Einfluss von Muttermilch und Samenflüssigkeit auf die Hepatitis
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Aus der Abteilung der experimentellen Virologie des TWINCORE Hannover, einer gemeinsamen Einrichtung der Medizinischen Hochschule Hannover und des Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig, angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed Einfluss von Muttermilch und Samenflüssigkeit auf die Hepatitis-C-Virus -Stabilität und -Infektiosität Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover vorgelegt von Julia Mareike Heyden aus Celle Hannover 2010 Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 08.10.2013 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Pietschmann PD Dr. rer. nat. Eike Steinmann Kobetreuer: PD Dr. med. Sandra Ciesek Referent: Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Wedemeyer Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Stefan Pöhlmann Tag der mündlichen Prüfung: 08.10.2013 Prüfungsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Kreipe Prof. Dr. med. Sebastian Suerbaum Prof. Dr. med. Manfred Stuhrmann- Spangenberg Inhaltsverzeichnis 2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ......................................................................................................................... 5 1.1 Hepatitis C - Überblick .................................................................................................. 5 1.2 Diagnostik, Krankheitsverlauf und Therapie .............................................................. 7 1.3 HCV –Molekularbiologie ............................................................................................... 9 1.4 HCV-Modellsysteme ..................................................................................................... 13 1.5 HCV in Verbindung mit Körperflüssigkeiten............................................................ 14 1.5.1 Muttermilch.............................................................................................................. 14 1.5.2 Samenflüssigkeit und Epigallocatechingallat .......................................................... 17 1.6 Themenstellung und Ziel der Arbeit ........................................................................... 19 2. Materialien und Methoden ......................................................................................... 20 2.1 Materialien .................................................................................................................... 20 2.1.1 Zellen ....................................................................................................................... 20 2.1.2 Medien ..................................................................................................................... 20 2.1.3 Antikörper ................................................................................................................ 20 2.1.4 Plasmide ................................................................................................................... 21 2.1.5 Puffer und Lösungen ................................................................................................ 22 2.1.6 Muttermilchproben................................................................................................... 22 2.1.7 Spermaproben .......................................................................................................... 23 2.1.8 SEVI ......................................................................................................................... 23 2.1.9 EGCG, EGC, ECG, EC............................................................................................ 23 2.1.10 Lactoferrin.............................................................................................................. 23 2.2 Methoden ....................................................................................................................... 23 2.2.1 Transformation von Bakterien ................................................................................. 23 2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen ............................................ 24 Inhaltsverzeichnis 3 2.2.3 In-vitro-Transkription .............................................................................................. 24 2.2.4 Auftrennung von DNA und RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese ................... 25 2.2.5 Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren ............................................................ 25 2.2.6 Kultivierung von Säugerzelllinien ........................................................................... 26 2.2.7 Kryokonservierung von Zellen ................................................................................ 26 2.2.8 Bestimmung der Zelldichte ...................................................................................... 26 2.2.9 RNA-Transfektion ................................................................................................... 26 2.2.10 DNA-Transfektion mit Lipofectamin .................................................................... 27 2.2.11 Generierung von HCV-Pseudopartikeln ................................................................ 27 2.2.12 Immunfluoreszenz (IF)-Analyse ............................................................................ 27 2.2.13 „Firefly“-Luziferase-Aktivitätsbestimmung .......................................................... 28 2.2.14 Histochemie und Virustitration (TCID50) .............................................................. 28 2.2.15 Dichtegradient ........................................................................................................ 29 3. Ergebnisse ......................................................................................................................... 30 3.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und seiner Komponenten auf die Stabilität und Infektiosität von HCV.................................................................. 30 3.1.1 Testung des Einflusses von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen ................................. 30 3.1.2 Überprüfung der Stabilität von HCV in Gegenwart von Muttermilch zu unterschiedlichen Zeitpunkten............................................................................... 33 3.1.3 Vergleich der Effekte von Muttermilch zu Milchproben anderer Spezies .............. 35 3.1.4 Einfluss vorverdünnter Muttermilch auf HCVcc Infektiosität ................................ 37 3.1.5 Verhalten von Muttermilch bei unterschiedlich langer Vorinkubation in Anund Abwesenheit von HCVcc ............................................................................... 39 3.1.6 Einfluss von verschiedenen Temperaturen und Schütteln auf Muttermilch und ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität ........................................................ 42 3.1.7 Lactoferrin................................................................................................................ 45 3.1.7.1 Einfluss von Lactoferrin auf die HCVpp-Infektiosität ..................................... 47 3.1.8 LL37 und CRAMP ................................................................................................... 49 3.2 Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und EGCG auf die Stabilität und Infektiosität von HCV .............................................. 51 Inhaltsverzeichnis 4 3.2.1 Einfluss von Sperma auf HCV ................................................................................. 51 3.2.1.1 Stabilität von HCVcc in Anwesenheit von Sperma ......................................... 51 3.2.1.2 Langzeitstabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma ............................... 53 3.2.2 Auswirkung von SEVI auf die HCVcc-Infektiosität ............................................... 54 3.2.3 Hepatitis-C-Virus und EGCG .................................................................................. 57 3.2.3.1 Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation ................................................ 57 3.2.3.2 Einfluss von EGCG und seinen Derivaten auf die HCVcc-Infektiosität ......... 59 3.2.3.3 Einfluss von EGCG auf die HCVpp-Infektiosität ............................................ 61 4. Diskussion.......................................................................................................................... 63 4.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und ihrer Komponenten auf die Stabilität und Infektiosität von HCV ........................................................................ 63 4.1.1 Lactoferrin, LL37 und CRAMP ............................................................................... 67 4.2 Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und EGCG auf die Stabilität und Infektiosität von HCV .............................................. 69 4.2.1 Einfluss von SEVI und EGCG ................................................................................. 70 4.3 Ausblick ......................................................................................................................... 73 5. Zusammenfassung ........................................................................................................... 75 6. Literaturverzeichnis........................................................................................................ 77 7. Anhang….…………..………………………………………….………………………………………….90 7.1 Verzeichnisse ................................................................................................................. 90 7.1.1 Abkürzungen ............................................................................................................ 90 7.1.2 Abbildungen ............................................................................................................. 93 7.1.3 Tabellen.................................................................................................................... 94 7.2 Curriculum vitae........................................................................................................... 95 7.3 Danksagung ................................................................................................................... 96 7.4 Eidesstattliche Versicherung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 ...................................... 97 Einleitung 5 1. Einleitung 1.1 Hepatitis C - Überblick Nach Angaben des Robert-Koch-Institutes (RKI) sind 2 bis 3% der Weltbevölkerung Träger des 1989 identifizierten Hepatitis-C-Virus‘ (HCV). Dies entspricht einer Zahl von 120 bis 170 Millionen Menschen, von denen 100 bis 130 Millionen als chronisch infiziert gelten. Mit einer Prävalenz von 0,4% leben von diesen Virusträgern alleine in Deutschland 400.000 bis 500.000 [1]. Wie in Abbildung 1 dargestellt, variiert die weltweite Prävalenz beträchtlich. Prävalenz der HCV-Infektion ≥ 10% 2,5 - 10% 1 - 2,5% 0 - 1% Abbildung 1: Weltweite Prävalenz der HCV-Infektion (adaptiert nach der Weltgesundheitsorganisation, 2003) Bis heute ist einzig der parenterale Übertragungsweg des Virus‘ bekannt. Damit besteht ein großes Infektionsrisiko für Personen mit Blutkontakt jeglicher Art. Dazu gehören insbesondere Empfänger von Bluttransfusionen und Organtransplantaten, Hämodialyse- und Hämophilie-Patienten, intravenös Drogenkonsumierende [2] und medizinisches Personal. Das Risiko einer vertikalen Transmission von der Mutter auf das Kind während der Geburt wird mit 3 bis 5% angeben und ist somit geringer als bei der Hepatitis-B-Infektion. Trotz HCVRNA Nachweis in der Muttermilch ist bisher kein Fall einer Infektion auf diesem Wege dokumentiert worden [3]. Daher wird weder in der Konsensuskonferenz der European Association for the Study of the Liver (EASL), noch von der Nationalen Stillkomission HCV-infizierten Müttern vom Stillen abgeraten [4-5]. Auch in anderen Körperflüssigkeiten wie Speichel, Tränenflüssigkeit, Stuhl, Sperma und Vaginalsekret ist HCV-RNA Einleitung 6 nachgewiesen worden [10-13]. Weiterhin konnte von Alltagsgebrauchsgegenständen die zur Körperhygiene genutzt werden, wie zum Beispiel Zahnbürsten und Rasierklingen, HCV-RNA isoliert werden [14]. Ein dadurch erhöhtes Infektionsrisiko kann bislang nicht belegt werden [15]. So konnten Ciesek et al. kürzlich bestätigen, dass der Nachweis von HCV-RNA auf verschiedenen Oberflächen nicht mit der Infektiosität korreliert [8]. Hingegen konnte Geschlechtsverkehr mit Hepatitis C Virusträgern in mehreren Studien als Risikofaktor für eine Infektion festgestellt werden. Dennoch ist das Ansteckungsrisiko in monogamen Partnerschaften mit <1% sehr gering im Vergleich zu anderen Viren [16-21]. Die Übertragung durch Blutprodukte konnte nach Einführung diagnostischer Tests zum Nachweis von HCV-RNA im Jahre 1990/1991 entscheidend auf ca. 0,004 bis 0,0004% pro transfundierte Einheit reduziert werden [2]. Allerdings wird noch immer aufgrund von Hygienemängeln von Zwischenfällen zum Beispiel bei Hämodialyse- und Koloskopiepatienten berichtet. Auch die Infektionsausbreitung unter Patienten, insbesondere durch die mehrmalige Nutzung von Infusionen und intravenös verabreichten Medikamenten, wird beschrieben [22-26]. Weiterhin besteht im Rahmen der nosokomialen Infektion für medizinisches Personal die Gefahr der Nadelstichverletzung an mit HCV kontaminierten Kanülen. Das Risiko, daraufhin eine HCV-Infektion zu entwickeln, beläuft sich im Durchschnitt auf weniger als 1% und in Europa lediglich auf ca. 0,4% [27]. Am bedeutsamsten für die HCV-(Neu-) Infektion ist der intravenöse Drogengebrauch. Bedingt durch den Usus, das Spritzenbesteck mit anderen Konsumenten zu teilen, werden wahrscheinlich die meisten Neuinfektionen auf diese Weise verursacht [28]. In bis zu 30% aller Fälle gibt es allerdings keinen eindeutigen Hinweis auf den Transmissionsweg [29]. Einen zusammenfassenden Überblick der diversen Ursachen der vor 1990 bzw. nach 1995 erworbenen HCV-Infektion gibt Abbildung 2 wieder. Einleitung 7 HCV-Infektion erworben vor 1990 HCV-Infektion erworben nach 1995 i.v. Drogenkonsum 60% i.v. Drogenkonsum 68% sexuell 15% Transfusion 10% unbekannt 10% andere 1%* beruflich 4% unbekannt 9% andere 1%* sexuell 18% beruflich 4% * „andere“ beinhaltet vertikale sowie im Gesundheitswesen übertragene Infektionen Abbildung 2: HCV-Übertragungswege. Vor 1990 und nach 1995 ist intravenöser Drogenkonsum mit 60% bzw. 68% die Hauptinfektionsquelle. Weitere Transmissionswege wie unbekannt (10% bzw. 9%), andere (1%), beruflich (4%) und sexuell (15% bzw. 18%) bleiben ebenfalls konstant. Alleinig die vor 1990 in 10% der Fälle verursachte Erkrankung durch Transfusionen ist nach 1995 weggefallen. (nach N. Terrault, 2008) 1.2 Diagnostik, Krankheitsverlauf und Therapie Die Hepatitis-C-Virus-Infektion wird in eine akute und eine chronische Infektion unterteilt. Dabei spricht man von einer akuten Hepatitis C, wenn die Infektion zum Diagnosezeitpunkt vor weniger als sechs Monaten erworben wurde. Diese verläuft meistens anikterisch und symptomarm bis völlig inapparent, weshalb sie häufig nicht diagnostiziert wird [15]. Eine Erhöhung der Aminotransferase-Aktivität kann auftreten und zu einer Leberfunktionseinschränkung führen, fulminante Verläufe sind hingegen äußerst selten [3031]. Die Viruslast bleibt in dieser Phase häufig gering. In diversen prospektiven Studien konnte gezeigt werden, dass bei 50 bis 85% der Infizierten das Virus innerhalb der ersten sechs Monate dennoch nicht eliminiert wird [32-35]. Die Erkrankung geht damit per definitionem in ein chronisches Stadium über. Auch in diesem chronischen Stadium bleibt die Erkrankung oftmals vorerst inapparent [15]. Gelegentlich treten unspezifische Symptome wie Müdigkeit, Abgeschlagenheit, Fieber, Inappetenz und Depressionen auf [2]. Bei ca. 40% der Patienten besteht weiterhin keine erhöhte Aminotransferasen-Aktivität. Die Gefahr bei der Einleitung 8 chronischen Verlaufsform besteht in der Entwicklung einer Leberzirrhose einerseits und eines sich oft daraufhin entwickelnden hepatozellulären Karzinoms (HCC) andererseits. Weltweit sind 27% der Leberzirrhosen und 25% der hepatozellulären Karzinome auf eine ursprüngliche HCV-Infektion zurückzuführen [36]. So ist bei 2 bis 35% der Patienten im Krankheitsverlauf von 20 bis 25 Jahren mit einer Leberzirrhose zu rechnen [33, 37]. Bei denen an einer Leberzirrhose im Stadium Child A Erkrankten wiederum, beträgt die jährliche Inzidenz für ein HCC 4% [15]. Darüber hinaus werden mannigfaltige extrahepatische Manifestationen beschrieben. Für den Verlauf der chronischen Hepatitis C sind des Weiteren zahlreiche prognostisch ungünstige Faktoren wie Alter des Patienten, chronischer Alkoholkonsum, virale Koinfektionen und chronische Hämodialyse identifiziert worden [37-44]. Die Diagnostik der Hepatitis-C-Infektion beruht eingangs auf der biochemischen Überprüfung von Leberfunktionsparametern wie der Alanin-Aminotransferase (ALT), der AspartatAminotransferase (AST), der Prothrombin-Zeit sowie u.a. der Albumin- und Globulin-Werte [2]. Befinden sich diese Werte außerhalb der Norm, so sind weiterführende Untersuchungen indiziert. Mittels eines Anti-HCV-Antikörpertests (ELISA) kann eine Infektion bestätigt werden. Allerdings werden Antikörper (Ak) nicht selten erst in der Zeit von sieben bis acht Wochen nach der Primärinfektion nachweisbar. Es empfiehlt sich daher, insbesondere zum Nachweis einer akuten HCV-Infektion, einen Test zum Nachweis von HCV-RNA beim Patienten durchzuführen. Eine Lebersonographie und –biopsie, die Bestimmung der Viruslast und des Genotypus‘, komplettieren schließlich das diagnostische Prozedere. Bisher gelang es nicht einen Impfstoff gegen die HCV-Infektion herzustellen. Das ist der Grund dafür, dass man abgesehen von generellen hygienischen Maßnahmen zur Prävention, nur zum Zeitpunkt einer schon bestehenden Erkrankung intervenieren kann. Ziel einer Therapie der akuten Hepatitis C ist es, möglichst frühzeitig in den Krankheitsprozess einzugreifen, um Chronifizierungen, und die damit verbundene Entwicklung einer Leberzirrhose und eines HCC, zu vermeiden. Es gilt dennoch zu beachten, dass bei zu frühem Therapiebeginn auch solche Patienten mit behandelt werden, bei denen die Infektion ansonsten spontan ausgeheilt wäre. Vorgeschlagen wird in diesem Stadium eine 24wöchige Therapie mit Interferon alpha (IFN-α) oder pegyliertem Interferon alpha (PEG-IFNα) [15]. Einleitung 9 Im chronischen Stadium der Krankheit wird die Therapie mit PEG-IFN-α durch das Guanosinanalogon Ribavirin ergänzt. Hierbei stehen die Vermeidung der oben genannten Folgen der Chronifizierung und die Viruselimination im Vordergrund [15]. Der Therapieerfolg wird schließlich durch die Normalisierung der Leberparameter, die Elimination der HCV-RNA im Blut und eine eventuelle Verbesserung der histologischen Befunde dokumentiert [15]. Die Therapie mit den diversen Medikamenten führt allerdings bei vielen Patienten zu starken Nebenwirkungen. Auch in der Wirksamkeit gibt es Unterschiede. So liegt die Ansprechrate bei den mit Genotyp-2- und -3-Infizierten bei ca. 80%, bei den mit Genotyp-1-Infizierten hingegen nur bei rund 50% [45-48]. 