Die Induktion von Interleukin-10 in humanen T-Helfer
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DIE INDUKTION VON INTERLEUKIN-10 IN HUMANEN T-HELFER-ZELLEN UND SEINE TRANSKRIPTIONELLE REGULATION vorgelegt von M.Sc. JONAS AHLERS geb. in Salzkotten von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades DOCTOR RERUM NATURALIUM (DR. RER. NAT.) genehmigte Dissertation Promotionsausschuss Vorsitzender: Prof. Dr. Juri Rappsilber Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster Gutachter: Prof. Dr. Alexander Scheffold Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 19.07.2017 Berlin 2017 „Bilde dich selbst, und dann wirke auf andere durch das, was du bist.“ - Wilhem von Humboldt INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG ................................................................................................................................. 1 1.1 Überblick über das Immunsystem .................................................................................................. 2 1.1.1 Angeborene und adaptive Immunität.............................................................................. 2 1.1.2 Biologie der T-Zellen ..................................................................................................... 3 1.2 TH-Zell-Differenzierung ................................................................................................................. 3 1.3 Oberflächenrezeptoren von TH-Zellen ........................................................................................... 5 1.3.1 Oberflächenrezeptoren von naiven TH-Zellen ................................................................ 6 1.3.2 Oberflächenrezeptoren von memory TH-Zellen .............................................................. 6 1.4 TH-Subpopulationen ....................................................................................................................... 6 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 1.4.5 TH1-Zellen ...................................................................................................................... 6 TH2-Zellen ...................................................................................................................... 7 TH17-Zellen .................................................................................................................... 7 TH1/17-Zellen ................................................................................................................. 7 TCM, TEM und TEMRA ........................................................................................................ 8 1.5 Regulatorische T-Zellen ................................................................................................................. 9 1.6 Interleukin-10 und seine regulatorische Wirkung .......................................................................... 9 1.7 IL-10-Expression in T-Zellen ....................................................................................................... 10 1.7.1 Foxp3+ regulatorische T-Zellen .................................................................................... 10 1.7.2 Foxp3− regulatorische T-Zellen .................................................................................... 11 1.7.3 Induktion von IL-10 in humanen TH-Zellen ................................................................. 12 1.8 Transkriptionelle Regulation von IL-10 in TH-Zellen .................................................................. 12 1.8.1 Der JAK-STAT-Signalweg .......................................................................................... 13 1.8.2 Zytokin-vermittelte Induktion von IL-10 in TH-Zellen ................................................ 13 1.9 Inhibitorische Rezeptoren auf TH-Zellen...................................................................................... 14 1.10 Der Transmembranrezeptor Notch .......................................................................................... 15 1.10.1 Signaltransduktion vermittelt durch Notch ................................................................. 15 1.10.2 Der Einfluss von Notch auf die IL-10-Produktion in TH-Zellen ................................ 16 2 ZIELSETZUNG ............................................................................................................................ 17 3 MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................ 19 3.1 Material ........................................................................................................................................ 20 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 3.1.10 3.1.11 3.1.12 3.1.13 3.1.14 Medien und Puffer ........................................................................................................ 20 Antikörper ..................................................................................................................... 20 Rekombinante Proteine ................................................................................................. 21 Materialien zur Stimulation von T-Zellen .................................................................... 21 Reagenzien zur Zellstimulation .................................................................................... 21 Materialien zur magnetischen Zellsortierung (MACS) ................................................ 22 Material für mRNA-Isolation, reverse Transkription, Real-Time-PCR ....................... 22 Primer ........................................................................................................................... 22 siRNAs .......................................................................................................................... 24 Kits .............................................................................................................................. 24 Andere Reagenzien ..................................................................................................... 24 Geräte .......................................................................................................................... 24 CED-Patienten: Zugrundeliegende Krankheit und klinische Daten ........................... 26 Software ...................................................................................................................... 27 3.2 Methoden ...................................................................................................................................... 28 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 Zellisolation .................................................................................................................. 28 Zellfärbung ................................................................................................................... 32 Zellkultur ...................................................................................................................... 34 Messung von Zytokin-Konzentrationen im Zellkulturüberstand ................................. 38 Analyse der mRNA-Expression ................................................................................... 39 siRNA-vermitteltes Ausschalten von Transkriptionsfaktoren ...................................... 42 Statistik ......................................................................................................................... 43 4 ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 44 4.1 Induktion von IL-10 in konventionellen humanen TH-Zellen ...................................................... 45 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induziert starke IL-10-Produktion ........................................ 45 IL-6 und IL-21 sind notwendig für IFN-α-vermittelte IL-10-Produktion .................... 48 Autokrines IL-21 verstärkt DLL4-vermittelte IL-10-Produktion ................................. 51 Differenzierung von TH-Zellen beeinflusst das Ansprechverhalten auf DLL4 ............ 53 IL-10 wird in memory TH-Zellen schneller induziert als in naiven TH-Zellen ............. 54 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induziertes IL-10 ist langfristig nicht stabil ......................... 56 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 beeinflusst selektiv die IL-10-Expression ............................ 57 Induktion eines regulatorischen Phänotyps über IL-10 hinaus..................................... 58 4.2 IL-10-Induktion via IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in TH-Subpopulationen ........................................ 61 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 IL-10-Induktion in allen wesentlichen TH-Subpopulationen ........................................ 61 Beeinträchtigte IL-10-Produktion in TH1/17-Zellen..................................................... 69 Beeinflussung von Effektorzytokinen in modulierten TH-Subpopulationen ................ 69 Induktion eines regulatorischen Phänotyps in TH-Subpopulationen ............................ 71 4.3 Induktion von IL-10 in humanen TH-Zellen durch dendritische Zellen ....................................... 72 4.3.1 Humane pDC und mDC exprimieren DLL4 nach Aktivierung über TLR ................... 72 4.3.2 IL-10-Induktion mittels DLL4-exprimierender pDC und mDC ................................... 73 4.4 Induktion immun-regulierender Funktionen durch IFN-α/IL-6/IL-21-Modulation .................... 75 4.4.1 Induktion eines anti-inflammatorischen Phänotyps in Monozyten via IL-10 .............. 75 4.4.2 Suppression der TH-Zellproliferation............................................................................ 77 4.5 IL-10-Induktion in professionellen regulatorischen T-Zellen ...................................................... 77 4.6 Die transkriptionelle Regulation der IL-10-Induktion in humanen TH-Zellen ............................. 78 4.6.1 Blimp-1 und c-Maf sind notwendig für die IL-10-Produktion in TH-Zellen ................ 79 4.6.2 Blimp-1 und c-Maf beeinflussen ihre Expression in TH-Zellen nicht gegenseitig ....... 84 4.6.3 Sowohl DLL4 als auch IFN-α/IL-6/IL-21 benötigen c-Maf und Blimp-1 für die Induktion von IL-10 .................................................................................................................. 85 4.6.4 STAT3 vermittelt und STAT1 inhibiert die IL-10-Expression .................................... 86 4.6.5 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 schafft die Voraussetzungen zur Bildung des ISGF3 .......... 86 4.7 Endogenes IL-10 beeinflusst die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation ..................................... 87 4.8 IL-10-Induktion in peripheren TH-Zellen von CED-Patienten ..................................................... 89 4.8.1 Beeinträchtigte IL-10-Expression in CED-TH-Zellen .................................................. 89 4.8.2 Geringere IL-10-Produktion von TH17- und Th1/17-Zellen in CED-Patienten ........... 92 4.8.3 Beeinträchtigte Blimp-1-Expression in CED-TH-Zellen .............................................. 92 5 DISKUSSION ................................................................................................................................ 94 5.1 Die Optimierung der IL-10-Induktion in humanen TH-Zellen durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 .. 95 5.2 IFN-α muss mit weiteren Stimuli kombiniert werden, um IL-10 zu induzieren ......................... 97 5.3 Die Rolle von autokrinem IL-21 bei der Induktion von IL-10..................................................... 98 5.4 Die Rolle des Notch-Signalweges bei der synergistischen Induktion von IL-10......................... 99 5.5 Die unterschiedlich starke IL-10-Expression zwischen TH-Subpopulationen ........................... 100 5.6 Die transkriptionelle Regulation der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Expression 101 5.6.1 5.6.1 5.6.2 5.6.3 5.6.4 Die transkriptionelle Rolle von c-Maf und Blimp-1................................................... 101 Die transkriptionelle Rolle von NFIL3 und IKZF3 .................................................... 102 Die gegenseitige transkriptionelle Kontrolle von c-Maf und Blimp-1 ....................... 103 Die transkriptionelle Rolle der STATs ....................................................................... 103 Die Balance zwischen Regulation und Inflammation ................................................ 106 5.7 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induziert einen TR1-ähnlichen Phänotyp in humanen TH-Zellen ....... 107 5.8 Die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte Induktion von IL-10 in humanen TREG ..................... 108 5.9 Endogenes IL-10 beeinflusst die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation ................................... 109 5.10 TH1/17-Zellen stellen eine besonders inflammatorische TH-Subpopulation dar ................... 110 5.11 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation von memory TH-Zellen aus CED-Patienten .............. 112 5.11.1 CED-Patienten weisen ein verstärkt inflammatorisches Zytokinprofil auf .............. 112 5.11.2 Verminderte Selbstregulation in CED-Patienten durch Blimp-1-Defekt ................. 114 5.12 Die funktionelle Rolle von TH1/17-Zellen ............................................................................ 115 5.13 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation als Therapiemöglichkeit bei CED ............................. 116 5.14 In vivo Modell: IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte Selbstregulation von humanen TH-Zellen 118 5.14.1 Induktion der IL-10-Expression ............................................................................... 118 5.14.2 Induktion von inhibitorischen Rezeptoren................................................................ 120 6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 122 7 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................................ I 8 ANHANG ....................................................................................................................................... XI 8.1 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................... XII 8.2 Abbildungsverzeichnis .............................................................................................................. XIV 8.3 Tabellenverzeichnis ..................................................................................................................... XV 8.4 Danksagung ............................................................................................................................... XVI 8.5 Publikationsliste ....................................................................................................................... XVII EINLEITUNG 1 1 EINLEITUNG EINLEITUNG 2 1.1 ÜBERBLICK ÜBER DAS IMMUNSYSTEM 1.1.1 ANGEBORENE UND ADAPTIVE IMMUNITÄT Der menschliche Organismus ist ständigen Bedrohungen durch Mikroorganismen oder Parasiten ausgesetzt. Um sich vor dieser Gefahr zu schützen, hat der Körper äußerst komplexe und effektive Abwehrmechanismen entwickelt, die zusammen das menschliche Immunsystem bilden. Neben der Haut und der Schleimhaut – den beiden ersten physikalischen Barrieren – wird das Immunsystem grundlegend in angeborene und adaptive Immunantworten unterteilt. Die erste und schnellere Reaktion auf Pathogene liefert das angeborene Immunsystem. Es basiert auf der Erkennung von sogenannten Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) durch einen Pattern Recognition Receptor (PRR). PAMPs sind wiederkehrende Oberflächenstrukturen von Pathogenen. Neben dem nicht-zellulären Komplementsystem, setzt sich das angeborene Immunsystem u.a. aus Makrophagen, dendritischen Zellen (DC), Granulozyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile) und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) zusammen. Obwohl das humane angeborene Immunsystem sehr schnell und effizient gegen Pathogene vorgeht, ist es unspezifisch und daher nur eingeschränkt schützend [1]. Um diese Lücke zu schließen, steht dem menschlichen Organismus das adaptive Immunsystem zur Verfügung. Merkmale einer adaptiven Immunantwort sind die Spezifität, die Anpassung und die Ausbildung eines Gedächtnisses. Somit können körperfremde Strukturen (Antigene) erkannt, spezifisch bekämpft und ein Gedächtnis gegen sie entwickelt werden. Das ermöglicht es, bei erneutem Kontakt schneller gegen bekannte Pathogene vorzugehen [1]. Das adaptive Immunsystem setzt sich zusammen aus T- und B-Zellen. Beide Zelltypen sind in der Lage, über spezielle Rezeptoren Antigene zu erkennen: Die B- und T-Zell-Rezeptoren (TCR). Dabei besitzen sowohl B- als auch T-Zellen Rezeptoren von nur einer Spezifität. Bei der Entstehung beider Zelltypen entwickeln die Rezeptoren durch äußerst vielfältige und komplexe Rekombinationsprozesse nach dem Zufallsprinzip ihre Spezifität für Antigenstrukturen. Das sichert die Diversität der Rezeptorspezifität von B- und T-Zellen und schützt so den Körper vor nahezu jeder denkbaren körperfremden Antigenstruktur. Bei adäquatem Antigenkontakt reagieren und proliferieren nur antigenspezifische T- und B-Zellen. Hier unterscheidet man zwischen humoralen und zellulären Immunantworten. Bei humoralen Immunantworten produzieren B-Zellen in der Folge ihrer Aktivierung lösliche Immunglobuline (Ig), spezifische Antikörper, gegen das Antigen. Damit können extrazelluläre Pathogene phagozytiert, lysiert oder neutralisiert werden. Zelluläre Immunantworten richten sich gegen intrazelluläre Pathogene. Hierbei werden die Erreger mitsamt der befallenen Zelle von Makrophagen, NK-Zellen oder zytotoxischen T-Zellen beseitigt. Die T-Helfer-Zellen (TH-Zellen) agieren indirekt sowohl bei humoralen als auch zellulären Immunantworten [1, 2]. EINLEITUNG 1.1.2 3 BIOLOGIE DER T-ZELLEN T-Zellen können über Antigene aktiviert werden. Dafür müssen die Antigene/Peptide den T-Zellen über antigenpräsentierende Zellen (APC) präsentiert werden. Die Präsentation der Peptide durch die APC geschieht über die Bindungsfurche des Major Histocompatibility Complex (MHC). Der TCR befindet sich auf der Oberfläche der T-Zelle und bildet einen Komplex zusammen mit unterschiedlichen Cluster of Differentiation (CD) 3-Molekülen (CD3γ, CD3δ, CD3ε) und der ζ-Kette, einem über Disulfidbrücken verbundenen Homodimer [2, 3]. Ist ein TCR spezifisch für einen Peptid:MHC-Komplex, kommt es zu einer Aggregation des TCR und der CD3-Moleküle und zu einer Phosphorylierung der Tyrosinreste der CD3-Moleküle im Zytoplasma. Diese initiale Phosphorylierung wird letztendlich bis in den Nukleus transduziert. Hier werden verschiedene Gene transskriptionell aktiviert, unter anderem auch solche, die die Zellproliferation stimulieren und regulieren [2, 4]. Es gibt zwei Arten von MHC-Molekülen: MHC-Klasse-I- (MHC-I) und MHC-Klasse-II-Moleküle (MHC-II). MHC-I-Moleküle binden vom Proteasom abgebaute Peptide aus dem Zytosol und werden von CD8+ zytotoxischen T-Zellen erkannt. Das ermöglicht die Erkennung und Eliminierung zytosolischer Pathogene (z.B. Viren). MHC-II-Moleküle hingegen binden Peptide von extrazellulären Pathogenen, die über Phagozytose von professionellen APC (z.B. B-Zellen, Makrophagen oder DC) aufgenommen und im Endosom abgebaut wurden. MHC-II-Moleküle aktivieren CD4+ TH-Zellen, die über ihre Effektorantworten dann andere Zellen des Immunsystems bei der Bekämpfung des Pathogens unterstützen. TH-Zellen können Zytokine produzieren und darüber Makrophagen aktivieren oder B-Zellen zur Antikörper-Produktion, spezifisch für die extrazellulären Pathogene, stimulieren. Die Effektorfunktionen von TH-Zellen sind sehr divers und komplex. Daher können naive TH-Zellen nach der MHC-II-Erkennung zu verschiedenen TH-Subpopulationen mit unterschiedlichen Effektoraktivitäten ausdifferenzieren [2, 4]. Um vollständig aktiviert zu sein benötigen sowohl CD8+ T-Zellen als auch CD4+ TH-Zellen neben der Aktivierung über MHC-I bzw. MHC-II ein zusätzliches (co-stimulatorisches) Signal über CD28 und seine Liganden CD80 und CD86. Andere co-stimulatorische Signale können z.B. über die RezeptorLiganden Bindung Inducible T-Cell Costimulator (ICOS) und ICOS-Ligand (ICOS-L) oder CD226 (Rezeptor) und CD155 (Ligand) in die T-Zelle gesendet werden. Co-stimulatorische Liganden werden unter anderem von APC exprimiert [1, 5]. 1.2 TH-ZELL-DIFFERENZIERUNG Damit eine naive TH-Zelle kompetente Immunreaktionen erzeugen kann, muss sie zu einer TH-Effektorzelle differenzieren. Entsprechend ihrer Vielfältigkeit der Funktionen und Aufgaben sind die TH-Effektorzellen in unterschiedliche Subpopulationen aufgeteilt. Jede Subpopulation zeichnet sich durch die Expression spezifischer Transkriptionsfaktoren, Zytokine und Oberflächenmoleküle aus. Die Entscheidung darüber, welchen TH-Effektor-Phänotyp eine TH-Zelle annimmt, wird, neben EINLEITUNG 4 der Aktivierung über den TCR, maßgeblich durch die Anwesenheit verschiedener Zytokine bestimmt (siehe Abb. 1.1). Es sind zahlreiche TH-Subpopulationen wie TH1, TH2, TH17, TH1/17, TH22, TH9 oder TFH (follikuläre TH-Zellen) beschrieben. Jüngste Untersuchungen zeigen allerdings, dass diese Differenzierungen durchaus plastische Zustände von TH-Zellen sind, die je nach Mikroumfeld ineinander übergehen können. Daher ist nicht eindeutig geklärt, inwiefern diese Subpopulationen finale oder transiente Phänotypen beschreiben und auf welche Weise hier die Regulation der einzelnen Effektorzytokine abläuft. Diese Arbeit wird sich auf die Subpopulationen TH1, TH2, TH17 und TH1/17 konzentrieren, da sie am besten klassifiziert sind (z.B. in vitro Differenzierung) und die wesentlichen TH-Subpopulationen darstellen. Die TH-Effektorzellen vermehren sich nach der Aktivierung stark (klonale Expansion), um gegen ihr spezifisches Antigen vorzugehen. Dadurch wird das Pathogen schnell beseitigt. Danach werden diese TH-Effektorzellen nicht mehr benötigt und der Großteil der expandierten TH-Zellen geht in Apoptose über (Kontraktion der Immunantwort). Ein kleiner Teil überlebt und verbleibt als memory TH-Zellen. Memory TH-Zellen behalten ihren TH-Effektor-Phänotyp bei [6, 7]. EINLEITUNG 5 Abb. 1.1 Phänotypen von peripheren CD4+ TH-Zellen. Naive TH-Zellen und natürliche regulatorische T-Zellen (nTREG) entstehen im Thymus. Naive TH-Zellen können, je nach Zytokinumgebung und exprimierten Transkriptionsfaktoren, in Effektor-TH-Zellen (TH1, TH2, TH17) oder zu regulatorischen Subpopulationen (pTREG, TR1) differenzieren. TH-Zellen können außerdem anhand ihrer Chemokinrezeptoren (CXCR3, CCR4, CCR6) unterschiedenen werden. Teilweise sind diese Phänotypen plastisch. TH17-Zellen können einen TH1-TH17Mischphänotyp (TH1/17) annehmen. Abbildung nach Neumann et al. [8], Zhu et al. [9], Geginat et al. [7] und Duhen et al. [10]. 1.3 OBERFLÄCHENREZEPTOREN VON TH-ZELLEN Eine naive TH-Zelle kann zu verschiedenen TH-Effektorzellen ausdifferenzieren (Abb. 1.1). Nach der Differenzierung verbleiben einige TH-Effektorzellen als sogenannte memory T-Zellen. Naive und memory TH-Zellen unterscheiden sich demnach in ihren Funktionen. Eine wesentliche Bedingung für das Ausüben ihrer Funktionen ist, dass TH-Zellen ihre Wirkungsstätte erreichen können müssen. Dies können lymphatische oder nicht-lymphatische Organe sein. Hierfür stehen sowohl naiven als auch memory TH-Effektorzellen bestimmte Oberflächenrezeptoren zur Verfügung, die es ihnen ermöglichen EINLEITUNG 6 in die entsprechenden Organe einzuwandern. Anhand dieser Rezeptoren kann man sowohl naive als auch memory TH-Zellen unterscheiden und isolieren (siehe Kapitel 3.2.1.5). 1.3.1 OBERFLÄCHENREZEPTOREN VON NAIVEN TH-ZELLEN Naive TH-Zellen müssen in sekundäre lymphatische Organe gelangen, damit ihnen Antigene präsentiert werden können. Hierfür benötigen sie die Rezeptoren C-C Chemokinrezeptor Typ (CCR) 7 und CD62L. Zusätzlich tragen sie CD45RA auf ihrer Oberfläche. Innerhalb ihrer Population kann man naive TH-Zellen weiter unterscheiden: naive TH-Zellen, die gerade den Thymus verlassen haben (Recent Thymic Emigrants, RTE), tragen das Molekül CD31 auf ihrer Oberfläche, während homoöstatisch proliferierte (Proliferation ohne Antigenkontakt) naive TH-Zellen, die sich schon länger in der Peripherie befinden, negativ sind für CD31 (Abb. 1.2) [6, 11]. 1.3.2 OBERFLÄCHENREZEPTOREN VON MEMORY TH-ZELLEN TH-Effektorzellen exprimieren neben ihren spezifischen Transkriptionsfaktoren und Zyotkinen auch unterschiedliche Chemokinrezeptoren (Abb. 1.1). Diese benötigen sie, um in nicht-lymphatische Organe (z.B. Lunge, Leber, Darm, Haut, Niere) einwandern zu können. Gleichzeitig müssen THEffektorzellen aber nicht mehr in sekundäre lymphatische Organe einwandern, um aktiviert zu werden. Daher verlieren sie die Oberflächenmarker CCR7 und CD62L. Ebenso exprimieren sie nicht mehr CD45RA, sondern tragen CD45R0 auf ihrer Oberfläche (Abb. 1.2). Je nach TH-Subpopulation exprimieren Effektorzellen u.a. die Chemokinrezeptoren C-X-C Motiv Chemokinrezeptor (CXCR) 3, CCR4, CCR6 oder CCR10 in verschiedenen Kombinationen, was es ihnen ermöglicht, in unterschiedliche nicht-lymphatische Organe einzuwandern (Abb. 1.1) [6, 7, 10, 12]. 1.4 TH-SUBPOPULATIONEN Die Klassifizierungen von TH-Subpopulationen ist weitreichend und äußerst komplex [7, 9]. Jedoch kann man die konventionellen TH-Zellen in drei grundlegende Subpopulationen mit klar unterschiedlicher transkriptioneller Grundausstattung und Zytokinprofil unterteilen: TH1, TH2 und TH17 [13]. Zusätzlich zu diesen drei Subpopulationen ist u.a. noch der gemischte Phänotyp der TH1/17 beschrieben (Abb. 1.1) [7]. 1.4.1 TH1-ZELLEN TH1-Zellen sind maßgeblich beteiligt an der Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene, im Speziellen an der Bekämpfung von Mykobakterien [14, 15]. Sie exprimieren den Chemokinrezeptor CXCR3 und produzieren u.a. die Zytokine Interferon (IFN)-γ und Interleukin (IL-) 2. IFN-γ ist grundlegend für die Bekämpfung viraler und intrazellulärer Infektionen durch das angeborene und das adaptive Immunsystem. Weiterhin ist bekannt, dass ein Defekt der IFN-γ-Produktion die Anfälligkeit für Infektionen mit Mykobakterien und auch mit Salmonella erhöht. Auch in der Tumorimmunologie spielt IFN-γ eine wesentliche Rolle und treibt beispielsweise eine Immunantwort gegen Tumorzellen EINLEITUNG 7 voran [16]. Außerdem weiß man, dass Makrophagen von IFN-γ rekrutiert werden, um Pathogene zu beseitigen [17]. TH1-Zellen werden induziert durch IL-12 und sind gekennzeichnet durch T-bet- und IFN-γ-Expression. Hierbei induziert IL-12 die Expression von Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) 4, was wiederum die IFN-γ-Produktion bewirkt. In der Folge aktiviert IFN-γ über STAT1 die Expression des Master-Transkriptionsfaktors T-bet [7-9]. 1.4.2 TH2-ZELLEN Während die TH1-Zellen an der Bekämpfung von intrazellulären Pathogenen beteiligt sind [15], vermitteln TH2-Zellen die Abwehr gegen extrazelluläre Parasiten wie z.B. Helminthen [14]. TH2Zellen tragen den Chemokinrezeptor CCR4 auf ihrer Oberfläche und produzieren u.a. die Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 [15]. Bei der Aktivierung von naiven TH-Zellen induziert IL-4 durch die Aktivierung von STAT6 die Expression von GATA3, dem Master-Transkriptionsfaktor von TH2Zellen. Bei der TH2-Differenzierung stellt IL-4 somit ein positives feedback-Moment dar, das die Entwicklung der TH2-Differenzierung weiter vorantreibt [18]. Außerdem sind TH2-Zellen durch die IL-4-Produktion maßgeblich am Klassenwechsel von IgE in B-Zellen beteiligt [19]. Durch die Produktion von IL-5 können TH2-Zellen Eosinophile rekrutieren [7-9, 20] 1.4.3 TH17-ZELLEN Th17-Zellen vermitteln die Immunantwort gegen extrazelluläre Bakterien und Pilze. Sie können anhand ihrer CCR6- und CCR4-Expression identifiziert werden. Als Zytokine, die von TH17-Zellen produziert werden, sind IL-17A, IL-17F, IL-22 und Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) zu nennen. In Anwesenheit der Zytokine IL-6 und TGF-β wird in naiven TH-Zellen STAT3 aktiviert, das wiederum den TH17-Master-Transkriptionsfaktor RORγt induziert. IL-17A und IL-17F werden häufig von einzelnen Zellen co-exprimiert und verwenden mit dem IL-17RA den gleichen IL-17-Rezeptor. Von IL-17A ist bekannt, dass es andere proinflammatorische Zytokine (z.B. IL-6) induzieren kann und damit eine proinflammatorische Wirkung bei Immunantworten hat. Beide Formen des IL-17 rekrutieren und aktivieren Neutrophile für die Abwehr gegen Bakterien und Pilze. TH17-Zellen sind außerdem beteiligt an vielen Autoimmunerkrankungen [7-9, 15, 21-23]. 1.4.4 TH1/17-ZELLEN Die Anwesenheit von IL-1β verstärkt die Sensitivität von TH17-Zellen auf IL-12. Dadurch entsteht ein TH1-TH17-Mischphänotyp. Diese TH1/17 Zellen exprimieren sowohl IFN-γ und T-bet als auch IL-17A und RORγt und besitzen ähnliche Funktionen wie TH17-Zellen. Obwohl TH1/17-Zellen auch in gesunden Spendern gefunden werden können, treten sie vermehrt in Patienten mit Autoimmunerkrankungen auf. Dadurch wird ihnen ein besonders inflammatorischer Phänotyp zugeschrieben [7, 10]. TH1/17-Zellen können eine pathologische Rolle bei Autoimmunkrankheiten einnehmen, u.a. bei Morbus Crohn (MC) [24], multipler Sklerose (MS) [25] und juveniler idiopathischer Arthritis (JIA) [26]. EINLEITUNG 1.4.5 8 TCM, TEM UND TEMRA Neben den beschriebenen TH-Phänotypen kann man memory TH-Zellen auch bezüglich ihres Migrationsverhaltens in sekundäre lymphatische Organe vs. nicht-lymphatische Organe unterteilen. Es gibt die Central Memory TH-Zellen (TCM) und Effector Memory TH-Zellen (TEM) (Abb. 1.2). TCM exprimieren neben CD45R0 außerdem CCR7 und CD62L auf ihrer Oberfläche und können damit, wie auch naïve TH-Zellen, in die Lymphknoten einwandern. Sie produzieren weniger Effektorzytokine als TEM und können nach erneutem Antigen-Kontakt rasch proliferieren, um eine zweite Welle von TEM bereitzustellen. TEM sind ebenfalls CD45R0+, exprimieren aber kein CCR7 oder CD62L mehr. Dadurch können sie nicht mehr in die Lymphknoten einwandern [7, 12]. Zusätzlich gibt es noch eine Subpopulation der memory TH-Zellen, die durch repetitive TCR-Stimulation entsteht. Diese terminal differenzierten T-Effektorzellen (TEMRA) zeichnen sich durch die Re-Expression von CD45RA aus, besitzen aber kein CCR7 auf ihrer Zelloberfläche (Abb. 1.2). Diesen Zellen wird zudem eine wesentliche pathologische Rolle bei Autoimmunkrankheiten zugesprochen [27, 28]. Die Supopulationen TH1-, TH2, TH17- und TH1/17-Zellen werden klassischerweise anhand ihrer Transkriptionsfaktoren identifiziert. Daher gibt es hier Übergangszustände und Überlappungen zwischen den TH-Subpopulation und der Zuordnung zu TCM, TEM oder TEMRA. Abb. 1.2 TH-Zell-Differenzierung. Die Dicke der Pfeile zeigt die Stärke des Antigen-Signals an. Nach Sallusto et al. [12, 29] und Goronzy et al. [27]. EINLEITUNG 9 1.5 REGULATORISCHE T-ZELLEN Während die konventionellen TH-Zellen die Abwehr von Pathogenen koordinieren, gibt es auf der Gegenseite spezialisierte T-Zellen mit immunregulatorischen Aufgaben, die den Körper vor pathologischen Immunreaktionen schützen (Abb. 1.1 und Kapitel 1.6). Diese heterogene Gruppe beinhaltet die natürlichen regulatorischen T-Zellen (nTREG) und peripheren TREG (pTREG). nTREG entwickeln sich schon im Thymus zu professionellen regulatorischen T-Zellen. Wie auch die pTREG exprimieren nTREG den Master-Transkriptionsfaktor Foxp3 und tragen die α-Kette des IL-2-Rezeptors (CD25) auf ihrer Zelloberfläche. pTREG entwickeln sich allerdings erst in der Peripherie aus naiven T-Zellen, z.B. durch die Anwesenheit von IL-2 und Transforming Growth Factor (TGF)-β. Im Menschen können allerdings auch konventionelle TH-Zellen Foxp3 exprimieren, sodass hier die Definition von TREG über Foxp3 alleine zu ungenau wäre [30]. Weitere TREG-Marker für humane T-Zellen sind CD137 [31] oder die Demethylierung des Foxp3-Locus, die TREG von Foxp3+ konventionellen TH-Zellen unterscheiden kann [32]. Die Gruppe der regulatorischen T-Zellen enthält darüber hinaus die Typ 1 regulatorischen (TR1)-Zellen. Sie entwickeln sich, ähnlich den THSubpopulationen (Abb. 1.1 und Kapitel 1.3) durch Zytokinstimuli aus naiven T-Zellen. TGF-β und IL-27 sind hierbei notwendig für die TR1-Entwicklung. Darüber hinaus können TR1-Zellen auch durch die Stimulation mit tolerogenen DC entstehen. Von TR1-Zellen und murinen pTREG und nTREG weiß man, dass sie IL-10 produzieren können, wordurch sie unter anderem ihre regulatorische Funktion ausüben. Da für TR1-Zellen bislang allerdings kein identitätsstiftender Transkriptionsfaktor ermittelt werden konnte und auch konventionelle TH-Zellen IL-10 produzieren können, ist bisher nicht eindeutig geklärt, ob es sich bei TR1-Zellen um eine eigene regulatorische Subpopulation handelt oder ob dieser Phänotyp einen regulatorischen Übergangszustand von TH-Zellen beschreibt [2, 9, 33]. 1.6 INTERLEUKIN-10 UND SEINE REGULATORISCHE WIRKUNG Neben der Fähigkeit, den Körper vor Pathogenen zu schützen, können Immunreaktionen im Körper auch Schäden verursachen, wenn sie nicht kontrolliert werden. Es kann passieren, dass chronische Entzündungen das Gewebe schädigen (Immunpathologie), dass Immunzellen unangemessen auf nichtpathogene Antigene reagieren (Allergien), oder dass T- oder B-Zellen körpereigene Strukturen als fremd erkennen und gegen sie vorgehen (Autoimmunität). Zur Erhaltung eines funktionierenden, gesunden Immunsystems hat der Körper daher eine Vielzahl an Mechanismen entwickelt [34]. Das bedeutendste anti-inflammatorische Zytokin ist IL-10. Ihm kommt eine wesentliche Aufgabe bei der Regulation von Immunantworten zu. Ursprünglich als TH2-Zytokin beschrieben, ist mittlerweile bekannt, dass IL-10 von weitaus mehr Zellen des Immunsystems produziert werden kann. So zum Beispiel von TH1-, TH2-, TH17-, TH1/17-, regulatorischen T-Zellen (nTREG, pTREG, TR1-Zellen), CD8+ T-Zellen, B-Zellen oder Makrophagen. Dass IL-10 von so vielen unterschiedlichen Zellen produziert wird, weist darauf hin, wie wichtig seine Rolle bei der Immunregulation ist [10, 35, 36]. IL-10 kann EINLEITUNG 10 seine anti-inflammatorische Wirkung auf TH-Zellen auf unterschiedliche Art und Weise vermitteln. Durch die Inhibition der Effektorfunktionen von APC wie DC oder Makrophagen verringert IL-10 die Antigenpräsentation und hemmt damit indirekt die Aktivierung und Proliferation von TH-Zellen. IL-10 kann aber auch direkt auf TH-Zellen wirken und die Produktion von inflammatorischen Zytokinen wie IL-2 oder Tumornekrosefaktor (TNF)-α verringern. Da TH-Zellen ebenfalls IL-10 produzieren können, stellt dies eine Möglichkeit der Selbstregulation von TH-Zellen dar [36, 37]. 