Reverse Transkription, Rekombination, Transposition
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Reverse Transkription, Rekombination, Transposition Hans-Georg Kräusslich, Abteilung Virologie http://virology.hyg.uni-heidelberg.de 27.06.06 Retro- und Pararetroviren Reverse Transkription Integration Rekombination Retroelemente Rekombination bei RNA-Viren Virale Replikationsstrategien („Baltimore-Schema“) Retroviren I + - II III + - + - + - IV + V - - VII + - + + - Pararetroviren VI + + - + mRNA 1 Retro- und Pararetroviren Retroviren: In einer Vielzahl von Wirtsorganismen, z.B.: Rous Sarkom Virus (Huhn) Mäuse Leukämie Virus (Maus) Mouse Mammary Tumor Virus (Maus) menschliche Retroviren (HIV und HTLV) Gypsy (Drosophila) endogene Retroviren (IAP, PERVs, HERVs) Pararetroviren: Hepadnaviren (HBV, DHBV) Caulimoviren Retroviraler Replikationszyklus (HIV) 2 Retrovirus Hepadnavirus Reverse Transkription Episom Integration Reverse Transkription © Flint et al. Principles of Virology Klassifikation der Retroviren Einfach (MLV, RSV) Komplex (HIV) Genus Beispiel Genom α β γ δ ε RSV MMTV/MPMV MLV HTLV WDSV HIV Foamyvirus einfach einfach einfach komplex einfach komplex komplex Avian sarcoma and leukosis Säuger B-, D-Typ Viren MLV-Verwandte HTLV/BLV Walleye dermal sarcoma virus Lentiviren Spumaviren 3 HIV Reverse Transkriptase RT ist Teil des POL-Polyproteins Polymerase HIV-1 RT Heterodimer: RNaseH Aktives Zentrum Finger Daumen p66 p51 Polymerasen sind strukturell miteinander verwandt Klenow T7 RNAP HIV-1 RT 3Dpol © Flint et al. Principles of Virology 4 Die aktiven Zentren der Polymerase und RNaseH im RT-Heterodimer sind räumlich voneinander entfernt: Versetzte Aktivität an der RNA-Matrize Aktives Zentrum RNaseH Aktives Zentrum Polymerase Bild: S. Hughes, NCI Reverse Transkription ist Primer-abhängig Retrovirale RT nützen zelluläre tRNA als Primer ¾Retroviren verpacken tRNA-Moleküle (ca. 100 Kopien; non-random) ¾Die 3‘ terminalen 18 Basen einer bestimmten tRNA binden an das virale Genom -Strang Synthese Primer binding site von ASLV ¾ Zur Bindung wird die tRNA-Struktur partiell entwunden (Beteiligung von NC?) tRNATrp ¾ Säuger-Retroviren: bevorzugt tRNAPro, tRNALys3, tRNALys1,2 © Flint et al. Principles of Virology 5 Vergleich der hepadnaviralen und retroviralen Polymerase © Flint et al. Principles of Virology Ein Tyrosinrest in der TP-Domäne des P-Proteins dient als Primer der reversen Transkription von Hepadnaviren P-Protein Packaging signal ε © Flint et al. Principles of Virology Bindung des P-Proteins an das Verpackungssignal ist wichtig für Genomverpackung und für reverse Transkription Das Terminale Protein bleibt kovalent am 5‘-Ende des –Strangs gebunden 6 Template-Wechsel bei der Reversen Transkription Minus-Strang U3 Provirus R U5 U3 LTR R U5 LTR Reverse Transkription Virale RNA R U5 PBS U3 R U5 PBS PPT U3 Strong stop DNA R R U5 tRNA 1.TemplateWechsel Mechanismus der Reversen Transkription Plus-Strang-Synthese © Coffin et al. Retroviruses 7 Hepadnavirus Reverse Transkription (I) Protein priming Terminale Redundanz Reverse Transkription beginnt mit Protein-Priming (TP ist Teil der RT), diskontinuierliche