b) MUSTER FÜR EIN NEU BEANTRAGTES TEILPROJEKT
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FECHNER TP A5N Allgemeine Angaben zum Teilprojekt A5N Titel: Bedeutung der Parvovirus B19 (B19)-Rezeptoren und der B19-Latenz in der Pathogenese der kardioendothelialen B19-Infektion Relevance of Parvovirus B19 (B19) Receptors and B19 Latency in the Pathogenesis of Cardioendothelial B19 Infections Fachgebiete und Arbeitsrichtung: Innere Medizin, Virologie Leiter/in: DR. MED. VET. H E N RY F E C H N E R , *23.06.1965 Medizinische Klinik II - Kardiologie und Pulmologie, Charité Centrum 11 für Herz-, Kreislauf- und Gefäßmedizin, Campus Benjamin Franklin, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Hindenburgdamm 30, 12200 Berlin Telefon: 030 - 8445 - 4527 Telefax: 030 - 8445 - 4582 E-Mail: [email protected] Zusammenfassung Parvovirus B19 (B19) ist ein kardio-endotheliotropes Virus, welches mit dem Krankheitsbild der inflammatorischen dilatativen Kardiomyopathie (DCMi) und endothelialer Dysfunktion assoziiert ist. Ziel des Projekts ist es, durch Analyse der einzelnen Schritte des B19Replikationszyklus in endothelialen Zellen und der Untersuchung möglicher viraler Ko-Faktoren den Infektionsverlauf und die Pathomechanismen der B19-Infektion des Herzens besser zu verstehen. Im Detail sollen dazu B19-Rezeptor abhängige- und unabhängige B19Aufnahmemechanismen sowie die Post-Entry-Replikationsschritte analysiert werden. Zusätzlich soll ermittelt werden, ob Adenoviren, die im Zusammenhang mit kardialen B19-Infektionen detektiert wurden, die endotheliale B19-Infektion aktivieren können. Weiterführende Zusammenfassung Parvovirus B19 (B19) gilt als Erreger einer Reihe von Erkrankungen des Menschen, wie Ringelröteln, aplastische Anämien, Hydrops fetalis und Polyarthritiden. Neben diesen seit langem bekannten Infektionsverläufen haben Untersuchungen der letzten Jahre gezeigt, dass B19 ein kardiotropes Virus ist und im Herzen akute Myokarditiden mit zum Teil fatalen Folgen auslösen kann. Aber auch chronische Verläufe mit dem Bild einer inflammatorischen Kardiomyopathie (DCMi) mit endothelialer Dysfunktion können mit einer B19-Infektion assoziiert sein. Die primäre Zielzelle des B19 im Myokard ist die Endothelzelle der kleinen Gefäße der Endstrombahn, wobei bisher über die endothelialen B19-Infektionswege, insbesondere über Rezeptor-abhängige und mögliche Rezeptor-unabhängige Aufnahme- TP A5N FECHNER mechanismen wenig bekannt ist. Im Herzen von chronisch mit B19 infizierten DCMi-Patienten kann B19-DNA über Monate, möglicherweise Jahre nachgewiesen werden, ohne dass bisher der Nachweis einer B19-Replikation oder der Expression von B19-Genen geführt werden konnte. Die Ursachen dieser Persistenz bzw. Latenz von B19 im Herzen sind insgesamt wenig verstanden. Ebenso ist nicht bekannt, ob und durch welche Faktoren die Latenz überwunden werden kann. Dieses Projekt soll einen Beitrag leisten, um diese Fragen zu beantworten. Projektteil A: Hier sollen Rezeptor-abhängige B19-Aufnahmemechanismen endothelialer Zellen untersucht werden. Dazu wird eine Analyse der endothelialen Expression der B19-Rezeptoren und -KoRezeptoren P-Antigen, α5ß1-Integrin und Ku80-Autoantigen in vitro und in endomyokardialen Herzmuskelbiopsien von Patienten vorgenommen. Diese Daten sollen zusätzlich in Abhängigkeit vom Zellzyklus erhoben und anschließend mit der B19-Aufnahme im Rahmen von Bindungs- und Internalisierungsstudien korreliert werden. Nach Modulation der Rezeptorexpression durch Vektor-vermittelte RNA-Interferenz und cDNA-Überexpression sowie durch die Antikörper-vermittelte Inhibierung der Rezeptorfunktion soll dann die funktionelle Notwendigkeit der B19-Rezeptoren für die endotheliale B19-Infektion ermittelt werden. In Fortführung dieser Experimente soll eine Kartierung der B19 bindenden Proteindomänen des vor kurzem erstmalig beschriebenen B19-Ko-Rezeptors Ku80-Autoantigen vorgenommen und eine mögliche Beteiligung des mit Ku80 heterodimerisierenden Proteins Ku70 an dieser Ko-Rezeptor-Funktion untersucht werden. Projektteil B: Neben der Rezeptor-abhängigen wird in den letzten Jahren verstärkt die Rezeptor-unabhängige, durch B19-Antikörper vermittelte B19-Internalisierung als Aufnahmemechanismus in nichtpermissiven Zellen diskutiert. Dieses als Antibody Dependent Enhancement (ADE) bezeichnete Phänomen soll im Projektteil B näher charakterisiert werden. Dazu werden B19 aus Seren von Patienten mit akuter B19-Infektion und rekombinante B19-Virionen verwendet. Die B19Aufnahme und -Replikation in Endothelzellen wird in Gegenwart und Abwesenheit B19spezifischer Antikörper analysiert. Ziel ist es, herauszufinden, ob ADE als alternativer Infektionsmechanismus bei der endothelialen B19-Infektion eine Rolle spielen kann. Projektteil C: Ziel dieses Projektteils ist es, durch Analyse der Post-Entry-Schritte der B19-Infektion deren unterschiedliche Verlaufsformen in nicht permissiven endothelialen Zellen und permissiven Zellen besser zu verstehen, um daraus Rückschlüsse auf die B19-Persistenz bei kardioendothelialer B19-Infektion zu ziehen. Dazu werden Untersuchungen zur Freisetzung der viralen Kapside aus den Endosomen, ihres Transport zum und