Isolierung von Bakterien aus der Umwelt

Isolierung
von Bakterien aus der Umwelt
École Polytechnique Federal de Lausanne
(EPFL)
Betreuer:
Dr. Lisa Metzger & Prof. Melanie Blokesch
Schüler:
Pascal Burri
Einführung in das Projekt
Bakterien leben überall auf der Erde. Sie sind aber so klein, dass wir sie von bloßem Auge gar nicht wahrnehmen
können. Diese kleinen Einzeller gehören zu den ältesten Lebensformen, die es auf diesem Planeten gibt. Es gibt
so viele Arten von Bakterien, dass noch nicht mal alle davon entdeckt worden sind.
Für das ganze Ökosystem, ob zu Land oder zu Wasser, sind Bakterien überlebensnotwendig. Viele Bakterien
gehören zu den sogenannten Destruenten. Dies sind Organismen, welche organische Substanzen wieder zu
anorganische Substanzen verarbeiten. In unserem Körper leben beispielsweise viele Bakterien auf der Haut, im
Mund und in der Darmflora. Diese Bakterien sind für uns essentiell, damit wir überhaupt überleben können. In
anderem Sinn gibt es Bakterienarten, die uns richtig krank machen oder sogar töten können, wenn wir sie in
unserem Körper haben. Nichts desto trotz gibt es aber auch Bakterienarten, die eigentlich in unserem Körper gar
nichts anstellen. Wir merken gar nicht, ob sie da sind oder nicht.
Während dieser Woche war es unser Ziel, kultivierbare Bakterien zu isolieren und sie zu charakterisieren und dann
von ausgewählten Isolaten die Spezies zu bestimmen.
1. Schritt: Die Proben beschaffen
Wir gingen an den Genfersee und wateten ein paar Meter ins Wasser. Wir suchten eine klare Stelle, damit wir
Proben vom klaren Wasser nahmen konnten. Danach nahmen wir Proben an der Brandung vom trüben Wasser.
Weil der See relativ sauber war, mussten wir das Wasser manuell ein wenig trüben. Dies funktionierte relativ gut,
indem man den Sand ein bisschen aufwirbelte. Als wir die Wasserproben beisammen hatten, holten wir nicht weit
vom See entfernt noch je eine Erdprobe und zupften einzelne Blätter ab. Wir arbeiteten dabei immer mit
Handschuhen. Dies nicht, weil wir Angst hatten, dass wir uns mit etwas Fremden infizieren konnten, sondern
deshalb, weil wir unsere Proben nicht mit Bakterien von uns kontaminieren durften.
2. Schritt: Die Proben kultivieren
Verschiedene Nährböden
Wir benutzten für unsere Proben verschiedene Nähböden. Diese Nährböden halfen uns, die Bakterien
vorzuselektionieren:
Luria- Broth (LB)
Dies ist ein Komplexmedium, welches viele wichtige Nährstoffe für die meisten Bakterien hergibt. Man benutzt es
als Standart-Nährboden.
MacConkey (MC)
MacConkey Agar ist ein Selektivnährboden für gramnegative Bakterien. Auch Bakterien, die Lactose fermentieren
können, fühlen sich auf MacConkey wohl. Diese Bakterien färben sich rot. Der Agar besitzt einen pH-Indikator.
Thiosulfate Citrate Bile Sucrose (TCBS)
TCBS ist speziell selektiv für Vibrio-Bakterienarten. Die Bestandteile des Nährbodens bestimmen auch die
Selektion der Bakterien. In diesem Agar hat es Natriumthiosulfat, Natriumcitrat, Gallensalze und einem
Einfachzucker, der Sacarose. Bei der Vermentierung der Sacarose von den Bakterien färbt sich der Nähragar gelb.
Also hat auch dieser Agar ein pH-Indikator.
Minimal Medium Methanol (MMM)
Ein selektives Nähragar für sehr spezialisierte Bakterien. Dieser Nährboden hat nur ein Kohlenstoffatom als
Kohlenstoffquelle für die Bakterien.
KingB
Ein selektiver Nähragar für die Selektion von Pseudomonas. Diese kann man nachweisen durch die Fluoriszenz.
Dieser Nährboden besitzt sehr geringe Nährstoffe.
Die Verdünnungsreihe

