Auswertung von Häufigkeitsverteilungen und Korrelationen der

Aus der Urologischen Klinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Bernd Wullich
Auswertung von Häufigkeitsverteilungen und Korrelationen der Proteine
Hdm2, P53, P63, P14ARF und P16INK4a im invasiven Harnblasenkarzinom an
digitalisierten Tissue Mikroarrays
- eine experimentelle Arbeit -
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Kerstin Anna Holzer
aus
Gochsheim
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Priv.-Doz. Dr. P. J. Goebell
Korrereferent:
Prof. Dr. B. Wullich
Tag der mündlichen Prüfung:
26. Februar 2013
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung ................................................................................................ 1
2
Einleitung ............................................................................................................... 5
2.1
Das Harnblasenkarzinom ............................................................................... 5
2.1.1
Epidemiologie und Ätiologie..................................................................... 5
2.1.2
Klassifikation des Harnblasenkarzinoms .................................................. 6
2.2
Zellzyklus und Zellzykluskontrolle ................................................................. 10
2.3
Tumorsuppressorgene – Onkogene ............................................................. 13
2.3.1
Das p53-Gen ......................................................................................... 13
2.3.2
Hdm2..................................................................................................... 18
2.3.3
INK4a/ARF-Genlokus ............................................................................ 20
2.3.4
Funktionen und Wechselwirkungen von P53/Hdm2/P14ARF ................... 23
2.3.5
P16INK4a.................................................................................................. 33
2.3.6
P63 ........................................................................................................ 38
2.4
Genetische Alterationen beim Harnblasenkarzinom ..................................... 43
2.4.1
Nicht-invasive papilläre Urothelkarzinome ............................................. 44
2.4.2
Carcinoma in situ ................................................................................... 46
2.4.3
Muskelinvasives Urothelkarzinom .......................................................... 47
2.4.4
T1 Blasenkarzinome .............................................................................. 48
2.4.5
Prognose und Therapie ......................................................................... 48
2.4.6
Bedeutung der Proteinveränderungen im Rahmen der Tumorgenese ... 51
3
Tissue Microarray ................................................................................................ 55
4
Zielsetzung der Arbeit .......................................................................................... 56
5
Material und Methoden ........................................................................................ 57
5.1
Material......................................................................................................... 57
5.1.1
Antikörper .............................................................................................. 57
5.1.2
Chemikalien........................................................................................... 58
5.1.3
Geräte ................................................................................................... 58
5.1.4
Lösungen und Puffer ............................................................................. 59
5.2
Methoden ..................................................................................................... 60
5.2.1
Tissue Microarray .................................................................................. 60
5.2.2
Immunhistochemische Färbungen ......................................................... 60
5.2.3
Durchführung der Immunhistochemischen Färbungen........................... 62
6
Ergebnisse .......................................................................................................... 64
6.1
6.1.1
P53-Färbung ......................................................................................... 66
6.1.2
Hdm2-Färbung ...................................................................................... 69
6.1.3
P14ARF-Färbung ..................................................................................... 71
6.1.4
P16INK4a Färbung ................................................................................... 75
6.1.5
P63-Färbung ......................................................................................... 79
6.2
Korrelationen und Mustererkennung ............................................................. 81
6.2.1
P53/P63 ................................................................................................ 81
6.2.2
P63/P53/P14ARF ..................................................................................... 83
6.2.3
Hdm2/P14/P53 ...................................................................................... 93
6.2.4
P14ARF/P16INK4a .................................................................................... 103
6.3
7
Immunhistochemische Auswertung der gefärbten Tumorproben .................. 64
Digitale Pathologie ...................................................................................... 107
Diskussion ......................................................................................................... 112
7.1
P53/P63...................................................................................................... 112
7.2
P63/P53/P14ARF .......................................................................................... 114
7.3
Hdm2/P53/P14ARF....................................................................................... 116
7.4
P14ARF/P16INK4a ........................................................................................... 119
7.5
Digitale Pathologie ...................................................................................... 123
8
Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... 126
9
Tabellenverzeichnis ........................................................................................... 127
10 Abbildungsverzeichnis ....................................................................................... 129
11 Literaturverzeichnis............................................................................................ 132
12 Danksagung ...................................................................................................... 149
Seite | 1
1
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteinexpressionen von
P53, P63, Hdm2, P14ARF und P16INK4a eines Tissue-Mikroarray (TMA) von invasiven
Harnblasenkarzinomen digitalisiert und auf das phänotypische Markerprofil hin
untersucht.
P53, P14ARF und Hdm2 sind zentraler Bestandteil des Regulationsmechanismus, der in
gesunden Zellen zum Zellzyklusarrest führt, in Tumorzellen jedoch oft mutiert ist und
die betroffenen Zellen immortalisieren kann und deren Progression ermöglicht [133,
224, 222]. Hdm2 führt über Ubiquitinierungen zur verstärkten Degradierung von P53
durch
das
zytoplasmatisch
lokalisierte
Proteasom.
In
einer
negativen
Regulationsschleife kann P53 zur verstärkten Expression von Hdm2 führen, und
seinen eigenen Abbau induzieren [177, 60]. P14ARF erhöht P53 indirekt über eine
Blockade von Hdm2. Dazu bindet es an die zentrale Region von Hdm2 und hält es im
Nukleolus [63]. Auch eine direkte Erhöhung der P53-Expression durch P14ARF ist
möglich [150]. Derzeit wird ein Mechanismus postuliert, bei dem die Bindung von P53mRNA an Hdm2 zu einer verstärkten Expression von P53 als Antwort auf DNASchäden führt [63]. Die Gruppe von Karni-Schmidt et al. [114] hat herausgefunden,
dass ΔNP63-positive Harnblasenkarzinome eine besonders schlechte Prognose
aufweisen. Außerdem konnten die Ergebnisse von Choi et al. [34] der epithelialenmesenschymalen
Transition
eine
bedeutende
Rolle
in
der
Entstehung
des
Harnblasenkarzinoms zuschreiben.
Häufig auftretende Mutationen im invasiven Blasenkarzinom sind Veränderungen des
INK4a/ARF-Genlokus, der für die Proteine P14ARF und P16INK4a kodiert [136]. Die
vorliegende Arbeit beschäftigt sich daher auch mit der Frage des Zusammenhangs der
Regulation der beiden Proteine.
Die rasanten Entwicklungen neuer technischer Apparate zur Digitalisierung und
Verbreitung eingescannter histologischer Präparate haben starken Einfluss auf die
Integration der Telemedizin in die Routine pathologischer Begutachtungen. So kann in
Ländern mit großer geographischer Fläche oder nicht ausreichendem Ärztebestand die
Patientenversorgung deutlich verbessert werden, wie die positiven Ergebnisse aus
Kanada und Ägypten belegen [7, 8, 243]. Ob diese Verfahren auch geeignet sind, die
in der experimentellen Forschung etablierten Aufbereitungs- und Nachweistechniken
im Rahmen der Untersuchung von Markerprofilen an Tumorproben abzubilden, war
weiterer Gegenstand der vorliegenden Arbeit.
1. Zusammenfassung
Seite | 2
Methoden: Ein aus einem Projekt des International Bladder Cancer Network und dem
SPORE-Programm am MD Anderson Cancer Center (Houston Texas, USA)
zusammengestellter, internationaler TMA, auf dem über 500 Tumorproben invasiver
Harnblasenkarzinome zusammengestellt sind [244], wurde auf die Expression der
oben genannten Proteine hin untersucht. Dazu wurde die Schnittpräparate nach
standardisierten Protokollen immunhistochemisch gefärbt, digitalisiert und ausgewertet.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Ergebnisse aus der vorliegenden Dissertation
spiegeln den derzeitigen Stand der Erforschung von Markerprofilen im invasiven
Harnblasenkarzinom wieder und belegen die hohe Konkordanz der Resultate der sich
durch den Einsatz von TMAs erreichen lässt. Im Einzelnen lassen sich diese wie folgt
zusammenfassen:
•
Der Phänotyp Hdm2 Z+/K+ kann in Tumorzellen gefunden werden, wobei die
zytoplasmatische Hdm2-Expression als nicht signifikant betrachtet werden kann
und sich auffällig inkongruent zu nukleären Hdm2-Färbungen verhält.
•
Eine Veränderung der Expressionsmuster von P53 und P14ARF in Hdm2-positiven
und Hdm2-negativen Zellen, ist nur in Tumorzellen zu beobachten, in denen alle
drei Proteine simultan gefärbt werden können.
•
In Zellen, in denen P14ARF negativ ist während die Hdm2-Expression erhalten ist, ist
eine Abnahme der P53-Proteinexpression im Zellkern nachzuweisen.
•
P63-negative Zellen weisen kein signifikantes Expressionsmuster von P53 und
P14ARF auf, P63-positive Schnittpräparate hingegen schon.
•
P16INK4a ist in invasiven Tumoren häufiger negativ als P14ARF (42,4% zu 16,9%).
•
Isolierte P16INK4a Mutationen treten häufiger auf als isolierte P14ARF Mutationen.
Ebenso belegen die Ergebnisse, dass sich die Telemedizin durch die Digitalisierung
der immunhistochemischen Färbungen der einzelnen TMA-Schnitte ebenso für den
Einsatz in der experimentellen Forschung wie in der Routine als geeignet erweist.
Somit könnten zukünftig auch in größeren Konsortien die Ergebnisse nicht nur von
verschiedenen Untersuchern, vereinfacht Kosten- und Zeitsparend interdisziplinär
bearbeitet werden, sondern auch mit erhöhter Transparenz validiert werden.
1. Zusammenfassung
Seite | 3
Abstract:
Background and objectives: In this thesis the protein expression profiles of P53, P63,
Hdm2, P14ARF and P16INK4a on a tissue microarray (TMA) from invasive bladder cancer
were digitalized and their phenotypic expression-pattern was investigated.
P53, P14ARF and Hdm2 are part of the regulatory mechanism which plays a vital role in
cell cycle arrest in healthy cells. However, mutation often occurs in tumour cells leading
to immortalization and progression [133, 224, 222].
Hdm2 causes degradation of P53 by ubiquitination in proteasoms found in the
cytoplasm. P53 leads to increased Hdm2 expression through a negative feedback loop
and thereby induces its own breakdown [177, 60]. P14ARF can increase P53 indirectly
by blocking Hdm2 but it can also directly increase P53-levels by enhancing P53expression [150]. Hdm2 is kept in the nucleolus in a P14ARF dependent manner after
P14ARF binding to its central region [63]. Current research suggests that DNA-damages
results in P53-mRNA binding to Hdm2 and thereby enhancing P53-levels [63]. KarniSchmidt et al. [114] discovered that ΔNP63 positive bladder carcinomas hold an
especially poor prognosis. Additionally, Choi et al. [34] were able to demonstrate the
important role of epithelial-mesenchymal transition in the development of invasive
bladder cancer. Common alterations seen in invasive bladder carcinomas are
mutations of the INK4a/ARF gene locus, which codes for P14ARF and P16INK4a [136].
Thus, the present thesis implemented discussions on the correlation of the regulation
of these two proteins.
The fast development of new technical devices to digitalize and share scanned
histologic slides had a strong impact of the integration of telemedicine in routine use as
a tool for histopathologic evaluation. With that patient care could be improved in
countries covering an extensive surface and countries suffering from a shortage of
medical personnel as positive results in Canada and Egypt are demonstrating [7, 8,
243]. To investigate, if these measures are also suitable to be implemented in addition
to the established techniques for the preparation and analyses as part of the
investigation of marker profiles of tumour samples, was an additional part of the
provided work.
Methods: From a joint project of the International Bladder Cancer Network and the
SPORE program at the MD Anderson Cancer Centre (Houston, Texas, USA) resulted
an international TMA consisting of more than 500 tumour samples from invasive
bladder cancer cases [244], which was used to investigate the expression of the above
1. Zusammenfassung
Seite | 4
mentioned proteins. Therefore the slides were stained using a standard protocol for the
immunohistochemistry and subsequently digitalized and analyzed.
Results and conclusion: The results of the provided work mirror the current status of
the investigation of marker profiles in invasive bladder cancer and demonstrate with the
high concordance of the results the TMAs can be used in this context. In detail, the
following results were obtained:
•
The phenotype Hdm2 Z+/K+ can be found in tumour cells with the cytoplasmatic
staining not being significant. It acts noticeably incongruently to nuclear staining of
Hdm2.
•
A difference in the profile of the P53 and P14ARF expression in Hdm2 positive and
negative cells can only be seen in cells which are positive for all of the three
proteins.
•
Reduced P14ARF-expression with preserved Hdm2, comes along with a decrease of
P53-protein expression in the nucleus.
•
There is no significant profile of the P53 and P14ARF expression in P63 negative
cells. Whereas it is seen in P63 positive cells.
•
P16INK4a is found to be negative more often in invasive tumors than P14ARF (42.4%
compared to 16.9%).
•
Isolated P16INK4a mutations appear more frequently than an isolated loss of P14ARFprotein expression.
In
addition,
the
results
prove
that
telemedicine
through
scanning
of
the
immunohistochemically stained TMA-slides may be as suitable for the experimental
investigation as for routine use. Thus, in the future larger consortia could not only share
their results more time and cost effective, but also provide a higher transparency for
their validation.
1. Zusammenfassung
Seite | 5
2
Einleitung
2.1
2.1.1
Das Harnblasenkarzinom
Epidemiologie und Ätiologie
Das Harnblasenkarzinom zählt zu den häufigsten malignen Tumorerkrankungen
weltweit. Die Inzidenz variiert stark und beträgt derzeit 16,5 pro 100.000 Personen für
Männer und 3,1 pro 100.000 für Frauen, mit den höchsten Erkrankungsraten in hoch
entwickelten Ländern [53]. Männer sind mehr als doppelt so häufig betroffen wie
Frauen, wobei das mittlere Erkrankungsalter bei Männern 71 Jahre, bei Frauen 74
Jahre beträgt. Allein in Deutschland erkranken jährlich über 29.000 Menschen an
Harnblasenkrebs [13]. Unter den Krebserkrankungen der ableitenden Harnwege ist das
Harnblasenkarzinom die häufigste Tumorform, was durch die Verteilung der
urothelialen Oberfläche erklärt wird [207]. Wie in Abbildung 2-1 gut zu erkennen ist
befindet sich 93% des Urothels in der Harnblase.
Oberfläche:
Häufigkeit:
4%
4,6%
3%
2,9%
93%
92,5%
Abbildung 2-1: Häufigkeit der Urothelkarzinome in Korrelation zur urothelialen Oberfläche [207]
1895 haben Rehn et al. zum ersten Mal einen Zusammenhang zwischen bestimmten
Chemikalien und dem Auftreten von Harnblasenkarzinomen beschrieben [194].
Seitdem sind weitere Faktoren identifiziert worden, die mit einem erhöhten
Karzinomrisiko einhergehen [207].
Das Harnblasenkarzinom zählt zu den anerkannten Berufserkrankungen und es konnte
bewiesen
werden,
dass
aromatische
Amine
(2-Naphtylamin,
Benzidin,
4-
2. Einleitung
Seite | 6
Aminobiphenyl,
Dichlorbenzidin,
Orthodianisidin,
Phenacetin,
Chlornaphazin,
Cyclophosphamid, 44-Methylen-2-chloranilin, Auramin, Magenta und polyzyklische
aromatische Kohlenwasserstoffe), die vor allem als Intermediärprodukte oder
Verunreinigungen in der Industrie auftreten, hierbei kanzerogen wirken [249, 207].
So werden 25% der Harnblasenkarzinome durch beruflich bedingten Kontakt mit
karzinogenen Substanzen hervorgerufen [108, 210, 271, 207]. Da zwischen Exposition
und Karzinomentstehung 10-40 Jahre vergehen können, sind auch heute noch nicht
alle Karzinogene bekannt und einige Berufsgruppen weiterhin gefährdet. Dazu zählen
Angestellte
der
Farb-,
Kohle-,
Aluminium-,
Textil-,
Strahlen-,
Druck-
und
Gummiindustrie, Kammerjäger, Laboratoriumsangestellte, Kimonomaler und Friseure
[207]. Auch eine medikamentöse Therapie mit Chlornaphazin, Phenacetin, und
Cyclophosphamid kann zur Entstehung eines Harnblasenkarzinoms beitragen, wobei
diese Substanzen nur noch eine untergeordnete Rolle im Rahmen der systemischen
Therapie spielen [185, 51, 155]. Weitere Faktoren wie chronische Entzündungen der
ableitenden
Harnwege
(Dauerkatheter,
Bilharziose),
eine
Balkannephropathie,
Strahlentherapie sowie ein Steinleiden seien der Vollständigkeit halber als Beispiele
erwähnt [174, 262, 118, 207]. Nikotin steht weiterhin an erster Stelle der karzinogenen
Noxen. Bei Männern werden 50-60% und bei Frauen 25% der Harnblasentumore auf
das Zigarettenrauchen zurückgeführt. Das relative Erkrankungsrisiko beträgt im
Vergleich zu einem Nichtraucher zwischen 2:1 und 6:1 [207]. Für Kaffee, künstliche
Süßstoffe und Bier, das nach deutschem Reinheitsgebot gebraut wurde, konnte bisher
kein signifikant erhöhtes Karzinomrisiko festgestellt werden [207]. Die Bedeutung von
Arsen, Chlor und Nitrat im Trinkwasser wird derzeit noch untersucht [260, 178, 231,
112,
24,
207].
Neben
Umweltfaktoren
spielt
eine
genetische
Disposition
möglicherweise ebenfalls als Risikofaktor eine Rolle [229].
2.1.2
Klassifikation des Harnblasenkarzinoms
Das Harnblasenkarzinom entwickelt sich zu etwa 95% aus dem Urothel, wobei generell
zwischen einem papillären und einem soliden Tumorwachstum unterschieden wird
[191, 198, 207]. Einen geringen Anteil von 3-6% machen in den westlichen
Industrienationen
Plattenepithelkarzinome
aus
[190,
217,
109,
184].
Das
Adenokarzinom, welches aus Resten des Urachus im Bereich des Blasendaches oder
aus periurethralen und periprostatischen Drüsen entsteht, macht 0,2-2% aller
Blasentumoren aus [105, 5, 207].
2. Einleitung
Seite | 7
Auf der Grundlage der Vereinbarungen der „Union International Contre le Cancer“
(UICC) wird das Stadium der Karzinome anhand von Kriterien bewertet (TNMKlassifikation) [89].
1. T-Stadium: Größe und Ausdehnung des Primärtumors
2. N-Stadium: regionäre Lymphknotenbeteiligung
3. M-Stadium: Fernmetastasen
Eine Bewertung des T-Stadiums wird durch Hinzufügen der Ziffern 1-4 vorgenommen.
2002 wurde eine neue Klassifikation zur Einteilung von Harnblasenkarzinomen von der
UICC erstellt. Diese Einteilung ist zum besseren Verständnis im folgenden Teil
tabellarisch aufgeführt:
T-Stadium
Größe und Ausdehnung des Primärtumors
Tx: Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0: kein Anhalt für Primärtumor
Ta: nicht invasiver papillärer Tumor
Tis: Carcinoma in Situ
T1: Tumor infiltriert subepitheliales Bindegewebe
T2: Tumor infiltriert Harnblasenmuskulatur
T2a: Tumor infiltriert oberflächliche Muskulatur
T2b: Tumor infiltriert tiefe Muskulatur (äußere Hälfte)
T3: perivesikuläre Tumorinfiltration
T3a: mikroskopisch
T3b: makroskopisch (extravesikale Masse)
T4: Infiltration von Nachbarorganen
T4a: Tumor infiltriert Prostata oder Uterus oder Vagina
T4b: Tumor infiltriert Beckenwand oder Bauchwand
Abbildung 2-2: T-Stadium Urothelkarzinom
Auch der Befall von Lymphknoten wird in der UICC-Klassifikation berücksichtigt, wobei
man unter regionären Lymphknoten die iliakalen und pelvinen Lymphknoten unter der
Bifurkation der Arteria iliaca communis versteht.
2. Einleitung
Seite | 8
N-Regionäre Lymphknoten
Nx: Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0: kein Anhalt für regionäre Lymphknoten
N1: Metastase in solitärem Lymphknoten <2 cm in größter Ausdehnung
N2: Metastase in solitärem Lymphknoten >2 cm, aber <5 cm in größter
Ausdehnung oder multiple Lymphknoten <5 cm
N3: Metastasen in Lymphknoten >5 cm in größter Ausdehnung
Abbildung 2-3: N-Stadien Urothelkarzinom
Die Fernmetastasen des Urothelkarzinoms finden sich vor allem in Lunge, Leber und
Knochen.
M-Fernmetastasen
Mx: Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
M0: keine Fernmetastasen
M1: Fernmetastasen
Abbildung 2-4: M-Stadien Urothelkarzinom
Die histologische Einteilung des Malignitätsgrades erfolgt auf Grundlage der
Klassifikation der WHO (world health organization). Da das Blasenkarzinom hinsichtlich
Biologie und Progression in zwei unterschiedlichen Formen auftreten kann, versucht
die WHO-Klassifikation von 2004 der Trennung Rechnung zu tragen. So werden
genetisch stabile Tumoren zu den „low-grade“- und genetisch instabile Tumoren zu
den „high-grade“-Läsionen gezählt.
Papillären Tumore werden in drei Kategorien aufgeteilt (siehe Abbildung 2-5): a)
hochdifferenzierte papilläre Tumoren als „papilläre urotheliale Neoplasie mit niedrig
malignem Potenzial“ (PUNLMP) b) „nichtinvasive low-grade-Karzinome“ (NILGC), bei
einer
Störung
der
Architektur
oder
Schichtung
und
c)
bei
ausgeprägten
Schichtungsstörungen die Gruppe der „nichtinvasiven high-grade-Tumore“ (NIHGC).
Sobald ein Areal eine Kernpolymorphie zeigt, handelt es sich bei diesen Tumoren per
definitionem um ein „Carcinoma in situ“ (CIS).
2. Einleitung
normal
Seite | 9
Normales
Urothel
genetisch stabil
Hyperplasie
PUNLMP
Stabil
nicht invasiv
NILGC
Dysplasie
NICGC
NIHGC
CIS
invasiv
pT1
genetisch instabil
Instabil
pT2 -4
Abbildung 2-5: Histopathologisches Grading (WHO-Klassifikation) [207]
Über drei Viertel der Karzinome werden zu einem Zeitpunkt diagnostiziert, an dem die
Veränderung noch oberflächlich auf die Mukosa oder Submukosa beschränkt ist. Eine
große
Gruppe
von
Harnblasenkarzinompatienten
hat
einen
jahrzehntelangen
Krankheitsverlauf, mit immer wieder nur oberflächlichen Läsionen. Leider lässt sich aus
dem histomorphologischen Aspekt der oberflächlichen Läsion allein nicht genau
vorhersagen, ob ein Patient einen invasiven Tumor entwickeln wird und damit eine viel
schlechtere Prognose hat. Die Fünf-Jahresüberlebensrate fällt von 88% bei einem
lokalen Befund bis auf 5% bei fortgeschrittener Metastasierung [228].
Aus diesem Grunde wäre es wünschenswert Informationen über die Biologie des
Tumors zu erfassen, die einen zusätzlichen prognostischen Hinweis liefern können.
2. Einleitung
Seite | 10
Damit wäre es zukünftig in vielen Fällen möglich rechtzeitig mit einer adäquaten
Therapie der Biologie des Tumors Rechnung zu tragen.
Die Einteilung der Tumoren in Low-grade und High-grade ist hauptsächlich an die
histologische Morphologie gebunden, jedoch gewinnen molekulargenetische Analysen
immer mehr an Bedeutung [207]. Vor allem die Rolle der am Zellzyklus beteiligten
Gene und Genprodukte steht hierbei im Mittelpunkt.
2.2
Zellzyklus und Zellzykluskontrolle
Die Forschung an den Regulationsmechanismen des Zellzyklus hat sich nicht zuletzt
deshalb zu einem bedeutenden Zweig der Zellbiologie entwickelt, da sowohl eine
fehlerhafte Regulation als auch deren kompletter Ausfall häufig zur Krebsentstehung
führen. Doch erst seit den bahnbrechenden Erkenntnissen über die Regulatorproteine
des Zellzyklus konnte die Entartung von Zellen besser verstanden werden. 2001
erhielten Leland H. Hartwell, Sir Paul M. Nurse und R. Timothy Hunt den Nobelpreis für
Medizin für die Entdeckung dieser Proteine und deren Aufgaben. Besonders die
Krebsforschung profitiert von diesem Wissen und kann neue Wege zu besseren
Therapien beschreiten.
Wesentlicher Bestandteil des Zellzyklus und zentrales Merkmal der Vermehrung und
Erneuerung von Zellen ist die Zellteilung. Diese umfasst die Entwicklung einer Zelle
vom Zeitpunkt ihrer Entstehung bis zu ihrer Teilung in zwei Folgezellen, wobei die
Aufteilung der Erbsubstanz von entscheidender Bedeutung ist. Während die Meiose
der Keimzellen einen Zellpool mit unterschiedlichem genetischen Material für die
Fortpflanzung gewährleistet, ist die Mitose für das Entstehen von Tochterzellen mit
identischem Erbgut essentiell, um Wachstum und Zellerneuerung zu garantieren.
Der Zellzyklus ist in die so genannte “M-Phase” (Mitosephase) und die Interphase
geteilt. Die Mitosephase beinhaltet die eigentliche Mitose (Kernteilung) und die sich
anschließende Zytokinese (Zytoplasmateilung).
Während dieses Prozesses löst sich in den meisten eukaryotischen Zellen die
Kernmembran auf und es erfolgt die Verteilung der replizierten Chromosomen. Die
Zellkerne der Tochterzellen entstehen durch Neubildung der Kernmembranen um die
getrennten Chromosomensätze. Die Mitose kann in fünf Stadien unterteilt werden
(Prophase, Prometaphase, Metaphase, Anaphase, Telophase). An deren Ende
entstehen zwei identische Zellkerne. Doch erst bei der anschließenden Zytokinese
werden die Tochterzellen in eigenständige Zellen getrennt.
2. Einleitung
Seite | 11
Während der Interphase wächst die Zelle und die Chromosomen werden, als
Vorbereitung auf die nachfolgende Zellteilung, verdoppelt. Auch die Interphase kann
noch
weiter
untergliedert
werden:
G1-Phase
(1.
Zwischenphase),
S-Phase
(Synthesephase) und G2-Phase (2. Zwischenphase). Während dieser Phasen werden
neue Proteine und zytoplasmatische Organellen erzeugt und es kommt zu einer
Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums. Die chromosomale DNA wird
allerdings nur während der S-Phase repliziert. Die Länge des Zellzyklus und seiner
verschiedenen Phasen variiert von Zellart zu Zellart, wobei die Länge der G1-Phase am
stärksten betroffen ist [21].
Um Wachstum, Entwicklung und das Überleben zu sichern muss der Zeitpunkt und die
Geschwindigkeit der Zellteilungen genau kontrolliert werden. Die Erweiterung der
Kenntnisse über die zugrunde liegenden Mechanismen hilft zu verstehen wie
Krebszellen dieser Kontrolle entgehen können. Der Zellzyklus kann an bestimmten
Kontrollpunkten durch interne und externe Signale reguliert werden, wobei die
Hauptkontrollpunkte in der G1-, der G2-, und der M-Phase liegen. Die Bedeutung der
Kontrollpunkte unterscheidet sich je nach Zelltyp [21]. Eine hochkonservierte Art den
Zellzyklus in Bewegung zu halten stellen Proteinkinasen und Cykline dar.
Proteinkinasen phosphorilieren andere Proteine und können sie dadurch aktivieren
oder inaktivieren. Die an der Zellregulation beteiligten Proteinkinasen liegen dem
gesamten Zellzyklus in gleicher Menge vor, müssen aber um aktiv zu werden an
Cykline binden. Sie werden deswegen als Cyklin-abhängigen Kinasen (CDK)
bezeichnet. Obwohl es eine große Anzahl an CDKs und Cyklinen gibt, sind nur wenige
an der Zellzyklusregulation beteiligt. Dazu zählen: CDK1, -2, -4, -6 sowie Cykline der
Klassen A, B, D und E. Jede Cyklin-abhängige-Kinase hat einen spezifischen
Cyklinpartner und ist zu einer bestimmten Zeit des Zellzyklus aktiv. Damit die Zelle die
G1-Phase durchlaufen kann, muss es zu einer Komplexbildung von CDK4 und CDK6
mit Cyklin D gekommen sein. Für den Eintritt in die S-Phase sind CDK2 und Cyklin E
verantwortlich, während der Komplex von CDK2 mit Cyklin A für das Ende der S-Phase
und den Eintritt in die G2-Phase steht. Für das Durchlaufen der M-Phase ist CDK1
verantwortlich [75]. In Abbildung 2-6 ist dieser Zusammenhang graphisch dargestellt.
Die Synthese und Degradation von Cyklinen findet in verschiedenen Phasen des
Zellzyklus statt und reguliert dadurch die Aktivität der CDKs.
Um einen Zellzyklusarrest zu induzieren muss die Aktivität der CDKs reduziert werden,
erst dann können Zelldefekte repariert und eine Übertragung auf die Tochterzellen
vermieden werden. Dazu werden CDK Inhibitor Proteine benötigt, die in der Lage sind,
CDKs zu binden und so zu inaktivieren. Im Rahmen der Erforschung der
2. Einleitung
Seite | 12
Tumorigenese sind besonders die Inhibitoren von CDK4 (INK4) aufgefallen. Zu dieser
Familie gehören INK4a, INK4b, INK4c und INK4d. Die Inhibitoren der CDKs vermeiden
einen zu frühen Eintritt in die S-Phase des Zellzyklus und ermöglichen eine
erfolgreiche DNA-Reparatur [75]. Doch auch andere Proteine wie P53, P16INK4a,
P14ARF, Hdm2 und P63 nehmen Einfluss auf den Zellzyklus.
Cyclin D
G2-Phase
M- Phase
CDK4, 6
G1-Phase
G2Phase
24 h
G2Phase
G2-Phase
G0Phase
G0-Phase
Cyclin A
SPhase
S-Phase
CDK2
Cyclin E
CDK2
Abbildung 2-6: Cyklin-abhängige Zellzykluskontrolle
2. Einleitung
Seite | 13
2.3
2.3.1
Tumorsuppressorgene – Onkogene
Das p53-Gen
Da sich Mutationen im p53-Gen oder Alterationen im Regulationszyklus von P53 in
50% aller malignen Entartungen des Menschen finden lassen, werde ich die
Bedeutung des Genes für die Fragestellung meiner Arbeit untersuchen.
2.3.1.1 Entdeckung
Beschrieben wurde das P53-Protein erstmalig im Rahmen von Untersuchungen an,
durch Simian-Virus 40 (SV40), transformierten Zellen. Diese Zellen zeigten die
Kopräzipitation eines Proteins von 53 kD Molekulargewicht zusammen mit dem großen
T-Antigen [68, 128, 134, 27]. Lane und Drawford (1979) konnten zeigen, dass die
beiden Proteine in vivo assoziiert waren und das 53 kD schwere Protein offenbar durch
ein zelluläres Gen kodiert wird. Linzer und Levine fanden heraus, dass nicht nur in
einer großen Anzahl verschiedener muriner SV40-transformierter Zellen eine
Überexpression des Proteins zu finden war, sondern auch in nicht-infizierten
embryonalen Karzinomzellen. Demnach verändert eine SV40-Infektion oder eine
SV40-Transformation von Mäusezellen die Synthese oder Stabilität eines zellulären
53-kD-Proteins [68, 145, 128].
De Leo et al. (1979) wiesen nach, dass die humorale Antwort auf, durch
Methylcholanthren induzierte Tumorzelllinien (MethA), über das P53-Protein vermittelt
wurde. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass durch verschiedene induzierte
Tumore eine vergleichbare Immunantwort hervorgerufen werden konnte, die spezifisch
für P53 war [68, 128, 156, 204]. Crawford et al. beschrieben 1982 erstmalig das
Vorkommen von Antikörpern gegen das humane P53-Protein in 9% der Seren von
Patientinnen mit einem Mammakarzinom.
Widersprüchliche Ergebnisse über die Funktion von p53 führten zunächst zu
Unklarheiten über die Klassifikation dieses Gens. Mikroinjektionsexperimente an
Swiss3T3-Mäusezellen, Untersuchungen an MethA-Zellen und NIH3T3-Zellen legten
die Vermutung nahe, dass es sich bei wtP53 um einen positiven Regulator der
Zellproliferation handelt. Daher wurde p53 zu den Proto-Onkogenen gezählt [68, 233,
195, 38, 157, 158]. Kotransfektionsexperimente von Rattenfibroblasten mit murinem
p53 und aktiviertem c-Ha-ras Onkogen schienen das onkogene Potential von p53 zu
belegen [68, 107, 181, 45].
2. Einleitung
Seite | 14
Ein
dritter
experimenteller
Ansatz
zeigte,
dass
murines
P53
normale
Rattenchondrozyten immortalisieren konnte und die Zellen für eine Transformation
durch ras sensibilisierte [68, 205, 107, 106].
Vor allem die von Finlay et al. 1988 durchgeführten Experimente an F9-Zellen deckten
Widersprüche auf. Das führte letztlich zu einer genaueren Untersuchung der murinen
cDNA-Klone, die in den genannten Experimenten verwendet worden waren. Diese
Ergebnisse ergaben, dass in allen Experimenten zuvor cDNA-Klone eingesetzt worden
waren,
die
p53-Mutationen
enthielten
[92].
Eine
weitere
Serie
von
Kotransfektionsexperimenten zeigte, dass wtP53 das Transformationspotential von
mutiertem P53, E1A oder myc zusammen mit aktiviertem Ha-ras-Gen herab setzen
kann [55, 44]. Diese Arbeiten führten schließlich zur Klassifikation von p53 als einem
Tumorsuppressor-Gen.
2.3.1.2 Struktur
Das p53-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 17 (17p13.1) und
besteht aus 11 Exons, deren 10 kodierende Exons (Exon 2-11) für ein Kernprotein von
54 kD kodieren. Die Exone 2, 4, 5, 7 und 8 stellen in der Evolution hoch konservierte
Domänen dar, in denen sich die meisten Mutationen des p53-Gens finden lassen. Das
unterstreicht die funktionelle Bedeutung dieser Regionen [68, 232, 93].
Das P53-Protein besteht aus 393 Aminosäuren und kann strukturell und funktionell in
sechs Domänen unterteilt werden [171] (Vergleiche Abbildung 2-7).
N
AS 1-67
AS 67-98
AS 98-303
AS
303323
AS 323-363
AS 363393
C
Transkriptionsaktivierungs-Domäne
Prolin reiche Region
Zentrale Bindungsdomäne
Region der nukleären Lokalisationssignale
Oligomerisierungsdomäne
Carboxyterminale Bindungsdomäne
Abbildung 2-7: Proteinstruktur von P53
2. Einleitung
Seite | 15
I. Transkriptionsaktivierungs-Domäne (TAD), Hdm2-Bindungsstelle (AS 1-67)
Diese Domäne kann in zwei Unterdomänen geteilt werden. TAD I (AS 1-40) und TAD II
(AS 41-67). Mit Hilfe dieser Domänen wird die Transkription von P53-Zielgenen
aktiviert [68] und durch das Binden von mehreren Zielmolekülen auch moduliert [171].
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Phosphorylierungen in der Hdm2Bindungsdomäne etwa durch ATM/ATR (Ataxia Teleangiectasia Mutated and Rad3
associated), DNA-aktivierte Proteinkinasen oder Chk1/Chk2 (Checkpointkinase 1 and
2), die Bindung zwischen Hdm2 und dem P53-Protein schwächen. Dies führt zu einer
Stabilisierung des P53-Proteins als Antwort auf Zellstress [251, 186].
Außerdem befindet sich in der Hdm2-Bindungsdomäne ein nukleäres Export Signal
(NES), an das CMR1, das nukleäre Exportprotein, bindet und P53 durch die
Kernmembran ins Zytoplasma schleust [17].
Durch die, von Zellstress ausgelösten Phosphorylierungen von Serinresten, wird das
NES blockiert und P53 bleibt im Zellkern. So können durch P53 adäquate, nukleäre
Reaktionen auf Zellstress ausgelöst werden. Die Phosphorylierung der Hdm2Bindungsdomäne blockiert auf der einen Seite die am N-Terminus liegende nukleäre
Export Sequenz und auf der anderen Seite wird die Bindung zwischen Hdm2 und P53
geschwächt.
Das
wiederum
verhindert
die
Ubiquitinierung
der
Tetramerisierungsdomäne und die dort liegende NES bleibt auch unzugänglich [251].
Das bedeutet, dass bei Zellstress P53 im Zellkern lokalisiert bleibt und dort als
Transkriptionsfaktor tätig werden kann. Der P53-Import ist negativ reguliert durch
Ubiquitinierungen. Dieses Szenario erklärt die Akkumulation von ubiquitiniertem P53 im
Zytoplasma und die niedrigen Spiegel vom P53 im Zellkern von ungestressten Zellen.
Eine Deletion dieser Domäne führt zu einer größeren Stabilität des Komplexes
zwischen P53 und sequenzspezifischer DNA [171].
II. Prolin-reiche Region (AS 67-98)
Die Prolin-reiche Domäne spielt in der Medikamenten induzierten, P53-vermittelten
Apoptose eine Rolle und beeinflusst die Fähigkeit der zentralen Bindungsdomäne DNA
zu binden [221]. Wahrscheinlich gewährt diese Region auch einen gewissen Schutz
vor der Hdm2-abhängigen Degradation von P53, da P53 ohne diese Region sehr
anfällig für diese wäre [17].
2. Einleitung
Seite | 16
III. Zentrale Bindungsdomäne (AS 98-303)
Dieser Bereich ist unter anderem für die Bindung an DNA verantwortlich und ist hoch
konserviert zwischen den verschiedenen Spezies. Die Region nimmt im Raum eine
antiparallele „β-Sandwich“-Struktur ein, die zwei Schleifen koordiniert, um Kontakt mit
der sequenzspezifischen DNA herzustellen. Diese Schleifen sind durch Zn2+ stabilisiert
und formen ein „loop-sheet-helix“-Motiv. Mutationen in dieser Domäne haben einen
verheerenden Effekt auf die Funktion von P53. Das kann so weit führen, dass P53
seine Fähigkeit als Transkriptionsfaktor zu agieren verliert [171]. Verschiedene
Proteine, wie z.B. ZBP-89, können an diese Domäne binden und so ihren Einfluss auf
die zelluläre Lokalisation von P53 geltend machen [251].
IV. Region der nukleären Lokalisationssignale (AS 303-323)
In
dieser
Region
Lokalisationssignal
(AS
(NLS
305-322)
I).
Der
befindet
P53-Import
sich
in
das
den
wichtigste
Zellkern
nukleäre
erfolgt
durch
Wechselwirkung zwischen Importin α und den Lysinen 319-322. Durch die
Motorproteine Dynein und Mikrotubulin wird P53 durch das Zytoplasma an die
Kernmembran transportiert um mit Hilfe von Importin α in den Zellkern zu gelangen
[17]. Importin α bevorzugt die Bindung an nicht-ubiquitiniertes P53 und fördert so
dessen nukleären Import. Die Lysine 319-322 sind auch Ziel der Ubiquitinierung durch
Hdm2. Diese P53-Ubiquitinierung befindet sich primär in ungestressten Zellen, ist
verschwindent gering in gestressten Zellen und führt zum Abbau von P53 durch das
Proteasom [148]. P53 wird in gestressten Zellen schnell im Zellkern stabilisiert und
erlangt dadurch die Fähigkeit innerhalb kürzester Zeit als Transkriptionsfaktor tätig zu
werden [148].
V. Oligomerisierungsdomäne (AS 323-363)
Sequenzanalysen der DNA-Bindungsstelle durch El-Deiry et al. legen die Vermutung
nahe, dass P53 seine spezifische Bindungsstelle in Form eines Tetramers besetzt.
Dafür spricht auch das überwiegende Vorliegen des P53-Proteins in Lösung als
Tetramer. Durch die Tetramerisierung von P53 wird die nukleäre Export Sequenz
(NES), die strategisch gut in der Teramerisierungsdomäne liegt, verdeckt [148].
Es wird angenommen dass, erst durch die Hdm2-abhängige Ubiquitinierung der
Tetramerisierungsdomäne, die NES zugänglich wird und P53 aus dem Nukleus in das
Zytoplasma transportiert werden kann, um dort vom Proteasom angebaut zu werden
[251].
2. Einleitung
Seite | 17
VI. Carboxyterminale Bindungsdomäne (AS 363-393)
In dieser Domäne befindet sich eine weitere DNA-Bindungsregion durch die P53 die
Fähigkeit bekommt auch an unspezifische DNA zu binden. Dazu zählen „mismatchedDNA“, Doppelstrangbrüche, Einzelstrang-DNA und „Holliday junction structures“. Der
gleiche Abschnitt des C-Terminus hat Einfluss auf die Bindungskapazität der zentralen
Bindungsdomäne und damit auf die Fähigkeit von P53 als Transkriptionsfaktor zu
agieren. Alle posttranslationalen Änderungen dieses Proteinabschnittes führen zu
Stabilitätsveränderungen in der P53-DNA-Komplexbildung. Zum Beispiel kann eine UV
induzierte Phosphorylierung von Serin392 oder eine stressinduzierte C-terminale
Acetylierung durch CBP/p300 oder PCAF die DNA-Bindungsdomäne aktivieren. Diese
Beobachtung hat zu der Hypothese geführt, dass die C-Domäne einen regulatorischen
Einfluss auf die zentrale DNA-Bindungsdömane hat [171].
Weiterhin befinden sich in dieser Domäne zwei nukleäre Lokalisationssignale, NLS II
(AS 366-372) und NLS III (376-381). Diese sind aber weniger aktiv als NLS I [148]. Die
Hypothese, dass es sich bei der Freilegung der DNA-Bindungsdomäne um einen
allosterischen Mechanismus handelt [251, 97] wurde durch die Arbeit von Ayed et al.
2001 in Frage gestellt [251, 9] und auch Okorokov et al. konnten bei ihren
Untersuchungen keine Konformationsänderung der zentralen DNA-Domäne feststellen
[171].
Doch wird die genaue Rolle der Carboxyterminalen Bindungsdomäne weiterhin
kontrovers diskutiert.