in den Nukleus, der Freisetzung des einzelsträngigen viralen Genoms (Uncoating) bis hin zur Bildung eines Transkriptionskompetenten DNA-Doppelstranges durchgeführt. FECHNER TP A5N Projektteil D: Exogene Faktoren, wie die Ko-Infektion mit anderen Viren, können zur Aktivierung latenter viraler Infektionen führen, sowohl auf der Ebene der Genexpression als auch auf der Ebene der Genomreplikation. Adenoviren besitzen einen ausgeprägten Helfereffekt bei der Replikation der helferabhängigen Parvoviren, der Adeno-assoziierten Viren (AAV), und wurden auch zusammen mit B19 im Herzen nachgewiesen. Daher sollen ein möglicher adenoviraler Helfereffekt für B19 und die daran beteiligten adenoviralen und B19-Funktionen einer detaillierten Analyse unterzogen werden. Ausgangssituation des Teilprojekts Stand der Forschung Die Bedeutung der Parvovirus B19-Infektion für die Entstehung kardialer Dysfunktionen Durch molekularbiologische Nachweisverfahren konnte in den letzten Jahren ein umfassendes Bild über das Vorkommen viraler Infektionen im Herzen erstellt werden. Dabei zeigte sich, dass neben den schon länger als Auslöser einer inflammatorischen dilatativen Kardiomyopathie (DCMi) bekannten Enteroviren auch Infektionen mit Adenoviren, verschiedenen Herpesviren, humanem Immundefizienzvirus (HIV), Influenzaviren, Mumpsvirus, Rötelnvirus, Hepatitis-CVirus (HCV) und vor allem mit Parvovirus B19 (B19) mit dieser Erkrankung assoziiert sein können. In einer größeren Studie mit 3.219 Patienten mit klinisch vermuteter Myokarditis und DCM wurde bei fast der Hälfte der Patienten Virus-DNA in Myokardbiopsien nachgewiesen (1), wobei der mit Abstand höchste Prozentsatz (36,7 %) auf B19 entfiel. B19 kann im Rahmen einer akuten B19-Infektion akute Myokarditiden induzieren (2) und stellt auch in aktuellen Untersuchungen das am häufigsten nachgewiesene kardiotrope Virus bei der DCMi dar (3). Allerdings kann der Nachweis von B19 im Herzen mittels molekularbiologischer Nachweisverfahren nicht per se als Beweis für die Ätiologie und pathogenetische Beteiligung der B19-Virusinfektion am Krankheitsgeschehen herangezogen werden. Insbesondere für chronische Verlaufsformen mit Viruspersistenz ist noch weitgehend ungeklärt, welche Bedeutung das Virus in der Pathogenese spielt. Dies wird auch dadurch unterstrichen, dass bei einem Großteil (bis zu 40 %) der Patienten mit positivem Virusbefund eine entzündliche Begleitaktivität fehlt, somit also eine latente Viruspersistenz ohne nachweisbare pathogenetische Auswirkungen vorliegt. Parvovirus B19-Infektionen des Herzens Erste konkrete Hinweise für eine mögliche ätio-pathogenetische Bedeutung einer B19-Infektion für die Entwicklung einer kardialen Dysfunktion ergaben sich aus in situ-Hybridisierungsstudien (4). Bei der akuten B19-Infektion der Herzens wiesen insbesondere Endothelzellen der kleinen intramyokardialen Arteriolen und postkapilläre Venolen und Venen eine hohe Viruslast auf. Infolge dieser Infektion wurde eine ausgeprägte Inflammation beobachtet, die mit massiver Infiltration des Herzmuskels mit CD3-positiven T-Lymphozyten und aktivierten Makrophagen einherging. Im Zuge dieser Infektion wurden nekrotische Veränderungen an den Myozyten beobachtet. Offensichtlich handelte es sich dabei um direkte Folgeerscheinung einer durch die Endothelschädigung induzierten koronaren Mikrozirkulationsstörung. Bei der DCMi mit B19Nachweis persistiert das Virus in den Endothelien der Kapillaren, und die Inflammation des TP A5N FECHNER Herzens stellt sich vornehmlich als makrophagenreiche Entzündungsreaktion dar (4). Diese Daten belegen, dass B19 einen ausgeprägten Tropismus zu Endothelzellen der Endstrombahn hat, und legen die Vermutung nahe, dass die klinische Symptomatik bei Patienten mit kardialer B19-Infektion eine Folge der B19-Infektion des kardialen Endothels ist. Endothelien haben eine wichtige physiologische Funktion als Barriere und sind wesentlich an der Regulation des transvasalen Flüssigkeitstransportes beteiligt. Eine endotheliale Virusinfektion kann über eine Aktivierung von Interferon-abhängigen Signalkaskaden (JAK/STAT- und Map-Kinase-Signalweg) und reaktiver Infiltration des Gewebes mit Leukozyten unter Beteiligung von Selektinen, Integrinen und Adhäsionsmolekülen (5) zu einer Dysfunktion des Endothels und letztendlich zu einem Zusammenbruch der Endothelbarriere führen (6). Für die B19-Infektion des Herzens wird ein solcher Zusammenhang vermutet. B19-Virusreplikation und Zelltropismus B19 gehört zur Gruppe der Erythroviren innerhalb der Familie der Parvoviridae. Es ist ein kleines (18-22 nm), nicht umhülltes Virus mit einem ikosaedrischen Kapsid, welches ein einzelsträngiges DNA-Molekül von 5.7 kb mit positiver oder negativer Polarität umschließt. Das Genom von B19 umfasst 2 offene Leserahmen für die Nichtstruktur- (NS) und Strukturproteine (VP), die von 5’ und 3’ lokalisierten Invertierten Terminalen Wiederholungen (ITRs) begrenzt werden (7). Unmittelbar an die linke ITR schließt sich der einzige B19-Promotor an, der auf Grund seiner Genomposition als P6 bezeichnet wird und die Transkription von neun alternativ gespleißten und teilweise überlappenden mRNAs initiiert. Neben einer Reihe