Untersuchungen über den Einfluss von p53

Aus der Klinik für Chirurgie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. H.-P. Bruch
Untersuchungen über den Einfluss von p53-Mutationen
auf die Expression des Vascular Endothelial Growth
Factors (VEGF) in humanen kolorektalen Karzinomen
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der Medizinischen Fakultät -
vorgelegt von
Steffen W. Pfarr
aus Wesel
Lübeck 2005
1.
Berichterstatter: Prof. Dr. med. Rainer Broll
2.
Berichterstatter: Prof. Dr. med. Alexander Herold
Tag der mündlichen Prüfung: 13.01.2006
Zum Druck genehmigt, Lübeck den 13.01.2006
2
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
6
1.1
Der Angiogenesefaktor Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
7
1.1.1
Molekulare und biologische Eigenschaften von VEGF
8
1.1.2
Rezeptor und Signaltransduktion des VEGF
10
1.1.3
VEGF-Expression in Neoplasien
12
1.2
Das Tumorsuppressorgen p53
13
1.2.1
Das p53-Gen
13
1.2.2
Eigenschaften des Genproduktes Wildtyp-p53-Protein (Wt-p53)
14
1.2.3
Mutiertes p53 (Mut-p53)
16
1.2.4
p53-Mutationen und kolorektale Tumore
17
1.3
Zusammenhang zwischen VEGF und p53
18
1.4
Zielsetzung
19
2
Material und Methoden
21
2.1
Patienten
21
2.2
Histologie
22
2.3
Gewebevorbereitung
23
2.4
Ermittlung der VEGF-Konzentration in den Gewebeproben
23
2.4.1
Proteinextraktion
23
2.4.2
Ermittlung der Gesamtproteinkonzentration
24
2.4.3
VEGF-Konzentrationsmessung
25
2.5
Mutationsanalyse im p53-Gen der Gewebeproben
27
2.5.1
DNA-Extraktion
27
2.5.2
Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR)
30
2.5.2.1
Gelelektrophorese mit zeitlichem Temperaturgradienten, (Temporal Temperature
Gradient Electrophoresis, TTGE) und Gelelektrophorese mit einem Denaturans
Gradienten Gel (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)
34
2.5.3
Sequenzierung
41
2.5.3.1
Klonierung der amplifizierten Homoduplex-DNA
42
2.5.3.2
Durchführung der Sequenzierung
45
2.6
Statistik
48
3
3
Ergebnisse
49
3.1
Alterationen des p53-Gens im Normal- und Tumorgeweben
49
3.2
Lokalisation und Art der p53-Mutationen
50
3.3
Art der nachgewiesenen Mutationen
53
3.4
VEGF-Konzentration im Normal- und im Tumorgewebe
54
3.5
VEGF-Konzentration im Normal- und Tumorgewebe von Patienten
55
mit und ohne Mutation im p53-Gen
3.6
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit Lokalisation
der Mutation im Exon 5,6,7 oder 8
3.7
57
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne p53-Mutation
in Abhängigkeit vom Geschlecht
3.8
58
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen
getrenntnach Lokalisation des Tumors
3.9
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen
unterteilt in Dukes-Stadien
3.10
59
60
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe zwischen Patienten mit und
ohne Mutation beiunterschiedlicher Invasionstiefe des Tumors nach dem
TNM-System
3.11
62
VEGF-Konzentrationen bei Patienten mit Mutationen in Codons, die für die
DNA-bindende Struktur und die Tertiärstruktur des p53-Proteins kodieren
63
4
Diskussion
65
4.1
Häufigkeit von p53-Mutationen und Mutationstypen
65
4.2
VEGF Konzentration im Tumor- und Normalgewebe
70
4.3
VEGF Konzentration bei Tumoren mit und ohne Mutation im p53-Gen
71
4.4
Schlussfolgerung
74
5
Zusammenfassung
76
6
Literaturverzeichnis
79
7
Anhang
96
7.1
Abkürzungen in alphabetischer Reihenfolge
96
7.2
Materialien
96
4
7.3
Geräte
104
7.4
Analysedaten
107
7.5
Abbildungsverzeichnis
112
7.6
Tabellenverzeichnis
112
8
Danksagung
114
9
Lebenslauf
115
5
1
Einleitung
Die Entstehung von kolorektalen Karzinomen ist ein kontinuierlicher Prozess. Die zugrunde
liegenden genetischen Alterationen treten in einer bestimmten zeitlichen Reihenfolge auf und
beeinflussen die biologischen Eigenschaften der Tumore [37,178]. Die Tumorgenese aus
gesunder Schleimhaut über ein Adenom bis hin zum Karzinom in Abhängigkeit der genetischen
Alterationen beschrieben Vogelstein et al. [172] mit der Adenom-Karzinom-Sequenz. Als
molekulargenetische Grundlage gilt in diesem Modell die Akkumulation von Mutationen in dem
Genom
einer
einzigen
Zelle
oder
eines
kleinen
Zellverbandes.
Aus
diesen
Genomveränderungen resultieren entweder eine Aktivierung von Onkogenen oder die
Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen [37]. Zu den Tumorsuppressorgenen werden das
APC-(Adenopolyposis Coli)Gen, das DCC-(Deleted in Colorectal Cancer)Gen sowie das p53Tumorsuppressorgen
gezählt
[91].
Onkogene
vermitteln
im
aktiven
Zustand
einen
Proliferationsreiz, die physiologische Funktion der Tumorsuppressorgene besteht darin, das
unkontrollierte Zellwachstum zu unterdrücken.
Die veränderte Aktivität der Suppressorgene stellt einen entscheidenden Schritt in der
Tumorprogression dar. Eine Störung in dem Verhältnis dieser Regulatoren kann zu
pathologischem Zellwachstum im Sinne eines malignen Prozesses führen. Zur Induktion einer
Transformation der Zelle vom physiologischen zum malignen Zustand wird die Aktivierung
mehrerer Onkogene benötigt [95,99]. Qualitative und quantitative Veränderungen auf der Ebene
der Transkription und Translation, die zur veränderten Expression oder zum Verlust der
transkriptionellen Regulation führen, beeinflussen die Funktion oder die Menge der
Genprodukte. Das Tumorsuppressorgen p53 wird hauptsächlich durch missense-Mutation oder
Deletion in einem oder beiden Allelen inaktiviert. Dadurch unterscheidet sich dieses von
anderen Tumorsuppressorgenen, die regelmässig durch Deletionen oder nonsense-Mutationen
inaktiviert werden, oder von Onkogenen der ras-Familie, die durch Mutationen in wenigen gut
definierten Kodons aktiviert werden [9]. Mutationen im p53-Gen treten regelmässig in
kolorektalen Karzinomen auf [9]. Entgegen dem 1990 postulierten Modell von Fearon und
Vogelstein [37], welches sukzessive genetische Veränderungen bei kolorektalen Malignomen
(CRC, colo rectal cancer), in den Genen APC, k-ras, DCC und p53 beschreibt, scheint aus
heutiger Sicht die Summe der Mutationen und deren zeitliche Reihenfolge für die Tumorgenese
relevant zu sein [7,24,172]. Folgende Schemata der Mutationsabfolge werden bei kolorektalen
Tumoren als Grundlage vorgeschlagen: Mutation in k-ras und folgend in APC, SMAD 2/4, p53
[7], oder zuerst eine Mutation im APC, folgend COX-2-(Cyclooxygenase 2) Überexpression,
anschließend eine Mutation in k-ras, p53 und 18q Allel-Verlust (Genlokus für u.a. DCC/SMAD
2/4) [24].
6
Neben dem Mutationsmuster der Tumore ist auch der, zum Teil durch die Mutationen bedingte,
Einfluss von Wachstumsfaktoren entscheidend für das weitere Proliferationsverhalten. Es zeigte
sich ein supportiver Einfluss des „Vascular Endothelial Growth Factors“ (VEGF) auf die
Progression von Adenomen zu kolorektalen Karzinomen. Die VEGF-Expression ist während der
Progression vom Adenom zum Karzinom in kolorektalen Tumoren schrittweise verstärkt [84,93].
1.1
Der Angiogenesefaktor Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
Der Vascular Endothelial Growth Factor ist ein potenter mitogener und angiogener Faktor,
welcher selektiv auf vaskuläre Endothelzellen wirkt [39,58,122] und möglicherweise auch die
Chemotaxis von Monozyten stimuliert [38,43,57,88]. Die Entstehung von neuen Blutgefäßen
aus schon vorhandenem Gefäß-Endothelium ist eine wichtige Komponente der Angiogenese.
Der 1989 entdeckte VEGF [39,58], auch als „Vascular Permeability Factor“ (VPF) [26] und
Vasculotropin [122] bekannt, ist ein fundamentaler Regulator der physiologischen und
pathologischen Angiogenese [43].
Im Rahmen der Tumorprogression wird das zu versorgende Tumorvolumen größer. Für viele
Neoplasieentitäten gilt, daß zu Beginn des Wachstums die Tumorzellen nach dem „cooptedvessel-model“ vorhandene Kapillaren als nutritive Gefäße rekrutieren. Das „besetzte“
Gefäßsystem unterliegt im Verlauf nicht der tumorinduzierten Angiogense. Diese Gefäße ziehen
sich aus dem Versorgungsgebiet ab einem bestimmten Zeitpunkt im Sinne einer „host-defenceReaktion“ zurück [72,73]. Wird nun ein kritischer Punkt erreicht, an dem die Perfusion durch das
noch vorhandene, den Tumor umgebende Gefäßnetz nicht mehr ausreicht, kann das
Wachstum der neoplastischen Zellen im Tumorverbund nicht über ein Volumen von 1-2mm3
hinaus expandieren. Erlangt der Tumor über angiogene Mechanismen wie z.B. ein verändertes
Expressionsmuster des antiangiogenen Angiopoietin-2 oder dem Agonisten VEGF die Potenz
zur Gefäßneubildung, nimmt sein Wachstum jedoch exponentiell zu [46,47,56,72].
Es zeigt sich eine gesteigerte VEGF-mRNA-Expression und vermehrte VEGF-Rezeptor-mRNA
in den zu den Tumoren benachbarten Endothelzellen [162]. Die VEGF-Expression ist in
avaskulären Arealen von Tumoren besonders stark. Hypoxie induziert die VEGF-Expression
und stimuliert bzw. reguliert somit die Tumorangiogenese, unabhängig von den einzelnen
genetischen Mutationen, die zur Transformation geführt haben. Der Tumorwachstumsvorteil
durch die VEGF-Expression scheint eine Konsequenz aus der parakrinen Stimulation der
Angiogenese zu sein [162]. Zusätzlich zu seiner mitogenen Aktivität beeinflusst VEGF die
Glukoseaufnahme und die Produktion von Gewebefaktoren, Kollagenasen und PlasminogenAktivatoren in Endothelzellen [165].
7
1.1.1
Molekulare und biologische Eigenschaften von VEGF
Das humane VEGF-Gen ist auf dem Chromosom 6p21.1 lokalisiert. Die kodierende Sequenz
spannt sich über einen Bereich von etwa 16kb. Das Gen besteht aus 8 Exons, getrennt durch 7
Introns [43,76,82,124,165,167]. Durch alternatives Verspleissen der mRNA können mindestens
fünf verschiedene Isoformen des VEGF-Proteins entstehen. Diese werden je nach Anzahl der
Aminosäuren bezeichnet (VEGF121, VEGF145, VEGF
165,
VEGF189 und VEGF206) und setzen sich
aus den Produkten der Exons des VEGF-Gens wie in Abbildung 1 zu sehen zusammen [43,
76,82,124,165,167].
Abbildung 1: Die fünf verschiedenen Isoformen des humanen VEGF entstanden durch Translation
alternativ verspleisster VEGF-mRNA. Exon I kodiert für ein Signalpeptid, das wie die Produkte der Exons
II-V und des Exon VIII in allen Isoformen präsent ist. Die durch die Exons III und IV kodierten Abschnitte
werden für die Bindung an VEGFR-1 und VEGFR-2 benötigt. Die Isoformen unterscheiden sich durch die
An- oder Abwesenheit der durch die Exon VI- und Exon VII- kodierten Aminosäuren, welche
hauptsächlich die Heparinbindung vermitteln bzw. für die Interaktion mit Neuropilin-1 verantwortlich sind
[n. 112,134].
Das als Dimer vorliegende VEGF-Protein besitzt in Abhängigkeit von der Anzahl der
Aminosäuren ein Molekulargewicht von 45-46kDa [41], das sich auf zwei Untereinheiten mit
jeweils etwa 23kDa verteilt [26]. Alle Isoformen verfügen über eine für sekretierte Proteine
typische N-terminale Sequenz. Sie unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, Heparin zu binden.
Während VEGF121 kaum Heparin bindet, ist für VEGF189 und VEGF206 eine starke und für
VEGF165 sowie VEGF145 eine mittelgradige Affinität für Heparin nachgewiesen [42,43,114]. Nur
VEGF121 liegt ausschliesslich in löslicher Form vor, VEGF189 und VEGF206 hingegen sind in
bioaktiver Form subepithelial an Heparin enthaltende Proteoglykane in der extrazellulären
Matrix (ECM) gebunden. Aus der ECM können diese mit Hilfe von Heparin und Plasmin durch
Spaltung am COOH-Terminus freigesetzt werden [43,77,117]. Die beiden Isoformen VEGF145
8
und VEGF165 liegen sowohl in löslicher Form als auch gebunden an die ECM vor [42,124].
VEGF165 ist die dominierende Isoform, welche in einer Reihe von normalen und transformierten
Zellen produziert wird. Transkripte, die für VEGF121 und VEGF189 kodieren, werden in der
Mehrzahl der Zellen und Gewebe gefunden, die das VEGF-Gen exprimieren [40]. Das VEGFProtein kann durch zwei Mechanismen für die endothelialen Zellen verfügbar werden, als frei
lösliches Protein (VEGF121/165) oder als Folge einer Protease-Aktivierung und Spaltung der
längeren Isoformen [43].
Die VEGF-Expression ist unter hypoxischen [121,152,153] aber auch unter hypoglykämischen
[20,153] Bedingungen erhöht. Dies geschieht über zwei Mechanismen, zum einen über
vermehrte Transkription z.B. über die Aktivierung durch HIF-1 [20,158], zum anderen über eine
Stabilisierung der mRNA [158]. Das VEGF-Gen kann durch einige Wachstumsfaktoren und
Zytokine induziert [38] oder in bestimmten Tumorentitäten durch die gesteigerte Expression des
ras-, raf-, src- oder mutierten p53-Gens reguliert werden [57,61,111,128,176]. Auch die
Akkumulation von Adenosin, welche unter hypoxischen Bedingungen auftritt, ist an der
Induktion der Transkription des VEGF-Gens beteiligt [102]. Über den aktivierten Adenosin A2Rezeptor kommt es zu einer erhöhten intrazellulären cAMP-Konzentration. Diese steigert die
VEGF-mRNA-Konzentration über einen Proteinkinase A vermittelten Signalweg [160]. Eine
Aktivierung
des
Onkogens
c-Src
zeigt
ebenfalls
einen
positiven
Einfluss
auf
die
hypoxieinduzierte Hochregulation der VEGF-Gen Expression [111].
Die biologischen Wirkungen von VEGF treten spezifisch nur an vaskulären Endothelzellen auf,
unabhängig von der Lokalisation des Gefässbettes oder der Spezies. Dabei wirkt VEGF über
einen parakrinen Mechanismus auf die Endothelzellen [9,26,41,114]. An Gefässendothelzellen
bewirkt VEGF Migration und Mitose in vitro [41,58] sowie Angiogenese und erhöhte
Permeabilität in vivo [26,98,121,143]. Der mitogene Effekt in vitro ist halbmaximal bei VEGFKonzentrationen von 2-3pM und maximal bei 22pM [41]. In Übereinstimmung mit der
Hypothese, dass im Zuge der Angiogenese eine begrenzte extrazelluläre Proteolyse vonnöten
ist [158], induziert VEGF die Expression von Plasminogen-Aktivator (PA) und PlasminogenAktivator-Inhibitor in Endothelzellen [20]. Die Plasminogen-Aktivierung und Generierung des
Plasmins spielen eine wichtige Rolle in der Angiogenesekaskade. Die Koinduktion dieser
Faktoren produziert ein Umfeld, welches Migration und Aussprossen von Endothelzellen
ermöglicht [176]. Generierung des bioaktiven VEGF, das durch proteolytische Spaltung
entsteht, scheint besonders wichtig in der Mikroumgebung eines Tumors zu sein. In Tumornähe
wird eine erhöhte Konzentration von Proteasen, z.B. des Plasminogen-Aktivators nachgewiesen
[133,156]. Dvorak [35] vermutete, dass eine Steigerung der mikrovaskulären Permeabilität für
Proteine ein bedeutender Schritt in der Angiogenese ist.
Die VEGF-abhängige Phospholipase-D (PLD) Aktivität ist direkt an der Kontrolle der DNATranskription beteiligt; diese beeinflusst die Synthese des Zytoskelettes, welches einen
9
weiteren wichtigen Schritt in der VEGF vermittelten Neoangiogenese darstellt [4]. Die
verschiedenen Isoformen von VEGF mit ihren unterschiedlichen Eigenschaften bezüglich
Heparinbindung und Bindung an die extrazelluläre Matrix scheinen in unterschiedlicher Weise
die Angiogenese zu induzieren. Zelllinien aus der Maus, die nur einzelne Isoformen
exprimierten, waren nicht fähig, ein voll funktionsfähiges Gefäßnetz zu bilden. Einzig VEGF164,
in der Maus analog dem humanen VEGF165, konnte eine angiogene Antwort induzieren.
VEGF120, analog dem humanen VEGF121, konnte nur Arme umgebender Gefäße rekrutieren,
ohne eine Vaskularisierung des Tumors zu gewährleisten. VEGF188, analog dem humanen
VEGF189, bewirkte eine ausgedehnte Mikrovaskularisierung des Tumors ohne ausreichende
Versorgung durch größere Gefäße [62].
VEGF beeinflusst neben der Angiogenese auch das Überleben der Endothelzellen. So führte es
bei in-vitro Experimenten an Endothelzellen zur Inhibition der Apoptose bei gleichzeitig erhöhter
Expression der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und A1 [53]. Auch auf das Überleben von
Karzinomzellen scheint VEGF einen Einfluss zu haben. So konnte in vitro bei Erhöhung der
VEGF-Konzentration eine Verminderung der Apoptoserate von Adenokarzinomzellen aus
einem metastasierenden Mammakarzinom festgestellt werden. Es fand sich ebenfalls eine
erhöhte bcl2-Expression. Im Gegenzug hatte eine Inkubation mit Anti-VEGF-Antikörpern eine
Erhöhung der Apoptoserate zur Folge [119].
1.1.2 Rezeptoren und Signaltransduktion des VEGF
Die Expression der VEGF-Rezeptoren Flt-1 (VEGFR-1) und Flk-1/KDR (VEGFR-2) ist begrenzt
auf das vaskuläre Endothel [39,114]. Hypoxie und Hypoglykämie sind wie bei VEGF wirksame
Mediatoren, die Genexpression der VEGF-Rezeptoren zu erhöhen [168]. VEGF selbst kann die
Expression von VEGFR-2 und VEGFR-1 in humanen Endothelzellkulturen hochregulieren.
Auch andere Mediatoren wie TNF-α, oder TGF-β beeinflussen die Expression beider VEGFRezeptoren [43].
VEGF bindet mit hoher Affinität an seine Rezeptoren. Die Dissoziationskonstanten betragen für
Flt-1 Kd = 16pM und für Flk-1/KDR Kd = 760pM [170,174]. Die Bindung von VEGF165 an
VEGFR-2 kann dabei durch Neuropilin-1, einem Rezeptor der Collapsin/Semaphorin-Familie,
welcher als Co-Rezeptor wirkt, verstärkt werden [154]. Neuropilin-1 präsentiert VEGF165 dem
Flk-1/KDR Rezeptor mit dem Ergebnis, dass die Effektivität der Flk-1/KDR vermittelten
Signaltransduktion verstärkt wird [43]. Beide Rezeptoren sind transmembranöse Tyrosinkinasen
mit sieben immunglobulinartigen extrazellulären Domänen (ECD), einer transmembranösen
Domäne und einer intrazellulären Tyrosinkinase-Domäne mit einer „Kinase Insert Domain“
[55,127,164]. Ein zusätzliches Mitglied der RTK (Rezeptor-Tyrosin-Kinasen)-Familie mit sieben
Ig-ähnlichen Domänen in der ECD ist Flt-4 (VEGFR-3). Flt-4 ist jedoch kein wirklicher Rezeptor
10
für VEGF, bindet aber einen Liganden mit dem Namen VEGF-C oder VEGF-related peptide
(VRP). VEGF-C zeigt eine Wirkung als Regulator der Lymphgefäßentwicklung [43,81]. Ähnlich
wie andere Wachstumsfaktoren mit transmembranösen Tyrosinkinaserezeptoren unterzieht sich
auch der VEGF-Rezeptor einer Liganden-induzierten Dimerisierung [165]. Die LigandenRezeptor-Interaktion führt bei VEGFR-2 zu einer Reihe von Effekten, die bei VEGFR-1 nicht
oder nur in geringem Ausmaße auftreten [55,174]. So führt die Stimulation von VEGFR-2 durch
VEGF in vitro zur Autophosphorylierung. Tyrosinreste in der zytoplasmatischen KDR-Domäne
sind das Ziel der Auto- oder Transphosphorylierung. In vivo führt eine Aktivierung von
Phospholipase C-
(PLC- ) und PI(3)K sowie erhöhter intrazellulärer Calciumspiegel und
vermehrt freigesetzter von Willebrand Faktor zu gesteigerter Angiogenese und zur Erhöhung
der Gefäßpermeabilität [18,55,127,165]. Dabei spielt möglicherweise das „VEGF receptor
associated protein“ (VRAP) eine Rolle, das an der intrazellulären Domäne an die „Kinase Insert
Domain“ des VEGFR-2 bindet und selbst mit der PLC- assoziiert ist [182]. In vitro ist bei
Stimulation
von
VEGFR-2
eine
ausgeprägte
Änderung
der
Zellmorphologie,
eine
Reorganisation des Aktins, Mitogenese und Chemotaxis zu beobachten [174]. All dieses tritt bei
Stimulation von VEGFR-1 nicht auf, wenn auch die Stimulation von VEGFR-1 in vitro ebenfalls
zur Autophosphorylierung des Rezeptors führt, allerdings in einem weitaus geringerem
Ausmaße als bei VEGFR-2 [174]. In vivo kommt es nicht zu den oben bei VEGFR-2
beschriebenen Effekten [55]. Das durch VEGF induzierte Überleben von Endothelzellen durch
Hemmung der Apoptose wird über VEGFR-2, wahrscheinlich unter Einbeziehung der PI3Kinase, vermittelt [54]. VEGFR-2 scheint somit der Rezeptor zu sein, der für die Angiogenese
entscheidend ist. Sowohl VEGFR-1 als auch VEGFR-2 werden in Endothelzellen von Gefäßen,
die maligne Tumore versorgen, verstärkt exprimiert [20,120,176,177].
Der zur Zeit einzig bekannte endogen exprimierte VEGF-Inhibitor ist eine alternative
Spleissversion des FLT-1 VEGF-Rezepors. Die Spleissversion führt zu einer verkürzten
löslichen Form (sFLT), welche aus der Retention eines Introns innerhalb der mRNA resultiert.
Die entsprechende an diesem Intron nicht prozessierte mRNA wird bis zum ersten im
Leseraster liegenden Stopcodon translatiert. Das sFLT-1 Protein beinhaltet die N-terminalen
sechs der sieben extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen welche mit den 31-Intron kodierten
Aminosäuren der C-terminalen Sequenz fusionieren. sFLT-1 ist ein Heparin-bindendes Protein,
das VEGF mit der gleichen Affinität und annähernd äquivalenter Spezifität wie der FLT-1Rezeptor bindet. Es wird durch die vaskulären endothelialen Zellen exprimiert und kann deren
mitogene Antwort auf VEGF hemmen. Durch Heterodimerisierung mit den extrazellulären
Ligandenbindungsregionen der VEGF-Rezeptoren werden die Rezeptoren vor der TyrosinTransphosphorylierung geschützt und damit auch die Signaltransduktion und die funktionelle
Aktivierung gehemmt. Die erhöhte Expression von sFLT-1 durch Tumorzellen inhibiert in vivo
11
das Wachstum der soliden Tumore, bzw. die metastatische Aussaat in die Lymphknoten und
verlängert das Überleben der Versuchsgruppe [57,85].
1.1.3
VEGF-Expression in Neoplasien
Die Annahme, dass das Tumorwachstum angiogeneseabhängig ist und dass VEGF das
Aussprossen von Gefäßen fördert, wird durch Untersuchungen unterstützt, welche eine positive
Korrelation zwischen der Vaskularisierung humaner Tumore und der VEGF-mRNA-Expression
zeigten [38]. Es wurde eine erhöhte VEGF-mRNA-Expression in den Tumorzellen, nicht jedoch
in den Endothelzellen gefunden. In den Endothelzellen konnten jedoch erhöhte VEGF-ProteinKonzentrationen nachgewiesen werden [20,96,163,177]. Ebenso trat in den Tumorzellen sowie
in den tumorassoziierten Endothelzellen eine erhöhte Konzentration von mRNA, welche für
VEGFR-1 und VEGFR-2 kodiert, auf [20]. Innerhalb von Karzinomen bestehen lokale
Unterschiede
in
der
VEGF-Konzentration.
In
Glioblastoma
multiforme
und
anderen
Tumorentitäten mit einem hohen Anteil an nekrotischen Komponenten sind die VEGF-mRNAKonzentrationen in ischämischen Tumorzellen nahe den nekrotischen Arealen hoch
[20,38,152].
Bei Magenkarzinomen findet sich eine positive Korrelation zwischen VEGF-Expression und
Metastasierung, wobei Patienten mit erhöhter VEGF-Konzentration im Karzinom eine
schlechtere Prognose bezüglich der Überlebenszeit haben [103].
Verschiedenen Studien wiesen auch bei kolorektalen Karzinomen eine erhöhte VEGFExpression nach [19,20,96]. In Adenomen konnte hingegen keine erhöhte VEGF-Expression
gezeigt werden [96]. Die Expression von VEGF und VEGFR-2 scheint bei metastasierenden
kolorektalen Karzinomen stärker zu sein als bei nicht-metastasierenden kolorektalen
Karzinomen. Gleichzeitig korreliert die Expression von VEGF und VEGFR-2 mit dem Ausmaß
der Neovaskularisation [162].
Die VEGF-Konzentration im Serum kann bei kolorektalen Karzinomen gemeinsam mit dem
carcinoembryonalen Antigen (CEA) für die Marker-Diagnostik eingesetzt werden. Die
Serumkonzentration von VEGF korreliert nicht nur mit dem Volumen bzw. der Größe des
Tumors, sondern zeigt auch einen positiven Zusammenhang mit der Überlebenszeit der
Patienten mit kolorektalen Karzinomen [19]. Hieraus lässt sich eine Korrelation zwischen der
Prognose der Patienten mit kolorektalen Karzinomen und dem Ausmaß der Angiogenese im
Tumorgewebe erkennen [84]. In acht humanen Kolonkarzinomzelllinien und 30 humanen
Lebermetastasen von kolorektalen Karzinomen wurden erhöhte Konzentrationen von VEGFR2/KDR und Flt-1 mRNA in tumorendothelialen Zellen im Vergleich zur Kontrolle (aus gesundem
Lebergewebe) bzw. dem umgebenden Gewebe nachgewiesen [177]. Aus diesen Ergebnissen
bzw. Beobachtungen können Therapieansätze abgeleitet werden, die an den verschiedenen
12
Punkten
der
VEGF-vermittelten
Angiogenese
inhibierend
ansetzen.
VEGF-Antikörper
blockieren die VEGF-induzierte Endothelzellproliferation in vitro [90,125]. In vivo gelang im
Mausmodell eine Suppression des Tumorwachstums mittels VEGF-Antikörpern bei etablierten
Tumoren, zudem kam es zur Reduktion der Tumormasse, sowie zur Verringerung der
Gefäßdichte [177]. Mittlerweile sind diese Therapieoptionen auch auf den Menschen übertragen
worden, indem Anti-VEGF-Antikörper [90], Rezeptorantagonisten oder dominant negative
Rezeptormutanten in der Antitumortherapie eingesetzt werden können [108]. Derzeit ergeben
sich Therapieoptionen durch eine passive Immuntherapie mit Avastin, einem rekombinanten
humanen monoklonalem IgG1 Antikörper gegen VEGF. Auch zeigen aktive Immuntherapien mit
Impfungen unter Verwendung von Endothelzellen, dentritischen Zellen oder DNA sowie
verschiedene
Ansätze
zur
Inhibition
der
Ligand-Rezeptor-Interaktion
und
der
Signaltransduktion, welche zur Therapie von kolorektalen Karzinome eingesetzt werden,
antiproliferative Effekte. Nach Prüfung in verschiedenen klinischen Studien ist Avastin als
Therapieoption in den USA zur Therapie zugelassen [57,65,75]. Es konnte eine Verlängerung
der mittleren
Überlebenszeit und Reduktion der Tumorgröße, Vaskularisierung und
Tumorzellproliferation im Tiermodell dargestellt werden [81,90,145,164], des weiteren hemmen
Inhibitoren der Tyrosinkinaseaktivität von VEGFR-2 die Mitogenese in vitro sowie die
Neovaskularisation in vivo [33,96,141,164].
1.2
Das Tumorsuppressorgen p53
1.2.1
Das p53-Gen
Das p53-Gen ist auf dem Chromosom 17p13 lokalisiert. Es erstreckt sich über 20kb der
genomischen DNA und enthält 11 Exons, die zu einer 2,6kb mRNA transkribiert und verspleisst
werden [99]. Die Expression des p53-Gens wird über Cis-Elemente reguliert. Das
Tumorsuppressorgen besitzt keine TATAA oder CAAT Box. Die Transkription startet von der
Basenposition –114 am 3‘-Ende des Exon 1. Der p53-Promotor besitzt ein Helix-Schleife-HelixErkennungsmotiv (CACGTG) in Position +70 in Exon 1. An dieser Erkennungsstelle binden cMyc/Max Heterodimere und aktivieren die Transkription des p53-Promotors [33]. Die
transkriptionale Aktivierung wird durch das humane MDM2-(murine double minus-2 protein)
Protein negativ reguliert [33,99].