2.3.1.3 Zielgene und biochemische Wirkung
P53 ist ein Transkriptionsfaktor und besitzt hunderte DNA-Zielgene im menschlichen
Genom. Die zentrale Bindungsdomäne von P53 interagiert mit einer spezifischen DNASequenz in der Nähe der Promotoren der Zielgene. Diese Erkennungsregionen
bestehen aus zwei decamerischen Halbseitensequenzen 5‘-RRRC(A/T)(T/A)GYYY-3‘
(R=Purin, Y=Pyrimidin), wobei eine Promotorregion mehrere Erkennungsregionen
besitzen kann. Dadurch kommt der DNA-Bindungsdomäne, durch die die Funktionen
von P53 im Rahmen des Zellzyklusgeschehens vermittelt werden, eine zentrale
Bedeutung zu [171].
2. Einleitung
Seite | 18
I. „mouse double minute 2-gene“ (mdm2) und das humane Homolog (hdm2)
Das hdm2-Gen steht unter der Transkriptionskontrolle von P53. Durch Komplexbildung
ist das Hdm2-Protein in der Lage die Transaktivierungsfähigkeit und die Wirkung des
P53-Proteins am G1-S-Phasenkontrollpunkt des Zellzyklus aufzuheben [68, 54, 172,
168]. Die Beeinflussung der Transkription von Mdm2 durch P53 unterliegt einer
negativen Autoregulationsschleife [235].
II. „growth arrest and DNA damage-inducible 45 gene“ (GADD 45)
Ein Gen, dessen Induktion von der Gegenwart des wtP53 abhängig ist und das in die
Kontrolle des G1-S-Phasenübergangs im Zellzyklus involviert ist.
III. „Wild typeP53 activated fragment 1-gene“ (WAF1/CDK interacting protein 1gene (CIP1))
Es ist bereits gut untersucht, dass p21 ein Zielgen von P53 ist. Im Promotorbereich von
p21 befinden sich zwei konservierte Bindestellen für P53, wodurch die Expression von
P21 hochreguliert wird [11]. Obwohl P21 eine zentrale Rolle in der Zellregulation spielt,
sind Mutationen im p21-Gen selten. Am häufigsten wird P21 auf Transkriptionsebene
beeinflusst. Wird wegen DNA-Schäden der Zellzyklus P21-abhängig unterbrochen und
in dieser Zeit die DNA durch Reparaturmechanismen verbessert, kann dies die Zelle
vor P53-ausgelöster Apoptose schützen. P21 fungiert also als Inhibitor der Apoptose,
kann so aber auch zum Überleben mutierter Zellen beitragen [64].
2.3.2
Hdm2
Erstmals wurde das mdm2-Gen in einer spontan transformierten Mauszelllinie
(BALB/c) entdeckt, wo es in Form von 25-30 Kopien gepaarter, akzentrischer
Chromatinkörperchen, sogenannter “double minutes”, vorlag. Dabei wurden drei Gene
identifiziert, von denen dem zweiten, “mdm2” (murine double minute Gen),
transformierende Eigenschaften zugeschrieben werden konnten. Daraufhin wurde
mdm2 zu den Onkogenen gezählt [166, 60].
2.3.2.1 Aufbau von Hdm2
Das menschliche Gen (hdm2) befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 12
(12q14.3-15)
und
codiert
für
eine
Gruppe
von
Kernproteinen
mit
einem
2. Einleitung
Seite | 19
Molekulargewicht von 57 bis 90 kD, die durch alternatives Spleißen entstehen [175].
Das mdm2-Gen codiert für ein 489 Aminosäuren starkes Protein, das 12 Exons
beinhaltet und zwei P53-“response elements“ (RE) [186, 49].
Die Transkription wird über zwei unterschiedliche Promotoren reguliert. Der P1Promotor befindet sich vor dem Exon 1 von hdm2 und agiert unabhängig von P53. Er
ist für die konstitutive Expression der vollständigen hdm2-mRNA verantwortlich. Im
ersten Intron dagegen befindet sich der P53-abhängige P2-Promotor, der neben der
P53-vermittelten Hdm2-Expression auch die bei Zellschäden induzierbare Expression
von alternativ gespleißten mRNA-Produkten induziert [177]. Durch die Transkription
von zwei verschiedenen Promotoren entstehen zwei Hdm2-Proteine: das lange P90Protein und das kurze P76-Protein, wobei das kurze Protein P53 nicht binden kann und
als dominant negativer Inhibitor von P90 agiert. Interessant ist, dass das durch den P2Promotor vermittelte Transkript ein verkürztes 5’-Ende aufweist und im Vergleich zum
P1-Transkript wesentlich effektiver translatiert wird. Obwohl beide Hdm2-Transkripte
den gleichen Leserahmen haben, da das AUG, das für die Initialisierung benötigt wird,
im dritten Exon liegt, sind die unterschiedlichen Promotoren im murinen und im
humanen Genom konserviert, was für die große Bedeutung der unterschiedlichen
Regulation von Hdm2 für die Zelle spricht [177].
Das Phosphoprotein Hdm2 besteht aus mehreren Domänen, die unterschiedliche
Funktionen beinhalten und in verschiedenen Spezies konserviert sind.
N
C
P53
Binderegion
NLS NES
Saure
Region
Zinkfinger
Motiv
Rinfinger
Domäne
mit NoLS
Abbildung 2-8: Proteinstruktur von Hdm2
I. N-terminale Domäne
Die N-terminale Domäne ist maßgeblich für die Interaktion von Hdm2 mit P53 und die
Unterdrückung von dessen Aktivität als Transkriptionsfaktor. Außerdem findet man in
dieser Domäne die “nuclear localization sequence” (NLS) und das “nuclear export
signal” (NES), die Hdm2 die Möglichkeit geben zwischen Nukleus und Zytoplasma zu
pendeln [203].
2. Einleitung
Seite | 20
II. Zentrale Domäne
Eine hoch saure Region mit einer integrierten Bindungsstelle für das ribosomalen
Protein L5 und der assoziierten ribosomalen 5S-RNA [149].
III. Zinkfinger-Motiv
Retinoblastom-Bindungsregion [268]
IV. Carboxyterminale Domäne
Die RING-Fingerdomäne in diesem Bereich kann an RNA binden und ist als E3 Ligase
für die Ubiquitinierung von P53 und damit für dessen Abbau im Proteasom
verantwortlich. P14ARF bindet und inaktiviert Hdm2 in dieser Region [60]. Es existiert die
Hypothese, dass P14
ARF
mit Hilfe des „nucleolar localization signal“ (NoLS), das sich
auch am C-terminalen Ende von Hdm2 befindet, Hdm2 in den Nukleolus befördert.
Dadurch wird P53 vor der Hdm2-abhängigen Degradation bewahrt [242, 147, 254]. Die
Hauptaufgabe von Hdm2 liegt ursächlich darin unter normalen physiologischen
Bedingungen der P53-bedingten Inhibition des Zellzyklus entgegenzuwirken. Um das
zu erreichen muss die Menge an funktionell aktiven P53 auf geringem Niveau gehalten
werden [166]. Unterstützt wird diese Hypothese durch die Beobachtung, dass Mdm2
knock-out-Mäuse sehr früh in der Entwicklung sterben, während sich “double-knockout”-Mäuse für Mdm2 und P53 normal entwickeln [166, 60, 18]. In Abwesenheit von
Mdm2 kommt es offensichtlich zu einer anormalen Aktivierung von P53, die schließlich
zur Ausprägung eines letalen Phänotyps führt. Damit wird Hdm2 der zelluläre
Antagonist von P53 und fungiert als dessen wichtigster Regulator. Seine Aktivität ist in
der Frühentwicklung essenziell [60]. Eine Überexpression von Hdm2 geht mit einer
beschleunigten Tumorentwicklung und Resistenz gegen Chemotherapie einher [246,
18].
2.3.3
INK4a/ARF-Genlokus
Zwei verschiedene Proteine werden von dem INK4a/ARF-Genlokus auf dem humanen
Chromosom 9p21 durch alternative Leserahmen codiert. Das Produkt des α-Transkript,
P16INK4a, besteht aus den Exons 1α, 2 und 3. Es ist ein Tumorsuppressor, der einen
G1-Zellzyklusarrest induziert, indem es die Phosphorylierung von Rb durch Cyklinabhängige Kinasen unterdrückt.
2. Einleitung
Seite | 21
Im Gegensatz dazu aktiviert das Produkt des β-Transkriptes, P14ARF(ARF=alternative
reading frame), bestehend aus den Exons 1β, 2 und 3, eine P53 abhängige Antwort
auf Zellstress durch einen Zellzyklusarrest in der G1 und G2/M-Phase [235].
Zellen mit Mutationen oder Deletionen im INK4a/ARF-Lokus sind hoch gefährdet sich
in Tumorzellen zu verwandeln. Es ist nicht verwunderlich, dass dieser Genort in vielen
humanen Tumoren, wie Melanomen und dem Adenokarzinom des Pankreas, durch
eine Deletion verloren gegangen ist [222, 199].
The CDKN2a/P16 or INK4a/ARF-locus on 9p21
CDKN2a/
P16
exon 1-β
exon 1-α
exon 2
exon 3
p14ARF
Abbildung 2-9: INK4a/ARF-Genstruktur
2.3.3.1 P14ARF
2.3.3.1.1 Entdeckung
Die meisten Informationen über P14ARF hat man von dem Maushomologen P19ARF auf
dem murinen Chromosom 4 gewonnen. Das murine β-Transkript wurde 1995 von
Quelle et al. entdeckt, als sie versuchten die cDNA des Proteins P16INK4a aus der Maus
zu isolieren. Dabei stießen sie auf ein Protein aus 169 Aminosäuren, das keine
Ähnlichkeiten mit den bisher bekannten Proteinen besitzt [235].
Quelle et al. konnten beweisen, dass das neu entdeckte Protein einen Zellzyklusarrest
herbeirufen kann ohne direkt mit den Cyklin-abhängigen Kinasen zu interagieren.
Weiterhin fiel ihnen auf, dass es zu einer Akkumulation von Zellen kam, die DNA der
G1 und G2/M-Phase enthielten, aber Zellen mit DNA der S-Phase fehlten. Außerdem
war der Gehalt an P19ARF in Zellen höher, die eine p53-Mutation oder eine
Überexpression von Mdm2 aufwiesen, was einen Zusammenhang der Proteine
vermuten lässt [235].
2. Einleitung
Seite | 22
Der
Transkriptionsstart
des
humanen
Proteins
wird
im
ersten
ATG
des
Translationsabschnittes vermutet. Das entstehende Protein hat eine Länge von 132
Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 13902 Da und wird daher als P14ARF
bezeichnet. Das murine und das humane Protein sind nur zu 50% identisch, trotzdem
konnte gezeigt werden, dass auch das humane β-Transkript einen Zellzyklusarrest
auslösen kann. Daraufhin wurde p14ARF als Tumorsuppressorgen eingestuft [235].
2.3.3.1.2 Struktur
P14ARF besteht in der vollen Länge aus 132 Aminosäuren, mit einer N-terminalen (AS
1-64) und einer Carboxyterminalen Hälfte (AS 65-132) [67].
I. C-Terminus
Eine Arginin reiche Region des C-Terminus (83GAQLRRPRHSHPTRARRCP101) ist in
den nukleolären Import des Proteins involviert. Mutationen in diesem Bereich
reduzieren die Fähigkeit von P14ARF P53 zu stabilisieren [199, 254]. Mutationen, die zu
einer veränderten Proteinfunktion oder -lokalisation führen, sind mit einer familiären
Prädisposition für Melanome vergesellschaftet. Daraus lässt sich vermuten, dass
Mutationen der C-terminalen Domäne die Fähigkeit von P14ARF beinträchtigen auf
DNA-Schäden zu reagieren und den Weg zur Tumorigenese ebnen [67].
I. N-Terminus:
Eine zweite Arginin-reiche Domäne (1MVRRFLVTLRIRR13), die in diesem Teil des
Proteins zu finden ist wird für die korrekte nukleoläre Lokalisation benötigt. Diese
Domäne ist in Maus, Monodolphins und Mensch hochkonserviert, was für seine
funktionelle Bedeutung spricht [269, 199]. Außerdem ist diese Domäne für die Bindung
zwischen P14ARF und Hdm2 und damit für die zellzyklusinhibitorische Funktion von
ARF
P14
verantwortlich. Die Aminosäuren 12 und 13 sind entscheidend für die nukleoläre
Lokalisation aber nicht für den Zellzyklusarrest [199].
2.3.3.1.3
Zielgene
Eine Übersicht über die Proteininteraktionen von P14ARF neben Hdm2 liefert folgende
Tabelle [67]:
2. Einleitung
Seite | 23
Interaktionen:
Konsequenzen:
Topoisomerase I: DNA-Synthese/Reparatur
Aktivität wird durch P14
E2F, E2F-2, E2F-3: S-Phase Transkriptionsfaktoren
Aktivität wird durch P14
HIF-1 Alpha: Hypoxie induzierter Transkriptionsfaktor
Aktivität wird durch P14
P120: Zinkfinger Transkiptionsrepressor
Bildet einen vorübergehenden Komplex mit P53
ARF
und P14
und verstärkt den Zellzyklusarrest
HR6/Rad-6: Postreplikationsreparatur
Ubiquitin-konjugierende Enzyme
der
ARF
verstärkt
ARF
blockiert
ARF
blockiert
DNA, Bildet einen vorübergehenden Komplex mit P53
ARF
und P14
MdmX: Hdm 2-Homolog, Blockiert P53, Bindet Hdm2
ARF
Entgegengesetzte Aktivität von P14
TBP-1: HIV Tat-bindendes Protein, regulatorische
ARF
Untereinheit
des
26S
Proteasom, Akkumulation von P14
Transkriptionsregulation
Spinophilin:
regulatorische
Proteinphosphatase I
Untereinheit
der
ARF
Verstärkt die Aktivität von P14
ARF
Pex19p: Farnysyliertes zytosolisches Protein
Interagiert nur mit P19
ARF
humanen P14
CARF „Collaborator of ARF“: Serin-reiches Protein
Verstärkt die Aktivität von P14
B23(NPM): Nukleoläre Ribosomenbiogenese
Stabilisierung von P14
ARF
durch P14
verursacht
EBNA-5: Epstein Barr Virus DNA Replikationsprotein
Entgegengesetzte Aktivität von P14
ARF
P14
: Tumorsuppressor
der Maus nicht mit
ARF
ARF,
Degradation wird
ARF
Bildung von Homooligomeren
ARF
P14
verstärkt
Bindungspartner
Ubc9: SUMO E2 konjugiertes Enzym
ARF
Werner's helicase: mutierte Helicase beim Werner's P14
ist für
Syndrom
verantwortlich
ARF
die
Sumoylation
nukleoläre
die
c-myc
der
Lokalisation
c-myc: Transkriptionsfaktor
P14
inhibiert
Transkription
induzierte
DP1: E2F bindendes Protein
P14
führt zur Auflösung der DP1/E2F1
Interaktion
5.8S Ribosomale RNA
Interaktion reduziert wahrscheinlich die rRNA
Produktion
ARF
ARF
Tabelle2-1: Proteininteraktionen von P14
2.3.4
Funktionen und Wechselwirkungen von P53/Hdm2/P14ARF
2.3.4.1 Funktion von P53
Nach heutiger Erkenntnis besteht die wesentliche Rolle des Tumorsuppressorgens p53
in der Regulation von Kontrollpunkten im Zellzyklus. Diese sind für die Integrität des
Genoms verantwortlich, weshalb P53 auch als „Wächter des Genoms“ bezeichnet wird
[133, 68, 140]. Nach subletaler DNA-Schädigung, z.B. durch UV-Strahlen oder ɣStrahlung, vermag Wildtyp-P53 Protein den Zellzyklus in der G1-Phase zu stoppen [68,
2. Einleitung
Seite | 24
115, 274]. Das wird über eine Induktion der p21/WAF1 Expression, ein G1-Zyklin-CDKInhibitor, vermittelt [68, 43]. Dieser Zellzyklusarrest ermöglicht der Zelle die DNAReparatur [68, 116] und verhindert so die Weitergabe genetischer Fehlinformation an
die Tochtergeneration. Das Wildtyp-p53 Gen ist damit in der Lage, die Auswirkungen
neoplastischer und onkogeninduzierter Transformationen zu verhindern [68, 250, 55,
141, 44]. Doch eine Aktivierung von P53 kann nicht nur zu einem G1-Phase Arrest
führen, sondern auch zu einem G2- und S-Phase Zellzyklusarrest. Die Inaktivierung
von P53 bewirkt einen Verlust des DNA-Kontrollpunktes im Übergang von der G1- in
die S-Phase, verhindert den G2-Arrest und führt zu aneuploiden und polyploiden
Zellen. Der G1-Phase Arrest kann zum einen, wie weiter unten beschrieben, über das
P53 Zielgen p21 erfolgen oder indem P53 direkt die Aktivität des CDK-aktivierenden
Kinase (CAK) Komplex CDK7/CyclinH1/Mat1 inhibiert. Dieser Komplex würde ohne
P53 zu einer Phosphorylierung und Aktivierung von Cyklin A/CDK2 führen. Zusätzlich
besteht die Möglichkeit, dass P53 über PC3 eine verstärkte Phosphorylierung von Rb
hervorruft. PC3 ist ein Zielgen von P53 und kann den Proteinstatus von Cyklin D1 und
so die Aktivität von CDK4 reduzieren [17].
In Abbildung 2-10 ist dieser Zusammenhang graphisch aufgearbeitet.
STRESS
p53
CA
K
PC3
p21
Cyclin D
Cyclin E
Cyclin A
CDK4, 6
CDK2
CDK2
P
E2F
Rb
Rb
G1-Arrest
E2F
S-Phase
Abbildung 2-10: P53-abhängiger G1-Zellzyklusarrest [17]
Der Weg über den P53 zu einem G2-Arrest führt ist noch nicht ganz geklärt, aber seine
Zielgene p21, 14-3-3-θ und GADD45 sind für diese Funktion essentiell. Wie man sich
diese Fähigkeit von P53 erklärt ist in folgender Graphik dargestellt [17].
2. Einleitung
Seite | 25
STRESS
14-3-3σ
p53
P
CDK25C
inaktiv
GADD45
14-3-3σ
Cyclin B
CDK2
Chk1
ATM
p21
CDK25C
aktiv
Cyclin B
CDK2
G2
M
Abbildung 2-11: P53-abhängiger G2-Zellzyklusarrest [17]
Alternativ kann P53-vermittelt, durch Aktivierung der Kaspase-Kaskade auch der
programmierte Zelltod, die Apoptose, herbeigeführt werden [68, 17, 266, 165].
In vitro wird das Tumorzellwachstum durch P53 gehemmt und in Tiermodellen wird die
Tumorbildung verhindert [68, 158, 32, 10]. Diese Effekte werden jedoch nicht durch
mutiertes P53 vermittelt, das selbst onkogenetisches Potential besitzt [121, 10]. Sie
sind an das Vorhandensein eines intakten Wildtyp-Proteins gebunden, wie
Untersuchungen an „knock-out“-Mäusen zeigen [68, 41].
Damit P53 seiner Aufgabe als Transkriptionsfaktor nachkommen kann, geht man
davon aus, dass P53 nach seinem Transport in den Zellkern durch noch unbekannte
Signale „promyelotic leukemia protein-nuclear bodies“ (PML-NB) bildet. Diese
Strukturen enthalten mehrere Proteine wie: PML, Sp100, SUMO-1, P300/CBP und
HMG1 und sind wahrscheinlich in der Transkriptionsregulation involviert. PML3 bindet
an P53, hält es in PML-NBs fest und kann so die Transkriptionsaktivität von P53
erhöhen. Diese Aktivitätssteigerung von P53 ist für eine vollständige Stressantwort von
P53 von wichtiger Bedeutung. In PML-/- Zellen ist die Fähigkeit von P53 auf γStrahlung zu reagieren, seine Transkriptionsfähigkeiten und die DNA-bindende
Kapazität erniedrigt. Onkogenetisches ras führt zu einer Hochregulation von PML und
triggert eine Komplexbildung von P53-PML-p300/CBP im PML-NB. Das führt zu einer
verstärkten Acetylierung von P53 am Lys382 durch p300/CRB. Auf diese Weise könnte
PML P53 aktivieren, indem dessen Koaktivator p300 rekrutiert wird. Nachdem eine
Überexpression von PML zur Apoptosis führt, ist dieses Protein wahrscheinlich von
2. Einleitung
Seite | 26
zentraler Bedeutung bei der P53-vermittelten Stressantwort [17]. (Siehe dazu
Abbildung 2-12).
ARF
Nukleus
Hdm2
Nukleolus
PML-NB
ARF
daxx
p53
SUMO
Hdm2
HMG
Ub
PML
Stress
Ub
p53
p53
NE
S
pRb
Onkogenetische
Signale
PML
p300
Im
po
rtin
-α
CRM
1
Dynein,
Tubulin
?
N
Ub
LS
p53
Ub
Ub
p53
26S
Proteasom
Degradation
Zytoplasma
Abbildung 2-12: Regulation der zellulären Verteilung von P53 [17]
2. Einleitung
Seite | 27
2.3.4.2 Funktion von Hdm2
Hdm2 und P53 sind durch eine autoregulatorische Rückkopplungsschleife miteinander
verbunden, folglich trägt die durch P53-induzierte Hdm2-Expression zu einem
beschleunigten Abbau von P53 bei [177, 60]. (Vergleiche Abbildung 2-13).
Hdm2
P53
Abbildung 2-13: Negative Rückkopplung von P53 und Hdm2
2.3.4.3 Hdm2 vermittelte Inhibition von P53
Hdm2 kann mehrere Wege gehen um P53 in Aktivität, Stabilität und Lokalisation zu
beeinflussen. Hdm2 interagiert mit seiner N-terminalen Domäne mit der α-Helix des Nterminalen Endes von P53 [131], dadurch entsteht ein stabiler Komplex, der in der
Lage ist, die transkriptionelle Funktion von P53 einzuschränken. Betrachtet man das
Ganze im Detail, bildet die N-terminale Domäne von Hdm2 eine tiefe hydrophobe
Tasche (AS 25-109), die sich mit der Alphahelixstruktur der Transaktivierungdomäne
von P53 verbindet und so deren Interaktion mit dem restlichen Transkriptionsapparat
verhindert [197, 166]. Beteiligt sind die Aminosäuren Phe19, Leu22, Trp23 und Leu26
in der Transaktivierungsdomäne von P53 [219]. Dieses Schlüssel-Schloss-Prinzip kann
jedoch nur bei erhaltener Konformität und Hydrophobie funktionieren, so dass kleinste
Veränderungen der Aminosäurenabfolge der beiden Proteine diese Interaktion
schwächen können. Diese Störung der Bindung von Hdm2 und P53 wird physiologisch
beim
Auftreten
von
DNA-Schäden
ausgenutzt,
indem
durch
Phosphorylierungskaskaden verschiedene, an der Interaktion der beiden Proteine
beteiligte, Aminosäuren phosphoriliert werden. Hierbei scheint besonders die Kinasevermittelte Phosphorylierung von Thr18 von Bedeutung zu sein, da diese die α-HelixStruktur von P53 stabilisiert. Aber auch Ser15 und Ser20 von P53 scheinen für die
Hdm2-abhängige Hemmung von P53 wichtig zu sein [209, 119].
2. Einleitung
Seite | 28
Das
durch
onkogenetische
ARF
Tumorsuppressorprotein P14
und
hyperproliferative
Signale
induzierte
führt auch zu einer Inaktivierung von Hdm2. Es hemmt
insbesondere die Eigenschaft von Hdm2, die zur P53 Transaktivierung benötigte
Acetylierung, zu blockieren [209, 119].
Doch nicht nur die direkte Bindung von Hdm2 an P53 kann dessen Aktivität
beeinflussen. Hdm2 kann als E3 Ligase den proteasomalen Abbau von P53 im
Nukleus und im Zytoplasma veranlassen [197, 166]. Es wird vermutet, dass MdmX (ein
Strukturhomolog von Mdm2) durch eine Komplexbildung mit Hdm2, durch die RINGFingerdomänen der beiden Proteine, die Fähigkeit von Hdm2 P53 zu Ubiquitinieren
verstärkt und gleichzeitig den Abbau von Hdm2 verhindert [170]. Meistens liegt Hdm2
in einem Komplex mit P300/CBP vor. Hdm2 ist nur zu einer Monoubiquitinierung fähig.
Zum restlosen Abbau von P53 ist aber dessen Polyubiquitinierung nötig, was mit Hilfe
der E4 Ligaseaktivität von P300/CBP gelingt. Auf diese Weise ist Hdm2 gleichzeitig in
der Lage die P300/CBP-vermittelte Acetylierung und transkriptionale Aktivierung von
P53 bei Bedarf zu inhibieren [166, 209]. Damit P53 im Zytoplasma dem Proteasom
zugänglich gemacht werden kann, muss es die Kernmembran durchbrechen. Der
nukleäre Export wird durch die NES Sequenzen von P53 und die RING-Fingerdomäne
von Hdm2 möglich. Hdm2 muss alle Lysinreste im COOH-Terminal von P53
monoubiquitinieren um dessen NES in der Tetramerisierungsdomäne freizulegen. Erst
dann kann P53 mit dem CRM1 Exportkanal interagieren. Konnte in gestressten Zellen
der DNA-Schaden vollständig repariert werden, muss der P53-Gehalt schnell reduziert
werden, um die Zellfunktion wieder aufnehmen zu können. Zur besseren Kontrolle des
Abbaus von P53 und Hdm2 und um ihm mehr Geschwindigkeit zu geben, werden
zytoplasmatische und nukleäre Proteasomen rekrutiert [197, 166].
2.3.4.3.1 Regulation der Ubiquitinierung und Degradation von P53
Unabhängig welcher Weg genommen wird, um eine Trennung des Komplexes
zwischen Hdm2 und P53 hervorzurufen, er führt immer zu einer Akkumulation von
aktivem P53 in der Zelle. Es sind verschiedene Mechanismen bekannt, um den
inhibitorischen Einfluss von Hdm2 auf P53 zu unterbrechen. Ionisierende Strahlung
aktiviert Stresskinasen, die über eine Phosphorylierung von P53 den P53/Hdm2Komplex schwächen. Dieser Weg führt über die ATM-Kinase und hCHK1- und 2Kinasen zu der Phosphorylierung von Serinresten, was die Affinität zwischen P53 und
Hdm2 reduziert [30, 122, 23].
2. Einleitung
Seite | 29
UV-Strahlen und Hypoxie führen über eine verminderte Transkription von Hdm2 zu
einer Stabilisierung von P53 [261, 3].
UV-Strahlen
blockieren
außerdem
die
Ubiquitinierung
und
begünstigen
die
Sumoylation von Lys386 von P53, was zu dessen verstärkter Tanskriptionsaktivität
führt [202]. Phosphorylierungen spielen bei der Regulation von P53 eine besondere
Rolle. ATM-Kinase kann auf der einen Seite durch eine Phosphorylierung von P53 das
Protein resistenter machen gegen die Hdm2-abhängige Degradation und verstärkt
seine Transkriptionsaktivität. Auf der anderen Seite wird die Affinität von Hdm2 zu P53
durch die ATM-abhängige Phosphorylierung von Hdm2 gemindert [42, 226, 152]. Der
Eintritt von Hdm2 in den Nukleus, um P53 zu ubiquitinieren, ist abhängig von seiner
Phosphorylierung durch die Phosphatidylinositol 3-Kinase (P13K)/AKT Kinasen. AKT
wiederum muss erst durch HER-2/neu, Wachstumsfaktoren oder Ras, aktiviert werden.
Da PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10) die AKTSignalkaskade antagonisiert, beschützt es P53 vor Hdm2-abhängiger Ubiquitinierung
und Degradation. PTEN ist außerdem ein Zielgen von P53 und bildet eine zusätzliche
autoregulatorische Rückkopplungsschleife mit P53 [153, 272].
Es gibt noch weitere Proteine, die die Funktion von Hdm2 beeinflussen können. Die
Phosphorylierung von Tyr394 von Hdm2 durch c-Abl hemmt die Hdm2-Ligaseaktivität,
während die Phosphorylierung von Ser166 und Ser186 durch Akt/PKB seine E3Ligaseaktivität unterstützt. Hdm2 setzt die eigene Ubiquitinierung in Gang wird aber
auch durch andere E3-Ligasen ubiquitiniert. Durch eine Komplexbildung mit Daxx und
Hausp wird Hdm2 deubiquitiniert. In diesem Komplex kommt es zur gegenseitigen
Regulation der Proteine. Daxx stabilisiert Hdm2, wird durch Hausp deubiquitiniert und
durch Hdm2 ubiquitiniert. Dieses Zusammenspiel der Proteine kann eine wichtige Rolle
in der Regulation von P53 spielen [186].
2.3.4.4 Funktion von P14ARF
ARF
P14
interagiert mit einer Vielzahl von anderen Proteinen außerhalb des Hdm2-P53
Regulationsweges, wobei einige dieser Interaktionen indirekt Einfluss auf diesen
Signalweg nehmen. Eine Möglichkeit ist der Wettstreit von Bindungspartnern um die
Bindungsstelle von Hdm2. Ein Beispiel dafür ist B23 (Nucleophosmin, NPM). Dieses
Protein ist im Nukleolus lokalisiert und interagiert mit dem N-Terminus von P14ARF.
P14ARF wird dadurch im Nukleolus stabilisiert und gleichzeitig wird seine Fähigkeit
Hdm2 zu binden vermindert. Studien an Mausfibroblasten, die B23 negativ sind zeigen,
dass in diesen Zellen P14ARF im Nukleoplasma verstreut ist. Diese Studien legen nahe,
2. Einleitung
Seite | 30
dass B23 für die nukleoläre Lokalisation von P14ARF benötigt wird und eine
Schlüsselrolle in der Interaktion zwischen P14
ARF
einnimmt. Da mehrere Studien beweisen, dass P14
und anderen Bindungspartnern
ARF
seine Tumorsuppressoraktivität
außerhalb der Nukleoli zum Einsatz bringt [146], muss der Komplex zwischen P14
und B23 erst aufgehoben werden, bevor P14
ARF
ARF
Hdm2 binden kann. Wie genau dieser
Mechanismus funktioniert ist noch unklar [127].
Eine weitere Interaktion besteht zwischen P14ARF und der nukleolären Topoisomerase
I. Sie reduziert den Torsionsstress der Polynukleotidstränge während der DNA- und
RNA-Synthese. Die exakte Rolle der Komplexbildung der beiden Proteine ist noch
nicht vollständig geklärt, aber man weiß, dass die Topoisomerase I-Aktivität durch
P14ARF P53-unabhängig stimuliert wird. Wichtig ist, dass bei der Komplexbildung die CARF
terminale Hälfte von P14
beteiligt ist, da diese Region für die nukleoläre Lokalisation
von Bedeutung ist, aber unwesentlich ist für die P53-abhängigen Aktivitäten [67, 113].
Es ist zwar bekannt, dass P14ARF im Nukleolus mit verschiedenen Proteinen, wie BP23,
Topoisomerase I und ribosomaler RNA Komplexe bildet, aber deren genauer Einfluss
auf den P53-Signalweg konnte noch nicht dargestellt werden. Durch moderate UVBestrahlung wird der nukleoläre Komplex zwischen P14ARF und B23 gespalten und
ARF
P14
bindet im Nukleoplasma an Hdm2. Dieser Lokalisationswechsel von P14ARF ist
P53-unabhängig, jedoch kann die Zellantwort auf UV-Strahlen nur beim Vorkommen
von Wildtyp P53 ausgelöst werden. 24h nach der Bestrahlung ist der Ausgangszustand
wieder hergestellt und P14ARF befindet sich wieder im Nukleolus. Es wird vermutet,
dass neusynthetisierte ribosomale RNA ein Signal für den Wiedereintritt von P14
ARF
in
den Nukleolus ist [67].
Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese von Rubbi und Milner, dass der
Nukleolus als Sensor für Zellschäden dient und die P53-abhängige-Signalkaskade in
Gang setzt. P14ARF ist ein Schlüsselprotein, das einen Wechsel von Wachstum und
Proliferation zu Reparatur und Zellzyklusarrest induziert. Mit der Hilfe von P14
ARF
wird
das nukleoläre Stresssignal in den Nukleus übertragen, wie Abbildung 2-14
verdeutlichen soll [176, 67].
2. Einleitung
Seite | 31
N
C
Hdm2
N
p
5
3
C
Nukleoplasma
N
P14
C
DNA-Schäden
N
B23
Topo I
C
Hdm2
N
P14
C
Nukleolus
Nukleoplasma
p
5
3
Hdm2
Freies Hdm2
(neu symthetisiert)
B23
N
C
Hdm2
B23
Abbildung 2-14: Proteinverteilung nach DNA-Schäden [66]
2.3.4.5 Wechselwirkungen
Die Proteine P53, P14ARF und Hdm2 müssen in der Zelle ihren individuellen Aufgaben
nachkommen als auch im Zusammenspiel untereinander optimal funktionieren.
Wie weiter oben erwähnt, induziert P14ARF als Tumorsuppressor die P53-abhängige
Zellzyklusregulation als Antwort auf DNA-Schäden und onkogenetische Aktivitäten.
P14ARF wird damit zum Schlüsselprotein, dessen Expression durch onkogenetische
und hyperproliferative Signale ausgelöst wird. Eine Deletion oder ein Funktionsverlust
des p14ARF-Gens kommt in 30-40% aller Krebsarten vor und beeinträchtigt die P53vermittelte Zellantwort auf onkogenetischen Stress, auch wenn P53 als Wildtyp
exprimiert wird. P14ARF aktiviert P53 indem es Hdm2 inhibiert. Hdm2 ist eine Ubiquitin
Ligase, die P53 ubiquitiniert und so dem Abbau durch das Proteasom zugänglich
macht [224, 222].
2. Einleitung
Seite | 32
P14ARF bindet an Hdm2 durch eine Interaktion zwischen dem N-Terminus von P14ARF
und dem C-Terminus von Hdm2, dadurch wird der Einfluss von Hdm2 auf P53
blockiert. Es resultieren eine erhöhte Proteinstabilität von P53 und eine verstärkte
transkriptionelle Aktivität, die den Zellzyklusarrest zum Ziel hat [224, 222]. (Siehe dazu
Abbildung 2-15)
p14
p53
mdm2
Transaktivierung von
Zielgenen
Abbildung 2-15: Regulationsweg P14
Die
Induzierbarkeit
von
ARF
-Hdm2-P53
ARF
P14
durch
Zellstress
stellt
einen
zentralen
Regulationsmechanismus des P53-Signalweges dar. P53 kann auch durch die
subzelluläre Kompartimentalisation des P14ARF-Proteins reguliert werden, ohne dass
die Gesamtexpression beeinflusst wird. Dieser Regulationsweg, führt durch die
Inaktivierung von Hdm2 durch P14ARF zu einer Stabilisierung von P53. P14ARF bindet
die RING-Fingerdomäne von Hdm2 und unterbindet die E3-Ligase Aktivität des
Proteins. Ob diese Inaktivierung im Nukleolus oder im Nukleoplasma stattfindet ist
noch nicht geklärt [224, 222].
Antagonisiert wird ARF durch HdmX. Wie schon besprochen ist HdmX ein Homolog
von Hdm2 ohne NOLs und NES oder E3-Ligase. Es unterstützt die Aktivität von Hdm2.
Da Hdm2 nur eine kurze Halbwertszeit besitzt, kann es ohne die Stabilisierung durch
HdmX P53 nur unzureichend degradieren. Jedoch ist Hdm2 für die Ubiquitinierung und
Degradation von HdmX zuständig. P14ARF drängt Hdm2 von der Degradation von P53
zur Degradation von HdmX. Dadurch wird HdmX abgebaut und P53 stabilisiert [179,
37]. Funktionsverluste der einzelnen Proteine oder eine Beeinträchtigung der
Interaktionen stellen ein zentrales Problem auf dem Weg zur Tumorentstehung dar.
2. Einleitung
Seite | 33
2.3.5
P16INK4a
2.3.5.1 Entdeckung, Funktion und Struktur
P16INK4a wurde 1993 in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System entdeckt, als ein Protein, das
mit der Cyklin-abhängigen-Kinase 4 interagiert
[218]. Weitere Mitglieder der INK4
Gen-Familie neben P16INK4a sind P15INK4b, P18INK4c und P19INK4d, die alle CDK4 und
CDK6 binden, um deren Interaktion mit Cyklin D zu vermeiden [75].
Humanes P16INK4a besteht aus 156 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von
16569 Da. Es besitzt vier Ankyrin Wiederholungen, die für die Protein-Protein
Interaktionen von Bedeutung sind. Diese Regionen formen eine konkave Struktur, die
die nicht-katalytischen Seiten von CDK4 und -6 bindet [208, 20]. Seine Aktivität als
Tumorsuppressor erlangt P16INK4a durch seine Fähigkeit CDK4 und 6 zu binden und
deren katalytische Aktivität zu inhibieren, dadurch wird die Komplexbildung zwischen
CDK4/CDK6 mit Cyklin D verhindert. Diese Komplexbildung phosphoriliert und inhibiert
in
sich
teilenden
Zellen
das
Retinoblastom
Protein
(Rb),
was
zu
einer
Zellzyklusprogression führt. Das Retinoblastom Protein ist ein „Torhüter“ des
Zellzyklus. In gesunden Zellen mit normalem Zellzyklus ist der Wechsel von G1-Phase
in die S-Phase davon abhängig, dass Rb durch Phosphorylierung inaktiviert wird.
Diese Phosphorylierung wird von cyklin-abhängigen Kinasen vollbracht [182]. Erhöhte
Pegel von P16INK4a führen zu einer verstärkten Bildung von CDK4, CDK6/P16INK4a
Komplexen und zu einer verminderten Bildung von CDK4, CDK6/Cyklin D-Komplexen.
Freies Cyklin D wird daraufhin ubiquitiniert und durch das Proteasom abgebaut. Der
Verlust von Cyklin D führt zu einer Akkumulation von P27KIP1, was die CDK2/Cyklin E
und
CDK2/Cyklin
A-abhängige
Phosphorylierung
von
Rb
unterdrückt.
Nicht-
phosphoriliertes Rb bindet den Transkriptionsfaktor E2F und führt zu einem
Zellzyklusarrest in der G1/S-Phase. Das bedeutet, dass P16INK4a abhängig von Rb,
einen Zellzyklusarrest induziert [267, 111].
2.3.5.2 Biologische Funktion von P16INK4a
Die Hauptfunktion von P16INK4a ist die Regulation der Phosphorylierung von Rb und
damit die Induktion des Zellzyklusarrest in der G1/S-Phase. Obwohl es viele Studien
INK4a
gibt, die über P16
als Tumorsuppressor berichten, ist die exakte biologische
INK4a
Funktion noch nicht endgültig geklärt. Bisher wird P16
eine Rolle in der
Zellalterung, Anoikis [189], Angiogenese [84] und Zellstreuung [50] zugeschrieben.
Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des stabilen Zellzyklusarrestes, der durch eine
2. Einleitung
Seite | 34
Vielzahl
von
onkogenetischen
Stimuli
hervorgerufen
wird.
Dazu
zählen
Telomerverkürzungen und die Aktivierung verschiedener Onkogene [22, 15, 240]. Die
Anzahl der Zellteilungen, die eine Zelle bis zur Alterung durchführen kann, wird durch
das Hayflick-limit bestimmt [86]. Zelluläre Alterung ist eine Barriere für die
Krebsentstehung, da sie geschädigte Zellen vor einem unkontrollierten Wachstum
bewahrt [240].
In gealterten Zellen ist ein erhöhter Spiegel von P53, P16INK4a und Rb messbar [200].
Ist Rb einmal durch P16INK4a aktiviert resultiert ein irreversibler Zellzyklusarrest, der
auch durch eine Inaktivierung von Rb und P53 nicht mehr rückgängig gemacht werden
kann. Eine Inaktivierung von Rb und P53 kann zwar noch zu einer erneuten
Initialisierung der DNA-Synthese führen, aber der komplette Zellzyklus kann in diesen
Zellen
nicht
mehr
durchlaufen
werden.
Dieser
Rb
und
P53
unabhängige
Zellzyklusblock ist nur in humanen Zellen und nicht in Mausfibroblasten nachweisbar
und bietet eine zweite Schutzbarriere vor Zellimmortalisierung. Durch diesen zweiten
Mechanismus erklärt sich der ungewöhnlich stabile Zellzyklusblock in gealterten,
humanen Zellen [22, 192].
In gealterten Zellen ist die Aktivität von CDKs durch erhöhte Expression der CDKIs
P21WAF1 und P16INK4a blockiert. Über p21WAF1 kommt es zu einer Verbindung des P53und
des
Retinoblastom-Signalweges,
so
dass
ein
festes
Netzwerk
zur
Tumorsuppression entsteht. Sobald P16INK4a an CDK4 und 6 gebunden hat, wird die
WAF1
Umverteilung von P21
und P27KIP induziert, was in deren Bindung an Cyklin E und
der Inaktivierung von CDK2 resultiert [225, 154, 164]. Die Aktivität von P21WAF1 und
INK4a
P16
bewahrt Rb vor einer Phosphorylierung und führt zu einem stabilen
Zellzyklusarrest in der G1-Phase [66]. Die zweite Barriere wird durch einen Rbabhängigen Zytokineseblock erreicht. Um die irreversible Blockierung der Zytokinese
möglich
zu
machen,
kooperiert
der
P16INK4a/Rb-Signalweg
mit
reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) [241]. In niedriger Dosierung sind ROS für die physiologische
Zellfunktion in ungestressten Zellen zuständig. Bei wenig Zellstress wird Rb durch
mitogene Signale niedrig gehalten, während E2F/DP hochreguliert wird. Der Zelle wird
es auf diese Weise ermöglicht in die S-Phase einzutreten [225, 40, 206, 245]. Obwohl
mitogene Signale zu einer verstärkten Bildung von ROS führen, wird dieser Effekt
durch den E2F/DP-Komplex antagonisiert und die Konzentration von ROS bleibt in
ungestressten Zellen niedrig [241].
Die Situation in gestressten Zellen unterscheidet sich durch erhöhte P16INK4aKonzentrationen, die zu einer Hypophosphorylierung von Rb führen und dadurch die
Komplexbildung von E2F/DP aufheben. Die mitogenen Signale können jetzt die
2. Einleitung
Seite | 35
Konzentration von ROS anheben. ROS aktivieren das nachgeschaltete PKCδ, das
durch eine positive Rückkopplung eine weitere Erhöhung von ROS auslöst [259, 125,
241].
Stark erhöhte ROS haben über verminderte Spiegel von WARTS (LATS1, „mitotische
exit network kinase“) eine antiproliferative Wirkung, die sich in Apoptose und
Seneszenz geltend macht [19, 265, 99]. Durch die, von P16INK4a angestoßene,
autonomisierte Aktivierung
Zytokineseblock
in
des
ROS/PKCδ-Signalweges
humanen,
gealterten
Zellen
wird
ein
irreversibler
aufrechterhalten.
