1. a -Aminosäuren Aminosäuren besitzen eine Amino

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1. α -Aminosäuren
Aminosäuren besitzen eine Amino- und eine Carboxylgruppe im Molekül. Außer Glycin sind
alle Aminosäuren optisch aktiv. Im Körper kommen α -Aminosäuren als Bausteine von
Proteinen vor. Die allgemeine Formel lautet:
Ist R nicht Wasserstoff (wie beim Glycin), so besitzt die Aminosäure ein asymmetrisches
Kohlenstoffatom. Zum Aufbau der Peptide und Proteine wird mit wenigen Ausnahmen nur
die L-Form verwendet. Als Beispiel sei hier die Struktur von L(+)-Alanin (= α Aminopropionsäure) angegeben:
Es gibt ca. 20 Aminosäuren, die regelmäßig in den Proteinen vorkommen. R kann außer CH3
(wie beim Alanin) ein Kohlenwasserstoff- oder auch ein aromatischer Rest sein. Er kann auch
weitere funktionelle Gruppen wie z.B. eine zweite Carboxyl- oder Aminogruppe beinhalten.
Die Aminosäuren besitzen sowohl eine saure (COOH) als auch eine basische (NH2) Gruppe
im Molekül. Sie sind deshalb Ampholyte. Im nach außen hin ungeladenen Zustand liegen die
Aminosäuren nicht entsprechend der obigen Formel vor, sondern sie weisen eine
Zwitterionen-Struktur auf.
Der pH-Wert, an dem die Zwitterionen vorliegen, heißt isoelektrischer Punkt. Obige Formeln
erklären auch den hohen Schmelzpunkt, die leichte Wasserlöslichkeit und die
Puffereigenschaften. Wegen der basischen Eigenschaften der Aminogruppe sind
Aminosäuren nicht wie gewöhnliche organische Säuren mit Laugen quantitativ titrierbar. Dies
gelingt erst, wenn die Aminogruppe mit Formaldehyd zur N-Methylen-aminosäure (=
Schiff’sche Base) kondensiert wird, die dann mit Natronlauge maßanalytisch bestimmt
werden kann.
Der Nachweis der Aminosäuren erfolgt mit der Ninhydrinreaktion. Diese Reaktion beruht auf
der vorhandenen freien Aminogruppe
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Die entstandene Verbindung ist wegen der Mesomerie unter der Beteiligung der
Wasserstoffbrückenbindung innerhalb des Systems konjugierter Doppelbindungen farbig. Die
Trennung eines Aminosäuregemisches
erfolgt durch Chromatographie (z.B.
Dünnschichtchromatographie). Damit können kleinste Mengen (0,001 - 0,1 mg) analysiert
werden. Durch Besprühen mit Ninhydrin und Erwärmen werden die Aminosäuren nach der
Chromatographie z.B. auf der Dünnschichtplatte sichtbar gemacht .
Die Dünnschichtchromatographie mit einer Kieselgelplatte beruht auf der Trennung durch ein
Adsorptions- und Verteilungsgleichgewicht (Nernst’scher Verteilungssatz). Die stationäre
Phase, das Kieselgel, adsorbiert die Aminosäure. Je polarer die einzelnen Aminosäuren sind,
umso stärker werden sie adsorbiert und umso langsamer werden sie durch die mobile Phase,
das Laufmittel, wieder eluiert. Je polarer jedoch das Laufmittel ist, desto leichter gehen polare
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Substanzen von der stationären in die mobile Phase über. Wird dem Laufmittel Wasser
zugesetzt, so überziehen sich die Kieselgel-Partikel mit einem Wasserfilm. Das zu trennende
Substanzgemisch kann nun nicht mehr am Kieselgel adsorbiert werden; es verteilt sich
zwischen der flüssigen mobilen Phase (Laufmittel) und der ebenfalls flüssigen stationären
Phase (Wasserfilm).
Eine charakteristische Größe bei der Dünnschichtchromatographie ist der Rf-Wert. Er ist
definiert als:
Primäre, sekundäre und tertiäre Amine lassen sich aufgrund ihrer chemischen Reaktionen
leicht voneinander unterscheiden. Primäre aliphatische und aromatische Amine reagieren mit
salpetriger Säure (Natriumnitrit + Salzsäure) unter Bildung von Diazoniumsalzen.
