Bedeutung der systemischen Komplementaktivierung in der

Ruhr-Universität Bochum
PD Dr. med. Stefan M. Weiner
Dienstort: Krankenhaus der Barmherzigen Brüder Trier
II. Medizinische Abteilung
Bedeutung der systemischen Komplementaktivierung
in der Diagnostik ausgewählter Komplikationen
nach Nieren- bzw. Pankreastransplantation
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Angela Suermann
aus Bochum
2007
Dekan
Referent
Koreferent
Prof. Dr. med. G. Muhr
PD Dr. med. S. M. Weiner
Prof. Dr. rer. nat. M. Köller
Tag der mündlichen Prüfung
06. November 2007
Meinen lieben Eltern
Inhaltsverzeichnis
1.
EINLEITUNG .............................................1
1.1. Bedeutung der Pankreastransplantation in der Therapie
des Diabetes mellitus Typ 1 – Chancen und Risiken ......... 1
1.2. Ausgewählte Komplikationen in den ersten Monaten
nach Transplantation ....................................................... 2
1.2.1. Akute Abstoßungsreaktion .....................................................2
1.2.2. Pankreastransplantatthrombose ..............................................5
1.2.3. Infektionen.............................................................................6
1.3. Rolle des Komplementsystems in der Diagnostik der
akuten Abstoßungsreaktion ............................................. 6
1.3.1. Pathophysiologische Bedeutung..............................................6
1.3.2. Diagnostische Nutzung ..........................................................8
1.4. Fragestellung ..................................................................10
2.
PATIENTEN, MATERIAL UND
METHODEN....................................................11
2.1. Patienten ........................................................................11
2.1.1. Zusammenstellung der Patientengruppen A und B ................11
2.1.2. Charakterisierung der Patientengruppen A und B ..................12
2.1.2.1. Demographische Charakteristika ..................................12
2.1.2.2. Grunderkrankung und Nierenersatztherapie .................13
2.1.2.3. Transplantationstypen ..................................................14
2.1.2.4. Immunsuppression .......................................................15
I
2.1.3. Diagnosekriterien .................................................................16
2.1.3.1. Akute Abstoßungsreaktionen von Niere bzw. Pankreas 16
2.1.3.2. Pankreastransplantatthrombose ....................................17
2.1.3.3. Infektionen...................................................................17
2.2. Material ..........................................................................18
2.2.1. Geräte..................................................................................18
2.2.2. Gel und Antikörper ..............................................................18
2.3. Methoden .......................................................................19
2.3.1. Rocketimmunelektrophorese zur Bestimmung der C3dKonzentration ......................................................................19
2.3.2. CRP-Bestimmung und Leukozytenzählung...........................26
2.4. Statistische Auswertung..................................................26
3.
ERGEBNISSE ............................................ 27
3.1. Postoperative C3d-Konzentrationen nach Nieren- bzw.
Pankreastransplantation .................................................27
3.2. C3d-Konzentrationen bei Abstoßungsreaktion und
Pankreastransplantatthrombose ......................................29
3.2.1. Charakterisierung der Patientengruppen I bis VI....................29
3.2.2. C3d-Konzentrationen bei Abstoßungsreaktionen von
Pankreas- bzw. Nierentransplantat........................................32
3.2.3. C3d-Konzentration bei Pankreastransplantatthrombose.........36
3.2.4. Kasuistik ..............................................................................39
3.3. Einfluss von Infektionen auf die C3d-Konzentration ......42
3.3.1. Charakterisierung der Gruppen A und B in
Abhängigkeit vom Auftreten von Infektionen........................42
3.3.2. C3d-Konzentration bei Infektion...........................................43
3.3.3. CRP-Konzentration bei Infektion bzw.
Abstoßungsreaktion..............................................................44
II
4.
DISKUSSION ............................................ 47
4.1. Systemische Komplementaktivierung postoperativ nach
Pankreas- bzw. Nierentransplantation ............................47
4.2. Nachweis systemischer Komplementaktivierung in der
Differentialdiagnose des Pankreasfunktionsverlustes
nach Pankreastransplantation .........................................50
4.3. Einfluss von Infektionen auf die C3d-Konzentration ......53
4.4. Stellenwert der Bestimmung des CRP in der Frage der
Differenzierung zwischen Abstoßungsreaktion und
Infektion bei nachgewiesener systemischer
Komplementaktivierung .................................................54
5.
ZUSAMMENFASSUNG ........................... 56
6.
LITERATURVERZEICHNIS .................... 58
7.
DANKSAGUNG
8.
LEBENSLAUF
III
Abkürzungsverzeichnis
AR
akute Rejektion, akute Abstoßungsreaktion
CAPD
kontinuierliche ambulante Peritonealdialyse
CMV
Cytomegalievirus
CRP
C-reaktives Protein
CT
Computertomographie
EBV
Ebstein-Barr-Virus
EDTA
Ethyldiamintetraessigsäure
HBV
Hepatitis B Virus
HCV
Hepatitis C Virus
HD
Hämodialyse
HIV
Human Immunodeficiency Virus
HLA
humanes Leukozyten-Antigen (human leukocyte antigen)
HSV
Herpes simplex Virus
IFN
Interferon
IKT
isolierte Nierentransplantation (isolated kidney transplantation)
IL
Interleukin
Inf
Infektion
IPT
isolierte Pankreastransplantation
(isolated pancreas transplantation)
i.v.
intravenös
Ko
Kontrolle
MHC
major histocompatibility complex
MRT
Magnetresonanztomographie
N-AR
akute Abstoßungsreaktion des Nierentransplantates
IV
NTx
Nierentransplantation
PAK
Pankreas- nach Nierentransplantation
(pankreas after kidney transplantation)
P-AR
akute Abstoßungsreaktion des Pankreastransplantates
p.o.
per os
P-Thr
Pankreastransplantatthrombose
PTx
Pankreastransplantation
RIE
Rocketimmunelektrophorese
SPKT
simultane Pankreas-/Nierentransplantation
(simultaneous pancreas kidney transplantation)
Th1
T-Helferzelle 1
TNF-α
Tumor-Nekrose-Faktor α
VZV
Varizella Zoster Virus
WBC
Leukozyten (white blood cells)
V
1.
Einleitung
1.1.
Bedeutung der Pankreastransplantation in
der Therapie des Diabetes mellitus Typ 1 –
Chancen und Risiken
Die Pankreastransplantation ist als kausal ansetzende Therapieform des mit gravierenden Sekundärkomplikationen einhergehenden Diabetes mellitus Typ 1 für
einen ausgewählten Patientenkreis zu einer effektiven therapeutischen Option
avanciert [4, 36]. In 91% der Fälle wird sie, sofern durch das Bestehen einer
Nephropathie mit terminaler Niereninsuffizienz die Indikation zur Nierentransplantation gegeben ist, als simultane Pankreas-/Nierentransplantation (SPKT)
durchgeführt [20, 18].
Seit der ersten kombinierten Pankreas-/Nierentransplantation im Jahr 1966
durch Lillehei und Kelly an der University of Minnesota wurden enorme Fortschritte in den Bereichen der chirurgischen Technik, der Immunsuppression sowie der Diagnostik und Therapie verschiedener Komplikationen erzielt, sodass
die Methode das experimentelle Stadium, das ihr lange Zeit zugeschrieben wurde, verlassen konnte und sich die erzielten Ergebnisse heute mit denen anderer
Organtransplantationen durchaus vergleichen lassen können. Im Zeitraum von
2000 bis 2004 betrug das 1-Jahres-Patienten-Überleben nach SPKT 94%, das 1Jahres-Transplantatüberleben des Pankreas nach SPKT 87%, das der Niere 92%
[18]. 2005 wurden in Deutschland 143 Patienten auf diese Art (SPKT) transplantiert [11].
Der entscheidende Vorteil dieser Methode im Gegensatz zur lebenslangen Insulinsubstitution liegt in der Wiederherstellung einer physiologischen Blutzuckerregulation, die durch keine noch so gut eingestellte Insulinsubstitutionstherapie
ersetzt werden kann. Somit können einerseits akute Komplikationen durch Blutzuckerentgleisungen verhindert werden; andererseits kann der Progression der
Sekundärkomplikationen des Diabetes mellitus (Vaskulopathie, Nephropathie,
1
Neuropathie, Retinopathie) Einhalt geboten werden [14, 4]. Insgesamt betrachtet
kann durch die SPKT im Vergleich zur isolierten Nierentransplantation (IKT)
die Mortalität von Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1 und terminaler Niereninsuffizienz signifikant reduziert werden [58]. Darüber hinaus ist der Gewinn an
Lebensqualität nicht zu unterschätzen [17].
In Kauf genommen wird eine Vielzahl unterschiedlicher Risiken, die einerseits
die mit dem Eingriff verbundenen Komplikationen immunologischer und nichtimmunologischer Art [9, 40, 53] sowie andererseits die Folgen der dauerhaften
Immunsuppression (erhöhte Infektionsneigung [41, 60], Nebenwirkungen der
Immunsuppressiva, gehäuftes Auftreten bestimmter Neoplasien) umfasst. Die
Morbidität nach Pankreastransplantation ist höher als bei anderen soliden Organtransplantationen [70].
1.2.
Ausgewählte Komplikationen in den ersten
Monaten nach Transplantation
1.2.1. Akute Abstoßungsreaktion
Als immunologisch bedingte Komplikation spielt die akute Abstoßungsreaktion
trotz allen Fortschrittes weiterhin eine bedeutende Rolle.
Diese im Kern T-Zell-vermittelte Reaktion entsteht durch die Präsenz HLAfremder Strukturen, die zur Auslösung einer Immunantwort führen. Antigenpräsentierende Zellen phagozytieren und prozessieren Alloantigene, die auf der
Oberfläche in HLA-II-Rezeptoren gezeigt werden und über die Interaktion mit
T-Zell-Rezeptoren deren Aktivierung bewirken. Die Folgen sind Zytokinfreisetzung (v.a. Zytokine der Th1-Reaktion: IL-12, IFN-γ, IL-2,…) und klonale Expansion der T-Zellen, die mittels Perforin und Granzym B eine zytotoxische
Wirkung auf die als fremd erkannten Zellen ausüben [10, 47, 54]. Es entsteht
2
eine entzündliche Reaktion, in deren Rahmen es u.a. durch die Aktivierung des
Komplementsystems zur Bildung chemotaktisch und damit proinflammativ
wirksamer Faktoren kommt, sodass die monozytäre Infiltration das histopathologische Bild dieser Reaktion kennzeichnet [37].
Laut Reddy et al. entwickelten 36% der zwischen 1988 und 1997 dort gemeldeten SPKT-Patienten im ersten Jahr nach der Transplantation mindestens eine
akute Abstoßungsreaktion der Niere. Lediglich in 3% der Fälle trat mindestens
eine isolierte Abstoßung des Pankreas auf, in 16% waren Niere und Pankreas
vom Abstoßungsgeschehen betroffen [51]. Analysen von 205 in der EuroSPK001-Studie untersuchten Patienten ergaben im 3-Jahres-Follow-up eine Häufigkeit der akuten Abstoßungsreaktion von 45%, die zu über 90% in den ersten
sechs Monaten auftraten und zumeist durch eine Kortikosteroidtherapie erfolgreich behandelt werden konnten [1]. Die akute Abstoßungsreaktion des Pankreas
nach SPKT stellt mit einem Anteil von 10% in den ersten Monaten die dritthäufigste Ursache eines Pankreastransplantatverlustes dar (nach technischem Versagen [55%] zumeist durch die vaskuläre Komplikation der Transplantatthrombose
an erster und Todesfällen bei funktionstüchigem Transplantat [20%] an zweiter
Stelle) [18]. Akute Abstoßungsreaktionen treten gehäuft in den ersten drei Monaten nach einer Transplantation auf, können aber durchaus auch im späteren Verlauf beobachtet werden [1]. Reddy et al. [51] berichten von einer Erhöhung des
relativen Risikos eines langfristigen Transplantatverlustes von 1,32 bei Verläufen
mit akuter Abstoßung der Niere, während es im Verlauf nach Abstoßung von
Niere und Pankreas 1,53 beträgt.
Von entscheidender Bedeutung für den Verlauf der Abstoßung und die Prognose
des Transplantats ist ein frühzeitiges Erkennen dieser Situation.
Die akute Abstoßungsreaktion der Niere macht sich klinisch bemerkbar durch
einen Funktionsverlust des Transplantats: Abnahme der Diurese und Anstieg des
Kreatinin sind die markantesten Zeichen. Andere Hinweise wie Fieber, Transplantatschwellung und -druckschmerzhaftigkeit werden entweder durch die Immunsuppression unterdrückt oder aber zeigen ein bereits fortgeschrittenes Stadi-
3
um an. Da bei einer Transplantatdysfunktion differentialdiagnostisch auch andere Ursachen (Infektionen, chirurgische Komplikationen, Ciclosporintoxizität,…)
in Betracht gezogen werden müssen, bedarf es einer umfassenden Abklärung.
Dabei ist die Nierenbiopsie die einzige Methode, die ein Abstoßungsgeschehen
eindeutig belegen kann [28].
Die Diagnosestellung einer akuten Abstoßungsreaktion des Pankreas gestaltet
sich insgesamt schwieriger, da das Geschehen initial oft subklinisch verläuft oder
aber sehr unspezifische, zumeist abdominelle Beschwerden durch peritoneale
Reizung, seltener auch Fieber hervorruft. Im Prinzip gilt ebenso wie bei der Abstoßung von Nierentransplantaten der Funktionsverlust des Transplantates als
Hinweis, der sich laborchemisch allerdings erst sehr spät bemerkbar macht durch
die Entwicklung einer Hyperglykämie und abfallender C-Peptid-Spiegel. Ein Anstieg der Serum-Amylase weist auf azinäre Schädigungen, die im Rahmen der
Abstoßung durch entzündliche Veränderungen zu erklären sind, differentialdiagnostisch jedoch nur schwerlich von einer einfachen Transplantatpankreatitis zu
unterscheiden sind. Bei Blasendrainage bietet sich die Bestimmung der UrinAmylase an, deren Konzentrationsverminderung auf eine Abstoßung weist [31].
Andere Parameter wie das Serum Anodal Trypsinogen [31], das Pankreasspezifische Protein, Serum-Amyloid A [43] oder die Konzentration von löslicher
Spender-DNA im Serum [15] können in der Zusammenschau hilfreiche Informationen liefern, haben allerdings keinen Eingang in die klinische Routine gefunden. Bei SPKT wird oftmals auf das Kreatinin als Surrogatparameter zurückgegriffen [31]. Bildgebende Verfahren wie die Sonographie tragen ergänzend zur
frühzeitigen Identifikation einer akuten Abstoßungssituation bei, sind aber stark
untersucherabhängig und isoliert betrachtet von geringer Spezifität gekennzeichnet [46, 68]; weitere Hinweise können durch magnetresonanztomographische
Untersuchungen gewonnen werden [32, 24]. Letztlich beweisend ist auch hier
nur die histologische Untersuchung des Biopsates, das im Vergleich zur Niere
unter invasiveren Bedingungen und erhöhtem Risiko für Komplikationen wie
Blutungen oder Fistelbildungen zu gewinnen ist [2, 23, 30].
4
1.2.2. Pankreastransplantatthrombose
Die Pankreastransplantatthrombose als frühe, zumeist in den ersten zwei Wochen nach der Transplantation auftretende vaskuläre Komplikation stellt die
häufigste Ursache (52%) für einen Transplantatverlust aus Gründen technischen
Versagens (13%) dar [25]. Ihre Inzidenz beträgt nach SPKT 5-13% [9, 16, 53].
Im Zentrum der pathophysiologischen Betrachtung steht der reduzierte Blutfluss,
der häufiger die venösen als die arteriellen Gefäße betrifft. Als ätiologisch relevant werden verschiedene Faktoren betrachtet: Zum einen werden mechanische
Faktoren wie eine starke Schwellung des Transplantates, atherosklerotische Veränderung des Pankreas bzw. des Y-graft oder ein Kinking der Portalvene des
Spenders verantwortlich gemacht. Andererseits existieren Untersuchungen über
die Bedeutung der lokalen oder systemischen Freisetzung prokoagulatorisch
wirksamer Mediatoren nach Transplantatpankreatitis, die sich z.B. in der Feststellung einer Dysbalance im Prostacyclin-Thromboxan-Verhältnis äußert. Als
Risikofaktoren für die Entwicklung einer Transplantatpankreatitis gelten spenderspezifische Größen (Alter über 45 Jahre, zerebrovaskuläre Todesursache) sowie verfahrens- bzw. operationstechnische Faktoren (Pankreasläsionen im Rahmen der Explantation oder Konservierung, Dauer der kalten Ischämiezeit, Ischämie-Reperfusions-Läsionen, linksseitige Implantation des Pankreas, Verwendung von Portalvenen-Extensionsgrafts, segmentale Pankreastransplantation,
intravenöse Tacrolimusapplikation usw.) [9, 56]. Verschlechterungen der Mikrozirkulation des Pankreas werden in tierexperimentellen Untersuchungen der Applikation von Desmopressin zur Aufrechterhaltung der hämodynamischen Stabilität hirntoter Organspender zugeschrieben. Die hyperkoagulatorische Wirkung
des Desmopressin liegt begründet in der Induktion der P-Selektin-Expression
und der Freisetzung des von-Willebrand-Faktors, was zur Endothel- und
Thrombozytenaktivierung führt [6, 27].
