Kohlenhydrate und Kohlenhydrat-Stoffwechsel.

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Kohlenhydrate und Kohlenhydrat-Stoffwechsel.
Ziel dieses Versuches ist es, zum Einen durch qualitative Analyse ausgewählter
Zucker Einblick in deren chemische Eigenschaften und deren Bedeutung zu
erhalten, zum Anderen durch kinetische Messungen an einer "Teilstrecke" der
Glycolyse
Charakteristika dieses Energie-erzeugenden Stoffwechselprozesses
besser zu verstehen.
Stichworte zur Vorbereitung
Struktur und Chemie der Zucker. Definition und Beispiele für : Aldosen, Ketosen,
Hexosen, Pentosen, Triosen etc. Glucose: offenkettige Form, Haworth-Darstellung.
Definition und Beispiele für: Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide.
Kohlenhydrate als Energiereserve und als Baustoffe: Stärke, Glycogen, Cellulose.
α- und ß-glycosidische Bindung. Kohlenhydratstoffwechsel: Aminozucker, Zuckeralkohole, On- und Uronsäuren, aerobe und anaerobe Glycolyse, Substratkettenphosphorylierung, Oxidation eines Thiohalbacetals, Phosphorolyse eines Thioesters
und ATP-Synthese, Energieausbeute der Glycolyse. Beziehung der Glycolyse zu
anderen Stoffwechselwegen. Fructose- und Galactosestoffwechsel.
Einführung.
Als "Kohlenhydrate" bezeichnet man Polyhydroxyaldehyde und -ketone und ihre
oligomeren und polymeren Verbindungen, die durch Hydrolyse wieder in ihre
monomeren Bausteine, die "Zucker" : Glucose, Fructose, Galactose, Mannose etc.
zerlegt werden können. Von großer Bedeutung sind auch Zucker, bei denen
Hydroxyl- oder Aldehydfunktionen zu Säurefunktionen oxidiert sind (Zuckersäuren)
oder Zucker bei denen eine Hydroxylgruppe durch eine Aminogruppen ersetzt ist.
(Aminozucker)
Dabei kommt der Glucose eine zentrale Bedeutung als Energieträger in allen
pflanzlichen und tierischen Organismen zu.
Unter anaeroben Bedingen können viele Einzeller, die weder zur Photosynthese
noch zur Lithotrophie (Energiegewinnung durch Oxidation anorganischer
Substanzen) befähigt sind, ihre Energie letztlich nur durch Glycolyse, den Abbau
des C6-Körpers Glucose zu C3- oder C2-Körpern, erzeugen.
Einige Zellen und Gewebe höherer Organismen verwenden aus unterschiedlichen
Gründen nur Glucose als alleinige Energiequelle und bauen diese glycolytisch
- auch in Gegenwart von Sauerstoff - lediglich zu Lactat ab. (Glaskörper,
Zellen der Cornea, Erythrozyten).
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Versuch 1
Reduzierende Wirkung von Aldosen und Ketosen
Prinzip:
In alkalischer Lösung reagieren Aldosen (z.B. Glucose) und Ketosen (z.B.
Fructose) mit verschiedenen Oxidationsmitteln, die dabei reduziert werden. Bei den
sogenannten "Reduktionsproben" werden die Zucker durch leicht reduzierbare
Metallionen oder Farbstoffe zu den entsprechenden "On-säuren" oxidiert. (z.B. die
Glucose zu Gluconsäure).
So werden z.B. Cu 2+ - Ionen zu unlöslichem Cu2O
+
(Fehlingsche Reaktion) , Ag -Ionen zu metallischem Silber (Silberspiegel an einer
Glasoberfläche) oder verschiedene Farbstoffe zu ihren farblosen "Leuko"-formen
reduziert. Beispielsweise werden dunkelblaue Lösungen von Methylenblau weitgehend entfärbt. (Es entsteht dabei das Leukomethylenblau, welches allerdings
durch Luftsauerstoff leicht wieder reoxidiert werden kann.)
Eine positive Reaktion wird bei einfachen Zuckern und bei Oligosacchariden beobachtet, sofern sie eine reduzierende Gruppe enthalten. Glycosidische Bindungen
werden nicht oxidiert. Nicht reduzierend wirken daher Saccharose (die gleichzeitig
ein Glucosid und ein Fructosid darstellt) und Trehalose, in der zwei halbacetalische
Gruppen von zwei Glucosemolekülen ein Vollacetal bilden. Aus diesen Disacchariden entstehen erst nach hydrolytischer Spaltung reduzierende Zucker.
