Untersuchungen zur Expression und Regulation von murinem
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Untersuchungen zur Expression und Regulation von murinem Bactericidal/ Permeability Increasing Protein (BPI) Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Melanie Eckert aus Fürth Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg. Tag der mündlichen Prüfung: 30.07.2007 Vorsitzender der Prüfungskommission: Erstberichterstatter: Zweitberichterstatter: Prof. Dr. E. Bänsch Prof. Dr. T. Winkler Prof. Dr. Dr. A. Gessner INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis I) Zusammenfassung 1 II) Summary 3 III) Einleitung 5 1) Rezeptoren der angeborenen Immunität 5 2) Signaltransduktion an TLRs 6 3) TLR4, der LPS- Rezeptor-Komplex 8 4) Lipopolysaccharid als Auslöser einer starken Immunantwort 9 5) LPS-neutralisierende Proteine 10 6) Die BPI-Familie 11 6.1) LPS-binding protein (LBP) 11 6.2) Humanes Bactericidal/ Permeability Increasing Protein (huBPI) 11 7) BPI-verwandte Proteine 13 8) Fragestellungen 13 IV) Material und Methoden 15 A) Materialien 15 1) Chemikalien 15 2) Hilfsmittel 16 3.) Kommerzielle Systeme 17 4) Stimulantien und Inhibitoren 17 4.1) Stimulantien 17 4.2) Inhibitoren 17 5) Enzyme 18 6) Antikörper 18 7) Plasmide 18 8) Oligonukleotide 19 B) Medien, Puffer und Lösungen 20 1) Nährmedien für Bakterien 20 2) Nährmedien für die Zellkultur 20 INHALTSVERZEICHNIS 3) Sonstige Puffer und Lösungen C) Zelllinien und Bakterien 1) Zelllinien 21 21 21 1.1) Kommerzielle Zelllinien 21 1.2) Generierte Zelllinien 21 2) Bakterien 22 D) Mausstämme 22 E) Methoden 23 1) Zellkultur 23 2) Primäre Zellen 23 2.1.1) Isolieren von peritonealen Exsudatzellen (PECs) 23 2.1.2) Generierung Dendritischer Zellen aus dem Knochenmark (BMDCs) 2.1.2.1) Durchflußzytometrie 23 24 3) Entnahme von Organen 25 4) Herstellung von cDNA 25 4.1) Isolierung von Gesamt-RNA 25 4.2) Verdau der DNA 25 4.3) Synthese der komplementären cDNA (RT-PCR) 25 5) Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 26 5.1) Qualitative PCR 26 5.2) Quantitative PCR 27 6) Klonierung von DNA 28 7) DNA-Aufreinigung 28 7.1) Elution von DNA aus Agarosegelen 28 7.2) Aufreinigung von PCR-Produkten 29 8) Ligation von DNA-Fragmenten in Vektoren 29 9) Herstellung und Transformation chemisch kompetenter Bakterien 29 9.1) Herstellung kompetenter Bakterien 29 9.2) Transformation kompetenter Bakterien mit Plasmid-DNA 30 9.3) PCR-Screening der Kolonien 30 10) Isolierung von Plasmid-DNA 31 INHALTSVERZEICHNIS 11) Sequenzieren von DNA 31 12) Transfektion von Säugerzellen 31 12.1) Transiente Transfektion 32 12.2) Stabile Transfektion 32 13) Luciferase-Reporter Assay 32 14) Proteinanalysen 33 14.1) Immunpräzipitation aus Überständen transfizierter Zellen 33 14.2) Proteinlysate aus Zellen 34 14.3) Quantifizieren von Proteinen 34 14.4) SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) 35 14.5) Immunoblot 35 15) Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) 37 16) Nachweis der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthetase (iNOS-Assay) 37 17) Gentamycin-Schutz-Test 37 18) Konfokale Lasermikroskopie 38 19) Viabiltätstest von Zellen (MTT-Test) 39 V) Ergebnisse 40 A) Vorarbeiten 40 B) Tanskriptionsanalysen 41 1) Murines BPI wird bereits in ruhenden murinen Granulozyten 41 exprimiert 2) Transkriptionelle Regulation 42 2.1) Murines BPI wird in Granulozyten durch verschiedene TLR-Liganden transkriptionell reguliert 42 2.2) Optimierung der Stimulationsbedingungen 44 2.3) Auch Dendritische Zellen exprimieren und regulieren 46 murines BPI 2.4) Intraperitoneale Gabe von LPS führt zu einer systemischen Induktion der BPI-Expression in Mäusen 49 3) Verantwortliche Rezeptoren und Signalmoleküle für die LPS-induzierte transkriptionelle Aktivierung von murinem BPI 3.1) Abhängigkeit von TLR4 50 50 INHALTSVERZEICHNIS 3.2) Adaptermoleküle im TLR4-Signalweg 51 3.3) Analysen der Signalwege durch Einsatz spezifischer Inhibitoren 53 3.3.1) NF-κB spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von BPI 53 3.3.2) MAP-Kinasen haben einen regulierenden Einfluss auf die Transkription von BPI 55 3.4) Proteinneusynthese ist notwendig für die Hochregulation von BPI nach LPS-Stimulation 58 3.5) Enbrel, ein löslicher TNF-Rezeptor, blockiert die Induktion von BPI 4) Bakterien regulieren BPI 4.1) UV-inaktivierte, gramnegative Bakterien induzieren BPI 59 61 62 4.2) Auch grampositive, nicht UV-inaktivierte Bakterien können die BPI-Transkription aktivieren C) Funktionsanalysen 63 66 1) Verschiedene Expressionskonstrukte von muBPI 66 2) LPS -Neutralisierende Wirkung von muBPI 67 2.1) Transiente Transfektionen von 293T-Zellen 67 2.2) Murines BPI neutralisiert LPS dosisabhängig 68 2.3) Die neutralisierende Wirkung von BPI auf LPS kann aufgehoben werden 70 2.4) Murines BPI neutralisiert LPS genauso effektiv wie humanes BPI 71 2.5) Vor allem extrazelluläres BPI neutralisiert LPS 73 2.6) Murines BPI inhibiert selektiv die Aktivierung von NF-κB 75 3) Murines BPI inhibiert das intrazelluläre Wachstum von Salmonella typhimurium 76 4) Die Hemmung des intrazellulären Wachstums könnte auf eine direkte Interaktion zwischen BPI und Salmonella typhimurium zurückzuführen sein 78 INHALTSVERZEICHNIS VI) Diskussion 79 1) BPI wird in Mäusen exprimiert und vor allem über die LPS–vermittelte TLR4-Aktivierung induziert 80 2) Die LPS-vermittelte Aktivierung der BPI-Transkription verläuft über den TRIF-abhängigen Signalweg von TLR4 82 3) Ein de novo synthetisiertes Protein ist in die Aktivierung der BPI-Transkription nach LPS-Stimulation involviert 84 4) Sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterienspezies können eine BPI-Induktion auf transkriptioneller Ebene vermitteln 84 5) BPI wirkt antibakteriell und LPS-neutralisierend 85 VII) Abkürzungsverzeichnis 87 VIII) Literaturverzeichnis 89 Danksagung 100 Lebenslauf 101 ZUSAMMENFASSUNG I) Zusammenfassung LPS-bindende Proteine repräsentieren eine wichtige Säule bei der Bekämpfung von gramnegativen Bakterien durch das angeborene Immunsystem. Zum einen liefern sie einen wichtigen Beitrag bei der hochsensitiven Erkennung gramnegativer Bakterien, zum anderen können sie durch die Neutralisation von LPS die Ausbildung eines septischen Schocks durch eine überschießende Immunantwort verhindern. Humanes Bactericidal/ Permeability Increasing Protein (BPI) ist als LPS-bindendes Protein beschrieben. Es zeigt sich, dass humanes BPI LPS neutralisiert und direkt antibakteriell gegen gramnegative Bakterien wirksam ist. Bisher galten Mäuse für ein Homolog von humanem BPI als natürlich defizient. In dieser Arbeit waren wir jedoch in der Lage, ein murines Homolog für das humane BPI zu identifizieren und initial zu charakterisieren. Murines BPI wird konstitutiv in den lymphoiden Organen und Geweben sowie im Hoden exprimiert. Analysen verschiedener Zelltypen des hämatopoetischen Systems zeigten, dass 24 Stunden nach Stimulation mit verschiedenen TLRLiganden eine starke Induktion der BPI-Transkription sowohl in Granulozyten als auch in BMDCs ausgelöst wurde. Als stärkster Induktor für eine Transkription von BPI stellte sich LPS heraus. Genauere Analysen der verwendeten Signalmoleküle identifizierten einen völlig von TLR4 und dem Adaptermolekül TRIF abhängigen Signalweg, der für die Regulation der BPI-Transkription nach LPS-Stimulation aktiviert wird. Außerdem stellte sich heraus, dass ein de novo gebildetes Protein in die, zur Hochregulation der BPImRNA benötigte, Signaltransduktion involviert ist. Als mögliche Kandidaten für dieses Protein kommen TNF und Lymphotoxin-α (LT-α) in Frage, denn mit einem löslichen TNF-Rezeptor II (Enbrel) behandelte, LPS-stimulierte Granulozyten aus Wildtyp-Mäusen waren nicht mehr in der Lage, die Induktion der BPI-Transkription zu vermitteln. In Bezug auf Ausprägung und Kinetik der BPI-Induktion zeigten Granulozyten TNF-defizienter Mäuse nach LPS-Stimulation den gleichen Phänotyp wie Wildtyp-Mäuse. Da Enbrel sowohl TNF als auch LT-α neutralisiert, lassen diese -1- ZUSAMMENFASSUNG Ergebnisse den Schluss zu, dass LT-α die BPI-Transkription nach LPS-Stimulation kontrolliert. Dieser neue Signalweg ist für TLR4 bis jetzt noch nicht beschrieben. Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Transkription von BPI bereits von isolierten TLR-Liganden induziert wird, stellte sich die Frage, inwieweit bakterielle Pathogene die Transkription von BPI beeinflussen. Die Analyse von Granulozyten, die mit verschiedenen, sowohl gramnegativen als auch grampositiven, Bakterien stimuliert wurden, zeigte, dass vor allem gramnegative Bakterien die Hochregulation der BPI-mRNA vermitteln konnten. In funktionalen Studien konnte eine LPS-neutralisierende Wirkung von BPI gezeigt werden. Experimente mit proliferierenden Bakterien ergaben außerdem, dass BPI eine Replikation intrazelullärer Bakterien wie Salmonella inhibieren bzw. zumindest stark verlangsamen kann. Die Ursache hierfür könnte in einer direkten Interaktion zwischen dem BPI-Protein und den intrazellulären Bakterien liegen, was durch eine Kolokalisation von BPI mit den Salmonellen gezeigt wurde. Murines BPI wird in Granulozyten und BMDCs exprimiert und über einen LPSaktivierten TLR4- und TRIF-abhängigen Signalweg reguliert. Durch die Expression und die Regulation von BPI wird das angeborene Immunsystem in die Lage versetzt, LPS zu neutralisieren und aktiv gegen gramnegative Bakterien vorzugehen. Dadurch sind TLRs in der Lage, Effektorproteine des angeborenen Immunsystems zu kontrollieren. Dies stellt neben der bereits gut dokumentierten Kontrolle des adaptiven Immunsystems eine zweite wichtige Kontrollebene der TLRs bei der Aktivierung einer gezielten und kompetenten Immunantwort dar. -2- SUMMARY II) Summary LPS-binding proteins represent an important part in the combat of gram negative bacteria by the innate immune system. On the one hand they contribute to the highly sensitive recognition of gram negative bacteria, on the other hand by neutralizing LPS they prevent the development of a septic shock, due to overwhelming activity of the immune responses. Human Bactericidal/ Permeability Increasing Protein (BPI) has been described as a LPS-binding protein. BPI displays LPS-neutralizing effects as well as direct antibacterial properties against gram negative bacteria. Until now, mice were considered to be naturally deficient of a homologue of human BPI. During this work however, we were able to identify and characterize a murine homologue of the human BPIprotein. Murine BPI is constitutively expressed in lymphoid organs and tissues as well as in the testis. The analysis of different hematopoetic cell types 24 hours after stimulation with various TLR-ligands showed a strong induction of the BPItranscription in granulocytes as well as in BMDCs. Among the different TLR-ligands LPS was the most potent inducer of the BPI-transcription. A more detailed analysis of the signaling molecules involved in the regulation of the LPS-induced BPI-transcription identified a signaling pathway completely dependent on TLR4 and the adaptor TRIF. Furthermore, it turned out that a de novo synthesized protein is required for the signal transduction responsible for the up regulation of BPI-mRNA. Since wild typederived granulocytes treated with a soluble form of TNF-receptor II (Enbrel) prior to LPS-stimulation were no longer able to activate the expression of BPI-mRNA, TNF and Lymphotoxin-α (LT-α) might be candidates for the newly synthesized protein. Granulocytes derived from TNF-deficient mice exhibited the same phenotype as wild type-derived granulocytes regarding the BPI-induction after LPS-stimulation. Given the fact that Enbrel neutralizes TNF as well as LT-α, those results lead to -3- SUMMARY the conclusion that LT-α controls the BPI-transcription after LPS-stimulation. This new signaling pathway for TLR4 has not yet been described. After it was shown, that the transcription of BPI is already induced by isolated TLRligands, we would like to address the question whether or not bacterial pathogens can influence the transcription of BPI. The analysis of granulocytes stimulated with various, gram negative as well as gram positive, bacteria showed, that particularly gram negative bacteria induce an up regulation of BPI-mRNA. Functional studies of murine BPI revealed LPS-neutralizing properties of the protein. Moreover, experiments with proliferating bacteria showed that the replication of intracellular bacteria is blocked or at least strongly inhibited by murine BPI. This might be due to a direct interaction between the murine BPI-protein and the intracellular bacteria, as demonstrated by the co-localization of BPI with Salmonella. Murine BPI is expressed in granulocytes and BMDCs and regulated via a LPSactivated TLR4- and TRIF-dependent signaling pathway. By expressing and regulating BPI, the innate immune system is able to neutralize LPS and actively fight gram negative bacteria. Thereby TLRs control effector proteins of the innate immune system. Aside from the already well documented control of the adaptive immunity, this constitutes a second important level of controlling the activation of a pointed and competent immune response by TLRs. -4- EINLEITUNG II) EINLEITUNG Mikroorganismen sind eine dauernde Gefahr für alle mehrzelligen Lebewesen. Deshalb bildeten sich im Laufe der Evolution immunologische Abwehrmechanismen heraus, die in der Lage sind, auch ohne vorherigen Kontakt potentielle Pathogene zu erkennen. Diese Erkennung wird durch eine klare Unterscheidung zwischen „Selbst“ und „Nicht-Selbst“ getroffen, was in einer effektiven und sofortigen Immunabwehr des Wirtes mündet (Aderem et al., 2000). Dabei werden die Pathogene von bereits in der Keimbahn-konfigurierten Rezeptoren aufgrund allgemeiner, unveränderlicher molekularer Muster erkannt, welche ausschließlich bei Mikroorganismen auftreten (Akira et al., 2001). Die initiale Erkennung von Pathogenen ist eine Hauptaufgabe des angeborenen Immunsystems und wurde im Lauf der Phylogenese in allen Mitgliedern des Tierreichs erhalten. Während einer Immunantwort sekretieren Zellen des angeborenen Immunsystems, wie zum Beispiel Granulozyten, ein Repertoire antimikrobieller Stoffe, die eine erste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene bilden (Selsted and Ouellette, 2005). Zusätzlich zur angeborenen Immunität entwickelte sich in den frühen Wirbeltieren, also mit Auftreten der Knorpelfische, das sehr anpassungsfähige adaptive Immunsystem. (Immunglobuline Durch und ein großes T-Zell Repertoire Rezeptoren), wirtsspezifischer die in sich Rezeptoren re-arrangierenden Gensegmenten kodiert sind, ist dieser Zweig des Immunsystems in der Lage, hochspezifische Strukturen verschiedenster Pathogene und fehlerhafte Wirtsproteine zu erkennen. Inzwischen ist bekannt, dass durch das Aktivieren des angeborenen Immunsystems nicht nur die Freisetzung antimikrobieller Proteine induziert wird, sondern auch die adaptive Immunantwort kontrolliert und reguliert werden kann (Fearon et al., 1996 & Schnare et al., 2001 & Akira et al., 2001). 