1.3 HCV –Molekularbiologie Das Hepatitis-C-Virus wird der Familie der Flaviviridae zugeordnet und ist innerhalb dieser das einzige Mitglied im Genus Hepacivirus [6]. Die HCV Isolate werden in sieben Genotypen eingeteilt (1-7), bei denen wiederum verschiedene Subtypen unterschieden werden (a,b,c usw.) [49-50]. Weltweit herrschen verschiedene Prädominanzen der Genotypen vor (zum Beispiel Genotyp 1 in den USA und Europa). Die Divergenz in ihrer Nukleotidsequenz beträgt bei den Genotypen ca. 30% und bei den Subtypen ungefähr 20% [51-52]. Die fehlende Korrekturlese-Aktivität der RNA-abhängigen RNA-Polymerase führt zu den genannten Unterschieden und ist letztlich der Grund dafür, dass ständig neue Virus-Mutanten entstehen können. Die zahlreich entstehenden Quasispezies, das heißt die gleichzeitige Existenz mehrerer Varianten des ursprünglichen Virus‘ in demselben Wirtsorganismus, ermöglichen es dem Virus langfristig sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunantwort des Wirtsorganismus‘ zu entgehen. Das HCV-Genom, bestehend aus einer ca. 9600 Nukleotide langen einzelsträngigen RNA positiver Polarität, kodiert für ein sich aus etwa 3000 Aminosäuren zusammensetzendes Polyprotein. Es wird von einem Kapsid (engl. core) umgeben, welches aus mehreren CoreProteinen aufgebaut ist. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kodiert das Genom am 5‘-Ende für eine nicht-translatierte-Region (5‘-NTR), welche zugleich eine interne Ribosomen Bindestelle (IRES) beinhaltet, gefolgt von einem offenen Leserahmen (ORF), der für die Struktur- ebenso wie die Nichtstrukturproteine kodiert, und eine NTR am 3‘-Ende (3‘-NTR). Auf die Spaltung Einleitung 10 des Polyproteins hin entstehen die Strukturproteine, zu denen das Kapsid und die beiden Hüllproteine E1 und E2 gezählt werden. Diese bilden in ihrer Gesamtheit das Viruspartikel. Das RNA-Genom wird schließlich in neue Viruspartikel verpackt. Außerdem entstehen die Nichtstrukturproteine (NS). Dazu zählen die Protease NS2 sowie die zum Replikationskomplex gehörenden NS3, NS4A/B und NS5A/B. Dabei spalten zelluläre Signalpeptidasen die Hüllglykoproteine und das p7-Protein sowie zusätzliche Signalpeptidpeptidasen das Core-Protein. Virale Proteasen (NS2-4A) hingegen spalten die Nichtstrukturproteine. Die Protease NS3 und ihr für die Bindung an das endoplasmatische Retikulum (ER) wichtiger Kofaktor, NS4A, sind für die Genomreplikation essentiell. Das NS4B-Protein nimmt eine führende Rolle bei der Induktion der Replikation am Membran-assoziierterten Replikationskomplex („mebranous web“) ein [53]. Für die Assemblierung und/oder Freisetzung der HCV-Partikel scheinen NS5A und NS2 benötigt zu werden. Entscheidend für die Replikation ist darüber hinaus NS5B, welches als RNA-Polymerase fungiert. Das Protein p7 ist zwischen den Struktur- und den Nichtstruktur-Proteinen lokalisiert und scheint als Ionenkanal zu agieren, der bei der Partikel-Assemblierung und -Freisetzung eine wichtige Rolle spielt [54]. Eine genauere Funktionsweise des Ionenkanals sowie der NS2- und NS5AProteine konnte allerdings noch nicht beschrieben werden. Einleitung 11 Abbildung 3: Organisation und Prozessierung des HCV-Genoms. Das Genom wird sowohl am 5‘- als auch am 3‘-Ende von einer NTR flankiert. Dazwischen befindet sich der für die Struktur (C, E1, E2)- und die Nichtstruktur (N2-NS5B)-Proteine kodierende offene Leserahmen sowie der Ionenkanal p7. Nach der Translation und Prozessierung entstehen die Strukturproteine, die das Viruspartikel bilden und die Nichtstrukturproteine NS3-NS5B, die den Replikationskomplex bilden. Ein weiteres Nichtstrukturprotein, NS2, fungiert als Protease. (adaptiert nach Prof.T.Pietschmann, unveröffentlicht) Der Hepatitis-C-Virus-Zelleintritt ist ein mehrschrittiger Prozess, welcher von der Interaktion der viralen Oberflächenglykoproteine E1 und E2 und multiplen Wirtszellfaktoren abhängt (vgl. Abbildung 4A). Anheftungsfaktoren, zu Hierbei denen interagiert das verschiedene Virus zunächst mit Glykosaminoglykane sogenannten und der Lipoproteinrezeptor niedriger Dichte (LDL-R) gezählt werden [55-57]. So sind der Scavenger Rezeptor Klasse B Typ1 (SR-B1) und das Tetraspanin CD81 in der frühen Phase des Zelleintritts unentbehrlich [58-59]. Bevor das Virus mittels Clathrin-abhängiger Endozytose schließlich in die Zelle aufgenommen wird [60], spielen die „tight-junction“-Proteine Claudin-1 (CLDN1) und Occludin (OCLN1) eine entscheidende Rolle [61-62]. Es konnte festgestellt werden, dass der Eintritt in die Zelle nur stattfindet, wenn alle vier Faktoren (SRB1, CD81, CLDN1, OCLN1) anwesend sind [62]. Nach der Freisetzung der viralen RNA ins Zytoplasma, erfolgt die Replikation des genetischen Materials (vgl. Abbildung 4B). Dies geschieht an Membran-assoziierten Einleitung 12 Replikationskomplexen („membranous webs“), die aus replizierender RNA, viralen Proteinen (NS3-NS5B) und zellulären Membrankomponenten bestehen [53, 63]. Sie befinden sich am rauen endoplasmatischen Retikulum (rER), wo die RNA-Translation initial von der HCV-IRES gesteuert wird. Vermutlich wird die Formierung der Viruspartikel von einer Interaktion des Core-Proteins mit zusätzlichen viralen Proteinen und genomischer RNA induziert [64-65]. Es wird darüber hinaus angenommen, dass die Knospung des Virions in das ER-Lumen hinein stattfindet [66], wo es auch seine Hülle mit den eingelagerten Glykoproteinen E1 und E2 erhält. Da allerdings intrazelluläre Viruspartikel eine andere Dichte aufweisen als extrazelluläre Partikel, wird vermutet, dass die HCV-Partikel während des Zellaustritts einen Reifeprozess durchlaufen, bei dem diese mit Lipoproteinen assoziieren [67-68], bevor sie schließlich über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum entlassen werden. A B Abbildung 4: Modell des HCV-Zelleintritts (A) und des -Replikationszyklus‘ (B). A: Das Virus bindet zunächst an den LDL-Rezeptor. Danach wandert der Virus-Rezeptor-Komplex entlang der Zelloberfläche von der basolateralen Seite, wo es auf SR-B1 und CD81 trifft, zum „tight-junction“ Bereich. Dort befinden sich die Proteine Claudin-1 (CLDN1) und Occludin (OCLN1). Alle vier Rezeptoren sind für den Zelleintritt notwendig. B: Das Virus wird über Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen. Nach der Freisetzung der viralen RNA ins Zytosol wird die Translation von der IRES am rER eingeleitet. Die Replikation findet an Membranassoziierten Replikationskomplexen („membranous webs“) statt. Die Knospung des HCV-Partikels erfolgt vermutlich direkt in das ER-Lumen hinein, bevor die reifen Partikel über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. (nach [69]) Einleitung 13 1.4 HCV-Modellsysteme Der Schimpanse ist bis dato das einzige in-vivo-Tiermodell, welches es zulässt, die Gesamtheit aller Faktoren, sowie die Pathogenese einer HCV-Infektion beim Menschen, zu untersuchen. Denn bisher ist nur dieses Tier für eine HCV-Infektion sowie dessen gesamten Lebenszyklus permissiv. Da der Schimpanse als Versuchstier ethisch umstritten ist, wird an der Entwicklung von Kleintiermodellen gearbeitet. So konnte zuletzt 2001 von Mercer et al. die uPA-SCID Maus entwickelt werden, bei der humanes Lebergewebe implantiert wurde [70]. Auf Grund des fehlenden Immunsystems der Mäuse kann mit Hilfe dieses Kleintiermodells nicht das komplette Erscheinungsbild einer HCV-Infektion reproduziert werden. Zudem ist die Arbeit mit diesem Modell technisch höchst anspruchsvoll. Nicht zuletzt auf Grund des Mangels an einem kompetenten in-vivo- als auch in-vitro-Modell gestaltete sich die Erforschung des Hepatitis-C-Virus‘ lange Zeit als äußerst unbefriedigend. So tasteten sich die Forscher langsam an mögliche Methoden zur näheren Beleuchtung des HCV-Replikationszyklus‘ heran. Ein erster Meilenstein war die Etablierung eines autonom replizierenden subgenomischen Replikons aus dem HCV-Isolat Con1 (Genotyp 1b), die 1999 erstmals Lohmann et al. gelang [71]. Bei diesem System werden die Replikationskomplexe von den Nichtstrukturproteinen gebildet und die RNA-Replikation kann folglich untersucht werden. Nach der Identifizierung Zellkultur-adaptiver Mutationen in den Nichtstrukturproteinen und durch die Auswahl hoch permissiver Zellen wurde das Niveau der RNA-Replikation optimiert [72]. Die Entfernung des Replikons aus einer Zelllinie, durch die Therapie mit Interferon oder HCV-Inhibitoren, führte schließlich zu Zellklonen wie den humanen Hepatomazellen Huh-7.5, die eine noch effizientere RNA-Replikation ermöglichen [73]. Da die Strukturproteine fehlen, erfolgt keine Freisetzung von infektiösen HCVPartikeln. Einen nächsten wichtigen Schritt stellte die Entwicklung von retroviralen HCVPseudopartikeln (HCVpp), die die Hüllproteine E1 und E2 auf ihrer Oberfläche exprimieren [74-76], dar. Diese lassen die Erforschung der frühen Phase der HCV-Infektion und insbesondere des Viruszelleintritts zu, da dieser von den Hüllproteinen vermittelt wird. Der Einfluss von Lipoproteinen auf den Zelleintritt kann hingegen nicht mit diesem System analysiert werden, da die HCVpp nicht mit ihnen assoziiert sind. Produziert werden HCVpp durch Kotransfekion von 293T-Zellen, welche Expressionsvektoren enthalten, die für gagpol-Proteine eines Lentivirus‘ kodieren. Einleitung 14 Die Entdeckung eines HCV Stammes, der in Zellkultur Viren produzieren kann, war schließlich der entscheidende Durchbruch hinsichtlich der Erforschung der HCVPathogenese. Es war der Stamm JFH1 („japanese fulminant hepatitis 1“), der die erstmalige Kultivierung von sowohl in vivo als auch in vitro infektiösen HCV-Partikeln (HCVcell culture (HCVcc)) des Genotyps 2a zuließ [77-79]. Eine Effizienzsteigerung des Zusammenbaus und der Freisetzung von Viruspartikeln konnte von Pietschmann et al. durch die Herstellung der Chimäre Jc1 (Japanese Chimera 1) aus JFH1 und dem Virusisolat J6CF (Genotyp 2a) erzielt werden [80]. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die in vitro produzierten HCV-Partikel sowohl im Schimpansen als auch in der uPA-SCID-Maus zu einer Infektion führen [77, 79]. Die durch Reisolation gewonnen Viren wiederum, erwiesen sich in Zellkultur als infektiös. So konnte das Verhalten von in vivo produzierten HCV-Partikeln erstmals erforscht werden. Zur Quantifizierung einer durch HCVpp oder HCVcc erfolgten Infektion der Wirtszelle stehen, gegenüber den Wildtyp-Viren, Reporterviren zur Verfügung. Geeignete Reporter sind unter anderem das GFP (grün-fluoreszierendes Protein) und die „Firefly“-Luziferase [81-84]. Die Untersuchung der HCVcc-Partikel auf ihre Infektiosität und ihren Virustiter hin, ist mittels der TCID50 (tissue culture infectious dose 50), der Luziferaseaktivität und der zusätzlich abschätzenden Immunfluoreszenz (IF)-Analyse möglich. 1.5 HCV in Verbindung mit Körperflüssigkeiten 1.5.1 Muttermilch Humane Muttermilch ist in Zeiten der künstlich hergestellten Mutterersatzmilch nicht lebensnotwendig, aber dennoch essentiell für den Säugling. Auf Grund ihres Reichtums an Nährwerten, Vitaminen, Antioxidantien und mütterlichen Antikörpern, bietet sie dem Baby einen besonderen Schutz in den ersten Lebensmonaten. Auch im Vergleich zur Milch anderer Tiere, wie zum Beispiel der Stute, scheint die menschliche Muttermilch besonders viele Vitamine zu enthalten. Parallelen können hingegen zu der Kuhmilch gezogen werden, da hier hinsichtlich der Mineralstoffe und Vitamine keine signifikanten Unterschiede bestehen (vgl. Abbildung 5). Einleitung 15 Wasser g 87,5 Mutterersatz milch1 90 Proteine g 1,31 Lipide g Kohlenhydrate Inhaltsstoffe/100ml Einheit Muttermilch Kuhmilch Stutenmilch 87,2 89,7 1,24 3,3 2,2 4,03 3,6 3,8 1,5 g 7 7,4 4,7 6,2 Natrium mg 13 17 45 - Kalium mg 47 68 141 64 Magnesium mg 3 5,7 12 9 Calcium mg 32 43 120 110 Phosphor mg 15 24 92 54 Eisen µg 58 67 59 65 Kupfer µg 72 0,05 7 30 Jod µg 6,3 14 6,1 - Vitamin A µg 69 68 28 12 Thiamin B1 µg 15 8 37 30 Riboflavin B2 µg 38 14 180 30 Vitamin B6 µg 14 5 36 30 Vitamin B12 µg 0,05 24 0,41 0,3 Vitamin C mg 4,4 9,5 1,7 15 Vitamin D µg 0,07 0,93 0,17 - Biotin µg 0,6 1,5 3,5 - Folsäure µg 8,5 9,5 6,4 - Niacin µg 170 59 90 140 Mineralstoffe Vitamine Tabelle 1: Inhaltsstoffe von Muttermilch, Mutterersatzmilch(1Pre Anfangsmilch; Milasan), Kuhmilch und Stutenmilch (nach Forschungsinstitut für Kinderernährung Dortmund und [7]) Es kann noch immer nicht mit Sicherheit gesagt werden, welches Risiko von einer HCVinfizierten stillenden Mutter ausgeht. Eine Studie ergab allerdings, dass sich die Infektionsraten der gestillten (8,3%) und der nicht-gestillten (9,5%) Säuglinge nicht signifikant voneinander unterschieden [85]. Eine weitere Studie konnte nachweisen, dass eine Übertragung des Hepatitis-C-Virus‘ durch das Stillen bei asymptomatischen Patientinnen nicht erfolgte. Symptomatisch Infizierte hingegen, insbesondere solche mit einer hohen Viruslast, schienen in einigen Fällen das Virus auf ihr Kind übertragen zu haben [86]. Weit größer scheint im Vergleich dazu das Risiko einer durch das Stillen bedingten Weitergabe des Einleitung 16 humanen-Immundefizienz-Virus‘ (HIV) zu sein. Literaturangaben zu Folge sind 40% der Fälle einer vertikalen Transmission von HIV-1 auf das Stillen zurückzuführen [87-88]. Trotz des Nachweises von HCV-RNA in Muttermilch wurden jedoch bislang keine Versuche dokumentiert, in denen in einem authentischen Rahmen die Stabilität oder Infektiosität des Virus‘ und die daraus resultierende potentielle Übertragbarkeit von HCV durch Muttermilch untersucht wurde. Bisher ist die Datenlage zu der eventuellen Infektiosität von Muttermilch kontrovers. Den oben beschriebenen Studien zu Folge scheint aber kein immenses Risiko der Infektionsübertragung von dieser Körperflüssigkeit auszugehen. Ziel der Forschung ist es daher, mögliche antiviral wirksame Komponenten der Muttermilch zu identifizieren. So konnten dem Cathelicidin LL37, welches natürlicherweise in humaner Muttermilch enthalten ist, sowie seinem murinen Homolog CRAMP, zumindest diverse antimikrobielle Wirkungsweisen nachgewiesen werden [89-91]. Dieses Cathelicidin zählt zu dem Gen „Cathelicidin antimicrobial peptide“ (CAMP). Über einen potentiellen antiviralen Effekt von LL37 ist allerdings bis dato nichts bekannt. Ein anderer denkbarer Faktor mit antiviraler Aktivität ist humanes Lactoferrin (hLf). Dieses der Familie der Transferrine angehörende Glykoprotein, ist wie LL37 ein natürlicher Bestandteil der Muttermilch. Es fungiert zum einen als Protease und zum anderen als Eisen bindendes Protein [92]. Die natürliche Konzentration von Lf in Muttermilch beträgt ca. 1 mg/ml und ca. 4 mg/ml im Kolostrum bzw. ca. 0,1-0,4 mg/ml in Rindermilch [93-94]. Lactoferrin werden antibakterielle, antimykotische, antivirale, antiparasitäre, antiinflammatorische und antikanzerogene Wirkungen zugesprochen [92, 95-96]. Weiterhin soll Lf ein potenter Inhibitor von einigen nicht- beziehungsweise umhüllten Viren wie z.B. Rotaviren, Enteroviren und Adenoviren sein [96]. Eine Studie konnte belegen, dass Lf auf der Stufe der Virusfusion oder des Viruseintritts die HIV-1Replikation teilweise inhibieren kann [97]. Ikeda et al. zeigten bereits 1998, dass bovines Lactoferrin (bLf) direkt mit dem Hepatitis-CVirus interagiert und somit den Viruseintritt in die Zelle verhindert [98-99]. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass das Virus durch Vorinkubation mit bLf (0,5 mg/ml) neutralisiert wird und damit eine protektive Wirkung gegenüber einer Infektion von humanen PH5CH8Hepatozyten ausübt. Weiterhin wurde der Effekt von Kamel-Lactoferrin (cLf) auf die Infektiosität von HCV untersucht [100]. Auch hier stellten die Wissenschaftler fest, dass die Vorinkubation mit cLf (1 mg/ml) einen inhibitorischen Einfluss sowohl auf den Viruseintritt in die mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMC) als auch der HepG2-Leberzellen bewirkt. Darüber hinaus demonstrierten El-Fakharany et al. mittels einer Polymerase-Ketten- Einleitung 17 Reaktion (RT-PCR), dass cLf in einer Konzentration von 1mg/ml die Replikation des Virus‘ in bereits infizierten PBMCs und HepG2-Zellen verhindern kann. Des Weiteren bindet bLf und hLf in vitro wahrscheinlich an das Hüllprotein E1, vor allem aber an das E2-Protein [101]. Dabei konnten bei der wissenschaftlichen Arbeit mit PH5CH8-Hepatozyten 33 Aminosäuren-Abkömmlinge des hLf identifiziert werden, die die spezifische Bindung an das E2-Hüllprotein bewirken [102]. Folglich kommt es zu einer Verhinderung der Infektion mit dem Virus. Vermutlich besitzt Lf darüber hinaus die Fähigkeit, die Infektiosität von HCVund Vesikular-Stomatits-Virus (VSV) –Pseudopartikeln, die die HCV-Hüllproteine auf ihrer Oberfläche tragen, in humanen HepG2- und PH5CH8-Leberzellen dosisabhängig zu verringern [83, 103-104]. Insbesondere aber das E2-Protein scheint eine zentrale Rolle bei der inhibitorischen Aktivität des Lf einzunehmen. Über die Effizienz einer Therapie mit bLf bei chronisch HCV-Infizierten sind bisher kontroverse Studien veröffentlicht worden. In klinischen Pilotstudien konnten auf der einen Seite einige positive Ergebnisse bei chronischen HCV-Patienten verzeichnet werden [105108]. Auf der anderen Seite erwies sich die Mono- beziehungsweise ergänzende Applikation von bLf in weiteren klinischen Studien als nutzlos, das heißt die Viruslast konnte nicht effizient verringert werden [109-110]. 