Diese Spaltung kann im Falle der Saccharose enzymatisch durch die Invertase
erfolgen.
Die verschiedenen Zucker sind unter basischen Bedingungen über ein gemeinsames Endiol ineinander überführbar. Als Beispiel für die Glucose / Fructose /
Mannose - Umwandlung sei die "Lobry de Bruyn-van Ekenstein Umlagerung"
genannt :
3
In der Medizin wird häufig eine quantitative Bestimmung von Glucose benötigt.
In der Praxis benützt man dafür ein spezifisches Enzym (Glucoseoxidase), das nur
Glucose oxidieren kann. (Siehe Versuch Organstoffwechsel)
Lösungen und Apparate
1. 1%ige Lösungen der Zucker: Glucose, Fructose und Saccharose zu
Vergleichszwecken.
2. Invertase-Lösung (1 mg/ml in 0.1 M Na-Acetat, pH 4.7)
3. 1%ige wässrige Methylenblaulösung
4. 0.02 N NaOH
5. 0.5 N NaOH
6. Inkubator (Temperatureinstellung 56 °C)
Durchführung
5 Eppendorfgefäße (1.2 ml) beschriften (1 - 5) und wie folgt beschicken mit:
H2O, Glucose-, Fructose-,Saccharoselösung oder der unbekannten Probe,
der Methylenblaulösung und der 0.02 N NaOH.
Gefäß Nr.
50 µl
5 µl
1000 µl
1
H2O
2
3
4
5
Glucose
Fructose Saccharose unbekannte Probe
1 %ige Methylenblaulösung in alle Gefäße
0.02 N NaOH in alle Gefäße
Gefäße verschließen, kurz schütteln, in den Inkubator stellen und im Abstand von
ca. 30 sec die Entfärbung in den Gefäßen überprüfen. Wenn in einem der Gefäße
erste Entfärbungstendenzen sichtbar werden, die Geschwindigkeit der Entfärbung
mit anderen Gefäßen vergleichen. Bei den Gefäßen, in denen eine Entfärbung
stattfindet, die Zeit notieren, die zur vollständigen Entfärbung notwendig war.
Wie verhielt sich Gefäß Nr. 5 (unbekannte Probe) ?
Das Experiment in gleicher Weise mit 0.5 N NaOH wiederholen.
Achten Sie dabei auf Unterschiede in den Entfärbungsgeschwindigkeiten im
Vergleich zum vorhergehenden Experiment. Zeit bis zur vollständigen Entfärbung
ebenfalls möglichst genau protokollieren!
Durchführung mit vorheriger Invertasebehandlung
Gefäß Nr.
50 µl
10 µl
5 µl
1000 µl
1
H2O
2
3
4
5
Glucose
Fructose Saccharose Unbekannte Probe
Invertase-Lösung in alle Gefäße
5 min bei 56 oC inkubieren und danach hinzufügen:
1%ige Methylenblaulösung in alle Gefäße
0.5 N NaOH in alle Gefäße
Achten Sie hier besonders auf das Verhalten von Gefäß Nr. 4 im Vergleich zu den
vorherigen Experimenten. Falls Gefäß Nr. 5 (unbekannte Probe) vorher nicht
entfärbt wurde, welches Verhalten zeigt sich jetzt ?
4
Versuch 2:
Reversible Teilreaktion der Glycolyse.
Die aus 11 enzymatischen Schritten bestehende Glycolyse ist insgesamt exergon,
dabei wird ein Teil der Energie zur Synthese von ATP verwendet. Drei dieser
Schritte (1., 3. und 10.) sind stark exergon: Die Hexokinase- ,
Phosphofructokinase- und die Pyruvatkinase-Reaktion ; das Gleichgewicht liegt bei
diesen Reaktionen also weitgehend auf der Seite der Produkte: Glucose-6phosphat, Fructose-1,6-bisphosphat und Pyruvat..
Alle anderen Schritte sind unter physiologischen Bedingungen mehr oder weniger
reversibel und stehen auch der Gluconeogenese zur Verfügung.
Kinetische Experimente an diesem "mittleren, reversiblen" Bereich
(von der Aldolase bis zur Phosphoglyceratkinase) sind Gegenstand dieses
Versuchs.
