Untersuchungen zur Biosynthese der Proteine, II1

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Bd. 315 (1959)
Untersuchungen zur Biosynthese der Proteine, II1
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Über die Verteilung der aminosäureaktivierenden Enzyme
in Zellfraktionen aus Homogenaten von Escherichia coli B.
Von
D. J. McCorquodale und W. Zillig
Aus dem Max-Planck-Institut für Biochemie, München
(Der Schriftleitung zugegangen am 9. Januar 1959)
Wir haben kürzlich die Isolierung und Fraktionierung zweier zellfreier Systeme aus Escherichia coli B. beschrieben, die den Einbau radioaktiv markierter Aminosäuren in Proteine katalysieren1'2. Sowohl eine
aus größeren Partikeln bestehende Fraktion (Debris) als auch eine Ribonucleoproteid-Partikel-Fraktion (RNP*) bauen in Gegenwart von löslichen Polyribonucleotiden relativ geringen Molekulargewichtes und
Adenosintriphosphat (ATP) als Cofaktor Aminosäuren in Proteine ein.
Im Falle des RNP-Systems ist darüber hinaus noch der Zusatz einer
aus DNS- und RNP-freiem Überstand (14-Stdn.-Überstand) durch isoelektrische Fällung bei £> 4,4 gewonnenen löslichen Proteinfraktion
( &-Fraktion) erforderlich. Es war daher zu prüfen, ob die von Hoagland 3 zuerst beschriebenen und mit der Proteinbiosynthese in Verbindung gebrachten aminosäureaktivierenden Enzyme auch an diesem Einbau beteiligt sind und wie sie sich über die Fraktionen der Einbausysteme verteilen.
Methoden
E. coli B. wurde wie früher beschrieben1 gezüchtet und homogenisiert. Das
Homogenat wurde durch differentielle Zentrifugation in die Desbris-Fraktion, die
in 10 Min. bei 20000 U/Min, im Rotor R 30 der Spinco-Zentrifuge, Modell L, sedimentiert, in die RNP-Partikel, die im Rotor R 40 bei 40000 U/Min, in 5 Stdn.
sedimentieren, und in einen DNS- und RNP-freien 14-Stdn.-40000-U/Min.-Überstand zerlegt. Dieser Überstand wurde durch Elektrophorese nach Tiselius in
eine nucleotidfreie Proteinfraktion (Albuminspektrum im UV) und eine RNS- :
Fraktion aufgetrennt.
Die RNP-Partikel wurden in magnesiumhaJtigem PhospJmtpuffer1 suspendiert und nochmals 5 Stdn. bei 30000 U/Min. (R 30) sedimentiert. Das Sediment
* Es werden folgende Abkürzungen verwendet: RNS = Ribonucleinsäure,
RNP 1= Ribonucleoproteid, DNS = Desoxyribonucleinsäure, PP = Pyrophosphat.
L Mitteü.: D. Schachtschabel u. W. Zillig, diese Z. 314, 262 [1959].
2
D. Schachtschabel u. W. Zillig, IV. Internat. Kongr. f. Biochemie
Wien, L—6. Sept. 1958, S. 76, Pergamon Press, London 1958; W. Zillig u. D. J.
McCorquodale,
ebenda, S. 76.
3
M. B. Hoagland, E. B. Keller u, P. C, Zamecnik, J. biol. Chemistry
218, 345 [1956].
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Zur Biosynthese der Proteine, II
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wurde durch Fällung mit Ammoniumsulfat zwischen 30 und 50% Sättigung von
begleitendem löslichem Protein befreit. Die Partikel bleiben dabei hinsichtlich
ihrer physikalischen Eigenschaften und in ihrer Fähigkeit, markierte Aminosäuren
'in ihr Protein einzubauen, unbeeinflußt.
Die Debris-Fraktion, der 14-Stdn.-Überstand, das elektrophoretisch präparierte micleotidfreie Protein und die RNP-Fraktion wurden wie in der Legende
zur Tabelle angegeben inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von Trichloressigsäure abgebrochen und das ATP-[32P] nach Crane und Lipmann 4 in der
Modifikation
von De Moss und Novelli 5 isoliert. Die auf Phosphatgehalt analysierten6 salzsauren Hydrolysate wurden auf Aluminiumplättchen, die mit einem
säurefesten Überzug (Araldit) versehen worden waren, aufgebracht und im SC-16Gasflow-counter der Fa. Tracerlab gezählt. Der statistische Fehler betrug dabei
nicht mehr als 5%. In der Berechnung wurde angenommen, daß je 2 Mol Orthophosphat im Hydrolysat
einem Mol ATP entsprechen.