1.5.2 Samenflüssigkeit und Epigallocatechingallat Der Geschlechtsverkehr mit HCV-Positiven konnte in zahlreichen Studien als Risikofaktor einer Infektion bestätigt werden (vgl. Abb. 2) [17-18]. Man nimmt an, dass die Gefahr mit zunehmender Zahl an Geschlechtspartnern, verletzungsträchtigen Sexualpraktiken [16, 111] und bei homosexuellen Männern, besonders jene mit einer HIV-Koinfektion [112-114], steigt. So gibt es Hinweise dafür, dass sich HCV-RNA in menschlichem Sperma befindet [10, 12-13, 115-117]. Außerdem gelang es 1992 Kotwal et al., virale Antigene in Spermaproben von nicht-A-nicht-B-Hepatitis-Patienten (NANBH) zu isolieren [118]. Allerdings sind auch gegenteilige Forschungsergebnisse publiziert worden, bei denen trotz Seropositivität für HCV-RNA kein Erbmaterial in der Samenflüssigkeit der Patienten nachgewiesen werden konnte [119-120]. Welche Rolle nun die Anwesenheit von HCV-RNA im Sperma bei der Infektionsübertragung einnimmt und welche Relevanz diese hat, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden. Kürzlich wurden sich aus Fragmenten der in Samenflüssigkeit vorkommenden prostatischsauren-Phosphatase (PAP) bildende amyloide Fibrillen entdeckt. Diese Amyloidfibrillen, die sich aus den natürlich und reichhaltig präsenten Fragmenten (PAP 248-286) formen, werden Einleitung 18 auch Semen-derived Enhancer of Virus Infection (SEVI) genannt. Münch et al. [121] konnten zeigen, dass SEVI gezielt HIV-Virionen erkennen und sowohl deren Anheftung an als auch die Fusion mit den Zielzellen fördern. Somit wird der Virustiter um einige Größenordnungen gesteigert. Die Korrelation von der HIV-Viruslast und dem Ausmaß der durch SEVI gesteigerten Infektiosität von Sperma waren dabei invers. SEVI wurde damit als Hauptakteur in der sexuellen HIV-Transmission, die klinisch die größte Relevanz hat, identifiziert. Ebenfalls gelang es Hong et al. durch SEVI gesteigerte Infektionsraten von primärem prostatischen Epithel und Stromazellen mit dem xenotropen-Mäuse-Leukämievirusverwandten Virus nachzuweisen [122]. Daten bezüglich einer möglichen Rolle von SEVI in der sexuellen Übertragung von HCV sind hingegen bislang nicht veröffentlicht worden. Es ist darüber hinaus ein Antioxidans, das Epigallocatechingallat (EGCG) identifiziert worden, das möglicherweise einen inhibitorischen Effekt auf SEVI ausüben kann [123]. EGCG ist ein Catechin, das der Untergruppe der Polyphenole angehört. Es sind bisher drei Derivate von EGCG charakterisiert worden: Epigallocatechin (EGC), Epicatechingallat (ECG) und Epicatechin (EC). EGCG beansprucht den Hauptanteil der in grünem Tee enthaltenen Catechine. In der Literatur werden ihm antikanzerogene, antibakterielle und antivirale Effekte zugesprochen [124-125]. EGCG scheint in der Lage zu sein, native Polypeptidketten zu binden und so die Missbildung zu Amyloidfibrillen, die z.B. neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson zur Folge hätten, zu verhindern [126]. Auch auf die sich in menschlichem Sperma bildenden Amyloidfibrillen (SEVI) hat EGCG wie oben erwähnt möglicherweise einen Einfluss. So fanden Hauber et al. im Kontext ihrer HIV-Forschungstätigkeit kürzlich heraus, dass es SEVI in seiner Aktivität inhibieren und zusätzlich abbauen kann. Dabei griff EGCG dosisabhängig in die Fibrillogenese ein. Die HIV-infektiositätssteigernde Wirkung von SEVI soll demnach durch EGCG vermindert werden [123]. Darüber hinaus konnte eine inhibitorische Aktivität von EGCG gegenüber der HCV NS3Serinprotease nachgewiesen werden [127]. Weitere Forschungsgebiet sind bisher allerdings nicht erlangt worden. Erkenntnisse auf diesem Einleitung 19 1.6 Themenstellung und Ziel der Arbeit Bisher ist die Datenlage bezüglich der klinisch äußerst relevanten Gefahr einer HCVTransmission durch Körperflüssigkeiten und der Nutzen eventueller natürlicher antiviraler Wirkstoffe wenig eindeutig. Zudem ist auf diesem Gebiet noch nicht viel bekannt. Daraus ließen sich folgende Fragestellungen für die vorliegende Arbeit formulieren: 1. Welches Risiko geht von der Muttermilch einer HCV-infizierten stillenden Mutter aus? Ist das Virus in der Muttermilch überhaupt stabil? Gibt es möglicherweise Faktoren in der Muttermilch, die die HCV-Infektiosität vermindern und somit antiviral auf das Virus wirken? Welche könnten diese sein? 2. Wie verhält sich das Virus in Anwesenheit von Samenflüssigkeit und SEVI? Kann die Infektiosität von Sperma, analog zu wissenschaftlichen Befunden bei HIV, durch die sich formenden Amyloidfibrillen gesteigert werden? 3. Welchen Einfluss kann EGCG auf die Infektiosität von HCV nehmen? Zeigt es antivirale Eigenschaften gegenüber dem Virus? Schließlich sollte mit der Abklärung der oben aufgestellten Fragestellungen ein sichererer Umgang mit diesen Körperflüssigkeiten gewährleistet und eine eventuell daraus resultierende sinkende Inzidenz der HCV-Infektion erzielt werden. Darüber hinaus galt es einen möglicherweise antiviral wirksamen Wirkstoff zu identifizieren, der in der Therapie einer bestehenden HCV-Erkrankung von Nutzen seien könnte. Materialien und Methoden 20 2. Materialien und Methoden 2.1 Materialien 2.1.1 Zellen Bakterienstamm E. coli DH5α Genotyp: fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 Säugerzellen Verwendete Zelllinien Huh-7.5 Durch IFN-α geheilte humane Hepatoma Replikon-Zelllinie mit einer Punktmutation im zellulären dsRNA-Sensor, dem durch Retinolsäure-induzierbaren Gen I (RIG-I) [52] 293T ATCC Nummer: CRL-1673. Embryonale Nierenzellen, die das SV40 „largeT“ Antigen exprimieren 2.1.2 Medien Bakterien LB-Medium 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl; 100 mg/ml Ampicillin. Zur Verfestigung kann dem Flüssigmedium 1,5% Agar-Agar zugesetzt werden. 2.1.3 Antikörper Primärantikörper Tabelle 2: Verwendete Primärantikörper Antikörper Spezies α-NS5A_JFH1 (9E10) Maus Typ monoklonal Bemerkungen 1:2000 IF; 1:2 TCID50 Materialien und Methoden 21 Sekundärantikörper Tabelle 3: Verwendete Sekundärantikörper Antikörper α - Maus IgG Spezies 1 α - Maus IgG2 1 Molecular Bemerkungen Ziege Alexa Fluor 488; 1:1000 IF Ziege HRP (horseradish peroxidase); 1:200 TCID50 Probes, Leiden, Niederlande; 2 Sigma, Taufkirchen 2.1.4 Plasmide Tabelle 4: Verwendete Plasmide Name Resistenz Beschreibung pFK-Luc-JFH1/J6/XbaI/C846_dg Ampicillin Bicistronisches Plasmid zur in vitro Transkription des HCV RNA Genoms über die T7-Polymerase. Dabei liegt F-luc im ersten Cistron, gefolgt von einer EMCV pFK-JFH1/J6/C-846_dg Ampicillin Plasmid zur Generierung von Konstrukten voller Länge ohne Reporter pcDNA Ampicillin Expressionsplasmid (Invitrogen) pcZ-J6 Ampicillin Plasmid zur Expression des HCV-Hüllproteins (J6-Genotyp 2a) pcZ-VSV-Gwt Ampicillin Plasmid zur Expression des VSV-Glykoproteins G pHit60 Ampicillin Retrovirales Verpackungsplasmid auf der Basis von MLV (murines Leukämievirus) pRVF-luc Ampicillin Retrovirales Transferplasmid auf der Basis von MLV. Enthält als Reporter die „Firefly“Luziferase Materialien und Methoden 22 2.1.5 Puffer und Lösungen Natriumacetat-Essigsäure-Puffer (Acetatos): 75 ml 0,5 M Natriumacetat; 30 ml 0,5 M Essigsäure; ad 1 Liter Wasser Carbazol-Lösung: 0,4 g 3-Amino-9-ethyl-carbazol in 125 ml N,N-Dimethylformamid Cytomix: 120 mM KCl; 0,15 mM CaCl2; 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,6); 25 mM Hepes (pH 7,6); 2 mM EGTA; 5 mM MgCl2; der pH-Wert der Lösung wurde mit KOH auf 7,6 eingestellt; vor Gebrauch wurde der Lösung 2 mM ATP (Titration auf pH 7,6 mit KOH); 5 mM Glutathion zugesetzt. 2 M Natriumacetat (NaOAc): 16,041 g NaOAc in 100 ml Wasser; pH 4,5 3 M Natriumacetat (NaOAc): 24,61 g NaOAc in 100 ml Wasser; pH 5,2 DNA Ladepuffer (Orange G): (10x Puffer) 16,5 ml 0,15 M Tris/HCL, pH 7,5; 30 ml Glycerol; 3,5 ml H2O + Orange G (0,25 g auf 100 ml, Sigma-Aldrich Cat. No. O-3756). Luziferase Lysepuffer: 1% Triton-x-100; 25 mM Glycyl-Glycin (pH 7,8); 15 mM Magnesiumsulfat; 4 mM EGTA; bei 4°C lagern; vor Gebrauch 1 mM DTT frisch zusetzen. Luziferase Testpuffer: 25 mM Glycyl-Glycin (pH 7,8); 15 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH7,8); 15 mM Magnesiumsulfat; 4 mM EGTA; vor Gebrauch 1 mM DTT und 2 mM ATP frisch zusetzen . Luziferase Substratlösung: 1 mM Luziferinlösung in 25 mM Glycyl-Glycil-Lösung 1:5 mit 25 mM Glycyl-Glycin-Lösung verdünnen. PBS (10-fach): 80 mM Di-Natriumhydrogenphosphat; 20 mM Natrium-di- Hydrogenphosphat; 1,4 M NaCl. TAE (40-fach): 193,82 g Tris-OH; 65,62 g NaAc; 29,78 g EDTA im Wasser lösen; pH mit ca. 50 ml Essigsäure auf 8,3 einstellen und mit Wasser auf 1 l auffüllen. Transkriptionspuffer RRL (5-fach): 400 mM Hepes (pH 7,5); 60 mM MgCl2; 10 mM Spermidin; 200 mM DTT. 0,5 % Triton-X/PBS: 5 ml Triton-X in 1 l 1 x PBS 2.1.6 Muttermilchproben Die Versuche wurden mit drei unterschiedlichen Muttermilchproben (Muttermilch.1/.2/.3) von anonymen, HCV-negativen Spenderinnen durchgeführt. Als Mutterersatzmilch wurde die Pre Anfangsmilch der Marke Milasan verwendet. Stutenmilch: Haflinger, 18 Jahre alt; Kuhmilch: Pool aus Milchproben von 20 Kühen der Rasse Holstein-Friesian; Biestmilch: Holstein-Friesian, ca. 24 h nach dem Kalben. Die Lagerung aller Proben erfolgte bei -20°C. Materialien und Methoden 23 2.1.7 Spermaproben Es wurde mit Spermaproben von sowohl zehn unabhängigen anonymen HCV-negativen Einzelspendern als auch mit einem Spermapool, der sich aus 30 anonymen HCV-negativen Samenspendern zusammensetzte, gearbeitet. Die Bereitstellung des Materials erfolgte durch Prof. Münch (Virologisches Institut, Universitätsklinikum Ulm). Die Lagerung erfolgte bei -20°C. 2.1.8 SEVI SEVI wurde in einem Aliquot in der Konzentration von 10 mg/ml von Prof. Münch (Virologisches Institut, Universitätsklinikum Ulm) zur Verfügung gestellt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 2.1.9 EGCG, EGC, ECG, EC Es wurden Präparate der Firma Sigma-Aldrich benutzt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 2.1.10 Lactoferrin Lactoferrin from human milk, approx. 90% SDS-PAGE; Lactoferrin from bovine milk, approx. 90% by SDS gel-electrophoresis. Es wurden Präparate der Firma Sigma-Aldrich benutzt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 2.2 Methoden Alle Zentrifugationen ohne Angaben eines Rotors wurden in Eppendorf Tischzentrifugen durchgeführt. Es wurden die Modelle 5417C und 5417R verwendet. 2.2.1 Transformation von Bakterien Es wurden 100 µl kompetente Bakterien mit 1 µl Plasmid-DNA für ca. 20 Minuten auf Eis lagernd inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 1,5 Minuten bei 42°C wurden zu jedem Ansatz 500 µl LB-Medium pipettiert. Es folgte eine aerobe Inkubation für 45 Minuten bei 37°C. Danach wurden die Bakterien abzentrifugiert und das entstandene Pellet in 100 µl LB- Materialien und Methoden 24 Medium resuspendiert. Anschließend erfolgte die Ausplattierung der Bakterien auf Selektivnährböden und deren Kultivierung bei 37°C über Nacht. 2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen Zur Präparation von 100 ml E.coli-Kulturen (Midi) wurde das NucleoSpin Plasmid Kit (Machery-Nagel, Düren) nach Angaben des Herstellers verwendet. Es wurde die Übernachtkultur in 50 ml Falcons für zehn Minuten bei 4°C abzentrifugiert (6000UpM; Sorvall RCGPlus, Thermo; Rotor F13S-14x50cy (FiberLite PTI)). Das entstandene Pellet wurde zur Lyse der Zellen in 4 ml A1-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden 4 ml des A2-Lysepuffers, und nach maximal fünf Minuten 4,8 ml des A3Neutralisationspuffers hinzugegeben. Die darauffolgende Zentrifugation wurde für 20 Minuten bei 4°C (12000UpM; Sorvall RCGPlus,Thermo; Rotor F13S-14x50cy (FiberLite PTI)) durchgeführt. Der Überstand wurde abgenommen und auf vier NucleoSpin Plasmid Säulen aufgetragen. Das Lysat wurde zweimal mit je 500 µl des erhitzten (ca. 50°C) AWWaschpuffers und einmal mit 700 µl des A4-Waschpuffers gewaschen. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgte mit je 50 µl AE-Puffer (5mM Tris/HCL, pH 8,5). 2.2.3 In-vitro-Transkription Zunächst mussten die für die in-vitro-Transkription benötigten Transkripte hergestellt werden. Hierzu wurden 10 µg der Plasmide (Jc1 Genom; Jc1 Genom mit „Firefly“Luziferase) für eine Stunde mit MluI (NEB) linearisiert. Es folgte eine DNA Aufreinigung mittels Phenol/Chloroform-Extraktion. Dafür wurde die DNA mit 0,1 Volumen 3 M Natriumazetat (pH 6,0) vermischt und zweimal mit 1 Volumen Phenol, gesättigt mit TrisEthylendiamintetraessigsäure, und einmal mit 1 Volumen Chloroform extrahiert. Die DNA Fällung erfolgte durch Zugabe von 2,5 Volumen 100% Ethanol und einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei -20°C. Die DNA wurde anschließend für 20 Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert. Daraufhin wurde die gefällte DNA mit 80% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 65 µl RNAase-freiem Wasser in Lösung gebracht. Das Gesamtvolumen von 100 µl des Transkriptionsansatzes für die in-vitro-Transkription setzte sich zusammen aus 20 µl 5x RRL-Transkriptionspuffer, 12,5 µl einer 25 mM rNTP Lösung, 100 U RNasin (Promega), 65 µl aufgereinigter und linearisierter DNA-Lösung und 60 U T7-RNA-Polymerase (Promega). Der Ansatz wurde für zwei Stunden bei 37°C inkubiert, anschließend wurden 30 U der T7-Polymerase hinzupipettiert, gefolgt von einer Materialien und Methoden 25 weiteren zweistündigen Inkubation bei 37°C. Schließlich wurde die Transkriptionsreaktion durch die Zugabe von 7,5 U RNase-freier DNase (Promega) und einer erneuten Inkubation von 30 Minuten bei 37°C beendet. Daraufhin wurden 60 µl 2M Natriumazetat (pH 4,5), 440 µl RNase-freies Wasser und 400 µl wassergesättigtes Phenol zugegeben. Der Ansatz wurde für zehn Minuten auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde anschließend für zehn Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde dann in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die RNA nach Zugabe von einem Volumen Chloroform extrahiert. Die Fällung der RNA wurde schließlich durch die Zugabe von 0,7 Volumen Isopropanol erzielt und diese durch Zentrifugation von zehn Minuten bei 20.000 x g bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 50 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen. Die Konzentration der RNA wurde, wie unter 2.2.4 beschrieben, bestimmt und die Intaktheit der in-vitro-Transkripte durch AgaroseGelelektrophorese überprüft. 2.2.4 Auftrennung von DNA und RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese Das Prinzip der Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis von DNA bzw. RNA besteht in der Größenauftrennung ihrer Fragmente im elektrischen Feld. Es wurden hierzu Agarosekonzentrationen von 1% benutzt. Die Agarose (Invitrogen, Karlsruhe) wurde in 1 x TAE-Puffer kurz aufgekocht und anschließend auf ca. 50°C abgekühlt. Die Gele wurden vor dem Gießen mit je 0,01 ml Ethidiumbromid (Stocklösung 10 µg/ml; Roth) auf 100 ml Agaroselösung versetzt. Zu den Proben wurde 1/6 Volumen 6 x Ladepuffer (Orange G; Sigma-Aldrich, Taufkirchen) hinzugefügt. Zur vergleichenden Bestimmung der Anzahl und der Größe der Fragmente wurde ein entsprechender Marker mit bekannten Bandengrößen mit aufgetragen (Lambda-DNA/Eco130/, Fermentas GmbH, St.Leon-Rot). Die Elektrophorese wurde in 1 x TAE-Puffer bei 120 Volt durchgeführt. Die Visualisierung der DNA-Fragmente bzw. der RNA erfolgte unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von 320 nm und deren Dokumentation mit dem Gel iX Imager (UV-Systeme, Intas, Göttingen). 2.2.5 Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren Die Bestimmung der Konzentration von DNA und RNA erfolgte photometrisch mittels eines Photometers bei 260 nm in einer Quarzküvette. Dabei entspricht 1 OD260 50 µg/ml doppelsträngiger DNA und 1 OD260 40 µg/ml RNA. Als Referenz für die Messung diente das entsprechende Lösungsmittel. Materialien und Methoden 26 2.2.6 Kultivierung von Säugerzelllinien Alle in dieser Arbeit benutzten Zelllinien wurden in DMEM cplt Medium bei 37°C in einer H2O-gesättigten 5%-igen CO2 Atmosphäre kultiviert. Die Subkultivierung der Zellen erfolgte entsprechend ihres Wachstumes alle zwei bis vier Tage. Dazu wurde bei konfluenten Zellen das Kulturmedium abgenommen, die Zellen mit sterilem 1 x PBS gewaschen und mit 0,05% Trypsin/0,02% EDTA-Lösung (Gibco; verdünnt mit sterilem PBS) trypsiniert. Nach einer kurzen Inkubationszeit von ca. fünf Minuten konnten die Zellen durch Abklopfen vom Kulturgefäßboden gelöst und in frischem Kulturmedium aufgenommen werden. Die Zellen wurden daraufhin in geringerer Dichte in ein anderes Kulturgefäß ausgesät. 2.2.7 Kryokonservierung von Zellen Ungefähr 106 Zellen wurden in Suspension für fünf Minuten bei 100 x g (Heraeus Multifuge 1SR; Thermo) pelletiert. Die sedimentierten Zellen wurden in Kryolösung (45ml FKS + 5ml DMSO) aufgenommen und auf -80°C abgekühlt. Nach ein bis zwei Wochen wurden sie für die dauerhafte Lagerung zu -150°C überführt. Um die zuvor kryokonservierten Zellen wieder in Kultur zu bringen, wurden diese zunächst in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut, dann in Medium überführt und bei 100 x g (Hereaus Multifuge 1SR; Thermo) für fünf Minuten sedimentiert. Schließlich konnten die Zellen in Medium aufgenommen und in Zellkulturgefäße überführt werden. 2.2.8 Bestimmung der Zelldichte Um die Dichte der Zellen in einer Suspension zu bestimmen, wurde eine Neubauer Zählkammer (LO-Laboroptik, Friedrichsdorf) benutzt. Eine Probe der Zellsuspension wurde in die Zählkammer gegeben und die Anzahl der Zellen in 16 Zählquadraten bestimmt. Das Volumen zwischen Zählkammer und Deckglas beträgt über 16 Quadrate 0,1 µl. Der gezählte Wert multipliziert mit 1 x 104 ergibt somit die Anzahl der Zellen pro ml. 2.2.9 RNA-Transfektion Mittels der Elektroporation wurden die in-vitro-Transkripte in Huh-7.5-Zellen transfiziert. Dafür wurden die Zellen mit 1 x PBS gewaschen, mit 0,05% Trypsin/0,02% EDTA abgelöst und in DMEM cplt Medium aufgenommen. Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer. Das benötigte Zellvolumen wurde für fünf Minuten bei 1000 UpM Materialien und Methoden 27 zentrifugiert, dann mit 1 x PBS gewaschen und erneut für fünf Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer Konzentration von 1,5 x 107 Zellen/ml in 400 µl Zytomix resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 5 oder 10 µg RNA in eine Elektroporationsküvette (0,4 cm Spaltbreite, BioRad, München) überführt und mit einem Gene-Pulser (BioRad) bei 975 µF und 270 Volt elektroporiert. Die Zellsuspension wurde schließlich je nach Experiment in 10 bis 16 ml Medium aufgenommen und ausgesät. Der Zellkulturüberstand wurde nach 48 und 72 Stunden abgenommen und filtriert (Porengröße: 0,45 µm) und je nach Experiment, z.B. zur Herstellung eines Virusstocks, aufkonzentriert (Amicon (Jc1-luc) bzw. Zentricon (Jc1 wt); Millipore). 2.2.10 DNA-Transfektion mit Lipofectamin Die Durchführung der Transfektion mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) erfolgte gemäß Herstellerangaben. 2.2.11 Generierung von HCV-Pseudopartikeln 293T-Zellen wurden mit den Plasmiden pHit60, pRVF-luc und VSV-Gwt im Verhältnis 1:1:1 mit Hilfe von Lipofectamin nach Angaben des Herstellers für die Generierung von MLVbasierten VSV Pseudopartikeln transfiziert. Für die Erstellung MLV-basierter HCV Pseudopartikel wurden die Plasmide pHit60, pRVF-luc und ein Plasmid mit den HCV Hüllproteinen des Isolates J6, ebenfalls im Verhältnis 1:1:1 eingesetzt. Die Inkubation der Zellen erfolgte bei 37°C und 5% CO2. Nach 48 Stunden Inkubationszeit wurden die Zellkulturüberstände abgenommen, filtriert (Porengröße 0,45 µm) und zur Infektion von Huh7.5 Zielzellen benutzt. 2.2.12 Immunfluoreszenz (IF)-Analyse In eine 24-Napf-Platte wurden Huh-7.5-Zellen in einer Dichte von 4 x 104 Zellen/Napf auf Deckgläschen ausgesät. Die Zellen wuchsen für ein bis zwei Tage, bevor sie mit 400 µl 3% Paraformaldehyd für zehn Minuten bei Raumtemperatur fixiert wurden. Vor der Fixierung wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS, nach der Fixierung dreimal mit 1 x PBS gewaschen. Es erfolgte die Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% TritonX-100/PBS. Die diversen Primärantikörper wurden gemäß den Verdünnungen in Tabelle 2 verdünnt. Eine unspezifische Antikörperbindung wird durch die Zugabe von 5% Ziegennormalserum verhindert. Nach Materialien und Methoden 28 einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur erfolgten drei Waschungen mit 1 x PBS und die Zugabe des an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelten Sekundärantikörpers (vgl. Tabelle 3), verdünnt in 1 x PBS mit 5% Ziegennormalserum. Es folgte eine Inkubationszeit im Dunkeln von 30 Minuten, dann eine einmalige Waschung mit 1 x PBS und die Färbung der Zellkerne mit DAPI (4,6-diamino-2-phenylindol-Dihydrochlorid, Molecular Probes). Dazu wurde die DAPI-Lösung 1:3000 (1:300 in H2O, dann 1:10 Verdünnung in PBS) verdünnt und die Zellen mit der Lösung für eine Minute im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die auf Deckgläschen fixierten Zellen dreimal mit PBS und einmal mit Wasser gewaschen, um dann, in Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates) eingebettet, auf Objektträgern fixiert zu werden. Die Immunfluoreszenz-Aufnahmen wurden schließlich an einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX 81) durchgeführt. 