Lehrbuch der Biochemie zur Hand nehmen !
Im Mittelpunkt unserer Experimente steht der Abschnitt der Glycolyse von der
Triosephosphat-isomerase bis zur Phosphoglycerat-kinase :
1.
Die Isomerisierung der Triosen
2.
Die anschließende Oxidation einer der Triosen durch NAD bei gleichzeitiger
Produktion einer energiereichen Verbindung
3.
Die Produktion von ATP mit Hilfe dieser energiereichen Verbindung
Den drei Schritten geht die Aldolase voraus.
Im Verlauf dieser Lyase-Reaktion erfolgt der Übergang von:
Hexosen zu Triosen
Triosen zu Hexosen
in Glycolyse-Richtung
in Gluconeogenese-Richtung
Der Einfluß dieser Gleichgewichtsreaktion auf die nachfolgenden
Triose-Reaktionen soll ebenfalls untersucht werden.
Alle für diese Experimente zur Verfügung stehenden Substrate / Cosubstrate
und Enzyme sind im nachfolgenden Schema kursiv und unterstrichen:
Dihydroxyacetonphosphat, NAD, ADP, HPO42- und die Enzyme
Aldolase, Triosephophat- isomerase, Glyceraldehydphosphat-dehydrogenase
und Phosphoglycerat-kinase.
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Überblick.
Reversible Teilreaktion der Glycolyse.
Aldolase("ALDO"):
Fructose-1,6-bisphosphat ↔ Glyceraldehyd-3-phosphat +
Dihydroxyacetonphosphat
Zu den Triosen
Zu den Hexosen
Triosephosphat-isomerase ("TIM"):
Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) ↔ Glyceraldehyd-3-phosphat
Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase
("GAPDH"):
Glyceraldehyd-3-phosphat + NAD + HPO42- ↔ 1,3-Bisphosphoglycerat
+ NADH + H+
HAsO42- statt HPO42Entkopplung durch Arsenat
Keine Bildung von 1,3-Bisphosphoglycerat und damit keine ATP-Bildung
Phosphoglycerat-kinase("PGK")
1,3-Bisphosphoglycerat + ADP ↔ 3-Phosphoglycerat (3-PG) +
ATP
Die Möglichkeit der einfachen photometrische Verfolgung der NADH - Bildung ist
die Basis für vielfältige und empfindliche kinetische Untersuchungen an dieser
Glycolyse-Teilstrecke. NADH besitzt im Gegensatz zu seiner oxidierten Form (NAD)
ein hohes Absoptionsmaximum bei 340 nm.
Absorptionskoeffizient
ε340 = 6200 (mol/l)-1.cm-1.
Im Filterphotometer wird bei
366 nm gemessen: ε366 = 3200 (mol/l)-1.cm-1.
(Zur Erinnerung : Siehe „Biochemische Labormethoden“)
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Wie man aus dem Schema weiter entnehmen kann, erfolgt innerhalb dieser Kette
einer der beiden ATP-Synthese-Schritte der Glycolyse. Wenn wir nun bei
der GAPDH statt Phosphat ( HPO42- ) Arsenat ( HAsO42- ) anbieten, entsteht
statt 1,3-Bisphosphoglycerat 1-Arseno, 3-phospho-glycerat, welches spontan zu
3-Phospho-glycerat hydrolysiert.
Auf diese Weise wird die NADH - Bildung von der ATP-Bildung in der PGK
"entkoppelt " .
Die GAPDH-Reaktion wird unabhängig vom ADP-Angebot in der nachfolgenden
PGK-Reaktion:
die NADH-Produktion läuft entsprechend schneller ab.
Alle folgenden gekoppelten Reaktionen finden in Halbmikroküvetten statt. Es wird
zunächst 500 µl 0.1 M TRIS-Puffer, pH 7.7 vorgelegt. Die nachfolgenden
Zugaben von Enzymen erfolgen in 2 bis 10 µl-Portionen, die der Substrate in
5 bis 50 µl-Portionen.
Die vorbereiteten Enzymlösungen enthalten je ca. 1000 U / ml, die Konzentrationen
der zur Verfügung gestellten Stammlösungen der Substrate/Cosubstrate
betragen 10 mmol/l bei NAD,
40 mmol/l bei Dihydroxyacetonphosphat und
ADP und 500 mmol/l bei Phosphat. Dem Ansatz wird noch 1 µl 1 mol/l Dithiothreitol (DTT) zugesetzt zum Schutz der essentiellen SH-Gruppen der GAPDH.