Aliphatische Diazoniumsalze sind nicht isolierbar; sie spalten sofort Stickstoff ab. Dagegen
sind aromatische Diazoniumsalze in der Kälte relativ stabil. Die Bildung eines
Diazoniumsalzes verläuft folgendermaßen:
Aliphatische Diazoniumsalze spalten nun Stickstoff ab. Das entstehende Kation R+ reagiert
entweder mit Wasser zu einem Alkohol oder es spaltet am Nachbar-Kohlenstoffatom ein
Proton ab, wobei ein Alken entsteht.
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Sekundäre Amine bilden N-Nitrosamine (farbiges, öliges Reaktionsprodukt), die stark
gesundheitsschädlich sind.
Tertiäre Amine zeigen demgegenüber keine Reaktion.
Die primäre Aminogruppe von Aminosäuren kann mit Aldehyden unter Bildung von
Schiff’schen Basen reagieren. Hierbei verliert die Aminogruppe ihre basische Eigenschaft und
die verbleibende Karbonsäure kann titriert werden. In der Biochemie spielt diese Reaktion
beim Stoffwechsel der Aminosäuren eine Rolle. Hierbei ist der Aldehyd das
Pyridoxalphosphat.
2. Peptide und Proteine
Werden mehrere Aminosäuren durch Säureamidbindungen (= Peptidbindung) miteinander
verknüpft, so erhält man je nach Kettenlänge ein Oligopeptid (bis 12 Aminosäurereste), ein
Polypeptid (bis 100 Aminosäurereste) oder ein Protein (über 100 Aminosäurereste). In den
Proteinen wird die Reihenfolge der einzelnen Aminosäuren (Sequenz) als Primärstruktur
bezeichnet. Eine Besonderheit der Peptidbindung ist die Behinderung der freien Drehbarkeit
um die Peptidbindung selbst. Infolge Mesomerie ist eine Grenzstruktur beteiligt, die eine
C=N-Doppelbindung aufweist.
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Dies bewirkt, dass sich die Gruppierung -CO-NH- wie eine "starre Platte" verhält, und dass
die Peptidkette nur um die Bindungen beiderseits der -CHR-Gruppe beweglich ist. Somit
kann ein großer Rest R die günstigste Lage im Raum einnehmen. Eine solche ist die
Anordnung als Spirale (α -Helix), wobei die Stabilisierung der einzelnen Windungen durch
Wasserstoffbrückenbindungen erfolgt, oder eine antiparallele Faltung zweier Ketten
zueinander (ß-Faltblattstruktur). Die räumliche Anordnung wird auch Sekundärstruktur
genannt. Eine Ausnahme sind Prolin und Hydroxyprolin, die als sekundäre, cyclische Amine
nicht in diese Struktur passen und dadurch einen Knick in der Spirale bewirken. Die
funktionellen Gruppen in den Resten (R) können zusätzlich noch Querverbindungen zwischen
verschiedenen Teilen der Peptidkette bewirken. Das erfolgt sowohl durch salzartige und
Wasserstoffbrückenbindungen als auch durch die kovalenten Disulfidbindungen (-S-S-) des
Cystins zwischen Cysteinresten an verschiedenen Stellen des Moleküls. Weiterhin spielen
van-der-Waals-Kräfte eine Rolle. Das ergibt eine bestimmte Konformation (Anordnung) des
gesamten Moleküls im Raum, die Tertiärstruktur, wobei auch mehrere verschiedene
Peptidketten durch -S-S-Brücken, wie z.B. beim Insulin, zusammengehalten werden können.
Mehrere Proteinmoleküle können sich weiterhin zu größeren Molekülverbänden
zusammenlagern (Quartärstruktur).
Die auf der Lösung von Nebenvalenzbindungen beruhende Denaturierung kann reversibel
oder irreversibel sein . Durch Ausbildung neuer Nebenvalenzbindungen oder durch
Wechselwirkung mit dem Denaturierungsmittel werden neue Konformationen stabilisiert. Es
bilden sich metastabile Zustände, die nach Wiederherstellung der physiologischen
Bedingungen die Rückbildung der nativen Konformation gestatten (Renaturierung, verbunden
mit wiedererlangter biologischer Aktivität).
Hitzebehandlung führt im fortgeschrittenen Stadium meist zur Ausbildung einer ungeordneten
Struktur, d.h. zu einer irreversiblen Denaturierung. Der Übergang vom nativen,
energieärmeren Zustand in die denaturierte Form ist mit einem Ordnungsverlust und damit
mit einer Entropiezunahme verbunden. Allerdings erhöht sich der Ordnungszustand der
umgebenden Wassermoleküle durch Hydratisierung der freigesetzten hydrophoben
Seitenkettenfunktionen, so dass dieser Effekt überkompensiert wird.