Das p53-Gen ist ein universeller Sensor des genotoxischen Stresses der Zelle. Dieses
Tumorsuppressorgen
kodiert
für
ein
im
Zellkern
lokalisiertes
Phosphoprotein
mit
antikarzinogener Eigenschaft. Der Verlust der physiologischen p53-Aktivität auf Grund einer
13
Mutation führt zur zellulären Immortalität und prädisponiert diese Zellen für weitere onkogene
Mutationen [59,67,92,99].
1.2.2
Eigenschaften des Wildtyp-p53-Proteins (Wt-p53)
Das humane 53kD grosse p53-Protein umfasst 393 Aminosäuren und ist unterteilt in 3
strukturelle und funktionelle Domänen (s. Abbildung 2). Die ersten 42 Aminosäuren am NTerminus stellen eine transkriptionelle Aktivator-Domäne dar, welche als positiver basaler
transkriptioneller Regulator der Genexpression wirkt [99]. Die Tetramerisierungsdomäne am Cterminalen Ende ist mit der DNA-Bindungsdomäne durch einen flexiblen 37 Aminosäurereste
umfassenden Strang (AS 287-323) verbunden. Die Aminosäuren 324-355 werden für die
Oligomerisation des Proteins benötigt [99].
P53 interagiert über eine hydrophobe Bindungsstelle an seiner N-terminalen Domäne als
negativer Regulator der transkriptionellen Aktivität der Zellen [99]. Es beeinflusst u.a. die
Transkription des humanen hsp70-Gens, durch Interaktion mit dem CCAAT-Bindungsfaktor
(CBS). Durch diese Protein-Protein-Interaktion wird die Transkription des hsp70-Gens negativ
beeinflusst. Das p53-Protein bindet an einen minimalen Promotor mit einer TATA-Sequenz,
wodurch TATA-Box-Gene negativ reguliert werden können [33]. Die DNA-bindende Domäne im
Bereich der Aminosäuren 102-292 von p53 unterscheidet sich von der anderer bekannter DNAbindender Proteine durch eine grosse ß-Sandwich-Struktur, welche die Orientierung und die
Positionierung zur Interaktion mit der DNA erlaubt [136]. Die ß-Sandwich-Struktur bildet das
Gerüst für eine Faltblattstruktur und für zwei anti-parallele ß-Schleifen. Die korrekte Ausrichtung
zur DNA-Bindung hängt von der Seitenketteninteraktion zwischen den parallelen ß-Schleifen
und der tetrahedralen Koordination eines Zinkatoms zwischen Cys176 und His179 in Schleife 2
und Cys238 und Cys242 in Schleife 3 ab. Das native p53-Protein ist in Lösung ein Tetramer. Die
Struktur beinhaltet Dimere mit zwei ß-Bögen und zwei α-Helices. Zwei Dimere werden durch
eine grosse hydrophobe Oberfläche der beiden Helix-Paare zusammengehalten, welche ein 4Helix-Bündel bilden. Die Möglichkeit des Wt-p53, einen antiproliferativen Effekt auf die Zelle
auszuüben, ist an den Wt-Konformationsstatus mit einem hohen Grad an Phosphorylierung
gebunden. Das Wt-p53-Protein kann seine Konformation und Phosphorylierung abhängig vom
Zellzyklus der Zelle verändern [33].
14
Abbildung 2: p53-Protein. Oben: Aminosäurenpositionen der in humanen Tumoren nachgewiesenen
Mutationen, welche die Funktion des p53-Proteins beeinflussen. Graue Boxen I-V repräsentieren die
evolutionär hoch konservierten Sequenzen. Die vertikalen Linien kennzeichnen die am häufigsten
gefundenen Stellen für einen Aminosäureaustausch in humanen Tumoren. Die zugrundeliegenden
Mutationen konzentrieren sich in den konservierten Regionen II–V. Unten: Strukturelle Organisation des
p53-Proteins. Phosphorylierungsstellen verschiedener Kinasen, gekennzeichnet durch P. MDM2 Protein
bindet am N-Terminus und unterdrückt die transkriptionelle Aktivierung von p53 als Teil der normalen
Kontrolle der p53-Funktion. Die Aktivität von p53 wird ebenfalls inhibiert z.B. durch die Bindung von
viralen Proteinen wie E6 des humanen Papillomavirus und E1b von Adenoviren
[n. 69,92].
Das Tumorsuppressorprotein ist ein multifunktionaler Transkriptionsfaktor, welcher bei der
Kontrolle
der
Zellzyklusprogression,
der
DNA-Integrität
und
des
Zellüberlebens
bei
agentienbedingten DNA-Schäden über die Regulation der Apoptose, der Suppression der
Zellproliferation und des G1/S- oder G2-Zellzyklusarrests eine Rolle spielt [2,9,92,99]. Die
Induktion der Apoptose durch Überexpression des Wt-p53-Proteins ist in humanen
Kolontumorzelllinien und Zelllinien anderer Tumore gezeigt worden [25,33,101,148].
Die p53-induzierte Apoptose wird über die positive transkriptionale Regulation des Bax- und
IGF-BP3-Gens vermittelt. BAX beschleunigt die Apoptose, indem es mit Bcl2 Heterodimere
bildet und dadurch die Bcl2-Funktion als Antagonist der Apoptose inhibiert. Bcl2Überexpression hemmt die p53-vermittelte Apoptose [25,99,101,130,148].
Das humane p53 zeigt sich als Substrat von CDC2. Die primäre Phosphorylierungsstelle ist
Serin-315. An dieser Position wird das Protein sowohl von p60-cdc2- als auch von Cyclin B-
15
cdc2-Enzymen phosphoryliert. Die Phosphorylierung durch CDC2 reguliert die antiproliferative
Aktivität des p53 [78].
Gene bzw. deren Produkte, die über p53-bindende Elemente hochreguliert werden (GADD45,
p21WAF-1/CIP1 und MDM2 oder Thrombospondin), sind negative Regulatoren der metastatischen
Aussaat oder der Angiogenese [29,136]. GADD45 ist an der Stimulation der DNAReparaturvorgänge beteiligt und wird als Antwort auf einen DNA-Schaden induziert. Es bindet
an PCNA (proliferating cell nuclear antigen), welches ein DNA-Polymerase prozessiver Faktor
ist, und kann somit den Zellzyklusarrest auslösen bzw. die DNA-Replikation inhibieren
[99,136,173].
Der p53-vermittelte G1/S-Zellzyklusarrest ist assoziiert mit der Transaktivierung des p21WAF1/CIP1
-Gens. Der Zellzyklus wird durch aktiviertes p53 und Modulation der p21WAF-1/CIP1
Transkription reguliert. In Abhängigkeit zum DNA-Schaden steigt die Konzentration des p21Transkripts
proportional
zum
p53-Anstieg
an
[2,31,66,109,181,185].
p21
bindet
an
verschiedene Cycline und Cdk-Komplexe sowie an die C-terminale Domäne des PCNA. Diese
p21-Bindungen führen zum Stop der DNA-Replikation. Neben diesem Mechanismus existiert
ein p21-unabhängiger, p53-vermittelter G1-Arrest [99,173].
MDM-2, ein Onkogenprodukt, welches selbst unter regulatorischem Einfluss des p53 steht
(s.o.), führt über den Abbau von p53-Protein zu einer Inaktivierung der p53-vermittelten
Transkription und wirkt als autoregulatorische Feedback-Schleife für die p53-Aktivität (s.
Bindungsstellen in Abbildung 2). MDM-2 bildet einen engen Komplex mit p53 über eine
hydrophobe Tasche, in der sich eine durch p53 geformte amphiphatische Helix mit hydrophober
Oberfläche einfügt. Es agiert sowohl mit mutiertem als auch mit Wt-p53 und inhibiert die negativ
regulatorischen Effekte von p53 [11,33,83,146,183,186].
Die p53-Protein-Konzentration in einer Zelle wird durch ständige Proteolyse auf einem konstant
niedrigen Niveau gehalten mit einer Halbwertszeit (HWZ) des Proteins von 20min [68,99]. Das
p53-Protein bindet an DNA-Reste und Reparaturstellen oder an interne Deletionsschleifen. Die
intrazelluläre Erhöhung der Wt-p53-Konzentrationen ist proportional zum Umfang des
aquirierten DNA-Schadens der Zelle. Zusätzlich zum Genomschaden kann Hypoxie die Wt-p53Protein-Konzentration steigern und das p53-Protein aktivieren. Durch die Aktivierung des Wtp53 kann so in Abhängigkeit des zytotoxischen Einflusses über die Apoptose eine negative
Wachstumsregulation transformierter bzw. potentieller maligner Zellen vermittelt werden [99].
1.2.3
Mutiertes p53 (Mut-p53)
Die Alteration des p53-Gens sind v.a. Punktmutationen in den stark evolutionär erhaltenen
Regionen (s. Abbildung 2, graue Boxen), mit komplett oder partiell veränderter p53Proteinstruktur [33]. Die Mehrzahl der Mutationen im p53-Gen gehen mit einem veränderten
16
p53-Protein einher und verhindern die sequenzspezifische Bindung des Proteins an die DNA.
Mutationen in der DNA-bindende Domäne sind v.a. missense-Mutationen, welche mit der
Entwicklung von humanen Tumoren einhergehen. Im Bereich des N-Terminus (AS 1-50) in der
sogenannten
Aktivierungsdomäne
finden
sich
prolinreichen
Folgeabschnitt
63-92)
40,7%,
(AS
50,0%
in
missense-Mutationen,
der
in
sequenzspezifischen
dem
DNA-
Bindungsdomäne (AS 100-300) 76,6%, in der Tetramerisierungsdomäne (AS 323-358) 34,2%
missense- und 40,2% nonsense-Mutationen und im C-Terminus (AS 363-393) 50% missenseMutationen [136,155]. Insgesamt wurden 73% der hauptsächlich missense-Mutationen in den
‚hot spot’-Exons 5-8 in den evolutionär hochkonservierten Regionen gefunden (s. Kapitel 1.2.4)
[44]. Cho et al. [23] klassifizierten drei Mutationstypen, welche in humanen Karzinomen die
DNA-Bindungsstelle von p53 beeinflussen.
Klasse I der Mutationen betreffen die Aminosäuren der DNA-bindenden Oberfläche von p53.
Durch Veränderungen in Arg248 und Arg273 kommt es zum Verlust der Protein-DNAKontaktpunkte. Diese stellen ‚hot spots’ für p53-Mutationen dar.
Klasse II-Mutationen beeinträchtigen die korrekte Orientierung der DNA-bindenden Oberfläche.
Diese in Arg175 und Arg249 lokalisierten Mutationen beeinflussen die Verbindung zwischen dem
Proteingerüst und der Bindungsoberfläche.
Klasse III-Mutationen stören die Ausrichtung des p53-Proteingerüsts. Dieses führt zur
Destabilisierung
der
Tertiärstruktur,
mit
einer
Veränderung
der
gesamten
DNA-
Bindungsdomäne [50,60,68,136].
Das mutierte p53-Protein scheint stabiler zu sein als der Wildtyp. Nach einer Alteration des p53Gens mit konsekutiv verändertem Protein, folgt eine erhöhte intrazelluläre Konzentration des
Proteins, da die HWZ in transformierten Zellen (in vitro) auf über 24h u.a. durch die
Phosphorylierung der MDM-2 Bindungsstellen verlängert und die Translation der p53-mRNA in
den Zellen gesteigert wird [68,99]. Daraus resultiert eine Akkumulation des Proteins im Zellkern
[115,131]. Das Mut-p53-Protein wirkt über eine Komplexbildung und Oligomerisierung direkt auf
Wt-53-Protein inaktivierend [87]. Zusätzlich könnten neben der veränderten Struktur des Mutp53-Proteins auch eine Veränderungen der intrazellulären Rezeptoren des p53-Proteins
mögliche wachstumsstimulierende Funktionen erklären [33].
1.2.4
p53-Mutationen und kolorektale Tumore
Für humane Kolonkarzinome resultiert eine genetische Instabilität aus einem Allelverlust auf
Chromosom 17. Die Mehrzahl dieser Karzinome enthalten zudem im korrespondierenden p53Allel eine Punktmutation [8,37]. Die Anwesenheit von Mut-p53-Protein korreliert mit dem Verlust
des korrespondierenden Wt-p53-Allels: In Kolonkarzinomzellen liegt die Koexistenz von Wt- und
Mut-Allel in einer Zelle bei unter 30%. Karzinomzellen mit nur einem Allel weisen in 91% ein
17
Mut-p53-Protein auf. Der Verlust der Heterozygozität zeigt sich entweder (in 75% der
Kolonkarzinome) in einem Chromosomenverlust des 17p Chromosoms oder (bei 86% der
Tumore) in einer Punktmutation (missense-Mutation) in einem p53-Allel [8,9,44].
Die p53-Mutationen finden sich selten in frühen Tumorstadien (Adenome). Mit dem Übergang
vom benignen zum malignen Wachstum (Karzinome) treten Mutationen entsprechend häufiger
auf [9,33,37,44].
Sowohl in in-vivo Untersuchungen, als auch die Beobachtung, die in vitro an kolorektalen
Zellkulturen gemacht wurden legen die Vermutung nahe, dass das Wt-p53-Gen einen
Tumorsuppressor
darstellt,
welcher
kolorektales
Tumorwachstum
inhibiert
[9].
Der
Wildtypverlust ist ein genetisches Schlüsselereignis, das unweigerlich zu Malignität führt [33].
Die häufigste Mutationsart in CRC sind missense-Mutationen (73%) in den ‚hot spot’-Regionen
(HSR) der Exons 5-8 (s. Abbildung 2) [44]. 52% der Punkmutationen wurden in den Codons
175, 248 und 283 gefunden. Kolorektale Tumore wiesen in 87% Transitionen und nur in 13%
Transversionen auf. Die häufigste Transition an CpG-Dinukleotiden war GC AT mit 65%.
missense-Mutationen, die auf solche Transitionen zurückgehen, fanden sich zu 25% in
kolorektalen Karzinomen [10,33,44,74,113].
In 39-69% der CRC wurde eine p53-Protein-Überexpression nachgewiesen [28,32]. Bei der
Aufteilung der Tumore entsprechend ihrer Dukes-Stadien zeigte sich eine deutliche Zunahme
der Mutationen in den beiden letzten Stadien (Dukes A-B: 55%, Dukes C-D: 67%) [74].
1.3
Zusammenhang zwischen VEGF und p53
In kolorektalen [161] und gastralen [138] Malignomen wurde ein Zusammenhang zwischen p53Proteinakkumulation und einer erhöhten VEGF-Konzentration mittels immunhistologischen
Nachweismethoden dargestellt. In Tumoren der Prostata [142], Lunge [5] und Niere [97]
hingegen konnte diese Korrelation nicht bestätigt werden. Andere Studien zeigten, dass
onkogene Transformationen mit aktiviertem ras, src oder raf-1 als Verbindung zwischen der
Tumorgenese und der Angiogenese zur gesteigerten Expression von VEGF führen
[61,111,128]. Mutiertes p53 scheint in kolorektalen Karzinomen die VEGF-Expression zu
induzieren. So zeigten 61,5% der untersuchten Karzinome eine Überexpression von p53Protein. In allen Karzinomen mit positiver p53-Immunhistologie wurde eine erhöhte VEGFExpression nachgewiesen. Mit dem Dysplasiegrad erhöhte sich auch die VEGF-Konzentration
in den untersuchten Tumorproben. Diese Untersuchungsergebnisse legen die Vermutung nahe,
dass es in Abhängigkeit des Tumorstadiums zu einer verstärkten Induktion der VEGFExpression in kolorektalen Tumoren kommt [93].
18
In einigen Tumorentitäten besteht eine Korrelation zwischen der erhöhten VEGF-Expression
und der p53-Proteinexpression. Diese geht signifikant mit dem Vaskularisationsgrad des
Tumors und der Metastasierungspotenz einher [49,161].
In in vitro Versuchen mit Hep3B (Hepatom)- und RKO (humanes kolorektales Karzinom)-Zellen
ging parallel mit dem Verlust der Wt-p53-Funktion eine gesteigerten Expression von VEGF
einher. Jedoch konnte bei Hep3B-Zellen keine signifikante Korrelation zwischen der VEGFmRNA-Expression und den Wt- oder Mut-p53-Proteinkonzentrationen gefunden werden. Auch
die hypoxieinduzierte physiologische VEGF-Expression wird nicht durch Wt-p53 beeinflusst [3].
Jedoch zeigten Zellen, die die Funktionen des Wt-p53-Proteins verloren hatten, eine erhöhte
Hypoxieresistenz.
Hieraus
kann
sich
eine
Selektion
von
nicht-apoptosefähigen,
hypoxieresistenten Zellen ergeben, welche zum dominanten genotypischen Zelltyp im Tumor
werden können [107].
Der Wechsel zu einem angiogenetischen Phänotyp ist eine fundamentale Veränderung im
neoplastischen Wachstum und der Tumorprogression. Wt-p53 trägt bei zur MDM2-vermittelten
proteosomalen Degradierung eines heterodimeren Transkriptionsfaktors, der Untereinheit des
„hypoxia-inducible
factor“
(HIF-1),
der
den
zellulären
Energiemetabolismus
und
die
Angiogenese in Abhängigkeit zur Sauerstoffdeprivation regelt. Ein Verlust des Wt-p53 in
Tumorzellen steigert die Konzentration von HIF-1α und die HIF-1 abhängige transkriptionale
Aktivierung des VEGF-Gens in Abhängigkeit zur Hypoxie und erhöht die Neovaskularisation
und das Wachstum im Tumorxenograft. Dies zeigt, dass die von HIF-1 abhängige Antwort auf
Hypoxie über den Verlust der p53-Funktion als Kofaktor zum angiogenetischen Wechsel
während der Tumorgenese beiträgt [129]. Die Überproduktion von Wt-p53-Protein reduziert in
vitro dosisabhängig die endogene VEGF-mRNA über die VEGF-Promotor-Aktivität. So wurde in
der humanen Kolonkarzinomzelllinie SW620 nach Transfektion mit dem Wt-p53-Gen eine
reduzierte Konzentration des VEGF-Proteins und seiner mRNA nachgewiesen [16].
Da Wt-p53-Protein, aber nicht Mut-p53 die Expression von Inhibitoren der Angiogenese
stimuliert,
stellen
Zellen
mit Wt-p53
im
Gegensatz
zu
jenen
mit
Mut-p53
einen
antiangiogenetischen Phänotyp dar [31]. Für Mut-p53 Ala135-Val besteht ein direkter
Zusammenhang zwischen der Mutation und der Regulation der VEGF-Expression. So wurde in
NIH-3T3-Zellen mit diesem Mutationstyp die Expression des VEGF-Gens über eine aktivierte
Proteinkinase C (PKC) induziert [89].
19
1.4
Zielsetzung
Mutationen im p53-Gen und erhöhte VEGF-Konzentration im Tumorgewebe sind wichtige
Faktoren beim Tumorwachstum und der Progression von kolorektalen Karzinomen. Die bis
heute veröffentlichten Ergebnisse lassen vermuten, dass diese Faktoren nicht unabhängig
voneinander die Tumorprogression beeinflussen. In humanen kolorektalen Tumorzelllinien
zeigte sich in vitro ein Zusammenhang zwischen der Wt-p53 Funktion als Suppressor der
VEGF-Expression. In vivo wurde unter anderem durch immunhistologische Verfahren eine
Korrelation zwischen erhöhter VEGF-Konzentration und p53-Protein-Überexpression in
kolorektalen Karzinomen nachgewiesen. Dieses führte zu der Hypothese, dass ein direkter
regulatorischer Einfluss von mutiertem p53 auf die VEGF-Expression besteht.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob bei Patienten mit kolorektalen
Karzinomen eine bestimmte Mutation im p53-Gen mit einer erhöhter VEGF-Konzentration im
Tumorgewebe einhergeht.
Es ergeben sich die folgenden Fragestellungen:
1) Besteht ein Unterschied in der VEGF-Konzentration zwischen Tumorgewebe mit bzw. ohne
Mutation im p53-Gen?
2) Beeinflussen unterschiedliche Mutationstypen bzw. Mutationen in bestimmten ‚hot spot’Exons die VEGF-Konzentration?
3) Beeinflussen Mutationstypen bzw. Mutationen in der kodierenden Sequenz
a) für die DNA-bindende Domäne oder
b) in der für die Tertiärstruktur des p53-Proteins
die VEGF-Konzentration?
4) Besteht ein Unterschied in der VEGF-Expression zwischen Tumoren mit bzw. ohne
Mutation im p53-Gen bei zusätzlicher Unterscheidung nach klinischen sowie pathologischen
Daten wie Geschlecht, Tumorlokalisation (Kolon/Rektum), Tumorstadium (Dukes A-D) und
T-Kategorie der TNM-Klassifikation als Kriterium der Invasionstiefe des Tumors?
Die Ergebnisse sollen zum weiteren Verständnis der Progression von kolorektalen Karzinomen
und deren Beeinflussung durch die Angiogenese beitragen.
20
2
Material und Methoden
Die Zahlen in den eckigen Klammern verweisen u.a. auf die Liste der Materialien und Geräte im
Anhang unter Punkt 7.2. und 7.3.
2.1
Patienten
Die in der Untersuchung verwendeten Gewebeproben wurden Patienten der Klinik für Chirurgie
(Direktor: Prof. Dr. H.-P. Bruch) des Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck
entnommen, welche im Zeitraum von Februar 1996 bis September 1997 an einem kolorektalen
Adenokarzinom operiert worden waren.
Das Resektat wurde nach Entnahme direkt in das Institut für Pathologie (Direktor: Prof. Dr.
Feller) gebracht und dort Gewebeblöcke sowohl aus der Region des Karzinoms (Tumorgewebe,
Tumorprobe) als auch aus dem gesunden angrenzenden Darmabschnitt (Normalgewebe,
Normalprobe) entnommen. Diese Gewebeblöcke konnten ohne weitere Behandlung sofort nach
Entnahme in flüssigem Stickstoff bei -196°C eingefr oren werden. Ebenfalls wurde durch das
Institut für Pathologie eine Aufarbeitung des OP-Resektates nach der damals gültigen TNMKlassifikation [71] durchgeführt. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Medizinischen
Fakultät der Universität zu Lübeck unter dem Aktenzeichen 33-96 vom 25. Mai 1996 genehmigt.
Die Gewebeproben von 52 Patienten, 21 (40,4%) weibliche und 31 (59,6%) männliche wurden
untersucht. 31 (59,6%) der Tumore waren im Kolon lokalisiert und 21 (40,4%) im Rektum. Im
TNM-System ist folgende Verteilung festzustellen: von 52 Tumoren waren 4 Tumore (7,7%)
klassifiziert als T1, 6 Tumore (11,5%) als T2, 33 Tumore (63,5%) als T3 und 9 Tumore (17,3%)
als T4. Die 52 Tumore unterteilten sich in die folgenden Dukes-Stadien: 9 (17,3%) im Stadium
Dukes A, 17 (32,7%) im Stadium Dukes B, 14 (26,9%) im Stadium Dukes C und 12 (23,1%) im
Stadium Dukes D. Das Alter der Patienten zur Zeit der Operation lag zwischen 36 und 92
Jahren, der Altersmedian betrug 67 Jahre (s. Tabelle I).
21
Tabelle I: Charakterisierung des Patientenkollektivs
Patienten
n
52
in %
100,00
Geschlecht:
Frauen
21
Männer
31
40,4
59,6
Lokalisation des Tumors
Kolon
31
Rektum
21
59,6
40,4
Staging nach pTNM
T1
4
T2
6
T3
33
T4
9
7,7
11,5
63,5
17,3
N0
N1
N2
N3
28
12
11
1
53,8
23,1
21,2
1,9
M0
M1
40
12
76,9
23,1
Klassifikation nach Dukes
Dukes A
9
Dukes B
17
Dukes C
14
Dukes D
12
17,3
32,7
26,9
23,1
Altersverteilung
Median
Range
Jahre
67
36-92
2.2
Histologie
Von jeder Gewebeprobe wurde durch einen histologischen Schnitt geprüft, ob es sich
tatsächlich um Tumor- oder Normalgewebe handelte. Weiterverwendet werden konnten nur
Gewebeproben, die im Falle der Tumorproben mindestens 80% Tumorgewebe respektive im
Falle der Normalgewebsproben keine Tumoranteile enthielten.
Vorbereitung der Proben:
Zunächst wurden die Gewebeproben nach Standardmethoden in Formalin fixiert und in Paraffin
eingebettet, um anschließend 4µm Schnitte auf dem Mikrotom [7.3.5] anzufertigen. Aufgetragen
auf Objektträger [7.2.42] trockneten die Schnitte im Anschluss.
22
Färbung der histologischen Schnitte:
Die bei Raumtemperatur durchgeführte Hämatoxylin-Eosin-Färbung der Gewebeschnitte folgte
dem allgemein bekannten Protokoll.
2.3
Gewebevorbereitung
Von den in flüssigem Stickstoff gelagerten Gewebeproben der Patienten konnten unter der
sterilen Werkbank [7.3.17] mittels in flüssigem Stickstoff gekühltem Skalpell und Pinzette jeweils
zwei 50mg schwere Proben des Normal- bzw. des Tumorgewebes separiert werden. Um eine
Materialverschleppung der Proben untereinander zu verhindern, wurde für jede Gewebeprobe
eine neue Arbeitsfläche aus Aluminiumfolie verwendet, sowie eine Reinigung der benutzten
Instrumente zwischen der Bearbeitung zweier Proben durch Ausglühen und Behandlung mit
100% Ethanol [7.2.18] durchgeführt. Nach der Portionierung lagerten die Proben bis zur
weiteren Verwendung in 2-ml-Eppendorf-Cups in flüssigem Stickstoff. Die asservierten Proben
wurden nachfolgend einer Proteinextraktion zur VEGF-Konzentrationsbestimmung und einer
DNA-Gewinnung zur p53-Mutationsanalyse zugeführt.
2.4
Ermittlung der VEGF-Konzentration in den Gewebeproben
2.4.1
Proteinextraktion
Für die Bestimmung der VEGF-Konzentration in den Gewebeproben mussten von diesen
zunächst Proteinextrakte hergestellt werden.
Die folgenden Arbeitsgänge fanden unter ständiger Kühlung mit Eis statt. Die Gewebeproben
(50mg)
wurden
jeweils
in
einem
2-ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß
mit
400µl
Proteinextraktionspuffer (PE-Puffer) [7.2.47] nach Takano et al. [163] überschichtet und mit dem
Ultraturrax® [7.3.3] für 1min bei maximaler Geschwindigkeit zerkleinert und homogenisiert, bis
makroskopisch keine Gewebestücke mehr zu erkennen waren. Anschließend wurde das
Homogenisat durch Zugabe von 600µl PE-Puffer auf ein Endvolumen von 1ml gebracht. Hieran
schloss sich eine Zentrifugation der Proben bei 22.900g und 4°C über 20min in der Zentrifuge
[7.3.19] an. Je 250µl des Überstandes, welcher den Proteinextrakt darstellte, wurden in 1,5-mlEppendorf-Cups aliquotiert und bei -80°C gelagert.
23
Zwischen den Arbeitsgängen mit unterschiedlichen Gewebeproben erfolgte eine Reinigung des
Ultraturrax® nacheinander mit 10% SDS [7.2.52], 1M NaOH [7.2.39], 70% Ethanol [7.2.20] und
aqua bidest., um ein Verschleppen von Probenmaterial zu vermeiden.
2.4.2
Ermittlung der Gesamtproteinkonzentration
Als Bezugsgröße für die VEGF-Konzentration diente die nach Bradford [17] ermittelte GesamtProtein-Konzentration in den Extrakten. Die im ELISA gemessene VEGF-Konzentration konnte
so auf die Gesamtproteinkonzentration bezogen werden, dies ermöglichte den Vergleich der
einzelnen Proben untereinander. Bei der Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford wird
die durch unspezifische Bindung an v.a. basische Aminosäuren hervorgerufene Verschiebung
des Absorptionsmaximums des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G250 von 465 zu 595nm
ausgenutzt.
Erstellen und Messen der Standardreihe:
Je 5, 10, 15, 20 und 40µl der BSA-Lösung [7.2.36] wurden in jeweils zwei 1,5-ml-EppendorfReaktionsgefäße pipettiert und mit je 80, 75, 70, 65 und 45µl 0,15M NaCl [7.2.37] sowie mit je
15µl PE-Puffer [7.2.47] auf ein Endvolumen von 100µl aufgefüllt. Dies entsprach einer Menge
von 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 und 20,0µg BSA/Ansatz. Zwei weitere Ansätze mit je 85µl 0,15M NaCl
und 15µl PE-Puffer dienten als Leerwert.
Alle Ansätze wurden mit 1ml Coomassie Brilliant Blue Lösung [7.2.6], 1:5 verdünnt mit aqua
bidest. (ultrafiltriert), versetzt und gründlich gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 10min bei
Raumtemperatur konnten die Ansätze der Standardreihe in Plastik-Halbmikroküvetten [7.2.27]
pipettiert und die Extinktion im Spektrophotometer [7.3.11] bei 595nm gemessen werden. Die
Auftragung der erhaltenen Werte gegen die BSA-Menge pro Ansatz (in µg) ergab die
Standardkurve.
Messung der Proteinextrakte:
Die Proteinextrakte lagerten auf Eis, nachdem sie für 30s anzentrifugiert worden waren. Aus
50µl Proteinextrakt und 150µl PE-Puffer [7.2.47] wurde eine 1:4 Verdünnung des
Proteinextraktes erstellt. Zur dreifachen Bestimmung wurden je 5µl (I), 10µl (II) und 15µl (III) der
verdünnten Proteinextrakt-Lösung in Eppendorf-Cups pipettiert und mit jeweils 10 (I), 5 (II) und
0 (III) µl PE-Puffer sowie je 85µl 0,15M NaCl auf ein Endvolumen von jeweils 100µl vermischt.