Die Pankreastransplantatthrombose geht – wie auch die Abstoßungsreaktion –
mit einem Funktionsverlust des Transplantates einher, der sich in Form plötzlich
und massiv ansteigender Blutzuckerwerte äußert. Hinzutreten können Hämat-
5
urie und durch die Transplantatschwellung bedingte abdominelle Schmerzen.
Die Diagnose wird bestätigt durch den doppler- bzw. duplexsonographischen
[46] oder aber magnetresonanztomographischen Nachweis eines Perfusionsausfalls [33].
1.2.3. Infektionen
Bedingt durch die immunsuppressive Therapie, die insbesondere in der ersten
Zeit nach der Transplantation angesichts des verstärkten Abstoßungsrisikos in
erhöhter Dosierung appliziert wird, treten Infektionen gehäuft auf. Sie stellen
eine wesentliche Ursache von transplantationsassoziierter Morbidität und Mortalität dar, insbesondere bei pankreastransplantierten Patienten. Bassetti et al.
berichten in dieser Patientengruppe von 75% der Patienten, die im Verlauf mindestens eine Infektion entwickeln [3].
Gerade in den ersten Monaten nach Transplantation handelt es sich dabei meist
um bakterielle Infektionen, die sich urogenital, respiratorisch, gastrointestinal
oder als Wundinfektion manifestieren. Auch einliegende Katheter dienen Erregern häufig als Eintrittspforte und können schwerwiegende septische Krankheitsbilder verursachen [3, 41].
1.3.
Rolle des Komplementsystems in der Diagnostik der akuten Abstoßungsreaktion
1.3.1. Pathophysiologische Bedeutung
Das Komplementsystem stellt als Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Abwehr eine wichtige Komponente der Immunabwehr dar, die eine kaskadenartige proteolytische Aktivierung durchläuft. Man unterscheidet dabei drei
Wege der Aktivierung in Abhängigkeit von der auslösenden Situation: Der klassische Aktivierungsweg wird eingeleitet durch die Bindung von Komplementkomponenten (C1q) am Fc-Fragment von Antikörpern und mündet in der Bil-
6
dung der C3-Konvertase C4bC2b. Ähnlich funktioniert der Mannose-Lektinbindende (MBL) Weg, der die Antikörperbindung der C1-Komponenten des
klassischen Weges durch die Bindung mannosebindender Serinproteasen
(MASP-1 und MASP-2) an entsprechende Zucker auf der Oberfläche von körperfremden Zellen ersetzt und ebenfalls in der Bildung einer C3-Konvertase
mündet, die der des klassischen Weges entspricht. Schließlich existiert eine alternative Komplementaktivierung, die Antikörper-unabhängig über den Kontakt
von Komplementkomponenten mit mikrobiellen Oberflächen in Gang gesetzt
wird. Dabei wird spontan gebildetes aktives C3b an diese Oberflächen gebunden
und trägt zur Spaltung und Aktivierung des Faktor B bei. Dabei entsteht
(C3b)2Bb, die C3-Konvertase des alternativen Weges.
Das aktivierte C3b dient der Opsonierung von Fremdmolekülen, die in der Folge
der Phagozytose zugeführt werden. Die weitere Kaskade führt zur Bildung eines
terminalen Membranangriffskomplexes (C5b-9), der durch Bildung einer Pore in
der Membran der Zielzelle für die Lyse derselben verantwortlich ist. Die Bildung
der Komplementspaltprodukte C5a, C4a und C3a führt zur Chemo- und Leukotaxe, die den Immunprozess aufrechterhalten [26]. Darüber hinaus kommen dem
Komplementsystem regulatorische Funktionen für die B- wie auch T-Zell-Aktivierung zu [13, 65, 49, 50].
Dass das Komplementsystem eine wesentliche Rolle bei Abstoßungsreaktionen
übernimmt, wird belegt durch eine Reihe von Beobachtungen:
Die lokale Synthese der Komplementkomponente C3 im Tubulusepithel trägt
wesentlich zur Entwicklung von Abstoßungsreaktionen der Niere bei: Untersuchungen an Mäusen zeigten, dass die Transplantation C3-defizienter Nieren im
Gegensatz zu Wildtyp-Transplantaten mit erheblich längeren Überlebenszeiten
und geringerer Inflammation einherging. Darüber hinaus wurde nach Restimulation bereits geprimter T-Lymphozyten mit Alloantigenen eine reduzierte
Zytokinsekretion und folglich T-Zell-Proliferation beobachtet, was auf immunregulatorische Funktionen des Komplementsystems hinweist [49], die bei der TZell-vermittelten Abstoßungsreaktionen beteiligt zu sein scheinen.
7
Immunhistochemische Untersuchungen an Transplantatnierenbiopsaten konnten in Abstoßungssituationen Komplementspaltproduktablagerungen entlang der
peritubulären Kapillaren nachweisen, die als C4d-Ablagerungen gehäuft im Zusammenhang akuter humoraler Abstoßungsreaktionen auftraten [5, 42, 45] und
bei zusätzlichen C3d-Ablagerungen mit schlechten klinischen Ergebnissen assoziiert waren [34].
Dass sich lokale Prozesse in der Niere auch in systemischen Untersuchungen
niederschlagen können, zeigen Untersuchungen von Tang et al. [61], die, den
genetischen Polymorphismus des C3-Moleküls zunutze machend, in Abstoßungsreaktionen einen Anteil des C3 aus der transplantierten Niere am zirkulierenden C3 von bis zu 16% ermitteln konnten.
1.3.2. Diagnostische Nutzung
Orientiert am Pathomechanismus der akuten Abstoßungsreaktion existiert eine
Vielzahl unterschiedlicher Ansätze, die auf eine Erweiterung des diagnostischen
Repertoires zielen:
Lederer et al. [38] bestimmten die Konzentration von Adhäsionsmolekülen
(sVCAM) sowie des Komplementspaltproduktes (C4d) im Urin nierentransplantierter Patienten und konnten auf diesem Wege Abstoßungsreaktionen identifizieren. Auch der Nachweis von im Urin ansteigender Konzentration der
mRNA zytolytischer Substanzen aus Lymphozyten (Granzym B, Perforin) sowie der mRNA des FOXP3-Gens als Marker von regulatorischen T-Lymphozyten korrelierte mit akuter Nierenabstoßung [39, 44].
Die Bestimmung des Interleukin-2-Rezeptors im Serum zeigte erhöhte Konzentrationen bei Abstoßungsreaktionen wie auch bei frühzeitiger Transplantatdysfunktion anderer Ursache [19]. Bei Untersuchungen im Plasma der Patienten
konnte ein einige Tage vor der akuten Abstoßung einsetzender Anstieg der
Komplementspaltprodukte C3a und des terminalen Komplexes C5b-9 gezeigt
werden [29]. Van Son et al. konnten diesen Zusammenhang nicht bestätigen und
8
fanden stattdessen Hinweise auf Veränderungen der C3d-Konzentration bei
CMV-Infektionen [63]. Erhöhte C3d-Konzentrationen lassen sich auch bei chronischen Infektionen nach Nierentransplantation nachweisen: So sind bei chronischer Hepatitis C Virusinfektion erhöhte C3d-Konzentrationen mit dem Auftreten einer Transplantat-Nephropathie assoziiert [64].
Die bisher publizierten Untersuchungen zielen i.d.R. auf isolierte Nierentransplantationen. Insofern bestehen in diesem Zusammenhang noch Unklarheiten
bezüglich der Situation bei pankreastransplantierten Patienten.
9
1.4.
Fragestellung
Um das Transplantatüberleben weiter zu verbessern, wäre es wünschenswert,
Parameter zur Verfügung zu haben, die frühzeitig, zuverlässig und nicht-invasiv
die Diagnostik von Komplikationen nach einer Transplantation ermöglichen.
Diese Arbeit will die Bedeutung der Bestimmung des Komplementspaltproduktes C3d im Plasma als Zeichen einer systemischen Komplementaktivierung bei
Patienten nach Pankreas- bzw. Nierentransplantation Patienten in diesem Zusammenhang klären:
Welche diagnostische Bedeutung hat der Nachweis des Komplementspaltproduktes C3d nach kombinierter Pankreas-/Nierentransplantation
im Rahmen einer Pankreastransplantatabstoßung in Abgrenzung zur
Pankreastransplantatthrombose?
Welche diagnostische Bedeutung hat der Nachweis des Komplementspaltproduktes C3d nach kombinierter Pankreas-/Nierentransplantation
im Rahmen einer Nierentransplantatabstoßung?
Wird die Konzentration des Komplementspaltproduktes C3d von Infektionsgeschehen beeinflusst?
Lässt sich durch eine kombinierte Bestimmung von CRP und C3d eine
bessere Abgrenzung zwischen Abstoßungsepisode und Infektion erreichen?
10
2.
Patienten, Material und Methoden
2.1.
Patienten
2.1.1. Zusammenstellung der Patientengruppen A und B
In den zehn Monaten zwischen Oktober 2004 und Juli 2005 wurden Patienten
des Transplantationszentrums der Chirurgischen Klinik des Knappschaftskrankenhauses Bochum-Langendreer, Universitätsklinikum der Ruhr-Universität Bochum, im Verlauf nach Transplantation beobachtet. Zweimal wöchentlich wurden alle EDTA-Plasma-Proben, die zur Bestimmung der Tacrolimusspiegel abgenommen worden waren, zentrifugiert (10 min, 2000 min-1) und bei -30°C zur
späteren Weiterverwendung eingefroren. Hierdurch konnte eine zusätzliche
Blutentnahme vermieden werden. Die Patienten wurden über die Untersuchung
und die weitere Verwendung der Blutproben informiert und gaben hierzu ihr
Einverständnis.
In die Studie eingeschlossen wurden alle Patienten, die im genannten Zeitraum
im Zentrum transplantiert wurden. Relevante Informationen über den klinischen
Verlauf, auftretende Komplikationen, die Ergebnisse von Nierenbiopsien und
bildgebenden Untersuchungen sowie Angaben zur immunsuppressiven Therapie
wurden erfasst. Außerdem wurden verschiedene Laborwerte (insbesondere Kreatinin, C-reaktives Protein und Leukozyten, Blutzucker, C-Peptid, Lipase, Amylase) ermittelt und ausgewertet.
Das Patientenkollektiv bestand aus 86 Patienten, die in zwei große Gruppen eingeteilt wurden:
Die Gruppe A (PTx) umfasst alle 22 Patienten, die im Beobachtungszeitraum
ein Pankreastransplantat erhielten. Bei ihnen wurden insgesamt 25 Pankreastransplantationen durchgeführt (vgl. 2.1.2.3).
11
Gruppe B (NTx) wird gebildet von allen Patienten, die in dieser Zeit isoliert nierentransplantiert wurden (n = 64). Aus dieser Gruppe wurde, um den finanziellen wie zeitlichen Studienaufwand in Grenzen zu halten, eine Stichprobe von 15
Patienten (Gruppe B*) intensiver untersucht (vgl. 3.2.1.).
Subgruppierungen (vgl. 3.2.1. bzw. 3.3.1.) wurden vorgenommen in Abhängigkeit von Besonderheiten des weiteren Verlaufes, sodass akute Abstoßungsprozesse, Pankreastransplantatthrombosen und Infektionen gesondert betrachtet und
ausgewertet werden konnten.
2.1.2. Charakterisierung der Patientengruppen A und B
2.1.2.1. Demographische Charakteristika
Im Durchschnitt waren die Patienten der Gruppe A zum Transplantationszeitpunkt signifikant jünger als die Patienten der Gruppe B, was mit der gezielten
Patientenauswahl im Rahmen der Indikationsstellung der Pankreastransplantation im Vergleich zur isolierten Nierentransplantation zu erklären ist. Innerhalb
der Subgruppen der Gruppen A bzw. B konnten keine signifikanten Altersunterschiede festgestellt werden.
Die Geschlechterverteilung beider großer Gruppen entsprach sich.
Tabelle 1: Die Gruppen A und B unterscheiden sich im mittleren Alter zum Zeitpunkt der
Transplantation, nicht jedoch in der Geschlechterverteilung.
Anzahl der Patienten n
Alter (Transplantationszeitpunkt)
Minimum bis Maximum [Jahre]
Geschlechterverhältnis m : w
männlich
weiblich
Gruppe A
(PTx)
Gruppe B
(NTx)
22
64
41,7 ± 10,4
24 bis 64
51,0 ± 11,8
21 bis 74
1,75 : 1
1,46 : 1
14 (63,6%)
8 (36,3%)
36 (59,4%)
26 (40,6%)
p-Wert
p = 0,001*
p = 0,92
12
2.1.2.2. Grunderkrankung und Nierenersatztherapie
Als Grunderkrankung der Patienten der Gruppe A bestand über 29,5 ± 8,7 Jahre
ein Diabetes mellitus Typ 1 (Erstdiagnose im Alter von 12,5 ± 9,4 Jahren), der
durch eine diabetische Nephropathie zur terminalen Niereninsuffizienz geführt
hatte. Vor der Transplantation wurde bei 21 dieser Patienten über 29,6 ± 20,6
Monate eine Nierenersatztherapie durchgeführt, bei 12 Patienten als Hämodialyse, bei 5 Patienten als Peritonealdialyse. 4 Patienten wurden im Stadium der präterminalen Niereninsuffizienz transplantiert. Bei einem Patient der Gruppe waren diese Daten nicht verfügbar.
Innerhalb der Gruppe B wurde eine Stichprobe von 15 Patienten (Gruppe B*)
intensiver untersucht (vgl. 3.2.1). Bei 7 dieser 15 Patienten (46,7%) bestand als
renale Grunderkrankung eine Glomerulonephritis, bei 2 Patienten (13,3%) ein
Alportsyndrom sowie in jeweils einem Fall Refluxnephropathie, interstitielle
Nephritis, Zystennieren, Nephrosklerose, Nierenzellkarzinom und Schrumpfnieren. Damit entspricht die Verteilung in etwa der in der gesamten Gruppe B, in
der ebenfalls Glomerulonephritiden mit 31,3% gefolgt von Zystennieren (14,1%)
zu den häufigsten Ursachen einer terminalen Niereninsuffizienz zählen.
Die der Transplantation vorausgehende Nierenersatztherapie wurde über einen
im Vergleich zur Gruppe A deutlich längeren Zeitraum durchgeführt, was mit
der Situation der Wartelisten vereinbar ist.
Tabelle 2: Dauer und Typ der vor der Transplantation durchgeführten Nierenersatztherapie
werden verglichen: Patienten nach NTx warteten länger auf ein Transplantat als nach PTx. In
beiden Gruppen dominiert die Hämodialyse.
Dauer der Nierenersatztherapie
Gruppe A
(PTx)
Gruppe B
(NTx)
24,3 ± 22,9 (n = 21)
68,0 ± 29,4 (n = 49)
p-Wert
p < 0,001
[Monate]
HD
CAPD
präterminal
keine Angaben
n = 12
n=5
n=4
n=1
29,5 ± 20,6
39,3 ± 23,5
n = 42
n=5
n=2
n = 11
64,9 ± 32,7
35,4 ± 40,8
13
2.1.2.3. Transplantationstypen
Alle 22 Patienten der Gruppe A erhielten im Beobachtungszeitraum ein Pankreastransplantat (PTx); zwei Patienten wurden nach einem Pankreastransplantatverlust während dieser Zeit einmal bzw. zweimal pankreasretransplantiert, sodass insgesamt 25 Pankreastransplantationen beobachtet werden konnten.
Bei 20 der Patienten erfolgte eine kombinierte Nieren-Pankreas-Transplantation
(SPKT), in jeweils einem Fall wurde eine isolierte Pankreastransplantation bzw.
eine Pankreas-after-Kidney-Transplantation durchgeführt. Unter den 20 SPKTPatienten befanden sich 3 Patienten, die das Pankreastransplantat infolge einer
Pankreastransplantatthrombose
verloren
und
im
Beobachtungszeitraum
pankreasretransplantiert werden konnten. Bei einem dieser Patienten fanden die
vorausgehende SPKT und der Transplantatverlust bereits vor Beginn der Beobachtungszeit statt. Ebenfalls in die 20 SPKT-Patienten eingeschlossen wurde
ein Patient mit umgekehrter Konstellation: Nach Versagen des Nierentransplantates musste eine Nephrektomie durchgeführt werden; später erhielt der
Patient im Rahmen einer Nierenretransplantation ein neues Organ.
Bei den Pankreastransplantationen wurde ausnahmslos das Verfahren der systemisch-venösen und enteralen Drainage genutzt.
Der Gruppe B (NTx) gehören alle isoliert nierentransplantierten Patienten
(n = 64) an. Sie lässt sich unterteilen in 53 Patienten (82,8%), die eine postmortale Organspende erhielten, und 11 Patienten (17,2%), die von einer Lebendspende
Gebrauch machen konnten. In 8 Fällen (12,5%) handelte es sich um eine Zweittransplantation, alle anderen Patienten (darunter alle Empfänger einer Lebendspende) erhielten erstmalig ein Transplantat.
In der Stichprobe (Gruppe B*) befanden sich 5 Empfänger von Lebendspenden
(33,3%) und 10 Empfänger postmortaler Organspenden (66,7%); 3 Patienten
(20%) waren in der Vorgeschichte bereits transplantiert worden.
14
2.1.2.4.