1.7 IL-10-EXPRESSION IN T-ZELLEN Mit der Einführung des IL-10-defizienten Maus-Modells vor über 25 Jahren konnte zum ersten Mal untersucht werden, wie wichtig IL-10 für die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase ist. Mäuse dieses Genotyps entwickeln eine chronische Entzündung des intestinalen Gewebes [38, 39]. Aufgrund der Tatsache, dass dieser Phänotyp nicht unter keimfreien Bedingungen entsteht, ist davon auszugehen, dass IL-10 die Immunantworten auf die kommensalen Bakterien der Darmflora kontrolliert [40]. Passend hierzu sind Mutationen im Gen für Il10- oder Il10ra bzw. Il10rb (codieren für die Untereinheiten A und B des IL-10-Rezeptors [IL-10R]) in Patienten mit früh einsetzender, chronisch entzündlicher Darmerkrankung (CED) [8, 41]. IL-10 kann von einer Vielzahl der Zellen des Immunsystems produziert werden, u.a. NK-Zellen, Mastzellen, Granulozyten, B-Zellen und CD8+ und CD4+ T-Zellen. Dass speziell das von CD4+ THZellen stammende IL-10 eine besondere Rolle bei der Regulation von Immunantworten einnimmt, zeigten Versuche, bei denen das TH-Zell-spezifische Ausschalten von IL-10 zu gleichen Immunpathologien führte wie ein systemischer IL-10-Knockout [42]. Offensichtlich ist also das von TH-Zellen produzierte IL-10 besonders wichtig und kann trotz der Vielzahl anderer IL-10produzierender Immunzellen nicht kompensiert werden [8, 35]. IL-10, produziert von TH-Zellen, sorgt also für die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase und für das Ausbleiben von Immunreaktionen gegen nicht-pathogene Antigene wie z.B. Nahrungsmittel, Hausstaub oder Pollen (periphere Toleranz) [8, 43, 44] 1.7.1 Die FOXP3+ REGULATORISCHE T-ZELLEN regulatorischen T-Zell-Subpopulationen nTREG und pTREG exprimieren den Master- Transkriptionsfaktor Foxp3 (Abb. 1.1). Murine nTREG und pTREG sind nachweislich in der Lage, IL-10 zu exprimieren. Zahlreiche Studien zu Versuchen TREG-spezifischer IL-10-Deletion zeigen, dass das von TREG stammende IL-10 beispielsweise notwendig ist für die Immunregulation im Darm, der Lunge [45] oder der Haut [37, 46]. Wenn man TREG jedoch ex vivo stimuliert, produzieren ausschließlich die Zellen aus dem Darm IL-10. Offensichtlich erhalten TREG in vivo bestimmte Signale zur IL-10Produktion. IL-4, IL-2 und TGF-β sind mögliche Kandidaten für die IL-10-Induktion in TREG in vivo [35]. Auch für humane Foxp3+ T-Zellen konnte gezeigt werden, dass sie IL-10 produzieren [47, 48], jedoch können auch konventionelle humane TH-Zellen Foxp3 exprimieren, sodass unklar ist, ob Foxp3 EINLEITUNG 11 im Menschen der Master-Transkriptionsfaktor für TREG ist [30]. Daher kann nicht zweifelsfrei bewiesen werden, dass Foxp3+IL-10+ humane T-Zellen tatsächlich TREG sind. 1.7.2 FOXP3− REGULATORISCHE T-ZELLEN Neben den TREG gibt es auch Foxp3− TH-Zellen, die IL-10 produzieren können. Ein Versuch, diese konventionellen TH-Zellen einer eigenen Subpopulation zuzuordnen brachte die TR1-Zellen hervor. Sie sind gekennzeichnet durch starke IL-10-Produktion, wenig IL-2 oder IFN-γ und keine IL-4Produktion. Gagliani et al. konnten die Kombination der Oberflächenmoleküle Lymphocyte-Activation Gene (LAG)-3 und CD49b als Marker für TR1-Zellen identifizieren [49]. Ihre regulatorischen Funktionen üben TR1-Zellen im Wesentlichen durch die Produktion von IL-10 und TGF-β aus. Hiermit können sie direkt die Proliferation sowie die Produktion von inflammatorischen Zytokinen wie IL-2 oder IFN-γ inhibieren. Außerdem bewirkt IL-10 von TR1-Zellen die Hemmung der Expression von co-stimulatorischen Molekülen und inflammatorischen Zytokinen in APC [33]. Neben der Stimulation von naiven TH-Zellen mit tolerogenen DC, die viel IL-10 und wenig IL-12 produzieren, sind außerdem die Zytokine IL-27, IL-6, TGF-β und IL-21 in die Induktion und Entwicklung von TR1-Zellen involviert [33]. Die Relevanz von TR1-Zellen bei der Aufrechterhaltung der Immunhomöostase zeigen die Assoziationen von TR1-Defekten in Patienten, die z.B. an MS, TypI-Diabetes oder CED leiden [33]. Entsprechend dazu verhindert ein adoptiver Transfer von murinen TR1-Zellen die Entwicklung pathologischer Symptome in Tierversuchsmodellen experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) und Colitis [33, 37]. Unabhängig von diesem TR1-Phänotyp weiß man auch von TH-Zellen, dass sie IL-10 produzieren können, um ihre eigenen Effektorfunktionen einzuschränken. Vor allem für TH1-Zellen ist beschrieben, dass die Co-Produktion von IFN-γ und IL-10 wesentlich ist für die Selbstregulation von TH1-vermittelten Immunantworten in murinen Infektionsmodellen [50-53]. IL-10+ TH1-Zellen bieten außerdem Schutz vor Autoimmunität. So ist die Produktion von IL-10 durch murine TH1-Zellen notwendig zur Ausbildung von peripherer Toleranz, indem sie Immunantworten auf Selbst-Antigene unterdrücken [54]. Darüber hinaus sind murine TH1-Zellen durch die Produktion von IL-10 weniger autoimmunogen in Krankheitsmodellen für EAE und Colitis [55]. Und auch in humanen TH-Zellen konnte ein Defekt der IL-10-Produktion mit Autoimmunkrankheiten wie systemischem Lupus erythematodes (SLE) [56], rheumatoider Arthritis (RA) [57] und MS [58] asoziiert werden. Auch TH17-Zellen verringern durch die Produktion von IL-10 ihre autoinflammatorischen Eigenschaften im EAE-Mausmodell und können, wenn sie adoptiv tansferiert werden, den Krankheitsverlauf abmildern. [59, 60]. Weiterhin kann die Produktion von IL-10 TH2Immunantworten gegen Parasiten kontrollieren und die Produktion von TH2-assoziierten Zytokinen wie IL-4 und IL-13 inhibieren [8, 37, 61]. EINLEITUNG 12 TH-Zellen sind also grundsätzlich auch unabhängig von einem TR1-Phänotyp in der Lage, IL-10 zu produzieren und können so sich selber regulieren. Darüber hinaus konnte bis heute kein MasterTranskriptionsfaktor für TR1-Zellen identifiziert werden. Daher ist es unklar, ob es sich bei TR1-Zellen tatsächlich um eine eigene TH-Subpopulation handelt oder ob ein IL-10+ Phänotyp eher einen regulatorischen Übergangszustand für konventionelle TH-Zellen darstellt. Darüber hinaus ist – vor allem für humane TH-Zellen – nicht geklärt, welche Signale für die IL-10-Expression notwendig sind. 1.7.3 INDUKTION VON IL-10 IN HUMANEN TH-ZELLEN Mit steigender Anzahl der Untersuchungen zur IL-10-Produktion in TH-Zellen stieg die Anzahl der beschriebenen Phänotypen und Zytokinprofile. Dadurch sind mittlerweile über die TR1-Definition hinaus zahlreiche Foxp3−, IL-10-produzierende TH-Zellen mit immunregulatorischen Eigenschaften beschrieben, die in vitro auf unterschiedlichen Wegen induziert werden können. In humanen TH-Zellen ist IFN-α ein sehr potenter Induktor von IL-10. In einer Vielzahl von Studien konnte die Fähigkeit von IFN-α, IL-10 zu induzieren gezeigt werden – unabhängig von einem möglichen TR1-Phänotyp [62-67]. Ebenso können IL-6 und IL-21 die IL-10-Produktion in humanen CD4+ TH-Zellen bewirken: IL-6 induziert IL-10 in naiven CD4+ TH-Zellen bzw. verstärkt die ICOSvermittelte IL-10-Produktion [68] und IL-21 kann IL-10 in humanen naiven TH-Zellen [69], in CD4+ TH-Zellen aus Nabelschnurblut und adultem peripherem Blut induzieren [70]. Weitere Zytokine, die in humanen TH-Zellen IL-10 induzieren können sind IL-12 [71, 72] und IL-27 [73]. Darüber hinaus bewirkte die Aktivierung von CD46 in humanen TH-Zellen die Produktion von IL-10. Interessanterweise zeigten TH-Zellen von MS-Patienten eine deutlich verringerte IL-10-Produktion nach CD46-Co-Stimulation [74]. Eine weitere Möglichkeit, IL-10 zu induzieren ist die Stimulation von murinen TH-Zellen in Anwesenheit von Vitamin D3 und Dexamethason [43, 75]. Viele der Studien zur Induktion von IL-10 in humanen TH-Zellen wurden jeweils nur in naiven bzw. kompletten CD4+ TH-Zellen durchgeführt. Daher ist nach wie vor unklar, inwiefern diese Stimuli einen generellen Mechanismus der IL-10-Induktion beschreiben, ob sie auch in memory TH-Zellen IL-10 induzieren und wie sich die IL-10-Induktion in verschiedenen TH-Subpopulationen unterscheidet. 1.8 TRANSKRIPTIONELLE REGULATION VON IL-10 IN TH-ZELLEN Die Expression von IL-10 in TH-Zellen wird durch eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren gesteuert. Von murinen TH-Subpopulationen weiß man, dass für die IL-10-Expression verschiedene Transkriptionsfaktoren notwendig sind. Ebenso vielfältig sind die induktiven Signale, die die Transkriptionsfaktor- und IL-10-Expression beeinflussen, z.B. durch Zytokine oder den NotchSignalweg. EINLEITUNG 1.8.1 13 DER JAK-STAT-SIGNALWEG Nach der Bindung eines Zytokins an seinen Rezeptor muss das Signal vom jeweiligen Zytokin:Zytokinrezeptor-Komplex bis in den Nukleus weitergeleitet werden. Diese Weiterleitung erfolgt unter anderem über den JAK-STAT-Signalweg, der neben den Tyrosin-Kinasen JAK1, JAK2, JAK3 und TYK2 die Moleküle STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B und STAT6 enthält, von denen alle jeweils hochspezifische Funktionen innehaben bei der Vermittlung von Immunantworten. Die Bindung des Zytokins an den Rezeptor bewirkt durch eine Konformationsänderung die Aktiverung der mit dem Rezeptor assoziierten JAK-Tyrosin-Kinasen. In der Folge können STATs an den Rezeptor binden und von JAKs phosphoryliert werden. Phosphorylierte STATs dimerisieren zu Homo- oder Heterodimeren und translozieren anschließend in den Nukleus, wo sie die Aktivierung der Gen-Expression beispielsweise von Transkriptionsfaktoren bewirken können [76]. Die Zytokin-abhängige Induktion von IL-10 kann über STAT1, STAT3, STAT4 oder STAT6 erfolgen (Abb. 1.3). 1.8.2 ZYTOKIN-VERMITTELTE INDUKTION VON IL-10 IN TH-ZELLEN Neben der Aktivierung des TCR in TH-Zellen gibt es zahlreiche Signale, die die IL-10-Expression in TH-Zellen beeinflussen und verstärken können (Abb. 1.3). In humanen TH-Zellen sind Typ-IInterferone wie IFN-α extrem potente und oft beschriebene Stimuli zur Induktion von IL-10 bzw. von regulatorischen TR1-Zellen (siehe Kapitel 1.7.2) [56, 62-67, 77, 78]. IFN-α kann STAT3 induzieren und über STAT3 den IL-10-Promoter trans-aktivieren [79]. Govender et al. konnten außerdem zeigen, dass STAT3 notwendig ist für die IFN-α-vermittelte IL-10-Induktion in TH-Zellen [80]. IFN-α aktiviert zudem STAT1. Ein weiteres wichtiges Zytokin zur Induktion von IL-10 ist IL-27. IL-27 kann STAT1, STAT3 und STAT4 aktivieren. In der Folge wird die IL-10-Expression entweder über C-Maf Proto-Oncogene (c-Maf) (STAT3) oder B-Lymphocyte-Induced Maturation Protein 1 (Blimp-1) (STAT1, STAT4) induziert [81-83]. Die IL-27-vermittelte IL-10-Produktion über STAT3 und c-Maf in TR1-Zellen kommt allerdings nicht ohne zusätzliche Signale aus. IL-27 benötigt IL-6, um via STAT3 und c-Maf IL-10 zu induzieren [84]. Diese IL-27- und IL-6-vermittelte IL-10-Induktion ist wiederum abhängig von IL-21, welches über autokrine Effekte die c-Maf-Expression verstärkt und somit wesentlich ist für eine solide IL-10-Expression [85, 86]. Darüber hinaus weiß man von IL-27, dass es IL-10 über den Transkriptionsfaktor Nuclear Factor, Interleukin 3 Regulated (NFIL3) induzieren kann [87]. In murinen TH1-Zellen bewirkt die Bindung von IL-12 an seinen Rezeptor die Aktivierung von STAT4 und in der Folge die Blimp-1-vermittelte Induktion der IL-10-Expression [82, 83, 88]. In murinen TH2-Zellen aktiviert IL-4 STAT6 und induziert so über GATA3 die Expression von IL-10 [89]. IL-4 kann außerdem NFIL3 induzieren [90]. TH17-Zellen wiederum benötigen IL-6-induziertes c-Maf für eine solide IL-10-Expression [91]. EINLEITUNG 14 Neben den genannten Zytokinen kann sich IL-10 außerdem selber induzieren [92, 93]. IL-10 aktiviert STAT3 in TH-Zellen [36, 94]. Inwiefern das notwendig ist für diese feedback-Induktion, ist nicht zweifelsfrei geklärt. Abb. 1.3 IL-10-induzierende Signale und Transkriptionsfaktoren in TH-Zellen. Dargestellt sind die Rezeptoren (R) der Zytokine IL-6, IL-21, IFN-α, IL-10, IL-27, IL-12 und IL-4, der Notch Rezeptor + intrazelluläre Domäne (NIZD) und der TCR. Die Signale werden weitergeleitet durch STAT1, STAT3, STAT4 und STAT6 und die Transkriptionsfaktoren c-Maf, Blimp-1, NFIL3 und GATA3. Durchgezogene Pfeile zeigen die Signale, die erwiesenermaßen mit der IL-10-Expression in Verbindung stehen. Bei gestrichelten Pfeilen ist die Verbindung zur IL-10Expression nicht klar. Adaptiert von Neumann et al. [8], Motomura et al.[95] und Gabrysova et al., [81]. 1.9 INHIBITORISCHE REZEPTOREN AUF TH-ZELLEN Zur vollständigen Aktivierung benötigen TH-Zellen zusätzlich zum TCR-Signal co-stimulatorische Signale über die CD28:CD80/CD86-Bindung (siehe Kapitel 1.2). Neben co-stimulatorischen Rezeptoren wie CD28 gibt es aber auch (co-)inhibitorische Rezeptoren (IRs), die anstelle der aktivierenden Signale inhibitorische Signale in die TH-Zelle weiterleiten, wenn sie ihre Liganden binden. Solche regulatorischen Signale können u.a. den Zellzyklus oder Effektorfunktionen inhibieren oder aber Apoptose oder Toleranz induzieren. Die Expression verschiedener co-stimulatorischerund -inhibitorischer Rezeptoren ermöglicht dadurch eine fein abgestimmte Regulation von TH-Zellen oder die Kontraktion einer Immunreaktion. Sowohl TH-Zellen als auch regulatorische T-Zellen können die IRs LAG-3, Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1), T Cell Immunoreceptor With Ig And ITIM Domains (TIGIT), T Cell Immunoglobulin And Mucin Domain-Containing Protein 3 (TIM3) oder Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA4) exprimieren. LAG-3 kann an MHC-II binden. Ist es auf TH-Zellen exprimiert, bewirkt die Bindung eine Inhibition der Zelle. Die Aktivierung von LAG-3 auf TREG oder TR1-Zellen verstärkt deren regulatorische Funktionen. Tatsächlich ist LAG-3 in Kombination mit dem Integrin CD49b als Marker für TR1Zellen [49]. Ähnlich funktioniert CTLA4: Auf regulatorischen T-Zellen exprimiert, konkurriert EINLEITUNG 15 CTLA4 mit CD28 um die Bindung mit CD80 und CD86 und inhibiert TH-Zellfunktionen oder deren Proliferation. Wird CTLA4 auf regulatorischen T-Zellen aktiviert, verstärkt dies deren regulatorische Eigenschaften. Wenn PD-1 auf regulatorischen T-Zellen exprimiert und durch seinen Liganden CD274 aktiviert wird, verstärkt es die Proliferation der Zellen und begünstigt deren Überleben. Auf TH-Zellen aktiviert, inhibiert PD-1 deren Effektorfunktionen. Vergleichbar zu CTLA4 und CD28, die beide um die Bindung zu CD80 und CD86 konkurrieren, haben TIGIT und der Oberflächenrezeptor CD226 den gleichen Liganden (CD155). Hierbei leitet CD226 ein co-stimulatorisches Signal in die TH-Zelle, während die Bindung von CD155 an TIGIT inhibitorische Wirkung hat. Auch TIGIT kann auf regulatorischen T-Zellen exprimiert werden und verstärkt bei Aktivierung deren antiinflammatorische Fähigkeiten. Die Aktivierung von TIM3 auf TH1-Zellen kann deren Apoptose induzieren oder die IFN-γ-Produktion verringern. Daher gilt TIM3 als ein negativer Regulator von TH1-Immunantworten. Darüber hinaus exprimieren aber auch regulatorische T-Zellen TIM3, wobei TIM3+ TREG verstärkte Suppressorfunktionen (z.B. IL-10 Produktion) gegenüber den TIM3− TREG aufweisen [5, 96]. 1.10 DER TRANSMEMBRANREZEPTOR NOTCH Notch-Proteine sind Zelloberflächenrezeptoren, die in vielen Spezies exprimiert werden. Ihre Hauptfunktion ist die Regulation der Zelldifferenzierung während der Ontogenese. Zuerst wurde Notch in Drosophila melanogaster beschrieben: In einem Phänotyp, der eingekerbte (notched) Flügel aufwies [97]. Säuger besitzen vier verschiedene Typen des Notch-Rezeptors (Notch1 – Notch4), die von fünf unterschiedlichen Liganden gebunden werden können (Delta-like 1, 3 und 4 und Jagged1 und Jagged2) [98]. Dass die Funktion des Notch-Signalwegs von großer Wichtigkeit für die Embryogenese ist, zeigen Versuche, in denen Notch1 und Notch2 in Mausembryonen ausgeschaltet wurden. Die fehlenden Transmembranrezeptoren führten zum Tod der Embryonen [99, 100]. Die Defizienz für Delta-like 4 (DLL4) erwies sich sogar im heterozygoten Genotyp als embryonal letal [101]. 1.10.1 SIGNALTRANSDUKTION VERMITTELT DURCH NOTCH Die Rezeptor:Liganden-Bindung führt zu einer proteolytischen Abspaltung des Notch-Rezeptors durch die A Disintegrin And Metalloproteinase (ADAM). Die Folge der proteolytischen Spaltung ist eine Mono-Ubiquitinierung der intrazellulären Domäne und darauf folgend die Endozytose der Transmembranregion des Notch-Rezeptors. Nun ist die Repression der Proteolyse im intrazellulären Bereich aufgehoben und die intrazelluläre Domäne des Notch-Rezeptors dient der γ-Sekretase als Substrat. Die Folge ist die Freisetzung der intrazellulären Domäne von Notch (NIZD), die dann durch Translokation in den Zellkern gelangt. Hier assoziiert die NIZD mit dem transkriptionellen Repressor Recombinant Signal Binding Protein J (RBP-J) und hebt die Repression der Gene, die durch RBP-J reguliert werden, auf. Ein direktes Zielgen des Notch-Signalweges ist Hairy And Enhancer Of Split (Hes) 1, das für den gleichnamigen Transkriptionsfaktor codiert [98, 102-104] (Abb. 1.4). EINLEITUNG 16 Abb. 1.4 Notch-Expression und -Aktivierung. CoA: Co-Aktivator, CoR: Co-Repressor. Nach Osborne et al. und Bray et al. [98, 103]. 1.10.2 DER EINFLUSS VON NOTCH AUF DIE IL-10-PRODUKTION IN TH-ZELLEN Neben der Zytokin-vermittelten Induktion konnten Experimente aus der eigenen Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung des Notch-Signalweges in TH-Zellen die Expression von IL-10 bewirken kann. Die Überexpression der NIZD in murinen TH-Zellen in Anwesenheit von IL-12 oder IL-27 bewirkte die IL-10-Produktion von IFN-γ+ TH1-Zellen. Die Co-Produktion von IFN-γ und IL-10 hatte zur Folge, dass die TH1-Zellen in vivo ihre inflammatorische Wirkung verloren und suppressive Eigenschaften annahmen. Offensichtlich bewirkte die Notch-Modulation die Induktion der Selbstregulation in murinen TH1-Zellen [83]. Experimente zur Aktivierung von Notch mittels der verschiedenen Liganden ergaben, dass die Delta-like Liganden, speziell DLL4, die stärkste IL-10-Induktion hervorriefen. Für murine Zellen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass plasmacytoide dendritische Zellen (pDC) und Leber-Endothelzellen DLL4 exprimieren und darüber in der Lage sind, IL-10 in TH1-Zellen zu induzieren [105, 106]. Unveröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe konnten diese Rolle von Notch und DLL4 bei der Induktion von IL-10 in humanen TH-Zellen bestätigen [107, 108]. Untersuchungen zur transkriptionellen Regulation ergaben, dass die Notch-Modulation STAT4- und Blimp-1-abhängig ist und Notch durch eine Verstärkung der c-Maf-Expression die IL-10-Produktion begünstigt [82, 83]. Wie die IL-10-Induktion via Notch in humanen TH-Zellen reguliert ist und welchen Einfluss Notch/DLL4 auf die IL-10-Expression in verschiedenen TH-Subpopulationen ist bisher nicht bekannt. ZIELSETZUNG 17 2 ZIELSETZUNG ZIELSETZUNG 18 IL-10 ist ein wichtiges immunsuppressives Zytokin, das eine zentrale Rolle bei der Regulation von Immunantworten und der Verhinderung pathologischer Immunreaktionen wie chronischen Entzündungsreaktionen, Allergien oder Autoimmunität übernimmt. IL-10 kann von einer Vielzahl von Zellen des Immunsystems produziert werden, jedoch ist vor allem von T-Zellen stammendes IL-10 von zentraler Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase und der peripheren Toleranz. Aus Untersuchungen in der Maus ist bekannt, dass IL-10 sowohl von spezialisierten regulatorischen als auch von inflammatorischen TH-Subpopulationen produziert werden kann. In humanen TH-Zellen sind die induktiven Signale, die transkriptionelle Regulation und die Stabilität der IL-10-Expression in den verschiedenen TH-Subpopulationen bislang weniger gut charakterisiert. In dieser Arbeit sollte daher untersucht werden § welche Signale eine starke IL-10-Produktion in den verschiedenen humanen TH-Subpopulationen induzieren, § welche Rolle der Notch-Signalweg bei der IL-10-Expression in humanen TH-Subpopulationen spielt, § ob die Fähigkeit zur IL-10-Produktion in humanen TH-Zellen stabil oder tansient reguliert ist, § welche Signaltransduktionswege und transkriptionelle Regulationseinheiten an der IL-10Produktion in humanen TH-Subpopulationen beteiligt sind, § ob die Regulation der IL-10-Expression in TH-Zellen in Patienten mit chronischer Darmentzündung möglicherweise gestört ist. MATERIAL UND METHODEN 19 3 MATERIAL UND METHODEN MATERIAL UND METHODEN 20 3.1 MATERIAL 3.1.1 MEDIEN UND PUFFER DMEM MEDIUM THERMO FISHER SCIENTIFIC 10 % 100 IU/ml 50 µM Fetal Bovine Serum South America (FCS) Penicillin-Streptomycin 2-Mercaptoethanol RPMI 1640 MEDIUM 5% 100 IU/ml THERMO FISHER SCIENTIFIC Human serum from human male AB plasma Penicillin-Streptomycin TEXMACS MEDIUM 5% 100 IU/ml 100 nmol Biowest Thermo Fisher Scientific PAN Biotech Sigma-Aldrich Thermo Fisher Scientific MILTENYI BIOTEC Human serum from human male AB plasma Penicillin-Streptomycin Rapamycin Sigma-Aldrich Thermo Fisher Scientific Miltenyi Biotec NaCl KCl KH2PO2 Na2HP2 × H2O Merck Merck Merck Merck PBS EDTA Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich PAN Biotech PBS, PH 7,2 137 mM 2,7 mM 1,5 mM 8,0 mM PEB, PH 7,2 2 mM 0,5 % (w/v) 3.1.2 SPEZIFITÄT ANTIKÖRPER KLON FLUOROCHROM/KONJUGAT HERSTELLER FÄRBUNG VON MOLEKÜLEN AUF DER ZELLOBERFLÄCHE BDCA1 BDCA4 CCR10 CCR4 CCR6 CCR7 CD14 CD163 CD19 CD3 CD31 CD4 CD40 CD45R0 CD45RA CXCR3 HLA-A2 HLA-DR AD5-8E7 AD5-17F6 REA326 L291H4 REA190 REA108 TÜK4 GHI/61.1 LT19 BW264/56 AC128 VIT4 HB14 UCHL1 T6D11 REA232 REA517 AC122 GM-CSF BVD2-21C11 45-15 IFN-γ FITC PE PE PerCP-Cy5.5 PEVio-770 PEVio-770 APC-Vio770, PE-Vio770 PE PE-Vio770 PE-Vio770 APC, VioBlue APC, APC-Vio770, VioBlue APC PerCP, PE FITC APC PE PerCP INTRAZELLULÄRE FÄRBUNG VON ZYTOKINEN PerCP-Cy5.5 FITC, APC-Vio770 Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Biolegend Miltenyi Biotec MATERIAL UND METHODEN 21 SPEZIFITÄT KLON FLUOROCHROM/KONJUGAT HERSTELLER IL-10 IL-17A IL-22 IL-4 TNF-α JES3-9D7 CZ8-23G1 REA466 7A3-3 cA2 APC, Vio515 PE-Vio770, APC-770 PE PE PE-Vio770 Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Blimp-1 c-Maf IKZF3/Aiolos NFIL3 MAB36081 sym0F1 14C4C97 MABA223 CD210 (IL-10R) hDLL4 IL-6 3F9 MHD4-46 MQ2-13A5 CD2 CD28 CD3 LT2 15E8 OKT3 INTRAZELLULÄRE FÄRBUNG VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN APC PE, APC, PerCP-Cy5.5 Brilliant Violet 421 PE BLOCKIERENDE ANTIKÖRPER R&D Systems Thermo Fisher Biolegend Thermo Fisher − − − Biolegend Biolegend Thermo Fisher AKTIVIERUNG VON TH-ZELLEN 3.1.3 Biotin Biotin Biotin Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec REKOMBINANTE PROTEINE ZYTOKIN KONZENTRATION HERSTELLER Proleukin rhIFN-α rhIL-12 rhIL-21 rhIL-27 rhIL-6 250 IU/ml 20 ng/ml 20 ng/ml 20 ng/ml 20 ng/ml 20 ng/ml REKOMBINANTE NOTCH LIGANDEN REKOMBINANTE ZYTOKINE rmDLL4-hFc Novartis Pharma Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec selbst hergestellt REKOMBINANTE ZYTOKINREZEPTOREN rhIL-21-Fc 3.1.4 5 µg/ml R&D Systems MATERIALIEN ZUR STIMULATION VON T-ZELLEN BEZEICHNUNG HERSTELLER Anti-Biotin MACSiBeads DLL4-MACSiBeads TREG MACSiBeads Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec 3.1.5 REAGENZIEN ZUR ZELLSTIMULATION BEZEICHNUNG HERSTELLER Lipopolysaccharide (LPS, E. coli) ODN 2395 (CpG-Oligonukleotid) Staphylococcus Enterotoxin B (SEB, Staphylococcus aureus) Sigma-Aldrich Miltenyi Biotec Sigma-Aldrich MATERIAL UND METHODEN 3.1.6 22 MATERIALIEN ZUR MAGNETISCHEN ZELLSORTIERUNG (MACS) BEZEICHNUNG HERSTELLER MICROBEADS Anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec Anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec CD14 Microbeads Miltenyi Biotec CD25 Microbeads Miltenyi Biotec CD3 Microbeads Miltenyi Biotec CD4 Microbeads Miltenyi Biotec ISOLATIONSSÄULEN LS Säulen LD Säulen Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec 3.1.7 MATERIAL FÜR MRNA-ISOLATION, REVERSE TRANSKRIPTION, REAL-TIME-PCR BEZEICHNUNG HERSTELLER MRNA-ISOLATION RNeasy 96 Kit twin.tec PCR Platten Qiagen Eppendorf REVERSE TRANSKRIPTION High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific REAL-TIME-PCR SYBR Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific MULTIPLEX-REAL-TIME-PCR 48.48 GT Sample/Loading Kit SUPERase-In Rnase Inhibitor SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA polymerase TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG 3.1.8 3.1.8.1 Fluidigm Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific PRIMER Primer für Real-Time-PCR Actb, Il10 und Prdm1 wurden als fertig designte Primer gekauft (KiCqStart SYBR Green Primers, Sigma-Aldrich). Hes1 und Maf wurden selber designt und von TIB MOLBIOL hergestellt. GEN Actb Hes1 Il10 Maf Prdm1 SEQUENZ Forward 5'-3' Reverse 3'-5' Forward 5'-3' Reverse 3'-5' Forward 5'-3' Reverse 3'-5' Forward 5'-3' Reverse 3'-5' Forward 5'-3' Reverse 3'-5' AATCTGGCACCACACCTTCT AGCCTGGATAGCAACGTACA TAAATGAAAGTCTGAGCCAGCT ATTTCCAGAATGTCCGCCTTC TGGAGGACTTTAAGGGTTAC TCTTGGTTCTCAGCTTGG AAGTCGACCACCTCAAGCAG AATGTGGCGTATCCCACTGA AGAGGTTATTGGAGTGATGAG GTTCTTAGGAACTGTGTCATTG ANLAGERUNGSTEMP. HERSTELLER 59 °C Sigma-Aldrich 61 °C TIB MOLBIOL 60 °C Sigma-Aldrich 62 °C TIB MOLBIOL 61 °C Sigma-Aldrich MATERIAL UND METHODEN 3.1.8.2 TaqMan-Assays für Multiplex-Real-Time-PCR Alle TaqMan-Assays wurden hergestellt von Thermo Fisher Scientific. GEN ASSAY # Ahr Bach2 Batf Batf3 Csf2 Ctla4 Egr2 Elk1 Erk Gata3 Gzmb Ifng Ikfz3 Il10 Il17a Il1rn Il2 Il4 Irf4 Jun Maf Mef2a Nfil3 Pdcd1 Prdm1 Smad4 Stat1 Stat2 Stat3 Stat4 Stat5a Stat6 Tgfb1 Tigit Tnf Hs00907314_m1 Hs00222364_m1 Hs00232390_m1 Hs00232744_m1 Hs00929873_m1 Hs00175480_m1 Hs00166165_m1 Hs00901847_m1 Hs01046830_m1 Hs00231122_m1 Hs00188051_m1 Hs00989291_m1 Hs04329617_m1 Hs00961622_m1 Hs00174383_m1 Hs00893626_m1 Hs00174114_m1 Hs00174122_m1 Hs00180031_m1 Hs01103582_s1 Hs04185012_s1 Hs01050409_m1 Hs00705412_s1 Hs01550088_m1 Hs00153357_m1 Hs00929647_m1 Hs01013996_m1 Hs01013115_g1 Hs01028017_m1 Hs01028017_m1 Hs00559637_g1 Hs00598625_m1 Hs00998133_m1 Hs00545087_m1 Hs00174128_m1 23 MATERIAL UND METHODEN 3.1.9 24 SIRNAS Die siRNAs wurden von Dr. Andrei Mantei designt [107]. GEN SEQUENZ siCTRL siMAF siPRDM1 siSTAT1 siSTAT3 siSTAT4 sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense 5'A AUU CUC CGA ACG UGU CAC GTT T3' 3'T TAA GAG GCU UGC ACA GUG CA 5' 5'A AAC GGC UCG AGC AGC GAC AAC C3' 3'T TUG CCG AGC UCG UCG CUG UT 5' 5'G ACG GCU UUA AUG AAG AGA AAA G3' 3'C TGC CGA AAU UAC UUC UCU UT 5' 5’ACA GAA AGA GCU UGA CAG TAA AG 3' 3’UAU CUU UCU CGA ACU GUC AUT 5’ 5’GCG GAG AAG CAU CGU GAG TGA GC 3' 3’CGC CUC UUC GUA GCA CUC ACT 5’ 5’AAA GAC AAA GCC UUC GGT AAA CA 3' 3’TTU CUG UUU CGG AAG CCA UUT 5’ 3.1.10 KITS BEZEICHNUNG HERSTELLER INTRAZELLULÄRE FÄRBUNG Foxp3 Staining Buffer Set (mit Fix/Perm und 1x Perm) Miltenyi Biotec Inside Stain Kit (mit Inside Fix und Inside Perm) Miltenyi Biotec KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON ZYTOKINEN IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit with Plates IL-10 Human Uncoated ELISA Kit with Plates IL-17A Human Uncoated ELISA Kit with Plates IL-4 Human Uncoated ELISA Kit with Plates MACSPlex Cytokine 12 Kit, human Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-1ra Set TRANSFEKTION Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific Miltenyi Biotec Bio-Rad Laboratories, Inc. P3 Primary Cell 96-Well Nucleofector Kit Lonza Group AG 3.1.11 ANDERE REAGENZIEN BEZEICHNUNG HERSTELLER Biocoll Trennlösung Brefeldin A CellTrace Violet Cell Proliferation Dye (Konzentration: 500 µM) Ionomycin calcium salt Phorbol-12-myristat-13-acetat Rapamycin Viobility 405/520 Fixable Dye Biochrom Sigma-Aldrich Thermo Fisher Scientific Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec 3.1.12 GERÄTE BEZEICHNUNG HERSTELLER 2720 Thermal Cycler 96-Well Shuttle Device Biomark HD FACSAria FACSAria II Thermo Fisher Scientific Lonza Group AG Fluidigm BD Biosciences BD Biosciences MATERIAL UND METHODEN 25 BEZEICHNUNG HERSTELLER MACSiMAG Separator MACSmix Tube Rotator MACSQuant Analyzer 10 Nucleofector 2b Device QuadroMACS StepOnePlus Real-Time-PCR System Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec Lonza Group AG Miltenyi Biotec Thermo Fisher Scientific MATERIAL UND METHODEN 26 3.1.13 CED-PATIENTEN: ZUGRUNDELIEGENDE KRANKHEIT UND KLINISCHE DATEN PATIENT # -FACHE IL-10INDUKTION* ZUGRUNDELIEGENDE KRANKHEIT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 17 8 15 5 9 6 9 14 18 6 18 5 13 16 12 17 19 11 10 6 Colitis ulcerosa Colitis ulcerosa Morbus Crohn Colitis ulcerosa Colitis ulcerosa Morbus Crohn Colitis ulcerosa Morbus Crohn Morbus Crohn Morbus Crohn Colitis ulcerosa Morbus Crohn Morbus Crohn Morbus Crohn Morbus Crohn Colitis ulcerosa Morbus Crohn Colitis ulcerosa Morbus Crohn Colitis ulcerosa HARVEYBRADSHAWINDEX MAYO SCORE MONTREAL+KLASSIFIZIERUN C-REAKTIVES PROTEIN [MG/L] MEDIKATION 3 1 <1 <1 1 0 <1 <1 14,6 1,2 <1,0 1,2 <1,0 4,3 <1,0 3,9 19,3 2,6 1,1 6,5 <1 <1 <1 Infliximab Prednisolon, Budesonid Budesonid Azathioprin/6-mercaptopurin Vedolizumab Azathioprin/6-mercaptopurin, Infliximab Vedolizumab Azathioprin/6-mercaptopurin, Infliximab Infliximab Azathioprin/6-mercaptopurin, Infliximab Infliximab Infliximab Infliximab Infliximab Infliximab Infliximab keine Infliximab Adalimumab 5-Aminosalicylsäure, E.coli Nissle G 5 3 2 5 0 1 10 2 0 0 3 3 15 2 3 2 2 0 1 3 2 2 0 * IL-10 Induktion in peripheren memory TH-Zellen nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation im Vergleich zur TCR-only-Stimulation (∅11,6) DAUER DER KRANHEIT (JAHRE) 20 7 10 5 3 21 6 16 12 8 13 1 13 16 1 1 11 30 MATERIAL UND METHODEN 3.1.14 SOFTWARE BEZEICHNUNG HERSTELLER FlowJo Genesis MACSQuantify Prism 6.0 Treestar A. Sturn, R. Snajder – TU Graz Miltenyi Biotec GraphPad Software Inc. 27 MATERIAL UND METHODEN 28 3.2 METHODEN 3.2.1 ZELLISOLATION Leukozytenfilter und periphere EDTA- oder Heparin-Blutproben dienten als Grundlage für die Isolation aller Leukozyten in den hier beschriebenen Versuchen. Sie wurden entnommen von Spendern der Charité Blutspende oder vor Ort von freiwilligen Spendern. EDTA-Blutproben von CED-Patienten (Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa) wurden entnommen in Zusammenarbeit mit der Charité Berlin, Universitätsmedizin, Medizinische Klinik für Gastroenterologie. Alle Patienten gaben ihr Einverständnis zur Blutspende (Ethik-Komitee der Charité, EA4/094/12). 3.2.1.1 Isolation von PBMC aus Leukozytenfiltern Leukozytenfilter wurden mit 100 ml PBS gespült, anschließend auf drei 50 ml Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und ggf. mit PBS auf 50 ml aufgefüllt. Anschließend wurden die Zellen bei RT (25 °C), 1000 × g (mit voller Beschleunigung und Bremse) für 30 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen, die Zellen in 35 ml PBS resuspendiert und mit 15 ml Biocoll-Trennlösung (ρ = 1,077 g/ml) unterschichtet. Die anschließende Dichtegradientenzentrifugation bei 1000 × g (schwache Beschleunigung und ohne Bremse), und RT für 35 min ermöglichte die Trennung der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von den restlichen Blutzellen wie Erythrozyten und Granulozyten. Nach der Zentrifugation waren die PBMC aufgrund niedrigerer Dichte (ρ = <1,077 g/ml) oberhalb der Trennlösung angereichert und konnten abgenommen werden, während die restlichen Blutzellen (ρ = >1,077 g/ml) pelletiert wurden. Anschließend wurden die PBMC in PBS aufgenommen, für 15 min bei 300 × g zentrifugiert, nochmals in PBS resuspendiert und erneut für 10 min bei 200 × g zentrigiert. Die Lagerung der PBMC erfolgte bei 4 °C. 3.2.1.2 Isolation von PBMC aus EDTA- oder Heparin-Blutproben Für die Untersuchungen von peripheren memory TH-Zellen in CED-Patienten wurden Morbus Crohn (MC)-Patienten, Colitis ulcerosa (CU)-Patienen und gesunden Spendern jeweils 30 ml Blut entnommen. Das Blut wurde mit 15 ml Biocoll Trennlösung unterschichtet und anschließend das Protokoll der PBMC-Isolation aus Leukozytenfiltern (siehe Kapitel 3.2.1.1) befolgt. 3.2.1.3 Magnetische Zellsortierung (MACS) Die magnetische Zellsortierung (MACS) basiert auf der Markierung von Zellen mit magnetischen Partikeln (Microbeads) und Isolations-Säulen (MACS-Säulen) in einem magnetischen Feld. Die Microbeads bestehen aus Dextran und Eisenoxid und sind kovalent gebunden an Antikörper oder Liganden, spezifisch für Moleküle auf Zelloberflächen. Durch die Bindung Microbeads über die Antikörper werden die markierten Zellen magnetisch. Lässt man die Zellsuspension über eine MACSSäule im magnetischem Feld laufen, so bleiben die Microbeads-markierten Zellen an der Säule hängen, während die unmarkierten Zellen über weitere Waschschritte mit PEB ausgespült werden. Durch anschließendes Entfernen der Säule aus dem magnetischen Feld kann man die isolierten Zellen MATERIAL UND METHODEN 29 mit PEB ausspülen. Verschiedene Matrices der MACS-Säulen sind optimiert für das Zurückhalten von entweder möglichst wenig unmarkierten oder möglichst vielen markierten Zellen. Dadurch lassen sich gewünschte Zellen, die einen bestimmten Marker exprimieren, isolieren bzw. anreichern oder ungewünschte Fraktionen depletieren [109]. 3.2.1.3.1 Anreicherung oder Depletion von Zellpopulationen mittels MACS Die gewünschte Anzahl PBMC wurde in PEB resuspendiert, mit der entsprechenden Menge spezfischer Microbeads versetzt und für 15 min bei 4 °C inkubiert. Wenn nicht anders erwähnt, erfolgte die Markierung mit Microbeads nach Herstellerangaben. Nach dem Herauswaschen der übrigen Microbeads mit mindestens dem 5-fachen Volumen PEB (5 min, 500 × g, 4 °C) wurden die Zellen in PEB resuspendiert (500 µl/1×108 PBMC) und auf eine MACS-Säule gegeben. Für die Anreicherung wurden LS-Säulen verwendet, für die Depletion LD-Säulen. Das Equilibrieren und Spülen der MACS-Säulen und das Herauswaschen der Wunschpopulation erfolgte mit PEB mit Volumen nach Herstellerangaben. Als Magnet wurde ein QuadroMACS verwendet. 3.2.1.4 Analyse und Isolation von Zellen mittels FACS Fluorescent-Associated Cell Sorting (FACS) ist eine Methode der Analyse und Isolation von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Zellpopulationen auf Einzelzell-Niveau. Hierbei werden die Zellen zunächst hydrodynamisch fokussiert, von Lasern bestimmter Wellenlängen angestrahlt und so die Fluoreszenzfarbstoffe angeregt. Diese emittieren daraufhin Licht bestimmter Wellenlängen. Zusätzlich liefert die Streuung des Laserlichts durch die Zellen selbst Informationen über die Größe (Forward Scatter, FSC) und Granularität (Side Scatter, SSC) der Zellen. Durch mehrere Systeme von Bandfiltern und Detektoren wird das gestreute und emittierte Licht aufgenommen und man erhält Informationen über jede einzelne Zelle bezüglich gefärbter Marker und der jeweiligen Zelleigenschaften. Mittels spezieller Software können Zellpopulationen getrennt voneinander betrachtet werden (gating). Das ermöglicht es, Informationen über Eigenschaften und gefärbten Marker und Moleküle für eine gewählte (gated) Zellpopulation zu erhalten. Nach der Messung und Analyse dieser Informationen mit Durchflusszytometern werden die Zellen verworfen. FACS-Geräte können darüber hinaus lebende Zellen anhand dieser Informationen isolieren, sodass sie für weiterführende Experimente verwendet werden können. Hierbei werden die Flüssigkeitstropfen, in denen die Zellen enthalten sind, elektronisch aufgeladen. Mit Hilfe dieser Ladung können die Tropfen über ein elektrisches Feld umgeleitet werden und so die gewünschten Zellen isoliert werden [110]. 3.2.1.5 Isolation von TH-Zell-Subpopulationen aus PBMC aus Leukozytenfiltern Für die Isolation von naiven und memory TH-Zellen aus Leukozytenfiltern wurden zunächst komplette CD4+ TH-Zellen mittels MACS angereichert. Hierfür wurden 1×108 PBMC in 130 µl PEB resuspendiert und 40 µl CD4 Microbeads hinzugegeben. Anschließend folgte die Anreicherung mittels MACS (siehe Kapitel 3.2.1.3.1). Am folgenden Tag wurden, je nach gewünschter Subpopulation, die TH-Zellen für die FACS-Isolation mittels FACSAria oder FACSAria II (BD Biosciences) gefärbt. MATERIAL UND METHODEN 3.2.1.5.1 30 FACS-Isolation von naiven und memory TH-Zellen In den angereicherten CD4+ TH-Zellen wurde zunächst CD4-APC-Vio770, CD45RA-FITC, CD45R0PE, CCR7-PE-Vio770 und CD31-APC gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.1 [b]). Mit dieser Färbung konnten unterschiedliche naive und memory TH-Zellen mittels FACS isoliert werden: CD31+ naive TH-Zellen (CD4+CD45RA+CCR7+CD31+), die im weiteren Verlauf dieser Arbeit als “naive” TH-Zellen bezeichnet werden, CD31– naive TH-Zellen (CD4+CD45R0+CD31–), komplette memory TH-Zellen (CD4+CD45R0+CD31–), die im weiteren Verlauf dieser Arbeit als “memory ” TH-Zellen bezeichnet werden und die unterschiedlichen Entwicklungsstadien von TH-Zellen memory TCM (CD4+CD45R0+CD31–CCR7+), TEM (CD4+CD45R0+CD31–CCR7–) und TEMRA (CD4+CD45RA+CD31– CCR7) (Abb. 3.1 und Abb. 1.2). Für Experimente, in denen Transkriptionsfaktor-Färbungen durchgeführt wurden, wurden die angereicherten TH-Zellen mit CD4-APC-Vio-770, CD45R0-PerCP und CD31-VioBlue gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.1 [b]) und anschließend mittels FACS memory THZellen (CD4+CD45R0+CD31–) isoliert. Abb. 3.1 Isolation von naiven und memory TH-Zellen FACS-Strategie für CD45RA+CCR7+CD31+ (CD31+) CD45RA+CCR7+CD31− (CD31) naive TH-Zellen und CD45R0+CCR7+ (TCM), CD45R0+CCR7 (TEM) und CD45RA+CCR7 (TEMRA) memory TH-Zellen. 3.2.1.5.2 FACS-Isolation von TH-Subpopulationen In den angereicherten CD4+ TH-Zellen wurde zunächst CD4-VioBlue, CD45R0-FITC, CXCR3-APC, CCR4-PerCP-Cy5.5, CCR6-PE-Vio770 und CCR10-PE gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.1 [b]). Mit dieser Färbung + konnten + die + TH-Subpopulationen + + + + TH1/17 (CD4 CD45R0 CXCR3 CCR6 ), TH2 (CD4 CD45R0 CCR4 ) und TH17 (CD4 CD45R0 CCR6+) mittels FACS isoliert werden (Abb. 3.2). + (CD4+CD45R0+CXCR3+), T H1 + MATERIAL UND METHODEN 31 Abb. 3.2 FACS-Isolation von TH-Subpopulationen. FACS-Strategie für TH-Subpopulationen: In angereicherten CD4+ TH-Zellen wurden die Oberflächenmoleküle CD4, CD45R0, CXCR3, CCR6, CCR4 und CCR10 gefärbt. Aus den CD4+CD45R0+ memory TH-Zellen wurden die CXCR3+ (TH1), CXCR3+CCR6+ (TH1/17), CCR4+ (TH2) und CCR6+CCR4+ (TH17) Subpopulationen isoliert [10, 12]. 3.2.1.6 Isolation von memory TH-Zellen aus PBMC aus EDTA- oder Heparin-Blutproben Aus 30 ml Blut aus EDTA- oder Heparin-Blutproben für die Untersuchungen von peripheren memory TH-Zellen in CED-Patienten wurden weniger PBMC isoliert als aus Leukozytenfiltern, sodass hier die PBMC ohne vorherige Anreicherung der CD4+ TH-Zellen für die FACS-Isolation verwendet wurden. Hierfür wurden die PBMC mit CD3-VioBlue, CD4-APC-Vio770 und CD45R0-PerCP gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.1 [b]) und mittels FACS die memory TH-Zellen (CD3+CD4+CD45R0+) isoliert. 3.2.1.7 Isolation von pDC und mDC aus PBMC Für die Isolation von plasmacytoiden DC (pDC) und myeloiden DC (mDC) wurden PBMC aus einem Leukozytenfilter in je 250 µl BDCA1-FITC und BDCA4-PE resuspendiert und gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.1 [b]). Anschließend folgte die Resuspension und Inkubation in je 250 µl anti-PE und anti-FITC Microbeads, gefolgt von der MACS-Anreicherung (siehe Kapitel 3.2.1.3.1). Die angereicherten DC wurden dann mit CD14-PE-Vio770 und CD19-PE-Vio770 gefärbt und mittels FACS die pDC (BDCA4+CD19–CD14–) und mDC (BDCA1+CD19–CD14–) isoliert. 3.2.1.8 Reinheitsbestimmung der isolierten Zellen MACS-isolierte bzw. depletierte Zellen (CD14+ Monozyten, CD25+ TREG, CD4+ TRESP, CD3depletierte PBMC) wurden nach der Isolation jeweils auf ihre Reinheit überprüft. Hierfür wurden Aliquots der gewünschten Fraktionen entnommen und die Isolationsmarker angefärbt (CD14, CD25, MATERIAL UND METHODEN 32 CD4, CD3 – siehe Kapitel 3.2.2.1 [b]) und durchflusszytometrisch gemessen. Hier lag die Reinheit für die isolierten Fraktionen bei >90 % bzw. bei <3 % CD3+ Zellen in den CD3-depletierten PBMC. Zur Bestimmung der Reinheit von TREG wurde zusätzlich intrazellulär Foxp3 gefärbt. Von den CD25+ TREG waren 60 – 80 % der Zellen Foxp3+. FACS-isolierte Zellen wurden nach der Isolation durchflusszytometrisch auf ihre Reinheit getestet. Hier lag die Reinheit der isolierten Zellen (naive und memory TH-Zellen, TH1, TH2, Th17, TH1/17, TCM, TEM, TEMRA, pDC, mDC) bei >99 %. 3.2.2 ZELLFÄRBUNG Die Expression von Oberflächenmolekülen, Zytokinen oder Transkriptionsfaktoren konnte mittels FACS analysiert werden (siehe Kapitel 3.2.1.4). Die entsprechenden Marker mussten dafür mit Antikörpern, markiert mit fluoreszierenden Farbstoffen, gefärbt werden. Je nachdem, ob Moleküle auf der Zelloberfläche intrazellulär oder intranukleär gefärbt werden mussten, wurden unterschiedliche Färbeprotokolle angewandt. Die Protokolle konnten kombiniert werden. Als Durchflusszytometer wurde für die hier durchgeführten Versuche ein MACSQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec) verwendet. 3.2.2.1 Färbung von Molekülen auf der Zelloberfläche Oberflächenmoleküle wurden auf lebenden Zellen gefärbt. So konnten die Zellen bei Bedarf mittels FACS-Isolation (siehe Kapitel 3.2.1.4) für weiterführende Versuche verwendet werden. Wurde eine Oberflächen-Färbung mit einer intrazellulären (siehe Kapitel 3.2.2.3) oder intranukleären Färbung (siehe Kapitel 3.2.2.4) kombiniert, wurden die Zellen zunächst auf der Oberfläche gefärbt und dann das jeweilige Protokoll angeschlossen. Färbungen wurden in [a] 96-Well-Platten oder [b] 15 ml Zentrifugenröhrchen durchgeführt. Bis zu [a] 5×105 Zellen/Well oder [b] 5×107 Zellen wurden zunächst zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C) und anschließend resuspendiert in [a] 30 µl/Well oder [b] 100 µl Färbelösung. Die Färbelösung setzte sich zusammen aus PEB und Fluoreszenz-markierten Antiköpern in zuvor titrierter Konzentration. Anschließend wurde die Zellsuspension für 10 min bei 4 °C und Dunkelheit inkubiert, mit [a] 200 µl/Well oder [b] 5 ml PEB gewaschen (5 min, 500 × g, 4 °C) und wieder in [a] 100 µl/Well oder [b] 1 ml PEB resuspendiert. In Kombination mit der Färbung von toten Zellen Viobility 405/520 Fixable Dye (siehe Kapitel 3.2.2.2) wurden die Zellen mit PBS gewaschen und für 15 min gefärbt. Bis zur durchflusszytometrischen Messung wurden die Zellen bei 4 °C und Dunkelheit gelagert. Kurz vor der Messung wurden tote Zellen bei Bedarf mit PI oder DAPI (je 1 µg/ml) gefärbt. 