Dieser
funktionssichere Mechanismus stellt in Zellen, in denen Rb und P53 außer Kraft
gesetzt sind, die letzte Hürde auf dem Weg zur Immortalisierung und Entartung der
Zellen dar [192, 240, 241]. Die Rolle des P16INK4a/Rb-Signalweges in der durch
Zellalterung ausgelösten Zytokineseblockade ist in folgender Abbildung dargestellt.
Abbildung 2-16: Die Rolle des P16
Zellen [238]
Außerdem wird P16
INK4a
INK4a
/Rb-Regulationsweges im Zellzyklusarrest von gealterten
eine entscheidende Rolle bei der Auslösung von Anoikis
zugeschrieben. Gesunde Epithelzellen, die den Kontakt zur extrazellulären Matrix
verloren haben, unterlaufen die Apoptose, während die meisten Tumorzellen die
Fähigkeit erlangt haben gegen diesen Vorgang resistent zu sein. Das ermöglicht den
Tumorzellen klonales Wachstum, Metastasierung und Tumorinvasion. In diesen Zellen
kann die Apoptose als Antwort auf Kontaktverlust durch induzierte hohe Spiegel von
P16INK4a wieder hergestellt werden. Man bringt diesem Einfluss von P16INK4a auf Anoikis
mit dem α5β1-Fibronektinrezeptor in Verbindung und geht davon aus, dass diese
2. Einleitung
Seite | 36
Funktion von P16INK4a unabhängig von Rb stattfindet [200, 29, 26, 253, 189].
Zusätzlich kann P16INK4a eine Rolle als Regulator in der αvβ3-Integrin-abhängigen
Zellstreuung auf Vitronektin zugeschrieben werden. P16
INK4a
beeinflusst oberhalb der
αvβ3-Integrin-abhängigen Aktivierung von PKC die matrixabhängige Zellmigration [50,
200]. In einer Studie, die neue therapeutische Ansätze zur Unterdrückung der
Angiogenese in Gliomen untersucht hat, ist eine P16INK4a-abhängige Unterdrückung
von VEGF („vascular endothelial growth factor“) aufgefallen. Diese Gruppe vermutet
eine Rolle von P16INK4a in der Regulation der Angiogenese in Gliomen [200, 84].
2.3.5.3 Regulation von P16INK4a
Betrachtet man die Bedeutung des INK4a/ARF-Lokus in Bezug auf Tumorsuppression
und Alterung, ist es nicht verwunderlich, dass die Regulation dieses Genlokus
Gegenstand von vielen Studien ist. Die Regulation des P16
INK4a
-Proteins kann in
mehreren Stadien erfolgen: Transkriptional, Posttranskriptional und Posttranslational.
I. Transkriptionale Regulation
Sauerstoffradikale,
Ionisierende
Strahlung,
Chemotherapeutika,
UV-Licht
und
Telomerdysfunktion führen über eine MAPK („mitogen activated protein kinases“)Aktivierung zu einer Expressionsinduktion des INK4A/ARF-Lokus. MAPK spielt eine
Schlüsselrolle in der Übertragung von extrazellulären Signalen nach intrazellulär [28].
Weitere beteiligte Proteine und deren Regulationswege sind in Tabelle 2-2 dargestellt.
Interaktion:
Ras-Raf-Mek-Erk
Kaskade:
Übertragung
extrazellulären Signalen nach intrazellulär [169]
Konsequenzen:
INK4a
von Erhöhte Promoteraktivität von p16
[169]
INK4a
Ets-1, Ets-2: Transkriptionsfaktoren am Ende der Ras-Raf- Erhöhte Promoteraktivität von p16
Mek-Erk Kaskade [77]
[77]
INK4a
Pea3, Sap1, Elk1: Transkriptionsfaktoren am Ende der Ras- Erniedrigte Promoteraktivität von p16
Raf-Mek-Erk Kaskade [77]
[77]
P38: Indirekte Aktivierung durch onkogenetisches Ras [101, Aktivierung von p16INK4a [101, 252]
252]
INK4a
Bmi-1: Protein der Polycombcomb Gruppe [74, 183]
Suppressor des P16
Signalweg [102]
/Cyklin D/RbINK4a
Id1-Protein: helix-loop-helix (HLH) Regulatorprotein der Erniedrigte Promoteraktivität von p16
Transkription [151]
[2]
CDC6 ATPase: Replikationsprotein, wichtig für die Erniedrigte Promoteraktivität von p16INK4a
Aktivierung des Replikationsanfangs, indem es an den [73]
„origin recognition complex“ (ORC) bindet und den „Minichromosomen Maintenance“(MCM)-Komplex rekrutiert [72]
Tabelle 2-2: Transkriptionale Regulation
2. Einleitung
Seite | 37
II. Posttranskriptionale Regulation
Diese Art der Regulation basiert auf Veränderungen in der mRNA-Stabilität und INK4a
Translation. Bisher sind zwei Möglichkeiten bekannt, die die mRNA von P16
beeinflussen. RNA bindende Proteine (RBPs) assoziieren mit RNA und regulieren die
Genexpression nach der Gentranskription. Diese Regulation kann auf verschiedenen
Mechanismen wie prä-RNA Spliceverfahren und -Reifung, mRNA -Transport, -Stabilität,
-Aufbewahrung und -Translation beruhen. Auch wenn noch nicht bis ins Detail geklärt
ist durch welchen Mechanismus die RBPs Einfluss auf die RNA von P16INK4a und
ARF
P14
nehmen, weiß man, dass eine Überexpression der RBPs A1 und A2 einen
höheren stabilen Zustand von P16
INK4a
und P14ARF zur Folge hat. Man vermutet eine
ARF
direkte Interaktion mit der mRNA von P14
INK4a
und P16
oder eine indirekte
Regulation durch Interaktion mit den mRNAs von Transkriptionsfaktoren, die wiederum
die mRNA-Expression von P14ARF und P16INK4a kontrollieren [273].
Eine weitere Gruppe von postranskriptional aktiven Regulationsfaktoren sind
microRNAs. Es handelt sich dabei um kurze (21-26nt) Einzelstränge nicht-kodierender
RNA, die zu „RNA-induced silencing complexes“ (RISC) zusammengefasst werden.
Diese RISC bilden mit ihrer Ziel mRNA sogenannte „processing bodies“ (P-bodies), die
im Zytosol abgebaut werden und dadurch ihre Translation verhindern. Zurzeit werden
noch verschiedene Modelle der miRNA-Funktion kontrovers diskutiert. Der Einfluss auf
die mRNA von P16INK4a funktioniert wahrscheinlich über eine Blockade der Initiation
und Elongation des P16
INK4a
-Proteins [132].
III. Posttranslationale Regulation
Die
bekanntesten
Mechanismen
der
posttranslationalen
Regulation
sind
Phosphorylierung und Ubiquitinierung. Obwohl das Wissen über die Funktionen von
INK4a
P16
immer weiter zunimmt, ist wenig über seine Regulation bekannt. Man hat
INK4a
endogenes P16
gefunden, dass mit CDK4 assoziiert ist und am Serin 125
phosphoriliert ist. Diese Phosphorylierung kann die Bindungskapazität von P16
INK4a
CDK4 und CDK6 beeinflussen oder die zelluläre Lokalisation von P16
INK4a
an
verändern.
Die genaue Auswirkung der Phosphorylierung ist aber noch Gegenstand der
Forschung [81].
Die Ubiquitinierung von Proteinen am C-Terminus ist dafür bekannt, für deren
Degradation durch das Proteasom verantwortlich zu sein. P16
INK4a
wird allerdings zu
den „naturally occuring lysine less“-Proteinen (NOLLPs) gezählt, was es zum Ziel einer
N-terminalen Ubiquitinierung macht. Es kann auch gezeigt werden, dass P16INK4a nur in
2. Einleitung
Seite | 38
wenig aktiven Zellen und nicht in teilungsaktiven Zellen ubiquitiniert und degradiert
wird,
was
einen
Zusammenhang
zwischen
N-terminaler-Ubiquitinierung
und
Degradation vermuten lässt [16].
Trotz der vielen Daten, die über P16INK4a im Umlauf sind, ist der genaue Mechanismus
der Regulation noch nicht bekannt und beruht bisher auf Vermutungen.
2.3.6
P63
Neben den Proteinen, die an der Regulation von P53 und Rb beteiligt sind, werden
noch andere Proteine verdächtigt an Tumorentstehung oder –progression beteiligt zu
sein. Eines davon ist P63, das in den folgenden Abschnitten näher beleuchten wird.
2.3.6.1 Struktur und Funktion
Zuerst davon ausgehend, dass die Struktur von P53 einzigartig ist, hat man 1997 zwei
neue Familienmitglieder entdeckt, die man P63 und P73 nannte. P63 ist auf dem Gen
3q27-29 lokalisiert und wird im menschlichen Epithel v.a. in Epidermis, Cervix, Urothel
und Prostata exprimiert. Vermutlich ist P63 der evolutionäre Vorgänger von P53 und
P73 ist. Es konnte auch gezeigt werden, dass menschliches und murines P63 am
Amino-Terminus zu 99% übereinstimmen. Warum gerade P63 zwischen den
verschiedenen Spezies hochkonserviert ist, ist noch unklar [263].
Die
drei
hochkonservierten
Transaktivierungsdomäne,
Regionen
die
der
drei
Proteine
DNA-Bindungsdomäne
sind
und
die
die
Oligomerisierungsdomäne. Das Gen von p63 besitzt zwei Promotorregionen: P1 in der
5‘ nichttranslatierten Region oberhalb des nichtcodierenden Exons 1 und P2 innerhalb
des Introns 3. P1 und P2 produzieren zwei Arten von Proteinen, bei denen die erste
Gruppe die Transaktivierungsdomäne (TAP63) besitzt, die zweite jedoch nicht
(ΔNP63). Weiterhin werden durch alternatives Spleißen die verschiedenen Proteine am
COOH-Terminus verändert. Die α-Variante besitzt alle Exons 10-14 in der vollen
Länge, die β-Form ist nach Exon 12 abgeschnitten und die ɣ-Variante, der zwar die
Exone 12-14 fehlen, hat aber dafür ein zusätzliches 10. Exon. Dadurch entstehen
sechs Hauptproteine mit unterschiedlichen Funktionen: TAα, TAβ, TAɣ, ΔNα, ΔNβ,
ΔNɣ [142].
Alle drei Mitglieder der P53-Familie haben signifikante Homologien bezüglich Gen- und
Proteinstatus. Jedes Protein besitzt eine Tetramerisierungsdomäne, eine DNA2. Einleitung
Seite | 39
Bindungsdomäne und eine Oligomerisierungsdomäne. P63 hat zusätzlich noch einen
langen C-terminus [142].
Die α-Form von TAP63 beinhaltet ein hochkonserviertes „steriles alpha motiv“ (SAM).
Sie besteht aus vier α-Helices und einer kleinen 310-Helix. SAMs sind für ProteinProtein Interaktionen von Nöten und kommen in vielen Proteinen vor, die für die
menschliche Entstehung unersetzlich sind [142].
Die größte Homologie zwischen P53, P73 und P63 wird in der DNA-Bindungsdomäne
erreicht. Es sind bis zu 60% identische Strukturen zwischen P53 und P63 zu finden.
Daraus lässt sich vermuten, dass die Proteine die gleichen DNA-Sequenzen binden
und die gleichen Proteine transaktivieren können [142].
Wegen den strukturellen Homologien zwischen P53, P73 und P63 nahm man an, dass
sie ähnliche Aufgaben als Transkriptionsfaktoren erfüllen. Es ist aber schnell klar
geworden, dass P63 und P73 nicht die gleiche Funktion wie P53 in der
Tumorentstehung innehaben. Besonders deutlich wurde dies an Untersuchungen in
Mäusen. Mäuse, denen P63 fehlte hatten verkrüppelte Gliedmaßen, keine Haarfollikel,
keine Zähne sowie keine Brust-, Tränen- oder Schweißdrüsen [162, 264]. Diese Studie
brachte ans Licht, dass die primäre biologische Funktion von P63 die Regulation der
physiologischen
Entwicklung
ist.
Heterozygote
Keimbahnmutationen
oder
Leserasterverschiebungen im p63-Gen führen zu Ectrodyktylie, Ektodermaldysplasie
und Gesichtsspalten. Erhöhte Spiegel in gesunden, humanen Keratinozyten führen zu
deren verstärkten Differenzierung, da Loricrin-, Involucrin- und Transglutaminase 1Promotoren durch P63 aktiviert werden [142].
P63 ist also absolut unersetzlich für die Entwicklung der Extremitäten und der
Epidermis (Haut und Zunge), sowie für die Adnexe (Zähne, Haare, Brust-, Prostata-,
Schweiß- und Tränendrüsen). Tiere, bei denen es wegen eines Verlustes von P63 zu
Missbildungen kam, können nicht länger als ein paar Tage postnatal überleben.
Keimbahnmutationen im p63-Gen führen zu sechs seltenen autosomal-dominanten
Erbkrankheiten, die eine sehr starke, wenn auch nicht 100%ige Genotyp-Phänotyp
Korrelation aufweisen. Die ersten Erkrankungen, die mit dem p63-Gen in Verbindung
gebracht wurden, waren das „ectrodactyly-ectodermal dysplasie-clefting“ und das HayWells-Syndrom
(ankyloblepharon-ectodermal
dysplasie-clefting).
90
betroffene
Familien mit „ectrodactyly-ectodermal dysplasie-clefting“ wurden genetisch untersucht,
wobei auffiel, dass unter 29 Mutationen des p63-Genes 28 Missensemutationen
auftraten, die alle in der DNA-Bindungsdomäne lokalisiert waren. Durch diese
Mutationen waren alle sechs Proteine des Genlokus betroffen und ihre Fähigkeit DNA
zu binden war beeinträchtigt [167].
2. Einleitung
Seite | 40
Die Mutationen, die bei „ankyloblepharon-ectodermal dysplasia-clefting“ zu sehen
waren, befanden sich in der SAM-Region und beeinträchtigten nur die beiden αIsoformen des P63-Proteins. Dadurch werden die Protein-Protein Interaktionen mit
„apobec-1 binding protein-1“ verhindert und die K-SAM Isoform des FibroblastenWachstums-Faktor-Rezeptor
2
(FGFR2)
wird
nicht
gebildet.
Die
epitheliale
Differenzierung ist dadurch gestoppt, was zum Phänotyp des „ankyloblepharonectodermal dysplasia-clefting“ führt. Die anderen vier Erkrankungen nach p63Mutationen sind: „Acro-Dermato-Ungual-Lacrimal-Tooth-Syndrome“, „Limb mammary
Syndrome“, „Rapp-Hodgkin Sydrome“ und „split hand split foot malformation“ [167].
Die verschiedenen Mutationen mit den zugehörigen Erkrankungen sind in Abbildung 217 dargestellt.
Hay-Wells
Ankyloblepharon Ectodermal dysplasie Clefting
Limb-Mammary Syndrome
Rapp-Hodgkin Syndrome
Ectrodactyly Ectodermal dysplasia clefting
Split-Hand/Foot Malformations
Acro-Dermato-Ungual-lacrimal-Tooth
N
TA
Pro
DBD
OD
TA
SAM
TID
C
TA = Transaktivierungsdomäne
PRO = Prolin-reiche Region
DBD = DNA-Bindungsdomäne
OD = Oligomerisierungsdomäne
SAM = steriles alpha motiv
TID = Transactivation inhibitory region
Abbildung 2-17: Lokalisation der Punktmutationen des p63-Gens [167]
Normale menschliche epitheliale Basalzellen exprimieren P63-Proteine in großer
Anzahl. Das Verhältnis von ΔNP63 zu TAP63 beträgt 100:1. Sobald die Zellen
aufhören Stammzellen zu sein, verlieren sie die P63-Expression. Auch die
Differenzierung von Keratinozyten ist mit dem Verlust von ΔNP63α assoziiert, während
die Expression der P53-Zielgene 14-3-3-σ und p21 ansteigen. P63 bindet also an den
Promotor von 14-3-3-σ und p21 und unterdrückt ihre Transkription. P63 ist auch für die
Differenzierung von Übergangsepithel zuständig und wird im gesunden Blasenurothel
gefunden. In den meisten invasiven Blasenkarzinomen ist den Zellen die Fähigkeit zur
P63-Expression verloren gegangen [167].
Zusammenfassend kann man sagen, dass P63 eine wichtige Rolle in der epithelialen
Stammzellbiologie zukommt und es auch für die Ausreifung der Extremitäten von
2. Einleitung
Seite | 41
Nöten ist [167].
Betrachtet man die bisher aufgeführten Ergebnisse und bezieht die Information mit ein,
dass TAP63-/- Mäuse ein signifikant kürzeres Leben haben als ihre Kammeraden mit
Wildtyp P63-Expression, wird die Rolle von P63 in der Erhaltung von Stammzellen in
Epithel und Geweben deutlich. Dies schafft TAP63 über die transkriptionelle
Aktivierung des „cyclin dependend kinase inhibitor“ P57 [14, 238].
Den P53-Familienmitgliedern wird eine besondere Rolle im Alterungsprozess
zugeschrieben. Eine Zunahme der Aktivität von P53 konnte mit Altern in
Zusammenhang gebracht werden, auch wenn es Studien gibt, die auf ein anderes
Ergebnis gekommen sind. Der Hauptunterschied dieser Studien lag im Phänotyp von
P53. In Mäusen, die eine verfrühte Alterung zeigten, konnte verkürztes P53
nachgewiesen werden, während die anderen Mäuse Wildtyp P53 aufwiesen, das durch
andere Mechanismen bezüglich des P53-Regulationsweges hochreguliert war. Eine
Erklärung für diese Erscheinung liefert die Hypothese, dass mutiertes P53 mit TAP63
interagiert und es so inaktiviert. Mäuse mit mutiertem P53 zeigten den gleichen
Phänotyp wie P63-/- Mäuse in Bezug auf Tumorigenese und Metastasierung [173,
135].
Mäuse mit Li-Fraumeni-Syndrom und punktmutiertem P53 inaktivieren P63 und P73,
indem P53 die beiden Proteine bindet und ihre Transkriptionsaktivität verhindert [100,
173, 135]. Diese Mäuse zeigten das gleiche Mutationsmuster wie Mäuse mit P53+/-,
P63+/-
und
p73+/-.
Diese
Versuche
veranschaulichen
einen
komplizierten
Zusammenhang zwischen den Familienmitgliedern der P53-Familie [56, 57].
Interessanterweise ist der Alterungsvorgang, der in P63 -/- Zellen in Gang gesetzt wird,
P53 unabhängig. Das weist darauf hin, dass TAP63 die Alterung in epidermalen
Vorläuferzellen direkt über eine Repression der Transkription von P14ARF und P16INK4a
auslöst [236, 238]. Diese Rolle von TAp63 zwingt uns dazu zu überdenken, ob es nicht
doch in die Gruppe der Tumorsuppressorgene einzuordnen ist [237].
In der Haut werden vor allem die Isoformen von ΔNP63 exprimiert. Man geht davon
aus dass diese Isoformen, allen voran ΔNP63α, eine wichtige Rolle in der Erhaltung
der Epidermis spielen. TAP63-Isoformen dagegen ähneln P53 in der Struktur am
meisten und werden im Laufe der Zellantwort auf DNA-Schäden induziert [58, 103].
Obwohl TAP63-Proteine nicht in gesunder Epidermis zu finden sind, steigt die
Expressionsrate bei Zellstress, wegen Verletzungen, dramatisch an. Daraus lässt sich
die Hypothese formulieren, dass TAP63 wie P53 die Aufgabe hat Zellen vor
Schädigungen zu schützen [238]. Diese Rolle für TAP63 ist neu und noch nicht ganz
2. Einleitung
Seite | 42
verstanden [237].
Die Funktionen von TAP63 bei Wundheilung und Haarwachstum zeigen einen neuen
therapeutischen
Ansatz
zur
Heilung
des
AEC-Syndroms,
aber
auch
bei
Wundheilungsstörungen wie sie beim Diabetes mellitus auftreten. Die zu klärende
Frage lautet, ob TAP63 in adulten dermalen Stammzellen reaktiviert werden kann und
ob dann Alterung und verfrühte Reifung rückgängig gemacht werden können und ob es
zur erneuten Haarregeneration und Wundheilung führen kann.
2.3.6.2 Regulation der Proteinstabilität und transkriptionaler Aktivität von P63
Die Ankyrin-reichen Proteine ASPP1 und ASPP2 stimulieren die apoptotischen
Funktionen von P53, P63 und P73, indem sie an die DNA-bindenden Domänen der
drei Proteine binden. Dadurch wird die P53-Familie aktiviert und bindet an die
Promotoren von Bax, PIG3 und Puma, die dann die Apoptose auslösen [167].
Die P63α-Isoformen sind wegen ihrer SAM-Region stabiler als die anderen Isoformen,
da es zu einer intramolekularen strukturellen Besetzung der Transaktivierungsdomäne
kommt, ihre Degradation ist somit unmöglich. Diese Isoformen bilden einen
Proteinpool, auf den im Falle von DNA-Schäden oder Entwicklungssignalen
zurückgegriffen werden kann. Allgemein sind jedoch die TAP63-Proteine mit einer
Halbwertszeit von ungefähr sechs Minuten in vitro weniger stabil als die ΔNP63Isoformen mit einer Halbwertszeit von mehr als fünf Stunden. Die spezifischen DNAbindenden Aktivitäten scheinen für die Halbwertszeit von TAP63 verantwortlich zu sein,
da Mutationen in diesem Bereich die Stabilität des Gens erhöhen. Obwohl Hdm2 an
TAP63 bindet, scheint seine E3-Ligaseaktivität keinen Einfluss auf das Protein zu
haben, aber P63α und P63ɣ werden bei einer Coexpression von Hdm2 aus dem
Nukleus ins Zytoplasma transportiert. Hdm2 ist in der Lage die Auslösung der
Apoptose durch P63 zu vermeiden, indem es das Protein aus dem Nukleus befördert,
aber nicht degradiert. Die Degradierung von P63 kann genauso wie die von P73 durch
eine COOH-terminale Ubiquitinierung reguliert werden, ein Beweis dafür fehlt noch.
Eine zweite Möglichkeit bietet eine Interaktion mit P53. Eine Komplexbildung zwischen
P53 und ΔNP63α führt über den Caspase1-spezifischen Signalweg zu einer
Degradation von P63. Es könnte sein, dass es eine Balance zwischen P53 und
ΔNP63α gibt. ΔNP63α verhindert die Transkription von P53 und P53 vermindert die
Stabilität von ΔNP63α. Welcher Regulationsweg der Richtige ist und ob überhaupt eine
Hypothese zutrifft, ist noch unklar [167].
2. Einleitung
Seite | 43
2.4
Genetische Alterationen beim Harnblasenkarzinom
Tumorentstehung ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Summierung genetischer
Veränderungen ab einem gewissen Schweregrad zur Entstehung einer Tumorzelle
führt. Viele genetische und epigenetische Veränderungen, die direkt oder indirekt zur
Tumorentstehung beitragen, wurden bisher auch für das Harnblasenkarzinom
beschrieben.
Zurzeit werden drei Wege diskutiert, die erklären sollen wie Blasenkarzinome
unabhängig voneinander entstehen können. Nicht-invasive (Ta) Tumoren entstehen
aus einer Urothelhyperplasie und wachsen zu einer exophytischen papillären Struktur
aus. Vorläuferläsionen von muskelinvasiven Blasenkrebs sind flache Dysplasien oder
Carcinoma in situ, wobei diese Tumorart gewöhnlich keine papilläre Struktur aufweist.
Die Einteilung der dritten Gruppe von Blasenkarzinomen ist weiterhin schwierig, da
man das pathologische Entstehungsmuster weder den rein exophytisch wachsenden
papillären Tumoren (Ta), noch den muskelinvasiven Tumoren zuordnen kann. Zu
dieser Gruppe gehören papilläre T1 Tumore, die zwar die Submukosa, aber nicht die
Muskulatur infiltrieren. Die Frage, ob papilläre T1 Tumore aus Ta Tumoren entstehen,
oder eine eigene Tumorentität darstellen, ist derzeit Gegenstand zahlreicher
Untersuchungen [71]. Siehe dazu auch Abbildung 2-18.
Genomisch stabil
FGFR3
Normales Urothel
Hyperplasie
Papilläres Karzinom
Low grade Ta
Rezidiv
Hyperplasie+
Dysplsie/CIS
Papilläres Karzinom
High grade Ta
Rezidiv
Dysplasie
CIS
T1 +/- CIS
Invasives Karzinom
>T2
T1 +/- CIS
Invasives Karzinom
>T2
P53
Rb
PTEN
Genomisch instabil
Abbildung 2-18: Mutationen und Entstehungswege von Urothelkarzinomen [71]
2. Einleitung
Seite | 44
Es gibt verschiedene Arten von Mutationen, die im Rahmen der Entstehung von
Harnblasenkarzinomen eine Rolle spielen. Die einen sind spezifisch für eine bestimmte
histopathologische Tumorart, die anderen sind unspezifisch und können in mehreren
Tumorentitäten des Blasenkarzinoms beobachtet werden [71].
Nicht spezifisch sind Veränderungen im Chromosom 9, da sie in 50% aller
Blasentumoren, unabhängig ihres Progressionsstatus, vorkommen. Da in vielen
Tumoren ein ganzes Chromosom verloren gegangen ist geht man davon aus, dass die
Gene beider Chromosomenarme in die Tumorprogression involviert sind. Auf dem
kurzen Arm befinden sich die Genorte der Tumorsuppressorproteine P14ARF, P16INK4a
und P15. In vielen Blasentumoren kommt es zu einer homozygoten Deletion des
Genlokus, aber ein konkreter Zusammenhang zum Schweregrad der Tumorerkrankung
konnte nicht gefunden werden. Die Genorte des langen Armes, PTCH (Gorlin
syndrome gene), DBC1 und TSC1 (tuberous sclerosis complex gene 1) sind noch nicht
so gut erforscht wie die des kurzen Armes. TSC1 konnte aber in einer Studie mit
Tumorinvasion in Zusammenhang gebracht werden. Weitere Studien sind notwendig
um der genauen Rolle des Genlokus auf die Spur zu kommen. Auch Ras-Mutationen
können in 13% aller Blasentumoren und in 85% der Ta-Tumoren beobachtet werden.
Jedoch ist auch bei Ras die Aussagekraft der Mutationen noch unklar [71]. Die
tumorspezifischen Veränderungen werden in den folgenden Abschnitten näher
betrachtet.
Hochdifferenzierte Urothelkarzinome zeigen wenige zytogenetische Alterationen und
weisen eine genetische Stabilität auf. TaG3-Tumoren und auch das Carcinoma in situ
weisen viele genetische Alterationen auf und gehören deswegen in die Gruppe der
invasiven Karzinome.
2.4.1
Nicht-invasive papilläre Urothelkarzinome
Wie schon beschrieben, weisen 80% der Blasenkarzinome zum Zeitpunkt der
Erstdiagnose ein oberflächliches, papilläres Wachstum auf, von denen dann 10-15%
eine Progression mit muskelinvasivem Wachstum zeigen [207].
Die folgende Tabelle zeigt eine Übersicht der gefundenen Veränderungen bei TaBlasenkarzinomen in Abhängigkeit ihrer Häufigkeit. Die wichtigsten werden noch
einmal separat beschrieben (nach [71]):
2. Einleitung
Seite | 45
Gene (zytogenetische Lokalisation)
Alteration
Häufigkeit
Oncogene:
HRAS (11p15)/NRAS (1p13)/KRAS2 (12p12)
Aktivierende Mutation
15%
FGFR3 (4P16)
Aktivierende Mutation
60-80%
CCND1(11q13)
Amplification
10-20%
und/oder
Überexpression
PIK3CA (3q26)
Aktivierende Mutation
25% PUNLMP; 16% Ta
MDM2 (12q13)
Überexpression
~30%
Homozygote Deletion (HD)
HD 20-30%, LOH ~60%
Tumoursuppressorgene:
CDKN2A (9p21)
oder
Methylierung
oder
Mutation
PTCH (9q22)
Deletion oder Mutation
LOH ~60%,
selten Mutation
DBC1 (9q32-33)
Deletion oder Methylierung
LOH ~60%
TSC1 (9q34)
Deletion oder Mutation
LOH ~60%; Mutation ~12%
Tabelle 2-3: Veränderungen bei Ta-Blasenkarzinomen in Abhängigkeit ihrer Häufigkeit
Mutationen im FGFR3 Gen, die in einer Überexpression resultieren, sind mit einem
niedrigen Tumorstadium und hoher Zelldifferenzierung vergesellschaftet. Da FGFR3Mutationen zu hohen Prozentzahlen in pTaG1-Tumoren und in Urothelpapillomen
vorkommen, erhärtet sich die Hypothese, dass man FGFR3-Mutationen mit „low-risk“
Blasenkarzinomen assoziieren kann und dass es einen molekularen Zusammenhang
zwischen der Entstehung von Urothel-Papillomen und „low-risk“ Blasenkarzinomen
gibt. Zusammengefasst kann man sagen, dass eine Überexpression von FGFR3,
aufgrund von Mutationen, in pTa- und G1-2 Tumoren häufiger vorkommt als in pT2und G3-Tumoren. Da FGFR3-Mutationen in 80% der pTa und 51% der pT2 Tumoren
vorkommen, stellen sie ein therapeutisches Ziel dar. FGFR3-Mutationen aktivieren den
Ras-MAP-Kinase-Signalweg, weswegen man den Mutationsstatus des Ras-Genes
genauer untersucht hat. Auch hier konnte festgestellt werden, dass Mutationen in pTa
oder G1 Tumoren häufiger sind als in pT2 oder G3-Tumoren, allerdings schließen sich
Mutationen im FGFR3-Gen und im Ras-Gen gegenseitig aus [71].
Zusätzlich
konnten
Mutationen
im
Phosphatidylinositol
3-Kinase
(PI3-kinase)
Signalweg gefunden werden. Mutationen in der p110-α-katalytischen Untereinheit der
PI3-Kinase (PIK3CA) konnten auch mit niedrigen Tumorstadien und Zellentartungen
2. Einleitung
Seite | 46
assoziiert werden, wenn auch nicht in so einem Ausmaß wie FGFR3. Ob es eine
Verbindung zwischen den Mutationen der helikalen Domäne der PIK3CA und der
krankhaften Aktivierung von RAS in Tumoren gibt, ist bisher noch unklar [71].
Abbildung 2-19 dient dem besseren Verständnis des erörterten Zusammenhangs der
Proteine.
Growth factors
MAPK/PI3K pathways
in advanced tumours
FGFR3
EGFR
receptor
tyrosine kinase
ERBB2/3
INK4A
BAD
P16
PTEN
PI3K
P14
RAS
RAF
P53
MDM2
AKT
TSC1
P21
GSK-3β
CDK 4/6
Cyclin D
MEK
TSC2
ERK
E2F-1
Cyclin
D
MYC
pRb
Rheb
MYC
mTOR
P
E2F-1
pRb
Translation
S-phase entry
Abbildung 2-19: Mutierte Gene der MAPK/PI3K Signalkaskade in Ta-Blasentumoren [71]
2.4.2
Carcinoma in situ
Ein CIS (Carcinoma in situ) ist der Definition nach eine hochgradige Läsion, die
entweder alleine oder gleichzeitig mit einer anderen, meist papillären, Läsion auftreten
kann. Da ein Carcinoma in situ leider nur wenig zu untersuchendes Material bietet, hat
man bisher nur wenige Daten gewinnen können. Man ist sich aber einig, dass CIS eine
hohe Rate an p53-Mutationen und LOH (Loss of heterozygosity) vom Chromosom 17
aufweisen. Der Verlust von Chromosom 9 ist in einem primären CIS eher selten, aber
in CIS, die gleichzeitig mit anderen Tumoren auftreten, eine häufige Mutation. Durch
diese Ergebnisse kommt der Verdacht auf, dass es zwei verschiedenen Wege gibt
durch die ein CIS entstehen kann. Unterstützt wird diese Aussage, da in nichtmuskelinvasiven Blasenkarzinomen, die mit einem CIS assoziiert auftreten, ein
höheres Risiko der Tumorprogression besteht [71].
FGFR3-Mutationen konnten nicht in CIS oder in Tumoren mit einem begleitenden CIS
gefunden werden. FGFR3 Mutationen kommen in nichtinvasiven, „low grade“ Tumoren
2. Einleitung
Seite | 47
vor, während ein CIS entweder als Primärtumor oder als Begleiter eines
fortschreitenden papillären Tumors auftritt [71].
Weitere häufige Veränderungen des CIS sind LOH von 14q, 8p, 13q, 11p und 4q. Allen
Veränderungen des CIS, die man bis heute kennt, konnte noch keine eindeutige
Funktion zugewiesen werden [71].
2.4.3
Muskelinvasives Urothelkarzinom
Einer der deutlichsten Unterschiede zwischen Ta und T2 Tumoren ist die Häufigkeit mit
der Mutationen in der Rb oder P53 Signalkaskade vorkommen. In mehr als 40% der T2
Tumoren ist P53 inaktiviert, während dies bei den Ta Tumoren kaum der Fall ist. Die
Interpretation von p53-Mutationen gestaltet sich schwierig, da die meisten Mutationen
in der DNA-Bindungsdomäne zu dominant negativen Proteinen führen und einige
Mutationen keinen veränderten Phänotyp nach sich ziehen. Eine Studie von Malats
und Kollegen an 10000 Blasenkarzinomen konnte einen Zusammenhang zwischen
P53-Überexpression und höherem Tumorstadium, sowie schlechterer Prognose finden.
Jedoch
konnte
dies
in
anderen
Studien
nicht
bewiesen
werden.
Andere
Veränderungen, die die Funktion von P53 beeinträchtigen, sind eine Überexpression
von Hdm2, Störungen der INK4A Regulation oder der Verlust von P21 [71].
Auch der Signalweg von Rb ist häufig in muskelinvasiven Blasentumoren verändert, in
Ta Tumoren kommt es nur selten vor. Die Überexpression von Rb ist meistens mit
einem Verlust des Tumorsuppressors P16INK4a assoziiert. Zweifellos sind Störungen
des P53- und Rb-Signalweges die Hauptdeterminanten der Entstehung von
muskelinvasiven Blasenkarzinomen [71].
Eine Deletion im Bereich von 10q konnte häufiger in invasiven als in nichtinvasiven
Karzinomen beobachtet werden. Das zugehörige Protein, PTEN, ist ein negatives
Regulatorprotein des PI3-Kinase Signalweges. LOH des Genes wurde bisher nur in
invasiven Tumoren entdeckt, aber die Bedeutung ist noch nicht geklärt. Auch
Mutationen von PIK3Ca und TSC1 ließen sich in invasiven Tumoren finden, ob diese
drei Veränderungen zusammenhängen oder ob verschiedene Alterationen einen
anderen Phänotyp hervorrufen ist noch nicht klar [71].
Veränderungen der Genorte 6p22, 8p, 8q und des Genes der Rezeptor-Tyrosin-Kinase
ERBB konnten mit invasiven Blasenkarzinomen in Verbindung gebracht werden, aber
es konnte noch keine Aussage über deren Bedeutung und klinisches Potenzial
getroffen werden [71].
2. Einleitung
Seite | 48
2.4.4
T1 Blasenkarzinome
Die Handhabung der Gruppe der T1-Karzinome wird noch immer kontrovers diskutiert,
da weder Herkunft noch molekulares Profil eindeutig geklärt sind. Ob T1 Karzinome
aus Ta-Läsionen im Zuge einer Tumorprogression entstehen oder ob sie sich aus
einem CIS oder einer Dysplasie entwickeln ist aus den bisherigen Studien nicht klar
herausgekommen. Es wurden T1-Tumoren gefunden, die ein eher papilläres
Wachstum aufwiesen, was für ihre Entstehung aus Ta-Tumoren sprechen würde, aber
es gibt auch T1G3 Tumoren, die wegen ihrer genomischen Instabilität und
Veränderungen eher an muskelinvasive Tumoren denken lassen. Natürlich ist es auch
möglich, dass T1-Tumoren eine eigene Tumorgruppe bilden, die sich von Ta- wie auch
von T2-Tumoren unterscheidet [71].
Obwohl in verschiedenen Studien Mutationen im FGFR3-Gen und Veränderungen im
P53-Signalweg gefunden wurden, kann man keine Aussage zwischen Endergebnis
und Mutationsstatus treffen. Alle gefundenen genetischen Störungen von T1 Tumoren
befinden sich zwischen denen von Ta- und T2-Tumoren. Unterschiede zwischen Taund T1-Karzinome sind vor allem Deletionen von 2q, 8p, 11p und Zugewinne von 1q
und 8q [71].
Um Patienten zu identifizieren, die von einer frühen Zystektomie profitieren würden, hat
die Arbeitsgruppe um Richter mittels CGH-Analyse herausgefunden, dass Patienten
mit Zugewinnen der Genloki 3p22-24, 5p und mit Deletionen in 4p11-15, 5q15-23,
6q22-23, 10q24-26 und 18q12-23 ein höheres Progressionsrisiko haben. Die
Alterationen der Genloki 5p+ und 6q werden auch regelmäßig in muskelinvasiven (T24) Tumoren gefunden [207].
Um diese Art von Tumoren besser behandeln zu können ist es essentiell mehr über
ihre Entstehung und ihren Mutationsstatus zu erfahren.
2.4.5
Die
Prognose und Therapie
wesentlichen
prognostischen
Faktoren
für
das
Blasenkarzinom
sind
Infiltrationstiefe und Differenzierungsgrad, wobei zwischen beiden Parametern ein
enger Zusammenhang besteht. Oberflächliche Urothelkarzinome sind in 60% der Fälle
hochdifferenziert, während muskelinvasive Tumoren mäßig bis schlecht differenziert
sind [161].
2. Einleitung
Seite | 49
Eine Tumorgröße von über drei Zentimetern erhöht das Rezidivrisiko um 1,6 mal [161].
Auch der Zeitabstand zwischen Diagnosestellung und Zystektomie, beeinflusst die
Überlebenszeit [94].
2.4.5.1 Low-risk Tumoren
Patienten
mit
oberflächlichen
Ta-Tumoren
entwickeln
unabhängig
vom
Differenzierungsgrad in 0,7% eine Metastasierung. Ist die Lamina propria schon
infiltriert,
erhöht
sich
die
Metastasierungsrate
auf
14-23%.
Bei
„low-risk“
Tumorpatienten (pTaG1-2, pT1G1-2) entwickelt sich die Metastasierung als Folge
einer lokalen Tumorprogression, wobei das Auftreten der Tumorprogression die
Prognose der Patienten, vor allem bei pT1G3-Tumoren, verschlechtert. Auch ein
Tumorrezidiv hat einen gesicherten Einfluss auf das Überleben der Patienten mit
pT1G3-Urothelkarzinomen [90].
Die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit nicht-invasiven Tumoren (Ta G1-3, T1
G1-2) liegt nach Transurethraler Resektion (TUR) zwischen 81 und 96%. Da Patienten
mit Ta-Tumoren nur in 0,7% eine Metastasierung aufweisen, treten zu über 99% in den
ersten fünf Jahren keine Metastasen auf [90].
Alle, als oberflächlich eingestuften Urothelkarzinome, zeigen eine Rezidivrate von 4080%.
Die
Wahrscheinlichkeit
für
eine
Tumorprogression
hängt
vom
Differenzierungsgrad der Tumorzellen ab und liegt bei 5% für TaG1 und 20-50% für
T1G3 Tumoren [87, 117].
Nach der neuen WHO-Klassifikation von 2004 werden Zellen, die hochdifferenziert
sind, sehr langsam wachsen und eine geringe Progressionsrate aufweisen als
PUNLMP bezeichnet. Bei diesen Patienten treten zu 66% innerhalb von fünf Jahren
Rezidive auf [62].
2.4.5.2 High-risk Tumore
Es ist wichtig Ta-Karzinome von muskelinvasiv wachsenden pT2-pT4-Tumoren
abzugrenzen. Obwohl diese Tumoren nur eine geringe Lokalrezidivrate von 7-11%
aufweisen, ist die Tumorprogression für eine schlechte Prognose verantwortlich, auch
wenn eine radikale Zystektomie durchgeführt wurde [91, 129, 88, 137].
Bei muskelinvasiven Tumoren ohne Lymphknoten- oder Fernmetastasen liegt die FünfJahresüberlebensrate der T2-Tumoren nach Zystektomie bei 89%, nach TUR sinkt sie
auf 45-70%. Sind bereits die Lymphknoten betroffen sinkt die 5-Jahres-Überlebensrate
2. Einleitung
Seite | 50
sogar auf 20% und die 10-Jahres-Überlebensrate auf 14,6% ab. Bei T3a Tumoren
lässt
sich
die
gleiche
Tendenz
erkennen.
Ohne
Lymphknotenbefall
oder
Fernmetastasierung sind fünf Jahre nach Zystektomie noch 79% der behandelten
Patienten am Leben und nach TUR nur noch 20-43% [91, 129, 88, 137].
Hat der Tumor schon makroskopisch die Blasenwand überschritten (T3b), liegt die 5Jahres-Überlebensrate trotz Zystektomie nur bei 37% [79]. Wahrscheinlich sind hierfür
Mikrometastasen verantwortlich [80].
Konnte bereits ein T4-Stadium nachgewiesen werden überleben die ersten fünf Jahre
nach Diagnosestellung nur 6-24% der betroffenen Patienten. In diesem Fall kann die
Zystektomie nur noch als palliativ betrachtet werden mit dem Ziel der Verbesserung
des
Allgemeinzustandes,
der
lokalen
Tumorkontrolle
und
der
Verhinderung
tumorbedingter Komplikationen (Blasentamponaden, Blutungen, Beeinträchtigung der
Blasenfunktion,
Infiltration
benachbarter
Organe).
Um
in
fortgeschrittenen
Tumorstadien eine gute Behandlungsstrategie liefern zu können, müssen neben der
Zystektomie auch Radiatio und Chemotherapie miteinbezogen werden [201].
Wie
im
oberen
Abschnitt
erläutert
gewinnen
genetische
Analysen
in
der
Tumorforschung immer mehr an Bedeutung. Besonders wichtig erscheint die
Erforschung von Funktionen, Aufgaben und Regelkreise der Tumorsuppressorproteine.
Daher werde ich mich auf den folgenden Seiten mit den für meine Arbeit am
wichtigsten erscheinenden Genen und deren Produkte auseinander setzen.
