Bildung von Interleukin 1 in Nabelschnurmonozyten bei

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
des St. Josef Hospital
-Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. C. Rieger
Bildung von Interleukin 1
in Nabelschnurmonozyten bei Neugeborenen
mit und ohne Atopierisiko
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des
Doktorgrades der Medizin
einer Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Claudia Julia Bockelmann
aus Ostfildern
2001
Dekan:
Prof. Dr. med. Muhr
Referent:
PD Dr. med. U. Schauer
Korreferent: Prof. Dr. med. A. W. O. Jensen
Tag der mündlichen Prüfung: 09.07.2002
Inhaltsverzeichnis
ABBILDUNGSVERZEICHNIS .................................................................................... 2
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................. 4
1
EINLEITUNG .......................................................................................................... 5
1.1
Atopische Erkrankungen...................................................................................5
1.1.1
Pathogenese der atopischen Erkrankungen ...............................................6
1.1.2
Effektorphase.............................................................................................9
1.2
Einflußfaktoren der Atopieentwicklung............................................................9
1.3
Bakterielle Stimuli ..........................................................................................12
1.4
Die Rolle der Monozyten im Immunsystem ...................................................14
1.5
Bedeutung von IL-1 ........................................................................................15
1.5.1
Stimuli zur IL-1-Freisetzung ...................................................................15
1.5.2
Wirkung von IL-1 auf immunkompetente Zellen ...................................15
1.5.3
Wirkung von IL-1 auf nicht-immunkompetente Zellen ..........................16
1.5.4
Die besondere Rolle von IL-1 bei verschiedenen Erkrankungen............18
1.6
2
3
Fragestellung ...................................................................................................19
MATERIAL UND METHODEN ......................................................................... 20
2.1
Probandenkollektiv .........................................................................................20
2.2
Isolierung mononukleärer Zellen ....................................................................21
2.3
Untersuchung der mononukleären Zellen .......................................................21
2.3.1
Zellkultur .................................................................................................21
2.3.2
Ernten ......................................................................................................22
2.3.3
Färbung der Monozyten ..........................................................................22
2.4
Messung mit dem Durchflußzytometer...........................................................23
2.5
Nabelschnur Gesamt-IgE ................................................................................24
2.6
Statistik............................................................................................................25
ERGEBNISSE ........................................................................................................ 26
3.1
Probandenkollektiv Fragebogenauswertung / Geburtsbuch............................26
3.1.1
Atopierisikogruppe und Nicht-Risikogruppe ..........................................26
3.1.2
Die Einflußfaktoren .................................................................................27
1
3.2
Interleukin-1-Untersuchungen ........................................................................28
3.2.1
IL-1-Kinetik.............................................................................................28
3.2.2
Unstimulierte und durch Bakterienderivate stimulierte IL-1Produktion von Nabelschnurblutmonozyten ...........................................29
3.2.3
Zusammenhang der IL-1-Produktion mit dem Atopierisiko ...................30
3.2.4
IL-1- und TNFa-Produktion im Vergleich .............................................31
3.3
4
Korrelation zwischen IgE und IL-1.................................................................32
DISKUSSION......................................................................................................... 33
4.1
Bedeutung der erhöhten IL-1-Werte für die Atopieentstehung ......................33
4.2
Der IL-1-Rezeptor und die Signaltransduktion...............................................34
4.3
Die Rolle der Monozyten in der Atopieentstehung.........................................37
4.4
Charakterisierung der Nabelschnurblutmonozyten (CBMC)..........................38
4.5
Wirkung bakterieller Stimuli auf das Immunsystem ......................................39
4.5.1
LPS als Bakterienprodukt – welche Rolle spielt es bei der Auslösung
von Allergien ...........................................................................................39
4.5.2
Weitere bakterielle Stimuli......................................................................40
4.6
Intrazelluläre durchflußzytometrische Zytokinbestimmung ...........................41
4.7
Einflußfaktoren der Atopieentstehung ............................................................43
4.8
Atopiemarker im Nabelschnurblut..................................................................44
5
ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................... 46
6
AUSBLICK............................................................................................................. 47
7
LITERATURVERZEICHNIS.............................................................................. 48
8
APPENDIX............................................................................................................. 64
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Th1- und Th2-Differenzierung
Abbildung 2: Setzen eines Lifegate um die Monozyten
Abbildung 3: IL-1-Kinetik
Abbildung 4: IL-1-Produktion aller Probanden mit und ohne LPS-Stimulation
Abbildung 5: IL-1-Produktion im Zusammenhang mit dem Atopierisiko
2
Abbildung 6: IL-1- und TNFa-Produktion nach LPS-Stimulation
Abbildung 7: IgE- und IL-1-Werte aller Probanden
Abbildung 8: Signaltransduktion der IL-1-, IL-18- und TLR-4-Rezeptoren
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: IL-1-Wirkung auf diverse Zellen
Tabelle 2: Charakterisierung der Probandengruppe
3
Abkürzungsverzeichnis
APC
Antigen Presenting Cell, Antigenpräsentierende Zelle
CBMC
Cord Blood Mononuclear Cell, Mononukleäre Nabelschnurblutzelle
ELISA
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
HBSS
Hanks balanced salt solution
IDC
Interdigitierende Dendritische Zellen
IFNg
Interferon gamma
IgA
Immunglobulin A
IgE
Immunglobulin E
IgG
Immunglobulin G
IgM
Immunglobulin M
IL
Interleukin
IRAK
IL-1-Rezeptor assoziierte Kinase
JNK
N-terminale Kinase
LAP
Lipid A assoziiertes Protein
LPS
Lipopolysaccharid
MAPK
Mitogen aktivierte Proteinkinase
MAS
Multizentrische Allergie Studie
MHC
Major Histocompatibility Complex,
Haupthistokompatibilitätskomplex
PBMC
Peripher Blood Mononuclear Cell, Mononukleäre Zelle des peripheren
Blutes
PCR
Polymerase Chain Reaction, Polymerase Kettenreaktion
PE
Phycoerythrin
RPMI
Rothwell Park Memorial Institut 1640 Kulturmedium
TCR
T-Zell Rezeptor
TIR
Toll / IL-1-Rezeptor
TLR
Toll-Like-Rezeptor
TNF
Tumornekrosefaktor
TRAF6
TNF-Rezeptor assoziierter Faktor 6
4
1 Einleitung
1.1 Atopische Erkrankungen
Die Prävalenz atopischer Erkrankungen hat in den letzten Jahrzehnten ständig
zugenommen und steigt weiter an (Skjonsberg et al. 1995). 25 % der Bevölkerung
erkranken im Verlauf des Lebens an Asthma, Heuschnupfen oder Neurodermitis, die
zum Formenkreis der Atopie gerechnet werden (Bergmann et al. 1993).
Der Begriff Allergie wurde 1906 zum ersten Mal von Pirquet verwendet. Er verstand
darunter eine veränderte, überschießende Immunreaktion beim zweiten oder
folgenden Kontakt mit einem „Agens“. Heute wird der Begriff Allergie als Symptom
der Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I (Allergische Reaktion vom Soforttyp
nach Coombs und Gell) bezeichnet.
Der Begriff Atopie wurde erstmalig 1923 von Coca und Cooce verwendet und ist eng
mit dem Begriff „Allergie“ verbunden. Atopie bezeichnet die Neigung zu
Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I. Die klinischen Leitsymptome der Atopie
sind Erkrankungen wie Asthma, endogenes Ekzem, Heufieber und Urtikaria.
Die Ursachen der atopischen Erkrankungen sind seit Jahrzehnten Gegenstand
wissenschaftlicher Forschung. Der Pathogenese dieser Erkrankungen liegen im
wesentlichen drei Faktoren zugrunde: erstens) eine genetische Prädisposition
(Roorda et al.1992, Cookson und Hopkin 1988, Pöysä et al.1989), zweitens) die
Allergenexposition (Bahna 1992) und drittens) verschiedene Einflußfaktoren (s.u.).
Die genetische Prädisposition scheint bei der Entstehung atopischer Erkrankungen
eine wichtige Rolle zu spielen. Es wird eine polygenetische und multifaktorielle
Vererbung angenommen, wobei es keine Vererbung für spezifische
Sensibilisierungen auf bestimmte Allergene gibt. Es wird vielmehr die Veranlagung
vererbt, im späteren Leben eine pathologische Immunreaktion auf Allergene zu
entwickeln (Bahna 1992). Diese „atopische Prädisposition“ ist als additive Polygenie
als die Summe aller in die gleiche Richtung weisenden Gene aufzufassen (Bergmann
et al. 1993). Man geht davon aus, daß für die Umwandlung der Disposition in die
Krankheit ein Schwellenwert existiert, der von verschiedenen Umweltfaktoren
5
abhängig ist. Die atopischen Erkrankungen manifestieren sich klinisch erst nach der
Überschreitung dieses Schwellenwertes (Kabesch 2001).
Die Allergenexposition ist ein weiterer Faktor, der zur Allergieentstehung beiträgt.
Dabei haben der Typ des Allergens, die Quantität, der Expositionsweg und die
Expositionsdauer einen Einfluß auf die Entwicklung der Erkrankung (Bahna 1992;
Holt, McMenamin und Nelson 1990).
1.1.1 Pathogenese der atopischen Erkrankungen
Die atopische Erkrankung ist durch eine lokale Entzündungsreaktion gekennzeichnet,
die durch Freisetzung von Entzündungsmediatoren nach Antigenkontakt mit
spezifischem IgE hervorgerufen wird.
Für die Allergieentstehung ist eine Regulationsstörung der IgE-Produktion im Sinne
einer gesteigerten IgE-Synthese verantwortlich. Hierfür existieren verschiedene
Erklärungsmodelle, von denen das folgende zunehmend an Bedeutung gewinnt:
Die B-Zellen wandeln sich von IgM produzierenden B-Zellen bei wiederholtem
Allergenkontakt in IgE oder IgG produzierende B-Zellen um (sog. „B-Zellswitch“).
In welche Richtung dieser B-Zellswitch stattfindet, hängt von dem Zytokinprofil zum
Zeitpunkt der Allergenexposition ab. Herrscht vorwiegend ein Zytokinmilieu mit
Interferon-g (IFNg) vor, differenzieren sich die B-Zellen eher zu IgG produzierenden
B-Zellen, während ein IL-4-Milieu zu einer Differenzierung zu IgE produzierenden
B-Zellen führt (Holt et al. 1990; Bergstedt-Linquist et al. 1988; Finkelman et al.
1988; Savelkoul et al. 1988).
Diese Zytokine, die für den B-Zellswitch verantwortlich sind, werden von den THelferlymphozyten (T-Helferzellen) produziert. T-Helferzellen können sich nach
dem von Mosmann 1986 entwickelten Modell in zwei Populationen differenzieren,
die durch ein spezifisches Zytokinprofil charakterisiert werden: einerseits in die IL-2
und IFNg produzierenden Th1-Zellen, andererseits in die IL-4, IL-5 und IL-10
produzierenden Th2-Zellen. Die Th1-Zellen sind für die zytotoxische Antwort
verantwortlich, die Th2-Zellen für die humorale Antwort. Den Th1-Zellen kommt
eine allergieprotektive Eigenschaft zu. Im Gegensatz dazu fördern die Zytokine der
6
Th2-Zellen die Bildung von IgE produzierenden B-Zellen, sie sind also eher
allergiefördernd.
Ob sich T-Helferzellen eher zu allergieprotektiven Th1-Zellen oder zu allergiefördernden Th2-Zellen differenzieren, hängt ebenfalls vom Zytokinmilieu zum
Zeitpunkt der T-Zelldifferenzierung ab.