Nachdem die Proben mit 1ml Coomassie Brilliant Blue Lösung [7.2.6] (1:5 verdünnt mit aqua
bidest., ultrafiltriert) gründlich vermischt wurden und 10min ruhten, konnte die Extinktion analog
zur Standardreihe gemessen werden.
24
Das verwendete Spektrophotometer [7.3.11] berechnete automatisch die Proteinmenge anhand
der zuvor erstellten Standardkurve. Gemäss des eingesetzten Volumens in µl wurde das
Ergebnis durch 5 (I), 10 (II) bzw. 15µl (III) geteilt und entsprechend der Vorverdünnung mit 4
multipliziert, woraus sich die Proteinkonzentration des unverdünnten Proteinextraktes (in µg
Protein/µl) ergab.
Zur weiteren Berechnung wurde aus den Proben (I), (II) und (III) der Median verwendet.
2.4.3
VEGF-Konzentrationsbestimmung
Die Bestimmung der VEGF-Konzentration erfolgte mittels des quantitativen Sandwich-ELISA
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Quantikine® Human VEGF Immunoassay [7.2.49],
welcher nach den Herstellerangaben verwendet wurde.
Bei dem Quantikine® Human VEGF Immunoassay werden monoklonale „capture“-Antikörper
aus der Maus gegen VEGF165, welche an die Titerplatte gebunden sind, verwendet. Der
polyklonale „Detektions“-Antikörper gegen VEGF165 stammt aus dem Kaninchen und ist mit
Meerrettich-Peroxidase
konjugiert.
Im
Färbungsschritt
wird
eine
Substratlösung,
hier
Wasserstoff-Peroxid und Tetramethylbenzidin zugegeben, die durch die Meerrettich-Peroxidase
in ein gefärbtes Produkt umgesetzt wird. Diese Reaktion wird zu einem definierten Zeitpunkt
mittels Schwefelsäure gestoppt und die Intensität des Farbstoffes photometrisch ermittelt.
Vorbereitung der Reagenzien:
Der Waschpuffer [7.2.49] (20ml, 25x konzentriert) wurde mit aqua bidest. auf 500ml aufgefüllt
und so auf einfache Konzentration verdünnt. Der lyophilisierte VEGF-Standard [7.2.49] musste
in 1ml Kalibrier-Verdünnungslösung RD6U [7.2.49] gelöst und 15min leicht geschüttelt werden.
Die so erreichte Konzentration entsprach 2000pg VEGF/ml. Zudem wurden die Farbreagenzien
A und B [7.2.49] kurz vor der Färbung im Verhältnis 1:1 gemischt.
Erstellung der Standardreihe:
Die Standardreihe umfasste einen Bereich von 0 bis 2000pg VEGF/ml, wobei der unverdünnte
VEGF-Standard
(2000pg
VEGF/ml)
[7.2.49]
als
höchster
Wert
und
die
Kalibrierverdünnungslösung RD6U [7.2.49] als Leerwert dienten. Die dazwischen liegenden
Ansätze mit den Konzentrationen 31,3, 62,5, 125,0, 250,0, 500,0 und 1000,0pg VEGF/ml
wurden durch Verdünnen des Standards mit der Kalibrierverdünnungslösung RD6U gemäss
dem in der Tabelle II angeführtem Schema erhalten. Jeder Standard wurde zweifach
eingesetzt.
25
Vorbereitung der Proben:
Nach dem Anzentrifugieren lagerten die Proteinextrakte auf Eis.
Eine 1:10 Verdünnung der Proteinextrakte aus den Tumorgewebeproben aus 20µl
Proteinextrakt
und
180µl
Proteinextraktionspuffer
[7.2.47]
sowie
die
unverdünnten
Proteinextrakte der Normalgewebeproben wurden in die Messung eingesetzt. Von jedem
Proteinextrakt erfolgte eine Doppelbestimmung.
Tabelle II: Pipettierschema zur Erstellung der Standardreihe des VEGF-ELISAs
Ansatz
VEGF-Standard (2000
pg/ml), in µl
RD6U
Verdünnungslösung in µl
1
2
3
4
5
6
7
8
0
500
500
0
0
0
0
0
500
0
500
500
500
500
500
50
0
0
0
500
500
500
500
500
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
0
2000,0
1000,0
500,0
250,0
125,0
62,5
31,3
Volumen aus
vorhergehendem Ansatz
(Nr.), in µl
VEGF-Konzentration, in
pg/ml
Die Durchführung des ELISA-Protokolls:
Nachdem 50µl Assay-Verdünnungslösung RD1W in jede Vertiefung der Microwell-Platte
[7.2.49] pipettiert worden waren, konnten 100µl Standard- bzw. Proben-Ansatz hinzugegeben
werden. Es folgte das Abkleben der Wells und eine Inkubation bei Raumtemperatur für 2h.
Nach dieser Zeit wurde die Flüssigkeit aus den Wells abgesaugt und diese dreimal mit jeweils
400µl Wasch-Puffer [7.2.49] gewaschen. Anschließend wurden 200µl VEGF-Konjugat [7.2.49]
in jedes Probenwell pipettiert. Wiederum wurden die Wells abgeklebt und 2h bei
Raumtemperatur inkubiert. An diesen Schritt schloss sich erneutes Absaugen der Lösungen
und dreimaliges Waschen mit jeweils 400µl Wasch-Puffer an. Nun konnten 200µl
Substratlösung, bestehend aus den Farbreagentien A und B [7.2.49], in jede Vertiefung
pipettiert werden. Es schloss sich erneutes Abkleben der Mikrotiterplatte und Inkubation bei
Raumtemperatur für 25min an. Dieser Färbevorgang endete durch die Zugabe von 50µl StopLösung [7.2.49] in jede Vertiefung. Innerhalb der nächsten 30min sollte die Extinktion bei
450nm mit dem Photometer [7.3.7] gemessen werden.
Das verwendete Photometer [7.3.7] erstellte eine Standardreihe und bestimmte gleichzeitig die
Konzentration in den Proben durch Vergleich der gemessenen Extinktion der Probe mit der
Standardreihe (Easy Fit, Version 3.45, SLT Lab Instruments, Crailsheim). Aus den Extinktionen
der doppelt bestimmten Proben wurde der Mittelwert gebildet. Die VEGF-Konzentrationen der
Standardreihe sowie der Proben wurde in pg/ml angegeben. Die VEGF-Konzentration der 1:10
26
verdünnten Proben (nur T-Proben) wurde mit dem Faktor 10 multipliziert und ergab so die
Konzentration von VEGF/ml der entsprechenden Proteinextrakte.
Berechnung der VEGF-Konzentration einer Probe:
Die VEGF-Konzentration einer Probe (in pg/ml) wurde auf die Gesamt-Proteinkonzentration (in
g/ l) dieser Probe bezogen.
Formel:
[VEGF]Probe X (in pg/ml) / [Protein]Probe X (in µg/µl) = [VEGF]Probe X (in pg VEGF/mg Protein)
2.5
Mutationsanalyse im p53-Gen der Gewebeproben
2.5.1 DNA-Extraktion
Aus allen 52 Normal- und den korrespondierenden Tumorgewebeproben wurde die DNA mit
Hilfe des QIAGEN Blood & Cell Culture DNA Kits [7.2.25] isoliert.
Grundlage der Methode des Kits ist die Möglichkeit der Isolierung von chromosomaler DNA mit
einer Größe von 20-150kb direkt aus dem Gewebe, basierend auf einem Puffersystem zur
vorsichtigen Lyse von Zellen und/oder Zellkernen. Der Vorgang der DNA-Extraktion mittels
Anionen-Austausch-Chromatographie bedient sich dem Prinzip, dass negativ geladene
Phosphatgruppen der DNA an positiv geladenen Gruppen der QUIAGEN-Anionen-AustauscherHarzsäule binden. Das Verfahren arbeitet mit Hilfe des Gravitationsflusses. Zur Aufreinigung
des Produktes werden RNA, Proteine, Zelldedritus und niedrigmolekulare Verunreinigungen
durch Puffer mit hoher Salzkonzentration ausgewaschen. Die gebundene genomische DNA
wird mit einem Elutionspuffer gelöst. Die Nachbearbeitung des Eluats umfasst das Fällen,
Konzentrieren und Waschen sowie das Resuspendieren der DNA, um eine optimale
Konzentration für die Weiterverwendung zu erhalten.
Vorbereitung der Gewebeproben:
In sterile 15ml Cellstar PP-Röhrchen mit Schraubdeckel [7.2.9] wurden 19µl RNase A [7.2.25] in
9,5ml Puffer G2 [7.2.25] verdünnt. Hiernach konnte die in flüssigem Stickstoff gelagerte
Gewebeprobe (50mg) hinzugeben und mit dem Homogenisator Ultraturrax® [7.3.3] bei
maximaler Stufe homogenisiert werden, bis makroskopisch keine Gewebereste mehr zu
erkennen waren. Diese Arbeitsschritte fanden unter ständiger Kühlung mit Eis statt. Nach
Zugabe von 0,5ml Protease-Lösung (20mg/ml) [7.2.25] wurde der Ansatz gründlich gemischt
und 2h im Wasserbad [7.3.16] bei 50°C unter ständig em Rütteln inkubiert.
27
Anschließend folgte eine Zentrifugation des Homogenisates bei 4°C und 5000g über 20min in
der Zentrifuge [7.3.19]. Die daraufhin entstandene obere trübe Schicht von wenigen Millilitern,
bzw. der Bodensatz als makroskopische Verunreinigung wurden verworfen und das
makroskopisch klare Homogenisat, welches die mittlere Schicht bildete, verwendet.
Protokoll der DNA-Isolation:
Um eine Kontamination und den Einfluss von ubiquitären DNAsen auf die isolierte DNA zu
vermeiden, fanden die folgenden Arbeitsschritte unter der sterilen Werkbank [7.3.17] statt.
Nach der Equilibrierung der Säule (QIAGEN Genomic 100/G Tip [7.2.25]) mit 4ml Puffer QBT
[7.2.25] wurde die wie oben beschrieben homogenisierte und proteolysierte Probe auf die Säule
pipettiert. Nachdem die Probenflüssigkeit vollständig durch die Säule gelaufen war, wurden
Verunreinigungen durch dreimaliges Auftragen von je 7,5ml Puffer QC [7.2.25] ausgewaschen.
Danach konnte das Auffanggefäß ausgewechselt und die DNA mit 5ml Puffer QF [7.2.25] (auf
50°C erwärmt) eluiert werden. Zur Präzipitation der DNA wurde dem Eluat 3,5ml -20°C kaltes
Isopropanol [7.2.29] hinzugefügt. Nach der Inkubation des Gemisches für 10min bei
Raumtemperatur konnte der Ansatz bei 4°C mit 5000g über 25min in der Zentrifuge [7.3.19]
zentrifugiert und der Überstand dekantiert werden. Das bei der Zentrifugation entstandene
Pellet entsprach der gefällten DNA, welche noch zweimal mit Ethanol gewaschen werden
musste. Zur Aufreinigung folgte jeweils die Überschichtung des Pellets mit 2ml 70% Ethanol
[7.2.20] (auf -20°C gekühlt), im Anschluss vorsichtiges Mischen, Zentrifugation bei 4°C mit
5000g über 10min in der Zentrifuge [7.3.19] und Dekantieren des Überstandes sowie
Trocknung des Pellets bei Raumtemperatur über 10min. Zur Lösung der DNA im Puffer wurde
das Pellet in 250µl TE-Puffer [7.2.61] resuspendiert und über 2h bei 55°C im Wasserbad
[7.3.16] inkubiert.
DNA-Konzentrationsbestimmung:
Um die DNA in definierter Konzentration in die PCR einsetzen zu können, musste die DNAKonzentration in der DNA-Lösung gemessen und die Probe anschließend mit TE-Puffer
verdünnt werden.
Mit 10µl DNA-Lösung und 90µl TE-Puffer [7.2.61] wurde zunächst eine 1:10 Verdünnung
hergestellt.
Messung der DNA-Proben:
Zur Bestimmung der DNA-Konzentration in den Proben wurde ihre Extinktion bei 260 und
280nm sowie zur Hintergrundkorrektur bei 320nm mit dem Spektrophotometer [7.3.11]
28
gemessen. Das verwendete Photometer berechnete automatisch die DNA-Konzentration unter
Verwendung folgender Formel nach Warburg und Christian [175]:
[DNA] (in µg/ml) = (-36.0 x A280) + (62.9 x A260)
Des Weiteren wurde zur Bestimmung des Reinheitsgrades der DNA-Lösung der Quotient aus
Extinktion bei 260nm und 280nm durch das Spektrophotometer berechnet. Für eine hoch reine
DNA-Probe sollte dieser etwa 1,8 betragen.
Um die gewünschte DNA-Konzentration von 100ng/µl zur Weiterverwendung in der PCR zu
erhalten, wurde die unverdünnte DNA-Lösung entsprechend dem jeweils berechneten
Verdünnungsfaktor mit TE-Puffer [7.2.61] verdünnt.
Verdünnungsfaktor = ([DNA] ng/µl gemessen x 10) / [DNA] ng/µl verdünnt
Kontrollgel der DNA:
Das Vorhandensein von DNA in der Lösung wurde zusätzlich in einem Agarosegel (8,5cm x
7,8cm x 1,0cm; Länge x Breite x Dicke) überprüft. Diesem war Ethidiumbromid [7.2.21]
beigefügt, welches ein in die DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff ist, der bei einer
Wellenlänge von 260–360nm zur Fluoreszenz angeregt wird. Als positive Kontrolle und
Standard wurde der Molekulargewichtsmarker VI [7.2.13] verwendet.
Zur Herstellung des 1%igen (w/v) Agarosegels [7.2.2] wurden 0,5g Agarose in 50ml 1x TAEPuffer [7.2.56] suspendiert und durch dreimaliges Aufkochen in dem Mikrowellengerät [7.3.6]
gelöst. Nach Abkühlen unter ständigem Rühren auf etwa 55°C konnten das noch flüssige Gel in
ein 50ml Cellstar PP-Röhrchen [7.2.9] umgefüllt und 5µl Ethidiumbromidlösung [7.2.21]
hinzupipettiert werden. Es folgte der blasenfreie Giessvorgang in den Gelschlitten der
Minigelkammer [7.3.1]. Das Gel kühlte innerhalb von ca. 20min auf Raumtemperatur ab, härtete
aus und wurde mit 1x TAE-Puffer [7.2.56] überschichtet. Zuletzt konnte das Gel mit den Proben
in die durch den Spacer freigehaltenen Probentaschen beladen werden.
Je 10µl jeder DNA-Probe (entsprechend 1µg DNA) wurden in einer Mikrotiterplatte mit je 1µl
Laufmarker [7.2.33] vermischt und von diesem Ansatz 10µl in die Beladungstaschen des Gels
eingesetzt.
Laufbedingungen:
-
Laufzeit: 1h
-
Spannung: 80V (konstant)
29
Auswertung des Gels:
Das Gel wurde auf dem UV-Transilluminator [7.3.15] unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von
312nm untersucht. Eine fluoreszierende Bande zeigte das Vorhandensein von DNA in der
Lösung an. Keine Bande führte zur erneuten Gelkontrolle. Bei einem zweiten negativen
Ergebnis wurde das DNA-Isolat verworfen und eine erneute DNA-Extraktion der Probe
durchgeführt.
2.5.2 Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR)
Das Prinzip der PCR basiert auf der Aktivität thermostabiler DNA-Polymerasen, welche in vitro
unter Verwendung sequenzspezifischer Primer (16-24 Basen grosse Oligonukleotide), aus
einem
Gemisch
unterschiedlicher
DNA-Moleküle
ein
bestimmtes
Fragment
beliebig
amplifizieren können. Die verwendete SAWADY Pwo-DNA-Polymerase, ein 90-kD-Protein, ist
eine hochprozessive 5’-3’-DNA-Polymerase mit einer zusätzlichen 3’-5’-Exonuklease-Aktivität,
dem sog. „Korrekturlesen“. Durch diese „proofreading“-Aktivität weist die Pwo-Polymerase die
niedrigste Fehlerrate der thermostabilen Polymerasen auf. Ein einzelner DNA-Synthesezyklus
ist in folgende drei Phasen bestimmter Reaktionstemperatur und Dauer entsprechend dem zu
amplifizierendem DNA-Abschnitt unterteilt (s.u.). Mehrere solcher DNA-Synthesezyklen können
direkt aneinandergereiht werden, wobei die DNA-Fragmente in jedem Zyklus jeweils verdoppelt
werden. Die Amplifizierung der DNA durch die PCR erfolgt daher exponentiell.
Phase 1: Thermische Denaturierung der Doppelstrang-DNA (94°C, 30-120s)
Phase 2: Bindung der Primer an die Einzelstrang-DNA (37°-70°C, 30-120s)
Phase 3: Elongation der Primer in 5´-3´Richtung (72°C bei Verwendung von
Pwo-Polymerase, 90-180s)
Untersucht wurden die Exons 5-8 des p53-Gens. Diese entsprechen den ‚hot spot‘-Regionen
für Mutationen in kolorektalen Karzinomen (s. Kapitel 1.2.3) [74]. Das Exon 5 wurde in zwei
Abschnitte unterteilt, welche sich im Bereich der Codons 156-160 überlappten: Exon 5-1 und
Exon 5-2. Dies war nötig, da die DNA dieses Exons ein komplexeres Schmelzverhalten mit zwei
Temperaturplateaus aufweist, und so für die Folgemethoden der Gelelektrophorese mit
zeitlichem Temperaturgradienten (Temporal Temperature Gradient Electrophoresis, TTGE)
bzw. der Gelelektrophorese mit einem Denaturans Gradienten (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis, DGGE) unterteilt werden musste. Die in dieser Arbeit zur Amplifikation
verwendeten Primer sind von Anderson und Börrisson beschrieben worden (s. Tabelle III) [6].
Zur weiteren Verwendung in der Mutationsanalyse mittels TTGE bzw. DGGE, wurden die
Amplifikate der Exons 5-1, 6, 7 und 8 über den Antisense-Primer bzw. im Falle des Abschnitts
30
5-2 über den Sense-Primer mit GC-Klammern („gc-clamp“, Guanin-Cytosinreiche Sequenz)
versehen. Für jeden der zu untersuchenden fünf DNA-Abschnitte wurden unterschiedliche
PCR-Bedingungen optimiert und jede Probe zur Doppelbestimmung zweimal amplifiziert.
Die Primer-Sequenzen [7.2.45] sind in Tabelle III aufgeführt:
a
Tabelle III: Angaben zu den verschiedenen Primern und den PCR-Produkten
Primer
PrimerSequenzlänge
Primer-Sequenz
Exon 5-1
sense
18bp
5’ - CTC TGT CTC CTT CCT CTT - 3’
5’ - CGC CCC GCC GCG CCC CGC GCC
Exon 5-1
antisense
59bp
Länge des
amplifizierten
Fragmentes
amplifizierte
Codons
191bp
Codon: 126-160
176bp
Codon: 156-184
96bp
Codon: 189-215
192bp
Codon: 225-259
191bp
Codon: 265-300
CGT CCC GCC GCC CCC GCC CGT
GTG ACT GCT TGT AGA TG - 3’
5’ - CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC
Exon 5-2
sense
Exon 5-2
antisense
Exon 6
sense
60bp
GTC CCG CCG CCC CCG CCC GTT CCA
CAC CCC CGC CCG GCA - 3’
20bp
5’ - CTC CAG CCC CAG CTG CTC AC - 3’
19bp
5’ - CAC TGA TTG CTC TTA GGT C – 3’
5’ - CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC
Exon 6
antisense
57bp
Exon 7
sense
20bp
GTC CCG CCG CCC CCG CCC AGT TGC
AAA CCA GAC CTC - 3’
5’ - TGG GCC TGT GTT ATC TCC TA - 3’
5’ - CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC
Exon 7
antisense
60bp
Exon 8
sense
20bp
GTC CCG CCG CCC CCC CCG CCC
GGC AAG TGG CTC CTG ACC TGG – 3’
5’ - ATC CTG AGT AGT GGT AAT CT – 3’
5’ – CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC
Exon 8
antisense
a
60bp
GTC CCG CCG CCC CCG CCC GTA CCT
CGC TTA GTG CTC CCT – 3’
basierend auf mRNA-Sequenz No NM_000546 (Genbank)
PCR mit Pwo-Peqlab PCR System:
Vorbereitung:
Für die PCR wurde das Pwo-Polymerase PCR System der Firma Peqlab [7.2.48] verwendet
und alle Pipettierschritte mit Filtertips [7.2.7] durchgeführt. Die 1mM Stammlösungen der Primer
[7.2.45] wurden 1:40 verdünnt: 1 Teil Sense-Primer : 1 Teil Antisense-Primer : 38 Teile aqua
bidest., steril. Die Konzentration nach Verdünnung betrug somit 25µM für jeden Primer.
Aufgrund der Exonuklease-Aktivität der Pwo-Polymerase, waren die einzelnen Komponenten
auf zwei Mastermixe (I und II, s. Tabelle IVa/b und Va/b) auf Eis angesetzt, so dass Primer und
Polymerase zunächst getrennt vorlagen.
31
PCR-Mastermix I:
Tabelle IVa: Mastermix I für die Exons 5-1, 6, 7, 8
Reagenz
dNTP, 20mM [7.2.14]
Konzentration
Volumen pro
im PCR Ansatz
PCR Ansatz
200µM
0,5µl
600nM
1,2µl
ad 24µl
22,3µl
senseantisense Primergemisch
je 25µM
aqua bidest., steril
Tabelle IVb: Mastermix I für das Exon 5-2
Reagenz
Glycerin 10%, steril
[7.2.26]
dNTP, 20mM [7.2.14]
Konzentration
Volumen pro
im PCR Ansatz
PCR Ansatz
0,1%
0,5µl
200µM
0,5µl
600nM
1,2µl
ad 24µl
19,6µl
senseantisense Primergemisch
je 25µM
aqua bidest., steril
PCR-Mastermix II:
Tabelle Va: Mastermix II für die Exons 5-1, 6, 7, 8
Reagenz
Pwo-DNA-Polymerase
(1 U/µl) [7.2.48]
10x Peqlab
Reaktionspuffer mit
MgSO4 [7.2.48]
aqua bidest., steril
Konzentration
Volumen pro
im PCR Ansatz
PCR Ansatz
2,5U/Ansatz
2,5µl
1x Puffer mit
2mM MgSO4
ad 25µl
5µl
17,5µl
32
Tabelle Vb: Mastermix II für das Exon 5-2
Konzentration
Volumen pro
im PCR Ansatz
PCR Ansatz
2,5U/Ansatz
2,5µl
2fach
5µl
MgSO4(25mM)
1,5mM
1,5µl
Aqua bidest., steril
ad 25µl
16,0µl
Reagenz
Pwo-DNA-Polymerase
(1 U/µl) [7.2.48]
10x Peqlab
Reaktionspuffer ohne
MgSO4 [7.2.48]
Die PCR-Cups wurden auf Eis nach folgendem Schema beladen:
1. 24µl Mastermix I
2. 1µl DNA Probe (=100ng DNA)
3. 25µl Mastermix II
Die PCR-Ansätze für die Exons 5-1, 6, 7, und 8 unterschieden sich nur durch die verwendeten
Primer. Im Falle des Exons 5-2 wurde dem Mastermix I steriles Glycerin [7.2.26] zugesetzt und
für den Mastermix II die MgSO4-Konzentration optimiert. Beide Optimierungen dienten zur
Erhöhung der Spezifität der Primerbindung. Bei jedem PCR-Lauf wurde eine Negativkontrolle
verwendet, indem einem Ansatz statt der DNA-Probe 1µl steriles aqua bidest. hinzupipettiert
wurde. Es folgte der Einsatz in den Thermocycler [7.3.12] und Start des jeweiligen PCRProgramms.
Reaktionsbedingen für die PCR:
1x
95°C, 2min (Denaturierung, „hot start“)
Dieser Schritt war für alle untersuchten Exons gleich.
Bei den folgenden Schritten wurden die Bedingungen des Primerannealing und der Zykluszahl
für die einzelnen Exons durch Testreihen optimiert (s. Tabelle VI).
Tabelle VI: Reaktionsbedingungen der PCR für die untersuchten Exons des p53-Gens
Exon
Zykluszahl
Denaturierung
Annealing
Elongation
5-1
30x
95°C, 75s
60°C, 75s
72°C, 60s
5-2
35x
95°C, 75s
58°C, 75s
72°C, 60s
6
30x
95°C, 75s
56°C, 75s
72°C, 60s
7
30x
95°C, 75s
65°C, 75s
72°C, 60s
8
35x
95°C, 75s
55°C, 75s
72°C, 60s
33
An die Amplifikation schloss sich jeweils eine Elongation von 1x 72°C für 7min an. Nach
Beendigung der PCR wurden die PCR-Produkte auf 4°C abgekühlt und im Agarosegel
kontrolliert (s. u.), anschließend in den PCR Cups bei -20°C bis zur weiteren Verwendung
gelagert.
Bei allen amplifizierten Exons waren das Bearbeitungsprotokoll, die PCR-Negativkontrolle
sowie die Kontrolle der PCR-Produkte standardisiert.
Kontrolle der PCR Produkte:
Zur Kontrolle der PCR-Produkte wurde ein 1,5% (w/v) Agarose Gel verwendet. Das Prozedere
der Gelherstellung sowie der Laufbedingungen war identisch mit dem im Abschnitt DNAProduktkontrolle (s. Kapitel 2.5) beschriebenen.
Vorbereitung der Proben:
10µl des PCR-Produktes wurden auf einer Mikrotiterplatte mit je 1µl Laufmarker [7.2.33]
vermischt und 10µl des Gemisches in die Taschen des Gels pipettiert. Als Längenstandard
dienten 5µl des DNA-Molekulargewichtsmarker VI [7.2.13], welcher ebenfalls mit 1µl
Laufmarker vermischt in das Gel eingesetzt wurde.
Auswertung des Gels:
Das Gel wurde auf dem UV-Transilluminator [7.3.15] unter UV-Licht mit einer Wellenlänge von
312nm betrachtet. Durch fluoreszierendes Ethidiumbromid visualisierten sich die PCRProdukte. Es wurden jeweils die Negativprobe (als Kontaminationsausschluss) auf ein
negatives Signal sowie die PCR-Produkte auf ein positives Signal kontrolliert. Die Größe der
PCR-Produkte wurden zudem mit den Fragmentlängen des DNA-Molekulargewichtsmarker VI
[7.2.13] verglichen. Bei fehlendem Signal in einem der PCR-Produkte oder falscher Position im
Vergleich zum Längenstandard folgte eine zweite Gelkontrolle. Bei gleichem Ergebnis wurde
die PCR für diese Probe wiederholt. Bei Auftreten einer DNA-Bande in der Negativprobe
wurden alle Ansätze einer PCR-Reihe verworfen und wiederholt.
34
2.5.3
Gelelektrophorese
mit
zeitlichem
Temperaturgradienten
(Temporal
Temperature
Gradient Electrophoresis, TTGE) sowie mit einem Denaturans Gradienten Gel
(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)
Die TTGE basiert auf dem Prinzip, dass doppelsträngige DNA in denaturierendem Milieu in
Abhängigkeit von der Basensequenz bei einer bestimmten Temperatur schmilzt und somit aus
doppelsträngiger DNA (double stranded DNA, dsDNA) zunächst ein aufgespaltenes Molekül
und dann, bei weiterem Ansteigen der Temperatur einzelsträngige DNA (single stranded DNA,
ssDNA) entsteht. Sowohl das aufgespaltene Molekül als auch die ssDNA weisen ein anderes
Laufverhalten auf als die dsDNA. Da die jeweiligen Schmelztemperaturen von der
Basensequenz abhängig sind, bewirkt eine Änderung der Basenabfolge, wie dies z.B. bei
Punktmutationen der Fall ist, eine Änderung in der Schmelztemperatur [45]. Bei der TTGE wird
die DNA in einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgetrennt, welchem Harnstoff als
Denaturans zugesetzt ist, um die Schmelztemperatur der zu untersuchenden DNA zu senken.
Die Elektrophorese läuft über eine definierte Zeit, wobei die Temperatur kontinuierlich erhöht
wird. In Abhängigkeit von der Basenabfolge beginnt die DNA aufzuschmelzen und ändert somit
ihr Laufverhalten über die Zeit. Da die mutierte DNA (Punktmutationen, Insertionen, Deletionen,
Frameshiftmutationen) ein anderes Laufverhalten aufweist als die Wildtyp-DNA, ist das
sichtbare Ergebnis ein differierendes Bandenmuster, anhand dessen sich eine Mutation
identifizieren lässt.
Ähnlich der molekularen Grundlage der TTGE arbeitet die DGGE. Bei dieser Methode wird eine
Änderung des Konformationszustandes der DNA in Abhängigkeit der Basenabfolge durch einen
Gradienten der denaturierenden Agentien Formamid und Harnstoff erreicht. Die Temperatur ist
während des gesamten Gellaufes konstant.
Bei Proben mit dem untersuchten Allel in homozygotem Zustand wird bei der TTGE und der
DGGE eine Homoduplex-Bande erhalten. Liegen Wildtyp und mutierte DNA nebeneinander vor,
wie es bei heterozygotem Zustand des untersuchten Allels oder bei einem Gemisch von
mutierter und nicht-mutierter DNA der Fall ist, zeigen sich im Idealfall vier Banden in der TTGE
bzw. DGGE. Zwei Banden stellen jeweils die Homoduplizes des Wildtyps bzw. der mutierten
DNA dar, die beiden weiteren Banden die Heteroduplizes. Diese sind während der
vorangegangenen PCR durch wiederholtes Aufschmelzen und Renaturieren von einem Wildtyp
und einem mutiertem DNA-Strang entstanden und weisen untereinander ein unterschiedliches
Laufverhalten in der TTGE bzw. DGGE auf (s. Abbildung 3). Um die Unterschiede im
Laufverhalten zu erhöhen und damit die Auftrennung der Banden zu verbessern, wird ein
möglichst frühes Aufschmelzen des mutierten Abschnittes sowie ein möglichst lang erhaltener
partiell aufgeschmolzenem Zustand der dsDNA angestrebt. Durch die hohe Bindungsenergie
der GC-Klammer des PCR-Produktes ist zu ihrem Aufschmelzen eine hohe Temperatur in der
35
TTGE oder entsprechend eine hohe Konzentration an Denaturantien in der DGGE erforderlich.
