Immunisierung, Antikörperproduktion (Fermentation), Reinigung

Immunisierung,
Antikörperproduktion (Fermentation),
Reinigung, Markierung
Hybridom-Technik
Universität Pécs, Medizinische Fakultät
Institut für Immunologie und Biotechnologie
Monoklonale Antikörper: werden von einer auf einen
einzigen B-Lymphozyten zurückgehenden Zelllinie (Zellklon)
produziert und richten sich gegen ein einzelnes Epitop.
Polyklonale Antikörper: Es handelt sich um ein Gemisch
mehrerer verschiedener Antikörper unterschiedlicher
Spezifität, die verschiedene Epitope eines bestimmten
Antigens erkennen und daran binden.
Antikörper erkennen einzelne Epitope
(Antigendeterminante)
Das komplexe Antigen löst eine polyklonale
Immunantwort aus, die zur Bildung
verschiedener Antikörper führt
Immunisierung 1.
Auswahl des geigneten Tieres:
{ Monoklonaler Antikörper – Maus oder Ratte
{ Polyklonaler Antikörper – Kaninchen, Schaf, Ziege
Antigen:
{ Hapten (5-10 kD >) – Träger
{ native / modifizierte Moleküle (Gabe: muskulär,
subkutan oder intrakutan) oder Zellen (Gabe: iv. oder
ip.)
Immunisierung
Das Antigen (der Carrier-Hapten-Komplex)
induziert die Bildung von Antikörpern mit
unterschiedlicher Spezifität
Antigen
(Träger + Hap ten)
Träg erspe zifische AK
ANTIKÖRPER
Ha ptenspe zifische AK
Träg er + Ha ptenspe zifisc he AK
Immunisierung 2.
Adjuvant (Hilfsmittel): verlangsamen die Aufnahme des Antigens
und verursachen die unspezifische
Immunsystems (Makrophagenaktivierung)
Stimulierung
des
Am häufigsten gebraucht:
{
{
{
{
{
{
inkompletter Adjuvant, auf Mineralöl-Basis, (z.B.: inkomplett:
Hegedűs, Freund)
Kompletter
Freund
Adjuvant: abgetötetes Mycobacterium
tuberculosis in Mineralöl-Emulsion
Aluminium-Hydroxid Gel
Muramil-Dipeptide (Mycobacterium tuberculosis )
Bakterielle Impfstoffe, die gleichzeitig gegeben werden, erhöhen die
Antikörperproduktion gegen das Immunogen z.B.: Bordatella
pertussis
Liposomen
Kinetik der Antikörperproduktion
Antikörperreinigung 1.
Antikörper werden als Serum aus Tieren gewonnen.
Klärung:
{
IgM:
• Gewinnung
der Ig-Fraktion mit chemischen
Methoden: auf Molekülgewicht und Löslichkeit
basierend
• Gewinnung
bei
niedriger
Ionkonzentration
(„euglobulin precipitation”)
• Wir können reinere Ausflockung erhalten, wenn wir
Borsäuredyalisis anwenden
• Weitere Reinigung mit Gelchromatographie
• Konzentrationsgradienten-zentrifugierung
Antikörperreinigung 2.
{
IgG:
• bei pH 6.4 wird sich nach der Zugabe von 1.39 M
(NH4)2SO4 niederschlagen
• Nach dem Niederschlag mit Rivanol bleibt das IgG
und das Transferrin in gelöster Form, der andere
Proteinbestandteil scheidet sich aus
• Ionaustauschchromatographie
• Affinitätschromatographie (Staphylococcus aureus
Protein A, Streptococcus Protein G)
Antikörperreinigung 3.
