Vorgesehenes Programm der AG Molekulare Resistenzbestimmung
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Vorgesehenes Programm der AG Molekulare Resistenzbestimmung in der Sektion Grundlagen der Paul-Ehrlich-Gesellschaft Nadja Auer, Peter Heisig Pharmazeutische Biologie und Mikrobiologie Universität Hamburg e-mail: [email protected], [email protected] Genetisch basierte Detektionssysteme Hintergrund: Die herkömmlichen Methoden der Ermittlung der Antibiotikaempfindlichkeit bakterieller Krankheitserreger beruhen auf kulturellen Verfahren, die den Resistenzphänotyp mittels Reihenverdünnung oder Agardilution bestimmen. Die Suche nach alternativen Methoden begründet sich vor allem auf der z.T. langen Anzuchtdauer (z.B. Mykobakterien) und der von den Anzuchtbedingungen abhängigen Expression mancher Resistenzeigenschaften, die zu falsch negativen Ergebnissen führen kann (z.B. Methicillin-Resistenz, bestimmte β-Laktamasen). Als Alternative soll die Möglichkeit der Detektion von Resistenzeigenschaften auf genetischer Ebene mittels molekularbiologischer Methoden untersucht werden. Zwei grundlegende genetische Mechanismen kommen für die Entstehung von Antibiotikaresistenz in Betracht: 1. Der Erwerb zusätzlicher genetischer Information, z.B. in Form von RPlasmiden, Integrons, Transposons oder einfacher Insertionselemente mittels Transformation, Transduktion oder Konjugation sowie 2. Mutationen Insertionen. die Veränderung vorhandener genetischer Information durch z.B. in Form von Punktmutationen, Deletionen oder VORTEILE NACHTEILE ¾ schnellere Datenverfügbarkeit, besonders bei langsam wachsenden Erregern ¾ mögliche Lücke bei neuartigen Resistenzdeterminanten ¾ möglicherweise nicht alle Resistenzdeterminanten erfassbar ¾ einfachere Handhabung ¾ bessere Standardisierbarkeit ¾ höhere Kosten ¾ umfangreicheres Spektrum an gleichzeitig zu erfassenden Mechanismen ¾gute Automatisierbarkeit ¾ bei fehlender Expression Überbewertung von positiven Nachweisen ¾ auch quantitative Änderungen in der Genexpression sind erfassbar ¾Eindeutiges Screening bei Auftauchen ‚alter‘ Resistenzgene in ‚neuen‘ Erregern ohne weitere methodische Entwicklung (VRSA) Beispiele: 1. Für den Nachweis des Erwerbs neuer genetischer Information, Insertionsund größere Deletionsmutationen eignet sich: 2. Für den Nachweis bekannter Punktmutationen mit weiter Verbreitung und hoher Homologie eignet sich: •PCR mit spezifischen Primern mit gelelektrophoretischer Auftrennung •PCR-Techniken mit allelspezifischen Primern oder spezifische Hybridisierungsmethoden für Mutationen, die in einem eng begrenzten Bereich lokalisiert sind ÆIdentifizierung des betreffenden DNA-Abschnitts anhand der Molekülgröße ÆErhöhung der Spezifität z.B. durch nachgeschalteten Restriktionsverdau ÆRT-PCR •Quantifizierung der mRNA ausgewählter Gene am Ende einer Aktivierungskaskade, wie z.B. Strukturgene für Effluxpumpen oder β-Laktamase für Punktmutationen, die an sehr variablen Positionen vorkommen •DNA-Sequenzierung zum Nachweis spezifischer Punktmutationen innerhalb größerer DNA-Bereiche 1a) Methicillin/Oxacillin Resistenz in Staphylokokken High-level Resistenz gegen β-Laktame entsteht durch ein alternatives Penicillinbinding-protein (PBP2a), kodiert durch das mecA Gen. 2a) Konservierte Aminosäuresequenzen in der QRDR von GyrA und ParC Gram-negativer Bakterien 67 ---- 78 - 79 - 80 - 81 - 82 - 83 - 84 - 85 - 86 - 87 - 88 - 89 - 90 - 91---106 Ala Gln ParC GyrA Abb. 1a: mecA Gen 1b) Mar (Multiple antibiotic resistance) Phänotyp bei E. coli beruht oft auf Dereprimierung durch Mutationen unterschiedlicher Regulatoren * für die Efflux Pumpe AcrAB * * Mar R Acr R A marR marA marB Mar A soxR Sox S B * Sox R soxS AcrA 2b) Acr B C acrR acrA acrB Komponenten der Efflux Pumpe AcrAB His Pro His Gly Asp Ser Ala Val Tyr Asp Thr Ile Val Arg Thr Ser Glu Ala Leu Asn 64 ---- 75 - 76 - 77 - 78 - 79 - 80 - 81 - 82 - 83 - 84 - 85 - 86 - 87 - 88---103 Ala His Pro His Gly Asp Ser Ala Cys Tyr Glu Ala Met Val Leu Gln Ser Ala Arg Ile Ile Gly Cys Ala Pro Ala His Abb. 2a: Punktmutationen in Position 83 und 87 in gyrA und parC gram negativer Bakterien Ser Asp Phe Val Gly Arg Thr Val Leu Asn Ile Tyr Mycobacterium tuberculosis:Trp Rifampin Resistenz Val Val Extreme Variabilität der Mutationen im rpoB Gen welches zur Resistenz gegen Rifampin führt Sox R* Abb. 1b: (nach Miller und Sulavik (1996)), regulatorisches System für die Kontrolle von multiple-antibiotic-resistance in E. coli A: marRAB locus; B: soxRS locus; C: acrAB locus. Pfeile zeigen positive Regulation, beidseitig beendete Linien zeigen negative Regulation. SoxR* ist das Protein in seiner aktivierten Form. AcrA und AcrB sind Komponenten des Efflux Pumpen Komplexes. Abb. 2b: mögliche Mutationen im rpoB Gen von M. tuberculosis (aus Musser JM (1995)). Ziele der zukünftigen Tätigkeit der neuen AG Molekulargenetische Resistenzbestimmung sollen daher sein, • zunächst bereits vorhandene Erfahrungen mit dem Nachweis einzelner Resistenzeigenschaften zu sammeln und in Form von Empfehlungen durch Expertenlaboratorien als leicht reproduzierbare Arbeitsvorschriften zur Verfügung zu stellen, • in ausgewählten Referenzlaboratorien einzelne molekulargenetische Techniken parallel zur routinemäßigen Resistenzbestimmung zu evaluieren, • die Erfahrungen regelmäßig auszutauschen und koordiniert zu erweitern, um für die weitere Zukunft die Entwicklung eines miniaturisierten Detektionssystems auf der Basis eines DNA-Chips anzustreben. Literatur Miller PF und Sulavik (1996). Overlaps and parallels in the regulation of intrinsic multiple-antibiotic resistance in Escherichia coli. Molecular Microbiology, 21 (3), 441-448 Fluit C, Visser MR, Schmitz F-J (2001). Molecular Detection of Antimicrobial Resistance. Clinical Microbiology Review, Oct., 836-871 Kobayashi N, Taniguchi K, Urasawa S (1998). Analysis of Diversity of Mutations in the mecA Promoter/Operator Region of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Mar., 717-720 Musser JM (1995). Antimicrobial Agent Resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights. Clinical Microbiolohy Reviews. Oct., 496-514