Immunsuppression
Die Induktionsimmunsuppression der Patienten nach Nieren- wie kombinierter
Pankreas-Nierentransplantation bestand aus der zweimaligen intravenösen Gabe
von jeweils 250 mg Methylprednisolon [Solu Decortin H®] – präoperativ und
intraoperativ vor der Reperfusion des Transplantats. Zusätzlich wurde nach
Narkoseeinleitung gewichtsadaptiert Anti-T-Lymphozyten-Globulin [Thymoglobulin®] als intraoperative single shot Induktion gegeben (1,25 mg/kg Körpergewicht nach IKT bzw. 1,5 mg/kg Körpergewicht nach SPKT). Am ersten postoperativen Tag wurden 125 mg Methylprednisolon i.v. verabreicht, außerdem
auf zwei Tagesdosen verteilt 0,15 mg/kg Körpergewicht Tacrolimus sowie die
erste Gabe Mycophenolat mofetil (2x 1g).
In besonderen Risikosituationen (wie Retransplantationen) kam außerdem der
monoklonale IL-2-Antikörper Daclizumab (2 mg/kg Körpergewicht präoperativ
und viermal wiederholt im Abstand von 14 Tagen) zum Einsatz. Bei Transplantationen von Nieren-Lebendspenden wurde bereits einige Tage präoperativ mit
der Einnahme von Tacrolimus begonnen.
Die Erhaltungsimmunsuppression der Patienten wurde in den meisten Fällen
gewährleistet durch eine Tripeltherapie bestehend aus Steroiden [Decortin H®],
Tacrolimus [Prograf®] und Mycophenolat mofetil [CellCept®]. Dabei wurde die
Steroiddosis schrittweise von initial 20 auf 5 mg/d reduziert (vgl. Tabelle 3). Der
Tacrolimusspiegel sollte in den ersten drei Monaten nach IKT zwischen 8 und
15 ng/ml (nach SPKT zwischen 10 und 15 ng/ml), anschließend bei 8-12 ng/ml
nach IKT (bzw. bei 8-15 ng/ml nach SPKT) liegen. Das Mycophenolat mofetil
wurde – sofern kein Grund zur Dosisreduktion vorlag – zweimal täglich mit 1 g
verabreicht.
Tabelle 3: Steroiddosis nach Nieren- bzw. kombinierter Pankreas-Nierentransplantation
Tage nach
Transplantation
MethylprednisolonDosis [mg/d]
Art der Verabreichung
1
2 – 14
15 – 28
29 – 42
ab 43
125 mg
20 mg
15 mg
10 mg
5 mg
i.v.
p.o.
p.o.
p.o.
p.o.
15
Drei Patienten wurden in die Euro-SKP-002-Studie aufgenommen und dem Studienprotokoll entsprechend behandelt: Dabei wurde Sirolimus (Rapamune®)
statt Mycophenolat mofetil in der Kombination mit Tacrolimus appliziert. Die
Induktion erfolgte auch hier mit Anti-Thymozytenglobulin und Steroiden, die als
Erhaltungstherapie nur bis zum 42. Tag post transplantationem gegeben wurden.
Ein Patient aus der Euro-SKP-002-Studie wurde aufgrund massiver Komplikationen nach einigen Wochen wieder ausgeschlossen.
2.1.3. Diagnosekriterien
2.1.3.1. Akute Abstoßungsreaktionen von Niere bzw. Pankreas
Als Definitionsgrundlage akuter Abstoßungsreaktionen der Niere wurde die Biopsie genutzt, die histopathologisch begutachtet und mittels Banff97 Klassifikation beurteilt wurde. Der Biopsietag wurde als Zeitpunkt der Abstoßungsreaktion angenommen.
Pankreasabstoßungen wurden nicht per Biopsie, sondern auf klinischer Grundlage diagnostiziert. Man beobachtete bei verschlechtertem Allgemeinzustand
Fieber, das trotz umfangreicher Fokussuche (Serologie CMV pp65-Antigen,
VZV, HSV, EBV; Urin-, Stuhl- und Blutkulturen; CT Thorax, Echokardiographie, MRT Abdomen) keiner anderen Ursache zugeschrieben werden konnte.
Zudem wurde laborchemisch ein Anstieg der Pankreasenzyme und des Nüchternblutzuckerspiegels verzeichnet. In Zusammenschau mit dem Ergebnis der
durchgeführten Sonographie sowie der Magnetresonanztomographie des Abdomens, die Veränderungen im Sinne einer Transplantatpankreatitis sichtbar machte, wurde der Verdacht einer Pankreasabstoßung geäußert und entsprechend eine
dreitägige Kortisonpulstherapie (250mg Methylprednisolon i.v.) eingeleitet. Als
Abstoßungszeitpunkt wurde der Therapiebeginn gesetzt, der in der begründeten
Annahme einer Pankreastransplantatabstoßung erfolgte.
16
2.1.3.2. Pankreastransplantatthrombose
Die Diagnose der Pankreastransplantatthrombose wurde gestellt basierend auf
der Beobachtung eines Funktionsverlustes des Transplantates, der sich durch
einen raschen und massiven Anstieg der Nüchtern-Blutzucker-Werte bemerkbar
machte. Zur Bestätigung wurden doppler- und duplexsonographische sowie
magnetresonanztomographische Untersuchungen der transplantierten Organe
durchgeführt, die den Perfusionsausfall belegen konnten.
In einem Fall wurde die Diagnose intraoperativ gestellt: Hier wurde unter anderer Verdachtsdiagnose relaparotomiert und als Zufallsbefund neben einer ödematösen Pankreatitis eine Thrombosierung der versorgenden Arteria mesenterica
superior festgestellt (vgl. 3.2.1).
2.1.3.3. Infektionen
In die vorliegende Untersuchung wurden schwerwiegende Infektionen eingeschlossen, die im Zeitraum bis zu zwei Monaten nach der Transplantation in
Erscheinung traten. Dabei fungierten klinische Beobachtungen sowie laborchemische und ggf. bildgebende Untersuchungen als Grundlage der Diagnostik.
Zum Zweck der Vergleichbarkeit wurde auch hier der Diagnosezeitpunkt der
Infektion gleichgesetzt mit dem Auftreten der Infektion.
Die Patienten erhielten nach IKT über drei Monate eine CMV-Prophylaxe (sofern sich nicht Empfänger und Spender seronegativ zeigten), die aus einer initialen intravenöser Gabe von 100 mg Ganciclovir sowie anschließender an die Nierenfunktion angepasster oraler Gabe von Valganciclovir bestand. Nach SPKT
wurde die intravenöse Gabe von 100 mg Ganciclovir bis zum 5. postoperativen
Tag ausgedehnt. Darüber hinaus wurde nach IKT als Pilz-Prophylaxe ebenfalls
über 3 Monate ab dem 1. postoperativen Tag Amphotericin B (4x 1 Lutschtablette bzw. Suspension Amphomoronal®) gegeben. Nach SPKT ging dieser Maßnahme eine initiale Gabe von 100 mg Fluconazol intraoperativ sowie am 1.
postoperativen Tag voraus. Als PCP-Prophylaxe wurde nach IKT wie nach
SPKT über 3 Monate 3x pro Woche 960 mg Cotrimoxazol gegeben.
17
2.2.
Material
2.2.1. Geräte
Zur Durchführung der Rocket-Immunelektrophorese wurden folgende Geräte
benötigt:
Elektrophoresekammer: Multiphor II Elektrophoresis (Amersham Biosciences, Code Nr. 18-1018-06 BR)
Netzgerät: Electrophoresis power supply (Consort E 833)
Als Zubehör erforderlich waren 2 Glasplatten (10 x 20 x 0,5 cm), eingeschweißtes Millimeterpapier (10 x 20 cm), 2 Schwammtücher (20 x 20 cm) sowie eine
eigens angefertigte Vorrichtung zum Ausstanzen der Wells für die Probenauftragung (Schablone und Lochstanzer). Außerdem werden Gelfolien (Gel Bond
Film for agarose gels, 124 x 258 mm, Amersham Biosciences, Code Nr. 80-112932) benötigt, auf eine Größe von 10 x 20 cm zugeschnitten.
2.2.2. Gel und Antikörper
Folgende Reagenzien wurden benötigt und in der angegebenen Weise zur Herstellung der verschiedenen Lösungen verwendet:
Agarosegel: 0,6 g Agarose (Sigma A-4679) mit 40 ml 1:2 verdünntem
Puffer vermischen
Puffer: Die unten aufgeführten Reagenzien werden in 5 Liter Aqua dest.
gelöst und mit Salzsäure (HCl, Baker 7088) auf pH 8,7 eingestellt.
- 88,60 g Tris ultrapure (AppliChem A 1086 CAS-Nr. 77-86-1)
- 44,80 g Barbital Natrium (Synopharm, CAS-Nr. 144-02-5)
- 1,23 g
L-Lactic Acid Calcium Salt Pentahydrate (MP Bio-
medicals Cat Nr. 153931)
- 0,13 g Natriumazid (Merck-Schuchardt, Art-Nr. 822335)
18
Antikörper:
- 900 µl Polyclonal Rabbit Anti-Human C3c-Complement
(DakoCytomation, A 0062)
- 224 µl Polyclonal Rabbit Anti-Human C3d-Complement
(DakoCytomation, A 0063)
Färbelösung:
- 5 g Coomassie Brillant Blue G250 (Biomol 03282)
- 450 ml Ethanol (Baker 8006)
- 100 ml Essigsäure (Baker 6052)
- 100 ml Aqua dest.
Entfärbelösung:
- 450 ml Ethanol (Baker 8006)
- 100 ml Essigsäure (Baker 6052)
- 450 ml Aqua dest.
2.3.
Methoden
2.3.1. Rocketimmunelektrophorese zur Bestimmung der
C3d-Konzentration
Da keine verlässlichen kommerziell vertriebenen Testsysteme zur Bestimmung
der Komplementaktivierung existieren, musste ein geeignetes Testverfahren aufgebaut werden. Die Rocket-Immunelektrophorese (RIE) ist ein Verfahren, das
auf dem Prinzip der Immunpräzipitation beruht, die verbunden wird mit der
elektrophoretischen Auftrennung der Proteine [52]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde diese Methode genutzt, um das Komplementspaltprodukt C3d
in EDTA-Plasmaproben zu quantifizieren. Eigens zu diesem Zweck wurde der
Versuch nach einem Versuchsprotokoll durchgeführt, das im Immunologischen
Labor von Prof. H. H. Peter in der Medizinischen Klinik des Universitätsklinikums Freiburg entwickelt wurde. Die Methode wurde von der Verfasserin im
19
Zentrum für Klinische Forschung der Ruhr-Universität Bochum aufgebaut und
standardisiert.
Das C3-Molekül (ca. 180kDa) wird im Zuge der Komplementaktivierung durch
die C3-Konvertasen gespalten in die Komponenten C3a (chemotaktische Funktion) und C3b. C3b, das für den weiteren Ablauf der Komplementkaskade essentiell ist, wird durch den Faktor I hydrolytisch gespalten, sodass neben einem
kleinen C3f-Fragment das inaktivierte Spaltprodukt iC3b entsteht. iC3b wiederum wird zu C3c und C3dg abgebaut, C3dg durch Trypsin und neutrophile Elastasen zu C3d und C3g [35, 65].
Das Komplementspaltprodukt C3d ist somit – ebenso wie das Spaltprodukt C3c
– Bestandteil des C3-Moleküls, sodass Antikörper, die gegen eine dieser Komponenten gerichtet sind, gleichzeitig immer auch das Gesamt-C3 binden.
Aus diesem Grund wird zum Nachweis der Komponente C3d ein zweischichtiges Agarosegel gegossen: Etwa zwei Drittel der 10 x 20 cm großen Gelfolie werden mit anti-C3d-Antikörper-haltigem Agarosegel beschichtet. Anschließend
wird das verbleibende Drittel mit anti-C3c-haltigem Agarosegel versehen. Zum
Probenauftrag werden Löcher entlang der Gelgrenze auf der Seite des C3chaltigen Gels eingestanzt. Somit durchwandern die elektrophoretisch aufzutrennenden Proteine zunächst die anti-C3c-haltige Schicht, die die großen C3Proteine wie auch die Komponente C3c abfängt. Die noch nicht präzipitierten
Proteine laufen weiter in das sich anschließende anti-C3d-haltige Gel. Hier ausfallende Proteine stellen die C3d-Fraktion dar und können, da ihre Wanderungsstrecke bei konstanter Antikörperkonzentration im linearen Verhältnis zur Konzentration steht, im Anschluss an die Färbung des Gels anhand des Vergleichs
mit einer Standard-Kurve quantifiziert werden.
Das Komplementspaltprodukt C3d entsteht im Zuge der Komplementaktivierung, in deren Mittelpunkt unabhängig vom eingeschlagenen Aktivierungsweg
die C3-Konvertase gestellt ist. Ein C3d-Anstieg weist somit auf einen verstärkten
C3-Umsatz.
20
Im Einzelnen müssen folgende Schritte durchgeführt werden. Die Darstellung
orientiert sich an der im Immunologischen Labor Freiburg angewandten Methode.
Vorbereitend wird die Gelfolie auf die Größe 10 x 20 cm zurechtgeschnitten und
an ihrer hydrophoben Seite mit zwei Linien auf der Höhe von 2,5 und 3 cm beschriftet. Auf die hydrophile Seite wird ein Tesafilmstreifen geklebt, dessen Oberkante der Linie auf 2,5 cm anliegt. Mit den überstehenden Enden des Tesafilmstreifens wird die Folie auf der ebenfalls 10 x 20 cm großen Glasplatte befestigt.
Die hydrophile Seite der Folie zeigt nach oben. Glasplatte samt Folie werden bei
70°C für ca. 20-25 min vorgewärmt.
Im Vorfeld des Versuches wird der Kammerpuffer nach obiger Anleitung angesetzt. 550 ml dieser Pufferlösung werden mit 550 ml Aqua dest. im Verhältnis
1:2 verdünnt und in jede der beiden Kammern des Elektrophoresegerätes gefüllt.
Die zu testenden Proben und Standards werden bei Raumtemperatur aufgetaut.
Im 56°C Wasserbad werden drei 15 ml-Tubes (für die später einzufüllende Agarose) sowie drei Eppendorfgefäße (für die Antikörper) für etwa 10 min vorgewärmt.
Zur Herstellung des Zweischichtgels werden 0,6 g der Agarose im 100 ml - Erlenmeyerkolben in 20 ml des Kammerpuffers und 20 ml Aqua dest. gegeben und
durch leichtes Schwenken vermengt. Der Erlenmeyerkolben wird in die Mikrowelle gestellt und unter Beobachtung aufgekocht. Sobald die Agarose überzuschäumen droht, wird die Mikrowelle ausgestellt und der Erlenmeyerkolben
leicht geschwenkt, bis keine Luftblasen mehr sichtbar sind. Diesen AufkochVorgang wiederholt man ca. fünf bis sechs mal – bis das Überkochen ausbleibt
und eine klare Lösung mit regelmäßiger Blasenbildung beobachtet werden kann.
Die gelöste Agarose wird direkt anschließend mit der 20 ml - Glaspipette in die
vorgewärmten 15 ml - Tubes umgefüllt: In zwei Tubes werden je 11,2 ml Agarose, in das dritte werden 8 ml pipettiert.
In eines der vorgewärmten Eppendorf-Cups werden jetzt 900 µl Anti-C3cAntikörper, in die anderen beiden je 112 µl Anti-C3d-Antikörper pipettiert, die
21
ca. 10 min bei 56 °C dort verbleiben. Während die Agarose und Antikörper temperiert werden, können die Standard-Verdünnungsreihe (1:2 bis 1:32) hergestellt
und die Kontrollproben (1:20 bzw. 1:40) verdünnt werden.
Jetzt werden die Antikörper zur Agarose zugegeben: 112 µl des C3d-Antikörpers
werden zu jedem der mit 11,2 ml Agarose gefüllten Tubes gegeben, 900 µl des
C3c-Antikörpers zu den 8 ml Agarose. Die vorsichtige Durchmischung sollte
ohne Blasenbildung erfolgen.
Die vorgewärmte Glasplatte mit Folie wird auf eine ebene Oberfläche gelegt.
Zügig und gleichmäßig wird die mit Anti-C3d versehene Agarose auf den oberen, größeren Teil der Folie gegossen. Mit den Tube-Rändern kann das Gel bis
an die Folienränder ausgezogen werden.
Das Gel erstarrt nach einiger Zeit und wird milchig-grau. Erst dann kann der
Tesafilmstreifen entfernt werden; mit dem Skalpell wird entlang der 3 cm-Linie
geschnitten und ein 0,5 cm breiter Gelstreifen vorsichtig abgetrennt. Die stumpfe
Skalpellseite kann genutzt werden, um den Gelstreifen abzuheben; mit Papiertüchern wird nachgewischt, um alle Reste zu entfernen. Jetzt kann die zweite mit
Anti-C3c versetzte Gelschicht auf den unteren Teil der Folie gegossen werden.
Dabei ist darauf zu achten, dass kein Anti-C3c-Gel in den oberen Teil überläuft.
Nach dem Auskühlen des Gels wird die Folie in eine Vorrichtung eingespannt,
mittels derer Löcher gleicher Größe und gleichen Abstandes ausgestanzt werden
können. Eine Vakuumpumpe mit aufgesetzter Glaspipette wird genutzt, um das
Agarosegel aus den gestanzten Löchern abzusaugen.
Die fertige Gelfolie wird hochkant (die Löcher auf der Kathodenseite) auf die
Trägerplatte der Elektrophoresekammer gelegt: zuunterst die Glasplatte, die sehr
exakt ausgerichtet werden muss. Darauf liegt das eingeschweißte Millimeterpapier, das auf der unteren Seite mit einigen Wassertropfen angefeuchtet der Glasplatte anliegt; schließlich folgt zuoberst die Folie.