100
1:10 Verdünnung
100µL(Probe) + 900µL (Puffer)

10-1
10-2
1:10 Verdünnung
100µL(Probe) + 900µL (Puffer)
Weil wir vermutet hatten, dass es in den Bodenproben extrem viele Bakterien hatten muss, hatten wir mit den
Wasser bzw. mit den Bodenproben Verdünnungsreihen angelegt. So bekamen wir einen besseren Überblick
wieviele Bakterienkulturen auf den Platten leben und man sah auch besser die Einzelkulturen.(Hier im Beispiel
Bodenplatten auf LB-Näühboden (S-LB) mit verschiedenen Verdünnungsstufen)
Abb.1 S-LB
Abb.2 S-LB 10-1
Abb.3 S-LB 10-2
3. Schritt: Charakterisierung der Bakterien
Makroskopie
Betrachtung der einzelnen Kolonien
Über die Nacht wuchsen die Kutluren auf den am Tag zuvor geimpften Platten. So sahen wir am Morgen sehr sehr
viele verschiedene Kolonien. Es gab Kolonien, welche leicht milich waren und glänzten, ja fast durchsichtig Einige
Kolonien waren sogar Pink oder Gelb, je nach Nähboden auf dem sie wuchsen. Auch der Unterschied in Grösse
der Kolonien war beachtlich. Einige waren sehr sehr klein und andere Kolonien waren schon richtig gross. Es gab
auch einige Bakterien, welche wie Fäden waren und diese bideten eine Art Teppich auf dem Nährboden.
Auch der Geruch war unterschiedlich. Bei vielen Platten roch man nichts spezielles als der normale Geruch des
Agars. Einige Koloinen jedoch rochen so richtig speziell. Eine Kolonie beispielsweise roch so richtig nach Wasser.
Gram positiv und Gram negative Bakterien
Eine erste grobe physische Unterscheidung von Bakterien kann man machen indem man bestimmt, ob sie Gram
positiv oder Gram negativ sind. Im Groben kann man sagen, dass die Gram positiven Bakterien eine viel dickere
Peptidoglykanschicht besitzen. Die Gram negativen Bakterien besitzen eine viel dünnere Peptidoglykanschicht
zwischen einer inneren und einer äusseren Membran. Für die Bestimmung ist die Peptidoglykanschicht wichtig,
darum gehe ich auf sie ein. Natürlich gibt es noch andere Unterschiede, aber die behandelten wir nicht.
Durch die Erwärmung der Bakterien auf über 80°C sterben die Bakterien ab. Nur die Sporen der Bakterien
überleben. Bakterien, welche Sporen bilden, sind bis auf ein paar Ausnahmen alle Gram +.
Bestimmung durch die Nutzung des MacConkey Agars
Dadurch, dass die MC-Platten selektiv sind für die Gram negativen Bakterien, kann man davon ausgehen, dass
nur Gram negative Bakterien auf dieser Platte wachsen können. Man kann also sicher sein, dass nur ein Bakterium
Gram negativ sein kann, wenn es auf dieser Platte überleben kann.
Mikroskopie
Auch die Beobachtung der Bakterien auf Mikroebene war wichtig. Unser wichtigstes Instrument war daher das
Mikroskopie. Wir sahen uns die Formen der Bakterien genau an. Einige waren Stäbchen, andere sahen aus wie
