu schützen und andererseits körpereigenes Gewebe nicht zu
bekämpfen, müssen sich Immunität und Toleranz die Waage halten.
Zur Gewährleistung dieser Toleranz durchlaufen die T-Zellen bei ihrer Reifung im
Thymus einen Selektionsprozess, bei dem durch positive Selektion nur Zellen in die
Peripherie ausgesendet werden, deren Rezeptor Peptide erkennt. Des Weiteren werden
im Zuge einer negativen Selektion T-Zellen eliminiert, deren Rezeptor Selbstpeptid
bindet. Diese Kontrolle und Elimination autoreaktiver Zellen bei ihrer Entwicklung im
Thymus wird als „Zentrale Toleranz“ bezeichnet.
Trotz zentraler Toleranz entgehen jedoch einige autoreaktive Zellen der Selektion,
gelangen in die Peripherie und sind dort in der Lage, Autoimmunerkrankungen
auszulösen (3). Um dies zu verhindern, existieren zahlreiche Mechanismen „Peripherer
Toleranz“ wie der aktivierungsinduzierte Zelltod oder die Anergie von T-Zellen durch
ausbleibende kostimulatorische Signale, die zur Aktivierung von T-Zellen notwendig
wären. Eine aktive Unterdrückung autoreaktiver Immunantworten in der Peripherie wird
durch sogenannte regulatorische Zellen oder Suppressorzellen gewährleistet. Eine
wichtige Rolle scheinen hierbei neben dendritischen Zellen (41) und B-ZellSubpopulationen (15) regulatorische T-Zellen zu spielen.
-6-
1.3 T-Zellen
T-Zellen entwickeln sich im Thymus und lassen sich in der Peripherie anhand ihrer
Oberflächenmoleküle sowie ihrer unterschiedlichen Funktionen in verschiedene
Gruppen unterteilen. So unterscheidet man T-Helferzellen (TH-Zellen), die im
ausgereiften Zustand den Korezeptor CD4 tragen, zytotoxische T-Zellen (CTLs) mit
CD8 an der Zelloberfläche und natürliche Killer-T-Zellen (NK-T-Zellen), die entweder
CD8, CD4 oder keinen der beiden Oberflächenmarker tragen.
T-Zellen reagieren nicht auf freie, sondern nur auf zellgebundene Antigene, die ihnen
mittels MHC-Molekülen präsentiert werden.
APCs, zu denen Makrophagen, dendritische Zellen und B-Lymphozyten zählen, nehmen
Antigene auf, prozessieren sie und binden sie in Form von Peptiden an intrazelluläres
MHC II. Das Peptid wird in Verbindung mit dem MHC II-Molekül auf der Oberfläche
der APCs präsentiert und von CD4 tragenden TH-Zellen erkannt, die daraufhin in
Anwesenheit kostimulatorischer Signale Zytokine ausschütten, durch welche z.B.
Makrophagen aktiviert (TH1-Zellen, zelluläre Immunabwehr) und B-Lymphozyten zur
Antikörperbildung (TH2-Zellen, humorale Immunabwehr) angeregt werden (Abb. 2).
Abb. 2: Aktivierung der T-Helfer-Zellen: Antigen präsentierende Zellen (APCs) präsentieren
über MHC II das prozessierte Antigen (AG), welches vom T-Zell-Rezeptor (TCR) CD4
tragender T-Helfer-Zellen (TH-Zellen) erkannt wird. In Anwesenheit kostimulatorischer Signale
wird die Information mittels CD3 ins Zellinnere geleitet und die TH-Zelle zur Ausschüttung von
Zytokinen aktiviert.
Des Weiteren besitzt jede kernhaltige infizierte Zelle die Fähigkeit, selbst Antigen über
MHC I zu präsentieren, um vom Immunsystem erkannt zu werden. MHC I kooperiert
-7mit dem CD8-Korezeptor der zytotoxischen T-Zellen, die in der Lage sind, nach
Erkennung des Antigens auf entarteten oder auf virusinfizierten Zellen die betroffenen
Zellen in den programmierten Zelltod zu leiten (Abb. 3).
Abb. 3: Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten: Die infizierte Zelle präsentiert über
MHC I das Antigen, das vom TCR der CD8 tragenden zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL)
erkannt wird. In Anwesenheit kostimulatorischer Signale wird die Information mittels CD3 ins
Zellinnere geleitet, woraufhin die CTLs in der Lage sind, infizierte Zellen in den
programmierten Zelltod zu leiten.
Zur Erkennung der durch mittels MHC präsentierten Peptide tragen alle T-Zellen einen
T-Zell-Rezeptor (TCR), der mit Ketten des CD3-Moleküls verbunden ist, das für die
Transduktion von Signalen ins Zellinnere sorgt. Außer den Signalen über den TCR
benötigen T-Zellen zu ihrer Aktivierung kostimulatorische Signale, die z.B. durch eine
Interaktion verschiedener Oberflächenmoleküle von T-Zellen und APCs zu Stande
kommen. So liefern dendritische Zellen unter anderem kostimulatorische Signale über
CD80 und CD86, die an CD28 auf den T-Zellen binden und damit die Aktivierung der
T-Zelle unterstützen.
1.3.1
Regulatorische T-Zellen
Verschiedene T-Zellen sind in der Lage, Immunreaktionen zu supprimieren; somit
werden sie als regulatorische T-Zellen bezeichnet, die nach normaler Entwicklung im
Thymus erst in der Peripherie zu ihrer regulatorischen Funktion aktiviert werden (39,
49). Unter diesen regulatorischen T-Zellen nehmen CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen
-8(Tregs) eine gesonderte Stellung ein. Sie haben ihren Ursprung als regulatorische Zellen
direkt im Thymus, sind von Anfang an suppressiv aktiv und spielen somit eine
Hauptrolle in der Gewährleistung peripherer Toleranz.
1.3.2
CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen
Die Existenz dieser natürlich vorkommenden suppressiven T-Zell-Subpopulation wurde
zum ersten Mal 1971 von Gershon und Kondo beschrieben (18). 1995 entdeckten
Sakaguchi et al. eine T-Zell-Subpopulation, die neben CD4 konstitutiv CD25, die αKette des IL-2-Rezeptors, exprimiert und in vivo in der Lage ist, antigenspezifisch und
Zell-Zell-Kontakt abhängig autoreaktive T-Zellen zu kontrollieren (50). Ein Fehlen der
CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen führt zu erhöhten IgE-Leveln, Eosinophilie,
verschiedenen Autoimmunkrankheiten, Ekzemen und Nahrungsmittelallergien. Darüber
hinaus konnte die immunsuppressive Wirkung der CD4+CD25+ regulatorischen TZellen bisher auch im Zusammenhang mit Toleranz gegenüber Transplantaten sowie
Tumorerkrankungen nachgewiesen werden, bei denen eine gesteigerte periphere
Toleranz eine Deletion entarteter Zellen behindert (52, 17, 19).
CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) werden wie die von ihnen in Proliferation
und Zytokinausschüttung supprimierten CD4+CD25- T-Zellen (Responder-Zellen) im
Thymus gebildet und unterscheiden sich von diesen durch einen hypoproliferativen
Phänotyp und eine konstitutive Expression verschiedener aktivationsassoziierter
Markermoleküle wie CTLA-4 und GITR, die auch in aktivierten CD4+CD25- T-Zellen
exprimiert werden (38, 54).
Es sind zahlreiche sich wohl ergänzende und sich nicht ausschließende Lösungsansätze
zum Mechanismus der Immunsuppression durch Tregs bekannt, aber kein Modell konnte
die
Zusammenhänge bisher vollständig beschreiben. Neben der Zell-Zell-Kontakt
abhängigen Suppression von Responder-Zellen in vitro konnten in vivo auch
zytokinvermittelte Suppressionsmechanismen beobachtet werden. So wurden z.B.
CTLA-4, TGF-β, IL-10 und Interferon γ eine wichtige Rolle für die suppressive
Wirkung von Tregs zugeschrieben (20, 4, 66). Auch IL-2 scheint Einfluss auf die
Kontrolle von Immunantworten durch Tregs zu nehmen, da 1998 Dai et al. zeigen
konnten, dass Mäuse ohne IL-2 bzw. ohne funktionierenden IL-2-Rezeptor die Toleranz
gegenüber Selbst-Antigenen verlieren (35, 13).
-9Für die Funktion und Entwicklung der Tregs unentbehrlich ist der Transskriptionsfaktor
FoxP3. Da CD25 auch bei CD25- T-Zellen nach Aktivierung hochreguliert wird, gilt
FoxP3 als einziger zuverlässiger Marker CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen (21, 26,
16).
1.3.3
Die Bedeutung von FoxP3 in CD4+CD25+ regulatorischen TZellen
FoxP3 (Scurfin) ist ein Transkriptionsfaktor aus der Familie der Forkhead Proteine, die
zahlreiche verschiedene zelluläre Prozesse steuern (30). Tregs zeichnen sich im
Gegensatz zu CD4+CD25- T-Zellen durch eine konstitutive Expression von FoxP3 aus
(52, 54, 16, 46). Eine Defekt-Mutation von FoxP3 beim Menschen führt zur seltenen
Erkrankung IPEX (X-linked syndrome of immunodysregulation, polyendocrinopathy,
and enteropathy), die durch autoreaktive Prozesse aufgrund mangelnder Selbsttoleranz
zu einem frühen Tod führt (62). Ein vergleichbares Syndrom kann bei Mäusen mit einer
Mutation im murinen FoxP3 beobachtet werden. Sie entwickelten eine massive
Autoimmun- und Entzündungserkrankung, das so genannte letale Autoimmun-Syndrom
„Scurfy“. Im Gegenzug führte eine Transfektion von FoxP3 in CD4+CD25- T-Zellen zu
einem den Tregs ähnlichen regulatorischen Phänotyp (21, 26, 16). Die Zusammenhänge
der neu aufgetretenen regulatorischen Wirkung nach FoxP3-Transfektion in CD4+CD25T-Zellen versuchten 2004 Choi et al. in Versuchen an Jurkat-T-Zellen zu entschlüsseln,
einem akuten T-Zell-Leukämie-Klon menschlichen Ursprungs. FoxP3-transifizerte
Jurkat-T-Zellen waren in der Lage, über Zell-Zell-Kontakt die Proliferationsrate nicht
transfizierter Wildtyp Jurkat-T-Zellen zu vermindern und wurden somit zu T-Zellen mit
regulatorischen Fähigkeiten. Die Transfektion führte sowohl zu einer verringerten
Produktion von Zytokinen wie Interleukin-2 und Interferon-γ als auch zu einem
antiproliferativen Effekt auf Wildtyp-Zellen. Außerdem konnte nach FoxP3Transfektion eine Induktion der Hämoxygenase-1 (HO-1) festgestellt werden, die
sowohl vermehrt exprimiert wurde als auch eine erhöhte Aktivität im Hämabbau zeigte
(11). Dieser Entdeckung folgten nähere Betrachtungen der HO-1, als Zielgen von
FoxP3, um ihre potentielle Rolle für den suppressiven Phänotyp der Tregs zu
untersuchen.
- 10 -
1.3.4
Die Bedeutung der HO-1 in CD4+CD25+ regulatorischen TZellen
Bisher
sind
drei
Isoformen
des
Enzyms
Hämoxygenase
bekannt,
die
als
geschwindigkeitsbestimmende Enzyme den Abbau von Häm zu äquivalenten Mengen
von Biliverdin, Kohlenmonoxid und Eisen katalysieren (33, 32, 37). Im Gegensatz zu
den konstitutiv exprimierten Isoformen HO-2 und HO-3 ist die 32 kDa große HO-1
induzierbar und nimmt in der Milz die vorherrschende Position im Abbau von Häm ein.
Außerhalb der Milz spielt die HO-2 die Hauptrolle in der Verstoffwechslung des Häms
(59, 63, 34).
HO-1, auch Hitzeschockprotein 32 genannt, ist neben ihrem Substrat Häm durch eine
Vielfalt von Stimuli induzierbar, die oxidativen Stress und Zellschäden verursachen,
wie z.B. UV- Licht, Hitzeschock, Wasserstoffperoxid, Hypoxie, Schwermetalle und
Stickstoffmonoxid (69, 25, 61, 24, 40). Darüberhinaus wird die Expression von HO-1
auch
durch
unterschiedliche
immunologisch
relevante
Faktoren
wie
proinflammatorische Zytokine, oxidiertes LDL und bakterielles Lipopolysaccharid
(LPS) gesteigert (9, 23, 8).
Die unterschiedlichen Situationen und Substanzen, die außer ihrem Substrat Häm zu
einer Induktion der HO-1 führen, deuten auf weitere Funktionen der Hämoxygenase
neben
dem
alleinigen
Hämabbau
hin,
und
so
untersuchten
zahlreiche
Forschungsarbeiten den Effekt einer HO-1-Induktion, welche in den Experimenten oft
durch Cobalt-Protoporphyrin (CoPP) und ∆12-Prostglandin J2 (PGJ2) erreicht wird (1,
60, 53, 27). Es konnte ein günstiger Einfluss der HO-1-Induktion auf verschiedenste
Organschäden gezeigt werden. Nieren konnten vor Ischämie- und Reperfusionsschäden
sowie akutem ischämischen Versagen bewahrt und kardiale Xenotransplantate vor einer
Abstoßung geschützt werden (60, 53, 55). Auch bei durch Transplantationen
verursachtem Ischämie- und Reperfusionsschaden in der Leber sowie Hämorrhagien
nach Reanimation wirkte eine HO-1-Induktion protektiv (2, 48). Ein HO-1-Gentransfer
konnte Lungenschäden durch Hypoxie sowie die Entstehung von Diabetes Typ 1 in
NOD Mäusen reduzieren (42, 22). Einen Überblick über weitere Beispiele für
antiinflammatorische, antiapoptotische und antiproliferative Effekte der HO-1 und ihrer
Produkte gibt Otterbein 2003 (43).
Des Weiteren beschreibt eine zunehmende Anzahl an Forschungsarbeiten eine direkte
immunsuppressive Wirkung von HO-1. So konnten kultivierte Fibroblasten und
- 11 Endothelzellen in vitro vor einer TNF-α-induzierten Apoptose geschützt werden (45, 7).
Außerdem konnte einem entzündungsbedingten apoptotischen Leberschaden in Mäusen
und einem endotoxischen Schock in Ratten vorgebeugt werden (51, 58). In vivo konnte
eine HO-1-Induktion Mäuse vor einer akuten Graft-versus-Host-Reaktion bewahren
sowie die Zytotoxizität, Proliferation und Zytokinproduktion von T- Zellen und
natürlichen Killerzellen supprimieren (64, 65).
2004 zeigten Pae et al., dass CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen im Gegensatz zu
CD4+CD25- T-Zellen konstitutiv HO-1 exprimieren und dass nach T-Zell-Stimulation in
beiden Zelltypen die HO-1 erhöht wird (44).