Für die Differenzierung der T-Zellen sind u.a. Makrophagen, bzw. deren Zytokine
verantwortlich:
In in-vitro- und in-vivo-Versuchen konnte gezeigt werden, daß antigenpräsentierende
Zellen (APC) Th2-Zellen als Antwort auf ein Allergen stimulieren. Die daraufhin
folgende IL-4-Freisetzung veranlaßt B-Zellen zu einer IgE-Produktion. Th1-Zellen
werden hingegen vornehmlich von Antigenen, wie z.B. Bakterienbestandteilen,
aktiviert. Das daraufhin freigesetzte IFNg führt zu einer Produktion von IgG durch
B-Zellen und zu einer Hemmung der Th2-Antwort. Th2-Zellen können durch die IL10-Produktion auch die Th1-Antwort unterdrücken und so die INFg-Freisetzung
hemmen.
Makrophagen sind aktivierte Monozyten und können als antigenpräsentierende
Zellen (APC) agieren. Sie phagozytieren und fraktionieren das Antigen und
präsentieren es zusammen mit Klasse-II-MHC auf der Zelloberfläche den THelferzellen. Die T-Helferzellen erkennen mittels eines T-Zell-Rezeptors (TCR)
Peptide, die in dem MHC-Molekül eingelagert sind. Die T-Zellaktivierung findet
zusätzlich auf Zytokinebene statt, z.B. durch das von Makrophagen freigesetzte IL-1.
Die MHC-Präsentation und die Aktivierung durch Zytokine bezeichnet man auch als
„Doppelsignal“ (Rook 1995, Kaufmann, 1991c).
Unter den APC nehmen die sog. dentritischen Zellen (IDC) eine wichtige Rolle ein.
Diese können mittels ihrer Fortsätze (Dendriten) ebenfalls Kontakt zu den THelferzellen aufnehmen und beschreiten so zur normalen Antigenpräsentation einen
alternativen Weg der T-Zell-Aktivierung.
7
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Th1- und Th2-Differenzierung
Noch bevor die Antigenpräsentation stattfindet, sezernieren Monozyten als
unspezifische Primärantwort auf eine Infektion T-Zell- und antikörperunabhängig
Zytokine wie IL-1, TNFa, IL-12. Zusätzlich exprimieren sie auf ihrer Oberfläche
verstärkt CD80 / CD86 (Rook 1995).
Die Zusammensetzung dieser Zytokine ist entscheidend für die nachfolgenden
Mechanismen der Immuneffektorsysteme, da IL-1 bzw. IL-12 die Differenzierung
der T-Helferzellen beeinflussen (Manetti et al. 1994). In der Allergieentstehung
spielen Makrophagen und deren sezernierte Zytokine eine entscheidende Rolle bei
der frühen immunologischen Prägung des Immunsystems mit allergietypischem
Reaktionsmuster. Jedoch sind die zugrundeliegenden Pathomechanismen noch
ungeklärt.
Welche Rolle Monozyten im Rahmen der allergischen Immunantwort spielen, und
welche Zytokine hierbei wichtig sind, ist noch weitgehend unklar.
8
1.1.2 Effektorphase
Bei der Typ I-Reaktion nach Coombs und Gell (Allergische Reaktion vom Soforttyp)
liegt eine antikörpervermittelte Immunreaktion vor. In der ersten Phase (20 min)
kommt den Mastzellen und dem IgE eine hervorstechende Bedeutung zu. Die
Mastzellen und basophilen Granulozyten tragen an ihrer Oberfläche homozytotrope
Immunglobuline vom Typ E (IgE). Bindet sich ein spezifisches Antigen gleichzeitig
an zwei benachbarte IgE-Moleküle, so kommt es durch eine Überbrückung
(„bridging“) zur Freisetzung von Mediatoren (S. H. E. Kaufmann, 1991b).
Die Mediatoren interagieren mit immunkompetenten Zellen sowie mit Gefäß- und
Muskelzellen. Je nachdem, in welchem Gewebe der Antigenkontakt stattfindet,
werden verschiedene Reaktionen hervorgerufen. In der Haut kommt es z.B. zu einer
Vasodilatation (klinisch erkennbar als Erythem und Überwärmung), zu einer
Erhöhung der Gefäßpermeabilität (Ödem) und zu Juckreiz. Findet der
Allergenkontakt im Bronchialsystem statt, kommt es zur Vasodilatation
(Schleimhautödem) und Bronchiokonstriktion (Verengung des Bronchiallumens).
Diese entzündlichen Reaktionen sind klinischen Leitsymptome der atopischen
Erkrankungen (hier: Urtikaria bzw. allergisches Asthma).
Darüber hinaus werden die Lymphokine freigesetzt, die für weitere immunologische
Reaktionen verantwortlich sind. Sie beeinflussen das entzündliche Geschehen, indem
sie auf komplexe Weise mit den Immunzellen interagieren. Das von T-Zellen
sezernierte IL-10 verstärkt beispielsweise die Mastzelldifferenzierung. Außerdem
können die sezernierten Lymphokine eine Leukotaxis bewirken, zu einer Aktivierung
oder Suppression der Immunantwort führen (s.u.).
1.2 Einflußfaktoren der Atopieentwicklung
Zahlreiche Faktoren können die Entstehung einer Atopie beeinflussen, im Folgenden
werden einige erläutert.
Rauchen:
1995 stellten Bergmann et al. in einer Untersuchung von 6401 Neugeborenen fest,
daß Rauchen einen Einfluß auf die Erhöhung der Nabelschnurblut IgE-Werte hat,
und somit auch als atopiefördernder Faktor einzustufen ist. Andrae et al. fanden 1988
in einer Untersuchung (von 5301 Kindern zwischen 6 Monaten und 16 Jahren) einen
9
Zusammenhang zwischen Tabakrauchexposition und bronchialer Hyperreaktivität
bei den Kindern.
Außerdem besteht ein Zusammenhang zwischen Tabakrauchexposition und der
Prävalenz atopischer Erkrankungen (Gortmarker et al. 1982), insbesondere der
Prävalenz von Asthma (Arshad und Wallace-Hide 1992).
Geschlecht:
In mehreren Studien wurden höhere Nabelschnur-IgE-Werte der männlichen im
Vergleich zu weiblichen Neugeborenen festgestellt (Bergmann et al. 1993 und 1995;
Bahna 1992; Kuehr et al. 1992). Croner konnte hingegen keine Prädominanz eines
Geschlechtes hinsichtlich eines erhöhten IgE-Wertes feststellen (Croner und
Kjellman 1990).
Geburtsmonat:
Pöysä et al. (1989) konnten zeigen, daß Kinder, die zwischen den Monaten Januar
und Februar geboren wurden, im späteren Leben eine positive Hautreaktion auf
Birkenpollen zeigten. Als die Säuglinge in einem Alter von 3-6 Monaten waren,
wurden sie auf Birkenpollen sensibilisiert. Daraus läßt sich schließen, daß das
Immunsystem zwischen dem 3. und 6. Monat leichter durch äußere Faktoren
beeinflußbar ist, als zu einem anderen Zeitpunkt. Croner und Kjellman (1986) fanden
heraus, daß es bei Kindern mit erhöhten Nabelschnurblut-IgE-Werten, die im Mai
geboren wurden, öfter zu einer Atopieentwicklung kam, als bei Kindern, die im
November geboren wurden. Arshad und Wallace-Hide (1992) stellten fest, daß
Kinder, die im Sommer geboren wurden, häufiger an Asthma erkrankten, als Kinder,
die im Winter geboren wurden.
Umweltverschmutzung:
Umweltschadstoffe können eine allergische Sensibilisierung auslösen, was im
Tierversuch bestätigt wurde (Riedel et al. 1988). Es konnte eine Beziehung zwischen
Schwefeldioxid bzw. Ozon und einer bronchialen Hyperreaktivität gezeigt werden
(Koenig et al. 1982; Kreit et al. 1989). Schwefeldioxide führten im Tierversuch zu
einer erhöhten IgE-Produktion (Osebold, Gerschwin und Zee 1980). Corbo et al.
(1993) stellten heraus, daß Luftverschmutzung nicht zum Anstieg der
10
Atopieprävalenz führt, aber die Entwicklung klinischer Symptome bereits
sensibilisierter Personen fördert.
Ernährung:
Die Allergenexposition ist von essentieller Bedeutung für die Entwicklung einer
Atopie. Im Säuglingsalter haben Nahrungsallergene die größte Bedeutung (Bahna
1992). Es konnte festgestellt werden, daß Stillen mit einer geringeren Atopieinzidenz
einhergeht ( Bahna 1986 und 1991). Die Ernährung der Mutter währen der Stillzeit
kann die prophylaktische Wirkung des Stillens unterstützen (Chandra et al. 1986,
Zeiger et al. 1989, Hattewig et al. 1989).
Schwangerschafts-, und Geburtskomplikationen:
Bergmann et al. (1995) stellten keinen Zusammenhang zwischen Gestationsalter und
erhöhten Nabelschnurblut IgE-Werten fest, was durch die Untersuchung von Kuehr
et al. 1992 an 1470 Kindern bestätigt werden konnte. Laut Bergmann et al. (1995)
bestand ebenfalls kein Zusammenhang zwischen Geburtsgewicht, APGAR Werten,
Nabelschnur pH-Werten und Medikation während der Schwangerschaft und erhöhten
Nabelschnur IgE-Werten.
Über den begünstigenden Einfluß der Umweltfaktoren auf die Entstehung atopischer
Erkrankungen wird zur Zeit kontrovers diskutiert. Einerseits soll eine hohe
Luftverschmutzung für die höhere Prävalenz verantwortlich sein (Gergen et al. 1987;
Ishizaki et al. 1987), andererseits konnte gezeigt werden, daß die Allergieprävalenz
in luftverschmutzten Städten in Polen (Braback et al. 1994) oder in Ostdeutschland
(von Mutius et al. 1994) geringer war, als in weniger schadstoffbelasteten Städten in
Schweden oder in München. Der andere Lebensstil in den ehemals sozialistisch
regierten Ländern könnte dafür verantwortlich sein (von Mutius et al. 1994). Mutius
postulierte 1994, daß die Unterbringung der Kleinkinder in Tagesstätten und der
daraus hervorgehenden Infekthäufung im Kindesalter eine allergiehemmende
Wirkung hat.
Wenn die Auseinandersetzung des Immunsystems mit Infekten, also mit bakteriellen
Stimuli die Atopieentwicklung beeinflußt, ist die Wirkung bakterieller Reize auf das
Immunsystems von großem Interesse. Es gibt zahlreiche bakterielle Stimuli.
11
1.3 Bakterielle Stimuli
Bakterienbestandteile gram-positiver und gram-negativer Bakterien sind in der Lage,
Monozyten zur Sekretion von Zytokinen (z.B. IL-1) zu stimulieren. Die Wichtigsten
unter den Bestandteilen gram-positiver Bakterien sind Teichonsäuren, Lipid Aassoziiertes Protein (LAP), Lipoarabinomannan und Staphylokokken Superantigen,
unter den der gram-negativen Bakterien LPS, LAP und Porine.
Beide Bakterienarten besitzen des weiteren Peptidoglykane, wobei diese in
Kombination mit eingelagerten Teichonsäuren (von Strep. pneumoniae) die
potentesten IL-1-Induktoren sein sollen (Riesenfeld-Orn et al. 1989).
Lipoteichonsäuren:
Lipoteichonsäuren bilden den Hauptbestandteil der Zellwand gram-positiver
Bakterien und gelten als Virulenzfaktoren (Riesenfeld-Orn et al. 1989). Bhakdi et al.
berichteten 1991 von großen Unterschieden der Lipoteichonsäuren verschiedener
Bakterien hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Monozyten zu einer Zytokinproduktion (IL-1,
IL-6 und TNFa) zu aktivieren. Lipoteichonsäuren diverser Enterokokkenarten
erwiesen sich als genauso wirksam, aber weniger potent als LPS, wohingegen z.B.