2. Einleitung
Seite | 51
2.4.6
Bedeutung der Proteinveränderungen im Rahmen der Tumorgenese
2.4.6.1 Bedeutung von P53
Wie schon beschrieben finden sich Mutationen im p53-Gen oder Alterationen im
Regulationszyklus von P53 in 50% aller malignen Entartungen des Menschen. Es
handelt sich dabei zu 90% um Punktmutationen in den hochkonservierten Domänen
der DNA-Bindungsstelle bei gleichzeitigem Vorliegen einer Deletion des Wildtyp-Allels.
Hierbei zeigen sich bei verschiedenen Tumorarten unterschiedliche Mutationsmuster,
die zum Teil charakteristisch für einzelne Tumorentitäten sind. Diese sogenannten
Mutations-„hot-spots“ finden sich zum Beispiel bei Mutationen im Codon 249 beim,
durch Aflatoxin-B1 induzierten, Leberzellkarzinom oder in den Codons 175, 248 und
273 beim Kolonkarzinom. Neben somatischen Mutationen und den Keimzellmutationen
treten auch andere Mechanismen der Inaktivierung der P53-Proteinwirkung auf. Virale
Proteine wie das E6-Protein (early 6) der humanen Papilloma-Viren 16 und 18 [258,
163], das E1B-55-kD-Protein (early region 1B) des Adenovirus, Typ 5 [213] und das
große T-Antigen (large tumor antigen) des SV40-Papovavirus (simian virus 40) [134,
213] haben spezifische Bindungsstellen im P53-Protein. Die Bindung des E6-Proteins
an die C-terminale Domäne von P53 induziert eine Ubiquitin-abhängige Degradation
des Moleküls [214]. Dagegen führt eine Bindung des E1B-55-kD-Proteins und des
großen
T-Antigens
zu
einer
Stabilisierung
des
P53-Moleküls
wobei
ein
Funktionsverlust durch Blockierung der jeweiligen Domänen erzielt wird [250, 83, 223,
76].
Gut untersucht sind Veränderungen, die zu einer Störung innerhalb des P53Signalweges führen. Dazu zählen die Überexpression von Hdm2, Störungen der
INK4A Regulation und der Verlust der P21-Expression [70].
Mutationen und Störungen im Regelkreis von P53 zählen zu den häufigsten
Mechanismen, um die Aktivität von P53 zu mindern. Auch hat man festgestellt, dass
eine Mislokalisation von P53 in der Zelle ebenfalls die Tumorsuppressoraktivität von
P53 schwächt [143]. Zum Beispiel ist im Brustkrebs Importin-α defekt, was den
nukleären Import von P53 blockiert und P53 seinen Aktivitäten als Tumorsuppressor
nicht nachkommen kann [17].
In
wie
weit
die
Lokalisation
von
P53
Einfluss
auf
die
Entstehung
des
Harnblasenkarzinoms hat, konnte bisher noch nicht geklärt werden.
2. Einleitung
Seite | 52
2.4.6.2 Bedeutung von Hdm2
Hdm2 ist in der Lage die Karzinogenese durch drei verschiedene Mechanismen zu
beeinflussen: Genamplifikation, gesteigerte Transkription und erweiterte Translation.
Während man unter Amplifikation die gezielte Vermehrung von DNA-Abschnitten
versteht,
ist
im
Gegensatz
dazu
eine
Überexpression
eine
gesteigerte
Proteinproduktion, die nicht zwingend mit einer Amplifikation einhergehen muss.
Wegen der tragenden Rolle von Hdm2 bei der P53-Regulation hat jegliche gesteigerte
Hdm2-Aktivitiät das Potenzial die Tumorigenese positiv zu beeinflussen. Betrachtet
man den damit verbundenen Einfluss auf den Zellzyklus ist diese Auswirkung leicht
nachvollziehbar. Doch kann je nach Tumorart die Überexpression von Hdm2 mit einer
positiven, als auch mit einer negativen Prognose verbunden sein und ist nicht
zwingend mit einem schlechteren Krankheitsverlauf vergesellschaftet [4].
Mdm2 und Mdmx stellen potentielle Ziele in der Krebsbehandlung dar. Kleine
molekulare Antagonisten von Mdm2 können die Interaktion zwischen P53 und Mdm2
aufheben und so P53 stabilisieren und aktivieren. Zum Beispiel kann Nutilin-3a mit
hoher Affinität an die N-terminale Domäne von Mdm2 binden und dadurch die
Verbindung mit P53 verhindern. Diese Art der Behandlung wird noch in humanen
Karzinomen erforscht [186].
2.4.6.3 Bedeutung von P14ARF
Die Häufigkeit, in der P53 oder sein Regulationsweg in Tumoren beeinträchtigt ist, lässt
darauf schließen, dass ein intakter Signalweg nicht mit Tumorwachstum kompatibel ist.
Therapien, die die Wiederherstellung des Signalweges zum Ziel haben, bieten eine
tumorspezifische
Therapie
mit
wenig
toxischen
Nebenwirkungen.
Diese
Therapieansätze ermöglichen eine Langzeitkontrolle des Tumors oder sogar eine
Heilung. In China wird zur Zeit solch eine Therapie für Kopf- und Nackentumoren
getestet [187].
Nachdem in Tumorzellen eine erhöhte Komplexbildung zwischen B23 und P14ARF
gemessen wurde, die die Bindung von P14ARF und Hdm2 verhindert, wurden
Überlegungen angestellt, wie diese Komplexe unterbrochen werden können. Es wurde
festgestellt, dass eine p53-Gentherapie erfolgversprechender ist, wenn sie mit
konventionellen Therapien oder Bestrahlung kombiniert wird, da diese nukleoläre
Komplexe spalten können. Ein besseres Verständnis der Aktivität und der
Bindungspartner von P14ARF, besonders im Hinblick auf die zelluläre Stressantwort,
wird noch bessere Therapiemöglichkeiten ans Licht bringen [67].
2. Einleitung
Seite | 53
2.4.6.4 Bedeutung von P16INK4a
Der Verlust von aktiven P16INK4a ist ein frühes und oft vorkommendes Ereignis in
Tumorzellen.
Obwohl
viele
Tumorsuppressorgene
hauptsächlich
durch
INK4a
Punktmutationen inaktiviert werden, überwiegen bei der p16
-Inaktivierung kleine
INK4a
homozygote Deletionen (<200 kb) oder Hypermethylierungen des p16
-Promoter.
INK4a
Eine Methylierung der 5' CpG-Insel kann mit einem Transkriptionsblock des p16
-
Gens in verschiedenen Primärtumoren in Zusammenhang gebracht werden.
Hervorzuheben sind Kopf-, Nacken-, Lungen-, Gehirn-, Colon-, Ösophagus- und
Blasentumoren [200]. In Familien mit Prädispositionen zu Melanomen oder PankreasAdenokarzinomen konnten Keimbahnmutationen im p16INK4a-Gen gefunden werden
[200, 98].
Zu den verschiedenen Mechanismen der Inaktivierungen des p16INK4a-Gen siehe
Tabelle 2-4.
homozygote
Deletion
Mutation
Methylierung
Tumor Art
%
Range
%
Range
%
Range
Total
Pancreas
30
3-49
32
17-38
13
-
75
Ösophagus
22
16-52
14
0-52
35
19-50
71
Kopf und Nacken
27
2-55
11
1-45
30
3-47
68
Gliom
33
21-67
4
0-14
29
14-42
66
Hypophyse
6
0-12
0
-
59
51-83
65
Leukämie
25
4-76
2
0-7
34
2-75
61
Harnblase
32
10-66
4
0-7
23
11-67
59
NSCLC
20
8-83
14
4-70
24
21-32
58
Mesotheliom
56
22-72
0
-
ND
-
56
Magen
4
0-9
1
0-2
39
32-42
44
Lymphom
12
3-50
2
0-7
19
0-61
33
Mamma
7
0-10
4
3-5
20
17-20
31
Colon
0
0
ND
-
27
10-53
27
Melanom
14
6-25
7
0-26
5
0-10
26
Ovarien
6
0-14
4
0-11
15
0-17
25
SCLC
3
0-5
12
0-40
ND
-
15
Prostata
4
0-20
3
0-6
7
0-13
14
Sarcom
8
5-25
1
0-2
46
-
9
Nierenzellen
8
2-16
ND
-
ND
-
8
INK4a
Tabelle 2-4: Häufigkeit der P16
-Inaktivierung in Primärtumoren in Abhängigkeit des
Mechanismus (ND = „not done“, NSCLC = „ Non-small-cell lung cancer“, SCLC = „ small cell
lung cancer“) [200]
2. Einleitung
Seite | 54
Die meisten dieser genetischen oder epigenetischen Veränderungen resultieren in
einer verminderten oder fehlenden P16
INK4a
-Proteinexpression [180, 193]. Diese Zellen
sind resistent gegen DNA-Schäden, die bei gesunden Zellen mit intaktem P16
INK4a
und
Rb-Protein zum Wachstumsarrest führen [220].
2.4.6.5 Bedeutung von P63
P63
ist
kein
Tumorsuppressor.
Die
Untersuchungen
von
Patienten
mit
Keimbahnmutationen des p63-Gens wiesen keine mutierten Proteine auf, sondern eine
Hochregulation der dominant-negativen Formen von P63. In einer Studie mit 47
Blasenkarzinomen wurde keine einzige P63-Mutante gefunden. P63 wird in
Plattenepithelzellen, Cervix- und Prostatatumoren regelmäßig exprimiert. Es ist
interessant, dass in Plattenepitheltumoren ΔNP63 die am häufigsten gefundene
Isoform
darstellt
und
diese
eine
dominant-negative
Wirkung
ausübt.
Eine
Untersuchung an 25 primären Nasopharynxkarzinomen zeigt eine Überexpression von
ΔNP63-Isoformen,
Suprabasalzellen
die
normalerweise
vorkommt
[36].
nur
Diese
in
proliferierenden
Beobachtung
konnte
Basalauch
und
in
Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus gemacht werden [33, 95]. Da ΔNP63Isoformen in Plattenepithelkarzinomen erhalten bleiben, können die Zellen in einer Art
stammzellartigem Dasein gehalten werden und so zum Tumorwachstum beitragen.
In der Prostata bildet P63 einen verlässlichen Marker für Basalzellen und ist in
Basalzellhyperaplasien positiv, jedoch in prostatischen Adenokarzinomen negativ.
Diese Information könnte in der Klinik für die Diffenzialdiagnostik eingesetzt werden
[256].
Eine Hochregulation von ΔNP63 wurde in einer Studie in 30 von 47 Blasentumoren
gefunden, während gleichzeitig TAP63 in 25 von diesen 47 Tumoren herunterreguliert
war. Betrachtet man dieses Phänomen genauer, fällt auf, dass in 93% von „low-grade“
papillären Tumoren P63 exprimiert wurde, während die P63-Expression auf 68% in
mittleren und hochgradigen Tumoren sinkt. Kam es zu einem Tumorprogess von
oberflächlichen zu invasiven Tumoren, dann wurde nur noch in 16% eine P63Expression gefunden. Daraus folgt die Annahme, dass der Verlust von P63 im
Übergangsgewebe zu einer Tumorprogression führt und mit höherem Tumorgrad und
schlechterer Zelldifferenzierung in Zusammenhang steht [124, 248].
2. Einleitung
Seite | 55
3
Tissue Microarray
Um möglichst viele Gewebeproben in möglichst kurzer Zeit auf eine große Anzahl von
molekularen Markern hin zu untersuchen, bedient man sich der Erstellung eines Tissue
microarray (TMA) (siehe Abbildung 3-1). Die Technik wurde 1986 von Battifora et al.
zum ersten Mal vorgestellt und von Kononen und Mitarbeitern modifiziert [12, 239,
126]. TMAs haben mittlerweile einen festen Platz in der onkologischen Forschung und
ermöglichen die gezielte Prüfung der klinischen oder prognostisch relevanter einzelner
Gene und/oder ihrer Produkte. Diese Untersuchungen helfen auf der einen Seite neue
Erkenntnisse zu Tumorentstehung und dem Krankheitsverlauf zu gewinnen, aber auf
der anderen Seite helfen sie auch neue Therapien zu entwickeln. Es ermöglicht
Angaben über das Ansprechen einzelner Tumorentitäten auf ein Therapieverfahren
[239].
Abbildung 3-1: TMA
Durch die Microarrays hat man nicht nur einen Geschwindigkeitsgewinn, sondern sie
erlauben
auch
eine
bisher
noch
nicht
dagewesene
Standardisierung
von
Versuchsabläufen. Alle Biopsien, die in einem TMA zusammengefasst werden, können
bei einem Untersuchungsvorgang mit einem identischen Set Reagenzien bei
einheitlichen Temperaturen und mit der gleichen Inkubationszeit bearbeitet werden.
Die am häufigsten durchgeführte Methode am TMA ist die Immunhistochemie, mit der
die Visualisierung bestimmter Proteine und ihre Lokalisation erforscht werden kann
[78]. Doch stellt sich die Frage in wie weit das ausgestanzte Gewebe für die
Gesamtheit
des
Tumors
repräsentativ
ist
und
ob
eine
subzelluläre
Kompartimentalisation der Proteine darstellbar ist.
3.Tissue Mikroarray
Seite | 56
4
Zielsetzung der Arbeit
Es gibt unzählige Studien zur Untersuchung molekularer Marker im invasiven
Harnblasenkarzinom und viele konnten einen Zusammenhang zwischen der
Proteinexpression von P53, P63, Hdm2, P14ARF und P16INK4a und klinischer Prognose
finden. Viele Studien waren durch das geringe Patientenkollektiv, fehlende einheitliche
Untersuchungsprotokolle und Definitionen in ihrer Aussagekraft eingeschränkt und eine
Vergleichbarkeit nur unzureichend möglich. Um diesem Problem Rechnung zu tragen
hat das „International Bladder Cancer Network“ (IBCN) im Rahmen eines SPOREProgramms am MD Anderson Cancer Center (Houston, Texas, USA) ein Konsortium
gegründet, mit dem Ziel ein Kollektiv aus 600 Patienten mit muskelinvasiven
Harnblasenkarzinom zu erstellen, die einer Zystektomie zugeführt wurden. Aus den
Untersuchungen des Materials und den dazugehörigen Verlaufsparametern erhofft
man sich genauere Aussagen zu Prognose und Therapie der Blasentumorpatienten
treffen zu können, um die Patienten heraus zu filtern, die von einer aggressiveren
Therapie profitieren können [59].
Die umfangreichen Daten zur Rolle der Zellzyklusproteine P53, Hdm2, P14ARF, P16INK4a
und P63 scheinen geeignet, immunhistochemische Befunde am TMA zu den
Proteinexpressionen und die daraus abgeleiteten Phänotypen als Referenz zu
benutzten, um eine Validierung der Befunde, die auf einem digitaisierten TMA
gewonnen werden, vorzunehmen. Zentral sind hier zusammengefasst die folgenden
Fragen von Bedeutung:
-
Lassen sich Expressionsmuster der Zellzyklusproteine P53, Hdm2, P14ARF,
P16INK4a und P63 im invasiven Harnblasenkarzinom an TMAs wiederfinden?
-
Entsprechen die gefundenen Expressionsmuster den Daten der Literatur
(Validierung TMA)?
-
Sind die entnommenen TMA-Proben repräsentativ für die dazugehörigen
Tumoren?
-
Eigenen sich digitale Medien um auch in der experimentellen Forschung
Ergebnisse transparent darzustellen und durch die Telemedizin eine kosten- und
zeitsparende Methode zu etablieren, um in großen Konsortien Gewebeproben
gemeinsam zu untersuchen ?
4. Zielsetzung der Arbeit
Seite | 57
5
Material und Methoden
5.1
5.1.1
Material
Antikörper
Antikörper
Hersteller
Maus anti human P53 monoklonal, IgG2b
DakoCytomation
Klon DO-7, Ch.-B 00050255, Blockpuffer 1:10
Glostrup (Dänemark)
Maus anti human P63 monoclonal, IgG2a
DakoCytomation
Klon 4A4, Ch.-B 00050990, Blockpuffer 1:10
Glostrup (Dänemark)
Maus anti human P14
ARF
monoclonal, IgG2a
Klon 4C6/4, Ch.-B 2, Blockpuffer 1:100
Maus anti human P16
INK4a
, monoclonal
CINtec Histologie KIT, Ch.-B 5.093601
Maus anti human P16
INK4a
monoclonal, IgG2a
Cell Signaling,
Danvers (USA)
mtm laboratories,
Heidelberg (Deutschland)
Santa Cruz Biotechnology,
Klon JC8, Ch.-B K1510, Blockpuffer 1:100
Santa Cruz (USA)
Maus anti human murine double minute 2, monoclonal
Merck,
Klon IF2, Ch.-B D00057629, Blockpuffer 1:10
Nottingham (UK)
Ziege anti Maus IgG Biotin konjugiert
Jackson ImmunoResearch,
Ch.-B 77099, Blockpuffer 1:500
Suffolk (UK)
Tabelle 5-1: Antikörper
5. Material und Methoden
Seite | 58
5.1.2
Chemikalien
Chemikalien
Hersteller
ABC-KIT, Vectastain ABC KIT, Standard
Vector Laboratories, Burlingame (Kanada)
Ethanol
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
fötales Kälberserum (FKS)
PAN-Biotech GmbH, Aidenbach (Deutschland)
Hämalaunlösung nach Mayer
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
HCl
Fluka, St.Louis (USA)
Immersionsöl, Immersol 518 F
Zeiss,Oberkochen (Deutschland)
Natriumchlorid
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
P16-KIT, CINtec Histology, Ch.-B 5.092601
mtm-Laboratories, Heidelberg (Deutschland)
Target Retrieval Solution pH6 (TRS6)
DakoCytomation, Glostrup (Dänemark)
Target Retrieval Solution pH9 (TRS9)
DakoCytomation, Glostrup (Dänemark)
Trishydroxymethylaminomethan
Fluka,St.Louis (USA)
Tween-20
AppliChem GmbH, Darmstadt (Deutschland)
Wasserstoffperoxyd 30%
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
Wässriges Eindeckmedium (Aquatex)
Merck KGaA, Darmstadt (Deutschland)
Xylenisomere
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
Tabelle 5-2: Chemikalien
5.1.3
Geräte
Geräte
Hersteller
Coverplate Assemblies
PLANO GmbH,Wetzlar (Deutschland)
Färbeautomat BenchMark ULTRA
Ventana Medical Systems, Tucson (USA)
Deckgläser 24 x 60 mm
Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig (Deutschland)
Kameras: Cool Cube1
Metasystem,Regio Emilia (Italien)
AxioCam MRc
Zeiss,Oberkochen (Deutschland)
Kocher Pascal
DakoCytomation, Glostrup (Dänemark)
Kühlschrank Santo
AEG,Frankfurt am Main (Deutschland)
Küvetten
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
Magnetrührer RCT basic
IKA,Staufen (Deutschland)
Mikroskope: Primo Star
Zeiss,Oberkochen (Deutschland)
Axio Scope.A1
Zeiss,Oberkochen (Deutschland)
Imager A2
Zeiss,Oberkochen (Deutschland)
Mikrozentrifuge IR, 22VAC
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
Objektträger Superfrost
Carl Roth GmbH + Co. KG,Karlsruhe (Deutschland)
pH-Meter SB70P SympHony
VWR International GmbH, Darmstadt (Deutschland)
Schüttelwasserbad 1083
GFL, Burgwedel (Deutschland)
Sequenza Slide Rack
PLANO GmbH,Wetzlar (Deutschland)
Pipetten
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen (Deutschland)
Vortex Genie 2
Scientific-Industries,Bohemia (USA)
Waage ALJ 220-4NM
KERN & Sohn,Balingen (Deutschland)
Wärmeschrank ST 5042
Heraeus,Hanau (Deutschland)
Tabelle 5-3: Geräte
5. Material und Methoden
Seite | 59
5.1.4
Lösungen und Puffer
Alle Puffer wurden, wenn im folgenden Text nicht extra beschrieben, nach publizierten
Standardprotokollen hergestellt.
Lösungen und Puffer
10X Tris Buffered Saline (TBS), pH 7,6
Inhaltsstoffe
24,2 g Trizma Base (C4H11NO3)
80 g NaCl
1l dH2O
HCl bis pH 7,6
1X TBS/0,1% Tween-20
100 ml 10X TBS
900ml dH2O
1 ml Tween-20
TBS, pH 7,4
6,5 g Trizma Base
9 g NaCl
1 l dH2O
HCl bis pH 7,4
Tabelle 5-4: Lösungen und Puffer
5. Material und Methoden
Seite | 60
5.2 Methoden
5.2.1
Tissue Microarray
Es wurden zylinderförmige Biopsien (Durchmesser 0,6mm, Höhe 3-4mm) von 609
betroffenen
Geweben
entnommen
und
formalinfixiert
in
einen
Paraffinblock
eingebracht. Von diesem Block wurden dann mit speziellen Geräten (Beecher
Instruments) erneut Proben entnommen und in einen anderen Parraffinblock eingefügt
(Vergleiche Abbildung 4-1). Von jedem Parraffinblock können bis zu 200 Schnitte mit 45μm Dicke gewonnen und auf einen Objektträger fixiert werden [239]. Dieses Gewebe
wurde, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben, mit immunhistochemischen
Färbemethoden auf verschiedene Proteinexpressionen hin untersucht.
Abbildung 5-1: Tissue Microarray Herstellung [255]
5.2.2
Immunhistochemische Färbungen
5.2.2.1 Die ABC-Methode
Die Basis der Avidin-Biotin-Komplex-Methode ist die hohe Affinität des Glykoproteins
Avidin zu Vitamin H. Diese Verbindung ist um eine Millionen Mal stärker als die der
meisten Antigen-Antikörperverbindungen und damit irreversibel. Eine entscheidende
Rolle spielt auch der Nachweis des Enzyms Peroxidase. Da Peroxidase auch
physiologisch in einigen Zellen des Körpers vorkommt, wie z.B. in Erythrozyten und
Granulozyten, muss zu Beginn der Färbung diese endogene Peroxidase, mit z.B.
5. Material und Methoden
Seite | 61
Wasserstoff-Peroxyd, blockiert werden. Die verwendeten Primärantikörper binden
spezifisch an die Antigene des verwendeten menschlichen Materials.
Im nächsten Schritt wird ein mit Biotin markierter Sekundärantikörper hinzugegeben,
der wiederum spezifisch an den Primärantikörper bindet. Biotinylierte MeerrettichPeroxidase (HRP) und Avidin werden in einem vom Hersteller angegebenen Verhältnis
gemischt. Es entsteht ein dreidimensionaler Komplex, in dem Avidin als Brücke
zwischen den biotinylierten Peroxidasemolekülen fungiert (Siehe dazu Abbildung 5-2).
Der entstandene Gitterkomplex ist in der Lage an den Sekundärantikörper zu binden
und kann mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) sichtbar gemacht werden. DAB wird durch
die HRP oxidiert und bildet ein unlösliches braunes Präzipitat, das im normalen Licht
detektiert werden kann und nicht ausbleicht. Endogene Antikörper sowie unspezifische,
endogene Antigene werden durch fötales Kälberserum (FKS) blockiert um eine
unspezifische Hintergrundfärbung zu vermeiden.
Die ABC-Methode wird wegen der einfachen Durchführbarkeit und der geringen
Hintergrundfärbung gerne verwendet.
Antigen
Primärantikörper
Biotinylierter
Sekundärantikörper
BiotinAvidinPeroxidasekomplex
Abbildung 5-2: ABC-Methode
5.2.2.2 Der P16-KIT
Mit dem Kit kann man ein immunhistochemisches Zweischritt-Färbeverfahren an
formalinfixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeproben durchführen.
Da auch bei diesem Färbeverfahren dem Enzym Peroxidase eine Schlüsselrolle
zukommt, muss die physiologisch vorkommende Peroxidase zuerst mit z.B.
5. Material und Methoden
Seite | 62
Wasserstoff-Peroxyd, blockiert werden. Zum Nachweis des P16INK4a-Antigens wird ein
monoklonaler Maus-Antikörper, der spezifisch gegen das humane P16INK4a Protein
reagiert, verwendet. Die nach dem Primärantikörper verwendete, gebrauchsfertige
Visualisierungsreagenz, ist eine Polymer-Reagenz konjugiert mit affinitätsgereinigten
Ziege-Anti-Maus-Antikörperfragmenten
und
Meerrettich-Peroxidase
(HRP).
Eine
Kreuzreaktivität der Visualisierungsreagenz mit humanen Immunglobulinen wurde
durch Festphasen-Absorption ausgeschlossen. Auch bei dieser Färbung wird das
Antigen durch 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) sichtbar gemacht. Die Chromogen-Reaktion
basiert auf der HRP vermittelten Oxidation eines DAB-Chromogens. An denjenigen
Stellen, an denen sich das Antigen befindet, kommt es zu einer braunen Ausfällung
des DAB-Chromogens.
5.2.3
Durchführung der Immunhistochemischen Färbungen
Bevor mit dem Prozess des Färbens begonnen wurde, mussten die verwendeten
Proben deparaffiniert und rehydriert werden. Dazu kamen sie für eine Stunde bei 60°C
in den Wärmeschrank. Anschließend musste die Xylenisomere/Ethanol-Reihe
durchlaufen werden. Die Proben wurden für insgesamt 30 Minuten in fünf verschiedene
Gefäße mit 100%igen Xylol getaucht. Danach für je zwei Minuten in drei Küvetten mit
100%igen Ethanol, in drei Küvetten mit 96%igen Ethanol und in eine Küvette mit
70%igen Ethanol inkubiert. Erst nach dieser Behandlung konnten die Proben weiter
bearbeitet werden.
5.2.3.1 Durchführung der ABC-Methode
Damit das Antigen frei liegt und für die Antikörper besser zugänglich ist, wurden die
Proben im Kochpuffer für eine Minute bei 120°C gekocht. Für die Färbungen der
Antigene Hdm2 und P14ARF wurde TRS9 als Kochpuffer verwendet, bei P53 und P63
TRS6. Nach dem Kochen wurden die Proben mit destilliertem Wasser (dH2O) für 15
Minuten gewaschen. Um die endogene Peroxidase zu blockieren wurden die Proben
für zehn Minuten in 3%igen Wasserstoff-Peroxyd inkubiert und anschließend noch
einmal für zehn Minuten mit dH2O abgespült.
Mit Hilfe des Waschpuffers wurden die Objektträger auf Coverplates aufgezogen und
in den Slide Rack eingebracht. Der Slide Rack stellt eine feuchte Kammer dar, in der
zehn Objektträger gleichzeitig und gleichmäßig gefärbt werden können. Nach einem
erneuten fünfminütigen Waschvorgang mit Waschpuffer wurden die Proben für eine
Stunde bei Raumtemperatur mit 5%igen FKS geblockt und nach Ablauf der Zeit erneut
5. Material und Methoden
Seite | 63
mit Waschpuffer für zehn Minuten gewaschen. Die Primärantikörper wurden vor der
Applikation in den oben genannten Verhältnissen mit Blockpuffer (FKS) verdünnt, um
dann über Nacht bei 4°C einzuwirken. Nachdem die Objektträger für 15 Minuten
abgespült wurden, wurde der biotinylierte Sekundärantikörper im oben genannten
Verhältnis verdünnt und auf den Objektträgern für 30 Minuten bei Raumtemperatur
belassen.
Während
der
Einwirkzeit
wurde
das
ABC-Reagens
gemäß
den
Herstellerangaben vorbereitet. Nach 15 Minuten Waschen mit dem Waschpuffer
wurden die Proben für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem ABC-Reagens
inkubiert und der Waschvorgang, nach Ablauf der Zeit, wiederholt. Die Objektträger
wurden dann vorsichtig aus dem Slide Rack entfernt und liegend in einer weiteren
feuchten Kammer für 20 Minuten mit dem DAB-Chromogen aus dem P16-Kit inkubiert.
Die Proben wurden anschließend mit dH2O gespült. Die Gegenfärbung mit Hämalaun
erfolgte, indem das Hämalaun für maximal zwei Minuten auf den Proben belassen
wurde. Nach der Gegenfärbung wurden die Objektträger in einer Küvette unter
fließendes Wasser gestellt. Das Eindecken erfolgte mit einem, auf wässriger Basis
bestehenden, Eindeckmedium. Als Positivkontrolle wurden bei der Hdm2-Färbung
Glioblastome, bei der P14ARF-Färbung Mamma-Karzinome und bei der P63- und P53Färbung
Tonsillengewebe,
verwendet.
Die
Negativkontrolle
erfolgte
ohne
Primärantikörper.
5.2.3.2 Durchführung des P16-KIT
Das Kochen der Objektträger erfolgt bei dem P16-Kit analog dem der ABC-Methode,
nur wird die im Kit enthaltene 10x Epitope Retrieval Solution 1:10 mit deionisierten
Wasser verdünnt und als Kochpuffer verwendet. Nach dem Kochen wurden die Proben
mit Tris-Puffer gewaschen und in einer feuchten Kammer für fünf Minuten mit dem
Peroxidase-Blocking-Reagens
inkubiert.
Anschließend
folgte
ein
erneuter
Waschvorgang mit Tris-Puffer. Der Primärantikörper ist in einer bestimmten
Verdünnung im Kit enthalten und musste für 30 Minuten auf die Proben einwirken.
Bevor das Visualisierungsreagens aufgetragen wurde, wurde der Objektträger mit
Polyalkylenglykolether (Brij®) gespült. Das Visualisierungsreagens konnte nach 30
Minuten mit Tris abgewaschen werden. Während der Einwirkdauer wurde das DABChromogen mit dem DAB-Puffer in einem Verhältnis von 1:50 gemischt und konnte
jetzt für 20 Minuten auf den Objektträger aufgebracht werden. Die Gegenfärbung
erfolgte Analog der ABC-Methode. Die Negativkontrolle erfolgte ohne Primärantikörper.
5. Material und Methoden
Seite | 64
6
6.1
Ergebnisse
Immunhistochemische Auswertung der gefärbten Tumorproben
Grundlegend besteht ein Problem bei der Bestimmung von Schwellenwerten für
biologische Marker. Unter den zahlreichen Publikationen zu diesem Thema, hat sich
hinsichtlich der P53-Akkumulation und deren immunhistochemischen Nachweises vor
allem die Arbeitsgruppe von Keegan und Kollegen sehr verdient gemacht [120]. Sie
konnten zeigen, dass eine reine Dichotomisierung der Variablen bei den Auswertungen
zu einer Verfälschung der Aussagekraft führen kann. Da die meisten Marker ein
biologisches Kontinuum beschreiben, lässt sich eben kein eindeutiger Wert festlegen,
der ein Patientenkollektiv in eine Gruppe mit besserer und eine Gruppe mit
schlechterer Prognose trennt, ohne Gefahr zu laufen wesentliche Aspekte der Biologie
dieser Tumore nur unvollständig abzubilden.
Um dieser wichtigen Arbeit und ihrer zentralen Aussagen Rechnung zu tragen wurde,
im Rahmen der Auswertung der immunhistochemischen Färbungen, sowohl nach
Lokalisation der gefärbten Proteine, als auch nach Intensität der Färbung
unterschieden. So konnte einerseits zwischen zytoplasmatischen, nukleären und
nukleolären Vorkommen unterschieden werden. Zum anderen wurden die Proben nach
Kategorien wie negativ, ein-, zwei- und dreifach positiv, voneinander abgegrenzt. Dies
ermöglicht eine exaktere statistische Auswertung, wie sie beispielsweise für die
Mustererkennung von Proteinkorrelationen in Kapitel 6.2 beschrieben sind. Als positiv
werden hierbei Proben mit einer gefärbten Tumorkernzahl von über 10% oder mit einer
Zytoplasmafärbung bei über 10% der Tumorzellen gewertet.
Insgesamt wurden in den über 550 muskelinvasiven Harnblasenkarzinomen, wie zu
erwarten, in einem hohen Prozentsatz (67,2%), mittels immunhistochemischen
Nachweis, eine Akkumulation von P53, nach den oben genannten Kriterien,
festgestellt. Weiterhin sind für die P63-Expression 67,5%, für den P14ARF-Nachweis
97,9%, für P16INK4a 45,4% und für die Hdm2-Überexpression 58,1% der Tumorproben
als positiv eingestuft worden, wie die nachfolgende Abbildung 6-1 veranschaulicht.
6. Ergebnisse
Seite | 65
100,0%
90,0%
Verteilung in Prozent
80,0%
70,0%
60,0%
-
50,0%
+
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
P63
P53
P14ARF
Hdm2
P16INK4a
Abbildung 6-1: Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Proben
Einen Überblick zur jeweiligen Lokalisation des positiven immunhistochemischen
Nachweises der einzelnen Proteine liefern Tabelle 6-1 und Abbildung 6-2. Hierbei
zeigte sich, dass isoliert im Nukleus lokalisiert in 67,2% des P53-, 5,5% des Hdm2-,
97,9%
des
P14ARF-,
0,8%
des
P16INK4a-
und
66,7%
des
P63-positiven
immunhistochemischen Nachweises vorkamen.
Eine spezifische isolierte Positivität innerhalb des Zytoplasmas fand sich in 3,0% der
P16INK4a- und in 35,7% der Hdm2-positiven immunhistochemischen Nachweise. Eine
Kolokalisation, die sich als Positivität sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma
darstellt, konnte in 41,6% der P16INK4a- und 16,9% der Hdm2-positiven Proben
gefunden werden.
Diese Ergebnisse waren erwartet und stehen im Einklang mit dem aktuellen Stand der
Literatur. Dieser postuliert einen Regulationszyklus zwischen den Proteinen Hdm2,
P14ARF und P53, auf deren Korrelation in Kapitel 6.2.2 genauer eingegangen wird.
6. Ergebnisse
Seite | 66
Negativ
Anzahl
Nukleus
Prozent
Anzahl
Zytoplasma
Prozent
Anzahl
Kolokalisiert
Prozent
Anzahl
Prozent
P53
179
32,8
367
67,2
0
0,0
0
0,0
Hdm2
228
41,9
30
5,5
194
35,7
92
16,9
ARF
11
2,1
503
97,9
0
0,0
0
0,0
202
54,6
3
0,8
11
3,0
154
41,6
177
32,2
367
66,7
0
0,0
0
0,0
P14
P16
INK4a
P63
Tabelle 6-1: Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Tumorproben nach der
Lokalisation
100,0%
90,0%
Verteilung in Prozent
80,0%
70,0%
Negativ
60,0%
Nukleus
50,0%
Zytoplasma
40,0%
Kolokalisiert
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
P53
Hdm2
P14ARF
P16INK4a
P63
Abbildung 6-2: Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Tumorproben nach der
Lokalisation
6.1.1
P53-Färbung
32,8% der Tumorproben zeigten keinen Nachweis einer P53-Akkumulation im Zellkern.
Als einfach positiv wurden 25,8% gewertet, als zweifach positiv 22,2% und als dreifach
positiv 19,2%. Eine zytoplasmatisch-positive Färbung wurde als unspezifisch
betrachtet und nicht in die Auswertungen miteinbezogen. Aus den Daten, die in den
nachfolgenden Tabellen und Abbildungen zusammengefasst sind, wird erkennbar,
dass in den ausgewerteten invasiven Blasenkarzinomen eine dreifache Positivität der
6. Ergebnisse
Seite | 67
Zellkerne am seltensten auftrat, während die einfach positiven am häufigsten
vorgekommen sind.
P53
Anzahl
Prozent
-
179
32,8
+
141
25,8
++
121
22,2
+++
105
19,2
Gesamt
546
100,0
Tabelle 6-2: Auswertung der immunhistochemischen P53-Färbung
35,0%
Verteilung in Prozent
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
P53 -
P53 +
P53 ++
P53 +++
Abbildung 6-3: Graphische Darstellung der immunhistochemischen P53-Färbung
Die Grenze zur Bewertung einer Färbung als positiv wurde von manchen
Wissenschaftlern nicht, wie in der vorliegenden Arbeit bei 10% der angefärbten Zellen
pro Gesichtsfeld, sondern oft bei 20% oder noch höheren Werten festgelegt. Um die
Ergebnisse trotzdem vergleichbar zu machen, wurde die P53-Bewertung nicht nur in
negativ, einfach-, zweifach- und dreifach-positiv eingeteilt, sondern es wurden auch
Berechnungen mit negativen- und einfach-positiven Proben (58,6%) auf der eine Seite,
sowie zwei- und dreifach-positiven (41,4%) auf der anderen Seite ausgearbeitet.
6. Ergebnisse
Seite | 68
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6-3 zusammengefasst.
Anzahl
P53
Prozent
-,+
320
58,6
++,+++
226
41,4
Gesamt
546
100,0
Tabelle 6-3: Auswertung der immunhistochemischen P53-Färbung mit anderer Aufteilung
In den Abbildungen 6-4 und 6-5 sind die charakteristischen nukleären P53Akkumulationen abgebildet.
Abbildung 6-4: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P53-Akkumulation mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper in 10facher Vergrößerung
6. Ergebnisse
Seite | 69
Abbildung 6-5: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P53-Akkumulation mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper in 60facher Vergrößerung
6.1.2
Hdm2-Färbung
Auch der immunhistochemische Nachweis einer Hdm2-Überexpression wurde unter
Berücksichtigung der Ergebnisse von Keegan et al. als Kontinuum betrachtet und nach
mehreren Abstufungen ausgewertet. Da die vorliegende Arbeit unter anderem die
Verteilung des Hdm2-Proteins in der Zelle untersucht, wurden neben der nukleären
Färbung
auch
die
zytoplasmatisch-gefärbten
Proben
in
den
Auswertungen
berücksichtigt. Die folgende Tabelle beschreibt die Korrelation der Lokalisationen eines
positiven immunhistochemischen Nachweises von Hdm2. Dabei wird ersichtlich, dass
mit einer Häufigkeit von insgesamt 52,8% eine zytoplasmatische und mit 22,4% eine
nukleäre Lokalisation nachzuweisen war. Die zytoplasmatische Färbung von Hdm2
herrschte damit vor. Dieser Expressions-Unterschied zwischen den beiden Gruppen
war signifikant (p≤0,05 und C=0,29).
Hdm2 K
-
Hdm2 Z
+
Prozent
Anzahl
+++
Anzahl
Prozent
-
228
41,9
20
3,7
10
1,8
0
0,0
+
131
24,1
34
6,3
18
3,3
3
0,6
++
58
10,7
12
2,2
18
3,3
3
0,6
+++
5
0,9
1
0,2
3
0,6
0
0,0
422
77,6
67
12,3
49
9,0
6
1,1
Gesamt
Anzahl
++
Prozent
Anzahl
Prozent
Tabelle 6-4: Auswertung der immunhistochemischen Hdm2-Färbung nach Lokalisation
6. Ergebnisse
Seite | 70
Die typischen zytoplasmatischen und nukleären positiven immunhistochemischen
Nachweise für eine Hdm2-Überexpression sind in den folgenden Abbildungen
dargestellt.
Abbildung 6-6: Zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis der Hdm2-Färbung mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper in 10facher Vergrößerung
Abbildung 6-7: Zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis der Hdm2-Färbung mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper in 60facher Vergrößerung
6. Ergebnisse
Seite | 71
Abbildung 6-8: Zytoplasmatischer und nukleärer immunhistochemischer Nachweis der Hdm2Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 10facher Vergrößerung
Abbildung 6-9: Zytoplasmatischer und nukleärer immunhistochemischer Nachweis der Hdm2Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 60facher Vergrößerung
6.1.3
P14ARF-Färbung
Insgesamt waren in diesem Kollektiv nur 2,1% der p14ARF-gefärbten Proben als negativ
einzustufen. In Analogie zur Auswertung der P53-Immunhistochemie wurde auch die
p14ARF-Färbung nicht nur nach negativ, einfach-, zweifach- und dreifach-positiv
6. Ergebnisse
Seite | 72
ausgewertet, sondern auch nach negativ/einfach-positiv sowie zweifach- und dreifachpositiv. Hierbei wurden 60,9% aller ausgewerteten p14ARF-gefärbten Tumorproben als
dreifach-positive, nukleäre Färbung ausgewertet. Dieser Phänotyp repräsentiert somit
die deutliche Mehrheit der ausgewerteten p14ARF-gefärbten Proben, wie die folgenden
Tabellen veranschaulichen.
Anzahl
P14
ARF
Prozent
-
11
2,1
+
76
14,8
++
114
22,2
+++
313
60,9
Gesamt
514
100,0
Verteilung in Prozent
Tabelle 6-5: Auswertung der immunhistochemischen P14
65,0%
60,0%
55,0%
50,0%
45,0%
40,0%
35,0%
30,0%
25,0%
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
P14 -
P14 +
ARF
-Färbung
P14 ++
P14 +++
ARF
Abbildung 6-10: Auswertung der immunhistochemischen P14
Anzahl
P14
ARF
-Färbung
Prozent
-,+
87
16,9
++.+++
427
83,1
Gesamt
514
100,0
Tabelle 6-6: Auswertung der immunhistochemischen P14
ARF
-Färbung mit anderer Aufteilung
6. Ergebnisse
Seite | 73
Betrachtet man die Lokalisation des positiven immunhistochemischen Nachweises
detaillierter, konnte bei 3,0% (7 Fälle) der positiven p14ARF-Färbungen am TMA eine
nukleoläre
Färbung
festgestellt
werden.
Dieses
Phänomen wurde
auch
an
herkömmlichen Schnittpräparaten beobachtet, trat dort aber mit einer Häufigkeit von
10,0% (1 aus 10 Färbungen) deutlich häufiger auf. Bei der Auswertung der anderen
Marker wurde keine nukleoläre Färbung gefunden.
Abbildungen 6-11 und 6-12 zeigen typische nukleäre, die Abbildungen 6-13, 6-14 und
6-15 typische nukleoläre Färbungen im Detail.
