Mobile Genetische Elemente / Transposition

Mobile Genetische Elemente / Transposition
Transposition
Retrotransposition / Retroviren
repetitive Elemente
mobile Elemente und Genomevolution / -regulation
Gentherapie
Berit Jungnickel
Institut für Klinische Molekularbiologie und Tumorgenetik
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit München
[email protected]
cut-paste
Transposons:
Insertion sequences
Transposons
nicht-virale Superfamilie
virale Superfamilie
Retroviren:
endogene Retroviren
Retroviren
Eukaryonten
einige Phagen
Retrotransposons:
copy-paste
Prokaryonten
Typen mobiler genetischer Elemente
Transposition
2 Transpositionsmechanismen
Conservative Transposition:
Replikative Transposition:
Ausschneiden, woanders einfügen
an andere Stelle „kopieren“
Konservative Transposition
Ausschneiden des Transposons erfolgt korrekt durch Transposase
„Donor“-Chromosom muss durch Wirtsenzyme repariert werden
Insertion in Zielsequenz: versetzte Schnittstellen werden eingeführt
Dadurch Duplikation der Zielsequenz an Flanken des Transposons
Durch Doppelstrangbrüche sind Rearrangements / Deletionen möglich
(Konservative und) Replikative Transposition
Mobile genetische Elemente (Bakterien)
Insertion Sequences
ITR:
Transposase:
Inverted terminal repeats
Erkennungssequenz zum Ausschneiden
Enzym zum Ausschneiden des Transposons
und zum Einsetzen in beliebige Zielsequenz
Composite Transposons
2 IS-Elemente können DNA,
die zwischen ihnen liegt,
„mobilisieren“:
Transposition anderer Gene
R-Plasmide:
vermitteln multiple
Antibiotikaresistenz
Problem in der
Klinik
Beispiel: TnA-Familie (Bakterien)
TnA-Transposons können
NUR replikative Transposition
Resolvase für Auflösung des
Cointegrates erforderlich
Resolvase führt zur
Rekombination von res
- sites in den direct
repeats von Tn3
Eukaryonten: Controlling elements (Mais)
Barbara McClintock (1950s):
bestimmte genetische Faktoren bewirken hohes Maß an ChromosomenBrüchen in den genetischen Loci wo sie auftreten
Ds (dissociation) - cytologisch detektierbar oder auch durch Ausprägung
rezessiver Eigenschaften
Ds Aktivierung ist abhängig von weiterem nicht-gekoppelten Gen (Ac activator) das sich auch nicht auf einen bestimmten Lokus mappen lässt...
1983 Nobelpreis für Medizin für die Entdeckung von „jumping genes“
Controlling elements (Mais)
Autonom:
normale Transposons
inverted repeats an den Enden
unterschiedliche Länge und Kodierungskapazität
Nicht-Autonom: ähneln autonomen, aber mit internen Deletionen
braucht autonomes Element der Familie für Aktivierung
P elements (Drosophila)
Transposase-Gene mit Introns
0.5-2.9 Kb Größe
aber immer perfekter 31 bp inverted repeat an Termini
Transposase mRNA wird nur in Keimzellen korrekt gespleißt nur dort ist Transposase-Aktivität vorhanden
P element braucht Transposase für Transposition diese kann aber auch von einem anderen P Element kommen
Transposition wird von einem (P-Element kodierten?) Repressor gehemmt
Gentransfer/identifikation über P elements
Kombination eines PElements mit einem
inserierten Gen und eines
intakten P elements führt
zur Insertion von
Fremdgenen in die
Keimbahn:
...transgene Fliege...
Transposon-tagging:
zufällige Insertion von Transposons
führt zu verschiedenen Phänotypen
verantwortliches Gen kann bei bekannter
Transposonsequenz identifiziert werden
Rekombination durch Transposons
Retrotransposition
Retrotransposition
Transposition über RNA-Intermediat / reverse Transkription
d.h. Retrotransposon
verbleibt in der DNA
partielle Excision
durch Rekombination der
LTRs ist aber möglich
„Life cycle“: bei
Retroviren vom Virus
aus gesehen (RNA) bei
Retro(trans)posons von
integrierter DNA aus...