Choi et al., die durch die Transfektion von FoxP3 in CD4+CD25- Jurkat-T-Zellen in
vitro einen regulatorischen Phänotyp erzeugten, beobachteten gleichzeitig eine HO-1Induktion durch FoxP3. Um festzustellen, ob die neu erworbenen suppressiven
Fähigkeiten der FoxP3- transfizierten Zellen von der Induktion der HO-1 herrührten,
wurde diese mittels ZnPP in ihrer Aktivität blockiert. Die Autoren beschrieben
daraufhin, dass durch eine Ausschaltung der HO-1 der suppressive
Effekt der
transfizierten Jurkat-T-Zellen verloren ging. Da ein ähnlicher Effekt auch bei Tregs direkt
zu beobachten war, wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Ausschaltung der durch
FoxP3 induzierten HO-1 zu einem Verlust der suppressiven Wirkung von CD4+CD25+
regulatorischen T-Zellen auf CD4+CD25- Responder-T-Zellen führt (11).
1.4 Ziel der Arbeit
Basierend auf den bisherigen Ergebnissen war Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, ob die
HO-1 entscheidend und ausreichend für die immunsuppressive Funktion humaner
CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen ist. Durch eine Bestätigung der Annahme, dass die
HO-1 für die immunsuppressive Aktivität der Tregs verantwortlich ist und dass durch
eine alleinige Inhibition bzw. Induktion der HO-1 eine Änderung der suppressiver
Kapazität von humanen Tregs bzw. CD4+CD25- T-Zellen erreicht werden kann, könnte
die Modulation der HO-1 in menschlichen Tregs neue Therapieansätze zur Behandlung
solcher Krankheiten eröffnen, die mit einem Ungleichgewicht von Toleranz und
Immunität im menschlichen Körper einhergehen.
Um die Frage nach den immunsuppressiven Kapazitäten der HO-1 in humanen Tregs zu
klären, sollten mittels Western-Blot die bisherigen Forschungsergebnisse zur HO-1
- 12 Expression in Tregs bestätigt werden und daraufhin der Verlauf der Expression von HO-1
in CD4+CD25- Responder-T-Zellen nach Induktion durch CoPP und PGJ2 über
verschiedene Tage überprüft werden, um später unter möglichst günstigen Bedingungen
die Auswirkungen einer HO-1 Induktion untersuchen zu können. In Anlehnung an die
Erkenntnis von Choi et al., dass FoxP3 HO-1 induziert, sollte im Gegenzug ein
Western-Blot zeigen, ob die Induktion von HO-1 in CD4+CD25- Responder-T-Zellen zu
einer Expression von FoxP3 führt. Daraufhin sollte der Einfluss einer HO-1 Induktion
auf CD4+CD25- Responder-T-Zellen näher betrachtet werden. In Kokultivation mit
unbehandelten CD4+CD25- T-Zellen sollte getestet werden, ob eine HO-1-Induktion zur
Suppression der Responder-Zellen befähigt. Das Ausmaß der Suppression sollte durch
Fluorescence activated cell sorting (FACS) anhand der Proliferationsrate der Zellen
bestimmt werden. Weitere Möglichkeiten zur Beurteilung der Suppression ergaben sich
aus der Messung der Zellteilungsrate über radioaktives
3
H-Thymidin und der
Zytokinproduktion im ELISA. Des Weiteren sollte mit den gleichen Methoden der
Einfluss einer HO-1-Inhibition auf Tregs untersucht werden, um festzustellen, ob diese
durch eine Blockade von HO-1 ihre suppressiven Fähigkeiten verlieren. Um die
Proliferationsrate zweier kokultivierter Zellgruppen im FACS getrennt voneinander zu
messen, sollte mittels unterschiedlicher Markierungen eine Möglichkeit entwickelt
werden, mit der sich beide Zellpopulationen gleichzeitig in ihrer Proliferation beurteilen
lassen.
- 13 -
2 Material und Methoden
______________________________________________________________________
2.1 Zellisolation
Die für die Experimente benötigten CD4+CD25+ T-Zellen und CD4+CD25- T-Zellen
wurden im Forschungsbereich der Hautklinik Erlangen (Abteilung für Experimentelle
Immuntherapie der Hautklinik des Universitätsklinikums Erlangen; Direktor: Prof. Dr.
G. Schuler) aus humanem Vollblut isoliert. Des Weiteren wurde dort die Aktivierung
der T-Zellen durch gebundene Anti-CD3- und lösliche Anti-CD28-Antikörper (Methode
2, siehe 2.2.1) sowie die [3H]-Thymidin-Markierung (siehe 2.4.6) durchgeführt. Alle
weiteren Versuche fanden im Institut für experimentelle Pharmakologie und
Toxikologie in Erlangen statt.
2.1.1
Dichtegradientzentrifugation
B-Zellen, T-Zellen, natürliche Killerzellen und Monozyten (PBMCs) können aufgrund
ihrer Dichte mit Hilfe eines dem Vollblut untergeschichteten Ficoll-Gradienten durch
Zentrifugation von anderen Blutbestandteilen getrennt werden. Die Dichte des Ficolls ist
so eingestellt, dass Zellen mit höherer Dichte wie Erythrozyten, Granulozyten oder tote
Zellen die Ficollschicht passieren und bei Zentrifugation pellettiert werden. Die
mononukleären Zellen sammeln sich zwischen Ficoll und Plasma in der Interphase an,
im Überstand befinden sich im Plasma die Thrombozyten.
Durchführung
140–200 ml periphervenöses Vollblut gesunder, freiwilliger Probanden wurde in
heparinisierten Spritzen à 20 ml abgenommen, im Verhältnis 1:3 mit raumtemperiertem
PBS verdünnt und in jeweils 50 ml Reaktionsgefäße aufgenommen. Nach
Unterschichtung von 13 ml Lymphoprep pro Reaktionsgefäß und 30minütiger
Zentrifugation mit 500 x g bei RT wurden die sich in der Interphase befindenden
peripheren mononukleären Zellen abgesaugt, in kaltem PBS mit 1mM EDTA zur
Thrombolyse von Thrombozyten resuspendiert und zur Auswaschung der restlichen
Erythrozyten zweimal 15 min mit 300 x g bei 4 °C zentrifugiert. Nach Dekantieren des
- 14 Zellüberstandes wurde das Zellpellet in PBS mit EDTA resuspendiert und die Zellzahl
der PBMCs bestimmt.
2.1.2
Zellzählung
Die Neubauer-Zählkammer besteht aus vier Großquadraten, die jeweils in 16 kleine
Quadrate unterteilt sind. Zwischen Deckblatt und Neubauer-Zählkammer befindet sich
ein definiertes Volumen, aus dem nach Zählen der Zellen eines Großquadrates unter
dem Mikroskop mit folgender Formel die Zellzahl pro ml berechnet werden kann:
Zellzahl pro ml = Zellen eines Großquadrates x Verdünnungsfaktor x 104
Bei einer Verdünnung des zur Zählung verwendeten Aliquots der Zellsuspension mit
Trypanblau können abgestorbene Zellen, die den blauen Farbstoff aufnehmen, aus der
Zählung genommen werden. Bei einer Zählung mit Türkscher Lösung werden nur
kernhaltige Zellen angefärbt, wodurch es möglich ist, Erythrozyten und Thrombozyten
aus der Zählung auszugrenzen. Außer bei der Zählung peripherer mononukleärer Zellen
mit Türkscher Lösung wurde für alle weiteren Zellzählungen Trypanblau verwendet.
2.1.3
Magnetische Sortierung von Zellen (MACS)
Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) ist ein Verfahren zur magnetischen
Zellseparation. Dabei können spezifische Zellstrukturen mittels Microbeads markiert
werden. Microbeads sind etwa 50 nm große superparamagnetische Mikropartikel, an die
Antikörper gebunden sind. Sie verhindern den Durchfluss der markierten Zellen durch
eine von einem starken Magnetfeld umgebene Säule, wobei unmarkierte Zellen unter
der Säule aufgefangen werden können. Man unterscheidet eine positive Selektion, bei
der die markierten Zellen die Zielzellen sind, und eine negative Selektion, bei welcher
die Zielzellen unmarkiert durch die Säule gespült werden (57).
- 15 Rezepte
MACS-Puffer:
PBS
Humanalbumin (HSA) 20%
500 ml
12,5 ml
MLPC:
RPMI 1640
Pool-Serum (hitzeinaktiviert)
Hepes-Puffer
Nicht-essentielle Aminosäuren
L-Glutamin
Gentamycin
Sodium-Pyruvat
500 ml
50 ml
5 ml
5 ml
5 ml
0,2 ml
5 ml
Durchführung
Die magnetische Zellsortierung wurde mit dem CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation
Kit für humane CD4+CD25+ T- Zellen durchgeführt.
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit human (Miltenyi Biotec)
o CD4+ T Cell Biotin- Antibody Cocktail, human (Cocktail aus humanen
monoklonalen Biotin- konjugierten CD14-, CD16-, CD19-, CD36-, CD56-, CD123und Glykophorin- Antikörpern)
o Anti- Biotin MicroBeads
o CD25 MicroBeads
o CD25-PE
Die wie in 2.1.1 beschrieben gewonnenen Zellen wurden in 9 µl MACS-Puffer pro 1
Million Lymphozyten aufgenommen und mit 1 µl Biotin-Antibody-Cocktail pro 1
Million Zellen versetzt. Daraufhin wurden nach zehnminütiger Inkubation bei 4 °C 2 µl
an monoklonale Anti-Biotin-Antikörper gekoppelte Microbeads pro 1 Million Zellen
hinzugefügt, für welche die Inkubationszeit 15 min betrug. Nach zehnminütiger
Zentrifugation bei 300 x g und 4 °C wurden die Zellen in 5 µl MACS-Puffer pro 1
Million Zellen aufgenommen. Alle weiteren Zentrifugationen der Zellsortierung
erfolgten mit gleicher Zentrifugeneinstellung.
Nach dem Prinzip der Negativselektion wurden die unmarkierten CD4+ T-Zielzellen
nach Durchfluss einer vom Magnetfeld des MACS-Separators umgebenen LD-Säule
gewonnen und nach Zählung in 9 µl MACS-Puffer pro 1 Million Zellen aufgenommen.
- 16 Die Auftrennung der CD4+ T-Zellen in CD25+ und CD25- Zellen erfolgte mittels
Zugabe von 1 µl CD25 Microbeads pro 1 Million Zellen, welche die CD25+ Zellen in
15 min Inkubationszeit bei 4 °C markierten. Nach zwei Waschschritten passierten
unmarkierte CD25- Zellen unbeeinträchtigt eine MS-Säule, wohingegen die in der MSSäule verbliebenen CD25+-Zellen nach Entfernung des Magnetfeldes mit Hilfe eines
Stempels in ein 15 ml Reaktionsgefäß gedrückt wurden. Nach Zählung der CD25+- und
der CD25- Zellfraktionen wurden diese in MLPC aufgenommen.
2.2 Zellkultur
Die ex vivo isolierten Zellen wurden 3mal durch zehnminütige Zentrifugation mit 400 x
g bei RT und Resuspension in RPMI + 10% FCS + 1% S/P + 2 mM L-Glutamin
(RPMI+) gewaschen. Für alle Waschschritte in weiteren Experimenten wurde, soweit
nicht anders vermerkt, grundsätzlich diese Zentrifugeneinstellung beibehalten.
Die Kultivierung der Zellen erfolgte in RPMI+ bei 37 °C in einer humiden Atmosphäre
von 5% CO2. Die Zellen wurden in der Regel in Kulturflaschen oder auf
Mikrotiterplatten auf eine Zelldichte von 1 Mio Zellen pro 1 ml RPMI+ eingestellt.
2.2.1
Stimulation mit Anti-CD3/ Anti-CD28
Eine Behandlung von CD4+ T-Zellen mit Anti-CD3/Anti-CD28-Antikörpern führt zu
einer Aktivierung, die sich in einer Steigerung der Proliferation der T-Zellen äußert.
Durchführung
Zur Anti-CD3/ Anti-CD28-Stimulation von T-Zellen wurden diese auf 96-WellMikrotiterplatten kultiviert, die mit anti-CD3/anti-CD28 Dynal T-Cell Expander Beads
(Methode 1) befüllt oder mit Anti-CD3-Antikörpern unter Verwendung löslicher AntiCD28-Antikörper (Methode 2) gecoatet wurden.
Bei Methode 1 wurden jeweils 0,5 µl anti-CD3/anti-CD28 Dynal T-cell Expander Beads
(Anti-CD3/Anti-CD28 Dynal T-cell expander beads, Miltenyi Biotec) in jedes Well
einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben.
- 17 Für die Beschichtung der Mikrotiterplatte mit Anti-CD-3-Antikörper nach Methode 2
wurde die Antikörper-Lösung (Purified Mouse Anti-human CD3 Monoclonal Antibody,
Biosciences BD) 1:100 mit PBS verdünnt, mit je 50 µl pro Well auf eine 96-WellMikrotiterplatte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach 2maligem Waschen
in PBS wurden die Zellen hinzupippetiert und jedes Well mit RPMI+ auf 200 µl
aufgefüllt, woraufhin pro Well 2 µl einer 1:100 Verdünnung von Anti-CD28Antikörpern in PBS hinzugegeben wurden.
2.2.2
2.2.2.1
Induktion und Inhibition der Hämoxygenase-1
Inhibition durch SnPP
Zur Inhibition der Hämoxygenase wurden CD4+CD25+ Zellen auf 6-Well-MikrotiterPlatten in RPMI+ auf die Zelldichte von 2 Million in 1 ml eingestellt und 1:1 mit 1 ml
eines doppeltkonzentrierten SnPP-Induktionsmedium (25 µM SnPP in 1 ml RPMI+)
versetzt. Eine Kontrollgruppe wurde mit der selben Menge an Medium behandelt und
auf das gleiche Endvolumen von 2 ml eingestellt. Da SnPP sehr lichtempfindlich ist,
wurde bei reduzierten Lichtverhältnissen gearbeitet. Nach der Inhibition wurden die
Zellen über Nacht bis zur Kokultivierung kultiviert oder zum Proliferationstest in
Einzelkultivierung an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit der selben Menge an SnPP
oder Medium zur Kontrolle behandelt.