1) Rezeptoren der angeborenen Immunität Die Erkennung von Pathogenen durch die angeborene Immunität wird durch mustererkennende Rezeptoren (Pattern-Recognition Receptors, PRRs) geleistet. -5- EINLEITUNG Diese erkennen hochkonservierte mikrobielle Strukturen, die nicht vom Wirt selbst exprimiert werden (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs) (Janeway, 1989 & Janeway and Medzhitov, 1998 & Akira et al., 2001). Unter den bis jetzt erforschten Rezeptoren, die solche Muster erkennen, gehört die Familie der Toll-Like Rezeptoren (TLRs) mit zu den am besten untersuchten. Die Familie der in Säugetieren vertretenen TLRs umfasst derzeit 13 Mitglieder (10 humane und 12 murine), die sowohl in vivo als auch in vitro mit der Erkennung verschiedenster PAMPs in Verbindung gebracht werden (Tabeta et al., 2004 & Akira et al., 2001 & Qureshi and Medzhitov, 2003 & Beutler, 2004). Evolutionär gesehen, sind TLRs die Säugetierhomologen der in Insekten gefundenen Toll-Rezeptoren, deren Struktur und immunologische Funktion über die Evolution hin zwischen Insekten und Säugern konserviert wurden (Medzhitov, Preston-Hurlburt and Janeway, 1997 & Anderson, 2000). Toll-Rezeptoren wurden erstmals in Drosphila identifiziert, wo man ihnen zunächst eine Rolle in der dorsoventralen Ausrichtung des Embryos während der Entwicklung zuschrieb (Anderson, Bokla and Nüsslein-Vollhardt, 1985). Deren zentrale Rolle in der Immunantwort gegen Pilzinfektionen wurde erst später erkannt: 1996 wurde gezeigt, dass die Induktion des fungiziden Drosophila-Proteins Drosomycin bei einer Infektion durch Aspergillen von einem funktionalen Toll-Rezeptor und Komponenten des embryonalen Toll-Signalweges abhängig ist (Lemaitre et al., 1996). 1998 wurden fünf den Drosophila-Toll-Rezeptoren strukturell homologe Proteine im Menschen gefunden, die TLRs 1-5 (Rock et al., 1998). In folgenden Studien konnte der TLR4 als Rezeptor für das in der Zellwand gramnegativer Bakterien enthaltene Lipopolysaccharid (LPS) identifiziert werden und dessen Rolle als Auslöser einer Immunantwort gegen gramnegative Bakterien charakterisiert werden (Poltorak et al., 1998 & Qureshi et al., 1999). 2) Signaltransduktion an TLRs Die Aktivierung von TLRs durch ihre Liganden TLRs sind Typ I transmembrane Proteine, deren zytoplasmatische Region homolog zum Typ I Interleukin-1 Rezeptor (IL-1R) ist und deshalb als Toll-Interleukin1-6- EINLEITUNG Receptor Homology (TIR) Domäne bezeichnet wird (O’Neill and Dinarello, 2000). Diese molekulare Verwandtschaft führt dazu, dass TLRs und der IL-1R die gleichen intrazellulären Proteine für ihre Signaltransduktion benutzen: Den Myeolid Differentiation Factor 88 (MyD88), die Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase (IRAK) und den Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Factor 6 (TRAF6) (Wesche, 1997 & Cao, 1996). Studien mit gendefizienten Mäusen zeigten, dass auch die Signaltransduktion durch TLR4 von MyD88, IRAK und TRAF 6 abhängig ist, um Zellen zu aktivieren (Kawai et al., 1999 & Suzuki et al., 2002 & Lomaga et al., 1999). Extrazellulär unterscheiden sich die beiden Rezeptortypen in ihrem molekularen Aufbau. Während die extrazellulären Anteile der TLRs aus Leucin-reichen, repetitiven (LRRs) Segmenten bestehen, ist der IL-1R aus drei Immunglobulinähnlichen Domänen aufgebaut (Figur 1). Ig-Domänen LRRs TIR-Domäne IL-1R TLR Figur 1: Aufbau von TLRs und IL-1R TLRs und IL-1R haben eine konservierte zytoplasmatische TIR-Domäne. Die extrazelullären Rezeptoranteile hingegen weisen starke Unterschiede auf: TLRs bestehen aus tandemartig angeordneten, repetitiven Leucin-reichen Segmenten, während der IL-1R drei Immunglobulinähnliche (Ig-like) Domänen besitzt. Von fast allen TLRs (außer TLR3) ist bekannt, dass sie MyD88, ein zytoplasmatisches Adapterprotein mit N-terminaler Death Domain und C-terminaler TIR-Domäne, zur Signalweiterleitung nutzen. MyD88 wird an die TIR Domäne des aktivierten TLRs rekrutiert und löst über homophile Interaktion eine Signalkaskade aus, welche neben der Aktivierung des Nuclear Transcription Factor κB (NF-κB) -7- EINLEITUNG und dessen Translokation in den Nukleus auch zur Aktivierung von Mitogenaktivierten Protein (MAP) Kinasen führt (Muzio et al., 1998). Analysen MyD88-defizienter Mäuse zeigten jedoch, dass vor allem für TLR3 und 4, aber auch für TLR2, alternative Signalwege existieren müssen (McGattrick und O’Neill, 2004 & Fitzgerald et al., 2003 & Kawai et al., 2001). 3) TLR4, der LPS- Rezeptor-Komplex Der TLR4 war der erste in Säugetieren identifizierte Vertreter aus der Familie der TLRs. Die Annahme, dass TLR4 bei der LPS-Erkennung ein Rolle spielen könnte, bestätigte sich durch die Analyse zweier Mausstämme, die nicht auf LPS reagieren (C3H/HeJ und C57BL/10ScCr- Mäuse). In beiden Mausstämmen konnten Defekte im TLR4-Gen gefunden werden (Poltorak et al., 1998 & Qureshi et al., 1999). Später zeigte sich, dass TLR4 nicht alleine für die LPS-Erkennung verantwortlich ist, sondern zusammen mit MD-2 und CD14 einen Rezeptorkomplex bilden muss (Miyake, 2003 & DaSilva et al., 2001). CD14 ist ein LPS-bindendes Molekül, dass die Responsivität gegen LPS drastisch erhöht und entweder als GlycosylPhosphatidyl-Inositol (GPI)-verankertes Protein auf der Zelloberfläche exprimiert wird oder als lösliches Protein sekretiert wird (Wright et al., 1990). CD14 besitzt keine eigene Signaldomäne, sondern agiert mit TLR4 als Ko-Rezeptor, indem es LPS bindet und dem TLR4 präsentiert, der daraufhin die Signalkaskade auslöst. MD-2, ein lösliches, chaperonartiges Protein, ist in die korrekte Verteilung von TLR4 involviert und ermöglicht die Oberflächenexpression von TLR4 (Miyake, 2002 & Shimazu et al., 1999). Zusätzlich zu dem von fast allen TLRs verwendeten Adaptermolekül MyD88 ist der TLR4-Rezeptorkomplex in der Lage, die LPS-vermittelten Signale auch unabhängig von MyD88 über andere Adaptoren zu leiten. Mehrere dieser alternativen Adaptoren in der TLR4-Signalkaskade sind bereits beschrieben, darunter das TIR Domain-Containing Adaptorprotein (TIRAP, auch Mal) und das TIR DomainContaining Adaptor-Inducinig IFN-β (TRIF, auch TICAM-1). Wird TIRAP/ Mal in der Signalweiterleitung sowohl von TLR4 als auch TLR2 benutzt, so ist TRIF/ TICAM-1 in die Signalkaskaden von TLR4 und TLR3 involviert (McGattrick and O’Neill, 2004 -8- EINLEITUNG & Horng et al., 2002 & Yamamoto et al., 2002 & Sato et al., 2003 & Yoshikazu et al., 2005). Erst vor kurzem konnte, durch die Analyse von Makrophagen TRIFdefizienter Mäuse, gezeigt werden, dass TRIF tatsächlich das für die Signaltransduktion verantwortliche Adaptermolekül im TLR4-abhängigen MyD88unabhängigen LPS-vermittelten Signalweg ist (Hirotani et al., 2004 & Yamamoto et al., 2003). 4) Lipopolysaccharid als Auslöser einer starken Immunantwort Als eines der ersten PAMPs wurde das Lipopolysaccharid (LPS), ein komplexes Glycolipid in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien, beschrieben. Bereits in geringen Mengen führt LPS zur Auslösung einer starken Immunantwort. Bei Infektionen mit gramnegativen Bakterien werden im Wirtsorganismus hohe Konzentrationen an LPS freigesetzt. Dies führt zu einer überschiessenden Entzündungsreaktion, die durch sehr hohe Mengen an systemischen, proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet ist. Durch die extrem stark ausgeprägte Immunreaktion kann es zu einem septischen Schock kommen, der sehr oft zu einem multiplen Organversagen und schließlich zum Tod führt (Beutler and Rietschel, 2003). Die immunstimulatorische Komponente von LPS ist der nach innen gerichtete Lipidanteil des LPS-Moleküls, das Lipid A (Figur 2) (Galanos et al., 1985). LPS bzw. Endotoxin ist als einer der stärksten Stimuli für das angeborene Immunsystem bekannt, was beispielsweise bei der Generierung von Antikörpern ausgenützt wird. In vivo-Studien haben gezeigt, dass die immunstimulatorischen Effekte von LPS durch die Aktivierung der TLRs vermittelt werden. Deshalb wurden isolierte Proteine und Antigene, gegen die Antikörper generiert werden sollten, mit LPS versetzt und dann in den gewünschten Wirt injiziert (z.B. Esel oder Hase). Das beigesetzte LPS wird in diesen Fällen als Adjuvans verwendet und aktiviert unter anderem Dendritische Zellen (DCs) und ihre Funktion als antigenpräsentierende Zellen (APCs). Dies wiederum führt zur Reifung der DCs, zur Induktion antigenspezifischer Immunreaktionen und zur Generierung spezifischer Antikörper (Akira -9- EINLEITUNG et al., 2001). Wegen der von LPS hervorgerufenen, starken Nebenwirkungen wurden inzwischen andere immunstimulatorischen Adjuvantien entwickelt. Figur 2: Aufbau von LPS Lipopolysaccharid (LPS), ein Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien, besteht aus einem nach außen ragenden Zuckeranteil und einem Lipidanteil, Lipid A, der das Glycolipid in der Membran verankert. Der Zuckeranteil ist der variabelste Teil von LPS und kann je nach Bakterienspezies sogar ganz fehlen. Der Polysaccharidanteil baut sich aus einem inneren, einem äußeren Kern und dem O-Antigen auf. Verantwortlich für die pathophysiologischen Eigenschaften von LPS ist das Lipid A. Dessen zwei Phosphatgruppen sowie die Anzahl, Länge und Verzweigung der Lipidketten bestimmen die Aktivität des Moleküls. 5) LPS-neutralisierende Proteine Um zum einen LPS als körperfremd zu erkennen und zum anderen LPS zu neutralisieren, gibt es in Menschen und Mäusen eine Anzahl verschiedener, löslicher, LPS-bindender Proteine, beispielsweise soluble CD14 (sCD14), LPSBinding Protein (LBP), Alkyl-Oxyalkyl-Hydrolase (AOAH), Secretory Leukocyte Protease Inhibitor (SLPI), Cathelicidin-Related Antimicrobial Peptide (CRAMP) und das humane Bactericidal/ Permeability Increasing Protein (BPI) (Tobias and - 10 - EINLEITUNG Ulevitch, 1993 & Munford, 1992 & Nakamura et al., 2003 & Wiese et al., 1997). Diese Proteine sind entweder in der Lage, die LPS-Erkennung durch Zellen zu verstärken oder dessen endotoxische Wirkung zu neutralisieren. 6) Die BPI-Familie Zur BPI-Familie gehören unter anderem zwei Proteine, die sehr potent LPS binden, nämlich das LBP und das BPI. Weitere Mitglieder dieser Familie sind das Phospholipid Transfer Protein (PLTP) und das Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP). Diese beiden letztgenannten Proteine sind, ähnlich wie LBP und BPI, in der Lage, Lipide zu binden und zu transferieren, spielen aber in der Immunabwehr vermutlich keine Rolle (Bruce et al., 1998). 6.1) LPS-Binding Protein (LBP) Das bisher wohl bekannteste und am besten untersuchte LPS-bindende Protein ist LBP. LBP hat eine starke Bindungsaffinität zu LPS und hat zwei verschiedene Funktionen (Tobias and Ulevitch, 1993). Einerseits transportiert es LPS aktiv zu seinen zellulären Rezeptoren CD14 und TLR4 und verstärkt so die immunstimulatorische Wirkung von LPS schon bei geringen Konzentrationen (Hailmann et al., 1994). Andererseits führt es zur einer Detoxifizierung von LPS durch Lipoproteine hoher Dichte (HDL): LBP führt das gebundene LPS den HDLs im Serum zu, die daraufhin ebenfalls an LPS binden und dieses inaktivieren (Ulevitch et al, 1979). 6.2) Humanes Bactericidal/ Permeability Increasing Protein (huBPI) Humanes BPI (huBPI) ist ein ca. 55 kDa großes Glycoprotein, welches ursprünglich aus den azurophilen Granula humaner Neutrophilen isoliert werden konnte (Levy, 2000). Außerdem kann huBPI auf der Zelloberfläche humaner, neutrophiler Granulozyten gefunden werden und, in geringerem Umfang, in Eosinophilen - 11 - EINLEITUNG (Lennartsson et al., 2003). Zusätzlich konnte die Expression von BPI in humanen Fibroblasten der Dermis und in mucosalen Geweben nachgewiesen werden (Reichel et al., 2003). Im Vergleich zu anderen LPS-bindenden Proteinen besitzt huBPI die höchste Affinität gegenüber LPS (Gazzano-Santoro, Parent, Grinna et al., 1992). Strukturelle Analysen von BPI zeigen eine zweigeteilte, symmetrisch-zylindrische Anordnung, die das Protein in zwei funktionelle Domänen unterteilt (Figur 3). Die durch eine hohe Anzahl basischer Aminosäuren kationische N-terminale Region des Proteins trägt die LPS-neutralisierende Funktion. Durch die Bindung mit hoher Affinität an LPS aus der Zellwand gramnegativer Bakterien neutralisiert BPI die LPS-vermittelten Entzündungsprozesse. Bindet BPI an Bakterien, resultiert daraus die Aktivierung endogener bakterieller Phospholipasen und die Hydrolyse von Phospholipiden. Dies führt zu einer erhöhten Permeabilität der äußeren Zellmembran, zur Einstellung der Zellteilung und letztendlich, durch Beschädigung der inneren Membran, zum Absterben der Bakterien (Wiese et al., 1997 & Marra et al., 1990). Die C-terminale Region des BPI-Proteins vermittelt die opsonisierende Funktion des Proteins und steigert so die Phagozytoserate der von BPI gebundenen gramnegativen Bakterien durch Makrophagen (Elsbach and Weiss, 1998). BPI weist also eine dreifache Wirkung in der Abwehr gramnegativer Bakterien auf. Figur 3: 3D-Struktur des humanen BPI-Proteins Die bildliche Darstellung stammt aus dem “Center for Bioinformatics & Computational Genomics” Computational Structural Biology http//:cbcg.lbl.gov/ssi-csb. - 12 - EINLEITUNG 7) BPI-verwandte Proteine Vor kurzem wurde eine ganze Familie BPI-ähnlicher Proteine identifiziert, deren Expression allerdings auf orale, nasopharyngeale und respriatorische Epithelien begrenzt ist. Eine genaue Funktion dieser Palate, Lung and Nasal Epithelial Clones (PLUNCs), RY-Proteine und BPI-like’s (BPILs) konnte allerdings noch nicht bestimmt werden, obwohl im Fall der PLUNC-Proteine bereits eine LPS-ProteinInteraktion gefunden wurde (Bingle et al., 2002 & Andrault et al., 2003 & Ghafouri et al., 2003). Auch konnten in der PLUNC-Familie bereits sieben verschiedene Proteine identifiziert werden, die sich zusätzlich in die beiden Untergruppen long (l) PLUNCs bzw. short (s) PLUNCs unterteilen lassen. In der Untergruppe der lPLUNCs lassen sich Ähnlichkeiten mit der C- und N-terminalen Region von sowohl BPI als auch LBP finden, wohingegen sPLUNCs nur mit der N-terminalen Region von BPI vergleichbar sind (Bingle and Craven, 2003). 