Durch Zugabe von leicht löslichen Salzen erfolgt Fällung der Proteine (Aussalzung). Durch
die Ionen des Salzes werden den Proteinen die Wassermoleküle zu ihrer Hydratisierung
entzogen. Ebenso wirkt Aceton oder Ethanol. Diese Fällungen sind meistens reversibel, d.h.
die Proteine erhalten ihre Funktion beim Lösen in Wasser zurück.
Proteine besitzen genauso wie Aminosäuren einen isoelektrischen Punkt. Auch sie sind bei
diesem pH-Wert am wenigsten löslich.
Zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen kann man verschiedene
Methoden benutzen. Die Biuretreaktion beruht auf der Bildung eines violetten
Farbkomplexes, der zwischen dem Cu2+-Ion und der Peptidbindung in alkalischer Lösung
entsteht. Aminosäuren binden Cu2+-Ionen ohne Farbkomplex. Die Atomgruppierung des
Biurets selbst, H2N-CO-NH-CO-NH2, ist in Proteinen jedoch nicht vorhanden.
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Die Xanthoprotein-Reaktion ist ein Nachweis von aromatischen Aminosäuren, z.B. von
Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, mit Salpetersäure. Der aromatische Ring wird dabei
nitriert (elektrophile aromatische Substitution); die entstehenden Produkte haben eine gelbe
Farbe.
3. Proteine als Kolloide
Große Moleküle wie die Proteine (und auch andere hochmolekulare Stoffe wie z.B. Stärke)
geben keine echten Lösungen mehr. Die einzelnen Teilchen bewirken zwar noch keine
sichtbare Trübung, aber eine Opaleszenz gegen den dunklen Hintergrund. Die einzelnen
Makromoleküle werden dadurch in Lösung gehalten, dass die Teilchen durch Adsorption von
Ionen oder durch Dissoziation saurer oder basischer Gruppen elektrische Ladungen tragen
und sich gegenseitig abstoßen. Zusätzlich enthält ihre Oberfläche infolge hydrophilen
Charakters große Mengen locker gebundenen Wassers. Dies verhindert, dass die Teilchen
einander berühren und durch Aggregation zu immer größeren Komplexen schließlich
"ausflocken". Solche Lösungen nennt man Kolloide. Durch Umladung infolge Änderung des
pH-Wertes oder durch Entzug des Hydratwassers durch konzentrierte Lösungen
leichtlöslicher Salze, insbesondere solcher mit mehrwertigen Ionen, oder durch Aceton,
werden hydrophile Kolloide, wie schon oben beschrieben, ausgefällt. Da die Kolloidteilchen
hier die gleich großen Eiweißmoleküle sind, gehören die Proteine zu den monodispersen und
molekulardispersen Kolloiden. Polydisperse Kolloide, z.B. Metallhydroxide oder Kieselsäure,
bestehen aus verschieden großen Molekülen oder Molekülaggregaten. Eine frei bewegliche
kolloide Lösung heißt Sol, in ausgeflocktem Zustand spricht man von Gel-Zustand. Gele
können zu Gallerten erstarren.
4. Weitere Naturstoffe
4.1. Hämoglobin
Proteine sind oft mit anderen, nicht proteinischen Komponenten verbunden, die zur Erfüllung
ihrer spezifischen Aufgaben notwendig sind. Man spricht dann von Proteiden, der nicht
proteinische Anteil ist die prostetische Gruppe.
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Ein wichtiges Proteid ist das Hämoglobin, der Farbstoff der roten Blutkörperchen. Es
transportiert den Sauerstoff im Blut. Hämoglobin enthält vier Peptidketten (zwei α -Ketten
mit je 141 Aminosäureresten und zwei ß-Ketten mit je 146 Resten), wobei jede Kette mit
einer Häm-Gruppe komplexartig verbunden ist. Häm besteht aus einem Porphyrinskelett und
einem Eisen-(II)-ion. Das Häm geht durch Oxidation leicht in das Hämatin über, in dem das
Eisen in der Oxidationsstufe +3 vorliegt.