Daher schmilzt die GC-Klammer als letztes auf und sichert so möglichst lange einen partiell
aufgetrennten Zustand der DNA [13,14,180].
Abbildung 3: Laufverhalten der DNA in der Denaturans Gradient Gelelektrophorese, DGGE,
[modifiziert n. 13]
Zur Festlegung der Laufbedingungen muss die zu untersuchende Basensequenz bekannt sein.
Um einen approximativen Temperaturbereich für die Auftrennung der DNA in der TTGE/DGGE
zu
bestimmen,
wurde
für
die
zu
untersuchenden
Exons
eine
Berechnung
der
Schmelztemperatur sowie des Schmelzverhalten online mit Hilfe des Poland Servers des
Instituts für Physikalische Biologie der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf [123,157]
durchgeführt.
Der
berechnete
Temperaturbereich
diente
als
Grundlage,
den
Schmelztemperaturbereich eines Exons einzugrenzen. Der Bereich wurde mit einer für das
entsprechende Exon heterozygoten Kontrolle (Gemisch aus Wildtyp- und mutierter DNA) in
einer Gelelektrophorese mit räumlichen Temperaturgradient, der sogenannten Temperature
36
Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) verifiziert [137]. Bei dieser Methode wurde ein Gel mit
konstantem denaturierendem Milieu verwendet. Über dem Gel liegt ein Temperaturgradient, der
über
die
Zeit
konstant
ist.
Die
Laufrichtung
der
Probe
verläuft
senkrecht
zum
Temperaturgradienten. Man erhält eine sigmoide Kurve, aus der man auf das Laufverhalten der
Probe bei unterschiedlichen Temperaturen rückschliessen kann. Die Kurve teilt sich im
Optimalfall in drei verschiedene Abschnitte und bei einem Gemisch aus mutierter und nichtmutierter DNA in vier verschiedene Einzelkurven. Diese repräsentieren die beiden Homo- sowie
die
beiden
Heteroduplizes
mit
ihrem
unterschiedlichen
Laufverhalten.
Für
den
Temperaturgradienten in der TTGE interessant ist der Temperaturbereich des Gels, bei dem
der Abstand zwischen den vier Kurvenverläufen in Laufrichtung der Probe am grössten ist. Hier
zeigt das Laufverhalten zwischen den beiden Allelen den grössten Unterschied. Dieser Anteil
der Kurve deckt sich mit dem Bereich der grössten Steigung der sigmoiden Kurve, welcher den
Schmelzbereich der DNA markiert (s. Abbildung 4).
Abbildung 4: Schema der Temperaturgradient-Gelelektrophorese, TGGE, Tmin bzw. Tmax entspricht der
Start- bzw. der Endtemperatur des Schmelzvorganges, zwischen den Symbolen +/- liegt eine definierte
Spannung an [modifiziert n. 184].
Im Vorversuch betrug dieser Bereich für die untersuchten Exons:
Tabelle VII: Temperaturbereiche der einzelnen Exons in der TGGE
Exon
Tmin
Tmax
5-1
51°C
61°C
5-2
58°C
64°C
6
48°C
56°C
7
56°C
66°C
8
56°C
68°C
37
Mit diesen Ergebnissen als Ausgangspunkt konnten mehrere Versuche durchgeführt werden, in
denen die Temperaturbereiche, die Temperatursteigerungsrate (ramp rate) bzw. die
denaturierenden Gradienten und die Laufzeit variiert wurden, bis ein Ergebnis mit optimaler
Trennung der Banden in der TTGE erzielt werden konnte.
Positivkontrollen [7.2.32]:
Als Positivkontrolle wurden DNA-Isolate aus den in Tabelle VIII beschriebenen Zelllinien mit
bekannten Mutationen im p53-Gen verwendet.
DNA aus dem Blut eines gesunden Spenders diente als Negativkontrolle. Die DNA sowohl der
Positiv- als auch der Negativkontrollen wurde mittels PCR analog den untersuchten Tumor- und
Normalproben verarbeitet.
Tabelle VIII: Positivkontrollen für die Mutationsanalyse der untersuchten Exons des p53-Gens
Exon Zellreihe
Charakterisierung
Mutation in Codon
Basenaustausch
Literatur
5
Capan-1 Adenokarzinom Pankreas
159
GCC CTC
70
6
BXPC-3
Adenokarzinom Pankreas
220
TAT TGT
51
7
DLD-1
Adenokarzinom Kolon
241
TCC TTC
135
8
SW480
Adenokarzinom Kolon
273/309
CGT CAT/CCC CCT 113,135,179
TTGE/DGGE-System:
Das DCode Universal Mutation Detection System [7.3.2] ist eine Gelkammer, in der das Gel
senkrecht in einem mit Puffer gefüllten Becken hängt, während eine Temperatureinheit über
einen Heizstab und einen Rührer die Temperatur des Puffers und damit des Gels kontinuierlich
steuert.
Vor
Beginn des Gellaufes wird
die Start-
und Zieltemperatur
sowie die
Temperatursteigerungsrate über die Zeit (in °C/h) eingegeben. Die Laufzeit wird über den
Spannungsgeber [7.3.10] kontrolliert.
Vorbereitung des TTGE-Gels:
Entsprechend Tabelle IX ist aus Acrylamid/Bisacrylamid [7.2.1], TAE-Puffer [7.2.58], Harnstoff
[7.2.28] und aqua bidest. eine Stammlösung angesetzt worden, von der 30ml für ein Gel von
16,0cm x 16,0cm x 0,1cm (Länge x Breite x Dicke) benötigt wurden.
Tabelle IX: Stammlösung für das TTGE-Gel
Reagenz
Volumen
40% Acrylamid/Bis
TAE Puffer, 50x
Harnstoff
aqua bidest.
10ml
1ml
16,8g
ad 40ml
Konzentration in der
Stammlösung
10%
1,25x
7M
38
Zu 30ml der Stammlösung wurden in einem 50ml Becherglas 270µl 10% APS [7.2.3] und 27µl
TEMED [7.2.60] pipettiert. Nach ausreichendem Vermischen wurde das noch flüssige Gel in
eine 50ml Spritze aufgezogen und zwischen die Glasplatten, welche im herstellereigenen
Gelgiessständer eingespannt waren, gegeben. Nach 1h Polymerisationsdauer konnte das Gel
in den Tank des DCode Universal Mutation Detection Systems gehängt werden, der zuvor mit 7
Litern TAE Puffer, 1,25x konzentriert [7.2.57], gefüllt und auf die Starttemperatur vorgeheizt
war.
Vorbereitung des DGGE-Gels:
Für die Analyse des Exons 5-2 und 6 wurde wie folgt ein 10%iges DGGE-Gel hergestellt.
Als erster Schritt mussten 25ml einer 10%igen Acrylamidlösung mit 75% Denaturans angesetzt
werden, indem 18,75ml einer Lösung mit 100% Denaturans (s. Tabelle Xa) mit 6,25ml einer
Lösung ohne Denaturans (0%ig, s. Tabelle Xb) gründlich gemischt wurden. Zu Beginn wurden
15ml der 75%igen Denaturanslösung, 135µl 10% APS [7.2.3] und 13,5ml TEMED [7.2.60]
gemischt. Dieses Gemisch konnte dann zwischen die vorbereiteten Glasplatten gegeben
werden. Im Anschluss daran konnte mit dem Gradientengiesssystem des DCode Systems der
Gel Gradient des Gels gegossen werden. Hierzu wurden 9ml der 75% Denaturanslösung und
9ml einer 30% Denaturanslösung, die zuvor aus 2,7ml 100% Denaturanslösung und 6,3ml 0%
Denaturanslösung hergestellt worden war, kontinuierlich vermischt und zwischen die
Glasplatten auf das polymerisierte Gel mit 75%igen Denaturanslösung gegeben. Beiden
Ansätzen war vorher 100µl 10% APS und 10µl TEMED zugegeben worden. Nach einer
Polymerisationszeit von einer Stunde wurde das Gel analog dem Gel der TTGE in den Tank
des DCode Universal Mutation Detection System [7.3.2] gehängt.
Tabelle Xa: 10% Acrylamid-Lösung mit 100% Denaturans
Acrylamid-Lösung
ml/Ansatz Endkonzentrationen
40% Acrylamid/Bis [7.2.1]
25ml
10%
50x TAE-Puffer [7.2.58]
2ml
1x
Formamid (deionisiert)
[7.2.24]
40ml
40%
Harnstoff [7.2.28]
42g
7M
aqua bidest. ad
Endvolumen
100ml
39
Tabelle Xb: 10%ige Acrylamid-Lösung mit 0% Denaturans
Acrylamid-Lösung
ml/Ansatz Endkonzentrationen
40% Acrylamid/Bis [7.2.1]
25ml
10%
50x TAE-Puffer [7.2.58]
2ml
1x
aqua bidest. ad
Endvolumen
100ml
Vorbereitung der Proben:
Je 3µl des PCR Produktes [2.5.2] wurden mit 5µl des TTGE-Laufmarkers [7.2.34] und 2µl des
TAE-Puffers, 1,25x konzentriert, [7.2.57] in einer Mikrotiterplatte gemischt und in die Taschen
des auf die Starttemperatur vorgeheizten Geles pipettiert. Die Laufbedingungen der Gele zur
Auftrennung der PCR-Produkte für die untersuchten Bereiche sind in Tabelle XI aufgeführt.
Tabelle XI: Laufbedingungen der TTGE für die Exons 5-1,7,8 und der DGGE für die Exons 5-2 und 6
Laufzeit
Spannung/V
Temperatur in
Heizrate (ramprate)
in h
(konstant)
Tmin°C-T max°C
in °C/h
TTGE
4
160
53- 63
2,5
5-2
DGGE
5
160
58
konstant
6
DGGE
5
160
58
konstant
7
TTGE
6
160
56- 66
1,7
8
TTGE
4
160
50- 59
2,25
Exon
Gelart
5-1
Gellauf:
Nachdem die vorbereiteten Proben in die Taschen des auf Tmin vorgeheizten (TTGE) bzw. auf
Arbeitstemperatur befindlichen (DGGE) Gels pipettiert worden waren, konnte der Gellauf unter
den für das zu untersuchende Exon bestimmten Bedingungen gestartet werden.
Auswertung des Gels:
Die DNA-Banden in den TTGE- bzw. DGGE-Gele wurden mittels Silberfärbung, die zu einer
unspezifischen Färbung von DNA führt, visualisiert [modifiziert n. 137].
Färbung des Gels:
Die Durchführung der Färbung erfolgte bei Raumtemperatur gemäss folgendem Protokoll.
Zunächst wurde das Gel dreimal jeweils für 5min in frischer Fixierlösung [7.2.23] fixiert. Hieran
schloss sich der Färbevorgang für 15min in der Silbernitratlösung [7.2.53] an. Nachdem das Gel
zweimalig mit aqua bidest. und darauffolgend zweimalig mit Entwicklerlösung [7.2.16] gespült
worden war, wurde es für 3, 5 und 12min in jeweils erneuerter Entwicklerlösung inkubiert. Der
Färbevorgang endete nach 5min Inkubieren in einer Natriumbikarbonatlösung [7.2.40]. Im
40
Anschluss daran folgte ein kurzes Waschen mit aqua bidest. zur Entfernung restlicher
Reagenzien und die Verpackung des Gels durch luftdichtes Verschweissen in Kunststofffolie.
Alle Inkubationen mit den Lösungen fanden auf dem Schwenktisch [7.3.8] statt.
Auswertung des Gels:
Das Bandenmuster der Tumor- und Normalgewebsproben wurde jeweils mit denen der Positivund der Negativkontrolle eines Gellaufes verglichen.
Da Positiv- und Negativkontrolle homozygot für das untersuchte Exon waren, ergab sich in der
TTGE bzw. DGGE jeweils eine einzelne Bande (entsprechend der Homoduplex), die sich
untereinander in der Position unterschieden. Erwartet wurde bei den Proben der Patienten im
Falle einer Mutation bei heterozygotem Gemisch der Probe für die untersuchten Exons
insgesamt vier Banden (entsprechend den zwei Homo- und den zwei Heteroduplizes; s. auch
Ergebnisse Abbildung 6).
2.5.4 Sequenzierung
Zur Charakterisierung der Mutation wurden die im Laufverhalten von der Negativprobe
abweichenden Homoduplizes aus dem TTGE- bzw. DGGE-Gel einer Klonierung und
anschließend einer Sequenzierung zugeführt. Dazu wurden die DNA-Banden aus dem Gel
eluiert, durch eine PCR amplifiziert und mittels TOPO-Klonierung [7.2.31] in den Vektor pCR®Blunt II-TOPO® inseriert. Die Plasmidinserts durchliefen ein Gel im Sequenzanalysegerät
[7.3.9], das mittels Laserabtastung die Basenabfolge des untersuchten DNA-Abschnittes
ermittelt.
Isolierung der DNA-Banden aus dem TTGE-Gel bzw. DGGE-Gel:
Die DNA-Banden wurden mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten, das Acrylamid-DNAGemisch manuell zerkleinert und in einem Eppendorf-Cup mit 30µl Elutionspuffer [7.2.15]
überschichtet. Die Eppendorf-Cups wurden bei 37°C über 2h im Thermomixer [7.3.13] unter
ständigem Schütteln inkubiert und im Anschluss für 15min mit 22.900g bei 18°C in der
Zentrifuge [7.3.18] zentrifugiert. Der flüssige Überstand, welcher die eluierten Homoduplizes
enthielt, konnte in Eppendorf-Cups abpipettiert und der Bodensatz verworfen werden [180]. Zur
Amplifizierung der aus dem Acrylamidgel eluierten DNA wurde eine PCR mit den
exonspezifischen Primern und Zyklusbedingungen durchgeführt (s. PCR p53 Exon 5-8, 2.5.2).
Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegel kontrolliert (s. PCR-Produktkontrolle, 2.5.2).
41
2.5.4.1 Klonierung der amplifizierten Homoduplex-DNA
Bei dem Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning [7.2.31] werden in einem Ein-Schritt-Verfahren bluntend-PCR-Produkte, die durch eine „proofreading“ Polymerase (z.B. Pwo) erzeugt werden, in
einen Plasmid-Vektor inseriert. Der im verwendeten Klonierungs-Kit enthaltene linearisierte
Plasmidvektor (pCR®-Blunt II-TOPO®) hat an den 3’-Phosphatgruppen jedes DNA-Stranges
Topoisomerase I aus dem Vaccinia Virus kovalent gebunden. Diese Topoisomerase bindet
dsDNA an einer spezifischen Stelle und spaltet das Phosphodiester Rückgrat nach einer 5’CCCTT-Sequenz in einem Strang [151]. Die Energie der Phosphodieesterbindung wird in der
Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der 3’-Phosphatgruppe des gespaltenen Stranges
und einem Tyrosylrest (Tyr-274) der Topoisomerase I konserviert. Die Phospho-Tyrosyl
Bindung zwischen DNA und Enzym kann später von der 5’-Hydroxylgruppe des gespaltenen
Stranges angegriffen werden, somit die Reaktion rückgängig gemacht und die Topoisomerase
abgelöst werden [150]. Diese Reaktion wird bei der TOPO® -Klonierung ausgenutzt, um sehr
effizient PCR-Produkte zu klonieren. In dem Vektor pCR®-Blunt II TOPO ist das Gen ccdB [12],
welches für einen Gyrase-Hemmer kodiert und so das Wachstum der meisten Escherichia coliStämme verhindert, an den C-Terminus des LacZα-Fragmentes fusioniert. Die Insertion eines
PCR-Produktes unterbricht die Expression der LacZα-ccdB-Fusion. Diese erlaubt eine direkte
Selektion von Rekombinanten nach einer Transformation, da die Zellen, welche Vektor ohne
Insertion enthalten, abgetötet werden. Auf die Anwesenheit des Vektors in den Zellen kann
durch die Anwesenheit von Genen gegen Zeocin oder Kanamycin selektiert werden. Für die
Transformation der TOPO® Klonierungs-Produkte wurden chemisch kompetente Zellen des
Bakterienstammes Escherichia coli TOP10 One Shot®verwendet [80].
Durchführung der TOPO®- Klonierung:
Vorbereitung:
Das Wasserbad [7.3.16] wurde auf 42°C vorgewärmt, u nd das SOC-Medium [7.2.54] auf
Raumtemperatur gebracht. LB-Platten [7.2.35] mit 50µg/ml Kanamycinsulfat [7.2.30] waren
30min auf 37°C vorgewärmt. Pro Klonierungsansatz wu rde eine Einheit der One Shot® Zellen
auf Eis aufgetaut.
Klonierungsreaktion:
In einem Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 4µl des blunt end PCR-Produktes sowie1µl der im
Klonierungs-Kit enthaltenen Salzlösung [7.2.31] und 1µl TOPO Vektor zusammenpipettiert.
Nach einer Inkubationszeit von 5min bei Raumtemperatur konnte der Reaktionsansatz auf Eis
gegeben werden.
42
Transformation:
2µl des Klonierungs-Ansatzes wurden zu einer Einheit chemisch kompetenter Escherichia coli
One Shot® TOP10 hinzugegeben und vermischt. Es folgte eine Inkubation des Ansatzes auf Eis
für 5min. Daran schloss sich ein Hitze-Schock der Zellen für 30s bei 42°C an. Im Anschluss
folgte ein direkter Transfer auf Eis. Die nächsten Schritte waren die Zugabe von 250µl des
SOC-Medium [7.2.54] bei Raumtemperatur und nachfolgendes horizontales Schütteln bei
200rpm und 37°C für 1h. Von jedem Transformationsan satz wurden 100µl auf eine
vorgewärmte LB+Kanamycin-Platte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Analyse der Klone:
Sechs der nach der Transformation auf dem Selektivmedium gewachsenen Kolonien waren zur
Aufreinigung auf LB+Kanamycin-Platten ausgestrichen und von jeweils einer der auf diesen
Platten gewachsenen Einzelkolonien Sektorenausstriche angefertigt worden. Diese dienten als
Ausgangsmaterial zum Beimpfen der für die Plasmidisolierung (Mini- oder Maxiprep) benötigten
Bakterienkulturen.
Plasmidisolierung:
Miniprep:
Zur Isolierung analytisch verwendbarer Mengen Plasmid-DNA wurde der NucleoSpin® Kit der
Firma Macherey-Nagel [7.2.41] verwendet. Diese Methode basiert auf der Bindung von DNA an
eine Silica-Membran. Jeweils 5ml LB-Medium mit 50µg/ml Kanamycin in 15ml GreinerRöhrchen wurden mit einer auf den Sektorenausstrichen gewachsenen Einzelkolonie beimpft
und über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Durch Zentrifugation bei 3500g und 4°C
wurden die Zellen pelletiert. Nachdem der Überstand dekantiert war, konnten die Zellen in 250µl
Puffer A1 [7.2.41] resuspendiert und in 1,5ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt werden.
Danach wurden 250µl Puffer A2 [7.2.41] hinzugefügt und die Reaktionsgefäße sechs- bis
achtmal umgedreht. Nach 5min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 300µl Puffer A3
[7.2.41] hinzugegeben, erneut sechs- bis achtmal gewendet und dann 10min bei 4°C und
22.000g zentrifugiert. Im Anschluss wurde der die Plasmid-DNA enthaltende Überstand auf die
vorbereiteten NucleoSpin® Plasmid-Säulen, welche auf 2ml Eppendorfgefäße aufgesetzt
worden waren, aufgetragen. Diese wurden mit 22.000g für 1min in einer Tischzentrifuge
zentrifugiert. Nach Verwerfen des Filtrats wurde die Säule mit 600µl Puffer A4 [7.2.41]
gewaschen und erneut mit 22.000g 1min zentrifugiert. Nachdem die Säulen auf 1,5mlEppendorf-Reaktionsgefäße überführt worden waren, wurden zur Elution der DNA 50µl Puffer
AE [7.2.41] aufgetragen, 1min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1min bei
22.000g zentrifugiert. Eine erneute Elution mit 50µl Puffer AE erhöhte die Ausbeute um 15-20%,
verdünnte jedoch die DNA-Lösung. Die Proben wurden mit einem Endvolumen von 10µl (9µl
Aliquot und 1µl Puffer AE 10x konzentriert [7.2.41]) aliquotiert.
43
Zur Kontrolle der isolierten Plasmide wurde mit diesen ein Restriktionsverdau mit dem Enzym
EcoRI durchgeführt. Da der Klonierungsvektor beidseitig der Insertionsstelle für das zu
klonierende Fragment jeweils eine Erkennungssequenz für EcoRI besitzt, wurde ein inseriertes
Fragment durch diesen Verdau herausgeschnitten. Hierzu wurden jeweils 9µl Plasmid-DNA mit
1µl 10x konzentriertem Puffer H [7.2.15] und 1µl EcoRI-Lösung (2,5U) gemischt und 2h bei
37°C
inkubiert.
Die
Kontrolle
erfolgte
durch
Agaros e-Gel-Elektrophorese
(s.
PCR-
Produktkontrolle 2.5.2). Hierbei gab sich eine erfolgreich verlaufende Klonierung an dem
Auftreten zweier Banden, von denen eine dem Vektor und die andere dem inserierten PCRFragment entsprach, zu erkennen. Zwei der nach EcoRI-Verdau als Insert-tragend identifizierte
Klone dienten als Ausgangsmaterial für eine Maxiprep-Plasmidisolierung unter Verwendung des
QUIAGEN Plasmid Maxi Kit 100 [7.2.44].
Maxiprep:
Die zur Aufreinigung eingesetzten Säulen sind Anionenaustauscher, von denen die PlasmidDNA durch einen Hochsalzpuffer eluiert wird.
Zunächst wurde eine Vorkultur vorbereitet. Dazu wurden 10ml LB-Medium+50µg/ml Kanamycin
[7.2.30] mit einer transformierten E. coli-Kolonie beimpft und 5 bis 6h lang bei 37°C stark
geschüttelt. Mit je 5ml Vorkultur konnten dann 100ml LB-Medium+50µg/ml Kanamycin inokuliert
und ca. 16h lang unter starkem Schütteln bei 37°C i nkubiert werden. 1,7ml dieser Kulturen
wurden entnommen und mit 300µl sterilem Glycerin [7.2.26] gemischt und dieses als
Stammkultur bei -80°C eingefroren. Der Rest der Hau ptkultur wurde gleichmässig in vier 50ml
Greiner-Reaktionsröhrchen überführt und 15min lang bei 4°C mit 3.400g zentrifugiert. Nachdem
der Überstand dekantiert war, konnte das Zell-Pellet in je 2,5ml P1-Puffer [7.2.44] pro Gefäß
resuspendiert werden. Nach dem Vereinigen der Suspensionen wurden diese mit 10ml P2Puffer [7.2.44] versetzt. Nach sechsmaligem Umdrehen des Gefäßes schloss sich 5min
Inkubation bei Raumtemperatur an. Nach Zugabe von 10ml 4°C kaltem P3-Puffer [7.2.44]
wurde wieder durch sechsmaliges Umdrehen gemischt und dann 20min auf Eis inkubiert. Im
Anschluss daran folgte eine Zentrifugation für 45min bei 3.400g und 4°C. Während dieser Zeit
waren die DNA-Säulen (Qiagen-tip 500) des Kits mit 10ml QBT-Puffer [7.2.44] äquilibriert
worden, und im Anschluss daran konnte die DNA-Lösung auf die Säulen aufgetragen werden.
Nach zweimaligem Waschen mit 30ml QC-Puffer [7.2.44] wurde die Säule auf ein 50ml
Reaktionsgefäß überführt und die Plasmid-DNA mit 15ml QF-Puffer [7.2.44] eluiert. Die DNA
wurde bei Raumtemperatur durch Zugabe von 0,7 Volumenanteilen (=10,5ml) 2-Propanol
[7.2.46] gefällt. Im Anschluss wurde 45min bei 3.400g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert und das DNA-Pellet mit 5ml 70%igem Ethanol [7.2.20] gewaschen.
Anschließend wurde für weitere 30min bei 3.400g und 4°C zentrifugiert, danach der Überstand
vorsichtig dekantiert, und die DNA als Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde in
44
100µl TE-Puffer [7.2.61] resuspendiert und nach Inkubation über Nacht bei 4°C in 1,5mlEppendorf-Reaktionsgefäße überführt. Nach einer 1:100 Verdünnung der DNA-Lösung konnte
die DNA-Konzentration photometrisch wie unter Kapitel 2.5.1 beschrieben gemessen werden.
Der Zielwert der DNA-Konzentration lag über 3mg/ml. Nach abschließender Kontrolle der
Plasmide durch Agarose-Gelelektrophorese (s. PCR-Produktkontrolle 2.5.2) wurden diese bei 20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
2.5.4.2 Sequenzierung
In der vorliegenden Arbeit kam die „Cycle-Sequenzierungs“-Methode, eine Abwandlung der
ursprünglich von Sanger et al. (1977) [139] beschriebenen Didesoxynukleotid-KettenabbruchSequenzierungsmethode, unter Verwendung von am 5‘-Ende mit einem IR-Farbstoff markierten
Primern zur Anwendung. Für die Sequenzreaktion wurde ein DNA-Sequenzierungskit mit
Thermo-Sequenase und 7-Desaza-dGTP der Firma Amersham Pharmacia Biotech [7.2.62]
verwendet. Als Primer wurden folgende IRD800-markierte Oligonukleotide, deren Sequenz im
Bereich des Polylinkers des Plasmides pCR®-Blunt II TOPO [7.2.31] zu finden ist, von der Firma
MWG Biotech [7.2.45] bezogen.
Primerangabe für die Cycle-Sequenzierung:
Primer 1: M13Universal(-21), 18mer:
5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’
Primer 2: M13Reverse (-29), 18mer:
5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’
Zunächst wurde für jede Sequenzierungsreaktion der in Tabelle XII aufgeführte Ansatz in PCRCups zusammenpipettiert.
Tabelle XII: Mastermix für Sequenzierungs-PCR
Reagenzien für
Sequenzierungs-PCR
µl/Ansatz
DNA (aus Maxiprep, 1 µg/µl)
1µl
Primer [2mM]
1µl
DMSO [7.2.12]
0,5µl
aqua bidest., steril
10,5µl
Von diesem Ansatz waren jeweils in 4 Ansätzen 3µl mit jeweils 1µl der vier dNTP/ddNTPGemische [7.2.14] in 0,2ml PCR-Reaktionsgefäßen [7.2.43] vermischt und anschließend mit
20µl “Chill-out Liquid Wax” [7.2.10] überschichtet worden.
45
Alle Pipettierschritte fanden auf Eis statt. Die Sequenzierungs-Ansätze wurden in den
Thermocycler [7.3.12] eingesetzt und den in Tabelle XIII aufgeführten Reaktionsbedingungen
ausgesetzt:
Tabelle XIII: Reaktionsbedingungen für die Cycle-Sequenzierung
Zykluszahl
Zeit
Temperatur
1x
1min 45s
95°C
12x
jeweils 15s
95°C, 55°C, 70°C
13x
jeweils 20s
95°C, 55°C, 70°C
1x
40s
95°C
Anschließend wurden die Reaktionsansätze mit jeweils 3µl Stop-Lösung [7.2.55] versetzt und
bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
Sequenzierungsgel:
Entsprechend Tabelle XIV wurden die Reagenzien gemischt, das Gel mit einer 50ml-Spritze
aufgezogen und unter Zuhilfenahme eines Membran-Filters (0.2µM) blasenfrei zwischen die
nach Anleitung des Herstellers montierten Glasplatten des Sequenzierers gegeben. Das Gel
hatte eine Größe von 41,0cm x 25,5cm x 0,25cm (Höhe x Breite x Dicke). Als Platzhalter für
den für die Auftragung der Proben verwendeten „Haifischzahnkamm“ wurde ein rechteckiger
Vorkamm eingesetzt.
Tabelle XIV: Zusammensetzung des Gels für die Sequenzierung
Reagenz
Volumen/Menge
RapidGel XL Sol 40% [7.2.51]
7,5ml
Harnstoff [7.2.29]
21g
10x TBE Long Run Puffer [7.2.60]
5ml
aqua bidest., steril
28ml
DMSO [7.2.12]
500µl
TEMED [7.2.61]
50µl
APS, 10% [7.2.3]
350µl
Nach 1,5h Polymerisation konnte das Gel in den automatischen Infrarot-Fluoreszens DNASequenzierer [7.3.9] eingesetzt und mit oberer und unterer Pufferkammer verbunden werden.
Als Laufpuffer diente einfach konzentrierter TBE-Puffer [7.2.59]. Nach Kalibrierung des Lasers
wurde zunächst ein Vorlauf von ca. 20min unter Sequenzierungsbedingungen gestartet, um
Verunreinigungen aus dem Gel, die die Sequenzierung stören könnten, zu entfernen. Dann
46
wurde der „Haifischzahn-Kamm“, der es ermöglichte 64 Ansätze, d.h. 16 Proben gleichzeitig
aufzutrennen, eingesetzt und je 1µl der Sequenzierungsansätze in der Basenreihenfolge A-CG-T aufgetragen. Nach erneuter Laserjustierung wurde der Gellauf unter folgenden
Bedingungen gestartet:
Spannung: 1500V (konstant)
Stromstärke: 35mA (zu Beginn)
Temperatur: 45°C
Laufzeit: 12h
Auswertung der Sequenzierung:
Die Sequenzdaten wurden mit Hilfe des Programms Base Image IR Data Collection, Version
2.31 (Li-Cor, Nebraska, USA, 1992-95) aufgezeichnet und gespeichert sowie anschließend mit
dem Analyseprogramm Base Image IR Image Analysis, Version 4.0 (Li-Cor, Lincoln, Nebraska,
USA, 1997) ausgewertet. Die erhaltenen Sequenzdaten wurden durch Vergleich mit der
Wildtyp-DNA (EMBL:U94788) mit Hilfe des multiplen Alignment Programms Clustal W online
beim European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.uc.uk) auf Mutationen hin untersucht.