2.2.2.2
Induktion durch PGJ2 und CoPP
Zur Induktion der Hämoxygenase in CD4+CD25- Zellen mit PGJ2 und CoPP wurde jede
Untergruppe auf die Zelldichte 2 Millionen pro 1 ml RPMI+ eingestellt und 1:1 mit 1 ml
eines doppeltkonzentrierten PGJ2- (10 µM in 1 ml RPMI+) bzw. eines CoPPInduktionsmediums (20 µg/ml in 1 ml RPMI+) versetzt. Kontrollgruppen wurden
anstelle des PGJ2 bzw. des CoPP mit dem Lösungsmittel Methylazetat in jeweils
gleicher Konzentration behandelt. Nach der Induktion wurden die Zellen im
Brutschrank kultiviert, um später kokultiviert zu werden. Um herauszufinden, wie lange
die HO-1 Induktion in Responder-Zellen anhält, wurden Zellpopulationen einen Tag,
drei Tage und fünf Tage nach der Induktion geerntet und nach zwei Waschschritten in
PBS möglichst komplett von ihrem Überstand befreit, in Stickstoff eingefroren und
dann bei -80 °C zum Proteinnachweis aufbewahrt.
- 18 -
2.3 Proteinnachweis
Die Methode des Western-Blots ermöglicht es, spezifische Proteine in komplexen
Proteingemischen nachzuweisen. Dafür werden die Proteine nach Proteinpräparation
durch die Gelelektrophorese in einem elektrischen Feld der Größe nach aufgetrennt, im
Verfahren des Western-Blottings auf eine Trägermembran übertragen und gleichzeitig
immobilisiert, um auf dieser mittels spezifischer Antikörper identifiziert werden zu
können. Ein erster Antikörper bindet an das gesuchte Protein, ein Sekundärantikörper,
an den z.B. ein Enzym gebunden ist, detektiert daraufhin den ersten. Die Enzymreaktion
liefert den Proteinnachweis (47).
2.3.1
Proteinpräparation
Zur Proteinpräparation wurden die Zellpellets in einer angemessenen Menge Lysispuffer
aufgenommen.
Rezept
Lysis-Puffer:
137 mM NaCl
0,5% NP 40
2 mM EDTA
50 mM Tris HCl pH 8,0
10% Glycerol
1% (V/V) Proteaseinhibitor
Anschließend wurden die Proben 30 min auf Eis inkubiert und zur Unterstützung des
Lyseprozesses alle 10 min gevortext. Nach einer Minute im Ultraschallbad folgte eine
Zentrifugation für 5 min bei 4 °C. Der Überstand wurde in vorgekühlte Eppendorf-Cups
gegeben, um daraufhin die Proteinmenge zu bestimmen. An diesem Punkt können die
Proteinlysate bei -80 °C zur späteren Weiterverarbeitung eingefroren werden.
2.3.2
Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung wurde nach Bradford (1976) mit Hilfe des Bio-Rad DC Protein
Assay durchgeführt (5). Über eine Bindung der Proteine an das saure Coomassie
Brilliant Blue G-Reagenz kommt es zu einer proportionalen Veränderung des
- 19 Absorptionsmaximums von 465 nm in Richtung 595 nm, je nach Proteingehalt.
Dadurch wird eine optische Farbveränderung sichtbar, deren Entstehung durch die
Stabilisierung der anionischen Form des Farbstoffes durch die hydrophoben und
ionischen Interaktionen der Proteine bedingt ist.
Durchführung
Jeweils 1 µl der lysierten Proben wurde mit 1:5 mit H2O verdünnter Bioradlösung
versetzt, einer Stammlösung bestehend aus dem Coomassie brilliant blue Farbstoff,
Ethanol und Phosphorsäure. Nach 10minütiger Inkubation bei RT erfolgte die
photometrische Messung bei 595 nm in Einmalküvetten gegen eine proteinfreie
Kontrolle mit sonst gleicher Zusammensetzung. Die Proteinkonzentration bemisst sich
nach der Zunahme der Absorption bei 595 nm. In Vorarbeiten mit Standardreihen zeigte
sich, dass sich durch eine Multiplikation des Absorptionswertes mit 20 die
Proteinkonzentration in µg/µl mit 90%iger Genauigkeit berechnen lässt. Nach
Ermittlung des Proteingehalts wurden alle Proben auf die gleiche Proteinkonzentration
pro 15 µl eingestellt. Höher konzentrierte Proben wurden mit Lysis-Puffer verdünnt, um
die gewünschte Proteinkonzentration zu erreichen. Nach Zugabe von 2,5 µl 6-fachem
Lämmli-Puffer (Rezept siehe 2.3.3) pro Probe wurden die Proben durch 5minütiges
Erhitzen auf 95 °C denaturiert.
2.3.3
Gelektrophorese
Die Proteine können über SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese ihrer relativen
Molekülmasse nach aufgetrennt werden (59). SDS (Natriumdodecylsulfat) ist ein
Detergens, das sich an Proteine anlagert, diese denaturiert und Komplexe mit
konstantem Ladungs- zu Massenverhältnis bildet. Die Laufgeschwindigkeit der Proteine
im Gel vom Minus- zum Pluspol ist nun nur noch von ihrer relativen Molekülmasse
abhängig.
Die Wahl der Acrylamidkonzentration und somit der Porengröße des Trenngels richtet
sich nach der Masse des gesuchten Proteins.
- 20 Rezepte
Trenngel (10%):
H2O
4*Trennpuffer
AA/BAA
APS
TEMED
6- fach Lämmli-Auftragspuffer:
12 % SDS
60 % Glycerol
600 mM DTT
60 mM Tris pH 6,8
0,06 % Bromphenolblau
in Bi-dest H2O
Sammelgel (4%) :
H2O
4*Trennpuffer
AA/BAA
APS
TEMED
2,625 ml
1,05 ml
0.56 ml
27,5 µl
8,75 µl
10x Laufpuffer:
250 mM Tris- Base
1,92 M Glycin
1,0% SDS
ad 2000 ml USF
60,5 g
288,0 g
20,0 g
1,88 ml
1,13 ml
1,50 ml
27,5 µl
6.25 µl
Durchführung
Für die Herstellung eines 10 cm breiten Gels wurde ein 10%iges Trenngel in die 13cm
breite Kammer des Bio-Rad Mini-Protean® 3 Systems gegossen. Alle weiteren
Angaben beziehen sich auf dieses System.
Zum Glätten der Oberfläche wurde das Trenngel hierauf mit 0,5 cm Isopropanol
überschichtet und nach einstündiger Polymerisation abgegossen. Die Kammer wurde
mit dem Sammelgel angefüllt, in welches ein Kamm zur Bildung von Geltaschen
eingesetzt wurde. Nach einer halben Stunde konnte der Kamm entfernt, das Gel in die
mit Laufpuffer angefüllte Elektrophoreseeinheit eingebaut und die Taschen mit je 17 µl
der Probenansätze befüllt werden. In einer Tasche wurde ein Proteingrößenstandard als
Kontrolle der Bandentrennung mitgeführt (Precision Plus Protein, Kaleidoscope). In
Relation zu diesem Größenstandard konnte später die Molekularmassenbestimmung der
gesuchten Proteine erfolgen. Mittels eines Spannungsgerätes wurde eine Spannung von
95 V an die mit Laufpuffer befüllte Gelelektrophoresekammer angelegt. Die
- 21 Stromstärke wurde während der Wanderung der Banden von 10 mA im Sammelgel auf
20mA für die Auftrennung erhöht.
2.3.4
Western-Blotting und immunologischer Proteinnachweis
Durch senkrecht zum Gel angelegte elektrische Spannung wurden die elektophoretisch
aufgetrennten Proteine mit dem Western-Blot-Verfahren auf eine NitrocelluloseTransfermembran übertragen und über hydrophobe Wechselwirkungen gebunden, bevor
sie immunochemisch durch Antikörper nachgewiesen werden konnten. Dazu wurde das
Semi-dry Blot-System verwendet.
Rezepte
Transferpuffer:
10 x TBST
Methanol
H2O
Waschpuffer:
PBS mit 0,05% Tween
Milchpulverlösung:
Milchpulver
10 x TBS-T
10 ml
10 mg
10 x TBS-T:
1 M Tris Base
1,5 M NaCl
Tween 20
ad pH 7,5 mit 32% HCl
Bi-dest H2O
243,3 g
175,3 g
20 ml
>100 ml
ad 2 Liter
ECL: Lösung A:
Luminol
0,1 M Tris/HCL pH 8,6
(bei 4 °C lagern)
50 mg
Para- Hydroxy- Coumarinsäure
DMSO
(Lagerung bei RT)
11 mg
10 ml
Lösung B:
50 ml
100 ml
350 ml
Durchführung
Das Gel wurde auf die Nitrocellulosemembran und zwischen zwei mit Transferpuffer
getränkte Whatman-Papers gelegt und dann bei einer Stromstärke von 0,2 A für 10 min
geblottet. Daraufhin wurde die Nitrocellulosemembran in Waschpuffer gewaschen und
- 22 1h in einer 5% Milchpulverlösung bei RT auf einem Schüttler geblockt, um
unspezifische Bindungsstellen auf der Membran abzusättigen. Wenn erst am nächsten
Tag weitergearbeitet wurde, konnte der Block-Vorgang in einem 50 ml Reaktionsgefäß
auf einem Rollschüttler bei 4 °C über Nacht ausgedehnt werden. Der spezifische
Primär-Antikörper zur Proteindetektion wurde in Verdünnung mit Milchpulverlösung
auf die Nitrocellulosemembran gegeben und für 2 h bei RT auf einem Rollschüttler
inkubiert (Tab.1). Alternativ wurde auch diese Inkubation bei 4 °C über Nacht
durchgeführt. Eine Markierung von GAPDH diente zur Kontrolle der äquivalenten
Proteinmengen und zur inneren Standardisierung.
Antikörper
Antigen
Herkunft
Verdünnung
Lagerung
Anti-human FoxP3
Clone: PCH101
FoxP3
Ratte (IgG 2a)
1:500
4 °C
Anti- HO-1 Polyclonal
Antibody, SPA-896
HO-1
Kaninchen
1:1000
-20 °C
GAPDH (V-18): sc20357
GAPDH
Ziege
1:500
4 °C
Tab. 1: Primärantikörper
Zur Lösung nicht gebundener Antikörper von der Membran wurde diese 3mal jeweils
5min auf dem Schüttler in Waschpuffer gewaschen. Dann wurde der enzymgekoppelte
Sekundärantikörper mit Milchpulverlösung verdünnt und auf die Membran gegeben.
Antikörper
Antigen
Herkunft
Verdünnung
Lagerung
Mouse Anti-Rat IgG
Ratte IgG
Maus
1:1000
-20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG
Kaninchen IgG
Ziege
1:5000
-20 °C
Rabbit Anti-Goat IgG
Ziege IgG
Kaninchen
1:5000
4 °C
Tab. 2: Sekundärantikörper
Nach einstündiger Inkubation auf dem Schüttler und drei Waschschritten konnte die an
den Zweitantikörper gebundene Peroxidase, deren katalysierte Reaktion dem
Proteinnachweis dienen soll, mit einem Substrat versetzt werden. Dafür wurde die
Membran mit ECL, einer Mischung aus 3ml Lumineszenz-Lösung A, 30 µl Lösung B
und 0,9 µl 30 % H2O2, eine Minute lang benetzt, getrocknet und in eine lichtdichte
Filmkassette gelegt. Die katalytische Aktivität der an den Zweitantikörper gekoppelten
- 23 Peroxidase überführte das Luminol in seine oxidierte, leuchtende Form. Die dadurch
entstandenen Banden wurden durch Auflegen eines photosensitiven Films für 1-10 min
in der Dunkelkammer detektiert.
Strippen
Die Nitrocellulosemembran kann mehrmals hintereinander mit verschiedenen
Antikörpern inkubiert werden. Beim Strippen kann durch Entfernung gebundener
Antikörper von der Membran und erneutes Blocken eine bereits entwickelte Membran
für
eine
weitere
Antiköperreaktion
wiederverwendet
werden.
Die
Nitrocellulosemembran wurde zur Entfernung von Antikörpern mit Strip-Puffer 30min
bei 55 °C inkubiert und mehrmals gewaschen; daraufhin konnte sie geblockt und für
weitere Proteindetektionen verwendet werden.
Rezept
48 mmol/l Tris-HCl
Strip-Puffer:
2% SDS
1% β-Mercaptoethanol
2.4 Messung der Zellproliferation und -suppression
2.4.1
CFSE-Markierung
Eine Methode zur Messung der Zellproliferation ist die Zellmarkierung mit CFSE. Das
hydrophobe 5-, 6-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester (CFDA-SE) kann die
lymphozytäre Zellmembran passiv durchdringen und wird im Zellinneren nach
irreversibler Bindung an Proteine durch Abspaltung von zwei Acetatresten durch
Esterasen
zum
polaren
grün-fluoreszierenden
CFSE
(Carboxyfluorescein-
Succinimidylester), das nicht mehr aus der Zelle diffundieren kann. Die mit CFSE
markierten Proteine werden zu gleichen Teilen an ihre Tochterzellen weitergegeben, so
dass die Fluoreszenzintensität einer Zelle auf die Anzahl der Zellteilungen schließen
lässt. Die Fluoreszensmessung kann mittels Durchflusszytometrie erfolgen.
- 24 -
Durchführung
Einen Tag nach der Zellseparation wurden die zu färbenden T-Zellen aus dem
Brutschrank von ihrer 6-Well-Mikrotiterplatte in ein Reaktionsgefäß 1 pipettiert. Nach
Zählung der Zellen wurden diese gewaschen und in raumtemperiertes PBS
aufgenommen (2mal 107 Zellen pro ml PBS).
Die Zellmarkierung erfolgte mit dem Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit.
Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit (Molecular Probes® Invitrogen detection
technologies)
o DMSO
o 5(6)-CFDA SE
o PBS
Zur Herstellung der Färbelösung (Vial B) mit Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit
wurden bei reduzierten Lichtverhältnissen zu 500 nl 5(6)-CFDA SE 90 µl
raumtemperiertes DSMO und 90 µl PBS gegeben. Vial B wurde nun im Verhältnis
1:1000 im Reaktionsgefäß 2 mit raumtemperiertem PBS gemischt und gevortext,
woraufhin dem Reaktionsgefäß 1 das gleiche Volumen aus Reaktionsgefäß 2
hinzugefügt und eine Einwirkungszeit von 7 min abgewartet wurde. Eine 2:1
Verdünnung mit FCS für 1 min führte einen Markierungsstopp herbei. Nach Auffüllen
mit eisgekühltem PBS wurden die markierten Zellen gewaschen, in RPMI+
aufgenommen und gezählt.
2.4.2
PKH26
PKH26-Markierung
ist
ein
stabiler
in
die
Zellmembran
integrierender,
aliphatischer
Fluoreszensfarbstoff, der bei jeder Zellteilung gleichermaßen an die Tochterzellen
weitergegeben wird, was zu einer Fluoreszenzausdünnung führt. Somit kann anhand der
Fluoreszenzintensität der mit dem rot-fluoreszierenden PKH26 markierten Zellen die
Proliferation der Zellen mit dem Durchflusszytometer bestimmt werden.