Als Entkoppler der Substratkettenphosphorylierung steht 100 mmol/l Arsenat und
als irreversibler Inhibitor der GAPDH steht 0.5 mol/l Iodacetamid (SH-Reagenz)
zur Verfügung.
Bei den nachfolgend beschriebenen Aufgaben wird nach Zugabe aller Enzyme und
Substrate am Photometer die Absorption bei 340 nm (oder 366 nm bei Verwendung eines Filterphotometers) im 10 sec Abstand bis zum Stillstand der Reaktion
notiert (d.h. bis keine Absorptionsänderung mehr stattfindet und die Reaktion damit
ihr Gleichgewicht erreicht hat).
(Nach Rücksprache mit dem Betreuer können an den Aufgaben bei Bedarf auch
kleine Veränderungen vorgenommen werden, bezüglich Abfolge und Volumina der
einzelnen Zugaben.)
1. Aufgabe
(Äquimolare Konzentrationen der Substrate/Cosubstrate: ADP, NAD,
Dihydroxyacetonphosphat
zu Beginn der Reaktion) (ohne Aldolase)
500 µl
TRIS-Puffer 0.1 M, pH 7.7
2 µl
TIM (2 U / 2 µl)
2 µl
GAPDH (2 U / 2 µl)
2 µl
PGK (2 U / 2 µl)
Berechnen Sie die Konzentration
der Substrate bei Reaktionsstart !
1 µl
DTT 1 mol/l
20 µl
NAD 10 mmol/l
5 µl
ADP 40 mmol/l
20 µl
Phosphat 0.5 mol/l
System etwa 2 min bei 340 oder 366 nm beobachten (Absorption notieren)
und dann starten durch Zugabe von :
5 µl
DHAP 40 mmol/l
Berechnen Sie aus der Absorptionsdifferenz (AE - AS) die Konzentration des
gebildeten NADH
AS : Absorption bei Reaktionsstart
AE : Absorption nach Stillstand der Reaktion
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Wieviel eingesetztes NAD wurde zu NADH reduziert ?
Versuchen Sie die Anfangsgeschwindigkeit ("Anfangssteigung") zu ermitteln aus
der Absorptionsänderung in den ersten 20 oder 60 Sekunden. (V20 oder V60,
erfahrungsgemäß liefert V60 den zuverlässigeren Wert.
Berechnungen siehe
Protokollvordruck ! )
Variationen der Experimente: Statt mit Dihydroxyacetonphosphat kann auch mit
ADP, NAD oder einem der Enzyme gestartet werden d.h. die Abfolge der Zugaben
kann selbstverständlich geändert werden. Die Reaktion startet erst dann (d.h. die
NADH-Bildung beginnt erst dann) wenn das System komplett ist.
Berechnung der Gleichgewichtskonstanten K und der Gibbs' freien Standardenthalpie ∆G° '.
Für unsere Reaktion:
TIM, GAPDH, PGK
DHAP + NAD + ADP + P
3-PG + NADH + ATP
gilt bei obigen äquimolaren Ausgangsbedingungen für die drei Quotienten:
[3-PG] / [DHAP]
=
[NADH] / [NAD]
=
[ATP] / [ADP]
während der gesamten Reaktion (bis zur Erreichung des Gleichgewichts).
Nun kann das Massenwirkungsgesetz folgendermaßen formuliert werden:
[3-PG] . [NADH]
K=
.
.
.
[ATP]
[DHAP] [NAD] [ADP]
.
1
oder: K = ( [NADH] / [NAD] ) 3
.
1 / [P]
[P]
Aus dem [NADH]/[NAD] -Quotient läßt sich also leicht die Gleichgewichtskonstante
unter den gegebenen Bedingungen ausrechnen, da die relativ hohe Phosphatkonzentration ( [P] ) sich während der Reaktion praktisch nicht ändert.
Diese Gleichgewichtskonstante entspricht dem Produkt der drei einzelnen Gleichgewichtskonstanten der TIM-, GAPDH- und der PGK-Reaktion:
K = KTIM
.
KGAPDH
.
KPGK
Diese Konstanten können vom amerikanischen National Institute of Standards and
Technology (NIST) geholt werden.
(http://wwwbmcd.nist.gov:8080/enzyme/enzyme.html).