von kleineren Proteinen mit noch unbekannter Funktion werden von diesen Transkripten das NichtStrukturprotein 1 (NS1) und die beiden Kapsidproteine VP1 und VP2 translatiert. NS1 transaktiviert die B19-Genexpression und ist essentiell für die Replikation des B19-Genoms. Es induziert eine Caspase-3-abhängige Apoptose verbunden mit einer erhöhten Produktion von Interleukin-6 (8). VP2 bildet 96 % des viralen Kapsids und bindet an das Erythrozyten PAntigen (Globosid, P-Antigen), den zellulären Rezeptor für B19 (9). VP1 unterscheidet sich von VP2 durch 226 zusätzliche Aminosäuren am Amino-terminalen Ende, die auf der Außenseite des Kapsids lokalisiert sind und entscheidende Bedeutung bei der Induktion Virus-neutralisierender Antikörper und damit für die Eliminierung des Virus aus dem Körper haben. Diese Region enthält ein in vielen Parvoviren konserviertes Phospholipase-A2-Motiv, das an der Freisetzung der B19-Virionen in das Zytoplasma beteiligt ist (10). VP2 induziert nur eine ineffiziente Immunantwort. Allerdings können VP2-abgeleitete Peptide kreuz-reaktive Autoantikörper gegen Kreatin, Kollagen und Cardiolipin induzieren und eine entscheidende Rolle bei chronischen B19-Infektionen spielen, bei denen immunpathogenetische Mechanismen im Vordergrund stehen. B19 besitzt einen stark restriktiven Zelltropismus. Der primäre Ort der Virusreplikation ist das Knochenmark. Eine produktive, lytische Infektion findet ausschließlich in erythroiden Vorläuferzellen statt. Daneben konnten Haut- und Synovialfibroblasten sowie Endothelzellen als B19-Zielzellen identifiziert werden, jedoch erfolgt in diesen Zellen nach übereinstimmenden Ergebnissen keine Virusreplikation (1). B19-Rezeptoren und -Ko-Rezeptoren FECHNER TP A5N Die Aufnahme von Viren in die Zielzelle wird durch zelluläre Oberflächenrezeptoren vermittelt. Dieser Prozess vollzieht sich bei vielen Viren in zwei Schritten. In einer ersten Phase adsorbiert das Virus an zelluläre Attachment-Rezeptoren, in einer zweiten erfolgt dann die Internalisierung durch Ko-Rezeptoren. Inzwischen wurde für viele Viren gezeigt, dass für unterschiedliche Zielzellen auch Zelltyp-spezifische Ko-Rezeptoren an der Internalisierung beteiligt sein können. Als ursprünglicher Rezeptor für B19 wurde das Erythrozyten-P-Antigen, bei dem es sich um ein neutrales Glykolipid handelt, identifiziert. Es wird hauptsächlich auf erythroiden Vorläuferzellen und roten Blutzellen, den hauptsächlichen Zielzellen von B19, aber auch auf Megakaryozyten und Endothelzellen gefunden (9). Patienten mit erblicher P-Antigen-Defizienz sind resistent gegen eine B19-Infektion. Daneben kann P-Antigen in der Plazenta und im fetalen Myokardium gefunden werden. Nachdem P-Antigen über lange Zeit als einziger B19-Rezeptor angesehen wurde, zeigten Untersuchungen der letzten Jahre, dass P-Antigen lediglich die Bindung von B19 an die Zelloberfläche vermittelt, während die Internalisierung, ähnlich wie bei anderen Viren, durch Ko-Rezeptoren erfolgt. Als erster Ko-Rezeptor für B19 wurde α5β1-Integrin identifiziert (11). So waren ausgereifte Erythrozyten, die eine hohe Expression des P-Antigens, aber kein α5ß1-Integrin auf ihrer Oberfläche aufwiesen, zwar in der Lage, B19 zu binden, jedoch erfolgte keine Aufnahme der Viruspartikel. Hingegen kommt es in primären humanen erythroiden Vorläuferzellen, die zusätzlich zum P-Antigen noch funktionelles α5ß1-Integrin exprimieren, zu einer effizienten Internalisierung von B19. α5ß1-Integrin wird in einer Reihe von Zelltypen exprimiert, darunter auch in endothelialen Zellen, in denen es als Rezeptor für Fibrinogen fungiert. Untersuchungen hinsichtlich einer möglichen Ko-Rezeptor-Funktion für B19 in Endothelzellen stehen bisher aber noch aus. Neben dem α5ß1-Integrin wurde mit dem Ku80-Autoantigen ein weiterer potentieller B19-KoRezeptor identifiziert (12). Ku80 ist Bestandteil eines als Ku bezeichneten heterodimerischen Proteinkomplexes mit Ku70 als Bindungspartner. Während Ku lange Zeit als ausschließlich zellkernassoziiertes Protein mit zentralen Funktionen bei DNA-Reparaturprozessen, der Erhaltung der Telomer-Länge und der Apoptose betrachtet worden war (13), konnte es in den letzten Jahren auch im Zytoplasma und in der Zellmembran von verschiedenen Zelltypen nachgewiesen werden. Die unterschiedlichen Befunde bezüglich seiner subzellulären Lokalisation scheinen dabei aus der Verwendung unterschiedlicher Zelltypen und Spezies mit unterschiedlichen Zellzyklusphasen, Differenzierungs- und Aktivierungszuständen sowie der unterschiedlichen Sensitivität der verwendeten Nachweismethoden zu resultieren. Ku80 wurde auch in der Zellmembran von B19-sensitiven Blutvorläuferzellen des Knochenmarks in vivo nachgewiesen. Inzwischen konnte gezeigt werden, dass Ku70 und Ku80 an Zell-ZellInteraktionen beteiligt sind. So fungiert Ku80 als Adhäsionsrezeptor für Fibronectin und TypIVKollagen und nimmt durch Interaktion mit der Metalloproteinase 9 (MMP-9) an der Zellmembran auch an der Regulation des „Remodeling“ der extrazellulären Matrix teil. Obwohl davon ausgegangen wird, dass Ku70 und Ku80 in der Regel als Heterodimere vorliegen, ist nicht klar, ob ihre Funktionen generell an die Heterodimerisierung