Lipoteichonsäuren von Staph. aureus und Strep. mutans gar keine Aktivität zeigten.
Lipoteichonsäuren von Pneumokokken führten zu einer IL-1, nicht jedoch zu einer
TNFa-Freisetzung, die Lipoteichonsäuren von Strep. faecales hingegen stimulierten
Monozyten zu einer Freisetzung beider Zytokine (Tsutsui et al. 1991). Man erkennt,
daß Lipoteichonsäuren in unterschiedlichem Maße zu einer Monozytenaktivierung
und Zytokinfreisetzung führen und daher einen weniger zuverlässigen Stimulus als
LPS darstellen.
Lipoarabinomannan:
Lipoarabinomannan ist ein Zellwandbestandteil der Mykobakterien und LPS
funktionell sehr ähnlich. Zudem vermag es auch an den CD14-LPS-Rezeptor zu
binden und IL-1, IL-6, TNFa und IL-10 freizusetzen.
Staphylokokkentoxin:
Die meisten Superantigene werden von Staph.aureus produziert und induzieren eine
TNF-, IL-1-, IL-6- und IFNg-Produktion. Das Staphylokokken-Enterotoxin, ein sog.
12
„Superantigen“, wirkt direkt aktivierend auf das spezifische Immunsystem durch die
Vernetzung von T-Zellen mit Monozyten bzw. Makrophagen. Es lagert sich sowohl
an den T-Zell-Rezeptor als auch an die MHC-Klasse-II-Moleküle an.
Porine:
Porine sind Bestandteile gram-negativer Bakterien und spielen eine Rolle als
Virulenzfaktoren. Porine von Salmonella typhimurium (Galdiero et al. 1993),
Yersinia enteroko-litika (Tufano et al. 1994a) oder von Helicobakter pylori (Tufano
et al. 1994b) stimulieren Monozyten und Lymphozyten zu einer Freisetzung
verschiedener proentzündlicher und immunregulatorischer Zytokine wie IL-1, IL-4,
IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF und IFNg. Vergleicht man die Porine von Sal.
typhimurium mit LPS, so zeigen beide eine ähnliche Fähigkeit, TNF und IL-6 zu
stimulieren, aber die Porine führen zu einer schwächeren Stimulation der
monozytären IL-1-Freisetzung. Somit schieden sie für diese Arbeit als Stimulus aus.
Surface associated material:
Surface associated material (SAM) ist locker mit der Bakterienoberfläche assoziiert
und kann leicht gelöst werden. Es ist teilweise biologisch aktiv. SAM kann zu einer
Stimulation der Freisetzung verschiedener Zytokine wie IL-1, TNF, IL-6 und IL-8
aus verschiedenen Zellpopulationen (Monozyten, Fibroblasten, PBMC und
Neutrophilen) führen. Das SAM einiger oraler Bakterien ist ein stärkerer
Zytokininduktor als das korrespondierende LPS. Es ist sogar gleich stark induzierend
wie das LPS von E. coli (Henderson und Wilson 1996).
Bakterielle Toxine:
Pneumolysin von Streptokokkus pneumoniae und Toxin B von Clostridium difficile
gehören zu den potentesten Stimulatoren der proinflammatorischen Zytokinsynthese
von IL-1 und TNF in Monozyten (Houldsworth et al. 1994).
LPS:
LPS ist Zellwandbestandteil gram-negativer Bakterien wie E.coli. Es besteht aus
einem innenliegenden hydrophobischen Lipid A, einem Kernglykolipid und
außenaufliegenden hitzestabilen Ketten, aus sich wiederholenden Einheiten von bis
13
zu sieben Zuckern (O-spezifischen Ketten) (Lebek und Cottier 1992, Couturier et al.
1991). Dabei ist hauptsächlich das Lipid A für die toxische Wirkung verantwortlich.
E. coli gehört, in Abhängigkeit von der Ernährung, schon im Säuglingsalter zur
konstanten Besiedlung des unteren Magen-Darm-Traktes (Lebek und Cottier 1992).
Bei ausschließlich gestillten Säuglingen herrscht eine Besiedlung mit Laktobazillus
bifidus vor, es kommt erst nach Zufütterung zu einer E. coli Besiedlung des MagenDarm-Traktes. So wird der Säugling schon in den ersten Lebensmonaten mit LPS,
welches bei Zerfall des Bakteriums freigesetzt und über die Darmmukosa
aufgenommen wird, konfrontiert.
LPS ist also einer von vielen bakteriellen Stimuli, es ist ubiquitär weit verbreitet, gut
charakterisiert und als reines Reagenz verfügbar.
Was bewirkt LPS? LPS stellt einen Aktivator der makrophagozytären
Zytokinproduktion dar. Es ist der Prototyp der in-vitro-Stimulation der IL-1Sekretion durch Monozyten (Anderson et al. 1992).
1.4 Die Rolle der Monozyten im Immunsystem
In der vorliegenden Arbeit wurden Monozyten untersucht, da diese die wichtigsten
Zellen der frühen unspezifischen Immunantwort darstellen, und ihre Rolle in der
Allergieentstehung noch weitgehend ungeklärt ist. Bekannt ist die Bedeutung der
Monozyten in der Immunantwort auf Infektionen bzw. Mikroorganismen:
Blutmonozyten entstammen dem Knochenmark. Sie wandern aus dem zirkulierenden
Blut-Pool in die verschiedenen Gewebe ein und entwickeln sich zu Makrophagen,
welche die aktivierte Form der Monozyten darstellen. Für die Migration in die
verschiedenen Gewebe sind u.a. Bestandteile von Mikroorganismen verantwortlich,
die für die Monozyten einen chemotaktischen Reiz darstellen. Durch Aktivierung des
alternativen Komplementweges erzielt das bakterielle Endotoxin diesen
chemotaktischen Effekt.
Im Gewebe besteht die Aufgabe des Monozyten darin, das Antigen zu phagozytieren
und durch Antigenpräsentation die Entzündung auszulösen. Zur Phagozytose muß
der Monozyt die Mikroorganismen mittels eines Rezeptors an seiner Oberfläche
binden. Bereits aktiviertes Komplement erleichtert die Phagozytose. Das
phagozytierte Antigen wird prozessiert und zusammen mit MHC-Klasse-II14
Molekülen den T-Helferzellen präsentiert. IL-1, welches gleichzeitig von den
Monozyten sezerniert wird, ist ein weiterer Stimulus für die Aktivierung der TZellen (Manetti et al. 1994).
Eine weitere Funktion besitzen Monozyten in der Effektorphase der zellvermittelten
Antwort. Als Effektorzellen besitzen sie Antitumor- und antimikrobielle Funktionen.
Zusätzlich können sie durch Zytokinproduktion als Entzündungszellen an der
Immunantwort teilnehmen (Rook 1995).
1.5 Bedeutung von IL-1
IL-1 wird von Monozyten durch LPS freigesetzt.
IL-1 ist das als erste beschriebene Interleukin und spielt eine Vielzahl von wichtigen
Rollen als regulatorisches Zytokin. Es wird von zahlreichen Zellen als Antwort auf
Traumen, Infektionen oder Antigene gebildet: von mononukleären Phagozyten, BLymphozyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Gliazellen, Fibroblasten,
Keratinozyten, Mesangialzellen und Astrozyten.
1.5.1 Stimuli zur IL-1-Freisetzung
Stimuli der monozytären IL-1-Sekretion können immunologischer, mikrobieller oder
anderer Art sein. Für die immunologische Stimulation werden aktivierte T-ZellZellkontakte, Ia begrenzte Lymphokine oder Immunkomplexe verantwortlich
gemacht. Bakterielle Stimuli stellen das Endotoxin (Lipid A) gram-negativer
Bakterien, die Zellwand, Muramyl-Dipeptid und Exotoxin gram-positiver Bakterien,
Hämagglutinin und die Doppelstrang-RNA von Viren dar. Ferner kommen als
Stimuli der IL-1-Sekretion Silikate, Urate und in vitro Phorbol-Mystat in Betracht
(Durum et al. 1985). Ein besonders wichtiger Stimulus ist LPS.
1.5.2 Wirkung von IL-1 auf immunkompetente Zellen
IL-1 wirkt auf Zellen des Immunsystems folgendermaßen: Im Zusammenspiel mit
den T-Zellen bewirkt es die T-Zell-Proliferation, die Expression von IL-2Rezeptoren und die Zytokinproduktion (Fischer et al. 1990; Davis und Lipsky 1986;
Williams et al. 1985; Holsti und Raulet 1989). Bei B-Zellen bewirkt IL-1 eine
15
Zellproliferation und Differenzierung zu Plasmazellen. Eine Steigerung der
Prostaglandinproduktion, der zytotoxischen Aktivität und der chemotaktischen
Wirkung wird bei den Makrophagen durch IL-1 vermittelt. Ferner steigert es die
zytotoxische Aktivität von Killer-Zellen (Durum et al. 1985).
1.5.3 Wirkung von IL-1 auf nicht-immunkompetente Zellen
Entzündungsreaktionen werden durch die IL-1 stimulierte Produktion von
Prostaglandinen und katabolen Kollagenasen unterhalten, welche bei der Knorpel-,
und Knochendestruktion eine besondere Rolle spielen. IL-1 kann auch als
zirkulierendes Hormon agieren, so löst es
als endogenes Pyrogen
im
Wärmezentrum des Gehirns Fieber aus und sezerniert Akutphaseproteine aus
Hepatozyten (Durum et al. 1985; Dinarello 1985 und 1991).
IL-1 wirkt als Entzündungsmediator auch auf viele Zellen, die nicht zum
Immunsystem gehören (siehe Tabelle 1).
16
Tabelle 1: Darstellung von Prostaglandinsynthese, Proliferation, Proteinsynthese und
weiterer Wirkungen auf den menschlichen Organismus von verschiedenen, nicht
zum Immunsystem gehörenden Zellen .
Gewebe/
Prostaglan-
Zelltyp
dinsynthese
Gehirn
+
Proliferation
Protein-
andere Wirkung
synthese
Astrozyten-
-
tumor
Fieber,
Somnolenz,
Anorexie
Synoviazellen
+
-
Kollagenase
proteolyt. EnzymFreisetzung
Knochen/
-
-
Kollagenase
-
+
-
Kollagenase
-
Osteoklasten
Knorpel/
Chondrozyten
Plasminogenaktivator
Muskelzellen
+
-
-
proteolyt. EnzymFreisetzung
Fibroblasten
+
+
Kollagenase
-
Endothel
+
+
pro
Makrophagen/
koagulatorische
Neutrophilen
Aktivität
adhäsion verstärkt
Epithelzellen
-
+
Typ-IV-Kollagen -
Leber/
-
-
Akutphase
Hepatozyten
Proteine
17
1.5.4 Die besondere Rolle von IL-1 bei verschiedenen Erkrankungen
IL-1 ist bei der Entstehung und Manifestation von speziellen Erkrankungen
maßgeblich beteiligt:
Bei der rheumatoiden Arthritis besteht ein ständiger IL-1-Überschuß in der Synovia
(Mizel et al. 1981; Bodel et al. 1968). Die Plasma IL-1-Konzentration korreliert mit
der systemischen Krankheitsaktivität (Eastgate et al. 1988). Bei der Psoriasis besteht
eine Zytokindysregulation. Die freigesetzten proinflammatorischen und wachstumsfördernden Zytokine steigern die T-Zellantwort auf allogenetische APC. IL-1 steigert
die T-Zell-APC-Interaktion und die Aktivität der Immunzellen. Es aktiviert
Fibroblasten und steigert die Adhäsion zwischen Endothelzellen und Leukozyten,
was zu einem Eindringen der Leukozyten in die psoriatische Haut führt (Cooper et
al. 1990). In normaler Haut besteht ein Verhältnis von IL-1a zu IL-1b von 40:1. In
psoriatischer Haut besteht aufgrund der IL-1a-Reduktion und der IL-1b-Steigerung
ein Verhältnis von IL-1a zu IL-1b von 1:1. Jedoch ist auch das IL-1b der
psoriatischen Läsionen inaktiv und es ist ausschließlich das IL-1a , obwohl es
reduziert ist, das für die biologische Aktivität verantwortlich ist.
