Die Protonenpumpe der pflanzlichen Zellmembran

Überblick
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Die Protonenpumpe der pflanzlichen
Zellmembran
Claudia Oecking
Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen (ZMBP), Universität Tübingen
In Höheren Pflanzen wird
die Energie für nahezu alle
bekannten Transportprozesse über die Plasmamembran durch eine protonentranslozierende P-Typ
ATPase zur Verfügung
gestellt. Diese H+-ATPase ist
somit für eine elementare
Lebensfunktion – die Aufrechterhaltung des Stoffaustauschs mit der Umgebung –
von entscheidender Bedeutung und sie ist in eine Vielzahl physiologischer
Prozesse eingebunden, die von der
Energetisierung des Membrantransports
abhängen. Die molekularen Mechanismen,
die die Aktivität dieses Enzyms regulieren,
sind daher von großem Interesse. Die
C-terminale Domäne der H+-ATPase konnte
als ein intramolekularer Inhibitor der
Enzymaktivität identifiziert werden; lange
Zeit waren jedoch die Regulationsmechanismen, die der – auf einer Konformationsänderung dieser autoinhibitorischen
Domäne beruhenden – Aktivierung der
H+-ATPase zugrunde liegen, unbekannt.
Einblicke wurden hier durch die Aufklärung
des Wirkmechanismus des Phytotoxins
Fusicoccin erhalten. Dieses nichtselektive
Pilztoxin aktiviert die Protonenpumpe
praktisch irreversibel und löst demzufolge
bei Pflanzen Welkeerscheinungen aus.
An diesem Effekt sind eukaryotische 14-3-3
Proteine maßgeblich beteiligt.
BIOspektrum · 1/02 · 8. Jahrgang
Die primär aktive H+-ATPase der pflanzlichen Plasmamembran transloziert unter
Hydrolyse von ATP Protonen aus dem Cytoplasma in den extrazellulären Raum und erzeugt so eine protonmotorische Kraft (∆p),
die sich aus einer elektrischen Potentialdifferenz (∆E) und einer Differenz in der Wasserstoffionenkonzentration (∆pH) zusammensetzt (∆p = ∆E – 59∆pH (mV)). Diese
protonmotorische Kraft stellt die Grundlage
vieler sekundärer Transportprozesse dar, die
über Carrier und Kanäle vermittelt werden
(Abb. 1). Demnach ist die protonentranslozierende ATPase für die Energetisierung des
Membrantransports verantwortlich und sie
trägt zu Wachstum und Differenzierung
pflanzlicher Organismen bei. Dieser Beitrag
gibt einen kurzen Überblick über den derzeitigen Kenntnisstand in bezug auf die
Struktur, Funktion und Regulation dieser
bedeutenden pflanzlichen Ionenpumpe.
Struktur der pflanzlichen H+-ATPase
Abb. 1: Schema zu primär aktiven sowie sekundären Transportprozessen über die Plasmamembran. Die H+-ATPase erzeugt als primär
aktive Pumpe eine protonmotorische Kraft, die
sekundäre Transportprozesse über Kanäle und
Carrier ermöglicht. Kanäle vermitteln den Transport von Ionen entlang ihrer elektrochemischen
Gradienten. Carrier arbeiten entweder passiv
(Uniporter) oder sekundär aktiv (Kotransporter:
Symporter oder Antiporter), indem sie den
Transport von Metaboliten über die Plasmamembran an die elektrochemisch begünstigte
Translokation von Protonen ins Zellinnere
koppeln.
