Skript Mikrobenphysiologie
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1 Mikrobenphysiologiepraktikum SS 2012 Praktikumsbeginn: 8:00 Uhr s.t.! Skript als Vorbereitung gründlich durcharbeiten! Zu Praktikumsbeginn werden Fragen über die Theorie der praktischen Arbeiten gestellt! Mitzubringen sind: 1. Kittel 2. Praktikumsskript 3. Taschenrechner, Schreibzeug (wasserfester Stift - Edding® 4000 - zum Beschriften) 4. Millimeterpapier 5. gebundenes A4-Heft kariert 6. Schloss für Spind VERSUCH 1 Vorbereitung für Tag 1: - Ökologie und Physiologie von Escherichia coli - Aufbau und Funktionsweise eines Photometers (Begriffsdefinition: Extinktion, Absorption, optische Dichte) - Verlauf einer Wachstumskurve (µ max, t d, …) Vorbereitung für Tag 2: - theoretischer Hintergrund der Protein- und Glucosebestimmung - Parameter eines Wachstumsverlaufs (Berechnung von YX/S, YBSW , YESW , YATP, n , ...) VERSUCH 2 Vorbereitung für Tag 1: - theoretische Grundlagen zur Regulation der Lactoseverwertung durch E. coli - Methoden zur Messung bakteriellen Wachstums - Streulicht-/Extinktionsmessung, Bestimmung der optischen Dichte einer Suspension - Theorie der Kinetiken bakteriellen Wachstums (µ, t d, Y) etc. Vorbereitung für Tag 2: - theoretische Grundlagen zur Glucose- und Lactosebestimmung - Grundlagen zur Messung der Enzymaktivität am Beispiel der ß-Galactosidase - Kinetik enzymatischer Reaktionen (iso- und allosterischer Enzyme) Bei der Abfassung der Praktikumsprotokolle sind die Hinweise auf den Seiten 18/19 unbedingt zu beachten! 2 Versuch 1 Wachstum und Physiologie von Escherichia coli unter aeroben und anaeroben Bedingungen Aufgaben A) Bestimmen Sie den linearen Messbereich für die Absorption einer MethylenblauLösung und für die optische Dichte verschiedener Bakteriensuspensionen. Erläutern Sie den Unterschied zwischen der photometrischen Absorptionsmessung und der Trübungsmessung (Streuung). B) Ermitteln Sie experimentell für Escherichia coli die maximalen Wachstumsraten (µmax) und die Ertragskoeffizienten für das Wachstum auf Glucose (YXS) unter aeroben und anaeroben Bedingungen und vergleichen Sie die erhaltenen Werte mit den theoretisch berechneten Wachstumserträgen. Erläutern Sie außerdem den Verlauf der erhaltenen Wachstumskurven in Zusammenhang zum gemessenen Substratverbrauch und zur pHÄnderung vergleichend (aerob, anaerob, verschiedene Glucosekonzentrationen, Proteingehalt, Werte aller Gruppen). Einführung Beim chemoorganoheterotrophen Wachstum wird eine organische Verbindung sowohl als Energie- als auch als Kohlenstoffquelle genutzt. Dabei wird die Energie, die bei der Oxidation des Substrats (im Energiestoffwechsel/ESW, Katabolismus) frei wird, genutzt, um Zellmasse zu synthetisieren. Außerdem liefert ein Teil des Substrates die Grundbausteine für die Synthese von Zellmasse (im Baustoffwechsel/BSW, Anabolismus). Der Ertragskoeffizient YXS gibt an, wie viel g Zellmaterial pro mol Substrat synthetisiert werden können. Dieser Wert hängt vom Energiegehalt des Substrats und dem Anteil dieser Energie ab, der zur ATP-Regeneration bzw. zum Aufbau von Zellsubstanz genutzt werden kann. Der EnergieErtragskoeffizient YATP (g Trockenzellen/mol ATP) gibt die Zellmasse an, die bei Verwertung eines 3 bestimmten (Baustoffwechsel-)Substrates aus einem mol ATP gebildet werden kann (YATP für Glucose als Substrat des Baustoffwechsels = 10 g TZ/mol ATP). E. coli ist als fakultativ anaerobes Bakterium in der Lage, auf Glucose als alleinigem Substrat sowohl aerob als auch anaerob zu wachsen. Unter aeroben Bedingungen wird die Glucose über den Embden-Meyerhof-Weg und den Citrat-Cyclus vollständig zu CO2 oxidiert. Die dabei entstehenden Reduktionsäquivalente werden in der Atmungskette auf O2 übertragen. Bei diesem Stoffwechselweg können pro mol Glucose ca. 26 mol ATP (= naerob, s.u.) gebildet werden. Unter anaeroben Bedingungen fermentiert E. coli die Glucose in einer gemischten Säuregärung zu Säuren (Succinat, - Lactat, Acetat, Formiat), Ethanol, Wasserstoff und CO2 (liegt in wässriger Lösung als HCO3 vor). Bei dieser Art des Energiestoffwechsels werden lediglich 2-3 mol ATP pro mol Glucose (= nanaerob, s.u.) im ESW gebildet. Berechnung von Wachstumsausbeuten Der Ertragskoeffizient (YXS) gibt an, wie viel Gramm Trockenzellen aus einem mol Substrat gebildet werden können. YXS lässt sich aus dem Ertragskoeffizienten des Energiestoffwechsels (YESW ) und dem Ertragskoeffizienten des Baustoffwechsels (YBSW) berechnen: Aufgelöst nach YXS: Energiestoffwechsel: 1 1 1 = + YXS YESW YBSW YXS = YESW = n