8) Fragestellungen Bei Beginn dieser Arbeit vertrat man noch die Annahme, dass Mäuse natürlich defizient für ein Homolog des humanen BPIs sind. Die Durchführung einer computergestützten Suche nach einem murinen Homolog in der ENSEMBL Datenbank expressed des Sanger-Instituts sequence tags identifizierte (ESTs) die beiden komplementären ENSMUSESTT00000001492 und ENSMUSESTT00000001501 (Abb. 1). Ein Vergleich der erhaltenen murinen Sequenzinformation mit der humanen Sequenz durch die Software von Genetics Computer Group zeigt nur eine schwache Übereinstimmung. Die Konservierung zwischen dem humanen und dem murinen Protein auf Ebene der Aminosäurensequenz ist zu 53% identisch, die Basenpaarreihung ist zu 63% homolog. - 13 - EINLEITUNG Abb.1: Sequenzvergleich des murinen BPI-Proteins mit dem humanen Homolog Die N-terminale Sequenz des murinen BPIs wurde abgeglichen mit der homologen humanen BPISequenz. Die Sequenz des murinen BPIs ist hinterlegt unter www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank, Zugriffsnummer AY648037. Ziel dieser Doktorarbeit ist die Analyse der Expression, Regulation und Funktion des neu entdeckten murinen BPIs’. Dabei soll zuerst untersucht werden, welche Zellen des hämatopoetischen Systems BPI exprimieren. Anschließend soll analysiert werden, ob diese Expression induzierbar ist und wie sie reguliert wird. Vor allem soll geklärt werden, ob Rezeptoren der angeborenen Immunität, wie z.B. die Familie der Toll-Like Rezeptoren, in der Lage sind, die Expression von murinem BPI zu kontrollieren. Damit käme den TLRs eine weitere wichtige Funktion neben der Kontrolle der adaptiven Immunität während der Immunantwort zu. Neben diesen Studien zur Expression und Regulation von BPI sollen auch Untersuchungen zur Funktion des Proteins durchgeführt werden. Es soll analysiert werden, ob murines BPI die Fähigkeit zur Neutralisation von LPS oder eine direkte antibakterielle Wirkung aufweist. - 14 - MATERIAL UND METHODEN IV) MATERIAL UND METHODEN A) Materialien 1) Chemikalien Tabelle 1: Chemikalien und Lösungen Chemikalien und Lösungen Hersteller Aceton Merck Acrylamid Serva Agarose Biozym Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich Ampicillin CalBiochem Aprotinin Sigma-Aldrich Bromphenolblau Sigma-Aldrich BSA Roth Chloroform Merck Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich DTT (Dithiothreitol) Sigma-Aldrich Entellan® Rapid Mounting Medium for Merck Microscopy Essigsäure Merck Ethanol Roth Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Ethylendiamintetraacetat (EDTA) CalBiochem FCS (fötales Kälberserum) Sigma Fluroprep BioMerieux Geneticinsulfat G418 (Neomycin) Calbiochem Gentamycin Sigma-Aldrich Glycerin Roth Hygromycin B Invitrogen Igepal Sigma-Aldrich Isopropanol Merck Isopropyl-ß-thiogalactosid (IPTG) Sigma Leupeptin Sigma L-Glutamin Gibco Magermilchpulver Töpfer Methanol Roth Natriumacetat Merck Natriumazid NaN3 Sigma-Aldrich Natriumchlorid NaCl Sigma-Aldrich Natriumfluorid NaF Merck Natriumhydrogencarbonat (NaHCo3) Roth Natriumorthovanadat (Na3VO4) Sigma-Aldrich Penicillin/Streptomycin Gibco Pepstatin A Sigma-Aldrich Phenymethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich - 15 - MATERIAL UND METHODEN Protein-A/G Agarose Beads Salzsäure HCl Saponin SDS Natrium-dodecyl-sulfat Silbernitrat AgNO3 ß-Mercaptoethanol TEMED (N,N,N´,N´- Tetramethylethylendiamin) TMB (3,3,5,5-Tetramethylbenzidin) Tris Triton-X 100 TRIZOL Trypanblau Trypsin/ EDTA (1x) Tween 20 Ziegenserum Santa Cruz Merck Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Merck BectonDickinson Amresco Sigma-Aldrich Invitrogen Sigma-Aldrich Gibco Merck Dianova 2) Hilfsmittel Tabelle 2: Hilfsmittel Hilfsmittel 96er PCRplatten und Deckel f. iCycler ABI PRISM 310 Genetic Analyzer Brutschrank Cellscraper Deckgläser ELISA-Reader iCycler Konfokales Fluoreszenzmikroskop Kunststoffpetrischalen Küvetten Luminometer Microlite 1FB 96well plates „B“ Dynex Microplates Neubauer Kammer Objekträger mattiert DNA ThermoCycler PCR-Reaktionsgefäße Photometer PVDF-Transfer-Membran Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml Reaktionsgefäße 15 und 50ml Röntgenfilme Röntgenfilmkassette Sterilfilter (ZAP CAPs) Tischzentrifuge Zellkultur 6-,12-, 24- und 96-Well-Platten Zellkulturflaschen Hersteller PeqLab Perkin-Elmer ThermoLifescience Sarstedt Engelbrecht Dynatech Biorad Leica Nalgo Nunc Int. Eppendorf Packard Biosciences ThermoLifescience Labor Optics Engelbrecht MJ Research Biozym Eppendorf Pierce Eppendorf Falcon Kodak Amersham Schleicher und Schuell Eppendorf Greiner Greiner - 16 - MATERIAL UND METHODEN 3) Kommerzielle Systeme Tabell 3: Kits KIT Hersteller BCA-Proteinassay Pierce TM ECLplus Western Blotting Detection Amersham System ELISA-Systeme Becton Dickinson Luciferase-Assay System Promega PCRkit TaqCore Qbiogen pGEM-T easy Vector sytems Promega PureYield™ Plasmid Midiprep System Promega RQ1 RNase-Free DNase Promega TripleMaster PCR-Kit Eppendorf Wizard® Plus SV Minipreps Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up Promega System 4) Stimulantien und Inhibitoren 4.1) Stimulantien Tabelle 4: Stimulantien Reagenz Lipopolysaccharid Petidoglycan poly I:C Staph. aureus Biopartikel Unmethylierte CpG-DNA-Motive Zymosan A Hersteller Sigma Fluka Amersham Biosciences Sigma Sequenz und Quelle Oligonucleotide Sigma 4.2) Inhibitoren Tabelle 5: Inhibhitoren Reagenz Cyclohexamid MG-132 NF-κB SN-50 PD 98059 SB 203580, Hydrochloride Hersteller Sigma Biomol Biomol Biomol Calbiochem - 17 - siehe MATERIAL UND METHODEN 5) Enzyme Tabelle 6: Enzyme Enzym Alkalische Phosphatase M-MMLV Reverse Transkriptase Proteinase K Restriktionsendonukleasen T4 DNA Ligase Hersteller Fermentas Promega Fermentas Fermentas Fermentas 6) Antikörper Tabelle 7: Antikörper Antikörper Anti-Maus CD11c-PE Anti-Maus MHC II-FITC CY3-konjugierter AffiniPure Goat Anti-Human IgG (H+L) Donkey Anti-Human IgG Peroxidasekonjugiert Donkey Anti-Rabbit IgG Peroxidasekonjugiert Rabbit anti IκB-α Rabbit anti NF-κB p65 Rabbit anti p38 Map Kinase Verwendung Zellfärbung Zellfärbung Zellfärbung Westernblot Westernblot Westernblot Westernblot Westernblot Rabbit anti Phospho-p38 MAP Kinase Westernblot Rabbit Anti-ACTIVE MAPK pAB Rabbit Anti-Erk1/2 pAB Westernblot Westernblot Hersteller BectonDickinson BectonDickinson Dianova (Jackson ImmunoRes.) Dianova (Jackson ImmunoRes.) Dianova (Jackson ImmunoRes.) Santa Cruz Santa Cruz Cell Signaling Technology Cell Signaling Technology Promega Promega 7) Plasmide Tabelle 8: Plasmide Plasmid Verwendung Quelle/ Referenz pGEM-T easy Subklonierungen Promega/ Promega Notes IgκBPI-huIgG1/Fc Igκ-huIgG1/Fc Transfektion Klonierung von huIgG1/FcFusionskonstrukten, sezernierte Proteine Transfektion Transfektion Expressionsvektor/ Transfektion Transfektion mBPI-huIgG1/Fc pBXIIluc (NF-κB-Reporter) pcDNA3.1-Hygro phuCD14 - 18 - Invitrogen MATERIAL UND METHODEN phuIgG1/Fc phuMD-2 phuTLR4 Klonierung von huIgG1/FcFusionskonstrukten Transfektion Transfektion 8) Oligonukleotide Alle Primer wurden über Thermo Electron/ Ulm bezogen, in einer Konzentration von 40µM in ddH2O gelöst und bei – 20°C gelagert. Tabelle 9: Oligonukleotide Primername Nukleotidsequenz (5‘ – 3‘) PBGD-P1 atgtccggtaacggcggc PBGD-P2 HPRT-1F HPRT-2R MBPI-L1F MBPI-L2R muBPI-LC1 muBPI-LC2 MBPI-3F MBPI-6R MBPI-16F MBPI-18F MBPI-22F MBI-7R MBPI-15R MBPI-21R HuBPI-8F HuBPI-13R HuBPI-2F HuBPI-3R HuBPI-4R HuBPI-5R HuBPI-6F HuBPI-L5F muspCpG Verwendung Quantitative RT-PCR murin caaggctttcagcatcgccacca Quantitative RT-PCR murin gagggtaggctggcctattggct Qualitative RT-PCR murin gttggatacaggccagactttgttg Qualitative RT-PCR murin ggctcccctgacaaccacgaac Qualitative RT-PCR murin aggcacgggcgctgagatg Qualitative RT-PCR murin ggatccggttcagccacttcacg Quantitative RT-PCR murin gcacagggccccggtacacagat Quantitative RT-PCR murin gctggaattgaaggaatcca Sequenzierung gtagtcaaccgaggtcacatc Sequenzierung ctcaggatatcatccgaggccttgtggtttg Klonierung mit interner Signalsequenz gccctgctagcgctggccatcattggcacag Klonierung, ohne interne Signalsequenz ccctggatatctggccatgatctcccagaag Klonierung caccggccttgaggaagttc Klonierug cagcggaaatgcggatgctgg Klonierung gtaaatgcggccgcagcaacaggaaattctgg Sequenzierung cgccaaagcttccgccgtgacagcggccgtc Klonierung catttctcgagaacgtctgcaccgaacagc Klonierung tcccagttcccagataag Sequenzierung gtagttgtcacaggtgcacg Sequenzierung cgtcgggtggccggaatggaag Sequenzierung cgacgaggaccttgacttcgtg Sequenzierung ccttgaagctttggcagctctggaggatgag Sequenzierung gaggtcagcgccgagtcc Sequenzierung tccatgacgttcctgacgtt Stimulation murinem - 19 - MATERIAL UND METHODEN MYD88-F MYD88-R MYD88-Neo tggcatgcctccatcatagttaacc gtcagaaacaaccaccaccatgc atcgccttctatcgccttcttgacg TLR9 MyD88 KO-Screen MyD88 KO-Screen MyD88 KO-Screen B) Medien, Puffer und Lösungen Alle verwendeten Medien und Puffer wurden mit Milliporewasser (ddH2O) angesetzt. 1) Nährmedien für Bakterien Alle Nährmedien wurden bei 121°C für 20min autoklav iert. Luria-Broth-Medium (LB): Trypton Hefeextrakt NaCl Agar 10 g/l 5 g/l 10 g/l 20 g/l (für Platten) SOB-Medium: Trypton Hefeextrakt NaCl KCl MgCl2 MgSO4 20 g/l 5 g/l 10 mM 2,5 mM 10 mM 10 mM SOC-Medium: wie SOB-Medium + Glucose 20mM 2) Nährmedien für die Zellkultur Phospatgepufferte Salzlösung (PBS), pH 7,4 wurde als Pulver bei Biochrom bezogen, als 1xPBS in ddH2O gelöst und autoklaviert. Alle anderen Zellkulturzusätze wurden steril filtriert. Für alle Zellen wurde RPMI 1640 der Firma PAN mit folgenden Zusätzen verwendet: 13 mM NaHCO3, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer, 0,05 mM 2Mercaptoethanol, 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (Sigma) und Penicillin/ Streptomycin-Lösung der Firma Gibco. Dies entspricht kompletten RPMI-1640 Medium. - 20 - MATERIAL UND METHODEN 3) Sonstige Puffer und Lösungen Tris-Acetat-Puffer (TAE): Trisacetat 40 mM EDTA 1 mM pH 7,7 mit Eisessig Nukleinsäureladepuffer: 0,1% (w/v) Bromphenolblau 50% Glycerin 5% (w/v) 20x TAE Proteinauftragepuffer: 0,1% (w/v) Bromphenolblau 2% (w/v) SDS 50 mM β-Mercaptoethanol 50 mM TRIS HCL pH 6,8 10% (v/v) Glycerin C) Zelllinien und Bakterien 1) Zelllinien 1.1) Kommerzielle Zelllinien Tabelle 10: Kommerzielle Zelllinien Zelllinie Zelltyp Spezies CHO Ovarzelllinie Hamster HEK 293T embryonal, Nierenepithelzelle Monozyt/ Makrophagen Human RAW 264.7 Murin (BALB/c) Herkunft/ Referenz ATCC*/ Puck et al., 1958 ATCC*/ Graham et al., 1977 ATCC*/ Ralph et al., 1977 * ATCC: American Type Culture Collection 1.2) Generierte Zelllinien Tabelle 11: Generierte Zelllinien Zellinie HEK 293 IgκBPI-huIgG1/Fc HEK mBPI huIgG1/Fc RAW mBPI-huIgG1/FC RAWкB IgκBPI-huIgG1/Fc RAWкB mBPI-huIgG1/FC RAWκB Plasmid IgκBPI-huIgG1/Fc mBPI huIgG1/Fc mBPI huIgG1/Fc IgκBPI-huIgG1/Fc mBPI huIgG1/Fc pBXIIluc (NFκB-Reporter) - 21 - MATERIAL UND METHODEN 2) Bakterien Die verwendeten Bakterienstämme wurden aus der Stammsammlung der Diagnostik des Instituts für klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Friedrich-Alexander Universität bezogen. Alle Bakterien wurden über Nacht angezogen, 2x mal mit PBS gewaschen und anschließend die Zellzahl photometrisch (OD600) bestimmt. Für die Stimulationen wurden die Bakterien entweder durch 5-8min UV-Behandlung inaktiviert oder lebend eingesetzt. Bei Stimulationen mit lebenden Bakterien wurde RPMI-1640 Medium ohne Antibiotika verwendet. Tabelle 12: Bakterien Bakterien Salmonella typhimurium Escherichia coli Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Pseudomonas aeroguinosa Medium LB LB TSB TSB TSB Berechnung der Zellzahl OD 0,2 = 1,2x108 Bakt./ml OD 1,0 = 8,8x108 Bakt./ml OD1,0 = 2,4x108 Bakt./ml OD 1,0 = 5,5x108 Bakt./ml OD 0,1 = 0,1x108 Bakt./ml D) Mausstämme Tabelle 13: Mausstämme Stamm C3H/HeJ C3H/HeN C57BL/6 IFNAR -/MyD88 -/TLR 2 -/TLR2-/- 4 -/TNF-/TRIF -/- Quelle/ Referenz Charles River Charles River Charles River Kalinke U./ Barchet et al., 2002 Akira S./ Kawai et al., 1999 Akira S./ Takeda et al., 1998 Eigene Zucht Körner H./ Körner et al., 1997 Beutler B./ Hoebe et al., 2003 - 22 - MATERIAL UND METHODEN E) Methoden 1) Zellkultur Kultiviert wurden alle Zelllinien bei 37°C, 5% CO 2 und 95% Wasserdampfsättigung. Alle Zellen wurden in kompletten RPMI 1640 Medium gehalten. Zum Passagieren der Zellen wurden die HEK 293 Zellen durch wiederholtes pipettieren vom Gefäßboden abgespült und verdünnt ausgesät. RAW-Makrophagen wurden mit einem Cell-Scraper vorsichtig vom Boden des Kulturgefäßes gelöst und weiterpassagiert. 2) Primäre Zellen 2.1.1) Isolieren von peritonealen Exsudatzellen (PECs) Um PECs zu erhalten wurden Mäuse mit 2 ml einer 4% Thioglycollatlösung intraperitoneal (i.p.) gespritzt. Zur Gewinnung von Granulozyten wurden die Mäuse nach 16h Stunden, zur Gewinnung von Makrophagen nach 72 Stunden durch zervikale Dislokation bzw. in Äther getötet. Danach wurde die Bauchhöhle mit 8ml kompletten RPMI-1640 gespült und die Zellzahl bestimmt. Für die Versuche wurden die Zellen in einer Dichte von 5x106/ 2ml kompletten RPMI-1640 in die Vertiefung einer 6-Well-Platte ausgesät. 4% Thioglycollat: 4g/ 100ml 4-5x aufgekocht, autoklaviert. 2.1.2) Generierung Dendritischer Zellen aus dem Knochenmark (BMDCs) Ober- und Unterschenkelknochen der beiden Hinterläufe von Mäusen wurden entfernt, gesäubert und das Mark mit eiskaltem PBS herausgespült. Die so erhaltene Zellsuspension wurde über ein Zellsieb (CellStrainer der Firma - 23 - MATERIAL UND METHODEN BectonDickinson/ 70 µm) gegeben, um größere Verunreinigungen zu entfernen. Nach Abzentrifugieren der Zellen bei 1700rpm wurden diese mit komplettem RPMI1640, mit 3% GM-CSF-(Granulozyten und Makrophagen-koloniestimulierender Faktor) konditioniertem Medium resuspendiert und in einer Dichte von 3x106 Zellen und einem Endvolumen von 10ml in Petrischalen der Firma NUNC ausgesät. Nach 4 Tagen wurden die Zellen mit 10ml frischem RPMI-1640, mit 3% GM-CSFkonditioniertem, Komplettmedium gefüttert. Am Tag 7 wurden die Zellen geerntet und deren Zusammensetzung mittels Durchflußzytomtrie analysiert. Dazu wurden die Zellen mit Antikörpern gegen CD11c (Anti-Maus CD11c-PE) als DC-Marker und MHC Klasse II (Anti-Maus MHC-II-FITC) als Reifungsmarker gefärbt und im FACS untersucht. Zur Durchführung von Versuchen wurden die Zellen in die Vertiefung einer 6-WellPlatte in einer Dichte von 5x106/ 2ml in kompletten RPMI-1640 ausgesät. GM-CSF-konditioniertes Medium wurde aus Zellkulturüberständen von X63Ag8653-Zellen gewonnen, die mit der entsprechenden cDNA stabil transfiziert wurden (Karasuyama et al., 1988). Der gewonnene Überstand wurde steril filtriert und bei 4°C gelagert. 2.1.2.1) Durchflußzytometrie Als Vorbereitung für die FACS-Analyse wurden 1x105 Zellen/ Färbung 2x in PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen mit je 1µl Anti-Maus CD11c-PE, 1µl AntiMaus MHC II-FITC 1:10 in PBS verdünnt und 1µl Streptavidin-APC 30 Minuten auf Eis im Dunklen inkubiert. Danach wurden die Zellen zunächst zweimal in PBS/ 1%FCS gewaschen, ein drittes Waschen erfolgte nur mit PBS. Für die FACSAnalyse wurden die Zellen in 300µl PBS resuspendiert. Die Kontrollzellen ohne Antikörper wurden genauso behandelt. - 24 - MATERIAL UND METHODEN 3) Entnahme von Organen Zunächst wurden Mäuse mit 100µg LPS, gelöst in PBS, oder als Kontrolle nur mit PBS i.p. gespritzt. Zur Entnahme der Organe nach 6, 12 bzw. 24 Stunden wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation bzw. in Äther getötet. Danach wurden die Organe entnommen und direkt in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung bis zur Weiterverarbeitung erfolgte bei –70°C. 4) Herstellung von cDNA 4.1) Isolierung von Gesamt-RNA Die Gesamt-RNA wurde aus maximal 1x107 Zellen pro Ansatz über eine PhenolChloroform Extraktion mit TRIzol der Firma Invitrogen nach Anleitung gewonnen. Die Konzentration der gesamten RNA wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260nm bestimmt. Gelagert wurde die in DEPC-behandelten ddH2O gelöste RNA bei – 70°C. 4.2) Verdau der DNA Um eventuelle DNA–Verunreinigungen aus der isolierten RNA zu elimieren, wurde die gewonnene RNA einer DNase–Behandlung mit DNase I der Firma Promega unterzogen. Dabei wurde 1µg Gesamt-RNA in einem Gesamtvolumen von 10µl mit 1µl 10xDNase-Puffer und 1µl DNase I 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Ansatz mit 1µl Stopp-Lösung versetzt, um die DNase zu inaktivieren. 