Die Tatsache, daß IL-1 bei so vielen Entzündungs- und imunregulatorischen
Prozessen beteiligt ist und von so vielen verschiedenen Zellen gebildet wird, stellt
die besondere und zentrale biologische Bedeutung des IL-1 heraus:
IL-1 gehört zu den Zytokinen, die frühzeitig ausgeschüttet werden und deshalb
richtungsweisend für die Immunantwort sein können,
Welche Rolle IL-1 hingegen bei der Atopieentstehung hat ist noch nicht hinreichend
geklärt.
18
1.6 Fragestellung
Mit der Frage, welche Ursachen der Allergieentstehung zugrundeliegen,
beschäftigten sich zahlreiche Studien der letzten Jahre (von Mutius et al. 1994;
Braback et al. 1994; Bergmann et al. 1995 (1993); Bahna 1992; Holt, Mc Menamin
und Nelson 1990; Willies-Jakobo et al. 1993; Pöylsä 1989; Gergen et al. 1987;
Ishizaki et al. 1987 ). Es wird angenommen, daß eine atopiefördernde oder
atopiehemmende Prägung des Immunsystems schon in utero beginnt (Jones et al.
1996) und in den ersten Lebensmonaten oder -jahren beendet wird. Bei der Klärung
der zugrundeliegenden Pathomechanismen stehen meist die Stimulierbarkeit und
zentrale Rolle der T-Helferzellen sowie deren immunologische Prägung im
Vordergrund.
Da die durch Makrophagen sezernierten Zytokine die T-Helferzellen aktivieren,
haben Makrophagen / Monozyten dadurch auch einen atopiefördernden oder
atopieprotektiven Einfluß auf die Prägung der Immunsystems.
Die Atopieentwicklung hängt von zahlreichen Faktoren, wie den Einflüssen
bakterieller Reize ab. LPS ist ein wichtiger bakterieller Reiz für die IL-1-Freisetzung.
IL-1 hat eine zentrale biologische Bedeutung. Die Rolle von IL-1 bei der
Atopieentwicklung ist jedoch noch weitgehend unklar.
In wieweit sich Monozyten zum Zeitpunkt der Geburt durch Bakterienderivate zu
einer Zytokinantwort stimulieren lassen, wurde in dieser Arbeit anhand von in-vitro
Versuchen untersucht.
Es wurde auf folgende Fragestellung eingegangen:
•
Inwieweit können Bakterienderivate zu einer frühen unspezifischen Zytokinproduktion von Monozyten bei Neugeborenen führen?
•
Gibt es Unterschiede in der Stimulierbarkeit von Monozyten zwischen
Neugeborenen mit und ohne Allergierisiko? Unterscheiden sie sich hinsichtlich
ihrer IL-1-Produktion nach Stimulation mit Bakterienderivaten wie LPS?
19
2 Material und Methoden
2.1 Probandenkollektiv
Die Nabelschnurblutproben von den 34 Neugeborenen wurden im Zeitraum vom
25.10.1994 bis zum 27.11.1994 zur Etablierung der Technik, sowie zwischen dem
28.11.1994 und dem 19.12.1994 für die Untersuchungen gewonnen. Die Kinder
wurden im St. Elisabeth Hospital oder in den Augusta Krankenhaus in Bochum
entbunden. Die Eltern der Neugeborenen waren über die Studie und ihre
Forschungsabsichten informiert und gaben eine schriftliche Einwilligung zur
Teilnahme.
Um sicher zu gehen, daß das Immunsystem nicht vorzeitig aktiviert worden war,
oder fehlerhaft arbeitete, stellten Schwangerschaftskomplikationen und
Frühgeburtlichkeit Ausschlußkriterien dar.
In der ersten Woche nach der Geburt wurden genaue Angaben über Verlauf und
Komplikationen während der Schwangerschaft und der Geburt aus den
Geburtsbüchern und von den Eltern erhoben. Des weiteren wurde eine gezielte
Familienanamnese hinsichtlich atopischer Erkrankungen durchgeführt. Dabei wurden
folgende Daten ermittelt:
•
Atopische Erkrankungen der Eltern und Geschwister
•
Anzahl der Geschwister
•
Schwangerschaftsanamnese: Medikamenteneinnahme, Infektionen und
Schwangerschaftsdauer
•
Geburtskomplikationen
•
Geschlecht des Neugeborenen
•
Geburtsgröße und Geburtsgewicht
•
APGAR Werte
Das Atopierisiko eines Neugeborenen wurde anhand des Gesamt-IgE-Wertes im
Nabelschnurblut und / oder aufgrund des Ergebnisses eines validierten Fragebogens
(multizentrische Atopiestudie (MAS), siehe Anhang) festgelegt. Dabei wurde ein
erhöhtes Atopierisiko als positiv ausfallende MAS (siehe Anhang) oder Ig-E-Werte >
0,9 kU/l definiert.
20
Es wurden so zwei Gruppen gebildet, eine Gruppe von Neugeborenen mit erhöhtem
Atopierisiko und eine ohne erhöhtes Atopierisiko.
2.2 Isolierung mononukleärer Zellen
Sofort nach der Entbindung des Neugeborenen wurde Blut aus der Vena umbilicalis
der Plazenta steril entnommen und in sterile 50 ml Reagenzröhrchen zu 10 ml
Pufferlösung gegeben. Die Pufferlösung bestand aus 1 ml HEPES 1M, 1 ml
Penicillin (10000 IE/ml) / Streptomycin (10000 m g/ml) zur Hemmung der
Keimbildung, aus 1 ml Amphotericin 250 mg/ml, sowie 20 ml Heparin-Natrium100
IE/ml zur Gerinnungshemmung; ad 100 ml Hanks Salzlösung (HBSS).
Das mit HBSS im Verhältnis 1:1 verdünnte Nabelschnurblut wurde an der sterilen
Arbeitsbank mit Ficoll-Trennlösung (Dichte = 1,077 g/ml) unterschichtet und
anschließend bei 670 x g Umdrehungen für 20 min zentrifugiert. Die mit
mononukleären Zellen angereicherte Interphase wurde abpipettiert und mit HBSS
wiederholt bei 300 x g für 10 min gewaschen. Die mit Türkscher-Lösung gefärbten
Zellen wurden in einer Neubauer-Zählkammer gezählt und auf eine
Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen / ml Medium eingestellt.
2.3 Untersuchung der mononukleären Zellen
2.3.1 Zellkultur
Das Kulturmedium bestand aus RPMI 1640 und 4 % Zusatzlösung aus :
•
nichtessentiellen Aminosäuren (L-Alanin, L-Asparagin x H2O, L-Asparaginsäure,
L-Glutaminsäure, Glycin, L-Prolin, L-Serin),
•
100 mM Natriumpyruvat,
•
200 mM L-Glutamin,
•
10000 IE / ml Penicillin,
•
10000 mg / ml Streptomycin,
im Verhältnis 1 : 1 : 1 : 0,5 : 0,5.
Die auf 2 x 10 6/ ml Medium verdünnten mononukleären Zellen wurden in 2 ml
Portionen in 2 Petri-Perm Schalen gegeben und mit 2,5 mM Monensin versetzt. Ein
Ansatz wurde mit LPS (1 mg/ml) stimuliert.
21
Anschließend erfolgte die Kultivierung im Inkubator bei 37° C für 8 h in einer 8 %
CO2-haltigen Atmosphäre.
2.3.2 Ernten
Nach 8 h (Ansatz für IL-1-Messung) bzw. nach 2 Stunden (Ansatz für TNFaMessung) wurden die mononukleären Zellen „geerntet“: sie wurden mit HBSS
resuspendiert und bei 300 x g für 10 min zentrifugiert.
Die Zellsuspension wurde im Anschluß mit 1 ml gekühltem 4 % Paraformaldehyd
fixiert und währenddessen mehrfach aufgeschüttelt. Nach 10 min wurde mit HBSS
aufgefüllt, geschüttelt und zentrifugiert. Zur Zellpermeabilisierung wurde
anschließend das Zellpellet in 100 ml Saponinpuffer (HBSS mit 0,01 M HEPES und
0,1 % Saponin) je Ansatz aufgenommen.
2.3.3 Färbung der Monozyten
Die Färbung der Monozyten erfolgte mittels monoklonaler, gegen Monozytenoberflächenantigene und intrazelluläre Zytokine gerichteten Antikörpern, die an die
Fluoreszenzfarbstoffe Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE)
gekoppelt waren.
Zur späteren Darstellbarkeit des intrazellulären Zytokins IL-1 wurde der an FITC
gekoppelte anti-IL-1-Antikörper verwendet. Zur späteren Darstellbarkeit des
intrazellulären TNFa wurde der an FITC gekoppelte anti-TNFa -Antikörper
verwendet.
Um die Monozytenpopulation im Folgenden darstellen zu können, wurde mittels
eines anti-CD14-PE markierten Antikörpers gefärbt.
10 ml anti-IL-1-FITC bzw. anti-TNFa-FITC und 5 ml anti-CD14-PE (entsprechend
Herstellerangaben) wurden in je 100 ml der Zellsuspension gegeben und bei 4° C für
20 min inkubiert. Anschließend wurde 1 ml Saponinpuffer hinzugegeben und bei 200
x g für 5 min der nicht gebundene Anteil des Antikörpers abzentrifugiert. Die
Zellpellets wurden für die durchflusszytometrische Messung in 250 ml HBSS
aufgenommen.
22
2.4 Messung mit dem Durchflußzytometer
Mit dem Durchflußzytometer wurde der Anteil der IL-1 produzierenden Zellen
bestimmt. Das Flowcytometer FACScanTM der Firma Becton Dickinson (San José,
USA) bietet die Möglichkeit, die Fluoreszenzintensität einer Zelle automatisiert zu
messen. Die in einer Suspension enthaltenen weißen Blutzellen werden über eine
Stahlkapillare mit Überdruck in eine Meßküvette eingeführt, so daß sie wie an einer
Perlenkette nacheinander die Meßküvette passieren. Dabei können für jede einzelne
Zelle bis zu 5 Eigenschaften gleichzeitig gemessen werden.
Zu diesem Zweck werden die einzelnen Blutzellen durch einen 488 nm-Laser
bestrahlt. Sind geeignete Fluoreszenz-Marker (z.B. FITC oder PE) an Strukturen der
Blutzellen gebunden, so werden diese zur Fluoreszenz angeregt und emittieren ein
Licht mit einer bestimmten Wellenlänge. Dieses wird von mehreren Detektoren
aufgefangen und entsprechend seiner Intensität und Wellenlänge in ein digitales
Signal umgewandelt. So kann man gleichzeitig bis zu drei verschiedene
Fluoreszenzen einer Zelle getrennt voneinander messen.
Für die einzelnen Leukozytensubpopulationen ist die charakteristische Größe
(Vorwärtslicht) und Granularität (Seitwärtslicht) bekannt, so daß man nun diese im
Dot-Plot markieren kann und für die definierte Anzahl einen dritten Parameter, z.B.
den Anteil der FITC-positiven Zellen bestimmen kann.
Da für uns nur die Eigenschaften der Monozyten von Interesse war, wurde ein
Lifegate gesetzt und somit nur diese Zellen für weitere Information gespeichert. So
konnte die Anzahl der gemessenen Monozyten verhältnismäßig gesteigert werden.