Von jedem nach TTGE/DGGE als mutiert identifizierten Fragment wurden routinemässig jeweils
2 Klone untersucht, wobei jeweils beide DNA-Stränge durch Verwendung von M13-Universalund M13-Reverse-Primer [7.2.45] sequenziert wurden. Bei unterschiedlichen Ergebnissen
wurden weitere Klone des jeweiligen Fragmentes zur Sequenzierung herangezogen.
2.6
Statistik
Die Stichprobenschätzung erfolgte zu Beginn der Doktorarbeit nach der Datenlage der Literatur
zu diesem Thema. Die Stichprobengröße betrug 52.
Zur Berechnung der Signifikanz des Unterschiedes in der VEGF-Konzentration zwischen
Tumor- und Normalgewebe wurde der Wilcoxon-Test angewendet. Die Signifikanz der
Unterschiede in der VEGF-Konzentration im Tumorgewebe zwischen Tumoren mit und ohne
Mutation im p53-Gen, unterteilt in verschiedene Gruppen (s. Kapitel 3), wurde mit Hilfe des
Mann-Whitney-U Test berechnet. Als signifikant wurde ein p-Wert von p≤0.05 gewertet.
Der Wilcoxon-Test sowie der Mann-Whitney-U Test wurden mit „SPSS for Windows“, Version
9.0.1, Fa. SPSS Inc., Chicago, USA, durchgeführt.
47
Abbildung 5: Boxploterklärung
Definitionen des Boxplot [169]:
Die Innere Eingrenzung ist definiert durch:
- Quartile, oberhalb bzw. unterhalb + 1,5 x F-Spanne
Werte ausserhalb der Inneren Eingrenzung sind als Ausreisser definiert.
Die Unterscheidung ausserhalb und weit ausserhalb wird getroffen durch zusätzliche Grenzen,
die wie folgt definiert sind:
- Quartile, oberhalb + 3 x F-Spanne
- Quartile, unterhalb - 3 x F-Spanne
48
3
Ergebnisse
3.1
Alterationen des p53-Gens im Normal- und Tumorgewebe
Die ‚hot spot‘-Regionen für Mutationen des p53-Gens in den Exon 5-8 wurden mit der TTGE für
die Exons 5-1, 7 und 8, und mit der DGGE für die Exons 5-2 und 6 auf Mutationen hin
untersucht (s. Kapitel 2.5.3). Die Abbildung 6 zeigt beispielhaft das Bandenmuster einer TTGE
mit der Positiv- (Zelllinie SW480) und der Negativkontrolle in den Spuren 1 und 2. War keine
Mutation vorhanden, so trat analog der Negativprobe (Spur 2) nur eine Bande auf,
entsprechend der Homoduplex aus homozygoter Wildtyp-DNA. Bei der Zelllinie SW480
(Positivkontrolle, Spur 1) mit einer Mutation im Exon 8 (Codon 273: CGT->CAT) ist ebenfalls
nur eine Bande zu sehen. Sie entspricht der Homoduplex aus homozygot mutierter DNA und
hat eine kürzere Laufstrecke als die Bande der Negativprobe. In den Spuren 4 (T83) und 10
(T125) sind jeweils vier Banden zu erkennen. Die beiden Banden mit der längsten Laufstrecke
entsprechen den Homoduplizes aus Wildtyp- respektive mutierter DNA. Darüber, mit kürzerer
Laufstrecke, sind die Heteroduplizes aus Wildtyp- und mutierter DNA zu erkennen, mit
unterschiedlichen Laufverhalten.
1
2
3
4
5
6
7
9
11
Abbildung 6: TTGE-Gel zum Nachweis von Mutationen im Exon 8 des p53-Gens.
Bedingungen: 10% Acrylamid, 7M Harnstoff, 160V, Temperaturbereich 53-63°C, Heizrate 2°C/h, 5h
Aufgetragen wurden Amplifikationsprodukte aus einer PCR mit Exon-8-spezifischen Primern und
genomischer DNA aus Spur 1: kolorektale Karzinom-Zelllinie SW480 [Positiv-Kontrolle: Mutation in
Codon 273 (CGT CAT)]; Spur 2: Blut eines gesunden Spenders (Negativ-Kontrolle); Spuren 3-11:
kolorektale Tumorgewebe. Proben, die von der Negativ-Kontrolle abweichende Banden aufwiesen,
wurden als mutiert identifiziert, siehe Spur 4 und 10.
Mit Hilfe der TTGE bzw. der DGGE wurden in 26 der 52 untersuchten Tumorproben insgesamt
29 Abweichungen von der Wildtyp-Sequenz in den untersuchten Exons des p53-Gens detektiert
(s. Tabelle XV). 25 Proben trugen jeweils eine Mutation und eine Probe (T169) zwei
49
Mutationen. Bei zwei Proben (T188 und T217) wurde zusätzlich zu einer Mutation im Tumor ein
Polymorphismus in Codon 213 sowohl im Tumor- als auch im Normalgewebe nachgewiesen. In
die Auswertung der Mutationshäufigkeit, Transversionen, Transitionen und Mutationen in den
einzelnen Stadien wurden alle 26 Tumorproben mit Mutation einbezogen. Der Polymorphismus
wurde nicht als Mutation gewertet.
Im korrespondierendem Normalgewebe der 26 Tumorproben mit Mutation fand sich keine
Mutation in den untersuchten Exons. In den Proben N188 und N217 konnte ebenfalls der
Polymorphismus nachgewiesen werden.
Tabelle XV: Häufigkeiten der p53-Mutation in den Exon 5-8
in % aller
Mutation
N
nein
26
50,00
ja
26
50,00
3.2
Tumore (n=52)
Lokalisation und Art der p53-Mutationen
Die Mutationsanalyse durch die TTGE bzw. DGGE ergab die in Tabelle XVI dargestellte
Verteilung der Mutationen auf die fünf untersuchten Exons.
Tabelle XVI: Verteilung der detektierten Mutationen auf die Exons 5-8
Lokalisation der
Mutation
in % der p53
n
positiven Tumore
in % aller Tumore
(n=52)
(n=26)
p53ex5
8
30,76
15,38
p53ex6
4
15,38
7,69
p53ex7
7
26,92
13,46
p53ex8
10
38,46
19,23
In der Sequenzierung konnten die 29 gefundenen Mutationen 14 verschiedenen Codons
zugeordnet werden (s. Tabelle XVII). 15 dieser Mutationen (51,72%) lagen in den ‚hot spot‘Codons 175, 245, 248, 273 und 282 des p53-Gens (s. Abbildung 2). Es zeigte sich, dass die
Mutationen in der Mehrzahl der Fälle (n=26) einen Aminosäurenaustausch zur Folge hatte (vgl.
Tabellen XVIII bis XXI). In zwei Proben wurde ein Polymorphismus in Codon 213 (s. Tabelle
XIX) nachgewiesen. Eine Probe trug eine stille Mutation (s. Tabelle XVIII).
50
Tabelle XVII: Verteilung der Mutationen im p53-Gen Exon 5-8 in den 26 Tumorproben auf die
einzelnen Codons
a
Lokalisation in
Codon
n
135
171
173
175
a
193- 201 Deletion
a
213 Polymorphismus
220
234
245
248
266
273
280
282
285
4
1
1
2
1
2
1
1
2
4
1
3
1
4
1
in % aller
Mutationen
(n=26)
15,38
3,85
3,85
7,70
3,85
7,70
3,85
3,85
7,70
15,38
3,85
11,54
3,85
15,38
3,85
in % aller
Tumoren
(n=52)
7,69
1,92
1,92
3,85
1,92
3,85
1,92
1,92
3,85
7,68
1,92
5,77
1,92
7,69
1,92
s. Tabelle XIX
In acht Tumorproben traten Mutationen im Exon 5 auf (s. Tabelle XVIII), von denen vier im
Codon 135 lagen und zu einer Sequenzänderung von TGC im Wildtyp nach TTC führten. In
zwei Fällen wurde im Codon 175 eine Mutation von CGC zu CAC detektiert. Eine Mutation in
Exon 5 betraf das Codon 171 (GAG GGG). In einer weiteren Probe war das Codon 173 an der
dritten Position von GTG zu GTT mutiert. Bei dieser Mutation handelte es sich somit um eine
"stille" Mutation, da beide Sequenzen für die gleiche Aminosäure (Val) kodieren (s. Tabelle
XVIII).
Tabelle XVIII: Mutationen in Exon 5 (n=8)
Codon
Anzahl der
Mutationen
Wt-Sequenz
Mut-Sequenz
Wt-Aminosäure
Mut-Aminosäure
135
4
TGC
TTC
Cys
Phe
171
1
GAG
GGG
Glu
Gly
173
1
GTG
GTT
Val
Val
175
2
CGC
CAC
Arg
His
In vier Tumorproben wurde eine Sequenzänderung im Exon 6 nachgewiesen (s. Tabelle XIX).
Dabei handelte es sich in zwei Fällen um einen bekannten seltenen Polymorphismus im Codon
213 [21], welcher abweichend von der Wildtyp-Sequenz CGG zur Sequenz CGA führte. Dieser
Polymorphismus wurde auch in den korrespondierenden Normalgewebeproben gefunden. In
einer Tumorprobe wurde eine Deletion der Codons 193 bis 201 mit dem Verlust von 8
51
Basentripletts nachgewiesen, welche für die Aminosäuren His, Leu, Ile, Arg, Val, Glu, Gly, Asn,
Leu kodieren. Das durch die Deletion entstandene Basentriplett kodiert für die Aminosäure Leu.
Eine weitere Tumorprobe besaß eine Punktmutation im Codon 220 von Wt TAT nach Mut TGT.
Tabelle XIX: Mutationen in Exon 6 (n=4)
Codon
Anzahl der
Mutationen
Wt-Sequenz
Mut-Sequenz
193-CAT CTT ATC
193-201
1
CGA GTG GAA
Wt-Aminosäure
Mut-Aminosäure
His, Leu, Ile, Arg,
193 -CTG- 201
GGA AAT TTG-201
Val, Glu, Gly, Asn,
Leu
Leu
213
2
CGA
CGG
Arg
Arg
220
1
TAT
TGT
Tyr
Cys
Insgesamt sieben Tumorproben trugen eine Mutation in Exon 7. Davon war in vier Proben das
Codon 248 mutiert, in drei Fällen von CGG zu CAG und einmal von CGG zu TGG. In zwei
Tumorproben waren die Mutationen im Codon 245 lokalisiert. Die Sequenz veränderte sich in
einem Fall vom Wildtyp GGC zu AGC, im anderen von GGC zu GAC. Eine weitere Mutation
zeigte sich im Codon 234 mit einer Triplettänderung von TAC zu CAC (s. Tabelle XX).
Tabelle XX: Mutationen in Exon 7 (n=7)
Codon
Anzahl der
Mutationen
Wt-Sequenz
Mut-Sequenz
Wt-Aminosäure
Mut-Aminosäure
234
1
TAC
CAC
Tyr
His
245
1
GGC
AGC
Gly
Ser
245
1
GGC
GAC
Gly
Asp
248
3
CGG
CAG
Arg
Gln
248
1
CGG
TGG
Arg
Trp
Von den zehn Tumorproben mit einer Mutation in Exon 8 trugen vier eine Mutation im Codon
282 mit einer Sequenzänderung vom Wildtyp CGG zu TGG auf. In drei Proben war das Codon
273 mutiert, wovon zweimal eine Mutation von Wt CGT zu CAT und einmal eine zu TGT
stattgefunden hatte. Jeweils eine Probe trug eine Mutation in Codon 266 Wt GGA zu Mut GAA,
Codon 280 mit Wt AGA zu Mut ATA und Codon 285 von Wt GAG zu Mut AAG (s. Tabelle XXI).
52
Tabelle XXI: Mutationen in Exon 8 (n=10)
Codon
Anzahl der
Mutationen
Wt-Sequenz
Mut-Sequenz
Wt-Aminosäure
Mut-Aminosäure
266
1
GGA
GAA
Gly
Glu
273
2
CGT
CAT
Arg
His
273
1
CGT
TGT
Arg
Cys
280
1
AGA
ATA
Arg
Ile
282
4
CGG
TGG
Arg
Trp
285
1
GAG
AAG
Glu
Lys
3.3
Art der nachgewiesenen Mutationen
In Tabelle XXII sind die Mutationsergebnisse nach ihrer Art aufgetrennt, d.h. ob es sich um den
Austausch einer Purinbase durch eine Purinbase bzw. einer Pyrimidinbase durch eine
Pyrimidinbase (Transition) handelte oder aber um den Austausch einer Purinbase durch eine
Pyrimidinbase bzw. umgekehrt (Transversion). Bei der Mehrzahl der Fälle (75,86%) war eine
Transition aufgetreten. Es zeigte sich, dass eine Transition, die zu einer Änderung der
Nukleotidpaarung von GC zu AT mit 11 Fällen (37,93%) die häufigste Mutation in dem
untersuchten
Tumorkollektiv
darstellte.
Mutationen,
welche
eine
Veränderung
der
Nukleotidabfolge von CG zu TA zeigten traten mit 6 (20,69%), AT zu GC mit 4 Fällen (13,79%)
und TA zu CG in einem Fall (3,45%) auf. Acht der 11 Transitionen (72,73%) GC zu AT und alle
6 Transitionen von CG nach TA lagen im Bereich von CpG Dinukleotiden (s. Tabelle XXIII).
Transversionen, die zu einer Änderung des Nukleotidpaares GC zu TA führten wurden in 6
Fällen nachgewiesen. In einem Fall bestand die Mutation aus einer Deletion in Exon 6 (vgl.
Tabelle XIX).
53
Tabelle XXII: Verteilung der Mutationsart in den untersuchten Exons des p53-Gen
Art der Mutation
Gesamt-
Exon 5
Exon 6
Exon 7
Exon 8
Ereignisse in %
GC/AT
2
0
5
4
11
37,93
CG/TA
0
0
1
5
6
20,69
AT/GC
1
a
3
0
0
4
13,79
TA/CG
0
0
1
0
1
3,45
5
0
0
1
6
20,69
0
1
0
0
1
3,45
8
4
7
10
29
100
Ereignisse n
Transition
Transversion
GC/TA
Deletion
Gesamtmutationen
a
davon 2mal Polymorphismus
Tabelle XXIII: Transitionen in CpG Dinukleotiden
Art der Mutation
Exon 5
Exon 6
Exon 7
Exon 8
GesamtEreignisse n
GC/AT
CG/TA
2
0
0
0
4
1
2
5
8
6
3.4
Ereignisse in %
auf
Gesamtmutation
27,59
20,69
VEGF-Konzentration im Normal- und Tumorgewebe
Normalgewebe:
Die mediane VEGF-Konzentration in den 52 ausgewerteten Proben betrug 82,87pg VEGF/mg
Protein (Range: 26,66-743,11pg VEGF/mg Protein). Der Mittelwert lag bei 72,41pg VEGF/mg
Protein mit einer Standardabweichung (SD) von 128,58pg VEGF/mg Protein (s. Tabelle XXIV
und Abbildung 7).
Tumorgewebe:
Die Probe T145 wurde in sämtliche VEGF-Berechnungen nicht mit einbezogen, da sie einen
Ausreisser
darstellte
(22552,71pg
VEGF/mg
Protein).
Bei
den
51
ausgewerteten
Tumorgewebeproben betrug der Median 887,43pg VEGF/mg Protein (Range 113,91-5642,11pg
VEGF/mg
Protein)
und
der
Mittelwert
1138,58pg
VEGF/mg
Protein
mit
einer
Standardabweichung 1176,07pg VEGF/mg Protein.
Der Vergleich der VEGF-Konzentration von Normal- und Tumorgewebe ergab einen hoch
signifikanten Unterschied (s. Tabelle XXIV und Abbildung 7). Es zeigte sich im Tumorgewebe in
92,3%
der
Proben
eine
höhere
VEGF-Konzentration
(VEGF T/VEGF N >1).
54
als
im
Normalgewebe
a
Tabelle XXIV: VEGF-Konzentration im Normal- und Tumorgewebe
a
Proben
n
Median
Mittelwert
SD
Range
N
52
82,87
72,41
128,58
26,66 bis 743,11
T
51
887,43
1138,58
1176,07
113,91 bis 5642,11
in pg VEGF/mg Protein
Abbildung 7: VEGF-Konzentration im Normal- und Tumorgewebe
55
p
p<0,001
3.5
VEGF-Konzentration im Normal- und im Tumorgewebe von Patienten mit und
ohne Mutation im p53-Gen
Die VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten ohne Mutation im p53-Gen
unterschied sich nicht signifikant von der bei Patienten mit Mutation (s. Tabelle XXV und
Abbildung 8).
a
Tabelle XXV: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe von Patienten mit und ohne Mutation im p53-Gen
im Tumorgewebe
n
a
Mutation
p53-Gen
Median
Mittelwert
SD
Range
25
Nein
897,01
1239,79
1373,83
117,28 bis 5642,11
26
Ja
816,31
1049,29
967,41
113,91 bis 4370,12
p
0,925
in pg VEGF/mg Protein
Abbildung 8: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen
Ebenso unterschied sich die VEGF-Konzentration im Normalgewebe bei Patienten ohne
Mutation im Tumor nicht signifikant von der bei Patienten mit p53-Mutation im Tumorgewebe
(siehe Tabelle XXVI und Abbildung 9).
56
a
Tabelle XXVI: VEGF-Konzentration im Normalgewebe von Patienten mit und ohne Mutation im p53-Gen
im Tumorgewebe
n
Mutation
p53-Gen
Median
Mittelwert
SD
Range
26
nein
70,89
128,56
164,49
26,66 bis 743,11
26
ja
86,96
110,91
80,66
36,71 bis 428,63
p
0,257
a in pg VEGF/mg Protein
Abbildung 9: VEGF-Konzentration im Normalgewebe mit und ohne Mutation in Exon 5-8 im
korrespondierendem Tumorgewebe
3.6
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit Lokalisation der
Mutation im Exon 5, 6, 7 oder 8
Die Unterteilung der Fälle nach Lokalisation der Mutation in den verschiedenen untersuchten
Exons ergab keinen signifikanten Unterschied in den entsprechenden VEGF-Konzentrationen
im Vergleich zu den aller anderen Tumorproben (s. Tabelle XXVII). Die Gruppe der Tumore
welche eine Mutation in Exon 7 trugen, besaß zwar mit 344,08pg VEGF/mg Protein (Median)
eine um 61% niedrigere VEGF-Konzentration als die mediane VEGF-Konzentration aller
Tumorproben (887,42pg VEGF/mg Protein), dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant
(p=0,071).
57
a
Tabelle XXVII: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe von Patienten mit Mutation im Exon 5, 6, 7 und 8
a
b
b
Exon
n
Median
Mittelwert
SD
Range
p
5
8
758,36
881,65
572,45
201,86 bis 1715,55
0,836
6
4
2837,5
1711,42
2167,46
113,91 bis 4370,12
0,700
7
7
344,08
470,74
299,39
113,91 bis 954,06
0,071
8
10
1161,56
1530,45
1321,48
234,29 bis 4370,12
0,209
in pg VEGF/mg Protein;
Unterschied jeweils im Vergleich zu allen übrigen Tumorproben
3.7
VEGF-Konzentration
im
Tumorgewebe
mit
und
ohne
p53-Mutation
in
Abhängigkeit vom Geschlecht
Unter den 52 untersuchten Patienten waren 21 Frauen (38,9%) und 31 Männer (59,6%). Es
wurden 51 Proben in Bezug auf die VEGF-Konzentration ausgewertet (s. Kapitel 3.1). Bei den
Frauen fand sich bei 10 Tumorproben (50% der Frauen) und bei den Männern bei 16
Tumorproben (51,61% der Männer) eine Mutation. In beiden Gruppen war kein signifikanter
Unterschied in der VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation zu finden
(s. Tabelle XXVIII und Abbildung 10).
a
Tabelle XXVIII: Unterschied in der VEGF-Konzentration im Tumorgewebe von Patienten mit und ohne
Mutation im p53-Gen, getrennt nach Geschlecht
a
Geschlecht
n
weiblich
10
weiblich
Mutation
Median
Mittelwert
SD
Range
nein
1045,32
1277,3
1321,7
221,01 bis 4644,2
10
ja
533,02
1278,26
1413,9
234,29 bis 4370,1
männlich
15
nein
893,11
1214,79
1452,9
117,28 bis 5642,1
männlich
16
ja
868,1
906,18
550,97
113,91 bis 1866,5
p53-Gen
in pg VEGF/mg Protein
58
p
0,705
0,968
Abbildung 10: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen bei
Frauen und Männern
3.8
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen
getrennt nach Lokalisation des Tumors
Von den untersuchten Tumoren waren 30 (57,7%) im Kolon und 21 (40,4%) im Rektum
lokalisiert. Bei 13 der im Kolon lokalisierten Tumore (43,3%; 25,0% aller Tumore) wurde eine
Mutation im p53-Gen detektiert. Ebenso fanden sich bei 13 Tumoren mit der Lokalisation im
Rektum (61,9%; 25,0% aller Tumore) Mutationen. Sowohl bei den im Kolon als auch im Rektum
lokalisierten Tumoren bestand kein signifikanter Unterschied (p>0,05) in der VEGFKonzentration zwischen Tumoren mit und ohne Mutation (s. Tabelle XXIX und Abbildung 11).
59
a
Tabelle XXIX: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe von Patienten mit und ohne Mutation im p53-Gen,
getrennt nach Lokalisation des Tumors
Mittelwert
SD
Range
nein
893,11
1132,00
1359,42
158,28 bis 5642,11
13
ja
887,43
1304,59
1255,44
113,91 bis 4370,12
Rektum
8
nein
1169,55
1468,86
1469,29
117,28 bis 4644,21
Rektum
13
ja
732,88
793,98
482,07
201,86 bis 1522,72
n
Kolon
17
Kolon
a
Mutation
Median
Lokalisation
p53-Gen
p
0,601
0,346
in pg VEGF/mg Protein
Abbildung 11: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen bei Lokalisation
des Tumors im Kolon bzw. Rektum
3.9
VEGF-Konzentration
im
Tumorgewebe
mit
und
ohne
Mutation
unterteilt
in Dukes-Stadien
Bei 2 von 9 Tumoren in Stadium A (22,2 %), 7 von 17 Tumoren in Stadium B (41,18%), 9 von
14 Tumoren in Stadium C (64,3%) und 8 von 12 Tumoren in Stadium D (66,67%) liess sich eine
Mutation im p53-Gen nachweisen. In allen vier Stadien fand sich kein signifikanter Unterschied
in der VEGF-Konzentration im Tumorgewebe zwischen Tumoren mit und solchen ohne
Mutation (s. Tabelle XXX, Tabelle XXXI und Abbildung 12).
60
Tabelle XXX: Mutationen im p53-Gen getrennt nach Dukes-Stadien
Dukes
Stadium
Mutation
n
p53-Gen
%-Mutationen
Exon 5
Exon 6
Exon 7
Exon 8
in dem
Stadium
A
9
2
2
0
0
0
22,2
B
17
7
2
1
0
4
41,2
C
14
9
4
1
3
2
64,3
D
12
8
0
0
4
4
66,7
a
Tabelle XXXI: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe von Patienten mit und ohne Mutation getrennt
nach Dukes-Stadien
Dukes
Stadium
a
n
Mutation
p53-Gen
Median
Mittelwert
SD
Range
A
7
nein
407,36
954,19
918,95
221,01 bis 2340,72
A
2
ja
334,97
334,97
188,25
201,86 bis 468,09
B
10
nein
1228,83
1059,90
741,77
117,28 bis 2042,86
B
7
ja
1435,69
1603,66
1315,26
237,36 bis 4370,12
C
5
nein
897,01
1509,65
1782,84
158,28 bis 4644,21
C
9
ja
552,33
624,25
451,51
113,91 bis 1320,88
D
4
nein
357,39
2056,10
3107,00
168,81 bis 5642,11
D
7
ja
954,06
1310,00
989,45
284,29 bis 3029,37
in pg VEGF/mg Protein
61
p
0,380
0,558
0,257
0,732
Abbildung 12: VEGF-Konzentration in Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen in bei Einteilung
der Tumore in die Dukes-Stadien
3.10
VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit und ohne Mutation im
p53-Gen
bei
unterschiedlicher
Invasionstiefe
des
Tumors
nach
dem TNM-System
Von den 52 untersuchten Tumoren waren nach dem TNM-System [71] 4 (7,7%) Tumore in T1,
7 (13,5%) in T2, 32 (61,5%) in T3 und 9 (17,3%) in T4 klassifiziert. Keiner der 4 T1 Tumore,
aber 3 der 7 (42,9%) T2 Tumore, 17 der 32 (53,1%) T3 Tumore sowie 6 der 9 (66,7%) T4
Tumore wiesen eine Mutation im p53-Gen auf (s. Tabelle XXXII).
Tabelle XXXII: Mutationen im p53-Gen, getrennt nach T-Kategorie der TNM-Klassifikation
TKategorie
n
Mutation
p53-Gen
% der Mutationen
bezogen auf Tumoren
in der T-Kategorie
1
4
0
0
2
7
3
42,9
3
32
17
53,1
62
4
9
6
66,7
Der Unterschied in der VEGF-Konzentration im Tumorgewebe zwischen Tumoren mit und ohne
Mutation war weder bei T1 noch bei T2, T3 oder T4 Tumoren signifikant (s. Tabelle XXXIII und
Abbildung 13).
a
Tabelle XXXIII: VEGF-Konzentration
im Tumorgewebe von Patienten mit und ohne Mutation
im p53-Gen bei unterschiedlicher Invasionstiefe des Tumors nach dem TNM-System
TNMStadium
a
n
Mutation
p53-Gen
Median
Mittelwert
SD
Range
T1
4
nein
334,87
743,09
892,94
225,30 bis 2077,30
T1
0
ja
-
-
-
-
T2
4
nein
1742,97
2087,79
1912,46
221,01 bis 4644,20
T2
3
ja
468,09
658,27
575,58
201,86 bis 1304,90
T3
15
nein
926,32
953,05
675,4
117,28 bis 2042,90
T3
17
ja
848,78
1103,97
987,14
234,29 bis 4370,10
T4
3
nein
357,39
2109,52
3059,34
329,06 bis 5642,10
T4
6
ja
630,74
1089,86
1150,98
113,91 bis 3029,40
in pg VEGF/mg Protein
63
p
-
0,289
0,874
0,439
Abbildung 13: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutationen im p53-Gen
bei Einteilung der Tumore nach den T-Stadien der TNM-Klassifikation
3.11
VEGF-Konzentrationen bei Patienten mit Mutationen in Codons, die für die
DNA-bindende Struktur und die Tertiärstruktur des p53-Proteins kodieren
Mutationen der Codons 248 und 273, welche beide im Wildtyp für Arginin kodieren, führen zur
Veränderung der DNA-Bindungsregion des p53-Proteins. Dagegen haben Mutationen mit
resultierendem Aminosäureaustausch in den Codons 175, 245, 249 oder 282 Auswirkung auf
die Tertiärstruktur des p53-Proteins. Beide Veränderungen des Genproduktes führen dazu,
dass das p53-Protein seine Wirkung zum Teil oder gänzlich verliert (s. Einleitung 1.2.3) [95].
Von den 26 Tumoren mit einer Mutation im p53-Gen, zeigten 13 einen Basenaustausch in den
oben genannten Codons (s. Tabelle XVII).
Eine Mutation in den Codons 248 und 273 besaßen insgesamt 7 Tumorproben (vgl. Tabellen
XX und XXI). Die VEGF-Konzentrationen in diesen 7 Tumoren wiesen im Vergleich zu den 19
Tumoren mit Mutationen in anderen Codons des p53-Gen keinen signifikanten Unterschied
(p>0,05) auf.
64
a
Tabelle XXXIV: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe von Patienten mit einer Mutation im Codon
248 oder 273 des p53-Gens
Mutation
n
Codon 248
Median
Mittelwert
SD
Range
P
oder 273
a
7
ja
552,33
669,58
433,88
267,83 bis 1435,69
19
nein
887,43
1189,18
1077,20
113,91 bis 4370,12
0,37
in pg VEGF/mg Protein
In insgesamt 8 Tumoren wurde eine Mutation in den Codons 175, 245 oder 282 gefunden (s.
Tabelle XVII),. Die VEGF-Konzentration in den entsprechenden Tumoren war etwa um das 1,6
fache erhöht im Vergleich zu der der 18 Tumoren, welche Mutationen in anderen Codons des
p53-Gen aufwiesen (s. Tabelle XXXV). Allerdings war dieser Unterschied mit einem p-Wert von
0,085 nicht signifikant.
a
Tabelle XXXV: VEGF-Konzentration
bei Patienten mit einer Mutation in Codon 175, 245 oder
282des p53-Gens
Mutation
n
Codon 175,
Median
Mittelwert
SD
Range
p
245 oder 282
a
8
ja
1104,46
1639,1
1403,46
307,42 bis 4370,12
18
nein
668,08
787,16
573,41
113,91 bis 1842,58
in pg VEGF/mg Protein
65
0,085
4
Diskussion
Mutationen im p53-Gen werden als spätes Ereignis in der Tumorprogression kolorektaler
Karzinome angesehen. Entsprechend der Adenom-Karzinom-Sequenz von Vogelstein et al.
[172] treten Mutationen im p53-Gen erst im Übergang von Adenomen zu Karzinomen auf.
Dabei scheint die Mutation im p53-Gen über den Verlust der Apoptose und dem
Zusammenspiel weiterer Mutationen (k-ras, DCC, APC) einen Auslösermechanismus
darzustellen, welcher zu einem malignen Zellwachstum führt.
Ein angiogenetischer Phänotyp ist die Grundlage für die nutritive Versorgung und das
Wachstumspotenzial von proliferierenden Tumoren. Hierbei kommt dem VEGF als angiogenen
Wachstumsfaktor eine bedeutende Rolle bei der Ausbildung eines Gefäßnetzes in vielen
Tumoren, inklusive CRC, zu [19,161,162]. Für Onkogene wie die der ras-Familie wurden in invitro Versuchen zum einen ein direkter positiver Einfluss auf die VEGF-Expression zum
anderen ein synergistischer Effekt, der die Expression von VEGF über die Hypoxie zusätzlich
verstärkt, beobachtet [63].