4.3) Synthese der komplementären cDNA (RT-PCR) Die Synthese der komplementären cDNA aus der mRNA erfolgte mit M-MLV Reverse Transkriptase der Firma Promega. Dazu wurde 1µg DNA-freie Gesamt- 25 - MATERIAL UND METHODEN RNA zunächst mit 1µl Oligo(dT) Primer 5 min bei 70°C hybridisiert und anschließend 5 min auf Eis inkubiert. Danach wurde der Ansatz mit 5µl 5xRT-Puffer und 0,3µl M-MLV Reverser Transkriptase und 1.5 µl dNTPs (10mM/ Qbiogene) in einem Endvolumen von 25 µl im DNA–Thermo-Cycler mit folgenden Parametern in cDNA umgeschrieben: Segment Zyklen Temperatur Zeit 1 1 40°C 10 min 2 1 48°C 50 min 3 1 70°C 15 min 4 1 4°C ∞ 5) Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Zur Amplifikation spezifischer cDNA wurde die PCR verwendet. 5.1) Qualitative PCR Die qualitative PCR wurde mit einem PCR-Kit der Firma Qbiogene und 1-2µl cDNA aus der reversen Transkription in einem Endvolumen von 25µl durchgeführt. Zur Amplifikation der cDNA wurde folgender Standardansatz verwendet: Reaktionsparameter: Segment Zyklen Temperatur Zeit 1 1 94°C 3 min 2 35 94°C 45 sec 56 - 60°C 45 sec 72°C 45 sec 3 1 72°C 10 min 4 1 4°C 1 min - 26 - MATERIAL UND METHODEN 2,5 µl 10xPCR-Puffer mit MgCl2 (2,5 mM) 1 µl dNTPs (10 mM) 0,2 µl 5´Primer (40 µM) 0,2 µl 3`Primer (40 µM) 0,25 µl Taq (0,5 Units) Zur Analyse der Amplifikate wurden 10 µl der PCR auf ein 1,5% Agarosegel aufgetragen. Bei dieser Methode ist allerdings nur eine qualitative Bewertung der Expressionsraten möglich. 5.2.) Quantitative PCR Um die mRNA-Expressionsraten auch quantitativ bestimmen zu können, wurde eine Echt-Zeit-PCR im iCycler der Firma Biorad durchgeführt. Das von uns verwendete PCR-System der Firma ABgene (ABsolute SYBRGreen Fluroescein) arbeitet mit der SYBRGreen-Methode. Der Fluoreszenzfarbstoff SYBRGreen interkaliert während der Amplifikation in die DNA. Nach jedem Amplifikationsschritt erfolgt eine Fluoreszenzmessung mittels eingebauter Kamera. Dadurch wird es möglich, eine quantitative Bestimmung der amplifizierten DNA vorzunehmen. Dabei wurde neben den zu analysierenden Proben jeweils ein Plasmid mit der Zielsequenz in einer 6 Logstufen umfassenden Verdünnungsreihe als interner Standard mitgeführt. Die relative Höhe der Expression von BPI-mRNA wurde nach Normalisierung auf das in einem zweiten Ansatz gemessenen konstitutiv exprimierten Bezugsgen Porphobillinogen Deaminase (PBGD) errechnet. Der 25 µl PCR Ansatz enthielt 12,5 µl 2x ABsolute SYBRGreen Fluroescein (ABgene), 10 µl Milliporewasser, je 1 µl der spezifischen Primer (10 µM) und 2 µl der 1:2 vorverdünnten cDNA bzw. des Standardplasmids. Dieser PCR-Ansatz wurde unter folgenden Bedingungen im iCycler der Firma Biorad inkubiert: - 27 - MATERIAL UND METHODEN Segment Zyklen Temperatur Zeit 1 1 94°C 3 min 2 50 94°C 15 sec 60°C 15 sec 72°C 15 sec 3 1 72°C 10 min 4 1 4°C 1 min Die Auswertung erfolgte mit dem iCycler Programm der Firma Biorad. 6) Klonierung von DNA Für eine Klonierung vorgesehene DNA-Fragmente wurden zunächst entweder mit dem TripleMaster PCR Kit und spezifischen Primern aus Gesamt-cDNA-Proben amplifiziert oder aus bereits vorhandenen Plasmiden mittels Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten. Die PCR bzw. die Restriktionen wurden danach präparativ über eine Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend aufgereingt. 7) DNA-Aufreinigung 7.1) Elution von DNA aus Agarosegelen Die für Klonierungen benötigten DNA-Fragmente wurden mit einem Skalpell bei möglichst kurzer UV-Bestrahlung und geringer Wellenlänge (360nm) aus dem Agarosegel (1%) ausgeschnitten und anschließend mit den Gel-Extraction Kit der Firma Promega aufgereinigt und in Wasser eluiert. - 28 - MATERIAL UND METHODEN 7.2) Aufreinigung von PCR-Produkten Zur Aufreinigung der PCR-Ansätze wurde der PCR-Aufreinigungskit der Firma Promega verwendet. Die DNA wurde in ddH2O eluiert und bei –20°C gelagert. 8) Ligation von DNA-Fragmenten in Vektoren Nach Aufreinigung der PCR-Produkte wurden diese entweder direkt in den T-tailed Vektor der Firma Promega eingebracht oder in einen Expressionsvektor ligiert. Bei der Verwendung des T-Tailed Vektors wird ausgenutzt, dass die Taq-Polymerase Poly A-Schwänze als Abschluss an das PCR-Fragment hängt und sich das PCRProdukt somit leicht in den mit T-Überhängen versehenen Vektor ligieren lässt. Für die Klonierung in Expressionsvektoren mussten Fragment und Vektor erst mit Restriktionsendonukleasen behandelt werden. Dazu wurden maximal 5µg DNA mit den Restriktionsendonukleasen und dem Puffer nach Herstellerangaben in einem Endvolumen von 50µl für 3-12 Stunden bei 37°C inkub iert. Anschließend erfolgte eine letzte Aufreinigung des Fragment und des Vektors. Das Insert wurde nochmals gelgereingt (Gel-Extraction Kit von Promega), der Vektor wurde mit dem PCRAufreinigungskit der Firma Promega behandelt. Zudem wurde der Vektor mit alkalischer Phosphatase inkubiert, um eine Religation des Vektorplasmids zu verhindern. Nach dieser letzten Aufreinigung wurde das benötigte Fragment-Vektor Verhältnis von ca. 5:1 im Präligationsgel ermittelt und anschliessend mit Hilfe von T4-Ligase in einem Endvolumen von 20µl bei Raumtemperatur (RT) eine Stunde lang ligiert. Alle verwendeten Plasmidvektoren besitzen ein Ampicillinresistenzkassette, um eine prokaryotische Selektion zu ermöglichen. 9) Herstellung und Transformation chemisch kompetenter Bakterien 9.1) Herstellung kompetenter Bakterien Um Bakterien aufnahmefähig für Plasmidvektoren zu machen, müssen diese erst kompetent gemacht werden. Dazu wurden Escherichia coli des Stammes DH10ß - 29 - MATERIAL UND METHODEN chemisch behandelt: Eine Bakterienkultur wurde in 100ml LB-Medium bis zu einer optischen Dichte von 0,48 (OD600=0,48) angezogen und anschließend 15 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Bakterien bei 4300rpm 10 min bei 4°C abzentrifugiert, in 400ml eiskalten Transformationspuffer I (TfbI) resuspendiert und wieder 15 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Abzentrifugieren wurden die Bakterien in 40ml eiskaltem Transformationspuffer II (TfbII) aufgenommen und nochmals 15 min auf Eis inkubiert. Abschließend wurden die Bakterien in Portionen zu 50µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei - 70°C gelagert. Tfb I: Kaliumacetat 30mM Rubidiumchlorid 100mM Calciumchlorid 10mM Manganchlorid 50mM Glycerol 15%v/v pH 5,8 mit verd. Essigsäure Tfb II: MOPS 10mM Calciumchlorid 75mM Rubidiumchlorid 10mM Glycerol 15%v/v pH 6,5 mit verd. NaOH 9.2) Transformation kompetenter Bakterien mit Plasmid-DNA Den Transfer rekombinanter DNA in prokaryotische Zellen nennt man Transformation. Hierzu wurden 50µl der kompetenten Bakterien auf Eis aufgetaut und mit 50ng Plasmid-DNA bzw. 2-5 µl eines Ligationsansatzes 30min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock (42°C/ 45sec) und nachfolgender I nkubation für 1min auf Eis wurde der Ansatz für 60min bei 37°C mit 900µl SOC-M edium inkubiert. Zur Selektion wurden 200µl der Bakterienkultur auf LB-Platten mit 100µg/ml Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Für Übernachtkulturen wurden 4ml LB-Medium und 100µg/ml Ampicillin mit einer Kolonie überimpft und für ca. 16h bei 37°C geschüttelt. Zur Kryokonservierung wurden 500µ l der Übernachtkultur mit 500µl 80% Glycerol versetzt und bei -70°C weggefror en. 9.3) PCR-Screening der Kolonien Zur Überprüfung der Transformation wurden ca. 10 Kolonien der überimpften Platten in je 50µl LB-Medium mit 100µg/ml Ampicillin für eine Stunde bei 37°C - 30 - MATERIAL UND METHODEN geschüttelt. Danach wurde eine qualitative PCR mit 1µl der Bakterienkultur und den spezifischen Primern durchgeführt und in einem Agarosegel analysiert 10) Isolierung von Plasmid-DNA Für analytische Zwecke wurden Plasmide aus 4ml Übernachtkulturen über den Minikit der Firma Promega aufgereinigt. Für die präparative Aufreinigungen wurden die Plasmide aus Kulturvolumina von 50–100ml über den Midikit der Firma Promega nach Herstellerangaben aufgereinigt. 11) Sequenzieren von DNA Die Sequenzierung der DNA zur Überprüfung der korrekten Basenabfolge erfolgte mit dem Big Dye DNA Sequencing Kit (PE Applied Biosystems). Zugrunde liegendes Prinzip ist die Kettenabbruchmethode nach Sanger, wobei die Terminatoren mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind. Basierend auf dem Herstellerprotokoll wurde die Reaktion in einem Volumen von 10µl mit folgendem Reaktionsansatz und Temperaturprofil durchgeführt. Reaktionsansatz: 1µg Plasmid-DNA Temperaturprofil: 96°C 3min 3 µl Reaktions-Mix 96°C 30 sec 8 pmol Primer 60°C 15sec 60°C 2min Die Analyse der Reaktion erfolgte mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. 12) Transfektion von Säugerzellen Den Transfer von Fremd-DNA in eukaryontische Zellen nennt man Transfektion. Dabei unterscheidet man zwischen transienter und stabiler Transfektion. - 31 - MATERIAL UND METHODEN 12.1) Transiente Transfektion Für transiente Transfektionen wurden Zellen in den Vertiefungen von 12-WellPlatten in einer Dichte von 4-6x104 Zellen pro Vertiefung und ml ausgesät. Die Transfektion erfolgte am nächsten Tag bei einer Konfluenz der Zellen von ca. 60%. Pro Vertiefung wurde 1µg Gesamt-Plasmid-DNA transfiziert und nach spätestens 48h analysiert. 12.2) Stabile Transfektion Um Zellen stabil zu transfizieren, wurden diese in mittleren Petrischalen (Ø10cm) der Firma NUNC in einer Dichte von 2x105 pro 10ml ausgesät. Die Zellen wurden mit 5-10µg DNA transfiziert und nach 48h mit entsprechenden Antibiotika für mindestens 14 Tage selektioniert. Als Transfektionsreagenz für die transienten bzw. die stabilen Transfektionen wurde LipofectaminTM 2000 der Firma Invitrogen verwendet. Bei dieser Transfektionsmethoden handelt es sich um eine Lipofektion. Dabei verwendet man kationische Lipide, um die Plasmid-DNA zu binden und in die Zellen einzuschleusen. Das LipofectaminTM 2000 wurde nach Herstellerangaben eingesetzt, allerdings wurden die Volumina für die Transfektionen in 12-Well-Platten optimiert: Pro Vertiefung einer 12-Well-Platte wurden 100µl aus DNA und Transfektionsreagenz zugegeben. Dieser Mix wurde im Transfektionsmedium OtpiMEM der Firma Gibco angesetzt. 13) Luciferase-Reporter Assay Wird die Promotorregion eines Gens durch einen Transkriptionsfaktor aktiviert, führt dies entweder zu einer Repression oder Aktivierung des Zielgens. In diesem Reportersystem wird die aktivierende Funktion des Promotors ausgenutzt, indem - - 32 - MATERIAL UND METHODEN das eigentliche Zielgen des Promotors mit einem leicht nachzuweisenden Reportergen ersetzt wird. Hier ist der Reporter ein Konstrukt aus dem Promoter für NF-κB und einem nachgeschalteten Luciferasegen. Bei Aktivierung des Promoters wird Luciferase synthetisiert, die im Cytoplasma der Zelle akkumuliert. Nach Lyse der Zellen wird dieses frei und wandelt zugegebenes Luciferin in Oxyluciferin um. Dabei wird Licht emittiert, dass im Luminometer detektiert werden kann. Ca. 24h Stunden nach einer transienten Transfektion wurden die Zellen, wenn nötig, für 16h Stunden stimuliert. Dadurch wird der durch die transiente Transfektion in die Zelle eingebrachte NF-κB-Reporter aktiviert. Danach wurde der Überstand abgenommen und die Zellen 2x mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Lyse der Zellen erfolgte in 150µl TNT-Lysispuffer für 15min bei RT. Nach abzentrifugieren der Zellen (14000rpm/ 10min/ RT) wurden 10µl des Lysats mit 50µl Luciferase-Reagenz der Firma Promega in 96-Well-Mikrotiterplatten zusammenpipettiert und im Luminometer ausgewertet. TNT-Lysispuffer: TRIS-HCl 50mM NaCl 150mM Triton 1% pH 7,4 14) Proteinanalysen 14.1) Immunpräzipitation aus Überständen transfizierter Zellen In den Überstand sezernierte Proteine aus stabil oder transient transfizierten Zellen wurden über Protein A/G-Agarose Beads aufgereingt. Dazu wurde 1ml des Zellkulturüberstandes mit 25µl Protein A/G-Agarose Beads über Nacht bei 4°C in einem Rotor inkubiert. Nach zweimaligen Waschen der Beads mit PBS (3200rpm/ 4°C/ 5min) wurden die Beads in 25µl 4xProteinauftra gepuffer aufgenommen. Das Gemisch wurde nach 5 Minuten kochen komplett auf das Polyacrylamidgel aufgetragen. - 33 - MATERIAL UND METHODEN 14.2) Proteinlysate aus Zellen Um Proteinlysate herzustellen, wurden Zellen nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS in modifiziertem RIPA-Lysispuffer 15min auf Eis inkubiert. Für den Nachweis von Phosphotyrosinresten, die bei aktivierten Proteinen zu finden sind, wurden dem Lysepuffer außerdem Phosphataseinhibitoren zugesetzt. Danach wurde das Lysat abzentrifugiert (14000rpm/ 15min/ 4°C) und bei -20°C eingefroren. Für Analysen der NF-κB-Signaltransduktion wurden dem Lysat ca. 3% Glycerin zugesetzt, um IκB-Komplexe zu stabilisieren. modifizierter RIPA-Lysepuffer: Proteaseinhibitor: Tris-HCl pH 7,4 10mM NaCl 150mM EDTA 1mM NP40 1% Natriumdesoxycholat 0,25% PMSF 1mM je 1µg/ml Aprotinin, Leupeptin und Pepstatin A Phosphataseinhibitoren Zum Auftragen auf das NaF 1mM Na3VO4 1mM Polyacrylamidgel wurden die Proben mit 6xProteinaufragepuffer versetzt und für 5 Minuten gekocht. 