Um im Hämoglobin die Farbstoff- von der Eiweißkomponente abzutrennen, lässt man Blut in
heißen Eisessig, der mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung versetzt ist, einfließen. Hierbei
scheiden sich unter gleichzeitiger Oxidation des Häms braune Kristalle, mit bläulichem
Oberflächenglanz, die sogenannten Teichmann’schen Kristalle, ab, in denen das Chlorid des
Hämatins, das Hämin vorliegt. Dieser Versuch wird im Rahmen der Vorlesung vorgeführt.
Das Hämoglobin übt im Organismus die äußerst wichtige Funktion der Sauerstoffübertragung
aus. Dabei wird pro Eisenion ein Molekül Sauerstoff unter Bildung von Oxyhämoglobin
locker gebunden. Die roten Blutkörperchen nehmen den Sauerstoff in der Lunge auf und
transportieren ihn im Blutkreislauf zu den Geweben, in denen er zur Zellatmung verbraucht
wird. An Stelle von Sauerstoff wird auch Kohlenmonoxid unter Bildung von
Kohlenoxidhämoglobin gebunden, das stabiler ist und 10.000 mal langsamer als das bei der
Atmung entstehende Oxyhämoglobin zerfällt. Dadurch wird die normale Funktion des
Hämoglobins als Sauerstoffüberträger ausgeschaltet, die Zellatmung unterbunden und der
Gesamtstoffwechsel gestört; bei längerem Einatmen von Kohlenmonoxid tritt der Tod ein
(Kohlenmonoxidvergiftung).
4.2. Chlorophyll
Der grüne Blattfarbstoff, das magnesiumhaltige Chlorophyll, findet sich gemeinsam mit den
roten und gelben Farbstoffen, den Carotinen und Xanthophyllen in den Chloroplasten der
Pflanzenzellen. Seine biochemische Funktion übt es bei der Photosynthese aus. In den
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Pflanzenzellen ist das Chlorophyll an Eiweiß gebunden, in Form eines lichtsensiblen, gegen
Sauerstoff und Kohlendioxid beständigen Chromoproteids. Das natürliche Chlorophyll
besteht aus zwei Komponenten, dem blaugrünen Chlorophyll a und dem in geringer Menge
als Begleiter auftretenden, gelbgrünen Chlorophyll b. Während im Blutfarbstoff das Eisen als
Zentralatom im Komplex fungiert, weisen die Chlorophylle je ein Atom Magnesium auf, das
ebenfalls komplex gebunden ist.
4.3. Coffein
Als Beispiel für die Extraktion einer Pflanze zur Isolierung eines Naturstoffes wird Ihnen der
Versuch zur Gewinnung von Coffein aus Tee vorgeführt. Das Coffein ist eine Purinbase und
leitet sich vom Xanthin ab. Es ist in den Kaffeebohnen (1 bis 1,5%) und im Tee (bis zu 5%)
enthalten. Coffein übt eine anregende und belebende Wirkung auf das Zentralnervensystem
und die Herztätigkeit aus und findet medizinische Verwendung.
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B. Aufgaben
1. Warum sind Aminosäuren im pH-Bereich ihres isoelektrischen Punktes am wenigsten
wasserlöslich?
2. Aminosäuren können aus den entsprechenden α -Halogencarbonsäuren durch
Umsetzung mit Ammoniak erhalten werden. Formulieren Sie die Umsetzung am
Beispiel von Valin.
3. Erklären Sie den ersten Schritt der Ninhydrin-Reaktion.
4. Was passiert bei der Umsetzung von Alanin mit Natriumnitrit im sauren Medium?
5. Warum gelingt die Pauly-Reaktion nicht bei Phenylalanin?
6. Suchen Sie alle erwähnten Aminosäuren heraus und stellen Sie für die entsprechenden
Nachweise die Reaktionsgleichungen auf.
7. Warum besitzen Proteine einen isoelektrischen Punkt?
8. Warum denaturieren Proteine bei der Veränderung des pH-Wertes?
9. Was bewirkt eine Temperaturerhöhung bei Proteinen? Versuchen Sie eine Erklärung
zu finden.
10. Suchen Sie im Vorlesungsskript Verbindungen, die mit Coffein verwandt sind.
Versuche
Versuch 1: Van Slyke-Reaktion
1 Spatelspitze Alanin, in 3 ml Wasser gelöst, wird mit 1 ml verd. Essigsäure und mit einer
Spatelspitze Natriumnitrit versetzt.