x YATP YESW × YBSW YESW + YBSW (g TZ/mol Glucose ESW) n = mol ATP gebildet pro mol Substrat (hängt vom Stoffwechselweg ab) YATP = g TZ gebildet pro mol ATP (hängt von der C-Quelle ab; für Glucose 10 g TZ pro mol ATP) Baustoffwechsel: C YBSW = Zahl C-Atome/Substratmolekül x Mr (g/mol) (g TZ/mol GlucoseBSW) 0,5* *Kohlenstoffgehalt von Trockenzellen = 50 % Berechnung der Enzymaktivitäten Aus der Absorptionsänderung pro Minute und dem Extinktionskoeffizienten wird die Volumenaktivität nach Lambert-Beer (E = ε x c x d) berechnet: Volumenaktivität (U/ml) spezifische Aktivität Einheiten: -1 = ∆E/∆t (min ) x Gesamtvolumen (µl) _ -1 -1 ε (mM x cm ) x d (cm) x Rohextraktvolumen (µl) = Volumenaktivität / Proteinkonzentration 1 U = 1 µmol/min 1 Katal = 1 mol/s 1 U = 16,67 nkat 4 Zur Vorbereitung Vorlesung Mikrobenphysiologie Fragen • Was charakterisiert Escherichia coli? • Was bedeutet chemo(organo)heterotrophes Wachstum? • Was ist bei anaeroben Arbeitstechniken zu beachten? • Wie wird das Wachstum von Bakterien untersucht? Welche Parameter müssen Sie beobachten oder bestimmen? Welche Parameter können aus Versuchsdaten berechnet werden? • Was ist der Unterschied zwischen photometrischen Absorptions- und Streuungsmessungen? • Wie verwertet E. coli Glucose unter aeroben und anaeroben Bedingungen? • Was gibt der Ertragskoeffizient an? Wie wird er berechnet? Zeitplan zu Versuch 1 1.Tag: • Bestimmung des linearen Messbereiches des Photometers für die Absorption einer Methylenblau-Lösung und für die Bestimmung der optischen Dichte von Kultursuspensionen von Escherichia coli und Clostridium pasteurianum • Wachstum von Escherichia coli auf unterschiedlichen Glucosekonzentrationen unter aeroben und anaeroben Bedingungen • Korrelation von OD zum Proteingehalt als Maß für das Wachstum (Protein – Teil 1) Von einer aeroben und einer anaeroben Kultur mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen soll jeweils eine Wachstumskurve erstellt werden. Hierzu werden stündlich die optische Dichte bei 578 nm (OD578) sowie der pH-Wert gemessen. Desweiteren erfolgt die Probenahme zur Bestimmung der Glucosekonzentration und des Proteingehaltes (Lagerung der Proben bei -21°C) . Nach dem Animpfen soll als erstes der lineare Messbereich des Photometers für Absorptions- sowie Streuungsmessungen ermittelt werden. Die Proben für die OD578-Bestimmung der Wachstumskurve sollen dann dementsprechend verdünnt werden, so dass der Messwert im linearen Bereich des Photometers liegt. Aus den gemessenen Wachstumsparametern sollen der Ertragskoeffizient (YXS), die maximale Wachstumsrate (µmax) und der Einfluss der Glucosekonzentration auf diese Parameter bestimmt werden. Mit einer bereitgestellten Kulturlösung von E. coli wird die Korrelation der OD578 zum Proteingehalt der Zellen ermittelt und die OD578-Werte aus den Wachstumskurven umgerechnet. 5 2. Tag: • Bestimmung des Substratverbrauchs • Bestimmung des Proteingehaltes der Proben des Wachstumsversuches (Protein – Teil 2) In den Proben aus dem Wachstumsversuch vom 1. Tag wird über einen kolorimetrischen Test die Glucosekonzentration bestimmt. Um die am ersten Versuchstag angefertigte Protein-OD-Korrelation auf ihre Anwendbarkeit hin zu überprüfen, wird ebenfalls der tatsächliche Proteingehalt der Proben des Wachstumsversuches bestimmt und mit den Werten der Korrelation verglichen (graphische Auswertung). Protokoll: • Durchführung in Stichpunkten notieren • graphische Abbildung der Messwerte der Absorptions- und Trübungsmessung für die Linearität des Messbereiches inklusive Wertetabellen • Wachstumskurven (OD578, Glucosekonzentration, pH-Wert bei anaerober Kultur gegen die Zeit) inklusive Wertetabellen • Eichkurven Glucosebestimmung • Korrelation OD578 zu Proteingehalt der Zellen mit Eichkurven und Wertetabellen • Vergleich der praktisch ermittelten Proteinkonzentrationen der Proben des Wachstumsversuches mit denen der Korrelation (graphische Auswertung) • Berechnung der theoretisch zu erwartenden Ertragskoeffizienten unter aeroben und anaeroben Bedingungen [YX/S (g TZ/mol Glucose)] mit Gleichungen; Herleitung von naerob und nanaerob erklären • Bestimmung von YX/S aus den einzelnen Wachstumskurven (Werte eigene Gruppe) • Auftragung von g Trockenzellen gegen die eingesetzten Glucosekonzentrationen, hieraus Berechnung des Ertragskoeffizienten YX/S; Werte aller Gruppen verwenden! • Bestimmung der maximalen Wachstumsraten µ max und der Verdoppelungszeit t d mit Gleichungen • Diskussion der Ergebnisse Durchführung 1. Tag WACHSTUMSVERSUCH Die Medien und Vorkulturen