gebunden sind. Ein Hinweis auf differentielle Funktionen von Ku70 und Ku80 ergibt sich durch die Beobachtung, dass Ku80 unabhängig von Ku70 in den Zellkern transportiert werden kann. Die Heterodimerisierung scheint jedoch wesentlich zur Stabilisierung beider Ku-Untereinheiten beizutragen. Ku70 und Ku80 werden in vielen Organen, wie Herz, Lunge, Leber, Niere und TP A5N FECHNER Gehirn exprimiert, wobei das Expressionsmuster zwischen Maus und Mensch relativ einheitlich ist. Bei der Identifizierung von Ku80 als neuem B19-Ko-Rezeptor konnte zusätzlich zu einer direkten Bindung von B19 an Ku80 Antigen auf der Zelloberfläche gezeigt werden, dass HeLaZellen, die zwar P-Antigen und α5ß1-Integrin, aber kein Ku80 auf der Zelloberfläche besitzen, durch die Expression von rekombinantem Ku80 in der Lage sind, B19 effektiv zu internalisieren (12). Im Gegenzug kann durch eine Reduktion der Ku80-Expression in B19-permissiven KU812Ep6-Zellen die Aufnahme von B19 inhibiert werden. Offensichtlich ist also die Expression aller drei B19-Rezeptoren bzw. -Ko-Rezeptoren (P-Antigen, α5ß1-Integrin und Ku80) eine entscheidende Voraussetzung für eine effiziente B19-Aufnahme. Inwieweit sich diese Erkenntnisse auch auf andere Zellen, wie z. B. Endothelzellen, übertragen lassen, ist allerdings offen. Interessanterweise konnte bei Patienten mit einer symptomatischen B19Infektion ein „Single-Nukleotid“-Polymorphismus (SNP) im Ku80-Gen nachgewiesen werden (14). Antikörper-abhängige Verstärkung (ADE) der Virusreplikation Eine Antikörper-abhängige Verstärkung (ADE) der viralen Replikation wurde erstmalig für Flaviviren beschrieben und in der Folge bei einer Reihe von anderen Viren, wie den Influenzaviren, HIV-1, dem Tollwutvirus und auch bei einem Vertreter der Parvoviren, dem AMDV (Aleutian mink disease parvovirus) in vitro und in vivo nachgewiesen. Beim Denguevirus, einem humanpathogenen Vertreter der Flaviviren, spielt ADE nach dem bisherigen Erkenntnisstand eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese des Dengue Schock Syndroms (DSS) und muss als mögliche Komplikation bei der Entwicklung einer wirksamen Vakzine Berücksichtigung finden. ADE wird bei Virusinfektionen primär durch die Wechselwirkung des Fc-Anteils von virusspezifischen Antikörpern der IgG-Klasse mit Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche von Makrophagen vermittelt und führt zu einer verstärkten Internalisierung der Antikörper-komplexierten Viren. Kürzlich konnte ADE erstmals für das Parvovirus B19 in der Monozyten-Zelllinie U937 nach Gabe von gereinigten IgG-Fraktionen aus B19-Antikörperpositiven Patienten nachgewiesen werden (15). Fcγ-Rezeptoren werden auch auf einer Reihe von endothelialen Zellen exprimiert, und Fcγ-Rezeptoren der Klasse IIa auf Kardiomyozyten sind möglicherweise an der Vermittlung der negativ-inotropen Effekte von Autoantikörpern bei der Pathogenese der dilativen Kardiomyopathie (DCM) beteiligt (16). Diese Befunde eröffnen die Möglichkeit, dass B19 nicht nur spezifisch über die bereits beschriebenen Rezeptoren und KoRezeptoren in endotheliale Zellen des Myokards aufgenommen wird, sondern nach Bildung von B19-Antikörpern im Verlauf der Infektion auch unspezifisch internalisiert werden kann. Post-Entry-Schritte der viralen Replikation Wie bei anderen Parvoviren umfasst der produktive Vermehrungszyklus von B19 im Anschluss an die primäre Adsorption an die Zielzelle und die darauf folgende Aufnahme eine ganze Reihe von weiteren Schritten. Dazu gehören die Freisetzung des Kapsids aus den Endosomen in das Zytosol, die Translokation des Genoms an die Kernporen und in den Zellkern, die Konvertierung zum DNA-Doppelstrang, die Transkription und die Replikation des viralen Genoms, die Assemblierung des Kapsids und die damit assoziierte Enkapsidierung des Genoms sowie FECHNER TP A5N schließlich die Freisetzung der reifen Viruspartikel durch Lyse der infizierten Zelle (7). Da es in nicht-permissiven Zellen zu keiner detektierbaren Replikation des B19-Genoms kommt, wird der ausgeprägte Zelltropismus von B19 möglicherweise nicht nur durch die vorhandenen Rezeptoren und Ko-Rezeptoren, sondern auch durch die nachfolgenden Prozesse bis zur Bildung eines Transkriptions-kompetenten DNA-Doppelstranges determiniert. Alle Parvoviren werden in einem relativ schnellen Schritt durch Rezeptor-vermittelte Endzytose, höchstwahrscheinlich unter Beteiligung von „clathrin-coated pits“, internalisiert. Im Gegensatz dazu ist die folgende Freisetzung aus den späten Endsosomen oder frühen Lysosomen ein langsamer Prozess, der in Kulturzellen mehrere Stunden in Anspruch nehmen kann. Für diesen Schritt ist im Parvovirus des Schweins (PPV) ein im VP1-spezifischen Amino-Terminus der Kapsidproteine lokalisiertes Motiv für eine sekretierte Phospholipase-A2-Aktivität (sPLA2) erforderlich. Eine sPLA2Aktivität wurde auch für die entsprechende Region im VP1 des Parvovirus B19 nachgewiesen. Die B19-VP1-sPLA2-Aktivität kann die Aufnahme von Ca2+ in die Zelle stimulieren und damit möglicherweise zum Pathomechanismus von B19 bei der DCM beitragen (17). Wie Untersuchungen mit dem Caninen Parvovirus (CPV) gezeigt haben, wird der Transport der freigesetzten Kapside zu den Kernporen wahrscheinlich durch Mikrotubuli und das Motorprotein Dynein vermittelt. Die parvoviralen Kapside werden in intakter Form durch den Nukleären Poren Komplex (NPC) in den Zellkern transloziert, wobei es durch Konformationsänderungen des Kapsids zur Exposition von Kernlokalisations-Signalen (NLS) in den VP-Proteinen kommt. An der Translokation des B19-VP2-Kapsidproteins in den Zellkern ist dabei ein basisches Aminosäure-Motiv beteiligt, welches nicht der NLS-Konsensus-Sequenz entspricht. 