- 25 Durchführung
Die PKH26-Färbung wurde mit dem PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit der Firma
Sigma® durchgeführt.
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma®)
o PKH26 dye stock
o Diluent C
Nach Zählung und Waschen der Zellen wurden diese in Diluent C aufgenommen (50 µl
pro eine Million Zellen). Bei reduzierten Lichtverhältnissen wurde die Färbelösung mit
einer 1:250 Verdünnung von PKH26 und Diluent C angefertigt und 1:1 mit der
Zellsuspension verdünnt. Nach 5min Einwirkzeit wurde für 1 min FCS hinzugegeben,
um den freien Farbstoff abzufangen. Nach Aufnahme in RPMI+ wurden die Zellen
gewaschen und anschließend gezählt.
2.4.3
Kokultivierung der Zellen
Die gefärbten Zellen wurden auf ein Volumen von eine Million Zellen pro 1 ml
eingestellt und in unterschiedlichen Kombinationen zur Proliferationsmessung
kokultiviert. Die Kokultiverung der Zellen wurde in 48-Well-Mikrotiterplatten
durchgeführt. Von jeder Zellgruppe wurde jeweils eine Zellmenge von 100 000 Zellen
in 100 µl pipettiert, so dass sich in den kokultivierten Zellpopulationen eine Zellstärke
von 200 000 Zellen und ein Volumen von 200 µl ergaben. Bei Einzelbetrachtung einer
Zellart wurde das Volumen von 200 µl mit 100 µl RPMI+ erreicht. In jedes Well wurden
als T-Zell-Proliferationsstimulus 0,5 µl anti-CD3/anti-CD28 Dynal T-cell expander
beads vorgelegt. Die Ansätze wurden zur Analyse im Durchflusszytometer jeweils
dreifach hergestellt. Die Zellen wurden für 3-5 Tage kokultiviert.
2.4.4
Durchflusszytometrie
Beim Fluorescent Acitivated Cell Sorting (FACS) werden Zellen in der partikelfreien,
schnell fließenden Trägerflüssigkeit des Durchflusszytometers in einem dünnen
Flüssigkeitsstrahl hintereinander aufgereiht und durch einen scharf gebündelten
Laserstrahl geleitet. Beim Durchtritt durch den Laserstrahl werden Lichtstreuung und
- 26 laserangeregte Fluoreszenz jeder einzelnen Zelle gemessen. Das Vorwärtsstreulicht
(forward scatter, FSC) gibt Informationen über die Größe, das Seitwärtsstreulicht (side
scatter, SSC) über die Komplexität und die Granularität einer Zelle.
Die Fluoreszenzfarbstoffe PKH26 und CFSE, mit denen die Zellen vorher markiert
wurden, absorbieren Licht einer spezifischen Wellenlänge und emittieren Licht einer
höheren Wellenlänge. Im Photomultiplier wird das emittierte Licht in elektrische
Signale umgewandelt, die Auskunft über die Fluoreszenzintensität der Zellen geben. Da
sich die Absorptions-Wellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden, wurde
versucht,
kokultivierte
PKH-
und
CFSE-markierte
Zellen
gleichzeitig
im
Durchflusszytometer zu betrachten. Anhand der spezifischen Fluoreszenzreduktion bei
jeder Zellteilung wurde ein Rückschluss auf ihre Proliferationsrate zugelassen.
Durchführung
Die kokultivierten Zellen wurden in 500-800 µl Facs-Puffer (PBS mit 1% BSA, 0.1%
Natriumazid) in FACS-Probenröhrchen aufgenommen. Das FACS-Gerät (FACScan
Flow Cytometer) wurde dreimal mit Trägerflüssigkeit (FACS-Flow) durchgespült und
anschließend die Proben in einem laminaren Flusss in das Durchflusszytometer
eingelesen. Die Daten wurden vom FACScan Flow Cytometer mittels der CellQuestSoftware (BD Pharmigen, Heidelberg) und der WinMDO 2.8 Software (J. Trotter,
Scripps Research Institute,, La Jolla, Kalifornien) ausgewertet und analysiert. Zur
quantitativen Bestimmung der Zellproliferation wurde ein Proliferativer Index (PI)
berechnet, welcher eine mathematische Annäherung an die mittlere Anzahl an
Zellteilungen der gesamten Responder-Zellen ab dem Zeitpunkt der Zellmarkierung
darstellt.
Mit folgendem Algorithmus wurde der PI berechnet:
PI = Log[FInd/MFIall]/Log[2]
MFIall= mittlere Fluoreszenzintensität aller Responder-Zellen
FInd= Peak-Fluoreszenz der sich nicht teilenden Zellen
2.4.5
IL-2-Nachweis durch ELISA
Der ELISA basiert auf der Bestimmung einer Antigenkonzentration mit Hilfe eines
Enzyms als Marker. Für den Nachweis eines Antigens durch den sogenannten
- 27 Sandwich-ELISA sind zwei für das Antigen spezifische Antikörper nötig. Der erste
Antikörper ist an den Boden einer Mikrotitterplatte gebunden und fängt den gesuchten
Stoff ab. An einen zweiten löslichen Antikörper, der den gleichen Stoff als Antigen
erkennt, ist ein Enyzm gebunden, dessen katalysierte Reaktion von einem Farbumschlag
begleitet wird. Anhand der Intensität der Farbreaktion im Vergleich zu einer
Referenzkurve kann auf die Konzentration des nachzuweisenden Stoffes geschlossen
werden.
Durchführung
Für die Durchführung wurde das Human IL-2 ELISA Set und das BD OptEIATM
Reagent Set B von BD Biosciences verwendet.
Human IL- 2 ELISA Set (BD Biosciences)
o Capture-Antikörper (monoklonaler Antikörper gegen humanes IL-2)
o Detection-Antikörper (mit Biotin markierter monoklonaler Antikörper gegen
humanes IL-2)
o Enzymreagenz ( Avidin-horseradish Peroxidase- Konjugat)
o Standards (Rekombinantes humanes IL-2)
BD OptEIATM Reagent Set B (BD Biosciences)
o Coating-Puffer (Auftragspuffer: 0.1 M Natriumkarbonat, pH 9,5, 8,4 g NaHCO3,
3,56 g Na2CO3, )
o Assay Diluent (PBS mit 10% FBS, pH 7,0)
o Wasch-Puffer (PBS mit 0,05% Tween-20)
o Substratlösung (Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid)
o Stop-Lösung (1 M H3PO4 oder 2 N H2SO4)
Jeweils 100 µl monoklonale IL-2-Antikörper (Capture-Antibody) wurden 1:250 mit
Coating-Puffer verdünnt. Bei 4 °C konnten die Capture-Antikörper über Nacht mittels
hydrophober Wechselwirkungen an den Grund eines jeden Wells einer PolystyrolMikrotiter-Platte im 96-Well-Format binden. Nach drei Waschschritten mit jeweils
300
µl
Waschpuffer
wurden
unspezifische
Proteinbindungsstellen
auf
der
Mikrotiterplatte mit 200µl Assay Diluent pro Well 1h bei RT abgeblockt. Darauf folgten
wiederum drei Waschschritte.
- 28 Auf einer weiteren 96-Well-Platte wurden die Zytokinüberstände der kokultivierten
Proben jeweils in unterschiedlichen Verhältnissen mit Assay Diluent verdünnt, um hohe
oder niedrige IL-2-Konzentrationen der Proben optimal darstellen zu können.
Zur Standardherstellung wurden in einem Reaktionsgefäß 10 µl Standard für
rekombinantes IL-2 mit 1,99 µl Assay Diluent gegeben und daraufhin in sieben
Eppendorf-Cups
eine
Standardreihe
verschiedener
IL-2-Konzentrationen
durch
absteigende 2:1 Verdünnung mit einem Endvolumen von je 300 µl hergestellt. Im
siebten Eppendorf-Cup befanden sich nur 300 µl Assay Diluent.
Je 100 µl der Proben, deren IL-2-Konzentration bestimmt werden sollte, sowie je 100 µl
der sieben Standards als Vergleich wurden auf die mit IL-2-Capture-Antikörper
vorbehandelte Mikrotiter-Platte gegeben. Es wurde eine Inkubationszeit von 1h bei RT
zur Bindung von IL-2 abgewartet, der fünf Waschschritte folgten. Der DetectionAntikörper, das Enzymreagenz und der Coating-Puffer wurden im Verhältnis 1:1:250
angemischt und je 100 µl dieser Lösung auf jedes Well gegeben. In sieben
Waschschritten wurden nicht gebundene Detection-Antikörper entfernt. Aus einer 1:1
Mischung von Tetramethylbenzidin und H2O2 wurde die Substratlösung hergestellt und
jedes Well mit je 100 µl befüllt, worauf sich langsam eine blaue Färbung einstellte. Die
Reaktion wurde nach 15min mit einer Stopp-Lösung gestoppt, bevor Standard 1 die
maximale Farbintensität erreichte. Daraufhin wurde im Photometer anhand der
Absorption bei 450 nm auf die IL-2-Konzentration geschlossen.
2.4.6
[3H]-Thymidin-Labeling
Mit radioaktivem Tritium [3H] markiertes Thymidin wird kompetitiv zur Pyrimdinbase
Thymidin in der S-Phase des Zellzyklus in die DNA eingebaut und stellt damit eine
Nachweismethode für DNA-Synthese und damit indirekt für Zellproliferation in vitro
dar. Durch Szinitillationsmessung lässt sich das eingebaute radioaktiv markierte
Thymidin quantitativ erfassen.
Durchführung
Jeweils 5 µCi Methyl-[3H]-Thymidin pro Vertiefung wurden zur Anti-CD3/Anti-CD28
aktivierten (Methode 2, siehe 2.2.1) Zellsuspension gegeben. Nach einer Inkubationszeit
von 18 h wurden die 96-well-Mikrotiterplatte mit den Zellen mit einem ICH-110
- 29 Erntegerät auf Glasfaserfilter (Printed Flitermat A) übertragen, getrocknet und in Wachs
(MeltiLex® A) eingebettet, das Szintillationsflüssigkeit enthielt. Die Einmessung
erfolgte mittels eines 1450 Mikroplattenzählers. Aus den jeweiligen Triplikaten wurden
die Mittelwerte sowie die einfache Standardabweichung der Radioaktivitäten in „counts
per minute“ (cpm) ermittelt, wodurch eine graphische Darstellung in Abhängigkeit zur
eingesetzten Antigenkonzentration möglich war.
2.5 Datenerfassung und -verarbeitung
Die Auswertung der experimentell erhobenen Daten erfolgte unter Zuhilfenahme des
Statistikprogrammes GraphPad InStat® der Firma GraphPad Software (San Diego,
Kalifornien, USA).
Alle Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts (mean ±
SEM) angegeben. Zur Berechnung der statistischen Signifikanz wurden die Daten
mittels des Student-T-Tests analysiert. Unterschiede in den Mittelwerten wurden als
statistisch signifikant bewertet, wenn p
0.05 war. Für die graphische Darstellung der
Ergebnisse wurde das Programm GraphPad Prism 4 der Firma GraphPad Software (San
Diego, Kalifornien, USA) verwendet.
- 30 -
3 Ergebnisse
______________________________________________________________________
3.1 Bestätigung von HO-1-Expression und -Induktion
3.1.1
HO-1-Expression in Tregs und stimulierten Responder-Zellen
Die Isolierung der humanen CD4+CD25+ T-Zellen und CD4+CD25- T-Zellen wurde mit
der Methode der magnetischen Zellsortierung (MACS) durchgeführt. Daraufhin wurden
die Zellen für weitere Untersuchungen in Untergruppen aufgeteilt. Zur Überprüfung der
HO-1-Expression im Western-Blot wurde eine Untergruppe der CD4+CD25- ResponderT-Zellen mit anti-CD3/anti-CD28 Beads stimuliert. Zudem wurden unbehandelte Tregs
und unbehandelte Responder-Zellen auf ihre Hämoxygenase-Expression untersucht. Im
Ergebnis zeigte sich sowohl eine konstitutive HO-1-Expression in Tregs als auch in den
stimulierten Responder-Zellen. Unbehandelte Responder- Zellen zeigten keine HO-1Expression (Abb. 4).
Abb. 4: Western-Blot-Analyse zum Nachweis von HO-1-Expression: Lysate aufgereinigter
CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen sowie unbehandelter und mit anti-CD3/anti-CD28
stimulierter Responder-Zellen wurden im Western-Blot im Bezug auf konstitutive HO-1Expression analysiert. Tregs zeigten eine konstitutive HO-1-Expression; eine HO-1-Induktion
konnte auch in stimulierten CD4+CD25- T-Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu
ließ sich in unbehandelten Responder-Zellen keine HO-1-Expression feststellen, nicht einmal,
wenn wesentlich höhere Lysatmengen auf das Gel geladen wurden (erkennbar an der GAPDHKontrolle).
- 31 Dieser Versuch, welcher Ergebnisse von Pae et al. aus Western Blot, RT-PCR und
FACS-Analyse bestätigte (44), war der Grundstein für die weiteren auf dieser
Erkenntnis aufbauenden Versuche.
3.1.2
HO-1-Induktion in Responder-Zellen durch CoPP und PGJ2
Im Western-Blot wurde darüberhinaus auch die Wirksamkeit einer HO-1-Induktion
durch PGJ2 und CoPP untersucht. Vor allem sollte dabei gezeigt werden, über wie viele
Tage die HO-1-Induktion in vitro anhält, als Voraussetzung für günstige experimentelle
Bedingungen bei späteren Suppressionsversuchen in Kokultivierung. Denn sind
induzierte und nicht-induzierte Zellen einmal kokultiviert, wäre eine Nachinduktion
einer Zellpopulation alleine nicht mehr möglich. Somit wurden Responder-Zellen in
Gegenwart der HO-1-Induktoren PGJ2 oder CoPP kultiviert, um festzustellen, ob die
HO-1 über mehrere Tage eines Suppressionsversuches hinweg pharmakologisch in
CD4+CD25- T-Zellen induziert bleibt. Für eine entsprechende Kontrollgruppe wurde das
Lösungsmittel Methylacetat in vergleichbarer Konzentration verwendet. Nach 1, 3 oder
5 Tagen Kultivierung wurden die Zellen geerntet, gewaschen und eingefroren, um die
Effektivität der HO-1-Induktion zu diesen Zeitpunkten zu überprüfen. Um die HO-1Expression der Zellen zu untersuchen, wurden sie nach dem Auftauen lysiert und die
Proteine im Gelelektrophoreseverfahren aufgetrennt, woraufhin die HO-1 über
Antikörper nachgewiesen wurde. In den mit PGJ2 behandelten Zellen konnte sowohl in
den am 1.Tag als auch in den am 3. und 5. weggefrorenen CD4+CD25- T-Zellen eine
HO-1-Expression gezeigt werden, d.h. eine HO-1-Induktion mittels PGJ2 ist mindestens
5 Experimenttage hindurch wirksam (Abb. 5).
Bei Analyse der HO-1-Experssion mit CoPP konnte im Gegensatz dazu nur in den am 1.