Versuch 2: Umsetzung einer Aminosäure mit Benzaldehyd
Eine Spatelspitze Glycin (oder Alanin) wird in 5 ml Wasser/Ethanol (1 : 1) gelöst. Prüfen Sie
den pH-Wert. Nun werden 0,5 ml Benzaldehyd zugesetzt und das Gemisch (keine klare
Lösung) wird 10 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt. Prüfen Sie nach dem Abkühlen
erneut den pH-Wert.
Versuch 3: Oxidation von Cystein
1 ml einer 1 %-igen wäßrigen Lösung von Cystein wird tropfenweise (!) mit ca. 2 ml IodKaliumiodid-Lösung versetzt.
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Versuch 4: Proteinfällung
a) Man gebe in 3 Reagenzgläser je 10 ml Eiweiß-Lösung und versetze das erste mit 1 ml 0,1
N Salzsäure, das zweite mit 1 ml Puffer-Lösung pH 4,7 (Acetatpuffer) und das dritte mit 1 ml
0,1 N Natronlauge, schüttele um und verteile die Lösungen auf jeweils 2 Reagenzgläser. Zu
dem ersten Satz von 3 Reagenzgläsern mit je etwa 5 ml Lösung werden jeweils 5 ml Ethanol
gegeben und umgeschüttelt. Was wird beobachtet?
b) Denaturierung, Ausflockung und Koagulation: Die anderen 3 Gläser (Satz 2) werden in ein
Becherglas gestellt, das 100 ml Wasser enthält und 10 Minuten erhitzt. Nach dem Abkühlen
auf Raumtemperatur wird das Ergebnis beurteilt. Zu den Reagenzgläsern Nr. 1 und 3 werden
nun je 5 ml der Puffer-Lösung gegeben. Erklären Sie die Niederschläge in den
Reagenzgläsern! Aus jedem Reagenzglas dieser Reihe werden 3 ml abgefüllt und mit
überschüssiger 0,1 N Salzsäure versetzt. Was wird beobachtet?
c) 3 ml der Eiweiß-Lösung werden mit Aceton versetzt, bis eine Fällung beobachtet wird.
Versuch 5: Fällung von Proteinen durch Denaturierung
3 ml einer Eiweiß-Lösung werden tropfenweise a) mit 1 ml 20%-iger Perchlorsäure
(Vorsicht!) und b) mit 1 ml 10 %-iger Trichloressigsäure versetzt.
Anmerkung: Salzsäure und Schwefelsäure fällen nicht oder nicht vollständig, wegen Bildung
löslicher Komplexe.
Versuch 6: Aussalzen von Proteinen
In ca. 2 ml Eiweiß-Lösung wird festes Ammoniumsulfat bis zur Sättigung eingetragen, d.h.
bis nach längerem Schütteln noch ungelöste Salzkristalle am Boden des Reagenzglases
bleiben. Was passiert beim Verdünnen mit Wasser?
Versuch 7: Biuretreaktion
Ca. 2 ml einer Eiweiß-Lösung werden mit Natronlauge alkalisch gemacht und mit einer
Kappenpipette mit 3 Tropfen verd. Kupfersulfat-Lösung versetzt. Überschuss an Kupfersulfat
ist sorgfältig zu vermeiden, da hierbei entweder eine unspezifische Blaufärbung oder gar ein
Niederschlag an Kupferhydroxid entsteht.
Versuch 8: Xanthoproteinreaktion
2 bis 3 ml Eiweiß-Lösung werden mit ca. 1 ml verd. Salpetersäure erhitzt. 0,5 bis 1 ml des
Gemisches werden in ein neues Reagenzglas abgegossen und mit Ammoniak alkalisch
gemacht.
Versuch 9: Pauly-Reaktion
Man stellt sich diazotierte Sulfanilsäure durch Vermischen von 3 ml HCl-haltiger
Sulfanilsäure (=Diazoreagenz I) und 3 Tropfen 0,5%-iger Natriumnitrit-Lösung
(=Diazoreagenz II) her.
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0,5 ml einer 1:10 verdünnten Tyrosin-Lösung werden mit Soda-Lösung bis zur alkalischen
Reaktion und dann mit 0,5 ml der Diazomischung versetzt.
Versuch 11: Extraktion von grünen Blättern
Es sollen Chlorophyll a und b, Xanthophyll sowie Carotin nachgewiesen werden. Dazu wird
ein Aceton-Extrakt frischer Blätter verwendet. Die Trennung erfolgt an Kieselgelplatten mit
n-Hexan/Essigester (3:1) als Laufmittel.