20 bis 30 Nukleotide des 5’-Endes des viralen Genoms mit einem kovalent gebundenen NS1-Protein werden außerhalb der parvoviralen Kapside exponiert, und die DNA könnte bei ihrer Freisetzung eine Pore an der 5-fach Symmetrieachse der Kapsidstruktur passieren. Sowohl nach Hitzebehandlung als auch nach pH-Änderungen, die der Ansäuerung im Endosom entsprechen (pH 6,5 bis 5,0), kann eine Externalisierung der DNA ohne eine parallele Desintegration der Kapsidstruktur erfolgen. Möglicherweise kann die Initiation der DNA-Replikation und der Zweitstrangsynthese jedoch in Kapsid-assozierter Form erfolgen, da durch partielle Desintegration des Kapsids auch das 3’-Ende des Genoms außerhalb des Kapsids exponiert werden kann. Während die Zweitstrang-Synthese bei den helferabhängigen Adeno-assozierten Parvoviren und vor allem bei den davon abgeleiteten rekombinanten Vektoren (rAAVs) einen entscheidenden limitierenden Faktor bei der Genexpression darstellt, ist sie beim Parvovirus B19 bisher nicht systematisch untersucht worden. Literatur 1. Kandolf R. Virus etiology of inflammatory cardiomyopathy. Dtsch Med Wochenschr 2004; 129: 2187-92. 2. Kuhl U, Pauschinger M, Bock T, Klingel K, Schwimmbeck CP, Seeberg B, Krautwurm L, Poller W, Schultheiss HP, Kandolf R. Parvovirus B19 infection mimicking acute myocardial infarction. Circulation 2003; 108: 945-50. 3. Kuhl U, Pauschinger M, Noutsias M, Seeberg B, Bock T, Lassner D, Poller W, Kandolf R, Schultheiss HP. High prevalence of viral genomes and multiple viral infections in the myocardium of adults with "idiopathic" left ventricular dysfunction. Circulation 2005; 111: 887-93. 4. Klingel K, Sauter M, Bock CT, Szalay G, Schnorr JJ, Kandolf R. Molecular pathology of inflammatory cardiomyopathy. Med Microbiol Immunol 2004; 193: 101-7. TP A5N FECHNER 5. Keller TT, Mairuhu AT, de Kruif MD, Klein SK, Gerdes VE, ten Cate H, Brandjes DP, Levi M, van Gorp EC. Infections and endothelial cells. Cardiovasc Res 2003; 60: 40-8. 6. Peters K, Unger RE, Brunner J, Kirkpatrick CJ. Molecular basis of endothelial dysfunction in sepsis. Cardiovasc Res 2003; 60: 49-57. 7. Heegaard ED, Brown KE. Human parvovirus B19. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 485-505. 8. Moffatt S, Yaegashi N, Tada K, Tanaka N, Sugamura K. Human parvovirus B19 nonstructural (NS1) protein induces apoptosis in erythroid lineage cells. J Virol 1998; 72: 3018-28. 9. Brown KE, Anderson SM, Young NS. Erythrocyte P antigen: cellular receptor for B19 parvovirus. Science 1993; 262: 114-7. 10. Cotmore SF, Tattersall P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv Virus Res 2007; 70183-232. 11. Weigel-Kelley KA, Yoder MC, Srivastava A. Alpha5beta1 integrin as a cellular coreceptor for human parvovirus B19: requirement of functional activation of beta1 integrin for viral entry. Blood 2003; 102: 3927-33. 12. Munakata Y, Saito-Ito T, Kumura-Ishii K, Huang J, Kodera T, Ishii T, Hirabayashi Y, Koyanagi Y, Sasaki T. Ku80 autoantigen as a cellular coreceptor for human parvovirus B19 infection. Blood 2005; 106: 3449-56. 13. Gullo C, Au M, Feng G, Teoh G. The biology of Ku and its potential oncogenic role in cancer. Biochim Biophys Acta 2006; 1765: 223-34. 14. Kerr JR. Pathogenesis of parvovirus B19 infection: host gene variability, and possible means and effects of virus persistence. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2005; 52: 335-9. 15. Munakata Y, Kato I, Saito T, Kodera T, Ishii KK, Sasaki T. Human parvovirus B19 infection of monocytic cell line U937 and antibody-dependent enhancement. Virology 2006; 345: 251-7. 16. Staudt A, Eichler P, Trimpert C, Felix SB, Greinacher A. 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Zusätzlich arbeitet Henry Fechner seit vielen Jahren auf dem Gebiet der Gentherapie; er war mit dieser Thematik als Projektleiter in der ersten SFB/TR 19-Förderungsperiode für das Teilprojekt C5 verantwortlich. Schwerpunkte waren dabei die Entwicklung neuer viraler Vektoren (2), gentherapeutischer Strategien zur Behandlung der Herzinsuffizienz (3) und die Entwicklung von Therapiekonzepten zur Behandlung kardialer Virusinfektionen (4). Hierzu zählen auch gentherapeutische Konzepte unter Verwendung von RNAi-Technologien zur Behandlung der B19Infektion, welche in Zusammenarbeit mit den Teilprojekten B5, C1 und C5 des SFB/Transregio durchgeführt werden. Diese Arbeiten erfolgten teilweise in Kooperation mit dem Ko-Antrags- FECHNER TP A5N steller. Stefan Weger untersucht die Wechselwirkungen des helferabhängigen Parvovirus AAV-2 (Adeno-assoziiertes Virus) mit zellulären Faktoren und die Bedeutung dieser zellulären Faktoren für verschiedene Schritte des viralen