Man sollte sich als erstes überlegen, welche Multiplettstruktur die

Lösung zur NMR-Aufgabe Pentapeptid (im Skript ab Seite 111)
Man sollte sich als erstes überlegen, welche Multiplettstruktur die einzelnen
Protonen zeigen. Es wären dies:
NH(Gly)
- dd (bzw. evtl. Pseudotriplett)
Hα(Gly)
- dd (gilt für beide diastereotopen Hα des Glycins)
NH(Ala)
- d
Hα(Ala)
- dq (Dublett von Quartetts, evtl. Pseudoquintett)
Hβ(Ala)
- d
Die NH-Protonen erscheinen im Bereich von 7.4 bis 8.6 ppm, die HαProtonen von 3.3 bis 4.3 ppm, die Hβ des Alanins bei etwa 1.2 ppm.
Singuletts sind nicht zu erwarten, das Singulett bei 3.3 ppm kann nur von
HOD bzw. H2O herrühren, weitere schwache Signale zwischen 1.8 und 3.0
ppm rühren von Verunreinigungen her. Indiz dafür ist das zu kleine Integral.
Alle NH-Protonen sind gut separiert, ebenso die vier diastereotopen HαProtonen des Glycins. Die Hα des Alanins lassen sich nicht vollständig
separieren, die drei Hβ-Dubletts sind gut auswertbar, wenn man die im
höchstfeldigen Dublett gemessene Kopplungskonstante als Hilfsmittel zur
Separation der übrigen vier Linien nutzt. Es gilt ein globales
Integralverhältnis NH:Hα:Hβ = 5:7:9, welches befriedigend erfüllt wird.
Die bisherigen Ergebnisse sollte man tabellarisch festhalten. Bei der
gegebenen Auflösung lassen sich die Kopplungskonstanten sinnvoll nur mit
einer Genauigkeit von 1 Hz angeben.
Proton
chem. Verschiebung
[ppm]
Multiplizitä
t
NH(Gly)
8.49
dd
Kopplungskonstante
n*
3
JNH,Hα´ = 6 Hz
JNH,Hα´´ = 6 Hz
3
JNH,Hα = 7 Hz
3
JNH,Hα = 7 Hz
3
JNH,Hα = 8 Hz
3
JNH,Hα´ = 4 Hz
3
JNH,Hα´´ = 7 Hz
3
NH(Ala)
NH(Ala)
NH(Ala)
NH(Gly)
8.22
8.14
7.72
7.66
d
d
d
dd
Hα(Ala)
Hα(Ala)
Hα(Ala)
Hα(Gly)
Hα(Gly)
Hα(Gly)
Hα(Gly)
Hβ(Ala)
Hβ(Ala)
Hβ(Ala)
≈4.2
≈4.1
≈4.1
3.90
3.76
3.59
3.43
1.25
1.24
1.20
dq
dq
dq
dd
dd
dd
dd
d
d
d
3
JHα,Hβ = 7 Hz
JHα,Hβ = 7 Hz
3
JHα,Hβ = 7 Hz
3
Die ´-Markierungen der Hα von Glycin sind nur als Unterscheidung der diastereotopen
Protonen zu verstehen und nicht als Zuordnung
Wegen der guten Dispersion der NH-Signale können die 5 eindimensionalen
Protonenspektren der fünf Aminosäuren im TOCSY einfach beobachtet
werden.
2
3
4
5
6
7
Gly-B
Ala-C
Ala-B
Ala-A
ppm
7
6
8
Gly-A
5
4
3
ppm
2
Die vorläufige Bezeichnung der Aminosäuren im Spektrum und den
folgenden Erklärungen stellt noch keinen Zusammenhang mit der
Sequenzierung dar, sondern erfolgte rein willkürlich.
Zwei Hα-Protonen von Alaninresten bleiben auch bei starker Vergrößerung
zufällig isochron. Die drei Methylgruppen lassen sich bei entsprechender
Vergrößerung (vgl. Blatt 4 der Aufgabenstellung) eindeutig dem jeweils
zugehörigen NH der gleichen Aminosäure zuordnen. Die Tabelle faßt die
bisherige Zuordnung zusammen.
Aminosäure
δ(NH) [ppm]
δ(Hα) [ppm]
δ(Hβ) [ppm]
Gly-A
8.49
Gly-B
7.66
Ala-A
Ala-B
Ala-C
8.22
8.14
7.72
3.90
3.43
3.76
3.59
≈4.1
≈4.1
≈4.2
1.20
1.25
1.24
H
N
R'
C
O
H
C
C R
N
C
H
O
H
NOE
i-1
NOE
i
Nun erfolgt die Sequenzierung des zyklischen Pentapeptids anhand eines
Vergleichs von TOCSY- und ROESY-Spektrum:
In Peptidsträngen sieht man ausgehend vom NH einer Aminosäure in
NOESY/ROESY-Spektren Kreuzsignale sowohl zum eigenen Hα (i), als auch
zum Hα der vorangehenden Aminosäure (i-1) in der Sequenz (siehe
Abbildung). Mit Hilfe des TOCSY-Spektrums können die eigenen Hα
Peotonen (i) der jeweiligen Aminosäure identifiziert werden. Durch
Ausschlußprinzip können dann im NOESY/ROESY-Spektrum anhand der
zusätzlichen Hα-Signale die Aminosäuren i-1 identifiziert werden (siehe
Spektren).
Durch
Zusammensetzung
der
Teilinformationen
(Aminosäurepaare) kann die Sequenz
Ala C Ala A Gly A Gly B Ala B
identifiziert werden. Fehlende Kreuzsignale im ROESY Spektrum
beeinträchtigen diese Aussage nicht, sondern weisen auf eine spezielle
Konformation hin, bei der der Abstand NH-Hα ungewöhnlich groß ist.
i-1
i-1
i
i-1 = Gly A
i-1 = ?
7.6
7.7
i
7.8
7.9
8.0
8.1
i
i-1 = Gly B
i-1 = Ala C
i-1
8.2
i
8.3
i-1
8.4
i-1 = Ala B oder
Ala A
i-1
i
8.5
ppm
ppm
4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4
7.6
i = Gly B
7.7
i = Ala C
7.8
7.9
8.0
8.1
i = Ala B
8.2
i = Ala A
8.3
8.4
i = Gly A
8.5
ppm
ppm
4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4