{
IgA, D, E: Methoden in mehreren Schritten
IgA:
nach
Ausflockung
mit
Zn;
Ionaustauschchromatographie und Gelfiltration
IgE: Affinitätschromatographie mit ConA
Immunosorbente
Methoden:
spezifische
Antigenisolierung auf der Oberfläche des
Sepharose-, Zellulose- oder Polyacrylamidegels
Antikörper-Testung
Die Prüfung des Titers und der Spezifizität sollte im gleichen System
durchgeführt werden, in dem der Antikörper aufgetragen wird.
z.B.: ELISA
Durchflusszytometrie
Immunohistochemie
Hybridomtechnik
Cesar Milstein
1985:
Nobel-Preis
Georges Koehler
Hybridomtechnik, Produzierung des
monoklonalen Antikörpers
Def.: Mit der Hybridomtechnik können spezifische
aktivierte
Immunzellen
mit
begrenzter
Lebenserwartung
zur
Antikörperproduktion
ausgewählt werden, in vitro
für unbeschränkte
Zeitdauer am Leben gehalten und zur Proliferation
fähig gemacht werden
Die Grundlage der Technik ist, dass wir in vitro eine
aktivierte Immunzelle mit einer Tumorzelle fusionieren
(vereinigen) lassen.
Myelome
Plasmazelle
Antikörperproduktion
Unsterblichkeit
Hybridome
unsterbliche, Antikörperproduzierende Zellen
Hybridomproduktion 1.
1.
Zellfusionierung: Milzzelle (von immunisiertem
unsezernierte Mausmyelomzelle (Sp-2/0-Ag14) + PEG
2.
Selektion: Selektion des gewünschten Hybride (Milzzelle –
Myeloma)
{
HGPRT- und TK-Enzyme (Synthesis von Purin und
Pyrimidin) fehlen in den Sp-2 Zellen, aber die Milzzellen
verfügen über sie, so können wir durch den Gebrauch von
einem selektiven Nährmedium (HAT) die Milzzelle - Sp2
Hybriden auswählen.
{
{
{
Tier)
+
HGPRT: „Hypoxanthine-guanine phosphorybosil transferase”
TK: „Thymidine Kinase”
HAT: Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidine
Hybridomproduktion 2.
3.
4.
5.
6.
7.
Auswählen der Hybridkulturen, die Antikörper
produzieren
Die Antikörperproduktion kann mit ELISA getestet
werden
Klonen: Verdünnung der Antikörper produzierenden
Zellen auf einer 96 well-Platte so, dass in ein Well nur
eine einzige Zelle kommt.
Wiederholtes Testen der Antikörperproduktion der
Monoklonen, der Antikörper, die durch einen einzelnen
Klon der Zellen produziert werden (monoklonale
Antikörper).
Antikörperproduktion in großer Menge: (1) Produktion
des Hybridomsupernatantes in vitro; (2) Gabe der
Hybridomzellen ip. in Maus; (3) Fermentor.
Schritte der
Hybridomproduktion
Anwendung der monoklonalen
Antikörper
{
{
{
{
{
Moderne Routinemethoden der Labordiagnostik
Immunhistochemishe Methoden: Markierung (CD) und
Lokalisierung der Lymphozytenuntergruppen (Blut,
Gewebe), Tumordiagnostische Zwecke
Durchflusszytometrie (FACS)
Proteinreinigung
In vivo Tumor- und Immuntherapie
Humanisierte Antikörper 1.
Therapeutische monoklonale Antikörper
{
{
{
Die verwendeten Antikörper der Maus (murine Antikörper,
Endung: -omab) wirken im menschlichen Organismus selbst
als Antigen und können eine gegen sie gerichtete
Immunantwort auslösen (HAMA= Human AntimausAntikörper).
Modifizierte Antikörper für die therapeutische Anwendung
Es ist in den letzten Jahren gelungen, modifizierte, den
menschlichen Antikörpern besser angepasste monoklonale
Antikörper zu entwickeln.
entwickeln
Humanisierte Antikörper
Fab
CDR
Fc
CDR= Hypervariable Region (Abschnitt)
Therapeutische Anwendungen von
humanisierten Antikörpern
{
{
{
Immunsuppression bei Organtransplantation –
Entfernung von aktivierten T-Zellen (a-CD3, aCD25)
Lymphomatherapie – a-CD20
Immunsuppression bei Autoimmunkrankheiten –
a-TNFα