werden gestellt. Jede Gruppe führt eine Kultivierung unter aeroben Bedingungen (Konzentrationsbereich: 2, 5 oder 10 mM Glucose) und eine Kultivierung unter anaeroben Bedingungen (Konzentrationsbereich: 5, 10 oder 15 mM Glucose) durch. aerob: 1 x 1-L-Schikanenkolben mit 200 ml Medium (+ Glucose) Vorkultur: Erlenmeyerkolben mit 50 ml Übernachtkultur auf 10 mM Glucose anaerob: 1 x ½-L-Schottflasche mit 200 ml Medium (+ Glucose) Vorkultur: 50 ml Übernachtkultur (10 mM Glucose) in 100ml-Serumflasche 6 Animpfen Vor dem Animpfen eine Probe Medium (1 ml) entnehmen und den OD578-Blindwert bestimmen. Das Animpfen erfolgt folgendermaßen: Aerob: Wattestopfen aus dem Schikanenkolben ziehen, Rand des Gefäßes kurz am Bunsenbrenner abflammen (Wattestopfen nicht abflammen! und nicht auf Tisch legen). Aus der Vorkultur (Wattestopfen rausziehen, Gefäß abflammen) zweimal 3,5 ml Bakteriensuspension mit steriler 5 ml-Pipette in den Schikanenkolben überimpfen (Vges = 7 ml). Anaerob: Schottflasche und Vorkulturflasche mit 70% Ethanol bespritzen, am Bunsenbrenner abflammen; sterile Einmalkanüle auf 20 ml-Spritze aufdrehen, Vorkulturflasche auf den Kopf drehen, Kanüle durchstechen, 20 ml Vorkultur entnehmen und in ½-L-Schottflasche überimpfen. Kanülen in dafür vorgesehene Abfallgefäße werfen! Aus allen Kolben sofort 1. Probe (t = 0) nehmen und die Kolben im 28°C-Brutraum auf einem Schüttelgerät (140 rpm) inkubieren. Anaerobe Kulturen werden als Standkultur bei 28°C inkubiert. Probennahme: OD578, pH, [Glucose], [Protein] Alle Proben zuerst in Reagenzgläschen füllen und danach erst entsprechend der durchzuführenden Analysen umfüllen. pH-Wert kann im Reagenzglas oder Eppendorfgefäß gemessen und Verdünnungen in Reagenzgläsern hergestellt werden. Aerob: Jede Stunde eine Probe von 4 ml mit einer 5-ml-Eppendorf-Pipette entnehmen: - genau 1 ml abzentrifugieren (1 min, 13.000 rpm): Überstand für Glucosebestimmung einfrieren Pellet für Proteinbestimmung einfrieren - 3 ml für OD578-Bestimmung (Dreifachbestimmung) Die Proben werden direkt im Brutraum entnommen. Am Anfang und Ende der Kultivierung zusätzlich 1 ml für pH-Wert Messung entnehmen. Anaerob: Stopfen der Kulturflaschen mit Ethanol sterilisieren und mit einer Spritze (mit steriler Kanüle) 5 ml Probe entnehmen: - genau 1 ml abzentrifugieren (1 min, 13.000 rpm): Überstand für Glucosebestimmung einfrieren Pellet für Proteinbestimmung einfrieren - 3 ml für OD578-Bestimmung (Dreifachbestimmung) - 1 ml für pH-Wert-Messung Die Proben werden am Arbeitsplatz entnommen. Vor jeder Probenahme Kulturflaschen mit Ethanol sterilisieren und neue sterile Kanüle verwenden. Nach Probenahme Kulturflache sofort wieder in Brutschrank stellen. 7 BESTIMMUNG DES LINEAREN MESSBEREICHES EINES PHOTOMETERS • Bestimmung des linearen Messbereiches der OD578 verschiedener Bakterienkulturen E. coli: 2 - 4 µm lang, 0.5 – 1 µm Durchmesser C. pasteurianum: 1 - 14 µm lang, 0.3 – 1.6 µm Durchmesser Als Ausgangskulturen werden verwendet: die aerobe E. coli - Vorkultur zum Animpfen der Wachstumskurve und eine bereitgestellte Übernachtkultur von C. pasteurianum. Messen Sie beide Kulturlösungen jeweils unverdünnt sowie verdünnte Zellsuspensionen mit 80, 50, 30, 20, 15, 10, 8, 5, 2 und 1 % (v/v) der Ausgangskultur. Die OD578 wird in Plastik-Küvetten bestimmt. Als Blindwert dient destilliertes Wasser. Tragen Sie die OD578 gegen die Konzentration der Zellsuspension (in %) auf. • Bestimmung des linearen Messbereiches der Absorption einer Methylenblau-Lösung -1 Stellen Sie 100 ml einer 100 µM Methylenblau-Lösung her (in 100 ml-Maßkolben; Mr = 373,9 g mol ). Stellen Sie verdünnte Lösungen her (100, 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 2.5 und 1 µM) und messen Sie die Absorption bei 660 nm. Tragen Sie die Absorption gegen die Konzentration auf. Unter Verwendung des Lambert-Beer’schen Gesetzes soll der Extinktionskoeffizient für Methylenblau -1 -1 bei 660 nm bestimmt und mit dem theoretischen Wert (ε660 nm = 71,5 mM cm ) verglichen werden. Wie sind die resultierenden unterschiedlichen Messbereiche zu erklären und welche Auswirkungen hat das auf Ihre Versuchsdurchführung? KORRELATION DER OPTISCHEN DICHTE ZUM PROTEINGEHALT DER ZELLEN (Protein – Teil 1 ) Aus einer bereitgestellten E. coli - Kultur werden Suspensionen mit verschiedenen optischen Dichten hergestellt. Dazu wird zunächst die OD578 der Ausgangssuspension bestimmt (1:15 verdünnen). Danach entsprechende Verdünnungen herstellen, mit denen OD578-Werte von ca. 