DISS. ETH NO. 18788 Analysis of Protein Interactions, Biological

DISS. ETH NO. 18788
Analysis of Protein Interactions, Biological Functions and
Immunogenicity of Carbohydrates Using Synthetic
Oligosaccharides
A dissertation submitted to
ETH Zurich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
TIM HORLACHER
Dipl. Biochem., Universität Regensburg
Date of birth
07.09.1978
citizen of
Germany
accepted on the recommendation of
Professor Dr. Peter H. Seeberger
Professor Dr. Markus Aebi
2009
Abstract
Virtually all cells are coated with oligo- and polysaccharides. These glycans regulate
interactions of cells with their environment. In organisms, carbohydrates are involved in all
physiological and many pathological processes. Glycans are essential for the correct
development of every organ. Carbohydrate-protein interactions mediate most glycan functions,
including cell adhesion, organization of protein interactions on the cell surface and cell
signaling.
However, due to the enormous complexity of glycans and the lack of appropriate research tools
still little is known about carbohydrate functions in organisms. Synthetic sugars open up new
ways to investigate glycan function.
In this thesis, synthetic oligosaccharides were employed to analyze protein interactions,
biological functions, and the immunogenicity of carbohydrates. Carbohydrate microarrays,
arrays of oligosaccharides that are spotted in microscale, allowed for analyzing dozens of
glycan interactions in parallel. Carbohydrate binding was further investigated in detail using
surface plasmon resonance measurements. In vitro assays using synthetic oligosaccharides
elucidated the biological function of glycan interactions. Immunization with oligosaccharideconjugates was used to investigate the role of glycans in the immune response, to analyze
vaccine candidates and to generate monoclonal antibodies.
These tools enabled me to address a great number of questions, including identification of
glycan interactions, ligand screening, determination of structure-activity relationships and
analysis of immunogenicity. A wide range of glycan classes, ranging from most eukaryotic
glycan classes to bacterial cell wall glycopolymers, was analyzed. The knowledge gained not
only increases our understanding of glycan interactions and functions, but may also guide the
development of vaccines, diagnostic tests and better anti-coagulants.
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Binding preferences of human galectins were determined using carbohydrate microarrays
(Chapter 2) to comprehend how galectin specificity for glycans is achieved by sugars adjacent
to the common galectin binding disaccharide. Distinct sugars at the reducing end of this
common motif directed preferential binding of some galectins to distinct glycan classes.
Glycosylations on the basic binding motif drastically altered galectin affinities. Cells are
therefore able to control the responsiveness to galectins by the expression of the respective
glycosyltransferases. Blood group antigens were identified as high affinity ligands for most
galectins and presumably mediate important galectin functions.
A synthetic heparin oligosaccharide library was used as basis for heparin microarray, surface
plasmon resonance and activity assay experiments to elucidate the structure-activity
relationship (SAR) of heparin and heparan sulfate for coagulation proteins or growth factors
(Chapter 3). Highly sulfated heparin/HS sequences revealed preferred binding motifs and
mediated the biological action of heparin/HS interactions. Modifications that are particularly
important for some protein interactions were identified and may therewith guide the
development of highly specific heparin/HS-based binders, including better anti-coagulants.
Annexin 1 was revealed to bind calcium-dependently heparin/HS. This binding event
presumably modulates annexin 1 action in organisms.
Immunogenicity of a hexasaccharide, representing a repeating unit of the glycopolymer found
on vegetative Bacillus anthracis cells, was analyzed. Monoclonal antibodies against the
vegetative Bacillus anthracis glycopolymer were produced by immunization with a
hexasaccharide carrier protein conjugate (Chapter 4). The use of these antibodies for B.
anthracis detection is currently being investigated. Carbohydrate microarray experiments
established that anti-(vegetative B. anthracis glycopolymer) hexasaccharide antibodies are
present in the sera of people having received the AVA vaccine that contains proteins of
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B. anthracis culture supernatants. This finding suggests a role of the glycopolymer in the
immune response against B. anthracis.
Finally, a pentasaccharide, representing a substructure of the Plasmodium falciparum
glycosylphosphatidylinositol (GPI), was investigated as a putative anti-toxin vaccine against
severe malaria (Chapter 5). Mice were immunized with a GPI-pentasaccharide-KLH conjugate,
infected with the mouse malaria agent Plasmodium berghei and the cerebral malaria incidence
was monitored. The results suggest that the GPI-pentasaccharide partially protects mice from
cerebral malaria with respect to sham-immunized mice.
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Zusammenfassung
Alle Zellen sind von Oligo- und Polysacchariden umgeben. Diese Glykane regulieren
Wechselwirkungen von Zellen mit ihrer Umgebung. In Organismen sind Kohlenhydrate an
allen physiologischen und vielen pathologischen Prozessen beteiligt. Glykane sind essentiell
für die korrekte Entwicklung jedes Organs. Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen vermitteln die
meisten
Funktionen
der
Glykane,
einschliesslich
Zelladhäsion,
Organisation
von
Proteininteraktionen auf der Zelloberfläche und Signaltransduktion.
Aufgrund der enormen Komplexität von Glykanen und fehlender Forschungsmethoden ist
immer noch wenig über die Funktionen von Kohlenhydraten in Organismen bekannt.