2.2.13 „Firefly“-Luziferase-Aktivitätsbestimmung Zellen, die mit HCVcc oder HCVpp infiziert worden waren, wurden mit 1 x PBS gewaschen, in unterschiedlichen Volumina von Lyse-Puffer aufgenommen (für 6-Napf -Platte: 1ml; für 12-Napf-Platte: 350 µl; für 96-Napf-Platte: 35 µl) und bei -20°C eingefroren. Die Zelllysate wurden auf Eis aufgetaut. Bei der 6-bzw. 12-Napf-Platte wurden 100 µl des Lysats mit 360 µl des Probenpuffers versetzt. Mittels eines Luminometers (Lumar LB9507, Berthold) erfolgte die Aktivitätsbestimmung. Nach Injektion von 200 µl 200 mM Luziferinlösung wurde das Substrat von der „Firefly“-Luziferase umgesetzt und die Freisetzung der Photonen für 20 Sekunden gemessen. Bei der 96-Napf-Platte wurden 20 µl des Lysates für die Aktivitätsbestimmung im Mikroplattenluminometer (Berthold Microplate Reader LB 960 Centro XS3; Berthold Technologies DLReady) verwendet. Die Injektion von Probenpuffer und Luziferinlösung erfolgten innerhalb des Gerätes. 2.2.14 Histochemie und Virustitration (TCID50) Dem Verfahren liegt das Protokoll von Lindenbach et al. [128] zur Virustiterbestimmung zu Grunde. Pro Napf einer 96-Napf-Platte wurden 200 µl einer Huh-7.5-Zellsuspension mit 5 x 104 Zellen/ml ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die filtrierten und konzentrierten Überstände der zuvor transfizierten Huh-7.5-Zellen wurden in einer Verdünnungsreihe titriert, wobei sechs Näpfe der naiven Huh-7.5-Zellen pro Verdünnung (1:10) infiziert wurden. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit eisgekühltem Methanol fixiert und für mindestens 20 Minuten bei -20°C gelagert. Das Methanol wurde anschließend Materialien und Methoden 29 entfernt, die Zellen kurzzeitig an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet und dann einmal mit 1 x PBS gewaschen. Es folgte die fünfminütige Permeabilisierung der Zellen mit 50 µl 0,5 % TritonX-100/PBS pro Napf. Daraufhin wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen, um dann für 45 Minuten mit dem Primärantikörper gegen NS5A (vgl. Tabelle 2) bei Raumtemperatur zu inkubieren. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit 1 x PBS gewaschen, um dann für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper α-Maus IgG (vgl. Tabelle 3) zu inkubieren. Es schlossen sich erneut drei Waschgänge mit 1 x PBS an. Zur Detektion wurde das HRP-Substrat aus 5 ml Acetatos, 1,5 Carbazol-Gemisch und 20 µl Wasserstoffperoxid angesetzt und mit einer Porengröße von 0,45 µm gefiltert. Es wurden 30 µl des Substrates pro Napf für die ca. 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur verwendet. Die Reaktion wurde mit Wasser gestoppt. Da NS5Aexprimierende Zellen rot gefärbt werden, konnten diese unter dem Lichtmikroskop identifiziert werden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte statistisch nach der Methode von Kärber und Spearman [129-130]. 2.2.15 Dichtegradient Zwei Tage nach der Elektroporation von HCV-RNA in Huh-7.5-Zellen, wurden die daraufhin produzierten infektiösen Partikel (HCVcc) geerntet, gefiltert (Porengröße: 0,45 µm) und konzentriert (Amicon). Ein Milliliter des Ansatzes wurde so unter einen 0, 10, 20 und 30% Iodixanol Schritt-Gradienten (Optiprep; Axis-Shield, Oslo, Norwegen) geschichtet, dass sich ein Endvolumen von 40% ergab. Dieser wurde hergestellt aus CSM („cell suspension medium“), bestehend aus 0,85% (wt/vol) NaCl und 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,4). Die Gradienten wurde für 16 Stunden bei 30.000 x g und 4°C zentrifugiert (Sorvall Ultra WX80; Rotor TH-641). Die Fraktionen (neun à 1 ml) wurden vom Grund der Röhrchen (12 ml PET Röhrchen; Thermo) geerntet und zur weiteren Infektion von Huh-7.5-Zellen in An- oder Abwesenheit von SEVI verwendet. Die Dichte der Fraktionen wurde mit einem Refraktometer bestimmt. Die Lagerung der Fraktionen erfolgte bei -80°C. Ergebnisse 30 3. Ergebnisse 3.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und seiner Komponenten auf die Stabilität und Infektiosität von HCV Bisher sind in der Literatur, trotz zahlreicher Studien zum Nachweis von HCV-RNA in humaner Muttermilch, keine Angaben zu der eigentlichen Stabilität des Hepatitis-C-Virus‘ in Gegenwart von Muttermilch gemacht worden. Es scheint allerdings so zu sein, dass das Virus nicht oder nur sehr selten durch das Stillen von der Mutter auf ihr Kind übertragen wird [3]. Es stellt sich somit die Frage anheim, welche Gründe es für dieses Phänomen gibt und ob es vielleicht Faktoren in der Muttermilch gibt, die eventuell eine inhibitorische Wirkung auf das Virus haben. Bis dato wurde gezeigt, dass das Eisentransporterprotein Lactoferrin, das einen natürlichen Bestandteil der Muttermilch darstellt, vermutlich einen Einfluss auf die HCVInfektiosität hat [83, 99-100, 102-104]. Ebenfalls sind CAMP, welchen zahlreiche antimikrobielle Eigenschaften nachgewiesen wurden [89-91], in Muttermilch enthalten. Über deren potentielle antivirale Wirkung ist hingegen nichts bekannt. Erst seit kurzem steht ein HCV-in-vitro-System zur Verfügung, welches die authentische Simulation der Virustransmission zulässt. Daher dienten die im folgenden Teil meiner Arbeit durchgeführten Experimente der erstmaligen realitätsnahen Untersuchung der Stabilität des Virus‘ unter verschiedenen Konditionen der Muttermilchpräsenz. Darüber hinaus wurde versucht, die beobachteten Effekte näher einzugrenzen und die verantwortliche(-n) Komponente(-n) der Muttermilch zu identifizieren. 3.1.1 Testung des Einflusses von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen Zu Beginn wurde der Effekt von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen getestet. Dies diente dem Zweck eventuelle Fehlinterpretationen von Versuchsausgängen zu vermeiden, die eine infektionsmindernde Wirkung allein von Muttermilch suggerieren. Dabei könnte jedoch der Effekt schon auf die durch Vorinkubation mit Muttermilch veränderten Hepatozyten zurückzuführen sein. Es sollte somit untersucht werden, ob gewisse Komponenten aus der Muttermilch durch die Leberzellen aufgenommen werden, die dann einen Einfluss auf HCV ausüben. Huh-7.5-Zellen wurden auch für alle weiteren Versuche mit Muttermilch verwendet. Ergebnisse 31 Für den Versuch wurden mindestens 7 h zuvor ausgesäte Huh-7.5-Zellen in einem Verhältnis von 1:10, 1:100 und 1:1000 mit Muttermilch einer Spenderin (Muttermilch.1) für 16 h (Abb. 5D) bei 37°C in einer 5%-igen CO2-Atmosphäre inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen, mit frischem Medium (DMEM cplt) versorgt und mit infektiösen HCVcc (Jc1 Wildtyp (Jc1 wt)) infiziert. Als Kontrolle dienten Huh-7.5-Zellen, die nicht mit Muttermilch vorinkubiert wurden. Der in der Kontrolle erreichte Virustiter ist in Abbildung 5B als rote Linie wiedergegeben. Mittels eines seriellen Verdünnungsassays wurde der Virustiter schließlich analysiert. Die Angabe des Titers erfolgt als „tissue culture infectious dose 50%“ (TCID50/ml). Dabei beschreibt TCID50 die Verdünnung, bei der 50% der jeweils sechs unabhängig inokulierten Zellkulturnäpfe mindestens ein Infektionszeichen zeigen. Der Nachweis wurde durch histochemisches Anfärben des HCV-NS5A-Proteins erzielt. Das experimentelle Prozedere ist modellhaft in Abbildung 5A und das Versuchsergebnis in Abbildung 5B dargestellt. In dem Versuch ließ sich gegenüber den nicht mit Muttermilch vorbehandelten Zellen eine Titerreduktion von vergleichsweise einer Zehnerpotenz in der 1:10-Verdünnung sowie eine minimale Verminderung in den Verdünnungen von 1:100 und 1:10000 beobachten. Ergebnisse 32 A Vorinkubation mit Muttermilch.1 in verschiedenen Konzentrationen für 16 h nach 16 h 72 h Zellen einmal mit 1 x PBS waschen + frisches Medium Jc1-wt titrieren TCID50/ml B Abbildung 5: Einfluss von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen. A: Versuchsaufbau. Huh-7.5-Zielzellen wurden 16 h mit Muttermilch.1 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen, mit neuem Medium (DMEM cplt) versehen und mit Jc1 wt-Virus infiziert. Nach 72 h erfolgte die Bestimmung des Virustiters anhand der TCID50/ml. B: Titerreduktion von ca. 1 Zehnerpotenz (1:10 Verdünnung) bzw. insignifikante Verminderung (1:100, 1:1000 Verdünnung) gegenüber dem Kontrolltiter (nicht mit Muttermilch vorinkubierte Zellen). Der Kontrolltiter ist als rote Linie angegeben. Die y-Achse gibt die Infektiosität in TCID50/ml an. Ergebnisse 33 3.1.2 Überprüfung der Stabilität von HCV in Gegenwart von Muttermilch zu unterschiedlichen Zeitpunkten Da kein signifikanter Effekt der Muttermilch auf die Hepatozyten verzeichnet werden konnte, sollte die Langzeitstabilität von HCV in Gegenwart von Muttermilch in einem nächsten Schritt überprüft werden. Dazu wurden filtrierte und aufkonzentrierte HCVcc (Jc1 wt) zusammen mit Muttermilch einer Spenderin 1, 2, 3, 4 und 7 Tage in einer 1:10 Verdünnung bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und anschließend zur Überprüfung des Virustiters mittels TCID50 titriert. Der Nachweis infizierter Zellen gelang mit Hilfe einer HCV-Histochemie (Abbildung 6A). Dabei waren die Zellen in der ersten und damit niedrigsten Verdünnungsreihe so stark geschädigt worden, dass sie bei der Auswertung nicht mehr zu visualisieren waren. Dieser resultierende Wert ist in den Abbildungen 6B und 6C mit „Zytotoxizität“ angegeben. In den höheren Verdünnungen konnte ebenfalls keine Infektion der Huh-7.5-Zellen festgestellt werden, so dass eine effiziente Infektion naiver Huh-7.5-Zellen in Anwesenheit von Muttermilch nach 24 h nicht mehr möglich zu sein scheint (vgl. Abb. 6B). Um diese Aussage zu überprüfen und die Vergleichbarkeit aller drei Muttermilchproben zu gewährleisten, wurden erneut HCVcc (Jc1 wt) zusammen mit jeweils einer Muttermilchprobe für 24 h bei Raumtemperatur in der gleichen Verdünnung inkubiert und schließlich mittels TCID50 titriert (vgl. Abb. 6C). Es konnte der gleiche Effekt wie im vorherigen Experiment beobachtet werden: Die Zellen in der ersten Verdünnungsreihe waren zu Grunde gegangen und bei den weiteren Verdünnungen konnte keine Zellinfektion detektiert werden. Da das Ergebnis für alle drei Muttermilchproben zutraf, kann von einer Vergleichbarkeit der Proben untereinander ausgegangen werden. In beiden Experimente diente eine Inkubation von Medium (DMEM cplt) mit HCVcc zu gegebenen Zeitpunkten als Kontrolle. Der Virustiter war in beiden Versuchen mit ca. 105 TCID50/ml (Abb. 6B) bzw. 106 TCID50/ml (Abb. 6C) erwartungsgemäß hoch. Ergebnisse 34 A Transfektion Überstandernte Filtration Konzentration Infektion 48, 72 h Jc1 wt Huh-7.5-Zellen TCID50/ml 72 h Muttermilch.1/.2./.3 Inkubation bei RT für 1/2/3/4/7 Tage B C Abbildung 6: Überprüfung der Stabilität von HCV zu unterschiedlichen Zeitpunkten in Gegenwart von Muttermilch. A: Experimentelles Vorgehen. Die nach Transfektion von Huh-7.5-Zellen gewonnenen, filtrierten und konzentrierten HCVcc wurden zusammen mit Muttermilch unterschiedlich lange (vgl. x-Achse) bei RT inkubiert. Es folgte die Infektion von Zielzellen und die Auswertung mittels TCID50/ml. B: Dargestellt ist die Infektiosität nach Inkubation von Muttermilch.1 zusammen mit HCVcc von 1, 2, 3, 4 und 7 Tagen bei RT. Bei den mit Muttermilch versetzten Proben kann nach 24 h keine Infektion mehr detektiert werden. C: Inkubation dreier unterschiedlicher Muttermilchproben zusammen mit HCVcc für 24 h bei RT. Alle drei Proben erwiesen sich als nicht infektiös. Bei den in B und C dargestellten Versuchen konnte ein zytotoxischer Effekt detektiert werden („Zytotoxizität“). In beiden Versuchen diente die Inkubation mit Medium (DMEM cplt) als Kontrolle. Auf die y-Achse ist hierbei jeweils die Infektiosität in TCID50/ml aufgetragen. Ergebnisse 35 3.1.3 Vergleich der Effekte von Muttermilch zu Milchproben anderer Spezies Es sollte im weiteren Verlauf getestet werden, ob sich die humane Muttermilch hinsichtlich des Einflusses auf HCVcc von der artifiziellen Mutterersatzmilch und der Milch anderer Säuger, wie der Kuh oder der Stute, unterscheidet. Da die Zusammensetzung dieser Körperflüssigkeit von Tier zu Tier verschieden ist (vgl. Tabelle 1), ist es möglich, dass jene jeweils andere als die bis dato beobachteten Auswirkungen auf die Stabilität des Virus‘ aufweisen. Es wurden hierfür zusammen mit HCVcc (Jc1 wt) jeweils gleiche Mengen von einer Muttermilchprobe, Mutterersatz-, Kuh-, Stuten- und Biestmilch (Kolostralmilch der Kühe) in einem Verhältnis von 1:10 für 24 h bei RT inkubiert. Anschließend erfolgten die Infektion von naiven Zielzellen und der Nachweis des Infektionsausmaßes mittels HCV-Histochemie (vgl. Abb. 6A). Wie in Abbildung 7 dargestellt, kann bei humaner Muttermilch und Stutenmilch keine Infektion nachgewiesen werden. Hingegen lässt sich bei der Mutterersatzmilch lediglich eine Infektiositätsminderung von weniger als einer halben Zehnerpotenz und bei der Kuh- bzw. Biestmilch von ca. 1 bis 1,5 Zehnerpotenzen beobachten. Alle Milchproben zeigten dennoch eine vergleichbare Zytotoxizität von 1 x 102 bis 1 x 103. Die rote Linie in Abbildung 7 repräsentiert die Kontrolle des Versuches, die wiederum durch Inkubation von DMEM cpltMedium zusammen mit HCVcc erfolgte. Ergebnisse 36 Abbildung 7: Einfluss von Milchproben unterschiedlicher Säugetiere und Mutterersatzmilch auf die HCVStabilität. HCVcc (Jc1 wt) wurden zusammen mit den Proben im Verhältnis 1:10 für 24 h bei RT inkubiert und dann zur Infektion von naiven Zielzellen benutzt (TCID50/ml). Bei Muttermilch.1 und Stutenmilch kann keine Infektion mehr detektiert werden. Hingegen zeigen die Proben von Mutterersatz-, Kuh- und Biestmilch eine geringe Infektionsreduktion von 0,5-1,5 Zehnerpotenzen. Die Mediumkontrolle ist als rote Linie angegeben. Die y-Achse zeigt die Infektiosität in TCID50/ml. Ergebnisse 37 3.1.4 Einfluss vorverdünnter Muttermilch auf HCVcc Infektiosität Mit dem Ziel, die bislang beobachteten Effekte weiter einzugrenzen und somit herauszufinden, ob der Faktor, der zur Infektionsreduktion führt, von der Konzentration abhängig ist, wurde jeweils eine Verdünnungsreihe (1:10; 1:100) der drei Muttermilchproben in 1 x PBS angesetzt. HCVcc wurden anschließend wie gewohnt in einem Verhältnis von 1:10 mit den vorverdünnten Muttermilchproben versetzt und bei RT für 24 h inkubiert, bevor sie zur Zielzelleninfektion gebraucht wurden (vgl. Abb. 6A). Zur vergleichenden Bewertung wurde jeweils eine Kontrolle der unverdünnten Muttermilch und eine Kontrolle mit DMEM cplt-Medium (angezeigt als rote Linie) bzw. 1 x PBS (Kontrolle (PBS)) mitgeführt. Eine Bewertung des Infektionsausmaßes gelang mit Hilfe der TCID50. In Abbildung 8 wird deutlich, dass in einer Verdünnung von 1:10 keine Infektion gemessen werden kann, sondern nur die schon in anderen Experimenten mit unverdünnter Muttermilch beobachtete Zytotoxizität. In einer Verdünnung von 1:100 hingegen kann bei allen drei Muttermilchproben wieder eine Infektion in Abwesenheit von Zytotoxizität detektiert werden. Das Infektionsausmaß ist gegenüber den Kontrollproben dennoch um ca. 2 Zehnerpotenzen (Muttermilch.1) beziehungsweise ca. 3,5 Zehnerpotenzen (Muttermilch.2) beziehungsweise ca. 1-1,5 Zehnerpotenzen (Muttermilch.3) reduziert. Ergebnisse 38 A B C Abbildung 8: Einfluss vorverdünnter Muttermilch auf HCVcc-Infektiosität. Unverdünnte und in 1 x PBS vorverdünnte Muttermilch.1 (8A), Muttermilch.2 (8B) und Muttermilch.3 (8C) wurden für 24 h bei RT mit HCVcc (Jc1 wt) inkubiert. Als Kontrolle diente die Inkubation mit DMEM cplt (rote Linie) und 1 x PBS (Kontrolle (PBS)). Anschließend wurden naive Huh-7.5-Zellen infiziert und der Virustiter mittels Histochemie nachgewiesen. Eine 1:10-Vorverdünnung zeigt keinen Unterschied zu unverdünnter Muttermilch (A-C). Bei einer Vorverdünnung von 1:100 hingegen kann Infektiosität in Abwesenheit von Zytotoxizität detektiert werden. Es besteht allerdings immer noch eine Infektionsreduktion von 2 Zehnerpotenzen (8A) bzw. 3,5 Zehnerpotenzen (8B) bzw. 1-1,5 Zehnerpotenzen (8C). Auf der y-Achse ist die Infektiosität in TCID50/ml aufgetragen. Ergebnisse 39 3.1.5 Verhalten von Muttermilch bei unterschiedlich langer Vorinkubation in An- und Abwesenheit von HCVcc Bisher konnte in den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bei einer 24-stündigen Inkubation keine Infektion mehr nachgewiesen werden. In einem nächsten Schritt sollte daher untersucht werden, bis zu welchem Zeitpunkt HCV in Gegenwart von Muttermilch eventuell noch stabil bleibt. Zudem galt es heraus zu finden, ob es einen Unterschied in der Titerreduktion gibt, je nachdem ob die Muttermilch zunächst ohne oder zusammen mit HCVcc inkubiert wurde. Anhand eines solchen Versuches könnte man die Unterscheidung treffen, ob einerseits die beobachteten Effekte allein auf das Verhalten der Muttermilch gegenüber dem Virus zurückzuführen sind. Das würde bedeuten, dass diese eine effektive Infektion der Zielzellen unterbinden kann. Andererseits wäre es auch denkbar, dass sich die Muttermilch oder ein in ihr enthaltener Faktor schon bei kurzer Inkubation in der Abwesenheit des Virus‘ so sehr verändert, dass ein hoher Virustiter nach Zugabe von HCVcc nicht mehr erreicht werden kann. Es würde sich dabei hinsichtlich der Infektiositätsminderung vielmehr um die passive Auswirkung der Zusammensetzung der Muttermilch auf das Virus, als um eine aktive antivirale Aktivität von Muttermilch gegenüber HCV, handeln. Um diese Unterscheidung vornehmen zu können, wurden parallel zum einen HCVcc (Jc1 wt) und Muttermilch für eine definierte Zeitperiode im Verhältnis 1:10 bei RT inkubiert (vgl. Abb. 9A), zum anderen wurde Muttermilch zuerst allein bei RT für eine bestimmte Zeit stehen gelassen und danach für entweder 1 min oder 1 h mit HCVcc (Jc1 wt) inokuliert und bei RT inkubiert (vgl. Abb. 9B). Bei der verwendeten Muttermilch handelte es sich um die Probe nur einer Spenderin (Muttermilch.3). Als Kontrolle diente jeweils ein Inokulat mit Medium (DMEM cplt). So wurde z.B. je ein Inokulat, bestehend aus Muttermilch und HCVcc, für 31 min oder 1,5 h inkubiert (vgl. Abb.10: „Muttermilch+Virus“). Parallel dazu wurde je eine Muttermilchprobe für 30 min in Abwesenheit des Virus‘ und danach für 1 min oder 1 h in Anwesenheit des Virus‘ inkubiert (vgl. Abb. 10: „Muttermilch+1min/1hVirus“), so dass auch hier eine