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 und 0.3 erhalten werden. Proben nochmals messen, OD578-Werte notieren und Proben zurück ins Probengefäß füllen. Aus einer Protein-Standardlösung (RSA … Rinderserumalbumin, 1 mg/ml) werden die Proben für die Protein-Eichkurve vorbereit – dazu Verdünnungen mit jeweils 0, 20, 40, 60, 80 und 100 µg/ml Protein in H2Odest herstellen. Vor der Durchführung des Proteintests müssen die Zellen aufgeschlossen werden. Dies erfolgt durch alkalische Lyse der Zellen mit NaOH. Dazu werden 200 µl Probe mit 50 µl 0.5 N NaOH vermischt und 5 min bei 95°C inkubiert. Der Ansatz wird dann auf Eis abgekühlt und anschließend 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Diese Prozedur muss parallel mit den Proben und den Standards durchgeführt werden. 8 Zur Proteinbestimmung wird die Methode nach Bradford verwendet. Dabei werden die Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue angefärbt und durch Bestimmung der Extinktion bei 590 nm quantifiziert. Dazu werden auf einer Mikrotiterplatte 50 µl Überstand (Probe bzw. Standard) und 200 µl Messreagenz (Roti-Nanoquant, wird vorverdünnt gestellt!) gemischt. Als Blindwert werden je 250 µl H2Odest in die Wells A1, A2 und A3 pipettiert. Die Ansätze werden 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach die E590 photometrisch bestimmt. Alle Proben werden in drei Parallelen vermessen. Für die Korrelation wird zuerst die Konzentration der Proteinstandards gegen die gemessene Extinktion (E590) aufgetragen (= Eichkurve). Mit Hilfe dieser Eichkurve kann die Proteinkonzentration in den verdünnten Zellsuspensionen berechnet werden. Anhand der Auftragung der berechneten Proteinkonzentration über die optische Dichte der Zellsuspensionen (= Korrelation) kann der Faktor ermittelt werden, mit dem die OD578 aus den Wachstumskurven in eine Proteinkonzentration umgerechnet werden kann. Um die Genauigkeit der Dreifachbestimmung der Messwerte (= drei Parallelen auf Mikrotiterplatte) zu überprüfen, erfolgt die Berechnung der Standardabweichung s' in %. Abweichung von ≤ 5% sind akzeptabel. Im Praktikum werden Werte ≤ 10% toleriert. Standardabweichung s ∑ ⁄ n … Anzahl der Messwerte xi … Messwert x … Mittelwert [%] Durchführung 2. Tag BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTES DER PROBEN DES WACHSTUMSVERSUCHES (PROTEIN – TEIL 2 ) Der Proteingehalt der am ersten Versuchstag entnommenen Proben soll ermittelt und mit denen der Korrelation verglichen werden. Dazu werden die Zellpellets zunächst in je 1 ml A. dest. resuspendiert und bis zur Messung auf Eis gelagert. Die Proteinbestimmung erfolgt analog zu der am ersten Versuchstag angewendeten Methode (siehe oben). Dabei ist zu beachten, das Proben mit einer OD578nm > 0.3 (siehe Wachstumskurven) vor der alkalischen Lyse verdünnt werden müssen. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben des Wachstumsversuches wird zunächst aus den Standardwerten eine Eichkurve erstellt. Mit Hilfe dieser können dann die Proteinkonzentrationen der Proben berechnet werden. Zur Auswertung soll eine Grafik erstellt werden, in der die tatsächlichen Proteinkonzentrationen mit denen der Korrelation verglichen werden (getrennte Abbildung für aerobe und anaerobe Kultur). 9 GLUCOSEBESTIMMUNG WACHSTUMSVERSUCH Glucose + H2O + O2 Glucoseoxidase H2O2 + DH2 Peroxidase Gluconsäure + H2O2 2 H2O + D DH2 = ABTS red D = ABTS ox Es werden bereitgestellt: A) Phosphatpuffer: 40 mM pH 7.0 B) Enzymlösung: 10 mg Glucoseoxidase, 3 mg Peroxidase in 1 ml Puffer C) ABTS-Lösung: 50 mg ABTS in 2 ml Puffer D) Glucosestandard: 0.2 mg/ml Glucose frisch herstellen: E) Inkubationslösung: 20 ml A + 0,04 ml B + 0,4 ml C (pro Mikrotiterplatte) F) Verdünnungen Glucosestandard: 0.2 mg/ml, 0.10mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.01 mg/ml Lösung E erst herstellen, wenn alle Proben/Standard auf Mikrotiterplatte gegeben wurden!!! Durchführung: Der Test wird in Mikrotiterplatten durchgeführt. • 0.01 ml Probe/Standard + 0.2 ml E • 60 min inkubieren • E436 bestimmen Blindwert: statt Probe 210 µl A. dest. in Kavität A1, A2, A3 auftragen Standard: statt Probe fünf Standardkonzentrationen sowie 0 mg/ml in jeweils 3 Parallelen auftragen Proben: 3fach Bestimmung im Messbereich zwischen 0 und 200 µg/ml Glucose auftragen Pro Probe werden zwei Verdünnungen hergestellt, die im Bereich der Eichkurve liegen könnten. Die Glucosekonzentration der Proben wird anhand der Wachstumskurve abgeschätzt! Auswertung: Berechnen Sie anhand der Eichgerade die Glucosekonzentrationen der Proben. Die Werte der Proben sollen in mM angegeben werden. Auch die graphische Auftragung der Glucosekonzentration (in der Wachstumskurve) erfolgt in mM. Allgemeiner Hinweis 2. Tag Alle Messwerte (Protein, Glucose) werden in drei Parallelen bestimmt. Die Mittelwertbildung ist nur sinnvoll, wenn die Standardabweichung unter 10% liegt (= Toleranz Praktikum, siehe Tag 1). Sollten sie stark abweichende Messwerte feststellen, können sie anhand oben genannter Formel feststellen, ob sie sich noch im Toleranzbereich befinden. Einzelne „Ausreißer“ können gestrichen und bei der Mittelwertberechnung vernachlässigt werden. 