Des weiteren wurde um die Monozytenregion ein Gate gesetzt, und die darin
enthaltenen anti CD14-PE markierten Zellen gegen die anti IL-1-FITS markierten
Zellen, bzw. die CD14-PE markierten Zellen gegen die anti TNFa markierten Zellen
aufgetragen. Die Messwerte werden in Prozent CD14 positiven Zellen ermittelt.
23
Lifegate
Größe!!
Abbildung 2: Durch Größe und Granularität können die Monozyten aus der
Lymphozytenpopulation bestimmt und mit einem Lifegate markiert werden.
2.5 Nabelschnur Gesamt-IgE
Die Bestimmung der Nabelschnur Gesamt-IgE-Werte erfolgte nach Beendigung der
Studie mit konventionellen Immunoassays. Vollblutproben wurden, nachdem sie
geronnen waren, für 15 min mit 1850 x g zentrifugiert, der Überstand in 1,5 ml
Gefäße gefüllt und bei -70° C eingefroren.
Zur Durchführung des Immunoassays gemäß den Herstellervorschriften wurden alle
Proben aufgetaut und jeweils 100 ml zur Analyse entnommen. Die Nachweisgrenze
lag bei 0,18 kU/l. Die Werte wurden nach Doppelbestimmung gemittelt.
24
2.6 Statistik
Es wurde der Wilcoxon-Rangsummentest für unverbundene Stichproben (siehe
Abbildung 5), sowie der Wilcoxon-Vorzeichenrangtest für verbundene Stichproben
(siehe Abbildung 4) angewandt. Graphisch werden empirische Quantile einer
Stichprobe in einem sogenannten Box-and-whiskers-Plot zusammengefasst (siehe
Abbildung 4 und 5). Das bietet eine grobe Information über die Symmetrie der
Verteilung des Medians. Die Box im Box-and-whiskers-Plot wird durch das 25 %und das 75 %-Quantil (auch als 1. und 3. Quartil bezeichnet) begrenzt. In der Mitte
des Kastens ist der Median eingezeichnet. An das obere und untere Ende des Kastens
schließen sich die sogenannten Whiskers („Schnurrhaare“) an. Die Whiskers werden
bis zum 5 %-(95 %-) Quantil (auch 5tes bzw 95stes Perzentil bezeichnet) gezeichnet
(Trampisch und Windeler 2000).
Die Bestimmung des Korrelationskoeffizienten erfolgte nach Spearman. Die
statistischen Berechnungen wurden mit dem Programm PC Statistik Version 1.1
durchgeführt.
25
3 Ergebnisse
3.1 Probandenkollektiv Fragebogenauswertung / Geburtsbuch
An der Studie nahmen 34 Neugeborene teil, 17 weibliche und 17 männliche. Ihr
Geburtsgewicht lag zwischen 2400 g und 4060 g, die Körpergröße variierte zwischen
48 cm und 56 cm. Sie wurden zwischen der 37. und 42. Schwangerschaftswoche
geboren und die von einem Gynäkologen bestimmten APGAR-Werte nach 1, 5 und
10 min lagen zwischen 7 und 10. Das Alter der Mütter lag zwischen 17 und 37
Jahren, das der Väter zwischen 23 und 44 Jahren. Die Neugeborenen hatten zwischen
0 und 2 Geschwister.
3.1.1 Atopierisikogruppe und Nicht-Risikogruppe
Die Probanden konnten zwei Gruppen zugeordnet werden, eine Gruppe mit erhöhtem
Atopierisiko (Risikogruppe) und eine Gruppe ohne erhöhtes Atopierisiko
(Kontrollgruppe). Dabei verteilten sich die Mittelwerte, Minimum / Maximum der
einzelnen Parameter wie folgt:
26
Tabelle 2: Charakterisierung der Probandengruppe
Alter der Mutter (Jahre)
Alter des Vaters (Jahre)
Geschlecht
Geschwisterzahl (Zahl)
Gestationsalter (SSW)
Gewicht (g)
Größe (cm)
APGAR 1 min
APGAR 5 min
APGAR 10 min
Risikogruppe n=19
Kontrollgruppe n=15
29,7
(22 - 37)
32,4
(23 - 44)
männlich/ weiblich
10 / 9
0,8
(0 – 2)
39,2
(36 - 42)
3349
(2350 - 4250)
50,5
(45 - 54)
8,7
(8 - 10)
9,8
(9 - 10)
9,8
(9 - 10)
25,9
(17 - 34)
31,1
(26 - 40)
männlich/ weiblich
7/8
0,9
(0 - 2)
39,4
(36 - 42)
3180
(2650 - 3710)
50,8
(46 - 56)
8,7
(7 - 10)
9,5
(8 - 10)
9,9
(9 - 10)
Darstellung von Median und Minimum / Maximum (in Klammern)
3.1.2 Die Einflußfaktoren
Die Neugeborenen der Risikogruppe und der Kontrollgruppe waren hinsichtlich ihres
Gewichtes, ihrer Größe, ihrer APGAR Werte, der Schwangerschafsdauer, der
Geschwisteranzahl und des Alters der Eltern normalverteilt. Diese Parameter zeigten
keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Risiko- und Kontrollgruppe.
Es fanden sich auch keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, was die
Ernährung und das Rauchverhalten der Mütter betraf. Bezüglich eines vorzeitigen
Blasensprungs oder Schwangerschafts- oder Geburtskomplikationen fanden sich
ebenfalls keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Risiko- und
Kontrollgruppe.
27
3.2 Interleukin-1-Untersuchungen
3.2.1 IL-1-Kinetik
Um den bestmöglichen Zeitpunkt der IL-1-Produktion herauszufinden, wurde die
monozytäre IL-1-Produktion nach Stimulation mit LPS nach 2, 4, 6 und nach 8
Stunden durchflußzytometrisch gemessen. Nach 2 und nach 4 Stunden konnte noch
keine IL-1-Produktion gemessen werden. Nach 6 Stunden konnte eine geringe und
nach 8 Stunden eine zufriedenstellende IL-1-Produktion verzeichnet werden, so daß
in dieser Arbeit im weiteren Verlauf die IL-1-Messung nach 8 Stunden erfolgte (vgl.
Abb. 3).
IL-1 Kinetik
6
5
%
4
3
2
1
0
2
4
6
8
Stunden nach LPS-Stimulation
Abbildung 3: IL-1-Kinetik: Durchflußzytometrische Messung der IL-1
produzierenden Monozyten in Prozent nach 2, 4, 6 und 8 Stunden Stimulation mit
LPS.
28
3.2.2 Unstimulierte und durch Bakterienderivate stimulierte IL-1-Produktion
von Nabelschnurblutmonozyten
Nach 8-stündiger Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) produzieren
Nabelschnur-blutmonozyten Neugeborener unabhängig von einem bestehenden
Atopierisiko vermehrt IL-1. Es konnte durchflußzytometrisch ein signifikanter
Anstieg (p <0,0001) der IL-1 produzierenden und mit LPS stimulierten Monozyten
verzeichnet werden. In den Zellansätzen ohne LPS konnte dieser Anstieg nicht
festgestellt werden (vgl. Abb. 4).
IL-1 produzierende Monozyten in %
IL-1 produzierende Monozyten in %
15
x
10
x
x
5
0
IL-1 ohne LPS
IL-1 mit LPS
Abbildung 4: Einfluß von LPS auf die IL-1-Produktion aller Probanten. Vor und
nach Stimulation mit LPS wurden durchflußzytometrisch die IL-1 positiven
Monozyten ermittelt und in Prozent dargestellt.
29
3.2.3 Zusammenhang der IL-1-Produktion mit dem Atopierisiko
Nach 8-stündiger Inkubation der mononukleären Zellen zeigten sich signifikante
Unterschiede zwischen der Risikogruppe und der Kontrollgruppe hinsichtlich der IL1-Produktion von Nabelschnurblutmonozyten nach Stimulation mit LPS (vgl. Abb.
5).
Abbildung 5: Nach 8-stündiger Stimulation mit LPS wurden duchflußzytometrisch
die IL-1 produzierenden Nabelschnurmonozyten bestimmt und zwischen
Atopierisikogruppe und der Gruppe ohne Atopierisiko verglichen. In der
Atopierisikogruppe waren signifikant mehr IL-1 produzierende Monozyten in
Prozent.
30
3.2.4 IL-1- und TNFa-Produktion im Vergleich
Die IL-1-Produktion der Nabelschnurblutmonozyten nach Stimulation mit LPS steht
in keinem Zusammenhang mit der TNFa-Produktion bei Neugeborenen mit und
ohne Atopierisiko.
In einem Parallelversuch dieser Studie, mit dem selben Probandenkollektiv, wurde
der Anteil der TNFa produzierenden Monozyten im Nabelschnurblut festgestellt und
mit dem Prozentsatz der IL-1 produzierenden Monozyten verglichen. Es konnte
keine Korrelation zwischen den gemessenen Parametern der beiden Gruppen
(Atopierisiko- und Kontrollgruppe) beobachtet werden (vgl. Abb. 6).
Abbildung 6:
Nach Stimulation mit LPS wurden durchflußzytometrisch dieTNFa produzierenden
mit den IL-1 produzierenden Nabelschnurmonozyten von Risiko- und
Kontrollgruppe verglichen. Es besteht keine Korrelation.
31
3.3 Korrelation zwischen IgE und IL-1
Die erhöhten IgE-Konzentrationen korrelieren nicht mit der erhöhten monozytären
IL-1-Produktion im Nabelschnurblut Neugeborener mit und ohne erhöhtem
Atopierisiko.
Weder in der Atopierisikogruppe noch in der Kontrollgruppe korrelieren die mit
Hilfe des Enzymimmunoassays bestimmten, erhöhten IgE-Werte mit der
durchflußzytometrisch
gemessenen
erhöhten
IL-1-Produktion
der
Nabelschnurblutmonozyten nach Stimulation mit LPS (vgl. Abb. 8).
Abbildung 7: Korrelation der IgE-Konzentration (kU/l) im Nabelschnurblut mit dem
Prozentsatz an IL-1 produzierenden Monozyten nach 8 stündiger LPS-Stimulation.
Korrelationskoeffizient r=0,1785, Signifikanzniveau p=0,1563.
32
4 Diskussion
Nabelschnurblutmonozyten von Kindern mit Atopierisiko produzieren signifikant
mehr IL-1, als die Nabelschnurblutmonozyten der Kinder ohne Risiko.
Diese Arbeit wurde durchgeführt um die Frage zu hinterleuchten, welche Rolle
IL-1 bei der Allergieauslösung spielt.
4.1 Bedeutung der erhöhten IL-1-Werte für die Atopieentstehung
Die Ergebnisse unserer Untersuchungen legen nahe, daß IL-1 eine Allergieauslösung
fördert, da die Monozyten der Kinder mit erhöhtem Atopierisiko mehr IL-1
produzieren. IL-1 unterstützt anscheinend die Th2-Differenzierung
So berichtet auch Manetti (1994), daß IL-1 die Prägung der T-Zellen in Richtung IL4 produzierende, allergiefördernde Th2-Zellen begünstigt, welche B-Zellen zur
Produktion von IgE stimulieren (Bergstedt-Lindquist et al. 1988, Finkleman 1988,
Pene et al. 1988 a/b, Del Prete et al. 1988). In der vorliegenden Arbeit ließ sich die
IL-1-Produktion schon zum Zeitpunkt der Geburt steigern, es bestanden
Unterschiede zwischen den Werten bei Neugeborenen mit und ohne Atopierisiko.
Das könnte bedeuten, daß bereits zu diesem Zeitpunkt eine atopiefördernde Prägung
des Immunsystems stattfindet oder bereits stattgefunden hat, bzw. eine genetische
Veranlagungen verstärkt wird oder wurde.