3.2.2.2 Intrazelluläre Färbung von toten Zellen Durch beschädigte Membranen von toten Zellen kann der hier verwendete Farbstoff in diese Zellen eindringen und mit primären Aminogruppen der zellulären Proteine reagieren. Dadurch ist der Farbstoff fixierbar und kann mit intrazellulären (siehe Kaptitel 3.2.2.3) und intranukleären Färbungen MATERIAL UND METHODEN 33 (siehe Kapitel 3.2.2.4) kombiniert werden. Die Färbung von toten Zellen erfolgte in 96-Well-Platten. Hierfür wurden die Zellen zunächst zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), in 200 µl/Well PBS resuspendiert und nochmals zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C). Anschließend wurden die Zellen in 30 µl/Well Färbelösung aus PBS + Viobility 405/520 Fixable Dye (1:5000) resuspendiert und bei RT und Dunkelheit für 15 min inkubiert. Dieser Färbelösung konnten bei Bedarf Oberflächen-Antikörper hinzugefügt werden. 3.2.2.3 Intrazelluläre Färbung von Zytokinen Um intrazellulär Zytokine zu färben, mussten die Zellen zunächst zur Zytokinproduktion angeregt werden. Hierfür wurden die Zellen mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA – 10 ng/ml) und Ionomycin (1 µg/ml) für 5 h restimuliert. Damit die Zytokine nicht in das Kulturmedium sekretiert werden und innerhalb der Zellen angefärbt werden konnten, wurde nach 1 h Brefeldin A (5 µg/ml) hinzugegeben, um den Golgi-Apparat zu hemmen. Im Anschluss mussten die Zellen zunächst fixiert und anschließend permeabilisiert werden damit die Antikörper in das Zytoplasma gelangen konnten. Dafür wurde das folgende Protokoll zur Färbung in 96-Well-Platten verwendet: In bis zu 5×105 Zellen wurden zunächst toten Zellen gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.2). Danach wurden direkt 30 µl/Well Inside Fix hinzugegeben, gemischt und die Zellen für 15 min bei RT und Dunkelheit fixiert. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), in 200 µl Inside Perm resuspenidert, wieder zentrifguiert (5 min, 500 × g, 4 °C) und dann in 30 µl Färbelösung aufgenommen und für 20 min bei RT und Dunkelheit inkubiert. Die Färbelösung bestand aus Inside Perm und Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen Zytokine in zuvor titrierter Konzentration. Nach der Inkubation wurden 200 µl PEB hinzugegeben, zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C) und anschließend die Zellen – je nach gewünschter Zellkonzentration – in 60 – 100 µl/Well PEB aufgenommen. Bis zur durchflusszytometrischen Messung wurden die Zellen bei 4 °C und Dunkelheit gelagert. 3.2.2.4 Intranukleäre Färbung von Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktoren werden, anders als Zyotkine (siehe 3.2.2.3), nicht im Zytoplasma, sondern im Nukleus angefärbt. Daher mussten sie speziell fixiert und permeabilisert werden. Dafür wurde das folgende Protokoll verwendet: Sollte die Färbung von Transkriptionsfaktoren mit Zytokin-Färbungen kombiniert werden, so wurden die Zellen zunächst mit PMA/Ionomycin + Brefeldin A restimuliert (siehe Kapitel 3.2.2.3). Intranukleäre Färbungen wurden in 96-Well-Platten durchgeführt. In bis zu 5×105 Zellen wurden zunächst tote Zellen gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.2). Während der Inkubationszeit wurden die Fixierlösung „Fix/Perm“ und die Permeabilisationslösung „1x Perm“ nach Herstellerangaben aus dem Foxp3-Staining-Buffer Set angesetzt. Nach der Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), in Fix/Perm-Puffer resuspendiert, für 30 min bei 4 °C und Dunkelheit fixiert, zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), in 200 µl/Well 1x Perm resuspendiert, zentrifugiert (5 min, MATERIAL UND METHODEN 34 500 × g, 4 °C), in 30 µl/Well Färbelösung resuspendiert und für 30 min bei 4 °C und Dunkelheit inkubiert. Die Färbelösung bestand aus 1x Perm und Antiköpern gegen Transkriptionsfaktoren (Foxp3, c-Maf, Blimp-1, NFIL3 oder IKZF3) in passender chromatischer Kombination. Nach der Färbung wurden die Zellen in 200 µl/Well 1x Perm gewaschen (5 min, 500 × g, 4 °C) und anschließend, je nach gewünschter Zellkonzentration, in 60 – 100 µl/Well PEB aufgenommen. Bis zur durchflusszytometrischen Messung wurden die Zellen bei 4 °C und Dunkelheit gelagert. Färbung von TH-Zellen mit CellTrace 3.2.2.5 CellTrace ist ein Farbstoff, der sich in TH-Zellen einlagert. Bei jeder Zellteilung wird die CellTraceFärbung in den Tochterzellen schwächer. So kann anhand abnehmender CellTrace-Intensität die Frequenz von proliferierten TH-Zellen bestimmt werden. Zunächst wurden hierfür TH-Zellen in PBS gewaschen (5 min, 500 × g, 4 °C) und anschließend 1 - 2×107 TH-Zellen/ml in PBS aufgenommen. Dann wurde CellTrace im gleichen Volumen 1:100 verdünnt (2 µM Endkonzentration), inkubiert (15 min, 37°C), die Inkubation mit dem doppelten Volumen DMEM gestoppt und zentrifugiert (5 min, 500 × g, RT). Anschließend wurden die Zellen in DMEM aufgenommen (5×105 Zellen/ml). 3.2.3 ZELLKULTUR Mit Hilfe der Zellkultur wurde die Aktivierung von TH-Zellen in vitro simuliert. Hierfür wurden die TH-Zellen in einer APC-freien Zellkultur mit polyklonalen, aktivierenden Antikörpern gegen CD3, CD28 und CD2 stimuliert. Alternativ wurden die TH-Zellen mit allogenen APC co-kultiviert, wobei die TH-Zellen in einer allogenen Immunreaktion mit den APC aktiviert wurden. 3.2.3.1 Stimulation von TH-Zellen im APC-freien Zellkultursystem Im APC-freien Zellkultursystem wurden die TH-Zellen mit Hilfe von CD3/CD28/CD2-MACSiBeads über ihren TCR aktiviert. Die Aktivierung des Notch-Signalweges in TH-Zellen erfolgte über zusätzliche MACSiBeads, auf die rmDLL4-Fc kovalent gebunden wurde. 3.2.3.1.1 Herstellung und Beladung von CD3/CD28/CD2-MACSiBeads Tab. 3.1 MACSiBeads REAGENZ VOLUMEN MENGE PEB anti-Biotin MACSiBeads anti CD3-Biotin anti-CD28-Biotin anti-CD2-Biotin 900 µl 250 µl 50 µl 50 µl 50 µl 5×107 MACSiBeads 5 µg 5 µg 5 µg Die Reagenzien wurden in einem 2000 µl Reagenzgefäß zusammengefügt und über Nacht oder für mindestens 2 h im MACSMix Tube Rotator (Miltenyi Biotec) bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 700 µl PEB hinzugefügt (2,5×104 MACSiBeads/µl). MATERIAL UND METHODEN 3.2.3.1.2 35 Herstellung und Beladung von DLL4-MACSiBeads Die Aktivierung des Notch-Signalweges in TH-Zellen erfolgte in den hier durchgeführten Versuchen über den Notch-Liganden DLL4. Die Aminosäuresequenzen von mDLL4 und hDLL4 stimmen zu 86 % überein [111] und Vorversuche zeigten, dass auch mDLL4 die IL-10 Induktion in humanen THZellen bewirkte [108]. Um seine Funktion ausüben zu können, muss DLL4 auf einer Matrix gebunden sein [98]. Als so eine Matrix wurden hier ebenfalls MACSiBeads verwendet. Vorversuche ergaben außerdem, dass kovalent auf MACSiBeads gebundenes DLL4 den stärksten Effekt auf die IL-10Induktion hatte. Um DLL4 kovalent auf die MACSiBeads zu binden, musste das Protein mit einem humanen Antikörper-Fc-Teil fusioniert werden, über den die kovalente Bindung erfolgte. Zur Herstellung dieses rekombinanten DLL4-Proteins wurden Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen verwendet, die stabil mit einem Plasmid für rmDLL4-hFc transfiziert wurden (mit freundlicher Unterstützung von Prof. Dr. Antonius Rohlink, Universität Basel). 2×106 CHO-Zellen wurden in einer T150 Zellkulturflasche für maximal 14 Tage in 30 ml Kulturmedium kultiviert (1×105). Tab. 3.2 Kulturmedium für CHO-Zellen REAGENZ VOLUMEN RPMI FCS (IgG frei) Penicillin-Streptomycin 2-Mercaptoethanol in PBS 485 ml 10 ml 5 ml 500 µl KONZENTRATION 10 % (v/v) 100 IU/ml 50 µM Anschließend wurde das Kulturmedium abgenommen, zentrifugiert (10 min, 2000 × g, 4 °C) und der Überstand über eine Protein A-Säule aufgereinigt. Die Beladung der MACSiBeads mit dem aufgereinigten rmDLL4-hFc erfolgte bei Miltenyi Biotec mit freundlicher Unterstützung von Nadine Mockel-Tenbrinck. Diese MACSiBeads wurden mit PEB auf eine Konzentration von 7,5×104 MACSiBeads/µl eingestellt. 3.2.3.1.3 Ansetzen und Ablauf der TH-Zell-Kultur FACS-sortierte TH-Zellen (siehe Kapitel 3.2.1.5) wurden mit einer Konzentration von 5×105 Zellen/ml in DMEM aufgenommen und 100 ml/Well in einer 96-Well-Platte ausgesät (5×104 Zellen/Well). Anschließend wurden 2 µl CD3/CD28/CD2-MACSiBeads (5×104 MACSiBeads/Well) hinzugefügt und, wenn benötigt, 2 µl DLL4-MACSiBeads (15×104 MACSiBeads/Well). Schließelich wurde die 96-Well-Platte zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), der Überstand abgenommen und 200 µl/Well DMEM + Proleukin hinzugefügt. Zur Stimulation der IL-10-Produktion wurden zusätzlich IFN-α, IL-6, IL-21, IL-12 oder IL-27 hinzugegeben. Zur Blockade von endogenen Zytokinen wurden anti IL-6 (10 µg/ml), anti IL-10R (10 µg/ml) oder rhIL-21R-Fc (5 µg/ml) eingesetzt. So ergaben sich die vier wesentlichen Stimulationsbedingungen, die in dieser Arbeit verwendet wurden: MATERIAL UND METHODEN 36 Tab. 3.3 Stimulationsbedingungen BEZEICHNUNG STIMULATION TCR-only DLL4 CD3/CD28/CD2-MACSiBeads + IL-2 CD3/CD28/CD2-MACSiBeads + IL-2 + DLL4-MACSiBeads IFN-α/IL-6/IL-21 CD3/CD28/CD2-MACSiBeads + IL-2 + IFN-α, IL-6 und IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 CD3/CD28/CD2-MACSiBeads + IL-2 + DLL4-MACSiBeads + IFN-α, IL-6 und IL-21 Für intrazelluläre Färbungen von Zytokinen (siehe Kapitel 3.2.2.3) und Messungen von Zytokinen im Zellkulturüberstand (siehe Kapitel 3.2.3.6) wurden die TH-Zellen für 120 h bei 37 °C und 5 % CO2 aktiviert. Anschließend folgten 24 h Ruhephase für die TH-Zellen. Dafür wurden die Zellen zentrifugiert (5 min, 500 × g, RT), der Zellkulturüberstand abgenommen, eingefroren (-20 °C) und durch vorgewärmtes, frisches DMEM ohne zusätzliche Zytokine ersetzt. Nach insgesamt 144 h folgte die Restimulation mit PMA/Ionomycin + Brefeldin A (siehe Kapitel 3.2.2.3). Der eingefrorene Überstand wurde für die Zytokin-Konzentrationsmessungen verwendet. Die Dauer der Aktivierung war abhängig von der anschließenden Analyse der TH-Zellen. Neben der intrazellulären Färbung wurden außerdem inhibitorische Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren auf den Zellen gefärbt und die Messenger RNA (mRNA)-Expression gemessen. Wenn nicht anders angegeben, wurden die TH-Zellen für folgende Zeiten aktiviert: Tab. 3.4 Aktivierungszeiten von TH-Zellen ANALYSE ZEIT Intrazelluläre Färbung Messung von Zytokinen im Zellkulturüberstand Färbung von IRs und Transkriptionsfaktorren mRNA-Expression und PD-1 Färbung 120 h 120 h 48 h 24 h 3.2.3.2 siehe Kapitel 3.2.2.3 siehe Kapitel 3.2.3.6 siehe Kapitel 3.2.2.1 [a] und 3.2.2.4 siehe Kapitel 3.2.5 und 3.2.2.1 Entfernung von MACSiBeads aus einer TH-Zellkultur Zur Entfernung des CD3/CD28/CD2- oder des DLL4-Stimulus konnten die MACSiBeads mittels MACSiMAG (Miltenyi Biotec) von den TH-Zellen getrennt werden. Hierfür wurden die TH-Zellen je nach Population oder Stimulus in 15 ml Zentrifugenröhrchen (gespült mit DMEM) gepooled und zunächst auf Eis gelagert. Für die Entfernung mittels MACSiMAG wurde die Zellsuspension zunächst gevortext und dann für 4 min im MACSiMAG platziert. Die magnetische Anziehung entfernte hierbei die MACSiBeads aus der Zellsuspension und man konnte die TH-Zellen ohne MACSiBeads in ein neues 15 ml Zentrifugenröhrchen überführen. Anschließend wurden die TH-Zellen zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C) und in frischem DMEM, in gewünschter Konzentration resuspendiert. 3.2.3.3 Messung der Stabilität der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten IL-10-Produktion Um die Stabilität der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten IL-10-Produktion zu untersuchen, wurden zwei Ansätze von naiven und memory TH-Zellen zunächst mit TCR-only oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 für 120 h aktiviert (siehe Kapitel 3.2.3.1.3) (1. Woche). Anschließend wurde der erste Ansatz für 24 h mit frischem DMEM, ohne Zytokine ruhen gelassen, mit PMA/Ionomycin + Brefeldin A restimuliert und IL-10 und IFN-γ intrazellulär gefärbt und mittels FACS gemessen (siehe Kapitel 3.2.2.3). Vom zweiten Ansatz wurden die MACSiBeads entfernt (siehe Kapitel 3.2.3.2), in einer neuen 96-Well- MATERIAL UND METHODEN 37 Platte 200 µl/Well der Zellsuspension ausgesät (5×104 Zellen/Well) und die Zellen für 48 h ruhen gelassen (37 °C, 5 % CO2). Nach der Ruhephase wurden die Zellen erneut für 120 h aktiviert (2. Woche). Dieses Mal aber ausschließlich mit TCR-only-Stimulus. Es folgten 24 h Ruhephase mit frischem DMEM, ohne Zytokine, die PMA/Ionomycin + Brefeldin A Restimulation und die intrazelluläre Färbung von IL-10 und IFN-γ einschließlich FACS-Messung. 3.2.3.4 Stimulation von TH-Zellen in einer Co-Kultur mit pDC oder mDC Um TH-Zellen mittels pDC und mDC zu aktivieren und den Notch-Signalweg zu aktivieren, mussten die DC zunächst über ihren Toll-like Receptor (TLR)-Liganden vor-aktiviert werden. Dazu wurden 5×103 mDC bzw. pDC pro Well in einer 96-Well-Platte ausgesät und nach mit TLR-Liganden über Nacht aktiviert. Tab. 3.5 TLR-Aktiverung von DC MDC PDC + 5 µg LPS + 1,4 µg ODN 2395 Am folgenden Tag wurden allogene naive und memory TH-Zellen mittels FACS isoliert (siehe Kapitel 3.2.1.5.1), mit einer Konzentration von 5×105 Zellen/ml in DMEM aufgenommen, und 100 µl/Well (5×104 Zellen/Well) mit den DC zusammengesetzt. Anschließend wurde die 96-Well-Platte zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), der Überstand abgenommen und in 200 µl/Well DMEM +Proleukin +1 µg/ml SEB aufgenommen. SEB diente zur Quervernetzung der TCR mit den MHC-II und co-stimulatorischen Molekülen auf den DC. Zur zusätzlichen Stimulation mit IL-10induzierenden Zytokinen wurden IFN-α, IL-6 und IL-21 hinzugefügt. Die Blockade von DLL4 erfolgte über Zugabe von 10 µg/ml anti DLL4-Antikörper. Als Kontrollen wurden die TH-Zellen APCfrei mit TCR-only und IFN-α/IL-6/IL-21 aktiviert (siehe 3.2.3.1.3). Nach 120 h Aktivierung und weiteren 24 h Ruhephase wurde IL-10 intrazellulär gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.3). 3.2.3.5 3.2.3.5.1 Suppressions-Assays Monozyten-Suppressions-Assay Naive TH-Zellen wurden mit TCR-only (TTCR-only) und IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (T /6/21/DLL4) aktiviert α (siehe Kapitel 3.2.3.1.3). Nach 120 h wurden die MACSiBeads entfernt (siehe Kapitel 3.2.3.2) und die Zellen wurden für weitere 24 h ruhen gelassen. Anschließend wurden dann CD14+ Monozyten mittels MACS aus allogenen PBMC isoliert (siehe Kapitel 3.2.1.3.1). Für den Suppressions-Assay wurden dann 5×104 TTCR-only oder T /6/21/DLL4 pro Well mit je 1×105 Monozyten für 40 h co-kultiviert. Zur α Blockade der Wirkung von IL-10 wurde ein inhibierender IL-10R-Antikörper (10 µg/ml) hinzugefügt. Anschließend wurde durchflusszytometrisch die Expression von CD163, CD40 und Human Leukocyte Antigen (HLA)-DR bestimmt (siehe Kapitel 3.2.2.1 [a]). 3.2.3.5.2 TH-Zell-Suppressions-Assay Naive TH-Zellen wurden mit TCR-only (TTCR-only) und IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (T /6/21/DLL4) aktiviert α (siehe Kapitel 3.2.3.1.3). Nach 120 h wurden die MACSiBeads entfernt (siehe Kapitel 3.2.3.2) und die MATERIAL UND METHODEN 38 Zellen wurden für weitere 24 h ruhen gelassen. Zusätzlich wurde mittels Oberflächenfärbung (siehe Kapitel 3.2.2.1 [a]) der HLA-A2-Phänotyp (HLA-A2+ oder HLA-A2–) der modulierten TH-Zellen bestimmt. Nach 144 h wurden mittels MACS aus allogenen PBMC mit gegensätzlichem HLA-A2Phänotyp CD4+ TH-Zellen (TRESP) isoliert (siehe Kapitel 3.2.1.3.1) und mit CellTrace gefärbt (siehe Kapitel 3.2.2.5). Zusätzlich wurden aus weiteren allogenen PBMC mittels MACS die CD3+ T-Zellen depletiert und dienten als APC (siehe Kapitel 3.2.1.3.1). In einer 96-Well-Platte wurden dann 5×104 TTCR-only oder T /6/21/DLL4 mit 5×104 TRESP und 1×105 APC α zusammengefügt, zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), der Überstand abgenommen und 200 µl DMEM hinzugefügt. Zur Blockade der Wirkung von IL-10 wurde ein inhibierender IL-10R-Antikörper (10 µg/ml) zugegeben. Nach 96 h wurde erneut HLA-A2 gefärbt. Dadurch konnte mittels gating TRESP von TTCR-only bzw. T /6/21/DLL4 unterschieden werden und die Frequenz der CellTrace negativen THα Zellen bestimmt werden, ohne dass TTCR-only oder T /6/21/DLL4 als falsch positive TH-Zellen die CellTraceα Messung verfälschten. 3.2.3.6 Stimulation von TREG im APC-freien Zellkultursystem TREG wurden mittels CD25 Microbeads aus PBMC aus Leukozytenfiltern nach Herstellerangaben isoliert (siehe Kapitel 3.2.1.3.1). Anschließend wurden 1x105 Zellen/Well in TexMACS Medium in einer 96-Well-Platte ausgesät und 4x105 TREG MACSiBeads hinzugefügt und, wenn benötigt, 3x105 DLL4-MACSiBeads. Anschließend wurde die 96-Well-Platte zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), der Überstand abgenommen und 200 µl/Well TexMACS Medium + Proleukin hinzugefügt. Zur Stimulation der IL-10-Produktion wurden zusätzlich IFN-α, IL-6 und IL-21 hinzugegeben. Nach 240 h wurden die Zellen zentrifugiert (5 min, 500 × g, RT), der Überstand abgenommen und eingefroren (-20°C), die Zellen in vorgewärmtem RPMI aufgenommen und für die intrazelluläre Färbung von IL-10, IFN-γ und TNF-α restimuliert (siehe Kapitel 3.2.2.3). Die Überstände wurden für die IL-10Konzentrationsbestimmung verwendet (siehe Kapitel 3.2.4). 3.2.4 MESSUNG VON ZYTOKIN-KONZENTRATIONEN IM ZELLKULTURÜBERSTAND Für die Messung der Zytokinproduktion wurden, wenn nicht anders erwähnt, die eingefrorenen Überstände der Zellkulturen nach 120 h TH-Zell-Aktivierung (siehe Kapitel 3.2.3.1.3) oder nach 40 h Restimulation nach der siRNA-Transfektion verwendet (siehe Kapitel 3.2.6.1). Sie wurde mit drei verschiedenen Techniken durchgeführt. 3.2.4.1 ELISA In Vorversuchen wurde über Titrationen der ungefähre Konzentrationsbereich für jedes untersuchte Zyotkin unter den jeweiligen Kulturbedingungen bestimmt. Die Berechnung der Konzentration erfolgte über eine mitgeführte Verdünnungsreihe aus rekombinantem Zytokin. Nach dem Auftauen wurden die Überstände so verdünnt, dass sich die Konzentration des Analyten im mittleren Bereich der Verdünnungsreihe befand. Konzentrationsbestimmungen mittels Enzyme-Linked Immunosorbent MATERIAL UND METHODEN 39 Assay (ELISA) wurden exakt nach Herstellerangaben durchgeführt (Protocol: Uncoated ELISA, Thermo Fisher Scientific). 3.2.4.2 MACSPlex Für die Bestimmung der Zytokinkonzentration mittels MACSPlex wurden unverdünnte Überstände verwendet. Nach dem Auftauen wurden die Überstände exakt nach Herstellerangaben verarbeitet (Datenblatt: MACSPlex Cytokine 12 Kit, human, Miltenyi Biotec). 3.2.4.3 Bioplex Die Konzentrationsbestimmung von IL-1 Receptor Antagonist (IL-1ra) wurde mittels Bioplex von der Firma Bio-Rad im Rahmen einer Produktvorstellung durchgeführt. 3.2.5 ANALYSE DER MRNA-EXPRESSION Die mRNA von TH-Zellen wurden manuell isoliert, zu cDNA umgeschrieben und für die Real-TimePCR verwendet. Alternativ wurden die Zellen in einem Ein-Well-Ansatz lysiert und zu cDNA umgeschrieben und anschließend für die Multiplex-Real-Time-PCR verwendet. 3.2.5.1 RNA-Isolation Für die Isolation von mRNA wurde das RNeasy 96 Kit (Qiagen) verwendet. Die Isolation erfolgte mit maximal 5×105 TH-Zellen nach Herstellerangaben (RNeasy 96 Protocol for Isolation of Total RNA from Animal Cells: Using spin technology). Die Zentrifugationsschritte wurden für 4 min, bei 4250 × g und RT durchgeführt. Die Elution der mRNA erfolgte in twin.tec PCR Platten (Eppendorf) mit zunächst 50 µl H2O und 20 µl H2O im zweiten Elutionsschritt. Die eluierte mRNA wurde bei -80 °C gelagert. 3.2.5.2 Reverse Transkription zu cDNA Die reverse Transkription der mRNA erfolgte mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific). In den folgenden Tabellen sind der Reaktionsmix für eine Reaktion und das Temperaturprofil der reversen Transkription gezeigt: Tab. 3.6 Reagenzien reverse Transkription REAGENZ VOLUMEN/REAKTION [µL] H2O 10x RT Buffer 10x RT Random Primers 25x dNTP Mix MultiScribe Reverse Transcriptase RNase Inhibitor eluierte mRNA 3,2 2 2 0,8 1 1 10 MATERIAL UND METHODEN 40 Tab. 3.7 Temperaturprofil reverse Transkription ZEIT TEMPERATUR 10 min 120 min 5 min halten 25 °C 37 °C 85 °C 4 °C Für die Reverse Transkription wurde der 2720 Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific) verwendet. 3.2.5.3 Real-Time-PCR Für die Real-Time-PCR wurde der SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Daher war die MgCl2-Konzentration nicht variabel. Die Real-Time-PCR wurde in einem StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) im 96-Well-Format im Standard Mode durchgeführt. In den folgenden Tabellen sind der Reaktionsmix für eine Reaktion und das Temperatur-Profil der Real-Time-PCR gezeigt. Tab. 3.8 Reaktionsmix Real-Time-PCR REAGENZ VOLUMEN [µL] SYBR Green PCR Master Mix Primer F Primer R H2O cDNA 6,25 0,5 0,5 2,25 3 Tab. 3.9 Temperaturprofil Real-Time-PCR Denaturation Amplifikation Schmelzkurve 3.2.5.4 TEMPERATUR ZEIT 95 °C 95 °C 60 °C 72 °C 3 10 min 15 sec 15 sec 20 sec ×50 Multiplex-Real-Time-PCR Die Multiplex-Real-Time-PCR wurde mit TCR-only- oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-stimulierten (siehe Kapitel 3.2.3.1.3) TH-Subpopulationen durchgeführt, mit freundlicher Unterstützung von Dr. Laura Lozza und Manuela Staeber. Hierfür wurde zunächst der Reaktionsmix 1 vorbereitet: Tab. 3.10 Reaktionsmix 1 REAGENZ VOLUMEN/REAKTION [µL] 2× Reaction Mix (aus Super Script III OneStep RT-PCR System) SUPERase-InTM RNase Inhibitor 5 0,1 5,1 µl/Well von Reaktionsmix 1 wurden in einer twin.tec PCR Platte (Eppendorf) vorgelegt und zentrifugiert (1 min, 1000 × g, 4 °C). Nach 24 h Aktivierung wurden die TH-Zellen je nach Subpopulation und Stimulationsbedingung gepoolt. Anschließend wurden mittels FACS 800 Zellen/Well in den Reaktionsmix sortiert, zentrifugiert (1 min, 1000 × g, 4 °C) und bei -80 °C gelagert. MATERIAL UND METHODEN 41 Es folgte die Reverse Transcription-Specific Target Amplification (RT-STA) in den gleichen Wells. Da in der anschließenden Multiplex-Real-Time-PCR 96 Gene für 96 Proben ermittelt wurden (96.96 Array), wurden hierbei 96 ausgewählte Gene über TaqMan-Assays zu cDNA umgeschrieben und pre-amplifiziert.Hierfür wurde zunächst der TaqMan-Reaktionsmix vorbereitet: Tab. 3.11 TaqMan-Reaktionsmix REAGENZ VOLUMEN TaqMan Gene Expression Assay (20×) DNA Suspensionspuffer 1,5 µl (× 96) 156 µl 300 µl TaqMan-Reaktionsmix (0,2×) Der TaqMan-Reaktionsmix wurde dann für die RT-STA verwendet: Tab. 3.12 RT-STA-Reaktionsmix REAGENZ VOLUMEN TaqMan-Reaktionsmix (0,2×) SuperScript III RT/Platinum Taq Mix (aus Super Script III One-Step RT-PCR System H2O 300 µl 24 µl 144 µl 468 µl RT-STA-Reaktionsmix Die vorsortierten TH-Zellen in Reaktionsmix 1 wurden dann aufgetaut, zentrifugiert (1 min, 1000 × g, 4 °C) 3,9 µl von dem RT-STA-Reaktionsmix hinzugegeben. Anschließend wurde die RT-STA durchgeführt: Tab. 3.13 Temperaturprofil RT-STA ZEIT TEMPERATUR 15 min 2 min 15 sec 4 min halten 50 °C 95 °C 95 °C 60 °C 4 °C ×50 Anschließend wurden die cDNA mit 10 µl DNA Suspensionspuffer verdünnt und bei -20 °C aufbewahrt. Für die Multiplex-Real-Time-PCR wurden dann zunächst zwei 96-Well-Platten entsprechend der Anordnung des späteren 96.96 Arrays vorbereitet: Tab. 3.14 Assay-Platte REAGENZ VOLUMEN/WELL TaqMan Gene Expression Assay (20×) Assay Loading Reagent je 3,5 µl (× 96) 3,5 µl Tab. 3.15 Sample-Platte REAGENZ VOLUMEN/WELL Taqman Universal PCR Master Mix Sample Loading Reagent cDNA 4 µl 0,4 µl 3,6 µl (× 96) Als Mastermix vorbereiten Sowohl aus der Assay-Platte als auch aus der Sample-Platte werden dann jeweils 5 µl auf den 96.96 Array aufgetragen und die Multiplex-Real-Time-PCR mittels Biomark HD (Fluidigm) durchgeführt. MATERIAL UND METHODEN 3.2.6 42 SIRNA-VERMITTELTES AUSSCHALTEN VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN Die RNA-Interferenz durch Short Interfering RNA (siRNA) ist ein evolutionär konservierter Mechansimus, um gezielt mRNA abzubauen und somit die Genexpression zu inhibieren. RNAInterferenz wird von eukaryotischen Zellen vielseitig eingesetzt, z.B. für die Abwehr von Viren oder die zelleigene Expressions-Regulation. Grundlage für die RNA-Interferenz ist doppelsträngige RNA (dsRNA). Die dsRNA wird innerhalb der Zelle von einem Proteinkomplex erkannt und ein Strang der dsRNA, die siRNA, wird in den Proteinkomplex eingebaut. So entsteht der RNA-Induced Silencing Complex (RISC). Mit Hilfe der siRNA-Sequenz kann RISC spezifisch an mRNA-Transkripte binden und sie abbauen. So wird die Translation von mRNA inhibiert [112]. 3.2.6.1 Transfektion von TH-Zellen mit siRNA Durch das Einbringen von siRNA in TH-Zellen kann man die intrazelluläre RNA-Interferenz der Zellen ausnutzen, um gezielt die Expression von Genen zu unterbinden. Eine sehr potente Methode zum Einbringen von siRNA in TH-Zellen ist die Nucleofector Technology. Hierbei wird durch spezielle Elektroporation in Kombination mit bestimmten Reagenzien die Zell- und Nukleus-Membran für eine kurze Zeit geöffnet, sodass umgebene siRNAs in die Zellen eindringen können. 3.2.6.1.1 Transfektionsprotokoll Für die Transfektion mit dem P3 Primary Cell 96-Well Nucleofector Kit (Lonza) wurden TH-Zellen zunächst mit DLL4, IFN-α/IL-6/IL-21 oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 für 48 h aktiviert (siehe Kapitel 3.2.3.1.3). Anschließend wurden die TH-Zellen je nach Subpopulation und Stimulationsbedingungen gepoolt und die MACSiBeads entfernt (siehe Kapitel 3.2.3.2). Die Zellsuspension wurde dann zentrifugiert (5 min, 500 × g, 4 °C), in RPMI aufgenommen, gezählt, mit RPMI auf mindestens 1×105 Zellen/Transfektion eingestellt, 200 µl/Well der Zellsuspension in den Nucleofector-Küvetten ausgesät und für mindestens 2 h ruhen gelassen (37 °C, 5 % CO2). Für die gleiche Zeit wurde RPMI in einer 96-Well-Platte vorgewärmt: 1×200 µl/Transfektion zum „Abstoppen“ der Transfektion und zum Spülen der Nucleofector-Küvetten und 1×100 µl/Transfektion als Vorlage für den Transfer aus den Nucleofector-Küvetten heraus. In der Zwischenzeit wurde der Transfektion-Mastermix vorbereitet: Tab. 3.16 Transfektions-Mastermix REAGENZ VOLUMEN/TRANSFEKTION Nucleofector Solution + Supplement siRNA (300 pmol/Transfektion) 20 µl 3 µl Nach der Ruhephase wurden die TH-Zellen zentrifugiert (10 min, 200 × g, RT), der Überstand abgenommen, die Zellen durch Vortexen in den Küvetten gelöst, 23 µl/Transfektion vom Transfektion-Mastermix hinzugegeben, erneut gevortext und transfiziert mit dem Nucleofector 2b + 96-Well Shuttle Device (Lonza Group AG) (Nucleofector-Programm ED-108). Nach der Transfektion wurden 100 µl/Transfektion vorgewärmtes RPMI hinzugegeben und die Zellen für 10 min ruhen gelassen (37 °C, 5 % CO2). Anschließend wurden die Zellen aus den Nucleofector-Küvetten in 100 µl vorgewärmtes RPMI überführt und die Nucleofector-Küvetten nochmals mit 30 µl vorgewärmtem MATERIAL UND METHODEN 43 RPMI (+5 % AB Serum) gespült und ebenfalls überführt. Danach folgte eine weitere Ruhephase über Nacht (37 °C, 5 % CO2). 3.2.6.1.2 Restimulation von transfizierten TH-Zellen Um die IL-10-Produktion nach der Transfektion zu untersuchen, wurden die Zellen zunächst gezählt, mit DMEM auf 1×104 Zellen/ml eingestellt und 100 µl/Well (1×103 Zellen/Well) in einer neuen 96-Well-Platte ausgesät. Zur Restimulation der Zellen wurden 1×103 CD3/CD28/CD2- MACSiBeads/Well (zuvor gewaschen mit DMEM – siehe Kapitel 3.2.3.1.1) hinzugefügt. Nach 48 h wurde der Überstand geerntet und bei -20 °C gelagert. 3.2.7 STATISTIK Die Daten wurden mittels D’Agostino und Pearson Omnibus Test auf Normalverteilung getestet. Zur Ermittlung der Signifikanzwerte (Signifikanz bei * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001) wurde bei normalverteilten Daten der t-Test (paired und unpaired), bei nicht-normalverteilten Daten der MannWhitney Test durchgeführt. Die Berechnungen erfolgten mit Hilfe der Software Prism 6.0 (Graph Pad Software Inc.). ERGEBNISSE 44 4 ERGEBNISSE ERGEBNISSE 45 4.1 INDUKTION VON IL-10 IN KONVENTIONELLEN HUMANEN TH-ZELLEN Die Produktion von IL-10 kann in TH-Zellen durch eine Vielzahl von Stimuli induziert werden. Eine wesentliche Rolle hierbei spielen Zytokine. Darüber hinaus konnte in eigenen Versuchen mit murinen TH-Zellen gezeigt werden, dass die Aktivierung des Signalweges + IL-12 und die Aktivierung von STAT4 in IFN-γ-produzierenden TH1-Zellen zu einer Induktion der IL-10-Produktion führt [82, 83, 106], wobei DLL4 diesbezüglich den stärksten Notch-Liganden darstellt [105]. Hier sollte untersucht werden, unter welchen Bedingungen humane TH-Zellen die maximale Menge an IL-10 produzieren und die erforderlichen Signalwege und transkriptionellen Kontrollelemente definiert werden. Dafür wurden verschiedene Zytokine und die Aktivierung des Notch Signalweges hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Produktion von IL-10 in TH-Zellen zu induzieren, getestet. 4.1.1 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 INDUZIERT STARKE IL-10-PRODUKTION In vorangegangenen, unveröffentlichten Experimenten mit humanen TH-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des Notch-Signalweges über seinen Liganden DLL4 zur Induktion der IL-10Produktion führt. Zusätzlich zu dieser Notch-Aktivierung wurde in diesen Vorversuchen die Zugabe oder Blockade der Zytokine IFN-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-23, IL-27, TNF-α und TGF-β auf ihre Fähigkeit, die DLL4-Effekte zu verstärken getestet [108]. Die Kombination aus IFN-α, IL-6 und IL-21 und DLL4 stellte sich hierbei als potentester IL-10-Induktor heraus. Ebenso verstärkten IL-12 und IL-27 die IL-10-Produktion. Um diese Ergebnisse zu verifizieren und die Einflüsse der einzelnen Komponenten dieser IL-10Induktion genauer zu untersuchen, wurden naive und memory TH-Zellen isoliert und in einem APCfreien Zellkultursystem für 120 h mit MACSiBeads (Magnetpartikel, Miltenyi Biotec, siehe Kapitel 3.2.3.1.1), beladen mit Antikörpern gegen CD3, CD28 und CD2 stimuliert. Zusätzlich wurden in verschiedenen Kombinationen rekombinantes IFN-α, IL-6, IL-21, IL-12 und IL-27 hinzugegeben. Zur Aktivierung des Notch-Signalweges wurden MACSiBeads, gekoppelt mit rekombinantem DLL4, hinzugefügt (siehe Kapitel 3.2.3.1.2). Anschließend wurden die Zellen für weitere 24 h ruhen gelassen und dann mit PMA/Ionomycin restimuliert und intrazelluläres IL-10 gefärbt. Die statistischen Signifikanzen der Unterschiede in der Frequenz der IL-10+ Zellen sind in Tab. 4.1 aufgelistet. Diese APC-freie Stimulation wurde gewählt, damit die TH-Zellkultur unter Good Manufacturing Practice (GMP)-Bedingungen durchgeführt werden konnte, für den Fall, dass die IL-10-induzierende Modulation von TH-Zellen für Zelltherapien eingesetzt werden soll. Ohne zusätzlichen Stimulus (TCR-only) produzierten weniger als 1 % der naiven TH-Zellen IL-10 und ca. 2 % der memory TH-Zellen (Abb. 4.1 und Tab. 4.1). IFN-α, IL-6 oder IL-21 einzeln und ohne DLL4 hatten jeweils nur sehr geringe Effekte auf die Induktion der IL-10-Produktion in naiven und memory TH-Zellen. Die Kombination aller drei Zytokine verstärkte die Frequenz der IL-10+ naiven ERGEBNISSE 46 und memory TH-Zellen allerdings auf ca. 3 % IL-10+ naive TH-Zellen und etwa 10 % IL-10+ memory TH-Zellen (Abb. 4.1 und Tab. 4.1). Abb. 4.1 Zytokin- und Notch-vermittelte Induktion von IL-10 in humanen naiven und memory TH-Zellen. Naive und memory TH-Zellen wurden in APC-freier Zellkultur aktiviert mit MACSiBeads, beladen mit Antikörpern gegen CD3, CD28 und CD2 und mit (+DLL4) oder ohne (ohne Notch) zusätzlichen MACSiBeads, beladen mit dem NotchLiganden DLL4 in Anwesenheit oder Abwesenheit (Medium) der angezeigten Zytokine für 120 h, mit anschließenden 24 h Ruhephase, Restimulation mit PMA/Ionomycin und intrazellulärer IL-10 Färbung (naive n=4-33, memory n=4-44). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Die zusätzliche Stimulation mit dem Notch-Liganden DLL4 sorgte für eine drastische Verstärkung der Zytokin-vermittelten IL-10-Produktion: In naiven TH-Zellen erhöhte DLL4 die Frequenz der IL-10+ Zellen durch IFN-α/IL-6/IL-21 nochmals um etwa das 5-fache auf ca. 14 % IL-10+ Zellen, in memory TH-Zellen um das 3-fache auf ca. 29 % (Abb. 4.1 und Tab. 4.1). Ebenso wurden die Effekte der einzelnen Zytokine IFN-α, IL-6 und IL-21 signifikant verstärkt. Darüber hinaus konnte die Kombination aus IFN-α/IL-6/IL-21 +DLL4 auch die Konzentration von sekretiertem IL-10 und der Il10 mRNA-Expression drastisch verstärken (Abb. 4.2 A). DLL4 alleine hatte nur einen moderaten ERGEBNISSE 47 Effekt auf die IL-10-Expression und steigerte die Frequenz der IL-10+ Zellen in naiven TH-Zellen auf etwa 1 %, in memory TH-Zellen auf ca. 6 %, bewirkte allerdings für alle Zytokine und ZytokinKombinationen eine signifikante Steigerung der IL-10-Expression (Abb. 4.1 und Tab. 4.1). Welches der drei Zytokine den stärksten Effekt auf die IL-10-Expression hatte, konnte nicht eindeutig geklärt werden. Im Mittel weist IFN-α/DLL4 eine höhere Frequenz IL-10+ Zellen auf als IL-6/DLL4 oder IL-21/DLL4, jedoch ist nur der Unterschied von IFN-α/DLL4 zu IL-21/DLL4 in memory TH-Zellen statistisch signifikant (Abb. 4.1 und Tab. 4.1). Die verstärkte Expression von Hes1 in Anwesenheit von DLL4 zeigte, dass der Notch-Signalweg tatsächlich aktiviert wurde, da Hes1 ein direktes Zielgen von Notch ist [104] (Abb. 4.2 B). Abb. 4.2 Induktion der IL-10-Produktion und Il10 mRNA-Expression in humanen naiven und memory TH-Zellen durch die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 Naive und memory TH-Zellen wurden in APC-freier Zellkultur aktiviert mit MACSiBeads, beladen mit Antikörpern gegen CD3, CD28 und CD2 und mit (+DLL4) oder ohne (ohne Notch) zusätzlichen MACSiBeads, beladen mit dem NotchLiganden DLL4 in Anwesenheit (IFN-α/IL-6/IL-21) oder Abwesenheit (Medium) von IFN-α/IL-6/IL-21: (A) für 120 h zur Messung der IL-10-Konzentration im Zellkulturüberstand bzw. für 24 h zur Messung der Il10 mRNA-Expression, oder (B) für 24 h zur Messung der mRNA-Expression des Notch-Zielgens Hes1 ohne zugegebene Zytokine. (A) IL-10-Konzentration: naive und memory n=8, Il10 mRNA-Expression naive n=6-17, memory n=4-12, (B) Mittelwert mit Standardfehler Standard Error of the Mean (SEM), naive n=3, memory n=6. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Neben IFN-α, IL-6 und IL-21 sind außerdem die Zytokine IL-12 [71, 82, 88] und IL-27 [82, 84, 86, 113, 114], dafür bekannt, dass sie IL-10 in TH-Zellen bzw. IL-10-produzierende TR1-Zellen induzieren. Die vorangegangenen Untersuchungen zu dieser Arbeit bestätigten diese Effekte von IL-12 und IL-27 auf die DLL4-vermittelte IL-10-Expression in humanen TH-Zellen. Um die IL-10Induktionsstärke von IFN-α/IL-6/IL-21 mit IL-12 und IL-27 zu vergleichen bzw. das Maximum der IL-10-Expression zu ermitteln, wurden naive und memory TH-Zellen mit verschiedenen ERGEBNISSE 48 Kombinationen von IFN-α, IL-6, IL-21, IL-12 und IL-27 stimuliert, jeweils in An- und Abwesenheit von DLL4. Selbst in Anwesenheit von IL-6 und IL-21 konnten weder IL-12, noch IL-27 die IL-10Induktion durch IFN-α/IL-6/IL-21 erhöhen, weder mit noch ohne DLL4. Die Kombination aus IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induzierte das Maximum an IL-10+ Zellen in naiven und memory TH-Zellen unter den hier getesteten Bedingungen. Auch die Kombination von IL-12 oder IL-27 mit IFN-α/IL-6/Il-21 bewirkte keine weitere Steigerung der IL-10-Produktion. In Abwesenheit von DLL4 schien IL-12 die IFN-α/IL-6/IL-21-vermittelte IL-10-Induktion (IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12 vs. IFN-α/IL-6/IL-21) sogar zu inhibieren (Abb. 4.1 und Tab. 4.1). Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass die Kombination der Zytokine IFN-α, IL-6 und IL-21 einen starken IL-10-Induktor darstellte. Dessen Wirkung auf IL-10 wurde durch die Aktivierung des Notch-Signalweges über seinen Liganden DLL4 nochmals massiv verstärkt. Auch die Zugabe von anderen IL-10-induzierenden Zytokinen wie IL-12 und IL-27 bewirkte keine weitere Steigerung der IL-10-Expression. 4.1.2 IL-6 UND IL-21 SIND NOTWENDIG FÜR IFN-α-VERMITTELTE IL-10-PRODUKTION In naiven und memory TH-Zellen ließen die vorangegangen Studien eine deutlich stärkere IL-10Induktion durch IFN-α alleine erwarten [63, 65] (Abb. 4.1). Erst die zusätzliche Zugabe von rekombinantem IL-6 und IL-21 zu IFN-α zeigte eine stabile IL-10-Induktion in naiven und auch in memory TH-Zellen Spender-übergreifend (Abb. 4.1). Sowohl IL-6 [115] als auch IL-21 [116] können endogen von TH-Zellen produziert werden. Daher war die Vermutung, dass Konzentrationsunterschiede dieser beiden Zytokine in der Zellkultur ein Grund für die schwache IL-10-Induktion durch IFN-α sein könnten. IFN-α [79], IL-6 [84] und IL-21 [85] können STAT3 aktivieren und darüber die IL-10-Expression verstärken. In unveröffentlichten Daten der Arbeitsgruppe konnte die Notwendigkeit von STAT3 jeweils für die IFN-α-, IL-6- und IL-21-vermittelte IL-10-Induktion gezeigt werden. Diese Versuche wurden durchgeführt von Dr. Andrej Mantei (Abb. 4.3 A) [107]. Daher erschien es möglich, dass diese drei Zytokine die IL-10-Expression durch gebündelte STAT3-Aktivierung verstärken. Gleichzeitig wäre dann die IFN-α-vermittelte IL-10-Induktion suboptimal, wenn nicht ausreichend IL-6 und IL-21 vorhanden sind. Um diesen Einfluss von endogenem IL-6 und IL-21 auf die IFN-αvermittelte IL-10-Produktion zu untersuchen, wurden naive und memory TH-Zellen mit IFN-α/DLL4 stimuliert und IL-21 bzw. IL-6 blockiert. Die Blockade von IL-21 zeigte sowohl in naiven als auch in memory TH-Zellen eine etwa 50 %-ige bzw. 20 %-ige Reduktion der IL-10-Produktion. Die Zugabe von blockierendem IL-6-Antikörper bewirkte in naiven TH-Zellen eine ca. 20 %-ige Reduktion der IL-10+ Zellen, in memory TH-Zellen hatte sie keinen Einfluss (Abb. 4.3 B). IL-6 Blockade (Abb. 4.3 B) und Zugabe von rekombinantem IL-6 alleine (Abb. 4.1) hatten jeweils nur geringe Auswirkungen auf die IL-10-Induktion in naiven und memory TH-Zellen. Daher stellte sich die ERGEBNISSE 49 Frage, ob IL-6 notwendig war für die maximale IL-10-Produktion. Der Vergleich von IFN-α/IL-21/DLL4 zu IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 zeigte jedoch eine signifikante Steigerung der IL-10Produktion in naiven und memory TH-Zellen (Abb. 4.1) und damit die Notwendigkeit von IL-6, um maximale Level von IL-10 zu induzieren. Zusammenfassend ergaben die Daten, dass die IL-10-Induktion über IFN-α und DLL4 durch die Zugabe von rekombinantem IL-6 und IL-21 stabilisiert und verstärkt wird. Da alle drei Zytokine über STAT3 agieren können, ist es möglich, dass die Stabilisierung über eine gebündelte STAT3Aktivierung erfolgt. Abb. 4.3 Notwendigkeit von STAT3, IL-6 und IL-21 für die IFN-α/DLL4–vermittelte IL-10-Expression. (A) Naive TH-Zellen wurden ex vivo transfiziert mit siRNAs gegen Stat3 (siSTAT3) oder eine nicht-codierende Kontrollsequenz (siCTRL) und nach 24 h Ruhephase in Anwesenheit IFN-α/DLL4 (IFN-α, n=17), IL-6/DLL4 (IL-6, n=8) oder IL-21/DLL4 (IL-21, n=8) aktiviert. Nach 120 – 168 h wurden die Zellen mit PMA/Ionomycin restimuliert und anschließend IL-10 intrazellulär gefärbt. Versuche wurden durchgeführt von Dr. Andrej Mantei [107]. (B) Naive (n=8) und memory TH-Zellen (n=15) wurden für 120 h aktiviert in Anwesenheit von IFN-α/DLL4 mit oder ohne (ohne) blockierende Reagenzien der Zytokine IL-6 (αIL-6) oder IL-21 (rmIL-21R-Fc - IL-21RFc). Nach weiteren 24 h Ruhephase folgte die Restimulation mit PMA/Ionomycin und die intrazelluläre IL-10-Färbung. Ein Datenpunkt pro Spender. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 ERGEBNISSE 50 Tab. 4.1 Zytokin- und Notch-vermittelte Induktion von IL-10 in naiven und memory TH-Zellen. Vergleich der Frequenzen der durch verschiedene IL-10-induzierende Stimuli (IFN-α, IL-6, IL-21, IL-21, IL-27, DLL4) induzierten IL-10+ TH-Zellen und ihre statistischen Auswertung. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001. Analysiert mittels Mann-Whitney Tests. Naive TH-Zellen [p-Wert] Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch Medium/ohne Notch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-α IFN-α IFN-α IL-6 IL-6 IL-21 IL-12 IL-27 IFN-a/DLL4 IFN-a/DLL4 IL-6/DLL4 IFN-α/IL-21 IL-6/IL-21/IL-12 IL-6/IL-21/IL-27 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-27 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/IL-27 vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. IFN-α IL-6 IL-21 IL-12 IL-27 IFN-α/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21 DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IFN-a/DLL4 IL-6/DLL4 IL-21/DLL4 IL-12/DLL4 IL-27/DLL4 IFN-α/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-27 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/IL-27 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/IL-27/DLL4 IL-6/IL-21/IL-12 IL-6/IL-21/IL-27 IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21 DLL4 IFN-a/DLL4 IL-6/DLL4 IL-21/DLL4 IL-12/DLL4 IL-27/DLL4 IFN-α/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/IL-27/DLL4 IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21 IFN-a/DLL4 IL-6/DLL4 IL-21/DLL4 IL-12/DLL4 IL-27/DLL4 IFN-α/IL-21/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/IL-27/DLL4 IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α IL-6 IL-21 IFN-α IL-6 IL-21 IL-12 IL-27 IFN-α/IL-21 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-27 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/IL-27 IL-6/IL-21/IL-12 IL-6/IL-21/IL-27 IFN-a/DLL4 IL-6 IL-21 IL-6/DLL4 IL-21 IL-21/DLL4 IL-12/DLL4 IL-27/DLL4 IL-6/DLL4 IL-21/DLL4 IL-21/DLL4 IFN-α/IL-21/DLL4 IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-27/DLL4 IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/IL-27/DLL4 0,0290 0.1179 0.0086 0,4713 0,0295 < 0.0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 0,0002 0,0014 < 0.0001 0,0022 0,0014 0,0014 0,0014 0,0028 0,0014 0,1013 0,0039 0,0014 0,0014 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0002 0,0127 0,0323 0,8601 0,8800 0,8208 0,0032 0,0032 0.0011 < 0,0001 0.0076 0.0002 0,0192 0,0017 < 0.0001 0,0014 0,0014 0,0014 0,0071 0,0095 0,0818 0,0554 0,3287 < 0,0001 < 0,0001 0.0003 0,0002 0,0424 0,6333 0,5091 0,0825 0,4195 0,0118 0,2710 < 0,0001 0,8374 0,4118 0.001 0,3974 0.0001 0,0022 0,0286 0,2855 0,5067 0,4705 0,0156 0,0294 0,0294 0,0286 0,0286 0,0294 * ns ** ns * *** *** *** *** *** *** *** *** ** *** ** ** ** ** ** ** ns ** ** ** *** *** *** *** *** *** * * ns ns ns ** ** ** *** ** *** * ** *** ** ** ** ** ** ns ns ns *** *** *** *** * ns ns ns ns * ns *** ns ns *** ns *** ** * ns ns ns * * * * * * memory TH-Zellen [p-Wert] 0,0047 0.0086 0.0158 0,7117 0,0502 < 0.0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 0,0002 0,0043 < 0.0001 0,0229 0,0011 0,0013 0,0011 0,0068 0,0011 0,8520 0,0081 0,0014 0,0013 < 0,0001 < 0,0001 0.0072 < 0,0001 < 0,0001 0,0002 0,0036 0,0171 0,2404 0,4196 0,5409 0,0036 0,0049 0.0032 0.0017 0.0443 0.0641 0,0006 0,2000 0,0012 0,0012 0,0012 0,0012 0,0979 0,0440 0,5518 0,1771 0,1260 0.0017 < 0,0001 < 0,0001 0,0001 0,0613 0,2538 0,0787 0,2503 0,1988 0,0020 0,0583 0.0013 0,4704 0,3864 0.0004 0,8852 < 0,0001 0,2546 0,2238 0,0939 0,0244 0,4363 0,0005 0,0286 0,0286 0,0286 0,0286 0,0286 ** ** * ns ns *** *** *** *** *** *** *** *** ** *** * ** ** ** ** ** ns ** ** ** *** *** ** *** *** *** ** * ns ns ns ** ** ** ** * ns *** ns ** ** ** ** ns * ns ns ns ** *** *** *** ns ns ns ns ns ** ns ** ns ns *** ns *** ns ns ns * ns *** * * * * * ERGEBNISSE 4.1.3 51 AUTOKRINES IL-21 VERSTÄRKT DLL4-VERMITTELTE IL-10-PRODUKTION Naive TH-Zellen produzierten weniger IL-10 als memory TH-Zellen nach der Stimulation mit DLL4 alleine (Abb. 4.1 und Abb. 4.2). Da sich auch über IL-10 hinaus die Zytokin-Produktion von naiven und memory TH-Zellen unterscheidet [117], wurde vermutet, dass beide Populationen IL-10induzierende, endogene Zytokine unterschiedlich stark oder schnell produzieren und so über autokrine Effekte die DLL4-vermittelte IL-10-Produktion beeinflussen können. IL-6 [115] und IL-21 [116] können beide von TH-Zellen produziert werden und sind zudem Teil des verwendeten IL-10induzierenden Zytokincocktails (Abb. 4.1 und Tab. 4.1). Daher wurde getestet, ob Unterschiede in der endogenen IL-6- bzw. IL-21-Produktion die IL-10-Expression durch DLL4 verstärken können. Aus diesem Grund wurde die IL-6- und IL-21-Produktion in naiven und memory TH-Zellen gemessen. Wenige naive TH-Zellen produzierten IL-21 (ca. 3%, Abb. 4.4 A, B), wenn man sie ohne zusätzlichen Stimulus kultivierte. Bei den memory TH-Zellen wurde hingegen eine Frequenz von etwa 29 % IL-21+ Zellen gemessen, wenn sie nur über ihren TCR aktiviert wurden. Die Anwesenheit von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 hatte nun einen komplett konträren Effekt auf naive bzw. memory TH-Zellen: In naiven TH-Zellen stieg die Frequenz IL-21+ TH-Zellen auf 17 %, während sie in memory TH-Zellen auf 17 % sank (Abb. 4.4 A, B). Die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21DLL4 sorgte also für eine Nivellierung der IL-21-Level von naiven und memory TH-Zellen. Die Expression von IL-6 hingegen war in beiden Subpopulationen sehr gering und lag bei ca. 1 % IL-6+ Zellen. Trotz der sehr niedrigen Frequenzen IL-6-produzierender TH-Zellen war eine signifikante Verringerung der IL-6-Produktion in memory TH-Zellen zu erkennen. Die gleiche Tendenz zeigte sich in naiven TH-Zellen (Abb. 4.4 A, B). ERGEBNISSE 52 Abb. 4.4 IL-6- und IL-21-Expression in IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten naiven und memory TH-Zellen. (A, B) Naive und memory TH-Zellen wurden für 120 h aktiviert in An- (α/6/21/DLL4) und Abwesenheit (TCR-only) von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4, nach weiteren 24 h Ruhephase mit PMA/Ionomycin restimuliert und auf intrazelluläre Expression von IL-6 und IL-21 gefärbt. (A) Dotplot und (B) statistische Auswertung für die Expression von IL-6 (naive n=4, memory n=7) und IL-21 (naive n=7-13, memory n=15-22). (C) Naive (n=4-14) und memory TH-Zellen (n=7-22) wurden für 120 h aktiviert mit TCR-only oder zusätzlichem DLL4, IFN-α, IL-6, IL-21, IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4). Die Zellkultur, Restimulation und Färbung erfolgte wie für A und B (Mittelwert mit Standardfehler [SEM]). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 In naiven TH-Zellen zeigten hierbei alle Bestandteile des IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus eine signifikante Induktion der IL-21-Expression. In memory TH-Zellen bewirkten alle Bestandteile, außer DLL4 den Rückgang der IL-21-Expression (Abb. 4.5). ERGEBNISSE 53 Abb. 4.5 Induktion der IL-21-Expression in humanen naiven und memory TH-Zellen Naive (n=4-14) und memory TH-Zellen (n=7-22) wurden für 120 h aktiviert mit TCR-only oder zusätzlichem DLL4, IFN-α, IL-6, IL-21, IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4). Nach weiteren 24 h Ruhephase wurden die Zellen mit PMA/Ionomycin restimuliert und auf intrazelluläre Expression von IL-21 gefärbt. Mittelwert mit Standardfehler (SEM). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass memory TH-Zellen IL-21 produzieren konnten, naive THZellen jedoch nicht. Da IL-21 einen IL-10-Induktor darstellt, war es möglich, dass memory TH-Zellen, IL-10-induzierendes IL-21 selber herstellten und damit – anders als naive TH-Zellen – durch einen autokrinen Mechanismus die IL-10-Induktion verstärkten. 4.1.4 DIFFERENZIERUNG VON TH-ZELLEN BEEINFLUSST DAS ANSPRECHVERHALTEN AUF DLL4 Memory TH-Zellen reagieren besser auf die Modulation mit DLL4 als naive TH-Zellen und produzieren mehr IL-10 (Abb. 4.1). Ein Grund hierfür könnte die Fähigkeit von memory TH-Zellen sein, IL-21 produzieren zu können (Abb. 4.4). Um näher zu beleuchten, inwiefern der Entwicklungsstatus von THZellen das Ansprechverhalten auf DLL4 beeinflusst, sollten unterschiedliche Entwicklungsstadien von TH-Zellen hinsichtlich der DLL4-vermittelten IL-10-Induktion verglichen werden. Anhand ihrer spezifischen Oberflächenmoleküle wurden hierfür die naiven Subpopulationen CD45RA+CCR7+CD31+ (CD31+), die auch in den bisherigen Versuchen dieser Arbeit als naive THZellen verwendet wurden, und CD45RA+CCR7+CD31− (CD31) sowie die memory Subpopulationen CD45R0+CCR7+ (TCM), CD45R0+CCR7 (TEM) und CD45RA+CCR7 (TEMRA) mittels FACS sortiert (Abb. 3.1 und Abb. 1.2) und in An- oder Abwesenheit von DLL4 stimuliert. ERGEBNISSE 54 Abb. 4.6 DLL4-vermittelte IL-10-Induktion in unterschiedlich differenzierten Subpopulationen von naiven und memory TH-Zellen. CD31+ (n=14-16), CD31 (n=14), TCM (n=14-16), TEM (n=16) und TEMRA (n=16) wurden mittels FACS isoliert (siehe Abb. 3.1) für 120 h mit (DLL4) oder ohne (TCR-only) Notch-Ligand DLL4 aktiviert und nach weiteren 24 h Ruhephase mit PMA/Ionomycin restimuliert und IL-10 intrazellulär gefärbt. Statistische Auswertung für vier unabhängig voneinander durchgeführte Experimente. Ein Datenpunkt pro Spender. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 In allen Subpopulationen bewirkte die Stimulation mit DLL4 einen signifikanten Anstieg an IL-10+ Zellen (Tab. 4.2). In den CD31+ naiven TH-Zellen stieg die Frequenz der IL-10+ Zellen von weniger als 1 % auf nur 1,5 % an, in CD31 naiven TH-Zellen hingegen schon von etwa 1 % auf ca. 8 % (Abb. 4.6). In TCM erhöhte DLL4 die Frequenz der IL-10+ Zellen mit einem Anstieg von 5 % auf 20 % zwar nur um das 4-fache, jedoch bewirkte hier die DLL4-Modulation die meisten IL-10+ Zellen. In TEM bewirkte DLL4 einen Anstieg der IL-10+ Zellen von etwa 4 % auf 14% und in TEMRA von 1 % auf 13 % (Abb. 4.6) Tab. 4.2 DLL4-vermittelte IL-10-Induktion in unterschiedlich differenzierten Subpopulationen von naiven und memory TH-Zellen. Vergleich der DLL4-induzierten Frequenzen von IL-10+ CD31+ und CD31− TH-Zellen und TCM, TEM, TEMRA und ihre statistische Auswertung. Die p-Werte wurden mittels Mann-Whitney Tests analysiert. p-Wert CD31+ CD31+ CD31+ CD31+ CD31CD31CD31TCM TCM TEM vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. vs. 4.1.5 CD31– TCM TEM TEMRA TCM TEM TEMRA TEM TEMRA TEMRA < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0006 0,0024 0,0002 0,0005 0,3378 *** *** *** *** *** *** ** *** *** ns IL-10 WIRD IN MEMORY TH-ZELLEN SCHNELLER INDUZIERT ALS IN NAIVEN TH-ZELLEN Vergleicht man die Daten zur IL-10-Expression durch die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation in naiven und memory TH-Zellen fällt auf, dass es hinsichtlich der Resonsanz auf den ERGEBNISSE 55 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus Unterschiede gibt. Innerhalb der naiven TH-Zellen werden weniger IL-10+ TH-Zellen induziert als innerhalb der memory TH-Zellen und ebenso sekretieren naive THZellen über den gleichen Zeitraum der Zellkultur nur ca. die Hälfte des IL-10 verglichen mit memory TH-Zellen. Hinzu kommt, dass naive und memory TH-Zellen unterschiedlich ansprechen auf die einzelnen Stimuli IFN-α/IL-6/IL-21 und DLL4: Relativ zur maximalen IL-10-Produktion durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4, reagieren memory TH-Zellen mit deutlich höherer IL-10-Produktion auf IFN-α/IL-6/IL-21 und DLL4 (Abb. 4.2 A und Kapitel 4.1.1). Um diese Unterschiede zwischen naiven und memory TH-Zellen hinsichtlich der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation genauer zu beleuchten, wurden Il10 mRNA-Expression und sekretiertes IL-10 im Verlauf der Zeit gemessen. Nach 48 h erreichte die Il10 mRNA-Expression das Maximum in naiven TH-Zellen, in memory THZellen bereits nach 24 h (Abb. 4.7 A). Bei der Messung des sekretierten IL-10 im Zellkulturüberstand wurde diese Beobachtung zum Teil bestätigt: IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierte memory TH-Zellen zeigten bereits nach 24 h einen leichten, allerdings nicht signifikanten Anstieg der IL-10-Produktion auf etwa 1,5 ng/ml, wohingegen die IL-10-Produktion der naiven TH-Zellen unter IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 Bedingungen erst nach 48 h messbar wurde (ca. 6 ng/ml). Nach 72 h waren die Konzentrationen von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induziertem IL-10 dann annähernd gleich zwischen naiven und memory TH-Zellen (ca. 10 ng/ml). Dass memory TH-Zellen im weiteren Verlauf der Zellkultur jedoch mehr IL-10 produzieren, ist aus den vorherigen Daten abzulesen (Abb. 4.2 A). Weiterhin ist zu erkennen, dass IFN-α/IL-6/IL-21 bzw. DLL4 alleine innerhalb der ersten 72 h nur in memory TH-Zellen zu einem bedeutenden Anstieg der IL-10-Produktion führten, nicht in naiven THZellen (Abb. 4.7 B). Zusammenfassend konnte hier gezeigt werden, dass IL-10 durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in memory TH-Zellen schneller induziert wurde als in naiven TH-Zellen. Naive TH-Zellen benötigten die Kombination aus IFN-α/IL-6/IL-21 und DLL4. Memory TH-Zellen genügte dafür schon IFN-α/IL-6/IL-21 oder DLL4 alleine. Diese Daten sprechen dafür, dass in memory TH-Zellen ein Gedächtnis für die Fähigkeit IL-10 zu aktivieren existiert. ERGEBNISSE 56 Abb. 4.7 IL-10-Kinetiken: mRNA-Expression und Konzentration im Zellkulturüberstand. Naive und memory TH-Zellen wurden aktiviert ohne zusätzlichen Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit NotchLigand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4). Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde (A) die totale mRNA isoliert und die Il10-Expression bestimmt (naive n=5-15, memory n=7-11) oder (B) der Zellkulturüberstand geerntet und die IL-10-Konzentration mittels ELISA gemessen (n=4). (A) und (B) Mittelwert mit Standardfehler (SEM). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 4.1.6 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-INDUZIERTES IL-10 IST LANGFRISTIG NICHT STABIL Für TH-Zellen ist bekannt, dass sie u.a. durch epigenetische Modifikationen ein Gedächtnis für die Expression von bestimmten Effektorzytokinen ausbilden können. Dieses Gedächtnis führt dazu, dass die TH-Zellen durch Reaktivierung über den TCR, unabhängig vom initialen, induzierenden Stimulus, diese Effektorzytokine wieder exprimieren können [118]. Da IL-10 ein Zytokin mit wesentlicher antiinflammatorischer Wirkung ist, war von besonderem Interesse, ob die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Modulation ein Gedächtnis für die IL-10-Produktion entwickelt, da es sich vor allem bei den Zytokinen um immun-aktivierende Signale handelt. Um dies zu testen, wurden naive und memory THZellen zunächst für eine Woche mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 moduliert, anschließend für die erste Zytokinbestimmung mit PMA/Ionomycin restimuliert oder 48 h ruhen gelassen, um dann nochmals eine zweite Woche mit TCR-only-stimuliert zu werden, ohne den initialen IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Stimulus. Die Frequenz der IL-10+ und IFN-γ+ TH-Zellen wurde jeweils mittels intrazellulärer Färbung gemessen. Die Restimulation nach der ersten Woche zeigte die erwartete IL-10-Induktion durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in naiven und memory TH-Zellen. Nach der zweiten Woche ohne IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus zeigten sowohl naive als auch memory TH-Zellen einen deutlich ERGEBNISSE 57 geringeren prozentualen Anteil an IL-10+ Zellen, der keinen Unterschied mehr aufwies zu den initial mit TCR-only-stimulierten Zellen. IFN-γ verhielt sich gegensätzlich: Hier bewirkte die zweite Aktivierung – unabhängig vom inital anwesenden Stimulus – einen Anstieg des prozentualen Anteils IFN-γ+ Zellen. (Abb. 4.8). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Fähigkeit nach PMA/Ionomycin-Restimulation mehr IL-10 zu produzieren als TCR-only-stimulierte TH-Zellen, nicht über einen längeren Zeitraum bestehen blieb, nachdem der initiale IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus entfernt wurde. Abb. 4.8 Stabilität der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten IL-10-Expression. Die IL-10- und IFN-γ-Produktion von naiven und memory TH-Zellen wurde nach PMA/Ionomycin-Restimulation an zwei Zeitpunkten (1. Woche und 2. Woche) bestimmt. Die Aktivierung der Zellen unterschied sich in der 1. Woche: Hier wurden die Zellen mit (α/6/21/DLL4, schwarze Kästchen) oder ohne (TCR-only, graue Kästchen) IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 aktiviert. Es folgten 48 h Ruhephase und die 2. Woche TCR-only-Aktivierung. Naive n=3, memory n=8. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 4.1.7 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 BEEINFLUSST SELEKTIV DIE IL-10-EXPRESSION Die Modulation von naiven und memory TH-Zellen mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 bewirkte eine extrem starke Induktion von IL-10 (Abb. 4.1, Abb. 4.2 und Kapitel 4.1.1). Dementsprechend interessant war es zu sehen, ob diese Stimuli einen vergleichbaren Einfluss auf andere Effektorzytokine hatten. Da viele dieser Effektorzytokine nicht von naiven TH-Zellen produziert werden, wurden diese Untersuchungen nur für memory TH-Zellen durchgeführt. DLL4 alleine verstärkte die Expression von IL-4 um ca. 100 % und die von GM-CSF um ca. 15 %. Die Frequenz der IFN-γ/IL-17A doppelt positiven Zellen nahm durch DLL4 um ca. 25 % ab. IFN-α/IL-6/IL-21 induzierte die Expression von IFN-γ von 40 % auf 45 %, während IL-4 (5 % → 4,5 %), IL-17A (9 % → 7 %), IFN-γ/IL-17A doppelt positive (3 % → 2 %), TNF-α (80 % → 75 %), IL-2 (60 % → 45 %) und GM-CSF (40 % → 25 %) durch IFN-α/IL-6/IL-21 inhibiert wurden (Abb. 4.9). IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induzierte die Frequenz IFN-γ+ Zellen von 40 % auf 47 % und IL- ERGEBNISSE 58 4+ Zellen von 5 % auf 7 %, während die IL-2+ Zellen von etwa 60 % auf 45 % und die GM-CSF+ von ca. 40 % 33 % sanken in Anwesenheit von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (Abb. 4.9). Obwohl IFN-α/IL-6/IL-21, DLL4 und IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Expression der verschiedenen Effektorzytokine teilweise beeinflusste, waren diese Effekte nicht vergleichbar mit der starken Induktion von IL-10. Außerdem ist es möglich, dass die Effekte nicht direkt durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 ausgelöst wurden, sondern indirekt durch IL-10 (siehe auch Kapitel 4.7). Abb. 4.9 Einfluss der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation auf andere Effektorzytokine. Memory TH-Zellen wurden für 120 h ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert und nach weiteren 24 h Ruhephase und PMA/Ionomycin-Restimulation wurden IFN-γ (n=24), IL-4 (n=24), IL-17A (n=24), TNF-α (n=24), IL-2 (n=11-14) und GM-CSF (n=7-10) intrazellulär gefärbt. Außerdem wurden IFN-γ+IL-17A+ (IFN-γ/IL-17A) Zellen bestimmt. Ein Datenpunkt pro Spender. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 4.1.8 INDUKTION EINES REGULATORISCHEN PHÄNOTYPS ÜBER IL-10 HINAUS Die Induktion von IL-10 in konventionellen TH-Zellen bzw. die Fähigkeit IL-10 zu produzieren wird oftmals TR1-Zellen zugeschrieben, wobei die Einteilung von TR1-Zellen als eigene TH-ZellSubpopulation strittig ist [33, 119]. Da die Modulation von TH-Zellen mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 eine massive IL-10-Produktion induzierte (siehe Kapitel 4.1.1), sollte untersucht werden, ob IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 weitere Merkmale von regulatorischen, respektive TR1-Zellen induziert. Hierfür wurde nach der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation die Expression von inhibitorischen ERGEBNISSE 59 Rezeptoren (IRs) (PD-1, TIGIT, TIM3, LAG-3) und Transkriptionsfaktoren (NFIL3, IKAROS Family Zinc Finger 3 [IKZF3 oder Aiolos]) gemessen, die phänotypisch humanen regulatorischen, IL-10produzierenden TH-Zellen zugeordnet werden [48, 49, 119, 120] bzw. die für die ex vivo Identifikation und Isolation von TR1-Zellen (LAG-3+CD49b+) [49] verwendet werden. IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 bewirkte in TH-Zellen den Anstieg der Frequenz LAG-3+ (35 % → 60 %), TIM3+ (9 % → 30 %), TIGIT+ (50 % → 60 %) und PD-1+ Zellen (40 % → 55 %). Ebenso erhöhte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Frequenz der LAG-3+CD49b+ Zellen um das 4-fache von 5 % auf 20 % (Abb. 4.10). DLL4 alleine induzierte außerdem bereits TIGIT und TIM3 und IFN-α/IL-6/IL-21 alleine bewirkte die Expression von PD-1, LAG-3 und LAG-3/CD49b. Jedoch induzierten weder DLL4 noch IFN-α/IL-6/IL-21 eine höhere IR-Expression als IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (Abb. 4.10). Neben den untersuchten IRs zeigten aktuelle Forschungsergebnisse auch eine Assoziation von NFIL3 [120] und IKZF3 [48] mit der IL-10-Expression in humanen TH-Zellen. IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 erhöhte die IKZF3-Expression um etwa das 1,5-fache. Außerdem steigerte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Frequenz der NFIL3+ Zellen von ca. 30 % auf 50 % (Abb. 4.10). Auch IKZF3 und NFIL3 wurden bereits von DLL4 bzw. IFN-α/IL-6/IL-21 alleine induziert, jedoch stellte auch hier IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 den stärksten Stimulus für beide Transkriptionsfaktoren dar (Abb. 4.10). Zusammenfassend konnte hier gezeigt werden, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4, über die Induktion von IL-10 hinaus, die Expression von mit Regulation assoziierten IRs und Transkriptionsfaktoren in memory TH-Zellen induziert. ERGEBNISSE 60 Abb. 4.10 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte Induktion von inhibitorischen Rezeptoren und regulatorischen Transkriptionsfaktoren. Memory TH-Zellen wurden für 48 h ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 aktiviert. Anschließend wurden die inhibitorischen Rezeptoren PD-1, TIGIT, LAG-3, TIM3 und die Transkriptionsfaktoren NFIL3 und IKZF3 gefärbt. (A) Repräsentative HistogrammPlots für PD-1, TIGIT, TIM3, NFIL3, IKZF3 nach TCR-only- (graue Fläche) und α/6/21/DLL4-Aktivierung (schwarze Linie) und repräsentativer Dotplot für CD49b/LAG-3 Co-Expression nach TCR-only- und α/6/21/DLL4-Aktivierung. (B) Statistische Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen für PD-1 (n=11), TIGIT (n=11), LAG-3 (n=18), CD49b (n=11), LAG-3/CD49b Co-Expression (n=11), TIM3 (n=26), NFIL3 (n=12) und IKZF3 (n=4). Gezeigt ist die Frequenz der angezeigten inhibitorischen Rezeptoren bzw. Transkriptionsfaktoren innerhalb kompletter memory TH-Zellen. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 ERGEBNISSE 61 4.2 IL-10-INDUKTION VIA IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IN TH-SUBPOPULATIONEN Es konnte gezeigt werden, dass die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 sowohl in naiven als auch in memory TH-Zellen eine starke IL-10-Produktion bewirkt (Kapitel 4.1.1). Innerhalb der memory THZellen gibt es jedoch verschiedene TH-Subpopulationen, die unterschiedliche Phänotypen aufweisen und denen dadurch bei einer Immunantwort unterschiedliche Aufgaben zukommen [7, 13]. Ob jede dieser Subpopulationen IL-10 nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation produzieren kann, war daher unklar. Aus diesem Grund sollte untersucht werden, ob sich TH1–, TH2–, TH17– und TH1/17–Zellen von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 zu IL-10-produzierenden TH-Zellen modulieren lassen. 4.2.1 IL-10-INDUKTION IN ALLEN WESENTLICHEN TH-SUBPOPULATIONEN Man kann TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen auf unterschiedliche Art und Weise identifizieren bzw. isolieren. Innerhalb kompletter memory TH-Zellen kann man sie anhand der Expression von Effektorzytokinen identifizieren. So lässt sich eine IFN-γ+ Zelle als TH1-Zelle, eine IL-4+ als TH2Zelle, eine IL-17A+ als TH17-Zelle und eine IFN-γ+IL-17A+ als TH1/17-Zelle definieren. Um herauszufinden, ob IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in allen TH-Subpopulationen IL-10 induzieren kann, wurden zunächst komplette memory TH-Zellen ohne zusätzliche Zytokine oder Notch-Stimulus bzw. mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 stimuliert und anschließend intrazellulär auf IL-10, IFN-γ, IL-4 und IL-17A gefärbt. Es konnte gezeigt werden, dass die IFN-γ- IL-4-, IL-17A und IFN-γ/IL-17A-produzierenden Zellen signifikant mehr IL-10+ Zellen enthalten, wenn die kompletten memory TH-Zellen mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 moduliert wurden (Abb. 4.11). ERGEBNISSE 62 Abb. 4.11 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion innerhalb Effektorzytokin-produzierender memory TH-Zellen. Komplette memory TH-Zellen (n=24) wurden für 120 h ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) bzw. mit IFN-α/IL6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert und nach weiteren 24 h Ruhephase und PMA-Ionomycin-Restimulation wurden IL10, IFN-γ, IL-4 und IL-17A intrazellulär gefärbt. (A) Repräsentativer Dotplot der intrazellulären Färbung. (B) Statistische Auswertung der IL-10+ Zellen innerhalb der IFN-γ- (CD45R0+IFN-γ+), IL-4- (CD45R0+IL-4+), IL-17A-produzierenden Zellen (CD45R0+IL-17A+) und IFN-γ/IL-17A-Doppelproduzenten (CD45R0+IFN-γ+IL-17A+). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Obwohl eine Unterscheidung der TH-Subpopulationen durch die Effektorzytokin-Produktion von kompletten memory TH-Zellen möglich war, war nicht ausgeschlossen, dass durch selektive in vitroEffekte während der Zellkultur bestimmte TH-Subpopulationen verstärkt expandierten und dadurch andere Subpopulationen depletiert wurden. Das würde das Bild des tatsächlichen Einflusses einer IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation auf die TH-Subpopulationen beeinträchtigten. Neben dem jeweils ERGEBNISSE 63 spezifischen Zytokin-Profil, das die unterschiedlichen TH-Subpopulationen aufweisen, exprimiert jede Subpopulation außerdem verschiedene Chemokinrezeptoren, die es ihnen in vivo ermöglichen, ihre Funktionen in unterschiedlichen Organen im Körper auszuüben [7, 12, 121, 122]. Diese Chemokinrezeptoren kann man zur Unterscheidung und Isolation dieser TH-Subpopulationen heranziehen und so eventuellen Verfälschungen durch Einflüsse der Zellkultur zuvorkommen. Hierfür wurden nach der Isolation der PBMC die CD4+ TH-Zellen mittels MACS angereichert und anschließend mit Antikörpern gegen CD4, CD45R0, CXCR3, CCR4, CCR6 und CCR10 gefärbt. Die Antikörper gegen CD4 und CD45R0 dienten der Identifizierung der CD4+ memory TH-Zellen. Innerhalb dieser Zellen wurde dann unterschieden zwischen CXCR3+ (definiert als TH1), CXCR3+CCR6+ (definiert als TH1/17), CCR4+ (definiert als TH2) und CCR6+CCR4+ (definiert als TH17) (Abb. 3.2). Um sicherzustellen, dass die Isolation über Chemokinrezeptoren funktionierte und es sich tatsächlich um TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen handelte, wurden die Zellen auf ihr Zytokinprofil hin untersucht. IFN-γ, IL-4 und IL-17A wurde mittels intrazellulärer Färbung, Messung der Konzentration im Zellkulturüberstand oder Bestimmung der jeweiligen mRNA-Expression gemessen. Zu allen gemessen Zeitpunkten waren TH1- und TH1/17-Zellen die Hauptproduzenten von IFN-γ. IL-4 wurde fast ausschließlich von TH2-Zellen produziert und IL-17A war vorrangig in TH17- und TH1/17Zellen zu finden. (Abb. 4.12). ERGEBNISSE 64 Abb. 4.12 Phänotyp-Bestimmung von TH-Subpopulationen. TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2). Zur Bestimmung des Phänotyps der TH-Subpopulationen wurde IFN-γ, IL-4 und IL-17A mittels intrazellulärer Färbung, Messung der Konzentration im Zellkulturüberstand oder Bestimmung der mRNA-Expression gemessen. Die Messungen fanden zu unterschiedlichen Zeitpunkten statt: Nach Stimulation mit PMA/Ionomycin direkt nach der FACS-Sortierung (6 h PMA) und jeweils nach 24 h (24 h TCR-only) bzw. 120 h (120 h TCR-only) Stimulation mit CD3/CD28/CD2 (Mittelwert mit Standardfehler [SEM], 6 h PMA, n=3; 24 h TCR-only, Zytokinkonzentration n=4, mRNA-Expression n=6; 120 h TCR-only, intrazelluläre Färbung n=14-24, Zytokinkonzentration n=6-14) ERGEBNISSE 65 Nachdem sichergestellt war, dass die isolierten Zellen die erwarteten Phänotypen aufwiesen, wurden sie mit TCR-only, DLL4, IFN-α/IL-6/IL-21 oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 stimuliert und die IL-10Produktion gemessen. Wie auch in kompletten memory TH-Zellen (Abb. 4.7 A) induzierte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Expression von Il10-mRNA in allen TH-Subpopulationen mit einem Maximum nach 24 h (Abb. 4.13 A). Ebenso bewirkte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Induktion von einer ca. 10-fach erhöhten Frequenz IL-10+ Zellen und einer ca. 3- bis 4-fach erhöhten Konzentration von sekretiertem IL-10 in allen THZellen. Auch IFN-α/IL-6/IL-21 und DLL4 alleine konnten jeweils in allen Subpopulationen signifikant die Frequenz von IL-10+ Zellen bzw. der IL-10-Konzentration (bis auf DLL4 in TH2Zellen) erhöhen. Das Maximum wurde jedoch immer durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 erreicht (Abb. 4.13 B, C). ERGEBNISSE 66 Abb. 4.13 Induktion von IL-10 mittels IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in TH-Subpopulationen. TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 aktiviert. Anschließend wurden (A) an den angegebenen Zeitpunkten die mRNA-Expression von Il10 bestimmt (n=4, Mittelwert mit Standardfehler [SEM]), (C – untere Reihe) die Zytokinkonzentration von IL-10 nach 120 h im Zellkulturüberstand mittels ELISA gemessen oder (B, C – obere Reihe) nach weiteren 24 h Ruhephase und PMA/Ionomycin-Restimulation mittels intrazellulärer Färbung die Zytokine IL-10, IFN-γ, IL-4 und IL-17A bestimmt. (B) Repräsentativer Dotplot für die intrazelluläre Färbung. (C) Statistische Auswertung der intrazellulären Färbung und der Konzentrationsbestimmungen. Intrazelluläre Färbung: TH1 n=13-22, TH2 n=9-14, TH17 n=13-22, TH1/17 n=13-21, IL-10Konzentration: TH1, TH2, TH17 und TH1/17 n=7-20. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 ERGEBNISSE 67 Um zu untersuchen, inwiefern die IL-10-Induktion an die Expression der jeweiligen Effektorzytokine gekoppelt ist, wurde die IL-10-Expression innerhalb der jeweiligen Effektorzytokin-positiven und -negativen TH-Zellen gemessen. So sollte ermittelt werden, ob durch die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4vermittelte IL-10-Produktion eine mögliche Selbstregulation der Effektorzellen induziert werden kann oder ob die IL-10-Produzenten eine separate Population darstellen, entkoppelt vom TH-Phänotyp. IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 konnte – unabhängig von der Effektorzytokin-Produktion – in allen THSubpopulationen die 3- bis 6-fache Frequenz IL-10+ Zellen induzieren. Hierbei war – bis auf TH1Zellen – kein Unterschied in der Stärke der IL-10-Induktion zwischen Effektorzytokin-positiven und -negativen Zellen zu erkennen (Abb. 4.14 A). ERGEBNISSE Abb. 4.14 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion innerhalb der Effektorzyokin-positiven und -negativen TH-Zellen: Vergleich von TH1-, TH17- und TH1/17-Zellen. TH1- (n=17-26), TH2- (n=14-16), TH17- (n=17-26) und TH1/17-Zellen (n=14-26) wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und für 120 h ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) oder mit IFN-α/IL6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert. Nach weiteren 24 h Ruhephase und PMA/Ionomycin-Restimulation wurden IL10, IFN-γ, IL-4 und IL-17A intrazellulär gefärbt. (A) Frequenz der IL-10+ Zellen innerhalb der IFN-γ+ und IFN-γ– TH1und TH1/17-Zellen (TH1 und TH1/17), der IL-4+ und IL-4– TH2-Zellen (TH2), der IL-17A+ und IL-17A– TH17- und TH1/17Zellen (TH17 und TH1/17) und der IFN-γ+IL-17A+ und IFN-γ–IL-17A– TH1/17-Zellen (TH1/17). (B) Vergleich der Frequenz der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten IL-10+ Zellen innerhalb der IFN-γ+IL-17A+, IFN-γ+ und IL-17A+ TH1/17-Zellen (Kreise) mit der Frequenz der IL-10+ Zellen innerhalb der IFN-γ+ TH1-Zellen (Kästchen) bzw. der IL-17A+ TH17-Zellen (Rauten). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 68 ERGEBNISSE 69 Die vorliegenden Daten zeigten somit, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in allen wesentlichen THSubpopulationen IL-10 induzierte. Diese Induktion war nicht gebunden an die EffektorzytokinProduktion der jeweiligen Subsets und damit entkoppelt von der TH-Differenzierung. Zusammen mit den vorherigen Daten zur Induktion von IL-10 in naiven und kompletten memory TH-Zellen (siehe Kapitel 4.1.1) und dessen Stabilität (siehe Kapitel 4.1.6) unterstützten diese Beobachtungen die Theorie, dass alle TH-Zellen – wenigstens transient – IL-10 produzieren können. 4.2.2 BEEINTRÄCHTIGTE IL-10-PRODUKTION IN TH1/17-ZELLEN Die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 bewirkte in allen TH-Subpopulationen einen signifikanten Anstieg der IL-10-Produktion. Wenn man die Subpopulationen jedoch miteinander verglich, so fiel auf, dass sich die IL-10-Produktion nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation zwischen den TH-Subpopulationen unterschied. Hier zeigten die TH1/17-Zellen die niedrigsten Frequenzen IL-10+ TH-Zellen nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation und auch die geringsten Konzentrationen an sekretiertem IL-10 im Zellkulturüberstand (Abb. 4.13 C). Gleichzeitig zeigte die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 keine direkte Schwächung des inflammatorischen Potentials der modulierten Zellen, z.B. durch eine bedeutende Verringerung der IFN-γ- oder IL-17A-Produktion, sondern stellte mit der Induktion von IL-10 eher eine Möglichkeit der Gegenregulation dar. Daher sollte genauer analysiert werden, ob TH1/17-Zellen tatsächlich eine geringere Fähigkeit zur Selbstregulation besitzen. Um dies genauer zu untersuchen, wurde die Fähigkeit der Induktion von IL-10 in IFN-γ+IL-17A+, IFN-γ+ und IL-17A+ TH1/17-Zellen jeweils mit IFN-γ+ TH1-Zellen und IL-17A+ TH17-Zellen verglichen. Die IFN-γ+IL-17A+ TH1/17-Zellen zeigten nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation nur ca. halb so viel IL-10-Expression wie die IFN-γ+ TH1-Zellen und etwa 1,5-fach weniger IL-10-Expression als IL-17A+ TH17-Zellen. Noch aufschlussreicher war allerdings der direkte Vergleich der IFN-γ- und IL-17A-Produzenten: Die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induzierte in IFN-γ+ TH1/17-Zellen nur halb so viel IL-10 wie in den entsprechenden TH1-Zellen. Das gleiche Bild ergab sich für IL-17A+ TH1/17 Zellen, die nur halb so viele IL-10-exprimierende Zellen aufwiesen wie IL-17A+ TH17-Zellen (Abb. 4.14 B). Die Tatsache, dass der gleiche Zytokin-produzierende Phänotyp in TH1/17-Zellen weniger IL-10 produzieren konnte als in TH1- bzw. TH17-Zellen deutete darauf hin, dass TH1/17-Zellen eine geringere Fähigkeit zur IL-10-Produktion besitzen. 4.2.3 BEEINFLUSSUNG VON EFFEKTORZYTOKINEN IN MODULIERTEN TH-SUBPOPULATIONEN Auch für die TH-Subpopulationen sollte untersucht werden, inwiefern sich IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation auf die Expression der jeweiligen Effektorzytokine auswirkt. die ERGEBNISSE 70 DLL4 alleine verstärkte die IL-4-Expression auf das Doppelte in TH2-Zellen und verringerte die Produktion von IFN-γ in TH1/17-Zellen um ca. 15 %. IFN-α/IL-6/IL-21 alleine hatte keinen signifikanten Einfluss auf eines der Effektorzytokine. IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 bewirkte eine Verstärkung der IL-4-Produktion in TH2-Zellen ebenfalls auf etwa das Doppelte und eine nichtsignifikante Induktion von IFN-γ in TH1-Zellen um ca. 15 % (Abb. 4.15 A). Diese Daten wurden durch die Messung der mRNA-Expression mittels Multiplex-Real-Time-PCR bestätigt: IFN-α/IL6/IL-21/DLL4 verstärkte die relative Expression von Ifng und Il4 in TH1- bzw. TH2-Zellen (Abb. 4.15 B). Gleichzeitig verringerte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Frequenz der IL-17A+ Zellen in TH1/17Zellen um ca. 20 % und verstärkte die IFN-γ-Produktion nicht signifikant um ca. einen Prozentpunkt (Abb. 4.15 A). Diese Beobachtungen konnten aber nicht durch die mRNA-Expression-Messung bestätigt werden (Abb. 4.15 B). Zusätzlich bestätigten die mRNA-Expressions-Messungen in TH-Zellen die Daten zur Produktion von IL-2, TNF-α und GM-CSF in kompletten memory TH-Zellen (Abb. 4.9): Die relative mRNAExpression von Il2, Tnf und Csf2 (codiert für GM-CSF) wird in allen TH-Subpopulation durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 verringert (Abb. 4.15 C). Insgesamt spiegeln diese Daten die Ergebnisse aus kompletten memory TH-Zellen (Abb. 4.9) wider. Ebenso waren auch hier die Effekte von IFN-α/IL-6/IL-21, DLL4 oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auf die jeweiligen TH-Effektorzytokine in ihrer Intensität nicht vergleichbar mit den Effekten auf die IL-10-Expression, die durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 um ca. das 10-fache in allen THSubpopulationen gesteigert wurde. ERGEBNISSE 71 Abb. 4.15 Einfluss von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auf die Expression von TH-Effektorzytokinen. TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert. (A) Nach 120 h Zellkultur, anschließenden 24 h Ruhephase und PMA/Ionomycin-Restimulation wurden die TH-Effektorzytokine IFN-γ in TH1- und TH1/17-Zellen, IL-4 in TH2-Zellen und IL-17A in TH17- und TH1/17-Zellen intrazellulär gefärbt. TH1 n=16-25, TH2 n=10-15, TH17 15-24, TH1/17 n=15-24. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001. (B, C) Bereits nach 24 h wurde von TCR-only- und IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4stimulierten TH-1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen die mRNA isoliert und mittels Multiplex-Real-Time-PCR die Expression bestimmt von (B) Ifng in TH1- und TH1/17-Zellen, von Il4 in TH2-Zellen und von Il17a in TH17- und TH1/17-Zellen bzw. von (C) Il10, Tnf, Il2 und Csf2 jeweils ins TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen. Dargestellt ist in (B) und (C) die durchschnittliche (n=6) relative Expressionsänderung der dargestellten Gene von TCR-only zu α/6/21/DLL4 für TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen. 4.2.4 INDUKTION EINES REGULATORISCHEN PHÄNOTYPS IN TH-SUBPOPULATIONEN Da IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in kompletten memory TH-Zellen nicht nur IL-10 (siehe Kapitel 4.1.1), sondern auch inhibitorische Rezeptoren und regulatorische Transkriptionsfaktoren induzierte (siehe Kapitel 4.1.8), sollte untersucht werden, ob IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auch in TH-Subpopulationen über IL-10 hinaus regulatorische Eigenschaften induziert. Mittels Multiplex-Real-Time-PCR wurde hierfür die mRNA-Expression von sekretierten regulatorischen Proteinen (IL-1ra, Granzym B, TGF-β1) und IRs (CTLA4, TIGIT, PD-1) [5, 59, 123-127] gemessen und die relative Expressionsänderung von TCR-only- gegenüber IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-stimulierten TH-Zellen berechnet. Ergänzend zu den durchflusszytometrischen Messungen in kompletten memory TH-Zellen (Abb. 4.10), erhöhte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die mRNA-Expression von Ctla4, Pdcd1 (codiert für PD-1) und Tigit in TH1-, TH2- und TH17-Zellen. In TH1/17-Zellen wurde nur Ctla4 und Pdcd1 induziert (Abb. 4.15 A). Ebenso steigerte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die mRNA-Expression von Il1rn (codiert für IL-1ra) und Gzmb (codiert für Granzym B) in allen TH-Subpopulationen. Bis auf eine minimale Induktion in TH2- ERGEBNISSE 72 Zellen, zeigte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 keinen Einfluss auf Tgfb1 (codiert für TGF-β1) (Abb. 4.15 B). Unterstützend zu der gesteigerten mRNA-Expression von Il1rn konnte zusätzliche ein etwa 3-facher Anstieg der IL-1ra-Konzentration im Kulturüberstand von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten kompletten memory TH-Zellen gemessen werden (Abb. 4.15 C). Zusammenfassend konnte hier gezeigt werden, dass in TH-Zellen durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4, über IL-10 hinaus, Gene von mit Regulation assoziierten Molekülen induziert werden. Abb. 4.16 Induktion eines regulatorischen Phänotyps in TH-Subpopulationen. (A, B) TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und ohne Zytokinoder Notch-Stimulus (TCR-only) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert. Nach 24 h wurde die mRNA isoliert und mittels Multiplex-Real-Time-PCR die Expression von (A) Ctla4, Pdcd1 und Tigit und von (B) Il1rn, Gzmb und Tgfb1 bestimmt. Dargestellt ist die durchschnittliche (n=6) relative Expressionsänderung der dargestellten Gene von TCRonly zu α/6/21/DLL4 für TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen. (C) Komplette memory TH-Zellen wurden für 120 h ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert. Anschließend wurde der Überstand geerntet und die IL1ra-Konzentration mittels Bioplex bestimmt (n=1). 4.3 INDUKTION VON IL-10 IN HUMANEN TH-ZELLEN DURCH DENDRITISCHE ZELLEN Die bisherigen Untersuchungen zur IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten Induktion von IL-10 in naiven und memory TH-Zellen wurden in einem APC-freien Zellkultursystem durchgeführt. Daher sollte die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion in einem biologisch relevanteren, TH-Zell-APC System getestet werden. Für diese Versuche wurden professionelle APC ausgewählt, da bei der Aktivierung von TH-Zellen eine direkte Interaktion zwischen Liganden und Rezeptoren auf den APC und TH-Zellen stattfindet. Aus Versuchen mit murinen pDC weiß man zudem, dass via DLL4 IL-10 in TH-Zellen induziert werden kann [105]. Ebenso können auch mDC DLL4 exprimieren [128]. 4.3.1 HUMANE PDC UND MDC EXPRIMIEREN DLL4 NACH AKTIVIERUNG ÜBER TLR Um den Notch-Liganden DLL4 und co-stimulatorische Oberflächenmoleküle zu induzieren, wurden mDC und pDC über Nacht mit TLR-Liganden inkubiert. Da sich pDC und mDC bezüglich ihrer TLRExpression unterscheiden, mussten sie mit unterschiedlichen TLR-Liganden stimuliert werden. mDC exprimieren hauptsächlich TLR4 und pDC TLR7 und TLR9. TLR4 kann über LPS aktiviert werden und TLR7/9 kann über Oligonukleotide mit CpG-Motiv (CpG) stimuliert werden (Tab. 3.5) [129]. ERGEBNISSE 73 Die Anwesenheit von LPS bzw. CpG bewirkte jeweils in mDC und pDC die Expression des NotchLiganden DLL4. Ohne entsprechenden TLR-Liganden war DLL4 auf der Zelloberfläche von mDC oder pDC kaum messbar. Darüber hinaus induzierte die TLR-Aktivierung die Verdoppelung der CD80+ pDC und mDC und steigerte den Prozentsatz von CD86+ Zellen in pDC von 83 % auf 97 % und in mDC von 16 % auf 39 %. Den MHC-II Rezeptor HLA-DR exprimierten mDC unabhängig von der Anwesenheit von LPS. In pDC steigerte CpG die HLA-DR-Expression nochmals von ca. 90 % auf fast 100 % (Abb. 4.17). Die Aktivierung des TLR bewirkte die Reifung von pDC und mDC zu kompetenten APC, die zusätzlich den Notch-Liganden DLL4 exprimierten. Abb. 4.17 Reifung und DLL4-Expression in mDC und pDC durch TLR-Aktivierung. mDC und pDC wurden aus PBMC isoliert und über Nacht mit (+TLR) oder ohne (ohne) TLR-Ligand (LPS für mDC, CpG für pDC) inkubiert. Anschließend wurde die Expression von DLL4, CD80, CD86 und HLA-DR durchflusszytometrisch bestimmt. (A) Repräsentativer Dotplot der durchflusszytometrischen Messung. (B) Statistische Auswertung von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten, n=4. 4.3.2 IL-10-INDUKTION MITTELS DLL4-EXPRIMIERENDER PDC UND MDC Um zu untersuchen, ob das von den DC exprimierte DLL4 die gleichen Effekte auf die IL-10Expression haben kann wie DLL4 im APC-freien System, wurden mDC und pDC zunächst über Nacht mit LPS (mDC) bzw. CpG (pDC) stimuliert und anschließend mit naiven oder memory THZellen in An- oder Abwesenheit von IFN-α/IL-6/IL-21 co-kultiviert. Als Kontrollen wurden die THZellen außerdem, wie in den APC-freien Kulturen zuvor, nur mit CD3/CD28/CD2-MACSiBeads bzw. zusätzlichem IFN-α/IL-6/IL-21 stimuliert. Die Anwesenheit von pDC bewirkte in naiven TH-Zellen einen Anstieg der IL-10+ Zellen von unter 1 % auf ca. 2 % und in memory TH-Zellen von etwa 3 % auf 10 % (Abb. 4.18). Wenn zusätzlich IFN- ERGEBNISSE 74 α/IL-6/IL-21 hinzugegeben wurde, verstärkte das die IL-10-Expression in naiven (ca. 8 %) und memory TH-Zellen (ca. 22 %) noch weiter. Die Blockade von DLL4 auf den pDC bewirkte sowohl in naiven als auch in memory TH-Zellen den Rückgang der IL-10+ Zellen um ca. 70 % (Abb. 4.18). Im Gegensatz zu den pDC verstärkten mDC die Frequenz IL-10+ Zellen nur in naiven TH-Zellen auf etwa 2 %. In memory TH-Zellen hatte die Anwesenheit von mDC keinen Einfluss auf die IL-10-Expression, unabhängig davon, ob IFN-α/IL-6/IL-21 zugegeben wurde oder nicht. Obwohl die mDC gegenüber der APC-freien Kontrolle keine Steigerung der IL-10-Expression in memory TH-Zellen bewirkten, verringerte die Blockade von DLL4 in naiven und memory TH-Zellen die Frequenz IL-10+ TH-Zellen um mindestens 80 %. (Abb. 4.18). Diese Ergebnisse zeigten, dass – wie im APC-freien System – die IL-10-induzierende Wirkung von IFN-α/IL-6/IL-21 in naiven und memory TH-Zellen durch DLL4 verstärkt wurde, vor allem in CoKultur mit pDC. Offenbar wird auch bei der APC-TH-Zell-Interaktion die IFN-α/IL-6/IL-21vermittelte IL-10-Expression durch DLL4 weiter gesteigert. Dass die Blockade von mDC-DLL4 einen Einfluss hat auf die Co-Kultur mit memory TH-Zellen weist auch hier auf einen Einfluss von DLL4 auf die IL-10-Expression hin. Abb. 4.18 IL-10-Induktion in naiven und memory TH-Zellen mittels DLL4-exprimierender mDC und pDC. Naive und memory TH-Zellen wurden für 120 h aktiviert: APC-frei ohne Zytokin- oder DLL4-Stimulus (TCR-only) , APCfrei mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21), mit mDC (mDC) oder pDC (pDC) als DLL4-Stimulus oder mit kombiniertem IFN-α/IL-6/IL-21- und DLL4-Stimulus über mDC (α/6/21/mDC) oder pDC (α/6/21/pDC). Zur Blockade des DLL4Stimulus unter α/6/21/mDC- bzw. α/6/21/pDC-Bedingungen wurde zusätzlich ein inhibierender DLL4-Antikörper hinzugegeben (+αDLL4). Nach weiteren 24 h Ruhephase und PMA/Ionomycin-Restimulation wurde IL-10 in den TH-Zellen intrazellulär gefärbt. Gezeigt ist die Frequenz IL-10+ Zellen innerhalb der proliferierten TH-Zellen. Ein Datenpunkt pro THZell-Spender, n=11. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 ERGEBNISSE 75 4.4 INDUKTION IMMUN-REGULIERENDER FUNKTIONEN DURCH IFN-α/IL-6/IL-21MODULATION IL-10 ist ein Zytokin mit immuno-regulatorischen Eigenschaften [36]. Vorherige Experimente zeigten, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in TH-Zellen IL-10 induzieren konnte. Nun sollte untersucht werden, ob dieses IL-10 funktionell aktiv ist und ob die modulierten TH-Zellen damit regulatorische Funktionen ausüben können. Da IL-10 seine regulatorischen Eigenschaften über den Einfluss sowohl auf APC als auch auf TH-Zellen direkt ausübt [36], sollte hier untersucht werden, ob und wie IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierte TH-Zellen den Phänotyp von Monozyten bzw. die Proliferation von TH-Zellen beeinflussen. 4.4.1 INDUKTION EINES ANTI-INFLAMMATORISCHEN PHÄNOTYPS IN MONOZYTEN VIA IL-10 Für die Untersuchung des Einflusses von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH-Zellen auf APC wurden TH-Zellen zunächst für 120 h mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (T /6/21/DLL4) moduliert oder nur über α ihren TCR aktiviert, ohne weiteren Zytokin- oder Notch-Stimulus (TTCR-only). Nach weiteren 24 h Ruhephase der TH-Zellen wurden sie für 40 h mit allogenen Monozyten co-kultiviert und anschließend der Phänotyp der Monozyten durchflusszytometrisch bestimmt. Hierbei wurde die Expression des anti-inflammatorischen Rezeptors CD163 [130, 131] und der beiden co-stimulatorischen Rezeptoren CD40 und HLA-DR [5, 132] gemessen. ERGEBNISSE 76 Abb. 4.19 IFN-α/IL-6/IL-21-modulierte TH-Zellen können in Monozyten einen regulatorischen Phänotyp induzieren und die Proliferation von TH-Zellen inhibieren. Naive (A, B) und memory TH-Zellen (C, D) wurden ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TTCR-only) oder mit IFN-α/IL-6/IL21/DLL4 (T /6/21/DLL4) für 120 h aktiviert und für 24 h ruhen gelassen. (A, B) Anschließend wurden die TH-Zellen mit allogenen Monozyten für 40 h co-kultiviert und durchflusszytometrisch der MFI von CD163 und CD40 und die HLA-DR+Frequenz in den Monozyten bestimmt. Zur Blockade der IL-10-Wirkung wurde ein blockierender Antikörper gegen den IL10R (+ αIL-10R) hinzugegeben. (A) Repräsentative Histogramm-Plots mit TTCR-only (graue Fläche), T /6/21/DLL4 (schwarze Linie) und T /6/21/DLL4 (gestrichelte schwarze Linie). (B) Statistische Auswertung der Oberflächenflächenfärbung. CD163 n=13, CD40 n=10, HLA-DR n=9. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001. Alternativ wurden die TH-Zellen mit (C, D) CD3depletierten PBMC und allogenen CD4+ TH-Zellen (TRESP) für 96 h co-kultiviert. Als Proliferations-Kontrolle wurden TRESP ohne TTCR-only oder T /6/21/DLL4 mit CD3-depletierten PBMC co-kultiviert (TRESP only) . Die TRESP waren mit einem Farbstoff gefärbt, dessen Intensität mit jeder Zellteilung nachließ (CellTrace). Daher wurde nach der Co-Kultur die Frequenz der proliferierten TRESP über die CellTrace-Intensität bestimmt. Zur Blockade der IL-10-Wirkung wurde ein blockierender Antikörper gegen den IL-10R hinzugegeben. (C) Proliferation der TRESP in Co-Kultur mit TTCR-only (TRESP + TTCR-only) oder mit T /6/21/DLL4 (TRESP + T /6/21/DLL4) in An- (αIL-10R) oder Abwesenheit (ohne) des blockierenden IL-10R-Antikörpers, dargestellt als % der proliferierten TRESP only (Mittelwert mit Standardfehler [SEM], n=2). (D) Repräsentative HistogrammPlots der CellTrace-Intensität für TRESP only, TRESP + TTCR-only und TRESP + T /6/21/DLL4. α α α α α α α Nach der Co-Kultur zeigten sich unterschiedliche Phänotypen zwischen den T /6/21/DLL4 und den TTCRα only co-kultivierten Monozyten. Relativ zur Co-Kultur mit TTCR-only war die Expression des anti- inflammatorischen Rezeptors CD163 durch die Anwesenheit von T /6/21/DLL4 bis zu doppelt so hoch, α wohingegen die CD40-Expression bis maximal um die Hälfte reduziert wurde (Abb. 4.19 A, B). ERGEBNISSE 77 Ebenso bewirkte die Co-Kultur mit T /6/21/DLL4 eine Reduktion der HLA-DR-Expression um bis zu α 10 %. Die Anwesenheit eines Antikörpers, der den IL-10R blockiert, bewirkte, dass die jeweiligen Effekte auf CD163, CD40 und HLA-DR abgeschwächt oder sogar aufgehoben wurden (Abb. 4.19 A, B). Die vorliegenden Daten zeigten, dass TH-Zellen, die mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 moduliert wurden, einen regulatorischen Phänotyp in Monozyten induzierten. Dass dieser Effekt durch die Blockade des IL-10R verringert oder aufgehoben wurde, beweist, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierte THZellen diese Funktionen über IL-10 vermittelten. 4.4.2 Zusätzlich SUPPRESSION DER TH-ZELLPROLIFERATION sollte untersucht werden, ob sich diese regulatorischen Eigenschaften von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH-Zellen auch auf andere TH-Zellen auswirken können. Hierfür wurden zunächst wieder TH-Zellen mit (T /6/21/DLL4) oder ohne (TTCR-only) IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 α kultiviert und anschließend mit Responder-TH-Zellen (TRESP) und APC für 96 h co-kultiviert. Die Messungen ergaben, dass die TRESP in Anwesenheit von T /6/21/DLL4 deutlich schwächer α proliferierten als in der Co-Kultur mit TTCR-only. Verglichen mit den TRESP only Zellen, verstärkten die TTCR-only sogar die Proliferation der TRESP (Abb. 4.19 C, D). Anders als in der Co-Kultur mit Monozyten (Abb. 4.19 A, B), wurde dieser Effekt jedoch nicht aufgehoben in Anwesenheit eines Antikörpers, der den IL-10R inhibiert. Die vorliegenden Daten zeigten, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierte TH-Zellen die Proliferation anderer TH-Zellen kontrollierten, jedoch war dieser Effekt nicht IL-10-abhängig. Das wies darauf hin, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierte TH-Zellen womöglich auf andere Art und Weise regulatorische Funktionen ausüben können – womöglich über die Expression von IRs oder anderer regulatorischer Proteine (siehe Kapitel 4.1.8 und 4.2.4). 4.5 IL-10-INDUKTION IN PROFESSIONELLEN REGULATORISCHEN T-ZELLEN Da IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 einen universellen Mechanismus für die Induktion von IL-10 in konventionellen TH-Zellen darstellte (siehe Kapitel 4.1.1 und 4.2.1), sollte untersucht werden, ob diese Modulation auch die Expression von IL-10 in professionellen regulatorischen T-Zellen hervorrufen kann. Dafür wurden CD25+ TREG isoliert und mit TREG MACSiBeads aktiviert. Zur Induktion von IL-10 wurden IFN-α/IL-6/IL-21 oder DLL4 MACSiBeads hinzugegeben. Ähnlich wie in konventionellen TH-Zellen (Abb. 4.1), bewirkten DLL4 und IFN-α/IL-6/IL-21 alleine einen nur schwachen, nicht signifikanten Anstieg der IL-10+ Zellen. Lediglich IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 verstärkte signifikant die IL-10-Produktion von ca. 1 % auf 6 % (Abb. 4.20 A, B). Dieser Einfluss von IFN-α/IL-6/IL-21, DLL4 oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 war ebenfalls im Überstand der TREG-Zellkultur messbar: In Anwesenheit von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 produzierten die ERGEBNISSE 78 TREG die größte Menge IL-10 (Abb. 4.20 C). Ein klarer Einfluss auf die Produktion der inflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α war nicht zu erkennen. Jedoch war auffällig, dass die isolierten TREG viel IFN-γ und TNF-α produzierten. (Abb. 4.20 B). Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auch in den hier isolierten Zellen IL-10 induzierten konnte. Aufgrund der großen Mengen IFN-γ und TNF-α war allerdings unklar, inwieweit es sich in diesen Experimenten tatsächlich um professionelle TREG handelte. Abb. 4.20 Induktion von IL-10 via IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in Foxp3+ TREG. CD25+ TREG wurden mittels MACS-Anreicherung aus PBMC isoliert und anschließend für 120 h ohne Zytokin- oder NotchStimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert. Anschließend wurden die Zellen (A, B) für 24 h ruhen gelassen, mit PMA/Ionomycin restimuliert und Foxp3, IL-10, IFN-γ und TNF-α intrazellulär gefärbt oder (C) direkt nach 120 h die IL-10-Konzentration im Zellkulturüberstand bestimmt. (A) Repräsentativer Dotplot der intrazellulären Foxp3/IL-10-Färbung. Statistische Auswertungen der (B) intrazellulären IL-10- (n=8-11), IFN-γ- (n=5-8) und TNF-α-Färbung (n=5-6) und der (C) Messung von IL-10 im Zellkulturüberstand von einem Experiment (Mittelwert mit Standardfehler [SEM], n=2-4). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 4.6 DIE TRANSKRIPTIONELLE REGULATION DER IL-10-INDUKTION IN HUMANEN TH-ZELLEN Die bisherigen Daten dieser Arbeit konnten zeigen, dass die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in allen untersuchten TH-Subpopulationen IL-10 induzieren konnte. Da die transkriptionelle Regulation von IL-10 in humanen TH-Zellen bisher nicht hinreichend aufgeklärt ist, war eine weitere wesentliche Fragestellung, welche Transkriptionsfaktoren in die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Expression involviert sind. ERGEBNISSE 4.6.1 79 BLIMP-1 UND C-MAF SIND NOTWENDIG FÜR DIE IL-10-PRODUKTION IN TH-ZELLEN In der Literatur sind eine Vielzahl an Transkriptionsfaktoren beschrieben, von denen man weiß, dass sie in die Expression von IL-10 involviert sind. Ein Großteil dieser Daten stammt jedoch aus murinen TH-Zellen. Unter anderem weiß man, dass IL-10 in den unterschiedlichen Subpopulationen muriner TH-Zellen unterschiedlich reguliert wird. Für TH1-Zellen ist bekannt, dass die Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und c-Maf eine wesentliche Rolle spielen, wobei in Abwesenheit von c-Maf immer noch IL-10 exprimiert werden kann. Ein Ausschalten von Blimp-1 hingegen schließt die IL-10-Expression aus [82]. In TH17-Zellen wiederum ist c-Maf der wesentliche Transkriptionsfaktor für die Produktion von IL-10 [91], und TH2-Zellen benötigen die Transkriptionsfaktoren GATA3 und STAT6 für eine stabile IL-10-Produktion [89]. Da die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in allen wesentlichen TH-Subpopulationen IL-10 induzieren konnte (Abb. 4.13), stellte sich die Frage, wie diese IL-10Induktion transkriptionell reguliert wird und ob es – trotz des gleichen Stimulus – Unterschiede in der Regulation gibt zwischen den TH-Subpopulationen. Hierfür wurden TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17Zellen isoliert (Abb. 3.2 A) und mit TCR-only und IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 stimuliert. Anschließend wurde eine Multiplex-Real-Time-PCR durchgeführt, in der die mRNA-Expression verschiedener Transkriptionsfaktoren gemessen wurde. Die relative Expression der mRNAs von Maf (codiert für c-Maf) und Prdm1 (codiert für Blimp-1) wurden durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in allen TH-Subpopulationen etwa verdoppelt und im Vergleich zu den übrigen Transkriptionsfaktoren am stärksten heraufreguliert. Ergänzend zu den intrazellulären Färbungen in kompletten memory TH-Zellen (Abb. 4.10) wurde ebenfalls die mRNA-Expression von Ikzf3 und Nfil3 durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 verstärkt – jedoch deutlich schwächer als Prdm1 und Maf. Interessanterweise zeigte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 keinen vergleichbaren Einfluss auf Gata3 und Stat6 in TH2-Zellen (Abb. 4.21 A). Blimp-1 und c-Maf wurden schon durch vorangegangene Experimente der Arbeitsgruppe in murinen TH1- und TH-17-Zellen als wesentliche Transkriptionsfaktoren der IL-10-Regulation identifiziert, unter anderem mit Notch als Induktor von c-Maf [82]. Da beide Transkriptionsfaktoren auch in den vorliegenden Experimenten die stärkste Assoziation mit dem IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus zeigten, wurden die Untersuchungen hierzu weiter intensiviert. Die Messung der Il10 mRNA-Expression ergab, dass das Maximum der mRNA-Expression sowohl für Maf als auch für Prdm1 in allen TH-Zellen nach 24 h erreicht wurde – genau wie in kompletten memory TH-Zellen (Abb. 4.21 B). ERGEBNISSE 80 Abb. 4.21 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induziert die Expression von Maf und Prdm1 in memory TH-Zellen. TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert. (A) Nach 24 h wurde die mRNA isoliert, mittels Multiplex-Real-Time-PCR die Expression der angegebenen Gene gemessen und die durchschnittliche (n=6) relative Expressionsänderung der dargestellten Gene von TCR-only zu α/6/21/DLL4 berechnet. (B) Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde in kompletten memory TH-Zellen, TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen die relative Expression von Maf (obere Reihe) und Prdm1 (untere Reihe) zu Actb mittels Real-Time-PCR gemessen. Gezeigt ist die statistische Auswertung von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (Mittelwert mit Standartfehler [SEM], n=4). Um herauszufinden, ob die Expression beider Transkriptionsfaktoren auch tatsächlich mit der IL-10Produktion assoziiert ist, wurden c-Maf und Blimp-1 zusammen mit IL-10 in memory TH-Zellen intrazellulär gefärbt. Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchungen bestätigten die Daten zur mRNAExpression: Die Frequenz der c-Maf+ memory TH-Zellen verdoppelte sich durch + IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 von ca. 40 % auf 80 % und auch Blimp-1 Zellen stiegen von etwa 5 % auf 20 % (Abb. 4.22 A, B). DLL4 und IFN-α/IL-6/IL-21 alleine induzierten ebenfalls die Expression von c-Maf und Blimp-1, zeigten jedoch unterschiedlich starke Effekte. Während DLL4 alleine (ca. 70 % c-Maf+) stärker c-Maf induzierte als IFN-α/IL-6/IL-21 (ca. 60 % c-Maf+), erhöhte IFN-α/IL-6/IL-21 (ca. 13 % Blimp-1+) die Blimp-1-Expression stärker als DLL4 (ca. 10 % Blimp-1+) (Abb. 4.22 A, B). Die Auswertung der Co-Expression von c-Maf und Blimp-1 mit IL-10 zeigte eine signifikante Anreicherung der IL-10+ Zellen sowohl in c-Maf+ als auch in Blimp-1+ Zellen, verglichen mit ihrem negativen Pendant. TH-Zellen, die c-Maf oder Blimp-1 exprimierten enthielten etwa doppelt so viele IL-10-Produzenten wie die TH-Zellen, die die Transkriptionsfaktoren nicht exprimierten (Abb. 4.22 C). ERGEBNISSE 81 Abb. 4.22 c-Maf und Blimp-1 sind assoziiert mit der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Produktion. Komplette memory TH-Zellen wurden ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) für 48 h aktiviert. Nach der anschließenden PMA/Ionomycin-Restimulation wurde IL-10, IFN-γ, IL-4, IL-17A, c-Maf und Blimp-1 intrazellulär gefärbt. (A) Repräsentativer Histogramm-Plot und (B) statistische Auswertung für die intrazelluläre Färbung von c-Maf (n=15) und Blimp-1 (n=11-16). (C) Frequenz IL-10+ Zellen innerhalb der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten c-Maf+ und c-Maf– Zellen (n=22) bzw. Blimp-1+ und Blimp-1– Zellen (n=16). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Für c-Maf konnten diese Daten zudem auch für die TH-Subpopulationen bestätigt werden. In allen THSubpopulationen wurde c-Maf durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induziert (Abb. 4.23 A). Darüber hinaus produzierten ebenfalls in allen TH-Subpopulationen die c-Maf+ Zellen mehr IL-10 als die c-Maf– Zellen. Gleichzeitig waren für die jeweiligen Effektorzytokine, bis auf mehr IL-4 in c-Maf+ TH2Zellen, keine signifikanten Unterschiede zwischen c-Maf+ und c-Maf− Zellen feststellbar (Abb. 4.23 B). ERGEBNISSE 82 Abb. 4.23 c-Maf ist assoziiert mit der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Produktion in TH-Subpopulationen. TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) für 48 h aktiviert. Nach der anschließenden PMA/Ionomycin-Restimulation wurde IL-10, IFN-γ, IL-4, IL-17A und c-Maf intrazellulär gefärbt. (A) Statistische Auswertung der intrazellulären c-Maf-Färbung in TH1-, TH2, TH17- und TH1/17-Zellen nach TCR-only- und α/6/21/DLL4-Stimulation (n=4-8). (B) Bestimmung der Frequenz der IL-10+ Zellen innerhalb der TH1-, TH2-, TH17 und TH1/17-Zellen, unterschieden nach c-Maf-Produktion (c-Maf+) und -nicht-Produktion (c-Maf–) nach IFN-α/IL-6/IL21/DLL4-Modulation (obere Reihe) und Bestimmung der Frequenz der IFN-γ+ TH1- und TH1/17-Zellen, der IL-4+ TH2-Zellen und der IL-17A+ TH17- und TH1/17-Zellen innerhalb der c-Maf-exprimierenden (c-Maf+) und -nicht-exprimierenden (c-Maf–) Zellen nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation (n=8). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Um herauszufinden, ob die Transkriptionsfaktoren c-Maf (codiert durch Maf) und Blimp-1 (codiert durch Prdm1) auch tatsächlich funktionell an der transkriptionellen Regulation von IL-10 beteiligt waren oder ob sie nur mit der IL-10-Produktion assoziiert waren (Abb. 4.22 C), wurden IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 modulierte TH-Zellen mit siRNAs gegen Maf (siMAF), Prdm1 (siPRDM1) und eine nicht codierende Sequenz (siCTRL) transfiziert. Da zudem untersucht werden sollte, ob c-Maf und Blimp-1 in allen TH-Subpopulationen an der IL-10-Expression beteiligt sind, wurden für diese Versuche TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen verwendet. Bevor jedoch nach der Transfektion die Fähigkeit der IL-10-Produktion valide bestimmt werden konnte, musste zunächst sichergestellt werden, ob die siRNAs auch die Expression ihrer jeweiligen Zielsequenz inhibieren. ERGEBNISSE 83 Die Messung der mRNA-Expression ergab, dass siMAF die Maf-Expression durchschnittlich um ca. 70 % und siPRDM1 die Prdm1-Expression um durchschnittlich ca. 50 % in allen untersuchten THSubpopulationen verringerte (Abb. 4.24 A). Abb. 4.24 siRNAs gegen Maf und Prdm1 verringern die Expression gegen ihre Zielgene, c-Maf und Blimp-1 beeinflussen aber nicht gegenseitig ihre Expression. TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 für 48 h aktiviert. Anschließend wurden die Zellen mit siRNAs gegen Maf (siMAF), Prdm1 (siPRDM1) und eine nicht-codierende Kontrollsequenz (siCTRL) transfiziert und über Nacht ruhen gelassen. Daraufhin wurde die mRNA isoliert und mittels Real-Time-PCR die relative Expression von Maf (schwarze Kästchen) und Prdm1 (graue Kästchen) zu Actb gemessen. Dargestellt ist die (A) relative Expression von Maf nach siMAF-Transfektion (obere Reihe, n=10-12) und von Prdm1 nach siPRDM1-Transfektion (untere Reihe, n=8-12) bzw. die (B) Expression von Maf nach siPRDM1-Transfektion (n=10-12) und von Prdm1 nach siMAF-Transfektion (n=8-12), jeweils normalisiert auf die Expression nach siCTRL-Transfektion. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Nachdem sichergestellt war, dass die Transfektion mit siRNAs gegen Maf und Prdm1 auch die Inhibition der jeweiligen mRNA-Expression bewirkte (Abb. 4.24 A), konnte untersucht werden, inwiefern sich das Ausschalten beider Transkriptionsfaktoren auf die IL-10-Produktion in IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen auswirkte. Sowohl die Transfektion mit siMAF als auch mit siPRDM1 bewirkte in allen TH-Subpopulationen eine signifikante Verringerung der IL-10-Produktion um ca. 70 % im Vergleich zu siCTRL-transfizierten TH-Zellen (Abb. 4.25 A). In keiner Subpopulation wurde jedoch die IFN-γ-Produktion beeinträchtigt. Ebenso zeigte die IL-17A-Produktion von TH17- bzw. TH1/17-Zellen keine Beeinträchtigung durch siMAF bzw. siPRDM1 (Abb. 4.25 B). Im Unterschied dazu war die Produktion von IL-4 in TH2Zellen nach der Transfektion mit siMAF und siPRDM1 um ca. 70 % verringert im Vergleich zur siCTRL-Transfektion (Abb. 4.25 B). Damit lässt sich eine Verbindung herstellen zu den bisherigen Beobachtungen, die zeigten, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 sowohl in kompletten memory TH-Zellen (Abb. 4.9) als auch in TH2-Zellen (Abb. 4.15) für eine verstärkte IL-4-Produktion verantwortlich ist. Zusammenfassend zeigten die vorliegenden Daten, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 nicht nur die Transkriptionsfaktoren c-Maf und Blimp-1 induzierte und ihre Expression mit IL-10 assoziiert ist, ERGEBNISSE 84 sondern auch dass beide Transkriptionsfaktoren in allen wesentlichen TH-Subpopulationen notwendig sind, um eine optimale IL-10-Produktion zu gewährleisten. Abb. 4.25 c-Maf und Blimp-1 sind notwendig für eine optimale IL-10-Produktion. TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 für 48 h aktiviert. Anschließend wurden die Zellen mit siRNAs gegen Maf (siMAF), Prdm1 (siPRDM1) und eine nicht-codierende Kontrollsequenz (siCTRL) transfiziert, über Nacht ruhen gelassen und für weitere 48 h mit CD3/CD28/CD2-Antikörpern beladenen MACSiBeads restimuliert. Anschließend wurde der Überstand der Zellkultur geerntet und die Konzentrationen von IL-10, IFN-γ, IL-4 und IL-17A bestimmt. Dargestellt sind die Konzentrationen von (A) IL-10 für alle TH-Zellen (n=11-12) und (B) IFN-γ für alle TH-Zellen, IL-4 für TH2-Zellen und IL-17A für TH17- und TH1/17Zellen (n=8-12) nach siMAF- (schwarze Kästchen) bzw. siPRDM1-Transfektion (graue Kästchen). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 4.6.2 BLIMP-1 UND C-MAF BEEINFLUSSEN IHRE EXPRESSION IN TH-ZELLEN NICHT GEGENSEITIG Die Kontrolle der Transfektionseffizienzen der siRNAs gegen Maf (codiert für c-Maf) und Prdm1 (codiert für Blimp-1) zeigte, dass beide siRNAs die Expression ihres jeweiligen Zielgens verringerten (Abb. 4.24 A). Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob die beiden Transkriptionsfaktoren ihre jeweilige Expression beeinflussen. Die Transfektion mit siPRDM1 bewirkte in keiner TH-Subpopulation eine signifikante Veränderung der Maf-Expression. Ebenso zeigte die siMAF-Transfektion keinen Effekt auf Prdm1 (Abb. 4.24 B). Offensichtlich nahmen die beiden Transkriptionsfaktoren c-Maf und Blimp-1 gegenseitig keinen Einfluss auf ihre Expression. ERGEBNISSE 4.6.3 85 SOWOHL DLL4 ALS AUCH IFN-α/IL-6/IL-21 BENÖTIGEN C-MAF UND BLIMP-1 FÜR DIE INDUKTION VON IL-10 Die intrazellulären Färbungen von c-Maf und Blimp-1 in kompletten memory TH-Zellen zeigten, dass DLL4 c-Maf stärker induzierte als IFN-α/IL-6/IL-21, während IFN-α/IL-6/IL-21 wiederum eine stärkere Blimp-1-Expression als DLL4 bewirkte (Abb. 4.22 A, B). Da sowohl c-Maf als auch Blimp-1 für die optimale IL-10-Produktion notwendig waren (Abb. 4.25 A), konnte man anhand dieser Daten vermuten, dass die Gesamt-IL-10-Produktion durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 zusammengesetzt wurde aus DLL4-gesteuerter c-Maf-Induktion und IFN-α/IL-6/IL-21-vermittelter Blimp-1-Induktion. Um dieser Frage nachzugehen, wurden komplette memory TH-Zellen jeweils mit DLL4 oder IFN-α/IL-6/IL-21 stimuliert und dann mit siCTRL (gegen nicht codierende Sequenz), siMAF (gegen Maf, codiert für c-Maf), siPRDM1 (gegen Prdm1, codiert für Blimp-1) oder beiden siRNAs (siMAF/PRDM1) transfiziert. Sowohl in den DLL4- als auch in den IFN-α/IL-6/IL-21-stimulierten memory TH-Zellen bewirkte die Transfektion mit siMAF und siPRDM1 eine Verringerung der IL-10-Produktion um ca. 70 % bzw. 80 % (Abb. 4.26). Zusätzlich dazu zeigte die Kombination von siMAF und siPRDM1 für DLL4- und IFN-α/IL-6/IL-21-stimulierte TH-Zellen eine weitere Verringerung der IL-10-Produktion im Vergleich zur jeweiligen einzelnen siRNA (Abb. 4.26). Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass sowohl für die DLL4- als auch für die IFN-α/IL-6/IL-21vermittelte IL-10-Produktion c-Maf und Blimp-1 notwendig waren. Abb. 4.26 DLL4 und IFN-α/IL-6/IL-21 benötigen c-Maf und Blimp-1 zur Induktion der IL-10-Produktion Komplette memory TH-Zellen wurden isoliert und mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4) oder IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) für 48 h aktiviert. Anschließend wurden die Zellen mit siRNAs gegen Maf (siMAF – schwarze Kästchen), Prdm1 (siPRDM1 – graue Kästchen), mit beiden siRNAs (siMAF/PRDM1 – schwarz/weiße Kästchen) oder mit einer siRNA gegen eine nichtcodierende Kontrollsequenz (siCTRL) transfiziert, über Nacht ruhen gelassen und für weitere 48 h mit CD3/CD28/CD2Antikörpern beladenen MACSiBeads restimuliert. Anschließend wurde der Überstand der Zellkultur geerntet und die Konzentrationen von IL-10 bestimmt (n=3). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 ERGEBNISSE 4.6.4 86 STAT3 VERMITTELT UND STAT1 INHIBIERT DIE IL-10-EXPRESSION Die IL-10-Induktion in TH-Zellen über IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 war neben der Aktivierung des NotchSignalweges abhängig von den Zytokinen IFN-α, IL-6 und IL-21 (siehe Kapitel 4.1.1 und 4.2.1). Ihre biologische Funktion üben Zytokine hauptsächlich durch die Aktivierung oder Inhibition verschiedener Zielgene aus. Dafür werden die Zytokin-Signale unter anderem über den JAK-STATSignalweg bis in den Nukleus weitergeleitet [76, 133]. IFN-α aktiviert hauptsächlich STAT1, STAT2 und STAT3 [133], während für murine TH-Zellen die Aktivierung von STAT3 bzw. STAT4 wesentlich ist für die IL-10-Expression [83-85, 88]. Gleichzeitig werden die Funktionen von IL-21 und IL-6 zum Großteil über STAT3 vermittelt [134, 135]. Hier sollte die Frage beantwortet werden, welche STAT-Moleküle in die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte Induktion von IL-10 involviert waren. In vorangegangenen unveröffentlichten Experimenten der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass in humanen naiven TH-Zellen STAT3 notwendig war für die IFN-α/DLL4-vermittelte IL-10Produktion. Das siRNA-vermittelte Ausschalten von STAT3 bewirkte eine Verringerung der IL-10+ Zellen um ca. 70 %, während das Ausschalten von STAT1 die Expression von IL-10 sogar um ca. 40 % verstärkte. Anders als in murinen TH-Zellen [83, 88] hatte STAT4 keinen Einfluss auf die Produktion von IL-10 (Abb. 4.27 A). Diese Experimente wurden durchgeführt von Dr. Andrej Mantei. Ergänzend dazu zeigten die Ergebnisse der Multiplex-Real-Time-PCR, dass Stat3 in allen TH-Zellen durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 hochreguliert wurde, während die Stat4-Expression kaum oder eher negativ beeinflusst wurde. Deutlich stärker wurden in allen TH-Subpopulationen Stat1, Stat2 und Stat5a durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 beeinflusst: Die mRNA-Expression von Stat1 und Stat2 wurde verstärkt, während Stat5a inhibiert wurde. Ähnlich wie auf Stat4 zeigte die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Modulation kaum Einfluss auf Stat6 (Abb. 4.27 B). Zusammenfassend lässt sich aus den vorliegenden Daten erkennen, dass STAT1 und STAT3 gegensätzlichen Einfluss haben auf die IL-10-Produktion, obwohl IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Expression sowohl von Stat1 als auch Stat3 induziert. 4.6.5 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 SCHAFFT DIE VORAUSSETZUNGEN ZUR BILDUNG DES ISGF3 Stat1 und Stat2 wurden durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 am stärksten in allen TH-Subpopulationen induziert (Abb. 4.27 B). Von STAT1 und STAT2 weiß man, dass sie hauptsächlich von Typ-IInterferonen wie IFN-α aktiviert werden. In der Folge können STAT1 und STAT2 zusammen mit Interferon Regulatory Factor (IRF) 9 den sogenannten Interferon-Stimulated Gene Factor (ISGF) 3 bilden, der wiederum als Transkriptionsfaktor für antivirale Gene fungiert [133]. Um zu untersuchen, ob durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Formation eines solchen Transkriptionsfaktor-Komplexes in THZellen möglich ist, wurde zudem die Irf9-Expression gemessen. ERGEBNISSE 87 Tatsächlich verdoppelt IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in allen TH-Subpopulationen die relative Expression von Irf9 (Abb. 4.27 B). Diese Beobachtung lässt vermuten, dass durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Voraussetzung zur Bildung von ISGF3 geschaffen wird. Abb. 4.27 Rolle von STAT1, STAT3 und STAT4 bei der IFN-α/DLL4-vermittelten IL-10-Induktion in humanen THZellen. (A) Naive TH-Zellen wurden ex vivo transfiziert mit siRNAs gegen Stat1 (siSTAT1), Stat3 (siSTAT3), Stat4 (siSTAT4) oder eine nicht-codierende Kontrollsequenz (siCTRL) und nach 24 h Ruhephase aktiviert in Anwesenheit von IFN-α und DLL4. Nach 120 – 168 h Zellkultur wurden die Zellen mit PMA/Ionomycin restimuliert und anschließend IL-10 intrazellulär gefärbt. Versuche wurden durchgeführt von Dr. Andrej Mantei [107]. siSTAT1 n=15, siSTAT3 n=17, siSTAT4 n=15. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001. (B) TH1-, TH2-, TH17- und TH1/17-Zellen wurden anhand ihrer Chemokinrezeptoren isoliert (Abb. 3.2) und ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) aktiviert. Nach 24 h wurde die mRNA isoliert, mittels Multiplex-Real-Time-PCR die Expression der angegebenen Gene gemessen und die durchschnittliche (n=6) relative Expressionsänderung der dargestellten Gene von TCR-only zu α/6/21/DLL4 berechnet. 4.7 ENDOGENES IL-10 BEEINFLUSST DIE IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-MODULATION Die bisherigen Daten zur Modulation von TH-Zellen konnten zeigen, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 einen regulatorischen Phänotyp in TH-Zellen induzierte, der über die Produktion von IL-10 hinaus ging und IRs, Transkriptionsfaktoren und andere immun-regulierende Proteine mit einschloss (siehe Kapitel 4.1.1, 4.1.8, 4.2.1 und 4.2.4). Da IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierte TH-Zellen große Mengen an IL-10 produzierten (Abb. 4.1 und Abb. 4.13) und bekannt war, dass IL-10 unter anderem seine eigene Produktion bzw. einen pTREG- oder TR1-Phänotyp induzieren kann [92, 136], sollte untersucht werden, inwiefern der hier beschriebene Phänotyp über IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 hinaus von endogenem IL-10 beeinflusst wird. Hierfür wurden memory TH-Zellen in An- oder Abwesenheit eines blockierenden Antikörpers gegen IL-10R mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 moduliert und anschließend die Expression verschiedener Zytokine, IRs und Transkriptionsfaktoren gemessen. Die Blockade des IL-10Rs bewirkte, dass die Produktion von IL-10 um ca. 15 % verringert wurde, während die IFN-γ− und TNF-α-Expression um ca. 5 % und die IL-2– und GM-CSF-Produktion um etwa 25 % anstieg, wenn endogenes IL-10 nicht auf die TH-Zellen wirken konnte. IL-17 blieb von dieser Blockade unbeeinflusst (Abb. 4.28 A). Endogenes IL-10 hatte ebenfalls Einfluss auf die Expression von IRs. So war die Frequenz von LAG-3/CD49b doppelt positiven Zellen um ca. 15 %, ERGEBNISSE 88 LAG-3+ Zellen um ca. 5 % und CD49b+ Zellen um ca. 15 % verringert in Anwesenheit des blockierenden IL-10R-Antikörpers. Ebenso bewirkte die IL-10-Blockade eine Abnahme der TIM3Expression auf der Zelloberfläche von memory TH-Zellen um ca. 25 %, während TIGIT und PD-1 keine Reaktion darauf zeigten (Abb. 4.28 B). Die Expression von c-Maf und NFIL3 wurde signifikant um ca. 5 % bzw. 10 % verringert, wenn IL-10 nicht auf die TH-Zellen wirken konnte. Für Blimp-1 und IKZF3 war eine ähnliche Tendenz zu erkennen, jedoch war dieser Effekt nicht statistisch signifikant (Abb. 4.28 C). Die verstärkte Produktion von inflammatorischen Zytokinen, bzw. die Abnahme der Expression von IL-10 selber, von IRs und von regulatorischen Transkriptionsfaktoren in Abwesenheit von IL-10 zeigten, dass IL-10 einen direkten Einfluss hatte auf den regulatorischen Phänotyp von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH-Zellen. Offenbar konnte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 den regulatorischen Phänotyp von TH-Zellen sowohl direkt beeinflussen als auch mit einem autokrinen Feedback-Mechanismus indirekt weiter verstärken über die IL-10-Produktion. Abb. 4.28 Endogenes IL-10 beeinflusst den IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten regulatorischen Phänotyp von memory TH-Zellen. Komplette memory TH-Zellen wurden mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 aktiviert, in An- (αIL-10R) oder Abwesenheit (ohne) eines blockierenden Antikörpers gegen den IL-10R. (A) Nach 120 h Zellkultur, 24 h Ruhephase und anschließender PMA/Ionomycin-Restimulation wurden die Zytokine IL-10 (n=11), IFN-γ (n=11), IL-2 (n=7) TNF-α (n=11), GM-CSF (n=11) und IL-17 (n=7) intrazellulär gefärbt und durchflusszytometrisch gemessen. (B) Nach 48 h wurden die Oberflächenrezeptoren LAG-3 (n=11), CD49b (n=11), TIM3 (n=11), TIGIT (n=8), PD-1 (n=7) und die LAG-3/CD49b CoExpression (n=11) gefärbt und durchflusszytometrisch gemessen. (C) Nach 48 h wurden die Transkriptionsfaktoren c-Maf (n=8), NFIL3 (n=8), Blimp-1 (n=4) und IKZF3 (n=4) intranukleär gefärbt und durchflusszytometrisch gemessen. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 ERGEBNISSE 89 4.8 IL-10-INDUKTION IN PERIPHEREN TH-ZELLEN VON CED-PATIENTEN Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) wie Colitis ulcerosa (CU) oder Morbus Crohn (MC) leiden die Patienten an einer chronischen, wiederkehrenden Entzündung des Gastrointestinaltraktes (GIT). Zahlreiche Studien hierzu legen dar, dass Zytokine eine entscheidende Rolle in diesem Krankheitsbild spielen. CED-Patienten weisen ein Ungleichgewicht von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen auf, das verhindert, dass die Entzündung kontrolliert werden kann und für ein Andauern der Inflammation sorgt. Die Folge hiervon ist die Zerstörung von Gewebe im GIT [137]. Beispielsweise ist die Produktion von inflammatorischen Zytokinen wie IFN-γ [138, 139] und IL-17A [140-142] in CD4+ TH-Zellen der Lamina propria von CED-Patienten erhöht. Auf der antiinflammatorischen Seite spielt IL-10 eine wesentliche Rolle in der Pathogenese von CED: Einzelnukleotid-Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) im Il10-Gen sind assoziiert mit der Anfälligkeit für CU [143]. Außerdem konnte in Patienten mit sehr früh einsetzender CED Funktionsverlustmutationen für IL-10 oder IL-10R identifiziert werden [41]. Darüber hinaus steigt die Konzentration von IL-10 im Serum von CED-Patienten in den Phasen der Verbesserung des Krankheitsverlaufes an [144]. Obwohl die systemische Behandlung mit IL-10 bisher keine oder nur moderate Effekte auf die Verbesserung von CED-Symptomen zeigte [145, 146], gibt es weitere vielversprechende zellbasierte Ansätze, um das anti-inflammatorische Potential von IL-10 für die Behandlung von CED zu nutzen [147, 148]. Der offensichtliche Zusammenhang zwischen einem Ungleichgewicht von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen – speziell die Bedeutung von IL-10 – und der Pathogenese von CED-Patienten, warfen die Frage auf, ob die IFN-α/IL-6/IL21/DLL4-vermittelte Induktion von IL-10 bzw. mögliche Defekte dieses IL-10- Induktionsmechanismus in CED-Patienten zum Zytokin-Ungleichgewicht in CED-Patienten beitragen. 4.8.1 BEEINTRÄCHTIGTE IL-10-EXPRESSION IN CED-TH-ZELLEN In den vorhergegangenen Versuchen der vorliegenden Arbeit wurde die Stimulation von TH-Zellen mit einer Kombination aus den Zytokinen IFN-α, IL-6, IL-21 und dem Notch-Liganden DLL4 als ein sehr potenter Mechanismus identifiziert, um die IL-10- in konventionellen TH-Zellen massiv zu verstärken (Abb. 4.1, Abb. 4.13). Interessanterweise sind zusätzlich zu den CED-assoziierten Mutationen und Polymorphismen im Il10- und den Il10ra- bzw. Il10rb-Genen [41, 143] ebenfalls SNPs im IFN-αRezeptor-Gen (Ifnar) [149] assoziiert mit CED. Darüber hinaus beschreiben Giles et al., dass womöglich ein fehlerhafter Typ-I-Interferon-Signalweg in Zellen des Colons für eine gestörte IL-10Regulation verantwortlich sein könnte [78]. Zusätzlich dazu konnte eine kleine Kohorte CU-Patienten erfolgreich mit dem CpG-Motiv-enthaltenen Wirkstoff DIMS0150 behandelt werden, der seine Funktion möglicherweise durch die Induktion von Typ-I-Interferonen vermittelt [137, 147]. Da IFN-α einen wesentlichen Bestandteil der IL-10-Induktion über IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 darstellte (siehe Kapitel 4.1.1), führte dies zu der Annahme, dass die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10Induktion in CED-Patienten beeinträchtig sein könnte. Um dies zu untersuchen, wurden memory TH- ERGEBNISSE 90 Zellen von CED-Patienten (CU n=9, MC n=11) und gesunden Spendern (n=19) isoliert und mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 moduliert. Anschließend wurde die Expression von IL-10 und anderer inflammatorischer Zytokine intrazellulär gemessen. Unabhängig vom anwesenden Stimulus, wiesen die memory TH-Zellen der CED-Patienten mindestens 25 % weniger IL-10+ Zellen auf als die der gesunden Spender (Abb. 4.29 A, B). Hierbei steigerte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in gesunden Spendern die Frequenz IL-10+ Zellen um das 7-fache, in CEDPatienten aber um das 10-fache (Abb. 4.29 B). Anhand der Medikation der Patienten (siehe Kapitel 3.1.13) konnten keine Rückschlüsse auf die IL-10-Induktion nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation gezogen werden. Der Durchschnitt bei allen CED-Patienten lag bei einer ca. 12-fachen Induktion IL-10+ TH-Zellen durch die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation. Maximal konnte hier IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Frequenz der IL-10+ Zellen in CED-Patienten um das 19-fache steigern, mindestens um das 5-fache. Die 19-fache Steigerung der IL-10+ Zellen wurde in dem einen Patienten gemessen, der keine Medikation bekam, die 5-fache Induktion wurde in einem Infliximab-behandelten Patienten gemessen. Innerhalb der Infliximab-behandelten Patienten schwankte die IL-10-Induktion von 5-fach bis 18-fach und auch innerhalb der Azathioprin/Infliximab-behandelten Patienten wurden beispielsweise 5-fache bis 14-fache Induktionen nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation gemessen. ERGEBNISSE 91 Abb. 4.29 Periphere memory TH-Zellen von CED-Patienten weisen ein verstärkt inflammatorisches Zytokinprofil auf. Memory TH-Zellen von gesunden Spendern (gesund, n=19) und CED-Patienten (CED, MC n=11 und CU n=9) wurden ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) , mit Notch-Ligand DLL4 (DLL4), mit IFN-α/IL-6/IL-21 (α/6/21) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) für 120 h aktiviert. Nach weiteren 24 h Ruhephase und PMA/IonomycinRestimulation wurde IL-10, IFN-γ, IL-17A, IL-22, GM-CSF und TNF-α intrazellulär gefärbt. (A) Repräsentativer Dotplot für die intrazelluläre Färbung von IL-10, IFN-γ und IL-17A in gesunden Spendern und CED-Patienten. (B) IL-10-Produktion in TCR-only-, DLL4-, α/6/21- und α/6/21/DLL4-stimulierten memory TH-Zellen von gesunden Spendern und CED-Patienten. (C) Produktion der angegebenen Zytokine in TCR-only- und α/6/21/DLL4-stimulierten memory TH-Zellen von gesunden Spendern und CED-Patienten. (D) Vergleich der IL-10-Produktion von IFN-γ+ (TH1), IL-17A+ (TH17) und IFN-γ/IL-17A+ Zellen (TH1/17) nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation zwischen gesunden Spendern und CED-Patienten. * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 Da CED-Patienten weniger IL-10 exprimierten (Abb. 4.29 A, B) und CED-Patienten auch über IL-10 hinaus ein Ungleichgewicht von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen aufweisen [137-141], sollte ermittelt werden, inwiefern sich ihre memory TH-Zellen in ihrem inflammatorischen Zytokinprofil von gesunden Spendern unterscheiden. ERGEBNISSE 92 Die Messung der Zytokinexpression ergab bei CED-Patienten, sowohl unter TCR-only- als auch unter IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Bedingungen einen höheren Prozentsatz IL-17A+, IFN-γ/IL-17A+, IL-22+ und GM-CSF+ memory TH-Zellen. TNF-α zeigte diesen signifikanten Unterschied nur bei TCR-onlyStimulation und IFN-γ wies keinerlei Unterschiede zwischen CED und gesunden Spendern auf (Abb. 4.29 A, C). Zusammenfassend zeigten die Daten, dass periphere memory TH-Zellen von CED-Patienten weniger IL-10 exprimierten bei gleichzeitig verstärkter Expression von inflammatorischen Zytokinen. 4.8.2 GERINGERE IL-10-PRODUKTION VON TH17- UND TH1/17-ZELLEN IN CED-PATIENTEN Für TH1/17-Zellen ist bereits bekannt, dass sie in diversen Autoimmunerkrankungen wie MC [24], MS [26] und JIA [25] eine pathologische Rolle einnehmen. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit bereits gezeigt werden, dass TH1/17-Zellen einen inflammatorischeren Phänotyp besitzen als TH1- oder TH17Zellen: Die Effektorzytokin-produzierenden Zellen der TH1/17-Subpopulation (IFN-γ+, IL-17A+, IFN-γ+IL-17A+) produzierten signifikant weniger IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermitteltes IL-10 als IFN-γ+ TH1-Zellen bzw. IL-17A+ TH17-Zellen (Abb. 4.14 B). Daher sollte untersucht werden, inwiefern TH1-, TH17 und TH1/17-Zellen beteiligt sind an dem verstärkt inflammatorischen Zytokinprofil von CED-Patienten (Abb. 4.29 A, B, C). Hierzu wurde die IL-10-Produktion innerhalb der IFN-γ+ (TH1), IL-17A+ (TH17) und IFN-γ+IL-17A+ (TH1/17) memory TH-Zellen bestimmt. Während sich für TH1-Zellen kein signifikanter Unterschied in der IL-10-Produktion zwischen CEDPatienten und gesunden Spendern ergab, zeigten sowohl TH17- als auch TH1/17-Zellen der CEDPatienten eine signifikant geringere IL-10-Expression in CED-Patienten, verglichen mit den gesunden Spendern (Abb. 4.29 D). 4.8.3 BEEINTRÄCHTIGTE BLIMP-1-EXPRESSION IN CED-TH-ZELLEN Bisher konnte gezeigt werden, dass die IL-10-Produktion in CED-Patienten beeinträchtigt ist (Abb. 4.29 A, B). Darüber hinaus war die Frequenz von TH17- und TH1/17-Zellen in CED-Patienten erhöht, die gleichzeitig weniger IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermitteltes IL-10 produzieren konnten als die TH17und TH1/17-Zellen in gesunden Spendern (Abb. 4.29 A, C, D). Eine Vermutung war, dass hierfür transkriptionelle Beeinträchtigungen in CED-Patienten der Grund waren. Wie hier gezeigt, sind c-Maf und Blimp-1 notwendig für die IL-10-Produktion in allen TH-Subpopulationen (Abb. 4.25). Zudem sind SNPs im Prdm1-Gen (codiert für Blimp-1) assoziiert mit der Anfälligkeit für CU [150]. Daher sollte untersucht werden, ob es Unterschiede in der Expression von c-Maf bzw. Blimp-1 gibt zwischen CED-Patienten und gesunden Spendern. Unter den kompletten memory TH-Zellen ergab sich kein signifikanter Unterschied in der Expression zwischen CED-Patienten und gesunden Spendern, weder von c-Maf noch von Blimp-1 (Abb. 4.30 A). ERGEBNISSE 93 Das gleiche Bild ergab sich bei der Messung von c-Maf+ Zellen, innerhalb der IL-10+ Zellen bzw. der TH1-, TH17- oder TH1/17-Zellen. Weder in Anwesenheit von TCR-only, noch von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 gab es einen signifikanten Unterschied in der c-Maf-Expression. Im Gegensatz dazu Blimp-1: Sobald IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 anwesend war, zeigten sich signifikant weniger Blimp-1+ Zellen innerhalb der IL-10+ Zellen bzw. der TH1-, TH17- und TH1/17-Zellen. Für die TH1/17-Zellen war dieser Effekt auch schon bei der TCR-only-Stimulation zu sehen (Abb. 4.30 B). Diese Daten weisen darauf hin, dass die reduzierte Fähigkeit Blimp-1 zu exprimieren, ursächlich an der verringerten IL-10-Produktion und dem verstärkten inflammatorischen Zytokinprofil von TH1-, Th17- und TH1/17-Zellen in CED-Patienten beteiligt ist. Abb. 4.30 Blimp-1 und c-Maf-Expression in Effektorzytokin-produzierenden, IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten memory TH-Zellen von CED-Patienten und gesunden Kontrollen. Memory TH-Zellen von gesunden Spendern (gesund, n=13) und CED-Patienten (CED, MC n=9 und CU n=4) wurden ohne Zytokin- oder Notch-Stimulus (TCR-only) oder mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 (α/6/21/DLL4) für 48 h aktiviert. Nach PMA/Ionomycin-Restimulation wurde IL-10, IFN-γ, IL-17A, c-Maf und Blimp-1 intrazellulär gefärbt. (A) Produktion von c-Maf und Blimp-1 in TCR-only- und α/6/21/DLL4-stimulierten kompletten memory TH-Zellen von gesunden Spendern und CED-Patienten. (B) Produktion von c-Maf (obere Reihe) und Blimp-1 (untere Reihe) in TCR-only- und α/6/21/DLL4stimulierten IL-10+, IFN-γ+ (TH1), IL-17A+ (TH17) und IFN-γ+IL-17A+ Zellen (TH1/17). * p < 0,05; ** p < 0,005; *** p < 0,001 DISKUSSION 94 5 DISKUSSION DISKUSSION 95 5.1 DIE OPTIMIERUNG DER IL-10-INDUKTION IN HUMANEN TH-ZELLEN DURCH IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 Die Fähigkeit der IL-10-Produktion ist grundlegend für die Kontrolle von Entzündungsreaktionen. Von TH1-, TH2- und TH17-Zellen ist bekannt, dass die Produktion von IL-10 wesentlich für die Regulation der jeweils vermittelten Immunantworten ist, um so den Körper vor Immunpathologien zu schützen. Hierfür gibt es zahlreiche Beispiele für IL-10 produzierende TH1-, TH2- und TH17-Zellen in murinen Krankheitsmodellen [37]. Humane IFN-γ/IL-10-produzierende TH1-Zellen konnten isoliert werden aus Patienten, die mit Mycobacterium tuberculosis [151, 152] und Leishmania donovani infiziert waren [153]. Erfolgreiche Behandlungen von Pollen- oder Hausstaub-Allergikern mit einer spezifischen Immuntherapie (SIT) korrelieren mit der Induktion von IL-10+ Allergen-spezifischen THZellen [154, 155]. In Übereinstimmung dazu limitiert IL-10 TH2-vermittelte Immunantworten unter anderem durch die Inhibition der IL-4-Produktion und die Entwicklung von naiven TH-Zellen zu TH2Zellen [156, 157]. In Patienten, die an dem autoinflammatorischen Cryopyrin-assoziierten periodischen Syndrom (CAPS) leiden, ist die IL-1β-Produktion massiv erhöht. In diesen Patienten findet man deutlich weniger IL-10+ TH17-Zellen als in gesunden Spendern [158], wohingegen die in vitro Blockade von IL-1β die Fähigkeit zur IL-10-Produktion wiederherstellen kann [159]. Darüber hinaus weiß man von Autoimmunkrankheiten wie RA [57] und MS [58], dass die CD46-vermittelte IL-10-Induktion in TH-Zellen beeinträchtigt ist (siehe auch 1.7.3) Die Fähigkeit IL-10 zusammen mit den jeweiligen Effektorzytokine zu produzieren, beschreibt in diesen Krankheitsbildern und -modellen den Schutz vor Immunpathologien. Welche Stimuli notwendig sind, um diese IL-10-Co-Produktion zu ermöglichen, wurde jedoch nicht eingehend untersucht. In dieser Arbeit wurden die Stimuli IFN-α, IL-6, IL-21 und DLL4 verwendet, um herauszufinden, ob sie einen generellen Mechanismus zur IL-10-Induktion und damit zur potentiellen Selbstregulation in humanen TH-Zellen darstellen. Die Fähigkeit von humanem IFN-α, IL-10 zu induzieren, ist ausführlich beschrieben. Die Daten hierzu reichen von kompletten PBMC [62, 67], über komplette CD4+ TH-Zellen [56, 62, 64, 66] bis hin zu naiven TH-Zellen [63, 65, 68] und memory TH-Subpopulationen [66]. Über eine direkte Wirkung von IFN-α auf IL-10 hinaus kann IFN-α außerdem IL-21 induzieren [160], welches in humanen memory TH-Zellen [69], TH-Zellen aus Nabelschnurblut und in CD4+ TH-Zellen aus adultem peripheren Blut die Produktion von IL-10 bewirken kann [70]. Die Rolle von IL-21 für die IL-10-Produktion wird zudem durch Daten aus murinen TH-Zellen untermauert [85]. Die Fähigkeit von IL-6 IL-10 in humanen Zellen zu induzieren, ist für naive TH-Zellen unter TH2-induzierenden Bedingungen beschrieben. Darüber hinaus kann IL-6 die ICOS-induzierte IL-10-Expression in naiven TH-Zellen unter TH2- und TH1-induzierenden Bedingungen verstärken [68]. Außerdem weiß man, dass IL-6 die IL-21-Expression in humanen CD4+ TH-Zellen bewirken kann [69, 161]. Die Haupterkenntnisse zu IL-6 als IL-10-Induktor stammen jedoch aus murinen TH-Zellen [84, 85]. DISKUSSION 96 Der Einfluss des Notch-Signalweges auf die IL-10-Produktion ist nahezu komplett auf Versuche mit murinen TH-Zellen beschränkt, die zeigen, dass eine Überexpression der NIZD bzw. die Stimulation mit dem Notch-Liganden DLL4 mit rekombinantem IL-12 oder IL-27 zur Induktion von IL-10 in murinen TH1-Zellen führt [82, 83, 105, 106]. Lediglich Versuche mit NIZD-transfizierten humanen CD4+ TH-Zellen [162] und unveröffentlichte Daten aus der eigenen Arbeitsgruppe mit naiven THZellen [107, 108] konnten zeigen, dass der Notch-Signalweg einen positiven Einfluss hat auf die IL-10-Produktion in humanen TH-Zellen. Die Stimulation von naiven TH-Zellen, kompletten memory TH-Zellen und der wesentlichen THSubpopulationen TH1, TH2, TH17 und TH1/17 mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 zeigte, dass eine massive IL-10-Induktion in allen diesen TH-Zellen möglich war. Die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation induzierte durchschnittlich ca. 15 % IL-10+ naive TH-Zellen, die im Mittel etwa 6 ng/ml IL-10 produzierten. Die bisherigen, vergleichbaren Studien zur IL-10-Induktion in humanen naiven THZellen zeigen Werte von 2,5 – 5 ng/ml IL-10 im Zellkulturüberstand durch Typ-I-Interferone [63, 77] bzw. maximal 2 ng/ml IL-10 durch IL-6- oder IL-21-Stimulation [68-70]. Intrazelluläre Färbungen ergaben maximal 8 % IL-10+ naive TH-Zellen nach Stimulation mit IFN-α, IL-6 oder IL-21 unter vergleichbaren Bedingungen [65, 68]. IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 konnte die Produktion von durchschnittlich ca. 10 ng/ml in kompletten memory TH-Zellen bzw. 6 ng/ml in TH1- und TH17- oder 7 ng/ml in TH2-Zellen induzieren. Die bisher einzige Studie zur IFN-α-vermittelten Induktion von IL-10 in humanen memory TH-Zellen zeigte durchschnittlich maximal 2 ng/ml IL-10 in den Zellkulturüberständen von TH1-, TH2- bzw. TH17-Zellen [66]. Ebenso übertreffen die hier erzielten Werte an produziertem IL-10 durch die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die maximal 200 ng/ml IL-10 im Zellkulturüberstand von Notch-modulierten kompletten CD4+ TH-Zellen [162]. Die Kombination aller drei Zytokine und vor allem die zusätzliche Stimulation des Notch-Signalweges bewirkte eine deutliche Verstärkung der Effekte von IFN-α, IL-6, IL-21 oder DLL4 alleine und sorgte dafür, dass IL-10 stärker in naiven und memory TH-Zellen produziert wurde als in den bisher bekannten Studien. Offensichtlich ist daher die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation eine optimierte Methode zur IL-10-Induktion in humanen TH-Zellen – in naiven und allen wesentlichen memory THZellen. Darüber hinaus zeigte der Vergleich von Effektorzytokin-produzierenden und -nicht-produzierenden TH-Subpopulationen, dass die IL-10-Induktion von der der Effektorzytokinproduktion entkoppelt war. Dies steht im Gegensatz zu Daten aus den hier referenzierten humanen Krankheitsbildern bzw. murinen Krankheitsmodellen, wo die Co-Produktion von inflammatorischen Effektorzytokinen und IL-10 einen Schutz vor Immunpathologien beschreibt. Somit stellt IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 eine generelle Möglichkeit IL-10 zu induzieren dar, die zeigt, dass dies prinzipiell in allen THSubpopulationen möglich ist, unabhängig von der Effektorzytokin-Produktion. DISKUSSION 97 Gleichzeitig kann IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 inflammatorische Zytokine wie IFN-γ und IL-4 schwach induzieren, hat keinen Einfluss auf IL-17 und TNF-α und inhibiert nur IL-2 und GM-CSF leicht. Daher scheint es, als wäre die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation kein Mechanismus zur Induktion eines professionellen regulatorischen Phänotyps in TH-Zellen. Vielmehr bestärken diese Beobachtungen die Annahme, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 selektiv die IL-10-Produktion induziert, während andere Zytokin-basierte Effektorfunktionen weitestgehend unbeeinflusst bleiben. 5.2 IFN-α MUSS MIT WEITEREN STIMULI KOMBINIERT WERDEN, UM IL-10 ZU INDUZIEREN Obwohl es hier nicht statistisch signifikant gezeigt werden konnte, lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, dass IFN-α einen wesentlichen Bestandteil der IL-10-Induktion darstellt. Sowohl in naiven als auch in memory TH-Zellen induziert IFN-α/DLL4 höhere Frequenzen IL-10+ Zellen als IL-6/DLL4 oder IL-21/DLL4. Dadurch ergänzt diese Arbeit die bisher bekannten Daten zu IFN-α als IL-10Induktor, da gezeigt werden konnte, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 übergreifend sowohl in naiven THZellen als auch in allen wesentlichen TH-Subpopulationen IL-10 induzieren kann. Touzot et al. zeigten sogar bereits, dass IFN-α in TH1-, TH2 und TH17-Zellen IL-10 induzieren kann. Jedoch wurden in dieser Studie die TH-Zellen zuvor mit IL-7 und IL-15 vor-kultiviert [66]. Unveröffentlichte Vorversuche zu dieser Arbeit und Literaturdaten zeigen allerdings, dass sowohl IL-7 [163] als auch IL-15 [164] die Produktion von IL-10 in humanen TH-Zellen verstärken. Somit ist nicht eindeutig geklärt, inwiefern IFN-α alleine für die IL-10-Produktion in den TH-Subpopulationen verantwortlich ist. Offensichtlich spielt die Kombination mit weiteren Stimuli – in dieser Arbeit IL-6, IL-21 und DLL4 – eine wesentliche Rolle bei der IFN-α-vermittelten IL-10-Induktion in humanen TH-Zellen. In den hier durchgeführten Versuchen wurden naive und memory TH-Zellen und auch die TH-Subpopulation sehr rein (<1% Kontamination) mittels FACS isoliert und anschließend APC-frei mit MACSiBeads und rekombinanten Zytokinen aktiviert und stimuliert. Hier zeigte die Stimulation mit IFN-α alleine in THZellen eine verhältnismäßig schwache IL-10-Induktion (ca. 8 % IL-10+ naive TH-Zellen [65, 68] vs. ∅4,6 % IL-10+ memory und ∅0,6 % IL-10+ naive TH-Zellen) und sowohl in naiven als auch in memory TH-Zellen bewirkte erst die Anwesenheit von rekombinantem IL-6 und IL-21 spenderübergreifend eine stabile IL-10-Produktion – noch weiter verstärkt durch DLL4. In den bisher veröffentlichten Daten zur IFN-α-vermittelten IL-10-Expression in humanen TH-Zellen wurden die TH-Zellen entweder mit APC kultiviert [56, 65, 67, 68], mit Kontaminationen in den sortierten TH-Zell-Fraktionen von 1-10 % sortiert [56, 62-64, 67] oder mit weiteren IL-10-induzierenden Stimuli wie IL-7, IL-15 oder CD46 stimuliert [56, 65, 66]. IL-6 und DLL4 können von APC exprimiert werden. Diese Arbeit und Daten aus der Literatur konnten zeigen, dass sowohl IL-6 als auch DLL4 direkt und indirekt über die Induktion von IL-21 in DISKUSSION 98 naiven TH-Zellen die IL-10-Expression verstärken [68, 69, 161]. Die Co-Kultur von TH-Zellen mit APC und eventuelle Kontaminationen mit APC schließen daher nicht aus, dass der vermeintliche Effekt von IFN-α auf naive TH-Zellen durch kontaminierendes IL-6 und/oder DLL4 verstärkt wurde. Zusammenfassend weist das darauf hin, dass die IFN-α-vermittelte IL-10-Produktion in humanen THZellen synergistisch mit weiteren Stimuli wie IL-6, IL-21 und DLL4 wirken muss, um IL-10 zu induzieren (Abb. 5.1). 5.3 DIE ROLLE VON AUTOKRINEM IL-21 BEI DER INDUKTION VON IL-10 Naive und memory TH-Zellen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, IL-21 zu exprimieren. TCM und TEM können bereits nach TCR-Aktivierung IL-21 produzieren und scheinen ein IL-21-Gedächtnis zu besitzen, ebenso komplette CD45RA+ naive TH-Zellen. CD31+ naive TH-Zellen sind nicht in der Lage, IL-21 zu exprimieren [69]. Komplette CD45RA+ TH-Zellen setzen sich zusammen aus CD31+ und CD31− Zellen. CD31− sind ebenfalls naive TH-Zellen, die allerdings durch homöostatische Proliferation bereits in der Peripherie expandiert sind (siehe Kapitel 1.3.1) [11]. Zytokine wie IFN-α, IL-6 oder IL-21 selbst sind in der Lage IL-21 in humanen TH-Zellen zu induzieren [69, 116, 160, 161]. IL-21 kann sowohl in murinen als auch in humanen TH-Zellen die IL-10-Produktion induzieren [69, 70, 85]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IL-21 selber zwar wenig IL-10 induziert, aber gleichzeitig ein wesentlicher Bestandteil der synergistischen IL-10-Induktion durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 ist (Abb. 5.1). Außerdem konnte bestätigt werden, dass naive TH-Zellen kein IL-21 produzieren, memory TH-Zellen hingegen schon. IL-21 induzierte seine eigene Expression in naiven TH-Zellen und auch DLL4, IL-6 und IFN-α bewirkten die IL-21-Produktion (Abb. 5.1), wohingegen IFN-α, IL-6 und IL-21 die IL-21-Expression von memory TH-Zellen geringfügig verringerten. DLL4 hatte keinen Einfluss auf die IL-21-Expression von memory TH-Zellen. Beim Vergleich von CD31+ und CD31− naiven TH-Zellen mit TCM, TEM und TEMRA war zu sehen, dass die CD31+ naiven TH-Zellen nach DLL4-Stimulation kaum IL-10 produzierten, CD31−, TCM, TEM und TEMRA hingegen große Mengen. Da hier gezeigt werden konnte, dass die Blockade von endogenem IL-21 in naiven und memory TH-Zellen die IL-10-Expression verringert, könnte autokrines IL-21 eine Erklärung für das unterschiedliche Ansprechverhalten auf den DLL4-Stimulus sein (Abb. 5.1). Autokrin produziertes IL-21 könnte hier also die IL-10-induzierenden Effekte von DLL4 verstärken und für die starke IL-10-Produktion in CD31−, TCM und TEM sorgen, wohingegen CD31+ naiven THZellen dieser zusätzliche Stimulus fehlt. Obwohl hier gezeigt werden konnte, dass DLL4 IL-21 in CD31+ naiven TH-Zellen induzieren konnte, ist es möglich, dass die DLL4-vermittelte IL-21-Induktion zu lange dauert, um die IL-10-Produktion zu verstärken. Memory TH-Zellen, bzw. CD31− naive THZellen hingegen sind durch ihr IL-21-Gedächtnis in der Lage, IL-21 direkt nach TCR-Aktivierung zu produzieren und so die autokrinen IL-10-induzierenden Effekte auszunutzen. Ob TEMRA IL-21 produzieren können ist nicht bekannt, jedoch ist davon auszugehen, da man von anderen terminal DISKUSSION 99 differenzierten TH-Zell-Subpopulationen weiß, dass sie IL-21 produzieren können [165]. Um diese Frage im Detail zu klären, müsste die IL-21-Produktion – auch von TEMRA – in Abhängigkeit der Zeit für die unterschiedlichen TH-Zellen untersucht werden. Bei der Untersuchung der IL-10-Expressions-Kinetiken sah man, dass memory TH-Zellen bereits nach 24 h, naive TH-Zellen erst nach 48 h Il10-mRNA exprimieren. Caprioli et al. schlagen vor, dass autokrines IL-21 durch den feedback-Mechanismus die IL-21-vermittelten Effekte in TH-Zellen stabilisieren und verstärken [116]. So wäre es möglich, dass memory TH-Zellen bereits in vivo durch das eigene IL-21 auf die IL-10-Produktion vorbereitet (geprimed) wurden und sie dadurch in vitro schneller als naive TH-Zellen auf den IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus reagieren und IL-10 produzieren. 5.4 DIE ROLLE DES NOTCH-SIGNALWEGES BEI DER SYNERGISTISCHEN INDUKTION VON IL-10 Die Stimulation des Notch-Signalweges über seinen Liganden DLL4 beeinflusst offensichtlich die IL10-Induktion in humanen TH-Zellen: Während DLL4 ohne weitere Stimuli die IL-10-Expression nur geringfügig erhöhte, konnte es den Einfluss von IFN-α, IL-6, IL-21 oder IFN-α/IL-6/IL-21 auf die IL10-Induktion in naiven und memory TH-Zellen synergistisch verstärken. Weiterhin konnte hier gezeigt werden, dass DLL4 die Expression von IL-21 induziert, dass STAT3 notwendig war für die IFNα/DLL4-, IL-6/DLL4- und für die IL-21/DLL4-vermittelte Expression von IL-10 und dass die Anwesenheit von DLL4 die Expression von Hes1 induziert. DLL4 könnte also in Abwesenheit von rekombinantem IL-21 zur synergistischen IL-10-Induktion durch IFN-α/DLL4 oder IL-6/DLL4 beitragen indem es die Expression von IL-10-induzierendem IL21 verstärkt. Da außerdem bekannt ist, dass die Interaktion von HES1 mit JAK2 und STAT3 die Phosphorylierung von STAT3 verstärkt [166], wäre es möglich, dass Notch/DLL4 die IL-10-Induktion in Anwesenheit von rekombinantem IL-21 (IL-21/DLL4 oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4) über eine synergistisch-verstärkte STAT3-Aktivierung steigert (siehe Kapitel 5.6.3 und Abb. 5.1). Eine weitere theoretische Möglichkeit für DLL4 die IL-10-Expression synergistisch zu verstärken ist der Phosphoinositid-3-Kinasen (PI3K)/Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3)-Signalweg. Sowohl von PI3K [167] als auch von GSK3 [120, 168] weiß man, dass sie an der IL-10-Produktion in T-Zellen beteiligt sind. In einem möglichen Modell inhibiert die aktiverte, de-phosphorylierte GSK3 die IL-10Expression, während PI3K die GSK3 durch Phosphorylierung inaktivieren können und so die IL-10Expression ermöglichen [169-171]. PI3K bilden hier die mögliche Schnittstelle bei der synergistischen IL-10-Induktion durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4: Man weiß von IFN-α [172], IL-6 [173] und IL-21 [135], dass sie PI3K aktiveren können. Und ebenso ist für Notch bzw. DLL4 bekannt, dass es γ-Sekretase-unabhängig (siehe Kapitel 1.10.1) die Aktivität von PI3K erhöhen kann [170, 174]. Möglicherweise könnte also die IFN-α-, IL-6-, IL-21- oder IFN-α/IL-6/IL-21-vermittelte Aktivierung DISKUSSION 100 von PI3K durch DLL4 synergistisch verstärkt werden, was dann in der Folge zu einer gesteigerten GSK3-Inhibition und dadurch zur erhöhten IL-10-Expression führen würde (Abb. 5.1). Da auch nach dem siRNA-vermittelten Ausschalten von c-Maf und Blimp-1 (siehe Kapitel 5.6.1) die IL-10 nicht vollständig inhibiert wurde, stellt der PI3K/GSK3-Signalweg eine Alternative zur IL-10Induktion via STAT3/c-Maf/Blimp-1 dar, bei der IFN-α, IL-6, IL-21 und DLL4 synergistisch zur IL-10-Expression beitragen könnten. Die tatsächliche Rolle von PI3K/GSK3 bei der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten Induktion von IL-10 muss aber in weiterführenden Versuchen überprüft werden. Abb. 5.1 Modell zur synergistischen Induktion von IL-10 in humanen TH-Zellen. 5.5 DIE UNTERSCHIEDLICH STARKE IL-10-EXPRESSION ZWISCHEN TH-SUBPOPULATIONEN Naive TH-Zellen produzierten weniger IL-10 und die IL-10-Expression startete später. Ebenso exprimierten TH1/17-Zellen weniger IL-10 als TH1- bzw. TH17-Zellen. Ein Grund hierfür könnte die unterschiedliche Fähigkeit IL-21 zu produzieren sein (siehe Kapitel 5.3). Aber darüber hinaus gibt es weitere Möglichkeiten, warum diese TH-Subpopulationen unterschiedlich auf die IFN-α/IL-6/IL21/DLL4-Modulation reagieren. Vom IFN-αR [175], IL-6R, IL-21R [176] und den verschiedenen Notch-Rezeptoren [177] weiß man, dass sie je nach T-Zell-Phänotyp oder -Differenzierung unterschiedliche stark exprimiert werden können. Da alle Komponenten der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Modulation benötigt wurden für die IL-10-Expression, ist davon auszugehen, dass eine unterschiedlich starke Expression der Rezeptoren das Ansprechverhalten auf die Modulation beeinflusst. Eine verringerte Expression von IFN-αR, IL-6R, IL-21R oder der Notch-Rezeptoren könnte daher ein Grund dafür sein, warum naive TH-Zellen später bzw. weniger IL-10 produzieren. Da IL-6R, IL-21R und die Notch-Rezeptoren auch innerhalb der TH-Subpopulationen unterschiedlich stark exprimiert sind, wäre eine beeinträchtigte Rezeptor-Expression auch eine Erklärung für die verringerte IL-10Expression von TH1/17-Zellen. Um diese Fragen zu beantworten, müsste in weiterführenden Versuchen geklärt werden, inwiefern sich naive TH-Zellen und die unterschiedlichen TH-Subpopulationen bezüglich der Expression der verschiedenen Rezeptoren unterscheiden. DISKUSSION 101 5.6 DIE TRANSKRIPTIONELLE REGULATION DER IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4VERMITTELTEN IL-10-EXPRESSION 5.6.1 DIE TRANSKRIPTIONELLE ROLLE VON C-MAF UND BLIMP-1 Eine wesentliche Aufgabe dieser Arbeit bestand darin zu klären, welche Transkriptionsfaktoren an der IL-10-Expression in humanen TH-Zellen beteiligt sind. Die transkriptionelle Kontrolle von IL-10 in murinen TH-Zellen ist – unter anderem durch Arbeiten der eigenen Arbeitsgruppe – bisher recht gut untersucht (Abb. 5.2). So weiß man, dass in TH1-Zellen die Transkriptionsfaktoren Blimp-1 und c-Maf an der Produktion von IL-10 beteiligt sind. Wobei ohne c-Maf noch IL-10 produziert werden kann, Blimp-1 aber wesentlich ist für die IL-10-Expression [82]. Murine TH2-Zellen benötigen für die Expression von IL-10 STAT6 und GATA3 [89] und TH17-Zellen sind angewiesen auf die Expression von c-Maf [91]. In dieser Arbeit wurden bei der Untersuchung von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten, IL-10assoziierten Transkriptionsfaktoren mittels Multiplex-Real-Time-PCR, Maf (codiert für c-Maf) und Prdm1 (codiert für Blimp-1) in TH1-, TH2-, TH17 und TH1/17-Zellen am stärksten induziert. Die Induktion von c-Maf und Blimp-1 konnte jeweils mittels intrazellulärer Färbung in kompletten memory TH-Zellen bestätigt und mit der IL-10-Produktion assoziiert werden. Das siRNA-vermittelte Ausschalten beider Transkriptionsfaktoren bewirkte jeweils in allen untersuchten TH-Subpopulationen einen signifikanten Rückgang der IL-10-Produktion, während IFN-γ und IL-17A nicht beeinflusst wurden. Blimp-1 und c-Maf waren außerdem notwendig für die IL-10-Produktion durch IFN-α/IL-6/IL-21 alleine und DLL4 alleine in kompletten memory TH-Zellen (Abb. 5.2). Anhand dieser Daten wurde deutlich, dass c-Maf und Blimp-1 notwendig sind für die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Produktion in allen wesentlichen humanen T H- Subpopulationen. Anders als in murinen TH-Zellen, wo die IL-10-Produktion je nach Subpopulation durch unterschiedliche Transkriptionsfaktoren reguliert wird [82, 91, 178], sind c-Maf und Blimp-1 in humanen TH-Zellen universell involviert in die IL-10-Produktion (Abb. 5.2). Da IFN-α/IL-6/IL-21 stärker Blimp-1 und DLL4 stärker c-Maf induziert, wäre es möglich, dass sich die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion zusammensetzt aus IFN-α/IL-6/IL-21-induzierter Blimp-1-Expression und DLL4-induzierter c-Maf-Expression. Aber auch bei der Auftrennung des IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus in IFN-α/IL-6/IL-21 und DLL4 wurde klar, dass sowohl die Zytokin-vermittelte als auch die Notch-vermittelte IL-10-Induktion abhängig ist von c-Maf und Blimp-1. In weiterführenden Versuchen sollte hier geklärt werden, wie und wo c-Maf und Blimp-1 im humanen Il10-Locus binden und wie sie hier miteinander Regulationseinheiten (z.B. STAT3 oder STAT1) interagieren. und mit anderen transkriptionellen DISKUSSION 102 Neben der beeinträchtigten IL-10-Produktion in siMAF- und siPRDM1-transfizierten TH2-Zellen, konnte hier auch eine verminderte IL-4-Produktion gemessen werden. Diese Daten entsprechen Erkenntnissen aus murinen c-Maf- [179] bzw. Blimp-1-defizienten [180] CD4+ TH-Zellen, die ebenfalls eine verringerte IL-4-Produktion aufweisen. Dazu passt zusätzlich die verstärkte IL-4Produktion in IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten kompletten memory bzw. TH2-Zellen in dieser Arbeit. 