Orthophosphat-[32P] wurde von der Kernreaktor-Bauund Betriebsgesellschaft mbH, Karlsruhe, bezogen, Pyrophosphat-[32P] daraus nach McCorquo7
dale und Mueller dargestellt; ATP wurde von Waldhof, Mannheim, die Aminosäuren wurden von der Hoffmann-La Roche-AG,
Basel, bezogen.
Protein wurde nach L o wry et al.8 bestimmt.
Ergebnisse
Enzyme, die den aminosäureabhängigen Austausch von 32P zwischen
ATP und 32PP katalysieren, sind in allen getesteten Fraktionen außer
der RNP-Fraktion in signifikanten Mengen enthalten (Tabelle). Da der
14-Stdn.-Überstand dem von De Moss und Novelli 5 untersuchten
.-co^-Extrakt entspricht, war zu erwarten, daß die von diesen Autoren
in ihrer Präpäration nachgewiesene Gruppe von austauschkatalysierenden Aminosäuren auch im 14-Stdn.-Überstand aktiv sei. Die Übereinstimmung ist in der Tat weitgehend. Abweichend von De Moss und
Novelli finden wir jedoch im Überstand auch serin- und threoninabhängigen, jedoch keinen von Phenylalanin katalysierten Austausch.
Die lösliche, mucleotidfreie Proteinfraktion, die aus dem Überstand
durch elektrophor^tische Abtrennung der Nucleinsäuren dargestellt
wurde, sollte die gleiche Gruppe aminosäureaktivierender Enzyme enthalten wie der Überstand selbst. Wir finden jedoch, daß in dieser Präparation nur 6 der im Überstand aktiven 10 Aminosäuren den Austausch
katalysieren. Die aktivierenden Enzyme für Serin, Isoleucin, Threonin
und Methionin sind im Verlauf der Operation entweder inaktiviert oder
entfernt worden.
Die sehr niedrige Austauschkapazität der RNP-Fraktion ist nicht
signifikant.
Die Debrisfraktion enthält aktivierende Enzyme für sämtliche 21
normalerweise in Proteinen gefundenen Aminosäuren.
4
5
R. K. Grane u. F. Lipmann, J. biol. Chemistry 201, 235 [1953].
J. A. De Moss u. G. D. Novelli, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam]
22, 496 [1956].
C. H. Fiske u. Y. Subbarow, J. biol. Chemistry 66, 375 [1925].
7
D. J. McCorquodale u. G. C. Mueller, J. biol. Chemistry 232, 31 [1958].
8
0. L. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr u. R. J. Randall, J. biol.
Chemistry 193, 265 [1951].
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Bd. 315 (1959)
Verteilung aminos ureaktivierender Enzyme in Fraktionen aus Homogenaten
von E. coli B.
0,5 ml Enzym, entsprechend 5 rng Debris-Protein, l mg 14-Stdn.- berstand
oder
0,55mg nucleotidfreier berstand, wurde mit 5μΜο1 ATP, 2μΜο1 32PP (42800
Imp./Min./μΜοΙ in den Experimenten mit Debris und nucleotidfreiem berstand,
320000 Imp./Min./μΜοΙ bei den Inkubationen mit 14-Stdn.- berstand und RNPPartikeln), 4 μΜο! MgCl2, 25 //Mol Phosphat, gepuffert auf ρπβ,δ, und δ μΜο! der
einzehien L-Aminos uren in einem Vol. von 1,0 ml 15 Min. bei 37° in Luftatmosph re inkubiert. Werte, die signifikant h her sind als die Kontrolle, sind
fettgedruckt.
ΡΓέiparate
πιμΜο 1 32PP in ATIYmg Protein in ] 5 Min.