Manetti et al. (1994) sieht IL-1 als Kostimulator für die Th2-Proliferation an. TaylerRobinson et al. (1994) unterstützten diese These. Sie stellten heraus, daß Th2-Zellen
in hoher Dichte IL-1-Rezeptoren exprimieren und durch IL-1 im Wachstum
gefördert werden. Die Th1-Proliferation scheint dagegen jedoch unabhängig von IL1 zu sein. Auch Lichtman et al. (1988) sehen IL-1 als Kostimulator der Th2Proliferation, nicht jedoch der Th1-Proliferation an. Auch sie stellten fest, daß nur
Th2-Zellen die hochaffinen IL-1-Rezeptoren exprimieren.
Es sei darauf hingewiesen, daß andere Untersuchungen zu dem Ergebnis kamen, daß
IL-1 an der Aktivierung von INF-g produzierenden Th1-Zellen beteiligt sein soll, und
somit eher eine allergiehemmende Wirkung haben soll (Skeen und Ziegler 1995,
Fischer et al. 1990).
33
Man darf jedoch nicht außer Acht lassen, daß IL-1 zwar wichtig für die primäre
unspezifische Abwehrreaktion ist, daß es aber nur einer von vielen Faktoren ist, der
zur T-Helferzellaktivierung beiträgt. Zu den früh sezernierten Monokinen gehören
IL-12 und TNF, welche immunstimulierend wirken, sowie IL-10, welches eine
hemmende Wirkung auf das Immunsystem hat. Diese Zytokine leisten ebenfalls
einen wichtigen Beitrag zur T-Zellaktivierung. Welches dieser Zytokine die dabei
vorrangige Rolle spielt, und wie diese Zytokine voneinander abhängen, ist noch nicht
ganz geklärt.
In einem Parallelversuch dieser Studie mit dem selben Probandenkollektiv wurde die
TNFa-Produktion untersucht, in der Annahme es habe eine Bedeutung in der
Allergieauslösung. Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied der TNFaProduktion von Nabelschnurblutmonozyten zwischen den Kindern mit und ohne
Atopierisiko festgestellt werden.
Anderson berichtet (1992), daß als erstes Monokin der frühen unspezifischen
Abwehrreaktion TNFa 2h nach einem Antigen-Kontakt (mit LPS) sezerniert wird.
Ihm folgt das IL-1 und das IL-6 nach ungefähr 4-6 h. IL-12 welches vor allem durch
T N F a induziert wird, wird erst Stunden später sezerniert. Für ein intaktes
Immunsystem ist ein Gleichgewicht dieser Monokine von entscheidender Bedeutung.
Wenn es nun in frühen Lebensabschnitten zu einer überschießenden Aktivierung
oder Hemmung dieser Zytokinproduktion kommt, kann dies zu der Entwicklung
einer Atopie beitragen. Die Funktion des IL-10 z.B., welches die Produktion der
anderen frühen Monokine herunterregeln kann, ist von großer Bedeutung. Es vermag
das Immunsystem vor überschießenden Entzündungreaktionen zu bewahren (De
Waal Malefyt et al. 1991 und Fiorentino et al. 1991).
4.2 Der IL-1-Rezeptor und die Signaltransduktion
Der IL-1-Rezeptor (IL-1RI) interagiert mit dem IL-1-Rezeptor assoziiertem Protein
(IL-1RAcP) und formiert einen Komplex, der die Signaltransduktion auslöst. Die
Aktivierung des Komplexes durch IL-1 steigert die Bildung einer großen Anzahl
entzündungstypischer Gene. Es gibt zahlreiche Rezeptoren bei Säugetieren, die
homologe rezeptorartige Proteine besitzen, sowie die der Drosophila Fruchtfliege
namens Toll. So existiert eine IL-1R/ toll-like receptor (TLR) superfamily mit ihrer
34
Toll/ IL-1R (TIR) Domäne. Bis jetzt sind 6 TLRs bekannt. Die Superfamilie teilt sich
in 2 Hauptgruppen, die eine hat 3 Immunglobulindomänen, die andere hat
extrazelluläre Leuzinketten.
IL-1, IL-18 und LPS, alle zur IL-1/ TLR superfamily gehörend, haben die gleichen
Aktivierungswege. MyD88 ein rein zytosolisches Protein fungiert als Adapter der
Superfamilie. Es verbindet die TIR Domäne mit den stromabwärts liegenden
Signalproteinen, der IL-1R assoziierte Kinase (IRAK) oder dem TNF-Rezeptor
assoziierten Faktor 6 (TRAF-6). Die aktivieren wiederum den Transkriptionsfaktor
NF-kB, p38 mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) und N-terminale Kinase
(JNK), (O’Neill und Dinarello 2000). Siehe Abbildung 9.
Aufgrund dieser Erkenntnisse gibt es Überlegungen die MyD88-Rekrutierung und
somit die Signalausbreitung und die damit verbundenen Entzündungsreaktionen z.B.
bei der Behandlung der Sepsis, zu unterbinden. Man ist auf der Suche nach einem
Molekül, einem antiinflammatorischen Agens.
35
LPS
CD14
TLR-4
IL-18RAcP
IL-18R
IL-1RI
LBP
IL-18
IL-1RAcP
IL-1
TIR
domain
MyD88
MyD88
IRAK-1 IRAK-2
TRAF-6
≈
≈
≈
NF-kB
p38
JNK
Abbildung 9: Signaltransduktion der IL-1-, IL-18- und TLR-4-Rezeptoren
36
Die Tatsache, daß IL-1 bei so vielen Entzündungs- und immunregulatorischen
Prozessen beteiligt ist und von so vielen verschiedenen Zellen gebildet wird, stellt
die besondere und zentrale biologische Bedeutung des IL-1 heraus:
IL-1 gehört zu den Zytokinen, die frühzeitig ausgeschüttet werden und deshalb
richtungsweisend für die Immunantwort sind, da IL-1 einen entscheidenden Einfluß
auf die Differenzierung der T-Helferzellen zu allergieprotektiven Th1-Zellen oder
allergiefördernden Th2-Zellen hat (vgl. 1.1) (Fischer et al. 1990, Schmitz,
Assenmacher und Radbruch 1993, Tayler-Robinson und Phillips 1994, Manetti et al.
1994).
In der vorliegenden Untersuchung wurde die IL-1-Produktion von
Nabelschnurblutmonozyten untersucht.
Für die Allergieauslösung ist die Rolle der Monozyten von großem Interesse.
4.3 Die Rolle der Monozyten in der Atopieentstehung
Monozyten sind in drei verschiedenen Stadien der Immunantwort beteiligt. Zeitlich
an erster Stelle steht die Beteiligung der Monozyten an dem schnellen protektiven
Mechanismus der frühen unspezifischen Abwehr.
Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit scheinen die Monozyten bereits in
diesem Stadium einen Einfluß auf eine Atopieentwicklung zu haben. Durch
Zytokinsekretion, beispielsweise dem in dieser Arbeit gemessenen IL-1, greifen sie
modulierend in das Immunsystem ein. Die Monozyten Neugeborener produzieren
mit einem zum Zeitpunkt der Geburt erhöhten Atopierisiko mehr IL-1, als die
Monozyten der Kontrollgruppe.
Im zeitlichen Verlauf spielen die Monozyten des weiteren auch als
antigenpräsentierende Zellen bei der Ausbildung einer Atopie eine Rolle. Sie können
bei der T-Helferzellaktivierung zu einem atopiefördernden Th2-typischen
Zytokinmuster, mit Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10 und nachfolgender IgEFreisetzung führen (Taylor-Robinson und Phillips 1994, Lichtman et al. 1988).
Zuletzt haben die Monozyten in der Effektorphase einen Einfluß auf die Entwicklung
einer Atopie. Monozyten können auf bestimmte Mediatoren, die an ihre
37
Oberflächenrezeptoren binden, mit einer charakteristischen Immunantwort reagieren.
Für die IgE-Bindung wird beispielsweise der niederaffine Fce RII auf der
Monozytenoberfläche exprimiert. B-Zellen tragen normalerweise Fce RIIa auf ihrer
Oberfläche, während die Expression des Fce RIIb auf T-Zellen, B-Zellen,
Monozyten und Eosinophilen eine Induktion durch IL-4 benötigt.
Bei Atopikern kann eine verstärkte Expression von dem Fce RIIb+ zeitgleich zu
einem IgE-Anstieg beobachtet werden (Brostoff und Hall 1995). Es konnte
festgestellt werden, daß mit spezifischem IgE sensibilisierte Alveolarmakrophagen
auf einen folgenden Allergenkontakt Fce RIIb exprimieren und Enzyme sezernieren.
Diese Zellen scheinen an der Entstehung von allergieinduzierten Lungenkrankheiten
wie Asthma und Alveolitis beteiligt zu sein.
Kim et al. fanden 1990 heraus, daß Fce RII im Nabelschnurblut von Kindern, die
später eine Atopie entwickelten, höher war als im Blut von Kindern, die frei von
atopischen Symptomen blieben. Die Inzidenz der Entwicklung atopischer Symptome
stieg mit dem Anstieg der Nabelschnurblut Fce RII.
In der vorliegenden Arbeit wurden bewußt Nabelschnurblutmonozyten untersucht, es
sollte das Immunsystem zum Zeitpunkt der Geburt untersucht werden. Inwieweit
sind zu diesem Zeitpunkt die Monozyten an einer Allergieauslösung beteiligt?
4.4 Charakterisierung der Nabelschnurblutmonozyten (CBMC)
Die vorliegende Arbeit zeigt, daß sich schon Nabelschnurblutmonozyten, die mit
Bakterienderivaten stimuliert werden, zu einer verstärkten IL-1-Produktion anregen
lassen, also schon zum Zeitpunkt der Geburt über eine funktionsfähige primäre und
unspezifische Abwehrreaktion verfügen.
Dies ist erstaunlich, da Neugeborene über ein noch weitgehend unreifes
Immunsystem verfügen (Belohradsky und Marget 1989). Die Leukozyten bestehen
aus vorwiegend unreifen Vorstufen und haben ihre Funktionsfähigkeit noch nicht
vollständig erlangt. Die Monozyten scheinen dabei eine Ausnahme darzustellen, da
sie zu einer regelrechten Immunantwort in der Lage sind, wie Untersuchungen von
Speer et al. (1986) und Roncarolo et al. (1994) belegen. Er stellte fest, daß die
Adhärenz, die chemotaktische Antwort und die Phagozytosekapazität der
38
Nabelschnurmonozyten mit den Eigenschaften von Monozyten Erwachsener
vergleichbar sind. Weiterhin gibt es Untersuchungen (Roncarolo et al. 1994), die
zeigen, daß aktivierte Nabelschnurmonozyten die gleiche Fähigkeit zur ZellStimulation wie periphere Blut Monozyten (PBMC) haben, und daß CBMC im
gleichen Maße IL-2, IL-6 und TNFa nach Aktivierung produzieren wie PBMC.
4.5 Wirkung bakterieller Stimuli auf das Immunsystem
4.5.1 LPS als Bakterienprodukt – welche Rolle spielt es bei der Auslösung von
Allergien
Die Ergebnisse dieser Untersuchung bestätigen, daß LPS in-vitro einen wirksamen
Stimulus
für
die
Monozyten
darstellt.
In
dieser
Arbeit
wurden
Nabelschnurblutmonozyten untersucht, die noch keinen Kontakt mit E. coli, bzw.
LPS hatten, da sie in uteri noch nicht den Magen-Darm-Trakt des Fötus besiedeln
(s.o.). Somit simulierte die in-vitro-LPS-Stimulation dieser Untersuchung die
immunologischen Vorgänge, die sich in den ersten Lebenswochen im Organismus
des Säuglings abspielen, wenn er in Kontakt mit dem bakteriellen Toxin von E. coli,
bzw. deren pathogenen Stämmen gerät.