H+-ATPasen bestehen aus einem einzigen
Polypeptid mit einer molekularen Masse um
100 kDa. Die Elektronenkristallographie
zweidimensionaler Kristalle der H+-ATPase
von N. crassa belegt die Existenz von zehn
transmembranen α-Helizes und vier cytoplasmatischen Domänen (Abb. 2) [1]. Weniger als 10% des Proteins sind extrazellulär
orientiert; im Cytoplasma befinden sich sowohl der N- als auch der C-Terminus des
Enzyms sowie die sogenannte kleine und
große Schleife. Letztere beinhaltet die ATPBindestelle und den Aspartatrest, der im Verlauf der Katalyse phosphoryliert wird [2]. Die
C-terminale Domäne der pflanzlichen Protonenpumpe wirkt autoinhibitorisch: erfolgt
eine selektive Abspaltung dieser Domäne
vom Rest des Enzyms mittels einer milden
Proteolyse (Trypsin), so weist das C-terminal verkürzte Enzym eine eindeutig erhöhte Aktivität auf [3].
Physiologische Funktionen der pflanzlichen
H+-ATPase
P-Typ ATPasen bilden eine große Familie von Membranproteinen, die ATP nutzen,
um Ionengradienten über Zellmembranen
aufzubauen. Die Bezeichnung ‚P-Typ’ geht
auf die Phosphorylierung eines Aspartatrestes im Verlauf der Katalyse zurück. Das
Synonym E1/E2-ATPase nimmt Bezug auf
detaillierte Untersuchungen von Säuger
P-Typ ATPasen, deren katalytischer Zyklus
auf einer – phosphorylierungsabhängigen –
Konversion zweier Konformationszustände
beruht. Diese unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Affinität gegenüber dem zu translozierendem Ion; der Mechanismus der
Ionentranslokation ist jedoch bislang unbekannt.
Viele physiologische Prozesse, die von der
protonmotorischen Kraft abhängen, werden
durch die Aktivität der H+-ATPase beeinflusst. Besonders eindrücklich macht dies eine Behandlung pflanzlicher Gewebe mit
dem Pilztoxin Fusicoccin (FC, Abb. 3) deutlich. Dieses Diterpenglucosid ist das Haupttoxin des phytopathogenen Pilzes Fusicoccum amygdali und aktiviert die Protonenpumpe in vivo nahezu irreversibel [4]. Darüber hinaus wird u.a. die Aufnahme und der
Transport von Nährstoffen stimuliert, eine
unphysiologisch starke Stomataöffnung induziert und die Zellstreckung gefördert;
Wirkungen, die in Summe auf die primäre
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Abb. 2: Topologie der H+-ATPase der Plasmamembran. Nähere Erläuterungen sind dem Text zu
entnehmen.
Stimulation der H+-ATPase zurückzuführen
sind.
Essentielle mineralische Nährelemente
(z. B. Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Kalium) nimmt die Pflanze in ionischer Form aus
dem Bodenwasser in die Wurzel auf. Zudem
werden Aminosäuren als bedeutende Transportform reduzierter Stickstoffverbindungen
und Kohlenhydrate als Produkt der photosynthetischen CO2-Fixierung über das Xylem und/oder Phloem in der Pflanze verteilt.
Der Transport von Ionen und Metaboliten
in die Zelle erfolgt dabei häufig entgegen
Konzentrationsgradienten bzw. elektrochemischen Gradienten und erfordert daher die
Kopplung an eine exergone Reaktion. Sogenannte Protonen-Symporter (sekundär aktive Carrier) nutzen die Energie, die in dem
elektrochemischen Protonengradienten gespeichert ist und ermöglichen – auf der
Grundlage des elektrochemisch begünstigten Kotransports von Protonen (Abb. 1) – die
Aufnahme vieler anorganischer und organischer Nährstoffe in die Zelle.
Pflanzen bauen im Gegensatz zu Tieren
einen hohen intrazellulären Druck, den sogenannten Turgor, auf. Eine Turgorerhöhung
ist beispielsweise die Ursache für das Öffnen der Stomata (Abb. 3), die für den Gasaustausch von Pflanzen verantwortlich sind.