Ebenfalls gerade ausgerichtet werden muss die Trägerplatte der Elektrophoresekammer. Die Proben und Standardverdünnungen werden gut durchmischt und
22
je 2 µl davon in die Wells eingebracht. Dabei werden die Positionen 1 bis 5
durch die Verdünnungen der Standardlösung belegt, Position 6 und 7 durch die
verdünnten Kontrollen. Die zu testenden EDTA-Plasmaproben werden in die
Wells Nr. 6 bis 37 gefüllt; die Position 39 wird schließlich mit der 1 : 8 verdünnten Standardlösung belegt.
Jetzt werden die Schwammtücher im Kammerpuffer getränkt und ca. 1 cm überlappend auf die Folienränder gelegt. Zur Fixierung wird eine zweite Glasplatte
gleicher Größe oben aufgelegt. Die Kühlung der Elektrophoresekammer wird
aktiviert und das Netzgerät auf 80-100 mA und 260-280V eingestellt.
Nach einer Laufzeit von 6 Stunden wird die Folie entnommen, Filterpapier auf
die Gelseite, beidseits dicke Zellstofflagen aufgelegt und mit einem Gewicht versehen mindestens 20 Minuten beschwert. Anschließend wird die Folie für mindestens 8 Stunden in eine mit 300-400 ml 0,9%iger Natriumchlorid-Lösung gefüllte Wanne im Kühlschrank gelagert.
Am nächsten Tag wird ein zweites Mal Filterpapier auf das Gel gelegt, beiderseits Zellstoff aufgebracht und mit einem Gewicht für ca. 25 Minuten beschwert.
Anschließend wird die Folie für 1,5 Std. bei 70°C in die Trockenkammer gelegt.
Damit sich die Ränder nicht wellen, werden die Ecken mit Messingklötzchen
beschwert. Nach Ablauf der 1,5 Stunden wird die Folie unter Leitungswasser
abgespült und an der Luft getrocknet.
Die Färbung erfolgt durch ca. zehnminütiges Einbringen der Folie in die Färbelösung. Es folgt die Entfärbung je 10 Minuten nacheinander in zwei Gefäßen mit
der entsprechenden Lösung – so lange, bis die Hintergrundfärbung ausgewaschen ist und nur die Peaks zu sehen sind.
Schließlich wird noch einmal mit Leitungswasser abgespült und vorsichtig getrocknet.
23
Abb. 1: Versuchsaufbau der Rocket-Immunelektrophorese: Dargestellt ist die Elektrophoresekammer mit der Gelfolie, der beiderseits in Kammerpuffer getränkte Schwammtücher angelegt
werden, um den Stromkreis zu schließen.
Abb. 2: Gezeigt ist die Folie nach Anfärbung. Die im Bereich des anti-C3d-haltigen Gels markierten Peaks ermöglichen die Ausmessung der Wanderungsstrecke und durch Vergleich mit der
Eichkurve die Bestimmung der C3d-Konzentration.
24
Zur Auswertung werden nach Beschriftung der Folie und Nummerierung der
Löcher die C3d-Peaks mit Folienstift markiert. Ihre Höhe wird gemessen ab der
Oberkante des Stanzloches und mit Hilfe von Excel in Relation gesetzt zu den
Werten der Standardverdünnungen mit bekannter C3d-Konzentration.
C3d-Auswertung
Test-Datum:
[mg/l]
Standard-Kurve
C3d-Standardreihe [mg/l] Peak [cm]
ab 20.6.2002 gemessen
190,00
(1:2)
95,00
6,05
(1:4)
47,50
4,75
(1:8)
23,75
3,7
(1:16)
11,88
2,7
(1:32)
5,94
1,8
2,97
1,48
[cm]
Potentielle Trendkurve
Patient
1
2
3
[C3d]=
1,3604
Peak
2,5
1,8
2,1
Verd.
*Peak^ 2,2887
1
1
1
[C3d]
11,1
5,2
7,4
Abb.3: In der dargestellten Excel-Tabelle kann die C3d-Konzentrationen [mg/l] ermittelt werden. Dabei wird die gemessene Wanderungsstrecke im Gel („Peak“, angegeben in cm) in Relation gesetzt zur Standardkurve.
Als normwertig gelten C3d-Konzentration <9 mg/dl. Dieser Cut-off ergibt sich
durch zum Vergleich herangezogene Untersuchungen an 31 gesunden Personen
(Laborpersonal), in deren Blut C3d-Konzentrationen von 6,4 ± 1,8 mg/l vorlagen. Eine weitere Vergleichsgruppe wurde gebildet aus 80 langzeittransplantierten Patienten, bei denen zwischen 1979 und 1997 eine isolierte Nierentransplantation durchgeführt worden war. Bei diesem Kontrollkollektiv wurden
zum Untersuchungszeitpunkt mögliche Ursachen für eine Komplementaktivie25
rung ausgeschlossen, insbesondere lagen keine Abstoßungsepisode und keine
chronische Rejektion oder chronische Infektion vor (CMV Antigen negativ, Serologie für HIV, HCV und HBV negativ). Ihre mittlere C3d-Konzentration lag
bei 6 ± 3 mg/l, womit sie trotz der mit der Transplantation verbundenen Besonderheiten des immunologischen Status in Bezug auf die Komplementaktivierung
den gesunden Kontrollpersonen entsprechen.
2.3.2. CRP-Bestimmung und Leukozytenzählung
Konzentrationen des C-reaktiven Proteins (CRP) sowie Leukozytenzahlen wurden im Zentrallabor des Knappschaftskrankenhauses Bochum Langendreer im
Rahmen des routinemäßigen Laborprogramms für die Patienten der Transplantationsstation ermittelt. Die Bestimmung des CRP erfolgte nephelometrisch mit
einem Normwert von <0,3 mg/dl, die Leukozytenzählung automatisch mit einem Referenzbereich von 4 000 bis 10 000/µl.
2.4. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Computerprogrammes SigmaStat 3.1. Zur Anwendung kommt die Berechnung von arithmetischem Mittel,
Standardabweichungen sowie als statistische Tests der student´s t-Test bzw.
Mann-Whitney Rank Sum Test sowie Chi-Quadrat-Test bzw. Fisher-exact Test.
P-Werte von <0,05 wurden als statistisch signifikant angenommen.
Die entsprechenden Grafiken wurden unter Verwendung der Computersoftware
SigmaPlot 9.0 erstellt.
26
3.
Ergebnisse
3.1. Postoperative C3d-Konzentrationen nach
Nieren- bzw. Pankreastransplantation
Die Bestimmung des Komplementspaltproduktes C3d ergab bei den transplantierten Patienten, die in den ersten 40 Tagen nach der Transplantation beobachtet wurden (Gruppe A und B*), mit im Mittel 10,9 ± 0,6 mg/l insgesamt gegenüber der Norm gesunder Probanden (6,4 ± 1,8 mg/l) wie langzeittransplantierter
Patienten (6 ± 3 mg/l) signifikant erhöhte Werte (p < 0,001*).
Es konnte kein signifikanter Unterschied ausgemacht werden zwischen den
Patienten, die (zumeist im Rahmen einer simultanen Pankreas-/Nierentransplantation) ein Pankreastransplantat (PTx) erhielten (10,6 ± 1,2 mg/l), und denen, die nach isolierter Nierentransplantation (NTx) untersucht wurden
(11,0 ± 0,9 mg/l; p = 0,49: PTx vs. NTx).
C3d-Verlaufsbeobachtungen in diesem Zeitraum ergaben bei nierentransplantierten Patienten im Mittel postoperativ initial erhöhte Werte von
12,2 ± 3,7 mg/l bei einer Spannbreite von 6,7 bis 18,0 mg/l. Im Verlauf der ersten 40 postoperativen Tage fielen diese Werte bis auf 9,7 ± 1,1 mg/l ab (Spannbreite von 8,6 bis 10,8 mg/l).
Bei pankreastransplantierten Patienten hingegen fand sich eine genau entgegengesetzte Entwicklung: Die postoperativen Werte betrugen im Mittel anfänglich
8,7 ± 3,1 mg/l (Spannbreite 5,0 bis 14,3 mg/l) und stiegen zum 40. Tag bis auf
11,6 ± 3,5 mg/l bei einer Spannbreite 5,0 bis 18,0 mg/l an (vgl. Abb. 4).
27
C3d-Verlauf postoperativ
14
C3d [mg/l]
12
10
8
bi
s
39
34
35
Ta
g
Ta
g
25
30
bi
s
bi
s
29
24
Ta
g
20
Ta
g
15
Ta
g
10
bi
s
19
bi
s
14
bi
s
bi
s9
5
Ta
g
Ta
g
Ta
g
1
bi
s4
0
Tag nach Transplantation
C3d nach Pankreastransplantation (Gruppe A)
C3d nach Nierentransplantation (Gruppe B)
Abb. 4: Der C3d-Verlauf in den ersten 40 Tagen nach Pankreastransplantation zeigt eine fallende, nach Nierentransplantation eine steigende Tendenz. Angegeben sind jeweils die Mittelwerte
mit dem entsprechenden Standarderror.
28
3.2. C3d-Konzentrationen bei Abstoßungsreaktion
und Pankreastransplantat-Thrombose
3.2.1. Charakterisierung der Patientengruppen I bis VI
Zur Untersuchung der Bedeutung der systemischen Komplementaktivierung in
der Frühphase nach Nieren- bzw. Pankreastransplantation wurde das unter 2.1.
beschriebene Patientenkollektiv in Abhängigkeit des Auftretens von Abstoßungsreaktionen, Pankreasthrombosen und Infektionen folgendermaßen subgruppiert:
Gruppe A (PTx), n = 25
Gruppe B* (NTx), n = 15 (aus 64)
Gruppe I (PTx, P-AR)
Pankreas-Abstoßung, n = 3
Gruppe II (PTx, N-AR)
Gruppe V (NTx, N-AR)
Nieren-Abstoßung, n = 7
Nieren-Abstoßung, n = 8
Gruppe III (PTx, P-Thr)
Pankreasthrombose, n = 4
Gruppe IV (PTx, Ko)
Gruppe VI (NTx, Ko)
Kontrolle: keine Abstoßung,
keine Pankreasthrombose
n = 11
Kontrolle: keine Abstoßung
n=7
Gruppe IVa (PTx, Ko, -Inf)
Kontrolle, keine Infektion
n=6
Gruppe IVb (PTx, Ko,+Inf)
Kontrolle, Infektion
n=5
Gruppe VIa (NTx, Ko)
Kontrolle, keine Infektion
n=3
Gruppe VIb (NTx, Ko):
Kontrolle, Infektion
n=4
Abb. 5: Übersicht über die Einteilung der Patienten
29
Eingeschlossen in die Beobachtungen sind somit alle 25 Pankreastransplantationen, die bei den Patienten der Gruppe A durchgeführt wurden, außerdem alle
Patienten der Gruppe B, bei denen eine Abstoßungsreaktion festgestellt wurde.
Als Kontrollgruppe (Gruppe VI) wurde aus dem Pool der 64 nierentransplantierten Patienten der Gruppe B mittels matched-pairs-Technik eine der Größe der
Gruppe V entsprechende Zahl an Patienten ausgewählt und untersucht.
Bezüglich der Alterstruktur finden sich keine signifikanten Unterschiede innerhalb der Subgruppen I-IV bzw. V-VI. Auch die Geschlechtsverteilung entspricht
einander mit Ausnahme der Gruppen I und III, in denen sich das in allen anderen Gruppen pankreastransplantierter Patienten zu findende Verhältnis von etwa
2,5 : 1 (männlich : weiblich) annähernd umkehrt. Die gleiche Beobachtung gilt
für die Kontrollgruppe VIb (nierentransplantierte Patienten mit Infektion), die im
Gegensatz zu den anderen Subgruppen nierentransplantierter Patienten mehr
weibliche als männliche Patienten umfasst (1 : 3, männlich : weiblich).
Die Dauer der der Transplantation vorausgehenden Nierenersatztherapie war
gleich lang innerhalb der Subgruppen der pankreas- bzw. nierentransplantierten
Patienten.
Die kalte Ischämiezeit der transplantierten Organe zeigt für das Pankreas keine
relevanten Differenzen zwischen den Subgruppen; einzig der Unterschied zwischen den beiden Kontrollgruppen IVa und IVb zeigt sich statistisch signifikant
(p = 0,046*), wobei die längere Ischämiezeit bei den Patienten ohne Infektion
beobachtet werden konnte. Für die Niere zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede in der Dauer der kalten Ischämiezeit; nur die Patienten der Gruppe I
konnten durch auffällig kurze Ischämiezeiten charakterisiert werden.
30
Tabelle 4: Vergleich der demographischen, transplantationstechnischen und verlaufsrelevanten Charakteristika der Gruppen I bis VI
Gruppe IVa
Gruppe IVb
Gruppe B* (NTx, Stichprobe aus 64 Pat.)
Gruppe VI
NTx, Kontrolle: keine AR
Gruppe V
NTx, N-AR
Gruppe VIa Gruppe VIb
keine Infektion
Infektion
keine Infektion
Gruppe A (PTx)
Gruppe IV
Gruppe I
Gruppe II
Gruppe III
PTx, P-AR
PTx, N-AR
PTx, P-Thr
Anzahl n
3
7
4
Alter [Jahre]
32,7 ± 8,1
41,9 ± 9,2
42,5 ± 6,2
Geschlechterverhältnis
m:w
1:2
2,5 : 1
1:3
männlich
weiblich
1 (33,3%)
2 (66,7%)
5 (71,4%)
2 (28,6%)
1 (25%)
3 (75%)
Dauer der
Nierenersatztherapie
[Monate]
28,5 ± 24,7
25,8 ± 30,1
16,3 ± 21,8
0% präterm.
Niereninsuff.
29% präterm.
Niereninsuff.
50% präterm.
Niereninsuff.
Niere
7,6 ± 0,9
Niere
12,4 ± 4,3
Niere
15,4 ± 6,0
Pankreas
11,3 ± 2,9
Pankreas
11,8 ± 4,9
Pankreas
13,1 ± 4,7
35,7 ± 11,8
32,4 ± 39,8
15,0 ± 11,8
kalte
Ischämiezeit
[Stunden]
Zeitpunkt
AR / Thr
[d post Tx]
PTx, Kontrolle: keine AR/P-Thr
11
6
5
44,4 ± 11,1
44,5 ± 7,7
49,0 ± 12,6
2,7 : 1
8 (72,7%) / 3 (27,3%)
2:1
4:1
4 (66,7%)
4 (80%)
2 (33,3%)
1 (20%)
18,3 ± 19,2
27% präterm. Niereninsuffizienz
18,8 ± 18,1
8,5 ± 9,3
33% präterm. NI
20% präterm. NI
8
51,5 ± 12,0
1,7 : 1
5 (62,5%)
3 (37,5%)
43,6 ± 41,8
13% präterminale
Niereninsuffizienz
Niere 13,6 ± 3,5
Pankreas 13,0 ± 2,6
Niere
Niere
14,8 ± 3,1
11,4 ± 3,5
Pankreas
Pankreas
14,4 ± 1,6
11,1 ± 2,9
Niere
10,7 ± 6,7
---
34,3 ± 26,2
Infektion
7
3
4
45,4 ± 13,2
35,0 ± 9,5
53,3 ± 10,0
1,3 : 1
4 (57,1%) / 3 (42,9%)
1:2
3:1
1 (33,3%)
3 (75%)
2 (66,7%)
1 (25%)
53,9 ± 31,9
14% präterm. Niereninsuffizienz
43,0 ± 43,0
62,0 ± 24,5
33% präterm. NI
0% präterm. NI
Niere
10,9 ± 6,0
Niere
8,5 ± 8,1
Niere
12,7 ± 4,2
---
31
3.2.2. C3d-Konzentrationen bei Abstoßungsreaktionen
von Pankreas- bzw. Nierentransplantat
Eine Abstoßungsreaktion des Pankreas (Gruppe I) wurde in 12% der untersuchten Transplantationen beobachtet; Zeitpunkt der Diagnosestellung und Therapieeinleitung war Tag 35,7 ± 11,8 post transplantationem.
Die Messung der C3d-Konzentrationen ergab im Zeitfenster der Abstoßungsreaktion (Tag 9 vor bis Tag 7 nach der Abstoßung) mit 14,0 ± 3,5 mg/l ein gegenüber der Kontrollgruppe erhöhtes Niveau (p = 0,046* I vs. IV). Für den unmittelbaren Zeitraum der Abstoßung (Tag 2 vor der Abstoßung bis zum Tag der Abstoßung) kann bei mittleren Werten von 14,0 ± 1,4 mg/l eine entsprechende
Aussage getroffen werden (p = 0,018*).
Abstoßungen des Nierentransplantates nach SPKT kamen in 35% der Fälle, im
Schnitt am Tag 32,4 post transplantationem (Spannbreite Tag 7 bis 121), vor.
Der mittlere C3d-Wert der Patienten dieser Gruppe betrug im Zeitfenster von 9
Tagen vor bis 7 Tagen nach der Abstoßung 12,7 ± 2,0 mg/l und differierte trotz
erkennbarer tendenzieller C3d-Niveau-Erhöhung nicht signifikant von den Konzentrationen in der Kontrollgruppe (p = 0,074: II vs. IV). Unmittelbar im Zeitraum der Abstoßung (Tag 2 vor bis zur Abstoßung) konnten C3dKonzentrationen von 15,9 ± 7,6 mg/l gemessen werden.