14.3) Quantifizieren von Proteinen Um die Gesamtproteinmengen der Lysate zu bestimmen wurde der BCA (bicinchoninic acid)-Proteinbestimmungskit der Firma Pierce nach Herstellerangaben verwendet. Das Gesamtprotein wird durch colometrische Detektion bestimmt. Die Reduktion von Cu2+ zu Cu1+ durch Proteine in einem alkalischen Millieu wird kombiniert mit der Messung des farblichen Umschlags von Cu1+ durch Bildung eines Chelatkomplexes - 34 - MATERIAL UND METHODEN in Anwesenheit von BCA. Als interner Standard wird BSA (Bovines Serum Albumin) in 7 Verdünnungsstufen (2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,06125 mg/ml und 0,03125 mg/ml) mitgeführt. Nach 30minütiger Inkubation bei 37°C erfolgt die Auswertung im ELISA-Reader bei 562 nm. 14.4) SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) Um Proteine semi-quantitativ charakterisieren, werden bzw. diese ihrer mittels molekularen SDS-PAGE Größe nach nach zu Laemmli (1970) aufgetrennt. Durch Anlagerung von SDS bilden sich negativ geladene Protein-SDSKomplexe, die sich durch ihre Molekulargewichte im Laufverhalten unterscheiden. Die Proteine wurden in 12% Polyacrylamid-Gelen (30% Rotipuran der Firma Roth) bei 100V aufgetrennt. Um eine Größenbestimmung zu ermöglichen, wurde parallel ein Größenstandard mitgeführt (PageRulerTM Prestained Protein Ladder/ Fermentas). Die Auftrennungen wurden in Gelektrophoresesystemen der Firma PeqLab durchgeführt. Die Gele wurden mit folgenden Lösungen gegossen: Sammelgelpuffer 4x: 61 g/l Tris-HCl, pH 6,8 Trenngelpuffer 4x: 182 g/l Tris-HCl, pH 8,8 Reservoirpuffer 10x: 144 g/l Glycin 30,2 g/l Tris-HCl 0.1% SDS SDS 10x: 10% SDS Radikalbildner TEMED Radikalstarter 10% Ammoniumpersulfat (APS ) 14.5) Immunoblot Um aus einem komplexen Proteingemisch spezifisch einzelne Proteine nachweisen zu können, verwendet man Immunoblot-Analysen. Hierzu werden die über die SDS-PAGE aufgetrennten Proteine mittels Elektroblot in einem Blottank der Firma PeqLab auf eine PVDF-Membran transferiert. - 35 - MATERIAL UND METHODEN Transferpuffer: 192mM Glycin 25mM Tris-HCl pH 8 20% Methanol Für Nachweis von Phospotyrosinresten: 1mM Na3VO4 Um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen, wurde die Membran in Blockpuffer bei Raumtemperatur (RT) inkubiert (1h/ Taumler). Im Anschluss wurde die Membran zunächst über Nacht (ÜN) mit dem Primärantikörper (4°C/ Taumler) und dann mit dem entsprechenden Peroxidase-gekoppelten Sekundärantiköper (1-2h/ Taumler/ RT) inkubiert. Jeweils nach den Antikörperinkubationen wurden die Membranen 2x10min mit TTBS und 1x10min mit TBS gewaschen. Die Verdünnung der Antikörper erfolgte im Blockpuffer. Abschließend wurde die Membran mit dem ECL-Plus Kit der Firma Amersham entwickelt. Dabei setzt die an den Sekundärantikörper gekoppelte Peroxidase das im ECL-Substrat vorhandene Luminol um. Die entstehenden Luminiszenzsignale wurden per Röntgenfilm detektiert. TBS-Puffer: 100mM NaCl 10 mM Tris-HCl pH 7.5 Für Nachweis von Phospotyrosinresten: 1mM Na3VO4 TBST-Puffer: wie TBS + 0.05% TWEEN Blockpuffer: 5% Magermilchpuffer in TBST-Puffer Für Nachweis von Phospotyrosinresten: 1mM Na3VO4 Um weitere Western-Blot-Analysen durchführen zu können, werden gebundene Antikörper durch Inkubation (50°C/ 30min/ Hybridisi erungsofen) der Membran in einem Stripping-Puffer abgewaschen. Nach nochmaligem Waschen in TBS-Puffer beginnt der neue Immunoblot mit dem Blocken der PVDF-Membran. Stripping-Puffer: 62.5mM Tris-HCl pH 6,7 100mM 2-Mercapto-Ethanol 2% SDS - 36 - MATERIAL UND METHODEN 15) Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) Für den Nachweis von humanem Interleukin-8 (huIL-8) bzw. murinem TNF und IL-6 mittels ELISA wurden die kommerziell erhältlichen Systeme von BectonDickinson (BD) gemäss den Herstellerangaben verwendet. Die Auswertung erfolgte bei 450nm im ELISA-Reader. 16) Nachweis der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthetase (iNOS-Assay) Als schnelle Kontrolle der Stimulation muriner Zellen wurde eine Messung von Nitritoxid im Überstand mit dem Griess-Reagenz in einer 96-Well-Mikrotitterplatte durchgeführt: 10µl des unverdünnten Überstandes werden mit 50µl einer 1% Sulfanilamidlösung in 5% Phosophorsäure für 5min inkubiert. Unter diesen sauren Bedingungen geht das Nitrit (NO2-) eine Diazotierungsreaktion mit den Aminogruppen der Sufanilsäure ein und es entsteht ein Diazoniumkation (freies N2+). 50µl einer 0,1% NED- Lösung (0,1% N-1-naphtylethylendiamin-dihydrochlorid in ddH2O) wurden dazupipettiert und die Platte 5min im Dunklen inkubiert. Dabei bildet das Diazoiniumkation mit dem N-Naphtyldiamin einen Azofarbstoff (Farbumschlag zu Pink). Die Auswertung erfolgte bei 550nm im ELISA-Reader. Als Standard wurde Nitrit in einer in PBS angesetzten Verdünnungsreihe mitgeführt (100 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM, 6,25 µM, 3,125 µM, 1,56 µM). 17) Gentamycin-Schutz-Test Bei diesem Test werden Zellen mit intrazellulären Bakterien infiziert. Nach 25minütiger Infektionszeit werden extrazellulär verbliebene Bakterien durch Gentamycin abgetötet. RAW-Zellen wurden 6 Stunden vor Infektion in einer Dichte von 6x105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte in 500µl kompletten RPMI-1640 Medium ausgesät. Salmonella typhimurium wurden in 3ml LB-Medium über Nacht bei 37°C angezogen. Nachdem die Bakterienzahl photometrisch bestimmt worden war, - 37 - MATERIAL UND METHODEN wurden die zur Infektion benötigte Bakterienzahl in 500µl kompletten RPMI-1640 ohne Antibiotika/ Vertiefung als Mastermix angesetzt. Das Medium der RAW-Makrophagen wurde aus den Plattenvertiefungen entfernt und die Zellen mit 500µl der Bakteriensuspension inkubiert. Zum Synchronisieren der Infektion wurden die Platten 5min bei 500rpm zentrifugiert und anschließend 25min im Brutschrank inkubiert. Nach Entfernen des Mediums wurden die Zellen 3x mit vorgewärmten PBS gewaschen und neues Medium mit 100µg/ml Gentamycin für eine Stunden dazugeben. Anschließend wurden die Zellen erneut gewaschen und in Medium mit 15µg/ml Gentamycin für die restlichen 1-15 Stunden inkubiert. Um das intrazelluläre Wachstum der Bakterien nach 2 und 16 Stunden Inkubation zu bestimmen, wurden die Zellen nach Ablauf der Infektionszeit 1x mit PBS gewaschen und mit 500µl/ Vertiefung vorgewärmten 0,1%Triton-X100/PBS-Lysispuffer für 10min lysiert. Von diesen Lysaten wurden serielle Verdünnungen mit PBS hergestellt und 100µl der einzelnen Stufen auf Müller-Hinton (MH)-Platten ausplattiert. Nach 2 Stunden Infektion wurde die Probe unverdünnt und in Verdünnungsstufen bis 10-3 ausplattiert. 16 Stunden nach Infektion wurden die Verdünnungsstufen 10-1–10-4 ausplattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C bebrütet und die gewachsenen Bakterienkolonien am folgenden Tag ausgezählt. 18) Konfokale Lasermikroskopie Hierfür wurden zunächst Deckgläser in die Vertiefung einer 24-Well-Platte gelegt. Anschließend wurden die Zellen in einer Dichte von 6x105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte auf den Deckgläsern ausgesät. Salmonellen, die mit einem Green-Fluorescent Protein (GFP-)Konstrukt mit Ampicilinresistenzkassette transformiert wurden, emittieren bei Laseranregung im Konfokalen Mikroskop Licht. Die Bakterien wurden über Nacht in ampicillinhaltigem (100µg/ml) LB-Medium angezogen, danach erfolgte die Infektion der Zellen. Bei den hier verwendeten Zellen handelt es sich um, mit BPI-huIgG1/Fc stabil transfizierte, RAWMakrophagen und die parentale Zelllinie. - 38 - MATERIAL UND METHODEN Nach 25minütiger Infektion wurden die Zellen auf den Objektträgern in den Plattenvertiefungen mit PBS gewaschen und mit 3% Paraformaldehyd auf den Objektträgern fixiert. Nach Permeabilisierung der Zellen (30min/ 37°C in B lockpuffer: PBS/ 2% Ziegenserum/ 2% BSA + 0.1% Saponin) und Inkubation mit dem Anti-huIgG1-Cy3gekoppelten Antikörper wurden die Zellen 3x mit PBS/ 0,025% Saponin gewaschen und die Probe mit Fluoroprep behandelt. Abschließend wurden die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf einen Objektträger platziert und mit Entellan versiegelt. Die Auswertung der Färbungen erfolgte im konfokalen Lasermikroskop. Dabei erscheinen die GFP-markierten Salmonellen grün, das mit dem Anti-huIgG1-Cy3 gefärbte BPI-Protein rot. Bei der Kolokalisation, also einer Überlagerung von BPI mit Salmonellen, entsteht eine gelbe Färbung. 19) Viabiltätstest von Zellen (MTT-Test) Über eine Messung der Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen ist es möglich, die Viabilität von Zellen zu bestimmen. Das Substrat MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetra-zoliumbromid) wird über die Dehydrogenasen in Formazan umgesetzt. Die Aktivität dieser Enzyme ist vom physiologischen Status der Zellen abhängig und kann so Aufschluss über deren Vitalität geben. 1x103 Zellen wurden in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte ausgesät. Vor dem Test wurden die Zellen mit 225µl frischem Medium und 25µl MTT-Stammlösung versetzt und 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Abgestop pt wurde die Reaktion mit Isopropanol mit 0,04N HCl. Die Auswertung wurde bei 550nm in einem ELISAMeßgerät durchgeführt. Für die MTT-Stammlösung wurden 50mg MTT in 10ml PBS gelöst, die Lagerung erfolgte dunkel bei 4°C. - 39 - ERGEBNISSE V) Ergebnisse A) Vorarbeiten Zu Beginn dieser Arbeit war weder etwas über die Expression noch die Funktion von murinem Bactericidal/ Permeability Increasing Protein (BPI) bekannt. Mäuse galten bisher als natürlich defizient für dieses Protein. In Vorarbeiten ist es unserer Arbeitsgruppe gelungen, mittels Computeranalysen, zwei komplementäre murine expressed sequence tags (ESTs) zu identifizieren, die mit der Sequenz von humanem BPI (huBPI) homolog sind. Zum Nachweis der BPIExpression in murinem Gewebe wurde mit Hilfe dieser Sequenzinformationen ein Northern-Blot etabliert und verschiedene Gewebe untersucht. Eine Expression der Eierstöcke Hoden Thymus Lunge Embryo Niere Milz Leber Gehirn Herz mRNA von BPI konnte im Hoden detektiert werden (Abb. 1). 6.0 4.0 2.0 1.0 0.5 Abb. 1: Verteilung von BPI in murinen Gewebeproben Ein RNA-Blot verschiedenster Mausgewebe wurde mit einer Sonde, bestehend aus cDNA von murinen BPI, hybridisiert. Um eine sensitivere Methode zur Detektion von BPI zu entwickeln, wurde eine konventionelle PCR zur qualitativen Analyse der Expression von BPI etabliert. Damit wurden wiederum zuerst murine Gewebeproben analysiert. In allen getesteten lymphoiden Organen konnte eine Expression von BPI nachgewiesen werden (Abb. 2). - 40 - ERGEBNISSE KM Thymus Milz LK BPI HPRT Abb. 2: BPI-Expression in lymphoiden Geweben Die Expression von BPI in ruhendem Gewebe des Knochenmarks (KM), Thymus, der Milz und des Lypmhknotens (LK) konnte mittels einer PCR unter Verwendung BPI-spezifischer Primer nachgewiesen werden. Die erfolgreiche cDNA-Synthese wurde durch einen PCR-Nachweis der konstitutiv exprimierten Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) überprüft. B) Tanskriptionsanalysen 1) Murines BPI wird bereits in ruhenden murinen Granulozyten exprimiert Um zu überprüfen, welche hämatopoetischen Zellen für die Expression der BPImRNA in den lymphoiden Organen der Maus verantwortlich sind, wurden aufgrund der Vorbefunde mit huBPI zunächst Granulozyten untersucht. Da für murine Granulozyten keine geeignete Zelllinie existiert, wurden peritoneale Exsudatzellen (PECs) verwendet. Dazu wurden Mäuse mit 4% ThioglyocllatLösung intraperitoneal gespritzt und 16 Stunden später wurden die PECs durch Spülen der Bauchhöhle mit komplettem RPMI-1640 Medium gewonnen. In diesen frisch isolierten und unstimulierten Granulozyten konnte nach Aufreinigung der RNA und anschließender RT-PCR eine schwache BPI-Expression mittels konventioneller PCR nachgewiesen werden (Abb. 3). - 41 - ERGEBNISSE - Gr. + BPI HPRT Abb. 3: Die BPI-Expression wurde mittels RT-PCR im Hodengewebe (+) und frisch isolierten Granulozyten (Gr.) detektiert 1 µg Gesamt-RNA wurde mit reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben und mit spezifischen Primern amplifizert. Die Negativkontrolle (-) wurde mit Wasser durchgeführt. Die Qualität der cDNA wurde durch die Amplifikation des Haushaltsgens Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) mittels PCR kontrolliert. Die so aus der Bauchhöhle isolierten PECs bestehen allerdings nicht nur aus Granulozyten, sondern beinhalten ebenfalls eingewanderte Makrophagen. Deswegen wurden auch Makrophagen auf die Expression von BPI untersucht. Neben primären Makrophagen, also PECs, die erst 72 Stunden nach Injektion mit der 4%igen Thioglycollat-Lösung gewonnen wurden, wurde zusätzlich eine Makrophagen-Zelllinie (RAW 267.4) analysiert. Weder in den primären Makrophagen noch in der Makrophagen-Zelllinie konnte BPI-mRNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mäuse ein Homolog von huBPPI exprimieren, welches in Granulozyten, nicht aber in Makrophagen detektierbar ist. 2) Transkriptionelle Regulation 2.1) Murines BPI wird in Granulozyten durch verschiedene TLR-Liganden transkriptionell reguliert Zur Analyse einer möglichen Regulation von murinem BPI auf transkriptioneller Ebene wurden aus der Bauchhöhle von Mäusen angelockte Granulozyten isoliert und anschließend ex vivo mit verschiedenen, spezifischen TLR-Liganden stimuliert. - 42 - ERGEBNISSE 12 bzw. 24 Stunden nach Stimulation der Granulozytenpräparation mit verschiedenen PAMPs wurde die cDNA nach Aufarbeitung der Proben mittels qualitativer PCR auf die Expression von BPI untersucht. Bei Auswertung der konventionellen PCR zeigte sich, dass alle verwendeten Liganden in der Lage waren, die BPI-Expression zu induzieren (Abb. 4A). A T [h] 0 12 24 12 CpG 24 12 LPS 24 12 S. aureus 24 PGN 12 24 Zym. A BPI HPRT B x-fache Induktion der BPI-mRNA 100 50 n. d. 0 12 CpG 24 12 24 LPS 12 24 S. aureus 12 PGN 24 12 24 Zym. A Abb. 4: BPI-Induktion in Granulozyten kann durch eine Vielzahl verschiedener Stimuli induziert werden A) Aus dem Peritoneum von Mäusen gewonnene Granulozyten wurden für 12 und 24 Stunden (h) mit 2 µM CpG-DNA Motiven (CpG), 100 ng/ml LPS, 10 µg/ml Biopartikeln von Staphylococcus aureus (S. aureus), 10 µg/ml Peptidoglycan (PGN) bzw. 10 µg/ml Zymosan A (Zym. A) stimuliert oder unbehandelt gelassen (0). Danach wurden 1 µg isolierter Gesamt-RNA in cDNA umgeschrieben. Die Expression von BPI-mRNA wurde mittels einer spezifischen PCR untersucht. Die gelungene Synthese der cDNA wurde durch eine HPRT-PCR analysiert. B) Echt-Zeit-PCR zur Analyse der Höhe der BPI-Expression. Die Induktion wurde nach Normalisierung der Proben auf die konstitutiv exprimierte Porphobilinogen Deaminase (PBGD) aus den relativen Kopienzahlen berechnet. Die gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. n.d. = nicht detektierbar. - 43 - ERGEBNISSE Um die mRNA-Expression von murinem BPI quantitativ zu erfassen, wurde neben einer konventionellen PCR zur qualitativen Bewertung der Expression von BPI auch eine Echt-Zeit-PCR für BPI etabliert. Diese ermöglicht es, durch die Interkalierung des Fluoreszenzfarbstoffes SYBRGreen in die DNA während der Amplifikation und einer Fluoreszenzmessung nach jedem Amplifikationsschritt, eine quantitative Bestimmung vorzunehmen. Die relative Höhe der Expression von BPI-mRNA wurde nach Normalisierung auf das in einem zweiten Ansatz gemessene Bezugsgen ermittelt und als „relative Kopienzahl“ dargestellt. Als Bezugsgen wurde das konstitutiv exprimierte Haushaltsgen Porphobilinogen Deaminase (PBGD) verwendet. Um die relative Höhe der mRNA-Expression der Granulozyten nach Stimulation mit unterschiedlichen TLR-Liganden zu beurteilen, wurden die Proben zusätzlich mit der quantitativen Echt-Zeit-PCR analysiert. Bei fast allen Stimuli konnte nach Abgleich mit PBGD nach 12 Stunden (außer bei Staph. aureus-Biopartikeln) eine einsetzende Hochregulation der BPI-mRNA beobachtet werden, die nach 24 Stunden den höchsten mRNA-Level erreichte. Als der stärkste Induktor unter den eingesetzten Liganden stellte sich LPS heraus, bei dem nach 24 Stunden eine 65fache Induktion der mRNA zu messen war (Abb. 4B). Diese Induktion entspricht etwa einer relativen Kopienzahl von 5 Kopien BPI pro Kopie PBGD. Diese Experimente zeigen deutlich, dass von den verwendeten TLR-Liganden LPS der stärkste Induktor für die transkriptionelle Hochregulation der BPI-mRNA ist. Am höchsten exprimiert wird die BPI-mRNA 24 Stunden nach Stimulation. Da LPS für Granulozyten eindeutig der stärkste Aktivator für die Synthese der BPImRNA war, wurden alle weiteren Versuche mit LPS durchgeführt. 