Gesamtinkubationszeit von 31 min und 1,5 h vorlag. Das gleiche Vorgehen gilt für die jeweiligen Mediumkontrollen (vgl. Abb. 10: „Medium+Virus“ beziehungsweise „Medium+1min/1h Virus“). Alle Proben wurden nach der definierten Inkubationsperiode bei -80°C eingefroren. Erst nach Ablauf aller Inkubationszeiten wurden die Proben zusammen aufgetaut (vgl. Abb. 9C) und gemäß des TCID50/ml-Protokoll titriert. Die Bewertung des Virustiters erfolgte 72 h nach der Infektion (vgl. Abb. 9D). Abbildung 9 gibt den Versuchsaufbau modellhaft wieder. Ergebnisse 40 A B C D Abbildung 9: Versuchsaufbau. Es wurde Muttermilch zusammen mit HCVcc (Jc1 wt) für einen definierten Zeitraum bei RT inkubiert (A) und parallel dazu Muttermilch zuerst für eine bestimmte Zeit bei RT stehen gelassen, bevor HCVcc hinzugefügt wurden und das Inokulat für 1 min oder 1 h bei RT inkubiert wurde (B). Als Kontrolle diente jeweils ein Inokulat mit Medium (DMEM cplt). Alle Proben wurden nach der jeweiligen Inkubationszeit bei -80°C eingefroren (A und B). Nach Ablauf der letzten Inkubationszeit wurden alle Proben aufgetaut (C) und zur Infektion von naiven Zielzellen verwendet (D). Nach 72 h wurde der Virustiter ermittelt (D). Aus der Abbildung 10 geht hervor, dass nach alleiniger 30-minütiger Inkubation von Muttermilch und anschließender Inkubation mit HCVcc für 1 min, eine Infektiositätsminderung von ca. 3 Zehnerpotenzen gegenüber der Medium-Kontrolle beobachtet werden kann. Diese Minderung bleibt nahezu konstant für alle weiteren gemessenen Zeitwerte. Außerdem lässt sich kein Unterschied in der anschließenden Zeit der Inkubation von entweder 1 h oder 1 min der Muttermilch mit HCVcc verzeichnen. Die gleichzeitige Inkubation von Muttermilch zusammen mit HCVcc ergibt ein ähnliches Resultat. Die Titer der Messwerte liegen allerdings von Anbeginn um ca. eine halbe Zehnerpotenz niedriger als die der zuvor vergleichsweise in Abwesenheit inkubierten Muttermilch. Nach ca. 8 h Inkubationszeit ließ sich bei diesen Proben keine Infektion mehr oberhalb der Zytotoxizitätsgrenze ermitteln. Ergebnisse 41 A B Abbildung 10: Verhalten von Muttermilch bei Vorinkubation in An- und Abwesenheit von HCVcc. A: Muttermilch ohne Virus vorinkubiert bei RT für angegebene Zeitperioden. Hinzufügen des Virus‘ für 1 min. B: Muttermilch ohne Virus vorinkubiert bei RT für angegebene Zeitperioden. Hinzufügen des Virus‘ für 1 h. Parallel erfolgte jeweils die gemeinsame Inkubation von Muttermilch und Virus für die gleichen Zeitperioden (A, B). Als Kontrolle dienten jeweils nach dem oben beschriebenen Schema behandelte Mediumproben. Die bei allen Muttermilchproben beobachtete Zytotoxizität ist in den Abbildungen angegeben. Nach 30-minütiger Inkubation von Muttermilch ohne HCVcc und anschließender Inkubation mit HCVcc für 1 min, kann eine Infektiositätsminderung von ca. 3 Zehnerpotenzen gegenüber der Mediumkontrolle beobachtet werden. Diese Minderung bleibt nahezu konstant für alle weiteren gemessenen Zeitwerte. Weiterhin besteht kein Unterschied in der anschließenden Zeit der Inkubation von entweder 1 h oder 1 min der Muttermilch mit HCVcc. Ähnliche Resultate ergibt die gleichzeitige Inkubation von Muttermilch+HCVcc, allerdings liegen die Titer der Messwerte von Anbeginn um ca. eine halbe Zehnerpotenz niedriger als die der zuvor in Abwesenheit inkubierten Muttermilch. Keine Infektion oberhalb der Zytotoxizitätsgrenze ließ sich nach ca. 8 h der Inkubation bei diesen Proben ermitteln. Auf der x-Achse ist die Inkubationszeit in Stunden und auf der y-Achse die Infektiosität, gemessen in TCID50/ml, aufgetragen. Ergebnisse 42 3.1.6 Einfluss von verschiedenen Temperaturen und Schütteln auf Muttermilch und ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität In dem folgenden Teil der Arbeit sollte analysiert werden, ob sich durch das Erhitzen oder Schütteln von Muttermilch etwas in ihrer bisher beobachten Wirkung verändert. Dadurch sollte die nähere Eingrenzung des potentiellen Effektors in Muttermilch gelingen. So spräche eine weniger ausgeprägte Infektionsreduktion nach Erhitzen der Muttermilch dafür, dass ein Protein für die bislang beobachteten Effekte verantwortlich ist. Denn Proteine beginnen bei Temperaturen von etwa 40 bis 80°C zu denaturieren. Darüber hinaus würde durch das Schütteln der Muttermilch das Komplementsystem inaktiviert werden, welches ebenfalls als Effektor in Frage kommt [9]. Für diesen Versuch wurde Muttermilch aller drei Spenderinnen, bzw. DMEM cplt-Medium als Kontrollprobe, in Abwesenheit des Virus‘ für 1 h in verschiedenen Heizblöcken auf 37 bis maximal 99°C erhitzt und teilweise dabei mit 600 rpm („rotations per minute“) geschüttelt. Anschließend wurden, nach Abkühlen der Proben auf RT, infektiöse HCVcc (Jc1 wt) dazu pipettiert und das Inokulat sofort auf naive Huh-7.5-Zellen titriert. Der Infektionsnachweis gelang 72 h später mit Hilfe der histochemischen Färbung des HCVNS5A-Proteins (vgl. Abb. 11). Muttermilch erhitzt +/- Schütteln für 1h Std nach 1 h TCID50/ml + Jc1 wt Infektion 72 h Abbildung 11: Experimentelles Vorgehen. Muttermilch wurde in Abwesenheit von HCVcc für 1 h auf verschiedene Temperaturen, mit oder ohne Schütteln bei 600 rpm, erhitzt. Nach Abkühlen auf RT wurden infektiöse HCV-Partikel dazu pipettiert und das Inokulat sofort auf naive Huh-7.5-Zellen titriert (TCID50/ml). Zum Nachweis einer Infektion wurde 72 h später eine histochemische Färbung durchgeführt. In Abbildung 12 kann man erkennen, dass bei einer Temperatur von 37°C eine Infektiositätsreduktion gegenüber der Mediumkontrolle von ungefähr 2 Zehnerpotenzen stattfindet. Dieses trifft für alle drei getesteten Muttermilchproben zu. Die Reduktion der Infektiosität bleibt im Mittel bei allen Proben bei Temperaturen von bis zu maximal 99°C konstant und verändert sich nicht. Eine Zytotoxizität von 102 ließ sich auch in diesem Ergebnisse 43 Experiment beobachten (vgl. rote gestrichelte Linie). (Die Muttermilchprobe einer Spenderin (Muttermilch.3) wurde aufgrund von Materialmangel nur bis auf 65°C erhitzt). Abbildung 12: Einfluss von verschiedenen Temperaturen auf Muttermilch und ihre Wirkung auf die HCVInfektiosität. Die Muttermilchproben wurden auf Temperaturen zwischen 37 und 99°C erhitzt. Bei allen drei Muttermilchproben ist die Infektiosität bereits bei 37°C um ca. 2 Zehnerpotenzen gegenüber der Mediumkontrolle reduziert. Eine abnehmende Reduktion kann bei steigender Temperatur nicht beobachtet werden. Die beobachtete Zytotoxizität ist in Form einer roten gestrichelten Linie angegeben. (Die Muttermilchprobe einer Spenderin (Muttermilch.3) wurde aufgrund von Materialmangel nur bis auf 65°C erhitzt). Auf der x-Achse ist die Temperatur in °C und auf der y-Achse die Infektiosität, gemessen in TCID50/ml, aufgetragen. Alleiniges vorheriges Erhitzen der Muttermilch auf 37°C führt bei allen Muttermilchproben zu einer Reduktion der Infektiosität von 2 Zehnerpotenzen (Muttermilch.1/.2; Abb. 13A und B) bzw. 3 Zehnerpotenzen (Muttermilch.3; Abb. 13C). Außerdem lässt sich bei einer Erhitzung der Muttermilch auf 37°C und gleichzeitigem Schütteln bei 600 rpm ebenfalls eine Infektiositätsminderung von ca. 2 Zehnerpotenzen (Muttermilch.1/.3; Abb. 13A und C) und von einer Zehnerpotenz (Muttermilch.2; Abb. 13B) beobachten. Damit besteht bei Muttermilch.1 kein Unterschied in den beiden angewendeten Methoden. Bei Muttermilch.2 und Muttermilch.3 führt das Schütteln bei 600 rpm zu einer jeweils um eine Zehnerpotenz weniger ausgeprägten Infektiositätsreduktion. Zusammenfassend ließ sich jedoch keine signifikante verminderte Reduktion der Infektiosität durch das vorherige Erhitzen und/oder Schütteln der Muttermilch beobachten. Ergebnisse 44 A B C Abbildung 13: Einfluss von Schütteln und 37°C auf Muttermilch sowie ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität. A: Muttermilch.1 auf 37°C +/- Schütteln bei 600 rpm erhitzt. Infektiositätsreduktion von ca. 2 Zehnerpotenzen sowohl mit als auch ohne Schütteln. B: Muttermilch.2 auf 37°C +/- Schütteln bei 600 rpm erhitzt. Infektiositätsreduktion von ca. 2 Zehnerpotenzen ohne Schütteln und um eine Zehnerpotenz mit Schütteln. C: Muttermilch.3 auf 37°C +/- Schütteln bei 600 rpm erhitzt. Infektiositätsreduktion von fast 3 Zehnerpotenzen ohne Schütteln und von ca. 2 Zehnerpotenzen mit Schütteln. Es konnte jeweils eine Zytotoxizität von 1 x 102 festgestellt werden. Die y-Achse gibt die Infektiosität in TCID50/ml an. Ergebnisse 45 3.1.7 Lactoferrin Da bisher eine Reduktion der Infektiosität von HCV in Gegenwart von Muttermilch beobachtet werden konnte, sollte der dafür verantwortliche Effektor erforscht werden. Ein natürlicher und großer Bestandteil der Muttermilch ist das Lactoferrin. Deshalb weckt er wissenschaftliches Interesse, vor allem aber hinsichtlich seinen bereits nachgewiesenen unter anderem antiviralen Eigenschaften [92, 95-96]. Daher zielen die Versuche in diesem Abschnitt darauf ab, ein tieferes Verständnis der Wirksamkeit von Lactoferrin auf HCVcc zu erlangen und Lactoferrin als potentiellen Effektor in Muttermilch zu identifizieren. Da man in der Literatur bereits Aussagen darüber findet, dass bLf an HCV bindet und somit den Viruseintritt verhindert [98-99], sollte diese Hypothese im folgenden Teil meiner Arbeit weiterführend und im Rahmen eines authentischen Zellkultursystems überprüft werden. Außerdem galt es, das humane Lactoferrin auf seine eventuelle anti-HCV-Wirkung zu testen. Um eine vergleichende Aussage treffen zu können, wurden äquimolare Mengen von hLf und bLf verwendet. Es wurden in Zellkultur gewonnene, filtrierte und konzentrierte HCVcc (Jc1wt) zusammen mit entweder hLf oder bLf, gelöst in sterilem und destilliertem Wasser, in einem Verhältnis von 1:10 für 24 h bei RT inkubiert. Es wurden Konzentrationen von 0,1 bis 4000 µg/ml (hLf) sowie 1000 bis 4000 µg/ml (bLf) getestet. Als Kontrolle diente die Inkubation von HCVcc mit Medium (DMEM cplt) (vgl. rote Linie in Abb. 14B). Nach der angegebenen Inkubationszeit wurde das Inokulat zur Infektion naiver Zielzellen verwendet. Der Virustiter wurde 72 h später beurteilt. Abbildung 14A zeigt modellhaft den Versuchsaufbau. Wie man in Abbildung 14B erkennen kann, ist der Kontrolltiter mit ca. 107 TCID50/ml erwartungsgemäß hoch. Der Vergleichstiter des hLf-Inokulats liegt bei den Konzentrationen 0,1 bis 10 µg/ml mit etwas mehr als 106 TCID50/ml nicht ganz eine Zehnerpotenz niedriger. Bei den höheren Konzentrationen von 100 bis 4000 µg/ml besteht zum Kontrolltiter ein Unterschied von im Mittel einer Zehnerpotenz. Ähnliches trifft für das bLf-Inokulat zu. Bei einer Konzentration von 1000 µg/ml beträgt der Unterschied zum Mediuminokulat eine Zehnerpotenz. Der Titer nähert sich dem Kontrollwert bei den Konzentrationen von 2000 bis 4000 µg/ml immer weiter an. Weiterhin konnte kein signifikanter Unterschied bei den Ergebnissen des humanen und des bovinen Lactoferrins festgestellt werden. Ergebnisse 46 A Transfektion Überstandernte Filtration Konzentration TCID50/ml Infektion 48, 72 h Jc1 wt Huh-7.5-Zellen 72 h bLf/hLf Inkubation bei RT, 24 h B Abbildung 14: Einfluss von Lactoferrin auf HCVcc-Infektiosität. A:Versuchsaufbau. In vitro produzierte HCVcc (Jc1 wt) wurden zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von bLf oder hLf für 24 h bei RT inkubiert. Anschließend erfolgten die Infektion von Zielzellen und die Virustiterermittlung 72 h später. B: Der Titer des hLf liegt ca. eine Zehnerpotenz unterhalb des Kontrolltiters (Konzentration: 0,1-10 µg/ml). Bei den Konzentrationen von 100-4000 µg/ml beträgt der Titerunterschied im Mittel eine halbe Zehnerpotenz. Der Titer des bLf liegt bei einer Konzentration von 1000 µg/ml ebenfalls eine Zehnerpotenz niedriger. Es folgt eine Annäherung an die Werte des Kontrolltiters (Konzentration: 2000-4000 µg/ml). Der Kontrolltiter ist in Form einer roten Linie angeben. Auf der x-Achse ist die Konzentration von Lactoferrin in µg/ml und auf der y-Achse die Infektiosität in TCID50/ml aufgetragen (B). Ergebnisse 47 3.1.7.1 Einfluss von Lactoferrin auf die HCVpp-Infektiosität Anlass zur Überprüfung des Effektes, den Lactoferrin möglicherweise auf die HCV Pseudopartikel und das VSV-Glykoprotein-G hat, gaben wissenschaftliche Publikationen. So sollen bLf und hLf vornehmlich an das HCV-Hüllprotein E2 binden [101] und eine Dosis abhängige Verringerung der HCVpp- und VSVpp-Infektiosität bewirken [83, 103-104]. Dieser Abschnitt der Arbeit ist daher der erstmaligen Überprüfung des Einflusses von Lactoferrin auf authentische, pseudotypisierte HCV-Partikel in einem etablierten in-vitroSystem gewidmet. Als Negativkontrolle dienten in diesem Versuch der pcDNA Leervektor, als Vergleichsprobe die pseudotypisierten VSV-G-Partikel. Diese werden häufig als Standard verwendet, um die Infektiosität anderer Pseudopartikel zu vergleichen [131]. VSV sind Viren, die sehr viele verschiedene Wirtszellen infizieren können. Um die Infektion quantifizieren zu können, handelt es sich bei den eingesetzten Pseudopartikeln um solche, die das Gen für die „Firefly“-Luziferase enthalten. Für den Versuch wurden daher jeweils pseudotypisierte VSVG- sowie HCV-Partikel (HCVpp; E1E2J6, Genotyp 2a-Isolat) mit humanem Lactoferrin in den Konzentrationen von 0, 2 und 4 mg/ml versetzt und für eine Infektion von naiven Huh7.5-Zellen in einer 12-Napf-Platte verwendet. Nach sechsstündiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde ein Mediumwechsel (DMEM cplt) vorgenommen. Nach 72 h wurde schließlich die „Firefly“-Luziferase-Aktivität in einem Luminometer gemessen. Es kann dadurch eine Aussage über das Ausmaß der Infektion getroffen werden. Das Ergebnis des Versuches ist in Abbildung 15 dargestellt. Die Intensität des Luziferase-Signals ist bei den nicht mit Lactoferrin versehenen Proben am stärksten. Es kann ein sehr schwach ausgeprägter Abfall der Signalstärke bei VSV-G mit zunehmender Konzentration von Lactoferrin beobachtet werden. Im Vergleich zu der unbehandelten Probe sieht man in der mit 2 mg/ml hLf versetzten Probe eine dezente, jedoch insignifikante Signalabnahme bei den HCVpp (E1E2J6). Eine weitere Signalreduktion mit steigender hLf-Konzentration kann hier hingegen nicht verzeichnet werden. Ergebnisse 48 Abbildung 15:Einfluss von Lactoferrin auf HCVpp-Infektiosität. Sehr schwache Signalreduktion bei VSV-G mit steigender hLf-Konzentration. Bei den HCVpp (E1E2J6) hingegen nicht signifikante Dosis abhängige Signalabnahme. Auf der y-Achse ist die Intensität des „Firefly“-Luziferase Signals pro Napf angeben. Ergebnisse 49 3.1.8 LL37 und CRAMP In einem weiteren Schritt sollte der mögliche Effekt von LL37, beziehungsweise seines murinen Homologes CRAMP, auf die Infektiosität von HCVcc überprüft werden. Dieses Cathelicidin hat zahlreiche antimikrobielle Eigenschaften und ist wie das Lactoferrin ein natürlicher Bestandteil der Muttermilch. Es sollte somit im folgenden Teil überprüft werden, ob dieses Peptid möglicherweise antivirale Eigenschaften besitzt und daher als eventueller Effektor in der Muttermilch in Frage kommt. Es wurden hierfür unterschiedliche Endkonzentrationen von LL37 (0 bis 50 µg/ml; Abb. 16A) beziehungsweise von CRAMP (0 bis 5 µg/ml; Abb. 16B) in in vitro generierten HCVcc angesetzt. Das Inokulat wurde für die sofortige Infektion naiver Huh-7.5-Zellen im 12-NapfFormat verwendet. Nach 4 h erfolgte ein Mediumwechsel (DMEM cplt). Die LuziferaseAktivität konnte schließlich 72 h später im Luminometer erfasst werden, da die zuvor verwendeten infektiösen HCV-Partikel das Reportergen für die „Firefly“-Luziferase enthalten. Mit „mock“ wird in diesem Versuch der im Gerät gemessene Hintergrund angeben, das bedeutet das Signal der nicht infizierten Zelllysate. Das Ergebnis der Experimente ist in Abbildung 16 dargestellt. Aus Abbildung 16A geht hervor, dass die Intensität des Luziferase-Signals mit steigender Konzentration von LL37 zunächst um ca. eine halbe Zehnerpotenz zunimmt (2 µg/ml), um dann um weniger als eine Zehnerpotenz im Vergleich zum Kontrollwert (0 µg/ml LL37) abzufallen (10 und 50 µg/ml). Bei demselben Versuchsaufbau mit CRAMP konnte ebenfalls keine signifikante Veränderung in der Luziferase-Signalstärke gegenüber dem Kontrollwert festgestellt werden (vgl. Abb. 16B). Ergebnisse 50 A B Abbildung 16: LL37 und CRAMP. A: LL37. Die Luziferase-Signalstärke bleibt für alle eingesetzten Konzentrationen von LL37 nahezu konstant. Bei einer Konzentration von 2 µg/ml LL37 nimmt die Signalintensität um ca. ein halbe Zehnerpotenz zu. In den Konzentrationen von 10 und 50 µg/ml LL37 nimmt das Signal um weniger als eine Zehnerpotenz gegenüber dem Kontrollsignal ab. B: CRAMP. Die Intensität des Luziferase-Signals verändert sich bei unterschiedlichen Konzentrationen von CRAMP sehr geringfügig gegenüber dem Kontrollsignal. Mit „mock“ ist das Signal der nicht infizierten Zelllysate angegeben. Auf der x-Achse ist die jeweils eingesetzte Konzentration von LL37 (A), beziehungsweise CRAMP (B), und auf der y-Achse die Intensität des LuziferaseSignals aufgetragen. Ergebnisse 51 3.2 Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und EGCG auf die Stabilität und Infektiosität von HCV Im folgenden Teil der Arbeit sollte die Stabilität von HCV in Gegenwart von menschlicher Samenflüssigkeit und des Antioxidans EGCG analysiert werden. Denn bis dato sind hinsichtlich dieser Fragestellungen keine oder nur sehr wenige wissenschaftliche Publikationen gemacht worden. Zurzeit ist einer der wenigen Anhaltspunkte die Entdeckung von Amyloidfibrillen (SEVI) im Sperma, die die Infektiosität des HI-Virus‘ steigern [121]. Darüber hinaus konnten Hauber et al. zeigen, dass EGCG in die Fibrillogenese eingreift und somit die infektionssteigernde Wirkung hemmen kann [123]. Aber auch im Allgemeinen werden EGCG unter anderem antiviral wirksame Eigenschaften zugesprochen [124-125]. Es gilt daher herauszufinden, ob sich diese Erkenntnisse auch auf das Hepatitis-C-Virus anwenden lassen. 