Kokken. Es war spannend diese Bakterien unter dem Mikroskop anzusehen. Das Witzige an den Kokken Bakterien
ist, dass sie immer in Verbänden zu viert vorkommen. Unser Beispiel bei den Kokken war: Micrococcus luteus.
Was auch spannend war, dass es auch bei den Stäbchen untereinander Unterschiede gibt. E.coli sind nach der
Teilung nicht mehr zusammen. Sie kommen also immer einzeln vor. Sie sind nicht miteinander verbunden. Bei
Bacillus subtilis war das nicht so. Diese Bakterien bleiben nach der Teilung bei einander und bilden eine Kette.
Gram Stain
Der Gram Stain (GS) ist eine Methode, bei dem man mit Färbemitteln die Peptidogklykanschicht einfärben kann.
Wenn man die Bakterien, welche man trockenkonserviert hat, mit Gentiana Violett einfärbt und dann anschliessend
nach einer Minute Einwirkungszeit mit Lugol „abwäscht“, färbt sich die Peptidogklykanschicht violett. Im nächsten
Schritt gibt man Ethanol dazu und macht so die Peptidoglykanschicht kaputt. Wir durften das Ethanol nur 30
Sekunden auf den Bakterien lassen, da wir ja nur wollten, dass die dünnere Peptidoglykanschicht der Gram-Bakterien kaputt geht. Danach geben wir einen pink-roten Farbstoff dazu. So färben sich die Gram- pink-rot. Die
Gram+ bleiben violett. Jetzt kann man die Proben unter dem Mikroskop betrachten und kann sie bestimmen. Nach
eigener Erfahrung von uns und der Bestätigung von Frau Dr. Metzger kommt es ganz darauf an, wie exakt man
sich an die Einwirkungszeiten hält und welche Art von Bakterium man gerade färbt, um ein eindeutiges Resultat zu
bekommen. Färbt man es nur einmal zu lange oder entfärbt man es zu lange und schon sind auch die Gram
positiven wie Gram negativen gefärbt.
Als Überprüfung schauten wir sie noch unter dem Mikroskop an, um die Farbe definitiv zu bestimmen.
4. Schritt: Auswahl der Bakterienkolonien
Wir durften 3 Bakterien auswählen um mit ihnen die Sequenzierung durchzuführen und ihre Spezies
herauszufinden.
Meine Auswahl traff ich, indem ich mir die Bakterienkolonien
genauer ansah. Mich faszinierte eine Kultur, die auf der BodenLB Platte wuchs. Diese Kultur wuchs in 3 Ebenen. Das
erstaundliche aber an dieser Kolonie war für mich, dass es so
richtig schleimig war. Es war auch richtig milchig. Es roch nicht
irgendwie speziell. Doch sein Aussehen faszinierte mich. Dies
war meine 1. Probe.
Abb.4 S-LB Platte
Abb.5 S-LB(10-1) Mikroskop
Wir bemerkten, dass auf meiner TCBS Platte mit dem trüben
Wasser (T) etwas wuchs. Da dieses Medium sehr selektiv ist
für Bakterien der Gattung vibrio, waren wir sehr aufgeregt, was
diese Kultur für eine Spezies ist. Es war klar für mich, dass ich
das genauer untersuchen wollte. Dies war meine 2 Probe.
Abb.7 T-TCBS Mikroskop