10 Versuch 2 Diauxisches Wachstum von E. coli auf Glucose und Lactose Nachweis der allosterischen Regulierbarkeit der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Einführung In einer synthetischen Nährlösung befinden sich zwei unterschiedliche Kohlenstoff- und Energiequellen (C/E-Quellen), die wachstumslimitierend sind. Ihre Verwertung kann auf zweierlei Weise erfolgen: 1. Beide C/E-Quellen werden simultan abgebaut. 2. Eine der C/E-Quellen wird bevorzugt oder ausschließlich vor der anderen verwertet. Wachstumskinetisch kann man diauxisches Wachstum folgendermaßen beschreiben: Der Wachstumsverlauf ist durch zwei exponentielle Phasen (log-Phase 1 und 2) gekennzeichnet, die durch eine intermediäre lag-Phase voneinander getrennt sind. In der Regel ist die maximale spezifische Wachstumsrate in der log-Phase 1 (µmax1) größer als die in der log-Phase 2 (µmax 2). Für das diauxische Wachstum von E. coli auf dem C/E-Quellengemisch Glucose und Lactose ist CKatabolitrepression verantwortlich: 1. Die Enzyme für den Glucoseabbau sind in E. coli konstitutiv vorhanden; die Enzyme für den Lactoseabbau (Permease, ß-Galactosidase und Transacetylase) sind jedoch induzierbar. 2. Obwohl Lactose als physiologischer Induktor in der Nährlösung vorhanden ist, kommt es erst nach dem vollständigen Glucoseverbrauch zur Induktion, d.h. zur Transkription des LactoseOperons. 3. Den Strukturgenen des Lactoseoperons ist ein schwacher Promotor vorgeschaltet. Deshalb ist auch bei Vorhandensein eines inaktiven Repressors nur dann eine Transkription möglich, wenn genügend cAMP-CAP-Komplex in der Zelle vorliegt (CAP = catabolite activation protein). Während des Wachstums auf Glucose ist jedoch der zelluläre cAMP-Spiegel gering, was die Ausbildung einer regulatorisch wirksamen cAMP-CAP-Komplexmenge verhindert. Bei allosterischen Enzymen kann die Bindung des Substrates an ein aktives Zentrum die Eigenschaften des anderen Zentrums im gleichen Enzymmolekül beeinflussen. Darüber hinaus unterliegt die Aktivität von allosterischen Enzymen oft dem Einfluß regulatorisch wirkender Moleküle (Effektoren), die an anderen Stellen als dem aktiven Zentrum gebunden werden. Man spricht von Kooperativität zwischen den substratbindenden bzw. effektorbindenden Stellen am oligomeren Enzymmolekül. 11 Es ist oft schwierig, bei linearer Auftragung experimentell ermittelter Abhängigkeiten der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration zwischen nicht-allosterischen und allosterischen Enzymen zu unterscheiden. Ursache dafür ist, daß Substanzen, die eine positive Kooperativität bedingen, schon in sehr geringen Konzentrationen eine starke Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit bewirken. Dadurch nähert sich die sigmoidale Kennlinie der hyperbolen Kennlinie nicht-allosterischer Enzyme an. Eine Aussage darüber, ob es sich um ein allosterisches Enzym handelt ergibt sich aus der Darstellung der Meßdaten im LINEWEAVER-BURK-Diagramm. Man trägt v(s) als 1/v gegen 1/s auf. Nicht allosterische Enzyme ergeben in dieser Auftragung für v(s) eine Gerade, allosterische dagegen eine Kurve. Trägt man nach HILL ln [v / (vmax - v)] = n x ln s – ln km auf, so erhält man als Anstieg der Geraden den HILL-Koeffizienten (n). Dieser beschreibt das Ausmaß der Kooperativität. Folgende Fälle können auftreten: 1. n = 1 keine Kooperativität, das Enzym ist isosterisch und gehorcht der Michaelis-MentenBeziehung 2. n > 1 positive Kooperativität, das Enzym ist allosterisch 3. n < 1 negative Kooperativität, das Enzym ist allosterisch Am Beispiel der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola soll der Einfluß der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit eines allosterischen Enzyms untersucht werden. Zeitplan zu Versuch 2 1. Tag: Wachstum auf einer Nährlösung, die Glucose und Lactose enthält Zu Versuchsbeginn wird ein Kolben mit einer mit Puffer gewaschenen 16 Stunden alten Vorkultur beimpft. Halbstündlich wird die optische Dichte bestimmt. Im Zusammenhang mit jeder Probenahme wird die Biomasse aus 1,5 ml Kultursuspension durch Zentrifugation gewonnen. Die Sedimente werden bis zum nächsten Praktikumstag eingefroren. Die zellfreien Überstände werden abgetrennt und für die weitere Analytik eingefroren. Vom verwendeten E. coli-Stamm wird eine Trockenmasseeichkurve erstellt. 