Synthetische Zucker eröffnen neue Möglichkeiten Glykanfunktionen zu untersuchen.
In dieser Doktorarbeit wurden mit synthetischen Oligosacchariden Proteininteraktionen,
biologische Funktionen und die Immunogenität von Kohlenhydraten analysiert. KohlenhydratMikroarrays, modifizierte Objektträger mit kovalent, im Mikromaßstab gebundenen Zuckern,
ermöglichten
es,
dutzende
Glykaninterkationen
gleichzeitig
zu
analysieren.
Kohlenhydratbindungen wurden dann mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) im Detail
untersucht. In vitro Experimente basierend auf synthetischen Oligosacchariden klärten die
biologische
Funktion
von
Glykaninteraktionen
auf.
Immunisierung
mit
Oligosaccharidkonjugaten wurde eingesetzt, um die Funktion von Glykanen in der
Immunantwort zu untersuchen, Impfstoffkandiaten zu analysieren und monoklonale Antikörper
zu produzieren.
Die verwendeten Methoden ermöglichten zahlreiche Forschungsaspekte zu untersuchen,
darunter die Identifikation von Glykaninteraktionen, Ligandenscreening, die Bestimmung von
Struktur-Aktivitätsbeziehungen und die Analyse der Immunogenität. Ein breites Spektrum an
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Glykanen, das von den meisten eukaryotischen Glykanklassen bis zu BakterienzellwandGlykopolymeren reichte, wurde untersucht. Das erhaltene Wissen trägt nicht nur zum besseren
Verständnis von Glykaninteraktionen- und Funktionen bei, sondern hilft auch bei der
Entwicklung von Impfstoffen, Diagnostika und besseren Gerinnungshemmern.
Mit Kohlenhydrat-Mikroarrays wurden die Bindungspräferenzen von menschlichen Galektinen
bestimmt (Kapitel 2), die erklären, wie die Spezifität der Galektine für interagierende Glykane
durch die benachbarten Zucker des allgemeinen Bindungsmotivs entsteht. Bestimmte Zucker
am nicht-reduzierenden Ende des allgemeinen Bindungsmotivs bewirkten, dass einige
Galektine bestimmte Glykanklassen bevorzugt binden. Glykosylierungen am allgemeinen
Bindungsmotiv veränderten die Affinität von Galektinen drastisch. Über die Expression von
Glykosyltransferasen können Zellen somit die Empfindlichkeit gegenüber Galektinen
kontrollieren. Blutgruppenantigene wurden als hochaffine Liganden für die meisten Galektine
ausgemacht und vermitteln wahrscheinlich wichtige Funktionen von Galektinen.
Eine
synthetische
Heparinoligosaccharidbibliothek
wurde
in
Heparin-Mikroarray-,
Oberflächenplasmonenresonanz- und Aktivitätsexperimenten verwendet, um die StrukturAktivitätsbeziehung von Heparin und Heparansulfat mit Koagulationsproteinen oder
Wachstumsfaktoren aufzuklären (Kapitel 3). Hoch sulfatierte Heparin/HS-Sequnzen stellten
sich als bevorzugte Bindungsmotive heraus und vermitteln die biologische Wirkung von
Heparin/HS-Interaktionen. Es wurden Modifikationen gefunden, die besondere Bedeutung für
einige Proteininteraktionen haben und somit die Entwicklung spezifischer Heparin-basierter
Binder, einschliesslich besserer Gerinnungshemmer, ermöglichen. Es konnte gezeigt werden,
dass Annexin 1 Calcium-abhängig Heparin/HS bindet, wodurch wahrscheinlich die Annexin 1Wirkung im Organismus moduliert wird.
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Die Immunogenität eines Hexasaccharids, die einer Wiederholungseinheit des Glykopolymers
auf vegetativen B. anthracis Zellen entspricht, wurde analysiert (Kapitel 4). Monoklonale
Antikörper gegen das vegetative B. anthracis Glykopolymer wurden durch Immunisierung mit
dem Hexasaccharid-Trägerproteinkonjugat hergestellt. Der Einsatz dieser Antikörper für die
Detektion von B. anthracis wird zurzeit untersucht.
Kohlenhydrat-Mikroarray-Experimente zeigten, dass sich Antikörper gegen das vegetative B.
anthracis Glycopolymerhexasaccharid in Seren von Menschen befinden, die mit dem AVAImpfstoff geimpft wurden. Der AVA-Impfstoff enthält Proteine, die aus Überständen von B.
anthracis Kulturen gewonnen werden. Diese Erkenntnis weisst darauf hin, dass das
Glykopolmer eine Bedeutung für die Immunantwort besitzt.
Schliesslich wurde ein Pentasaccharid, das einer Substruktur des Plasmodium falciparum
Glycosylphosphatidylinositols (GPI) entspricht, als anti-Toxin-Impfstoff gegen schwere
Malaria untersucht (Kapitel 5). Mäuse wurden mit GPI-Pentasaccharid-KLH-Konjugat
immunisiert, mit dem Maus-Malaria-Erreger Plasmodium berghei infiziert und auf das
Eintreten von zerebraler Malaria überprüft. Die Resultate weisen darauf hin, dass das GPIPentasaccharid Mäuse im Vergleich zu scheinimmunisierten Mäusen teilweise vor zerebraler
Malaria schützt.
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