Auf freiwilliger Basis dürfen Interessierte die Übereinstimmung ihrer experimentellen
Daten mit den Literatur-Daten überprüfen.
Aus der Gleichgewichtskonstanten kann ferner noch die Gibbs' freie Standardenthalpie berechnet werden : ∆G° ' = − R . T . ln K.
(Allgemeine Gaskonstante R = 8.314 J . mol-1 . K-1 T = absolute Temperatur)
Siehe Rechenbeispiel am Ende dieser Praktikumsvorschrift !
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2. Aufgabe
( Einfluss der Aldolase auf die Reaktion )
500 µl
TRIS-Puffer 0.1 M, pH 7.7
5 µl
ALDO (5 U / 5 µl)
2 µl
TIM (2 U / 2 µl)
2 µl
GAPDH (2 U / 2 µl)
Berechnen Sie die Konzentration
der Substrate bei Reaktionsstart !
2 µl
PGK (2 U / 2 µl)
1 µl
DTT 1 mol/l
20 µl
NAD 10 mmol/l
5 µl
DHAP 40 mmol/l
20 µl
Phosphat 0.5 mol/l
System etwa 2 min bei 340 nm oder 366 nm beobachten (Absorption notieren)
und dann starten durch Zugabe von:
5 µl
ADP 40 mmol/l
Wie wirkt sich die zusätzliche Aldolase aus, im Vergleich zum, sonst identischen,
vorhergehenden Experiment ?
Achten Sie auf evtl. andere Anfangsgeschwindigkeiten.
Wie wäre eine geringere Geschwindigkeit der NADH-Bildung zu erklären ?
3. Aufgabe
( Entkopplung der GAPDH - Reaktion durch Arsenat, 3-PG entsteht jetzt auch in
Abwesenheit von ADP und PGK)
500 µl
TRIS-Puffer 0.1 M, pH 7.7
2 µl
TIM (2 U / 2 µl)
2 µl
GAPDH (2 U / 2 µl)
Berechnen Sie die Konzentration
der Substrate bei Reaktionsstart !
1 µl
DTT 1 mol/l
10 µl
NAD 10 mmol/l
50 µl
DHAP 40 mmol/l
System etwa 2 min bei 340 nm oder 366 nm beobachten (Absorption notieren)
und dann starten durch Zugabe von:
20 µl
Arsenat 100 mmol/l
Rechnen Sie hier nach, ob unter diesen Bedingungen das eingesetzte NAD
vollständig zu NADH reduziert wurde.
4. Aufgabe
Wiederholen Sie das vorhergehende Experiment . Wenn ungefähr ein Drittel der
Endabsorption dieses Experiments erreicht ist, geben Sie 5 µl Jodacetamid hinzu.
Beobachtung ?
9
Fragen
1. Wie verhält sich die, aus den Bausteinen Glucose und Fructose
bestehende Saccharose bei den sogenannten Reduktionsproben,
wie z. B. bei der Fehlingschen Probe?
1. Ist die Verknüpfung zwischen den Bausteinen der Saccharose α-glycosidischer
oder ß-glycosidischer Natur ? Oder beides ? Erklärung ?
2. Was ist ein Halbacetal ?
3. Was versteht man unter pyranosiden und furanosiden Formen der Zucker ?
4. Wie entstehen sie aus der offenkettigen Form ?
5. Glucose und Fructose: Vorwiegend Furanoside oder Pyranoside ?
6. Bei der phosphorolytischen Spaltung von Glycogen entsteht Glucose-1-phosphat,
welches dann zu Glucose-6-phosphat isomerisiert werden kann.
Wie
unterscheiden sich die beiden Zuckerphosphate bezüglich Energieinhalt und Art
der Phosphatbindung ?
7. Wie heißt das Enzym, welches diese Isomerisierung katalysiert ? Wo liegt das
Gleichgewicht ?
8. Im Verlauf der Glycolyse spielen Hexose- und Triosephosphate mit sehr
unterschiedlichen Energieinhalten (freier Energie der Hydrolyse) eine Rolle:
Beschreiben Sie die Unterschiede zwischen normalen Phosphorsäureestern,
den Gemischtsäureanhydriden und Enolester.
9. Welche Bedeutung haben letztere bei der ATP- Synthese ?
10. Was versteht man unter "Gruppenüberträgerpotential" ?
11. Nennen Sie Einzelheiten der GAPDH -Reaktion. Welche Rolle spielen
essentielle SH-Guppen des Enzyms ? Skizzieren Sie die Oxidation des
Thiohalbacetals zum Thioester durch NAD und die anschließende
phosphorolytische Spaltung des Thioesters.