Da LPS im in-vitro-Versuch zu einer Immunantwort mit IL-1-Sekretion der
Monozyten führte, stellt sich die Frage, ob schon geringe Mengen des bakteriellen
Toxins LPS, wie sie physiologisch im Körper vorkommen, ebenfalls zu einer
gesteigerten IL-1-Sekretion in-vivo führen. Sind also die Ergebnisse der in-vitroVersuche auf die Immunreaktion des Säuglings in den ersten Lebenswochen
übertragbar, stellt sich die Frage, ob die erhöhte IL-1-Produktion eine
allergiefördernde oder -hemmende Wirkung hat.
Das Immunsystem reagiert auf bakterielle Stimuli mit einer T-Zell-unabhängigen,
zellvermittelten Immunabwehr durch direkte Aktivierung des Komplementsystems
und unmittelbarer Stimulation von Monozyten, Neutrophilen, Makrophagen und
Natürliche-Killer-Zellen. Diese Zellen werden nach Phagozytose der Bakterien oder
direkt durch ein Toxin aktiviert. Lipopolysaccharid (LPS) ist ein solches bakterielles
Toxin. Es bindet zusammen mit dem Lipopolysaccharid bindenden Protein (LBP) an
den CD14 Rezeptor der Monozyten (Tobias und Ulevitch 1993), woraufhin diese im
39
aktivierten Zustand entzündungsfördernde Zytokine, vor allem IL-1 und TNFa sowie
entzündungshemmende Zytokine wie IL-10 sezernieren (Cavaillon und HaeffnerCavaillon 1990, Couturier et al. 1991, Henderson und Wilson 1996). Die
Signaltransduktionskette ist aufgeklärt (O’Neill und Dinarello 2000). Siehe
Abbildung 9.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen die Schlußfolgerung zu, daß LPS über die
Stimulation der Monozyten mit konsekutiver IL-1-Sekretion zu einer
atopiefördernden Th2-Antwort des Immunsystems führt, da die IL-1-Sekretion der
Monozyten von Atopieriskokindern signifikant höher als die von Nichtrisikokindern
ist. Bekanntermaßen führt aber die Stimulation durch Bakterienderivate zu einer
atopiehemmenden Th1-Antwort. Der Grund hierfür könnte darin liegen, daß die
Zellen der Kinder ohne Risiko im Allgemeinen empfindlicher, und somit zu einer
gesteigerten IL-1-Sekretion fähig sind. Es könnte auch einen Einfluß gehabt haben,
daß LPS als Stimulus verwendet wurde, welcher anders als andere bakterielle Stimuli
wirkt. Außerdem wurde in der vorliegenden Arbeit nur IL-1 gemessen. LPS wirkt
jedoch auch auf andere Zytokine, wie beispielsweise IL-12, welches die Reaktion
von IL-1 maßgeblich beeinflussen bzw. aufheben kann. Die Tatsache, daß TNFa in
der vorliegenden Arbeit keine Korrelation zur IL-1-Produktion aufwies, spricht auch
dafür, daß andere Zytokine andere Regulationsmechanismen haben. Aufgrund der
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist auch folgende Schlußfolgerung zulässig: IL-1
wirkt indirekt ebenfalls auf die Th-1-Entwicklung. Ein Entzug von LPS in den ersten
Lebenstagen oder Lebensmonaten könnte dazu führen, daß die Th2-Antwort geringer
ausfällt.
4.5.2 Weitere bakterielle Stimuli
Bakterienbestandteile gram-positiver und gram-negativer Bakterien sind in der Lage,
Monozyten zur Sekretion von Zytokinen (z.B. IL-1) zu stimulieren. Die bakteriellen
Stimuli wurden bereits erläutert.
Man kann feststellen, daß Bakterien neben dem LPS eine Vielzahl von
zytokininduzierenden Proteinen, Carbohydraten und Lipiden beinhalten oder
produzieren. Jedoch ist keines so geeignet und gut charakterisiert wie das LPS,
weswegen LPS als Stimulus für die Nabelschnurblutmonozyten zur IL-1-Freisetzung
in der vorliegenden Arbeit ausgewählt wurde.
40
4.6 Intrazelluläre durchflußzytometrische Zytokinbestimmung
Mit dem Durchflußzytometer wurde in der vorliegenden Arbeit die monozytäre
IL-1-Produktion gemessen.
Mit Hilfe des Durchflußzytometers ist es möglich geworden, intrazelluläre Zytokine
nach Fixierung, Permeabilisation und indirekter Immunfluoreszenzfärbung
flowzytometrisch zu analysieren. Es kann somit bestimmt werden, auf welche Zellen
einer heterotropen Zellpopulation die gemessene Zytokinproduktion zurückzuführen
ist, ohne eine Zelltrennung vornehmen zu müssen.
Die Untersuchungen mit dem Durchflußzytometer haben in den letzten Jahren
zunehmend an Bedeutung gewonnen, vor allem bei der Analyse der Lymphozyten
und Lymphozytensubpopulationen. In dieser Arbeit konnte erstmalig die
Zytokinproduktion der Monozyten dank der von Jung entwickelten Methode zur
Lymphozytendiskriminierung bestimmt werden.
Diese sensitive Methode vermag die genaue Durchflußfrequenz zu bestimmen,
welches heißt, daß die gemessene Zytokinproduktion auf eine bekannte Zellzahl
zurückzuführen ist. Es wird der Prozentsatz der Zytokin-sezernierenden Monozyten
bestimmt. Hingegen kann keine Aussage über die Produktionsrate getroffen werden,
mit der man die Zytokinproduktion einzelnen Zellen zuschreiben kann. Es konnte
jedoch in diversen Studien (Pohl et al. 1997, Jung et al.1993) eine hohe Konkordanz
zwischen der durchflußzytometrisch bestimmten intrazellulären Zytokinmessung und
der mit Hilfe eines ELISA-Testes bestimmten Zytokine im Überstand der Zellkultur
festgestellt werden. So kann man in der vorliegenden Arbeit von dem Anteil der
IL-1 sezernierenden Monozyten auf die realen IL-1-Konzentration rückschließen.
Es gibt neben dem Durchflußzytometer verschiedene Methoden der
Zytokinbestimmung. Das Fluoreszenzmikroskop beispielsweise wurde von dem
Durchflußzytometer abgelöst, da jenes den wesentlichen Vorteil hat, daß es bis zu
fünf Eigenschaften (davon drei verschiedene Fluoreszenzfarben) gleichzeitig messen
kann. Vor allem ist das Arbeiten mit dem Durchflußzytometer schneller und
objektiver und die Zahl der analysierten Zellen liegt mit ca. 1000 Zellen / Minute
auch weitaus höher als beim Fluoreszensmikroskop.
Der ELISA-Test ist eine Methode, mit der Zytokine im Zellüberstand einer Kultur
mittels spezifischer Antikörper gemessen werden können.
41
Die Unterschiede im Ausmaß der Zytokinproduktion und Bestimmung mit dem
ELISA-Test können auf die schwankenden Monozytenzahlen der untersuchten
Probanden zurückgeführt werden. Bei konstanten Monozytenzahlen bestünde ein
Vorteil des ELISA-Tests gegenüber dem Durchflußzytometer darin, daß die
Produktionsrate exakt zu bestimmen wäre, jedoch nur bei gereinigten Zellen.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht eine Zytokinanalyse auf m-RNA
Niveau und läßt keine direkten Aussagen über die DNA- und die Proteinebene zu,
welchen in der vorliegenden Arbeit das Interesse gilt. Quantitative Aussagen mit
Hilfe der PCR stellen ein aufwendiges und kostenspieliges Verfahren dar.
Im Gegensatz zum ELISA und der PCR ist die Messung mit dem
Durchflußzytometer materialsparender. Es werden wesentlich geringere Blutmengen
benötigt, weshalb es in dieser Arbeit, in der verschiedene Parallelversuche liefen,
angewendet wurde.
Messung der IL-1-Produktion:
In dieser Studie wurde die IL-1-Produktion der Monozyten mit Hilfe des anti-IL-1FITC untersucht. Die Charakterisierung der Monozyten erfolgte dabei mit antiCD14-PE. Die Zugabe von Monensin sicherte, daß das IL-1 im Golgi-Apparat
akkummulierte (Jung et al. 1993). Durch die zusätzliche Inkubation mit
Paraformaldehyd und Saponin wurde gewährleistet, daß die Zellpermeabilität erhöht
wurde, und so das von den Monozyten produzierte IL-1 das anti-IL-1 binden konnte,
ohne daß Oberflächenstrukturen wie CD14 zerstört werden (De Caestecker et al.
1992). Für eine unspezifische Bindung des anti-IL-1 an andere Zellstrukturen gibt es
in der Literatur keinen festen Anhalt, somit ist davon auszugehen, daß die Messung
die tatsächliche IL-1-Produktion (Konzentration nach Fixierung) der Monozyten
erfasste. Dies wird durch Ergebnisse anderer Studien bestätigt (De Caestecker et al.
1992, Jung et al. 1993), die mit der gleichen Methode einen reproduzierbaren
Anstieg der intrazellulären IL-1-Konzentration nach LPS-Stimulation beobachten
konnten.
42
4.7 Einflußfaktoren der Atopieentstehung
Viele Untersuchungen beschäftigen sich mit Einflußfaktoren der Atopieentstehung.
In einigen Studien wurde, wie in der vorliegenden Arbeit, Nabelschnurblut
untersucht, um Aussagen über das Immunsystem zum Zeitpunkt der Geburt machen,
und sich mit Präventivmaßnahmen auseinandersetzen zu können. Häufig wurden
dabei erhöhte IgE-Werte mit einer Atopie gleichgesetzt, da sich IgE als prädiktiver
Wert einer Atopieentstehung bewehrt hat (Croner und Kjellman 1990, Bousquet,
Ménardo und Michel 1984, Odelram et al. 1995, Lilja et al. 1990, Bergmann et al.
1993 und 1995).
Auch in der vorliegenden Arbeit war die IgE-Konzentration im Nabelschnurblut von
Neugeborenen mit Atopierisiko signifikant höher als bei den Kindern ohne
Atopierisiko. Die erhöhten IgE-Konzentrationen korrelieren jedoch nicht mit der
erhöhten monozytären IL-1-Produktion von Kindern mit und ohne erhöhtem
Atopierisiko.
Einfluß genetischer Veranlagung auf die Atopieentwicklung:
Es
besteht
ein
Unterschied
im
Ausmaß
der
IL-1-Sekretion
der
Nabelschnurblutmonozyten in Abhängigkeit eines bestehenden Atopierisikos zum
Zeitpunkt der Geburt. Die Tatsache, daß die Schleimhäute wie oben erwähnt noch
nicht mit (fakultativ) pathogenen Bakterien bzw. Bakterienbestandteilen besiedelt
sind, und die endgültige Ausreifung des Immunsystems mit der Geburt beginnt,
spricht dafür, daß genetische Veränderungen zu der veränderten Reaktionsweise der
CBMC beigetragen haben.
Postma et al. beschrieben 1995 die enge Nachbarschaft der Gene, die für die
Regulation des IgE-Niveaus und die Entwicklung eines hyperreagiblen
Bronchialsystems verantwortlich sind. Die Genorte, die für die Zytokine IL-4, IL-5,
IL-13 und für CD14 kodieren, konnten in nächster Nachbarschaft auf dem
Chromosomen 5q31 lokalisiert werden. Es liegt die Vermutung nahe, daß sie
gemeinsam vererbt werden. Der Synergismus dieser Zytokine könnte entscheidend
für die Ausprägung einer Atopie sein. Inzwischen sind eine Vielzahl von Genorten
lokalisiert, die für die Atopieentstehung mitverantwortlich sind (Kabesch 2001).