Die Betrachtung des C3d-Verlaufes ließ bei den Patienten der Gruppen I und II
diskrete Tendenzen eines Anstieges im Vorfeld der Abstoßung ausmachen. Dieser wird in seiner Aussagekraft jedoch eingeschränkt durch stark interindividuell
differierende C3d-Niveaus und -Verläufe.
In der Gruppe der Patienten nach isolierter Nierentransplantation konnte keine
charakteristische Veränderung der C3d-Konzentration beobachtet werden.
32
C3d-Verlauf Gruppe I (PTx, P-AR)
30
25
C3d [mg/l]
20
15
10
5
0
Ta
9
g-
bis
-6
Ta
is
5b
g-
-3
2b
gTa
0
is
g1
Ta
bis
7
Tage vor bzw. nach Pankreastransplantatabstoßung
Abb. 6: Die C3d-Konzentration bei den pankreastransplantierten Patienten der Gruppe I zeigt
einen tendenziellen Anstieg im zeitlichen Umfeld der Pankreastransplantatabstoßung.
C3d-Verlauf Gruppe II (PTx, N-AR)
30
25
C3d [mg/l]
20
15
10
5
0
9b
gTa
-6
is
T
ag
is
5b
-3
g
Ta
-2
bis
0
g
Ta
1b
is
3
g
Ta
4b
7
is
Tage vor bzw. nach Nierentransplantatabstoßung
Abb. 7: Dargestellt ist der Verlauf der C3d-Konzentration bei den pankreastransplantierten Patienten der Gruppe II im zeitlichen Umfeld der Nierentransplantatabstoßung.
33
C3d-Verlauf Gruppe V (NTx, N-AR)
30
25
C3d [mg/l]
20
15
10
5
0
Ta
9b
g-
-6
is
Ta
5
g-
bis
-3
Ta
2
g-
bis
0
g1
Ta
bis
3
T
4
ag
bis
7
Tage vor bzw. nach Nierenabstoßung
Abb. 8: Der Verlauf der C3d-Konzentration bei den isoliert nierentransplantierten Patienten der
Gruppe V bleibt von der Nierentransplantatabstoßung unbeeinflusst.
Nach isolierter Nierentransplantation traten bei 8 Patienten (12,5%) am Tag 34,3
± 26,2 post transplantationem akute Abstoßungsreaktionen auf. Betroffen waren
3 Empfänger von Lebendspenden und 5 Empfänger postmortaler Organspenden.
Im Blut dieser Patienten wurden im entsprechenden Zeitraum C3d-Konzentrationen von 10,1 ± 0,6 mg/l gemessen, die sich von den Werten der Kontrollgruppe VI während der ersten 40 postoperativen Tage (11,9 ± 0,6 mg/l) signifikant unterschieden (p < 0,001* V vs. VI). Allerdings wies dieser Unterschied eine den Beobachtungen bei PTx-Patienten entgegengesetzte Richtung auf, indem
die C3d-Werte der Patienten mit Abstoßung unter denen der Kontrollgruppe
lagen.
Nach Differenzierung dieser Kontrollgruppe VI in Abhängigkeit des Auftretens
von Infektionen in den ersten zwei Monaten nach der Transplantation zeigte
sich ein signifikanter Unterschied lediglich zur Untergruppe von Patienten mit
Infektion (p < 0,001*: V vs. VIb), die erhöhte C3d-Konzentrationen aufwiesen.
Hingegen bestand kein Unterschied zu den Patienten ohne entsprechendes Infektionsgeschehen.
34
Betrachtet man beide Kontrollgruppen (IV und VI) gemeinsam, so bestätigt sich
das Bild geringerer C3d-Konzentrationen in der infektionsfreien Gruppe (IVa
und VIa) im Vergleich zur Gruppe der Patienten, die eine Infektionen erlitten
(p= 0,003*: IVa+VIa vs. IVb+VIb) (vgl. Tabelle 4).
Unter den transplantierten Patienten in der Gruppe A lässt sich eine entsprechende Tendenz erkennen, die allerdings außerhalb des statistischen Signifikanzniveaus bleibt (p = 0,061: I vs. IVa bzw. p = 0,114: I vs. IVb).
Vergleich der C3d-Konzentrationen der Patientengruppen I bis VI
20
C3d [mg/l]
15
10
5
0
AR
P-
P
ch
na
Tx
AR
N-
P
ch
na
Tx
r
Th
Tx
hP
c
na
o
xK
T
P
AR
N-
n
hN
ac
Tx
o
xK
T
N
Patientengruppen
Transplantatabstoßung bzw. -thrombose
Kontrollgruppe gesamt
Kontrollgruppe ohne Infektion
Kontrollgruppe mit Infektion
Abb. 9: Vergleich der C3d-Konzentrationen der untersuchten Patientengruppen I bis VI.
35
3.2.3. C3d-Konzentration bei Pankreastransplantatthrombose
Nach 4 Transplantationen (16%) kam es am Tag 15,0 ± 11,8 post transplantationem zu Thrombosen des Pankreastransplantates, die in 3 Fällen (12%) zum Verlust des Transplantates führten. In einem Fall wurde der Befund einer Thrombose der A. mesenterica superior intraoperativ inzidentell entdeckt. Es zeigten sich
ödematöse Veränderung des Pankreas; Nekrosen oder ischämiebedingte Verfärbungen ließen sich jedoch nicht nachweisen, sodass nach erfolgreichem FogartyManöver eine ausreichende Perfusion gewährleistet war und das Organ erhalten
werden konnte.
Bei den betroffenen Patienten wurden im relevanten Zeitfenster C3dKonzentrationen von 9,1 ± 1,6 mg/l gemessen (9 Tage vor bis 7 Tage nach der
Diagnosestellung der Thrombose), zum Zeitpunkt der Transplantatthrombose
7,6 ± 0,6 mg/l (2 Tage vor bis zum Tag der Diagnosestellung). Diese Werte liegen unterhalb denen der Kontrollgruppe, was insbesondere beim Vergleich mit
den Patienten der Gruppe I (P-AR) zum Tragen kommt (p = 0,026*: I vs. III;
p = 0,012*: I (d-2 bis d0) vs. III (d-2 bis d0)).
C3d-Verlauf bei Pankreastransplantatthrombose (Gruppe III)
30
25
C3d [mg/l]
20
15
10
5
0
Ta
9b
g-
-6
is
Ta
5
g-
bis
-3
T
ag
2b
is
0
g1
Ta
bis
4
T
5
ag
bis
7
Tage vor/nach Pankreastransplantatthrombose
Abb. 10: Die C3d-Konzentrationen der Patienten der Gruppe III (PTx, P-Thr) fällt im zeitlichen
Umfeld der Pankreastransplantatthrombose ab.
36
Vergleich der C3d-Konzentrationen
vor Pankreastransplantatabstoßung und -thrombose
20
C3d [mg/l]
15
10
5
0
Tag -9 bis -6
Tag -5 bis -3
Tag -2 bis 0
Tage vor Abstoßung bzw. Thrombose des Pankreastransplantates
Pankreastransplantatabstoßung (Gruppe I)
Pankreastransplantatthrombose (Gruppe III)
Abb. 11: Die C3d-Konzentrationen der Patienten der Gruppe III (PTx, P-Thr) liegen insgesamt
untern denen der Gruppe I (PTx, P-AR); im zeitlichen Umfeld der Pankreastransplantatthrombose ist ein Konzentrationsabfall zu beobachten.
37
Tabelle 5: Ergebnisse der C3d-Messungen bei den Patienten der Gruppen I bis V
Gruppe A (PTx)
Anzahl n
Gruppe I
Gruppe II
Gruppe III
PTx, P-AR
PTx, N-AR
PTx, P-Thr
3
7
4
10,6 ± 1,2 (d0-40 post Tx)
14,0 ± 3,5
12,7 ± 2,0
9,1 ± 1,6
mittleres
C3d
[mg/l]
Gruppe B* (NTx, Stichprobe aus 64 Pat.)
Gruppe IV
Gruppe VI
PTx, Kontrolle: keine AR/P-Thr
Gruppe V
NTx, Kontrolle: keine AR
Gruppe IVa
Gruppe IVb
NTx, N-AR
keine Infektion
Infektion
11
6
5
I-IV vs. V-VI: p = 0,489
8
10,6 ± 1,9
10,1 ± 0,6
(d1-40 post Tx)
(d-20 bis +7 um
AR)
(d-9 bis d+7 um
AR)
(d-9 bis d+7 um
AR)
(d-9 bis d+7
um Thr)
I vs. IV:
p = 0,046*
II vs. IV:
p = 0,074
III vs. IV:
p = 0,180
IVa: p = 0,061
IVb: p = 0,114
IVa: p = 0,089
IVb: p = 0,180
I vs. III:
p = 0,026*
VIa: p = 1,0
VIb: p < 0,001*
14,0 ± 1,4
15,9 ± 7,6
7,9 ± 0,6
9,3 ± 1,9
(d-2 bis P-AR)
(d-2 bis N-AR)
(d-2 bis Thr)
P-AR vs. -Thr:
p = 0,012*
10,4 ± 2,1
11,0 ± 1,9
(d1-40 post Tx)
(d1-40 post Tx)
---
---
V vs. VI
p < 0,001**
(d-2 bis N-AR)
Gruppe VIa
Gruppe VIb
keine Infektion
Infektion
7
3
4
11,0 ± 0,9
11,9 ± 0,6
(d1-40 post Tx)
10,1 ± 1,7
12,9 ± 0,8
(d1-40 post Tx)
(d1-40 post Tx)
---
---
38
3.2.4. Kasuistik
Der zum Transplantationszeitpunkt 40-jährige Patient litt seit Jahren an Diabetes mellitus Typ 1, der zur Entwicklung einer terminalen Niereninsuffizienz bei
diabetischer Nephropathie geführt hatte. Drei Jahre lang wurde mit CAPD behandelt, bis eine simultane Pankreas-/Nierentransplantation durchgeführt werden konnte. Spender und Empfänger zeigten ein HLA-Mismatch von 1-2-2, die
Ischämiezeit der Niere betrug 8 Stunden 24 Minuten, die des Pankreas 6 Stunden 56 Minuten. Als Induktionsimmunsuppression wurden im Rahmen der Euro-SPK-2-Studie 250 mg Methylprednisolon, 5 mg Sirolimus, 2x 7 mg Tacrolimus sowie über zwei Tage je 67,5 mg Anti-Thymoglobulin verabreicht. Die sich
anschließende Erhaltungsimmunsuppression umfasste Steroide, Tacrolimus und
Sirolimus mit dem Ziel der Steroidfreiheit ab dem 42. Tag. Aufgrund der im
Folgenden beschriebenen Komplikationen wurde der Patient allerdings aus der
Studie ausgeschlossen, sodass er im weiteren Verlauf auf die bewährte Tripeltherapie bestehend aus Steroiden, Tacrolimus und Mycophenolat mofetil umgestellt
wurde.
Am 27. postoperativen Tag wurde eine Thrombose der Arteria lienalis und mesenterica festgestellt, die zu Relaparotomien mit Revaskularisierungsversuchen
am 27. und 28. postoperativen Tag führten. Am 30. postoperativen Tag musste
das Pankreastransplantat dennoch entfernt werden. In der sich anschließenden
Rekonvaleszenzzeit entwickelten sich Hautdefekte aufgrund auftretender Wundheilungsstörungen, die zunächst mittels Vaccuseal-System therapiert, in späteren
Sitzungen dann plastisch gedeckt wurden.
Untersuchungen des Gerinnungssystems deckten eine heterozygote Prothrombinmutation sowie eine Hyperhomocysteinämie auf.
Gut vier Monate nach Verlust des Pankreastransplantats wurde dem Patienten
ein neues Pankreastransplantat angeboten, das komplikationsfrei eingesetzt werden konnte. Als Induktionsimmunsuppression dieser Retransplantation wurden
hier 500 mg Methylprednisolon sowie 60 mg Daclizumab verabreicht. Letzteres
wurde in der Folgezeit alle zwei Wochen, insgesamt viermal wiederholt, gegeben.
39
Am 42. Tag nach dieser Zweittransplantation (Tag 208 im Gesamtverlauf) verdichtete sich der Verdacht auf eine Pankreasabstoßung (Leukozytose, CRPAnstieg, subfebrile Temperaturen und Anämie ohne auszumachenden Infektfokus, Anstieg der Nüchternblutzuckerwerte, Anstieg der Pankreasenzyme, Nachweis einer Transplantatpankreatitis im MRT), sodass eine dreitägige Kortisonstoßtherapie unter Fortsetzung der Daclizumab-Gaben eingeleitet wurde, unter
der eine Besserung zu verzeichnen war.
Im gesamten Verlauf ist die Nierenfunktion nicht beeinträchtigt gewesen. Nierenperfusions- und -funktionsszintigraphien sowie Kreatininwerte belegen einen
diesbezüglich komplikationsfreien Verlauf.
Betrachtet man bei diesem Patienten den Verlauf der Komplementspaltproduktmessungen (vgl. Abb. 11), so fällt ein insgesamt erhöhtes Niveau der C3d-Werte
auf, die im Schnitt 13,4 ± 6,5 mg/l betragen.
Der Pankreasthrombose (Tag 27) geht eine Phase deutlicher C3d-SpiegelErhöhung voraus (14,5 ± 2,7 mg/l, ab Tag 8 vor der Pankreasthrombose). Zum
Zeitpunkt der Thrombose fallen die Werte stark ab und verbleiben in den darauf
folgenden 10 Tagen auf niedrigem Niveau (7,3 ± 1,6 mg/l im Durchschnitt der
Tage 0 bis 10 nach Auftreten der Thrombose). Anschließend, also in der Rekonvaleszenzphase, steigt die C3d-Konzentration erneut auf einen mittleren Wert
von 14,4 ± 5,4 mg/l. Dabei zeigen die späten Messungen (Tag 79 und 97 post
transplantationem) eine Normalisierung des C3d-Spiegels (8,4 mg/ml).
Dieses niedrige Niveau kann auch nach der Pankreasretransplantation beibehalten werden (6,4 ± 1,6 mg/l) und zeigt erst in der zeitlichen Umgebung (d.h. 15
Tage vor und nach) der Pankreasabstoßung eine erneute Erhöhung (11,4 ± 1,8
mg/l).
Die Immunsuppressionstherapie des Patienten umfasste an Tag 29 und 31 zwei
Kortisonstöße von 250 mg Methylprednisolon. In diesem Zeitfenster der Pankreasthrombose ist der oben beschriebene C3d-Konzentrations-Abfall zu
beobachten.
Im Rahmen der Pankreasabstoßung wurde eine dreitägige Kortisonpulstherapie
durchgeführt, nach deren Einsetzen eine Reduktion der zum Abstoßungzeitpunkt ihr Maximum erreichenden C3d-Werte zu konstatieren ist.
40
Kasuistik: Verlauf von C3d und CRP
35
[mg/l] bzw. [mg/dl]
30
Pankreasretransplantation
Pankreasthrombose
25
Pankreasabstoßung
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100 160
180
200
220
Tag post transplantationem
C3d (mg/l)
CRP (mg/dl)
Abb. 12: C3d- und CRP-Verlauf des in der Kasuistik vorgestellten Patienten im Verlauf nach
Transplantation
Der Verlauf des CRP ist gekennzeichnet durch einen Abfall nach initialer postoperativer Erhöhung auf 2,19 ± 0,66 mg/dl (bis zum Tag 26). Mit Feststellung
der Pankreasthrombose und operativer Thrombektomie steigen die Werte im
Sinne einer akuten Phase Reaktion gegenläufig zum C3d-Verlauf maximal an,
um anschließend wieder auf ein niedriges Niveau von 3,0 ± 0,62 mg/dl (Tag 40
bis 50) zu fallen. Weitere CRP-Anstiege finden sich zum Zeitpunkt der Zweittransplantation (13,28 ± 1,18 mg/dl bis Tag 4 nach der Transplantation) sowie
14 Tage im Vorfeld der Abstoßungsreaktion (8,69 ± 2,75 mg/dl). Das abschließend erreichte CRP-Level liegt bei fallender Tendenz unterhalb von 1,0 mg/dl.
Infektionen spielten bei diesem Patienten während des Beobachtungszeitraumes
keine Rolle.
41
3.3.
Einfluss von Infektionen auf die C3dKonzentration
3.3.1. Charakterisierung der Gruppen A und B in Abhängigkeit vom Auftreten von Infektionen
Um die in den Kontrollgruppen IV und VI gemachten Beobachtungen zum Einfluss von Infektionen auf die C3d-Konzentration genauer zu untersuchen, wurden die zur Verfügung stehenden Patientengruppen A und B in Abhängigkeit
vom Transplantationstyp und dem Auftreten von Infektionen, aber unabhängig
vom Auftreten von Abstoßungen bzw. Transplantatthrombosen, neu subgruppiert. Dabei bildeten die Patienten, die im Laufe der ersten zwei Monate nach
Transplantation eine Infektion entwickelten, die jeweilige Studiengruppe. Als
infektionsfreie Kontrolle fungierten alle anderen Patienten.