In in-vitro Studien konnte ein negativer Einfluss des Wild-Typ p53-Proteins auf die Angiogenese
nachgewiesen
werden.
Dieser
beruhte
auf
einer
Stimulation
der
TSP-1-Expression
(Thrombospondin-1) und einer dosisabhängigen Herunterregelung der Promotoraktivität des
VEGF-Gens [16,30,110]. In Gentransferstudien an den humanen Kolonkrebszellinen SW620
und KM12L4 konnte deutlich gezeigt werden, dass in Karzinomzellen transferiertes Wt-p53 die
VEGF-Expression herunterregelt und so zu einer Inhibierung der tumorinduzierten Angiogenese
führt [16].
Immunhistologische Untersuchungen an verschiedenen Tumorentitäten zeigten eine Korrelation
von erhöhten intrazellulären p53-Proteinkonzentrationen, bedingt durch eine Verlängerung der
Halbwertszeit
bei
mutiertem
p53-Genstatus,
und
erhöhten
VEGF-Konzentrationen
[15,84,100,161]. Weiterhin wurden molekulare Mechanismen beschrieben, durch die mutiertes
p53-Protein über 12-O-tetra-Decanylphorbol-13-Acetat (Phorbolester) und Proteinkinase C die
VEGF-Expression direkt steigert [52,89].
In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob bei kolorektalen Tumoren in
vivo ein Zusammenhang zwischen dem Mutationsstatus des p53-Gens und der VEGFExpression besteht.
66
4.1
Häufigkeit von p53-Mutationen und Mutationstypen
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der TTGE bzw. DGGE bei 26 (50%) der 52 untersuchten
kolorektalen Karzinomen eine Mutation im p53-Gen festgestellt. Dieses Ergebnis liegt in der
Spannweite der in der Literatur beschriebenen Mutationshäufigkeiten, welche in Abhängigkeit
vom
Stichprobenumfang
und
Detektionsverfahren
zwischen
29%
und
61%
liegen
[1,27,32,51,79,86,149]. Die Spannbreite der Ergebnisse ist zum einen durch nicht-einheitliche
Verfahren
zur
Detektion
der
Mutation
(RFLP;
SSCP;
TTGE;
CDGE;
DGGE)
mit
unterschiedlicher Sensitivität und zum anderen durch eine unterschiedliche Selektion der
Stichproben (untersuchte Exons, Stadien der Karzinome und Tumorentitäten) erklärbar.
Die verwendeten Normalgewebeproben wurden aus makroskopisch gesunden Darmarealen
entnommen und wiesen in der mikroskopischen Untersuchung (s. Kapitel 2) keine Tumoranteile
auf. Bei den hier verwendeten Proben wurden im Normalgewebe in keinem Fall eine Mutation
im p53-Gen nachgewiesen. Bei zwei der 52 Patienten konnte in den Normalgewebsproben und
in dem korrespondierenden Tumorgewebe ein bekannter Polymorphismus im Codon 213 Exon
6 des p53-Gens nachgewiesen werden [21].
Anzumerken ist jedoch, daß grundsätzlich jedoch trotz negativem Mutationsstatus für p53 die
Möglichkeit einer anderen zeitlich früheren Genmutationen, in Anlehnung an die AdenomKarzinom-Sequenz von Vogelstein et al. [172] besteht. Diese können auf Grund der in dieser
Arbeit durchgeführten Analyse nicht ausgeschlossen werden.
Die Mutationshäufigkeiten verteilten sich auf die einzelnen Dukes-Stadien wie folgt: Stadium A
22,2%, Stadium B 41,2%, Stadium C 64,3% und Stadium D 66,7%. Innerhalb der 26 Tumoren
mit mutiertem p53-Gen waren 30,7% der Mutationen im Exon 5, 7,7% im Exon 6, 26,9% im
Exon 7 und 38,5% im Exon 8 lokalisiert. Wie oben bereits erwähnt, lag in zwei Proben der
Polymorphismus in Codon 213 vor [21]. Eine Probe wies eine Deletion im Bereich der Codons
193-201 (Exon 6) auf.
Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen zeigte eine andere Untersuchung an 43 kolorektalen
Karzinomen, welche die DGGE zur Detektion einsetzte, eine Mutationsfrequenz im p53-Gen
von 60,5%. Die Mutationsereignisse waren Punktmutationen, Mikroinsertionen oder Deletionen.
Bei den 24 Punktmutationen wurde eine Verteilung von 25% in Exon 5, 16,7% in Exon 6, 25%
in Exon 7 und 29,2% in Exon 8 nachgewiesen [64]. In einer weiteren Studie mit einer Fallzahl
von 109 Proben und einer Vorselektion der Stichprobe von 59,6% der Tumoren in Dukes B und
40,4% Dukes C Tumoren, konnte bei den 40 im p53-Gen mutierten kolorektalen Karzinomen
(37%) eine Verteilung von 41% in Exon 5, 12% in Exon 6, 15% in Exon 7 und 32% in Exon 8
mittels SSCP detektiert werden [32].
Die unterschiedlichen Ergebnisse könnten darin begründet liegen, dass die DukesStadienverteilung im Krankengut auch durch den Zeitpunkt der Diagnosestellung bzw. der
67
Selektion der Operationsgruppe mitbeeinflusst wird. Frühe bzw. kleine Tumore (Dukes A)
werden nicht oder selten klinisch detektiert und dadurch einer operativen Sanierung zugeführt.
Hingegen sind Tumoren des Stadiums Dukes D z.T. schwer oder nicht mehr nach kurativen
Ansätzen zu operieren oder präsentieren ausgedehnte lokoregionale Metastasierungen oder
Fernmetastasen. Dadurch wird das Kollektiv der Proben in den Studien beeinflusst: Tumoren
der Dukes-Stadien A und D sind daher seltener als z.B. Tumoren der Kategorie Dukes
B oder C.
Abgesehen von diesen Einflussfaktoren vor der Untersuchung der Proben, zeigen sich bei dem
Vergleich
der
drei
Studien
in
Abhängigkeit
der
Dukes-Stadienverteilung
und
der
Detektionsmethode Differenzen in der Mutationsrate und Verteilung der Tumoren in den DukesStadien. Diese unterschiedlichen Ergebnisse können als Effekt bekannter Grundlagen gedeutet
werden,
bei
denen
sich
bei fortschreitender
Tumorprogression eine
Zunahme
der
Mutationenereignisse präsentiert. Im speziellen treten p53-Mutationen als zeitliches Ereignis
vermehrt im Übergang von Adenomen zu Karzinomen oder in einem noch späteren Stadium
der Progression auf.
Die hier gefunde Verteilung der Mutationsereignisse auf die einzelnen Exons weicht von der in
anderen Studien an anderen Tumorentitäten beobachteten z.T. stark ab. So verteilten sich z.B.
die in 17 (16,5%) von 109 untersuchten Mammakarzinomen mittels PCR und CDGE
detektierten Mutationen im p53 Gen zu 52,9% auf das Exon 5, zu 41,2% auf das Exon 7 und
nur zu 17,7% auf das Exon 8. Das Exon 6 wurde nicht analysiert [166].
In 17 nicht-kleinzelligen-Bronchialkarzinomen bei denen eine Mutation mittels PCR-SSCP
nachgewiesen worden war, ergab sich eine Verteilung der Mutationsereignisse von 38,8% im
Exon 5, 29,4% in Exon 7 und 11,8% in Exon 8. Auch in dieser Arbeit wurde das Exon 6 nicht
untersucht [171].
In der p53-Mutations-Datenbank der "International Agency for Research on Cancer" (IARC)
[155] sind Mutationen mit Schwerpunkt im Bereich der Codons der sequenzspezifischen DNABindungsdomäne zwischen Codon 100 und 300 aufgelistet (s. www-p53.iarc.fr). Unter den
somatische Mutationen weisen die Codons 175, 213, 220, 245, 248, 249, 273 und 282 eine
deutliche Akkumulation der Mutationsereignisse auf. Diese Codons liegen in den evolutionär
hoch konservierten Regionen (s. Abbildung 2). Diese Aussage trifft für die untersuchte
Tumorentität kolorektales Karzinom zu. Inwiefern Mutationen im p53-Gen auch bei anderen
Tumorentitäten auf wenige Exons, bzw. auch auf die evolutionär hoch konservierten Regionen
beschränkt sind ist fraglich.
Nigro et al. [113] beschrieben 1989 lediglich, dass in verschiedenen Tumorentitäten überhaupt
p53-Mutationen auftreten. Hingegen postulierten Hollstein et al. 1991, dass mehr als 80% der
p53 Mutationen in den Exon 5, 7 und 8 lokalisiert sind, aber auch in anderen Bereichen des
Gens Mutationen auftreten würden, dann bevorzugt im Exon 6 [74].
68
Unter Berücksichtigung potenzieller Einflussgrößen, wie die Sensitivität der Analysemethode
oder der Stichprobenauswahl besteht möglicherweise bei unterschiedlichen Tumorentitäten ein
spezielles, vielleicht sogar charakteristisches Verteilungsmuster der Mutationen in dem DNAAbschnitt der Exon 5 bis 8 (AS 100-300) im p53-Gen. So konnten bei Lungentumoren (NSCLC)
[171] einen Fokussierung auf Exon 5, bei oralen Plattenepithelkarzinomen [105] auf Exon 5 und
8, bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf/Hals-Bereiches [132] auf Exon 5 und bei
Mammakarzinomen [166] auf Exon 7 und 8 festgestellt werden.
In der in dieser Arbeit untersuchten Stichprobe wurden Punktmutationen in den Exons 5-8 in 13
verschiedenen Codons detektiert. In einem Fall kam es im Bereich der Codons 193-201 (Exon
6) zu einer Deletion. Veränderungen innerhalb der ‚hot spot’-Codons (s. Kapitel 1.2.3) zeigten
sich mit 15,4% in Codon 135 (Cys Phe), 248 (3 Proben mit Arg Glu, 1 Probe mit Arg Trp)
und 282 (Arg Trp). Weiterhin traten 11,5% der Mutationen im Codon 273 (2 Proben mit
Arg His und 1 Probe mit Arg Cys), und den Codons 175 (Arg His) und 245 (Gly Ser und
Gly Asp) mit 7,7% auf.
Bei 75,86% der Punktmutationen handelte es sich um Transitionen. Der Schwerpunkt der
Nukleotidveränderung lag bei der Transition von GC AT mit 37,93%, hingegen kamen die
Nukleotidveränderungen CG TA mit 20,69% und AT GC mit 13,79% weniger häufig vor (s.
auch Tabelle XXII/XXIII).
Acht der 11 Transitionen (72,73%) GC zu AT und alle 6 Transitionen von CG nach TA lagen im
Bereich von CpG Dinukleotiden (s. Tabelle XXIII). Transversionen, die zu einer Änderung des
Nukleotidpaares GC zu TA führten wurden in 6 Fällen nachgewiesen. Es wurde keine G C
Substitution gefunden.
Costa et al. [27] untersuchten die Exon 5-9 des p53-Gen in kolorektalen Karzinomen mittels
SSCP. Dabei zeigte sich eine Gesamtmutationsrate von 60,5% (22 von 38 Tumoren). Unter den
Transitionen (87% der Ereignisse) trat mit 65% am häufigsten eine GC AT Transition (an CpG
Dinukleotiden) auf. Weitere Ereignisse (an nicht CpG-Dinukleotiden) waren Veränderungen von
GC AT (18%), GC TA (13%) und AT GC (4%).
Insgesamt wurden 53% der Mutationen in den drei ‚hot spot’-Codons 175, 248, 282 gefunden.
Im Vergleich mit der Studie von Costa et al. [27] war in der vorliegenden Untersuchung GC TA
mit 20,69% das zweit häufigste Ereignis, im Gegensatz zeigte sich jedoch die Transition von
AT GC mit 13,79% (4% bei Costa et al. [27]). Weiterhin fanden sich in dieser Arbeit nur 38,5%
der Mutationen in den angegeben ‚hot spot’-Codons. Interessanterweise lagen bei Costa et al.
die Mutationsereignisse in den ‚hot spot’-Codons um 14,5% höher. Hollstein et al. [74] äußerten
schon 1991 unter Einbezug mehrerer Studienergebnisse [lt. 8,10,113,135], dass das
Mutationsspektrum zwischen einzelnen Malignomentitäten differiert. In Kolonkarzinomen, neben
Tumoren des ZNS (Zentralnervensystem) und Lymphomen ist die Transition an CpG
69
Dinukleotiden von GC AT die häufigste Substitution. Diese Transition trat in Kolontumoren mit
79% am häufigsten auf. Als zweithäufigste Transition kam AT GC mit 15% vor [74].
Ein Erklärungsansatz für kolorektale Karzinome könnte sein, dass die Transitionen von GC AT
durch Nahrungsmittel- bzw. Konservierungmittelanteile wie z.B. der Nitrosaminsäure ausgelöst
werden. Sehr lange schon wird postuliert, dass dieses Agens, welches in Nahrungsmitteln
vorkommt, eine karzinogene Substanz darstellt. Weiterhin sind CpG Dinukleotide häufig
Mutationen im Sinne einer Transition unterworfen, denn Cytosin ist häufig methyliert. Dieses
führt zu hoher Mutagenität über eine Desaminierung des Cytosin zum Thymidin [22].
In dieser Arbeit wurde keine G C (GC/CG) Substitution gefunden, so dass sich die Frage stellt,
ob die Mutationsanalyse mittels TTGE zur Detektion solcher Substitutionen sensitiv genug ist.
In der Literatur wird für kolorektale Tumoren das Auftreten von G C Mutationen mit 3%
angegeben. Für solide Tumore allgemein liegt die Häufigkeit solcher Veränderungen bei 9%
[74]. Tatsächlich können G C (GC/CG) Substitutionen in der TTGE übersehen werden, wenn
keine Heteroduplexbildung stattgefunden hat, da der Laufunterschied der beiden Homoduplizes
sehr gering ist [36]. Dies wäre eine mögliche Fehlerquelle, es ist aber davon auszugehen, dass
bei jeder untersuchten Probe mit vorliegender Mutation durch die vorhergehende PCR eine
Heteroduplexbildung stattgefunden hat.
Die Verteilung der Mutationsereignisse auf die verschiedenen Codons deckten sich zum Teil mit
Ergebnissen anderer Studien, welche ebenfalls kolorektale Karzinome untersuchten [27,74]. Da
jedoch die Fallzahl, die Analysemethode der Mutationen in den Exons und die weitere
Aufbereitung differieren, ist ein direkter Vergleich wohl kaum zulässig.
Bei einer Studie an 33 Plattenepithelkarzinomen konnten 12 Tumore mit einer Mutation im p53Gen detektiert werden (36,4%). Bei der Analyse der einzelnen Codons konnte, entgegen dieser
Arbeit, keine Akkumulation von Mutationsereignissen in den Codons festgestellt werden,
weiterhin gab es keine deutlich hervorgehobenen Mutationsereignisse wie Deletion, Transition,
oder Insertion [132]. In einer Untersuchung an NSCLC-Karzinomen von Ambs et al. [5], wurde
bei 14 von 27 Tumoren (51,9%) eine Mutation im p53-Gen nachgewiesen. Das häufigste
Mutationsereignis war mit 28,6% eine Transversion von G T (GC/TA) und mit der selben
Häufigkeit die Transition von C T (CG/TA). Am zweithäufigsten war der Austausch von G A
(GC/AT) mit 21,4%. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich auch durch Auswertung verschiedener
Einzelstudien [22].
Dieses sind weitere Ergebnisse welche die Hypothese verstärken, dass in Abhängigkeit der
zugrunde liegenden Noxe bzw. dem Mutationsmechanismus, dem originären Gewebe der
Neoplasie und der Tumorentität, jeweils ein anderes Mutationsmuster sowohl im Bereich der
Exons als auch des Basenaustausches zu Grunde liegt [22,74,116]. Analysen der Datenbank
der IARC beschreiben diese „Mutationsidentität“ der einzelnen Karzinomentitäten. Die Betreiber
der
Datenbank
demonstrieren
in
Analysen
70
einen
Zusammenhang
zwischen
dem
Ursprungsorgan des Tumors, den histologischen Kriterien und dem Tumorstadium gegenüber
charakteristischen Mutationstypen in Bezug auf die Basenabfolge und der Lokalisation der
Mutation im Genom [155].
4.2
VEGF-Konzentration im Tumor- und Normalgewebe
In dieser Arbeit lag die VEGF-Konzentration im Normalgewebe im Median bei 82,9 und im
Mittelwert (MW) bei 72,4pg VEGF/mg Protein. Im Tumorgewebe wurden weitaus höhere Werte
von 887,4 (Median) und 1138,6pg VEGF/mg Protein (MW) festgestellt. Die mediane VEGFKonzentration war somit im Tumorgewebe um den Faktor 15,7 gegenüber dem Normalgewebe
erhöht. In einer Studie von Broll et al., in der 38 kolorektale Karzinome untersucht worden
waren, lag die VEGF-Konzentration im Tumor im Mittelwert bei 984pg VEGF/mg Protein und im
Normalgewebe bei 89pg VEGF/mg Protein [19]. Diese Daten decken sich mit denen der
vorliegenden Arbeit. Zudem zeigte sich in beiden Untersuchungen eine große Spannbreite der
VEGF-Konzentration sowohl im Normalgewebe als auch im Tumorgewebe. Das gesamte
Bearbeitungsprotokoll der Proben war in beiden Studien identisch, und zur Bestimmung der
VEGF165-Konzentration wurde der gleiche ELISA-Kit verwendet.
Auch Linderholm et al. demonstrierten in einer Studie aus dem Jahr 2001, in der die VEGF165Konzentration in 224 primären Mammakarzinomen mit Hilfe des Quantikine-ELISA-Kits ermittelt
worden war, eine große Spannbreite der VEGF-Konzentration in den Tumoren von 7,5 –
9084pg/mg, wobei der Median bei 256,4pg VEGF/mg lag [100]. Damit lag die mediane VEGFKonzentration in den Mammakarzinomen nur bei etwa 29% des in unserer Studie für
kolorektale Karzinome ermittelten Wertes. Diese Diskrepanz kann möglicherweise in der Wahl
zweier verschiedener Tumorentitäten begründet sein.
Untersuchungen an ZNS-Tumoren zeigten einen deutlichen Unterschied zwischen dem hoch
malignen Glioblastom mit im MW 6281,6pg VEGF/mg Protein zu den niedrig malignen Tumoren
wie dem anaplastischem Astrozytom mit MW 493,6pg VEGF/mg Protein, dem low grade
Astrozytom mit 600,4pg VEGF/mg Protein (MW) bzw. zum ZNS-Normalgewebe mit 25,8pg
VEGF/mg Protein (MW) [163]. In der genannten Studie wurde die Konzentration des VEGF121
unter Verwendung eines VEGF-ELISAs gemessen.
Ein Expressionsunterschied von VEGF mit deutlich erhöhten Werten im Tumor- gegenüber dem
Normalgewebe wurde auch als Ergebnis anderer Studien, welche jedoch die VEGF-Expression
immunhistochemisch oder auf mRNA-Ebene durch in situ Hybridisierung untersuchten,
beschrieben
[20,85,97,163].
Dieser
Befund
unterstützt
die
These,
dass
VEGF
in
proliferierenden Tumoren verstärkt exprimiert wird und so die Neovaskularisation eines
proliferierenden Malignoms fördert.
Gewebehypoxie und
71
Hypoglykämie,
wie sie
bei
proliferierendem Gewebe aber insuffizienter Vaskularisation vorkommen, stellen einen starken
Reiz zur vermehrten VEGF-Expression dar [20,121,140,152,153].
Diese Einflussgrößen, welche die VEGF-Konzentration im Gewebe erhöhen, haben eine direkte
Auswirkung auf jede Studie die sich mit expansiv wachsenden Tumoren beschäftigt. Die
angeführten Ergebnisse lassen vermuten, dass die VEGF-Expression in Tumoren, welche in
oder aus einem Gewebe mit hoher Vaskularisationsdichte und hoher Grundexpression von
VEGF entstehen, à priori eine deutlich höhere Konzentration von VEGF im Tumor aufweisen.
Denkbar ist auch der Zusammenhang zwischen hoher Malignität und daraus resultierend
schneller Wachstumstendenz unter gleichzeitig schlechtem Gewebe-Perfusionsverhältnis. Die
unterschiedliche Größe der untersuchten Tumore, mit unterschiedlichen Anteilen an
nekrotischem und hypoxischem Zentrum sowie unterschiedlich gut vaskularisierter Peripherie
werden die Ergebnisse der VEGF-Konzentration stark beeinflussen. Diese verschiedenen
Gewebebereiche können VEGF in unterschiedlichem Ausmaß exprimieren, je nach Ausmaß
der Hypoxie (hohe Expression in hypoxischen, niedrige Expression in gut vaskularisierten
Bereichen) und der Vitalität der Zellen (niedrige Expression in nekrotischem Zentrum). Je
nachdem, aus welchem Bereich des Tumors die jeweiligen Gewebeproben entnommen sind,
können sich für ein und denselben Tumor somit unterschiedliche VEGF-Konzentrationen
ergeben. Gleichfalls kann die mittlere VEGF-Konzentration einer Stichprobe durch Überwiegen
des einen oder anderen Tumorbereichs beeinflusst sein.
4.3
VEGF Konzentration bei Tumoren mit und ohne Mutation im p53-Gen
Verschiedene Studien geben Anlass zu der Hypothese, dass p53 einen direkten Einfluss auf die
VEGF-Expression hat. So beschreibt Fontanini et al. [48], dass die Expression von Bcl-2 und
p53-Proteinen die Regulation der VEGF Expression in NSCLC gegensätzlich kontrollieren und
somit einen Einfluss auf die Entwicklung der Tumorangiogenese nehmen. Bouvet et al. [16]
beschrieben in vitro an Kolonkarzinomzellinien einen negativen Effekt der Expression von
VEGF durch ein durch Adenoviren verändertes Wt-p53-Protein. Dieser Effekt wirkt sich im
Verlauf inhibitorisch auf die Angiogenese bzw. Neoangiogenese aus.
In der Vergangenheit beschäftigte sich keine Untersuchung mit dem Einfluss von Mutationen in
den ‚hot spot’-Codons des p53-Gens auf die VEGF-Proteinkonzentration (in pg/mg), bzw. mit
der Frage nach Veränderung der VEGF-Expression bei Mutationen in den Codons welche für
die Tertiärstruktur bzw. die DNA-Bindungsregion des p53-Protein kodieren.
Ergebnisse verschiedener Studien an Plattenepithelkarzinomen des Kopf/Hals-Bereiches [132],
an Magenkarzinomen [104,138] und an nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen [49] stellten
eine signifikante Korrelation zwischen der p53-Proteinkonzentration und der VEGF-Expression
in
Tumoren
fest.
Die
zitierten
Studien
72
untersuchten
die
VEGF-Expression
mit
immunhistologischen Verfahren. Eine Studie [132] verwendete zur Analyse des p53-Status eine
PCR-SSCP. Hingegen wurden in den anderen Studien auch für den p53-Status eines Tumors
lediglich
immunhistologische
Verfahren
verwendet,
welche
eine
erhöhte
p53-
Proteinakkumulation nachweisen können. Diese Methode der Konzentrationsbestimmung von
p53 kann jedoch nicht eine physiologische Überexpression von einer Konzentrationserhöhung
auf Grund einer Mutation im p53-Gen diskriminieren, da einer erhöhten p53-Proteinkonztration
in einer Zelle zwei Mechanismen zugrunde liegen können, zum einen eine verlängerte HWZ,
zum anderen eine vermehrte Expression. Erhöhte Konzentrationen des p53-Proteins ohne
Mutation im Gen treten z.B. auch bei Strangbrüchen der dsDNA durch - oder UV-Strahlung
auf. Ein weiterer Stimulator sowohl für die p53-Expression und Aktivierung als auch der VEGFExpression ist eine zelluläre Hypoxie [99,152]. Diese Grundlagen lassen daran zweifeln ob der
Versuchsaufbau der o.g. Studien überhaupt eine Aussage bezüglich der Interaktion von p53 mit
VEGF zulässt. Zudem unterliegen beide Proteine getrennt einer Regulation durch den
hypoxischen zellulären Stress, welcher ein häufiger Zustand in expansiv wachsenden Tumoren
ist [99,153]. Ähnliche Studienschwachpunkte gelten auch für Untersuchungen an kolorektalen
Karzinomen
durch
Kang
et
al.
(163
Patientenproben)
und Takahashi
et
al.
(93
Patientenproben). Beide Untersuchungen demonstrierten eine signifikante Korrelation zwischen
immunhistochemisch
detektierter
erhöhter
VEGF-Konzentration
und
einer
p53-
Proteinüberexpression [84,161].
Ergebnisse an weiteren Tumorentitäten aus anderen Untersuchungen deuten auf eine erhöhte
VEGF-Expression in Verbindung mit einer Mutation im p53-Gen hin, wobei in den Studien z.T.
eine
erhöhte
p53-Proteinkonzentration
mit
einer
Mutation
gleichgesetzt
wird
[49,104,132,138,161].
In dieser Arbeit konnte das Postulat der vorgängig zitierten Studien nicht für die untersuchte
Stichprobe der 52 kolorektalen Karzinome in vivo bestätigt werden. So bestand keine
signifikante Korrelation zwischen der VEGF-Konzentration und einer p53-Gen-Mutation im
Tumorgewebe. Auch die Unterteilung der Tumore in Subgruppen nach Geschlecht der
Patienten, Lokalisation des Tumors oder Stadien nach Dukes zeigte hinsichtlich der VEGFExpression keinen signifikanten Unterschied zwischen Tumoren mit und ohne Mutation im p53Gen. Ebenfalls wurde kein signifikanter Unterschied in der VEGF-Konzentration festgestellt bei
der Einteilung der Tumoren nach Mutationen in den einzelnen Exons und Tumoren, welche
ausserhalb dieses untersuchten Exons p53-Mutationen aufwiesen.
Die Tumore mit einer Mutation in Exon 7 wiesen von allen untersuchten Exons die niedrigste
VEGF-Konzentration auf. Es konnte in dieser Arbeit ein Trend in der VEGF-Konzentration im
Tumorgewebe zwischen Patienten mit Mutation im Exon 7 im Vergleich zu allen Tumorproben
mit einem p-Wert von 0,071 durch den Mann-Whitney-U-Test ermittelt werden (s. Tabelle
XXVII). In Exon 7 sind die Codons 245 und 248, welche für die Tertiärstruktur und für die DNA-
73
Bindungsregion des p53-Proteins kodieren, enthalten. Da die Stichprobe bzw. die Untergruppen
zu den einzelnen Exons zu klein ist, kann kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der
Mutation und möglichen Regulationsmechanismen postuliert werden. In der Literatur wurde für
Patienten mit kolorektalen Karzinomen mit Mutation im Exon 7 eine kürzere postoperative
Überlebenszeit beschrieben [79]. In der zitierten Studie kumulieren die Mutationen im Exon 7 in
den Dukes Stadien C und D, bzw. Patienten mit einer Mutation im Exon 7 zeigten eine
verkürzte Überlebenszeit. Es bleibt jedoch unklar ob die Mutation im Exon 7 eine rasche
Tumorprogredienz verursacht und so die Anzahl an Dukes C und D Tumoren erhöht ist oder ob
unabhängig von der Mutation die postoperative Patientenüberlebenszeit allein durch ungünstige
Ausgangssituation eines Dukes C bzw. D Tumors bestimmt wird.
In einer Untersuchung an NSCLC zeigte sich, dass auch Mutationen in Exon 5 einen
prognostisch ungünstigen Faktor in Bezug auf die Überlebenszeit darstellten [171].
Vergleicht man diese Studien mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, konnte ebenfalls
eine Fokussierung der Mutationen in Exon 7 auf die Stadien Dukes C und D festgestellt werden.
Die Beobachtung tumorspezifischer Mutationen mit weiterführenden Effekten könnte mit dem in
Kapitel 4.1 schon genannten entitätsspezifischem Mutationsmuster erklärt werden und als
weites tumorspezifisches Charakteristikum gedeutet werden.
Kang et al. [84] und Kern et al. [86] beschreiben eine prognostisch ungünstige Konstellation bei
hohen p53-Proteinkonzentrationen bzw. Mutation im p53-Gen mit gleichzeitig erhöhten VEGFKonzentrationen im Tumor. Möglicherweise können diese Ergebnisse für kolorektale Karzinome
als prognostisch ungünstige Konstellation zwischen der Mutation im p53-Gen mit konsekutiv
erhöhten p53-Proteinkonzentrationen und gesteigerter VEGF-Expression oder aber spezielle
Mutationen so z.B. im Exon 7 gedeutet werden. Beide Konstellationen zeigen eine schlechtere
Überlebensrate der Patienten insbesondere, da für die erste eine verstärkte metastatische
Aussaat beschrieben wird [84,86].
Über welchen Mechanismus eine Mutation im Exon 7 zu einer schlechteren Prognose der
Patienten führt, sollte in weiteren Studien untersucht werden. Ebenfalls warum gerade bei
Mutationen in Exon 7 die VEGF-Konzentration am geringsten ist. Erklärungsansätze bei denen
man von einem einfachen Zusammenhang zwischen vermehrter Metastasierung über die
Neoangiogenese in Kombination mit Mutation im Exon 7 ausgeht, lassen sich nicht durch die
Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen. Da in dieser Arbeit durch die Gruppenbildung die
Stichprobengröße der einzelnen Kriterien noch weiter verringert wurde, ist die Fallzahl zu
gering, um eine eindeutige Aussage zu erhalten.