Abbildung 6-11: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P14
genannten monoklonalem Antikörper in 10facher Vergrößerung
ARF
-Färbung mit dem oben
6. Ergebnisse
Seite | 74
Abbildung 6-12: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P14
genannten monoklonalem Antikörper in 60facher Vergrößerung
ARF
-Färbung mit dem oben
ARF
Abbildung 6-13: Nukleolärer immunhistochemischer Nachweis der P14 -Färbung mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper in 80facher Vergrößerung im TMA
6. Ergebnisse
Seite | 75
ARF
Abbildung 6-14: Nukleolärer immunhistochemischer Nachweis der P14 -Färbung mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper im herkömmlichen Schnittpräparat
ARF
Abbildung 6-15: Nukleolärer immunhistochemischer Nachweis der P14 -Färbung mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper im herkömmlichen Schnittpräparat
6.1.4
P16INK4a Färbung
Analog zur Auswertung der immunhistochemischen Befunde beim Nachweis der
Hdm2-Expression, wurde bei der Betrachtung der Ergebnisse der p16INK4aImmunhistochemie ebenfalls die zytoplasmatische Färbung berücksichtigt und
6. Ergebnisse
Seite | 76
ausgewertet. Tabelle 6-7 macht deutlich, dass p16INK4a die einzige Färbung war, bei
der die negativen Proben mit 54,6% vorherrschen. Am zweithäufigsten waren Schnitte
mit positiven Kernen und gleichzeitig positivem Zytoplasma (41,6%). Folglich hatten
94,8%
der
Proben
mit
einer
negativen
Kernfärbung
auch
eine
negative
Zytoplasmafärbung. Die Präparate, die im Kern positiv gefärbt waren, sind zu 98,1%
ebenfalls im Zytoplasma positiv. Umgekehrt lag die Häufigkeit einer zusätzlichen
positiven Kernfärbung, eines im Zytoplasma positiv getesteten Präparats bei 93,3%.
Somit hatte in der Auswertung ein im Zytoplasma negativ gefärbter Schnitt auch in
98,5% eine entsprechend fehlende Kernfärbung (p≤0,05 und C=0,68).
P16
P16
INK4a
K
-
Anzahl
Gesamt
Z
+
Gesamt
202
11
213
% innerhalb von P16
INK4a
K
94,8
5,2
100,0
% innerhalb von P16
INK4a
Z
98,5
6,7
57,6
54,6
3,0
57,6
3
154
157
% der Gesamtzahl
+
INK4a
Anzahl
% innerhalb von P16
INK4a
K
1,9
98,1
100,0
% innerhalb von P16
INK4a
Z
1,5
93,3
42,4
% der Gesamtzahl
0,8
41,6
42,4
Anzahl
205
165
370
% innerhalb von P16
INK4a
K
55,4
44,6
100,0
% innerhalb von P16
INK4a
Z
100,0
100,0
100,0
55,4
44,6
100,0
% der Gesamtzahl
INK4a
Tabelle 6-7: Korrelation der P16
Nachweises
-Färbung nach Lokalisation des immumhistochemischen
Bei einem Vergleich der Intensitäten der jeweiligen immunhistochemischen Färbungen
in Kern und Zytoplasma war zu erkennen, dass die Intensitäten miteinander
korrelierten. Nur die dreifach positiven Färbungen überwiegen im Zytoplasma (Tabelle
6-8 und Abbildung 6-16).
6. Ergebnisse
Seite | 77
P16
Anzahl
INK4a
K
P16
Prozent
INK4a
Anzahl
Z
Prozent
-
213
57,6
205
55,4
+
45
12,2
33
8,9
++
40
10,8
32
8,6
+++
72
19,5
100
27,0
370
100,0
370
100,0
Gesamt
Tabelle 6-8: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Auswertung der P16
im Nukleus und Zytoplasma
INK4a
-Färbung
60,00%
Verteilung in Prozent
50,00%
40,00%
P16INK4a K
30,00%
P16INK4a Z
20,00%
10,00%
0,00%
-
+
++
+++
INK4a
Abbildung 6-16: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Auswertung der P16
Färbung im Nukleus und Zytoplasma
-
Die Abbildungen 6-17 und 6-18 zeigen typische Beispiele der beschriebenen
Färbungen.
6. Ergebnisse
Seite | 78
Abbildung 6-17: : Nukleärer und zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis der
INK4a
P16
-Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper im TMA in 10facher
Vergrößerung
Abbildung 6-18: Nukleärer und zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis der
INK4a
P16
-Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper im TMA in 40facher
Vergrößerung
6. Ergebnisse
Seite | 79
6.1.5
P63-Färbung
Wie in der Einleitung bereits ausgeführt wurde, werden aktuell sechs verschiedene
Isoformen des P63-Proteins beschrieben, die unterschiedliche Funktionen innerhalb
der Zelle ausüben. Da derzeit der immunhistochemische Nachweis einzelner
Isoformen letztlich auch aufgrund fehlender zuverlässiger Antikörper nur unzureichend
durchzuführen ist, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Antikörper verwendet, der alle
Isoformen bindet. Eine auftretende positive zytoplasmatische Färbung wurde als nicht
spezifisch gewertet und wurde deswegen nicht in den weiteren Auswertungen
berücksichtigt.
Tabelle
6-9
zeigt,
dass
mit
37,5%
der
als
zweifach-positiv
gewertete
immunhistochemische Nachweis einer P63-Expression am häufigsten zu beobachten
war. Ein Verteilungsmuster mit einer stetigen Zunahme des prozentualen Anteils der
als positiv bewerteten Proben (Vergleiche P14ARF) oder einer Abnahme des
prozentualen Anteils der als positiv bewerteten Proben (Vergleiche P53), wenn diese in
vier Gruppen hinsichtlich der Intensität der Färbung unterteilt werden, findet sich bei
der Auswertung der P63-Immunhistochemie nicht.
Anzahl
P63
Prozent
-
177
32,5
+
69
12,7
++
204
37,5
+++
94
17,3
544
100,0
Gesamt
Tabelle 6-9: Immunhistochemische Auswertung der P63-Färbung
Typische Beispiele einer immunhistochemischen P63-Färbung sind in den folgenden
Abbildungen zusammengestellt.
6. Ergebnisse
Seite | 80
Abbildung 6-19: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P63-Färbung mit dem oben
genannten monoklonalem Antikörper im TMA in 10facher Vergrößerung
Abbildung 6-20: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P63-Färbung mit dem oben
genannten monoklonalem Antikörper im TMA in 60facher Vergrößerung
6. Ergebnisse
Seite | 81
6.2
Korrelationen und Mustererkennung
Als signifikant werden Korrelationen betrachtet deren Siginifikanzniveau p≤0,05
beträgt. Der Kontingenzkoeffizient (C), der die Stärke des Zusammenhanges
beschreibt und die Größe des Kollektivs relativiert, wird ebenfalls in die Berechnungen
und Bewertungen mit einbezogen. Hierbei ergeben Werte nahe Null Hinweis auf
unabhängige Merkmale, Werte nahe Eins legen ein hohes Maß an Abhängigkeit nahe.
6.2.1
P53/P63
Wurden die Vorkommen von P63 und P53 im invasiven Blasenkarzinom mit dem ChiQuadrat-Test nach Pearson verglichen, ließ sich ein signifikanter Zusammenhang
(p≤0,05 und C=0,17) des Nachweises einer Expression beider Proteine erkennen. Von
den 540 untersuchten Tumorproben war im Nukleus bei 49,3% gleichzeitig ein positiver
Expressionsnachweis für P63 und P53 zu sehen. Nur 18,1% waren positiv für eine
P63-Expression
bei
fehlendem
immunhistochemischen
Nachweis
einer
P53-
Akkumulation (Tabelle 6-10).
P53
-
P63
Anzahl
+
Prozent
Anzahl
Gesamt
Prozent
Anzahl
Prozent
-
78
14,4
98
18,1
176
32,6
+
98
18,1
266
49,3
364
67,4
Gesamt
176
32,6
364
67,4
540
100,0
Tabelle 6-10: Zusammenhang der immunhistochemischen Färbung von P53 und P63 im
invasiven Blasenkarzinom
Je intensiver die immunhistochemische Färbung von p53 war, desto weniger Proben
konnten positiv hinsichtlich ihrer P63-Expression bewertet werden: 29,4% der P53
einfach-positiv gefärbten Proben waren als P63 positiv gewertet worden. 23,6% waren
es noch in der Gruppe der als zweifach-positiv für die P53-Akkumulation bewerteten
und nur 20,1% in der Gruppe der als dreifach-positiv, für die P53-Akkumulation
bewerteten Präparate, gewesen. Ein solches Verteilungsmuster über diese Gruppen
ließ sich bei fehlender P63-Expression nicht nachweisen. Bemerkenswert war, im
Vergleich dieser Expressionsmuster die Tatsache, dass von allen Proben bei denen
eine P53-Akkumulation als fehlend bewertet wurde, 55,7% als positiv für eine P636. Ergebnisse
Seite | 82
Expression gewertet wurden, wohingegen lediglich 44,3% einen fehlenden Nachweis
für P63 aufwiesen (p≤0,05 und C=0,18).
Dieser Sachverhalt wird in den nachfolgenden Tabellen und Graphen dargestellt.
P53
P63
-
+
Gesamt
Anzahl
+
++
+++
Gesamt
78
32
34
32
176
% innerhalb von P63
44,3
18,2
19,3
18,2
100,0
% innerhalb von P53
44,3
23,0
28,3
30,5
32,6
% der Gesamtzahl
14,4
5,9
6,3
5,9
32,6
98
107
86
73
364
% innerhalb von P63
26,9
29,4
23,6
20,1
100,0
% innerhalb von P53
55,7
77,0
71,7
69,5
67,4
% der Gesamtzahl
18,1
19,8
15,9
13,5
67,4
Anzahl
176
139
120
105
540
% innerhalb von P63
32,6
25,7
22,2
19,4
100,0
% innerhalb von P53
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
32,6
25,7
22,2
19,4
100,0
Anzahl
% der Gesamtzahl
Tabelle 6-11: Zusammenhang der Intensitäten der immunhistochemischen Färbung von P53
und P63 im invasiven Blasenkarzinom
6. Ergebnisse
Seite | 83
30,0%
Verteilung in Prozent
25,0%
20,0%
P53 +
P53 ++
15,0%
P53 +++
10,0%
5,0%
0,0%
P63 -
P63 +
60,0%
Verteilung in Prozent
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
P53 - / P63 -
P53 - / P63 +
Abbildung 6-21: Graphische Darstellung der Expressionsmuster von P53 und P63 im invasiven
Blasenkarzinom
6.2.2
P63/P53/P14ARF
Nach neusten wissenschaftlichen Untersuchungen zu molekularen Markern im
invasiven Blasenkarzinom, gewinnt die Korrelation von P63 und P14ARF zunehmend an
Relevanz. Es ist auch in unserem Kollektiv auffallend, dass mit einer Signifikanz von
p≤0,05 und C=0,22, P14ARF und P63 in 60,0% der ausgewerteten Proben gemeinsam
6. Ergebnisse
Seite | 84
als positiv bewertet worden sind. Während der Phänotyp P63-/P14ARF+ nur in 23,2%
auftrat. Am dritthäufigsten war der Phänotyp P63-/P14ARF-.
Wurden nur die P63-positiven Färbungen betrachtet, konnte mit einer Häufigkeit von
89,2% auch eine P14ARF-Positivität beobachtet werden. Bei den P63-negativen Proben
sank die Rate, der als positiv für P14ARF gewerteten Präparate auf 71,1%.
Dementsprechend stieg der Anteil der als negativ oder einfach positiv (- oder +) für die
P14ARF gewerteten Proben von 10,8% auf 28,9% an (Tabelle 6-12).
P63
P14
ARF
-,+
Anzahl
37
85
56,5
43,5
100,0
28,9
10,8
16,7
% der Gesamtzahl
9,4
7,3
16,7
Anzahl
118
305
423
27,9
72,1
100,0
% innerhalb von P63
71,1
89,2
83,3
% der Gesamtzahl
23,2
60,0
83,3
Anzahl
166
342
508
32,7
67,3
100,0
100,0
100,0
100,0
32,7
67,3
100,0
ARF
% innerhalb von P63
% innerhalb von P14
Gesamt
Gesamt
48
% innerhalb von P14
++,+++
+
% innerhalb von P14
ARF
ARF
% innerhalb von P63
% der Gesamtzahl
Tabelle 6-12: Korrelation von P14
ARF
mit P63
Wurde der immunhistochemische Nachweis einer P53-Akkumulation in die Berechnungen
miteinbezogen, wiesen von 506 untersuchten Tumorproben 228 (45,1%), den Phänotyp
P53+/P63+/P14ARF+ auf. Wie aus Kapitel 6.2.1 zu erwarten war, wurden fast alle
Tumorproben mit dem Phänotyp P53+/P63+ als positiv hinsichtlich der Expression von
P14ARF gewertet.
Wie die folgende Tabelle zeigt, sind unter den als positiv für P63 bewerteten
Tumorproben 67,1% auch als positiv für die Expression bzw. Akkumulation von P14ARF
und P53 bewertet worden. In der Gruppe der als negativ für P63 bewerteten Proben nahm
6. Ergebnisse
Seite | 85
dieser Anteil auf 46,4% ab. Auffallend war auch, dass unter den als positiv für P63
gewerteten Proben 5,3% als negativ hinsichtlich der Expression bzw. Akkumulation von
P14ARF und P53 gewesen sind, deren Häufigkeit aber auf 19,9% anstieg, wenn auch der
Nachweis einer P63-Expression fehlte (p≤0,05 in beiden Fällen, sowie C=0,30 und
C=0,17).
P14
P63
-,+
P53
Anzahl
ARF
++,+++
Prozent
Anzahl
Gesamt
Prozent
Anzahl
Prozent
-
33
19,9
41
24,7
74
44,6
+
15
9,0
77
46,4
92
55,4
Gesamt
48
28,9
118
71,1
166
100,0
-
18
5,3
75
22,1
93
27,4
+
19
5,6
228
67,1
247
72,6
Gesamt
37
10,9
303
89,1
340
100,0
-
+
Tabelle 6-13: Korrelation von P53, P63 und P14
ARF
Um die zentrale Bedeutung einer Expression von P63 weiter zu charakterisieren,
wurde diese mit den Daten zur P53-Akkumulation und denen der P14ARF-Expression
korreliert und hierbei sowohl für den P53- sowie auch für den P14ARF-Nachweis eine
Unterscheidung
in
jeweils
vier
Gruppen
hinsichtlich
der
Bewertung
der
immunhistochemischen Ergebnisse vorgenommen. Diese detaillierteren Ergebnisse
zeigten unterschiedliche phänotypische Expressionsmuster von P53 und P14ARF in
Abhängigkeit vom Status der P63-Expression der Tumore.
Wie
in
den
Kapiteln
6.1.1
und
6.1.3
beschrieben,
ergab
sich
für
den
Expressionsnachweis der Proteine ein bestimmtes phänotypisches Muster. Während
die Anzahl der als positiv für P14ARF-gewerteten Proben mit Intensität der Färbung
zunahm, sank die Zahl der als positiv für P53 gewerteten Proben mit der Intensität des
immunhistochemischen Nachweises (Vgl. Abbildungen 6-10 und 6-3). Dieses
phänotypische Expressionsmuster war allerdings nur in der Gruppe, der als positiv für
die Expression von P63 beurteilten Proben zu sehen, während dieses Muster bei
fehlendem Expressionsnachweis von P63 nicht nachzuweisen war (p≤0,05 und
C=0,24). Siehe folgende Tabellen und Graphiken.
6. Ergebnisse
Seite | 86
P14
P63
-
ARF
+
++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-
7
1,4
41
8,1
40
7,9
78
15,4
+
4
0,8
33
6,5
73
14,4
232
45,7
Gesamt
11
2,2
74
14,6
113
22,2
310
61,0
Tabelle 6-14: Korrelation von P14
ARF
Anzahl
+++
Prozent
Anzahl
Prozent
und P63 im invasiven Harnblasenkarzinom
50,00%
45,00%
Verteilung in Prozent
40,00%
35,00%
30,00%
P14ARF+
25,00%
P14ARF++
20,00%
P14ARF+++
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
P63-
P63+
ARF
Abbildung 6-22: Korrelation von P63 mit P14
Auch
hinsichtlich
des
Nachweises
einer
P53-Akkumulation
ließ
sich
ein
phänotypisches Muster nur in den als positiv für eine P63-Expression bewerteten
Tumorproben zeigen (p≤0,05 und C=0,18), wie aus Tabelle 6-15 und Abbildung 6-23
ersichtlich wird.
P53
P63
+
++
Anzahl
+++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Prozent
Anzahl
Prozent
-
78
14,4
32
5,9
34
6,3
32
5,9
+
98
18,1
107
19,8
86
15,9
73
13,5
Gesamt
176
32,6
139
25,7
120
22,2
105
19,4
Tabelle 6-15: Korrelation von P53 und P63 im invasiven Harnblasenkarzinom
6. Ergebnisse
Seite | 87
20,00%
18,00%
Verteilung in Prozent
16,00%
14,00%
12,00%
P53+
10,00%
P53++
8,00%
P53+++
6,00%
4,00%
2,00%
0,00%
P63-
P63+
Abbildung 6-23: Korrelation von P63 mit P53
Mit Zunahme der Intensität des immunhistochemischen Nachweises der P53Akkumulation, nahm die Anzahl, der gleichzeitig als P14ARF-positiv bewerteten Proben,
ab. Dieses Expressionsmuster war auch in den als P53-negativ bewerteten Proben
erkennbar (p≤0,05 und C=0,26). Die folgende Tabelle stellt diesen Sachverhalt dar.
P53
P14
ARF
-
+
++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-,+
52
10,2
18
3,5
11
2,1
6
1,2
++,+++
118
23,0
112
21,9
99
19,3
96
18,8
Gesamt
170
33,2
130
25,4
110
21,5
102
19,9
Tabelle 6-16: Korrelation von P14
ARF
Anzahl
+++
Prozent
Anzahl
Prozent
und P53 im invasiven Harnblasenkarzinom
6. Ergebnisse
Seite | 88
30,00%
Verteilung in Prozent
25,00%
20,00%
P53+
P53++
15,00%
P53+++
10,00%
5,00%
0,00%
P14ARF-,+
Abbildung 6-24: Korrelation von P14
P14ARF++,+++
ARF
und P53 im invasiven Harnblasenkarzinom
Nach den bisher genannten Ergebnissen war zu erwarten, dass bei der Korrelation des
Nachweis der Expression aller drei Proteine, entsprechend nur unter den als P63positiv bewerteten Proben das gleiche phänotypische Muster zu finden war (Abb. 625). Tabelle 6-17 zeigt diese Ergebnisse (p≤0,05 sowie C=0,31 und C=0,18).
6. Ergebnisse
Seite | 89
P63 P53
P14
ARF
-
+
++
Anzahl
+++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Prozent
Anzahl
Prozent
-,+
33
19,9
8
4,8
4
2,4
3
1,8
++,+++
41
24,7
23
13,9
26
15,7
28
16,9
Gesamt
74
44,6
31
18,7
30
18,1
31
18,7
P63 +
P53
P14
ARF
-
+
++
Anzahl
+++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Prozent
Anzahl
Prozent
-,+
18
5,3
10
2,9
6
1,8
3
0,9
++,+++
75
22,1
87
25,6
73
21,5
68
20,0
Gesamt
93
27,4
97
28,5
79
23,2
71
20,9
ARF
Tabelle 6-17: Korrelation von P53, P14
und P63 im invasiven Harnblasenkarzinom
P63 positiv
30,00%
Verteilung in Prozent
25,00%
20,00%
P53+
P53++
15,00%
P53+++
10,00%
5,00%
0,00%
P14ARF-,+
P14ARF++,+++
ARF
Abbildung 6-25: Korrelation von P63, P53 und P14
6. Ergebnisse
Seite | 90
Die Korrelation von P14ARF und P53 zeigte das gleiche Muster. Mit Zunahme der
Intensität des immunhistochemischen Nachweises der P14ARF-Expression nahm die
Anzahl der gleichzeitig als P53-positiv bewerteten Proben zu, was in den folgenden
Berechnungen und Abbildungen veranschaulicht wird (p≤0,05 und C=0,28).
P14
P53
ARF
+
++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-
6
1,2
46
9,0
44
8,6
74
14,5
+
5
1,0
30
5,9
70
13,7
237
46,3
Gesamt
11
2,1
76
14,8
114
22,3
311
60,7
Tabelle 6-18: Korrelation von P14
ARF
Anzahl
+++
Prozent
Anzahl
Prozent
und P53 im invasiven Harnblasenkarzinom
50,00%
45,00%
Verteilung in Prozent
40,00%
35,00%
30,00%
P14ARF+
25,00%
P14ARF++
20,00%
P14ARF+++
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
P53-
P53+
ARF
Abbildung 6-26: Korrelation von P53 und P14
Wie auch bei den vorangegangen Berechnungen ist dieses phänotypische Muster
identisch unter den als P63-positiv bewerteten Schnitten zu beobachten, nicht jedoch
unter den als P63-negativ bewerteten Proben, wie die folgenden Tabellen und
Abbildungen zeigen (p≤0,05 sowie C=0,33 und C=0,20).
6. Ergebnisse
Seite | 91
P63 P14
P53
ARF
+
++
Anzahl
+++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Prozent
Anzahl
Prozent
-
4
2,4
29
17,5
19
11,4
22
13,3
+
3
1,8
12
7,2
21
12,7
56
33,7
Gesamt
7
4,2
41
24,7
40
24,1
78
47,0
P63 +
P14
P53
-
ARF
+
++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-
2
0,6
16
4,7
25
7,4
50
14,7
+
2
0,6
17
5,0
48
14,1
180
52,9
Gesamt
4
1,2
33
9,7
73
21,5
230
67,6
Tabelle 6-19: Korrelation von P63, P53 und P14
ARF
Anzahl
+++
Prozent
Anzahl
Prozent
im invasiven Blasenkarzinom
6. Ergebnisse
Seite | 92
p63 negativ
35,00%
Verteilung in Prozent
30,00%
25,00%
P14ARF+
20,00%
P14ARF++
15,00%
P14ARF+++
10,00%
5,00%
0,00%
P53-
P53+
p63 positiv
60,00%
Verteilung in Prozent
50,00%
40,00%
P14ARF+
P14ARF++
30,00%
P14ARF+++
20,00%
10,00%
0,00%
P53-
P53+
ARF
Abbildung 6-27: Korrelation von P63, P53 und P14
im invasiven Blasenkarzinom
Zusammenfassend legen diese Ergebnisse nahe, dass mit dem positiven Nachweis
einer Expression von P63 invasive Blasentumore in zwei verschiedene phänotypische
Gruppen unterteilt werden können.
6. Ergebnisse
Seite | 93
6.2.3
Hdm2/P14/P53
Durch die immunhistochemische Untersuchung der 540 Proben auf dem TMA
hinsichtlich ihrer Hdm2-Überexpression sowie ihrer P53-Akkumulation, konnten durch
Summierung der relevanten beobachtbaren Merkmale, die Phänotypen Hdm2-/P53-,
Hdm2-/P53+, Hdm2+/P53-, Hdm2+/P53+ eindeutig identifiziert werden. Diese traten
jeweils mit einer Häufigkeit von 30,4%, 52,8%, 2,4% und 14,4% auf (p≤0,05 und
C=0,18). Die detaillierte Aufstellung der prozentualen Verteilung innerhalb der
ausgewerteten Schnitte ist zusammenfassend in Tabelle 6-20 dargestellt.
P53
-
Hdm2 K+/Z+
Anzahl
+
Prozent
Gesamt
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-
164
30,4
285
52,8
449
83,1
+
13
2,4
78
14,4
91
16,9
Gesamt
177
32,8
363
67,2
540
100,0
Tabelle 6-20: Zusammenhang der Expressionsmuster von P53 und Hdm2 im invasiven
Blasenkarzinom
Wurde statt der dichotomen Bewertung für die P53-Akkumulation eine Unterteilung in
vier Gruppen vorgenommen, konnte gezeigt werden, dass mit steigender Intensität des
immunhistochemischen Nachweises einer P53-Akkumulation die Anzahl, der als positiv
für eine Hdm2-Überexpression bewerteten Proben, abnahm (p≤0,05 und C=0,20), was
in der nachfolgenden Tabelle dargestellt ist.
P53
-
+
++
+++
Hdm2 K+/Z+
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-
164
30,4
104
19,3
92
17,0
89
16,5
+
13
2,4
37
6,9
26
4,8
15
2,8
Gesamt
177
32,8
141
118
21,9
104
19,3
26,1
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Tabelle 6-21: Verteilung der Intensität der Hdm2- und P53-immunhistochemischen Färbungen
6. Ergebnisse
Seite | 94
Eine ähnliche Beobachtung ließ sich bei der Betrachtung des Phänotyp P53+/Hdm2 Z/K+ machen. Je stärker der immunhistochemische Nachweis einer P53-Akkumulation
und einer gleichzeitig nachgewiesenen Hdm2-Überexpression im Nukleus war, desto
weniger Proben konnten als positiv eingestuft werden. Weiterhin konnte keine Probe
mit einer als dreifach-positiv bewerteten Hdm2-Kernfärbung gefunden werden, welche
gleichzeitig positiv für den immunhistochemischen Nachweis einer P53-Akkumulation
war (p≤0,05 und C=0,23), wie die Ergebnisse der folgenden Tabelle zusammenfassen.
P53
-
+
++
+++
Hdm2 K+/ZAnzahl
Prozent
-
101
39,1
43
16,7
45
17,4
39
15,1
+
4
1,6
9
3,5
5
1,9
2
0,8
++
2
0,8
5
1,9
2
0,8
1
0,4
107
41,5
57
52
20,2
42
16,3
Gesamt
Anzahl
Prozent
22,1
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Tabelle 6-22: Zusammenhang der nukleären Färbungen von P53 und Hdm2 im invasiven
Blasenkarzinom
Der rein zytoplasmatisch positive Nachweis einer Hdm2-Überexpression zeigte bei der
Korrelation mit den Ergebnissen der P53-Akkumulation ein anderes Bild:
Eine stetige Abnahme des Anteils, der als zytoplasmatisch positiv bewerteten Proben,
wie sie bei dem nukleären und dem simultanen Nachweis von Hdm2 im Nukleus und
Zytoplasma gezeigt worden war, konnte in dieser phänotypischen Gruppe von Proben
nicht gefunden werden. Wie Tabelle 6-23 zeigt ließ sich in der Gruppe, der für die
zytoplasmatische Hdm2-Überexpression positiv gewerteten Proben, kein eindeutiges
Expressionsmuster erkennen (p≤0,05 und C=0,23).
6. Ergebnisse
Seite | 95
P53
-
+
++
+++
Hdm2 K-/Z+
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-
101
24,1
43
10,3
45
10,7
39
9,3
+
45
10,7
24
5,7
31
7,4
30
7,2
++
11
2,6
20
4,8
9
2,1
16
3,8
+++
1
0,2
3
0,7
0
0,0
1
0,2
158
37,7
90
21,5
85
20,3
86
20,5
Gesamt
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Tabelle 6-23: Zusammenhang der nukleären Färbungen von P53 und der zytoplasmatischen
Färbung von Hdm2 im invasiven Blasenkarzinom
Die graphische Aufarbeitung der Daten aus den Tabellen 6-21, 6-22 und 6-23
veranschaulicht die phänotypischen Expressionsmuster der Proben und belegt die
Ähnlichkeit der Phänotypen P53+/Hdm2 Z+/K+ und P53+/Hdm2 Z-/K+. Während die
Gruppe der Proben, bei denen lediglich im Zytoplasma ein positiver Nachweis einer
Hdm2-Überexpression gesehen wurde, dazu im starken Kontrast steht.
12,00%
Verteilung in Prozent
10,00%
8,00%
P53 +
P53 ++
6,00%
P53 +++
4,00%
2,00%
0,00%
Hdm2 K+/Z+
Hdm2 K+/Z-
Hdm2 K-/Z+
Abbildung 6-28: Gegenüberstellung der Hdm2- und P53-Expressionen
6. Ergebnisse
Seite | 96
Da im Regulationszyklus von P53 nicht nur Hdm2, sondern auch die Expression von
P14ARF eine Rolle spielt (Kapitel 2.3.4.5), wurden in dieser Arbeit alle Proben hierauf
untersucht und in die Auswertung mit einbezogen. Hierbei konnten 89,8% der als P53positiv bewerteten Proben parallel auch für die immunhistochemische P14ARF-Färbung
als positiv ausgewertet werden. Wohingegen nur 10,2% als P14ARF-negativ
ausgewertet wurden. Der am häufigsten gefundene Phänotyp war mit 60%
P14ARF+/P53+ (p≤0,05 und C=0,25), wie die graphische Darstellung in Tabelle 6-24
verdeutlicht.
P53
P14
ARF
-,+
Anzahl
35
87
59,8
40,2
100,0
% innerhalb von P53
30,6
10,2
17,0
% der Gesamtzahl
10,2
6,8
17,0
Anzahl
118
307
425
27,8
72,2
100,0
% innerhalb von P53
69,4
89,8
83,0
% der Gesamtzahl
23,0
60,0
83,0
Anzahl
170
342
512
33,2
66,8
100,0
100,0
100,0
100,0
33,2
66,8
100,0
% innerhalb von P14
Gesamt
Gesamt
52
% innerhalb von P14
++,+++
+
% innerhalb von P14
ARF
ARF
ARF
% innerhalb von P53
% der Gesamtzahl
ARF
Tabelle 6-24: Korrelation zwischen P53- und P14
-positiven Proben
In einem nächsten Schritt wurde, analog zu den bereits beschriebenen Analysen, die
Korrelation der Expression von P14ARF, P53 und Hdm2 untersucht. Dabei wurde die
Hdm2-Überexpression zusätzlich getrennt nach nukleärer und zytoplasmatischer
Färbung betrachtet.
Unter den Tumorproben, die für Hdm2 im Zytoplasma und im Kern positiv gewertet
wurden, konnten 80% ebenfalls für die immunhistochemischen Färbungen von P14ARF
und P53 positiv ausgewertet werden. Der Phänotyp P14ARF+/P53-/Hdm2 K+/Z+ trat zu
10,6% auf. Die Proben, die neben Hdm2 K+/Z+ zusätzlich für P14ARF als negativ
6. Ergebnisse
Seite | 97
bewertet wurden, wurden zu jeweils 50% P53-negativ beziehungsweise P53-positiv
ausgewertet.
Dieses phänotypische Expressionsmuster war bei allen ausgewerteten Färbungen,
unabhängig der Lokalisation und Hdm2-Überexpression, ersichtlich. Jedoch wurde der
Häufigkeitsunterschied,
zwischen
den
als
P14ARF-positiv
und
P14ARF-negativ
ausgewerteten Proben, bei dem Phänotyp P53+/Hdm2 K-/Z- kleiner (39,6%) als bei
dem Phänotyp P53+/Hdm2 K+/Z+ (75,3%).
Die Korrelationen konnten als signifikant betrachtet werden (Hdm2K+/Z+: p≤0,05 und
C=0,29; Hdm2K-/Z+: p≤0,05 und C=0,26; Hdm2K-/Z-: p≤0,05 und C=0,22), einzig die
Korrelation mit Hdm2K+/Z- war mit p=0,35 nicht signifikant. Eine Erklärung für diese
fehlende Signifikanz liegt möglicherweise in der geringen Anzahl, der ausgewählten
Fälle (29 Fälle).
Die folgende Tabelle und Abbildung zeigt den Zusammenhang zwischen den
Proteinen.
P53
P14
ARF
-
Hdm2K+Z-
Hdm2K-Z+
Hdm2K-Z-
Gesamt
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
4,0
4,7
4,0
4,7
8,0
9,4
++,+++
9
10,6
68
80,0
77
90,6
Gesamt
13
15,3
72
84,7
85
100,0
-,+
0
0,0
3
10,3
3
10,3
++,+++
6
20,7
20
69,0
26
89,7
Gesamt
6
20,7
23
79,3
29
100,0
-,+
16
9,0
10
5,6
26
14,7
++,+++
39
22,0
112
63,3
151
85,3
Gesamt
55
31,1
122
68,9
177
100,0
-,+
32
14,7
18
8,3
50
23,0
++,+++
63
29,0
104
47,9
167
77,0
Gesamt
95
43,8
122
56,2
217
100,0
-,+
Hdm2K+Z+
+
ARF
Tabelle 6-25: Korrelation von P53 und P14
und Hdm2
6. Ergebnisse
Seite | 98
80,00%
Verteilung in Prozent
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
P53-
30,00%
P53+
20,00%
10,00%
0,00%
P14+
P14-
P14+
Hdm2K+Z+
P14-
Hdm2K+Z-
P14+
P14-
P14+
Hdm2K-Z+
P14-
Hdm2K-Z-
Abbildung 6-29: Graphische Darstellung der Korrelation von P53, P14
ARF
und Hdm2
Um zusätzliche Informationen über die Rolle der Hdm2-Überexpression im invasiven
Blasenkarzinom zu erarbeiten, wurden die als Hdm2-positiv bewerteten Proben mit den
als
P14ARF-positiv
und
P53-positiv
bewerteten
Proben
korreliert
und
deren
Expressionsmuster, im Sinne einer Zuordnung zu den einzelnen Phänotypen,
analysiert.
Für die Korrelation von den Hdm2-immunhistochemisch gefärbten Proben mit den
P14ARF-immunhistochemisch gefärbten Proben, konnte weder ein Unterschied der
Expressionsmuster,
der
als
P14ARF-positiv
bewerteten
Proben,
zwischen
zytoplasmatischer und nukleärer Hdm2-Überexpression festgestellt werden. Noch
zwischen den als Hdm2-positiv und -negativ bewerteten Proben (p≤0,05 und C=0,26).
(Tabelle 6-26).
6. Ergebnisse
Seite | 99
P14
-
ARF
+
++
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Hdm2 K+/Z+
0
0,0
8
1,6
8
1,6
70
13,7
Hdm2 K+/Z-
1
0,2
2
0,4
10
2,0
16
3,1
Hdm2 K-/Z+
3
0,6
23
4,5
32
6,3
120
23,5
Hdm2 K-/Z-
7
1,4
43
8,4
62
12,2
105
20,6
Tabelle 6-26: Korrelation und Musterverteilung von P14
Anzahl
+++
ARF
Prozent
Anzahl
Prozent
in Hdm2-positiv gewerteten Proben
Wie Tabellen 6-21 bis 6-23 zeigen konnten auch keine Unterschiede zwischen den als
Hdm2-positiv und Hdm2-negativ bewerteten Proben, unter Einbeziehung der als P53positiv bewerteten Färbungen, gefunden werden. So wiesen die als positiv bewerteten
zytoplasmatischen Hdm2-Färbungen ein abweichendes phänotypisches Muster auf,
als die mit nukleären oder simultanen Nachweis von Hdm2 im Nukleus und
Zytoplasma.
Wurden nur Proben betrachtet, welche für alle drei Proteine als positiv bewertet
wurden, war das phänotypische Expressionsmuster von P53 und P14ARF (siehe Kapitel
6.2.2, Tabelle 6-16) unter den als Hdm2-positiv bewerteten nukleären oder nukleär und
zytoplasmatischen Färbungen erkennbar. Unter den als Hdm2-negativ bewerteten
Proben hingegen nicht.
Auch bei dieser Korrelation zeigte die als zytoplasmatisch bewertete Hdm2-Färbung
ein Verhalten, das eher den negativ bewerteten, als den rein nukleär oder nukleär und
zytoplasmatisch gefärbten Proben ähnelte (Hdm2K+/Z+: p≤0,05 und C=0,32; Hdm2K/Z+: p≤0,05 und C=0,28; Hdm2K-/Z-: p≤0,05 und C=0,28). Die Korrelation mit
Hdm2K+/Z- war mit p=0,68 nicht signifikant. Wie weiter oben aufgeführt, könnte dies
mit der geringen Anzahl an zugeordneten Proben (29 Fälle) erklärt werden.
6. Ergebnisse
Seite | 100
P53
P14
+
++
+++
ARF
Hdm2K+Z+
Hdm2K+Z-
Hdm2K-Z+
Hdm2K-Z-
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
Anzahl
Prozent
-,+
4
4,7
1
1,2
1
1,2
2
2,4
++,+++
9
10,6
34
40,0
22
25,9
12
14,1
Gesamt
13
15,3
35
41,2
23
27,1
14
16,5
-,+
0
0,0
2
6,9
1
3,4
0
0,0
++,+++
6
20,7
11
37,9
6
20,7
3
10,3
Gesamt
6
20,7
13
44,8
7
24,1
3
10,3
-,+
16
9,0
3
1,7
5
2,8
2
1,1
++,+++
39
22,0
38
21,5
31
17,5
41
24,3
Gesamt
55
31,1
41
23,2
36
20,3
45
25,4
-,+
32
14,7
12
5,5
4
1,8
2
0,9
++,+++
63
29,0
29
13,4
38
17,5
37
17,1
Gesamt
95
43,8
41
18,9
42
19,4
39
18,0
Tabelle 6-27: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14
ARF
in gefärbten Hdm2 Proben
Hdm2 K+/Z+
45,00%
40,00%
Verteilung in Prozent
35,00%
30,00%
25,00%
P14ARF -
20,00%
P14ARF +
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
P53+
P53++
P53+++
Abbildung 6-30: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14
zytoplasmatisch gefärbten Hdm2 Proben
ARF
in nukleär und
6. Ergebnisse
Seite | 101
Hdm2 K+/Z40,00%
Verteilung in Prozent
35,00%
30,00%
25,00%
P14ARF -
20,00%
P14ARF +
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
P53+
P53++
P53+++
ARF
Abbildung 6-31: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14
Hdm2 Proben
in nukleär gefärbten
Hdm2 K-/Z+
30,00%
Verteilung in Prozent
25,00%
20,00%
P14ARF -
15,00%
P14ARF +
10,00%
5,00%
0,00%
P53+
P53++
P53+++
ARF
Abbildung 6-32: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14
gefärbten Hdm2 Proben
in zytoplasmatisch
6. Ergebnisse
Seite | 102
Hdm2 K-/Z20,00%
18,00%
Verteilung in Prozent
16,00%
14,00%
12,00%
10,00%
P14ARF -
8,00%
P14ARF +
6,00%
4,00%
2,00%
0,00%
P53+
P53++
P53+++
Abbildung 6-33: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14
gefärbten Hdm2 Proben
ARF
in zytoplasmatisch
Bei der Betrachtung der als P53-positiv bewerteten Proben war aufgefallen, dass mit
zunehmender Intensität des immunhistochemischen Nachweises die Häufigkeit unter
den als P53-positiv bewerteten Proben abnahm (Vergleiche Abbildung 6-3 und Tabelle
6-2). Die als P14ARF-positiv bewerteten Proben nahmen in Ihrer Häufigkeit, mit
zunehmender Intensität des immunhistochemischen Nachweises hingegen zu
(Vergleiche Abbildung 6-10 und Tabelle 6-5).
Wurden als P53-positiv bewertete Proben und als positiv bewertete P14ARF-Proben
korreliert, nahmen unter den als P53-positiv bewerteten Proben, mit zunehmender
Intensität der immunhistochemischen Färbung, die Häufigkeit der gleichzeitig als
P14ARF-positiv bewerteten Proben ab (Vergleiche Abbildung 6-24 und Tabelle 6-16).
Wurden Proben, die immunhistochemisch für P53 oder P14ARF gefärbt waren, jeweils
einzeln mit Hdm2 immunhistochemisch gefärbten Proben korreliert, konnten die eben
erwähnten Expressionsmuster in den als Hdm2-positiv und -negativ bewerteten Proben
festgestellt werden. Wurden Zellen untersucht, die für alle drei Proteine als positiv
bewertet wurden, waren die Expressionsmuster nur in den als Hdm2-positiv
gewerteten Zellen zu finden, wenn diese nukleär oder nukleär und zytoplasmatisch
gefärbt waren.
6. Ergebnisse
Seite | 103
P14ARF/P16INK4a
6.2.4
Die Auswertung der Korrelation von P14ARF und P16INK4a ließ die Phänotypen
P14+/P16+, P14+/16-, P14-/P16+ und P14-/P16- erkennen, welche mit einer Häufigkeit
von 37,9%, 45,3%, 3,8% und 13,0% auftraten. Dabei wurde die P16INK4a-Expression
isoliert in Nukleus oder Zytoplasma oder simultan in Nukleus und Zytoplasma
gefunden. Die Häufigkeitsverteilungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt (p≤0,05
und C=0,17).
P14
P16
INK4a
-,+
Z+/K+
Anzahl
ARF
++,+++
Prozent
Anzahl
Gesamt
Prozent
Anzahl
Prozent
-
48
13,0
167
45,3
215
58,3
+
14
3,8
140
37,9
154
41,7
Gesamt
62
16,8
307
83,2
369
100,0
Tabelle 6-28: Korrelation zwischen den als P14
bewerteten Proben
ARF
-positiv und den als P16
INK4a
-positiv
Bemerkenswerterweise fand sich unter den Tumorproben, die P16INK4a isoliert nukleär
exprimierten, kein Phänotyp P14ARF-/P16INK4a+. Alle als P16INK4a-positiv eingestuften
Proben sind gleichzeitig als P14ARF-positiv bewertet worden. Diese Korrelation konnte
allerdings nicht als signifikant betrachtet werden (p=0,43), was mit der geringen Anzahl
an P16INK4a-positiv gewerteten Proben erklärt werden kann (3 Fälle).
6. Ergebnisse
Seite | 104
P16
INK4a
Z-/K+
P14
-,+
-
Anzahl
% innerhalb von P16
INK4a
% innerhalb von P14
ARF
% der Gesamtzahl
+
Gesamt
Anzahl
ARF
++,+++
Gesamt
62
304
366
16,9
83,1
100,0
100,0
99,0
99,2
16,8
82,4
99,2
0
3
3
% innerhalb von P16
INK4a
0,0
100,0
100,0
% innerhalb von P14
ARF
0,0
1,0
0,8
% der Gesamtzahl
0,0
0,8
0,8
Anzahl
62
307
369
16,8
83,2
100,0
100,0
100,0
100,0
16,8
83,2
100,0
% innerhalb von P16
INK4a
% innerhalb von P14
ARF
% der Gesamtzahl
ARF
Tabelle 6-29: Korrelation zwischen als P14
INK4a
-Färbungen
P16
-positiv bewerteten und isoliert nukleären
Konträr verhielten sich Proben mit zytoplasmatischer P16INK4a-Expression in Korrelation
zu P14ARF-positiv bewerteten Proben. War eine P16INK4a-Expression im Zytoplasma
immunhistochemisch detektierbar, konnten 40% dieser Proben als P14ARF-negativ und
nur 60% als P14ARF-positiv bewertet werden. Der Phänotyp P14ARF-/P16INK4a+ konnte
nicht nachgewiesen werden (p≤0,05 und C=0,10).