Tag weggefrorenen CD4+CD25- T-Zellen HO-1 nachgewiesen werden. In den über 3
oder 5 Tage kultivierten Responder-T-Zellen, die einmalig mit CoPP behandelt worden
waren, konnte keine HO-1-Induktion mehr gezeigt werden (ohne Abbildung). Eine
Induktion
der
HO-1
mit
CoPP
wurde
somit
für
Kokultivierungsversuche
ausgeschlossen.
In weiteren Versuchen wurde gezeigt, dass eine dreimalige Induktion der Zellen an den
Tagen 0, 1 und 3 mit PGJ2 oder CoPP keinen verstärkenden Effekt auf die HO-1-
- 32 Expression nach sich zieht und damit keinen Vorteil gegenüber der einmaligen
Induktion darstellen würde (ohne Abbildung).
3.1.3
HO-1-Induktion führt nicht zu einer FoxP3-Expression
Vorhergegangene
Forschungsergebnisse
zeigten,
dass
Tregs
konstitutiv
FoxP3
exprimieren und dass eine FoxP3-Transfektion in Jurkat-T-Zellen eine HO-1Expression induziert. Zudem wurde die Vermutung aufgestellt, dass HO-1 eine Rolle
für die regulatorischen Fähigkeiten von CD4+CD25+ T-Zellen spielt. Deswegen sollte
nun gezeigt werden, ob im Gegenzug eine HO-1-Induktion in CD4+CD25- T-Zellen eine
FoxP3-Expression induzieren kann. Somit wurde in den Zellen nach Western-Blot
Analyse der HO-1 nun auch die FoxP3-Expression untersucht. Allerdings konnte nur in
Tregs eine FoxP3-Expression gezeigt werden, wohingegen in den bewiesenermaßen HO1-induzierten CD4+CD25- T-Zellen sowie in den kontrollbehandelten CD4+CD25- TZellen keine FoxP3-Expression nachgewiesen werden konnte. Eine HO-1-Induktion
führt somit nicht zu einer FoxP3-Expression (Abb. 5).
Abb. 5: Western-Blot-Analyse zum Nachweis induzierbarer HO-1-Expression:
Eine einmalige Behandlung von CD4+CD25- T-Zellen mit PGJ2 am Tag 0 induzierte
eine HO-1-Expression, die 5 Tage andauerte. Die HO-1-Expression ging jedoch nicht
mit einer Induktion von FoxP3 einher. Tregs dienten als positive Kontrolle für FoxP3. Im
Vergleich zu den anderen Lysaten wurde eine geringere Proteinmenge verwendet, was
zu einer schwächeren HO-1-Bande bei den Tregs führte.
- 33 -
3.2 Analyse der Suppression im FACS durch unterschiedliche
Fluoreszenzfarbstoffe
Die meisten gängigen Methoden zur Analyse von Zellproliferation stoßen dann an ihre
Grenzen, wenn nicht die Proliferation einer einzelnen Zellgruppe, sondern die von
kokultivierten Zellpopulationen bestimmt werden soll. Somit musste ein Weg gefunden
werden, die Proliferation supprimierender und supprimierter Zellen gleichzeitig
darstellen zu können, um auf die Effektivität der Suppression schließen zu können.
Zur Quantifizierung der T-Zellproliferation wurde eine durchflusszytometrische
Messung durchgeführt, bei der die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert
wurden, der bei jeder Zellteilung gleichmäßig an jede Tochterzelle weitergegeben wird.
So konnte nach der Markierung einer Zellpopulation mit dem Fluoreszenzfarbstoff
CFSE (grün) oder PKH26 (rot) von der Ausdünnung der Fluoreszenz bei jeder
Zellteilung auf die Proliferationsrate geschlossen werden.
Fluoreszenzmarkierte Zellen geben jedoch unter Kultivierung Fluoreszenzfarbstoff an
ihr Medium ab, ein Vorgang, der als “Bleeding” (Ausbluten) bezeichnet wird. Bei
Kokultivierung einer fluoreszenzgefärbten Zellpopulation mit einer ungefärbten
Zellpopulation führt der Farbstoff im Medium zu einer signifikanten Markierung der
unmarkierten Zellen. Eine einzelne Analyse der Proliferation markierter ResponderZellen wäre somit unmöglich. Die Fluoreszenz unabsichtlich markierter regulatorischer
Zellen würde die Fluorenz der supprimierten Zellen überlappen, insbesondere solcher,
deren Fluoreszenz durch mehrfache Teilungszyklen reduziert wurde.
Um dieses Problem zu umgehen, wurden grundsätzlich sowohl die regulatorischen (mit
PKH26)
als
auch
Responderzellen
(mit
CFSE)
markiert,
wodurch
beide
Zellpopulationen mit ihrem Fluoreszenzfarbstoff abgesättigt waren. Durch die
unterschiedlichen Absorptions-Wellenlängen der beiden Fluoreszenzfarbstoffe bei der
durchflusszytometrischen Messung wurde eine Diskrimination zwischen beiden
Zellpopulationen möglich (Abb. 6).
- 34 -
Abb. 6: CFSE- und PKH26-Markierung zur parallelen Analyse der Zellproliferation
zweier kokultivierter Zellpopulationen: CD4+CD25- Responder-Zellen und CD4+CD25+
regulatorische T-Zellen wurden entweder mit CFSE oder mit PKH26 markiert und daraufhin in
Anwesenheit von stimulierenden anti-CD3/anti-CD28 Beads vier Tage kokultiviert. Diese
Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden sich in ihren Emissionsspektren und binden an
intrazelluläre Proteine oder Zellmembranen. Bei der Mitose markierter Zellen werden CFSE
und PKH26 gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt. Die Reduktion der
Fluoreszenzintensität, die mit jeder Teilung einhergeht, ermöglicht es, in der FACS-Analyse die
Proliferationsrate beider Zellpopulationen parallel zu quantifizieren. Mit unterschiedlicher
Fluoreszenzmarkierung lassen sich die beiden Zellpopulationen deutlich identifizieren.
Verzerrungen der Messung durch Ausbluten des Farbstoffes ins Medium mit darauf folgender
Sekundärmarkierung der entsprechenden anderen Zellpopulation wurden somit umgangen.
Zum Nachweis einer Zellproliferation und einer potentiellen Suppression dieser
Proliferation mussten die kokultivierten Zellen vor durchflusszytometrischer Messung
stimuliert werden.
In Vorversuchen mit unterschiedlichen Proliferationsstimuli (ohne Abbildung), konnte
gezeigt werden, dass anti-CD3/anti-C28 T-cell Expander Beads gut geeignet sind, um
durch Aktivierung humaner CD4+ Zellen eine Proliferation zu induzieren, die sich
durchflusszytometrisch nachweisen lässt. Somit wurden diese Beads für alle weiteren
durchflusszytometrischen Experimente verwendet.
- 35 -
3.3 Einfluss der HO-1-Induktion auf die Proliferation von
CD4+CD25- T-Zellen
Um den direkten Einfluss einer HO-1-Induktion auf die Proliferation der T-Zellen
selbst zu messen, wurde die Proliferation HO-1 induzierter CD4+CD25- T-Zellen im
Vergleich zu einer kontrollbehandelten Gruppe CD4+CD25- T-Zellen gemessen. Die
CD4+CD25- T-Zellen wurden mit PGJ2 behandelt, mit CFSE markiert und mit antiCD3/ anti-C28 T-cell expander beads zur Proliferation angeregt. Nach drei Tagen
Kultivierung wurde die Proliferation der Zellen durchflusszytometrisch gemessen. Es
zeigte sich eine ausgeprägte Verminderung der T-Zell-Proliferation nach HO-1Induktion durch PGJ2 im Vergleich zu den uninduzierten, kontrollbehandelten T-Zellen.
Dieses Ergebnis wurde aus der durchflusszytometrisch gemessenen CFSE-FluoreszenzReduktion bei Zellteilung erhoben (Abb. 7A) sowie durch die Berechnung des
proliferativen Index aus den FACS-Daten, der signifikant vermindert war (Abb. 7B) .
- 36 -
Abb. 7: Durchflusszytometrische Analyse der Zellproliferation nach HO-1-Induktion
durch PGJ2 in Responder-Zellen: CD4+CD25- T-Zellen wurden entweder mit PGJ2 oder
einem gleichen Volumen des Lösungsmittels Methylacetat als Kontrolle behandelt, um
daraufhin mit CFSE markiert zu werden. An die Kultivierung in Anwesenheit von antiCD3/anti-CD28 Beads schloss sich eine durchflusszytometrische Messung der anhand der Art
ihrer Lichtstreuung identifizierten lebenden Lymphozyten an, die eine ausgeprägte
Proliferationshemmung bei den PGJ2 behandelten Zellen erkennen ließ, was sich in einer
größeren Fraktion ungeteilter Zellen zeigte (A). Dieser Effekt wurde quantitativ durch die
Berechnung des proliferativen Index (PI) als eine mathematische Annäherung an den Median
der Anzahl der Zellteilungen in einer gegebenen Zellpopulation erfasst (B).
- 37 -
3.4 Einfluss der HO-1-Inhibition auf die Proliferation von
Tregs
Auf Grund des Ergebnisses des vorgehenden Experiments, in dem eine HO-1-Induktion
eine Proliferationsminderung hervorrief, stellte sich die Frage, ob im Gegenzug eine
Hemmung der HO-1-Aktivität von Tregs, die bewiesenermaßen HO-1 konstitutiv
exprimieren, mit Zinn-Protoporphyrin (SnPP) deren Proliferation steigern würde.
Um diese Frage zu beantworten, wurden aufgereinigte CD4+CD25+ T-Zellen mit
Fluoreszenzfarbstoff markiert und drei Tage in Anwesenheit von anti-CD3/ anti-CD28
Beads kultiviert, wobei eine Gruppe über drei Tage täglich mit dem HO-1-Inhibitor
SnPP behandelt wurde und eine Gruppe als Kontrolle unbehandelt blieb. Tatsächlich
führte die tägliche SnPP-Behandlung zu einer signifikant erhöhten Proliferation der
CD4+CD25+ T-Zellen, die im Durchflusszytometer gemessen wurde (Abb. 8).
Abb. 8: Durchflusszytometrische Analyse der Zellproliferation nach HO-1-Inhibition
durch SnPP in Tregs: Tregs, deren HO-1 mit einer täglichen SnPP-Applikation über drei
Versuchstage inhibiert wurde, zeigten eine signifikant erhöhte Proliferation, was sich bei einer
durchflusszytometrischen Messung im prozentualen Anteil der sich teilenden Zellen
widerspiegelte (die Graphik stellt Mittelwerte ± SEM dar; n=3; *, p < 0,05).
- 38 -
3.5 HO-1-Induktion ist nicht ausreichend zur Induktion
regulatorischer Fähigkeiten
Um zu untersuchen, ob durch eine HO-1-Induktion in CD4+CD25- T-Zellen gleichzeitig
regulatorische Fähigkeiten induziert werden, wurden diese mit PGJ2 vorbehandelt, mit
PKH26 markiert, gewaschen und zusammen mit CFSE-markierten Responder-Zellen in
der Anwesenheit von anti-CD3/ anti-C28 T-cell Expander Beads kultiviert. Zum
Vergleich wurden PKH26 markierte Tregs, deren immunsuppressive Wirkung bekannt
ist, ebenfalls mit CFSE-markierten Responder-Zellen kokultiviert. Während die Tregs in
der Lage waren, äußerst effizient die aktivierungsinduzierte Proliferation der
Responder-Zellen zu supprimieren, konnte durchflusszytometrisch keine Inhibition der
Proliferation der Responder-Zellen durch HO-1-induzierte CD4+CD25- T-Zellen
festgestellt werden. Zudem wurde zur Überprüfung der Effektivität der Suppression die
IL-2-Konzentration im Kulturmedium der Zellen gemessen. Nach Aktivierung
sezernieren T-Zellen IL-2 und bilden den IL-2-Rezeptor aus, woraufhin sie sich selbst
über IL-2 zur Proliferation stimulieren. Tregs sind in der Lage, diese IL-2-Produktion
aktivierter Responder-Zellen zu supprimieren. Wie sich im ELISA zeigte, sind
CD4+CD25- T-Zellen hingegen nach PGJ2-Behandlung nicht in der Lage, die IL-2Produktion zu inhibieren.
Somit konnte durch die HO-1-Induktion in CD4+CD25- T-Zellen weder ein Einfluss auf
die IL-2-Produktion noch auf die Zellproliferation kokultivierter Responder-Zellen
gemessen werden. In beiden Fällen zeigte sich kein signifikanter Unterschied zu einer
kontrollbehandelten Zellgruppe. Die HO-1-Induktion führte somit nicht zu einem
regulatorischen Phänotyp (Abb. 9).
- 39 -
Abb. 9: Durchflusszytometrische Analyse immunregulatorischer Fähigkeiten HO-1induzierter CD4+CD25- T-Zellen: CD4+CD25- T-Zellen wurden mit PGJ2 zur HO-1-Induktion
oder als Kontrolle mit dem Lösungsmittel Methylacetat vorbehandelt, dann mit PKH26
markiert, gewaschen und mit CFSE-markierten CD4+CD25- Responder-Zellen in Anwesenheit
von anti-CD3/anti-CD28 Beads kokultiviert. Kokultivierungen von CFSE-markierten
Responder-Zellen mit PKH26-markierten Tregs dienten als positive Kontrolle, Einzelkulturen
von Respondern ohne Beads dienten als negative Kontrolle. Im Gegensatz zur ausgeprägten
suppressiven Kapazität der Tregs konnte bei den PGJ2 behandelten CD4+CD25- T-Zellen keine
Fähigkeit zur Suppression nachgewiesen werden. Übereinstimmende Ergebnisse erbrachte auch
die Quantifizierung von IL-2 aus den Kulturüberständen (Mittelwert ±SEM; n=3; *, p < 0,05).
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass der Proliferationsstimulus auf die ResponderZellen durch die Beads zu stark ist, um von den durch die HO-1-Induktion eventuell nur
gemäßigt immunsuppressiv wirkenden CD4+CD25- T-Zellen unterdrückt zu werden,
- 40 wurde das Experiment mit einem schwächeren Stimulus wiederholt. Dafür wurden
gebundene anti-CD3 und lösliche anti-CD28 Antikörper verwendet. Da unter diesen
Stimulationsbedingungen in Vorversuchen zwar DNA-Synthesen gemessen werden
konnten, mit der CFSE-Fluoreszenz-Ausdünnung aber nur marginale Zellproliferationen
detektiert werden konnten, konnte die Proliferation dieser stimulierten Zellen nicht
durchflusszytometrisch bestimmt werden. Stattdessen wurde eine [3H]-ThymidinMarkierung nach Standardprotokollen durchgeführt, welche anhand der Aufnahme von
radioaktiv markiertem Thymidin bei jeder Durchwanderung des Zellzyklusses Aussagen
über die DNA-Replikationsraten und damit indirekt über die Proliferation von Zellen
trifft. Auch dieser Versuch lieferte quantitativ ähnliche Ergebnisse wie die
CFSE/PKH26-Experimente. Auch die Proliferation von Responder-Zellen, die nur
schwach stimuliert wurden, konnte von PGJ2-behandelten CD4+CD25- T-Zellen nicht
supprimiert werden (Abb. 10).