Bei der Analyse der Mutationen in den für die DNA-Bindungsregion bzw. die Tertiärstruktur des
Proteins kodierenden Codons, zeigte sich kein signifikanter Unterschied der VEGFKonzentration im Vergleich zu den Tumoren mit Mutation an anderer Position im p53-Gen bzw.
im Vergleich zu allen anderen Tumoren mit und ohne Mutation in den untersuchten Exons des
74
p53-Gens. Allerdings besteht auch hier in den Ergebnissen ein Trend zwischen der VEGFKonzentration von Tumoren mit Mutation in den Codons welche für die Tertiärstruktur kodieren
gegenüber den anderen Tumoren mit p53-Mutation. Der p-Wert lag bei dieser Stichprobe bei
0,085. Auch hier ist möglicherweise die Fallzahl mit einer Gesamtstichprobe von 26 Tumoren
mit p53-Mutation und nur 8 Tumoren mit Mutation in dem betreffenden Codon zu gering, um ein
eindeutig signifikantes Ergebnis zu erhalten. In Anbetracht dieser Ergebnisse wäre eine
Wirkung des veränderten Proteins auf die Regulationsmechanismen der VEGF-Expression
denkbar.
Da die Mutation im p53-Gen in kolorektalen Karzinomen ein spätes Ereignis in der
Tumorprogression darstellt, könnten andere, zeitlich frühere Mutationen in Onkogenen oder
anderen Tumorsuppressorgenen an der Regulation der VEGF-Expression beteiligt sein.
Möglich wären eigenständige, direkte oder synergistische Wirkungen mit mutiertem p53-Protein
auf die VEGF-Regulation. Für kolorektale Karzinomen wurde z.B. in vitro [7] und für
Lungentumoren in vivo [94] eine signifikante Korrelation zwischen einer Mutation im k-ras Gen
und der VEGF-Expression beschrieben. Weiter wurde an verschiedenen Zellreihen eine
Korrelation zwischen der Überexpression von v-Src und VEGF gefunden [110]. Die
Einflussgröße anderer Mutationen konnten in dieser Arbeit nicht berücksichtigt werden.
Neben dem Mutationsstatus in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen nehmen auch der
Oxygenierungs- und CO2-Retentionszustand einen signifikanten Einfluss auf die VEGF
Konzentration.
Weiterhin
können
aus
dem
Serum
stammende
oder
parakrine
Wachstumsfaktoren und Zytokine wie z.B. „keratinocyte growth factor“ (fibroblast growth factor7), „epidermal growth factor, „tumor necrosis factor“, „transforming growth factor-1“, und
Interleukin-1, auf die VEGF-Expression stimulierend wirken (s. Einleitung 1.2). Alle diese
Faktoren zeigten auch einen Einfluss auf die VEGF-Konzentration in Zellkulturen und
Tumorgewebe [118,165]. Diese einzelnen Faktoren konnten bei der Untersuchung einer
Korrelation zwischen dem p53-Mutationsstatus und der VEGF-Konzentration in kolorektalen
Tumoren nicht berücksichtigt werden.
4.4
Schlussfolgerungen
Die in dieser Untersuchung gefundenen Daten lassen keinen signifikanten Effekt der p53Mutation in kolorektalen Karzinomen auf die Expression von VEGF erkennen. Möglicherweise
liegt der beschriebenen Assoziation zwischen Überexpression von p53-Protein und VEGFKonzentration in kolorektalen Karzinomen ein p53-unabhängiger Mechanismus zugrunde.
Vorstellbar ist, dass das reziproke Expressionsverhalten zwischen Wt-p53-Protein und VEGFProtein in Tumoren durch mehrere koexistente zelluläre Regelkreise beeinflusst wird. Da
Hypoxie die Expression von Wt-p53 verstärkt [99], werden Zellen sensibilisiert für die
75
hypoxieinduzierte Apoptose. Durch die Mutationen, welche die Funktion des p53-Protein
alterieren, fällt der Mechanismus der hypoxieinduzierten Apoptose aus. Dies kann die
Grundlage für einen hypoxieresistenten Zelltyp im proliferierenden Zellverband, der im größeren
Masse VEGF exprimiert darstellen [99]. Die p53-induzierte Apoptose wird über die positive
transkriptionale Regulation des Bax- und IGF-BP3-Gens vermittelt. BAX beschleunigt die
Apoptose, in dem es mit Bcl2 Heterodimere bildet und dadurch die Bcl2-Funktion inhibiert. Bcl2Überexpression hemmt die p53-vermittelte Apoptose. Bax bindet an Bcl2 und ist Antagonist
dieses negativen Einflusses auf die Apoptose [24,95,98,126]. Zudem wurde für VEGF ebenfalls
ein Mechanismus beschrieben, in dem über Bcl2 ein antiapoptotischer Effekt ausgelöst wird
[119]. Diese Ergebnisse lassen auf eine Effektschleife schliessen, die Fontanini et al. 1998
beschrieb, bei der bcl2 und p53 möglicherweise die Tumorangiogenese in NSCLC über VEGF
regulieren [48]. Dies würde zur weiteren Induktion der Neoangiogenese führen.
Mutationen
im
p53-Gen
beeinflussen
negativ
die
antiangiogenetische
Wirkung
von
Thrombospondin-1 [30,31]. Es gibt Hinweise, das eine Verbidung bzw. Wirkung zwischen Mutp53 und der Ras/MAPK Endstrecke über das hHSP70 (humanes Hitzeschockprotein 70)
besteht, was zu einer Induktion der VEGF Expression in humanen kolorektalen Karzinomen
führt [34,106]. Für zeitlich frühere Mutationen wie z.B. der Mutation in der ras-Familie wurden
direkte positive Regelmechanismen der VEGF-Expression beschrieben. Fasst man die
Ergebnisse aus der Literatur zusammen unter Berücksichtigung der negativen Korrelation
zwischen dem p53-Mutationsstatus und der VEGF-Konzentration aus dieser Arbeit, so könnte
die
Assoziation
zwischen
der
erhöhten
VEGF-Konzentrationen
und
der
p53-
Proteinkonzentration als Ergebnis einer vermehrten Hypoxie in Tumorzellen gesehen werden.
Möglich sind auch komplexere Regelmechanismen des p53 auf Wachstumsfaktoren inklusive
dem VEGF über einen noch nicht identifizierten zellulären Regelmechanismus. Dies scheint
möglich, da p53 oder seine Liganden an einer grossen Zahl von molekularen Regelkreisen
teilnehmen [99,126,147].
In der Zukunft könnten Studien zu diesem Thema mit Analyse der VEGF- sowie der
Thrombospondin-Expression in Korrelation zum p53-Mutationsstatus in den ‚hot spot’-Regionen
des p53-Gens an einer ausreichend grossen Stichprobe zum Verständnis der Neoangiogenese
in kolorektalen Karzinomen führen. Dieses würde zum weiteren Verständnis des komplexen
zellulären Zusammenspiels von positiven und negativen Faktoren der Tumorprogression
beitragen.
Mit dem Verständnis der molekularen Mechanismen der Angiogenese bei kolorektalen
Karzinomen bietet sich die Möglichkeit das gewonnene Wissen in den klinischen Alltag bei der
Behandlung von Karzinompatienten weiter einfliessen zu lassen. Aus dem Grundlagenwissen
ergeben sich neue und spezifischere Strategien zur Therapie von u.a. malignen Neoplasien.
VEGF war in der Vergangenheit Ziel verschiedener präklinischer Therapieansätze, um über die
76
Angiogenese auf die Proliferation von Tumoren einzuwirken. Zum Einsatz kamen Antikörper
gegen VEGF [88,125] und VEGFR-2 [144,159] sowie Hemmung der Tyrosinkinaseaktivität von
VEGFR-2 [141,144]. Die Effekte dieser Therapieansätze wirkten sich auf die Tumorexpansion
sowie auf die Reduktion der Tumormasse, vermittelt über eine Reduktion der Vaskularisation
des Tumors, mit verlängertem Überleben der Versuchstiere aus. Derzeit steht mit Avastin eine
für den Menschen zugelassene Substanz zur Verfügung (s. auch Kapitel 1.1.3).
Auf dem Gebiet des expansiven Tumorwachstums, vermittelt und unterstützt durch die
Angiogenese durch eine erhöhte VEGF-Expression bedarf es weiterer Forschungen, um das
komplexe Zusammenspiel von Wachstumsfaktoren und genetischen Defekten zu klären.
Besonders die vielfältigen Interaktionen und Wirkungen des p53-Gens und dessen
Genproduktes, sowie die Steuerung von Wachstumsfaktoren speziell die des VEGF und dessen
Expression wird in der Zukunft weiter zu analysieren sein.
5
Zusammenfassung
Mutationen im p53-Gen spielen eine wichtige Rolle bei der Progression von humanen
kolorektalen Karzinomen. Das Wachstum eines soliden Karzinoms ist allerdings nicht nur durch
den Verlust der Suppressorgenfunktion und anderen onkogenen Mutationen bestimmt, sondern
auch von der Fähigkeit, eine ausreichende Vaskularisation des Malignoms zu induzieren und
ein nutritives Gefäßnetz auszubilden. VEGF kommt als parakrinem Wachstumsfaktor, der
selektiv auf Endothelzellen wirkt, eine entscheidende Rolle in diesem Prozess zu. Der
Neoangiogenesefaktor wird in kolorektalen Karzinomen wie auch in anderen Karzinomen
verstärkt exprimiert.
Es zeigte sich in vitro ein Zusammenhang zwischen der Wildtyp p53 Funktion als Suppressor
der VEGF-Expression in humanen kolorektalen Tumorzellinien. In vivo wurde durch
immunhistologische Verfahren ein Zusammenhang zwischen erhöhter VEGF-Konzentration und
p53-Protein Überexpression in kolorektalen Karzinomen postuliert, und die Vermutung über
einen direkten Einfluss von mutiertem p53 auf die VEGF-Expression geäussert.
Mit dieser Studie an kolorektalen Karzinomen sollten folgende Fragen beantwortet werden:
77
1) Besteht ein Unterschied in der VEGF-Konzentration zwischen Tumorgewebe mit bzw. ohne
Mutation im p53-Gen?
2) Beeinflussen unterschiedliche Mutationstypen bzw. Mutationen in bestimmten ‚hot spot’Exons die VEGF-Konzentration?
3) Beeinflussen Mutationstypen bzw. Mutationen in der kodierenden Sequenz
a) für die DNA-bindende Domäne oder
b) in der für die Tertiärstruktur des p53-Proteins
die VEGF-Konzentration?
4) Besteht ein Unterschied in der VEGF-Expression zwischen Tumoren mit bzw. ohne
Mutation im p53-Gen bei zusätzlicher Unterscheidung nach klinischen sowie pathologischen
Daten wie Geschlecht, Tumorlokalisation (Kolon/Rektum), Tumorstadium (Dukes A-D) und
T-Kategorie der TNM-Klassifikation als Kriterium der Invasionstiefe des Tumors?
Um diese Frage zu beantworten, wurden Gewebeproben von 52 Patienten (w 21/ m 31) mit
kolorektalen Adenokarzinomen (Stadium A: n=9, B: n=17, C: n= 14, D: n=12) analysiert. Bei
jedem Patienten wurden dabei sowohl im Tumor als auch im gesunden Gewebe mittels ELISA
die VEGF-Konzentration in pg VEGF/mg Protein bestimmt sowie mit Hilfe von PCR und
Temporal Temperature Gradient Electrophoresis (TTGE), bzw. Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE) nach einer Mutation im p53-Gen gesucht und, soweit vorhanden,
durch Sequenzierung charakterisiert. In 26 von 52 (50%) Tumorproben wurde eine Mutation im
p53-Gen identifiziert.
Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die VEGF-Konzentration bei
kolorektalen Karzinomen im Tumorgewebe gegenüber dem gesunden kolorektalen Gewebe
signifikant erhöht ist (p<0.001, VEGF-Median: Tumor 887,43, Normalgewebe 82,87 in pg
VEGF/mg Protein). Es bestand keine signifikante Korrelation zwischen der VEGF-Konzentration
im Tumorgewebe und dem Mutationsstatus im p53-Gen Exon 5-8 (p>0,05).
Die VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Tumoren mit Mutation im p53-Gen unterschied
sich nicht signifikant von der bei Tumoren ohne eine solche Mutation.
Ebenfalls fand sich bei Untersuchung der Stichprobe nach Untergruppen (z.B. Geschlecht,
Lokalisation des Tumors, Lokalisation der Mutation in Exon 5-8 des p53-Gen, in Codon 248 und
273 kodierend für die DNA-Bindungsregion bzw. Codon 175, 245 und 282, mit Einfluss auf die
Tertiärstruktur des Genproduktes, Stadium des Tumors nach Dukes und T-Kategorie der TNMKlassifikation) kein signifikanter Unterschied in der VEGF-Konzentration zwischen Tumoren mit
und solchen ohne Mutation im p53-Gen (p>0,05).
78
Die
Neoangiogenese
als
massgeblicher
Faktor
des
Größenwachstums
und
der
Tumorprogression in kolorektalen Karzinomen wird weiter zu analysieren sein, um nicht nur die
zugrundeliegenden molekularbiologischen Mechanismen zu verstehen, sondern auch um das
therapeutisches Potenzial einer spezifischen Tumortherapie zu vergrößern.
Weiter scheint es sinnvoll das Mutationsmuster in kolorektalen Tumoren und damit den Einfluss
auf die Tumorprogression, die Wachstumstendenz und wachstumsfördernden Faktoren zu
untersuchen. Dieses kann Hinweise für die Prognose der Patienten geben. Im klinischen Alltag
könnten Antikörper gegen Produkte der Onkogene und Tumorsuppressorgene, die das
Mutationsmuster charakterisieren als Tumormarker oder Screeningmethode eingesetzt werden.
Auch ist eine Gentherapie mittels Vektoren zur Regulation wichtiger Schlüsselgene der
Tumorprogression
eine
hoffnungsvolle
Strategie
Karzinomleiden.
79
zur
Bekämpfung
von
humanen
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Wu LW, Mayo LD, Dunbar JD, Kessler KM, Ozes ON, Warren RS, Donner DB
VRAP is an adaptor protein that binds KDR, a receptor for vascular endothelial
growth factor
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Wu X, Bayle JH, Olson D, Levine AJ
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The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop
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Wulfert M, Manual Whatman Biometra TGGE
The TGGE System: A fast method for differentiation between wild type and mutant DNA
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Xiong Y, Khang H
p21 is an universal inhibitor of cyclin kinases
Nature 1993; 366: 701-4
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Zietz C, Rössle M, Haas C, Sendelhofert A, Hirschmann A, Stürzl M, Löhrs U
MDM-2 oncoprotein overexpression, p53 gene mutation, and VEGF up-regulation in
angiosarcomas
Am J Path 1998; 153: 1425-33
96
7
Anhang
7.1
Abkürzungen in alphabetischer Reihenfolge
Abkürzung
Erläuterung
5-JÜR
5-Jahres Überlebensrate
APC
AS
Bcl-2
BSA
c-AMP
COX-2
CRC
DCC
DGGE
Adenopolyposis Coli–Gen
Aminosäure
Proto-Onkogen im B-Zell-Leukämie-Genlokus Chromosom 18
bovines Serum Albumin
zyklisches Adenosinmonophosphat
Cyclooxygenase 2
colorectal carcinoma, kolorektale Karzinome
deleted in colorectal cancer–Gen
denaturing gradient gel electrophoresis,
Gelelektrophorese mit chemischem Gradienten
deoxy Nukleotid Triphosphat
double strandend DNA, doppelsträngige DNA
extrazelluläre Domäne
extrazelluläre Matrix
enzyme linked immuno sorbent assay
fetal liver kinase
fms-like tyrosine kinase
GTPase activating Protein, GTPase aktivierendes Protein
Guanidinnukleotid Diphosphat
Guanidinnucleotide dissociation stimulator,
Guanidinnukleotid Dissoziations-Stimulator
Guanidinnukleotid Triphosphat
Stunde
Hypoxie-induzierter-Faktor 1
Kilo Basen
Kilo Dalton
kinase-insert domain containing receptor
Onkogen
Molar
mitogen activated protein kinase
MAPK oder ERK Kinase
maximal
minimal
Minute
milli Molar
messenger RNA (Ribonukleinsäure)
Medizinische Universität zu Lübeck
mutierter Typus
Mittelwert
Normal-...
Nanometer
nicht signifikant
nach
optische Dichte
open reading frame, offener Leserahmen vom Start- bis Stop-Codon
Plasminogen-Aktivator
dNTP
dsDNA
ECD
ECM
ELISA
flk
flt
GAP
GDP
GDS
GTP
h
HIF-1
kb
kDa
KDR
k-ras
M
MAPK
MEK
max
min
(Zahl)min
mM
mRNA
MUL
Mut
MW
N
nm
n.s.
n.
OD
ORF
PA
97
PCR
PE-Puffer
PGE2
PI(3)K
PIP
PLC-γ
PLD
pM
ras
raf
RTK
src
s
s.
SD
ssDNA
SMAD 2/4
T
TGF
TGGE
TNF
TSP
TTGE
UKL
VEGF
VEGFR
vgl.
VPF
VRAP
v-Src
Wt
µM
ZNS
7.2
Polymerase Chain Reaction, Polymerase Kettenreaktion
Proteinextraktionspuffer
Prostaglandin E2
Phosphatidyl Inositol 3 Kinase
Phosphoinositol-Phosphat
Phospholipase C-γ
Phospholipase D
piko Mol
Onkogen
Onkogen
Rezeptor-Tyrosin-Kinasen
Onkogen
Sekunde
siehe
Standardabweichung
single stranded DNA, einzelsträngige DNA
mothers against decapentaplegic homolog 2/4; Transkriptionsfaktor
von u.a. TGF-beta
Tumor-...
tumor growth factor, Tumorwachstumsfaktor
temperature gradient gel electrophoresis, Gelelektrophorese mit räumlichem
Temperaturgradienten
Tumornekrosefaktor
Thrombospondin
temporal temperature gradient electrophoresis,
Gelelektrophorese mit zeitlichem Temperaturgradienten
Universitätsklinik Lübeck
vascular endothelial growth factor
VEGF receptor
vergleiche
vascular permeability factor
VEGF receptor associated protein
Tumorsuppressorgen
Wildtyp
10-6 Meter
Zentrales Nervensystem
Materialien
7.2.1 Acrylamid/Bis, 40%
40% (w/v) Acrylamid und N’N’ Methylen-bis-Acrylamid, Verhältnis vom Monomer zum
Quervernetzer: 37,5:1
Fa. Bio-Rad, Hercules, California; USA
7.2.2 Agarosegel, 1%
eigene Herstellung
1% (w/v) Agarose, Fa. Invitrogen Corp., Carlsbad, California; USA
TAE-Puffer, 1x [7.2.56]
7.2.3 Ammoniumpersulfat, 10%
eigene Herstellung
10% (w/v) APS, in aqua bidest., steril
Fa. Sigma Chemical Co, St. Louis; USA
98
7.2.4 Bacto® Tryptone
Becton Dickinson and Company
Sparks, MD 21152 USA
38800 Le Pont de Claix ; France
7.2.5 Bacto® Yeast Extract
DIFCO Laboratories
Detroit MI 48232-7058; USA
7.2.6 Bio-Rad Protein Assay
Coomassie Brilliant Blue G250 Lösung
Fa. Bio-Rad, Hercules, California; USA
7.2.7 Biosphere Filtertips
Filtertips, steril, 10 µl
Filtertips, steril, 100µl
Filtertips, steril, 1000µl
Fa. Sarstedt, Nuembrecht; Deutschland
7.2.8 Bitek Agar
Becton Dickinson
Microbiology System
Becton Dickinson and Company, France S.A.
8800 Le Pont de Claix; France
7.2.9 Cellstar PP-Röhrchen
15ml, mit Schraubdeckel, steril
50ml, mit Schraubdeckel, steril
Fa. Greiner Labortechnik GmbH, Solingen; Deutschland
7. 2.10 Chill out wax
Fa. Biozym, Hessisch Oldendorf; Deutschland
7.2.11 Deckgläser
24 x 24 x 0,1 mm
Fa. Menzel Gläser, Braunschweig; Deutschland
7. 2.12 DMSO, Dimethylsulfoxid
Fa. Sigma Chemical Co, St. Louis; USA
7.2.13 DNA-Molekulargewichtsmarker VI
154-2176 bp, 25µg/µl; 50mg
Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; Deutschland
7. 2.14 DNA-Polymerisation Mix
dNTP-Gemisch, 20mM
Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Piscatanay, New Jersey; USA
7.2.15 EcoR I, Restriktionsendonuklease
Puffer H (Pufferangaben vertraulich), 20U/µl
Fa. Amersham Biosciences, Freiburg; Deutschland
7. 2.16 Elutions-Puffer
eigene Herstellung (nach: Separation of small DNA fragments by conventional gel
electrophoresis, in:
Current Protocols in Molecular Biology [178], Kapitel 2.7.4, Suppl. 45):
99
10mM Tris (Fa. Bio-Rad, Hercules, California; USA)
50mM NaCl (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
1mM EDTA (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
mit HCL auf pH 7,5 eingestellt
7. 2.17 Entwicklerlösung
eigene Herstellung
1,5% (w/v) NaOH (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
0,4% (v/v) Formaldehyd 35-40% (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
aqua bidest.
7. 2.18 Ethanol, 100% vergällt
Apotheke der Universitätsklinik Lübeck
7. 2.19 Ethanol, 96%
eigene Herstellung
96% (v/v) Ethanol 100% p.a. [7.2.18]
aqua bidest
7. 2.20 Ethanol, 70%
eigene Herstellung
70% (v/v) Ethanol 100% p.a. [7.2.18]
aqua bidest
7. 2.21 Ethidiumbromidlösung, 10mg/ml
Fa. Bio-Rad, Hercules, California; USA
7. 2.22 Eukitt
Einschlussmittel für histologische Schnitte
Fa. O. Kindler GmbH & Co, Freiburg; Deutschland
7. 2.23 Fixierlösung
eigene Herstellung
10% (v/v) Methanol 100%, p.a. (Fa. JT Baker, Deventer; Niederlande)
0,5% (v/v) Essigsäure 100% (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
aqua bidest.
7.2.24 Formamid
99,9%, pH 7,0 Micro Select for Molecular Biology
Fa. Fluka Chemie GmbH, Buchs; Schweiz
7.2.25 Genomic Kit
QIAGEN Blood & Cell Culture DNA Kits
RNase A (100mg/ml; 7000U/ml)
1 Unit katalysiert die Hydrolyse von RNA mit einer Geschwindigkeitskonstante ersten
Grades von 1,0 bei 25°C, pH 5,0
QIAGEN Protease: 28mg lyophilisierte Protease, 45 mU / mg Protein, gelöst in 1,4ml
sterilem H2Obidest = 20mg/ml
1 mU ist die Aktivität, die pro Minute folin-positive Aminosäure und Peptide freisetzt, die
1µmol Tyrosin entsprechen
Puffer G2:
800mM Guanidino Hydrochlorid
30mM Tris Cl, pH 8,0
30mM EDTA, pH 8,0
5% Tween-20
0,5% Triton X-100 (Benzyltrimethylammoniumhydroxid)
100
-
-
-
-
Puffer QBT:
750mM NaCl
50mM MOPS (3-(N-morpholino)Propan Sulfon Säure), pH 7,0
15% (v/v) Isopropanol
0,15% (v/v) Triton X-100 (Benzyltrimethylammoniumhydroxid)
Puffer QC:
1,0M NaCl
50mM MOPS (3-(N-morpholino)Propan Sulfon Säure), pH 7,0
15% Isopropanol
Puffer QF:
1,25M NaCl
50mM Tris Cl, pH 8,5
15% Isopropanol
QIAGEN Genomic 100/G Tips: Anionen-Austauscherharz-Säulen
Fa. QIAGEN GmbH, Hilden; Deutschland
7.2.26 Glycerin 10%, steril
eigene Herstellung
Verdünnung Glycerin (99,2%, steril) 1:10 mit aqua bidest. (steril)
auf Endkonzentration 10%
Apotheke der Universitätsklinik Lübeck
7.2.27 Halbmikroküvetten, 1,5ml
PMMA Plastibrand® , Fa. Brand; Deutschland
7.2.28 Harnstoff
Fa. Bio-Rad, Hercules, California; USA
7.2.29 Isopropanol, 100%, p.a.
Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland
7.2.30 Kanamycin-Monosulfat
Fa. Sigma Chemical Co, St. Louis; USA
7.2.31 Kit des pCR®- Blunt II-TOPO®
Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit, Firma Invitrogen, Carlsbad, Californien; USA
pCR®-Blunt II-TOPO® 10ng/µl Plasmid DNA in:
50% Glycerin
50mM Tris-HCL, pH 7,4
1mM EDTA
2mM DTT
0,1% Triton X-100
100µg/ml BSA
Bromphenolblau
dNTP Mix
12,5mM dATP
12,5mM dCTP
12,5mM dGTP
12,5mM dTTP
pH 8,0
Salzlösung 1,2M NaCl
0,06M MgCl2
SOC Medium 2%Trypton
7.2.32 Kontroll-DNA
Positivkontrolle Zelllinien:
101
Capan-1
Zelllinie aus humanem Pankreaskarzinom
mit Mutation in p53 Exon 5 Codon 159 GCC CTC
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Deutschland
Zellkulturen,
Braunschweig;
BXPC-3
Zelllinie aus humanem Pankreaskarzinom
mit Mutation in p53 Exon 6 Codon 220 TAT TGT
ATCC, Manassas, UA; USA
DLD-1
Zelllinie aus humanem Kolon Adenokarzinom
mit Mutation in p53 Exon 7 Codon 241 TCC TTC
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig;
Deutschland
SW 480
Zellinie aus humanem Kolonkarzinom
mit Mutation in p53 Exon 8 Codon 273: CGT CAT
Codon 309: CCC TCC
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig;
Deutschland
Negativ Kontrolle
DNA aus Eigenblutspende des Verfassers der Dissertationsarbeit
7. 2.33 Laufmarker (Agarosegel) 10x konzentriert
eigene Herstellung
40% (w/v) Saccharose (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
0,25% (w/v) Xylencyanol (Fa. Serva, Heidelberg; Deutschland)
0,1M EDTA, pH 8,0
7.2.34 Laufmarker (TTGE-Gel), 2x konzentriert
eigene Herstellung
0,05% (w/v) Bromphenolblau (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
0,05% (w/v) Xylencyanol (Fa. Serva, Heidelberg)
70% (v/v) Glycerol (Fa. Caesar und Loretz, Hilden; Deutschland)
aqua bidest.
7.2.35 LB-Platten
eigene Herstellung,
10g NaCl [7.2.38],
10g Bacto Trypton [7.2.4],
5g Yeast Extract [7.2.5],
ad 1 l aqua bidest.,
pH 7,5 mit 1M NaOH [7.2.39],
15g Agar [7.2.8]
7.2.36 Micro-Standard
Bovines Serum Albumin, 1mg/ml in 0,15M NaCl und 0,05% Natriumazid
(Konservierungsmittel)
eingesetzt in 1:2 Verdünnung mit NaCl Lösung, 0,15M [7.2.37], entsprechend einer
Konzentration von 0,5mg/ml
102
Fa. Sigma Chemical Co, St. Louis; USA
7.2.37 NaCl-Lösung, 0,15M
eigene Herstellung
0,15M NaCl (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
aqua bidest. (ultrafiltriert)
7.2.38 NaCl p.a.
Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland
7.2.39 NaOH-Lösung, 1M
eigene Herstellung
1M NaOH (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
aqua bidest.
7.2.40 Natriumbikarbonatlösung
eigene Herstellung
0,75% (w/v) NaHCO3 (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
aqua bidest.
7.2.41 NucleoSpin® Kit
Pufferangaben vom Hersteller vertraulich.
Firma Macherey-Nagel, Düren; Deutschland
7.2.42 Objektträger
Super Frost Plus, 25x75x1 mm
Fa. Menzel Gläser, Braunschweig; Deutschland
7.2.43 PCR-Reaktionsgefässe
ThermoTubeTM PCR Tubes 0,2ml
Fa. PeQlab, Erlangen; Deutschland
7.2.44 Plasmid Purifikation Maxi Kit Quiagen ®
Puffer:
P1: Resuspensionspuffer
50mM Tris-HCl, pH 8,0;
10mM EDTA;
100µg/ml RNase A
P2: Lysepuffer
200mM NaOH, 1% SDS (w/v)
P3: Neutralisationspuffer
3,0 mM K-Acetat, pH 5,5
QBT: Equilibrierungspuffer
750mM NaCl ;
50mM MOPS, pH 7,0 ;
15% Isopropanol (v/v);
0,15% Triton ® X-100 (v/v)
QC: Waschpuffer
1M NaCl;
50mM MOPS, pH 7,0
15% Isopropanol (v/v)
QF: Eluierungspuffer
103
1,25M NaCl;
50mM Tris-Cl, pH 8,5;
15% Isopropanol (v/v)
TE:
10mM Tris-HCl, pH 8,0;
1mM EDTA
Fa. QIAGEN GmbH, Hilden; Deutschland
7.2.45 Primer
(basierend auf der Sequenz der p53mRNA mit der Genebank Acc. No NM_000546)
lyophilisiert,
lösen zu einer Endkonzentration von 1mM in sterilem aqua bidest.