Retroelemente
Retroviraler Lebenszyklus
provirus
Reverse Transkription
U3
R
U5
U3
R
U5
AAA
tRNA dient als Primer
AAA
Verlängerung in linke LTR
AAA
Degradation der Hybrid-RNA
AAA
Template switch zu rechter
LTR
AAA
Verlängerung
Meiste RNA wird entfernt
Verlängerung des 2. Strangs
Template switch zu linker LTR
Kompletierung
Integration
Transkription des viralen Genoms
„linke“ LTR-Sequenz initiiert Transkription
LTR-Sequenzen enthalten Promotor / Enhancer
„rechte“ LTR-Sequenz dient als polyA-Signal
retrovirale Vektoren für starke Expression anderer Gene!
Retrotransposons
fakultativ
oder nicht
Retrotransposons
Retrovirus-like Retrotransposons:
alles wie bei Retroviren
aber keine Verpackung in Hülle
= virale Superfamilie
nicht-retrovirale Retrotransposons:
keine LTRs, d.h. Unterschiede bei
reverser Transkription/Integration
= nicht-virale Superfamilie
Ty-Elemente (Hefe)
virale Superfamilie
Ty-Transposition geht über
RNA-Intermediat, da:
Erhöhung der Transkription
über Gal-Promotor auch die
Transposition erhöht, und da
alle transponierten Ty-Elemente
kein Intron mehr haben... =
klassischer Retrotranspositionsassay
LINE-Elemente (Mensch)
nicht-virale Superfamilie
LINE = long interspersed nuclear elements
Viele Kopien im menschlichen Genom,
viele davon sind defekt, manche können noch transponieren
v.a. in nicht-kodierenden Regionen (z.B. in Introns)
Reverse Transkription / Integration von LINE-Elementen
„processed pseudogenes“
gespleißte mRNAs sind revers transkribiert worden und wurden durch
einen ähnlichen Mechanismus wie LINE Elemente ins Genom inseriert
SINE Elemente: Alu-repeats (Mensch)
nicht-virale Superfamilie
Alu-repeats sind häufigstes repetitives Element im menschlichen Genom
(ca. alle 3000 bp), stammen von 7SL-RNA (SRP) ab und sind imperfekte
Tandem-Duplikate, manche Alu-Elemente werden noch aktiv transkribiert,
d.h. sie könnten sich noch weiter vermehren...
Alu-repeats sind Rekombinations-Hotspots und können zu Deletionen oder
Rearrangements führen - entsprechende Krankheiten sind bekannt
Genomevolution durch repetitive Elemente
Grün: Alu
Blau: B1
Rot: L1 (LINE)
Gelb: L1
repetitive Elemente haben sich aus
gemeinsamen Vorläufern entwickelt
(7SL RNA von SRP im Falle von Alu / B1)
und haben sich relativ spät vermehrt
Genomregulation durch repetitive Elemente
Aktivierung:
Retrotransposons werden vor allem in Eizellen / Embryos exprimiert
dabei werden Fusionstranskripte von Transposon und mRNAs gebildet
der originalen mRNA entsprechende oder aber neue Funktion
...Regulation der Embryonalentwicklung durch Retrotransposons...?
Genomregulation durch repetitive Elemente
Suppression:
LTRs können Transkription des
Retrotransposons in BEIDE
Richtungen bewirken
es entstehen doppel-strängige
RNAs und über den RNAInterferenzweg siRNAs
siRNAs vermitteln an homologer
DNA die Assemblierung von
Heterochromatin
...Regulation der
Chromatinstruktur durch
Retrotransposons...?