Abb. 10: [³H]-Thymidin zur Analyse der Suppressionsfähigkeit von PGJ2-behandelten
Zellen mit einem schwächeren T-Zell-Stimulus: Gebundene anti-CD3 und lösliche antiCD28 monoklonale Antikörper wurden als Proliferations-Stimulus benutzt. Die Proliferation
wurde durch den Einbau von radioaktivem [³H]-Thymidin bewertet. Die Graphik stellt das
Ergebnis eines von zahlreichen Experimenten mit diesem Stimulus dar, die zu vergleichbaren
Ergebnissen führten (Mean ±SEM; n=3; *, p < 0,05).
- 41 -
3.6 Fehlender Einfluss der HO-1-Inhibition
immunsuppressiven Phänotyp von Tregs
auf
den
Des Weiteren wurde, um abzuklären, ob die HO-1-Aktivität an der immunsuppressiven
Funktion menschlicher CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen beteiligt ist, in diesen
durch SnPP die HO-1 inhibiert. Wie Xia et al. zeigen konnten, wird durch eine SnPPBehandlung von Tregs die Expression der HO-1 zwar gesteigert, ihre Aktivität jedoch
bereits nach 24h inhibiert; die HO-1 ist somit funktionslos. Dieser Effekt sei über 24
Tage hinweg nachweisbar (65). Somit wurden die Tregs nach Aufreinigung mit SnPP
vorbehandelt, mit PKH26 markiert, über Nacht kultiviert und am nächsten Tag nach
Auswaschung des frei im Medium schwimmenden SnPP mit CFSE-markierten
Responder-Zellen kokultiviert. Durchflusszytometrisch wurde die Fähigkeit der Tregs
untersucht,
trotz unfunktioneller HO-1 die Proliferation von Responder-Zellen zu
supprimieren. Bei einer Kokultivierung von CD4+CD25- Responder T-Zellen zum einen
mit unbehandelten Tregs, zum anderen mit SnPP oder kontrollbehandelten Tregs zeigte
sich kein Unterschied in der Fähigkeit der drei Tregs- Gruppen, Responder-Zellen zu
supprimieren. Eine HO-1-Inhibition durch SnPP hatte somit keinen Einfluss auf die
immunsuppressive Kapazität der Tregs.
Eine erwünschenswerte Methode zur Untermauerung dieses Versuches wäre eine
Ausschaltung der HO-1 durch Transfektion einer spezifischen siRNA gewesen.
Allerdings würde aufgrund der hohen Effektivität der Tregs, Responder-Zellen zu
supprimieren, schon eine mäßige Anzahl an nicht-transfizierten Tregs mit funktioneller
HO-1 ausreichen, um das Ergebnis extrem zu stören. Zudem stellt sich die
Durchführung einer Transfektion in Lymphozyten sehr schwierig dar. Es wurden einige
Transfektions-Reagenzien mit fluoreszenz-markierter siRNA in anfänglichen Versuchen
getestet,
aber
kein
Protokoll
gefunden,
das
eine
zufrieden
stellende
Transfektionseffektivität in humane CD4+ T-Zellen bieten konnte, ohne dabei
zytotoxisch zu wirken (ohne Abbildung).
Somit konnte eine Beeinträchtigung der suppressiven Kapazität von humanen Tregs
durch eine Behandlung mit SnPP nicht bewiesen werden, was vermuten lässt, dass die
Aktivität der HO-1 möglicherweise nicht entscheidend für deren regulatorischen
Phänotyp ist (Abb. 11, 12).
- 42 -
Abb. 11: Vorbehandlung CD4+CD25+ Tregs mit dem HO-1-Inhibitor SnPP zeigt einen
Einfluss auf deren regulatorische Aktivität: 1x105 CD4+CD25- CFSE-markierte ResponderZellen pro Well wurden in Abwesenheit (negative Kontrolle) und in Anwesenheit von antiCD3/anti-CD28 Beads kultiviert. Da in einigen (nicht in allen) Experimenten festgestellt
wurde, dass die Proliferation nicht nur von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen, sondern
auch von der Gesamtzahl der Zellen beeinflusst wird, wurde eine Versuchsgruppe mit 2x105
Responder-Zellen pro Well kultiviert, um die gleiche Zellzahl wie in den
Kokultivierungsversuchen zu erreichen. In den kokultivierten Gruppen wurden 1x105 CFSEmarkierte Responder- Zellen zusammen mit 1x105 SnPP- oder Kontroll-behandelten, PKH26markierten Tregs kultiviert. Die suppressiven Fähigkeiten der SnPP-vorbehandelten Tregs kamen
denen der mit einer Kontroll-behandelten Tregs gleich, so wurde die Fraktion der
proliferierenden Responder von beiden gleichermaßen supprimiert (Mean±SEM; n=3; *, p <
0,05 im Vergleich zur unstimulierten Kontrollgruppe; #, p < 0,05 im Vergleich zu beiden
Gruppen mit nur Responder-Zellen).
- 43 -
Abb. 12: Titrationsexperimente mit unterschiedlichen Treg: Responder-Verhältnis: In
Titrationsexperimenten wurden 1x105 CD4+CD25- CFSE-markierte Responder pro Well mit
unterschiedlichen Mengen an PKH26- markierten SnPP- oder mit einer Kontrolle behandelten
Tregs kokultiviert. Der Proliferative Index (PI) und das genaue T:R Verhältnis (Verhältnis von
Tregs zu Responder-Zellen) jeder Probe wurde aus den durchflusszytometrischen Analysen
berechnet. Die PIs vs. T:R Daten-Sets unterlagen bei beiden Tregs Gruppen einer sigmoidalen
Dosis-Wirkungs-Beziehung. Die entsprechenden Kurven zeigen, dass die suppressiven
Kapazitäten der beiden Gruppen fast identisch waren.
- 44 -
4 Diskussion
4.1 Immunsuppressivität vs. Proliferationsaverser Phänotyp
In den ersten Versuchen wurde durch einen Proteinnachweis im Western-BlotVerfahren gezeigt, dass humane CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen des peripheren
Blutes konstitutiv HO-1 exprimieren. Im Gegensatz dazu war HO-1 in CD4+CD25- TZellen erst nach Aktivierung nachweisbar; ruhende CD4+CD25- T-Zellen exprimieren
keine HO-1. Somit wurden die entsprechenden Ergebnisse von Pae et al. aus RT-PCR
und Durchflusszytometer-Versuchen bestätigt und konnten als Voraussetzung für die
weitere Versuchsplanung dienen.
Beim weiteren Vorgehen wurde bestätigt, dass eine Behandlung von PGJ2 zur Induktion
von HO-1 in CD4+CD25- T-Zellen führt, und es stellte sich heraus, dass durch die HO-1
Induktion die Proliferationsrate dieser Zellen abnahm. Im Gegenzug wurde festgestellt,
dass eine Behandlung von CD4+CD25+ T-Zellen mit SnPP, die die Aktivität der von
ihnen konstitutiv exprimierten HO-1 inhibiert, deren Proliferation erhöhen konnte.
Diese beiden Ergebnisse deuten an, dass die HO-1 in der Lage ist, die
Proliferationseigenschaften von T-Lymphozyten zu modulieren.
Inhibition und Induktion der HO-1 durch eine Behandlung der Tregs mit SnPP bzw. der
Responder-Zellen mit PGJ2 hatten jedoch keinen Einfluss auf die Suppression
kokultivierter Responder-Zellen. Nach Modulation der HO-1 konnte, gemessen an der
IL-2-Produktion sowie der Proliferation der kokultivierten Responder-Zellen, weder
eine Suppression noch eine Induktion immunsuppressiver Eigenschaften festgestellt
werden. Somit kann gefolgert werden, dass die HO-1-Expression zum typischen
proliferationsaversen Phänotyp der Tregs beiträgt. Auch frisch aktivierte T-Zellen sind
der Proliferation abgeneigt, was somit auch durch die aktivationsbedingte HO-1Induktion erklärt werden würde.
Insgesamt legen die Ergebnisse dieser Arbeit den Schluss nahe, dass
HO-1 nicht
ausreichend und wahrscheinlich nicht nötig ist, um humanen CD4+ Zellen suppressive
Kapazitäten zu verleihen.
- 45 -
4.2 Fragliche Rolle der HO-1 für die Immunsuppressivität
muriner Tregs
Diese Aussage für humane Tregs
unterstützt eine erst kürzlich von Zelenay et al.
veröffentlichte Arbeit, bei der an HO-1-defizienten hmox-1-/- Mäusen gezeigt wurde,
dass murine Tregs ohne funktionierende HO-1 die Proliferation von Responder in vitro
genauso wie Wildtyp–Mäuse supprimieren können. Zudem ergab sich in den Versuchen
von Zelenay et al., dass eine HO-1- Induktion durch CoPP in den Tregs deren suppressive
Aktivität nicht steigern kann, sondern vielmehr gar keinen Einfluss auf diese nimmt.
Somit wurde geschlossen, dass die HO-1 bei der Maus nicht für die Entwicklung und
Funktion regulatorischer T-Zellen erforderlich ist (70). Die Ergebnisse von Zelenays
Studie für murine Tregs und die der jetzigen Arbeit für humane Tregs stehen den
Ergebnissen von Choi et al. entgegen, die der HO-1 eine essentielle Rolle in der
immunsuppressiven Funktion regulatorischer T-Zellen zusprechen (11).
4.3 Diskrepanz zu vorherigen Forschungsergebnissen
Eine Erklärung für die Diskrepanz der Forschungsergebnisse könnten Unterschiede in
experimentellen Bedingungen sein, vor allem in Anbetracht der Methoden zur
Proliferationsquantifizierung. In dieser Arbeit wurde anhand von Zellteilungsraten und
aktuellen Änderungen der Anzahl von Zellen auf das Maß der Proliferation geschlossen.
Die Erhebung der diesbezüglichen Daten erfolgte aus durchflusszytometrischen
Messungen.
Im Gegensatz dazu bestimmten Choi et al. die Proliferation durch einen 5-Bromo-2Deoxyuridin (BrdU)-basierten ELISA. Das Thymidinanalogon BrdU wird in der SPhase des Zellzyklus in die DNA eingebaut und lässt sich im ELISA über einen
enzymmarkierten Antikörper nachweisen. Die Intensität der katalysierten Farbreaktion
spiegelt das DNA-Synthese-Ausmaß der letzten Stunden des Versuches wieder. Ein
gravierender Mangel der Methoden, die basierend auf der DNA-Synthese die
Zellprolifaration messen, ist, dass sie in Experimenten, bei denen zwei Zellpopulationen
kokultiviert werden, nicht zwischen den unterschiedlichen Zelltypen differenzieren
können. Somit kann bei einer Kokultivierung von Tregs und Responder-Zellen nur eine
Annäherung an die aktuelle DNA-Synthese-Rate der Responder-Zellen stattfinden,
indem man die Werte allein kultivierter Tregs von den Werten beider Zellpopulationen
- 46 im Kokultivierungsversuch abzieht. Choi et al. kokultivierten
die Zellen in
Anwesenheit des HO-1-Inhibitors Zink-Protoporphyrin (ZnPP) und erhielten in den
Kokultivierungsversuchen eine erhöhte relative Zellproliferationsrate. Durch ihre
Berechnungen interpretierten sie diese erhöhte Proliferation als verminderte Suppression
der Tregs durch Inhibition der HO-1 und eine daraus resultierende erhöhte
Proliferationsrate der Responder-Zellen. Allerdings könnte dieses Ergebnis genauso
durch eine HO-1-Inhibitions-bedingte Proliferationssteigerung der Tregs erklärt werden.
Zudem erhöht ZnPP selbst den BrdU-Einbau in beide der involvierten Zelltypen, auch in
Einzelkultivierungen. Somit könnte es wohl ziemlich schwierig sein, eine ZnPPinduzierte Proliferationserhöhung in Kokultivierung hauptsächlich den potentiellen
Änderungen der Suppressionskapazität der Tregs zuzuschreiben.
4.4 Entscheidende Rolle der HO-1 für immunologische
Toleranz im murinen Modell
4.4.1
Verlängertes Überleben von Allotransplantaten
Neben den Studien von Choi et al. und Zelenay et al. gibt es viele weitere Studien,
welche die HO-1 mit Toleranz und/oder CD4+CD25+ Tregs in Verbindung bringen. So
berichteten z.B. Braudeau et al., dass eine HO-1-Überexpression durch adenoviralen
HO-1 Gentransfer in ein Herz-Allotransplantat das Überleben des Transplantates
verlängerte. Dieses Phänomen ging mit einer verminderten allogenen Immunantwort in
einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) einher, wobei diese Inhibition
lymphozytärer Proliferation von der Anwesenheit antigenpräsentierender Zellen
abhängig war (6). Des Weiteren beschrieben Yamashita et al., dass Herzen, die von
C57BL/6- in BALB/c- Mäuse transplantiert wurden, über einen längeren Zeitraum
überlebten, wenn die Empfängermäuse vorher mit toleranzinduzierenden anti-CD40L
Antikörpern in Kombination mit einer Donor-spezifischen Transfusion (DST) behandelt
wurden. Bei einer Transplantation in HO-1-defiziente Mäusen oder unter einer HO-1Inhibition durch ZnPP in den Empfängermäusen konnten diese Ergebnisse nicht erzielt
werden und die Transplantate wurden innerhalb von 24 Tagen nach Transplantation
abgestoßen. Durch eine Vorbehandlung der Empfängermäuse durch CoPP zur HO-1Induktion in Kombination mit DST wurde in Abhängigkeit von Tregs ein langfristiges
- 47 Transplantatüberleben erreicht. Demnach scheint die Tregs-bedingte Toleranzinduktion
mit der HO-1 Expression in der Maus gekoppelt zu sein (68).