Synthese ähnlich Retroviren, Strangtransfer at direct repeats (dr1 und dr2) Abbau des templates durch RNaseH © Flint et al. Principles of Virology Hepadnavirus Reverse Transkription (II) Terminales RnaseH-Produkt als primer Linearer Doppelstrang © Flint et al. Principles of Virology 8 Hepadnavirus Reverse Transkription (III) Nach dem Strangtransfer des Plus-Strang-Primers wird bis zum 5´ Ende der Matrize elongiert. Dann erfolgt Strangtransfer vermittelt durch terminale Redundanzen (R) Das Produkt ist eine zirkuläre DNA, die zunächst inkomplett bleibt und erst nach Infektion der Zielzelle komplettiert und kovalent geschlossen wird (cccDNA) © Flint et al. Principles of Virology Vergleich Reverse Transkription Retroviren - Hepadnaviren Gemeinsamkeiten: ¾ Polymerase hat RT und RNaseH Aktivität ¾ Initiation der DNA-Synthese nahe dem 5‘Ende des templates ¾ Transfer des naszierenden Strangs zu einer komplementären Sequenz am anderen Ende des Templates ¾ Rest des RNA templates dient als primer für die (-)Strang DNA Synthese ¾ Reverse Transkription findet innerhalb subviraler core-Partikel statt Retrovirus Genom im Partikel: Überwiegend RNA Reverse Transkription: überwiegend nach Entry Hepadnavirus Unvollständige dsDNA vor der Partikelfreisetzung (-)Strang primer: tRNA P-Protein Endprodukt: lineare dsDNA Provirus integriert im Wirtsgenom zirkuläre dsDNA episomal im Zellkern 9 Retroviraler Replikationszyklus (HIV) Integration Merkmale des integrierten Provirus Spezifische Sequenz unspezifische Sequenz 2 bp an den Enden der viralen cDNA fehlen Duplikation der flankierenden Wirtssequenzen (4-6 bp, charakteristisch für Retrovirus) © Coffin et al. Retroviruses 10 Mechanismus der retroviralen Integration 1. Prozessierung IN 2. Strang-Transfer IN Zelluläre Faktoren Reparatur © Coffin et al. Retroviruses Retrovirale Integration ¾ Retrovirale Genome integrieren in zelluläre Chromosomen ¾ Vermittelt durch IN und Enden der linearen viralen cDNA ¾ Sequenz-unspezifisch, aber beeinflußt durch nukleosomale Struktur ¾ Retrovirale Integration Insertionsmutagenese mit möglichen pathogenen Folgen Retrovirale Vektoren (franz. Gentherapie-Studie)! Molekularbiologisches Werkzeug 11 Nukleosomenstruktur beeinflußt Integrationspräferenz Nukleosom MLV-Integration in Minichromosom MLV-Integration in nackte DNA HIV-Integration in vitro (Größe = Häufigkeit) (Pryciak et al., 1992) (Pruss et al., 1994) Bevorzugung bestimmter Integrationsorte (Bushman, Cell 2003) LTR retrotransposons (Hefe) Ty1 750 bp stromaufwärts von Pol-III Genen TY3 Transkriptionsstart von Pol-III Genen TY5 Heterochromatin an Telomeren Tf1 Stromaufwärts von Pol-II genen HIV-1 Aktive Gene MLV Promotoren von aktiven Genen AMV Aktive Gene Non-LTR Retrotransposon LINE Unspezifisch; Rearrangiert Integrationsort DNA Transposon Sleeping beauty Vermeidet Alu-repeats Viren 12 Genetische Konsequenzen retroviraler Integration MMTV Mammary tumor MLV ähnlich Hairless GALV ähnlich Expression von Amylase in Speicheldrüsen von Menschenaffen und Menschen Stärkereiche Nahrung kann verdaut werden Coffin et al., ‚Retroviruses‘, 1997 Parasitäre DNA-Elemente Ein großer Teil des