Primersequenzen s. Tabelle III
PCR für TTGE, DGGE:
p53ex 5-1 sense: Sequenzlänge 18 bp
p53ex 5-1 antisense: Sequenzlänge 59 bp
Länge des amplifizierten Genproduktes: 191 bp
p53ex 5-2 sense: Sequenzlänge 60 bp
p53ex 5-2 antisense: Sequenzlänge 20 bp
Länge des amplifizierten Genproduktes: 176 bp
p53ex 6 sense: Sequenzlänge 19 bp
p53ex 6 antisense: Sequenzlänge 57 bp
Länge des amplifizierten Genproduktes: 96 bp
p53ex7 sense: Sequenzlänge 20 bp
p53ex7 antisense: Sequenzlänge 60 bp
Länge des amplifizierten Genproduktes: 192 bp
p53ex8 sense: Sequenzlänge 20 bp
p53ex8 antisense: Sequenzlänge 60 bp
Länge des amplifizierten Genproduktes: 191
Sequenzierung:
Primer 1: M13universal(-21), 18mer:
5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’
Primer 2: M13Reverse (-29), 18mer:
5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’
mit IRD 800 Farbstoff am 5’-Ende
alle Primer: Fa. MWG Biotech, Ebersberg; Deutschland
7.2.46 Propanol (2-Propanol)
Apotheke der Universität Lübeck
7.2.47 Proteinextraktionspuffer
eigene Herstellung (nach: [163])
25 mM Tris, pH 7,4 (Fa. Bio-Rad, Hercules, California, USA)
100 mM NaCl (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
20 mM NH4HCO3 (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
104
7.2.48 Pwo-Peqlab PCR System
Enzym Mix: 3,5x103 U/ml
1 Unit entspricht der Enzymmenge, die benötigt wird, um 20nmol dNTP in 60min bei
65°C in säureunlösliche Substanz zu überführen
Expand HF Puffer, 10x konzentriert, 15mM MgCl2, genaue Zusammensetzung nach
Angabe des Herstellers vertraulich
Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; Deutschland
7.2.49 Quantikine Kit
VEGF Microwell-Platte, 96 (12x8) wells aus Polystyrol, beschichtet mit monoklonalen
Antikörpern aus der Ratte gegen VEGF
VEGF-Konjugat, polyklonaler Antikörper gegen VEGF mit
Meerrettich-Peroxidase konjugiert
VEGF-Standard, humanes rekombinantes VEGF165 in gepufferter Proteinlösung,
lyophilisiert (2000 pg)
Assay-Verdünnung RD1W, gepufferte Proteinlösung
Kalibrier-Verdünnung RD6U, Tierserum
Waschpuffer, 25x konzentriert, gepuffertes Surfactant
Farbreagenz A, Wasserstoffperoxid
Farbreagenz B, Tetramethylbenzidin
(Farbreagenz A und B 1:1 gemischt ergeben die Substratlösung)
Stop-Lösung, 2N Schwefelsäure
Fa. R&D Systems, Abingdon, Oxon; UK
7. 2.50 Rapid Gel XL, 40%
Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Piscatanay, New Jersey; USA
7. 2.51 Sawady Pwo DNA Polymerase
Pwo-Polymerase, 1U/µl
1 Unit entspricht der Enzymmenge, die benötigt wird, um 10nmol dNTP in 30min bei
70°C in säureunlösliche Substanz zu überführen
Reaktionspuffer, 10x konzentriert:
100mM Tris-HCL (pH 8,8)
50mM (NH4)2SO4
250mM KCl
20mM MgSO4
Fa. Peqlab, Erlangen; Deutschland
7.2.52 SDS-Lösung
eigene Herstellung
10% (w/v) SDS (Fa. Sigma Chemical Co, St. Louis; USA)
aqua bidest.
7. 2.53 Silbernitratlösung
eigene Herstellung
0,1% (w/v) AgNO3 (Fa. Fluka Chemie GmbH, Buchs; Schweiz)
aqua bidest.
7.2.54 SOC-Medium
Fa. Invitrogen Corp., Carlsbad, California; USA
10g Bacto-Trypton
2,5 g Yeast-Extrakt
1ml % M NaCl-Lsg.
0,41ml 3M KCl-Lsg.
pH 7,0
ad 500ml aqua bidest., autoklavieren
105
kalt hinzugeben nach steriler Filtration:
2,5ml 2M MgCL2
5ml 1M MgSO4
4,5ml 40% Glukose
7.2.55 Stop Solution
0,5M EDTA, 0,2ml
Formamid, deionisiert, 9,5ml
Bromphenol-Blau, 10mg
aqua bidest. ad 10ml
7. 2.56 TAE-Puffer, 1x konzentriert
eigene Herstellung
2% (v/v) TAE-Puffer, 50x [7.2.58]
aqua bidest.
7.2.57 TAE-Puffer, 1,25x konzentriert
eigene Herstellung
2,5% (v/v) TAE-Puffer, 50x [7.2.58]
aqua bidest.
7.2.58 TAE-Puffer, 50x konzentriert
eigene Herstellung
2M Trisbase (Fa. Sigma Chemical Co, St. Louis, USA)
5,7% (v/v) Eisessig (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
10mM EDTA (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
aqua bidest., pH 8,0
7. 2.59 TBE Long Run Buffer, 10x
eigene Herstellung
1340mM Tris
450mM Borsäure
25mM EDTA
aqua bidest.
eingesetzt als TBE Long Run Buffer, 1x, nach 1 :10 Verdünnung mit aqua bidest.
bei 50°C ca. pH 8,5
7. 2.60 TEMED
Fa. Gibco BRL
7.2.61 TE-Puffer
eigene Herstellung
10mM Tris-HCl 7,5pH(Fa. Bio-Rad, Hercules, California, USA)
1mM EDTA (Fa. Merck KGaA, Darmstadt; Deutschland)
aqua bidest.
7. 2.62 Thermosequenase Kit
dNTP/ddNTP-Gemische:
- A Reagenz:
Tris-HCl, pH 9,5, MgCl2, Tween 20, Nonidet P-40, 2-Mercaptophenol, dATP,
dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP, ddATP, thermostabile Pyrophosphatase, Thermo
Sequenase DNA Polymerase
- C Reagenz:
106
Tris-HCl, pH 9,5, MgCl2, Tween 20, Nonidet P-40, 2-Mercaptophenol, dATP,
dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP, ddCTP, thermostabile Pyrophosphatase, Thermo
Sequenase DNA Polymerase
- G Reagenz:
Tris HCl, pH 9,5, MgCl2, Tween 20, Nonidet P-40, 2-Mercaptophenol, dATP,
dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP, ddGTP, thermostabile Pyrophosphatase, Thermo
Sequenase DNA Polymerase
- T Reagenz:
Tris HCl, pH 9,5, MgCl, Tween 20, Nonidet P-40, 2-mercaptophenol, dATP,
dCTP, 7-deaza-dGTP, dTT, ddTTP, thermostabile Pyrophosphatase, Thermo
Sequenase DNA-Polymerase
Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Piscatanay, New Jersey, USA
7.3
Geräte
in alphabetischer Reihenfolge
7.3.1 Gelkammer (Agarosegel)
Minigelkammer
Fa. cti, Idstein; Deutschland
7.3.2 Gelkammer (TTGE/DGGE)
DCode Universal Mutation Detection System
Fa. Bio-Rad, Hercules, California; USA
7.3.3 Homogenisator
Ultra Turrax T25 basic
Fa. IKA Labortechnik, Staufen; Deutschland
7.3.4 Mikroskop
Axioskop
Fa. Carl Zeiss, Jena; Deutschland
7.3.5 Mikrotom
Mikrotom Jung SM 2000 R
Fa. Leica, Wetzlar; Deutschland
7.3.6 Mikrowellengerät
Fa. Siemens, Berlin; Deutschland
7.3.7 Photometer (ELISA)
340 ATTC
Fa. SLT Lab Instruments, Crailsheim, jetzt: Tecan Austria, Salzburg; Österreich
7.3.8 Schwenktisch
KS 250 basic
Fa. IKA Labortechnik, Staufen; Deutschland
7.3.9 Sequencer
DNA Sequencer Model 4000L
Fa. LiCOR, Lincoln, Nebraska; USA
7.3.10 Spannungsgeber
Bio-Rad Power Pac 300
107
Fa. Bio-Rad, Hercules, California; USA
7.3.11 Spectrophotometer
Beckmann DU 640
Fa. Beckmann, Fullerton, California; USA
7.3.12 Thermocycler
Primus 96 plus
Fa. MWG Biotech, Ebersberg; Deutschland
7.3.13 Thermomixer
Thermomixer compact
Fa. Eppendorf, Köln; Deutschland
7.3.14 TGGE Gelkammer
Fa. Whatman Biometra® , Göttingen; Deutschland
7.3.15 UV-Transilluminator
Fa. MWG Biotech, Ebersberg; Deutschland
7.3.16 Wasserbad
Type 850208, Nr. 1550
Fa. Braun, Melsungen; Deutschland
7.3.17 Werkbank, steril
Class II Type A/B3, Nuaire Lagbard Sicherheitswerkbank (NU 425-400E)
Fa. Nuaire, Plymouth, MN, USA
7.3.18 Zentrifuge
Biofuge 22R
Fa. Heraeus (Sepatech), Osterode; Deutschland
7.3.19 Zentrifuge
Rotanta/TR
Fa. Hettich, Tuttlingen; Deutschland
108
7.4
Analysedaten
Klinisch pathologische Eigenschaften der 52 untersuchten Kolonkarzinompatienten
109
Nummer Alter bei OP
77
80
83
85
90
91
92
100
105
116
121
122
123
124
125
127
129
131
132
135
136
137
138
141
142
143
144
145
156
167
168
169
171
172
173
175
182
183
188
189
192
194
196
204
206
211
215
217
223
231
232
236
65
74
61
60
81
67
58
70
59
63
67
73
70
75
73
57
81
56
64
68
64
65
86
74
68
56
73
82
55
86
63
84
52
59
55
74
70
66
67
55
77
74
76
85
75
52
62
36
52
45
67
92
0=weiblich,
1=männlich
0
1
1
0
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
1
1
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
0
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1=Kolon,
2=Rektum
2
2
1
2
1
2
2
2
1
1
2
1
1
2
1
1
2
1
1
2
2
1
1
1
2
1
1
1
2
1
1
2
2
2
2
2
1
1
1
2
1
1
2
2
1
2
1
1
1
1
1
1
VEGF-Konzentration
110
T
N
M
3
2
3
4
3
3
3
1
3
4
3
3
4
3
3
2
3
3
4
3
3
1
2
3
1
4
3
3
2
3
3
3
3
3
2
3
2
4
4
3
3
3
3
4
3
3
3
3
4
1
3
3
1
0
1
0
0
0
2
0
0
1
0
0
2
0
1
0
0
1
2
2
0
0
0
2
0
2
2
1
1
0
1
3
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
1
2
1
2
2
0
2
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
1
0
1
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
Dukes Grading
c
a
c
b
b
b
d
a
b
d
b
b
d
b
d
a
b
c
d
d
b
a
a
c
a
d
d
d
c
b
c
c
b
b
a
c
a
d
c
b
b
b
c
c
d
c
d
b
c
a
c
b
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
3
2
2-3
3
1
2
2
Nummer
77
80
83
85
90
91
92
100
105
116
121
122
123
124
125
127
129
131
132
135
136
137
138
141
142
143
144
145
156
167
168
169
171
172
173
175
182
183
188
189
192
194
196
204
206
211
215
217
223
231
232
236
N-Proben: VEGF T-Proben: VEGF N-Proben: VEGF T-Proben: VEGF
Konzentration
Konzentration
Konzentration
Konzentration
(pg/ml
(pg/ml
(in pg VEGF / mg (in pg VEGF / mg
Proteinextrakt)
Proteinextrakt)
Protein)
Protein)
175,85
809,65
66,04
234,29
175,32
424,67
88,35
201,86
119,50
528,50
76,01
237,36
173,40
805,40
50,19
329,06
259,38
1418,74
110,99
1836,99
180,84
294,21
234,15
213,38
167,16
1559,43
73,08
597,96
142,51
280,58
51,90
407,36
191,28
1827,20
62,99
1322,64
430,05
8075,90
197,30
1866,52
236,25
3065,56
428,63
1304,87
247,16
1955,23
102,81
1135,02
153,82
15432,98
53,36
5642,11
94,85
3842,67
52,34
1435,69
123,22
3430,30
55,87
1842,58
54,42
5983,90
35,17
2340,72
116,49
3295,52
39,97
1383,49
150,99
561,20
44,13
158,28
525,68
1559,45
132,00
954,06
478,24
664,49
109,77
344,08
142,51
451,39
54,32
117,28
139,68
983,32
54,36
262,39
123,50
885,95
26,66
221,01
159,95
1623,51
60,58
552,33
223,61
6486,24
52,94
2077,31
455,94
4914,61
160,06
3029,37
211,59
2001,82
175,81
848,78
309,63
9396,96
743,11
22552,71
232,38
1935,09
557,72
4644,21
601,62
1695,48
189,66
381,67
259,58
3969,06
174,81
897,01
66,45
561,20
66,72
732,88
114,47
2740,76
81,54
1836,58
112,09
2835,19
43,83
1056,79
181,62
1152,64
59,13
468,09
109,70
2634,56
36,71
783,84
117,89
1737,08
98,88
1145,23
196,58
547,45
153,70
357,39
269,68
219,30
206,01
113,91
110,47
2026,80
85,57
1522,72
246,48
1630,52
174,82
1715,55
112,18
545,51
102,25
887,43
157,01
2521,04
94,87
1320,88
124,86
274,30
53,36
267,83
56,91
440,70
51,32
168,81
156,04
1541,07
84,20
955,62
111,32
569,10
85,16
284,29
150,23
5007,81
94,86
4370,12
176,28
353,92
104,56
307,42
70,57
515,35
30,38
225,30
284,70
1278,53
124,36
893,11
190,16
2436,40
78,78
2042,86
Mutationsnachweis im p53-Gen Exon 5-8
111
N-Proben: Mutation in der T-Proben: Mutation in der
TTGE/DGGE (0=nein,
TTGE/DGGE (0=nein,
Nummer
1=ja)
1=ja)
77
0
1
80
0
1
83
0
1
85
nicht untersucht
0
90
nicht untersucht
0
91
nicht untersucht
0
92
0
1
100
nicht untersucht
0
105
nicht untersucht
0
116
0
1
121
0
1
122
nicht untersucht
0
123
nicht untersucht
0
124
0
1
125
0
1
127
nicht untersucht
0
129
nicht untersucht
0
131
nicht untersucht
0
132
0
1
135
0
1
136
nicht untersucht
0
137
nicht untersucht
0
138
nicht untersucht
0
141
0
1
142
nicht untersucht
0
143
0
1
144
0
1
145
nicht untersucht
0
156
nicht untersucht
0
167
nicht untersucht
0
168
nicht untersucht
0
169
0
1
171
nicht untersucht
0
172
0
1
173
0
1
175
0
1
182
nicht untersucht
0
183
nicht untersucht
0
188
0
1
189
0
1
192
0
1
194
0
1
196
0
1
204
0
1
206
nicht untersucht
0
211
nicht untersucht
0
215
0
1
217
0
1
223
0
1
231
nicht untersucht
0
232
nicht untersucht
0
236
nicht untersucht
0
Charakterisierung der Mutation durch Sequenzierung:
112
CodonSequenz
Wt
TGC
GAG
TGC
GTG
TGC
TGC
CGC
CGC
CodonSequenz
Mut
TTC
GGG
TTC
GTT
TTC
TTC
CAC
CAC
Mutation in
Exon:
ProbenNr.:
Codon:
5
5
5
5
5
5
5
5
80
169
173
175
189
192
196
223
135
171
135
173
135
135
175
175
6
121
220
6
172
Deletion
193- 201
6
6
188
217
213
213
7
7
7
7
7
7
7
92
132
135
169
188
204
215
245
248
248
245
234
248
248
GGC
CGG
CGG
GGC
TAC
CGG
CGG
AGC
CAG
CAG
GAC
CAC
CAG
TGG
Gly
Arg
Arg
Gly
Tyr
Arg
Arg
Ser
Gln
Gln
Asp
His
Gln
Trp
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
77
83
116
124
125
141
143
144
194
217
285
280
282
273
266
273
282
273
282
282
GAG
AGA
CGG
CGT
GGA
CGT
CGG
CGT
CGG
CGG
AAG
ATA
TGG
CAT
GAA
TGT
TGG
CAT
TGG
TGG
Glu
Arg
Arg
Arg
Gly
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
Lys
Ile
Trp
His
Glu
Cys
Trp
His
Trp
Gly
7.5
Wt-AS
Mut-AS
Cys
Glu
Cys
Val
Cys
Cys
Arg
Arg
Phe
Gly
Phe
Val
Phe
Phe
His
His
TAT
TGT
Tyr
193 -CAT
CTT ATC
His, Leu, Ile,
CGA GTG 193- CTG – Arg, Val,
201
GAA GGA
Glu, Gly,
AAT TTGAsn, Leu
201
CGA
CGG
Arg
CGA
CGG
Arg
Cys
Leu
Arg
Arg
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Die fünf verschiedenen Isoformen des VEGF
Abbildung 2: Mutationen und Eigenschaften des humanen p53-Protein
Abbildung 3: Laufverhalten der DNA in der Denaturans Gradient Gelelektrophorese, DGGE
Abbildung 4: Schema der Zeit Gradient Gelelektrophorese, TGGE
Abbildung 5: Boxploterklärung
Abbildung 6: TTGE-Gel zum Nachweis von Mutationen im Exon 8 des p53-Gen
Abbildung 7: VEGF-Konzentration in Normal- und Tumorgewebe
Abbildung 8: VEGF-Konzentration in Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen
Abbildung 9: VEGF-Konzentration im Normalgewebe mit und ohne Mutation in Exon 5-8
im korrespondierendem Tumorgewebe
Abbildung 10: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen
bei Frauen und Männern
Abbildung 11: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen in
bei Lokalisation des Tumors im Kolon bzw. Rektum
Abbildung 12: VEGF-Konzentration in Tumorgewebe mit und ohne Mutation im p53-Gen in
113
bei Einteilung der Tumore in die Dukes-Stadien
Abbildung 13: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe mit und ohne Mutationen im p53-Gen
bei Einteilung der Tumore nach den T-Stadien der TNM-Klassifikation
7.6
Tabellenverzeichnis
Tabelle I: Charakterisierung des Patientenkollektivs
Tabelle II: Pipettierschema zur Erstellung der Standardreihe des VEGF-ELISAs
Tabelle III: Angaben zu den verschiedenen Primern und den PCR-Produkten
Tabelle IVa: Mastermix I für die Exons 5-1,6,7,8
Tabelle IVb: Mastermix I für das Exon 5-2
Tabelle Va: Mastermix II für die Exons 5-1,6,7,8
Tabelle Vb: Mastermix II für das Exon 5-2
Tabelle VI: Reaktionsbedingungen der PCR für die untersuchten Exons des p53-Gens
Tabelle VII: Temperaturbereiche der einzelnen Exons in der TGGE
Tabelle VIII: Positivkontrollen für die Mutationsanalyse der untersuchten Exons des p53-Gens
Tabelle IX: Stammlösung für das TTGE-Gel
Tabelle Xa: 10% Acrylamid-Lösung mit 100% Denaturans
Tabelle Xb: 10% Acrylamid-Lösung mit 0% Denaturans
Tabelle XI: Laufbedingungen der TTGE für die Exons 5-1,7,8 und der DGGE für die
Exons 5-2 und 6
Tabelle XII: Mastermix für Sequenzierungs-PCR
Tabelle XIII: Reaktionsbedingungen für die Cycle-Sequenzierung
Tabelle XIV: Zusammensetzung des Gels für die Sequenzierung
Tabelle XV: Häufigkeiten der p53-Mutation in den Exon 5-8
Tabelle XVI.: Verteilung der detektierten Mutationen auf die Exons 5-8
Tabelle XVII: Verteilung der Mutationen im p53-Gen Exon 5-8 in den 26 Tumorproben auf die
einzelnen Codons
Tabelle XVIII: Mutationen in p53 Exon 5
Tabelle XIX: Mutationen in p53 Exon 6
Tabelle XX: Mutationen in p53 Exon 7
Tabelle XXI: Mutationen in p53 Exon 8
Tabelle XXII: Verteilung der Mutationsart in den untersuchten Exons des p53-Gen
Tabelle XXIII: Transitionen in CpG Dinukleotiden
Tabelle XXIV: VEGF-Konzentration im Normal- und Tumorgewebe
Tabelle XXV: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit und ohne Mutation
im p53-Gen im Tumorgewebe
Tabelle XXVI: VEGF-Konzentrationa im Normalgewebe von Patienten mit und ohne Mutation
im p53-Gen im Tumorgewebe
Tabelle XXVII: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit Mutation
im Exon 5, 6, 7 und 8
Tabelle XXVIII: Unterschied in der VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit
und ohne Mutation im p53-Gen, getrennt nach Geschlecht
Tabelle XXIX: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit und ohne Mutation
im p53-Gen, getrennt nach Lokalisation des Tumors
Tabelle XXX: Mutationen im p53-Gen, getrennt nach Dukes-Stadien
Tabelle XXXI: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit und ohne Mutation
getrennt, nach Dukes-Stadien
Tabelle XXXII: Mutationen im p53-Gen, getrennt nach T-Kategorie der TNM-Klassifikation
Tabelle XXXIII: VEGF-Konzentration im Tumorgewebe bei Patienten mit und ohne Mutation im
p53-Gen bei unterschiedlicher Invasionstiefe des Tumors nach dem
TNM-System
Tabelle XXXIV: VEGF-Konzentrationa im Tumorgewebe von Patienten mit einer Mutation im
Codon 248 oder 273 des p53-Gens
Tabelle XXXV: VEGF-Konzentrationa bei Patienten mit einer Mutation in Codon 175, 245 oder
282 des p53-Gens
114
8
Danksagung
Hiermit möchte ich folgenden Personen meinen besonderen Dank aussprechen:
Hr. Prof. Dr. R. Broll, Forschungslabor der Klinik für Chirurgie, Universitätsklinikum SchleswigHolstein, Campus Lübeck, für die freundliche Überlassung des Themas dieser Arbeit, die
Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die stets hilfreiche Unterstützung in allen Stadien meiner
Arbeit
Fr. Dr. U. Windhövel, für die stets freundliche und hilfreiche Unterstützung in allen Stadien
meiner Arbeit sowie die Betreuung und Hilfe während der praktischen Arbeit
Hr. PD Dr. H.-J. Friedrich, Institut für Biometrie und Statistik des Universitätsklinikums
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, für die hilfreiche Beratung in den Bereichen der Statistik
und der kritischen Ergebnisbetrachtung
Fr. Elke Gheribi, Fr. Regina Kaatz, Fr. Vera Grobleben, Fr. Gisela Grosser-Pape und allen
anderen Mitarbeitern des Forschungslabors der Klinik für Chirurgie, Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, für die tatkräftige Unterstützung und das gute
Arbeitsklima
Hr. Dr. Menke, ehemals Mitarbeiter des Instituts für Pathologie der Christian Albrecht
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel, für die Unterstützung im Bereich der
TGGE und der Entwicklung einer geeigneten Färbetechnik für Polyacrylamidgele
Hr. Prof. Dr. Stürzbecher, Institut für Humangenetik, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein,
Campus Lübeck, für Anregungen im Bereich der TTGE und bei der Auswahl der DNAKontrollen
Hr. Dr. Till Milde, für die Zeit als Kommilitone und Freund über all die Jahre und den
gemeinsamen Weg
Meinen Eltern für die stetige und unerlässliche Unterstützung
Fr. B.-L. Matthiessen und Fr. Dr. med. C. Küchlin für die Unterstützung, Anregung und Hilfe
Hr. PD Dr. med. F. W. Tischendorf für die Beratung bei formellen Aspekten
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Lebenslauf
Curriculum Vitae
Name:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Familienstand:
Adresse:
Steffen W. Pfarr
24.06.1973
Wesel
ledig
Moosmattstr. 34
CH-6005 Luzern
Tel.: +41 79 331 8010
e-mail: [email protected]
Schulbildung:
Besuch der Martin-Luther-Grundschule, Brilon
Besuch des Gymnasium Petrinum, Brilon
1979- 1983
1983- 1992
Ausbildung:
Ausbildung zum examinierten Krankenpfleger, Marsberg
Oktober 1992September 1995
Studium:
Humanmedizinstudium,
Medizinische Universität Lübeck
Ärztliche Vorprüfung
Erstes Staatsexamen
Gasthörer an der University of the Witwatersrand Johannesburg
Oktober 1999
Zweites Staatsexamen
Drittes Staatsexamen
seit Oktober 1995
September 1997
August 1998
SeptemberMärz 2001
Juni 2002
Assistenzarzt:
Assistenzarzt Chirurgie, PD Dr. med. R. Babst
Kantonsspital Luzern Chirurgie A, Luzern Schweiz
seit Juli 2004
Ausbildungsstelle in der allgemeinen Chirurgie, Dr. med. M. Lüdi
Am Kantonsspital Obwalden, Sarnen Schweiz
Januar 2003Juni 2004
Praktisches Jahr:
I. Tertial: Innere Medizin,
kardiologische Abteilung/ Intensivstation, Prof. Dr. med. H. Katus
Medizinische Universität Lübeck
II. Tertial: Chirurgie, Prof. Dr. med. M. von Flüe,
Handchirurgie/Plastische Chirurgie, Dr. med. U. v. Wartburg/ Dr. med. E. Fritsche
Kantonsspital Luzern/ Schweiz.
III. Tertial: Zahn- Mund- Kiefer- Gesicht- Chirurgie,
Prof. Dr. A. Pogrel, UCSF San Francisco/ USA und
Prof. Dr. dent., Dr. med. v. Domarus, Medizinische Universität Lübeck
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Aus-/ Weiterbildung:
Jahr 2002:
25.-28. November: Weiterbildungsblock: Strahlenschutz in der Röntgendiagnostik,
Gesundheitswesen und Wirtschaftlichkeit, Ethik und Berufsrecht,
Notfallmedizin. Neustadt Schleswig-H./D
18. Dezember:
„Brauchen wir noch die kontrollierte maschinelle Beatmung?“
Ärztekammer Hamburg/D
Jahr 2003:
27. März:
Workshop zur Untersuchungstechnik, Diagnostik, Therapie und
Nachbehandlung von Schulterverletzungen Nottwil/CH
21.-24. Mai
Jahreskongress der Schweizer Gesellschaft für Chirurgie und der
Schweizerischen Gesellschaft für Thorax-,Herz- und Gefässchirurgie St.
Gallen/CH
15. Juni:
Erwerb der Sachkundezeiten Anwendungsgebiet Notfalldiagnostik
03.-06. September:
39th National Congress of Swiss Society of Plastic, Reconstruktiv and
Aesthetic Surgery as well as Swiss ISAPS Course, Lugano/CH
23. Oktober:
Workshop zur Untersuchungstechnik, Diagnostik, Therapie und
Nachbehandlung von Knieverletzungen Nottwil/CH
05.-08. November:
Kombinierter Grund- und Spezialkurs im Strahlenschutz (Fachkunde nach
Röntgenverordnung) Landesärztekammer Schleswig- H./D
14.-19. Dezember:
AO Kurs: Prinzipien der operativen Frakturbehandlung, Davos/CH
Jahr 2004:
Frühjahr: 4 Tage
Hospitation in der Abteilung für Plastische Chirurgie, Handchirurgie,
Intensiveinheit für Schwerbrandverletzte
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck
05. Februar:
Handgelenksverletzungen- Gips oder OP Nottwil/CH
28. Februar- 5. März: 21st internationaler Workshop for Gastrointestinal Surgery, Davos/CH
23.-24. April:
28. April:
4. Ostseesymposium, Hand-Brust-Plastische Chirurgie
Ästhetische-Rekonstruktive-Mammaplastik inkl. Übungen,
Neustadt Schleswig-H./D
Verletzungen des Handgelenkes- Primärdiagnostik und
weitere therapeutische Schritte
17. Juni:
Beurteilung und Versorgung proximaler Femurfrakturen Nottwil/CH
10. Juli:
Notfallsonokurs KLS/Luzern CH
09. September:
Gipskurs: Gipstechnik und praktische Übungen KSL/Luzern CH
November:
Schweizer Chirurgie Basisexamen absolviert
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Veröffentlichungen:
Präsentation der Arbeit auf dem Deutschen Krebskongress 2002 in Berlin, Abstract:
S. Pfarr, T. Milde, U. Windhoevel, M. Duchrow, H.- P. Bruch, R. Broll:
Correlation between VEGF tissue level and Ki-ras or p53 mutations in human colorectal
carcinoma, J Cancer Res Clin Oncol, Suppl. to Vol. 128 (200), S.145.
Präsentation der Arbeit auf den 6. Chirurgischen Forschungstagen in Köln, Abstract:
U. Windhövel, S. W. Pfarr, T. Milde, H.-P. Bruch, R. Broll
Correlation between VEGF tissue level an mutations of the p53 gene in human colorectal
carcinomas
Präsentation der Ergebnisse European Surgery Acta Chirurgica Austria, Abstract:
26th Seminar of the Austrian Society for Surgical Research, 2002 in Gosau
R. Broll, T. Milde, S. Pfarr, O. Schwandner, U. Windhövel:
Beeinflussen Mutationen im k-ras Onkogen die Expression des Vascular- Endothelial- GrowthFactors (VEGF) in kolorektalen Karzinomen?
Eur. Surg. Vol. 34; Suppl. No. 189, S. 34; 2002
Praktische Tätigkeiten:
Famulatur in der kardiologischen Abteilung der
Medizinischen Klinik II, MUL, Prof. Dr. med. H. Katus
Frühjahr 1998
Famulatur in der neurochirurgischen Klinik der
Friedrich-Alexander Universität, Erlangen- Nürnberg
Prof. Dr. med. R. Fahlbusch
Herbst 1998
Praxisfamulatur radiologischen/ nuklearmedizinischen Praxis,
Maria-Hilf-Krankenhaus in Brilon, Dr. med. R. Krämer
Frühjahr 1999
Praxisfamulatur allgemeinmedizinischen Praxis Dr. med. B. Walters
in Brilon.
Frühjahr 1999
Famulatur in der chirurgischen Klinik Helen Joseph Hospital,
Herbst 1999
Univerity of the Witwatersrand, Johannesburg, Prof. Dr. med. GJ Oettle
Famulatur in der plastischen Chirurgie
der Fachklinik Hornheide- Münster, Dr. med. H. Tilkorn
Frühjahr 2000
Sonstiges:
regelmässige Wochenend- und Nachtdienste im
Krankenhaus Süd der Hansestadt Lübeck
1999- 2001
Präparationsarbeit für Fortgeschrittene
Sommer 1997
Grundkurs Medizinische Ethik
Kurs der Medizinischen Informatik und Statistik
Kurs der Sportmedizin (2 Semester)
Notfallmedizinisches Kolloquium (2 Semester)
OP- Kurs der Klinik für Kiefer- u. Gesichtschirurgie
Kurs der Plastisch- chirurgische Indikationen und Anatomie,
mit Training des mikrochirurgischen Arbeiten der Plastischen Chirurgie
1995/96
1997
1998/99
1998/99
1999
2000
Steffen W. Pfarr
Luzern den 01.01.2005
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