2. Tag: Bestimmung der Substratkonzentrationen und der Enzymaktivitäten In den Proben aus dem Wachstumsversuch werden mittels eines kolorimetrischen Tests die Konzentrationen von Glucose und Lactose bestimmt. Aus den eingefrorenen Zellen wird durch Zellaufschluß mit Natriumdesoxycholat ein Proteinrohextrakt (RE) hergestellt. Im RE wird die Volumenaktivität der ß-Galactosidase bestimmt. Nach Bestimmung des Proteingehaltes im RE kann die spezifische Aktivität errechnet werden. Am Beispiel des allosterisch regulierten Enzyms Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Pseudomonas syringae pv. phaseolicola wird die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration ermittelt. 12 Durchführung 1. Tag Wachstumsversuch Medien und Vorkulturen werden bereitgestellt. Medium: Stamm: Escherichia coli ML 30 10 g KH2 PO4 ca. 16 Stunden alte Suspension in Puffer 10 g K2HPO4 pro Gruppe werden gestellt: 1 Standrundkolben mit 80 ml Medium Kolben für Wachstumskinetik und für ß-Gal 20 ml Glucose/Lactose Vor Beimpfen Substrat ergänzen 1 g Na Cl 4 g (NH4)2SO4 0.7 g MgSO4 x 7 H2O 1 l Aqua dest. C-Substrat (Endkonzentration) 1 g Glucose x 1 H2O / Liter 1 g Lactose / Liter Beimpfen: Animpfdichte OD578 = 0,1 entsprechendes Volumen der Vorkultur verwenden (berechnen) Achtung! Kolben enthalten bereits 100 ml Medium Kolben in den 37°C Brutraum - auf Schüttelmaschin e (ca. 200 RPM) Probennahme: Probe unmittelbar nach dem Beimpfen aus Kolben entnehmen alle weiteren Proben werden gleich im Brutraum genommen Maschine möglichst kurze Zeit anhalten (O2 –Limitation vermeiden) Probevolumen 1. 4-5 ml in Zentrifugenglas zur OD578-Bestimmung sterile Spitzen verwenden! 2. 1,5 ml im Eppendorfgefäß 5 min zentrifugieren, Überstand gewinnen und einfrieren 3. Sediment in 750 µl Phosphatpuffer pH 7,5 (0,1M) aufnehmen, 50 µl Na-desoxycholat (2 mg/ml) dazugeben und einfrieren. 4. Probe für OD-Messung (3fach) verdünnen (Ex maximal 0,3) und messen (578 nm) 5. ab 3 Stunden bis zum Glucoseverbrauch die Glucosekonzentration mit Teststreifen kontrollieren und dokumentieren 13 Trockenmasse-Eichkurve für E. coli ML30 5 getrocknete Wägeschälchen je 5 x wägen ↓ Vorkulturkolben (Mitte log-Phase) abzentrifugieren (10 min, 4.000 rpm) ↓ Sediment in Aqua dest. resuspendieren (30 ml) Suspension einsetzen für: A B je 5 ml in getrocknete und gewogene Suspension verdünnen Wägeschälchen pipettieren 1. Schritt : ↓ auf OD578 zwischen 0,7 u. 0,9 verdünnen Verdünnung notieren (= V1) bei ca. 80°C trocknen 2. Schritt: ↓ weiter verdünnen: 1/1.5 1/2 1/4 1/6 1/10 1/20 1/30 1/60 (= V2) (2.Praktikumstag) 5x wägen Berechnung der Gesamtverdünnung (Ergebnis: TM (mg/5ml)) V gesamt= V1 x V2 ( z.B. 1/20 x 1/1,5 = 1/30) ↓ Messung der OD578 aller Verdünnungsstufen ↓ Zeichnen der Eichkurve OD578 = f (TM). Die Konzentrationen in den Verdünnungen können aus den gewogenen Trockenmassen und den Verdünnungsfaktoren errechnet werden. C (mg/ml) = (TM * Vgesamt )/ 5 Der Reziprokwert des Anstieges der Eichkurve ist der Faktor (F), mit dem die OD578 -Werte multipliziert werden müssen, um den Trockenmasssewert zu erhalten. Messung der optischen Dichte: 1. Probe in den linearen Bereich der Trockenmasseeichkurve (OD578 unter 0,3) verdünnen (!) und möglichst wenige verschiedene Verdünnungen verwenden! (1/2, 1/5, 1/10); stets 3fachBestimmungen 2. OD578 in Plastikküvetten messen, zuvor jedoch im Zentrifugenglas oder Eppi verdünnen (!) 3. OD578 x F x Verdünnung = Trockenmasse (mg/ml) F = Faktor, der sich aus dem Anstieg der Eichkurve ergibt (ist zu ermitteln) 14 Durchführung 2. Tag Glucosebestimmung Glucose + H2O + O2 Glucoseoxidase H2O2 + DH2 Peroxidase Gluconsäure + H2O2 2 H2O + D DH2 = ABTS red D = ABTS ox Es werden bereitgestellt: A) Phosphatpuffer: 40 mM pH 7.0 B) Enzymlösung: 10 mg Glucoseoxidase, 3 mg Peroxidase in 1 ml Puffer C) ABTS-Lösung: 50 mg ABTS in 2 ml Puffer D) Glucosestandard: 0.2 mg/ml Glucose frisch herstellen: E) Inkubationslösung: 20 ml A + 0,04 ml B + 0,4 ml C (pro Mikrotiterplatte) F) Verdünnungen Glucosestandard: 0.2 mg/ml, 0.10mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.01 mg/ml Lösung E erst herstellen, wenn alle Proben/Standard auf Mikrotiterplatte gegeben wurden!!! Durchführung: Der Test wird in