3.2.1 Einfluss von Sperma auf HCV 3.2.1.1 Stabilität von HCVcc in Anwesenheit von Sperma Um zu überprüfen, welchen Einfluss menschliche Samenflüssigkeit auf die HCVccInfektiosität hat, wurden in vitro generierte infektiöse HCV-Partikel zusammen mit einer der Spermaproben (Sperma.1-.10; Sperma pool (bestehend aus 30 unterschiedlichen Spenderproben)) in einem Mischverhältnis von 1:10 für 24 h bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte mit Hilfe des Inokulats die Infektion von naiven Huh-7.5-Zellen für 72 h. Als Kontrolle diente ein Inokulat, das anstelle von Sperma mit Medium (DMEM cplt) versetzt worden war (vgl. rote Linie in Abb. 17B). Das Ausmaß der Infektion wurde mittels Färbung des NS5A-Proteins sichtbar gemacht. Abbildung 17A gibt modellhaft den Versuchsaufbau wieder und das Ergebnis des Versuches ist in Abbildung 17B dargestellt. Der Unterschied zwischen dem Titer der verschiedenen Spermaproben und dem Kontrolltiter beträgt ungefähr 1 x 10 bzw. 0 x 10 TCID50/ml und scheint daher nicht signifikant zu sein. Auch zwischen den diversen Proben können, abgesehen von geringfügigen Schwankungen, keine signifikanten Unterschiede verzeichnet werden. Eine Zytotoxizität von ca. 102 konnte bei den mit Sperma inkubierten Proben verzeichnet werden. Ergebnisse 52 A Transfektion Überstandernte Filtration Konzentration TCID50/ml Infektion 48, 72 h Jc1 wt Huh-7.5-Zellen 72 h Sperma Inkubation bei RT (unterschiedliche Zeitwerte) B Abbildung 17: Einfluss von Sperma auf die HCVcc-Infektiosität. A: Versuchsaufbau. In vitro produzierte HCVcc (Jc1 wt) wurden zusammen mit verschiedenen Spermaproben für unterschiedliche Zeitperioden bei RT inkubiert. Anschließend erfolgte die Infektion der Zielzellen und die Virustiterermittlung 72 h später. B: Zehn verschiedene Spermaproben und ein Spermapool wurden auf ihren Einfluss auf die Infektiosität von HCV getestet. Gegenüber dem Kontrolltiter ist für alle Proben nahezu der gleiche Titer (mit Abweichungen von bis zu einer Zehnerpotenz) ermittelt worden. Alle Proben wiesen eine Zytotoxizität von 102 auf. Auf der y-Achse ist die Infektiosität, gemessen in TCID50/ml, aufgetragen. Der Kontrolltiter ist als rote Linie gekennzeichnet. Ergebnisse 53 3.2.1.2 Langzeitstabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma Bis zu diesem Zeitpunkt ließ sich keine Veränderung der Infektiosität von HCV in Gegenwart von Samenflüssigkeit bei 24-stündiger Inkubation feststellen. Zur Testung der Langzeitstabilität von HCV in Gegenwart von Sperma wurde dieses in einem nächsten Experiment für verschiedene definierte Zeiträume zusammen mit HCVcc inkubiert. In einem Mischverhältnis von 1:10 wurden die infektiösen Partikel zusammen mit dem Spermapool für 7/14/21/28 Tage bei RT inkubiert. Ein Mediuminokulat wurde jeweils als Kontrolle eingesetzt. Die Proben wurden nach der jeweiligen Inkubationszeit von 7/14/21/28 Tagen bei -80°C eingefroren, später zusammen aufgetaut und mittels TCID50 titriert. Die Bewertung des Infektionsausmaßes gelang 72 h später mit Hilfe des Anfärbens des NS5A-Proteins. In Abbildung 17A ist der Versuchsaufbau modellhaft angegeben (das Einfrieren der Proben ist nicht aufgeführt) und in Abbildung 18 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Nach sieben Tagen Inkubationszeit kann keine Infektion mehr gemessen werden. Nur eine Zytotoxizität ist bei allen Zeitwerten messbar („Zytotoxizität Sperma (pool)“). Auch der Titer des Kontrollinokulats nimmt über die Zeit ab. So erreicht dieser nach 21 Tagen die untere Messschwelle für die Infektiosität. Abbildung 18: Langzeitstabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma. Inkubation von 7/14/21/28 Tagen. Nach 7 Tagen kann nur Zytotoxizität („Zytotoxizität Sperma (pool)“) in Höhe von 103 und keine Infektion mehr gemessen werden. Dieser Wert bleibt bis zum Tag 28 konstant. Der Titer des Kontrollinokulats nimmt kontinuierlich ab. Dieser hat an Tag 21 die untere Messschwelle für die Infektiosität erreicht. Die x-Achse gibt die Inkubationsdauer in Tagen und die y-Achse die Infektiosität, gemessen in TCID50/ml, an. Ergebnisse 54 3.2.2 Auswirkung von SEVI auf die HCVcc-Infektiosität In diesem Teil der Arbeit sollte die Hypothese, dass SEVI einen Einfluss auf die HCVccInfektiosität nehmen kann, geprüft werden. Es sollte erforscht werden, ob SEVI, ähnlich wie bei dem HI-Virus, in der Lage ist, die Infektiosität von HCV zu steigern. Es wurden hierfür HCVcc (Jc1-luc) zusammen mit SEVI in verschiedenen Endkonzentrationen (0,4 bis 250 µg/ml) jeweils für 4 h bei RT inkubiert. Erst danach erfolgte mit dem Inokulat die Infektion naiver Huh-7.5-Zellen im 96-Napf-Format für 72 h. Als Kontrolle diente ein Mediuminokulat (DMEM cplt) (angezeigt in Form einer roten Linie in Abb. 19). Es wurden jeweils Dreifachansätze pipettiert. Bei den verwendeten HCV-Partikeln handelte es sich in diesem Fall um solche, die das Gen für die „Firefly“-Luziferase enthalten. Das Ausmaß der Infektion konnte somit über die Signalintensität der Luziferase im Mikroplattenluminometer detektiert werden. Dabei wird mit „mock“ (vgl. Abb.19) der im Gerät gemessene Hintergrund angeben, das bedeutet das Signal der nicht infizierten Zelllysate. In Abbildung 19A wurde unverdünntes Viruskonzentrat verwendet. Mit zunehmender SEVIKonzentration lässt sich ein minimaler Anstieg der Infektiosität gegenüber dem Kontrollwert feststellen. Es handelt sich dabei allerdings nur um eine maximale Zunahme einer halben Zehnerpotenz. Zytotoxizität ließ sich in diesem Versuch nicht feststellen. In Abbildung 19B wurde das Viruskonzentrat 1:10 in Medium (DMEM cplt) vorverdünnt. Es sollte dadurch getestet werden, ob nicht bei einem zu hohen Virustiter bereits so viele HCVPartikel existieren, dass eine weitere Anreicherung und damit Steigerung der Infektiosität durch SEVI nicht möglich ist. So fanden auch Münch et al. heraus, dass die größte HIVInfektiositätssteigerung durch SEVI bei niedriger Viruslast erfolgte [121]. Allerdings sieht man in Abbildung 19B, dass kein verändertes Verhalten in der Beeinflussung der HCVInfektiosität eintritt. So kann festgestellt werden, dass sich die maximale Signalstärkezunahme auf weniger als ca. eine halbe Zehnerpotenz im Vergleich zum Kontrollwert beläuft und zudem Schwankungen unterliegt. Erneut konnte in dem Experiment keine Zytotoxizität verzeichnet werden. Ergebnisse 55 A B Abbildung 19: Einfluss von SEVI auf HCVcc-Infektiosität. A: Unverdünntes Virus. Minimale Signalstärkezunahme mit steigender SEVI-Konzentration von max. einer halben Zehnerpotenz. .B: Verdünntes Virus (1:10). Insignifikante Signalstärkezunahme gegenüber dem Kontrollwert, die zudem Schwankungen unterliegt. Auf der y-Achse ist die Luziferase-Signalstärke pro Napf und auf der x-Achse sind die verwendeten Konzentrationen von SEVI in µg/ml aufgetragen. Die rote Linie zeigt jeweils den Mediumkontrollwert an. Das von den nicht infizierten Zelllysaten ausgehende und gemessene Signal wird mit „mock“ bezeichnet. Ergebnisse 56 Da bisher nur eine geringe Zunahme des Luziferase-Signals beobachtet werden konnte, galt es in einem weiteren Schritt herauszufinden, ob SEVI eine stimulierende Wirkung nur auf eine bestimmte Fraktion des Hepatitis-C-Virus‘ hat. Denn es ist bereits bekannt, dass HCV aus Partikeln unterschiedlicher Dichte besteht [132]. Es wurde daher zunächst das Virus (Jc1-luc) mittels eines Dichtegradienten (vgl. 2.2.15) in neun unterschiedlich dichte Fraktionen aufgeteilt. Diese Fraktionen wurden jeweils in einem Doppeltansatz entweder mit SEVI in einer Endkonzentration von 40 µg/ml oder ohne SEVI für 4 h bei RT inkubiert. Nach den 4 h Inkubationszeit wurde das Inokulat für die 72-stündige Infektion von naiven Huh-7.5-Zellen im 96-Napf-Format benutzt. Die Luziferase-Aktivität wurde schließlich im Mikroplattenluminometer gemessen. Das Ergebnis des Versuches ist in Abbildung 20 dargestellt. Die Stärke des Luziferase-Signals weicht bei den zu vergleichenden Proben nur minimal ab. Es scheint daher kein signifikanter Unterschied in der Infektiosität der Viren unterschiedlicher Dichte bei der Inkubation mit oder ohne SEVI zu bestehen. Abbildung 20: HCV-Dichtegradient. Neun verschiedene Fraktionen wurden +/- SEVI inkubiert. Ein Unterschied in der Inkubation +SEVI zu der -SEVI kann nicht verzeichnet werden. Auf der x-Achse ist die im Refraktometer gemessene Dichte der Fraktionen in g/ml und auf der y-Achse ist die gemessene Luziferaseaktivität pro Napf aufgetragen. Ergebnisse 57 3.2.3 Hepatitis-C-Virus und EGCG 3.2.3.1 Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation Die Hypothese, dass EGCG einen inhibitorischen Effekt auf die HCV-Replikation und die Freisetzung infektiöser Partikel ausüben kann, sollte in diesem Versuch getestet werden. Es wurden naive Huh-7.5-Zellen mit für das Reportergen „Firefly“- Luziferase kodierender HCV-RNA transfiziert, um vier Stunden später mit verschiedenen Konzentrationen von EGCG versetzt zu werden (0 bis 100 µg/ml). Nach 48 h der Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde zum einen der Überstand geerntet, filtriert und für die Infektion von naiven Zielzellen verwendet, zum anderen wurde direkt die „Firefly“-Luziferase-Aktivität der Zellen des 48 hWertes gemessen. Die „Firefly“-Luziferase-Aktivität wurde dann auch wiederum nach 48 h von den mit Überstand infizierten Zielzellen gemessen. Somit lässt sich eine Aussage darüber treffen, inwiefern EGCG in die Replikation des Virus‘ eingegriffen hat (Abb.21A) und wie viele infektiöse Partikel trotzdem noch effektiv freigesetzt werden können (Abb. 21B). Abbildung 21A stellt modellhaft den Versuchsaufbau und Abbildung 21B-C die Ergebnisse dar. Nach 48-stündiger Inkubation der in vitro replizierenden Viren zusammen mit EGCG kann bei den eingesetzten Konzentrationen von 1 bis 100 µg/ml kein Unterschied in der Intensität des Luziferase-Signals gegenüber der Kontrollprobe (0 µg/ml EGCG) festgestellt werden. Eine minimale Abschwächung des Signals in der Konzentration von 100 µg/ml EGCG kann als insignifikant gewertet werden (Abb. 21B). Bei der Bestimmung der Luziferase-Aktivität 48 h nach Infektion naiver Zielzellen mit den in Anwesenheit von EGCG produzierten HCVcc, kann eine von der zuvor eingesetzten EGCGDosis abhängige Abnahme des Signals von ca. 1 x 106 auf ca. 1 x 105 beobachtet werden (Abb. 21C). Bei der Dosis von 100 µg/ml EGCG konnte eine Zytotoxizität detektiert werden (Wert im Grafen nicht angezeigt). Ergebnisse 58 A Überstand ernten und filtrieren Transfektion +/- EGCG 4h Huh-7.5-Zellen Infektion naiver Huh-7.5-Zellen 48 h sofort 48 h LuziferaseAssay B C Abbildung 21: Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation und Freisetzung infektiöser Partikel. A: Experimentelles Vorgehen. Huh-7.5-Zellen wurden transfiziert und 4 h später mit verschiedenen Konzentrationen von EGCG versetzt. Nach 48 h wurde der Überstand geerntet, filtriert und für die Infektion von Zielzellen eingesetzt. Schließlich wurde die Luziferase-Aktivität von den Zellen mit dem 48 h-Wert einerseits, und von den naiven Zielzellen 48 h nach der Reinfektion andererseits, gemessen. B: RNA-Replikation. Das Signal der Luziferase (y-Achse) bleibt trotz Inkubation mit EGCG bei den Konzentrationen von 1 und 10 µg/ml (vgl. x-Achse) konstant. Es konnte die gleiche Signalstärke wie für den Kontrollwert detektiert werden. Bei der Inkubation mit EGCG von 100 µg/ml scheint das Signal insignifikant abzunehmen. C: Produktion infektiöser Partikel. Das Luziferase-Signal nimmt abhängig von der zuvor eingesetzten EGCG-Dosis von ca. 1 x 106 auf ca. 1 x 105 ab. Ergebnisse 59 3.2.3.2 Einfluss von EGCG und seinen Derivaten auf die HCVcc-Infektiosität Es sollte in einem nächsten Schritt die Vermutung überprüft werden, dass EGCG einen antiviralen Effekt auf den HCV-Zelleintritt und/oder die -Replikation ausüben kann. Außerdem sollte eine Abgrenzung von den eventuellen Effekten von EGCG gegenüber seinen Derivaten (EGC, ECG, EC) erfolgen. Man könnte daraus Schlüsse ziehen, welche chemische Gruppe des EGCGs für eine Interaktion mit dem Virus benötigt wird. Um diese Hypothese nun zu testen, wurden verschiedene Endkonzentrationen von EGCG (0 bis 100 µg/ml) oder EGC, ECG, EC (0 bis 50 µg/ml) in in vitro generierten infektiösen HCVPartikeln hergestellt. Das Inokulat wurde daraufhin für die Infektion naiver Huh-7.5Zielzellen im 12-Napf-Format benutzt. Nach 4 h erfolgte ein Mediumwechsel (DMEM cplt). Da es sich wiederum um HCVcc handelte, die das Reportergen für die „Firefly“-Luziferase enthalten, konnte dessen Aktivität 72 h später im Luminometer erfasst werden (vgl. Abb. 22A). Es konnte schließlich beobachtet werden, dass die Luziferase-Signalintensität mit steigender Konzentration von EGCG abnimmt (vgl. Abb. 22B und 22C). Ab einer eingesetzten Konzentration von 10 µg/ml entspricht die Signalstärke bereits der des Kontrollwertes zur Messung des Hintergrundes (vgl. Abb. 22B, „mock“, rote Linie). Es konnte darüber hinaus eine Abgrenzung von EGCG gegenüber seinen Derivaten erfolgen. So wurde keine veränderte Signalstärke bei steigenden Konzentrationen von EGC und EC (wirkt ab >10 µg/ml toxisch) festgestellt. Das gleiche trifft für ECG bis zu einer Konzentration von 10 µg/ml zu. Erst in einer Konzentration von 50 µg/ml ECG wird das Signal der Luziferase abgeschwächt (vgl. Abb. 22C). Ergebnisse 60 A Transfektion Überstandernte Filtration Konzentration Infektion 72 h Jc1-luc Huh-7.5-Zellen B Mediumwechsel EGCG/EGC /ECG/EC 4h 72 h LuziferaseAssay C Abbildung 22: Einfluss von EGCG und seinen Derivaten auf HCVcc-Infektiosität. A: Versuchsaufbau. EGCG/EGC/ECG/EC wurde mit in vitro generierten HCVcc versetzt. Es erfolgte die sofortige Infektion naiver Zielzellen. Nach 4 h wurde ein Mediumwechsel vorgenommen. Da die verwendeten HCVcc das Reportergen für die „Firefly“-Luziferase enthalten, konnte 72 h später dessen Aktivität gemessen werden. B: EGCG. Eine von der Dosis abhängige Signalminderung kann beobachtet werden. Beim Einsetzten von 10 µg/ml EGCG geht die Intensität des Signals auf den Vergleichswert zur Messung des Hintergrundes („mock“, rote Linie) zurück. C: EGCG und seine Derivate. Die Intensität des Signals nimmt mit steigender Konzentration von EGCG ab. Bei den Derivaten EGC und EC lässt sich bei den unterschiedlichen Konzentrationen keine Veränderung in der Signalstärke feststellen. EC wirkt toxisch ab einer Konzentration von >10 µg/ml. Bei ECG bleibt das Signal in seiner Intensität bis zur eingesetzten Konzentration von 10 µg/ml ebenfalls konstant bevor es in einer höheren Konzentration abgeschwächt wird. In Abbildung 22 B-C ist auf der x-Achse die Konzentration des verwendeten Stoffes in µg/ml und auf der y-Achse die Intensität des Luziferase-Signals aufgetragen. Ergebnisse 61 3.2.3.3 Einfluss von EGCG auf die HCVpp-Infektiosität In den vorherigen Versuchen dieser Arbeit konnte keine Veränderung in der Signalintensität der „Firefly“-Luziferase bei Betrachtung der HCV-Replikation, jedoch eine verminderte Infektiosität im Zusammenhang des Viruszelleintritts und des kompletten HCVLebenszyklus‘ in Anwesenheit von EGCG, beobachtet werden. Es sollte in diesem Teil der Arbeit daher der eventuelle Einfluss von EGCG speziell auf den Viruseintritt erforscht werden. Für einen solchen Versuch eignet sich daher das HCV-Pseudopartikel-Modellsystem (vgl. 1.4), das insbesondere eine Interpretation des Effekts auf die Hüllproteine E1 und E2 zulässt. Es wurden hierfür jeweils der Leervektor pcDNA, pseudotypisierte VSV-G- sowie HCV-Partikel (E1E2J6) mit EGCG in verschiedenen Endkonzentrationen von 1 bis 100 µg/ml versetzt und für eine Infektion naiver Huh-7.5-Zellen in einer 12-Napf-Platte benutzt. Nach sechsstündiger Inkubation bei 37°C in einer 5%-igen CO2-Atmosphäre erfolgte ein Mediumwechsel (DMEM cplt). Nach 72 h wurde schließlich in einem Luminometer die „Firefly“-Luziferase-Aktivität gemessen. Eine Aussage über das Ausmaß der Infektion kann so getroffen werden. Das Ergebnis des Versuches ist in Abbildung 23 dargestellt. Es scheint ein Dosis abhängiger Zusammenhang zwischen der Luziferase-Signalstärke und der eingesetzten EGCG-Konzentration zu bestehen. So bleibt die Intensität des Signals bei den Konzentrationen von 1 bis 10 µg/ml EGCG gegenüber dem Kontrollwert (0 µg/ml EGCG) zunächst konstant bei Werten von knapp 1 x 107 für die Vergleichsprobe (VSV-G) und bei ca. 1 x 105 für die HCVpp (E1E2J6). Bei den Konzentrationen von 50 und 100 µg/ml EGCG lässt sich allerdings eine zunehmende Abschwächung des Luziferase-Signals sowohl für die Vergleichsprobe als auch für die HCVpp beobachten. Die Signalstärke aller Proben ist bei einer Konzentration von 100 µg/ml EGCG sogar bis auf das Level der Negativkontrolle (pcDNA) reduziert. Ergebnisse 62 Abbildung 23: Einfluss von EGCG auf die HCVpp-Infektiosität. Ab einer Konzentration von 50 µg/ml EGCG nimmt das Luziferase-Signal von der Dosis abhängig sowohl für die Vergleichsprobe (VSV-G) als auch für die HCVpp (E1E2J6) ab. Bei einer Konzentration von 100 µg/ml ist das Signal bis auf das Level der Negativkontrolle (pcDNA) reduziert. Auf der y-Achse ist die Intensität des Luziferase-Signals aufgetragen. Diskussion 63 4. Diskussion Ein weltweit bedeutsames Gesundheitsrisiko stellt die chronische HCV-Infektion mit ca. 120 bis 170 Millionen Virusträgern dar. Neben dem bisher hinreichend beschriebenen parenteralen Übertragungsweg, konnten einige Fälle der sexuellen und vertikalen Transmission verzeichnet werden. Es gelang darüber hinaus, HCV-RNA unter anderem sowohl im Sperma als auch in der Muttermilch HCV-Infizierter zu isolieren. Dabei konnte jedoch weder ein Beweis für, noch ein Mechanismus der Virusübertragung gesichert werden. Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche hatten somit das Ziel, erstmals grundlegende Erkenntnisse über die Stabilität von authentischem HCV in Gegenwart von Sperma und Muttermilch sowie den potentiellen Einfluss dieser Körperflüssigkeiten auf die Infektiosität des Virus‘ zu erlangen. Denn erst seit kurzem steht ein HCV-in-vitro-System zur Verfügung, welches eine Simulation der Virustransmission zulässt [77-79]. In dieser realitätsnahen Form wurden in der Forschung bislang keine Experimente zu der oben formulierten Fragestellung durchgeführt. Dennoch gibt es gegenwärtig Hinweise dafür, dass der in der Muttermilch enthaltene Eisentransporter Lactoferrin einen inhibitorischen Effekt auf die infektiösen Partikel sowie die Pseudopartikel des Virus‘ ausüben kann [83, 99-100, 102-104]. Im Gegensatz dazu wurden Amyloidfibrillen (SEVI) identifiziert, die eine infektiositätssteigernde Wirkung auf das HI-Virus haben [121]. Forschungsarbeiten einer anderen Gruppe zu Folge soll diese Fibrillogenese allerdings durch ein Extrakt aus grünem Tee, dem EGCG, inhibiert werden können [123]. Es wurden daher in dieser Arbeit Untersuchungen angestellt, um jene Hypothesen erstmals im Rahmen eines authentischen HCV-in-vitro-Systems sowie die Übertragbarkeit der oben genannten Ergebnisse auf das Gebiet der HCV-Forschung zu testen. 