Replikationszyklus' (5,7,10,13). Darüber hinaus leitet er die AAV-Vektor-Core-Facility am Institut für Virologie, die hochgereinigte AAV-Vektoren für klinische Fragestellungen und Anwendungen entwickelt und in großem Maßstab produziert. Bedeutung der B19-Rezeptoren und Ko-Rezeptoren für die B19-Infektion endothelialer Zellen Verschiedene Studien der letzten Jahre haben eine Assoziation von kardio-endothelialer B19Infektion mit dem Krankheitsbild der DCMi gezeigt. Obwohl endotheliale Zellen nach allen bisherigen Befunden die Zielzellen der kardialen B19-Infektion darstellen, gelten sie als nicht permissiv für eine produktive B19-Infektion. Auf welcher Ebene jedoch der Replikationsblock in endothelialen Zellen erfolgt und welche Faktoren und Mechanismen daran beteiligt sind (beispielsweise B19-Aufnahme und Post-Entry-Schritte der Virusreplikation), ist bisher nur wenig untersucht. Wir haben für eine initiale Charakterisierung der B19-Infektion endothelialer Zellen in Zusammenarbeit mit dem TP B5 die Endothelzelllinie HMEC-1 mit B19-haltigen Serumproben infiziert und eine Kinetik der B19-mRNA-Expression mittels B19-Real Time RTPCR erstellt. Die Ergebnisse belegen, dass diese Zellen B19 aufnehmen und das B19-Genom nach Freisetzung im Nukleus transkribieren können. Ähnliche Ergebnisse wurden mit HUVEC, einer zweiten endothelialen Zelllinie, erhalten. Um einen möglichen Beitrag der beschriebenen B19-Rezeptoren (P-Antigen) und -Ko-Rezeptoren (Ku80-Autoantigen und α5β–Integrin) für die endotheliale B19-Aufnahme bewerten zu können, wurde deren Expressions- und Verteilungsmuster auf einer Reihe von endothelialen und Kontrollzelllinien untersucht. Mittels Real Time RT-PCR konnte der Nachweis von Ku80- und α5β-Integrin-mRNA in endothelialen HUVEC-, HMEC- und EA.hy926-Zellen geführt werden. Da Ku70 aufgrund einer möglichen Heterodimerisierung mit Ku80 an der Rezeptorfunktion von Ku80 beteiligt sein könnte, wurden dessen mRNA-Expression ebenfalls bestimmt. Die Expressionsmuster der B19-Rezeptoren und Ko-Rezeptoren auf Protein-Ebene sowie deren subzelluläre Verteilung wurden in EA.hy926Zellen analysiert. Dabei handelt es sich um eine Hybridzelllinie aus HUVEC und A549 (Lungenkarzinomzelllinie) mit endothelialen Zelleigenschaften, die im Vergleich zu HUVEC eine größere Stabilität aufweist. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte eine hohe Expression vonα5β-Integrin an der Zellmembran nachgewiesen werden, während Ku80 und Ku70 ausschließlich Zellkern-assoziiert vorlagen. FACS-Analysen an permeabilisierten und nicht-permeabilisierten Zellen bestätigten diese Befunde, zeigten jedoch darüber hinaus, dass sowohl Ku80 als auch Ku70 zusätzlich an der Zellmembran exprimiert werden (Abb. 1). In Übereinstimmung mit publizierten Befunden konnte neben den B19-Ko-Rezeptoren der primäre B19-Rezeptor, P-Antigen, auf endothelialen Zellen nachgewiesen werden. Abb. 1 Nachweis der Expression der B19-Rezeptoren und -Ko-Rezeptoren P-Antigen, α5β-Integrin und Ku80 sowie von Ku70 mittels FACS-Analysen. Die Untersuchungen wurden an nicht-permeabilisierten bzw. permeabilisierten (nur Ku70/Ku80 total) EA.hy926-Zellen durchgeführt. TP A5N FECHNER Um die Notwendigkeit der B19-Rezeptoren und -Ko-Rezeptoren für die Infektion endothelialer Zellen auf der funktionellen Ebene zu analysieren, sollten zunächst adenovirale Vektoren sowohl für eine Inhibition dieser Proteine mittels small hairpin (sh) RNA („knock-out“-Ansatz) als auch mit Expressionskassetten für eine Komplementierung Rezeptor-defizienter Zellen („knock-in“Ansatz) generiert werden. Am weitesten fortgeschritten sind bisher die Arbeiten für den B19Ko-Rezeptor α5β-Integrin. Hier konnte mit einem adenoviralen shRNA-Vektor eine dosis- und zeitabhängige Inhibition der endogenen α5β-Integrin-mRNA-Expression von über 95 % erreicht werden. In Ko-Transfektionen wurde auch bereits die Funktionalität der Shuttle-Plasmide für die Generierung der adenoviralen Vektoren mit den shRNA-Expressionskassetten gegen Ku80 und Ku70 nachgewiesen. Derzeit wird die Produktion der entsprechenden adenoviralen Vektoren und auch der adenoviralen Ku70/Ku80-Überexpressionsvektoren durchgeführt. Da das P-Antigen als neutrales Glykolipid nicht direkt auf Nukleinsäureebene überexprimiert oder inhibiert werden kann, haben wir shRNAs gegen eines des Schlüsselenzyme des P-Antigen-Syntheseweges, die Gb3/77 Synthase, generiert. Gegenwärtig wird dabei die Funktionalität der shRNAExpressionsplasmide untersucht. Post-Entry-Schritte der viralen Replikation Neben der Adsorption und Internalisierung kann eine Reihe weiterer Faktoren den B19Infektionsverlauf in endothelialen Zellen beeinflussen. Post-Entry-Schritte, wie der Transport der Virionen in den Zellkern mit anschließender Freisetzung der parvoviralen DANN, spielen dabei mit Sicherheit eine wichtige Rolle. Beide Antragsteller haben bereits gemeinsam Untersuchungen zu diesen spezifischen Mechanismen der Transduktion endothelialer und kardialer Zellen mit verschiedenen Serotypen des helferabhängigen Parvovirus AAV durchgeführt. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf dem intrazellulären AAV-Infektions-Pathway (1). Es zeigte sich, dass zusätzlich zur AAV-Serotyp-spezifischen Internalisierung des Vektorgenoms die Freisetzung der AAV-DNA im Zellkern (Uncoating) einen der limitierenden Schritte bei der Genexpression in verschiedenen Zelltypen darstellt, während für die Translokation des Viruskapsids in den Zellkern keine signifikanten Unterschiede zwischen den verwendeten Serotypen und Zelllinien gefunden wurden. Diese Untersuchungen wurden mit selbst-komplementären, dimerischen AAV-Vektoren durchgeführt, die für eine effiziente Genexpression nicht auf die Zweitstrangsynthese des einzelsträngigen parvoviralen Genoms angewiesen sind. Die Bedeutung der Zweitstrangsynthese für die B19-Infektion endothelialer Zellen soll im Rahmen des hier dargestellten Projekts mit Hilfe rekombinanter B19-Viren, die alternativ einzelsträngige oder selbst-komplementäre, quasi-doppelsträngige AAV2-Vektor-DNA enthalten, analysiert werden. Da beide Arbeitsgruppen seit längerer Zeit monomerische und dimerische AAV-Vektoren für eine Reihe von therapeutischen Anwendungen entwickeln und in hochgereinigter Form produzieren, ist die für die Generierung rekombinanter B19/AAV-Vektoren notwendige Technologie bereits gut etabliert. Aus der Charakterisierung von Zielstrukturen der AAV Rep Proteine, der funktionellen Homologe des B19-NS1-Proteins, stehen eine Reihe von methodischen Werkzeugen zur Analyse der Post-Entry-Schritte der B19-Virusreplikation zur Verfügung. Ebenfalls bereits etabliert ist eine Real Time PCR zur Quantifizierung der genomischen B19-DNA. FECHNER TP A5N Untersuchung der Interaktion von Adenovirus mit der endothelialen Parvovirus B19Infektion Der Nachweis von B19-Genomen in endomyokardialen Biopsien ohne detektierbare Spiegel an viralen Genprodukten und neu generierten Virionen deutet auf eine latente Virusinfektion hin. Ob und durch welche Faktoren es zu einer Reaktivierung des latenten B19 mit entsprechenden patho-physiologischen Auswirkungen kommen kann, ist bisher nicht bekannt. Exogenen Faktoren, die hier möglicherweise eine wichtige Rolle spielen, sind Superinfektionen mit anderen Viren. Adenoviren wurden bei DCMi-Patienten mit B19-Infektion nachgewiesen und besitzen transaktivierende Eigenschaften. Initiale Experimente in endothelialen Zellen zeigten, dass Adenoviren zu einer signifikanten Steigerung der Expression der B19-Proteine VP1 und VP2 führen (Abb. 2). Welche adenoviralen Gene hierfür verantwortlich sind und mit welchen B19-Genom- bzw. Strukturkomponenten sie dabei interagieren, ist jedoch bisher nicht geklärt. Die beteiligten Komponenten sollen im Rahmen des Projekts im Detail charakterisiert werden. Spezifische Erfahrungen zur Transaktivierung von Promotoren und der TransKomplementierung viraler Replikation durch die adenoviralen E1A-Gene konnten bereits in früheren Studien gesammelt werden (6,8,12). Aus diesen Studien steht ferner eine Reihe von Expressionskonstrukten für die frühen adenoviralen Gene zur Verfügung. Abb. 2 Adenovirus-vermittelte Induktion der B19-Expression in Endothelzellen. EA.hy926-Zellen wurden mit einem infektiösen B19-Genom (Plasmid pB19-M20) transfiziert und mit Adenoviren des Serotyps 5 überinfiziert. Der Nachweis der B19-Strukturproteine VP1 und VP2 erfolgte mittels FACS-Analysen und indirekter Immunofluoreszenz. Liste der publizierten einschlägigen Vorarbeiten Publikationen in wissenschaftlichen Zeitschriften 1. Sipo I, Fechner H, Pinkert S, Suckau L, Wang X, Weger S, Poller W. Differential internalization and nuclear uncoating of self-complementary adeno-associated virus pseudotype vectors as determinants of cardiac cell transduction. Gene Ther 2007; 14: 1319-29. 2. Fechner H, Wang X, Hurtado Pico A, Wildner J, Suckau L, Pinkert S, Sipo I, Weger S, Poller W. A bidirectional Tet-dependent promotor construct regulating the expression of E1A for tight control of oncolytic adenovirus replication. J Biotechnol 2007; 127: 560-74. 3. Fechner H, Suckau L, Kurreck J, Sipo I, Wang X, Pinkert S, Loschen S, Rekittke J, Weger S, Dekkers D, Vetter R, Erdmann VA, Schultheiss HP, Paul M, Lamers J, Poller W. Highly efficient and specific modulation of cardiac calcium homeostasis by adenovector-derived short hairpin RNA targeting phospholamban. Gene Ther 2007; 14: 211-8. 4. Fechner H, Pinkert S, Wang X, Sipo I, Suckau L, Kurreck J, Dorner A, Sollerbrant K, Zeichhardt H, Grunert HP, Vetter R, Schultheiss HP, Poller W. Coxsackievirus B3 and adenovirus infections of cardiac cells are efficiently inhibited by vector-mediated RNA interference targeting their common receptor. Gene Ther 2007; 14: 960-71. 5. Weger S, Hammer E, Gotz A, Heilbronn R. Identification of a cytoplasmic interaction partner of the large regulatory proteins Rep78/Rep68 of adeno-associated virus type 2 (AAV-2). Virology 2007; 362: 192-206. 6. Hurtado Pico A, Wang X, Sipo I, Siemetzki U, Eberle J, Poller W, Fechner H. Viral and nonviral factors causing nonspecific replication of tumor- and tissue-specific promoter-dependent oncolytic adenoviruses. Mol Ther 2005; 11: 563-77. TP A5N FECHNER 7. Weger S, Hammer E, Heilbronn R. SUMO-1 modification regulates the protein stability of the large regulatory protein Rep78 of adeno associated virus type 2 (AAV-2). Virology 2004; 330: 284-94. 