2.2) Optimierung der Stimulationsbedingungen Nach diesem Ergebnis sollte in einem weiteren Experiment untersucht werden, wie sich der zeitliche Ablauf der Induktion der BPI-mRNA darstellt. Dazu wurden die Granulozyten in einer engeren Kinetik von 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden mit 100 ng/ml - 44 - ERGEBNISSE LPS stimuliert, geerntet und nach Synthese der cDNA sowohl mit konventioneller als auch mit Echt-Zeit-PCR analysiert. Bei beiden PCR-Methoden ist eine Induktion der BPI-Expression zu beobachten, die ihre stärkste Ausprägung nach 24 Stunden hat (Abb. 5). Dies wird nach der quantitativen Auswertung mit Hilfe der Echt-ZeitPCR deutlich: Ein messbarer Anstieg der Induktion der BPI-Transkription beginnt acht Stunden nach LPS-Stimulation mit 2 Kopien BPI/ PBGD, steigt bis zwölf Stunden stark an und ist mit 8 Kopien BPI/ PBGD nach 24 Stunden am höchsten. Da in diesem Experiment bei unbehandelten Granulozyten in der Echt-Zeit-PCR keinerlei Expression von BPI zu messen war, konnte keine Induktion berechnet werden. Bei Granulozyten konnten auf Grund der kurzen Lebensdauer ex vivo keine späteren Zeitpunkte in der Stimulationskinetik untersucht werden. A B LPS BPI HPRT 0 2 4 8 12 24 - + 10 Kopienzahl BPI/ PBGD T[h] 5 T[h] n. d n. d n. d 0 2 4 8 12 24 Abb. 5: BPI-Induktion in Granulozyten durch LPS ist nach 24 Stunden am stärksten A) Aus dem Peritoneum von Mäusen gewonnene Granulozyten wurden für 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden (h) mit 100 ng/ml LPS stimuliert oder unbehandelt gelassen (0). 1 µg isolierte Gesamt-RNA wurde in cDNA umgeschrieben und die Expression von BPI-mRNA durch eine spezifische PCR untersucht. Die gelungene Synthese der cDNA wurde durch eine HPRT-spezifische PCR analysiert. B) Echt-Zeit-PCR zur Analyse der Höhe der BPI-Expression. Da in den unbehandelten Proben kein BPI zu messen war, konnte keine Induktion berechnet werden. Daher wurde die Expressionshöhe als relative Kopienzahl (Kopienzahl BPI/ PBGD) nach Normalisierung der Proben auf die konstitutiv exprimierte Porphobilinogen Deaminase (PBGD) angegeben. n.d. = nicht detektierbar. Um die LPS-Konzentration zu ermitteln, die zur stärksten transkriptionellen Aktivierung von murinem BPI führt, wurden Granulozyten mit absteigenden LPS- - 45 - ERGEBNISSE Konzentrationen (100 µg/ml–1 ng/ml) über einen Zeitraum bis zu 24 Stunden stimuliert. Bei allen eingesetzten Konzentrationen konnte nach Auswertung mittels Echt-ZeitPCR eine Induktion der BPI-mRNA beobachtet werden, die jeweils nach 24 Stunden am höchsten war. Die stärkste Induktion der mRNA war bei X-fache Induktion der BPI-mRNA Konzentrationen zwischen 100 ng/ml und 10 µg/ml zu sehen (Abb. 6). 7 0 5 0 3 0 1 LPS Abb. 6: LPS-Konzentrationen von 10 µg/ml-100 ng/ml vermitteln die stärkste BPI-Transkription Peritoneale Granulozyten wurden mit absteigenden LPS-Konzentrationen (100 µg/ml, 10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml bzw. 1 ng/ml) über 24 Stunden stimuliert. Danach wurde die Höhe der BPI-Expression durch Echt-Zeit-PCR-Analyse ermittelt. Nach Normalisierung auf PBGD wurde die Induktion der BPI-mRNA berechnet. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden in den nachfolgenden Experimenten Granulozyten mit einer LPS-Konzentration von 100 ng/ml für 12 und 24 Stunden stimuliert. 2.3) Auch Dendritische Zellen exprimieren und regulieren murines BPI Dendritische Zellen (DCs) sind vor allem für ihre Fähigkeit bekannt, durch Antigenpräsentation und Sezernieren von Zytokinen (e.g. Interleukin 12) Signale zur Aktivierung und Modulation der Immunantwort zu geben (Banchereau and Steinman, 1998). Erste Hinweise, dass DCs eventuell auch direkt auf Pathogene - 46 - ERGEBNISSE einwirken können, ergaben sich, als man das antibakterielle Protein Alkyl-OxyalkylHydrolase (AOAH) in DCs nachweisen konnte (Lu et al., 2003). Bei der Analyse unstimulierter Zellen konnte sowohl in DCs lymphoider Abstammung als auch in aus Knochenmark isolierten, myeoliden DCs (BMDCs) eine schwache konstitutive Expression von BPI mittels konventioneller PCR nachgewiesen werden. In der Literatur ist beschrieben, dass nur myeloide DCs (BMDCs) einen funktionalen TLR4 exprimieren (Kadowaki et al., 2001). Da die LPS-Stimulation TLR4 vermittelt ist, wurden für die Untersuchung einer möglichen transkriptionellen Regulierung von BPI nur BMDCs verwendet. Um BMDCs zu generieren, wurde das Knochenmark aus den Oberschenkelknochen der Hinterläufe von Mäusen gespült und über sieben Tage in GM-CSF konditioniertem RPMI-1640 Komplettmedium kultiviert. Nach einer FACSAnalyse auf Reinheit und Reifegrad (Abb. 7) wurden die zu etwa 70-80% reinen DCs ausgesät und in einer Kinetik von 12, 24 und 48 Stunden mit LPS stimuliert. 28% 60% 10% 2% Abb. 7: Die Zusammensetzung der generierten BMDCs wurde vor deren Verwendung mittels Durchflußzytomtrie untersucht Die Zellen wurden mit Antikörpern gegen CD11c (Anti-Maus CD11c-PE) als DC-Marker und MHC Klasse II (Anti-Maus MHC-II-FITC) als Reifungsmarker gefärbt. Ähnlich wie in Granulozyten, zeigte sich auch in BMDCs nach Auswertung der Echt-Zeit-PCR eine Regulation der BPI-Transkription, die mit einer etwa 100-fachen Induktion 24 Stunden nach LPS-Stimulation am höchsten war und bis 48 Stunden nach Stimulation mit LPS wieder auf den Ausgangswert zurückging (Ab. 8). - 47 - ERGEBNISSE X-fache Induktion der BPI-mRNA 100 50 T[h] 0 12 24 48 Abb. 8: DCs aktivieren BPI-Transkription nach LPS-Stimulation BMDCs wurden mit 100 ng/ml LPS über 12, 24 und 48 Stunden stimuliert oder unbehandelt gelassen (0). Die Expression von BPI wurde mittels Echt-Zeit-PCR analysiert. Nach Abgleich der Zeitpunkte auf PBGD wurde die Induktion berechnet. Kommen DCs in Kontakt mit LPS, führt das zur sogenannten Reifung der DCs. Bei diesem Übergang vom unreifen zum reifen Zellstadium wird in den DCs ein komplexes Aktivierungsprogramm angeschaltet. Dadurch werden verstärkt sowohl MHC Klasse II Moleküle als auch kostimulatorische Moleküle, e.g. CD80, auf der Oberfläche der reifen DCs exprimiert. Durch diesen Reifungsprozess erlangen die DCs ihre besondere Fähigkeit als sehr potente Antigen-präsentierende Zellen (APCs) T-Zellen zu aktivieren (Banchereau and Steinman, 1998). Im Verlauf dieses Reifungsprozesses der DCs nimmt die Expressionshöhe der BPImRNA zu, nach vollständiger Ausreifung wird die BPI-Transkription wieder herunterreguliert. Dass murine DCs BPI exprimieren und die Expression sogar regulieren können, konnte in dieser Form in humanen DCs nicht gefunden werden. Diese Resultate konnten mit hochreinen DCS, die nach sortieren der Zellen erhalten wurden, bestätigt werden (Daten nicht gezeigt). Es zeigt sich, dass BMDCs nicht nur Signale zur Aktivierung der Immunantwort in Form von Zytokinen und Antigenpräsentation an andere Zellen geben, sondern möglicherweise über ein direkt antibakteriell wirkendes Protein aktiv in die Pathogenabwehr eingreifen können. - 48 - ERGEBNISSE 2.4) Intraperitoneale Gabe von LPS führt zu einer systemischen Induktion der BPIExpression in Mäusen In diesem Experiment sollte die Frage geklärt werden, in welchem Maß die inneren Organe von Mäusen in der Lage sind, nach systemischer LPS-Gabe die BPIExpression zu regulieren. Dazu wurden Wildtyp-Mäuse intraperitoneal mit 100 µg LPS gespritzt und Herz, Lunge, Milz, Leber und Nieren sowie Blut, Knochenmark und PECs nach 6, 12 bzw. 24 Stunden entnommen. Nach Aufarbeitung der Organe und der cDNA-Synthese wurden die Proben mittels Echt-Zeit-PCR analysiert. Dabei zeigte sich, dass in PECs und Nieren über die gesamte Kinetik eine Expression der BPI-mRNA zu beobachten war. Mit einer 30fachen Induktion 24 Stunden nach LPSInjektion war die Expression in PECs am stärksten. In den Nieren hingegen war die stärkste BPI-mRNA-Expression mit einer etwa 15fachen Induktion nach 12 Stunden messbar und in den Lungen konnte erst nach 24 Stunden eine schwache, ca. 5fache BPI-mRNA-Induktion gezeigt werden (Abb. 9). X-fache Induktion der BPI-mRNA 40 20 T[h] 6 12 24 Abb. 9: Systemische Gabe von LPS induziert die BPI-Expression Nach Injektion von 100 µg LPS in die Bauchhöhle von Wildtyp-Mäusen wurden die Organe zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Nach Extraktion der RNA und cDNA-Synthese wurden die Proben mittels Echt-Zeit-PCR analysiert. Die Induktion der BPI-Expression in den PECs ( Niere ( ) und in der Lunge ( ), in der ) wurde nach Abgleich auf das Haushaltsgen PBGD berechnet. Die hier gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. - 49 - ERGEBNISSE 3) Verantwortliche Rezeptoren und Signalmoleküle für die LPS-induzierte transkriptionelle Aktivierung von murinem BPI 3.1) Abhängigkeit von TLR4 Eine zentrale Komponente des trimolekularen LPS-Rezeptorkomplexes stellt der TLR4 dar. Dieser Rezeptor ist im Zusammenspiel mit CD14 und MD-2 in der Lage, LPS zu erkennen und eine Zellaktivierung zu initiieren. Um den genauen Signalweg, der für die LPS-vermittelte Induktion von mBPI zuständig ist, aufzuschlüsseln, wurden zunächst Granulozyten aus Mäusen isoliert, die einen Defekt im TLR4-Gen tragen und daher keinen funktionellen TLR4 mehr besitzen (C3H/HeJ-Mäuse). Als Kontrolle dienten TLR2-Knock-out-Mäuse und der zu den TLR4-defizienten Mäusen gehörende Wildtyp-Stamm C3H/HeN. Wie erwartet, waren nur die Mäuse mit intaktem TLR4 in der Lage, die durch LPS induzierte Hochregulation der BPI-mRNA zu vermitteln (Abb. 10). C3H/HeJ C3H/HeN TLR2 -/HPRT 0 12 BPI 24 + 0 LPS 12 24 + T[h] LPS Abb. 10: LPS-vermittelte Induktion von BPI ist TLR4 abhängig Sowohl Granulozyten aus Wildtyp-Mäusen als auch aus TLR4- und TLR2-defizienten Mäusen wurden über 12 und 24 Stunden mit 100 ng/ml LPS stimuliert. Nach Isolation der Gesamt-RNA und Synthese der cDNA wurden die Proben in einer spezifischen PCR auf die BPI-Expression hin analysiert. Die Qualität der cDNA wurde mit einer HPRT-spezifischen PCR kontrolliert. Als Positivkontrolle (+) diente Hoden-cDNA. - 50 - ERGEBNISSE 3.2) Adaptermoleküle im TLR4-Signalweg Eine Besonderheit von TLR4 ist die Möglichkeit, zwei verschiedene Signalwege zur intrazellulären Signaltransduktion zu verwenden. Dabei unterscheidet man den zentralen Pfad über das Adaptermolekül MyD88, der von fast allen TLRs verwendet wird und den vom Adaptermolekül TRIF abhängigen Pfad, der außer für TLR4 nur noch exklusiv für den TLR3 beschrieben ist. Um Aufschluss darüber zu erhalten, welcher der beiden Wege für die LPSvermittelte Aktivierung der BPI-Transkription eine Rolle spielt, wurden zunächst Granulozyten und DCs MyD88-defizienter Mäuse gewonnen und analysiert. Als Kontrolle dienten aus Wildtyp-Mäusen isolierte Granulozyten und DCs. Zunächst wurde überprüft, ob es sich bei den Mäusen tatsächlich um MyD88Knock-out-Mäuse handelte. Da Mäuse, denen MyD88 fehlt, nicht mehr der Lage sind, nach LPS-Stimulation TNF zu produzieren, wurden die Überstände der Stimulationen mittels eines TNFELISAs untersucht (Kawai et al., 1999). Wie erwartet, konnte in den Überständen der MyD88-defizienten Mäuse kein TNF nachgewiesen werden (Abb. 11). TNF [pg/ml] 2000 1600 1200 800 400 0 T [h] n. d. n. d. 0 n. d. n. d. 12 24 Abb. 11: MyD88-defiziente Mäuse können kein TNF produzieren Die Überstände der stimulierten Granulozyten aus MyD88-defizienten Mäusen ( Mäusen ( ) und Wildtyp- ) wurden in einem TNF-ELISA analysiert. n.d. = nicht detektierbar. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass das für fast alle TLRs zentrale Adaptermolekül MyD88 nicht notwendig für die Signaltransduktion ist und die LPSvermittelte BPI-Induktion unabhängig von MyD88 verläuft (Abb. 12). - 51 - ERGEBNISSE Nachdem sich MyD88 nicht als das notwendige Adaptermolekül für die LPS-TLR4 vermittelte Aktivierung der BPI-Transkription herausstellte, wurden nun Granulozyten und DCs TRIF-defizienter Mäuse analysiert. Wie in Abbildung 12 zu erkennen, ist es nach LPS-Stimulation ohne das Adaptermolekül TRIF nicht mehr möglich, die BPI-mRNA zu regulieren. Die Analysen der DCs ergaben die gleichen Ergebnisse. Kopienzahl BPI/ PBGD 10 5 T[h] 24 12 0 Abb. 12: LPS-vermittelte BPI-Induktion ist MyD88-unabhängig, aber TRIF-abhängig Granulozyten aus Wildtyp-Mäusen ( ), MyD88-defizienten ( ) und TRIF-defizienten ( ) Mäusen wurden nach LPS-Stimulation und Aufbereitung der Proben mit einer spezifischen Echt-Zeit-PCR analysiert. Nach Normalisierung der Proben auf PBGD wurde die Höhe der BPI-Expression als relative Kopienzahl angegeben. Die gezeigten Daten wurden in drei unabhängigen Experimenten ermittelt. Um die Stimulation der TRIF-defizienten Zellen zu kontrollieren, wurde mit den Stimulationsüberständen der Experimente ein IL-6 ELISA durchgeführt. Wie in Abbildung 13 zu sehen, ist die durch die LPS-Stimulation ausgelöste Produktion und Sekretion von IL-6 in die Überstände deutlich messbar. IL-6 [pg/ml] 15000 12000 9000 6000 3000 0 T [h] n. d. 0 12 24 Abb. 13: IL-6-Freisetzung aus Granulozyten TRIF-defizienter Mäuse nach LPS-Stimulation Die Überstände der LPS-stimulierten Granulozyten TRIF-defizienter Mäuse wurden in einem IL-6ELISA analysiert. n.d. = nicht detektierbar. - 52 - ERGEBNISSE 3.3) Analysen der Signalwege durch Einsatz spezifischer Inhibitoren 3.3.1) NF-κB spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von BPI Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird durch eine Vielzahl verschiedener Stimuli aktiviert. Werden Zellen beispielsweise LPS, inflammatorischen Zytokinen wie TNF und IL-1 oder viralen Infektionen und UV-Strahlung ausgesetzt, führt das über die jeweiligen intrazellulären Signalmoleküle zur Aktivierung von NF-κB. Im Zytoplasma liegt NF-κB als inaktiver Komplex, bestehend aus IκB-α und den beiden Untereinheiten p50 und p65, vor. Bei einer Aktivierung von NF-κB, dissoziiert IκB-α vom Komplex und wird von Proteosomen degradiert, während die NF-κB-Untereinheiten p65 und p50 als Heterodimer in den Nukleus translozieren. Nach Bindung an geeignete Bindungsstellen des Promotors aktiviert NF-κB viele für die Immunantwort relevante Gene, z.B. TNF oder IL-6. Um zu überprüfen, ob NF-κB für die transkriptionelle Aktivierung von muBPI eine wichtige Rolle spielt, wurden zwei Inhibitoren eingesetzt, welche die Aktivierung von NF-κB verhindern. Dabei blockiert SN 50 die Translokation von NF-κB in den Zellkern und der Proteasomeninhibitor MG-132 inhibiert die Dissoziation von IκB-α vom NF-κB (Lin et al., 1995). Granulozyten aus Wildtyp-Mäusen wurden deshalb eine Stunde vor LPS-Stimulation mit den Inhibitoren behandelt und 6, 12 bzw. 24 Stunden nach LPS-Stimulation geerntet. Die Funktionalität beider Inhibitoren wurde auf Ebene der TNF-Freisetzung mittels ELISA nachgewiesen (Abb. 14). Bei beiden Inhibitoren war die TNF-Freisetzung stark vermindert, nur die unbehandelten Granulozyten waren weiterhin in der Lage, das über NF-κB aktivierte TNF freizusetzen. - 53 - ERGEBNISSE 1600 TNF [pg/ml] 1200 800 400 N=2 0 T[h] N=2 12 24 Abb. 14: NF-κ κB-Inhibitoren blockieren die TNF-Freisetzung Die Kulturüberstände der unbehandelten, LPS-stimulierten (100 ng/ml) ( SN-50 (20 µM), ( ) und MG-132 (10 µM), ( ) bzw. mit den Inhibitoren ) vorbehandelten und LPS-stimulierten (100 ng/ml) Granulozyten wurden in einem TNF-ELISA analysiert. Die gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Die Funktionalität von MG-132 konnte zusätzlich in einem Immunoblot gezeigt werden. Durch die proteosomale Lyse von IκB-α unmittelbar nach LPS-Stimulation der Granulozyten wird NF-κB aktiviert. Durch MG-132 wird diese Lyse verhindert, IκB-α wird nicht abgebaut und es erfolgt keine Freisetzung von NF-κB (Abb. 15A). Die gleichmäßige Beladung der Spuren wurde in einem nachfolgenden Immunoblot mit dem NF-κBp65-spezifischen Antikörper dokumentiert. A 37 kD Anti-IκB-α 65 kD Anti-NF-κB p65 B 0 10 20 LPS 30 60 0 10 20 30 60 T[min] LPS + MG-132 Abb. 15: In MG-132-behandelten Granulozyten kann Iκ κB-α α nicht mehr degradiert werden 30 µg des Totallysates aus Granulozyten wurden über eine 12% SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mit spezifischen Antikörpern analysiert. A) Wie mit dem Anti-IκB-α-Antikörper gezeigt, wird IκB-α nach LPS-Stimulation proteosomal degradiert. B) Eine gleichmäßige Beladung der Spuren wurde durch den Anti-NF-κBp65-Antikörper nachgewiesen. - 54 - ERGEBNISSE Nach Analyse der RNA mit quantitativer Real-Time PCR zeigte sich, dass beide Inhibitoren die Hochregulation der BPI-mRNA nahezu vollständig blockierten (Abb. 16). NF-κB spielt also auch für die LPS-TLR4 vermittelte Hochregulation der BPIExpression eine zentrale Rolle. Kopienzahl BPI/ PBGD 10 5 T[h] N=2 N=2 12 24 Abb. 16: NF-κ κB spielt eine zentrale Rolle bei der Induktion der BPI-mRNA Nach Isolation der Gesamt-RNA wurde 1 µg in die cDNA-Synthese eingesetzt. Anschließend wurden die unbehandelten, mit 100 ng/ml LPS stimulierten ( 132 ( ) bzw. mit 20 µM SN-50 ( ) und 10 µM MG- ) behandelten, LPS-stimulierten (100 ng/ml) Proben in einer Echt-Zeit-PCR auf die Expressionshöhe von BPI untersucht. Normalisiert wurden die Proben auf konstitutiv exprimiertes PBGD. Die gezeigten Daten stammen aus 3 unabhängigen Experimenten. 