Der Turgor kann über eine Veränderung des
osmotischen Potentials der Zelle und den
damit verbundenen Wassereinstrom oder
-ausstrom über selektive Poren (Aquaporine)
beeinflusst werden. Auch an diesem Prozess
ist die H+-ATPase maßgeblich beteiligt: ihre Aktivierung führt über eine Hyperpolarisation des Membranpotentials zu einer Öffnung spannungsabhängiger K+-Kanäle und
ermöglicht den passiven Einstrom osmotisch
wirksamer K+-Ionen (Abb. 1). Dies hat einen
Anstieg des osmotischen Potentials und des
Turgors zur Folge, der mechanisch – bedingt
durch die ungewöhnliche Zellwandstruktur
der Schließzellen – in eine verstärkte Öffnung der Stomata umgesetzt wird.
Die pflanzliche Zellwand stellt eine mechanische Barriere dar, die die Zellvergrößerung einschränkt. Eine Ansäuerung der
Zellwand, die sich auf eine gesteigerte Aktivität der H+-ATPase zurückführen lässt,
initiiert das Zellstreckungswachstum. Dieser Prozess ist als Säure-Wachstumshypothese bekannt und kann vereinfacht als
säureinduzierte Zellwanderweichung aufgefasst werden, die die Aufnahme von Wasser und somit die Zellstreckung ermöglicht.
Die H+-ATPase stellt eine bedeutende
Komponente dieses Prozesses dar: neben der
Initiierung des säureinduzierten Wachstums
ist sie für die Aufrechterhaltung des Zellturgors im Verlauf der Zellstreckung verantwortlich (s. o.).
Regulation der pflanzlichen H+-ATPase
Berücksichtigt man den hohen Energieverbrauch der H+-ATPase und die Vielzahl der
physiologischen Prozesse pflanzlicher Zellen, in die dieses Enzym eingebunden ist, so
muss von einer strikten Regulation in vivo
ausgegangen werden. Daher verwundert es
nicht, dass die Aktivität der Protonenpumpe durch zahlreiche Stimuli beeinflusst wird.
Hierzu gehören beispielsweise Licht, Phytohormone (Auxine, Brassinosteroide), Toxine
und andere Umwelteinflüsse [5]. Physiologische Studien wiesen jeweils auf die H+ATPase als das hauptsächliche Zielsystem
dieser regulatorischen Ereignisse hin; der
molekulare Mechanismus der Regulation
konnte jedoch nur in wenigen Fällen aufgeklärt werden. Im Folgenden werden die
derzeit diskutierten Möglichkeiten zur Re-
gulation der Aktivität der H+-ATPase in Kürze vorgestellt. Abschließend wird auf den
Mechanismus der FC-Wirkung eingegangen, der zur Entdeckung sogenannter
14-3-3 Proteine als physiologische Aktivatoren der H+-ATPase führte.
Die protonentranslozierende ATPase der
pflanzlichen Plasmamembran wird von einer erstaunlich großen Multigenfamilie kodiert, die zum heutigen Zeitpunkt molekular bereits recht gut charakterisiert ist. So
wurden beispielsweise zehn Gene in A. thaliana und neun in Nicotiana plumbaginifolia
identifiziert [2,5]. Die Expression einzelner
Isoformen erfolgt gewebespezifisch und entwicklungsabhängig und wird z.T. durch Umwelteinflüsse (mechanischer Stress, Salzstress) reguliert; dies stellt sicherlich den bedeutsamsten Faktor dar, der es Pflanzen ermöglicht, die Energetisierung der Plasmamembran den jeweiligen „Transportbedürfnissen“ einzelner Zellen und Geweben anzupassen [2,5].
Neben dieser transkriptionellen Regulation ist jedoch auch eine Regulation des Enzyms auf der Ebene einer posttranslationalen Modifikation notwendig, die insbesondere eine schnelle Antwort auf Umwelteinflüsse ermöglicht. Als bedeutender Botenstoff ist Calcium in diverse pflanzliche Signaltransduktionsprozesse eingebunden. Es
gibt Hinweise darauf, dass physiologische
Ca2+-Konzentrationen eine reversible Inaktivierung der H+-ATPase in Schließzellen
zur Folge haben [6] und somit den turgorgesteuerten Stomataverschluss einleiten. Dieser Effekt scheint jedoch indirekt zu sein [2,5]
und wird möglicherweise durch eine Phosphorylierung des Enzyms, die auf die Aktivität einer Ca2+-abhängigen Proteinkinase
(CDPK) zurückzuführen ist, vermittelt [2].