12. Was versteht man unter "Substratkettenphosphorylierung" ?
13. Welche Auswirkungen auf das Enzym haben Alkylierungsmittel, die die SHGruppen der GAPDH in stabile Thioether umwandeln ?
14. Beschreiben Sie den Unterschied zwischen Hemmung und Entkopplung der
Substratkettenphosphorylierung.
15. Welche Schritte der Glycolyse sind irreversibel ?
16. In welchem Zellkompartiment findet die Glycolyse statt ?
17. Welche Zellen und Gewebe des Menschen gewinnen ihre Energie ausschließlich
durch Glycolyse ? Nennen Sie die Gründe für den Verzicht auf den energetisch
viel ergiebigeren vollständigen Abbau der Glucose zu CO2 und H2O.
18.Angenommen, ∆G°' für DHAP+NAD+ADP+P ↔ 3-PG+NADH+ATP wäre
positiv, unsere Reaktion also endergon (unter Standardbedingungen !),
warum würde
trotzdem
zumindest zu Beginn, 3-PG, NADH und ATP
gebildet ?
Betrachten Sie dazu die Gleichung:
∆G = ∆G°' + RT ln ( [3-PG][NADH][ATP] / [DHAP][NAD][ADP][P] )
Erläutern Sie die Unterschiede zwischen freier Enthalpie ∆G und freier
Standardenthalpie ∆G°' . Welche Rolle spielen die Konzentrationen der Stoffe ?
Welchen Wert nimmt ∆G an, wenn die Reaktion zum Stillstand gekommen ist
und damit ihr Gleichgewicht erreicht hat ?
(Siehe auch Taschenatlas der Biochemie 2. Auflage S. 16/17).
10
Protokoll zum Versuch Kohlenhydrate /
Kohlenhydratstoffwechsel
1. Reduzierende Wirkung von Aldosen und Ketosen
mit 0.02 N NaOH
Gefäß Nr.
1
2
3
4
5
H2O
Glucose
Fructose
Saccharose
unbekannte Probe
Zeit [min] bis zur
vollständigen
Entfärbung
mit 0.5 N NaOH
Gefäß Nr.
1
2
3
4
5
H2O
Glucose
Fructose
Saccharose
unbekannte Probe
Zeit [min] bis zur
vollständigen
Entfärbung
nach Behandlung mit Invertase
Gefäß Nr.
Zeit [min] bis zur
vollständigen
Entfärbung
Kommentar:
1
2
3
4
5
H2O
Glucose
Fructose
Saccharose
unbekannte Probe
11
2. Reversible Teilreaktion
der Glycolyse.
Berechnung von V20 bzw. V60
und [NAD]S , [NAD]E, [NADH]E :
V20 bzw. V60 Anfangsgeschwindigkeit
20 bzw. 60 sec. nach Reaktionsstart
V20 = 5.107 . (A20 - AS) / ε
[nmol/l . sec-1]
V60 = 1.67.107 . (A60 - AS) / ε [nmol/l . sec-1]
[NAD]S
NAD-Startkonzentration
[NAD]E
NAD-Endkonzentration
[NADH]E NADH-Endkonzentration
[NADH]E = 103 . (AE − AS) / ε [mmol/l]
[NAD]E = [NAD]S − [NADH]E [mmol/l]
1. Aufgabe
AS
A20
A60
AE
Absorption bei Reaktionsstart
Absorption nach 20 sec
Absorption nach 60 sec
Absorption bei Reaktionsende
2. Aufgabe
AS
A20
A60
AE
AS
A20
A60
AE
V20
V60
[NAD]S
[NAD]E
[NADH]E
[NADH]E / [NAD]E
(nmol/l) . sec-1
(nmol/l) . sec-1
mmol/l
mmol/l
mmol/l
V20
V60
[NAD]S
[NAD]E
[NADH]E
[NADH]E / [NAD]E
(nmol/l) . sec-1
(nmol/l) . sec-1
mmol/l
mmol/l
mmol/l
V20
V60
[NAD]S
[NAD]E
[NADH]E
[NADH]E / [NAD]E
(nmol/l) . sec-1
(nmol/l) . sec-1
mmol/l
mmol/l
mmol/l
V20
V60
[NAD]S
[NAD]E
[NADH]E
[NADH]E / [NAD]E
(nmol/l) . sec-1
(nmol/l) . sec-1
mmol/l
mmol/l
mmol/l
Entkopplung der
GAPDH durch
Arsenat