Gentherapie
Virale Vektoren für die Gentherapie
Oncoretrovirale Vektoren (z.B. Murines Leukämie Virus, MLV):
-integrierend, daher stabile Expression des Transgens
-bevorzugte Integration in/um Promoter
-LTRs, daher Gefahr der Aktivierung zellulärer Gene (sh. Therapie von SCID-X1)
-nur für sich teilende Zellen
Adenovirale Vektoren:
-episomal, daher transiente Expression des Transgens
-auch für nicht-teilende Zellen
-Gefahr der Immunantwort (sh. Fall Jesse Gelsinger)
Adeno-assoziierte Vektoren (AAV)
-nicht-autonom, kleines ss-DNA-Genom
-meist episomal, in <10% integrierend (passiv, an DSB-Orten
im Zuge von NHEJ)
Lentivirale Vektoren:
-integrierend, daher stabile Expression des Transgens
-bevorzugte Integration innerhalb transkribierter Regionen
-LTRs, aber Gefahr der Aktivierung zellulärer Gene geringer
als bei oncoretroviralen Vektoren
-auch nicht-teilende Zellen
Thomas, Nature Rev Genet 4:346-358,2003
Leukämie nach Gentherapie von SCID-X1
•SCID-X1: γc-Kette der Zytokin-Rezeptoren defekt, daher keine Entwicklung
von B, T und NK Zellen; Hauptform von SCID in Mensch,
ca. 1/80000 Geburten
•ex vivo-Strategie: Transduktion von autologen hämatopoietischen Stammzellen
mit Vektor (basierend auf MLV) und Re-Infusion
•9 von 10 Kindern in klinischen Versuch zeigten deutliche Verbesserung des
Immunsystems
•aber: nach mehreren Monaten in zwei Kindern T-Zell-Leukämie
•Ursache: insertionale Oncogenese durch Insertion des Vektors nahe Promoter von
LMO2; dadurch Aktivierung von LMO2 (=Transkr.-faktor für Hämatopoiese)
•Integrationsort in jeder transduzierten Zelle anders! d.h. bei Millionen von
transduzierten Zellen 2 x Integration nahe LMO2 möglich (MLV bevorzugt
in Promoternähe!); dann Selektion wegen Wachstumsvorteil
•weitere begünstigende Faktoren: γc hat starke anti-apoptotische Wirkung;
reduzierte Immunüberwachung
Williams, Science 302:400-401 (2003)
Der Fall Jesse Gelsinger
•Gentherapie von Ornithin-Transcarbamylase (OTC)-Defizienz
•OTC ist Enzym im Harnsäurezyklus; Hyperammonämie bei Mangel
•J. Gelsinger litt an milder Form, die durch Diät und Medikamente
behandelbar ist. Er stellte sich für Gentherapie-Studie
zur Verfügung, obwohl selbst nicht profitierend.
•Todesursache war Überreaktion des Immunsystems auf Capsidproteine des Adenovirus
Sleeping Beauty Gentherapie (zB Fanconi trial)
SB ist künstlich erwecktes Transposon auf Grundlage von (inaktivem)
Tc1-ähnl. Transposon in Fischen. Erweckung durch Rückmutation.
SB-Transposons für den Gentransfer
Sicherheit: Nicht-viral — keine immunologischen
Nebenwirkungen
keine LTR‘s — sollten keine Onkogene
aktivieren können
Therapiedauer: Chromosomale Integration —
lebenslange Expression des Transgens
bevorzugter Zielort: ATATATAT (Palindrom/
Sekundärstruktur)
Alternative: Gen-Reparatur
•Korrektur einer Mutation am normalen Genort
•z.B. über gene replacement / gene targeting:
genutzt für Herstellung von Ko-Mäusen
aber sehr ineffizient (nicht-homologe Insertion 1000x häufiger)
•neue Strategie:
mit ss-Oligos (ca. 35-90 nt lang; geschützte Enden durch
modifizierte Nukleotide)
Modelle zur Gene repair durch Oligos:
5‘
G
3‘
3‘
C
5‘
3‘
5‘
3‘
3‘
T
G
T
5‘
5‘
C
Mismatch-Reparatur
3‘
5‘
Schnitt und Insertion