43
4.8 Atopiemarker im Nabelschnurblut
Seit Jahren ist man auf der Suche nach Vorhersagemöglichkeiten einer Atopie bereits
zum Zeitpunkt der Geburt. Es wäre erstrebenswert, anhand eines Wertes eine
Aussage über eine spätere Atopiemanifestation treffen und somit geeignete
Präventivmaßnahmen ergreifen zu können. Der IgE-Wert war in den 80er Jahren ein
Hoffnungsschimmer bei diesen Bestrebungen. In 67 % der Fälle gehen erhöhte IgEWerte zum Zeitpunkt der Geburt mit einer späteren Atopiemanifestation einher
(Croner und Kjellman 1990). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt
werden, daß das IgE bei Neugeborenen mit Atopierisiko signifikant höher ist als bei
Neugeborenen ohne Atopierisiko.
Jedoch erscheint es wenig sinnvoll, IgE als Screening-Wert für die
Vorhersagemöglichkeit einer Atopieentstehng einzuführen. Die IgE-Werte sind
äußerst spezifisch aber nicht sehr sensitiv. Die Sensitivität
der
Vorhersagemöglichkeit der IgE-Werte war im Vergleich zu der der
Familienanamnese niedrig, die Spezifität war hingegen im Vergleich zu der
Familienanamnese sehr hoch (Croner und Kjellman 1990).
Es wurden noch weitere Marker auf ihre Vorhersagemöglichkeit hinsichtlich einer
Atopiemanifestation untersucht:
Hattevig et al. (1984) untersuchte IgE-Werte. Er stellte fest, daß sich bei Kinder mit
stark erhöhten IgE-Werten (>1,3 kU/l) eine Atopie manifestierte. Ergebnisse von
Kim et al. (1990) deuteten einen Zusammenhang zwischen Fce RII und der
Entwicklung einer atopischen Funktionsstörung an, denn der IgE bindende Faktor
war im Nabelschnurblut von Kindern, die später eine Atopie entwickelten, höher als
im Blut von Kindern, die frei von atopischen Symptomen blieben. Magnusson und
De Weck (1989) betrachteten die Thrombozytenzahlen von Neugeborenen. Sie
waren bei Neugeborenen mit erhöhten IgE-Werten (>1.20 kU/l) erniedrigt, und die
Kinder, die im Folgenden eine Atopie entwickelten, hatten zum Zeitpunkt der Geburt
niedrigere Thromozytenwerte, als solche, die keine atopischen Symptome zeigten.
Des weiteren beobachteten verschiedene Autoren eine Veränderung
der
Fettsäurezusammensetzung bei Allergikern (Strannegard et al. 1987 und Rocklin et
al. 1986). Außerdem konnte eine veränderte Phosphordiesterase-Aktivität bei
Atopikern bzw. Neugeborenen mit positiver Familienanamnese festgestellt werden
44
(Grewe et al. 1982, bzw. McMillan et al. 1985). Es gibt auch Äußerungen, die eine
Veränderung der T-Zellen bei Atopikern beobachtet haben wollen (Juto und
Strannegard 1979): z.B. Defekte der T-Zellregulation (Chandra und Baker 1983).
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß kein Marker für sich betrachtet, ausreichen
würde eine Atopieentstehung vorhersehen zu können.
Außerdem sollte geklärt werden, ob diese Veränderungen im Nabelschnurblut wie
die in der vorliegenden Arbeit gemessenen erhöhten IL-1-Werte oder die anderen
eben erwähnten Marker, nicht sekundäre Veränderungen auf eine genetisch
determinierte Veranlagung sein können. Vielleicht können die gemessenen
Veränderungen aber auch eine Reaktion auf eine Sensibilisierung in uteri auf
mütterliche Allergene sein.
45
5 Zusammenfassung
Zahlreiche Untersuchungen konnten die zentrale Rolle der Monozyten im
Immunsystem und im Speziellen die Rolle bei der Entwicklung einer Atopie
herausstellen.
In
der
vorliegenden
Arbeit
wurde
insbesondere
die
Rolle
der
Nabelschnurblutmonozyten bei der Atopieentstehung näher beleuchtet.
Ziel dieser Arbeit war es, zu zeigen, ob und in wieweit sich Monozyten zum
Zeitpunkt der Geburt zu einer Zytokinantwort durch Lipopolysaccharid stimulieren
lassen, und in wieweit die Stimulierbarkeit von einem bestehenden Atopierisiko der
Neugeborenen abhängt.
Die mononukleären Nabelschnurblutzellen von 19 Neugeborenen mit und 15
Neugeborenen ohne Atopierisiko wurden 8 Stunden mit Lipopolysaccharid (LPS)
stimuliert.
Anschließend konnte die Monozytenpopulation mittels des Oberflächenmarkers antiCD14-PE und des IL-1-Antikörpers (anti-IL-1-FITC) hinsichtlich ihrer IL-1Produktion durchflußzytometrisch analysiert werden.
Nabelschnurmonozyten ließen sich durch LPS zu einer gesteigerten IL-1-Produktion
stimulieren, wobei die Monozyten der Neugeborenen mit Atopierisiko signifikant
mehr IL-1 produzierten als die Monozyten der Kinder der Kontrollgruppe.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß IL-1 eine atopiefördernde Wirkung auf das
Immunsystem hat. Nabelschnurblutmonozyten verfügen zum Zeitpunkt der Geburt
über eine funktionsfähige primäre unspezifische Abwehr, da sie sich durch LPS zu
einer verstärkten Zytokinproduktion stimulieren lassen. Dieses zeigt, daß die
Nabelschnurblutmonozyten in diesem frühen Stadium bereits einen Einfluß auf die
Atopieentwicklung haben.
46
6 Ausblick
Die Ergebnisse dieser Untersuchung legen nahe, daß die Monozyten an der Prägung
des Immunsystems bezüglich einer Atopie beteiligt sind. Monozyten atopisch
veranlagter Neugeborener produzieren vergleichsweise mehr IL-1 und können so die
Prägung der T-Helferzellen stärker beeinflussen als Monozyten Neugeborener ohne
erhöhtes Atopierisiko.
Monozyten agieren als APC, jedoch können Dendritische Zellen im Vergleich dazu
in wesentlich höherem Maße T-Zellen aktivieren und T-zellabhängige Zytokine wie
das IL-2 und IFN-g induzieren. Das mag an einer höheren Expression von CD80,
MHCII und ICAM I auf der Oberfläche von den Dendritischen Zellen liegen, die
ihnen eine besonders wirksame Trauben-/ Gruppenbildung mit den T-Zellen
ermöglicht (Kanangat et al. 1995). Anscheinend sind die Dendritischen Zellen die
bedeutenderen APC, sie sind hauptsächlich für die T-Zellaktivierung mit
konsekutiver Zytokinausschüttung verantwortlich. Es wäre also sinnvoll das
Augenmerk bei zukünftigen Untersuchungen auf die Dendritischen Zellen und deren
Rolle in der Immunantwort zu richten.
Zur Klärung der Frage, welche Auswirkungen die permanente low-dose Freisetzung
auf das Immunsystem hat, bedarf es zukünftig weiterer Untersuchungen, in denen
mit verschiedenen LPS-Konzentrationen stimuliert werden sollte.
47
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63
8 Appendix
Fragebogen zur Bestimmung des familienanamnestischen Allergierisikos
1
Haben oder hatten Sie ein juckendes Ekzem beim Kontakt bestimmter Dinge mit
der Haut, z.B. unechtem Schmuck, oder nach Einnahme von Medikamenten?
1
Leiden oder litten Sie jemals an einer Neurodermitis (auch endogenes Ekzem
oder atopische Dermatitis genannt)?
2
Hatten Sie wiederholt Nesselsucht, auch Urtikaria genannt, mit Quaddeln wie
nach Brennessel-Kontakt und/oder Schwellungen an Lippen und Augen?
3
Leiden oder litten Sie - ohne dabei erkältet zu sein - an einer juckenden,
verstopften oder laufenden Nase und/oder an verschwollenen, juckenden Augen,
und zwar regelmäßig im Frühjahr oder Sommer oder fast immer bei Umgang mit
bestimmten fell- oder federtragenden Tieren?
4
Haben oder hatten Sie einen Heuschnupfen (allergischen Schnupfen) oder
allergische Bindehautentzündung?
5
Leiden oder litten Sie an allergischem Asthma (Bronchial-Asthma)?
6
Reagieren Sie regelmäßig auf bestimmte Nahrungsmittel allergisch (Nesselsucht,
Verschlimmerung eines Ekzems, Übelkeit, Erbrechen, Durchfall, Asthma)?
7
Wurde bei Ihnen schon einmal eine Allergietestung vorgenommen, und hat der
Test die Allergie nachgewiesen?
8
Wurde bei Ihnen schon einmal eine Hyposensibilisierung (Desensibilisierung,
Spritzenkur) zur Allergie-Behandlung vorgenommen?
9
Sind bei Ihren leiblichen Kindern folgende Erkrankungen aufgetreten oder von
einem Arzt diagnostiziert worden?
64
a) wiederholte Bronchitis mit pfeifender Atmung
b) Asthma oder asthmoide Bronchitis
c) Heuschnupfen (allergischer Schnupfen)
d) Milchschorf und/oder juckendes Ekzem besonders in Ellbogen und
Kniekehlen
e) Nesselsucht (Urtikaria)
g) Nahrungsmittelallergie (wie oben beschrieben)
Auswertung des Fragebogens
Das Neugeborene wurde der Atopierisikogruppe zugeordnet, wenn
eine der Fragen 2, 4, 5, 6, 10b, 10c, 10e
und/oder
zwei oder mehr der Fragen 10a, 10d, 10f, 10g
und/oder
drei oder mehr der Fragen 3, 7, 8, 9
von der Mutter oder dem Vater des Kindes mit ja beantwortet wurden.
65
Danksagung
Mein herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn PD Doktor Schauer, der mir
das Thema überließ und diese Arbeit ermöglichte. Er stand mir in allen Fragen mit
Rat und Tat zur Seite.
Dem Team des immunologischen Labors der Kinderklinik danke ich für die
Hilfsbereitschaft und Unterstützung.
Außerdem möchte ich auch noch meinen Eltern und Freunden danken. Sie waren
hilfsbereit, verständnisvoll und motivierten mich immer wieder.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Geburtstag/-ort
Anschrift
Telefon
Familie
Claudia Julia Bockelmann
16. November 1971, Ruit
Frickestraße 49, 20251 Hamburg
040-46856181
Mutter: Wilma Bockelmann (Kinderärztin)
Vater: Friedrich Bockelmann (Dipl. Ingenieur)
Schwester: Bettina; 1970 (Dipl. Ingenieurin)
Schulausbildung:
1978-1982
1982-1991
Juni 1991
Lindenschule (Grundschule) in Ostfildern
Heinrich-Heine-Gymnasium in Ostfildern
Abitur
Studium:
an der Ruhr-Universität Bochum
1991-1993
1993-1996
1993
1994
1996
1997-1998
1998
Vorklinischer Studienabschnitt
Klinischer Studienabschnitt
Physikum
1. Staatsexamen
2. Staatsexamen
Praktisches Jahr in Remscheid und Neuchâtel (Schweiz)
3. Staatsexamen
Auslandsfamulaturen in Chile und USA
Berufliche Tätigkeit
Mai 1998Oktober 2001
Arbeit als Ärztin in der Vestischen Kinderklinik
Datteln.
Seit November 2001 Arbeit als Assistenzärztin im Katholischen Kinderkrankenhaus
Wilhelmstift in Hamburg