6. Ergebnisse
Seite | 105
P16
INK4a
Z+/K-
P14
-,+
-
Anzahl
Gesamt
58
301
359
INK4a
16,2%
83,8%
100,0%
% innerhalb von P14
ARF
93,5%
98,0%
97,3%
15,7%
81,6%
97,3%
4
6
10
40,0%
60,0%
100,0%
6,5%
2,0%
2,7%
1,1%
1,6%
2,7%
62
307
369
16,8%
83,2%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
16,8%
83,2%
100,0%
Anzahl
% innerhalb von P16
INK4a
% innerhalb von P14
ARF
% der Gesamtzahl
Gesamt
++,+++
% innerhalb von P16
% der Gesamtzahl
+
ARF
Anzahl
% innerhalb von P16
INK4a
% innerhalb von P14
ARF
% der Gesamtzahl
Tabelle 6-30: Korrelation zwischen als P14
INK4a
-Färbungen
P16
ARF
-positiv bewerteten und isoliert zytoplasmatischen
Die Korrelation der als P14ARF-positiv eingestuften Proben mit Proben, die P16INK4a
simultan zytoplasmatisch und nukleär exprimierten, ließ erkennen, dass 77,4% der als
P14ARF-negativ bis leicht gefärbten Proben auch als P16INK4a-negativ bewertet werden
konnten. Nur 22,6% konnten als P16INK4a-positiv eingestuft werden.
Umgekehrt zeigte sich bei den als p16INK4a -negativ eingestuften Proben, dass hier in
der überwiegenden Anzahl der Fälle eine Expression von p14ARF nachzuweisen war.
(Tabelle 6-31 und Abbildungen 6-34 und 6-35).
6. Ergebnisse
Seite | 106
P16
INK4a
Z+/K+
P14
-,+
-
Anzahl
Gesamt
48
167
215
INK4a
22,3%
77,7%
100,0%
% innerhalb von P14
ARF
77,4%
54,4%
58,3%
13,0%
45,3%
58,3%
14
140
154
9,1%
90,9%
100,0%
22,6%
45,6%
41,7%
3,8%
37,9%
41,7%
62
307
369
16,8%
83,2%
100,0%
100,0%
100,0%
100,0%
16,8%
83,2%
100,0%
Anzahl
% innerhalb von P16
INK4a
% innerhalb von P14
ARF
% der Gesamtzahl
Gesamt
++,+++
% innerhalb von P16
% der Gesamtzahl
+
ARF
Anzahl
% innerhalb von P16
INK4a
% innerhalb von P14
ARF
% der Gesamtzahl
Tabelle 6-31: Korrelation zwischen P14
ARF
-positiven sowie kolokalisierter P16
INK4a
-Färbung
80,0%
Verteilung in Prozent
70,0%
60,0%
50,0%
P16INK4a -
40,0%
P16INK4a +
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
P14ARF- / P14ARF+
Abbildung 6-34: Korrelation zwischen P14
Färbung
P14ARF++ / P14ARF+++
ARF
-gefärbten Proben und kolokalisierter P16
INK4a
-
6. Ergebnisse
Seite | 107
1
0,9
Verteilung in Prozent
0,8
0,7
0,6
P14ARF -/+
0,5
p14ARF ++/+++
0,4
0,3
0,2
0,1
0
P16INK4a -
P16INK4a +
Abbildung 6-35: Korrelation zwischen P16
Färbung
6.3
INK4a
-gefärbten Proben und kolokalisierter P14
ARF
-
Digitale Pathologie
Weiterer zentraler Bestandteil der vorliegenden Arbeit war die Evaluation des
Einsatzes der Auswertung gefärbter Proben an digitalisierten Objektträgern. Aus
diesem Grund wurden die gefärbten Proben, im Rahmen des experimentellen Teils
dieser Arbeit, nicht nur standardgemäß mit einem herkömmlichen Mikroskop, sondern
auch mit Hilfe eines digitalen Slide-Scanners „MIRAX MIDI“ ausgewertet. Dessen
Funktionsweise basiert auf der sogenannten „Digital Slide Technology“. Diese, von der
Firma „Carl Zeiss Microlmaging GmbH“ entwickelte, Technologie ermöglicht eine
digitale
Analyse
Archivierung
von
histologischer
Objektträgern,
Präparate.
ist
die
Neben
parallele
der
dauerhaften
Befundung
von
digitalen
mehreren
Serienschnitten auf einem entsprechenden Bildschirm eine der Hauptvorteile dieser
Verfahrensweise. Über das im hiesigen Institut für Pathologie etablierte System,
wurden die konventionellen Objektträger aus Glas mit dem „MIRAX midi Scanner“ von
Carl
Zeiss
digitalisiert.
Hierbei
erzeugt
ein
automatisierter
Scanner
einen
hochaufgelösten digitalen Datensatz der einzelnen Proben, welcher als „digital slide“
bezeichnet wird. Durch die geeignete Software, den „MIRAX Viewer“, wird eine
Möglichkeit geliefert die Ergebnisse an einem Bildschirmarbeitsplatz auszuwerten
(Abbildung 6-36).
6. Ergebnisse
Seite | 108
Abbildung 6-36: Digitalisierte P63-Färbung im Überblick
Zu den wichtigsten Vorteilen der verwandten Software zählt die Tatsache, dass bei der
Auswertung der verschiedenen Expressionsmuster von Proteinen die zeitgleiche
Gegenüberstellung der verschieden gefärbten digitalisierten Objektträger durchgeführt
werden kann. Somit ist es möglich, identische Gewebebereiche gleichzeitig in
mehreren immunhistochemischen Färbungen zu betrachten. Als Beispiel für eine
solche direkte zeitgleiche Betrachtung ist hier der Vergleich zweier Proben abgebildet,
die zum einen mit einem Antikörper gegen P53 und zum anderen mit einem Antikörper
gegen P63 immunhistochemisch gefärbt worden sind (Abbildung 6-37).
6. Ergebnisse
Seite | 109
Abbildung 6-37: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Färbungen von P63 und P53
im digitalisierten Objektträger
Zur Analyse der Expressionsmuster immunhistochemisch gefärbter Proben, unter der
Verwendung von Antikörper gegen P53-, P14ARF-und Hdm2, wurde ebenfalls die
Technik der „digital slides“ angewandt (Abbildung 6-38)
ARF
Abbildung 6-38: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Färbungen von P53, P14
und Hdm2 im digitalisierten Objektträge
6. Ergebnisse
Seite | 110
Nach immunhistochemischer Färbung erfolgte der Vergleich der Expressionsprofile
von P14ARF-positiv und P16INK4a-positiv bewerteten Proben gleichermaßen an
digitalisierten Datensätzen, die in Abbildung 6-39 aufgezeigt sind.
Abbildung 6-39: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Färbungen von P16
ARF
P14
im digitalisierten Objektträger
INK4a
und
Ein weiterer Vorteil der Software besteht darin, durch die Verwendung verschiedener
Zoomstärken, die Auswertung der Präparate erheblich zu erleichtern. Da auch dies
zeitgleich erfolgt, führt das zu einer deutlichen Vereinfachung des direkten Vergleichs
und gleichzeitig zu einer Erhöhung der Präzision und zu einem Zeitgewinn (Abbildung
6-40).
6. Ergebnisse
Seite | 111
Abbildung
6-40:
Gegenüberstellung
unterschiedlicher
immunhistochemischen P63-Färbung im digitalisierten Objektträger
Das
Abspeichern
und
Verschicken
der
digitalisierten
Vergrößerungen
Objektträger
ist
der
von
unschätzbarem Wert für die gemeinsame Beurteilung durch mehrere Wissenschaftler
an verschiedenen Orten, sowie die interdisziplinäre Zusammenarbeit. So konnten bei
Unklarheiten mit einfacher Handhabung die verschiedenen Wissenschaftler gleichzeitig
zu den einzelnen Proben und deren Beurteilung konsultiert werden.
Zusätzlich wurde die Software im Rahmen der Dissertation dazu verwendet, die
photographische Dokumentation und das Einfügen der Bilder in dem fließenden Text
durchzuführen, was eine weitere Funktionsmöglichkeit des benutzten Programms
belegt.
6. Ergebnisse
Seite | 112
7
7.1
Diskussion
P53/P63
Nach der Entdeckung von P53 als das am häufigsten mutierte Gen in menschlichen
Tumoren, war die Entdeckung zweier homologer Proteine, P63 und P73, ein weiterer
wesentlicher
Meilenstein
in
der
Weiterentwicklung
des
Verständnisses
der
Pathogenese maligner Zellen. Diese neue Gruppe von Proteinen, die als P53-Familie
bezeichnet wird, zeigt eine hohe Übereinstimmung sowohl auf genetischem als auch
auf Proteinniveau. Alle Drei enthalten eine Transaktivierungs-, eine DNA-Bindungsund eine Oligomerisierungsdomäne. Ein langes C-Ende mit einem sterilen alpha Motiv
(SAM) lassen sich bei P73 sowie P63 finden. Diese Struktur wird vor allem bei
Proteinen gefunden, die in die Zellregulation eingreifen, so dass P63 und P73
wahrscheinlich die Zelldifferenzierung beeinflussen. Die stärksten Homologien der
Proteinfamilie werden in der DNA-Bindungsdomäne gefunden (63% zwischen P53 und
P73, 60% zwischen P53 und P63). Möglicherweise sind die drei Proteine in der Lage
identische DNA-Sequenzen zu binden und die dazugehörigen Promotoren zu
aktivieren [142]. Somit gibt es Grund zu der Annahme, dass P53, P73 und P63 sowohl
gemeinsame
als
auch
unterschiedliche
Funktionen
innehaben.
Die
Expressionskorrelationen von P53 und P63 im invasiven Blasenkarzinom werden in
der vorliegenden Arbeit untersucht.
Karni-Schmidt et al. [114] haben in ihren Untersuchungen zum P63-Expressionsprofil
im fortgeschrittenen Blasenkarzinom herausgefunden, dass die verschiedenen
Unterformen von P63 eine abweichende Auswirkung auf das biologische Verhalten von
Blasenkarzinomen aufweisen. Sie haben entdeckt, dass eine P63-Färbung nur bei
gemischten Kohorten (Ta- bis T4-Tumore) oder bei nicht-invasiven Tumoren, mit einer
besseren Prognose korreliert, als bei negativen P63-Tumoren. Ihre Experimente
ergaben eine 69,1%ige Positivität für P63 im invasiven Blasenkarzinom (T2-T4
Tumore). Dies steht in keiner Wechselwirkung zu einer besseren Prognose. Jedoch
fanden Sie einen signifikanten Zusammenhang zwischen ΔNP63-Positivität und einer
schlechteren Prognose. Davon waren 41,8%, der im Rahmen ihrer Studie
untersuchten, invasiven Blasenkarzinome betroffen. Sie konnten auch nachweisen,
dass die Expression von TAP63 von 67,7-96,8% im nicht-invasiven pTa Tumor auf
30,9-69,1% in invasiven Tumoren abnahm. Das gleiche Verhalten galt für den
immunhistochemischen Nachweis von P63 (96,8% in pTa und 69,1% in >T2 Tumoren).
ΔNP63 dagegen wies ein inverses Auftreten auf und nahm von 29% in Ta auf 41,8% in
>T2 Tumoren zu. Während ΔNP63 im gesunden Urothel nicht vorkam, war TAP63 dort
zu 100% zu finden. Ein immunhistochemischer Nachweis von P63 mit dem 4A4-Klon,
7. Diskussion
Seite | 113
der TAP63 sowie ΔNP63 bindet, stellte sich nicht als guter prognostischer Marker im
invasiven Blasenkarzinom heraus. Ähnliche Ergebnisse bestätigte die Gruppe um
Woonyoung Choi [34].
Die Prüfung des Expressionsmusters von P53 im Blasenkarzinom zeigte ein markant
höheres Expressionsniveau in invasiven (43,5%) als in nicht-invasiven Tumoren
(20,4%) [114].
Die Akkumulation von P53 im Nukleus kann durch Mutationen entstehen, durch die
P53 die Fähigkeit verliert als Transkriptionsfaktor für Hdm2 tätig zu sein und dadurch
seinen eigenen Abbau verhindert [159, 35, 82]. Eine andere Erklärung sind Mutationen,
durch die das P53-Protein seine räumliche Struktur verändert [82]. Im Blasenkarzinom
können beide Wege vorkommen, was zu einer Akkumulation von P53 im Nukleus führt.
Auch
Wild-Typ
P53
kann
akkumulieren
wenn
seine
Degradierungs-
oder
Regulationswege verändert sind [1].
Verschiedene Arbeiten konnten bisher belegen, dass eine P53-Akkumulation mit
höherem Tumorgrad und Stadium vergesellschaftet ist. Ein klarer Zusammenhang, der
die Stärke des Effektes auf das Überleben und die Progression belegt, ist weiterhin
Gegenstand intensiver Forschung, auch wenn bereits belegt ist, dass die Tumore eine
aggressivere Biologie haben, bei denen ein positiver Nachweis von P53 gefunden
werden kann [230]. So wurde in einigen Studien herausgefunden, dass eine verstärkte
P53-Akkumulation im Nukleus signifikant mit einer Fortschreitung der Krankheit und
Tumor-assoziiertem Tod verbunden ist [247, 110, 31, 212].
Die Ergebnisse, der im Rahmen der vorliegenden wissenschaftlichen Arbeit
durchgeführten P53- und P63- Auswertung im invasiven Blasenkarzinom mittels
immunhistochemischer Färbung, lassen sich durchaus mit den Arbeiten der
Arbeitsgruppe von Karni-Schmidt et al. [114] erklären: Es konnte gezeigt werden, dass
in 67,5% der Fälle eine P63- und in 67,2% eine P53-Positivität nachzuweisen war. Das
schwächere Vorkommen von P53 in der Arbeit von Karni-Schmidt et al. [114] könnte
sich dadurch erklären, dass im untersuchten Kollektiv dieser Gruppe T2-Tumore
eingeschlossen wurden, während sich die vorliegende Arbeit ausschließlich mit sehr
fortgeschrittenen Tumoren beschäftigte. Auch wurden unterschiedliche Antikörper
verwendet (P53 antibody clone PAb1801 Calbiochem-EMD Chemicals, Gibbstown,
NJ). Die Ergebnisse, auf dem hier untersuchten TMA, entsprechen eher den
Resultaten von Jahnson und Karlsson [104], die in 58,1% der von Ihnen untersuchten
invasiven Tumore eine P53 Positivität entdeckten. Grundlegend, belegt die Varianz der
Ergebnisse in der Literatur auch die Bedeutung einer zukünftigen Standardisierung der
7. Diskussion
Seite | 114
immunhistochemischen Färbung von P53, um einen besseren Vergleich der Arbeiten
untereinander zu erzielen [69, 215]
Mit den zur Verfügung stehenden Methoden war es leider nicht möglich einen direkten
Vergleich zwischen ΔNP63 und P63 zu ziehen, da der hier verwendete Antikörper
sowohl ΔNP63 als auch TAP63 färbte. Interessant ist aber, dass in 49,2% der
invasiven Karzinome P63 und P53 positiv waren, was geringfügig über den 41,8%
ΔNP63-positiven Schnitten der oben genannten Arbeit lag. In einem weiteren Schritt
könnte daher untersucht werden, ob die Karzinome, die simultan positiv für P63 und
P53 gefärbt sind, eine ΔNP63-Positivität und somit eine schlechtere Prognose
aufweisen.
Da nach Karni-Schmidt et al. die Expression von TAP63 mit zunehmender
Tumorprogression abnimmt, wäre auch interessant, ob die P63-positiven und P53negativen Tumoren (18,1%) TAP63 positiv sind und dies mit einer eher besseren
Prognose einhergeht.
Auf dieser Arbeit basierend ist eine weiterführende Fragestellung vorstellbar, die sich
mit der Korrelation von den P63-Untergruppen mit der P53-Akkumulation befasst und
deren Vorhersagekraft hinsichtlich Prognose und Tumorprogression untersucht.
7.2
P63/P53/P14ARF
Wenn epitheliale Zellen ihre Zugehörigkeit zu einem Zellverbund verlieren, wird ein
Zellsignal ausgelöst, das zum programmierten Zelltod dieser „heimatlosen“ Zellen führt.
Dieser,
als
Anoikis
bekannte,
Mechanismus
dient
der
Vermeidung
einer
Metastasierung von Tumorzellen. Werden Resistenzen gegen diesen Mechanismus
erworben, entweder durch genetische Veränderungen oder durch abnorm veränderte
Signalkaskaden, können sich Tumorzellen im betroffenen Organismus ausbreiten und
zu einer metastasierten Erkrankung führen. Gewinnen epitheliale Zellen, denen es
normalerweise durch feste Zell-zu-Zellverbindungen unmöglich ist ihre Lokalisation zu
ändern, Migrationseigenschaften, wird von einer epithelial-mesenchymalen Transition
(EMT) gesprochen. Molekulare Marker, die in Zellen mit EMT gefunden werden, haben
unter anderem eine erniedrigte Expression von N-Cadherin, und Vimentin, sowie eine
erhöhte Expression von Snail1 (Snail), Snail2 (Slug), Twist, EF1/ZEB1, SIP1/ZEB2,
und/oder E47, welches die Produktion von E-Cadherin unterdrückt [138].
Kumar et al. fanden heraus, dass in Zellen mit EMT, NRAGE (neurotrophin receptor
interacting melanoma antigen) nicht mehr zytoplasmatisch sonder nukleär auftritt.
7. Diskussion
Seite | 115
Unter normalen Umstanden wird NRAGE durch eine Komplexbildung mit Ankyrin-G,
einem Bestandteil des E-Cadherinkomplex, im Zytoplasma gehalten. Da wie eben
erwähnt E-Cadherin in EMT Zellen erniedrigt ist und somit auch weniger Ankyrin-G
vorhanden ist, kann in diesen Zellen NRAGE im Nukleus auftreten. Das nukleäre
onkogenetische Transkriptionsrepressorprotein TBX2 interagiert mit NRAGE und steht
nicht mehr für die Expression von P14ARF zur Verfügung. P14ARF allerdings würde
Zellen zur Anoikis veranlassen. Der Komplex NRAGE/TBX2 schützt betroffene Zellen
vor dem P14ARF ausgelösten Zelltod [130].
Choi et al. konnten zeigen, dass muskelinvasive Blasenkarzinome eine erniedrigte
Expressionen von P63 und E-Cadherin aufweisen. Diese als epitheliale Marker
geltenden Proteine korrelierten stark in ihren Experimenten. Außerdem entdeckten sie
eine verstärkte Expression von mesenchymalen Markern, die wie weiter oben erwähnt
zu einer verstärkten Migration von Tumorzellen, in invasiven Blasenkarzinomen, führen
können [34]. Sie bestätigten somit die Ergebnisse von Cordon-Cardo et al., laut denen
ΔNP63-positive muskelinvasive Blasentumoren eine schlechtere Prognose aufweisen,
obwohl diese einen epithelialen Phänotyp zeigen [114]. Choi et al. vermuten deshalb,
dass der epitheliale Phänotyp von ΔNP63-positiven Zellen durch eine P63-abhängige
und forcierte Expression von miR205 entsteht. MiR205 kann neben der miR200Familie die Expression von mesenchymalen Transkriptionsfaktoren supprimieren und
somit einen epithelialen Phänotyp aufrecht erhalten [34].
Werden diese Ergebnisse zusammengefasst, scheinen in invasiven Blasenkarzinomen
verschiedene Phänotypen mit unterschiedlichen Prognosen zu existieren. Zum einen
sind P63-negative Tumoren mit positivem Nachweis mesenchymaler Markern zu
erwarten, bei denen durch die oben erwähnten Mechanismen P14ARF supprimiert ist.
Aus den bisherigen Daten ergäbe sich für diesen Phänotyp auch eine minimal bessere
Prognose.
Auf der anderen Seite wäre mit einem Phänotyp zu rechnen, der ΔNP63 positiv ist und
mit einer erhaltenen E-Cadherin-Expression, ohne den Nachweis mesenchymaler
Marker einhergeht. Bei dieser Subgruppe, die nach den oben zitierten Arbeiten eine
schlechtere Prognose aufweisen würde, würde man eine P14ARF Positivität erwarten.
Auf diesem Hintergrund sind die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zu erwarten
gewesen. Die P63-positiven Tumorproben sind meistens auch P53-positiv, was mit der
schlechteren Prognose des untersuchten Kollektivs fortgeschrittener Tumore erklärt
werden kann. Zusätzlich sind sie häufiger ebenfalls P14ARF-positiv (89,2%), als die
P63-negativen Tumorproben (71,1%). Dies lässt sich auf das oben erklärte Modell
7. Diskussion
Seite | 116
übertragen: ist P63 positiv, überwiegen epitheliale Marker, die auf die P14ARFExpression
keinen
Einfluss
nehmen.
mesenchymale Proteine die P14
Wird
dagegen
P63
negativ,
können
ARF
-Expression erniedrigen und die Tumorzelle vor
Anoikis schützen.
Unter den P63-negativen Tumorproben war bei insgesamt 55,7% eine P53-Positivität
nachweisbar. Unter den P63-positiven Proben waren dagegen insgesamt 73,1% positiv
für den Nachweis einer P53 Akkumulation.
Die in der vorliegenden Arbeit beobachteten Ergebnisse (Vergleiche Kapitel 6.2.2)
unterstützen die Hypothese, dass P63 ein Protein darstellt, welches geeignet scheint,
bei invasiven Blasenkarzinomen zwei wesentliche phänotypische Subgruppen zu
identifizieren. Diese gehen dann auch mit einer unterschiedlichen Biologie einher. Die
Entdeckung der Expressionsmuster von P14ARF und P53, die nur in P63-positiven
Schnittpräparaten ermittelbar waren, unterstreichen den Stellenwert von P63.
Aufbauend auf dieser Arbeit müssten, wie auch schon in Kapitel 6.1 erwähnt, die
Ergebnisse mit P63-Untergruppen erweitert werden und mit den Überlebensdaten der
Patienten des Kollektivs korreliert werden. Die vorliegende Doktorarbeit setzte jedoch
klar
den
Schwerpunkt
auf
den
Einsatz
von
Tissue
Mikroarrays
und
die
Phänotypisierung anhand bekannter Progressions- und Zellzyklusmarker durch die
Verwendung digitaler Medien.
7.3
Eine
Hdm2/P53/P14ARF
Vielzahl
von
Arbeitsgruppen
haben,
in
ihren
Untersuchungen
von
verschiedenartigen menschlichen Tumoren, eine Hdm2-Überexpression bzw. eine
Hdm2-Amplifikation gefunden [196, 172, 227]. Beispielsweise hat die Gruppe um
Shiina [227] einen möglichen Zusammenhang zwischen Hdm2-Überexpression und
Tumorentstehung oder –progression im Blasenkarzinom untersucht. Ihre Resultate
beschreiben, dass Hdm2 keine signifikante Korrelation mit Tumorgrad oder -stadium
aufweist. Auch wurde kein Zusammenhang zwischen Hdm2-Überexpression und
Tumorprogression gefunden. Selbiges gilt für Überlebenszeit und P53-Akkumulation.
Jedoch ergab sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Tumorstadium, der
Überlebenswahrscheinlichkeit und der Tumorprogression bei Tumoren die simultan für
P53 und Hdm2 als positiv gewertet wurden. Die größte Überlebenswahrscheinlichkeit
zeigten Patienten mit dem Phänotyp Hdm2-/P53- und die schlechteste Patienten mit
Hdm2-/P53+.
Hdm2+/P53+
Patienten
hatten
keine
signifikant
höhere
7. Diskussion
Seite | 117
Überlebenschance. Sie lag jedoch etwas über der von Hdm2-/P53+ Patienten. Im
Vergleich von Hdm2+/P53- und Hdm2-/P53+ zeigten Patienten des ersten Phänotyps
ebenfalls ein kürzeres Überleben.
In
einem
weiteren
Experiment
fanden
Lianes
et
al.
[144]
in
invasiven
Blasenkarzinomen 24% mit einem positiven Hdm2-Phänotyp, 41% mit einem P53positiven Phänotyp und in 18% eine simultane Färbung der Proteine nach
immunhistochemischer Färbung. Bei der Korrelation der nukleären Färbung dieser
Proteine ließ sich, im Gegensatz zu den Ergebnissen der Gruppe um Shiina [227], ein
starker statistischer Zusammenhang feststellen. Dieser war jedoch beschränkt auf
Mutationen mit einem niedrigen Tumorstadium und -grad. Weiterhin stellte sich heraus,
dass Mutationen in den Exonen 5,7 und 8 zu einer nukleären Akkumulation von P53
führen, allerdings ausschließlich Mutationen im Exon 8 mit einer Überexpression von
Hdm2 korrelieren. Mutationen in den Exonen 7 und 8 erzielten zwar eine Akkumulation
von P53, waren aber Hdm2 negativ.
Die Auswertungen, der hier vorliegenden Arbeit, stimmen somit größtenteils mit den
Ergebnissen von Lianes et al. [144] überein. Allerdings ist ein direkter Vergleich der
Ergebnisse nicht ganz einfach, da eine getrennte Betrachtung von zytoplasmatischer
und nukleärer Hdm2-Färbung, wie sie in der vorliegenden Arbeit durchgeführt wurde, in
keiner der aufgelisteten Publikationen erfolgte. In 16,9% der invasiven Tumoren kann
in den Tumorzellen der Phänotyp Hdm2 Z+/K+ gefunden werden. Isoliert im Nukleus
gefärbt nur 5,5%. Betrachtet man alle Hdm2-positiven Kernfärbungen unabhängig
einer parallelen Zytoplasmafärbung, ergibt sich für den Phänotyp Hdm2 K+ eine
Häufigkeit von 22,4%, die mit den 24% von Lianes et al. übereinstimmt. Insgesamt sind
in der vorliegenden Arbeit 67,2% der Tumoren P53-positiv, doch wurde bei Lianes et
al. ein cut-off von 20% für die P53-Positivität gesetzt und nicht bei 10%, wie in der
vorliegenden Auswertung. Werden nur die zwei- und dreifach-positiven P53Tumorproben in die Berechnungen mit einbezogen, so ergibt sich ebenfalls eine
Positivität von 41,4%. Der Phänotyp Hdm2(K+/Z+)+/P53+ ist mit 14,4% (p≤0,05,
C=0,18) vertreten (Vergleiche 24% Hdm2+, 41% P53+, 18% Hdm2+/p53+ bei Lianes
et al. [144]).
Schließt man den Regulationszyklus von Hdm2/P53/P14ARF in die Überlegungen mit
ein, so scheint es verwunderlich, dass der Phänotyp Hdm2+/P53+ existiert, da nach
dem bisherigen Stand der Wissenschaft ein erhöhtes Hdm2 zu einer verstärkten P53Degradierung führen müsste und somit P53 als Zellzyklusregulator fehlen würde [172,
168]. Im Umkehrschluss führt P53 in gesunden Zellen im Rahmen einer negativen
Rückkopplungsschleife zu einer verstärkten Hdm2-Expression und induziert seinen
7. Diskussion
Seite | 118
eigenen Abbau. Eine Erklärung für den simultan positiven Phänotyp in den
untersuchten Proben liefern die Resultate von Gajjar et al.. Diese Gruppe postuliert ein
Modell, indem durch genotoxischen Zellstress Hdm2 am Ser395 ATM-abhängig
phosphoryliert wird. Dadurch erfolgt eine Konformationsänderung der Hdm2-RINGDomäne, und exponiert eine Bindungsregion für P53 mRNA. Diese Interaktion führt zu
einer SUMO-lierung von Hdm2 und translokalisiert Hdm2 in den Nukleolus. Hdm2 wird
dadurch zu einem positiven Regulator von P53, verstärkt dessen Synthese und
unterdrückt die Hdm2-abhängige Ubiquitinierung von P53. Aufgrund der gefundenen
Daten vermutete diese Gruppe, dass ein Mechanismus existiert, mit dem die Bindung
von P53-mRNA an Hdm2 zu einer verstärkten Expression von P53, als Antwort auf
DNA-Schäden, führt [63].
Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen Expressionsmuster von P53 und P14ARF in
Hdm2-positiven Zellen, unterstützen die Annahme, dass es einen Hdm2-abhängigen
Mechanismus des Regelkreises P53/P14ARF/Hdm2 geben muss. Für diesen müssen
jedoch alle drei Proteine gleichzeitig in den Zellkernen vorhanden sein. Diese
Ergebnisse werden durch die oben erläuterten Ergebnisse von Gajjar et al. unterstützt
[63].
Durch die gleiche Argumentation lassen sich auch die Ergebnisse von Shiina et al.
[227] erklären. Die schlechte Prognose der Patienten des Phänotyps Hdm2-/P53+,
welcher in der hier vorliegenden Arbeit mit 52,8% den häufigsten Phänotyp ausmacht,
könnte daraus resultieren, dass P53 zwar vorliegt, dessen Expression aber nicht durch
Hdm2 verstärkt wird. Die Zelle wäre dadurch nicht mehr in der Lage die DNA-Schäden
zu reparieren, während der Phänotyp Hdm2+/P53+ dies eventuell noch könnte und
somit dieser Phänotyp eine besseren Prognose hätte.
Das gerade der Phänotyp mit der schlechtesten Prognose, in den hier aufgelisteten
Ergebnissen, überwiegt, könnte daran liegen, dass in diesem Kollektiv überwiegend
fortgeschrittene invasive Tumore untersucht wurden, die an sich schon eine schlechte
Prognose haben.
Die Experimente von Markl und Jones [150] schlossen die Expression von P14ARF in
ihre Untersuchungen, zum Mechanismus der P53-Regulation, mit ein. Sie konnten
zeigen, dass eine Mutation der Exone 5-11 im p53-Gen meist mit mutiertem Rb
vergesellschaftet ist, und Mutationen der Exone 1-4 oder Wildtyp gemeinsam mit
Mutationen des CDKN2A/ARF-Lokus auftreten. Sie postulierten, dass P14ARF entweder
direkt zu einer Erhöhung der P53-Expression führen kann, oder indirekt durch die
Verhinderung der Interaktion von Hdm2 und P53. Dies deckt sich mit den oben
7. Diskussion
Seite | 119
aufgeführten Ergebnissen. Die unter 6.2.3 aufgelisteten Ergebnisse legen nahe, dass
die p53-Expression eher von einer simultanen p14ARF-Expression abhängig ist, als von
einer simultanen Hdm2-Expression. Unabhängig der Hdm2-Lokalisation und des
Hdm2-Expressionsniveaus reduziert sich die Häufigkeit von als P53-positiv bewerteten
Tumorproben
p14ARF-negativ
in
bewerteten,
im
Gegensatz
zu
p14ARF-positiv
bewerteten Proben (Tabelle 6-25). P14ARF kann die Wirkweise von Hdm2 nicht mehr
verhindern und somit wird P53 abgebaut, was nach Markl und Jones [150] ein häufig
eintretendes Ereignis bei der Entstehung von Blasentumoren ist.
Die
Datenlage
zur
Aussagekraft
zytoplasmatischer
Hdm2-Expression
ist
ausgesprochen schwach und es häufen sich in der Literatur Zweifel, ob es sich bei
dieser Färbung nicht um eine unspezifische Begleitreaktion des Antikörpers handelt.
Wie im Ergebnisteil beschrieben, verhalten sich die zytoplasmatischen Hdm2Färbungen
nicht
kongruent
zu
den
nukleären
oder
kolokalisierten
Hdm2-
Überexpressionen, oder mussten als nicht signifikant betrachtet werden. In einigen
Arbeiten
wird
hierzu
von
Hdm2-Antikörperklonen
berichtet,
bei
denen
eine
Kreuzreaktivität der Antikörper zu zytoplasmatisch lokalisierten Zytokeratinen bestehen
kann. Jedoch wurde in keiner recherchierten Publikation dem in dieser Arbeit
verwendeten Antikörper-Klon diese Kreuzreaktivität zugeschrieben [188]. Ein anderer
Erklärungsansatz wäre eine Färbung unterschiedlicher Hdm2-Isoformen. Wie in Kapitel
2.3.2.1 beschrieben, existieren P53-unabhängige Hdm2-Isoformen, die konstitutiv
abgelesen werden und von den Antikörpern mit gefärbt werden [177]. Diese sind
eventuell nicht in den P53-P14ARF-Hdm2-Regelkreis eingebunden. Eine Entwicklung
von Antikörpern, die isoliert verschiedene Hdm2-Isoformen färben, könnte helfen
weitere Funktionen dieser Isoformen zu definieren.
Weiterführende Arbeiten, die sich mit einem möglichen Zusammenhang zwischen den
verschiedenen
Hdm2-Lokalisationen
und
Tumorprogression
oder
Prognose
beschäftigen, sind denkbar.
7.4
P14ARF/P16INK4a
P14ARF und P16INK4a entstehen durch einen alternativen Leserahmen aus dem
INK4a/ARF-Genlokus. Sie sind in zwei unterschiedlichen Wegen der Tumorigenese
involviert. In den meisten invasiven Blasenkarzinomen ist entweder der P14ARF/P53oder der P16INK4a/Rb-Weg oder simultan beide Wege außer Kraft gesetzt [136]. In einer
Untersuchung von mehreren unterschiedlichen humanen Tumoren (Pankreas-Ca,
NSCLC) konnten Geradts et al. [65] feststellen, dass der Verlust der P14ARF7. Diskussion
Seite | 120
Expression zwar häufig auftritt, aber seltener als die Supprimierung von P16INK4a (53%
gegen 76%). Der am häufigsten vorkommenden Mechanismus, der Inaktivierung von
P16INK4a und P14ARF, sind homozygote Deletionen des Gens, Hypermethylierung der
Promoter (1α von P16INK4a, 1β von P14ARF), sowie intragenetische Mutationen. Die
Methylierungen der Promoter scheinen voneinander unabhängige Ereignisse zu sein,
so dass es Mechanismen gibt, mit deren Hilfe die Proteine des Gens unabhängig
reguliert werden können [47].
Die vorliegende Arbeit kann diese Diskrepanz, durch das unterschiedliche Auftreten
verschiedener Phänotypen, ebenfalls bestätigen. P14ARF ist in 16,9% der invasiven
Tumoren negativ bis leicht gefärbt, P16INK4a dagegen in 42,4%, wenn nur die
Kernfärbung betrachtet wird, wie es in den zitierten Arbeiten der Fall ist.
Le
Frère-Belda
et
al.
[136]
fanden
in
Ihren
Untersuchungen eine
große
Übereinstimmung der Expressionsmuster von nukleärem P16INK4a und P14ARF (71%) im
Blasenkarzinom, so dass sie von einer gemeinsamen Regulation der Expression dieser
Proteine ausgingen. Doch auch sie fanden Phänotypen, die gegen eine ausschließlich
identische
Regulation
sprechen
(P14+/16-
in
24%,
P14-/P16+
in
5%).
Interessanterweise zeigten ihre Ergebnisse, dass sich in Tumorproben, die P14ARFnegativ waren, zu 94,4% keine P16INK4a-Färbung nachweisen ließ. Wenn P14ARF-positiv
war, zeigten 86,7% diese Tumorproben auch eine P16INK4a-Positivität.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit laufen damit konform, denn die Verteilung der
nachgewiesenen Phänotypen ist auch in diesem Kollektiv mit ähnlicher Häufigkeit
nachweisbar. Wurden nur die Proben betrachtet, die eine isolierte P16INK4a-Positivität
für den Kern aufwiesen, waren alle P14ARF-negativen bis leicht gefärbten Präparate
auch negativ für den Nachweis einer P16INK4a-Expression. Waren Kern und Zytoplasma
gefärbt, trat der Phänotyp P14ARF-/P16 INK4a- in 77,4% der Proben auf.
Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass sobald P14ARF mutiert ist, meist auch die
Expression von P16INK4a kompromittiert ist. Es könnte sich folglich um eine Mutation
handeln, die die Expression beider Genprodukte gleichzeitig beeinflusst. Die Gruppe
um Rocco et al. [200] untersuchten die Häufigkeiten der verschiedenen Möglichkeiten
P16INK4a zu supprimieren. In 54,2% der untersuchten Blasentumoren, mit P16INK4aInaktivierung, fanden sie homozygote Deletionen, in 6,8% Mutationen und in 39,0%
Promotermethylierungen. Bei homozygoten Deletionen können P14ARF und P16INK4a
gleichzeitig inaktiviert werden. Da dieser Mechanismus am häufigsten in der Arbeit von
Rocco et al. [200] nachgewiesen wurde, wäre zu erwarten gewesen, dass in der
vorliegenden Arbeit der Phänotyp P14ARF-/P16 INK4a- mit der größten Häufigkeit auftritt.
7. Diskussion
Seite | 121
Mit einem Vorkommen in nur 13,0% der Proben tritt er jedoch eher selten auf, was
möglicherweise durch das Vorherrschen anderer Mutationen, mit unterschiedlicher
Auswirkung auf die Expression der beiden Genprodukte, zu erklären wäre.
Umgekehrt ist bei den P16INK4a-negativen Schnittpräparaten in den meisten Fällen
P14ARF trotzdem in den Zellkernen nachweisbar. Die Regulation von P16INK4a scheint
somit in einigen Fällen unabhängig von der Expression von P14ARF zu sein. Umgekehrt
scheint dies nicht der Fall zu sein. Dafür spricht auch, dass noch keine Mutation
beschrieben wurde, die selektiv Exon 1β, das erste Exon von P14ARF betrifft [234],
jedoch konnten vier verschieden Mutationen im Exon 1α identifiziert werden [52]. Um
diesen Phänotyp genauer charakterisieren zu können, müssten Mutationsanalysen in
diesen Proben durchgeführt werden, die den Genlokus INK4a/ARF vollständig
sequenzieren.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit korrelieren eher mit den Auswertungen zum
Nicht-kleinzelligen-Lungenkarzinom von Geradts et al. [65]. Sie identifizierten ebenfalls
die Phänotypen P14ARF+/P16INK4a+, P14ARF+/16INK4a-, P14ARF-/P16INK4a+ und P14ARF/P16INK4a- mit einer Häufigkeit von 43,3%, 16,7%, 10,0% und 30,0% (Vergleiche die
oben aufgeführten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit mit 37,9%, 45,3%, 3,8% und
13,0%.). Interessant ist, dass in allen drei Arbeiten [65, 136] der Phänotyp P14ARF/P16INK4a+ am seltensten auftritt, während P14ARF+/16INK4a- häufig vertreten ist,
beziehungsweise in der vorliegenden Arbeit mit der größten Häufigkeit auftritt. Auch
diese Ergebnisse sprechen für eine stärkere Abhängigkeit der P14ARF-Regulation von
der Expression von P16INK4a als das umgekehrt der Fall ist.
Keine Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Le Frère-Belda et al. [136] findet sich
bei dem Phänotyp P14ARF+/P16INK4a+. In der hier vorliegenden Arbeit lassen sich unter
den P14ARF-positiven Schnittpräparaten zwei Gruppen mit einem etwa gleichen Anteil
an Proben identifizieren: 54,4% der Proben sind P16INK4a-negativ, 45,6% sind P16INK4apositiv (Vergleiche 86,7% bei le Frère-Belda).
Rocco et al. [200] erklärten den Phänotyp P14ARF+/16INK4a- durch die Abhängigkeit von
der P53- und Rb-Signalkaskade. Der Verlust von P16INK4a würde somit, durch
Überkreuzungen der beschriebenen Wege, P53 aktivieren und damit dieses in seiner
Funktion als Tumorsuppressor aktivieren. Dadurch würde P14ARF hochreguliert werden,
um Hdm2 im Nukleolus festzuhalten [200]. Das Resultat wäre ein Phänotyp mit dem
Expressionsprofil P14ARF+/P16INK4a-. Gezielte Untersuchungen, die vor allem auch die
funktionellen Aspekte dieser Hypothese im invasiven Blasenkarzinom belegen, stehen
derzeit noch aus.
7. Diskussion
Seite | 122
Die Entstehung des P14ARF+/P16INK4a+ Phänotyps im invasiven Blasenkarzinom wäre
damit erklärbar, dass entweder auch Wildtyp-Proteine exprimiert werden können, die
dann immunhistochemisch nachweisbar sind, oder missense-Mutationen auftreten, die
zu inaktiven Proteinen führen, die ebenfalls positiv gefärbt werden [65].
In gesunden Zellen wird P16INK4a im Zytoplasma exprimiert und anschließend in den
Nukleus transportiert. Eine immunhistochemische Färbung, die im Zytoplasma
lokalisiert ist, gilt unter diesen Umständen deshalb als unspezifisch. In mehreren
Arbeiten wurde berichtet, dass P16INK4a in Tumorzellen vermindert oder nicht mehr in
Nukleus
vorkommen
kann
[123,
61,
139],
jedoch
kann
eine
spezifische
zytoplasmatische Färbung in diesen Zellen beobachtet werden. Evangelou et al. [48]
entdeckten eine simultane P16INK4a-Färbung von Nukleus und Zytoplasma in
Tumorzellen von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen. Di Vinci et al. [39] zeigten in
ihren Ergebnisse, dass P16INK4a in Fibroadenomen der Brust und im gesunden Epithel
nukleär lokalisiert ist, während in Mammakarzinomen die Färbung nukleär und
zytoplasmatisch beobachtet werden kann. Weiterhin erkannte die Gruppe um MildeLangosch [160], dass die Expression von P16INK4a in Nukleus und Zytoplasma im
Mammakarzinom mit einem stärkeren Differenzierungsgrad und einem maligneren
Phänotyp korreliert. Im pleomorphen Adenom der Speicheldrüsen konnten Yu-Hua Hu
et al. [96] zeigen, dass der P16INK4a-Status im Nukleus vermindert und im Zytoplasma
erhöht ist. Es wurde jedoch keine Korrelation mit dem Methylierungszustand des
P16INK4a-Promoters gefunden.
Erklärungsversuche für die zytoplasmatische Expression von P16INK4a sind bisher
unbefriedigend. Evangelou et al. [48] postulieren eine Inaktivierung von P16INK4a, durch
die die zytoplasmatische Expression zustande kommt. Jedoch konnten weder
Mutationen
noch
unterschiedlichen
der
Verlust
der
Brustkrebszelllinien
Heterozygotie
mit
des
p16INK4a-Gens
zytoplasmatischer
in
drei
P16INK4a-Expression
identifiziert werden [46]. Diskutiert werden bisher nicht detektierte Mutationen in
Chaperon-Gruppen, durch die der nukleäre Eintritt des P16INK4a-Proteins verhindert
wird [6]. Auch eine Komplexbildung mit CDK-4 wird diskutiert. In einem Zustand der
Überexpression von CDK-4, kann P16INK4a an dieses Protein binden, um die Zelle zu
schützen. Der neu geformte Komplex erreicht eine Größe, die es P16INK4a unmöglich
macht in den Zellkern zurückzukehren und so als Tumorsupressor zu agieren [270].
Die Lokalisation von P16INK4a im Zytoplasma kann dementsprechend einen
Mechanismus repräsentieren, der zur Inaktivierung von P16INK4a führt.
Auch in der hier vorliegenden Arbeit konnten spezifische Zytoplasmafärbungen der
Tumorzellen
gefunden
werden.