Der C-Terminus der pflanzlichen H+ATPase stellt eine regulatorische Domäne
dar, deren autoinhibitorische Aktivität in vivo nachgewiesen werden konnte [7].Über die
molekulare Grundlage einer Aktivierung der
H+-ATPase, die auf einer posttranslationalen Regulation ihrer C-terminalen Domäne
beruht, war lange Zeit wenig bekannt. 1993
konnte gezeigt werden, dass die autoinhibitorische Aktivität dieses intramolekularen
Regulators in Gegenwart von FC – vermutlich aufgrund einer Konformationsänderung
– aufgehoben wird [8]. Dies hat eine irreversible Aktivierung der Protonenpumpe zur
Folge und bedingt aufgrund einer irreversiblen Öffnung der Stomata (s.o.) letztendlich ein Welken der Pflanzen (Abb. 3). Die
FC-Wirkung wird über ein hochaffines
FC-bindendes Protein (FCBP) der Plasmamembran vermittelt, so dass man sich grundlegendere Aufschlüsse über den Mechanismus der FC-Wirkung durch die Identifizierung des FCBP erhoffte.
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Mechanismus der FC-Wirkung
Die zahlreichen Untersuchungen zum FCBindeprotein haben zu einem klassischen
Rezeptorkonzept geführt, demzufolge das
FCBP als ein integrales Membranprotein
mit einer extrazellulären Bindestelle für FC
anzusehen ist [9]. Mit der Entdeckung, dass
sogenannte 14-3-3 Proteine, die keinerlei hydrophobe Domänen aufweisen, zumindest
eine Komponente des FCBP darstellen [10,
11, 12] , musste dieses klassische Rezeptorkonzept jedoch in Frage gestellt werden.
14-3-3 Proteine wurden 1967 als dominante Proteine des Säugerhirns identifiziert.
Ihren ungewöhnlichen Namen haben sie
aufgrund ihrer Wanderungsgeschwindigkeit
im Verlauf einer zweidimensionalen Auftrennung erhalten. Nach heutigem Kenntnisstand sind Mitglieder der hochkonservierten 14-3-3 Proteinfamilie ubiquitär unter Eukaryoten verbreitet und sie gelten als
multifunktionelle Regulatoren zellulärer
Signalprozesse; ihre regulatorische Funktionen üben sie über direkte Proteininteraktionen aus [13]. 14-3-3 Homologe selbst bilden Homo- oder Heterodimere mit einer
klammerartigen Struktur aus [14]; jedes Monomer verfügt dabei über eine amphipathische Grube, die eine Bindung an Zielpeptide ermöglicht. Die Interaktion von 14-3-3
Proteinen mit ihren Zielproteinen setzt i.a.
die Phosphorylierung eines Serinrestes innerhalb eines spezifischen Sequenzmotives
voraus. Die entsprechenden Proteine werden als Folge der 14-3-3 Bindung in ihrer Aktivität moduliert, bezüglich ihrer intrazellulären Lokalisation beeinflusst oder auf-
grund der Adaptorfunktion der 14-3-3 Dimere in räumliche Nähe eines weiteren Proteins gebracht [13].