4.1 Untersuchung des Einflusses von Muttermilch und ihrer Komponenten auf die Stabilität und Infektiosität von HCV Es wurde zunächst sichergestellt, dass nicht die in allen Experimenten benutzten Huh-7.5Zellen schon durch die in dieser Arbeit verwendete Muttermilch beeinflusst werden. Denn andernfalls könnte eine beobachtete infektionsreduzierende Wirkung irrtümlich der Muttermilch allein zugeschrieben werden, obwohl die Effekte auf die Interaktion der durch Muttermilch veränderten Zellen zurückzuführen wären. So wäre es denkbar, dass gewisse Diskussion 64 Komponenten der Muttermilch bei Vorinkubation mit den Hepatozyten von diesen aufgenommen werden. Diese könnten dann bereits einen Einfluss auf die Infektiosität haben. Den in dieser Arbeit generierten Ergebnissen zufolge, kann jedoch eine Wirkung der mit Muttermilch vorinkubierten Hepatozyten auf die Infektiosität ausgeschlossen werden. Die Änderung der Infektiosität zu einem niedrigeren Wert, im Vergleich zu den nicht mit Muttermilch vorinkubierten Zellen, ist äußerst gering. Diese Reduktion könnte auch auf eine eventuelle schlechtere Beschaffenheit der Zellen zum Zeitpunkt der Inkubation zurückzuführen sein. Es muss ferner mit in Betracht gezogen werden, dass in den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen die Zellen nie in derartig hohen Konzentrationen mit Muttermilch inkubiert wurden. Vielmehr wurde Muttermilch jeweils in einem Verhältnis von 10:1 mit HCVcc vorverdünnt und das Inokulat schließlich wiederum in einer Verdünnung von 1:10 auf die Huh-7.5-Zellen gegeben. Alle verzeichneten Effekte sind daher auf eine reine Interaktion der Muttermilch mit HCV, aber nicht eine Wirkung der durch Muttermilch veränderten Hepatozyten, zurückzuführen. In dieser Arbeit konnte erstmalig in einem authentischen Rahmen nachgewiesen werden, dass das Hepatitis-C-Virus bei der gemeinsamen Inkubation mit Muttermilch wenig stabil ist. So führte schon die Inkubation des Inokulats von 24 Stunden bei RT zur Infektiositätsreduktion unterhalb der Zytotoxizitätsgrenze. Diese Zytotoxizität konnte außerdem in nahezu allen weiteren Experimenten reproduziert werden. Sie kann vermutlich mit der oben beschriebenen Wirkung der Muttermilch auf die Wachstumsbedingungen der Huh-7.5-Zellen in der niedrigsten Verdünnung des Assays erklärt werden. Dieses Ergebnis trifft für alle drei getesteten Muttermilchproben gleichermaßen zu. Es ist somit von einer Vergleichbarkeit der verschiedenen Muttermilchproben bei allen folgenden Aussagen auszugehen. Aus diesem Grund wurden weitere Experimente oftmals mit der Probe nur einer Spenderin durchgeführt. Da bereits nach 24 Stunden Inkubationszeit keine Infektion mehr detektiert werden kann, entspricht das Resultat, dass auch im weiteren Inkubationszeitraum von bis zu 7 Tagen keine Infektion messbar ist, den Erwartungen. Allerdings verliert das Virus auch in Abwesenheit von Muttermilch an Stabilität, denn es verliert innerhalb des einwöchigen Inkubationszeitraumes an Infektiosität von einer Zehnerpotenz. Diese Feststellung entspricht aktuellen Forschungsergebnissen [8]. Es konnte folglich belegt werden, dass Muttermilch einen spezifischen Einfluss auf das HCVirus ausübt. Das Virus wird in seiner Stabilität beeinträchtigt und es wird ferner nicht das gleiche Infektiositätsausmaß wie in einer Kontrollprobe ohne Muttermilch erreicht. Diskussion 65 Es wurde im weiteren Verlauf versucht, humane Muttermilch gegenüber Milchproben anderer Tierarten in ihrer Wirkung abzugrenzen. Bislang gibt es auf diesem Gebiet keinerlei Forschungsergebnisse. So konnte in dieser Arbeit erstmalig belegt werden, dass Unterschiede in der Einflussnahme auf die Infektiositätsreduktion zwischen verschiedenen Säugetieren bestehen. Dabei verursachte die Stutenmilch denselben Effekt wie humane Muttermilch, hingegen erwiesen sich Kuh-, Biest- und Mutterersatzmilch nicht als vergleichbar potent bei der Inhibition der Infektiosität. Ein Grund hierfür könnte sein, dass die Zusammensetzung der Milch unterschiedlicher Säuger und artifiziell hergestellter Milch differiert (vgl. Tabelle 1). Daraus lässt sich schließen, dass ein oder mehrere Faktoren, die in der humanen Muttermilch enthalten sind und zur Infektiositätsreduktion führen, nicht oder nur in einer geringeren Konzentration in der Milch anderer Spezies vorkommen. Weiterhin konnte in den durchgeführten Experimenten herausgefunden werden, dass der für die bisher beobachteten Effekte verantwortliche Faktor in der Muttermilch in einem Verhältnis von 1:100 verdünnbar ist. So war eine Infektion der Zielzellen, im Gegensatz zu solchen mit im Verhältnis von 1:10 vorverdünnter Muttermilch versetzten Hepatozyten, wieder detektierbar. Trotzdem besteht in jener Verdünnung noch immer eine verminderte Infektiosität gegenüber einer unverdünnten Mediumkontrollprobe. Dieser Beweis der Instabilität des Virus‘ gelang mit den Muttermilchproben aller drei Spenderinnen gleichermaßen. Jenes Faktum weist daher darauf hin, dass die infektiositätsreduzierende Wirkung von Muttermilch konzentrationsabhängig ist. Von Wichtigkeit war außerdem, eine Unterscheidung zu treffen zwischen der aktiven und der passiven Wirkung von Muttermilch auf HCV. So wäre ein aktiver Prozess auf eine direkte Interaktion der Muttermilch mit dem Virus zurückzuführen. Dafür wurde die Muttermilch jeweils in An- oder Abwesenheit von HCVcc inkubiert. Die zunächst in Abwesenheit von infektiösen Partikeln inkubierten Proben wurden schließlich auch mit HCVcc versehen. Schließlich wurden naive Huh-7.5-Zellen zur Virustiterermittlung mit sämtlichen Inokulaten infiziert. Es konnte dabei ein geringfügiger Unterschied in der Höhe des jeweiligen Titers der unterschiedlich behandelten Proben festgestellt werden. Der plötzliche Titeranstieg bei dem jeweils letzten Zeitwert, der nur für 1 Stunde oder 1 Minute mit HCVcc inkubierten Proben, ist durch die Verwendung einer frischen zuvor bei -80°C gelagerter HCVcc-Probe zu erklären. Für die restlichen Proben wurden bei 4°C gelagerte HCV-Viruspartikel desselben Virusstocks benutzt. Allerdings nimmt die Stabilität des Virus‘ Diskussion 66 trotz Lagerung bei 4°C minimal über die Zeit ab, so dass der Virustiter der nicht mit frischen HCV-Partikeln inkubierten Proben geringer ausfiel. Es ergab sich für die Proben, die zunächst in Abwesenheit von HCVcc inkubiert worden waren, bei fast allen Zeitwerten ein etwas höherer Virustiter als bei solchen, die die komplette Zeitperiode zusammen mit HCVcc inkubiert worden waren. Dennoch ließ sich die schon in vorherigen Experimenten beobachtete verminderte Infektiosität auch in diesen Versuchen nachweisen. Es ist deswegen davon auszugehen, dass die bislang festgestellten Effekte nicht allein auf ein aktives inhibitorisches Verhalten der Muttermilch gegenüber HCV zurückzuführen sind. Daraus ergibt sich ein neuer Blickwinkel für die Resultate der in dieser Dissertation durchgeführten Versuche. Diesen Erkenntnissen zufolge könnte daher eine differenziertere Erklärung für die in den Versuchen resultierende verminderte Infektion der Zielzellen gefunden werden. So könnten ein oder eventuell mehrere Faktoren in der Muttermilch so präsent sein, dass HCVcc bei Zugabe nicht stabil bleibt und folglich keinen hohen Virustiter in den infizierten Zielzellen erzielen kann. Der genaue Mechanismus wird in weiteren Studien zu untersuchen sein. Die Hypothese, dass ein Protein oder das Komplementsystem die möglichen Effektoren in der Muttermilch sind, erwies sich als negativ. So führte das Erhitzen der Muttermilch vor der Inokulation mit HCVcc weiterhin zu einer Reduktion der Infektiosität gegenüber der Kontrollprobe. Es konnte außerdem keine Veränderung oder gar Abnahme in diesem Reduktionsverhalten bei steigenden Temperaturen festgestellt werden. Auch das Schütteln der Muttermilch bei 37°C vor der Inokulation mit HCVcc führte zu keinem anderen Resultat. Die Infektiositätsreduktion gegenüber den Vergleichsproben war nur insignifikant geringer ausgeprägt. Da allerdings ein Erhitzen der Muttermilch auf Temperaturen von ca. 40 bis 80°C Proteine bereits denaturieren lässt und das Schütteln bei 600 rpm das Komplementsystem inaktivieren sollte, ist die anfangs aufgestellte Hypothese in dieser Arbeit widerlegt worden. Allerdings könnte in zukünftigen Arbeiten zur weiteren Absicherung des Ausschlusses eines Proteins als Effektor in der Muttermilch ein Proteaseverdau durchgeführt werden. Dieser würde sowohl zum Verdau von Proteinen als auch von Peptiden, allerdings nicht von HCV, führen. Wenn daraufhin immer noch die gleichen Effekte einer verminderten Infektiosität beobachtet werden könnten, wären diese Komponenten als Effektoren mit endgültiger Sicherheit auszuschließen. Diskussion 67 4.1.1 Lactoferrin, LL37 und CRAMP Der Eisentransporter Lactoferrin macht einen großen Bestandteil der Muttermilch aus und war deshalb als möglicher Effektor dieser Körperflüssigkeit in Betracht zu ziehen. Zudem ist Lf in der Literatur bereits als u.a. antiviral wirksames Molekül beschrieben worden [92, 95-96]. So wurde in einer Studie ein inhibitorischer Effekt des bLf auf HCV gefunden [98-99]. Allerdings wurden in jener Studie PH5CH8-Hepatozyten verwendet. Da es bisher nicht bekannt ist, ob diese Zelllinie über alle für eine HCV-Infektion notwendigen Rezeptoren verfügen, sind die Ergebnisse von Ikeda et al. in Frage zu stellen. Es wäre möglich, dass der von ihnen beobachtete inhibitorische Effekt lediglich auf eine fehlende Infizierbarkeit der Zellen zurückzuführen ist. Auch El-Fakharany und Kollegen publizierten eine Studie der zu Folge cLf den Viruseintritt und dessen Replikation innerhalb der Zelle verhindern sollte [100]. Aufgrund des Benutzens von HepG2-Hepatozyten für sämtliche Versuche sind diese Ergebnisse jedoch eindeutig als insignifikant zu beurteilen. Denn den Zellen dieser Zelllinie fehlt der CD81-Rezeptor, der unabdingbar für den Viruseintritt und folglich der HCVInfektion ist [133]. Für alle in dieser Arbeit durchgeführten Experimente mit Lf wurde hingegen das Huh-7.5-Zellsystem verwendet. Dieses ist nachweislich höchst permissiv für eine HCV-Infektion und es kommen im Gegensatz zu den oben beschriebenen Studien authentische Viren zum Einsatz. Eine Inhibition der Infektion mit HCVcc durch bLf oder hLf gelang aber im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht. Die in den oben beschriebenen Studien beobachteten Effekte von Lf auf HCVcc fanden somit keine Anwendung im Rahmen eines authentischen in-vitro-Systems und müssen daher in Frage gestellt werden. Des Weiteren wurde in anderen Studien augenscheinlich eine besondere Affinität von hLf für das E2-Hüllprotein identifiziert [102]. Es wurden daher Untersuchungen angestellt um herauszufinden, ob Lf damit in der Lage ist die HCVpp-Infektiosität zu vermindern. Diverse Studien führten zu dem Ergebnis, dass bLf die Infektiosität der HCVpp Dosis abhängig verringern kann [83, 103-104]. Allerdings wurden auch in jenen Arbeiten die schon im vorherigen Text diskutierten PH5CH8- sowie HepG2-Leberzellen zur Infektionsdetektion verwendet, womit die Aussagekraft der Versuchsergebnisse äußerst fraglich ist. So fanden diese Hypothesen bei der erstmaligen Verwendung authentischer Viren in einem etablierten in-vitro-System im Rahmen der vorliegenden Arbeit ebenfalls keine Anwendung. Es konnte kein signifikanter Einfluss von hLf auf die HCVpp-Infektiosität verzeichnet werden. Allerdings konnte ein minimaler Effekt des hLf auf die Infektiosität der pseudotypisierten VSV-G-Partikel nachgewiesen werden. Dieses läuft konform mit den im Obigen Diskussion 68 beschriebenen Ergebnissen der allerdings zum Teil in Frage zu stellenden Studien. Der verantwortliche Mechanismus für diese Beobachtung könnte in weiteren Untersuchungen eventuell weiter erforscht werden. Da Lf in dieser Arbeit nicht als der verantwortliche Effektor in Muttermilch identifiziert werden konnte, wurden weitere Bestandteile von Muttermilch, das Cathelicidin LL37 und sein murines Homolog CRAMP, analysiert. Allerdings konnte auch in diesen Versuchen keine signifikante Veränderung des Luziferase-Signals und somit der Infektiosität von HCV beobachtet werden. Somit scheint dieses Cathelicidin zwar antimikrobiell, jedoch nicht antiviral in Bezug auf HCV wirksam zu sein. Es konnte in dieser Arbeit schließlich gezeigt werden, dass weder hLf oder bLf noch LL37 oder CRAMP als potenzielle Inhibitoren der HCV-Infektion in Frage kommen. Dieses stimmt überein mit dem im Rahmen dieser Arbeit vorherigen Ausschließen eines Proteins als möglichen Effektor in der Muttermilch. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich die Stabilität von HCV in konzentrationsabhängiger Anwesenheit humaner Muttermilch, im Gegensatz zu der Milch anderer Tiere und vor allem artifizieller Muttermilch, verändert. Ein eher passiver Mechanismus in der Muttermilch, der außerdem nicht von den Hepatozyten ausgeht, scheint für den infektiositätsmindernden Effekt verantwortlich zu sein. Dabei konnte noch nicht geklärt werden, welcher Bestandteil dieser Körperflüssigkeit für die beobachteten Effekte zuständig ist. Ausgeschlossen werden konnten zumindest das Komplementsystem und Proteine, speziell das Lactoferrin sowie LL37, beziehungsweise CRAMP. Vielleicht könnte in zukünftigen Studien, neben dem oben beschriebenen Proteaseverdau, eine Größen- sowie Phasenauftrennung der Muttermilch erfolgen, um den potentiellen Inhibitor in Muttermilch weiter einzukreisen oder sogar zu identifizieren. Allgemeinhin weisen die Ergebnisse dieser Arbeit auf ein sehr geringes oder eventuell sogar abwesendes Risiko einer in-vivo-Virustransmission durch Muttermilch hin. Diskussion 69 4.2 Erforschung des Einflusses von Samenflüssigkeit, seiner Komponenten und EGCG auf die Stabilität und Infektiosität von HCV Mit dem Zweck zum ersten Mal im Rahmen eines authentischen HCV-in-vitro-Systems erste Erkenntnisse über die Stabilität von HCV in Gegenwart von Sperma oder dessen Einfluss auf die HCV-Infektiosität zu erlangen, wurde zunächst, analog zu den Versuchen mit Muttermilch, der Effekt einer 24-stündigen Inkubation der mit jeweils unterschiedlichen Spermaproben versetzten Inokulate untersucht. Dabei konnte bei keiner der zehn Spermaproben oder bei dem Spermapool ein signifikanter infektiositätsmindernder oder eventuell sogar –steigernder Einfluss festgestellt werden. Das Virus ist somit in der Gegenwart von Sperma vergleichsweise stabil wie in der Anwesenheit von DMEM cpltMedium geblieben. Dieses trifft gleichermaßen für alle getesteten Spermaproben zu, womit von einer inhaltlichen Kohärenz ausgegangen werden kann. Allerdings konnte ähnlich wie bei den Versuchen mit Muttermilch eine geringe Zytotoxizität detektiert werden, die mit einem direkten schädlichen Einfluss der Samenflüssigkeit auf die Huh-7.5-Zellen zu erklären ist. Diese Ergebnisse gehen konform mit wissenschaftlichen Erkenntnissen über die anscheinend häufige Zytotoxizität von Samenflüssigkeit auf Zellen [134-135]. Im weiteren Verlauf wurde versucht, den Zeitraum der Stabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma genauer einzugrenzen. So gelang in dieser Arbeit der Nachweis, dass die HCVcc nur über einen bestimmten Zeitraum von weniger als zumindest 7 Tage bei einer Inkubation mit Sperma stabil bleiben. Dies deutet auf einen Effekt der Samenflüssigkeit auf die HCVcc hin, da die Mediumvergleichsprobe zu jenem Zeitpunkt noch immer einen relativ hohen Virustiter aufweist. Jedoch verliert auch das Virus in Abwesenheit von Sperma an Stabilität, denn es kann nach 28-tägiger Inkubation keine Infektion mehr nachgewiesen werden. Dies läuft konform mit aktuellen wissenschaftlichen Erkenntnissen [8]. Allerdings wurde dieses Experiment nur einmal durchgeführt und sollte zur Bestätigung der Beobachtungen wiederholt werden. Zusammenfassend kann damit festgehalten werden, dass HCV in Gegenwart von Sperma für mindestens 24 Stunden stabil bleibt und somit zumindest potentiell die Transmission des Virus‘ auf dem Weg des Geschlechtsverkehrs denkbar wäre. Jedoch wird in weiteren Studien einerseits herauszufinden sein, warum HCV nur mindestens 24 Stunden in Gegenwart von Samenflüssigkeit stabil bleibt und andererseits, wie die in-vivo-Situation mit Sperma HCVInfizierter zu bewerten ist. Allerdings weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die HCV- Diskussion 70 Transmission bei Kontakt von Samenflüssigkeit mit bestehenden Läsionen des Partners während des Geschlechtsverkehrs möglich ist. 4.2.1 Einfluss von SEVI und EGCG In einer Studie konnten die sich in humanem Sperma bildenden Amyloidfibrillen (SEVI) identifiziert werden, die ferner einen infektiositätssteigernden Einfluss auf das HI-Virus nehmen. Die Steigerung war dabei von der eingesetzten SEVI-Dosis von 1 bis maximal 200 µg/ml abhängig [121]. In der vorliegenden Arbeit wurde daraufhin versucht, diese Erkenntnisse auf das Hepatitis-C-Virus anzuwenden. Jedoch gelang es nicht, einen solchen Effekt von SEVI auf HCV nachzuweisen. Zwar war es möglich, eine geringfügige von der SEVI-Dosis abhängige Zunahme der „Firefly“-Luziferase-Signalstärke bei Verwendung eines unverdünnten Viruskonzentrates zu verzeichnen. Jedoch kann diese Veränderung nicht als signifikant gewertet werden. Es hätte dennoch der Fall seien können, dass HCV durch den hohen Virustiter übersättigt ist und SEVI daher keinen weiteren Einfluss auf dessen Infektiosität nehmen kann. Der Versuch wurde deshalb mit verdünntem Viruskonzentrat wiederholt. So konstatierten auch Münch und Kollegen, dass die HIV-infektionssteigerndePotenz von SEVI bei geringer Viruslast am Größten sei [121]. Aber auch diese auf HCV übertragene Hypothese konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Da ein minimaler Anstieg des „Firefly“-Luziferase-Signals und somit der Infektiosität beobachtet werden konnte, wurde schließlich überprüft, ob SEVI HCV-Partikel bestimmter Dichte beeinflusst. Schließlich konnte bereits bewiesen werden, dass HCV aus Serum unterschiedlicher Dichte besteht [132]. Allerdings konnte im Rahmen dieser Dissertation keine signifikante Einflussnahme von SEVI auf eine der Fraktionen nachgewiesen werden. Die fehlende Übertragbarkeit der bei HIV gefundenen Effekte von SEVI auf HCV könnte damit erklärt werden, dass HCV-Partikel im Gegensatz zu HIV-Partikeln jeweils sehr dicht mit Glykoproteinen ausgestattet sind. Die genaue Dichte der Hüllproteine eines HCVPartikels ist noch nicht bekannt, jedoch konnten Münch et al. kürzlich bestätigen, dass solche Viren mit weniger Hüllglykoproteinen wie HIV-1, HIV-2, verschiedene simiane Immundefizienz Viren, das feline Immundefizienz Virus, Koala Retrovirus, schweineähnliches endogenes Retrovirus, felines Leukämie Virus, murines Leukämie Virus, xenotropes-Mäuse-Leukämievirus-verwandtes Virus sowie Marburg Virus auf die infektiositätssteigernde Wirkung von SEVI ausgezeichnet ansprechen. Hingegen erwiesen sich Viren mit vermutlich sehr dicht ausgestatteten Glykoproteinen wie das Herpes simplex Diskussion 71 Virus-1/-2, Cytomegalie Virus, Hepatitis-B-Virus, Dengue, Respiratory-Syncytial-Virus, VSV sowie das Masern Virus als nicht oder nur geringfügig zugänglich für die durch SEVI verursachten Effekte. Darüber hinaus ergaben Versuche mit unterschiedlichen Quantitäten von VSV-G in HIV-Pseudopartikeln eine inverse Korrelation hinsichtlich der infektiositätssteigernden Wirkung von SEVI. Dabei war der größte Effekt bei der niedrigsten Menge von VSV-G zu beobachten [Prof. Münch, mündliche Mitteilung]. Daher liegt es nahe, dass der Unterschied in dem Wirkungsspektrum von SEVI gegenüber HIV in der Dichte der Hüllglykoproteine der HCV-Partikel und folglich in der Zugänglichkeit der Virusmembran begründet ist. Ferner zählen die HCV-Partikel diesen Ergebnissen zu Folge vermutlich zu solchen mit sehr vielen Hüllglykoproteinen. Hauber und Kollegen veröffentlichten eine Studie, die einen inhibitorischen Effekt des EGCG auf SEVI während einer HIV-Infektion suggerieren [123]. Allerdings ist diese Interpretation ihrer Ergebnisse in Frage zu stellen. So soll EGCG, in den Konzentrationen zwischen 0,625 und 2,5 mM, dosisabhängig in der Lage sein, SEVI, in seiner Eigenschaft die HIVInfektiosität zu steigern, mit großer Effizienz zu antagonisieren. Jedoch handelt es sich dabei lediglich um Effekte die um den Faktor 2 gesteigert sind. Diese können im Allgemeinen nicht als signifikant gewertet werden. Ferner gelang in jener Studie kein Nachweis eines direkten antiviralen Effekts von EGCG gegenüber der HIV-Infektion. Dennoch gaben diese und andere Studien, in denen antivirale Eigenschaften gegenüber anderen Viren des EGCG konstatiert wurden [124-125], Anlass dazu, den potenziellen Einfluss dieses Catechins auf HCV in der vorliegenden Arbeit zu überprüfen. Zunächst wurde der Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation und die Freisetzung infektiöser Partikel getestet. Es konnte mittels des Luziferase-Assay nachgewiesen werden, dass die Replikation der HCV-RNA durch EGCG nicht beeinträchtigt wird. Allerdings konnte bei der anschließenden Überprüfung der Anzahl von den Zellen freigesetzter HCV-Partikel ein geringfügiger Rückgang dieser messbaren Partikel mit zunehmender EGCGKonzentration verzeichnet werden. Scheinbar wird also die Replikation der RNA nicht durch EGCG inhibiert, aber dennoch ist durch die Anwesenheit von EGCG die Sezernierung der neu gebildeten Partikel etwas gestört. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Sachverhalt in einer leichten zytotoxischen Wirkung des EGCGs begründet liegt. Bei der Betrachtung des Einflusses von EGCG sowohl auf den Zelleintritt als auch auf die Replikation von HCV, konnte festgestellt werden, dass EGCG die Infektiosität des Virus‘ inhibiert. So nahm die Intensität des Luziferase-Signals bei steigenden Konzentrationen von EGCG soweit ab bis es unterhalb der Messschwelle lag. Auffällig ist, dass diese Wirkung auf Diskussion 72 HCV nur EGCG hat, nicht aber seine Derivate EGC, ECG oder EC. Lediglich seinem Derivat ECG konnte in dieser Arbeit ein ähnlicher, aber weniger potenter Einfluss auf die Minderung der HCV-Infektiosität nachgewiesen werden. Daher ist es offensichtlich, dass den Derivaten von EGCG eine bestimmte chemische Gruppe vergleichsweise fehlt, um die HCVInfektiosität zu inhibieren. Auch Song et al. gelang es analog dazu, einen inhibitorischen Effekt des EGCGs und des ECGs, nicht aber der weiteren Derivate, auf die Replikation des Influenzavirus‘ und der Neuraminidaseaktivität nachzuweisen. Dabei war auch in jener Studie der Effekt des EGCGs stärker ausgeprägt, als der seines Derivates ECG [136]. Da zwar ein inhibitorischer Effekt des EGCG auf die Infektiosität von HCV, nicht aber auf dessen RNA-Replikation bewiesen werden konnte, lag es nahe, den Einfluss auf den Zelleintritt von HCV genauer zu analysieren. Schließlich könnte durch den Nachweis der Verhinderung des Zelleintritts von HCV durch EGCG die bis dato in dieser Arbeit generierte Datenlage erklärt werden. Es wäre möglich, dass EGCG genau an dieser Stelle in den Mechanismus der Zellinfektion eingreift. Modellhaft wurde zur Überprüfung der aufgestellten Hypothese das HCV-Pseudopartikelsystem benutzt. Da hier nur die HCV-Hüllproteine E1 und E2 vorhanden sind lässt sich eine differenzierte Aussage über den Einfluss von EGCG auf die Effizienz des HCV-Zelleintritts treffen. Tatsächlich bestätigte sich in dieser Arbeit die Vermutung, dass EGCG den HCV-Zelleintritt des Genotyp 2a-Isolates inhibiert. Außerdem wurde ein vergleichbarer Effekt auf pseudotypisierte VSV-G-Partikel festgestellt. Es konnte eine positive Korrelation zwischen der eingesetzten EGCG-Dosis und der Abnahme der Infektiosität nachgewiesen werden. Ein antiviraler Einfluss des EGCG auf das Hepatitis-C-Virus konnte somit erstmals im Rahmen dieser Arbeit mit einem etablierten Zellkultursystem nachgewiesen werden. Dabei war die Inhibition von HCV durch EGCG auf den Viruseintritt in die Zelle beschränkt und allein durch EGCG, nicht aber durch seine Derivate, effektiv möglich. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich die Daten aus der HIV-Forschung bezüglich der die Infektiosität steigernden Amyloidfibrillen nicht auf HCV übertragen lassen. Es gelang in dieser Arbeit nicht, einen solchen Effekt von SEVI auf HCV nachzuweisen. Hingegen konnte erstmals ein antiviraler Einfluss von EGCG auf das Hepatitis-C-Virus bewiesen werden. Durch diese Erkenntnisse wird der eventuell positive sowie unterstützende Einfluss des Konsums von grünem Tee, dessen Hauptbestandteil EGCG ist, auf die HCV-Therapie suggeriert. Darüber hinaus wäre es denkbar ein EGCG-Therapeutikum zu entwickeln, Diskussion 73 insbesondere zum Beispiel für die Reinfektionsprophylaxe nach einer Lebertransplantation bei HCV-Positiven. Dieses wird allerdings noch in weiteren Studien zu erforschen sein. 4.3 Ausblick Die Daten dieser Studie geben erste Einblicke in die potentielle Gefahr der HCVTransmission durch Muttermilch und Samenflüssigkeit. So konnte erstmals im Zusammenhang mit einem authentischen Virus belegt werden, dass sich die Stabilität von HCV in Gegenwart von Muttermilch verändert und die gemeinsame Inkubation daher zu einer Infektiositätsreduktion führt. Allerdings gelang es im Rahmen dieser Dissertation nicht, den verantwortlichen Effektor zu identifizieren. Es konnten lediglich das Komplementsystem, Lactoferrin und LL 37, beziehungsweise murines CRAMP, ausgeschlossen werden. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass die beobachteten Effekte sowohl von der Konzentration als auch der Inkubationszeit der Muttermilch abhängig sind. In einer in-vivo-Situation deuten die generierten Daten auf ein geringes oder sogar abwesendes Risiko, das von dieser Körperflüssigkeit ausgeht, hin. Dennoch konnte in dieser Arbeit die in-vivo-Situation in vitro nur nachgeahmt werden. Daher kann ein Restrisiko der HCV-Übertragung einer infizierten stillenden Mutter auf ihr Baby, z.B. bei bestehenden Läsionen im Mundbereich des Säuglings, nicht ausgeschlossen werden. Diese Annahmen werden bestätigt durch andere Publikationen, bei denen auf der einen Seite eine gesteigerte Infektionsrate der gestillten Säuglinge HCV-positiver Mütter nicht beobachtet werden konnte [85]. Auf der anderen Seite wurde das Virus einiger symptomatisch infizierter Mütter mit hoher Viruslast jedoch durch das Stillen auf ihr Kind übertragen [86]. Es wird somit Aufgabe zukünftiger Forschungsarbeit sein, den genauen Mechanismus der Virusinteraktion von Muttermilch mit dem Ziel zu identifizieren, eine eindeutige Risikoabschätzung treffen sowie eine Evidenz basierte Empfehlung an HCV-infizierte stillende Mütter aussprechen zu können. In der Anwesenheit von Sperma hingegen konnte im Rahmen dieser Arbeit, zudem erstmals mit Hilfe eines authentischen in-vitro-Systems, eine zumindest 24-stündige unveränderte Stabilität von HCV nachgewiesen werden. Daraus kann geschlossen werden, dass die Virustransmission durch ungeschützten Geschlechtsverkehr, vor allem beispielsweise bei Kontakt der Samenflüssigkeit mit vorhandenen Wunden, möglich ist. Dies wird bestätigt durch weitere Studien, in denen Geschlechtsverkehr mit HCV-Positiven und insbesondere Diskussion 74 verletzungsintensiven Sexualpraktiken als Risikofaktor der HCV-Transmission identifiziert wurden [16-18, 111]. Allerdings ließ sich eine etwaige Potenzierung der Infektiosität dieser Körperflüssigkeit zum Beispiel durch SEVI, wie es bei HIV herausgefunden wurde, ausschließen [121]. Erstmalig konnte weiterhin in der vorliegenden Arbeit EGCG als potentieller Inhibitor des Hepatitis-C-Virus‘ identifiziert werden. Dabei schien der Effekt des Catechins auf eine Inhibition des Viruseintritts zurückzuführen zu sein. Eventuell wäre es möglich, in zukünftigen Studien den genauen Mechanismus der Interaktion mit den HCV-Hüllproteinen zu analysieren und gleichzeitig den entscheidenden Unterschied in der chemischen Struktur des EGCG gegenüber seinen Derivaten zu identifizieren. Da EGCG nun einen Hauptbestandteil des grünen Tees darstellt, wäre es außerdem denkbar, dass dieser Tee einen positiven Einfluss auf die Viruslast HCV-Infizierter nimmt. An dieser Stelle müsste die invivo-Bedeutung der Applikation von grünem Tee in der HCV-Therapie allerdings noch eruiert werden. Ebenfalls muss die Möglichkeit der Entwicklung eines EGCG-Therapeutikums, zum Beispiel in Form einer Tablette, überprüft werden. So könnte EGCG als vermutlicher HCVZelleintritt-Inhibitor sehr nützlich in der Therapie von HCV-Patienten und vor allem in der Reinfektionsprophylaxe HCV-positiver Lebertransplantierter sein. Zusammenfassung 75 5. Zusammenfassung Die Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion stellt mit weltweit rund 120 bis 170 Millionen Virusträgern ein wichtiges Gesundheitsproblem dar. Bis dato ist einzig der parenterale Übertragungsweg von HCV gesichert. Dennoch gelang in einigen Studien der Nachweis von HCV-RNA in verschiedenen Körperflüssigkeiten wie unter anderem dem Sperma und der Muttermilch. Weiterhin ist der Geschlechtsverkehr mit HCV-Positiven als eindeutiger Risikofaktor einer Infektion identifiziert worden. Darüber hinaus konnte denen sich im Sperma formenden Amyloidfibrillen, genannt „Semen-derived Enhancer of Virus Infection“ (SEVI), eine potenzierende Wirkung auf die Infektiosität des humanen-ImmundefizienzVirus‘ (HIV) nachgewiesen werden. Ein Inhaltsstoff des grünen Tees hingegen, das Catechin Epigallocatechingallat (EGCG), hat neben seinen antiviralen Effekten vermutlich einen vermindernden Einfluss auf die Potenzierung der HIV-Infektiosität durch SEVI. Im Rahmen dieser Dissertation sollte daher zum einen herausgefunden werden, welches Risiko tatsächlich von der Muttermilch einer HCV-infizierten stillenden Mutter ausgeht und ob HCV überhaupt in dieser Körperflüssigkeit stabil ist. Zum anderen galt es, die Stabilität von HCV in Gegenwart von Samenflüssigkeit, und damit die Möglichkeit einer Infektionstransmission auf diesem Wege, zu erforschen. Ferner sollte die eventuelle Anwendbarkeit der bei HIV gefundenen Effekte von SEVI und EGCG auf HCV getestet werden. Es konnte festgestellt werden, dass sich die Stabilität von HCV in Anwesenheit von Muttermilch verändert und es somit zur einer Infektiositätsreduktion kommt. Dabei schien der beobachtete Effekt sowohl von der Inkubationszeit als auch von der Konzentration und der speziellen Zusammensetzung humaner Muttermilch gegenüber der Milch anderer Spezies abhängig zu sein. Des Weiteren konnten Proteine, insbesondere das Lactoferrin sowie LL37, und das Komplementsystem als potentielle Effektoren der Muttermilch ausgeschlossen werden. Die Resultate weisen auf ein fehlendes Risiko der Virustransmission durch das Stillen hin. Ein signifikant verändertes Verhalten in der Stabilität von HCV in Gegenwart von Sperma ließ sich hingegen nicht detektieren. Die Übertragung von HCV durch Samenflüssigkeit scheint daher theoretisch möglich zu sein. Ebenfalls konnte kein signifikanter potenzierender Effekt von SEVI auf HCV festgestellt werden. Allerdings gelang erstmals der Beweis, dass Zusammenfassung 76 EGCG inhibitorisch auf den HCV-Zelleintritt wirkt. Somit ist EGCG als potentieller Inhibitor einer HCV-Infektion identifiziert worden. Allerdings muss an diesen Stellen noch weitere Forschungsarbeit geleistet werden, um die genauen Mechanismen und die eindeutigen Risikoeinschätzungen zu klären. Literaturverzeichnis 77 6. Literaturverzeichnis 1. Epidemiologisches Bulletin 20/2009, Virushepatitis B, C und D im Jahr 2009. RobertKoch-Institut 2009. 2. Weltgesundheitsorganisation (WHO) 3. Schreier, E., et al., Gesundheitsberichterstattung des Bundes. Hepatitis C. RobertKoch-Institut Juni 2003. 15 4. Empfehlung des Bundesinstitutes für Risikobewertung. Ergänzung zu den Empfehlungen der Nationalen Stillkommission zu Hepatitis C und Stillen vom März 2001. Bundesgesundheitsblatt 2003. 46: p. 790 5. EASL International Consensus Conference on hepatitis C, Paris, 26 –27 February 1999, Consensus statement. 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Abbildung Ak Antikörper ALT Alanin-Aminotransferase AST Aspartat-Aminotransferase ATP Adenosin-5’-triphosphat bLf, cLf, hLf bovines-, Kamel-, humanes Lactoferrin ca. circa cc cell culture (Zellkultur) CAMP cathelicidin antimicrobial peptide (Cathelicidin antimikrobielles Peptid) CLDN1 Claudin-1 cplt. completed DAPI 4,6-diamino-2-phenylindol-Dihydrochlorid DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA desoxyribonucleic acid DTT Dithioerythrol E1 HCV Hüllprotein 1 E2 HCV Hüllprotein 2 E. coli Escherichia coli EASL European Association for the Study of the Liver EC Epicatechin ECG Epicatechingallat EGCG Epigallocatechingallat EGC Epigallocatechin EGTA Ethylenglykoltetraessigsäure ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay et. al. und andere (vervollständigt) (Desoxyribonukleinsäure) Anhang 91 F-luc „Firefly“-Luziferase FCS fetal calf serum (fötales Kälberserum) g Erdschwerebeschleunigung (9,81 m/s2) g Gramm GFP grün-fluoreszierendes Protein Glu Glutamat h hour (Stunde) HCC hepatocellular carcinoma (hepatozelluläres Karzinom) HCV Hepatitis-C-Virus HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat HIV human immunodeficiency virus (humanes Immunschwäche Virus) HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) Huh humane Hepatomazellen IF Immunfluoreszenz IFN-α Interferon alpha IgG Immunglobulin G IRES interne ribosomale Eintrittsstelle J6 Genotyp 2a Isolat Jc1 Japanese chimera1 JFH1 Japanese fulminant Hepatitis 1 l Liter LB Lysogeny broth LDL-R Lipoproteinrezeptor niedriger Dichte m milli M Molar µ mikro min Minute MLV murine leukemia virus Na2EDTA Natrium-Ethylendiamintetraacetat NANBH nicht-A-nicht-B-Hepatitis NS Nichtstrukturprotein NTR nicht-translatierte Region OCLN1 Occludin OD optische Dichte (Japanische Chimäre1) (=10-3) (=10-6) (murines Leukämie Virus) Anhang 92 ORF open reading frame (offenes Leseraster) PAP prostatisch-saure-Phosphatase PBMC mononukleare Zellen des peripheren Blutes PBS Phosphat buffered saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung) PCR Polymerase-chain-reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion) PEG-IFN-α pegyliertes Interferon alpha pp Pseudopartikel (r)ER (raues) endoplasmatisches Retikulum RKI Robert-Koch-Institut RLU relative light units (relative Lichteinheiten) RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rpm rotations per minute (Rotationen pro Minute) RT Raumtemperatur Sek Sekunde SEVI Semen-derived Enhancer of Virus Infection (Sperma-abstammender Verstärker viraler Infektion) SR-BI Scavenger-Rezeptor-Klasse-B-Typ-I TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TCID50 tissue culture infectious dose 50 Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan U unit UV Ultraviolett vgl. vergleiche Vol Volumen VSV Vesikuläres Stomatitis Virus VSV-G Hüllprotein des vesikulären Stomatitis Virus WHO World Health Organisation Wt Wildtyp α- Anti- (Virustiter) (Einheit) (Weltgesundheitsorganisation) Anhang 93 7.1.2 Abbildungen Seite Abb. 1 Weltweite Prävalenz der HCV-Infektion 5 Abb. 2 HCV-Übertragungswege 7 Abb. 3 Organisation und Prozessierung des HCV-Genoms 11 Abb. 4 Modell des HCV- Zelleintritts und des Replikationszyklus‘ 12 Abb. 5 Einfluss von Muttermilch auf Huh-7.5-Zellen 32 Abb. 6 Überprüfung der Stabilität von HCV zu unterschiedlichen Zeitpunkten in Gegenwart von Muttermilch Abb. 7 34 Einfluss von Milchproben unterschiedlicher Säugetiere und Mutterersatzmilch auf die HCV-Stabilität 36 Abb. 8 Einfluss vorverdünnter Muttermilch auf HCVcc-Infektiosität 38 Abb. 9 Versuchsaufbau 40 Abb. 10 Verhalten von Muttermilch bei Vorinkubation in An- und Abwesenheit von HCVcc 41 Abb. 11 Experimentelles Vorgehen 42 Abb. 12 Einfluss von verschiedenen Temperaturen auf Muttermilch und ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität Abb. 13 43 Einfluss von Schütteln und 37°C auf Muttermilch und ihre Wirkung auf die HCV-Infektiosität 44 Abb. 14 Einfluss von Lactoferrin auf HCVcc-Infektiosität 46 Abb. 15 Einfluss von Lactoferrin auf HCVpp-Infektiosität 48 Abb. 16 LL37 und CRAMP 50 Abb. 17 Einfluss von Sperma auf die HCVcc-Infektiosität 52 Abb. 18 Langzeitstabilität von HCV in Anwesenheit von Sperma 53 Abb. 19 Einfluss von SEVI auf HCVcc-Infektiosität 55 Abb. 20 HCV-Dichtegradient 56 Abb. 21 Einfluss von EGCG auf die HCV-Replikation und Freisetzung infektiöser Partikel 58 Abb. 22 Einfluss von EGCG und seinen Derivaten auf HCVcc-Infektiosität 60 Abb. 23 Einfluss von EGCG auf die HCVpp-Infektiosität 62 Anhang 94 7.1.3 Tabellen Seite Tab. 1 Inhaltsstoffe von Muttermilch, Mutterersatzmilch, Kuhmilch und Stutenmilch 15 Tab. 2 Verwendete Primärantikörper 20 Tab. 3 Verwendete Sekundärantikörper 21 Tab. 4 Verwendete Plasmide 21 Anhang 96 7.3 Danksagung An dieser Stelle möchte ich meinen Dank gegenüber all denjenigen aussprechen, die zum Anfertigen und Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Außerdem danke ich der Medizinischen Hochschule Hannover für die Bereitstellung des Stipendienplatzes im Rahmen des StrucMed-Programmes. Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Thomas Pietschmann für die Aufnahme in seine Abteilung der experimentellen Virologie des TWINCORE Hannover sowie die Bereitstellung des interessanten Themas. Außerdem danke ich ihm und insbesondere Dr. Eike Steinmann und Dr. Sandra Ciesek für die kontinuierliche und engagierte Betreuung, Unterstützung, das Einarbeiten in die Methoden sowie die anregenden Diskussionen und Vorschläge, die dieses Projekt voran gebracht haben. Außerdem gilt ein herzliches Dankeschön Martina Friesland, die mir stets mit Rat und Tat bei allen technischen und auch anderweitigen Problemen geduldig und motiviert zur Seite stand. Weiterhin möchte ich mich bei der gesamten Arbeitsgruppe für die Aufnahme in ihr Team, das nette Arbeitsklima, die Hilfestellung bei allen Problemen sowie das angeregte und fruchtvolle Diskutieren meiner Ergebnisse bedanken. Des Weiteren danke ich meiner ganzen Familie und insbesondere meinen Eltern für die liebevolle Begleitung und Unterstützung auf meinem Lebensweg. Ohne Euch wäre mir das Studium und dessen Verlängerung, um diese Arbeit anfertigen zu können, nicht möglich gewesen. Vielen Dank auch an alle, die diese Arbeit Korrektur gelesen oder begutachtet haben. Schließlich möchte ich noch allen Personen danken, die mir durch ihre Muttermilch- bzw. Spermaspenden die Erforschung dieses der Arbeit zu Grunde liegenden Themas ermöglicht haben. Anhang 97 7.4 Eidesstattliche Versicherung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel „Einfluss von Muttermilch und Samenflüssigkeit auf die Hepatitis-C-Virus Stabilität und Infektiosität“ in der Abteilung der experimentellen Virologie des TWINCORE Hannover, einer gemeinsamen Einrichtung der Medizinischen Hochschule Hannover und des Helmholtz Zentrums für Infektionsforschung Braunschweig, unter Betreuung der Herren Professor Dr. rer. nat. T. Pietschmann, Dr. rer. nat. E. Steinmann und Frau Dr. med. S. Ciesek ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt. Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe. Hannover, den 08. Oktober 2013 ……………………… (Unterschrift)