Mikrotiterplatten durchgeführt (Pipettierreihenfolge beachten) • 0.01 ml Probe/Standard + 0.2 ml E • 60 min inkubieren • E436 bestimmen Blindwert: statt Probe Aqua dest. in Kavität A1, A2, A3 auftragen Standard: statt Probe fünf Standardkonzentrationen (siehe F) in jeweils 3 Parallelen auftragen Proben: 3fach Bestimmung im Messbereich zwischen 0 und 200 µg/ml Glucose auftragen (Verdünnen! nach Absprache) Lactosebestimmung … erfolgt in 2 Schritten: 1. Spaltung der Lactose durch ß-Galactosidase 2. Bestimmung der gebildeten Glucose mit der ABTS-Methode Berechnung der Lactosekonzentration: Aus der Differenz zwischen Glucosewert aus der Lactosebestimmung und Glucosewert aus der Glucosebestimmung berechnen. 15 In die Felder (= Well) einer Mikrotiterplatte werden pipettiert: • 0.02 ml Probe/Standard + 0.04 ml ß-Galactosidase • 120 min inkubieren • + 0,2 ml Lösung E (siehe Glucosetest) • 60 min inkubieren • E436 bestimmen Blindwert: statt Probe Aqua dest. in Kavität A1, A2, A3 auftragen Standard: statt Probe Glucosekonzentrationen auftragen 0.2 / 0.1 / 0.05 / 0.02 / 0.01 mg/ml Proben: 3fach-Bestimmung im Messbereich zwischen 0 und 200 µg/ml Glucose auftragen (Verdünnen! nach Absprache) Bestimmung der Volumenaktivität der ß-Galactosidase Herstellung von Rohextrakt RE • suspendierte Feuchtzellen auftauen (Proben enthalten bereits Natriumdesoxycholat) • ≥ 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubieren • 30 min bei 13000 x g zentrifugieren (Raumtemperatur) • Überstand in neues Reaktionsgefäß geben und bis zur Messung auf Eis lagern Messung: ß-Galactosidase o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid (NPGP) + H2O o-Nitrophenol + Galactose Das Reaktionsprodukt o-Nitrophenol wird bei 408 nm (E408) vermessen. Die Messung erfolgt in Mikrotiterplatten in je drei Parallelen (pro Probe): • 0.025 ml RE + 0.075 ml Substratpuffer (1,5 mM NPGP in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5) • 10 min messen (kinetische Messung) Die Reaktionsgeschwindigkeit wird als Extinktionsänderung pro Minute ausgedruckt. -1 Molarer Extinktionskoeffizient für o-Nitrophenol: 3.06 mM x cm -1 Schichtdicke: 0.5 cm Unter Berücksichtigung aller Verdünnungen ergibt sich die Volumenaktivität (VA) der ß-Galaktosidase im RE in der Dimension U/ml (Formel S. 2). Die spezifische Aktivität ist der Quotient aus der VA und der Gesamtproteinmenge in 1 ml RE mit der Dimension U/mg. 16 Proteinbestimmung der RE (für Berechnung der spezifischen Aktivität der ß-Galaktosidase): Zur Proteinbestimmung wird die Methode nach Bradford verwendet. Dabei werden die Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue angefärbt und durch Bestimmung der Extinktion bei 590 nm quantifiziert. Dazu werden auf einer Mikrotiterplatte 50 µl Überstand (Probe bzw. Standard) und 200 µl Messreagenz (Roti-Nanoquant, wird vorverdünnt gestellt!) gemischt. Als Blindwert werden je 250 µl H2Odest in die Wells A1, A2 und A3 pipettiert. Die Ansätze werden 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach die E590 photometrisch bestimmt. Alle Proben werden in drei Parallelen vermessen. Aus einer Protein-Standardlösung (RSA, 1 mg/ml) werden die Proben für die Protein-Eichkurve vorbereit – dazu Verdünnungen mit jeweils 0, 20, 40, 60, 80 und 100 µg/ml Protein in H2Odest herstellen. Der Standard 0 µg/ml entspricht der Blank-Probe. Auswertung des Wachstumsversuches • µmax1 (Glucose) • µmax2 (Lactose) • Ertrag (X) auf Glucose und auf Lactose • Ertragskoeffizienten (Yx/s) für beide C/E-Quellen • Verdopplungszeiten für das Wachstum auf Glucose und Lactose (td) • Trockenmassezunahme, Abnahme von Glucose und Lactose, Änderung der ßGalactosidaseaktivität alles im Zusammenhang als f(t) grafisch darstellen und interpretieren. Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Pseudomonas syringae Glucose-6-Phosphat + NAD + Glucose-6-PhosphatDehydrogenase 6-Phosphogluconolacton + NADH + H+ Die Messgröße ist der Extinktionsanstieg, der durch die Bildung von NADH 1erfolgt und bei 340 nm -1 -1 verfolgt wird. (ε340 = 6.2 mM *cm ) Durchführung: In eine Küvette werden pipettiert: • 0.6 ml 0.05 M Triethanolamin-Puffer pH 7.5 (TEA-Puffer) • + 0.05 ml 15 mM NAD • + 0.05 ml Glucose-6-Phosphat-DH • + 0.05 ml Glucose-6-Phosphat (Reaktionsstart; mit 150 mM Glc-6-Phosphat beginnen) • mit Plastikspatel gut mischen und Küvette in Messgerät stellen 17 Folgende Konzentrationen Glucose-6-Phosphat werden eingesetzt: 150 mM, 75 mM, 37.5 mM, 18.75 mM, 15 mM, 7.5mM, 5 mM, 3.75 mM, 3 mM, 1.5 mM, 1 mM Stammlösung: 150 mM Die Ermittlung der Volumenaktivitäten für die einzelnen Substratkonzentrationen erfolgt über das Lambert-Beersche Gesetz wie im Versuch 1 dargestellt. Auswertung der Enzymkinetik (Glucose-6-Phosphat-dehydrogenase) • Die ermittelte Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substrat- konzentration ist im LINEWEAVER-BURK und im HILL-PLOT darzustellen. Der HillKoeffizient ist zu bestimmen. Anmerkung: Die im Experiment ermittelten Daten liegen im HILL-PLOT nicht alle auf einer Geraden. Für die Berechnung von n wird die Gerade mit dem größten Anstieg zugrunde gelegt (Konzentrationen < 10 mM). 