Die detaillierten Untersuchungen zur Interaktion von 14-3-3 Homologen mit der H+ATPase haben deutlich machen können,
dass 14-3-3 Proteine direkt an den C-Terminus der pflanzlichen H+-Pumpe binden
und so seine autoinhibitorische Funktion unterbinden [15, 16, 17]. Unter physiologischen
Bedingungen wird die Aktivität der H+ATPase über eine Veränderung ihres Phosphorylierungsstatus reguliert. Erfolgt eine
Phosphorylierung des Threoninrestes im extrem C-terminalen Tripeptid YTV [18, 19, 20]
durch eine bislang unbekannte Kinase
(YpTV), so wird das Gleichgewicht zwischen
dem 14-3-3 komplexierten Enzym und den
Einzelkomponenten in Richtung des Komplexes verschoben (Abb. 4). Cytoplasmatische 14-3-3 Proteine bewirken durch ihre
Assoziation an die C-terminale Domäne der
H+-ATPase eine Konformationsänderung
dieses intramolekularen Regulators und bedingen so eine Aktivierung des Enzyms. FC
bindet an den ausgebildeten Komplex, der
das funktionelle FCBP repräsentiert, und
kann ihn arretieren. Jedoch scheint FC die
Aktivität der H+-ATPase auch unabhängig
vom Phosphorylierungsstatus beeinflussen
zu können [18, 19] und das Gleichgewicht in
Richtung des Komplexes zu verschieben
(Abb. 4). Interessanterweise weist das im Bereich des C-Terminus der H+-ATPase identifizierte Assoziationssignal für 14-3-3 Proteine (YpTV) keinerlei Ähnlichkeit zu bekannten, charakteristischen 14-3-3 Bindemotiven auf [13]; zudem konnte ein zweites
essentielles Motiv identifiziert werden, das
mit hoher Wahrscheinlichkeit eine amphipathische Helix ausbildet [21]. Die Möglichkeit der Bindung eines solchen Sekundärstrukturelements wurde bereits im Rahmen
der Strukturaufklärung eines tierischen
14-3-3 Dimers diskutiert [14], bislang jedoch
in keinem Fall gezeigt. So ist vorstellbar, dass
jedes 14-3-3 Monomer eins dieser Motive in
seiner amphipathischen Grube bindet und,
dass ausschließlich diese Art der bivalenten
Interaktion eine Konformationsänderung der
autoinhibitorischen Domäne der H+-ATPase
bewirkt.
Zukünftig sollte insbesondere analysiert
werden, welche Umwelteinflüsse zu einer
phosphorylierungsabhängigen Bindung von
14-3-3 Proteinen und dementsprechend zu
einer Aktivierung der H+-ATPase führen. So
haben aktuelle Untersuchungen bereits zeigen können, dass die durch Blaulicht induzierte Stimulation der Protonenpumpe, die
für die Öffnung der Stomata von Bedeutung
ist, über 14-3-3 Proteine vermittelt wird [22].
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Abb. 3: Strukturformel und Wirkung des „Welketoxins“ Fusicoccin. Im Hintergund ist die Epidermis der
Blattunterseite von Commelina communis gezeigt; die Stomata sind infolge einer FC-Behandlung
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BIOspektrum · 1/02 · 8. Jahrgang
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Abb. 4: Modell zur Interaktion von 14-3-3 Proteinen mit der autoinhibitorischen Domäne der H+ATPase der pflanzlichen Plasmamembran sowie der Wirkungsweise des Phytotoxins Fusicoccin.
T bezeichnet die Aminosäure Threonin im hochkonservierten Tripeptid YTV der H+-ATPase, pT die
entsprechende Aminosäure in phosphorylierter Form. Nähere Erläuterungen sind dem Text zu
entnehmen
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Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Claudia Oecking
Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen
Universität Tübingen
Auf der Morgenstelle 5
D-72076 Tübingen
Tel.: (07071) 29 76679
eMail: [email protected]
of the fusicoccin-binding 14-3-3 homologs of Commelina
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Claudia Oecking
geboren 1963, Studium
der Biologie an der
Ruhr-Universität
Bochum, Promotion
1993 bei Prof. Dr. E. W.
Weiler (Lehrstuhl für
Pflanzenphysiologie),
1999 Arbeitsaufenthalt
an der Université Catholique de Louvain, Belgien, 2001 Habilitation für
das Fachgebiet Botanik,
seit 2001 Professorin
für Molekularbiologie
der Pflanzen am ZMBP
der Universität
Tübingen.
BIOspektrum · 1/02 · 8. Jahrgang