Gruppe A (PTx), n = 25
Gruppe B* (NTx), n = 15
Gruppe AInf+
Gruppe BInf+
PTx, Infektion, n = 9
NTx, Infektion, n = 5
Gruppe AInf–
Gruppe BInf–
PTx, keine Infektion, n = 16
NTx, keine Infektion , n = 10
Abb. 13: Übersicht über die Aufteilung der Patientengruppen zur Analyse des Einflusses von
Infektionen auf die C3d-Konzentration
Schwerwiegende Infektionen in den ersten zwei Monaten nach der Transplantation traten somit bei 35% der Patienten auf (36% PTx, 33% NTx). Es handelte
sich dabei um vier clostridien-positive Enterokolitiden, drei Gastroenteritiden,
zwei Pneumonien, eine Sinusitis, zwei Katheterinfekte sowie zwei Fälle einer
Urosepsis. Diese wurden im Schnitt am Tag 24,5 ± 13,5 nach der Transplantation diagnostiziert und antibiotisch behandelt.
42
3.3.2. C3d-Konzentration bei Infektion
Die C3d-Bestimmung ergab im Zeitraum von 10 Tagen vor bis 10 Tagen nach
Diagnosestellung der Infektion absolut sowie gegenüber der jeweils entsprechenden Kontrollgruppe erhöhte Werte (p < 0,001*: AInf++BInf+ vs. AInf–+BInf– bzw.
p = 0,002*: AInf+ vs. AInf– bzw. 0,017*: BInf+ vs. BInf– ). Der Vergleich zwischen den
verschiedenen Transplantationstypen ergab hingegen – wie schon bei den Gruppen I bis VI gezeigt – keinen signifikanten Unterschied (p = 0,39: AInf+ vs. BInf+
bzw. p = 0,71: AInf– vs. BInf– ).
Die Betrachtung des C3d-Verlaufes zeigt bei 5 von 9 Patienten der Gruppe AInf+
unter Therapie, teils verzögert, signifikant abfallende Werte (vgl Abb. 14,
p = 0,019*). Im Vorfeld der Infektion kann jedoch kein charakteristischer C3dAnstieg verzeichnet werden. Die NTx-Patienten der Gruppe BInf+ weisen insgesamt geringere Schwankungen der C3d-Konzentration auf. Hier konnte bei 2
von 5 Patienten ein tendenzieller C3d-Abfall unter Therapie festgestellt werden.
Die verbleibenden Verläufe beider Gruppen lassen keine relevante Konzentrationsänderung erkennen.
Inf+
C3d-Verlauf bei Infektion nach PTx (A
)
35
30
C3d [mg/l]
25
20
15
10
5
bi
sd
+1
1
d+
9
+8
bi
sd
d+
5
bi
sd
+4
0
d+
1
bi
sd
d2
-3
bi
sd
d6
d-
10
bi
sd
-7
0
Tage vor/nach Diagnosestellung Infektion
Abb. 14: C3d-Einzelverläufe der Patienten der Gruppe AInf+. Im Vorfeld der Infektion ist kein
klarer Verlaufstrend zu beobachten.
43
3.3.3. CRP-Konzentration bei Infektion bzw.
Abstoßungsreaktion
Bei der Ermittlung der CRP-Konzentration zeigen die Patienten nach Pankreastransplantation erhöhte Werte gegenüber den entsprechenden Gruppen nach
Nierentransplantation (p = 0,003*: AInf– vs. BInf–). Dabei ist in den C3d-Mittelwerten des entsprechenden Zeitraumes v.a. nach Pankreastransplantation kein
signifikanter Unterschied in Abhängigkeit vom Infektionsgeschehen zu beobachten (p = 0,37: AInf+ [Tag 10 vor bis 10 nach Infektion] vs. AInf– [Tag 10-40 post
transplantationem, um postoperative CRP-Erhöhungen auszuklammern]).
Entsprechende Ergebnisse liefert die Auswertung der Leukozytenzahlen (vgl.
Tabelle 4).
Betrachtet man die CRP-Konzentration der Patienten mit Infektion im Verlauf
(vgl. Abb. 16), so zeigt sich, dass bei 5 von 9 Patienten der Gruppe AInf+ das CRP
zwischen Tag -6 bis -3 und Tag -2 bis 0 der Infektionen signifikant ansteigt (im
Mittel um 4,35 mg/dl) und bei allen Patienten unter Therapie abfällt. Entsprechend können bei 3 von 5 Patienten der Gruppe BInf+ im Verlauf ansteigende und
nach Therapie wieder abfallende CRP-Konzentrationen beobachtet werden. Die
verbleibenden Patienten der Gruppen weisen vom Infektionsgeschehen weitgehend unbeeinflusste auf.
CRP-Analysen in den Gruppen I bis VI legen offen, dass auch hier eine deutliche
Unterscheidung zwischen den Transplantationstypen besteht (p = 0,01*: A vs.
B*). Bei der CRP-Analyse im zeitlichen Umfeld der Abstoßungsreaktionen ergaben sich relative Erhöhungen gegenüber der jeweiligen Kontrollgruppe, insbesondere bei den Patienten mit Nierentransplantatabstoßungen nach SPKT
(Gruppe II).
44
CRP-Verlauf bei Infektion nach PTx (Gruppe AInf+)
30
25
CRP [mg/dl]
20
15
10
5
bi
sd
+1
1
d+
9
d+
5
bi
s
d+
8
d+
4
d+
1
bi
s
bi
sd
0
d2
bi
sd
-3
d6
d10
bi
sd
-7
0
Tage vor/nach Diagnosestellung Infektion
Abb. 15: CRP-Einzelverläufe der Patienten der Gruppe AInf+: Trotz ausbleibender CRP-NiveauDifferenz zu Patienten ohne Infektion (AInf–) sind im Verlauf ansteigende Werte zu erkennen.
C3d, CRP und WBC bei Infektion nach Transplantation
p = 0,02
p = 0,017
p = 0,007
p = 0,048
12
10
p = 0,003
8
4
ara
me
ter
6
C3d
2
WBC
0
A/Inf+
CRP
A/Inf-
B/Inf+
Patientengrup
pe
La
bo
rp
[mg/l] bzw. [mg/dl] bzw. [1/µl].
14
B/Inf-
CRP [mg/dl]
WBC [1/µl]
C3d [mg/l]
Abb.16: Vergleich der C3d-, CRP- und WBC-Werte der Patienten mit Infektion bzw. ohne Infektionsgeschehen
45
Tabelle 6: Ergebnisse der Messungen von C3d, CRP und WBC in den Gruppen A und B.
Gruppe A (PTx)
Gruppe B* (NTx)
Gruppe AInf+
Gruppe AInf–
Gruppe BInf+
Gruppe BInf–
PTx,
Infektion
PTx,
keine Infektion
NTx,
Infektion
NTx,
keine Infektion
Anzahl n
9
16
5
10
Diagnosestellung
24,9 ± 13,2
---
23,2 ± 15,5
---
[d post tx]
mittleres
C3d
[mg/l]
13,4 ± 1,8
10,3 ± 1,1
12,3 ± 2,1
10,1 ± 0,9
(d±10 Infektion)
(d0-40 post Tx)
(d±10 Infektion)
(d0-40 post Tx)
AInf+ vs. AInf– :
BInf+ vs. BInf–:
p = 0,002*
AInf– vs. BInf– :
p = 0,017**
AInf+ vs. BInf+:
p = 0,71
AInf+/BInf+ vs. AInf–/BInf– :
p = 0,39
mittleres
CRP
[mg/dl]
p < 0,001**
5,66 ± 1,39
4,95 ± 1,42
4,61 ± 2,08
2,33 ± 1,08
(d±10 Infektion)
(d10-50 post Tx)
(d±10 Infektion)
(d10-40 post Tx)
AInf+ vs. AInf– :
p = 0,37
AInf– vs. BInf– :
AInf+ vs. BInf+:
p = 0,003*
BInf+ vs. BInf–: p =
0,065
p = 0,33
mittlere
Leukozytenzahl
10,6 ± 1,1
10,9 ± 2,6
8,6 ± 1,0
8,2 ± 1,5
(d±10 Infektion)
(d10-50 post Tx)
(d±10 Infektion)
(d10-40 post Tx)
[nl-1]
p = 0,786
AInf– vs. BInf– :
AInf+ vs. BInf+:
p = 0,048*
AInf+ vs. AInf– :
BInf+ vs. BInf–: p =
0,64
p = 0,007*
46
4.
Diskussion
4.1.
Systemische Komplementaktivierung postoperativ
nach Pankreas- bzw. Nierentransplantation
Die Bestimmung des Komplementspaltproduktes C3d, das bedingt durch den
Konzentrationsanstieg bei verstärktem Komplementumsatz als Marker einer systemischen Komplementaktivierung gilt [44], reiht sich in eine große Gruppe unterschiedlicher Ansätze ein, hinter denen das Bestreben steht, Parameter zu finden, die im Rahmen eines einfach durchführbaren Monitorings genutzt werden
können, um bestimmte Komplikationen im Verlauf nach einer Transplantation
frühzeitig, möglichst nicht-invasiv und zuverlässig zu erkennen.
Komplementspaltproduktmessungen (C3a, C1rsC1Inhibitor, C3b(Bb)P, SC5b-9
bzw. C3d) im Verlauf nach isolierter Nierentransplantation ergaben in mehreren
Studien nach initialer postoperativer Erhöhung bei stabiler Transplantatfunktion
einen Abfall auf normwertige Level nach bis zu 12 Tagen [29, 63]. Die im Rahmen der vorliegenden Studie erhobenen Daten fügen sich in dieses Bild, indem
sich die C3d-Spiegel in der Gruppe der NTx-Patienten nach initialer Erhöhung
normalisieren, was hier allerdings einen Zeitraum von 30 – 40 Tagen nach der
Transplantation in Anspruch nahm.
Vergleichbare Untersuchungen an herztransplantierten Patienten konnten in der
postoperativen Phase signifikant erhöhte Konzentrationen der Komplementspaltprodukte C4d und SC5b-9 nachweisen, die nach 4 – 6 Wochen deutlich abfielen und nach 3 Monaten zur Normalisierung der Konzentrationen führten
[62].
Da eine initiale postoperative Komplementaktivierung in der Frühphase nach
NTx und PTx nachgewiesen werden konnte, während man bei gesunden Probanden und langzeittransplantierten Patienten normwertige C3d-Spiegel gemessen hatte, scheint die immunologisch neue Situation der Transplantation Einfluss auf diesen Parameter zu nehmen. Die neu eingebrachten Allogene führen
47
durch direkte oder indirekte T-Zell-Aktivierung zu Immunreaktionen, die durch
die Expression von Th1-Zytokinmustern v.a. zelluläre Mechanismen auf den
Plan rufen. [10, 22]. Es werden zunehmend Hinweise entdeckt, dass das Komplementsystem auch hier und nicht nur bei der humoralen, B-Zell-vermittelten
Immunantwort [13] einen wichtigen Beitrag als Regulator und Effektor leistet.
So führt im Tierversuch eine C3-Defizienz zu deutlich reduzierten T-Zellvermittelten Reaktionen nach Transplantation [49, 50].
Durch die Transplantationsprozedur entstehen auf Antigen-unabhängiger Ebene
Ischämie-Reperfusions-Läsionen, die das Organ frühzeitig schädigen können
und das Risiko für spätere Abstoßungsreaktionen erhöhen. Eine Hypoxie des
Transplantates führt zu Entzündungsreaktionen des Transplantates, die eine verstärkte Expression von Zytokinen und Adhäsionsmolekülen sowie die überschießende Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten nach sich ziehen und somit
Nekrose bzw. Apoptose bedingen. Pathogenetisch spielt hier das aktivierte
Komplementsystem eine wesentliche Rolle [7, 12], was beispielsweise in Studien
zum Ausdruck kommt, die durch die Blockade des Komplementfaktors C5 mittels monoklonaler Antikörper eine Minderung der entzündlichen Reaktion im
Transplantat beobachten konnten [55].
Im Rahmen von Ischämie-Reperfusions-Läsionen kommt es außerdem zur verstärkten Expression von MHC-II-Molekülen auf den Zellen des Transplantates,
was die Allogenität und konsekutiv die oben beschriebene T-Zell-Reaktion steigert [55].
C3d verhält sich nicht wie ein Akute-Phase-Protein, was durch die Beschreibung
der postoperativen Konzentrationsverläufe nahe liegend wäre. Beobachtungen
der Patienten, bei denen aus anderen Gründen eine Relaparotomie erforderlich
wurde, gingen mit starkem CRP-Anstieg einher, beeinflussten die C3d-Spiegel
aber nicht charakteristisch. Exemplarisch wird dies deutlich in der dargestellten
Kasuistik. Ähnliche Resultate erbrachten frühere Studien für das Mannosebindende Lektin, das bei der Komplementaktivierung eine entscheidende Rolle
spielt. Nach elektiven Operationen (Resektionen im Gastrointestinaltrakt in Folge maligner Erkrankungen) konnte kein relevanter Anstieg festgestellt werden
[57]. Allerdings stellt sich die Studienlage in dieser Frage nicht einheitlich dar.
48
Wolbink et al. [67], die den Nachweis von CRP-vermittelter Komplementaktivierung in vivo führten, zeigten einen diese Aktivierung ausdrückenden Anstieg
von Komplement-CRP-Komplexen nach dem operativen Eingriff der Nierentransplantation. Im Zusammenhang der hier diskutierten Frage von akute-PhaseReaktionen und Komplementaktivierung ist jedoch nur schwer auseinanderzuhalten, welche Rolle der operative Eingriff als solcher und die Transplantation
im Speziellen bei dieser Beobachtung spielt.
Bei den im Rahmen der vorliegenden Studie untersuchten PTx-Patienten wurde
postoperativ ebenfalls eine deutliche Komplementaktivierung nachgewiesen, die
innerhalb der ersten 40 Tage im Mittel zur Gruppe der NTx-Patienten keinen
signifikanten Unterschied aufdecken konnte. Allerdings zeigte die Verlaufsbetrachtung – im Gegensatz zu den Beobachtungen an nierentransplantierten Patienten – in diesem Zeitraum keinen relevanten Abfall der C3d-Spiegel auf, es fielen hingegen tendenziell ansteigende Konzentrationen auf.
Man könnte annehmen, dass die Masse an immunogenem Material, das bei der
Transplantation eingebracht wird die Stärke der immunologischen Reaktion bestimmt. Allerdings konnten im Mittel keine signifikanten Unterschiede zwischen
den Transplantationstypen festgestellt werden.
Im Rahmen der Pankreastransplantation wird ein etwas intensiveres Schema der
Induktionsimmunsuppression verwandt als nach isolierten Nierentransplantationen. Dieser Aspekt könnte den unterschiedlichen Verlauf der C3d-Werte nach
Transplantation, insbesondere den Anstieg nach Pankreastransplantation erklären: Eine ausgedehnte Komplementaktivierung wird initial durch die starke immunsuppressive Therapie unterbunden und kann erst im weiteren Verlauf beobachtet werden.
Auch die im Vergleich zur isolierten Nierentransplantation höhere postoperative
Morbidität der Patienten nach kombinierter Pankreas-/Nierentransplantation
[69] macht die ausgeprägte und langandauernde Komplementaktivierung bei
dieser Patientengruppe plausibel.
49
4.2.
Nachweis systemischer Komplementaktivierung in
der Differentialdiagnose des Pankreasfunktionsverlustes nach Pankreastransplantation
Komplikationen in der Frühphase nach Pankreastransplantation treten im Vergleich zur Situation nach isolierter Nierentransplantation häufiger auf und sind
nicht immer leicht zu diagnostizieren. Trotz aller Fortschritte in Diagnostik und
Therapie versagen 3 – 5% der Pankreastransplantate innerhalb der ersten 6 Monate. In den meisten Fällen (> 50%) sind zumeist Thrombosen verantwortlich zu
machen, nach den Todesfällen bei funktionstüchtigem Transplantat an zweiter
Stelle (20%) folgen akute Abstoßungsreaktionen (10%) in diesem Zeitfenster auf
Platz drei [18].
Die vorliegende Studie untersucht, ob und inwieweit die Bestimmung der C3dKonzentration im Plasma einen Beitrag liefern kann in der Diagnostik von Abstoßungsreaktion bzw. Pankreastransplantatthrombosen in der Frühphase nach
der Transplantation:
Im zeitlichen Umfeld der Pankreasabstoßungsreaktion wurde gegenüber der
Kontrollgruppe eine erhöhte C3d-Konzentration gemessen. Für die Nierenabstoßungen nach SPKT konnte bei großen interindividuellen Unterschieden ein
leicht erhöhtes Niveau festgestellt werden, das gegenüber der Kontrollgruppe
jedoch keine statistische Signifikanz erreicht. Geht man davon aus, dass im Fall
einer SPKT die durch Biopsie nachgewiesene Abstoßungsreaktion der Niere
auch das vom gleichen Spender stammende Pankreas betraf, ergibt sich das Bild
einer verstärkten systemischen Komplementaktivierung nach Abstoßungsreaktionen bei pankreastransplantierten Patienten. Die isoliert nierentransplantierten
Patienten zeigten hingegen in Abstoßungssituationen keine charakteristischen
C3d-Veränderungen.
Dieses Ergebnis steht mit den Resultaten von van Son et al. [63] in Einklang, die
bei Komplementspaltproduktmessungen nach Nierentransplantation keine Korrelation eines C3d-Konzentrations-Anstieges mit dem Auftreten akuter Abstoßungsreaktionen beobachten konnten. Bei herztransplantierten Patienten wurde
in vergleichbaren Untersuchungen (C4d-Bestimmung im Plasma) ebenfalls kein
Zusammenhang nachgewiesen [62]. Andererseits existieren auch Studien an nie50
rentransplantierten Patienten, die einen Zusammenhang zwischen Komplementspaltprodukten beschreiben – es handelte sich dabei allerdings um C3a und
SC5b-9, nicht C3d [29].