eukaryontischen Genoms besteht aus Sequenzen, die sich von integrierten ‚Parasiten‘ ableiten Bei Vertebraten sind das über 40% des Genoms Der größte Teil entstand aus revers transkribierten Sequenzen 13 Retroelemente im Eukaryontengenom Retroelemente machen ca. 5-10% des Säugergenoms aus, weitere ca. 30% stammen von revers transkribierten Sequenzen ab Merkmale Beispiel Kopien/Genom RT, LTR, (Pol II Promotor), env HERVs (Mensch) IAP (Maus) 1-100 RT, LTR (Pol II Promotor) Ty3 (Hefe) 102-104 RT, internal Pro -motor, polyA LINE1 (Mensch) 104-105 Pol III Promotor), polyA Alu (Mensch) 105-106 Kein Promotor, polyA β-Tubulin (Mensch) 1-100 © Flint et al. Principles of Virology (1) Lebenszyklus von Retrovirus und LTR-Retrotransposon (2) (10) (11) © Coffin et al. Retroviruses 14 Retrotransposition des L1 Elements Bushman, Nature 2004 Mobile Elemente im menschlichen Genom IR/DR IR/DR 1. Transposon (Mariner) ‚IN‘ 2. Autonome Retrotransposons LTR-tragende (HERV-K) gag PR RT/RH pol IN env Non-LTR/Poly(A) (L1) ORF1 EN RT ORF2 AAAAn 3. Nicht- Autonome Retrotransposons L-Alu R-Alu Alu AB AAAAn Prozessierte Pseudogene Retrovirales Provirus M-MuLV AAAAn gag PR RT/RH pol IN env 15 Verwandtschaft viraler und nicht-viraler RT Euk. Zellen Retroelemente Viren © Coffin et al. Retroviruses Telomer-Replikation © Alberts et al. Mol Biol of the Cell 16 RNA Rekombination Rekombination während der –Strang Synthese (copy-choice) Heterozygotes Virusgenom -Strang Synthese an einem Template > Wechsel zum 2. Template (bei Strangbruch, Pause oder zufällig) © Flint et al. Principles of Virology 17 Rekombination während der +Strang Synthese (strand assimilation) Heterozygotes Virusgenom Synthese von 2 -Strängen Strand displacement während der +Strang Synthese Verdrängter +Strang bindet an -Strang vom anderen template ¾Doppelstrang mit Heteroduplex-Regionen © Flint et al. Principles of Virology RNA-Rekombination (copy-choice) © Flint et al. Principles of Virology 18 Defective interfering RNAs Durch Rekombination können RNAs mit Deletionen entstehen Produkt: Verkürzte RNA ¾ Kürzere RNA kann schneller replizieren ¾ Kompetiert mit dem Genom um RNA-Synthese Maschinerie (Akkumulation) ¾ Kann in Partikel verpackt werden, wenn fehlende Proteine durch vollständiges Helfervirus zur Verfügung gestellt werden ¾ Defekte interferierende Viren akkumulieren während der Replikation von (-) und (+)Strang RNA Viren Voraussetzung: hohe m.o.i. (= in vitro) ¾ Rolle in der Pathogenese? Die Pathogenität des BVDV ist assoziiert mit der Produktion des NS3-Proteins durch rekombinante cp Viren Infektion mit non-cp BVDV Baby on board Mutation des Virus -> cp BVDV persistente Infektion mit non-cp BVDV (erworbene Immuntoleranz) Schleimhauterkrankung (Mortalität 100%) -> Nachweis von non-cp und cp Virus © Flint et al. Principles of Virology 19 RNA-Rekombination ¾ Rekombination erhöht die genetische Vielfalt ¾ homolog oder nicht-homolog Insertion zellulärer Sequenzen möglich ¾ erfordert Infektion mit zwei oder mehr Viren Ausnahme: Retroviren (diploides Genom erhöht Rekombinationsfrequenz) ¾ Mechanismus: copy-choice besonders in Regionen verlangsamter Polymerisation 20