Diese
Proben
weisen
ein
abweichendes
7. Diskussion
Seite | 123
Färbeverhalten von den nukleär gefärbten Tumorproben auf. Wie im Ergebnisteil 6.3
beschrieben, sind 40% der isoliert zytoplasmatisch-gefärbten P16INK4a-Tumorproben
P14ARF-negativ bis leichtgewertet worden. Ein Erklärungsvorschlag für diesen
Phänotyp ist, dass wie weiter oben erläutert, eine Expression von P16INK4A im
Zytoplasma vor allem in weiter fortgeschrittenen Tumoren dominiert und für deren
schlechtere Prognose verantwortlich ist. Durch die supprimierte Expression von P14ARF
wäre
die
P53-Signalkaskade
gestört.
Somit
könnte
der
Phänotyp
P14ARF-
/P16INK4AZ+/K- ein Patientenkollektiv mit schlechterer Prognose beschreiben.
Auf der Basis der vorliegenden Ergebnisse könnten in einer weiteren Arbeit die
Abhängigkeiten
der
P14ARF-
und
P16INK4a-Mutationen
untersucht
und
mit
Patientendaten korreliert werden, um eventuell eine Patientengruppe mit besonders
schlechter oder besonders guter Prognose zu identifizieren.
7.5
Digitale Pathologie
Die virtuelle Darstellung eines gesamten Objektträgers, wie sie in der vorliegenden
Arbeit verwendet wurde, ist eine Technik die aus zwei Komponenten besteht. Erstens
muss der gesamte gläserne Objektträger mit dem enthaltenen histologischen Präparat
gescannt werden. Zweitens wird eine Software benötigt mit der die digitalen Daten
bearbeitet werden können [257].
Diese Art der Datenerhebung bietet mehrere Vorteile. Immunhistochemische oder
Floureszenzfärbungen, die unter herkömmlichen Methoden aufbewahrt werden
erfahren über die Jahre ein Ausbleichen der Farben. Digitale Objektträger behalten
dagegen ihre ursprüngliche Qualität bei [25]. Da sich die hier vorliegende Arbeit über
einen längeren Zeitrahmen hingezogen hat, konnte mit der Digitalisierung der Proben
ein Verlust der Daten verhindert werden.
Weiterhin ist zu beachten, dass Referenzproben schnell und direkt miteinander
verglichen werden können. Diese direkte Gegenüberstellung wie sie in Kapitel 5.4
geschildert ist, lässt bei Expressionsanalysen auch kleinste Unterschiede erkennen
und dokumentieren [25].
Das gescannte Präparat wird digital gespeichert und bietet die Möglichkeit jeder Zeit
abgerufen zu werden. Es ist immer das gesamte Präparat verfügbar und ermöglicht die
Analyse in verschiedenen Vergrößerungen [25].
7. Diskussion
Seite | 124
Die Digitalisierung von pathologischen Untersuchungsmaterialien hat der Telemedizin
neue Wege geöffnet. Hierbei können Präparate nicht durch ein Mikroskop, sondern
durch
digitale
Software
ortsunabhängig
betrachtet
werden.
Dies
kann
für
Primärdiagnosen, Zweitmeinungen, Fernstudien oder Qualitätssicherung verwendet
werden [8]. Zur Telepathologie zählt man statische, dynamische und Hybridsysteme
sowie das Scannen von ganzen Objektträgern. [8].
Durch das Einscannen gesamter Objektträger ist das telepathologische Befunden
einzelner Präparate möglich geworden. Dies stellt einen Meilenstein in der
Durchführung von telepathologischen Konsilen dar. Komplizierte Patientenfälle, zu
denen eine Zweitmeinung zu tragbaren Kosten erbeten wird, können virtuell diskutiert
werden [216].
Ein Beispiel für die routinemäßige Nutzung dieses Systems stellt das MammographieScreening in Deutschland dar. 2005 wurde im Auftrag des Bundesverbandes
Deutscher Pathologen am Institut für Pathologie der Charité Berlin ein TelepathologieKonsultationsservice
„T.Konsult
Pathologie“
etabliert.
Nach
einem
auffälligen
radiologischen Befund können histologische Untersuchungen mehrfach befundet
werden. Pathologen aus ganz Deutschland können auf dieser Internetplattform die
vorliegenden
Patientendaten
eingeben
und
die
dazugehörigen
digitalisierten
Objektträger versenden. Dadurch entfällt das zeit- und kostenaufwändige postalische
Versenden der auf einen Glasobjektträger aufgebrachten histologischen Präparate. In
50% der Fälle der „T.Konsult Pathologie“-Studie wurde die Zweitbefundung innerhalb
der ersten zwei Tage durchgeführt. Bei Beschreitung des herkömmlichen Weges war
dies in nur 31% der Fall. Eine Doppelbefundung oder das Erörtern einer Zweitmeinung
gewinnt durch Telepathologie erheblich an Geschwindigkeit. In einer Studie konnte
bewiesen werden, dass es eine hohe Korrelation zwischen den konventionellen
Auswertungen histologischer Präparate und der virtuellen Mikroskopie im Rahmen der
Telepathologie gibt [211]. Somit wird durch die Telepathologie unter Einsatz des
Scannens ganzer Objektträger die Möglichkeit eröffnet, eine Verkürzung der
Befundlaufzeit ohne Qualitätseinbußen zu erreichen [216].
Eine
weitere Einsatzmöglichkeit
der Telepathologie
ist
die Versorgung
von
abgelegenen Krankenhäusern in Ländern mit großem Staatsgebiet, wie zum Beispiel
Kanada, und die Versorgung von Entwicklungsländern mit Expertenwissen. So wurden,
im Rahmen des „Eastern Québec telepathology project“, 21 Krankenhäuser mit einem
Scannsystem für Objektträger, einem makroskopischen Arbeitsplatz, Apparaten zur
Videokonferenz
sowie
qualifiziertem
Personal
ausgestattet.
Das
Ziel
dieses
Experimentes war es Strukturen aufzubauen, die eine gute Patientenversorgung in
7. Diskussion
Seite | 125
einem Land mit großer geographischer Weite und geringer Bevölkerungsdichte
garantieren. Chirurgen und Pathologen sollten jederzeit der Zugriff zu Expertenwissen
und Zweitmeinungen ermöglicht werden, um einen unnötigen Patiententransfer zu
verhindern. Dieses Ziel konnte, dank der Telepathologie und der Digitalisierung
histologischen Materials, trotz einiger Probleme, erreicht werden [243].
Es ist nicht verwunderlich, dass Norwegen, das aufgrund seiner Besiedelungsstruktur
mit ähnlichen logistischen Problemen wie Kanada konfrontiert ist, das erste Land war,
welches schon 1996 eine Gebührenordnung für telepathologische Befundungen für
das allgemeine Gesundheitswesen erstellte und die gesamte telemedizinische
Versorgung stetig weiter ausbaut [85]
Erwähnenswert ist die Zusammenarbeit des italienischen Krankenhauses in Kairo und
des Städtischen Krankenhauses in Palermo seit 2003, mit Beteiligung von mehreren
Zentren in Venedig, London und Pittsburgh seit 2004. Es ist das erste Krankenhaus im
Nahen Osten, das über eine digitalisierte Pathologie verfügt. Unter Verwendung der
Telepathologie konnten die Ärzte des italienischen Krankenhauses in Kairo
komplizierte Fälle mit Experten aus Italien, England und den USA diskutieren. Dadurch
erreichten sie eine finanzielle und zeitliche Ersparnis und konnten gleichzeitig den
Patienten eine bessere medizinische Versorgung ermöglichen. Sie errichteten eine
virtuelle pathologische Bücherei für Studenten mit Hilfe des Scannens ganzer
Objektträger und digitalisierten ihre gesamte pathologische Lehre. Geplant ist weiterhin
eine digitale Bücherei auf welche die gesamte arabische Welt Zugriff hat [7].
Nach dem Beispiel Ägyptens könnten Entwicklungsländer, beziehungsweise alle
Länder mit einer schlechten Versorgung mit Pathologen, durch Telepathologie ihre
Patientenversorgung verbessern.
Wie schon erwähnt konnte in der vorliegenden Arbeit ein Verlust der Daten, über einen
längeren Zeitraum, durch Digitalisierung der Objektträger verhindert werden. Eine
Gegenüberstellung der verschiedenen immunhistochemischen Färbungen, erleichterte
die Auswertung koexprimierter Proteine erheblich. Der Vorteil der Vergrößerung und
Speicherung von Tumorproben machte sich vor allem bei der Konsultation eines
Pathologen, zur Einholung einer Zweitmeinung, bemerkbar.
Es konnte festgestellt werden, dass digitalisierte slides von TMAs durchaus als
repräsentativ für die Gesamtheit der Tumoren gewertet werden können und die
gleichen phänotypischen Muster zeigen, die aus der Literatur zu erwarten waren.
7. Diskussion
Seite | 126
8
Abkürzungsverzeichnis
AEC-Syndrom
Ankyloblepharon-Ektodermaldysplasie-CleftingSyndrom
AKT
Proteinkinase B
AS
Aminosäure
CDKN2a
Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
cDNA
komplementäre Desoxyribonukleinsäure
C-Terminus
Carboxy-Terminus
Da
Dalton
DNA
Desoxyribonukleinsäure
et al
et alii, et aliae, et alia (und andere)
K+/K-
Kern positiv gewertet/Kern negativ gewertet
kD
Kilodalton
Leu
Leucin
Lys
Lysin
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
N-Terminus
Amino-Terminus
p53, p63, p14
ARF
P53, P63, P14
, p16
ARF
INK4a
, P16
, hdm2
INK4a
, Hdm2
p53-, p63-, p14
ARF
P53-, P63-, P14
INK4a
-, p16
ARF
-, P16
-, hdm2-Gen
INK4a
-, Hdm2- Protein
Phe
Phenylalanin
pRb
phosphoryliertes Retinoblastomprotein
Rb
Retinoblastomprotein
RING
Really Interesting New Gene
RNA
Ribonukleinsäure
rRNA
ribosomale Ribonukleinsäure
Ser
Serin
Thr
Threonin
Trp
Tryptophan
UV
Ultraviolett
wt
Wildtyp
Z+/Z-
Zytoplasma
gewertet
Zn+
Zinkion
positiv
gewertet/Zytoplasma
negativ
8. Abkürzungsverzeichnis
Seite | 127
9
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2-1: Proteininteraktionen von P14ARF .............................................................. 23
Tabelle 2-2: Transkriptionale Regulation ..................................................................... 36
Tabelle 2-3: Veränderungen bei Ta-Blasenkarzinomen in Abhängigkeit ihrer Häufigkeit
................................................................................................................................... 45
INK4a
-Inaktivierung in Primärtumoren in Abhängigkeit des
Tabelle 2-4:Häufigkeit der P16
Mechanismus (ND = „not done“, NSCLC = „ Non-small-cell lung cancer“, SCLC = „
small cell lung cancer“) [200] ...................................................................................... 53
Tabelle 5-1: Antikörper................................................................................................ 57
Tabelle 5-2: Chemikalien ............................................................................................ 58
Tabelle 5-3: Geräte ..................................................................................................... 58
Tabelle 5-4: Lösungen und Puffer ............................................................................... 59
Tabelle 6-1: Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Tumorproben nach der
Lokalisation................................................................................................................. 66
Tabelle 6-2: Auswertung der immunhistochemischen P53-Färbung ........................... 67
Tabelle 6-3: Auswertung der immunhistochemischen P53-Färbung mit anderer
Aufteilung ................................................................................................................... 68
Tabelle 6-4: Auswertung der immunhistochemischen Hdm2-Färbung nach Lokalisation
................................................................................................................................... 69
Tabelle 6-5: Auswertung der immunhistochemischen P14ARF-Färbung ....................... 72
Tabelle 6-6: Auswertung der immunhistochemischen P14ARF-Färbung mit anderer
Aufteilung ................................................................................................................... 72
nach
Lokalisation
des
Tabelle
6-7:
Korrelation
der
P16INK4a-Färbung
immumhistochemischen Nachweises ......................................................................... 76
Tabelle 6-8: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Auswertung der P16INK4aFärbung im Nukleus und Zytoplasma.......................................................................... 77
Tabelle 6-9: Immunhistochemische Auswertung der P63-Färbung ............................ 79
Tabelle 6-10: Zusammenhang der immunhistochemischen Färbung von P53 und P63
im invasiven Blasenkarzinom ...................................................................................... 81
Tabelle 6-11: Zusammenhang der Intensitäten der immunhistochemischen Färbung
von P53 und P63 im invasiven Blasenkarzinom .......................................................... 82
Tabelle 6-12: Korrelation von P14ARF mit P63 ............................................................. 84
Tabelle 6-13: Korrelation von P53, P63 und P14ARF .................................................... 85
Tabelle 6-14: Korrelation von P14ARF und P63 im invasiven Harnblasenkarzinom ...... 86
Tabelle 6-15: Korrelation von P53 und P63 im invasiven Harnblasenkarzinom ........... 86
Tabelle 6-16: Korrelation von P14ARF und P53 im invasiven Harnblasenkarzinom ...... 87
Tabelle 6-17: Korrelation von P53, P14ARFund P63 im invasiven Harnblasenkarzinom 89
9. Tabellenverzeichnis
Seite | 128
Tabelle 6-18: Korrelation von P14ARF und P53 im invasiven Harnblasenkarzinom ...... 90
Tabelle 6-19: Korrelation von P63, P53 und P14ARF im invasiven Blasenkarzinom ..... 91
Tabelle 6-20: Zusammenhang der Expressionsmuster von P53 und Hdm2 im invasiven
Blasenkarzinom .......................................................................................................... 93
Tabelle 6-21: Verteilung der Intensität der Hdm2- und P53-immunhistochemischen
Färbungen .................................................................................................................. 93
Tabelle 6-22: Zusammenhang der nukleären Färbungen von P53 und Hdm2 im
invasiven Blasenkarzinom .......................................................................................... 94
Tabelle 6-23: Zusammenhang der nukleären Färbungen von P53 und der
zytoplasmatischen Färbung von Hdm2 im invasiven Blasenkarzinom......................... 95
Tabelle 6-24: Korrelation zwischen P53- und P14ARF-positiven Proben....................... 96
Tabelle 6-25: Korrelation von P53 und P14ARF und Hdm2 ........................................... 97
Tabelle 6-26: Korrelation und Musterverteilung von P14ARF in Hdm2-positiv gewerteten
Proben ........................................................................................................................ 99
Tabelle 6-27: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14ARF in gefärbten Hdm2
Proben ...................................................................................................................... 100
Tabelle 6-28: Korrelation zwischen den als P14ARF-positiv und den als P16INK4a-positiv
bewerteten Proben ................................................................................................... 103
Tabelle 6-29: Korrelation zwischen als P14ARF-positiv bewerteten und isoliert nukleären
P16INK4a-Färbungen .................................................................................................. 104
Tabelle 6-30: Korrelation zwischen als P14ARF-positiv bewerteten und isoliert
zytoplasmatischen P16INK4a-Färbungen .................................................................... 105
Tabelle 6-31: Korrelation zwischen P14ARF-positiven sowie kolokalisierter P16INK4aFärbung .................................................................................................................... 106
9. Tabellenverzeichnis
Seite | 129
10 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2-1: Häufigkeit der Urothelkarzinome in Korrelation zur urothelialen
Oberfläche [205] ........................................................................................................... 5
Abbildung 2-2: T-Stadium Urothelkarzinom................................................................... 7
Abbildung 2-3: N-Stadien Urothelkarzinom ................................................................... 8
Abbildung 2-4: M-Stadien Urothelkarzinom ................................................................... 8
Abbildung 2-5: Histopathologisches Grading (WHO-Klassifikation) [78] ........................ 9
Abbildung 2-6: Cyklin-abhängige Zellzykluskontrolle .................................................. 12
Abbildung 2-7: Proteinstruktur von P53....................................................................... 14
Abbildung 2-8: Proteinstruktur von Hdm2 ................................................................... 19
Abbildung2-9: INK4a/ARF-Genstruktur ....................................................................... 21
Abbildung 2-10: P53-abhängiger G1-Zellzyklusarrest [16] ........................................... 24
Abbildung 2-11: P53-abhängiger G2-Zellzyklusarrest [16] ........................................... 25
Abbildung 2-12: Regulation der zellulären Verteilung von P53 [16] ............................. 26
Abbildung 2-13: Negative Rückkopplung von P53 und Hdm2 ..................................... 27
Abbildung 2-14: Proteinverteilung nach DNA-Schäden [66] ........................................ 31
Abbildung 2-15: Regulationsweg P14ARF-Hdm2-P53 ................................................... 32
Abbildung 2-16: Die Rolle des P16INK4a/Rb-Regulationsweges im Zellzyklusarrest von
gealterten Zellen [238] ................................................................................................ 35
Abbildung 2-17: Lokalisation der Punktmutationen des p63-Gens [167] ..................... 40
Abbildung 2-18: Mutationen und Entstehungswege von Urothelkarzinomen [71] ........ 43
Abbildung 2-19: Mutierte Gene der MAPK/PI3K Signalkaskade in TaBlasentumoren[71]...................................................................................................... 46
Abbildung 3-1: TMA .................................................................................................... 55
Abbildung 5-1: Tissue Microarray Herstellung [255] .................................................... 60
Abbildung 5-2: ABC-Methode ..................................................................................... 61
Abbildung 6-1: Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Proben..................... 65
Abbildung 6-2: Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Tumorproben nach der
Lokalisation................................................................................................................. 66
Abbildung 6-3: Graphische Darstellung der immunhistochemischen P53-Färbung ..... 67
Abbildung 6-4: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P53-Akkumulation mit
dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 10facher Vergrößerung ................ 68
Abbildung 6-5: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P53-Akkumulation mit
dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 60facher Vergrößerung ................ 69
10. Abbildungsverzeichnis
Seite | 130
Abbildung 6-6: Zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis der Hdm2Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 10facher Vergrößerung
................................................................................................................................... 70
Abbildung 6-7: Zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis der Hdm2Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 60facher Vergrößerung
................................................................................................................................... 70
Abbildung 6-8: Zytoplasmatischer und nukleärer immunhistochemischer Nachweis der
Hdm2-Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 10facher
Vergrößerung ............................................................................................................. 71
Abbildung 6-9: Zytoplasmatischer und nukleärer immunhistochemischer Nachweis der
Hdm2-Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 60facher
Vergrößerung ............................................................................................................. 71
Abbildung 6-10: Auswertung der immunhistochemischen P14ARF-Färbung ................. 72
Abbildung 6-11: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P14ARF-Färbung mit
dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 10facher Vergrößerung ................ 73
Abbildung 6-12: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P14ARF-Färbung mit
dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 60facher Vergrößerung ................ 74
Abbildung 6-13: Nukleolärer immunhistochemischer Nachweis der P14ARF-Färbung mit
dem oben genannten monoklonalem Antikörper in 80facher Vergrößerung im TMA ... 74
Abbildung 6-14: Nukleolärer immunhistochemischer Nachweis der P14ARF-Färbung mit
dem oben genannten monoklonalem Antikörper im herkömmlichen Schnittpräparat .. 75
Abbildung 6-15: Nukleolärer immunhistochemischer Nachweis der P14ARF-Färbung mit
dem oben genannten monoklonalem Antikörper im herkömmlichen Schnittpräparat .. 75
Abbildung 6-16: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Auswertung der
P16INK4a-Färbung im Nukleus und Zytoplasma ............................................................ 77
Abbildung 6-17: : Nukleärer und zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis
der P16INK4a-Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper im TMA in
10facher Vergrößerung ............................................................................................... 78
Abbildung 6-18: Nukleärer und zytoplasmatischer immunhistochemischer Nachweis
der P16INK4a-Färbung mit dem oben genannten monoklonalem Antikörper im TMA in
40facher Vergrößerung ............................................................................................... 78
Abbildung 6-19: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P63-Färbung mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper im TMA in 10facher Vergrößerung .......... 80
Abbildung 6-20: Nukleärer immunhistochemischer Nachweis der P63-Färbung mit dem
oben genannten monoklonalem Antikörper im TMA in 60facher Vergrößerung .......... 80
Abbildung 6-21: Graphische Darstellung der Expressionsmuster von P53 und P63 im
invasiven Blasenkarzinom .......................................................................................... 83
Abbildung 6-22: Korrelation von P63 mit P14ARF ......................................................... 86
Abbildung 6-23: Korrelation von P63 mit P53.............................................................. 87
Abbildung 6-24: Korrelation von P14ARF und P53 im invasiven Harnblasenkarzinom .. 88
Abbildung 6-25: Korrelation von P63, P53 und P14ARF ................................................ 89
10. Abbildungsverzeichnis
Seite | 131
Abbildung 6-26: Korrelation von P53 und P14ARF ........................................................ 90
Abbildung 6-27: Korrelation von P63, P53 und P14ARF im invasiven Blasenkarzinom . 92
Abbildung 6-28: Gegenüberstellung der Hdm2- und P53-Expressionen ..................... 95
Abbildung 6-29: Graphische Darstellung der Korrelation von P53, P14ARF und Hdm2. 98
Abbildung 6-30: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14ARF in nukleär und
zytoplasmatisch gefärbten Hdm2 Proben ................................................................. 100
Abbildung 6-31: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14ARF in nukleär
gefärbten Hdm2 Proben............................................................................................ 101
Abbildung 6-32: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14ARF in
zytoplasmatisch gefärbten Hdm2 Proben ................................................................. 101
Abbildung 6-33: Korrelation und Musterverteilung von P53 und P14ARF in
zytoplasmatisch gefärbten Hdm2 Proben ................................................................. 102
Abbildung 6-34: Korrelation zwischen P14ARF-gefärbten Proben und kolokalisierter
P16INK4a-Färbung ...................................................................................................... 106
Abbildung 6-35: Korrelation zwischen P16INK4a -gefärbten Proben und kolokalisierter
P14ARF-Färbung ........................................................................................................ 107
Abbildung 6-36: Digitalisierte P63-Färbung im Überblick .......................................... 108
Abbildung 6-37: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Färbungen von P63
und P53 im digitalisierten Objektträger ..................................................................... 109
Abbildung 6-38: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Färbungen von P53,
P14ARF und Hdm2 im digitalisierten Objektträge ........................................................ 109
Abbildung 6-39: Gegenüberstellung der immunhistochemischen Färbungen von
P16INK4a und P14ARF im digitalisierten Objektträger ................................................... 110
Abbildung 6-40: Gegenüberstellung unterschiedlicher Vergrößerungen der
immunhistochemischen P63-Färbung im digitalisierten Objektträger ........................ 111
10. Abbildungsverzeichnis
Seite | 132
11 Literaturverzeichnis
1.
Abdel-Fattah R, Challen C, Griffiths TR, Robinson MC, Neal DE, Lunec J:
Alterations of TP53 in microdissected transitional cell carcinoma of the
human urinary bladder: high frequency of TP53 accumulation in the
absence of detected mutations is associated with poor prognosis. Br J
Cancer 1998, 77(12):2230-2238.
2.
Alani RM, Young AZ, Shifflett CB: Id1 regulation of cellular senescence
through transcriptional repression of p16/Ink4a. Proc Natl Acad Sci U S A
2001, 98(14):7812-7816.
3.
Alarcon R, Koumenis C, Geyer RK, Maki CG, Giaccia AJ: Hypoxia induces
p53 accumulation through MDM2 down-regulation and inhibition of E6mediated degradation. Cancer Res 1999, 59(24):6046-6051.
4.
Alhopuro P, Ylisaukko-Oja SK, Koskinen WJ, Bono P, Arola J, Jarvinen HJ,
Mecklin JP, Atula T, Kontio R, Makitie AA, Suominen S, Leivo I, Vahteristo P,
Aaltonen LM, Aaltonen LA: The MDM2 promoter polymorphism SNP309T->G and the risk of uterine leiomyosarcoma, colorectal cancer, and
squamous cell carcinoma of the head and neck. J Med Genet 2005,
42(9):694-698.
5.
Anderstrom C, Johansson SL, Von Schultz L: Primary adenocarcinoma of the
urinary bladder. A clinicopathologic and prognostic study. Cancer 1983,
52(7):1273-1280.
6.
Arifin MT, Hama S, Kajiwara Y, Sugiyama K, Saito T, Matsuura S, Yamasaki F,
Arita K, Kurisu K: Cytoplasmic, but not nuclear, p16 expression may signal
poor prognosis in high-grade astrocytomas. J Neurooncol 2006, 77(3):273277.
7.
Ayad E: Virtual telepathology in Egypt, applications of WSI in Cairo
University. Diagn Pathol 2011, 6 Suppl 1:S1.
8.
Ayad E, Sicurello F: Telepathology in emerging countries pilot project
between Italy and Egypt. Diagn Pathol 2008, 3 Suppl 1:S2.
9.
Ayed A, Mulder FA, Yi GS, Lu Y, Kay LE, Arrowsmith CH: Latent and active
p53 are identical in conformation. Nat Struct Biol 2001, 8(9):756-760.
10.
Baker SJ, Preisinger AC, Jessup JM, Paraskeva C, Markowitz S, Willson JK,
Hamilton S, Vogelstein B: p53 gene mutations occur in combination with
17p allelic deletions as late events in colorectal tumorigenesis. Cancer
Res 1990, 50(23):7717-7722.
11.
Bargonetti J, Manfredi JJ: Multiple roles of the tumor suppressor p53. Curr
Opin Oncol 2002, 14(1):86-91.
12.
Battifora H: The multitumor (sausage) tissue block: novel method for
immunohistochemical antibody testing. Lab Invest 1986, 55(2):244-248.
13.
Batzler WU, Giersiepen K, Hentschel S, Husmann G, Dr. Peter Kaatsch P,
Katalinic A, Kieschke J, Klaus Kraywinkel Msc K, Martin Meyer M, Stabenow R,
Stegmaier C, Joachim Bertz J, Haberland J, Wolf U: Krebs in Deutschland
2003–2004: Häufigkeiten und Trends. In., vol. 6. Berlin: Robert-Koch-Institut,
Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V.; 2008:
82-85.
14.
Beaudry VG, Attardi LD: SKP-ing TAp63: stem cell depletion, senescence,
and premature aging. Cell Stem Cell 2009, 5(1):1-2.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 133
15.
Ben-Porath I, Weinberg RA: When cells get stressed: an integrative view of
cellular senescence. J Clin Invest 2004, 113(1):8-13.
16.
Ben-Saadon R, Fajerman I, Ziv T, Hellman U, Schwartz AL, Ciechanover A:
The tumor suppressor protein p16(INK4a) and the human papillomavirus
oncoprotein-58 E7 are naturally occurring lysine-less proteins that are
degraded by the ubiquitin system. Direct evidence for ubiquitination at the
N-terminal residue. J Biol Chem 2004, 279(40):41414-41421.
17.
Blagosklonny MV, Sionov RV, Hayon IL, Haupt Y: Cell Cycle Checkpoints
and Cancer. In. Georgetown USA: Landes Bioscience, Eurekah.com; 2001:
106-118.
18.
Bond GL, Hu W, Bond EE, Robins H, Lutzker SG, Arva NC, Bargonetti J, Bartel
F, Taubert H, Wuerl P, Onel K, Yip L, Hwang SJ, Strong LC, Lozano G, Levine
AJ: A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates
the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in
humans. Cell 2004, 119(5):591-602.
19.
Bothos J, Tuttle RL, Ottey M, Luca FC, Halazonetis TD: Human LATS1 is a
mitotic exit network kinase. Cancer Res 2005, 65(15):6568-6575.
20.
Brotherton DH, Dhanaraj V, Wick S, Brizuela L, Domaille PJ, Volyanik E, Xu X,
Parisini E, Smith BO, Archer SJ, Serrano M, Brenner SL, Blundell TL, Laue ED:
Crystal structure of the complex of the cyclin D-dependent kinase Cdk6
bound to the cell-cycle inhibitor p19INK4d. Nature 1998, 395(6699):244250.
21.
Campbell NA, Cain ML, Jackson RB, Minorsky PV, Reece JB, Urry LA,
Wasserman SA: Biologie. In., vol. 8. München: Pearson Studium; 2009: 303322.
22.
Campisi J: Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging:
good citizens, bad neighbors. Cell 2005, 120(4):513-522.
23.
Canman CE, Lim DS, Cimprich KA, Taya Y, Tamai K, Sakaguchi K, Appella E,
Kastan MB, Siliciano JD: Activation of the ATM kinase by ionizing radiation
and phosphorylation of p53. Science 1998, 281(5383):1677-1679.
24.
Cantor KP, Lynch CF, Hildesheim ME, Dosemeci M, Lubin J, Alavanja M,
Craun G: Drinking water source and chlorination byproducts. I. Risk of
bladder cancer. Epidemiology 1998, 9(1):21-28.
25.
Carl Zeiss Ag: www.zeiss.de/mirax, last accessed on 01/03/2012 13:09. In.
Oberkochen: Carl Zeiss AG; 2011.
26.
Carnero A, Hudson JD, Price CM, Beach DH: p16INK4A and p19ARF act in
overlapping pathways in cellular immortalization. Nat Cell Biol 2000,
2(3):148-155.
27.
Chang C, Martin RG, Livingston DM, Luborsky SW, Hu CP, Mora PT:
Relationship between T-antigen and tumor-specific transplantation
antigen in simian virus 40-transformed cells. J Virol 1979, 29(1):69-75.
28.
Chang L, Karin M: Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature
2001, 410(6824):37-40.
29.
Chao HH, Buchmann AM, Decaprio JA: Loss of p19(ARF) eliminates the
requirement for the pRB-binding motif in simian virus 40 large T antigenmediated transformation. Mol Cell Biol 2000, 20(20):7624-7633.
30.
Chehab NH, Malikzay A, Appel M, Halazonetis TD: Chk2/hCds1 functions as
a DNA damage checkpoint in G(1) by stabilizing p53. Genes Dev 2000,
14(3):278-288.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 134
31.
Cheng HL, Trink B, Tzai TS, Liu HS, Chan SH, Ho CL, Sidransky D, Chow NH:
Overexpression of c-met as a prognostic indicator for transitional cell
carcinoma of the urinary bladder: a comparison with p53 nuclear
accumulation. J Clin Oncol 2002, 20(6):1544-1550.
32.
Cheng YT, Li YL, Wu JD, Long SB, Tzai TS, Tzeng CC, Lai MD:
Overexpression of MDM-2 mRNA and mutation of the p53 tumor
suppressor gene in bladder carcinoma cell lines. Mol Carcinog 1995,
13(3):173-181.
33.
Choi HR, Batsakis JG, Zhan F, Sturgis E, Luna MA, El-Naggar AK: Differential
expression of p53 gene family members p63 and p73 in head and neck
squamous tumorigenesis. Hum Pathol 2002, 33(2):158-164.
34.
Choi W, Shah JB, Tran M, Svatek R, Marquis L, Lee IL, Yu D, Adam L, Wen S,
Shen Y, Dinney C, Mcconkey DJ, Siefker-Radtke A: p63 Expression Defines a
Lethal Subset of Muscle-Invasive Bladder Cancers. PLoS ONE 2012,
7(1):e30206.
35.
Courtois S, De Fromentel CC, Hainaut P: p53 protein variants: structural and
functional similarities with p63 and p73 isoforms. Oncogene 2004,
23(3):631-638.
36.
Crook T, Nicholls JM, Brooks L, O'nions J, Allday MJ: High level expression of
deltaN-p63: a mechanism for the inactivation of p53 in undifferentiated
nasopharyngeal carcinoma (NPC)? Oncogene 2000, 19(30):3439-3444.
37.
De Graaf P, Little NA, Ramos YF, Meulmeester E, Letteboer SJ, Jochemsen
AG: Hdmx protein stability is regulated by the ubiquitin ligase activity of
Mdm2. J Biol Chem 2003, 278(40):38315-38324.
38.
Deppert W, Buschhausen-Denker G, Patschinsky T, Steinmeyer K: Cell cycle
control of p53 in normal (3T3) and chemically transformed (Meth A)
mouse cells. II. Requirement for cell cycle progression. Oncogene 1990,
5(11):1701-1706.
39.
Di Vinci A, Perdelli L, Banelli B, Salvi S, Casciano I, Gelvi I, Allemanni G,
Margallo E, Gatteschi B, Romani M: p16(INK4a) promoter methylation and
protein expression in breast fibroadenoma and carcinoma. Int J Cancer
2005, 114(3):414-421.
40.
Dimova DK, Dyson NJ: The E2F transcriptional network: old acquaintances
with new faces. Oncogene 2005, 24(17):2810-2826.
41.
Donehower LA, Harvey M, Slagle BL, Mcarthur MJ, Montgomery CA, Jr., Butel
JS, Bradley A: Mice deficient for p53 are developmentally normal but
susceptible to spontaneous tumours. Nature 1992, 356(6366):215-221.
42.
Dumaz N, Meek DW: Serine15 phosphorylation stimulates p53
transactivation but does not directly influence interaction with HDM2.
EMBO J 1999, 18(24):7002-7010.
43.
El-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy DB, Parsons R, Trent JM, Lin D,
Mercer WE, Kinzler KW, Vogelstein B: WAF1, a potential mediator of p53
tumor suppression. Cell 1993, 75(4):817-825.
44.
Eliyahu D, Michalovitz D, Eliyahu S, Pinhasi-Kimhi O, Oren M: Wild-type p53
can inhibit oncogene-mediated focus formation. Proc Natl Acad Sci U S A
1989, 86(22):8763-8767.
45.
Eliyahu D, Raz A, Gruss P, Givol D, Oren M: Participation of p53 cellular
tumour antigen in transformation of normal embryonic cells. Nature 1984,
312(5995):646-649.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 135
46.
Emig R, Magener A, Ehemann V, Meyer A, Stilgenbauer F, Volkmann M,
Wallwiener D, Sinn HP: Aberrant cytoplasmic expression of the p16 protein
in breast cancer is associated with accelerated tumour proliferation. Br J
Cancer 1998, 78(12):1661-1668.
47.
Esteller M, Tortola S, Toyota M, Capella G, Peinado MA, Baylin SB, Herman
JG: Hypermethylation-associated inactivation of p14(ARF) is independent
of p16(INK4a) methylation and p53 mutational status. Cancer Res 2000,
60(1):129-133.
48.
Evangelou K, Bramis J, Peros I, Zacharatos P, Dasiou-Plakida D,
Kalogeropoulos N, Asimacopoulos PJ, Kittas C, Marinos E, Gorgoulis VG:
Electron microscopy evidence that cytoplasmic localization of the
p16(INK4A) "nuclear" cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI) in tumor
cells is specific and not an artifact. A study in non-small cell lung
carcinomas. Biotech Histochem 2004, 79(1):5-10.
49.
Evans SC, Viswanathan M, Grier JD, Narayana M, El-Naggar AK, Lozano G:
An alternatively spliced HDM2 product increases p53 activity by inhibiting
HDM2. Oncogene 2001, 20(30):4041-4049.
50.
Fahraeus R, Lane DP: The p16(INK4a) tumour suppressor protein inhibits
alphavbeta3 integrin-mediated cell spreading on vitronectin by blocking
PKC-dependent localization of alphavbeta3 to focal contacts. EMBO J
1999, 18(8):2106-2118.
51.
Fairchild WV, Spence CR, Solomon HD, Gangai MP: The incidence of
bladder cancer after cyclophosphamide therapy. J Urol 1979, 122(2):163164.
52.
Fargnoli MC, Chimenti S, Keller G, Soyer HP, Dal Pozzo V, Hofler H, Peris K:
CDKN2a/p16INK4a mutations and lack of p19ARF involvement in familial
melanoma kindreds. J Invest Dermatol 1998, 111(6):1202-1206.
53.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM:
http://globocan.iarc.fr, last accessed on 01/03/2012 10:00. In: . vol. 10
[Internet]. Lyon, France: IARC; 2010.
54.
Finlay CA: The mdm-2 oncogene can overcome wild-type p53 suppression
of transformed cell growth. Mol Cell Biol 1993, 13(1):301-306.
55.
Finlay CA, Hinds PW, Levine AJ: The p53 proto-oncogene can act as a
suppressor of transformation. Cell 1989, 57(7):1083-1093.
56.
Flores ER: The roles of p63 in cancer. Cell Cycle 2007, 6(3):300-304.
57.
Flores ER, Sengupta S, Miller JB, Newman JJ, Bronson R, Crowley D, Yang A,
Mckeon F, Jacks T: Tumor predisposition in mice mutant for p63 and p73:
evidence for broader tumor suppressor functions for the p53 family.
Cancer Cell 2005, 7(4):363-373.
58.
Flores ER, Tsai KY, Crowley D, Sengupta S, Yang A, Mckeon F, Jacks T: p63
and p73 are required for p53-dependent apoptosis in response to DNA
damage. Nature 2002, 416(6880):560-564.
59.
Frederic M. Waldman CPND, Peter J. Goebell, Guido Sauter, Christer Busch,
Susan Groshen: Prognostic Markers in Muscle Invasive Bladder Cancer.
60.
Freedman DA, Wu L, Levine AJ: Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell
Mol Life Sci 1999, 55(1):96-107.
61.
Friedrich MG, Blind C, Milde-Langosch K, Erbersdobler A, Conrad S, Loning T,
Hammerer P, Huland H: Frequent p16/MTS1 inactivation in early stages of
11. Literaturverzeichnis
Seite | 136
urothelial carcinoma of the bladder is not associated with tumor
recurrence. Eur Urol 2001, 40(5):518-524.
62.
Fujii Y, Kawakami S, Koga F, Nemoto T, Kihara K: Long-term outcome of
bladder papillary urothelial neoplasms of low malignant potential. BJU Int
2003, 92(6):559-562.
63.
Gajjar M, Candeias MM, Malbert-Colas L, Mazars A, Fujita J, Olivares-Illana V,
Fahraeus R: The p53 mRNA-Mdm2 Interaction Controls Mdm2 Nuclear
Trafficking and Is Required for p53 Activation following DNA Damage.
Cancer Cell 2012, 21(1):25-35.
64.
Gartel AL, Tyner AL: The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21
in apoptosis. Mol Cancer Ther 2002, 1(8):639-649.
65.
Geradts J, Wilentz RE, Roberts H: Immunohistochemical [corrected]
detection of the alternate INK4a-encoded tumor suppressor protein
p14(ARF) in archival human cancers and cell lines using commercial
antibodies: correlation with p16(INK4a) expression. Mod Pathol 2001,
14(11):1162-1168.
66.
Gil J, Peters G: Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor
locus: all for one or one for all. Nat Rev Mol Cell Biol 2006, 7(9):667-677.
67.
Gjerset RA, Bandyopadhyay K: Regulation of p14ARF through subnuclear
compartmentalization. Cell Cycle 2006, 5(7):686-690.
68.
Goebell PJ (ed.): Expression und Spleißvarianten des Humanen Double
Minute-Gens (HDM2) während der Entstehung und Progression von
Urothelkarzinomen Düsseldorf: Heinrich-Heine Universität Düsseldorf; 2000.
69.
Goebell PJ, Groshen SL, Schmitz-Drager BJ: Guidelines for development of
diagnostic markers in bladder cancer. World J Urol 2008, 26(1):5-11.
70.
Goebell PJ, Keck B, Wach S, Wullich B: Value of biomarkers in urology.
Urologe A 2010, 49(4):547-559.
71.
Goebell PJ, Knowles MA: Bladder cancer or bladder cancers? Genetically
distinct malignant conditions of the urothelium. Urol Oncol 2010, 28(4):409428.
72.
Gonzalez MA, Tachibana KE, Laskey RA, Coleman N: Control of DNA
replication and its potential clinical exploitation. Nat Rev Cancer 2005,
5(2):135-141.
73.
Gonzalez S, Serrano M: A new mechanism of inactivation of the INK4/ARF
locus. Cell Cycle 2006, 5(13):1382-1384.
74.
Gould A: Functions of mammalian Polycomb group and trithorax group
related genes. Curr Opin Genet Dev 1997, 7(4):488-494.
75.
Gözde I: Regulation of p16INK4A, The Cyclin Dependent Kinase Inhibitor &
the Tumor Suppressor, Master Thesis. In. Utrecht University; 2009: 5-29.
76.
Grand RJ, Lecane PS, Owen D, Grant ML, Roberts S, Levine AJ, Gallimore PH:
The high levels of p53 present in adenovirus early region 1-transformed
human cells do not cause up-regulation of MDM2 expression. Virology
1995, 210(2):323-334.
77.
Graves BJ, Petersen JM: Specificity within the ets family of transcription
factors. Adv Cancer Res 1998, 75:1-55.
78.
Grube D: Constants and variables in immunohistochemistry. Arch Histol
Cytol 2004, 67(2):115-134.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 137
79.
Gschwend JE, Dahm P, Fair WR: Disease specific survival as endpoint of
outcome for bladder cancer patients following radical cystectomy. Eur
Urol 2002, 41(4):440-448.
80.
Gudemann CJ, Weitz J, Kienle P, Lacroix J, Wiesel MJ, Soder M, Benner A,
Staehler G, Doeberitz MV: Detection of hematogenous micrometastasis in
patients with transitional cell carcinoma. J Urol 2000, 164(2):532-536.
81.
Gump J, Stokoe D, Mccormick F: Phosphorylation of p16INK4A correlates
with Cdk4 association. J Biol Chem 2003, 278(9):6619-6622.
82.
Hainaut P, Wiman KG, Joeger AC, Friedler A, Fersht AR: 25 Years of p53
Research: Wild type p53 conformation, structural consequences of p53
mutations and mechanism of mutant p53 rescue. In. Dordrecht, The
Netherlands: Springer Verlag; 2005: 377-398.
83.
Hall PA, Lane DP: p53 in tumour pathology: can
immunohistochemistry?--Revisited! J Pathol 1994, 172(1):1-4.
84.
Harada H, Nakagawa K, Iwata S, Saito M, Kumon Y, Sakaki S, Sato K,
Hamada K: Restoration of wild-type p16 down-regulates vascular
endothelial growth factor expression and inhibits angiogenesis in human
gliomas. Cancer Res 1999, 59(15):3783-3789.
85.
Hartvigsen G, Johansen MA, Hasvold P, Bellika JG, Arsand E, Arild E,
Gammon D, Pettersen S, Pedersen S: Challenges in telemedicine and
eHealth: lessons learned from 20 years with telemedicine in Tromso. Stud
Health Technol Inform 2007, 129(Pt 1):82-86.
86.
Hayflick L, Moorhead PS: The serial cultivation of human diploid cell
strains. Exp Cell Res 1961, 25:585-621.
87.
Heney NM, Proppe K, Prout GR, Jr., Griffin PP, Shipley WU: Invasive bladder
cancer: tumor configuration, lymphatic invasion and survival. J Urol 1983,
130(5):895-897.
88.