Abb.6 T-TCBS Platte
Als dritte und letzte Probe wählte ich diese Kultur aus, weil
diese Bakteriumkultur sehr spannend wächst. Es bedenkte
den Agarboden wie ein Teppich. Die Frage um welches
Bakterium es sich handelt, stellte sich mir schon als ich es zum
ersten Mal sah. Ich finde diese Kultur sehr schön.
Abb.9 S-LB Mikroskop
Abb.8 S-LB (10-1) Platte
5. Schritt: Sequenzierung und Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Vorbereitung
Wir wählten sechs von unseren Bakterienkolonien aus, welche wir aus den Proben gewonnen hatten. Wir strichen
diese Einzelkolonien auf LB Platten aus und liessen sie bei 30°C wasen um Einzelkolonien zu erhalten. Von diesen
sechs entschieden wir uns dann für 3 Isolate,für welche wir die Spezie bestimmen wollten. Um die Spezies eines
Bakterium zu bestimmen machgt man sich zu nutzen, dass die 16S rRNA eine Art Daumenabdruck der
Bakteriumsspezies ist. Man findet diese Sequenz bei allen Bakterien. Diese ist aber bei jeder Spezies anderst,
sodass man die Spezies gut bestimmen kann.
Isolierung der Desoxyribonukleinsäure (DNS)
Damit wir überhaupt mit einer Sequenzierung die 16S rRNA bestimmen konnten, mussten wir von Bakterien die
DNS isolieren. Das ging mit einem speziellen Kit. Dieses Kit beinhaltet die ganzen Stoffe und Behälter (PCR Tubes),
die wir brauchten um die DNS zu isolieren.
Man nimmt eine Probe der gewünschten Bakteriumkultur. Um an die DNA des Bakteriums zu kommen, muss zuerst
mal die Zellwand zerstört werden. Mit einem Enzym geht das am Besten. Wir nahmen eine Lysozyme Lösung. Wir
liessen die Lösung mit Puffer, Enzym und Bakterien bei 37°C und bei 30 Min. inkubieren. Nach diesem Schritt gibt
es von der Zellwand nichts mehr. Leider gibt es ausser der DNA noch sehr viel andere Sachen in der Lösung, die
man nicht braucht. Wir wollten nur die DNA. Nun ging es der RNA an den Kragen. Dieser Schritt ist nicht notwendig,
aber wir machten ihn trotzdem. Die RNA zerstört man mit RNAase. Jetzt schwimmen noch Proteine und DNA
herum. Weil wir die Proteine nicht brauchten, gaben wir noch Proteinase dazu. Dies zerstört die Proteine und die
DNA ist noch alleine auffindbar.
Messung der DNS-Konzentration
Als wir die DNS isolert hatten, mussten wir schauen, wieviel DNS wir überhaupt isoliert hatten. Wenn wir zu wenig
gehabt hätten, hätte eine PCR keinen Sinn gemacht, da die DNS Polyimerase eine gewisse Menge DNS braucht.
Sample ID
PB #1
PB #2
PB #4
Date
18.03.2015
18.03.2015
18.03.2015
ng/ul
10.32
35.32
28.82
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Die Polymerase Chain Reaction oder in deutsch Polymerase Kettenreaktion ist die Vermehrung einer bestimmten
Sequenz der DNA. Damit eine PCR funktioniert, braucht es:

Ein Polymerase Buffer

Primer

Nukeleotide

DNA Polymerase

Destiliertes Wasser

gDNA

Thermozykler
Die PCR wir in einem Thermozykler vollzogen, da verschiedene Abschnitte verschiedene Temperaturen benötigen.
Hier ist das Programm, welches wir benutzten:
94°C
2 min
94°C
50°C
72°C
15 sek
30 sek
2 min
10 Zyklen
94°C
50°C
72°C
15 sek
30 sek
2 min + 5 sek/cycle
20 Zyklen
72°C
8°C
10 min
∞´
Der 1. Schritt der PCR ist die Denaturierung der DNS. Das heisst, der DNS-Doppelstrang wird durch die Erhitzung
auf 94 Grad Celsius in Einzelstränge aufgetrennt. Die Temperatur wird auf ca.55 Grad Celsius abgesekt, sodass
sich die Primer an die DNS-Einzelstränge anlagern können. Dieser Schritt wird Hybritisierung genannt. Die
Temperatur wird nach dem 2. Schritt auf die ideale Arbeitstemperatur der Polymerase erhöht, sodass diese den
Primer verlängern und abschliessen können. Dies ist war bei uns bei ca. 72 Grad Celsius
Die Schritte 1 bis 3 werden ständig wiederholt und so verdoppelt sich jedes Mal die Anzahl an kopierten DNSMolekülen. Da die DNS-Polymerase mit der Zeit nicht mehr so schnell arbeitet, gibt man ihr nach einer gewissen
Zeit immer mehr Zeit für die Arbeit. Ganz am Schluss wird die vervielfachte DNS auf 8 Grad Celsius
heruntergekühlt, damit sie nicht kaputt gehen kann.
6. Schritt: Das Agarose Gel
Anschliessend nach der PCR testeten wir wieder die Konzentration der DNS:
Sample ID
Date
ng/ul
PB-PCR#1 18.03.2015 137.23
PB-PCR#2 18.03.2015 117.69
PB-PCR#4 18.03.2015 174.28
Um sicher zu gehen, dass die PCR funktioniert hat, macht man ein Agarose Gel. Unsere 16S rRNA Sequenz muss
etwa 1500 Basenpaare aufweisen können, denn das ist die Grösse dieser Sequenz. Wenn man sieht, dass es
weniger anzeigt, dann ist die PCR fehlgeschlagen und man muss den Fehler suchen gehen.
9 10
Isolation no
L 2
6 7 8
Isolation no
9 10
L 2 6 7 8
6000 bp
6000 bp
3000 bp
3000 bp
1500 bp
1500 bp
1000 bp
1000 bp
gDNA
Abb.10 Agarose Gel der gDNA
9 10
Nach PCR
Abb.11 Agarose Gel nach der PCR
Die Klone 2,6 und 7 sind von meiner Kollegin. Die Isolate 8(S-LB), 9(T-TCBS) und 10(S-LB(10-1) sind von mir.
7. Schritt Sequenzierung
Damit wir nun genau herausfinden konnten, was für Bakterien wir vor uns hatten, mussten wir sie zur
Sequenzierung schicken. Die Firma Mycrosynth, welche die Sequenzierung vornahm, schickte uns die Sequenz
per E-Mail. Nachdem wir die Sequenzen zusammengefügt haben, verglichen wir sie mit der Datenban: fyi
Ribosomal Database Project. Wir bekamen so unsere Ergebnisse der Proben.
8. Schritt: Die Bestimmung der Arten
Nach der Auswertung der Sequenzierung durch die Internetseite ergaben sich diese Arten, welche am Meisten
zutrafen. Der „S_ab Score“ bezieht sich auf die Genauigkeit der Übereinstimmung der Sequenz. Je näher an 1
desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass es diese Spezies ist.
Kultur
Gattung
S_ab Score
Passenste Spezies
S-LB
Aeromonas .
0.997
A. caviae /
A. hydrophila
T-TCBS
Aeromonas
0.992
A. salmonicida
(S-LB(10-1))
Bacillus
1.000
B. subtilis
Zusammenfassung
Es war für mich eine sehr interessante und äusserst spannende Woche. Es gab jeden Tag neue Dinge, die wir
lernten. Ich war noch nie in einem Forschungslabor. Ich lernte sehr viel und konnte mein Wissen sehr gut vertiefen.
Der Weg der Artenbestimmung von der Probe zur Isolierung, dann von der PCR zur Sequenzierung und schliesslich
endlich das Resultat mit was für einer Spezies wir arbeiteten, war eine tolle Erfahrung. Es machte mir sehr Spass
und ich war zu jeder zeit äusserst gefordert.
Danksagung
Ich möchte an dieser Stelle allen danken die mir diese Woche ermöglicht haben. Ich bedanke „Schweizer Jugend
forscht“, dass ich überhaupt an diese Woche teilnehmen konnte. Mein Dank geht auch der EPFL, welche uns eine
super Infrastruktur zur Verfügung gestellt haben. Auch bedanke ich mich an Prof. Melanie Blokesch und ihr Team.
Ein ganz besondere Dank geht an Frau Dr. Lisa Metzger. Sie bereitete die Woche für uns vor und schrieb uns
sogar ein ganzes Dossier. An diesem Dossier konnten wir uns die ganze Woche halten. Wir wussten immer wo wir
sind und was es zu tun gab. Sie erklärte uns alles in aller Ruhe und wenn wir es mal nicht gerade auf anhieb
verstanden, erklärte sie es uns noch einmal. Vielen Dank für die geniale Woche. Ich werde die ganze Woche in
guter Erinnerung behalten und es jedem weiterempfehlen.