8. Fechner H, Wang X, Srour M, Siemetzki U, Seltmann H, Sutter AP, Scherubl H, Zouboulis CC, Schwaab R, Hillen W, Schultheiss HP, Poller W. A novel tetracycline-controlled transactivatortransrepressor system enables external control of oncolytic adenovirus replication. Gene Ther 2003; 10: 1680-90. 9. Fechner H, Noutsias M, Tschoepe C, Hinze K, Wang X, Escher F, Pauschinger M, Dekkers D, Vetter R, Paul M, Lamers J, Schultheiss HP, Poller W. Induction of coxsackievirus-adenovirusreceptor expression during myocardial tissue formation and remodeling: identification of a cell-to-cell contact-dependent regulatory mechanism. Circulation 2003; 107: 876-82. 10. Weger S, Hammer E, Heilbronn R. Topors, a p53 and topoisomerase I binding protein, interacts with the adeno-associated virus (AAV-2) Rep78/68 proteins and enhances AAV-2 gene expression. J Gen Virol 2002; 83: 511-6. 11. Noutsias M, Fechner H, de Jonge H, Wang X, Dekkers D, Houtsmuller AB, Pauschinger M, Bergelson J, Warraich R, Yacoub M, Hetzer R, Lamers J, Schultheiss HP, Poller W. Human coxsackie-adenovirus receptor is colocalized with iIntegrins alpha(v)beta(3) and alpha(v)beta(5) on the cardiomyocyte sarcolemma and upregulated in dilated cardiomyopathy: Implications for cardiotropic viral infections Circulation 2001; 104: 275-280. 12. Fechner H, Wang X, Wang H, Jansen A, Pauschinger M, Scherubl H, Bergelson JM, Schultheiss HP, Poller W. Trans-complementation of vector replication versus Coxsackie-adenovirusreceptor overexpression to improve transgene expression in poorly permissive cancer cells. Gene Ther 2000; 7: 1954-68. 13. Weger S, Wendland M, Kleinschmidt JA, Heilbronn R. The adeno-associated virus type 2 regulatory proteins rep78 and rep68 interact with the transcriptional coactivator PC4. J Virol 1999; 73: 260-9. 14. Fechner H, Haack A, Wang H, Wang X, Eizema K, Pauschinger M, Schoemaker R, Veghel R, Houtsmuller A, Schultheiss HP, Lamers J, Poller W. Expression of coxsackie adenovirus receptor and alphav-integrin does not correlate with adenovector targeting in vivo indicating anatomical vector barriers. Gene Ther 1999; 6: 1520-1535. Ausgewählte Vorträge auf Fachkongressen Pozzuto T, Größl T, Fechner H. Evidence of human Parvovirus B19 receptors on endothelial cells. International Parvovirus Meeting 2007, September 1-4, Bari, Italien Fechner H: Gene therapy for treatment of viral heart diseases - new molecular tools and techniques open new perspectives. ESC Congress, 2007, October 8 - 10, Berlin Weger S, Hammer E, Heilbronn R. Identification of a novel cytoplasmic protein that interacts with the large regulatory proteins Rep78/Rep68 of adeno-associated virus type 2 (AAV-2). XIth Parvovirus Workshop, Les Diablerets, Schweiz, 2006, August 27 -31 Weger S, Westphal J., Hammer E., Heilbronn R. Regulation of AAV gene expression and DNA replication by the transcriptional coactivator PC4. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2006, München, Deutschland, März 15-18 Fechner H: Onkolytische Adenoviren in der Tumorgentherapie Berliner Gentherapie-Seminar, Januar 12, 2005, Berlin Fechner H: Neue Ansatzpunkte antiviraler Therapie bei der DCMi SFB TR Workshop 2004: Kardiomyopathie, August 21-22, Berlin Fechner H: Pharmacological regulated oncolytic adenoviruses. Jährliche Tagung der Deutschen Gesellschaft für Virologie 2004, June 30 – Juli 3, Frankfurt FECHNER TP A5N Weger S, Hammer E, Hüser D, Heilbronn R. Covalent modification of the large Rep proteins of AAV-2 by the small ubiquitin like modifier (SUMO). Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2003, Berlin, Deutschland, März 26-28 Weger S, Hammer E, Heilbronn R. Covalent modification of the large Rep proteins of AAV-2 by the small ubiquitin like modifier (SUMO). IXth Parvovirus Workshop, Bologna, Italien, 2002, August 28 – 31 Ziele des Teilprojekts Während die kardiotropen Enteroviren überwiegend Myozyten infizieren, sind die primären Zielzellen der akuten B19-Infektion Endothelzellen der kleinen intramyokardialen Arteriolen sowie postkapilläre Venolen und Venen. Auch bei einem Nachweis von persistierendem B19 bei der DCMi findet man das Virus vornehmlich in den Endothelien der Kapillaren. Obwohl Endothelzellen den primären B19-Rezeptor, das Erythrozyten-P-Antigen, auf ihrer Oberfläche exprimieren, findet in diesen Zellen nach übereinstimmenden Befunden keine produktive Virusreplikation statt. Eines der Hauptziele des Projektes ist es daher, in Endothelzellen und in permissiven erythroiden Vorläuferzellen einen detaillierten Vergleich der Virusaufnahme sowie der nachfolgenden Schritte des B19-Replikationzyklus' bis zur Bildung eines transkriptionskompetenten DNA-Doppelstranges im Nukleus durchzuführen. Die so erhaltenen Aufschlüsse über prinzipielle Mechanismen der kardialen B19-Infektion sollten zu einem besseren Verständnis der abortiven B19-Infektion und der damit verbundenen Etablierung eines latenten Zustandes des B19-Genoms in Endothelzellen führen. Untersuchungen zur Reaktivierung von B19 bzw. die Induktion einzelner B19-Genprodukte im latenten Zustand durch eine Überinfektion mit den kardiotropen Adenoviren sollen einen weiteren Schwerpunkt des Projekts bilden.