5.6.1 DIE TRANSKRIPTIONELLE ROLLE VON NFIL3 UND IKZF3 Neben den Transkriptionsfaktoren c-Maf und Blimp-1 weiß man, dass auch NFIL3 und IKZF3 (Aiolos) für die Expression von IL-10 notwendig bzw. assoziiert damit sind. In murinen TH-Zellen ist NFIL3 essentiell für die IL-27-vermittelte IL-10-Produktion [87, 95]. Außerdem kann NFIL3 von IL-4 induziert werden und die IL-10-Produktion ist in murinen Nfil3–/– TH2-Zellen beeinträchtigt [181]. Darüber hinaus korreliert die Expression von NFIL3 sowohl in murinen [182] als auch in humanen TH-Zellen [120] mit der IL-10-Expression. IKZF3 ist ebenfalls assoziiert mit der IL-10-Produktion in humanen TH-Zellen [48] und ist notwendig für die Induktion von humanen IL-10+ nTREG [125]. Neben Maf und Prdm1 zeigte die Mulitplex-Real-Time-PCR auch eine Induktion der Nfil3- und Ikzf3mRNA. Diese Daten konnten mittels intrazellulärer Färbung bestätigt werden. Damit bekräftigen die hier gemachten Beobachtungen die Daten aus der Literatur, die eine Assoziation von NFIL3 und IKZF3 mit humanen IL-10+ TH-Zellen beschreiben [48, 120]. Auch wenn hier IKZF3 und NFIL3 nicht mittels siRNA-Transfektion ausgeschaltet wurden, ist anzunehmen, dass neben Blimp-1 und c-Maf auch NFIL3 und IKZF3 in die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte Induktion von IL-10 involviert sind (Abb. 5.2), da in murinen Nfil3–/– TH-Zellen die IL-10-Produktion beeinträchtigt ist [87, 95, 181] und IL-10+ pTREG IKZF3 für ihre Entwicklung benötigen [125]. Außerdem weiß man, dass NFIL3 im murinen Il10-Genlocus und IKZF3 im humanen Il10-Genlocus binden können und dass die Überexpression von NFIL3 bzw. IKZF3 die IL-10-Expression bewirken kann [48, 95]. Darüber hinaus bewirkte in dieser Arbeit selbst das gleichzeitige Ausschalten von c-Maf und Blimp-1 keine vollständige Inhibition der IL-10-Produktion. Obwohl die siRNA-Transfektion keinen 100%-igen knockdown von Maf und Prdm1 bewirkten, ist es möglich, dass weitere Transkriptionsfaktoren in die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Produktion involviert sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit identifizierten dafür IKZF3 und NFIL3 als mögliche Kandidaten. Hier müsste in weiterführenden Versuchen geklärt werden, inwiefern NFIL3 bzw. IKZF3 auch bei einer IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation in humanen TH-Zellen an den Il10-Genlocus binden, wie sie mit c-Maf, Blimp-1 oder anderen transkriptionellen Regulationseinheiten interagieren und wie sich ein Ausschalten beider Transkriptionsfaktoren auf die IL-10-Produktion auswirken würde. DISKUSSION 5.6.2 103 DIE GEGENSEITIGE TRANSKRIPTIONELLE KONTROLLE VON C-MAF UND BLIMP-1 Durch das siRNA-vermittelte Ausschalten von c-Maf und Blimp-1 konnte außerdem gezeigt werden, dass die beiden Transkriptionsfaktoren ihre gegenseitige Expression nicht beeinflussen. Dies steht im Gegensatz zu murinen TH1-Zellen, wo gezeigt werden konnte, dass c-Maf die Expression von Blimp-1 induziert [82] (Abb. 5.2). Hier wurde die Maf-Expression nach siPRDM1-Nukleofektion bzw. die Prdm1-Expression nach siMAF-Nukleofektion nur auf mRNA-Ebene gemessen, jeweils nach einer Ruhephase über Nacht. Möglicherweise war dieser Zeitraum zu kurz, um zu gewährleisten, dass die Inhibition der jeweiligen mRNA sich in einer Reduktion der c-Maf-Protein- bzw. Blimp-1-ProteinProduktion niederschlagen konnte. Demnach hätten c-Maf oder Blimp-1 in diesem kurzen Zeitraum auch noch keinen Einfluss auf die Prdm1- bzw. Maf-Expression nehmen können. 5.6.3 DIE TRANSKRIPTIONELLE ROLLE DER STATS Die Weiterleitung von Zytokinsignalen erfordert den JAK-STAT-Signalweg (siehe Kapitel 1.8.1). Für die Induktion der IL-10-Expression in humanen und murinen TH-Zellen sind zahlreiche unterschiedliche STATs beschrieben. IL-12 induziert IL-10 in murinen TH1-Zellen über STAT4 [82, 88]. Und auch in Notch-modulierten, IL-12- oder IL-27-stimulierten TH1-Zellen verläuft die IL-10Induktion über STAT4 [83]. In murinen TH2-Zellen werden IL-4 und STAT6 benötigt, um IL-10 zu exprimieren [89] und in murinen TH17-Zellen wird IL-10 über IL-6 und STAT3 induziert [82, 91] (Abb. 5.2). IFN-α vermittelt Signale über STAT1, STAT2 und STAT3 [133], während sich IL-6 und IL-21 hauptsächlich der Funktion von STAT3 bedienen, aber ebenso ihre Signale über STAT1 und STAT5 weiterleiten können [134, 135]. In humanen und murinen TH-Zellen konnte gezeigt werden, dass die IFN-α- und IL-21-vermittelte IL-10-Induktion von STAT3 abhängig ist [70, 80, 85]. Für IL-6 ist dieser Zusammenhang nur für murine TH-Zellen bekannt [84], wird für humane TH-Zellen aber ebenfalls vermutet [68]. Unabhängig von Notch induziert IL-27 die IL-10-Expression in murinen und humanen TH-Zellen über STAT1 und STAT3 (Abb. 1.3 und Abb. 5.2) [84, 183]. Durch das siRNA-vermittelte Ausschalten von STATs konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in naiven TH-Zellen die IL-10-Induktion via IFN-α/DLL4, IL-6/DLL4 und IL-21/DLL4 abhängig ist von STAT3. Gleichzeitig zeigte STAT1 eine Hemmung und STAT4 keinen Einfluss auf die IFN-α/DLL4vermittelte IL-10-Produktion [107] (Abb. 5.2). Die Analyse von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH-Subpopulationen mittels Multiplex-Real-Time-PCR zeigte hier ergänzend die Induktion der Stat1und Stat3-mRNA in allen TH-Subpopulationen, während für Stat4 und Stat6 kein eindeutiger Effekt zu erkennen war. Anhand dieser Experimente kann man Rückschlüsse auf die Notwendigkeit von STATs bei der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Induktion in humanen TH-Zellen ziehen und Vermutungen zur unterschiedlichen Rolle der STATs bei der IL-10-Expression in humanen THSubpopulationen anstellen. DISKUSSION 104 STAT3 spielt bei der IL-10-Induktion via IFN-α, IL-6, IL-21 und DLL4 eine wesentliche Rolle. Dies entspricht den Literaturdaten zur Induktion von IL-10 in humanen TH-Zellen [68, 70, 80]. Außerdem weiß man, dass die Interaktion von Notch-induziertem HES1 und STAT3 dessen Aktivierung verstärkt [166]. Daher kann man vermuten, dass die Zytokine IFN-α, IL-6 und IL-21 zusammen mit DLL4 die IL-10-Expression durch synergistische Verstärkung der STAT3-Aktivierung beeinflussen (Abb. 5.2, Kapitel 5.3 und 5.4). Inwiefern STAT3 in jeder TH-Subpopulation für die IL-10-Expression notwendig ist, wurde hier nicht untersucht, jedoch sprechen die Daten der Multiplex-Real-Time-PCR dafür, dass STAT3 nicht nur in TH17-Zellen notwendig ist, wie es in murinen TH-Zellen beschrieben ist [82, 91]. Die Rolle von STAT4 bei der IL-10-Induktion in murinen TH1-Zellen konnte hier für humane THZellen nicht bestätigt werden. Während die IL-12- bzw. IL-12/Notch- oder IL-27/Notch-vermittelte IL-10-Expression in murinen TH1-Zellen STAT4 benötigt [83, 88], spielt es bei der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Expression in humanen TH-Zellen keine Rolle, obwohl man von STAT4 weiß, dass es in humanen TH-Zellen in die IL-12-vermittelte IL-10-Induktion involviert ist [71, 72]. In TH1-Zellen wurde die Stat4-mRNA sogar durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 herunterreguliert. Auch in dieser Arbeit zeigte IL-12 eine Induktion von IL-10, jedoch konnte IL-12 die IFN-α-vermittelte IL-10-Produktion (jeweils mit und ohne DLL4) nicht weiter steigern. Wie bei IFN-α, IL-6 oder IL-21 verstärkte DLL4 auch die IL-12-abhängige IL-10-Induktion (Abb. 5.2). In Abwesenheit von DLL4 schien es so, als ob IL-12 die IFN-α/IL-6/IL-21-vermittelte IL-10-Induktion inhibiert. Dieser Unterschied war zwischen IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 und IFN-α/IL-6/IL-21/IL-12/DLL4 aber nicht mehr zu erkennen. Während STAT4 essentiell ist für die IL-10-Expression in murinen TH1-Zellen via IL-12, IL-27 bzw. Notch-Modulation, scheint STAT4 bei der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Induktion in humanen TH-Zellen keine Rolle zu spielen. Hier wird STAT3 benötigt, was wiederum in murinen TH17-Zellen gebraucht wird, um IL-10 zu produzieren. Womöglich stellen die STAT3- (via IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4) und die STAT4-vermittelte Induktion (via IL-12) von IL-10 in humanen THZellen zwei voneinander unabhängige Wege dar (Abb. 5.2). In weiterführenden Versuchen sollte untersucht werden, inwiefern diese beiden Wege der IL-10-Induktion getrennt voneinander ablaufen, ob sie sich gegenseitig beeinflussen/inhibieren und ob DLL4 bei einer möglichen IL-12/STAT4vermittelten Induktion ebenfalls als IL-10-verstärkender Stimulus wirkt. DISKUSSION 105 Abb. 5.2 Unterschiede der transkriptionellen Regulation von IL-10 zwischen murinen und humanen TH-Zellen Außerdem konnte in dieser Arbeit für naive TH-Zellen gezeigt werden, dass STAT1 die IFN-α/DLL4vermittelte IL-10-Induktion inhibiert, IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 aber die Stat1-mRNA in allen THSubpopulationen stark hochreguliert. Obwohl die Expression von STATs nicht zwangsläufig deren Aktivierung garantiert, ist davon auszugehen, dass die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10Induktion auch in humanen TH-Subpopulationen durch STAT1 verringert wird (Abb. 5.2). Dafür spricht, dass man von STAT1 und STAT3 vermutet, dass sie das Inflammationspotential von IFN-αvermittelten Immunantworten ausbalancieren [184]. Die IL-27-abhängige IL-10-Induktion in murinen und humanen TH-Zellen benötigt STAT3 und STAT1 [84, 183]. In dieser Arbeit induzierte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 signifikant mehr IL-10 als IL-27/IL-6/IL-21/DLL4 in naiven und memory THZellen. Eine mögliche Erklärung könnte die zusätzliche Aktivierung von STAT1 durch IL-27 sein, das dann die STAT3-vermittelte IL-10-Expression inhibiert (Abb. 5.2). Die Rolle von STAT6 bei der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Induktion ist unklar. Während es in murinen TH2-Zellen für die IL-10-Expression benötigt wird [89] (Abb. 5.2), zeigen die hier gewonnen Daten keinen eindeutigen Effekt auf die Expression von STAT6. Die hier gewonnen Daten zur Rolle der STATs bei der IL-10-Induktion in humanen THSubpopulationen lassen nur Spekulationen zu. Um hier eindeutige Aussagen treffen zu können und sie zweifelsfrei von den Daten aus murinen TH-Zellen abgrenzen zu können, müssten in weiterführenden Experimenten die betreffenden STATs in den humanen TH-Subpopulationen ausgeschaltet werden, um dann die Effekte auf die IL-12-, IL-27- oder IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Produktion zu messen. DISKUSSION 5.6.4 106 DIE BALANCE ZWISCHEN REGULATION UND INFLAMMATION Neben der STAT3-vermittelten Induktion von regulatorischem IL-10, kann IFN-α über STAT1 und STAT2 inflammatorische Immunantworten auslösen. Hierbei bilden phosphoryliertes STAT1 und STAT2 im Nukleus zusammen mit IRF9 den Proteinkomplex ISGF3, der wiederum inflammatorische Gene induziert [133]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 sowohl IL-10, aber auch die mRNA von Stat1, Stat2 und Irf9 in hohem Maße induziert – vermutlich über IFN-α. Gleichzeitig bewiesen die siRNA-Experimente, dass STAT1 die IL-10-Expression in naiven, IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH-Zellen inhibiert (Abb. 5.2). Die regulatorischen Effekte von IL-10 sind konträr zu denen einer inflammatorischen Immunantwort. Passend dazu konnten Ho et al. ebenfalls zeigen, dass IFN-α-aktiviertes STAT1 und STAT3 in einem inflammatorischenregulatorischen Gegensatz zueinander stehen, wobei STAT3 die STAT1-vermittelten inflammatorischen Immunantworten inhibieren kann. Sie schlagen vor, dass die Balance zwischen aktiviertem STAT1 und STAT3 das inflammatorische Potential einer Immunantwort bestimmt [184]. Eine ähnliche Theorie für IFN-α-vermittelte Immunantworten wird von Odorizzi et al. vorgeschlagen, die vermuten, dass IFN-α zunächst über eine anti-virale Immunantwort den Virus bekämpft, dann aber, bei einer chronischen, unvermeidbaren viralen Infektion den Körper vor Immunpathologien schützt [185]. Diese STAT1/STAT3-Balance und die damit verbundene Justierung von Immunantworten rechtfertigen die Überlegung eine gezielte Inhibition von STAT1 als Therapie bei inflammatorischen Krankheiten einzusetzen (siehe Kapitel 5.13). Zusätzlich zur Induktion von IL-10 konnte hier gezeigt werden, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 ebenfalls die Produktion der inflammatorischen Zytokine IL-2 und GM-CSF inhibiert. Beide Zytokine vermitteln ihre Signale unter anderem über STAT5A [186, 187], welches ebenfalls in allen THSubpopulationen durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 deutlich herunterreguliert wurde – eine weitere antiinflammatorische Eigenschaft, die von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 hervorgerufen wird. Jedoch könnte dies auch ein sekundärer Effekt von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 sein, da hier ebenfalls gezeigt werden konnte, dass endogenes IL-10 die IL-2- und GM-CSF-Expression negativ beeinflusst (siehe Kapitel 5.9). Inwiefern ISGF3 und inflammatorische Mediatoren tatsächlich durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 gebildet werden, müsste in weiterführenden Experimenten geklärt werden. Aber offensichtlich stehen sich hier tatsächlich inflammatorische und regulatorische Effekte, induziert durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4, gegenüber. Das bestärkt die Vermutung, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 eher die Fähigkeit zur Selbstregulation induziert, als dass es eine generelle Inhibition von inflammatorischen Fähigkeiten in TH-Zellen bewirkt. DISKUSSION 107 5.7 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 INDUZIERT EINEN TR1-ÄHNLICHEN PHÄNOTYP IN HUMANEN TH-ZELLEN Klassischerweise wird die Fähigkeit, IL-10 zu produzieren und darüber Immunantworten zu kontrollieren, professionellen regulatorischen T-Zellen, wie Foxp3+ TREG oder Foxp3– TR1-Zellen, zugeschrieben. Darüber hinaus können sich Effektor-TH-Zellen über IL-10 selber regulieren und so den Körper vor pathologischen Immunantworen schützen. In vitro können beispielsweise IL-27, unterschiedliche tolerogene DC oder IL-10 selber den TR1-Phänotyp in naiven TH-Zellen hervorrufen. Dieser Phänotyp zeichnet sich aus durch eine starke IL-10-Produktion, variable Mengen IFN-γ und wenig bis kein IL-2 und IL-4 [33, 37, 92]. Zusätzlich können aber auch IL-10+, „TR1-ähnliche“ Phänotypen durch Vitamin D3 und Dexomethason [188] oder durch Co-Stimulation von CD46 zusätzlich zur TCR-Aktivierung [56, 74] induziert werden. Dies erschwert eine eindeutige Zuordnung von IL-10-produzierenden TH-Zellen zu einer Subpopulation. Es wirft die Frage auf, ob die Produktion von IL-10 überhaupt einer bestimmten Subpopulation zugeschrieben werden kann, oder ob es nicht eher eine generelle Fähigkeit von TH-Zellen beschreibt, die je nach Bedarf und Stimulus angeschaltet werden kann. Gagliani et al. konnten die Oberflächenrezeptoren LAG-3 und CD49b als Marker für TR1-Zellen identifizieren [49]. Zusätzlich können TR1-Zellen auch andere inhibitorische Rezeptoren (IRs) wie CTLA4 [33], PD-1, TIM3 [189] oder TIGIT exprimieren [182]. Mit Hilfe dieser IRs können TR1-Zellen Immunantworten kontrollieren. Die Expression dieser Marker auf TH-Effektorzellen kann zur Kontraktion einer Immunantwort beitragen [5, 96]. Neben IRs stehen TR1-Zellen auch sekretierbare Moleküle wie Granzym B zur Verfügung, um ihre regulierenden Effektorfunktionen auszuüben [125]. Die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induzierte eine sehr starke IL-10-Produktion. Außerdem konnte mittels FACS die Expression von PD-1, LAG-3, LAG-3/CD49b, TIM3 und TIGIT auf IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten memory TH-Zellen gezeigt werden (Abb. 5.5). Die MultiplexReal-Time-PCR Untersuchungen ergaben zudem eine starke mRNA-Expression von Ctla4, Gzmb (codiert für Granzym B) und Il1rn (codiert für IL-1ra). Bei der durchflusszytometrischen Untersuchung anderer Zytokine neben IL-10 zeigten sich eine deutliche Induktion von IL-4 und eine Verringerung der IL-2-Produktion durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4. Hohe IL-10- und verringerte IL-2-Produktion [33, 37], LAG-3/CD49b-Expression [49], Expression der verschiedenen IRs [33, 96, 189] und Gzmb-Expression [33] beschreiben eindeutige Identifikationsmerkmale bzw. Effektorfunktionen von TR1-Zellen. Offensichtlich kann die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation also einen TR1-Phänotyp in TH-Zellen hervorrufen – auch in bereits ausdifferenzierten memory TH-Zellen. Diese Daten zeigen, dass die Erlangung eines „TR1Phänotyps“ generell für TH-Zellen möglich ist und lassen daher die Vermutung zu, dass TR1-Zellen keine eigene Subpopulation darstellen. Dafür spricht außerdem, dass bisher kein MasterTranskriptionsfaktor für TR1-Zellen identifiziert werden konnte [33] während in allen wesentlichen DISKUSSION 108 TH-Subpopulationen c-Maf und Blimp-1 die IL-10-Expression regulieren. Hier sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden, inwiefern c-Maf und Blimp-1 auch für die Expression der anderen TR1-Marker verantwortlich sind bzw. welche Rolle c-Maf und Blimp-1 bei der Entwicklung von „klassischen“ TR1-Zellen spielen. Neben der erhöhten IL-10-Produktion sind die Expression von LAG-3/CD49b und eine sehr geringe IL-4-Produktion Hauptmerkmale des TR1-Phänotyps [33, 37, 49]. Während IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Expression von IL-10 und LAG-3/CD49b bewirkt, verstärkt die Modulation aber gleichzeitig die IL-4-Produktion. Hier werden also zwei identitätsstiftende Merkmale von TR1-Zellen induziert, während ein anderes nicht eingehalten wird. Das liefert einen weiteren Hinweis dafür, dass ein einheitlicher TR1-Phänotyp nicht generell eingehalten werden kann und daher in Frage zu stellen ist. Um dieser Frage nachzugehen, sollte in weiteren Versuchen untersucht werden, wie stabil die Expression der IRs und besonders der LAG-3/CD49b-Expression ist. Da die IRs hier nur nach 24 h bzw. 48 h gemessen wurden, kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Rezeptoren im weiteren Verlauf der Modulation wieder verschwinden und die TH-Zellen keinen „TR1-Phänotyp“ mehr aufweisen. Zusätzlich liefert der hier beschriebene inhibitorische Phänotyp in TH-Zellen über IL-10 hinaus eine Erklärung für die IL-10-unabhängige Inhibition der TRESP Proliferation im TH-Zell-Suppressionsassay. Hier könnten IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierte TH-Zellen beispielsweise die Proliferation der TRESP indirekt über eine Granzym B-vermittelte Lyse von APC inhibiert haben [125]. Ein andere Möglichkeit wäre die direkte Inhibition der TRESP-Proliferation über IRs auf den IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH-Zellen (Abb. 5.5) [5, 96]. Unabhängig vom „klassischen“ TR1-Phänotyp konnte hier eine massive mRNA-Expression von Il1rn durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in allen TH-Subpopulationen gezeigt werden. Die Messung von IL-1ra im Zellkulturüberstand von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten kompletten memory TH-Zellen bestätigte dieses Ergebnis. IL-1ra ist ein anti-inflammatorisches Molekül und natürlicher Inhibitor von IL-1, das hauptsächlich von APC produziert wird [123]. Bis auf die relativ verstärkte Expression von Il1rn in einem murinen IL-10-produzierenden TH17-Phänotyp [59] ist zur IL-1ra-Produktion in THZellen kaum etwas bekannt. Da die Messungen hierzu mit Überständen aus APC-freien Zellkulturen durchgeführt wurden und daher das IL-1ra von den TH-Zellen stammen musste, ist es von besonderem Interesse, inwiefern IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 IL-1ra in TH-Zellen induzieren kann. 5.8 DIE IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-VERMITTELTE INDUKTION VON IL-10 IN HUMANEN TREG Die Modulation von MACS-isolierten CD25+ TREG bewirkte eine Induktion von IL-10 in Foxp3+ T-Zellen. Foxp3 ist der Master-Transkriptionsfaktor von TREG und sorgt unter anderem dafür, dass die Produktion von inflammatorischen Zytokinen blockiert wird [190, 191]. Die intrazellulären Färbungen DISKUSSION 109 von IFN-γ und TNF-α zeigten allerdings, dass die isolierten T-Zellen hohe Level dieser inflammatorischen Zytokine produzierten. Außerdem wird in humanen T-Zellen durchaus diskutiert, ob Foxp3 eindeutig TREG identifizieren kann [30]. Daher war anzunehmen, dass nach der MACSIsolation von CD25+ TREG kontaminierende TH-Zellen kultiviert wurden, die auch trotz des enthaltenen TREG-begünstigenden Rapamycins [192] die Messung der IL-10-Induktion verfälschten, vor allem bei der Konzentrationsmessung im Zellkulturüberstand. Humane TREG können alternativ über die Oberflächenmoleküle CD137 und CD154 von TH-Zellen unterschieden werden [193]. Während TREG CD137+CD154– sind, sind konventionelle TH-Zellen CD137–CD154+. Eine weitere Möglichkeit, um zu identifizieren, ob IL-10 tatsächlich in den TREG induziert wird, wäre die Co-Färbung von IL-10, Foxp3, CD137 und CD154. So könnte durchflusszytometrisch bestimmt werden, ob IL-10 von CD137+CD154–Foxp3+ TREG exprimiert wird. 5.9 ENDOGENES IL-10 BEEINFLUSST DIE IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-MODULATION Die Modulation von TH-Zellen mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induzierte enorme Mengen IL-10. IL-10 kann seine eigene Expression induzieren: Rekombinantes IL-10 [92] bzw. von tolerogenen DC produziertes IL-10 [93] wird benötigt für die Entwicklung von IL-10+ TR1-Zellen. Außerdem weiß man, dass IL-10 STAT3 in TH-Zellen induzieren kann [36, 94]. Daher ist davon auzugehen, dass IL-10 seine eigene Expression über STAT3 vermittelt. Dass die direkte Wirkung von IL-10 auf TH-Zellen tatsächlich notwendig ist für die Regulation von Immunantworten, zeigen Versuche, bei denen die IL-10R-Signalweiterleitung inhibiert wurde: Murine TH17-Zellen können durch regulatorische T-Zellen via IL-10 inhibiert werden [194] und TR1-Zellen benötigen für ihre IL-10-vermittelten, regulatorischen Effektorfunktionen einen intakten IL-10R [195]. Das war Grund zur Annahme, dass das produzierte IL-10 innerhalb der Zellkulturen in dieser Arbeit eine direkte Wirkung auf die THZellen hatte. Hier konnte gezeigt werden, dass die Blockade des IL-10R eine Verringerung der IL-10-Expression bewirkt, während inflammatorische Zytokine wie IFN-γ, GM-CSF, IL-2 und TNF-α verstärkt exprimiert wurden. Die Produktion von IL-17A wurde nicht beeinflusst. Ebenfalls bewirkte die Inhibition der IL-10R-Signalweiterleitung, dass die IRs LAG-3/CD49b und TIM3 und die Transkriptionsfaktoren c-Maf und NFIL3 verringert exprimiert wurden. Blimp-1 zeigte ebenfalls die Tendenz einer abgeschwächten Expression in Anwesenheit des IL-10R-Antikörpers. Offensichtlich trug hier IL-10 in einem autokrinen Mechanismus zu seiner eigenen Expression bei. Da IL-10 STAT3 in TH-Zellen aktivieren kann [94], ist davon auzugehen, dass IL-10 zusammen mit IFN-α, IL-6 und IL-21 zur STAT3-Phosphorylierung beiträgt und so seine eigene Produktion verstärkt (Abb. 5.4). Die ebenfalls durch anti IL-10R verringerte Expression von c-Maf, NFIL3 und evtl. Blimp-1 lässt vermuten, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 das Zytokin IL-10 direkt und indirekt induzieren kann. Zunächst bewirkt die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation eine direkte, initiale DISKUSSION 110 Produktion von IL-10 über STAT3, c-Maf, Blimp-1 und NFIL3. Das produzierte IL-10 bewirkt dann in einer autokrinen feedback-Schleife wiederum die Verstärkung der STAT3-Phosphorylierung und der c-Maf-, Blimp-1 und NFIL3-Expression, was in der Folge zu noch mehr IL-10 führt (Abb. 5.4). Wie dieser autokrine Mechanismus tatsächlich wirkt, müsste in weiterführenden Experimenten, z.B. über gezieltes Ausschalten von Transkriptionsfaktoren mittels siRNA untersucht werden. Neben der Beeinflussung seiner eigenen Expression bewirkte IL-10 aber auch die Inhibition von inflammatorischen Zytokinen in TH-Zellen. Übereinstimmend mit Daten aus der Literatur war die Produktion von IFN-γ [94, 196], GM-CSF [197] und IL-2 [196, 198] erhöht, wenn IL-10 blockiert wurde. Ebenso konnten Naundorf et al. zeigen, dass IL-10 die IL-17A-Produktion in TH-Zellen nicht verringert [94]. Zusätzlich beeinflusste IL-10 außerdem die Expression des TR1-Markers LAG-3/CD49b [49] und des IR TIM3. IL-10 verstärkte also nicht nur seine eigene Expression, sondern festigte darüber hinaus den regulatorischen Phänotyp von TH-Zellen durch die Inhibition von inflammatorischen Zytokinen und die Induktion von IRs. Offensichtlich spielt IL-10, zusätzlich zu IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4, eine wesentliche Rolle bei der Ausprägung des stark IL-10 produzierenden, regulatorischen, „TR1-ähnlichen“ Phänotyps in TH-Zellen (Abb. 5.4). 5.10 TH1/17-ZELLEN STELLEN EINE BESONDERS INFLAMMATORISCHE TH-SUBPOPULATION DAR Neben den gut beschriebenen TH-Subpopulationen TH1, TH2 und TH17, gibt es den TH1-TH17Mischphänotyp Th1/17, der sich in Anwesenheit der Zytokine IL-1β, IL-23 und IL-12 aus TH17Zellen entwickeln kann [7, 10]. Dieser TH1/17-Phänotyp existiert für murine und humane TH-Zellen und zeichnet sich durch die gleichzeitige Expression der Zytokine IFN-γ und IL-17A/F und der Master-Transkriptionsfaktoren T-bet und RORγt aus. Durch die Expression der Chemokinrezeptoren CXCR3 und CCR6 ist es TH1/17-Zellen möglich sowohl an TH1- als auch an TH17-Entzündungsherde zu gelangen. TH1/17-Zellen sind vor allem von großem Interesse, da sie vermehrt in Patienten autoinflammatorischer Krankheiten wie CED [24], MS [25] und JIA [26] zu finden sind und vermutet wird, dass sie durch ihren inflammatorischen Phänotyp zur Pathologie dieser autoimmunologischen Krankheiten beitragen [10, 121, 199]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation neben den TH1-, TH2- und TH17-Zellen, IL-10 auch in TH1/17-Zellen induzieren konnte. Beim Vergleich der IL-10Produktion innerhalb der Effektorzytokin-positiven TH-Zellen ergab sich aber, dass IFN-γ+IL-17A+, IFN-γ+ und auch IL-17A+ TH1/17-Zellen weniger IL-10 produzierten als IFN-γ+ TH1-Zellen bzw. IL-17A+ TH17-Zellen. Außerdem konnte im peripheren Blut von CED-Patienten ein höherer Prozentsatz TH1/17-Zellen als in gesunden Spendern identifiziert werden, die gleichzeitig nach DISKUSSION 111 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation weniger IL-10 und Blimp-1 exprimierten als die TH1/17-Zellen der gesunden Spender (Abb. 5.3). Diese Ergebnisse zeigen, dass TH1/17-Zellen schwächer auf die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation ansprechen und – wegen der geringeren IL-10-Produktion – ein geringeres Potential zur Selbstregulation besitzen (Abb. 5.3). Diese Beobachtung geht einher mit einer Studie von Duhen et al., in der gezeigt werden konnte, dass TH1/17-Zellen weniger IL-10 produzieren als TH17-Zellen [10]. Dass gleichzeitig die Frequenz von TH1/17-Zellen in CED-Patienten erhöht ist und sie hier nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation noch weniger IL-10 produzieren als in gesunden Spendern, untermauert diese inflammatorische Rolle von TH1/17-Zellen und stimmt überein mit der bisher untersuchten pathologischen Rolle von TH1/17-Zellen in CED [24], MS [25] und JIA [26] (Abb. 5.3). Interessanterweise sind auch TEM und TEMRA mit autoimmunologischen Krankheiten wie RA oder MS assoziiert [27, 28, 200]. TEM und TEMRA produzierten nach DLL4-Modulation ebenfalls weniger IL-10 als TCM, für die ein solcher direkter Zusammenhang zur Autoimmunität nicht bekannt ist. Das spricht dafür, dass die IL-10-vermittelte Selbstregulation von TH-Zellen bei Autoimmunkrankheiten beeinträchtigt ist. Da TH1/17-Zellen die gleiche Il10 mRNA-Kinetik wie die anderen TH-Subpopulationen aufweisen, ist nicht auszuschließen, dass die IL-10-Induktion in TH1/17-Zellen zunächst gleich stark stattfindet, diese aber möglicherweise instabil ist oder die IL-10-produzierenden TH1/17-Zellen selektiv in Apoptose übergehen. Wie genau die geringere IL-10-Expression in TH1/17-Zellen zu erklären ist, muss in weiterführenden Versuchen zur der IL-10-Kinetik und dem Überleben von TH1/17-Zellen untersucht werden. Hierbei sollte man außerdem prüfen, inwiefern sich die TH-Subpopulationen unterscheiden bezüglich des Ansprechverhaltens auf die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation. Es wäre möglich, dass TH1/17-Zellen weniger Notch-, IFN-α-, IL-6- oder IL-21-Rezeptoren exprimieren, was eine Erklärung liefern könnte für die verringerte IL-10- und Blimp-1-Expression (siehe Kapitel 5.5). Auffällig ist hier zudem, dass innerhalb der CED-TH1/17-Zellen die Blimp-1-Expression schwächer als in gesunden Spendern ist. TH-Zellen aus Blimp-1-defizienten Mäusen bilden verstärkt einen TH1/17-Phänotyp aus [201]. Da in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass Blimp-1 für die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Produktion notwendig ist, kann angenommen werden, dass dieser Blimp-1-Defekt in CED-Patienten zur verringerten IL-10-Produktion in TH1/17-Zellen und damit auch zur beeinträchtigten Fähigkeit zur Selbstregulation von TH1/17-Zellen in CED-Patienten führt. In gesunden Spendern konnte nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation auf mRNA-Ebene keine verringerte Prdm1-Expression in TH1/17-Zellen festgestellt werden. Ob hier auch schon ein Blimp-1Defekt zur verringerten Fähigkeit zur Selbstregulation beiträgt, muss in weiterführenden Versuchen geklärt werden. DISKUSSION 112 5.11 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-MODULATION VON MEMORY TH-ZELLEN AUS CED-PATIENTEN 5.11.1 CED-PATIENTEN WEISEN EIN VERSTÄRKT INFLAMMATORISCHES ZYTOKINPROFIL AUF CED sind chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie CU oder MC, bei denen ein Ungleichgewicht von inflammatorischen und regulierenden Zytokinen zum Krankheitsverlauf beiträgt (siehe Kapitel 4.8) [137]. Man weiß von TH-Zellen und anderen Immunzellen aus dem mukosalen Gewebe von CED-Patienten, dass sie mehr IFN-γ [138, 139], IL-17A [140-142], GM-CSF, TNF-α [202] und IL-22 [203] produzieren als in gesunden Spendern. Die wichtige regulatorische Rolle von IL-10 bei CED konnte durch zahlreiche Untersuchungen belegt werden. In Patienten mit früh einsetzender CED konnten Funktionsverlustmutationen im IL-10- oder IL-10R-Gen identifiziert werden [41] und SNPs im Il10-Gen sind assoziiert mit CU [143]. Außerdem steigt die IL-10Konzentration im Serum an, wenn sich CED-Patienten in der Remissionsphase befinden [144]. Studien zu Typ-I-Interferonen in CED-Patienten konnten zeigen, dass SNPs im Ifnar mit CED assoziiert sind [149] und dass die IL-10-Produktion über den Typ-I-Interferon-Signalweg in CEDPatienten offenbar fehlerhaft ist [78]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IFN-α einen wesentlichen Beitrag zur IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten IL-10-Produktion leisten konnte und dass diese IL-10-Produktion in CED-Patienten beeinträchtigt ist (Abb. 5.3). Dieser Defekt unterstützt die Studie von Giles et al., die in CED-Patienten eine defekte Typ-I-Interferon-vermittelte IL-10-Produktion in TH-Zellen der Lamina propria feststellen konnten [78]. Zusammen mit der Assoziation von SNPs im Ifnar mit CED [149] liefern diese Daten einen Hinweis darauf, dass ein Defekt im Typ-I-Interferon-Signalweg in CED-Patienten an der verringerten IL-10-Produktion von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten THZellen beteiligt sein könnte. Die verringerte IL-10-Produktion war jedoch bereits ohne IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation in CED-Patienten zu erkennen. Daher ist es wahrscheinlich, dass neben einem möglichen Typ-I-Interferon-Defekt auch andere IL-10-induzierende Mechanismen bzw. die Bildung eines IL-10-Gedächtnisses in CED-Patienten bereits in vivo beeinträchtigt sind. Bei der weiterführenden Untersuchung des Zytokinprofils von peripheren memory TH-Zellen in CEDPatienten ergab sich, dass – unabhängig vom IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Stimulus – die Zytokine IL-17A, IL-22, GM-CSF und TNF-α (signifikant nur in TCR-only-stimulierten) stärker produziert wurden als in gesunden Spendern. Damit erweitern die hier gemachten Beobachtungen die Daten zum verstärkten inflammatorischen Zytokinprofil im mukosalen Gewebe [140-142, 202, 203] um periphere memory TH-Zellen. Neben den bereits diskutierten TH1/17-Zellen, die vermehrt in CED-Patienten vorkommen und nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation weniger IL-10 produzieren (siehe Kapitel 5.10), konnten also DISKUSSION 113 auch mehr IL-17A+ TH-Zellen (TH17-Zellen) in CED-gefunden werden, die ebenfalls eine geringere Fähigkeit zur Selbstregulation aufwiesen. Diese Beobachtungen gehen einher mit Studien, die zeigen, dass sowohl TH1/17- als auch TH17-Zellen am pathologischen Phänotyp von CED beteiligt sind [24, 204, 205]. In gesunden Spendern zeigten die IL-17A+ TH17-Zellen nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Modulation eine höhere IL-10-Produktion als IL-17A+ TH1/17-Zellen und schienen keine beeinträchtigte Selbstregulation aufzuweisen. Anders in CED-Patienten: Hier produzierten die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten TH17-Zellen weniger IL-10 als in gesunden Spendern. Da man weiß, dass sich TH1/17-Zellen unter Einwirkung von IL-1β, IL-12 und IL-23 aus TH17-Zellen entwickeln [7, 10], wäre es daher möglich, dass bereits IL-10-beeinträchtigte TH17-Zellen in CEDPatienten zum pathologischen Phänotyp beitragen. Die sich daraus entwickelten TH1/17-Zellen hätten dann durch die zusätzliche IFN-γ-Produktion sowohl einen stärker inflammatorischen Phänotyp als TH17-Zellen als auch die geringere Fähigkeit zur Selbstregulation durch verringerte IL-10-Produktion. Anders als in den CD4+ TH-Zellen der CED-Lamina propria [138, 139], konnte in dieser Arbeit keine erhöhte Frequenz an IFN-γ+ TH-Zellen (TH1-Zellen) gemessen werden. Jedoch war die Frequenz der IFN-γ/IL-17A-doppelt-positiven TH-Zellen (TH1/17-Zellen) in den hier untersuchten CED-Patienten erhöht. Da in den bekannten Daten aus der Literatur jeweils keine Unterscheidung zwischen IFN-γund IFN-γ/IL-17A-Produzenten gemacht wurde, ist anzunehmen, dass die erhöhte IFN-γ-Produktion in CED-Patienten auf die TH1/17-Zellen zurückzuführen ist. Somit widersprechen die hier vorliegenden Daten aus peripheren memory TH-Zellen nicht zwangsläufig den Studien zur erhöhten IFN-γProduktion in der CED-Lamina propria. Zudem ist es sehr wahrscheinlich, dass sich das Zytokinprofil von TH-Zellen der Lamina propria bezüglich der IFN-γ-Produktion von dem der peripheren TH-Zellen unterscheidet, sodass es auch möglich ist, dass die verstärkte IFN-γ-Produktion erst im GIT auftritt. Im Gegensatz zu IL-17A, GM-CSF und TNF-α nimmt IL-22 eine protektive Rolle bei entzündlichen Darmerkrankungen ein [204, 205]. Dass die IL-22-Produktion in CED-Patienten erhöht ist, spricht daher dafür, dass es in den CED-Patienten verstärkt exprimiert wird, um gewebeschützende Funktionen im GIT zu erfüllen und so der chronischen Inflammation entgegenzuwirken. Möglicherweise ist die erhöhte IL-22-Produktion also ein Kompensationsmechanismus, um die beeinträchtigte IL-10-vermittelte Immunregulation auszugleichen. Aus murinen TH-Zellen weiß man jedoch, dass IL-10 und IL-22 nicht von der gleichen TH-Zelle exprimiert werden, da c-Maf IL-10 induziert, während es IL-22 inhibiert [206]. Daher kann man vermuten, dass ein solcher IL-10/IL-22Kompensationsmechanismus nicht intra- sondern interzellulär abliefe. Um dieser Frage nachzugehen, müsste überprüft werden, ob die IL-10-produzierenden TH-Zellen aus CED-Patienten IL-22 exprimieren können und inwiefern sich die Expression zu gesunden Spendern unterscheidet. DISKUSSION 114 Abb. 5.3 Verminderte Selbstregulation von TH-Zellen in CED-Patienten. 5.11.2 VERMINDERTE SELBSTREGULATION IN CED-PATIENTEN DURCH BLIMP-1-DEFEKT Ellinghaus et al. konnten zeigen, dass SNPs in Prdm1 (codiert für Blimp-1) assoziiert sind mit MC [150]. Darüber hinaus entwickeln Mäuse, in denen Blimp-1 TH-Zell-spezifisch ausgeschaltet wurde, eine starke Colitis und produzieren weniger IL-10 [82, 207]. Der gleiche Blimp-1 knockout lässt außerdem murine TH-Zellen verstärkt in einen IFN-γ+/IL-17A+ Phänotyp differenzieren [201]. In dieser Arbeit konnte innerhalb der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten IL-10-produzierenden THZellen eine verringerte Blimp-1-Expression verglichen mit gesunden Spendern, nachgewiesen werden. Blimp-1 war notwendig für die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Produktion in allen THSubpopulationen. Da Blimp-1 für die Homöostase und IL-10-Produktion von murinen TH-Zellen notwendig ist [82, 207] und in SNPs in Prdm1 mit MC assoziiert sind [150], lassen diese Ergebnisse vermuten, dass ein Blimp-1-Defekt zur verringerten IL-10-Produktion in CED-Patienten beiträgt DISKUSSION 115 (Abb. 5.3). Das hieße, dass Blimp-1 in humanen TH-Zellen für die Selbstregulation benötigt wird, die, wenn sie versagt, zur CED-Pathologie beitragen kann. Interessant ist, dass die SNPs in Prdm1 sehr selten sind [150], hier jedoch anscheinend ein genereller Blimp-1-Defekt in den gemessenen CEDPatienten sichtbar ist. Hier sollte untersucht werden, wie sich die Blimp-1-Expression in CEDPatienten mit Blimp-1-SNP zu anderen CED-Patienten unterscheidet und ob die IL-10Expression - auch in gesunden Spendern im Rahmen der Spendervariabilität – mit der Blimp-1Expression korreliert. Da humane TH1/17-Zellen vermehrt in CED-Patienten vorkommen und gleichzeitig weniger Blimp-1 exprimieren, ist in diesem Zusammenhang besonders interessant, dass Blimp-1-defiziente Mäuse einen TH1/17-Phänotyp ausbilden [201]. Ein Blimp-1-Defekt könnte also zum einen dazu beitragen, dass CED-Patienten mehr inflammatorische TH1/17-Zellen bilden und zum anderen deren verringerte IL-10-Produktion und beeinträchtigte Fähigkeit zur Selbstregulation erklären. Natürlich ist hier auch möglich, dass die inhibierte Selbstregulation die Entwicklung von TH17-Zellen hin zu TH1/17-Zellen begünstigt. Ebenso weiß man aus murinen TREG, dass sie Blimp-1 zur Produktion von IL-10 benötigen [208]. Sollte sich ein möglicher Blimp-1-Defekt in CED-Patienten nicht auf TH-Zellen beschränken, ist es wahrscheinlich, dass auch TREG dadurch weniger IL-10 produzieren und ihre regulatorischen Fähigkeiten nicht vollständig ausüben können. Das wiederum könnte ein Grund sein für das inflammatorische Zytokin-Ungleichgewicht [137] und damit zur Ätiologie der Krankheit beitragen. 