18 Merkblatt zur Anfertigungen von Verlaufsprotokollen 1. Das Protokoll wird während des Versuches in ein gebundenes DIN A 4 Heft mitgeschrieben. 2. Die Seiten müssen nummeriert werden und auf den Seiten 1 und 2 wird ein Inhaltsverzeichnis erstellt. 3. Es dürfen keine losen Blätter in dem Heft liegen. Falls Abbildungen auf Milimeter- oder Logarithmenpapier erstellt werden, so müssen diese eingeklebt werden. 4. Der Inhalt muss durch Überschriften und Zwischenüberschriften gegliedert sein. Außerdem muss an entsprechender Stelle auf die Vorschrift aus dem Skript verwiesen werden (die Vorschrift muss dann auch nicht noch einmal abgeschrieben werden) 5. Die Verlaufsprotokolle für sind jeden Versuchstag mit einem Datum zu versehen. 6. Abbildungen: • Jede Abbildung erhält einen Titel und eine Unterschrift, die beschreibt, was dargestellt ist. Außerdem muss auf die Wertetabelle verwiesen werden, aus der die Abbildung erstellt wurde. Zu jeder Abbildung gehört eine Wertetabelle. • Jede Abbildung erhält eine Nummer. Diese Nummern sind im ganzen Heft fortlaufend • Alle Achsen müssen beschriftet sein mit Werten und Einheiten in (runden) Klammern. • Zu jeder Kurve gehört eine Legende z.B.--- --- = OD578 • Die verschiedenen Kurven sollten gut unterscheidbare und nicht zu kleine Symbole erhalten. • Ausreißer auf jeden Fall mit in der Abbildung darstellen. • Bei Eichgeraden muss die Geradengleichung angegeben werden. • Die Kurven oder Geraden sollten nach Möglichkeit das gesamte Format ausfüllen. Vor allem die Spreizung der Ordinate ist entscheidend! • Gerundete Punkt-Punkt-Verbindungen sind zu vermeiden! 7. Werte der Extinktion oder der optischen Dichte stets mit Messwellenlänge angeben. 4 7.5 3 7.0 2 6.5 1 6.0 0 5.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zeit (h) OD578-berechnet pH OD578 Beispiel für eine Abbildung pH Abb. 27: Zunahme der OD578 sowie Abnahme des pH-Wertes beim Wachstum von Clostridium pasteurianum auf Glucose-Minimalmedium mit 20 mM Glucose. Es wurden die Werte aus Tabelle 15 aufgetragen. 19 8. Tabellen • Jede Tabelle erhält eine Nummer. Diese Nummern sind im ganzen Heft fortlaufend. • Jede Tabelle erhält einen Titel und eine Überschrift die beschreibt, was dargestellt ist. Außerdem kann auf eine Abbildung verwiesen werden. • Alle Zeilen und Spalten müssen eindeutig beschriftet sein mit Werten und Einheiten in (runden) Klammern. • Wird eine Zeile oder Spalte aus einer anderen berechnet, so ist in der Überschrift der Rechenweg anzugeben. • Ausreißer auf jeden Fall mit in der Tabelle auflisten. • Anmerkungen zu einzelnen Werten werden als Fußnote angegeben. Beispiel für eine Tabelle: Tabelle 15: Zunahme der OD578, der Wasserstoffmenge und Abnahme des pH-Wertes beim Wachstum von Clostridium pasteurianum auf Glucose-Mini-malmedium. OD578berechnet = (OD578gemessen - Blindwert)*Verdünnung. Der Blindwert betrug OD578 = 0,07. Die Zunahme von OD578berechnet und die Abnahme des pH-Wertes sind in Abbildung 27 dargestellt. Zeit (h) OD578gemessen Verdünnung OD578berechnet pH H2 (l) 0,0 0,330 1 0,263 7,40 0,00 2,5 0,400 1 0,331 7,24 0,025 4,75 0,360 2 0,582 7,00 0,05 5,0* 0,268* 10* 1,98* 6,50* 0,40* 6,25 0,268 5 0,993 6,68 0,19 7,75 0,270 10 2,00 6,20 0,41 8,25 0,335 10 2,65 5,98 0,54 8,75 0,1016 10 3,16 5,87 0,65 9,25 0,1011 10 3,11 5,77 0,68 10,0 0,337 10 2,67 5,84 0,70 10,75 0,343 10 2,73 5,76 0,70 *) Werte wurden nicht in die Berechnung mit einbezogen, da eventuell zwei Proben vertauscht wurden 9. Alle Nebenrechnungen und Beobachtungen kommen ins Heft und sonst nirgendwo hin; z.B. falls eine 1:20-Verdünnung gemacht wurde, schreibt man auf, wie man sie gemacht hat, also: 50 µl Probe + 950 µl Wasser entspricht einer 1:20 Verdünnung 10. Abgabe immer spätestens am auf das Blockende folgenden Montag. Deshalb wird das Protokoll während und nicht nach dem Versuch geschrieben. Eichkurven, Tabellen oder Abbildung können, müssen aber nicht mit dem Computer erstellt werden. Viel Spaß und Erfolg im Praktikum!!!