Ein Hinweis auf organspezifische Unterschiede zwischen der Komplementaktivierung nach Transplantation kann in folgender Beobachtung gefunden werden:
C3 und C5 können durch aktiviertes Trypsin proteolytisch gespalten werden,
sodass die weitere Aktivierungskaskade ihren Lauf nimmt. Aktiviertes Trypsin
wird im Rahmen akuter Pankreatitiden freigesetzt und konnte im Tierversuch
abhängig von der Schwere der Erkrankungen mit zeitnahen C3a-Anstiegen korreliert werden [21]. Inwieweit die entzündliche Reaktion bei Abstoßungsreaktionen eines Pankreastransplantats auf den gleichen Aktivierungsmechanismus zurückgreift, der eine stärkere Komplementaktivierung als nach Nierentransplantation vermuten lässt, müssten weitere Studien klären.
Die Analyse des C3d-Verlaufs der einzelnen Patienten konnte keinen prädiktiven
Nutzen in der frühzeitigen Diagnostik einer Abstoßungsreaktion aufzeigen. Die
C3d-Werte unterliegen starken Schwankungen, was auf eine Vielzahl von Einflussfaktoren weist, und bieten kein stabiles Niveau, auf dessen Basis ein Anstieg
vor der klinischen Manifestation einer Abstoßungsreaktion charakteristisch erschiene oder aber ein Abfall eine erfolgreiche Therapie belegen könnte.
Über Infektionen als Einflussfaktor konnten in der vorliegenden Studie Hinweise
gewonnen werden (vgl. 3.3. und 4.3.). Weiterführende Studien müssten diesen
wie auch weitere mögliche Einflussfaktoren, z.B. die immunsuppressive Therapie, die initial bzw. in Abstoßungssituationen gegeben wird, operative Eingriffe
zur Behebung von Komplikationen (wie Nachblutung oder Anastomoseninsuffizienz) identifizieren und näher konkretisieren. Auch intraindividuelle Vergleiche
der Situation vor und nach Transplantation könnten Aufschluss geben über die
generelle Komplementaktivierung.
Den Nachweis insgesamt erhöhter C3d-Werte während der Pankreastransplantatabstoßung kann man sich zunutze machen durch den Vergleich mit den
Patienten, die im Verlauf eine Transplantatthrombose entwickelten. Letztere
zeigten normwertige C3d-Konzentrationen, die tendenziell sogar unter denen
51
der Kontrollgruppe lagen. Die enge Beziehung zwischen Gerinnungs- und Komplementsystem [8] mag folglich im lokalen Geschehen eine Rolle spielen, das
sich allerdings nicht in Form systemisch nachweisbarer Veränderungen immunologischer Parameter niederschlägt. Ursache könnte die durch die Transplantatthrombose unterbrochene Perfusion sein, die eine Ausschwemmung in den
Kreislauf verhindert.
Diagnostisch stützt man sich nach der Feststellung einer sich verschlechternden
Pankreastransplantatfunktion auf verschiedene Methoden: Da klinische Symptome nur unzuverlässig, meist zudem sehr spät und unspezifisch auftreten, werden im Rahmen eines postoperativen Monitorings verschiedene biochemische
Marker (Amylase, Lipase, Pankreas-spezifisches Protein, Trypsinogen, SerumAmyloid A usw.) herangezogen, die aber auch in ihrer Aussagekraft beschränkt
sind und daher auch nicht in jedem Fall Eingang in die klinische Routine gefunden haben. Bildgebende Verfahren wie die Doppler- und Duplex-Sonographie
können insbesondere in der Diagnostik der Thrombose wichtige Informationen
liefern, sind aber z.T. von technischen Schwierigkeiten überlagert und können in
der Aussage stark untersucherabhängig und unspezifisch sein [46]. Der drohende
Pankreasverlust fordert eine rasche Diagnosefindung und Therapieeinleitung,
wobei sich die therapeutischen Konsequenzen der Optionen Abstoßungsreaktion
und Thrombose grundsätzlich unterscheiden.
Die Bestimmung der C3d-Plasma-Konzentration könnte einen nicht-invasiven
Beitrag in der Differentialdiagnostik leisten: Unter den Patienten, die eine Pankreastransplantatthrombose entwickelten, konnten in keinem Fall erhöhte Werte
nachgewiesen werden, während dies in der Gruppen der Patienten mit Pankreastransplantatabstoßung regelmäßig zu beobachten war. Insofern würde eine Verschlechterung der Transplantatfunktion bei normwertigem C3d für eine Transplantatthrombose sprechen, bei erhöhtem C3d für eine Transplantatabstoßung.
Die dargestellte Kasuistik zeigt exemplarisch den C3d-Verlauf eines Patienten,
der das erste Pankreastransplantat durch eine Transplantatthrombose verlor und
das nach einigen Monaten retransplantierte Organ durch eine Abstoßungsreakti-
52
on bedroht sah: Beide Situationen zeigten gegenläufige Entwicklungen der C3dKonzentration.
Damit wird der Unterschied zwischen der Abstoßungsreaktion als immunologisch und der Thrombose als nicht-immunologisch bedingter Komplikation, die
trotz des engen Zusammenhangs zwischen Komplement- und Gerinnungskaskade keinen systemischen Niederschlag findet, unterstrichen.
Die vorliegenden Daten basieren auf einer geringen Fallzahl und sollten Anlass
geben, die Wertigkeit der C3d-Bestimmung bei einer größeren Gruppe von pankreastransplantierten Patienten mit entsprechenden Komplikationen zu überprüfen.
4.3.
Einfluss von Infektionen auf die C3dKonzentration
Infektionen treten bedingt durch die immunsuppressive Dauertherapie der transplantierten Patienten gehäuft auf. Ein erhöhtes Risiko birgt die Frühphase nach
der Transplantation [3], da hier, um der Prävention akuter Abstoßungen gerecht
zu werden, mit hohen Dosierungen und multiplen Kombinationen der Immunsuppressiva gearbeitet wird, die erst im Laufe der Zeit schrittweise reduziert werden. In der vorliegenden Studie traten in 35% der Fälle im Verlauf der ersten
zwei Monate schwerwiegende Infektionen auf, zwischen NTx- und PTxPatienten bestand dabei kein Unterschied (33% bzw. 36%). Eine frühere Untersuchung am selben Transplantationszentrum ergab eine Infektionsrate von
55,9% nach SPKT und 30,2% für IKT [70], sodass die jetzt erhobenen Ergebnisse unter den PTx-Patienten deutlich günstiger erscheinen. Die Differenz der Infektionsrate lässt sich erklären durch den Ausschluss von Minorkomplikationen
wie konservativ behandelbarer Wundheilungsstörungen in der vorliegenden Untersuchung.
Infektionen scheinen Einfluss zu nehmen auf die systemische Komplementaktivierung: Es konnte gezeigt werden, dass die C3d-Konzentration im Zeitraum der
Infektion insgesamt erhöht war; die Verlaufsanalyse der einzelnen Patienten ließ
53
im Vorfeld hohe Werte, nach einsetzender Therapie einen Abfall der Konzentration erkennen. Frühere Studien verwiesen bereits auf Konzentrationsanstiege
von Komplementspaltprodukten im Rahmen von CMV-Infektionen [63] bzw.
HCV-Infektionen [64] bei nierentransplantierten Patienten.
Bei der Verlaufsanalyse der Parameter unter Infektion ist zu bedenken, dass der
als Tag Null gewählte Diagnosezeitpunkt keinen exakten, einheitlichen Punkt im
Infektionsverlauf der beobachteten Patienten wiedergeben kann und das Bild auf
der Zeitachse verzerren kann.
Für die unter 4.2. dargestellten differentialdiagnostischen Überlegungen bedeuten die Beobachtungen dennoch, dass eine C3d-Erhöhung durchaus auch mit
einem Infektionsgeschehen vereinbar sein kann. Eine C3d-Erhöhung stellt also
ein unspezifisches Geschehen dar, das durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflussbar erscheint. Die erhobenen Daten weisen auf die Bedeutung von Infektionen, die daher ausgeschlossen werden sollten, um die Aussagekraft in der dargestellten Fragestellung zu erhöhen.
4.4.
Stellenwert der Bestimmung des CRP in der Frage
der Differenzierung zwischen Abstoßungsreaktion
und Infektion bei nachgewiesener systemischer
Komplementaktivierung
Das C-reaktive Protein (CRP) wird in seiner Eigenschaft als Akute-PhaseProtein bei Infektions- bzw. Inflammationszuständen auch und gerade bei transplantierten Patienten diagnostisch genutzt [59]. CRP-Erhöhungen in den ersten
postoperativen Tagen konnten sich bei der Prädiktion von Pankreastransplantatassoziierten Komplikationen als hilfreich erweisen [69]. In der längerfristigen
Verlaufsbeobachtung nierentransplantierter Patienten gingen erhöhte CRPWerte als unabhängiger Risikofaktor mit einer erhöhten Mortalität einher [66].
Während einer Nierentransplantatabstoßung konnten jedoch keine relevanten
Veränderungen der CRP-Konzentration beobachtet werden [59].
54
Bei der Analyse dieses Parameters in der Gruppe der pankreastransplantierten
Patienten fiel auf, dass sich diese bei den Patienten mit Infektion im Mittel nicht
von denen ohne Infektionsgeschehen unterschieden, während zu den isoliert nierentransplantierten Patienten, v.a. in den Kontrollgruppen, ein deutlicher Unterschied zu beobachten war.
Ein Anstieg des nach Transplantation zumeist per se erhöhten CRP in den ersten
Wochen nach Transplantation spricht dennoch für eine Infektion, was die Bedeutung von regelmäßigen Bestimmungen im Verlauf betont. Nicht alle Patienten zeigen CRP-Erhöhungen, was teilweise auf eine virale Genese der Infektion
oder die Auswirkungen der Immunsuppression zurückzuführen sein könnte.
Die nierentransplantierten Patienten zeigten CRP-Verläufe, die relativ rasch
nach der Infektion auf Normwerte zurückfielen, was bei den pankreastransplantierten Patienten eine deutlich längere Zeit in Anspruch nahm und oftmals durch
Komplikationen weiter verzögert wurde.
Möglicherweise tragen die inflammativen Auswirkungen des größeren operativen Eingriffs oder die starke immunsuppressive Therapie (insbesondere die
hochdosierte Kortikosteroidtherapie) dazu bei, dass ein hohes Level in der Konzentration dieser Parameter lange bestehen bleibt und die Veränderung im Rahmen akuter Infektionen im errechneten Mittelwert nicht immer offensichtlich
erscheinen lässt.
55
5. Zusammenfassung
Die Pankreastransplantation ist für einen ausgewählten Patientenkreis zu einer
effektiven Behandlungsmethode des mit schwerwiegenden Folgeerkrankungen
einhergehenden Diabetes mellitus Typ 1 geworden, bei dem trotz allem Fortschritt nach wie vor ein nicht zu vernachlässigendes Komplikationsrisiko besteht. Häufige Ursachen eines Pankreastransplantatverlustes in den ersten postoperativen Monaten sind Transplantatthrombosen und Abstoßungsreaktionen.
Im Fall eines Funktionsverlustes des Pankreastransplantates muss die richtige
Diagnose schnell und zuverlässig gefunden werden, um eine adäquate Therapie
einleiten zu können. Diese Studie analysiert den diagnostischen Nutzen des
Nachweises einer systemischen Komplementaktivierung durch serielle C3dBestimmungen im Plasma.
Im Verlauf nach isolierter Nierentransplantation (NTx, n = 15) bzw. nach Pankreastransplantation (PTx, n = 25) wurden EDTA-Plasmaproben mittels RocketImmunelektrophorese auf das Komplementspaltprodukt C3d untersucht. Im
Mittelpunkt der Beobachtung standen Komplikationen wie Abstoßungsreaktionen von Niere bzw. Pankreas, Pankreastransplantatthrombosen und Infektionen.
Von den PTx-Patienten erlitten 3 eine Abstoßungsreaktion und 4 eine Thrombose des Pankreastransplantates, in 7 Fällen nach simultaner Nieren-Pankreastransplantation (88% der PTx-Patienten) kam es zu Nierentransplantatabstoßungen. Nach NTx entwickelten 8 Patienten eine Abstoßung.
Postoperativ war in den Studiengruppen eine systemische Komplementaktivierung festzustellen, die innerhalb von 40 Tagen nach NTx auf Normalwerte abfiel, nach PTx hingegen tendenziell anstieg.
Während Abstoßungsreaktionen des Pankreastransplantates war die mittlere
C3d-Konzentration im Gegensatz zur Situation bei Transplantatthrombose wie
auch im Vergleich zur ereignisfreien Kontrollgruppe erhöht. Nierenabstoßungen
nach simultaner Nieren-Pankreastransplantation zeigten einen nicht-signifikanten Anstieg, Nierenabstoßungen nach NTx gingen einher mit mittleren C3d-
56
Werten, die gegenüber den Patienten der Kontrollgruppe, die Infektionen erfahren hatten, sogar erniedrigt waren.
Infektionen waren assoziiert mit insgesamt erhöhten, im Verlauf jedoch nicht
ansteigenden C3d-Spiegeln.
Unterschiede in der CRP-Konzentration zwischen Patienten mit und ohne Infektion waren nicht so deutlich ausgeprägt wie diejenigen zwischen Patienten nach
PTx und NTx. Ein im Verlauf nach NTx oder PTx beobachteter CRP-Anstieg
kann jedoch als Hinweis auf eine Infektion interpretiert werden.
C3d kann folglich in der Situation eines unklaren Funktionsverlustes des Pankreastransplantates bei der Differenzierung von Transplantatabstoßung und
Transplantatthrombose nach Ausschluss von Infektionen zur Diagnosefindung
beitragen, ist jedoch kein verlässlicher Parameter in der Prädiktion von Abstoßungsreaktionen. Die Analyse der C3d-Verläufe lässt multiple Einflüsse auf die
Komplementaktivierung vermuten. Infektionen scheinen hier eine Rolle zu spielen, was bei der Interpretation erhöhter C3d-Werte berücksichtigt werden muss.
57
6. Literaturverzeichnis
[1]
Arbogast, H., Malaise, J., Illner, W. D., Tarabichi, A., Dieterle, C.,
Landgraf, R., Land, W., Euro-SPK Study Group (2005). Rejection after
simultaneous pancreas-kidney transplantation. Nephrol Dial Transplant
20, ii11-ii17
[2]
Atwell, T. D., Gorman, B., Larson, T. S., Charboneau, J. W., Ingalls
Hanson, B. M., Stegall, M. D. (2004). Pancreas transplants: Experience
with 232 percutaneous US-guided procedures in 88 patients. Radiology
231, 845-849
[3]
Bassetti, M., Salvalaggio, P. R. O., Topal, J., Lorber, M. I., Friedman, A.
L., Andriole, V. T., Basadonna, G. P. (2004). Incidence, timing and site
of infections among pancreas transplant recipients. J of Hosp Inf 56, 184190
[4]
Becker, B. N., Odorico, J. S., Becker, Y. T., Groshek, M., Werwinski, C.,
Pirsch, J. D., Sollinger, H. W. (2001). Simultaneous pancreas-kidney and
pancreas transplantation. J Am Soc Nephrol 12, 2517-2527
[5]
Cascalho, M., Platt, J. L. (2004). Basic mechanisms of humoral rejection.
Pediatr Transplantation 9, 9-16
[6]
Chapman, J. R., Robertson, P., Allen, R. D. M. (2001). Why do pancreas
transplants thrombose? Transplantation 72, 182-183
[7]
De Vries, B., Walter, S. J., Peutz-Kootstra, C. J., Wolfs, T. G. A. M., van
Heurn, L. W. E., Buurman, W. A. (2004). The Mannose-Binding-Lectin
pathway is involved in complement activation in the course of renal
ischemia-reperfusion-injury. Am J Pathol 165, 1677-1688
58
[8]
Del Conde, I., Cruz, M. A., Zhang, H., Lopez, J. A., Afshar-Kharghan,
V. (2005). Platelet activation leads to activation and propagation of the
complement system. JEM 201, 871-879
[9]
Delis, S., Dervenis, C., Bramis, J., Burke, G. W., Miller, J., Ciancio, G.
(2004). Vascular complications of pancreas transplantation. Pancreas 28,
413-420
[10] Divate, S. A. (2000). Acute renal allograft rejection: progress in understanding cellular and molecular mechanisms. J Postgrad Med 46, 293-296
[11] Eurotransplant, Annual Report 2005. (Zugriff vom 05.01.2007)
http://www.eurotransplant.nl/files/annual_report/AR2005_def.pdf
[12] Farrar, C. A., Wang, Y., Sacks, S. H., Zhou, W. (2004). Independent
pathways of P-selectin and complement-mediated renal ischemia/reperfusion injury. Am J Pathol 164, 133-141
[13] Fischer, M. B., Ma, M., Goerg, S., Zhou, X., Xia, J., Finco, O., Han, S.,
Kelsoe, G., Howard, R. G., Rothstein, T. L., Kremmer, E., Rosen, F. S.,
Carroll, M. C. (1996). Regulation of the B cell response to T-dependent
antigens by classical pathway complement. J Immunol 157, 549-556
[14] Gaber, A. O., Moore, L. (2006). The impact of pancreas transplantation
on secondary complications of diabetes. Curr Opin Organ Transplant 11,
84-87
[15] Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N.D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S.