2007 beschrieben Lee et al. ein weiteres Beispiel für die Rolle der HO-1 für das
Überleben von Allotransplantaten. Sie zeigten, dass bei einer Inselzell-Transplantation
von BALB/c- zu C57BL/6-Mäusen eine HO-1-Indukion in Kombination mit einer
Bilirubin- und CO-Zufuhr die Toleranz der Empfängermäuse gegenüber dem
Allotransplantat erhöht und somit ein Transplantatüberleben von über 100 Tagen
erreicht wird. Dies konnte bei gleicher Behandlung jedoch nicht beobachtet werden,
wenn in den Empfängermäusen vorher mittels anti-CD25 Antikörpern die Tregs zerstört
wurden. Die Autoren vermuteten, dass durch die Behandlung mit Bilirubin, Co und
durch die HO-1-Induktion eine Migration oder eine de novo Synthese von Tregs induziert
wird, die an der Entstehung der Toleranz gegenüber den Insellzell-Allotransplantaten
beteiligt sind (29).
4.4.2
Verminderung von Abortraten
Sollwedel et al. konnten bei schwangeren Mäusen durch eine HO-1-Induktion eine
erhöhte Toleranz gegenüber dem Fötus nachweisen. Hierbei wurden CBA/J- und
DBA/2J-Mäuse gepaart -eine Kombination, die für ihre Neigung zu Aborten bekannt ist.
Eine HO-1-Inhibition mit ZnPP steigerte die Abortrate, wohingegen eine Induktion
durch CoPP Aborte verhindern konnte. Diese protektiven Effekte wurden neben anderen
Mechanismen durch die Aktivierung regulatorischer T-Zellen vermittelt, d.h. durch eine
Steigerung der Zellzahl oder der Aktivität von Tregs an der fetal-maternalen Schnittstelle
nach der Induktion von HO-1 (56).
4.4.3
Suppression allergischer Atemwegsinfektionen
Xia et al. untersuchten 2006 den Einfluss von Tregs und der von diesen exprimierten
HO-1 auf Suppression von allergischem Asthma durch regulatorische T-Zellen. Mittels
Ovalbumin wurde im Lungengewebe der Mäuse eine mit dem allergischen Asthma
vergleichbare Entzündungsreaktion hervorgerufen, woraufhin die Mäuse 28 Tage lang
wiederholt mit Häm, SnPP+Häm, SnPP oder mit einer Kontrolle behandelt wurden.
Durch die Häminbehandlung und die daraus resultierende HO-1-Induktion konnte die
Entzündungsreaktion erfolgreich supprimiert werden. Zudem wurde durch die HO-1-
- 48 Induktion nachweislich der prozentuale Anteil und die suppressive Fähigkeit von
CD4+CD25+ Tregs erhöht sowie die Expression von FoxP3-mRNA im Lungengewebe
gesteigert. Im Gegenzug blieben durch eine zusätzliche Behandlung mit SnPP diese
Effekte
aus
und
auch
durch
eine
alleinige
SnPP-Behandlung
und
damit
Akivitätsminderung der HO-1 konnte die Ovalbumin-induzierte Atemwegsentzündung
nicht supprimiert werden (67).
4.5 HO-1 im Zusammenhang mit Antigen präsentierenden
Zellen
Wenn jedoch die Interpretation der Forschungsergebnisse dieser Arbeit richtig ist, die
besagt, dass die HO-1 weder ausreichend noch notwendig für den regulatorischen
Phänotyp von
Tregs ist, stellt sich die Frage, welcher Mechanismus dann der
offensichtlich so wichtigen Rolle der HO-1 für die Gewährleistung immunologischer
Toleranz zugrunde liegt und wie die Abhängigkeit der Immunsuppressivität der HO-1
von CD4+CD25+ Tregs zu Stande kommt.
Bei einer in vivo Modulation der HO-1-Aktivität werden durch die Behandlung mit
Induktoren oder Inhibitoren nicht nur regulatorische T-Zellen beeinflusst, sondern auch
andere immunologisch relevante Zelltypen. Unter diesen könnten im speziellen Antigen
präsentierende Zellen (APCs) wie Dendritische Zellen (DCs) eine Rolle spielen.
4.5.1
Reduktion der Anzahl von DCs durch HO-1-Induktion in der
Ratte
In einem Transplantationsmodell bei der Ratte wurde vor einer Nierentransplantation
die Spenderratte mit CoPP behandelt. Durch die HO-1-Induktion wurde die Anzahl der
aus der Spenderratte stammenden DCs im Transplantat und am Transplantationsort im
Empfänger reduziert. Dies ging mit einer verminderten Anzahl an CD4+ T-Zellen, CD8+
T-Zellen und damit einer reduzierten immunogenen Aktivität gegen das Allotransplantat
einher (36).
- 49 -
4.5.2
Reduktion der Anzahl von DCs durch HO-1 im murinen
Diabetesmodell
Darauf aufbauende Versuche mit NOD.scid-Mäusen (nicht fettleibig diabetisch, mit
kombiniertem schweren Immundefekt), denen ein rekombinanter, adeno-assoziierter
HO-1-Gen-tragender Virus (AAV-HO-1) i.v. injiziert wurde, führten zu einer
reduzierten Inzidenz von autoimmunem Diabetes mellitus bei diesen Mäusen. Isolierte
Splenozyten
der
AAV-HO-1-Mäuse
durchflusszytometrische
prozentualen
Anteil
Messungen
von
waren
ergaben
CD4+CD25+
weniger
jedoch
Diabetes
keinen
regulatorischen
auslösend,
Unterschied
T-Zellen
in
im
der
kontrollbehandelten und in der AAV-HO-1 behandelten Gruppe. Allerdings war die
CD11c+ MHC II+ dendritische Zell-Population in der AAV-HO-1-Gruppe im Vergleich
zur Kontrollgruppe massiv erniedrigt. Somit wurde geschlossen, dass die HO-1 durch
eine Reduktion dendritischer Zellen einen abschwächenden Effekt auf Entwicklung von
Diabetes hat (22). Gleichermaßen wiesen Li et al. darauf hin, dass eine Verknüpfung
zwischen dem Anstieg von HO-1 und der Senkung der Anzahl dendritischer Zellen
besteht. In einem Diabetesmodell zeigten sie, dass die Anzahl von CD11c+ dendritischen
Zellen im Pankreas von NOD-Mäusen durch eine CoPP-Behandlung mit darauf
folgender HO-1-Induktion reduziert wurde (31).
4.5.3
Bestätigung der Rolle der HO-1 für die Aktivität von DCs
beim Menschen
Außerdem wurde der HO-1-Aktivität eine Schlüsselrolle in der Vermittlung der antiinflammatorischen
Wirkung
humaner
Monozyten
nach
einer
intensiven
Alkoholbehandlung zugesprochen, wobei Monozyten als wichtigste Vorläuferquelle für
dendritische Zellen gelten. Durch eine Applikation von Alkohol wird in Monozyten die
Produktion von TNF-α vermindert und IL-10 hochreguliert, ein anti-inflammtorischer
Effekt, der durch eine HO-1-Inhibition verloren ging (14).
- 50 -
4.6 Das Zusammenspiel Antigen präsentierender Zellen mit
Tregs
4.6.1
HO-1-Expression dendritischer Zellen
Nach Aussage von Chauveau et al. exprimieren nicht nur Tregs, sondern auch
Monozyten-abgeleitete humane unreife dendritische Zellen (iDCs) sowie einige frisch
aus der Milz von Ratten isolierte DCs und iDCs aus dem Knochenmark von Ratten
konstitutiv HO-1. Die Autoren zeigten, dass die HO-1-Expression durch eine in vitro
induzierte Reifung der dendritischen Zellen in beiden Spezies drastisch sank.
Übereinstimmend exprimieren beim Menschen nur unreife, nicht aber reife dendritische
Zellen HO-1. Eine HO-1-Induktion durch CoPP in DCs von Ratte und Mensch
verhinderte
eine
LPS-induzierte
Reifung
sowie
die
Ausschüttung
von
proinflammatorischen Zytokinen. Daraus resultierte eine Inhibition alloreaktiver TZellproliferation. Die Fähigkeit der DCs, das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 zu
produzieren blieb jedoch erhalten (10).
4.6.2
Vermittlung immunregulatorischer Effekte der HO-1 über
APCs
Dieses Datenmaterial legt die Hypothese nahe, dass die immunregulatorischen Effekte
der HO-1 ihren Ursprung größtenteils in ihrer Aktivität in Antigen präsentierenden
Zellen haben.
Diese Hypothese wird von einer aktuellen Arbeit von Chora et al. im Zusammenhang
mit der autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen unterstützt. Sie fanden heraus,
dass die HO-1 durch eine Wirkung auf APCs die Demyelinisierung sowie klinische
Symptome wie Paralyse bei der Multiplen Sklerose unterdrückte (12). Die HO-1Induktion durch CoPP supprimierte die MHC II-Expression in den murinen Antigen
präsentierenden Zellen und damit in dendritischen Zellen, außerdem in Mikroglia und
ZNS infiltrierenden Makrophagen. Dies ging mit einer Inhibition sowohl einer
Akkumulation von T-Helfer- und CD8 T-Zellen als auch von deren Proliferation und
Effektivität im ZNS einher. Der antiproliferative Effekt der HO-1-Induktion auf
autoreaktive T-Helfer-Zellen, die im Falle der Multiplen Sklerose gegen körpereigenes
Myelin reagieren, konnte somit deutlich den durch HO-1 modulierten APCs/DCs
- 51 zugesprochen werden und wurde nicht durch eine direkte Beeinflussung der
proliferativen Kapazität der T-Zellen selbst verursacht (12).
Auch die Forschungsarbeiten von Xia et al., die wie oben beschrieben zeigten, dass
durch eine in vivo Modulation der HO-1 eine Modulation der immunregulatorischen
Kapazität
muriner
Tregs
möglich
ist,
würden
in
dieses
Modell
einer
immunmodulatorischen Funktion der HO-1 in APCs passen:
Eine in vivo Induktion bzw. -Inhibition der HO-1 durch Häm oder SnPP erreicht nicht
nur Tregs, sondern auch zahlreiche unterschiedliche Zellarten im ganzen Organismus.
Somit wurde die Entwicklung bzw. Wappnung der Treg
in den 28 Tagen des
Experiments vermutlich durch eine unterschiedliche Modulation der HO-1 in den APCs
in den verschiedenen Behandlungsgruppen beeinflusst. Diese Interpretation würde auch
gut zu den Beobachtungen der Autoren selbst passen, dass der HO-1 vermittelte Anstieg
der suppressiven Kapazität der Tregs von der Anwesenheit von IL-10 während der 28
Tage abhing, wobei das IL-10-Milieu anscheinend auch durch die HO-1-Induktion/ Inhibition moduliert wird. In IL-10 defizienten Mäusen konnte keine Steigerung der
Immunsuppressivität beobachtet werden (67).
4.7 Ausblick
In Anbetracht der Relevanz der HO-1-Aktivität in Tregs kann man letztendlich nicht
ausschließen, dass die unterschiedlichen Stimuli für eine T-Zell-Aktivierung bei in vitro
Kokultivierungsversuchen
sowie
die
variierenden
Bestimmungsmethoden
der
Suppressivität für die unterschiedlichen Ergebnisse der Studien verantwortlich sind, die
sich mit der Frage beschäftigten, ob eine HO-1-Modulation in Tregs deren
immunsuppressive Kapazität beeinflusst oder nicht. Aber auch wenn die HO-1Expression in regulatorischen T-Zellen für deren eigenen regulatorischen Phänotyp
weder ausreichend noch nötig ist, heißt das nicht zwingend, dass die HO-1-Aktivität der
Tregs für den Organismus irrelevant wäre. In Anbetracht der multiplen physiologischen
Effekte der katalytischen Produkte der Hämoxygenase moduliert die HO-1-Aktivität der
Tregs Immunantworten vielleicht auf einer anderen Ebene als über ihre eigene zelluläre
suppressive Aktivität.
Somit sind weitere Studien notwendig, um klarzustellen, an welcher der zahlreichen
Komponenten einer komplexen Immunantwort die HO-1 den initialen Auslöser setzt,
- 52 über den die Kaskade maßgeblicher immunregulatorischer Effekte gestartet wird.
Zudem gilt es herauszufinden, welche Faktoren letztendlich durch die HO-1 direkt oder
durch ihre katalytischen Produkte beeinflusst werden.
Abschließend lässt sich anhand der Ergebnisse dieser Arbeit sagen, dass ein
therapeutischer Ansatz beim Menschen mit einer HO-1-Modulation zur direkten
Beeinflussung humaner Tregs zur Induktion oder Inhibition von Toleranz fraglich ist.
Allerdings könnte durch eine Verifizierung der Hypothese, dass eine HO-1-Modulation
zwar nicht direkt die regulatorische Kapazität von Tregs steuert, jedoch über
dendritischen Zellen auf die Funktion von Tregs Einfluss nimmt, die Modulation der HO1
dennoch
ein
bedeutender
Ansatz
zur
Therapie
von
Tumor-
und
Autoimmunerkrankungen sowie ein wichtiger Faktor in der Transplantationsmedizin
sein.
- 53 -
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ischemia/reperfusion injury and chronic graft deterioration by a single-donor
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required for mouse regulatory T cell development and function. Int Immunol.19
(1): 11-18.
- 59 -
6 Abkürzungsverzeichnis
AA
AAV-HO-1
AG
APS
APC
BAA
BrdU
BSA
Bzw.
C57BL/6
CBA/J
CD3
CD 4
CD8
CD 11c
CD25
CD28
CFSE
CTLA-4
CO
CoPP
DBA/2J
DC
DTT
EDTA
ELISA
FACS
FBS
FCS
GAPDH
FoxP3
GAPDH
GITR
HO-1
HSA
iDCs
IgG
IL-10
IL-2
i.v.
KCl
KH2PO4
MACS
MHC II
Acrylamid
Adeno-assoziierter Virus, der ein HO-1 Gen trägt
Antigen
Ammoniumpersulfat
Antigen präsentierende Zelle
Bisacrylamid
5-Bromo-2-Deoxyuridin
Bovines Serum Albumin
Beziehungsweise
Mausstamm
Mausstamm
T-Zellen-Oberflächenmarker
T-Zellen-Oberflächenmarker
T-Zellen-Oberflächenmarker
T-Zellen-Oberflächenmarker
T-Zellen-Oberflächenmarker
T-Zellen-Oberflächenmarker
Carboxyfluorescein succinimidyl ester
cytotocix T lymphocyte antigen-4
Kohlenstoffmonoxid
Cobalt- Protoporphyrin
Mausstamm
Dentritische Zelle
Dithiothreitol
Ethylendiamintetraacetat
Enzyme-linked immunosorbent assay
Fluorescein activated cell sorting
Fötales bovines Serum
Fötales Kälberserum
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
Forkhead Box P3
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
Glucocorticoid- induced TNF-Rezeptor
Hämoxygenase-1
Humanes Serumalbumin
Immature dentritic cells (unreife dentritische Zellen)
Immunglobulin G
Interleukin 10
Interleukin 2
intravenös
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogencarbonat
Magnetic Activated Cell Sorting
Major Histocompatibility Complex
- 60 MLPC
MLR
NaCl
NKT
NOD
NOD.scid
NP 40
PBMC
PBS
RPMI
RPMI+
RT
PBMCs
PBS
PGJ2
PI
PKH26
SDS
SEM
SnPP
TCR
TEMED
TNFα
Tris
Tween 20
P/S
RT
RPMI
RPMI+
SDS
TBST
Treg
U
UV
z.B.