5.12 DIE FUNKTIONELLE ROLLE VON TH1/17-ZELLEN Th1/17-Zellen kommen vermehrt vor in MS- und JIA-Patienten und ergänzend zu Annunziato et al. konnte auch hier gezeigt werden, dass der Prozentsatz an TH1/17-Zellen erhöht ist in CED-Patienten [10, 24-26]. Das alles weist darauf hin, dass TH1/17-Zellen eine verstärkt inflammatorische THSubpopulation sind und eine wichtige pathologische Rolle bei Autoimmunkrankheiten einnehmen. Dennoch konnten hier die TH1/17-Zellen auch in gesunden Spendern nachgewiesen werden. Tatsächlich haben TH1/17-Zellen zahlreiche funktionelle Überschneidungen mit TH17-Zellen: Sie besitzen die gleichen Rezeptoren wie TH17-Zellen, weisen ein vergleichbar niedriges cytotoxisches Potential auf und aktivieren ebenfalls die Ig-Produktion in B-Zellen. Darüber hinaus haben sie eine geteilte Antigen-Spezifität und reagieren sowohl auf klassische TH17-Pathogene wie Candida albicans und Staphylococcus areus als auch auf das TH1-Pathogen Influenza [10, 24]. Gleichzeitig konnte hier die beeinträchtigte IL-10-Expression von TH1/17-Zellen bereits in gesunden Spendern gezeigt werden, was die Daten von Duhen et al. bestätigt [10]. Möglicherweise nehmen TH1/17-Zellen durch ihre Vielseitigkeit eine besondere Rolle bei TH1- und TH17-Immunantworten ein, als eine Art „Alleskönner“, der nicht zu stark durch die IL-10-vermittelte Selbstregulation inhibiert werden darf, um diese vielseitigen Funktionen ausüben zu können. Da TH1/17-Zellen gleichzeitig aber DISKUSSION 116 nur geringfügig von TREG kontrolliert werden können [24], ist die IL-10-Selbstregulation – trotz der Beeinträchtigung im Vergleich zu anderen TH-Subpopulationen wesentlich, um TH1/17- Immunpathologien zu vermeiden. Wenn nun, wie möglicherweise in CED-Patienten [150, 201], ein Blimp-1-Defekt die IL-10-Selbstregulation noch weiter schwächt, wäre auch diese Kontrollinstanz außer Kraft gesetzt und die vielseitigen Fähigkeiten der TH1/17-Zellen würden dem Körper eher schaden als dass er davon profitiert (Abb. 5.3). Inwiefern diese Vermutungen zutreffen, muss allerdings in weiterführenden Versuchen zur Selbstregulation und Pathogenität von TH1/17-Zellen geklärt werden. Nichtsdestoweniger ist aber offensichtlich, dass TH1/17-Zellen eine besondere TH-Subpopulation darstellen, die weiter hinsichtlich ihrer Rolle in Autoimmun-Patienten, aber auch gesunden Spendern untersucht werden sollte. 5.13 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-MODULATION ALS THERAPIEMÖGLICHKEIT BEI CED Aufgrund der anti-inflammatorischen Effekte von IL-10 war und ist dieses Molekül Gegenstand zahlreicher Untersuchungen zur Behandlung von CED-Patienten. Die systemische Gabe von IL-10 in verschiedenen Konzentrationen ist zwar verträglich, zeigte aber in unterschiedlichen Studien keine signifikante Besserung im Vergleich zur Placebo-Gabe [145, 146]. Eine systematische Revision von Studien bis 2010, die in MC Patienten die Gabe von rekombinantem IL-10 mit einer PlaceboKontrolle verglich, ergab sogar, dass IL-10 keinerlei Verbesserung der Krankheit bewirkte [209]. Ein Grund hierfür könnte sein, dass bei Einhaltung der verträglichen Dosis die notwendige lokale Konzentration von IL-10 nicht durch eine systemische Gabe erreicht werden kann [145]. Dennoch gibt es zellbasierte, lokale Therapie-Ansätze, die die regulatorischen Fähigkeiten von IL-10 zur Behandlung von CED-Patienten ausnutzen. Braat et al. konnten zeigen, dass die Verabreichung von genetisch modifizierten, IL-10-produzierenden Lactococcus lactis zu einer Verringerung der Krankheitsaktivität führt [148]. Musch et al. verwendeten in einer kleinen Kohorte ergänzend zu bestehenden Therapien den immunmodulatorischen Wirkstoff DIMS0150, der in allen ColitisPatienten die rasche Reduktion der Krankheitsaktivität bewirkte. DIMS0150 ist ein CpG-enthaltenes Oligonukleotid, das möglicherweise durch eine IFN-α-induzierte IL-10-Produktion seine immunmodulatorische Wirkung vollzieht [137, 147]. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von TNF-α z.B. über das Medikament Infliximab zusätzlich zur Blockade des inflammatorischen TNF-α auch die Expression von IL-10 in humanen TH-Zellen induziert [48]. Daher wäre es möglich, dass eine Verringerung der Krankheitsaktivität in CED-Patienten durch die zusätzliche Induktion von IL-10 verstärkt wird. Möglicherweise muss IL-10 gezielt am Wirkort hohe Konzentrationen aufweisen, um seine regulatorische Wirkung entfalten zu können. Eine hohe lokale Konzentration von IL-10 bewirkt auch die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4. IFN-α/IL-6/IL-21/DLL könnte zwar einem CED-Patienten nicht verabreicht werden, jedoch ist es grundsätzlich möglich (DLL4-)MACSiBeads und rekombinante Zytokine unter GMP-Bedingungen herzustellen. Daher könnte man memory TH-Zellen von CED-Patienten isolieren und sie in vitro mit DISKUSSION 117 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 modulieren und expandieren. Anschließend würden die IL-10+ TH-Zellen mittels adoptivem Transfer dem Patienten wieder zugeführt, damit IL-10-produzierende TH-Zellen lokal im GIT regulatorische Funktionen ausüben und möglicherweise zur Verbesserung der Krankheitsaktivität beitragen. Hier konnte allerdings auch gezeigt werden, dass die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion nicht langfristig stabil ist. Um also zu gewährleisten, dass die modulierten TH-Zellen nach dem Transfer auch weiterhin IL-10 produzieren, müsste man in weiterführenden Versuchen prüfen, ob es möglich ist, die IL-10-Expression zu stabilisieren und inwiefern über IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 ein IL-10-Gedächtnis induziert werden kann. Möglich wäre auch eine Kombination aus initialer IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation in vitro, die zunächst die massive IL-10-Produktion gewährleistet, mit einer gezielten IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Restimulation in vivo nach dem Zelltransfer. Möglicherweise könnte die Verbindung der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation mit einem Wirkstoff wie DIMS0150 diese in vivo Restimulation bewirken, indem er in APC (z.B. pDC) durch das enthaltene CpG-Motiv die IFN-α-, IL-6- und DLL4Expression induziert. Bei der Untersuchung der Stabilität von IL-10 wurde hier allerdings noch nicht geprüft, ob eine Restimulation der TH-Zellen mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die IL-10-Produktion erneut induzieren kann. Das wäre die Voraussetzung für eine solche in vivo IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Restimulation. Eine weitere große Herausforderungen dieses Ansatzes besteht darin, die modulierten TH-Zellen gezielt in den GIT zu leiten. Hier wäre es vorstellbar TH-Zellen zu modulieren, die aufgrund ihrer Chemokinrezeptor-Ausstattung in den GIT einwandern können. Solche Chemokinrezeptoren sind Integrin α4β7 oder CCR9. Man könnte gezielt diese TH-Zellen sortieren und modulieren oder zusätzlich zur Modulation von kompletten memory TH-Zellen die α4β7- und CCR9-Expression durch Retinolsäure induzieren [210]. Selbst wenn die modulierten TH-Zellen die ChemokinrezeptorAusstattung mitbringen, um in den GIT einzuwandern, wäre nicht gewährleistet, dass sie für die dortigen Antigene spezifisch reaktiviert werden und IL-10 produzieren. Eine weitere Möglichkeit wäre daher TH-Zellen zu modulieren, die spezifisch sind für die Mikroorganismen aus der Darmflora. Hierfür könnte man diese spezifischen TH-Zellen isolieren [193] oder TH-Zellen mit einem spezifischen TCR ausstatten [211]. Außerdem wäre denkbar, die Methoden zu kombinieren und beispielsweise in Darmflora-spezifischen TH-Zellen die Expression von α4β7- und CCR9 zu induzieren. Da STAT1 die IL-10-Expression abschwächt, gäbe es außerdem die Möglichkeit, in CED-Patienten STAT1 gezielt zu inhibieren, um so die IL-10-Produktion in TH-Zellen zu verstärken. Ein solcher STAT1-Inhibitior ist Pravastatin, das die Phosphorylierung von STAT1 verhindert [212]. In einer retrospektiven Studie zur Wirkung von Pravastatin und anderen Statinen bei CED konnte sogar bereits gezeigt werden, dass die Behandlung mit Statinen eine leichte Verringerung der Krankheitsaktivität bewirkte [213]. DISKUSSION 118 5.14 IN VIVO MODELL: IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-VERMITTELTE SELBSTREGULATION VON HUMANEN TH-ZELLEN 5.14.1 INDUKTION DER IL-10-EXPRESSION Neben der artifiziellen Stimulation von Notch über DLL4-beladene MACSiBeads konnte auch die CoKultur mit DLL4-exprimierenden dendritischen Zellen IL-10 in naiven und kompletten memory THZellen induzieren. Dies liefert den Ansatz für eine Theorie, wie die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4vermittelte IL-10-Induktion in vivo in humanen TH-Zellen ablaufen könnte (Abb. 5.4). Abb. 5.4 In vivo Modell zur IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten Induktion eines regulatorischen Phänotyps in THZellen – Teil I. Über ihren Pattern Recognition Receptor (PRR) können pDC oder mDC Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) erkennen und Effektorfunktionen ausüben. Aktivierte DC können u.a. DISKUSSION 119 die Zytokine IFN-α und IL-6 produzieren [68, 133, 214, 215]. Außerdem konnte hier gezeigt werden, dass die Aktivierung über den TLR (TLR gehören zu den PRR) die Expression von DLL4 und costimulatorischen Molekülen wie CD80 und CD86 in pDC bewirkt. Die MHC-II-Moleküle auf DC präsentieren nun das Antigen und können so, zusammen mit CD80 und CD86, die TH-Zelle über ihren TCR und CD28 aktivieren. Die Expression von DLL4, IFN-α und IL-6 setzt zusätzlich die IL-10Induktion in Gang. IFN-α und IL-6 phosphorylieren STAT3 innerhalb der TH-Zelle und induzieren vermutlich darüber die Transkriptionsfaktoren c-Maf und Blimp-1. Neben der Zytokin-vermittelten Induktion über STAT3 kann auch der Notch-Rezeptor durch die Freisetzung seiner NIZD nach DLL4Bindung die c-Maf- und Blimp-1-Expression bewirken. In der Folge exprimiert und sekretiert die THZelle IL-10. Neben IL-10 induzieren IFN-α, IL-6 und DLL4 aber auch IL-21 in naiven TH-Zellen, das nun autokrin auf die TH-Zellen wirken kann. Memory TH-Zellen könnten bereits nach der TCRAktivierung autokrin wirkendes IL-21 produzieren. In der Folge bündeln IFN-α, IL-6 und IL-21 ihre STAT3-Aktivierung und bewirken gemeinsam eine verstärkte c-Maf und Blimp-1-abhängige IL-10Expression. Zusätzlich hat auch IL-10 autokrine Effekte auf TH-Zellen und erhöht seine eigene Expression, vermutlich über STAT3 [94]. Da die Blockade von endogenem IL-10 die c-Maf- und Blimp-1-Expression verringert, ist es möglich, dass dieser feedback-Mechanismus ebenfalls über die beiden Transkriptionsfaktoren abläuft. Neben der Induktion seiner eigenen Expression vermittelt IL-10 die Selbstregulation der TH-Zelle und inhibiert ihre Effektorfunktionen (z.B. inflammatorische Zytokine oder co-stimulatorische Moleküle), die Proliferation und den Zellzyklus [36, 37]. Neben c-Maf und Blimp-1 induziert IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auch die Transkriptionsfaktoren NFIL3 und IKZF3. Aufgrund der Assoziation bei Transkriptionsfaktoren mit der IL-10-Produktion in humanen TH-Zellen [48, 120] und der Notwendigkeit von NFIL3 für die IL-10-Produktion in murinen TH-Zellen [87, 95, 181] ist davon auszugehen, dass auch NFIL3 und IKZF3 an der IL-10-Expression beteiligt sind. IL-10 ist maßgeblich an der Regulation von Immunantworten beteiligt [36]. Hierbei hat IL-10 ein solches anti-inflammatorisches Potential, dass es sogar notwendige Immunantworten inhibieren kann und so die Eliminierung des Pathogens beeinträchtigt [51]. Obwohl Immunantworten, wenn sie nicht reguliert werden, Immunpathologien hervorrufen können, benötigt der Körper sie zur Bekämpfung von Pathogenen. Daher stellt sich bei der Betrachtung dieser Ergebnisse die Frage, wieso inflammatorische Zytokine wie IL-6 und IFN-α eine anti-inflammatorische Immunantwort induzieren, die im Falle einer Infektion vermutlich die Beseitigung des Pathogens behindern würde. Eine mögliche Antwort hierauf liefert die Stabilität und die Kinetik der IL-10-Expression. Diese Arbeit ergab, dass diese IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion ohne IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Restimulation nicht über einen längeren Zeitraum stabil ist und daher vermutlich kein IL-10Gedächtnis in den TH-Zellen hervorruft. Außerdem produzieren memory TH-Zellen nach 24 h das erste IL-10 und naive TH-Zellen erst nach 48 h. Für inflammatorisches IFN-γ hingegen bilden TH-Zellen ein Gedächtnis aus [118] und sie können es bereits ca. 6 h nach TCR-Aktivierung produzieren [216]. Das DISKUSSION 120 bedeutet, dass nach der Aktivierung der TH-Zellen zunächst die inflammatorische Entzündungreaktion abläuft, um das Pathogen zu bekämpfen. Erst nach 24 h – respektive nach 48 h, wenn das Pathogen ein unbekanntes Antigen darstellt und naive TH-Zellen aktiviert werden – beginnt langsam die IL-10vermittelte Kontrolle der Immunreaktion. Hierbei ist aber wohl davon auszugehen, dass es sich eher um ein Ausbalancieren der Immunantwort handelt, um mögliche Gewebeschäden schon frühzeitig zu verhindern. Die Immunreaktion wird zu diesem frühen Zeitpunkt also noch nicht durch IL-10 beendet, sondern eher feinjustiert. Eine Schnittstelle für diese Balance könnten die antagonistisch agierenden STAT1 und STAT3 sein [184, 185]. Hier konnte bestätigt werden, dass die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Modulation mit der Expression von Stat1, Stat2 und Irf9 die Voraussetzungen für die Entstehung des ISGF3-Komplexes schafft, der wiederum inflammatorische Gene induzieren kann [133]. Gleichzeitg inhibierte STAT1 die IL-10-Produktion in modulierten TH-Zellen, während STAT3 hierfür notwendig war. IFN-α induziert also neben STAT3 auch STAT1 und STAT2 und leitet darüber zunächst die inflammatorische Immunantwort ein. Gleichzeitig wird aber auch, zusammen mit IL-6, IL-21 und DLL4, die IL-10-Expression induziert, die allerdings mehr Zeit benötigt und daher nicht direkt die Eliminierung des Pathogens unterdrückt. 5.14.2 INDUKTION VON INHIBITORISCHEN REZEPTOREN Durch die IFN-α/IL-6/IL-21/-vermittelte IL-10-Produktion waren TH-Zellen in der Lage, die costimulatorischen Moleküle HLA-DR und CD40 auf APC zu inhibieren und den antiinflammatorischen Rezeptor CD163 zu induzieren. CD163 kann wiederum selbst die IL-10Produktion in APC veranlassen [217] (Abb. 5.5). So könnte eine IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation in vivo zu einer Regulation von APC-abhängigen Immunantworten beitragen. Neben der Induktion von IL-10 konnte diese Arbeit zeigen, dass die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4Modulation die Expression von IRs auf TH-Zellen induzierte. Hierbei bewirkte IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Präsentation von CTLA4, PD-1, TIGIT, LAG-3 und TIM3 auf der Zelloberfläche. CTLA4 konkurriert mit CD28 um die Bindung von CD80 und CD86 und vermitteln inhibitorische Signale in die Liganden-exprimierende Zelle. So kann CTLA4 in TRESP Toleranz oder Apoptose induzieren oder TH-Effektorfunktionen, die Proliferation oder den Zellzyklus inhibieren. Die Expression von PD-1, TIGIT, LAG-3 und TIM3 ermöglicht es den IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4modulierten TH-Zellen, durch die Bindung der jeweiligen Liganden, ihre suppressiven Fähigkeiten zu verstärken. CD274, der Ligand von PD-1, inhibiert die durch die PD-1-Aktivierung die exprimierende T-Zelle in ihren Effektorfunktionen und ihrer Proliferation. Außerdem kann TIGIT über die Bindung an CD155 auf APC direkt die IL-12-Expression inhibieren und die Tolerogenität und IL-10Produktion induzieren. Über die IL-10-Produktion sind die APC dann selber in der Lage TRESPImmunantworten zu kontrollieren (siehe Kapitel 1.9) [5, 96]. DISKUSSION 121 Auch bei der Expression von IRs kann das IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10 autokrin wirken. Hier konnte gezeigt werden, dass IL-10 die Expression von LAG-3 und TIM3 positiv beeinflusst und so ebenfalls über die Induktion von IRs an der Selbstregulation von TH-Zellen beteiligt ist. Offensichtlich verleiht die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation neben den IL-10-vermittelten (selbst)regulatorischen Effektorfunktionen TH-Zellen auch die Möglichkeit, über direkten Zell-ZellKontakt Immunantworten zu kontrollieren. Abb. 5.5 In vivo Modell zur IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten Induktion eines regulatorischen Phänotyps in THZellen – Teil II. ZUSAMMENFASSUNG 122 6 ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMENFASSUNG 123 Die Produktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 von TH-Zellen ist ein wesentlicher Mechanismus zur Regulation von Immunantworten. Hierbei können professionelle regulatorische T-Zellen suppressive Funktionen übernehmen oder IL-10-produzierende TH-Zellen sich selber regulieren. Trotz der zahlreich beschriebenen Induktions- und Identifikations-Möglichkeit von IL-10produzierenden TH-Zell-Subpopulationen ist bisher unklar, inwieweit die Fähigkeit der IL-10Produktion im Menschen professionellen regulatorischen T-Zellen wie TREG oder TR1-Zellen vorbehalten ist, oder ob prinzipiell alle humanen TH-Zellen dazu in der Lage sind. Während die transkriptionelle Regulation von IL-10 in murinen TH-Zellen mittlerweile gut nachvollzogen werden kann, weiß man nur unzureichend über notwendige Transkriptionsfaktoren bei der IL-10-Expression in humanen TH-Zellen Bescheid. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Stimulation mit den Zytokinen IFN-α, IL-6 und IL-21 sowie die Aktivierung des Notch-Signalweges über den Liganden DLL4 in naiven TH-Zellen und allen wesentlichen TH-Subpopulationen (TH1, TH2, TH17 und TH1/17) eine massive IL-10-Produktion induzieren kann – unabhängig von der Fähigkeit TH-Effektorzytokine zu produzieren. Damit stellt die IFN-α/IL-6/IL-21-Modulation einen generellen und optimierten Mechanismus der IL-10-Induktion in TH-Zellen dar. Die Untersuchung der transkriptionellen Regulation erbrachte, dass subpopulationsübergreifend die Transkriptionsfaktoren c-Maf und Blimp-1 notwendig sind für die IL-10-Produktion in humanen THZellen. Hierbei werden beide Transkriptionsfaktoren sowohl für die Zytokin-vermittelte (IFN-α/IL-6/IL-21) als auch für die DLL4-vermittelte IL-10-Induktion benötigt. Zusätzlich induziert IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die IL-10 assoziierten Transkriptionsfaktoren NFIL3 und IKZF3. Die IL-10induzierende Wirkung vermitteln IFN-α, IL-6 und IL-21 hierbei über STAT3. Dieser antiinflammatorischen Wirkung steht STAT1 entgegen, welches ebenfalls durch IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induziert wird und die IFN-α-vermittelte IL-10-Produktion inhibiert. Daraus ergibt sich für die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation eine STAT1/STAT3-vermittelte Balance zwischen Pathogenbekämpfender, inflammatorischer Immunantwort via STAT1 und Immunregulation zum Schutz vor chronischen Entzündungen via STAT3. Der Vergleich der TH-Subpopulationen zeigte, dass TH1/17-Zellen eine verringerte Fähigkeit zur IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Produktion aufweisen. Komplette memory TH-Zellen von CED-Patienten haben gleichzeitig mehr TH1/17-Zellen im peripheren Blut als gesunde Spender. Diese TH1/17-Zellen wiederum produzieren nach IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation noch weniger IL-10 als ihre Pendants in gesunden Spendern und haben gleichzeitig einen Blimp-1-Defekt. Offenbar liegt in CED-Patienten eine eingeschränkte Selbstregulationsfähigkeit in TH-Zellen vor, wobei ein Defekt in der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten Blimp-1-Expression ein Grund dafür sein könnte. Über IL-10 hinaus bewirkt die Stimulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 die Expression der inhibitorischen Rezeptoren PD-1, CTLA4, LAG-3, TIM3 und TIGIT. Mit deren Hilfe sind TH-Zellen ZUSAMMENFASSUNG 124 in der Lage, ihre eigenen suppressiven Kapazitäten zu verstärken oder andere TH-Zellen oder APC zu inhibieren. Zusätzlich bewirkt IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auch die CD49b-Expression, das zusammen mit LAG-3 in vivo TR1-Zellen identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 keine wesentliche Inhibition der inflammatorischen Effektorfunktionen erkennen lässt, sondern eher die zusätzliche Induktion von IL-10 und anderen anti-inflammatorischen Eigenschaften. Daher beschreibt die IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation vielmehr die Fähigkeit zur Selbstregulation von TH-Zellen, die in CED-Patienten beeinträchtigt zu sein scheint. Die Tatsache, dass IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auch in memory TH-Zellen und unabhängig vom TH-Phänotyp große Mengen IL-10 induziert und darüber hinaus auch Rezeptor-phänotypisch TR1-Merkmale in TH-Zellen hervorruft, hinterfragt die Definition einer gesonderten TR1-Subpopulation. Aufbauend auf diese Arbeit sollte mit weiterführenden Versuchen das Verständnis der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten Selbstregulation verbessert werden. Das würde die Grundlage schaffen für die Identifizierung und Entwicklung neuer Therapieansätze für Krankheiten in denen die Autoregulation und/oder die IL-10-Produktion von TH-Zellen beeinträchtigt ist. LITERATURVERZEICHNIS I 7 LITERATURVERZEICHNIS LITERATURVERZEICHNIS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. II Delves, P.J. and I.M. 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ANHANG XI 8 ANHANG ANHANG XII 8.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS APC Blimp-1 c-Maf CAPS CCR CD cDNA CED CHO-Zelle CpG Csf2 CTLA4 CU CXCR DC DLL4 DMEM DNA dsRNA EAE ELISA FACS FCS FITC FSC GIT GM-CSF GMP GSK3 Gzmb HES HLA-DR ICOS ICOS-L IFN Ifnar Antigenpräsentierende Zelle // Allophycocyanin (Fluorochrom) B-Lymphocyte-Induced Maturation Protein 1 C-Maf Proto-Oncogene Cryopyrin-assoziiertes periodisches Syndrom C-C Chemokinrezeptor Cluster of Differentiation Komplementäre Desoxyribonukleinsäure Chronisch entzündliche Darmerkrankung Chinese Ovary Hamster Zelle CpG-Oligonukleotid Colony Stimulating Factor 2 (Gen) Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4 Colitis ulcerosa C-X-C Motiv Chemokinrezeptor Dendritische Zelle Delta-like 4, Notch-Ligand Dulbecco's Modified Eagle's Medium Desoxyribonukleinsäure Doppelsträngige RNA Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis Enzyme-linked Immunosorbent Assay Fluorescent-associated cell sorting Fetal Bovine Serum South America Fluoresceinisothiocyanat Forward Scatter Gastrointestinaltrakt Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor Good Manufacturing Practice Glykogensynthase-Kinase 3 Granzym B (Gen) Hairy And Enhancer Of Split Human Leukocyte Antigen - antigen D Related, MHC-II Rezeptor Inducible T-Cell Costimulator Inducible T-Cell Costimulator Ligand Interferon Ifng Interferon-γ (Gen) Immunglobulin IKAROS Family Zinc Finger 3 Interleukin Interleukin 1 Receptor Antagonist Rekombinantes chimäres Protein aus humanem IL-21-Rezeptor und Fc-Domäne Interleukin 1 Receptor Antagonist (Gen) Inhibitorische Rezeptoren Interferon Regulatory Factor Interferon-Stimulated Gene Factor Juvenile idiopathische Arthritis Lymphocyte-Activation Gene 3 Lipopolysaccharide Magnetische Zellsortierung C-Maf Proto-Oncogene (Gen) Morbus Crohn Myeloide dendritische Zelle Ig IKZF3 IL IL-1ra IL-21RFc Il1rn IRs IRF ISGF JIA LAG-3 LPS MACS Maf MC mDC Interferon-α Rezeptor (Gen) ANHANG MHC mRNA MS NFIL3 NIZD NK-Zelle nTREG ODN PAMP PBMC PBS PCR PD-1 pDC Pdcd1 PE PEB PerCP PI3K PMA Prdm1 PRR pTREG R RA rh RISC rm RNA RPMI RT RT-PCR RT-STA RTE SEB SEM SIT SLE SNP SSC STAT TCR TFH TGF Tgfb1 TH-Zelle TIGIT TIM3 TLR TNF TR1-Zelle TREG α XIII Major Histocompatibility Complex Messenger RNA Multiple Sklerose Nuclear Factor, Interleukin 3 Regulated Intrazelluläre Domäne von Notch Natürliche Killerzelle Natürliche TREG Oligodesoxyribonukleotide Pathogen Associated Molecular Patterns Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes Phosphatgepufferte Salzlösung Polymerase Chain Reaction Programmed Cell Death Protein 1 Plasmacytoide dendritische Zelle Programmed Cell Death 1 (Gen) Phycoerythrin Phosphatgepufferte Salzlösung + Bovine Serum Albumin + EDTA Peridinin-Chlorophyll-Protein Phosphoinositid-3-Kinasen Phorbol-12-myristat-13-acetat Positive Regulatory Domain I-Binding Factor 1 (Gen – codiert für Blimp-1) Pattern Recognition Receptor Periphere TREG Rezeptor Rheumatoide Arthritis Rekombinant human RNA-induced Silencing Complex Rekombinant murin Ribonukleinsäure Roswell Park Memorial Institute Medium Raumtemperatur Real-Time Polyermase Chain Reaction Reverse Transcription-Specific Target Amplification Recent Thymic Emigrants Staphylococcus Enterotoxin B Standard Error of the Mean Spezifische Immuntherapie Systemischer Lupus erythematodes Single Nucleotide Polymorphism Side Scatter Signal Transducer and Activator of Transcription T-Zell-Rezeptor Follikuläre T-Helfer-Zelle Transforming Growth Factor Transforming Growth Factor Beta 1 (Gen) T-Helfer-Zelle T-Cell Immunoreceptor With Ig And ITIM Domains T-Cell Immunoglobulin And Mucin Domain-Containing Protein 3 Toll-like Rezeptor Tumornekrosefaktor Typ 1 regulatorische T-Zelle Regulatorische T-Zelle anti ANHANG XIV 8.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abb. 1.1 Phänotypen von peripheren CD4+ TH-Zellen............................................................................ 5 Abb. 1.2 TH-Zell-Differenzierung. .......................................................................................................... 8 Abb. 1.3 IL-10-induzierende Signale und Transkriptionsfaktoren in TH-Zellen. .................................. 14 Abb. 1.4 Notch-Expression und -Aktivierung. ...................................................................................... 16 Abb. 3.1 Isolation von naiven und memory TH-Zellen .......................................................................... 30 Abb. 3.2 FACS-Isolation von TH-Subpopulationen. ............................................................................. 31 Abb. 4.1 Zytokin- und Notch-vermittelte Induktion von IL-10 in humanen naiven und memory THZellen. ............................................................................................................................................ 46 Abb. 4.2 Induktion der IL-10-Produktion und Il10 mRNA-Expression in humanen naiven und memory TH-Zellen durch die Modulation mit IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 ..................................................... 47 Abb. 4.3 Notwendigkeit von STAT3, IL-6 und IL-21 für die IFN-α/DLL4–vermittelte IL-10Expression. .................................................................................................................................... 49 Abb. 4.4 IL-6- und IL-21-Expression in IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-modulierten naiven und memory THZellen. ............................................................................................................................................ 52 Abb. 4.5 Induktion der IL-21-Expression in humanen naiven und memory TH-Zellen ........................ 53 Abb. 4.6 DLL4-vermittelte IL-10-Induktion in unterschiedlich differenzierten Subpopulationen von naiven und memory TH-Zellen. ...................................................................................................... 54 Abb. 4.7 IL-10-Kinetiken: mRNA-Expression und Konzentration im Zellkulturüberstand. ................ 56 Abb. 4.8 Stabilität der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten IL-10-Expression. .................................. 57 Abb. 4.9 Einfluss der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-Modulation auf andere Effektorzytokine. .................. 58 Abb. 4.10 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte Induktion von inhibitorischen Rezeptoren und regulatorischen Transkriptionsfaktoren. ........................................................................................ 60 Abb. 4.11 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion innerhalb Effektorzytokinproduzierender memory TH-Zellen. ............................................................................................... 62 Abb. 4.12 Phänotyp-Bestimmung von TH-Subpopulationen. ................................................................ 64 Abb. 4.13 Induktion von IL-10 mittels IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in TH-Subpopulationen. .................. 66 Abb. 4.14 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelte IL-10-Induktion innerhalb der Effektorzyokinpositiven und -negativen TH-Zellen: Vergleich von TH1-, TH17- und TH1/17-Zellen. .................. 68 Abb. 4.15 Einfluss von IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 auf die Expression von TH-Effektorzytokinen. ....... 71 Abb. 4.16 Induktion eines regulatorischen Phänotyps in TH-Subpopulationen. ................................... 72 Abb. 4.17 Reifung und DLL4-Expression in mDC und pDC durch TLR-Aktivierung. ....................... 73 Abb. 4.18 IL-10-Induktion in naiven und memory TH-Zellen mittels DLL4-exprimierender mDC und pDC. ............................................................................................................................................... 74 Abb. 4.19 IFN-α/IL-6/IL-21-modulierte TH-Zellen können in Monozyten einen regulatorischen Phänotyp induzieren und die Proliferation von TH-Zellen inhibieren. .......................................... 76 Abb. 4.20 Induktion von IL-10 via IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 in Foxp3+ TREG. ..................................... 78 Abb. 4.21 IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4 induziert die Expression von Maf und Prdm1 in memory THZellen. ............................................................................................................................................ 80 Abb. 4.22 c-Maf und Blimp-1 sind assoziiert mit der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10Produktion. .................................................................................................................................... 81 Abb. 4.23 c-Maf ist assoziiert mit der IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten IL-10-Produktion in THSubpopulationen. ........................................................................................................................... 82 Abb. 4.24 siRNAs gegen Maf und Prdm1 verringern die Expression gegen ihre Zielgene, c-Maf und Blimp-1 beeinflussen aber nicht gegenseitig ihre Expression. ...................................................... 83 Abb. 4.25 c-Maf und Blimp-1 sind notwendig für eine optimale IL-10-Produktion. ........................... 84 Abb. 4.26 DLL4 und IFN-α/IL-6/IL-21 benötigen c-Maf und Blimp-1 zur Induktion der IL-10Produktion ..................................................................................................................................... 85 Abb. 4.27 Rolle von STAT1, STAT3 und STAT4 bei der IFN-α/DLL4-vermittelten IL-10-Induktion in humanen TH-Zellen. ................................................................................................................... 87 ANHANG XV Abb. 4.28 Endogenes IL-10 beeinflusst den IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-induzierten regulatorischen Phänotyp von memory TH-Zellen. ................................................................................................. 88 Abb. 4.29 Periphere memory TH-Zellen von CED-Patienten weisen ein verstärkt inflammatorisches Zytokinprofil auf............................................................................................................................ 91 Abb. 4.30 Blimp-1 und c-Maf-Expression in Effektorzytokin-produzierenden, IFN-α/IL-6/IL21/DLL4-modulierten memory TH-Zellen von CED-Patienten und gesunden Kontrollen. .......... 93 Abb. 5.1 Modell zur synergistischen Induktion von IL-10 in humanen TH-Zellen. ............................ 100 Abb. 5.2 Unterschiede der transkriptionellen Regulation von IL-10 zwischen murinen und humanen TH-Zellen ..................................................................................................................................... 105 Abb. 5.3 Verminderte Selbstregulation von TH-Zellen in CED-Patienten. ......................................... 114 Abb. 5.4 In vivo Modell zur IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten Induktion eines regulatorischen Phänotyps in TH-Zellen – Teil I. .................................................................................................. 118 Abb. 5.5 In vivo Modell zur IFN-α/IL-6/IL-21/DLL4-vermittelten Induktion eines regulatorischen Phänotyps in TH-Zellen – Teil II.................................................................................................. 121 8.3 TABELLENVERZEICHNIS Tab. 3.1 MACSiBeads ............................................................................................................................ 34 Tab. 3.2 Kulturmedium für CHO-Zellen ............................................................................................... 35 Tab. 3.3 Stimulationsbedingungen ........................................................................................................ 36 Tab. 3.4 Aktivierungszeiten von TH-Zellen ........................................................................................... 36 Tab. 3.5 TLR-Aktiverung von DC ........................................................................................................ 37 Tab. 3.6 Reagenzien reverse Transkription ........................................................................................... 39 Tab. 3.7 Temperaturprofil reverse Transkription .................................................................................. 40 Tab. 3.8 Reaktionsmix Real-Time-PCR ................................................................................................ 40 Tab. 3.9 Temperaturprofil Real-Time-PCR ........................................................................................... 40 Tab. 3.10 Reaktionsmix 1 ...................................................................................................................... 40 Tab. 3.11 TaqMan-Reaktionsmix .......................................................................................................... 41 Tab. 3.12 RT-STA-Reaktionsmix.......................................................................................................... 41 Tab. 3.13 Temperaturprofil RT-STA..................................................................................................... 41 Tab. 3.14 Assay-Platte ........................................................................................................................... 41 Tab. 3.15 Sample-Platte ......................................................................................................................... 41 Tab. 3.16 Transfektions-Mastermix ...................................................................................................... 42 Tab. 4.1 Zytokin- und Notch-vermittelte Induktion von IL-10 in naiven und memory TH-Zellen. ...... 50 Tab. 4.2 DLL4-vermittelte IL-10-Induktion in unterschiedlich differenzierten Subpopulationen von naiven und memory TH-Zellen. ...................................................................................................... 54 ANHANG XVI 8.4 DANKSAGUNG An dieser Stelle möchte ich den Personen danken, die mich auf dem Weg zu dieser Arbeit begleitet haben. Zunächst gilt mein Dank Roland Lauster dafür, dass er sich mir und meiner Arbeit angenommen hat und mir so die völlig reibungslose Promotion an der TU Berlin ermöglicht hat. Alexander Scheffold möchte ich für die Möglichkeit danken, diese Arbeit in seiner Arbeitsgruppe anzufertigen. Ich danke dir für die großartige Betreuung, den kreativen Freiraum und die Geduld, die du mit mir hattest. Petra Bacher, Christian Neumann, Freddy Heinrich, Marko Janke und Thordis Hohnstein danke ich für die hervorragende fachliche und praktische Unterstützung bei meinen Aufgaben und Problemen und für die anregenden Diskussionen, ohne die ich vermutlich nicht immer den richtigen Weg gefunden hätte. Bei der gesamten AG Scheffold, inklusive aller ehemaligen Kollegen, die mich begleitet haben, möchte ich mich bedanken für die äußerst angenehme Arbeitsatmosphäre und die zahlreichen helfenden Hände zu jeder Zeit. Besonderer Dank gilt hier Freddy, der mich 2010 als hervorragender Betreuer meiner Bachelorarbeit in die AG integriert hat. Laura Lozza und Manuela Staeber danke ich für die essentielle Unterstützung und Geduld bei der Durchführung der Multiplex-Real-Time-PCR. Nadine Mockel-Tenbrinck gilt mein Dank für die technische Unterstützung bei der Herstellung der DLL4-MACSiBeads, die wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit sind. Jochen Maul danke ich für die Zusammenarbeit bei der Bearbeitung der CEDKohorte. Meinen Freunden Philipp, Lutz und Jan und meinem Bruder Bernhard habe ich zu danken für die freundschaftliche Unterstützung und notwendige Ablenkung während der gesamten Doktorarbeitszeit. Es ist und war schön euch während dieser Zeit um mich zu haben. Mein größter Dank gilt meinen Eltern Hildegund und Friedhelm. Ich hätte diesen Weg niemals ohne euch und eure permanente, unerschütterliche Unterstützung gehen können. Ich hatte 2007 die passionierte, aber doch sehr diffuse Idee, nach Berlin zu gehen, die mich letztendlich bis hierher geführt hat. Ihr habt zu jeder Zeit unumstößlich hinter mir gestanden. Ich hoffe, ich kann euch hiermit einen Teil zurückgeben. DANKE. ANHANG XVII 8.5 PUBLIKATIONSLISTE Christian Neumann, Frederik Heinrich, Katrin Neumann, Victoria Junghans, Mir-Farzin Mashreghi, Jonas Ahlers, Marko Janke, Christine Rudolph, Nadine Mockel-Tenbrinck, Anja A. Kuehl, Markus M. Heimesaat, Charlotte Esser, Sin-Hyeog Im, Andreas Radbruch, Sascha Rutz, Alexander Scheffold: Role of Blimp-1 in programing Th effector cells into IL-10 producers. Journal of Experimental Medicine 07/2014