Henry K, Miller J, Mori M, Loening S, Fallon B: Comparison of transurethral
resection to radical therapies for stage B bladder tumors. J Urol 1988,
140(5):964-967.
89.
Hermanek P (ed.): TNM-Klassifikation maligner Tumoren: 4. Auflage
Springer, Berlin; 1987.
90.
Herr HW, Bochner BH, Dalbagni G, Donat SM, Reuter VE, Bajorin DF: Impact
of the number of lymph nodes retrieved on outcome in patients with
muscle invasive bladder cancer. J Urol 2002, 167(3):1295-1298.
91.
Herr HW, Whitmore WF, Jr.: Ureteral carcinoma in situ after successful
intravesical therapy for superficial bladder tumors: incidence, possible
pathogenesis and management. J Urol 1987, 138(2):292-294.
92.
Hinds P, Finlay C, Levine AJ: Mutation is required to activate the p53 gene
for cooperation with the ras oncogene and transformation. J Virol 1989,
63(2):739-746.
93.
Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC: p53 mutations in human
cancers. Science 1991, 253(5015):49-53.
94.
Horan AH: Re: Cystectomy delay more than 3 months from initial bladder
cancer diagnosis results in decreased disease specific and overall
survival. C. T. Lee, R. Madii, S. Daignault, R. L. Dunn, Y. Zhang, J. E.
Montie and D. P. Wood, Jr., J Urol, 175: 1262-1267, 2006. J Urol 2006, 176(6
Pt 1):2744.
we
trust
11. Literaturverzeichnis
Seite | 138
95.
Hu H, Xia SH, Li AD, Xu X, Cai Y, Han YL, Wei F, Chen BS, Huang XP, Han
YS, Zhang JW, Zhang X, Wu M, Wang MR: Elevated expression of p63
protein in human esophageal squamous cell carcinomas. Int J Cancer
2002, 102(6):580-583.
96.
Hu YH, Zhang CY, Tian Z, Wang LZ, Li J: Aberrant protein expression and
promoter methylation of p16 gene are correlated with malignant
transformation of salivary pleomorphic adenoma. Arch Pathol Lab Med
2011, 135(7):882-889.
97.
Hupp TR, Lane DP: Allosteric activation of latent p53 tetramers. Curr Biol
1994, 4(10):865-875.
98.
Hussussian CJ, Struewing JP, Goldstein AM, Higgins PA, Ally DS, Sheahan
MD, Clark WH, Jr., Tucker MA, Dracopoli NC: Germline p16 mutations in
familial melanoma. Nat Genet 1994, 8(1):15-21.
99.
Iida S, Hirota T, Morisaki T, Marumoto T, Hara T, Kuninaka S, Honda S, Kosai
K, Kawasuji M, Pallas DC, Saya H: Tumor suppressor WARTS ensures
genomic integrity by regulating both mitotic progression and G1
tetraploidy checkpoint function. Oncogene 2004, 23(31):5266-5274.
100.
Iwakuma T, Lozano G, Flores ER: Li-Fraumeni syndrome: a p53 family
affair. Cell Cycle 2005, 4(7):865-867.
101.
Iwasa H, Han J, Ishikawa F: Mitogen-activated protein kinase p38 defines
the common senescence-signalling pathway. Genes Cells 2003, 8(2):131144.
102.
Jacobs JJ, Scheijen B, Voncken JW, Kieboom K, Berns A, Van Lohuizen M:
Bmi-1 collaborates with c-Myc in tumorigenesis by inhibiting c-Mycinduced apoptosis via INK4a/ARF. Genes Dev 1999, 13(20):2678-2690.
103.
Jacobs WB, Govoni G, Ho D, Atwal JK, Barnabe-Heider F, Keyes WM, Mills
AA, Miller FD, Kaplan DR: p63 is an essential proapoptotic protein during
neural development. Neuron 2005, 48(5):743-756.
104.
Jahnson S, Karlsson MG: Predictive value of p53 and pRb immunostaining
in locally advanced bladder cancer treated with cystectomy. J Urol 1998,
160(4):1291-1296.
105.
Jakse G, Jacobi GH, Altwein JE: Adenocarcinoma of the bladder. Urologe A
1979, 18(2):86-90.
106.
Jenkins JR, Rudge K, Chumakov P, Currie GA: The cellular oncogene p53
can be activated by mutagenesis. Nature 1985, 317(6040):816-818.
107.
Jenkins JR, Rudge K, Currie GA: Cellular immortalization by a cDNA clone
encoding the transformation-associated phosphoprotein p53. Nature 1984,
312(5995):651-654.
108.
Johansson SL, Cohen SM: Epidemiology and etiology of bladder cancer.
Semin Surg Oncol 1997, 13(5):291-298.
109.
Johnson DE, Schoenwald MB, Ayala AG, Miller LS: Squamous cell carcinoma
of the bladder. J Urol 1976, 115(5):542-544.
110.
Kakehi Y, Ozdemir E, Habuchi T, Yamabe H, Hashimura T, Katsura Y, Yoshida
O: Absence of p53 overexpression and favorable response to cisplatinbased neoadjuvant chemotherapy in urothelial carcinomas. Jpn J Cancer
Res 1998, 89(2):214-220.
111.
Kamijo T, Van De Kamp E, Chong MJ, Zindy F, Diehl JA, Sherr CJ, Mckinnon
PJ: Loss of the ARF tumor suppressor reverses premature replicative
11. Literaturverzeichnis
Seite | 139
arrest but not radiation hypersensitivity arising from disabled atm
function. Cancer Res 1999, 59(10):2464-2469.
112.
Karagas MR, Tosteson TD, Blum J, Morris JS, Baron JA, Klaue B: Design of
an epidemiologic study of drinking water arsenic exposure and skin and
bladder cancer risk in a U.S. population. Environ Health Perspect 1998, 106
Suppl 4:1047-1050.
113.
Karayan L, Riou JF, Seite P, Migeon J, Cantereau A, Larsen CJ: Human ARF
protein interacts with topoisomerase I and stimulates its activity.
Oncogene 2001, 20(7):836-848.
114.
Karni-Schmidt O, Castillo-Martin M, Shen TH, Gladoun N, Domingo-Domenech
J, Sanchez-Carbayo M, Li Y, Lowe S, Prives C, Cordon-Cardo C: Distinct
expression profiles of p63 variants during urothelial development and
bladder cancer progression. Am J Pathol 2011, 178(3):1350-1360.
115.
Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, Vogelstein B, Craig RW: Participation
of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res 1991,
51(23 Pt 1):6304-6311.
116.
Kastan MB, Zhan Q, El-Deiry WS, Carrier F, Jacks T, Walsh WV, Plunkett BS,
Vogelstein B, Fornace AJ, Jr.: A mammalian cell cycle checkpoint pathway
utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell 1992,
71(4):587-597.
117.
Kaubisch S, Lum BL, Reese J, Freiha F, Torti FM: Stage T1 bladder cancer:
grade is the primary determinant for risk of muscle invasion. J Urol 1991,
146(1):28-31.
118.
Kaufman JM, Fam B, Jacobs SC, Gabilondo F, Yalla S, Kane JP, Rossier AB:
Bladder cancer and squamous metaplasia in spinal cord injury patients. J
Urol 1977, 118(6):967-971.
119.
Kawai H, Wiederschain D, Kitao H, Stuart J, Tsai KK, Yuan ZM: DNA damageinduced MDMX degradation is mediated by MDM2. J Biol Chem 2003,
278(46):45946-45953.
120.
Keegan PE, Matthews JN, Lunec J, Neal DE: Statistical problems with
'optimal' thresholds in studies of new prognostic factors in urology. BJU
Int 2000, 85(4):392-397.
121.
Kern SE, Pietenpol JA, Thiagalingam S, Seymour A, Kinzler KW, Vogelstein B:
Oncogenic forms of p53 inhibit p53-regulated gene expression. Science
1992, 256(5058):827-830.
122.
Khosravi R, Maya R, Gottlieb T, Oren M, Shiloh Y, Shkedy D: Rapid ATMdependent phosphorylation of MDM2 precedes p53 accumulation in
response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(26):1497314977.
123.
Knopp S, Bjorge T, Nesland JM, Trope C, Scheistroen M, Holm R: p16INK4a
and p21Waf1/Cip1 expression correlates with clinical outcome in vulvar
carcinomas. Gynecol Oncol 2004, 95(1):37-45.
124.
Koga F, Kawakami S, Kumagai J, Takizawa T, Ando N, Arai G, Kageyama Y,
Kihara K: Impaired Delta Np63 expression associates with reduced betacatenin and aggressive phenotypes of urothelial neoplasms. Br J Cancer
2003, 88(5):740-747.
125.
Konishi H, Tanaka M, Takemura Y, Matsuzaki H, Ono Y, Kikkawa U, Nishizuka
Y: Activation of protein kinase C by tyrosine phosphorylation in response
to H2O2. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94(21):11233-11237.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 140
126.
Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton S,
Torhorst J, Mihatsch MJ, Sauter G, Kallioniemi OP: Tissue microarrays for
high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med 1998,
4(7):844-847.
127.
Korgaonkar C, Hagen J, Tompkins V, Frazier AA, Allamargot C, Quelle FW,
Quelle DE: Nucleophosmin (B23) targets ARF to nucleoli and inhibits its
function. Mol Cell Biol 2005, 25(4):1258-1271.
128.
Kress M, Girard M: The influence of fluoro-phenyl-alanine on the synthesis
of simian virus 40 DNA and T antigens. Biochimie 1979, 61(3):419-423.
129.
Kulkarni JN, Pramesh CS, Rathi S, Pantvaidya GH: Long-term results of
orthotopic neobladder reconstruction after radical cystectomy. BJU Int
2003, 91(6):485-488.
130.
Kumar S, Park SH, Cieply B, Schupp J, Killiam E, Zhang F, Rimm DL, Frisch
SM: A pathway for the control of anoikis sensitivity by E-cadherin and
epithelial-to-mesenchymal transition. Mol Cell Biol 2011, 31(19):4036-4051.
131.
Kussie PH, Gorina S, Marechal V, Elenbaas B, Moreau J, Levine AJ, Pavletich
NP: Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor
suppressor transactivation domain. Science 1996, 274(5289):948-953.
132.
Lal A, Kim HH, Abdelmohsen K, Kuwano Y, Pullmann R, Jr., Srikantan S,
Subrahmanyam R, Martindale JL, Yang X, Ahmed F, Navarro F, Dykxhoorn D,
Lieberman J, Gorospe M: p16(INK4a) translation suppressed by miR-24.
PLoS ONE 2008, 3(3):e1864.
133.
Lane DP: Cancer. p53, guardian of the genome. Nature 1992, 358(6381):1516.
134.
Lane DP, Crawford LV: T antigen is bound to a host protein in SV40transformed cells. Nature 1979, 278(5701):261-263.
135.
Lang GA, Iwakuma T, Suh YA, Liu G, Rao VA, Parant JM, Valentin-Vega YA,
Terzian T, Caldwell LC, Strong LC, El-Naggar AK, Lozano G: Gain of function
of a p53 hot spot mutation in a mouse model of Li-Fraumeni syndrome.
Cell 2004, 119(6):861-872.
136.
Le Frere-Belda MA, Gil Diez De Medina S, Daher A, Martin N, Albaud B,
Heudes D, Abbou CC, Thiery JP, Zafrani ES, Radvanyi F, Chopin D: Profiles
of the 2 INK4a gene products, p16 and p14ARF, in human reference
urothelium and bladder carcinomas, according to pRb and p53 protein
status. Hum Pathol 2004, 35(7):817-824.
137.
Lebret T, Herve JM, Yonneau L, Barre P, Lugagne PM, Butreau M, Molinie V,
Botto H: [Study of survival after cystectomy for bladder cancer. Report of
504 cases]. Prog Urol 2000, 10(4):553-560.
138.
Lee JM, Dedhar S, Kalluri R, Thompson EW: The epithelial-mesenchymal
transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol
2006, 172(7):973-981.
139.
Lee YY, Kang SH, Seo JY, Jung CW, Lee KU, Choe KJ, Kim BK, Kim NK,
Koeffler HP, Bang YJ: Alterations of p16INK4A and p15INK4B genes in
gastric carcinomas. Cancer 1997, 80(10):1889-1896.
140.
Levine AJ: p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997,
88(3):323-331.
141.
Levine AJ, Momand J, Finlay CA: The p53 tumour suppressor gene. Nature
1991, 351(6326):453-456.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 141
142.
Levrero M, De Laurenzi V, Costanzo A, Gong J, Wang JY, Melino G: The
p53/p63/p73 family of transcription factors: overlapping and distinct
functions. J Cell Sci 2000, 113 ( Pt 10):1661-1670.
143.
Li Q, Falsey RR, Gaitonde S, Sotello V, Kislin K, Martinez JD: Genetic
analysis of p53 nuclear importation. Oncogene 2007, 26(57):7885-7893.
144.
Lianes P, Orlow I, Zhang ZF, Oliva MR, Sarkis AS, Reuter VE, Cordon-Cardo
C: Altered patterns of MDM2 and TP53 expression in human bladder
cancer. J Natl Cancer Inst 1994, 86(17):1325-1330.
145.
Linzer DI, Levine AJ: Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor
antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal
carcinoma cells. Cell 1979, 17(1):43-52.
146.
Llanos S, Clark PA, Rowe J, Peters G: Stabilization of p53 by p14ARF
without relocation of MDM2 to the nucleolus. Nat Cell Biol 2001, 3(5):445452.
147.
Lohrum MA, Ashcroft M, Kubbutat MH, Vousden KH: Identification of a
cryptic nucleolar-localization signal in MDM2. Nat Cell Biol 2000, 2(3):179181.
148.
Marchenko ND, Hanel W, Li D, Becker K, Reich N, Moll UM: Stress-mediated
nuclear stabilization of p53 is regulated by ubiquitination and importinalpha3 binding. Cell Death Differ 2010, 17(2):255-267.
149.
Marechal V, Elenbaas B, Piette J, Nicolas JC, Levine AJ: The ribosomal L5
protein is associated with mdm-2 and mdm-2-p53 complexes. Mol Cell Biol
1994, 14(11):7414-7420.
150.
Markl ID, Jones PA: Presence and location of TP53 mutation determines
pattern of CDKN2A/ARF pathway inactivation in bladder cancer. Cancer
Res 1998, 58(23):5348-5353.
151.
Massari ME, Murre C: Helix-loop-helix proteins: regulators of transcription
in eucaryotic organisms. Mol Cell Biol 2000, 20(2):429-440.
152.
Maya R, Balass M, Kim ST, Shkedy D, Leal JF, Shifman O, Moas M,
Buschmann T, Ronai Z, Shiloh Y, Kastan MB, Katzir E, Oren M: ATMdependent phosphorylation of Mdm2 on serine 395: role in p53 activation
by DNA damage. Genes Dev 2001, 15(9):1067-1077.
153.
Mayo LD, Dixon JE, Durden DL, Tonks NK, Donner DB: PTEN protects p53
from Mdm2 and sensitizes cancer cells to chemotherapy. J Biol Chem
2002, 277(7):5484-5489.
154.
Mcconnell BB, Gregory FJ, Stott FJ, Hara E, Peters G: Induced expression of
p16(INK4a) inhibits both CDK4- and CDK2-associated kinase activity by
reassortment of cyclin-CDK-inhibitor complexes. Mol Cell Biol 1999,
19(3):1981-1989.
155.
McCredie M, Stewart JH, Ford JM, Maclennan RA: Phenacetin-containing
analgesics and cancer of the bladder or renal pelvis in women. Br J Urol
1983, 55(2):220-224.
156.
Melero JA, Greenspan DS, Carroll RB: T-antigen-associated proteins
induced by SV40 transformation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1980,
44 Pt 1:201-210.
157.
Mercer WE, Nelson D, Deleo AB, Old LJ, Baserga R: Microinjection of
monoclonal antibody to protein p53 inhibits serum-induced DNA
synthesis in 3T3 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1982, 79(20):6309-6312.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 142
158.
Mercer WE, Shields MT, Amin M, Sauve GJ, Appella E, Romano JW, Ullrich
SJ: Negative growth regulation in a glioblastoma tumor cell line that
conditionally expresses human wild-type p53. Proc Natl Acad Sci U S A
1990, 87(16):6166-6170.
159.
Midgley CA, Lane DP: p53 protein stability in tumour cells is not
determined by mutation but is dependent on Mdm2 binding. Oncogene
1997, 15(10):1179-1189.
160.
Milde-Langosch K, Bamberger AM, Rieck G, Kelp B, Loning T:
Overexpression of the p16 cell cycle inhibitor in breast cancer is
associated with a more malignant phenotype. Breast Cancer Res Treat
2001, 67(1):61-70.
161.
Millan-Rodriguez F, Chechile-Toniolo G, Salvador-Bayarri J, Palou J, Algaba F,
Vicente-Rodriguez J: Primary superficial bladder cancer risk groups
according to progression, mortality and recurrence. J Urol 2000, 164(3 Pt
1):680-684.
162.
Mills AA, Zheng B, Wang XJ, Vogel H, Roop DR, Bradley A: p63 is a p53
homologue required for limb and epidermal morphogenesis. Nature 1999,
398(6729):708-713.
163.
Min BM, Baek JH, Shin KH, Gujuluva CN, Cherrick HM, Park NH: Inactivation
of the p53 gene by either mutation or HPV infection is extremely frequent
in human oral squamous cell carcinoma cell lines. Eur J Cancer B Oral
Oncol 1994, 30B(5):338-345.
164.
Mitra J, Dai CY, Somasundaram K, El-Deiry WS, Satyamoorthy K, Herlyn M,
Enders GH: Induction of p21(WAF1/CIP1) and inhibition of Cdk2 mediated
by the tumor suppressor p16(INK4a). Mol Cell Biol 1999, 19(5):3916-3928.
165.
Miyashita T, Krajewski S, Krajewska M, Wang HG, Lin HK, Liebermann DA,
Hoffman B, Reed JC: Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax
gene expression in vitro and in vivo. Oncogene 1994, 9(6):1799-1805.
166.
Moll UM, Petrenko O: The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res 2003,
1(14):1001-1008.
167.
Moll UM, Slade N: p63 and p73: roles in development and tumor formation.
Mol Cancer Res 2004, 2(7):371-386.
168.
Momand J, Zambetti GP, Olson DC, George D, Levine AJ: The mdm-2
oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53mediated transactivation. Cell 1992, 69(7):1237-1245.
169.
Ohtani N, Zebedee Z, Huot TJ, Stinson JA, Sugimoto M, Ohashi Y, Sharrocks
AD, Peters G, Hara E: Opposing effects of Ets and Id proteins on p16INK4a
expression during cellular senescence. Nature 2001, 409(6823):1067-1070.
170.
Okamoto K, Taya Y, Nakagama H: Mdmx enhances p53 ubiquitination by
altering the substrate preference of the Mdm2 ubiquitin ligase. FEBS Lett
2009, 583(17):2710-2714.
171.
Okorokov AL, Orlova EV: Structural biology of the p53 tumour suppressor.
Curr Opin Struct Biol 2009, 19(2):197-202.
172.
Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS, George DL, Vogelstein B: Amplification of
a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas. Nature
1992, 358(6381):80-83.
173.
Olive KP, Tuveson DA, Ruhe ZC, Yin B, Willis NA, Bronson RT, Crowley D,
Jacks T: Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni
syndrome. Cell 2004, 119(6):847-860.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 143
174.
Olson CA, De Vere White RW: Cancer of the bladder. In: Principles and
management of urologic cancer. In. Edited by Javadpour N. Baltimore:
Williams & Wilkins; 1979: 337.
175.
Olson DC, Marechal V, Momand J, Chen J, Romocki C, Levine AJ:
Identification and characterization of multiple mdm-2 proteins and mdm-2p53 protein complexes. Oncogene 1993, 8(9):2353-2360.
176.
Olson MO: Sensing cellular stress: another new function for the
nucleolus? Sci STKE 2004, 2004(224):pe10.
177.
Onel K, Cordon-Cardo C: MDM2 and prognosis. Mol Cancer Res 2004, 2(1):18.
178.
Otto T, Rubben H: Prevention of bladder cancer. Urologe A 2004, 43(5):562564.
179.
Pan Y, Chen J: MDM2 promotes ubiquitination and degradation of MDMX.
Mol Cell Biol 2003, 23(15):5113-5121.
180.
Papadimitrakopoulou V, Izzo J, Lippman SM, Lee JS, Fan YH, Clayman G, Ro
JY, Hittelman WN, Lotan R, Hong WK, Mao L: Frequent inactivation of
p16INK4a in oral premalignant lesions. Oncogene 1997, 14(15):1799-1803.
181.
Parada LF, Land H, Weinberg RA, Wolf D, Rotter V: Cooperation between
gene encoding p53 tumour antigen and ras in cellular transformation.
Nature 1984, 312(5995):649-651.
182.
Pardee AB: G1 events and regulation of cell proliferation. Science 1989,
246(4930):603-608.
183.
Paro R: Propagating memory of transcriptional states. Trends Genet 1995,
11(8):295-297.
184.
Patterson JM, Ray EH, Jr., Mendiondo OA, Medina WD, Gee WF: A new
treatment for invasive squamous cell bladder cancer: the Nigro regimen:
preoperative chemotherapy and radiation therapy. J Urol 1988, 140(2):379380.
185.
Pearson RM, Soloway MS: Does cyclophosphamide induce bladder
cancer? Urology 1978, 11(5):437-447.
186.
Peirce SK, Findley HW: Targeting the MDM2–p53 interaction as a
therapeutic strategy for the treatment of cancer. Cell Health and
Cytoskeleton 2010, 2(1):49–58.
187.
Peng Z: Current status of gendicine in China: recombinant human Ad-p53
agent for treatment of cancers. Hum Gene Ther 2005, 16(9):1016-1027.
188.
Pharmingen™ BD: www.bdj.co.jp/reagent/products/pdf/556353.pdf last
accessed 01/03/2012 13:50. In., vol. 2012. Franklin Lakes, USA: Becton,
Dickinson and Company.
189.
Plath T, Detjen K, Welzel M, Von Marschall Z, Murphy D, Schirner M,
Wiedenmann B, Rosewicz S: A novel function for the tumor suppressor
p16(INK4a): induction of anoikis via upregulation of the alpha(5)beta(1)
fibronectin receptor. J Cell Biol 2000, 150(6):1467-1478.
190.
Quilty PM, Duncan W: Primary radical radiotherapy for T3 transitional cell
cancer of the bladder: an analysis of survival and control. Int J Radiat
Oncol Biol Phys 1986, 12(6):853-860.
191.
Raghavan D, Huben R: Management of bladder cancer. Curr Probl Cancer
1995, 19(1):1-64.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 144
192.
Ramsey MR, Sharpless NE: ROS as a tumour suppressor? Nat Cell Biol
2006, 8(11):1213-1215.
193.
Reed JA, Loganzo F, Jr., Shea CR, Walker GJ, Flores JF, Glendening JM,
Bogdany JK, Shiel MJ, Haluska FG, Fountain JW, Et Al.: Loss of expression
of the p16/cyclin-dependent kinase inhibitor 2 tumor suppressor gene in
melanocytic lesions correlates with invasive stage of tumor progression.
Cancer Res 1995, 55(13):2713-2718.
194.
Rehn L: Über Blasengeschwüre bei Fuchsinarbeitern. Arch Klin Chir 1895,
50:588-600.
195.
Reich NC, Oren M, Levine AJ: Two distinct mechanisms regulate the levels
of a cellular tumor antigen, p53. Mol Cell Biol 1983, 3(12):2143-2150.
196.
Reifenberger G, Liu L, Ichimura K, Schmidt EE, Collins VP: Amplification and
overexpression of the MDM2 gene in a subset of human malignant
gliomas without p53 mutations. Cancer Res 1993, 53(12):2736-2739.
197.
Reincke SA: Genvarianten des Tumorsuppressors p53 und seiner
Regulatoren MDM2 und MDM4 bei Patientinnen mit Mammakarzinom.
Med. Diss. In. Hannover: Medizinische Hochschule Hannover; 2009: 17-21.
198.
Riede UN, Werner M, Schaefer HE: Allgemeine und spezielle Pathologie. In.,
vol. 5. Stuttgart: Georg Thieme Verlag; 2004: 854-857.
199.
Rizos H, Darmanian AP, Mann GJ, Kefford RF: Two arginine rich domains in
the p14ARF tumour suppressor mediate nucleolar localization. Oncogene
2000, 19(26):2978-2985.
200.
Rocco JW, Sidransky D: p16(MTS-1/CDKN2/INK4a) in cancer progression.
Exp Cell Res 2001, 264(1):42-55.
201.
Rodel C: Current status of radiation therapy and combined-modality
treatment for bladder cancer. Strahlenther Onkol 2004, 180(11):701-709.
202.
Rodriguez MS, Desterro JM, Lain S, Midgley CA, Lane DP, Hay RT: SUMO-1
modification activates the transcriptional response of p53. EMBO J 1999,
18(22):6455-6461.
203.
Roth J, Dobbelstein M, Freedman DA, Shenk T, Levine AJ: Nucleocytoplasmic shuttling of the hdm2 oncoprotein regulates the levels of the
p53 protein via a pathway used by the human immunodeficiency virus rev
protein. EMBO J 1998, 17(2):554-564.
204.
Rotter V, Witte ON, Coffman R, Baltimore D: Abelson murine leukemia virusinduced tumors elicit antibodies against a host cell protein, P50. J Virol
1980, 36(2):547-555.
205.
Rovinski B, Benchimol S: Immortalization of rat embryo fibroblasts by the
cellular p53 oncogene. Oncogene 1988, 2(5):445-452.
206.
Rowland BD, Bernards R: Re-evaluating cell-cycle regulation by E2Fs. Cell
2006, 127(5):871-874.
207.
Rübben H, Vom Dorp F, Eisenhard A, Goebell PJ, Gschwend J, Jäger T, Jakse
G, Jocham D, Karl A, Krege S, Lümmen G, Otto T, Rettenmeier A, Rödel C,
Rübben H, Schenck M, Schmid KW, Stief C, Stöckle M, Zaak D: Uroonkologie.
In., vol. 5. Heidelberg: Springer Medizin Verlag; 2009: 395-461.
208.
Russo AA, Tong L, Lee JO, Jeffrey PD, Pavletich NP: Structural basis for
inhibition of the cyclin-dependent kinase Cdk6 by the tumour suppressor
p16INK4a. Nature 1998, 395(6699):237-243.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 145
209.
Sabbatini P, Mccormick F: MDMX inhibits the
acetylation of p53. DNA Cell Biol 2002, 21(7):519-525.
p300/CBP-mediated
210.
Sadetzki S, Bensal D, Blumstein T, Novikov I, Modan B: Selected risk factors
for transitional cell bladder cancer. Med Oncol 2000, 17(3):179-182.
211.
Santiago TC, Jenkins JJ, Pedrosa F, Billups C, Quintana Y, Ribeiro RC,
Qaddoumi I: Improving the histopathologic diagnosis of pediatric
malignancies in a low-resource setting by combining focused training and
telepathology strategies. Pediatr Blood Cancer 2012:doi: 10.1002/pbc.24071.
212.
Sarkis AS, Bajorin DF, Reuter VE, Herr HW, Netto G, Zhang ZF, Schultz PK,
Cordon-Cardo C, Scher HI: Prognostic value of p53 nuclear overexpression
in patients with invasive bladder cancer treated with neoadjuvant MVAC. J
Clin Oncol 1995, 13(6):1384-1390.
213.
Sarnow P, Ho YS, Williams J, Levine AJ: Adenovirus E1b-58kd tumor
antigen and SV40 large tumor antigen are physically associated with the
same 54 kd cellular protein in transformed cells. Cell 1982, 28(2):387-394.
214.
Scheffner M, Werness BA, Huibregtse JM, Levine AJ, Howley PM: The E6
oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes
the degradation of p53. Cell 1990, 63(6):1129-1136.
215.
Schmitz-Drager BJ, Goebell PJ, Heydthausen M: p53 immunohistochemistry
in bladder cancer. Combined analysis: a way to go? Urol Oncol 2000,
5(5):204-210.
216.
Schrader T, Dietel M, Schlake W: Telepathologie: Digitalisierung schreitet
voran. Deutsches Ärzteblatt 2008, 105(40):3-5.
217.
Sen SE, Malek RS, Farrow GM, Lieber MM: Sarcoma and carcinosarcoma of
the bladder in adults. J Urol 1985, 133(1):29-30.
218.
Serrano M, Hannon GJ, Beach D: A new regulatory motif in cell-cycle
control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 1993,
366(6456):704-707.
219.
Shangary S, Wang S: Targeting the MDM2-p53 interaction for cancer
therapy. Clin Cancer Res 2008, 14(17):5318-5324.
220.
Shapiro GI, Edwards CD, Ewen ME, Rollins BJ: p16INK4A participates in a
G1 arrest checkpoint in response to DNA damage. Mol Cell Biol 1998,
18(1):378-387.
221.
Sharma AK, Ali A, Gogna R, Singh AK, Pati U: p53 Amino-terminus region (1125) stabilizes and restores heat denatured p53 wild phenotype. PLoS
ONE 2009, 4(10):e7159.
222.
Sharpless NE, Depinho RA: The INK4A/ARF locus and its two gene
products. Curr Opin Genet Dev 1999, 9(1):22-30.
223.
Shaulsky G, Goldfinger N, Ben-Ze'ev A, Rotter V: Nuclear accumulation of
p53 protein is mediated by several nuclear localization signals and plays a
role in tumorigenesis. Mol Cell Biol 1990, 10(12):6565-6577.
224.
Sherr CJ: The INK4a/ARF network in tumour suppression. Nat Rev Mol Cell
Biol 2001, 2(10):731-737.
225.
Sherr CJ, Roberts JM: CDK inhibitors: positive and negative regulators of
G1-phase progression. Genes Dev 1999, 13(12):1501-1512.
226.
Shieh SY, Ikeda M, Taya Y, Prives C: DNA damage-induced
phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell 1997, 91(3):325334.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 146
227.
Shiina H, Igawa M, Shigeno K, Yamasaki Y, Urakami S, Yoneda T, Wada Y,
Honda S, Nagasaki M: Clinical significance of mdm2 and p53 expression in
bladder cancer. A comparison with cell proliferation and apoptosis.
Oncology 1999, 56(3):239-247.
228.
Silverberg E, Boring CC, Squires TS: Cancer statistics, 1990. CA Cancer J
Clin 1990, 40(1):9-26.
229.
Silverman DT, Hartge P, Morrison AS, Devesa SS: Epidemiology of bladder
cancer. Hematol Oncol Clin North Am 1992, 6(1):1-30.
230.
Slaton Jw BW, Dinney Cp.: P53 in bladder cancer: mechanism of action,
prognostic value, and target for therapy. Urology 2001, May;57(5):852-9.
231.
Smith AH, Goycolea M, Haque R, Biggs ML: Marked increase in bladder and
lung cancer mortality in a region of Northern Chile due to arsenic in
drinking water. Am J Epidemiol 1998, 147(7):660-669.
232.
Soussi T, Caron De Fromentel C, May P: Structural aspects of the p53
protein in relation to gene evolution. Oncogene 1990, 5(7):945-952.
233.
Steinmeyer K, Maacke H, Deppert W: Cell cycle control by p53 in normal
(3T3) and chemically transformed (Meth A) mouse cells. I. Regulation of
p53 expression. Oncogene 1990, 5(11):1691-1699.
234.
Stone S, Jiang P, Dayananth P, Tavtigian SV, Katcher H, Parry D, Peters G,
Kamb A: Complex structure and regulation of the P16 (MTS1) locus.
Cancer Res 1995, 55(14):2988-2994.
235.
Stott FJ, Bates S, James MC, Mcconnell BB, Starborg M, Brookes S, Palmero I,
Ryan K, Hara E, Vousden KH, Peters G: The alternative product from the
human CDKN2A locus, p14(ARF), participates in a regulatory feedback
loop with p53 and MDM2. EMBO J 1998, 17(17):5001-5014.
236.
Su X, Cho MS, Gi YJ, Ayanga BA, Sherr CJ, Flores ER: Rescue of key
features of the p63-null epithelial phenotype by inactivation of Ink4a and
Arf. EMBO J 2009, 28(13):1904-1915.
237.
Su X, Flores ER: TAp63: The fountain of youth. Aging (Albany NY) 2009,
1(10):866-869.
238.
Su X, Paris M, Gi YJ, Tsai KY, Cho MS, Lin YL, Biernaskie JA, Sinha S, Prives
C, Pevny LH, Miller FD, Flores ER: TAp63 prevents premature aging by
promoting adult stem cell maintenance. Cell Stem Cell 2009, 5(1):64-75.
239.
Suhr J, Goebell PJ, Schmid KW, Worm K, Rübben H, Otto T: Mikroarrays in
der Urologie. Aktuelle Urologie 2002, 33(4):262-267.
240.
Takahashi A, Ohtani N, Hara E: Irreversibility of cellular senescence: dual
roles of p16INK4a/Rb-pathway in cell cycle control. Cell Div 2007, 2:10.
241.
Takahashi A, Ohtani N, Yamakoshi K, Iida S, Tahara H, Nakayama K,
Nakayama KI, Ide T, Saya H, Hara E: Mitogenic signalling and the
p16INK4a-Rb pathway cooperate to enforce irreversible cellular
senescence. Nat Cell Biol 2006, 8(11):1291-1297.
242.
Tao W, Levine AJ: P19(ARF) stabilizes p53 by blocking nucleo-cytoplasmic
shuttling of Mdm2. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(12):6937-6941.
243.
Tetu B, Fortin JP, Gagnon MP, Louahlia S: The challenges of implementing a
"patient-oriented" telepathology network; the Eastern Quebec
telepathology project experience. Anal Cell Pathol (Amst) 2012, 35(1):11-18.
244.
The
University
of
Texas
Md
Anderson
Cancer
Center:
http://www.mdanderson.org/education-and-research/research-at-md11. Literaturverzeichnis
Seite | 147
anderson/early-detection-and-treatment/researchprograms/spores/bladder-cancer-spore/international-tissue-arraystudy/index.html, last accessed on 16/04./2012 14:59. In. Houston: The
University of Texas MD Anderson Cancer Center 2012.
245.
Trimarchi JM, Lees JA: Sibling rivalry in the E2F family. Nat Rev Mol Cell Biol
2002, 3(1):11-20.
246.
Turbin DA, Cheang MC, Bajdik CD, Gelmon KA, Yorida E, De Luca A, Nielsen
TO, Huntsman DG, Gilks CB: MDM2 protein expression is a negative
prognostic marker in breast carcinoma. Mod Pathol 2006, 19(1):69-74.
247.
Tzai TS, Tsai YS, Chow NH: The prevalence and clinicopathologic correlate
of p16INK4a, retinoblastoma and p53 immunoreactivity in locally
advanced urinary bladder cancer. Urol Oncol 2004, 22(2):112-118.
248.
Urist MJ, Di Como CJ, Lu ML, Charytonowicz E, Verbel D, Crum CP, Ince TA,
Mckeon FD, Cordon-Cardo C: Loss of p63 expression is associated with
tumor progression in bladder cancer. Am J Pathol 2002, 161(4):1199-1206.
249.
Vineis P PRaaaCCCCV, P., Pirastu R: Aromatic amines and cancer. Cancer
Causes Control 1997, 8(3):346-355.
250.
Vogelstein B, Kinzler KW: p53 function and dysfunction. Cell 1992,
70(4):523-526.
251.
Vousden KH: Activation of the p53 tumor suppressor protein. Biochim
Biophys Acta 2002, 1602(1):47-59.
252.
Wang W, Chen JX, Liao R, Deng Q, Zhou JJ, Huang S, Sun P: Sequential
activation of the MEK-extracellular signal-regulated kinase and MKK3/6p38 mitogen-activated protein kinase pathways mediates oncogenic rasinduced premature senescence. Mol Cell Biol 2002, 22(10):3389-3403.
253.
Weber JD, Kuo ML, Bothner B, Digiammarino EL, Kriwacki RW, Roussel MF,
Sherr CJ: Cooperative signals governing ARF-mdm2 interaction and
nucleolar localization of the complex. Mol Cell Biol 2000, 20(7):2517-2528.
254.
Weber JD, Taylor LJ, Roussel MF, Sherr CJ, Bar-Sagi D: Nucleolar Arf
sequesters Mdm2 and activates p53. Nat Cell Biol 1999, 1(1):20-26.
255.
[email protected]:
www.microarraystation.com/tissuemicroarray/ last accessed 01/03/2012 16:40. In.: Microarray Station; 2006.
256.
Weinstein MH, Signoretti S, Loda M: Diagnostic utility of
immunohistochemical staining for p63, a sensitive marker of prostatic
basal cells. Mod Pathol 2002, 15(12):1302-1308.
257.
Weinstein RS, Graham AR, Richter LC, Barker GP, Krupinski EA, Lopez AM,
Erps KA, Bhattacharyya AK, Yagi Y, Gilbertson JR: Overview of
telepathology, virtual microscopy, and whole slide imaging: prospects for
the future. Hum Pathol 2009, 40(8):1057-1069.
258.
Werness BA, Levine AJ, Howley PM: Association of human papillomavirus
types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science 1990, 248(4951):76-79.
259.
Wheaton K, Riabowol K: Protein kinase C delta blocks immediate-early
gene expression in senescent cells by inactivating serum response factor.
Mol Cell Biol 2004, 24(16):7298-7311.
260.
Wigle DT: Safe drinking water: a public health challenge. Chronic Dis Can
1998, 19(3):103-107.
261.
Wu X, Bayle JH, Olson D, Levine AJ: The p53-mdm-2 autoregulatory
feedback loop. Genes Dev 1993, 7(7A):1126-1132.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 148
262.
Wynder EL, Goldsmith R: The epidemiology of bladder cancer: a second
look. Cancer 1977, 40(3):1246-1268.
263.
Yang A, Kaghad M, Wang Y, Gillett E, Fleming MD, Dotsch V, Andrews NC,
Caput D, Mckeon F: p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple
products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative
activities. Mol Cell 1998, 2(3):305-316.
264.
Yang A, Schweitzer R, Sun D, Kaghad M, Walker N, Bronson RT, Tabin C,
Sharpe A, Caput D, Crum C, Mckeon F: p63 is essential for regenerative
proliferation in limb, craniofacial and epithelial development. Nature 1999,
398(6729):714-718.
265.
Yang X, Yu K, Hao Y, Li DM, Stewart R, Insogna KL, Xu T: LATS1 tumour
suppressor affects cytokinesis by inhibiting LIMK1. Nat Cell Biol 2004,
6(7):609-617.
266.
Yonish-Rouach E, Resnitzky D, Lotem J, Sachs L, Kimchi A, Oren M: Wildtype p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by
interleukin-6. Nature 1991, 352(6333):345-347.
267.
Zhang HS, Postigo AA, Dean DC: Active transcriptional repression by the
Rb-E2F complex mediates G1 arrest triggered by p16INK4a, TGFbeta, and
contact inhibition. Cell 1999, 97(1):53-61.
268.
Zhang Q, Xiao H, Chai SC, Hoang QQ, Lu H: Hydrophilic residues are
crucial for ribosomal protein L11 (RPL11) interaction with zinc finger
domain of MDM2 and p53 protein activation. J Biol Chem 2011,
286(44):38264-38274.
269.
Zhang Y, Xiong Y: Mutations in human ARF exon 2 disrupt its nucleolar
localization and impair its ability to block nuclear export of MDM2 and
p53. Mol Cell 1999, 3(5):579-591.
270.
Zhao P, Hu YC, Talbot IC: Expressing patterns of p16 and CDK4 correlated
to prognosis in colorectal carcinoma. World J Gastroenterol 2003,
9(10):2202-2206.
271.
Zheng W, Mclaughlin JK, Gao YT, Silverman DT, Gao RN, Blot WJ: Bladder
cancer and occupation in Shanghai, 1980-1984. Am J Ind Med 1992,
21(6):877-885.
272.
Zhou BP, Liao Y, Xia W, Zou Y, Spohn B, Hung MC: HER-2/neu induces p53
ubiquitination via Akt-mediated MDM2 phosphorylation. Nat Cell Biol 2001,
3(11):973-982.
273.
Zhu D, Xu G, Ghandhi S, Hubbard K: Modulation of the expression of
p16INK4a and p14ARF by hnRNP A1 and A2 RNA binding proteins:
implications for cellular senescence. J Cell Physiol 2002, 193(1):19-25.
274.
Ziegler A, Jonason AS, Leffell DJ, Simon JA, Sharma HW, Kimmelman J,
Remington L, Jacks T, Brash DE: Sunburn and p53 in the onset of skin
cancer. Nature 1994, 372(6508):773-776.
11. Literaturverzeichnis
Seite | 149
12 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die mich bei der
Erstellung dieser Arbeit unterstützt haben.
Zuerst möchte ich meinen Doktorvater PD Dr. med. P. J. Goebell erwähnen. Er
beantwortete mir jederzeit bereitwillig meine Fragen und hat versucht auch an
stressigen Tagen Zeit für mich zu finden. Vielen Dank für diese engagierte und
motivierende Betreuung.
Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. med. B. Wullich für die Annahme als Doktorandin
in seinem Institut, sowie für seine Bereitschaft als Korreferent zu fungieren.
Die Arbeit im Labor der molekularen Urologie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. rer.
nat. Helge Taubert hat mir immer sehr viel Spass bereitet. Ein besonderer Dank geht
an Dipl. Biol. E. Nolte, Dr. rer. nat. S. Wach und K. Weigelt, die mir alle immer weiter
geholfen und mir bei der Lösung von vielen Problemen beigestanden haben. Danke für
das Mut zusprechen und das stetige Motivieren.
Bedanken möchte ich mich auch beim Pathologischen Institut. Zum einen bei dem
Immunhistochemischen Labor, dass mich nicht nur eingearbeitet, sondern mir in den
letzten Jahren immer wieder mit guten Ratschlägen zur Seite gestanden hat. Weiterhin
möchte ich mich auch bei Herrn Dr. Tilman Rau bedanken, der mir eine große Hilfe bei
der Etablierung der IHC-Färbungen gewesen ist. Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof.
Dr. med. A. Hartmann, der mich bei der Auswertung der IHC-Färbungen unterstützt hat
und ein offenes Ohr für alle Fragen hatte.
Ich danke meiner Schwester Katja, von deren Erfahrungen ich profitieren konnte und
meiner Cousine Michaela, die mir bei Fragen zur Statistik geholfen hat. Ich danke
meinem Freund Felix, der mich in meiner Arbeit immer bestärkt hat und meinen Eltern,
die die Grundsteine für meinen Weg gelegt haben.
12. Danksagung