3.3.2) MAP-Kinasen haben einen regulierenden Einfluss auf die Transkription von BPI Die Mitogen-Aktivierten Protein Kinasen (MAPK) gehören zu einer Gruppe von Protein-Serin/ Threonin–Kinasen, die durch eine Vielzahl extrazellulärer Stimuli über Phosphorylierung aktiviert werden und so die Signalweiterleitung von der Zelloberfläche zum Nukleus vermitteln. Neben der Aktivierung von NF-κB sind TLRs auch in der Lage, MAPK-Signalkaskaden zu aktivieren und so verschiedene Transkriptionsfaktoren wie Activator Protein-1 (AP-1) zu induzieren. Bei den hier untersuchten Kinasen handelt es sich um die ERK1/ERK2-Kinasen und die p38 Kinase, von denen bereits gezeigt wurde, dass diese nach LPS-Stimulation aktiviert werden (Downey and Han, 1998). Beide können durch Zugabe hochspezifischer - 55 - ERGEBNISSE Inhibitoren (PD 98059 für ERK1/ Erk2 und SB 203580 für p38) blockiert werden (Alessi et al., 1995 & Lee et al., 1994). Auch hier wurden die aus Wildtyp-Mäusen isolierten Granulozyten und DCs eine Stunde vor der Stimulation mit LPS mit den Inhibitoren vorinkubiert. Die Funktionalität der Inhibitoren wurde über eine SDS-PAGE mit anschließendem Immunoblot überprüft. Da die Phosphorylierung der Kinasen bereits in den ersten zehn Minuten nach Stimulation der Zellen einsetzt und nach 30 bis 60 Minuten wieder stoppt, wurden die Wirkungsweise der Inhibitoren mit Phospho-spezifischen Antikörpern 0, 10, 20, 30 und 60 Minuten nach LPS-Stimulation untersucht. Wie in Abbildung 17A & C zu sehen, war die Blockierung der Phosphorylierung durch die eingesetzten Inhibitoren vollständig. Um die gleichmäßige Beladung der Spuren zu dokumentieren (Abb. 17B & D), wurden die Blots durch Behandlung mit einem speziellen Waschpuffer zunächst von den Phopho-spezifischen Antikörpern befreit. Danach wurde ein zweiter Immunoblot mit Antikörpern durchgeführt, die das Gesamt-Protein der Kinasen p38 und ERK1/2 erkennen. Wie die Auswertung der Echt-Zeit-PCR zeigt, war keiner der verwendeten Inhibitoren in der Lage, die Transkription von BPI vollständig zu unterdrücken. Allerdings war bei Einsatz der Inhibitoren eine deutliche Verminderung der BPIExpressionshöhen (Abb. 18), ca. 50% bei Einsatz des p38 Kinase-Inhibitors und etwa 70% bei Inhibierung von ERK1/2, zu erkennen. - 56 - ERGEBNISSE A B 0 10 20 30 60 10 LPS 20 30 60 42 kD 44 kD Anti-active MAPK 42 kD 44 kD Anti-ERK1/2 T[min] LPS + PD 98059 C 43 kD Anti-phosphop38 43 kD Anti-p38 D 0 10 20 30 60 10 LPS 20 30 60 T[min] LPS + SB 203580 Abb. 17: Phosphorylierung der ERK1/2 und p38-Kinasen kann durch spezifische Inhibitoren unterbunden werden 60 µg des Totallysates aus Granulozyten wurden über eine 12% SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mit spezifischen Antikörpern analysiert. A) Wie mit dem Anti-active MAPK-Antikörper gezeigt, erfolgt eine starke Aktivierung von ERK1/2 nach LPS-Stimulation. B) Eine gleichmäßige Beladung der Spuren wurde durch den Anti-ERK1/2-Antikörper nachgewiesen. C) Der mit AntiPhospho-p38 behandelte Immunoblot zeigt eine deutliche Aktivierung der p38-MAPK. D) Die Beladungskontrolle wurde mit einem p38-spezifischen Antikörper durchgeführt. Kopienzahl BPI/ PBGD 10 5 n. d. T[h] 24 12 Abb 18: Die MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 tragen nur teilweise zur Aktivierung der BPITranskription bei Nach Isolation der Gesamt-RNA wurde 1 µg in die cDNA-Synthese eingesetzt. Anschließend wurden die unbehandelten, mit 100 ng/ml LPS stimulierten ( Inhibitors SB 203580 ( ), bzw. zusätzlich mit 10µM des p38- ) und 20 µM des ERK1/2-Inhibitors PD 98059 ( ) behandelten, LPS- stimulierten (100 ng/ml) Proben in einer Echt-Zeit-PCR auf die Expressionshöhe von BPI untersucht. Normalisiert wurden die Proben auf konstitutiv exprimiertes PBGD. Die gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. n.d. = nicht detektierbar. - 57 - ERGEBNISSE Diese Experimente zeigen, dass einzelne MAP-Kinasen zwar keine exklusive Hauptrolle in der Signalkaskade zur Aktivierung der BPI-Transkription spielen, aber einen Einfluss auf die Induktionshöhe der BPI-mRNA nach LPS-Stimulation ausüben. 3.4) Proteinneusynthese ist notwendig für die Hochregulation von BPI nach LPSStimulation Wie bereits unter 3.2) beschrieben, wird die LPS-vermittelte, transkriptionelle Regulation von BPI über den TRIF-abhängigen Signalweg des TLR4 vermittelt. Die Aktivierung von TRIF führt zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF3/7. IRF3/7 transloziert in den Kern und induziert die Transkription von Typ I IFN. Dieses wird daraufhin als de novo synthetisiertes Protein von der Zelle sekretiert und bindet an den zelleigenen Typ I IFN-Rezeptor (autokrine Aktivierung) bzw. den Rezeptor von Nachbarzellen (parakrine Aktivierung). Durch diese Bindung wird in den Zellen Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) -1 phosphoryliert. Phosphoryliertes STAT-1 wiederum induziert als Transkriptionsfaktor weitere Gene, wie z.B. Regulated on Activation, Normal T-Cell Expressed and Secreted (RANTES) und Interferon-gamma-inducible Protein 10 (IP-10). Um zu analysieren, welche Rolle Typ I IFN bei der Regulation von BPI spielen könnte, wurde die Neusynthese von Proteinen in LPS-stimulierten Granulozyten und DCs aus MyD88-Knockouts durch Behandlung mit Cyclohexamid (CHX), einem Hemmer der Proteinneusynthese, unterbunden (Huberman and Riggs, 1968). Die Echt-Zeit-PCR-Auswertung der mRNA-Proben zeigte, dass in den mit CHX behandelten Proben nach LPS-Stimulation keine Regulation der BPI-mRNA mehr erfolgte (Ab. 19). Die Auswertungen der mit DCs durchgeführten Versuche ergaben die gleichen Ergebnisse. Diese Befunde zeigen, dass nach LPS-Stimulation und Aktivierung der TLR4-TRIFSignalachse ein Potein neu synthetisiert werden muss, damit BPI transkriptionell aktiviert wird. Typ I IFN ist ein Kandidatengen, welches über den TLR4-TRIFSchenkel aktiviert und synthetisiert wird. Über die Bindung an den Typ I IFN- 58 - ERGEBNISSE Rezeptor werden dann in einer zweiten Signalkaskade Typ I IFN-abhängige Gene transkribiert. Daher wurden Granulozyten aus Mäusen, die für den Typ I IFNRezeptor defizient sind (IFNAR-Mäuse) isoliert, mit LPS stimuliert und untersucht. Die Analyse der IFNAR-Mäuse zeigte, dass Typ I IFN nicht notwendig für die LPSvermittelte Induktion von BPI ist (Ab. 19). Kopienzahl BPI/ PBGD 10 5 n. d. T[h] 12 24 Abb. 19: Ein de novo synthetisiertes Protein wird zur Aktivierung der BPI-Transkription benötigt 1 µg Gesamt-RNA wurde nach Isolation in die cDNA-Synthese eingesetzt. Anschließend wurden sowohl die mit LPS stimulierten ( ) und die zusätzlich mit CHX-behandelten ( ) Granulozyten aus MyD88 -/- Mäusen als auch die mit LPS-stimulierten Granulozyten aus IFNAR-Mäusen ( ) mittels einer BPI-spezifischen Echt-Zeit-PCR analysiert. Als Bezugsgen zur Normalisierung diente PBGD. Die gezeigten Daten wurden in drei unabhängigen Experimenten ermittelt. n.d.= nicht detektierbar. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass ein noch unbekanntes, nach LPSStimulation de novo synthetisiertes Protein in die Signalvermittlung der Regulation von BPI involviert ist. Jedoch spielt Typ I IFN keine Rolle in der LPS-vermittelten Regulation von BPI. 3.5) Enbrel, ein löslicher TNF-Rezeptor, blockiert die Induktion von BPI TNF ist ein proinflammatorisches Zytokin, dass sowohl während der Immunabwehr als auch bei verschiedenen Krankheiten, wie z.B. der Arthrose und bei der Sepsis, nach Überproduktion eine Rolle spielt. Eine LPS-vermittelte Induktion und Neusynthese von TNF kann über den TRIF-abhängigen Signalweg unter Verwendung der oben untersuchten MAP-Kinasen vermittelt werden (Covert et al., 2005). - 59 - ERGEBNISSE Zur Analyse der Rolle von TNF in der LPS-vermittelten Regulation von murinem BPI, wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt. Zum einen wurden aus TNFKnockout-Mäusen isolierte Granulozyten untersucht, zum anderen wurden WildtypGranulozyten mit Enbrel behandelt. Bei Etanercept, Handelsname Enbrel, handelt es sich um ein seit etwa 2000 in Deutschland zugelassenes Medikament zur Behandlung verschiedenster arthritischer Erkrankungsformen. Ein Merkmal von an Arthritis leidenden Patienten ist, dass das proinflammatorische Zytokin TNF in den betroffenen Gelenken stark erhöht ist und die dadurch hervorgerufene chronische Entzündung eine der Hauptursachen der rheumatischen Gelenkzerstörung darstellt (Harris et al., 2001). Um diese Zerstörung zu verhindern, wurden Substanzen entwickelt, die in der Lage sind, TNF zu neutralisieren. Enbrel ist ein löslicher TNF−Rezeptor, der mit dem zirkulierenden TNF einen Komplex bildet, der nicht mehr von zellständigen TNF−Rezeptoren in den Gelenken erkannt werden kann (Mease, 2002). Die aus TNF-Knockout-Mäusen isolierten Granulozyten bzw. die mit Enbrel behandelten Wildtyp-Granulozyten wurden mit LPS stimuliert und anschließend anlaysiert. Zunächst wurden die Kulturüberstände nach LPS-Stimulation mittels eines TNFELISA’s überprüft. Dabei bestätigte sich zum einen die Wirksamkeit des löslichen Rezeptors, zum anderen wurde der Knockout-Phänotyp der TNF-defizienten Mäuse bestätigt (Abb. 20). Eine Analyse der iNOS-Akitivtät in den Kulturüberständen zeigte aber keinen Unterschied in der Stärke der Stimulation (Daten nicht gezeigt). TNF [pg/ml] 2000 1500 1000 500 n.d. n.d. n.d. 0 T[h] 12 24 Abb. 20: TNF-Freisetzung nur bei unbehandelten, mit LPS stimulierten Granulozyten von Wildtyp-Mäusen. Die Kulturüberstände der mit LPS-stimulierten, unbehandelten Granulozyten aus Wildtyp-Mäusen ( ) und TNF -/- -Mäuse ( ) und der zusätzlich mit Enbrel behandelten Wildtyp-Granulozyten ( ) wurden in einem TNF-ELISA analysiert. Die gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. n.d. = nicht detektierbar. - 60 - ERGEBNISSE Obwohl die Knockout-Mäuse keinen zu den Wildtyp-Mäusen abweichenden Phänotyp zeigten, waren die mit Enbrel behandelten Mäuse nicht mehr in der Lage, eine transkriptionelle Aktivierung von BPI nach Stimulation mit LPS zu vermitteln (Ab. 21). Kopienzahl BPI/ PBGD 6 4 2 T[h] 12 24 Abb. 21: In mit Enbrel behandelten Granulozyten erfolgte keine Induktion der BPI-mRNA Nachdem 1 µg der Gesamt-RNA in cDNA umgeschrieben wurde, erfolgte eine Analyse der Proben mittels Echt-Zeit-PCR. Normalisiert wurden die Proben der mit 100 ng/ml LPS stimulierten Wildtyp( ) und TNF-/--Granulozyten ( ) und der zusätzlich mit 25 µg/ml Enbrel behandelten, LPS- stimulierten Wildtyp-Granulozyten ( ) auf das Haushaltsgen PBGD. Die hier gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Dass mit Enbrel behandelte Granulozyten nicht mehr in der sind Lage sind, nach LPS-Stimulation eine Hochregulation der BPI-mRNA zu vermitteln, könnte daran liegen, dass Enbrel nicht nur TNF neutralisiert, sondern auch das dem TNF in seiner 3D-Struktur sehr ähnliche Lymphotoxin α (LT-α). LT-α ist ein lösliches, von aktivierten Lymphozyten sekretiertes Protein, welches die gleichen Rezeptoren wie TNF verwendet (Aggarwal et al., 1985). Es wird angenommen, dass LT-α eine Rolle in der Modulation von Immunantworten spielt (Lund et al., 2002 & McDevitt et al., 2004). 4) Bakterien regulieren BPI Nachdem gezeigt wurde, dass isolierte, aufgereinigte TLR-Liganden in der Lage sind, die Transkription von BPI zu induzieren, sollte nun die Frage geklärt werden, ob auch komplette Bakterien in der Lage sind, eine Induktion von BPI zu vermitteln. - 61 - ERGEBNISSE 4.1) UV-inaktivierte, gramnegative Bakterien induzieren BPI Erste Versuche wurden mit gramnegativen Escherichia coli und Salmonella typhimurium und grampositiven Staphylocoocus aureus durchgeführt. Nach UVInaktivierung wurden die aus der Diagnostik-Stammsammlung der klinischen Mikrobiologie stammenden Bakterien zur Stimulation von Granulozyten verwendet. Da UV-inaktivierte Bakterien nicht mehr in der Lage sind, sich zu replizieren, erlaubt dies auf der einen Seite gleiche Stimulationsbedingungen für alle Bakterienspezies, auf der anderen Seite jedoch benötigt man eine relativ hohe multiplicity of infection (MOI, also Zahl der Bakterien pro Zelle) für eine gute Stimulierung. Nach Durchführung eines TNF-ELISAs mit den Kulturüberständen konnte gezeigt werden, dass UV-inaktivierte Bakterien in der eingesetzten Menge von 100 bzw. 75 Bakterien pro Granulozyt (MOI 100 bzw. 75) diese Zellen stark stimulierten. Da bereits eine MOI von 75 ausreichte, eine starke Stimulation der Granulozyten zu vermitteln (Abb. 22), wurde diese für die folgenden Experimente eingesetzt. 2000 TNF [pg/ml] 1500 1000 500 0 T [h] 6 12 24 Abb. 22: TNF-Freisetzung durch UV-inaktivierte Bakterien Nach Stimulation von Granulozyten mit UV-inaktivierten E. coli ( ), Salmonellen ( ) und Staphylococcen ( ) in einer MOI von 75 und 100 ng/ml LPS als Kontrolle ( ) wurde die TNFKonzentration in den Kulturüberständen durch einen spezifischen ELISA bestimmt. Daraufhin wurden die Proben in einer Echt-Zeit-PCR analysiert. Wie in Abbildung 23 zu sehen, waren es vor allem die gramnegativen Bakterien, die eine Hochregulation der BPI-mRNA auslösten, wobei Escherichia coli die stärkste - 62 - ERGEBNISSE Induktion der BPI-mRNA bereits nach 6 Stunden vermittelte. Salmonella und LPS waren in der Kinetik und Ausprägung der Induktion vergleichbar, während die grampositiven Staphylococcen keine Induktion der BPI-mRNA vermitteln konnten. 