Nucleotidfreie
14-Stdn.Fraktion aus
RNPDebris
berstand 14-Stdn.- ber- Partikel
stand
Kontrollen :
ohne Aminos ure . . . .
ohne ATP
ohne Enzym
Asparagins ure
Glycin
Cystein
Hydroxyprolin
Glutamin
Arscinin
Asparagin
Serin
Phenylalanin
Prolin .
Histidin
Glutamins ure
Lysin
Tryptophan
Tyrosin
Leucin
Isoleucin
Threonin
Valiii . . .
Alanin
Methionin
. .
. .
19
15
2
55
0
0
35
5
0
10
0
0
25
25
26
26
27
27
28
28
30
31
31
40
46
47
49
57
58
60
63
63
225
54
54
143
56
54
54
56
77
54
54
63
56
56
129
86
76
133
100
126
54
125
34
34
43
34
35
35
35
34
34
34
58
34
34
169
51
124
34
36
81
36
34
10
11
11
9
9
10
11
11
10
9
10
9
11
9
11
11
11
9
9
10
11
l g Bakterien (Trockengewicht) liefert etwa 560 mg Debris-Fraktion,
200mg 14-Stdn.- berstand und 237mg RNP-Partikel. Ein betr chtlicher Anteil der gesamten aminos ureaktivierenden Enzyme ist demnach an Partikel gebunden.
Zahl und Art der aminos ureaktivierenden Enzyme, die man in
einer gegebenen Pr paration findet, scheinen von der Festigkeit ihrer
Bindung an Partikel und von der gew hlten Extraktionsprozedur, die
labile Enzyme inaktivieren kann, abzuh ngen.
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Diskussion
Die Ergebnisse zeigen, daß aminosäureaktivierende Enzyme in
Homogenaten von E. coli sowohl in löslicher als auch in partikelgebundener Form vorliegen. Die in Gegenwart von RNS und ATP zum Einbau von Aminosäuren in Protein befähigte Debris-Fraktion enthält
aktivierende Enzyme für alle 21 normalerweise im Protein gefundenen
Aminosäuren. Dies erklärt den Befund, daß der Zusatz der löslichen,
aminosäureaktivierende Enzyme enthaltenden Fraktion für den Einbau
im Debris-System nicht notwendig ist1.
Im RNP-System ist außer dem Zusatz von löslicher RNS (L-RNS)
die Gegenwart löslichen Proteins (#>H4-Fraktion, 14-Stdn.-Überstand
oder nucleotidfreies Protein daraus) für den Einbau von Aminosäure
ins Protein erforderlich. Die Aktivität des Über stand s im Einbausystem
ist proportional seinem Gehalt an aktivierendem Enzym,
Diese Befunde machen den absoluten Bedarf an aminosäureaktivierenden Enzymen in beiden Einbausystemen wahrscheinlich.
Herrn Prof. Dr. A. Butenandt danken wir sehr für wohlwollende Förderung der Arbeit. Der eine von uns (McC.) dankt für ein großzügiges Stipendium
der American Cancer Society.
Zusammenfassung
Die Fähigkeit verschiedener Fraktionen aus Homogenaten von
E. coli B., den aminosäureabhängigen Austausch zwischen 32PP und
ATP zu katalysieren, wurde bestimmt. Amülosäureaktivierende Enzyme
wurden in signifikanter Menge in der Debris-Fraktion, dem 14-Stdn.Überstand und der daraus durch elektrophoretische Abtrennung der
Nucleotide gewonnenen nucleotidfreien Proteinfraktion, nicht hingegen
in der Ribonucleoprot3id-Fraktion, nachgewiesen. Die Debris-Fraktion
enthält aktivierende Enzyme für sämtliche normalerweise in Proteinen
gefundenen 21 Aminosäuren, der 14-Stdn.-Überstand nur eine Gruppe
davon.
Summary
The ability of various fractions from homogenates of E. coli B. to
catalyze an amino acid-dependent 32PP-ATP exchange was tested.
Amino acid-activating enzymes were found in substantial quantities in
the debris fraction, the 14 hr.-105,000 g supernatant, and tlie protein
electrophoretically isolated from the 14' hr.-105,000 g supernatant.
The ribonucleoprotein particles exhibited a low level of activity which
was considered to be due to contamination with soluble amino acidactivating enzymes. Amino acid-activating enzymes corresponding to all
21 amino acids commonly found in nature were detected in the debris
fraction.
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