ZnPP
Mixed Lymphocyte Peptide Culture
Gemischte Lymphozytenreaktion
Natriumchlorid
Natürliche Killer T-Zellen
Mausstamm (nicht fettleibig diabetisch)
Mausstamm (nicht fettleibig diabetisch mit kombiniertem
schweren Immundefekt)
Nonidet® P40
Periphere mononukleäre Zellen
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
Roswell Park Memorial Institute
RPMI + FCS+ S/P
Raumtemperatur
Periphere mononukleäre Zellen
Phosphat gepufferte Saline
Prostaglandin J2
Proliferativer Index
Fluoreszenzfarbstoff (rot)
Na2HPO4 Natriumdodecylphosphat
Standardfehler des Mittelwerts
Zinn-Protoporphyrin
T-Zell-Rezeptor
N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin
Tumornekrosefaktor α
Tris (hydroxy)-aminomethan
Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
Penicillin/Streptomycin
Raumtemperatur
Roosevelt Park Memorial Institute (entwickelte das
Zellzuchtmedium RPMI)
RPMI + FCS+ P/S + L-Glutamin
Natriumdodecylphosphat
Tris gepufferte Salzlösung plust Tween
CD4+CD25+ natürliche regulatorische T-Zellen
Umdrehungen pro Minute
Ultraviolett
zum Beispiel
Zink-Protoporphyrin
- 61 -
7 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
Abbildungen
Abb. 1:
Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz……………..…….….5
Abb. 2:
Aktivierung der T-Helfer-Zellen…...………………...…………….…….6
Abb. 3:
Aktivierung zytotoxischer T-Lymphozyten.………..……………………7
Abb. 4:
Western-Blot-Analyse zum Nachweis von HO-1-Expression.......…..…30
Abb. 5:
Western-Blot-Analyse zum Nachweis induzierbarer HO-1Expression………………………………………………………..……..32
Abb. 6:
CFSE- und PKH26-Markierung zur parallelen Analyse der
Zellproliferation zweier kokultivierter Zellpopulationen…………...….34
Abb. 7:
Durchflusszytometrische Analyse der Zellproliferation nach HO-1Induktion durch PGJ2 in Responder-Zellen………………….................36
Abb. 8:
Durchflusszytometrische Analyse der Zellproliferation nach HO-1Inhibition durch SnPP in Tregs...…………...………………………..…..37
Abb. 9:
Durchflusszytometrische Analyse immunregulatorischer Fähigkeiten
HO-1-induzierter CD4+CD25- T-Zellen………………….…………….39
Abb. 10:
[³H]-Thymidin zur Analyse der Suppressionsfähigkeit von PGJ2behandelten Zellen mit einem schwächeren T-Zell-Stimulus……...…..40
Abb. 11:
Vorbehandlung CD4+CD25+ Tregs mit dem HO-1-Inhibitor SnPP zeigt
einen Einfluss auf deren regulatorische Aktivität…………………..…..42
Abb. 12:
Titrationsexperimente mit unterschiedlichen
Treg: Responder-Verhältnissen………………………………………….43
Tabellen
Tab. 1:
Primärantikörper…………...…………………………………………...22
Tab. 2:
Sekundärantikörper……………………...………………………...……22
- 62 -
Anhang
A
Chemikalien und Reagenzien
Gleiche, in der Hautklinik von einem anderen Hersteller verwendete Reagenzien und
Chemikalien wurden mit dem Symbol (D) für Dermatologie gekennzeichnet.
Kulturmedien und Zusätze
Medien und Zusätze
Hersteller
BioWhittaker RPMI 1640 (D)
RPMI 1640 + Glutamax™-1
Fetales Kälberserum (FCS)
Penicillin + Streptomycin
PBS (D)
Cambrex, Verviers, Belgien
Gibco Invitrogen; Karlsruhe, Deutschland
Gibco Invitrogen; Karlsruhe, Deutschland
Biochrom AG; Berlin, Deutschland
Cambrex, Verviers, Belgien
Substanzen
Substanz
Hersteller
Acrylamid
Amino Acids (100x) Non Essential
Ammoniumpersulfat (APS)
Bioradlösung „Protein Assay“
Bovines Serumalbumin (BSA)
Bromphenolblau
Cobalt-Protoporphyrin
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dithiothreitol (DTT)
EDTA (D)
EDTA
FACS-Flow
Gentamycin Solution
Glycerol
Glycin
Heparin-Natrium 5000
Hepes-Buffer
Humanalbumin (HSA)
Isopropanol
Kaliumdihydrogencarbonat (KH2PO4)
Kaliumchlorid (KCl)
L-Glutamin (D)
L-Glutamin
Luminol
Lymphoprep
Magermilchpulver „Non-Fat Dry Milk“
AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland
PAA, Pasching, Österreich
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Bio-Rad, München, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Alexis Biochemicals GmbH, Laussen, Schweiz
Fluka, Neu-Ulm, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
BD Biosciences, Heidelberg
PAA, Pasching, Österreich
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Rathiopharm, Ulm Deutschland
PAA, Pasching, Österreich
Baxter, München, Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Cambrex, Verviers, Belgien
Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Fresenius Kabi Norge, Holden, Norwegen
Bio-Rad, München, Deutschland
- 63 -
Substanz
Hersteller
β-Mercaptoethanol
Methanol
Methylacetat
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,
Deutschland
Amersham, Freiburg, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Gibco/BRL, Eggenstein, Deutschland
Alexis Biochemicals GmbH, Laussen, Schweiz
Cambrex, Verviers, Belgien
Bio-Rad, München, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
PAA, Pasching Österreich
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Roth GmbH, Karlsruhe Deutschland
Alexis Biochemicals GmbH, Laussen, Schweiz
Methyl-[3H]-Thymidin
Natriumazid
Natriumchlorid (NaCl)
N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin (TEMED)
Na2HPO4 Natriumdodecylphosphat (SDS)
Natriumchlorid
NP 40
Para-hydroxy-Coumarinsäure
Penicillin/ Streptomycin
PGJ2 (15-Deoxy-∆12,14 Prostaglandin J2 )
Pool-Serum (BioWhittaker Human Serum)
Precision Plus, Kaleidoscope
Protease Inhibitor Cocktail P8340
Sodium Pyruvate Solution
Tris-Base
Tris-HCl
Trypanblau
Trypanblau (D)
Türksche Lösung
Tween 20
Wasserstoffperoxid
Zinn-Protoporphyrin (SnPP)
- 64 -
Antikörper:
Primärantikörper
Hersteller
FoxP3: Clon PCH101, Isotyp Ratte IgG 2a
eBiosciences, San Diego, USA
HO-1: Rabbit Anti-HO-1-Antibody SPA- 896
Stressgen, Ann Arbor, USA
GAPDH: GAPDH (V-18)
Santa Cruz Biotechnology, California, USA
Sekundärantikörper
Hersteller
FoxP3: Mouse Anti-Rat IgG
Jackson-ImmunoResearch, Baltimore, USA
HO-1: Goat Anti-Rabbit IgG
Jackson-ImmunoResearch, Baltimore, USA
GAPDH: Peroxidase-conjugated AffiniPure
Rabbit Anti-Goat
Jackson-ImmunoResearch, Baltimore, USA
Aktivierungs-Antikörper
Hersteller
Anti-CD3/Anti-CD28 Dynal T-cell expander
beads
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Deutschland
Purified Mouse Anti-human CD3 Monoclonal
Antibody
BD Biosciences GmbH, Heidelberg,
Deutschland
Purified Mouse Anti-human CD28
BD Biosciences GmbH, Heidelberg,
Deutschland
Versuchsysteme:
Versuchssysteme (Kits)
Hersteller
CD4+CD25+ Regulatory T Cell
Isolation Kit human
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland
Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Human IL- 2 ELISA
BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Deutschland
BD OptEIATM Reagent Set B
BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Deutschland
- 65 -
B
Geräte und Materialien
Gerät
Hersteller
Centrifuge 5417R
Centrifuge 5810
Gel Doc 2000
Gelelektrophoreseapparatur Sub-Cell® GT
ICH-110 Erntegerät
Inkubator CO- 150
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Bio-Rad, München, Deutschland
Bio-Rad, München, Deutschland
Inotech, Dottikon, Schweiz
New Brunswick Scientific Deutschland GmbH,
Nürtingen, Deutschland
Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Deutschland
Wallac, Turku, Finnland
Heraeus Instruments GmbH, Osterode,
Deutschland
Heraeus Instruments GmbH, Osterode,
Deutschland
Assistent, München, Deutschland
Elga, Celle, Deutschland
Dynatech, Hamburg, Deutschland
Bio-Rad, München, Deutschland
FACScan
MACS Separator
1450 Mikroplattenzähler
Mikroskop CK40- F200
Multifuge 3 S-R
Neubauer-Zählkammer
Purelab Plus USF (Wasseraufbereitungsanlage)
Photometer DIAS
Photometer SmartSpectTM 3000
Pipetten Research
(2,5 – 10 – 20 – 100 – 200 – 1000 µl)
Pipettierhilfe Easypet
Pipettierhilfe Falcon® (D)
Schüttler REAX 3
Semi-dry Blotting System, Fastblot B44
Spannungsgeber Power Pac 300
Sterilwerkbank Hera Safe HS12
Thermoleader HB-120 (Heizblock)
Universalnetzgerät EA-3050
(Antrieb Rollschüttler)
Vortex Genie 2
Vortex Reax 1 DR
Waage SAB61 (200g x 0,1g)
Cellstar © PP-Test-Tubes (Reaktionsgefäße):
DiscardifTM II, 20ml (Spritzen)
Dispenser
Duran® Becherglas 200ml
Eppendorf-Cups (Multireaktionsgefäße)
Halb-Mikro-Küvette
MACS® Seperation Columns (LD-Säule, MSSäule)
MeltiLex® A
Nitrocellose Transfer Membran
NuncleonTM (Mikrotiterplatten):
6-Well-Platten
24-Well-Platten
48-Well-Platten
96-Well-Platten
ELISA-Platte (Maxisorb, 96 Well)
Pipettenspitzen
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland
Heidolph, Schwabach, Deutschland
Biometra, Göttingen, Deutschland
Bio-Rad, München, Deutschland
Heraeus Instruments GmbH, Hanau,
Deutschland
Uniequip, München, Deutschland
Elektro-Automatik, Viersen, Deutschland
Scientific Industries, New York, USA
Heidolph, Schwabach, Deutschland
Scaltec, Göttingen, Deutschland
Greiner bio-one, Kremsmünster, Deutschland
BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Deutschland
TPP, Trasadingen, Schweiz
Schott, Mainz, Deutschland
Roth, Karlsruhe, Deutschland
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Deutschland
Wallac, Turku, Finnland
Whatman GmbH, Dassel, Deutschland
Nunc, Wiesbaden, Deutschland
Nunc, Wiesbaden, Deutschland
Nunc, Wiesbaden, Deutschland
Nunc, Wiesbaden, Deutschland
Nunc, Wiesbaden, Deutschland
Roth, Karlsruhe, Deutschland
- 66 -
Gerät
Hersteller
Polystyrene Round-Bottom Tube
Printed Filtermat A (Filter)
Whatman-Paper
Zellkulturflaschen 75cm2, 25cm2
Falcon, Heidelberg, Deutschland
Wallac, Turku, Finnland
Whatman, USA
TPP, Trasadingen, Schweiz
- 67 -
Danksagung
______________________________________________________________________
An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Betreuer Dr. Markus Biburger bedanken,
der mir sowohl fachlich als auch menschlich eine sehr große Stütze war, mir immer mit
seinem Rat zur Seite stand und mich wissenschaftlich unterstützte. Ohne seine
Begleitung hätte diese Arbeit so nicht entstehen können.
Mit großem Respekt spreche ich auch meiner Arbeitsgruppenleiterin und Doktormutter
Frau Prof. Dr. Gisa Tiegs meinen Dank für die Bereitsstellung des Themas, die
freundliche Betreuung und die vielen Anregungen aus.
Bei Herrn Prof. Dr. Andreas Ludwig bedanke ich mich für die Übernahme des
Korreferats.
Mein großer Dank gilt auch Frau Dr. Gabriele Theiner, der Betreuerin meiner Versuche
in der Hautklinik. Ihr großes Interesse an meiner Arbeit sowie ihre tatkräftige und
freundliche Unterstützung beim [3H]-Thymidin-Labeling weiß ich sehr zu schätzen.
Bei Stefanie Dotterweich bedanke ich mich für die Einführung in die Zellisolation, für
die stetige bereitwillige Hilfestellung und das freundschaftliche Arbeitsklima.
Des Weiteren möchte ich den technischen Assistenten im Institut für Klinische und
Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie ein großes Dankeschön für ihre
verlässliche Hilfsbereitschaft und Unterstützung in praktischen Fragen aussprechen.
Danke an Andrea Agli, Sonja Heinlein und Elena Tasika.
Ein weiterer Dank gilt den Mitgliedern meiner Arbeitsgruppe, Frau Dr. Gabriele Sass
und den Doktoranden Dominik Abt, Stefanie Buerbank, Annette Erhardt, Florian
Haimerl und Irena Kröger, die mich bei auftretenden Problemen unterstützten, für eine
fröhliche und fruchtbare Arbeitsatmosphäre sorgten und somit zum Gelingen dieser
Arbeit beitrugen.
Zudem möchte ich mich bei meinen Freunden aus Donauwörth und Erlangen und bei
meinen Brüdern bedanken, die mir in allen Hochs und Tiefs dieser Arbeit eine Stütze
waren.
Vor allem gilt mein Dank meinen Eltern, die mich vorbehaltlos in meinem Studium
unterstützen und mir in jeder Lage zur Seite standen.
Vielen lieben Dank!
- 68 -
Lebenslauf
______________________________________________________________________
Name:
Mirjam Franziska Schädle
Geburtsdatum:
08.06.1983
Geburtsort:
Donauwörth
Eltern:
Dr. Georg Schädle
Maria Schädle, geb. Eding
Geschwister:
Tobias und Jonathan Schädle
Schulausbildung:
1989-1993
Mangold Grundschule, Donauwörth
1993-2002
Gymnasium Donauwörth
Abitur am 28.06.2002
Studium:
2002-2003
Studium der Kunstgeschichte, Psychologie und
Philosophie an der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
2003-2009
Studium der Humanmedizin an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Erste ärztliche Prüfung am 04.04.2005
(alte Approbationsordnung)
Zweite ärztliche Prüfung am 14.05.2009
(neue Approbationsordnung)