(2006). Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate
with pancreas-kidney rejection. Clin Chem 52, 379-382
59
[16] Gilabert, R., Fernandez-Cruz, L., Real, M. I., Ricart, M. J., Astudillo, E.,
Montana, X. (2002). Graft thrombosis after kidney-pancreas transplantation. Br J Surg 89, 355-360
[17] Gross, C. R., Limwattananon, C., Matthees, B., Zehrer, J. L., Savik, K.
(2000). Impact of transplantation on quality of life in patients with diabetes and renal dysfunction. Transplantation 70, 1736-1746
[18] Gruessner, A. C., Sutherland, D. E. R. (2005). Pancreas transplant outcome for United States (US) and non-US cases as reported to the United
Network for Organ Sharing (UNOS) and the International Pancreas
Transplant Registry (IPTR) as of june 2004. Clin Transpl 19, 433-455
[19] Gupta, R. K., Jain, M., Sharma, R. K. (2003). Serum and urinary interleukin-2 levels as predictors in acute renal allograft rejection. Indian J
Med Res 119, 24-27
[20] Haritopoulos, K. N., Hakim, N. S. (2002). Indications for kidney and
pancreas transplantation and patient selection.
in Hakim, N., Stratta, R., Gray, D. (ed.). Pancreas and Islet Transplantation. Oxford University Press New York, 59-78
[21] Hartwig, W., Klafs, M., Kirschfink, M., Hackert, T., Schneider, L., Gabhard, M.-M., Büchler, M. W., Werner, J. (2006). Interaction of complement and leukocytes in severe acute pancreatitis: potential for therapeutic
intervention. Am J Physio Gastrointest Liver Physiol 291, 844-850
[22] Heeger, P. S., Fairchild, R. L. (2005). Taking aim at a moving target: The
complexity of immune-mediated organ rejection. Curr Opin Organ
Transplant 10, 3-8
60
[23] Hergesell, O., Felten, H., Andrassy, K., Kühn, K., Ritz, E. (1998). Safety
of ultrasound-guided percutaneous renal biopsy – retrospective analysis of
1090 consecutive cases. Nephrol Dial Transplant 13, 975-977
[24] Heverhagen, J. T., Wagner, H. J., Ebel, H., Levine, A. L., Klose, K. J.,
Hellinger, A. (2004). Pancreatic transplants: Noninvasive evaluation with
secretin-augmented MR pancreatography and MR perfusion measurements – preliminary results. Radiology 233, 273-280
[25] Humar, A., Ramcharan, T., Kandaswamy, R., Gruessner, R. W. G.,
Gruessner, A. C., Sutherland, D. E. R. (2004). Technical failures after
pancreas transplants: Why grafts fail and the risk factors – a multivariate
analysis. Transplantation 78, 1188-1192
[26] Janeway, C. A. jr. (2002). Das Komplementsystem und die angeborene
Immunität.
in Janeway, C. A. jr., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. (Hrsg.).
Immunologie. Spektrum Akad. Verl., Heidelberg Berlin, 46-67
[27] Keck, T., Banafsche, R., Werner, J., Gebhard, M. M., Herfarth, C., Klar,
E. (2001). Desmopressin impairs microcirculation in donor pancreas and
early graft function after experimental pancreas transplantation. Transplantation 72, 202-209
[28] Keller, C. K. (2002). Transplantatabstoßung.
in Keller, C. K., Burkarth, C. M., Geberth, S. K. (Hrsg.). Praxis der
Nephrologie, Springer Verlag, Berlin, 512-517
[29] Kirschfink, M., Wienert, T., Prado, E. B. de A., Pomer, S. (1995). Zur
Bedeutung des Komplementsystems für die akute reversible Abstoßungsreaktion von Nierentransplantaten. Immun. Infekt. 23, 55-56
61
[30] Klassen, D. K., Weir, M. R., Cangro, C. B., Artlett, S. T., Papdimitriou,
J. C., Drachenberg, C. B. (2002). Pancreas allograft biopsy: safety of percutaneous biopsy – results of a large experience. Transplantation 73, 553555
[31] Koffron, A. J., Kaufman, D. B. (2002). Diagnosis and treatment of pancreatic rejection.
in Hakim, N., Stratta, R., Gray, D. (ed.). Pancreas and Islet Transplantation. Oxford University Press, New York, 191-203
[32] Krebs, T. L., Daly, B., Wong-You-Cheong, J. J., Carroll, K., Bartlett, S.
T. (1999). Acute pancreatic transplant rejection: evaluation with dynamic
contrast-enhanced MR imaging compared with histopathologic analysis.
Radiology 210, 437-442
[33] Krebs, T. L., Daly, B., Wong, J. J., Chow, C. C., Bartlett, S. T. (1995).
Vascular complications of pancreatic transplantation: MR evaluation.
Radiology 196, 793-798
[34] Kuypers, D. R., Lerut, E., Evenpoel, P., Maes, B., Vanrenterghem, Y.,
van Damme, B. (2003). C3d deposition in peritubular capillaries indicates
a variant of acute renal allograft rejection characterized by a worse clinical outcome. Transplantation 76, 102-108
[35] Lachmann, P. J., Pangburn, M. K., Oldroyd, R. G. (1982). Breakdown of
C3 after complement activation: Identification of a new fragment, C3g,
using monoclonal antibodies. J Exp Med 156, 205-216
[36] Larsen, J. L. (2004). Pancreas Transplantation: Indications and consequences. Endocrine Reviews 25, 919-946
[37] Le Moine, A., Goldman, M. (2003). Contributions of innate immunity to
allograft rejection and survival. Curr Opin Organ Transpl 8, 2-6
62
[38] Lederer, S. R., Friedrich, N., Regenbogen, C., Getto, R., Toepfer, M.,
Sitter, T. (2003). Non-invasive monitoring of renal transplant recipients:
urinary excretion of soluble adhesion molecules and of the complementsplit product C4d. Nephron Clin Pract 94, c19-c26
[39] Li, B., Hartono, C., Ding, R., Sharma, V. K., Ramaswamy, R., Qian, B.,
Serur, D., Mouradian, J., Schwartz, J. E., Suthanthiran, M. (2001). Noninvasive diagnosis of renal-allograft rejection by measurement of messenger RNA for perforin and granzyme B in urine. NEJM 344, 947-954
[40] Malaise, J., Steurer, W., Koenigsrainer, A., Mark, W., Margreiter, R.,
van Ophem, D., Mourad, M., Squifflet, J. P., EUROSPK Study Group
(2005). Simultaneous pancreas-kidney transplantation in a large multicenter study: surgical complications. Transplant Proc 37, 2859-2860
[41] Michalak, G., Kwiatkowski, A., Bieniasz, M., Meszaros, J., Czerwinski,
J., Wszola, M., Nosek, R., Ostrowski, K., Chmura, A., Danielewicz, R.,
Lisik, W., Adadynski, L., Fesolowisz, S., Dobrowolska, A., Durlik, M.,
Rowiñski, W. (2005). Infectious complications after simultaneous pancreas-kidney transplantation. Transplant Proc 37, 3560-3563
[42] Moll, S., Pascual, M. (2005). Humoral rejection of organ allografts. Am J
Transplant 5, 2611-2618
[43] Müller, T. F., Trösch, F., Ebel, H., Grüssner, R. W. G., Feier, H., Föke,
B., Greger, B., Lange, H. (1997). Pancreas-specific protein (PASP), serum
amyloid A (SAA), and neopterin (NEOP) in the diagnosis of rejection
after simultaneous pancreas and kidney transplantation. Transpl Int 10,
185-191
63
[44] Muthukumar, T., Dadhania, D., Ding, R., Snopkowski, C., Naqvi, R.,
Lee, J. B., Hartono, C., Li, B., Sharma, V. K., Seshan, S. V., Kapur, S.,
Hancock, W. W., Schwartz, J. E., Suthanthiran, M. (2005). Messenger
RNA for FOXP3 in the urine of renal-allograft recipients. NEJM 353,
2342-2351
[45] Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. (2002).
Detection of the complement degradation product C3d in renal allografts:
diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol 13, 242-251
[46] Nikolaidis, P., Amin, R. S., Hwang, C. M., McCarthy, R. M., Clark, J.
H., Gruber, S. A., Chen, P. C. (2003). Role of sonography in pancreatic
transplantation; Radiographics 23, 939-949
[47] Otto, C., Ulrichs, K. (2004). The immunology of allograft rejection: A
survey of current knowledge and a discussion of peptide-specific antirejection strategies. Tx Med 16, 158-171
[48] Peakman, M., Senaldi, G., Vergani, D. (1989). Assessment of complement activation in clinical immunology laboratories: Time for reappraisal?. J Clin Pathol 42, 1018-1025
[49] Peng, Q., Li, K., Patel, H., Sacks, S. H., Zhou, W. (2006). Dendritic cell
sythesis of C3 is required for full T cell activation and development of a
Th1 phenotype. J Immunol 176, 3330-3341
[50] Pratt, J. R., Basheer, S. A., Sacks, S. H. (2002). Local synthesis of complement component C3 regulates acute renal transplant rejection. Nat
Med 8, 582-587
64
[51] Reddy, K. S., Davies, D., Ormond, D., Tuteja, S., Lucas, B. A., Johnston, T. D., Wid, T., McKeown, J. W., Ranjan, D. (2003). Impact of
acute rejection episodes on long-term graft survival following simultaneous kidney-pancreas transplantation. Am J Transpl 3, 439-444
[52] Roether, E., Lang, B., Coldewey, R., Hartung, K., Peter, H. H. (1993).
Complement split product C3d as an indicator of disease activity in systemic lupus erythematosus. Clin Rheumatol 12, 31-35
[53] Sansalone, C. V., Maione, G., Aseni, P., Mangoni, I., de Roberto, A.,
Soldano, S., Minetti, E., Broggi, M. L., Civati, G. (2005). Surgical complications are the main cause of pancreatic allograft loss in pancreaskidney transplant recipients. Transplant Proc 37, 2651-2653
[54] Sayegh, M. H. (1999). Why do we reject a graft? Role of indirect allorecognition in graft rejection. Kidney Int 56, 1967-1979
[55] Schmaderer, C., Lutz, J., Stangl, M., Heemann, U. (2005). Ischämie-/
Reperfusionsschaden nach Nierentransplantation. TransplantLinc 10, 1525
[56] Schweitzer, E., Farney, A., Allen, E. (2001) Pancreas Transplantation.
in Kuo, P. C., Schroeder, R. A., Johnson, L. B. (ed.). Clinical Management of the Transplant Patient. Oxford University Press, New York, 123149
[57] Siassi, M., Hohenberger, W., Riese, J. (2003). Mannan-binding lectin
(MBL) serum levels and post-operative infections. Biochemical Society
Transactions 31, 774-775
65
[58] Smets, Y. F. C., Westendorp, R. G. J., van der Pijl, J. W., de Charro, F.
T., Ringers, J., de Fijter, J. W., Lemkes, H. H. P. J. (1999). Effect of simultaneous pancreas-kidney transplantation on mortality of patients with
type-1 diabetes mellitus and end-stage renal failure. Lancet 353, 19151919
[59] Sobiesiak, M. (2003). Acute Phase Proteins in Transplant Patients. Tx
Med 15, 25-20
[60] Splendiani, G., Cipriani, S., Tisone, G., Iorio, B., Condo, S., Vega, A.,
Dominijanni, S., Casciani, C. U. (2005). Infectious complications in renal
transplant recipients. Transplant Proc 37, 2497-2499
[61] Tang, S., Zhou, W., Sheerin, N. S., Vaughan, R. W., Sacks, S. H. (1999).
Contribution of renal secreted complement C3 to the circulating pool in
humans. J Immunol 162, 4336-4341
[62] Vallhonrat, H., Williams, W. W., Dec, G. W., Keck, S., Schoenfeld, D.,
Cosimi, A. B., Pascual, M. (2001). Complement activation products in
plasma after heart transplantation in humans. Transplantation 71, 13081311
[63] Van Son, W. J., van der Woude, F. J., van der Hem, G. K., The, T. H.,
Ockhuizen, T., Tegzess, A. M. (1985). Complement activation associated
with active cytomegalovirus infection in renal transplant patients, and its
absence in transplant rejection episodes. Transplantation 39, 510-514
[64] Weiner, S. M., Thiel, J., Berg, T., Weber, S., Krumme, B., Peter, H. H.,
Rump, L. C., Grotz, W. H. (2004). Impact of in vivo complement activation and cryoglobulins on graft outcome of HCV-infected renal allograft
recipients. Clin Transplant 18, 7-13
66
[65] Weis, J. J., Fedder, T. F., Fearon, D. T. (1984). Identification of a
145,000 Mr membrane protein as the C3d receptor (CR2) of human B
lymphocytes. Proc Natl Acad Sci 81, 881-885
[66] Winkelmayer, W. C., Lorenz, M., Kramar, R., Födinger, M., Hörl, W.
H., Sunder-Plassmann, G. (2004). C-reactive protein and body mass index independently predict mortality in kidney transplant recipients. Am J
Transplant 4, 1148-1154
[67] Wolbink, G. J., Brouwer, M. C., Buysmann, S., ten Berge, I. J.M., Hack,
C. E. (1996). CRP-mediated activation of complement in vivo: Assessment by measuring circulating complement-C-reactive protein complexes.
J Immunol 157, 473-479
[68] Wong, J. J., Krebs, T. L., Klassen, D. K., Daly, B., Simon, E. M., Bartlett, S. T., Grumbach, K., Drachenberg, C. B. (1996). Sonographic
evaluation of acute pancreatic transplant rejection: morphology – Doppler analysis versus guided percutaneous biopsy. Am J Rontg 166, 803807
[69] Wullstein, C., Drognitz, O., Woeste, G., Schareck, W. D., Bechstein, W.
O., Hopt, U. T., Benz, S. (2004). High levels of C-reactive protein after
simultaneous pancreas-kidney transplantation predict pancreas graftrelated complications and graft survival. Transplantation 77, 60-64
[70] Wullstein, C., Woeste, G., Taheri, A. S., Dette, K., Bechstein, W. O.
(2003). Morbidität der kombinierten Pankreas-/Nierentransplantation.
Der Chirurg 74, 652-656
67
7. Danksagung
Mein Dank gilt in erster Linie Herrn PD Dr. med. Weiner für die Themenstellung und damit verbunden die Chance, einen Einblick in klinische Forschungsarbeit zu erhalten. Die stets freundliche und motivierende Unterstützung und
Betreuung in organisatorischen wie fachlichen Fragen habe ich sehr geschätzt,
die unkomplizierte Ansprechbarkeit war mir eine große Hilfe.
Des Weiteren möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Rump für seine konstruktiven,
wertvollen Verbesserungsvorschläge danken, die ich gerne beherzigt habe.
Wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben die MitarbeiterInnen
der Abteilung für experimentelle Nephrologie im Zentrum für Klinische Forschung der Ruhr-Universität Bochum, insbesondere Jun.-Prof. Dr. med. Oliver
Vonend und Bettina Priesch, deren tatkräftige Unterstützung mir die Versuchseinrichtung und -durchführung dort erst ermöglicht haben.
Danken möchte ich auch den MitarbeiterInnen des Immunologischen Labors
der Medizinischen Klinik der Universität Freiburg, v.a. Herrn Dr. rer. nat.
Schlesier und Frau Kaiser für die Hilfen beim Erlernen der Methode.
Den MitarbeiterInnen des Zentrallabors des Knappschaftskrankenhauses in Bochum-Langendreer, namentlich besonders Frau Richter, gilt mein Dank für die
Unterstützung bei der Blutprobensammlung. Prof. Dr. med. Viebahn und dem
Ärzteteam der transplantationschirurgischen Station des Knappschaftskrankenhauses danke ich dafür, mir im Rahmen einer Famulatur die praktischen Aspekte der Nieren- bzw. Pankreastransplantation näher gebracht zu haben.
Darüber hinaus danke ich meinen Freunden, die mir viel Geduld und ein immer
offenes Ohr entgegen gebracht haben. Besonders erwähnen möchte ich Ngoc
Pham, ohne deren tatkräftige und freundschaftliche Unterstützung mir die Arbeit
im Labor nur halb so viel Spaß gemacht hätte, des Weiteren Joachim Lutz, dessen Computerkenntnisse mir einige Mühen erspart haben und dessen Korrekturvorschläge mir eine große Hilfe waren.
Schließlich gilt mein Dank meinen Geschwistern Matthias und Katharina, letzterer für die Hilfen in puncto Bibliotheksnutzung und Literaturbeschaffung, sowie meinen Eltern für ihre empathische, geduldige, motivierende und jederzeit
tatkräftige Unterstützung.
8. Lebenslauf
PERSÖNLICHE DATEN
Name, Vorname
Suermann, Angela
Geburtsdatum, -ort
13. April 1981, Bochum
Familienstand
ledig
Staatsangehörigkeit
deutsch
Religionsbekenntnis
römisch-katholisch
SCHULISCHE AUSBILDUNG
1987 – 1991
Gemeinschaftsgrundschule Heggen
1991 – 2000
St.-Ursula-Gymnasium, Attendorn
bilinguales (dt.-engl.) Abitur
UNIVERSITÄRE AUSBILDUNG
10/2000 – 7/2007
Studium der Humanmedizin
an der Ruhr-Universität Bochum
9/2002
Physikum
9/2003
1. Staatsexamen
9/2005
2. Staa tsexamen
4/2006 – 3/2007
Praktisches Jahr, Augusta-Krankenanstalt Bochum
Wahlfach: Geriatrie
7/2007
3. Staatsexamen