Absorption bei Reaktionsstart
Absorption nach 20 sec
Absorption nach 60 sec
Absorption bei Reaktionsende
4. Aufgabe
ε340 = 6200 (mol/l)-1 . cm-1 (Monochromator 340 nm)
ε366 = 3300 (mol/l)-1 . cm-1 (Filterphotometer Eppendorf)
Einfluß der Aldolase
auf die Reaktion
Absorption bei Reaktionsstart
Absorption nach 20 sec
Absorption nach 60 sec
Absorption bei Reaktionsende
3. Aufgabe
AS
A20
A60
AE
Äquimolare
Konzentrationen von
NAD, DHAP, ADP
Hemmung der
GAPDH durch
Iodacetamid
Absorption bei Reaktionsstart
Absorption nach 20 sec
Absorption nach 60 sec
Absorption bei Reaktionsende
12
Kommentare zur 1. Aufgabe:
(Äquimolare Konzentrationen
von NAD, ADP, DHAP)
Welche Gleichgewichtskonstante für die Reaktion:
NAD + DHAP + ADP + P ↔ NADH + 3-GP + ATP
ergibt sich aus dem NADH zu NAD Verhältnis unter den gegebenen Bedingungen ?
Welcher Wert ergibt sich für die Gibbs' freie Standardenthalpie ∆G°' ?
Welche Aussage steckt in diesen Konstanten ?
Kommentare zur 2. Aufgabe:
(Gegenwart von Aldolase)
Geben Sie eine Begründung, falls die Anfangsgeschwindigkeit im Vergleich zur
1. Aufgabe niedriger oder höher ist (bei sonst gleichen Substratkonzentrationen).
Kommentare zur 3. Aufgabe:
(Entkopplung durch Arsenat)
Vergleichen Sie Anfangsgeschwindigkeit und NADH-Endkonzentration mit den
vorherigen Daten. Wird NAD vollständig zu NADH umgesetzt, nachdem die
ATP-Synthese "abgekoppelt" wurde ?
Kommentare zur 4. Aufgabe:
(Wirkung des Alkylierungsmittels Jodacetamid)
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Beispiel für die Berechnung der Gleichgewichtskonstanten K und
der Gibbs' freien Standardenthalpie ∆G°' der Reaktion:
TIM, GAPDH, PGK
DHAP + NAD + ADP + P
3-PG + NADH + ATP
(1. Aufgabe von Versuch 2)
Berechnung der NAD-Startkonzentration:
Das Gesamtvolumen in der Küvette war 557 µl davon war:
20 µl
10 mmol/l NAD
(die NAD-Lösung wurde damit 1: 27.85 verdünnt)
Also: 10 / 27.85 = 0.359
[NAD]Start = 0.359 mmol/l
Am Eppendorf-Photometer wurde nun folgende
Absorptionsdifferenz (AE - AS) nach
Erreichung des Gleichgewichtes erhalten:
Daraus ergibt sich bei
ε366 =
∆A = 0.5
(war tatsächlich so: exakt 0.1 → 0.6)
3300 (mol/l)-1 . cm-1
NADH-Endkonzentration also:
NAD-Endkonzentration:
[NAD]Ende =
die NADH-Konzentration:
0.5 / 3300 = 1.515 . 10-4
[NADH]Ende = 0.151 mmol/l
[NAD]Start − [NADH]Ende
[NAD]Ende = 0.208 mmol/l
Bei Erreichung des Gleichgewichts ergibt sich also folgender NADH / NAD-Quotient:
[NADH] / [NAD] = 0.726
Berechnung der Phosphatkonzentration: (ändert sich während der Reaktion praktisch nicht)
20 µl 0.5 mol/l Phosphat 1 : 27.85 verdünnt (wie oben) [P] = 0.018 mol/l
In unsere Gleichung K =
( [NADH] / [NAD] ) 3
.
1 / [P] eingesetzt, ergibt sich:
K = 21.26
Daraus läßt sich folgende Gibbs' freie Standardenthalpie errechnen:
∆G°' = − R .T. ln K = − 8.314 . 300 . ln 21.26 = − 7624 J . mol-1
∆G°' = − 7.6 kJ
.
mol-1