8 Kopienzahl BPI/PBGD 6 4 2 n.d. T [h] n.d. n.d . 6 12 n.d. 24 Abb. 23: Induktion der BPI-mRNA wird nur durch gramnegative Bakterienspezies vermittelt Nach Aufarbeitung der bei einer MOI von 75 mit UV-behandelten E.coli ( ), Salmonella ( ) und Staphylococcen ( ) stimulierten Proben wurden diese mittels Echt-Zeit-PCR analysiert. Zur Normalisierung der Proben wurde die Expression von PBGD bestimmt. Als Kontrolle dienten mit LPS ( ) stimulierte Granulozyten. Die gezeigten Daten wurden in drei unabhängigen Experimenten ermittelt. n.d. = nicht detektierbar. 4.2) Auch grampositive, nicht UV-inaktivierte Bakterien können die BPITranskription aktivieren Inwieweit lebende Bakterien in der Lage sind, eine Aktivierung der BPITranskription auszulösen, sollte in weiteren Versuchen geklärt werden. Des Weiteren wurde überprüft, ob die Aktivierbarkeit der transkriptionellen Regulation von BPI von der Zellwandstruktur der Bakterien abhängt. Ob die eingesetzte MOI 10 der Bakterien eine gute Stimulation der Granulozyten auslöste, wurde über die Sezernierung von TNF in die Kulturüberstände überprüft. Wie in Abbildung 24 dargestellt, waren sowohl die gramnegativen (E. coli, S. typhimurium, und P. aeruginosa) als auch die grampositiven (Staphylococcus aureus und Streptococcus agalactiae) Bakterienspezies in der verwendeten MOI in der Lage, Granulozyten zu aktivieren. - 63 - ERGEBNISSE 2400 TNF [pg/ml] 1800 1200 600 0 T [h] 6 12 24 Abb. 24: TNF-Freisetzung durch Bakterien Nach Stimulation von Granulozyten mit proliferierenden E. coli ( ), Salmonellen ( ), Pseudomonas ( ), Staphylococcen ( ) und B-Streptococcen ( ) in einer MOI von 10 und 100 ng/ml LPS als Kontrolle ( ) wurde die TNF-Konzentration in den Kulturüberständen durch einen spezifischen ELISA bestimmt. Die Auswertung der Echt-Zeit-PCR (Abb. 25) zeigt, dass alle getesteten gramnegativen Bakterien, außer Pseudomonas aeroguinosa, die Transkription von BPI induzierten. Die Induktion der BPI-mRNA durch Escherichia coli setzte bereits nach 12 Stunden ein und war etwa zweifach höher als die LPS-vermittelte Induktion zu diesem Zeitpunkt. Nach 24 Stunden, als die durch LPS vermittelte Hochregulation der BPI-mRNA am höchsten war, ging die durch Escherichia coli ausgelöste Induktion wieder stark zurück. Der Verlauf der BPI-Transkription nach Stimulation der Granulozyten mit Salmonella typhimurium war mit dem nach LPSStimulation vergleichbar. Pseudomonas aeroguinosa dagegen war nicht in der Lage, eine Hochregulation von BPI auszulösen, was evtl. an den gegenüber anderen gramnegativen Bakterienspezies modifizierten LPS-Strukturen liegen kann (Ernst et al., 2003). Etwas überraschend war die Tatsache, dass lebende Streptocoocen der Gruppe B, wie z. B. der hier verwendete Streptococcus agalactiae, ebenfalls in der Lage sind, eine Induktion der BPI-mRNA auszulösen (Abb. 25.), die allerdings schwächer ist als mit LPS oder gramnegativen Bakterien. - 64 - ERGEBNISSE 8 Kopienzahl BPI/PBGD 6 4 2 n.d. T [h] n.d. n.d. 6 n.d. n.d. 12 n.d. 24 Abb. 25: Induktion der BPI-mNRA durch lebende Bakterien Nach Stimulation der Granulozyten mit lebenden E. coli ( Staphylococcen ( ( ) und B-Streptocoocen ( ), Salmonellen ( ), Pseudomonas ( ), ) in einer MOI von 10 und 100 ng/ml LPS als Kontrolle ) wurde je 1 µg Gesamt-RNA in cDNA umgeschrieben. Darauf folgte eine Analyse mittels BPI- spezifischer Echt-Zeit-PCR. Um eine Normalisierung der Proben zu ermöglichen, erfolgte eine zweite, PBGD-spezifische Echt-Zeit-PCR. Die gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. n.d. = nicht detektierbar. Die transkriptionelle Regulation von BPI ist nicht nur auf die Stimulation mit LPS und gramnegativen Bakterien beschränkt. Auch bestimmte grampositive Bakterien (Gruppe B-Streptococcen) aktivieren die Transkription von BPI. Diese Ergebnisse stimmen mit den Resultaten, die mit isolierten TLR-Liganden erhoben wurden, überein. Wie unter Absatz 2.1 beschrieben und in Abbildung 4B dargestellt, waren verschiedene TLR-Liganden neben LPS auch unabhängig von TLR4 in der Lage, eine Induktion der BPI-Transkription zu vermitteln. - 65 - ERGEBNISSE C) Funktionsanalysen Um zu untersuchen, welche biologische Funktionen murines BPI hat, wurden verschiedene Expressionskonstrukte von Maus-BPI kloniert. 1) Verschiedene Expressionskonstrukte von muBPI Zuerst wurde die für murines BPI codierende cDNA, mit Hilfe einer korrekturlesenden Polymerase, aus LPS-stimulierten Granulozyten amplifiziert. Da es für murines BPI keine Antikörper zur Detektion des Proteins gab, wurde zunächst ein Fusionskonstrukt mit einem humanen IgG1/Fc-Anteil am C-terminalen Ende von murinem BPI hergestellt (muBPI-huIgG1/Fc). Dieses Konstrukt wurde in einen geeigneten Vektor kloniert, der die Expression in eukaryontischen Zellen ermöglicht. Der Vektor verfügte zusätzlich über eine Hygromycin-ResistenzKassette, um stabile Transfektanten zu isolieren. Überprüft wurde das fertige Konstrukt mittels Sequenzierung. Um zu testen, ob das Konstrukt auch zu einer Expression des Proteins führt, wurden 293 HEK-Zellen transient mit dem muBPI-huIgG1/Fc-Konstrukt transfiziert. Der Expressionsnachweis des Proteins in den Zelllysaten bzw. den Überständen erfolgte 48 Stunden nach Transfektion der Zellen über einen Immunoblot gegen den humanen Ig-Teil des Fusionskonstruktes. Das in den Überstand sekretierte Protein wurde mittels Immunpräzipitation durch Bindung des huIgG1/Fc-Anteils an eine Protein A/G-Matrix gereinigt und anschließend im Immunoblot analysiert. Die tatsächliche Größe von ca. 95kDa des exprimierten Proteins liegt etwas oberhalb der über die lineare Aminosäuresequenz berechneten Proteingröße von etwa 85kDa, die sich aus den 55kDa des BPI-Proteins und den ca. 30kDa des huIgG1/Fc –Anteils ergibt. Die Ursache für die leichte Abweichung des Proteins von der errechneten Größe könnte an der Prozessierung und Glykosilierung des murinen Proteins durch die für die Expression verwendeten Zellen liegen. Allerdings verblieb bei diesem Konstrukt der Grossteil des gebildeten Proteins im Zelllysat und wurde nicht in den Überstand sekretiert (Abb. 26A). Diese Experimente verdeutlichen, dass die BPI-eigene Leadersequenz in den verwendeten Zellen nicht zur primären Sekretion des Proteins führt. Deshalb wurde - 66 - ERGEBNISSE ein zweites BPI-Expressionskonstrukt kloniert, bei dem die BPI-eigene Leadersequenz mit der Sequenz des Leaders der schweren Kappakette von Immunglobulin ausgetauscht wurde. Diese Sequenz dient als Signal zu Sekretion des Proteins. Auch hier entstand ein Fusionskonstrukt mit einem humanen IgG1/Fc-Marker (IgκBPI-huIgG1/Fc). Wie in Abbildung 26B dargestellt, ist mit diesem Konstrukt eine gute Sekretion des Proteins in den Überstand gewährleistet. A B Überstand Überstand 95kDa 95 kDa Lysat Lysat 95kDa 95 kDa Abb. 26: Verbesserte Sekretion des BPI-Proteins durch die Leadersequenz der schweren Kappakette von Immunglobulin 75 µg des Zelllysates und 1 ml des aufgereingten Überstandes der Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion auf ein SDS-Gel aufgetragen. Der Nachweis des A) muBPI-huIgG1/Fc-Konstruktes bzw. des B) IgκBPI-huIgG1/Fc-Konstruktes erfolgte durch einen Immunoblot mit einem gegen den huIgG1/Fc-Anteil des Proteins gerichteten Antikörper. Beide BPI-Konstrukte lassen sich exprimieren, wobei das mit der Sequenz der schweren Kappakette von Immunglobulin versehene BPI-Konstrukt IgκBPIhuIgG1/Fc, wie erwartet, deutlich besser in den Überstand sekretiert wird. 2.) LPS -Neutralisierende Wirkung von mu BPI 2.1) Transiente Transfektionen von 293T-Zellen Zur Untersuchung der LPS-neutralisierenden Fähigkeiten von murinem BPI wurden 293T-Zellen, die weder BPI noch den LPS-Rezeptorkomplex (TLR4, CD14 und MD2) endogen exprimieren, verwendet. Bei 293T-Zellen handelt es sich um eine - 67 - ERGEBNISSE humane Nierenepithelzelllinie, die bereits stabil mit dem Large T-Antigen des Simian Virus 40 (SV40) transfiziert wurde. Diese Behandlung ermöglicht es den Zellen, Fremd-DNA sehr effizient aufzunehmen, zu stabilisieren und sie undegradiert im Zellinneren zu halten. Diese Zellen wurden zunächst mit dem LPS-Rezeptorkomplex, bestehend aus TLR4, MD-2 und CD14 und einem NF-κB-Luciferase-Reporter mittels Lipofectamin transient transfiziert und mit LPS stimuliert. Die durch LPS vermittelte Aktivierung von NF-κB wurde über die Produktion von Luciferase durch das unter der Kontrolle des NF-κB-Promotors stehenden Luciferasegens bestimmt. Um die LPSneutralisierende Wirkung von BPI zu untersuchen, wurden die Zellen zusätzlich mit IgκBPI-huIgG1/Fc in zwei unterschiedlichen experimentellen Ansätzen transfiziert. 2.2) Murines BPI neutralisiert LPS dosisabhängig Im ersten Ansatz sollte untersucht werden, ob murines BPI konzentrationsabhängig in der Lage ist, die über LPS-TLR4 vermittelte Aktivierung von NF-κB zu hemmen. Dafür wurden die 293T-Zellen neben dem LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD-2) und dem NF-κB-Reporter zusätzlich mit verschiedenen Konzentrationen (500 ng –100 ng) des in den Überstand sekretierenden murinen BPI-Konstruktes (IgκBPI-huIgG1/Fc) ko-transfiziert. Die Stimulation der Zellen erfolgte mit einer gleichbleibenden LPS-Konzentration von 10 ng/ml. Wie in Abbildung 27A zu erkennen, ist murines BPI in der Lage, LPS dosisabhängig zu neutralisieren. Ist zu wenig BPI im System, hebt sich die inhibierende Wirkung des Proteins auf. - 68 - ERGEBNISSE A) B * 8 X-fache Induktion von NF-κ κB X-fache Induktion von NF-κ κB 8 6 4 * 2 ** ** BPI LPS C 6 4 2 BPI + + + + + CD4/TLR4 D 95 kDa BPI BPI 500ng - + Abb. 27: BPI neutralisiert LPS spezifisch und dosisabhängig 293T-Zellen wurden mit einem NF-κB-Reporter und dem LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD2), (A) bzw. einem konstitutiv-aktiven TLR4-Konstrukt (CD4/TLR4) (B) transient transfiziert. Kotransfiziert wurden die Zellen mit absteigenden Mengen von IgκBPI-huIgG1/Fc (500, 400, 200, 100 ng/ml). A) 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen, die mit dem LPS-Rezeptorkomplex transfiziert wurden, mit LPS (10 ng/ml) stimuliert oder unstimuliert belassen. 16 Stunden nach Stimulation wurden die Zellen lysiert und die Aktivität der Luciferase im Luminometer bestimmt. *, p < 0,05; ** p < 0,005, bestimmt durch einen Student’s t-Test. Zur Kontrolle der Expression von murinem BPI wurden die Kulturüberstände mit Protein A/GAgarose Beads aufgereinigt. Die Proben wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblot analysiert. Gezeigt werden die mit TLR4 und BPI in absteigender Menge (500, 400, 200 und 100 ng) ko-transfizierten Proben (C) und die CD4/TLR4 Kontrollen, ko-transfiziert mit 500 ng BPI (D). Als Kontrolle (-) dienten Zellen, die nicht mit BPI transfiziert wurden. Um nachzuweisen, dass die Hemmung der NF-κB-Aktivierung durch LPS spezifisch ist, wurde eine konstitutiv-aktive TLR4-Variante (CD4/TLR4), bestehend aus der extrazellulären Ig-Domäne von CD4 und der intrazellulären TLR4 Domäne, als Kontrolle verwendet. Transfiziert man Zellen gleichzeitig mit diesem Konstrukt und dem NF-κB-Reporter, aktiviert CD4/TLR4 den NF-κB-Reporter Ligand- - 69 - ERGEBNISSE unabhängig (Abb. 27B). Ko-transfiziert man CD4/TLR4 und den NF-κB-Reporter zusammen mit den LPS-inhibierenden Konzentrationen von murinem BPI, zeigt sich, dass murines BPI keinerlei Einfluss auf die CD4/TLR4 vermittelte Aktivierung von NF-κB hat. (Abb. 27B) Zur Überprüfung der BPI-Proteinexpression in die Zellkulturüberstände nach Transfektion wurde das IgκBPI-huIgG1/Fc-Fusionsprotein über Immunpräzipitaion mit Protein A/G-Agarose Beads aus den Versuchsansätzen aufgereinigt und anschließend im Immunoblot analysiert. Wie in Abbildung 27C zu erkennen ist, korreliert der Anteil des in den Überstand sekretierten Proteins mit dem Grad der Inhibierung der LPS- vermittelten Aktivierung von NF-κB. 2.3) Die neutralisierende Wirkung von BPI auf LPS kann aufgehoben werden Im zweiten Versuchsaufbau sollte geklärt werden, wie effektiv muBPI LPS neutralisieren kann. Hierfür wurden die Zellen mit dem LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD-2), dem NF-κB-Reporter und mit 500 ng IgκBPI-huIgG1/Fc kotransfizert. Die Stimulation der transfizierten Zellen erfolgte mit LPS- Konzentrationen zwischen 1 µg/ml und 10 fg/ml. Wie in Abbildung 28A deutlich zu erkennen, ist BPI in der Lage, die, durch niedrige LPS-Konzentrationen, verursachte Aktivierung von NF-κB völlig zu unterdrücken. LPS in hohen Dosen hingegen kann von BPI nicht mehr vollständig neutralisiert werden und löst so eine Aktivierung von NF-κB aus. Ebenso konnte die Hemmung der LPS-vermittelten NF-κB-Aktivierung durch BPI auch auf Ebene der Zytokinproduktion nachgewiesen werden. 293T Zellen sind in der Lage, nach Transfektion mit dem LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD-2) auf die Stimulation mit LPS mit der Produktion von humanem Interleukin 8 (IL-8) zu reagieren und dieses in den Überstand zu sekretieren. Mittels IL-8 ELISA konnte nachgewiesen werden, dass bei Ko-Transfektion der Zellen mit dem LPSRezeptorkomplex und muBPI die LPS-induzierte Produktion von IL-8 inhibiert wird und dessen Sekretion in den Zellüberstand abnimmt (Abb. 28 B). - 70 - ERGEBNISSE A X-fache Induktion von NF-κ κB 8 6 4 ** ** * ** 2 * LPS B IL-8 [pg/ml] 800 600 ** 400 200 ** LPS Abb. 28: BPI inhibiert die LPS vermittelte Aktivierung von Zellen sowohl auf NF-κ κB-Ebene als auch auf Ebene der IL-8-Freisetzung A) 293T-Zellen wurden mit dem NF-κB-Reporter, dem LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD-2) ( ) und 500ng des BPI-Konstruktes IgκBPI-huIgG1/Fc ( ) transfiziert und anschließend in Anwesenheit oder Abwesenheit absteigender LPS-Konzentrationen (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 10 pg/ml und 10 fg/ml) stimuliert. Die Stimulation erfolgte 24 Stunden nach Transfektion. Die Luciferaseaktivität in den Zelllysaten wurde 16 Stunden nach Stimulation im Luminometer bestimmt. B) Die Sekretion von IL-8 in den Kulturüberständen wurde durch einen spezifischen ELISA bestimmt. Gezeigt sind die LPS-Konzentrationen 100 ng/ml, 10 ng/ml, 10 pg/ml und 10 fg/ml. Als Kontrolle wurde der Kulturüberstand CD4/TLR4 -transfizierter ( ) Zellen verwendet. *, p < 0,05; **p < 0,005, bestimmt durch einen Student’s t-Test. 2.4) Murines BPI neutralisiert LPS genauso effektiv wie humanes BPI Ebenfalls interessant war die Frage, welchen Wirkungsgrad muBPI in seiner LPSneutralisierenden Funktion im Vergleich zum gut charakterisierten humanen BPI aufweist. Zur Klärung dieser Frage wurde zunächst ein Fusionskonstrukt aus huBPI mit huIgG1/Fc-Anteil und der Signalsequenz der Kappakette von Immunglobulin - 71 - ERGEBNISSE (Igκ-huBP-huIgG1/Fc) kloniert. So entstand ein humanes Fusionsprotein, welches mit dem verwendeten murinen BPI-Konstrukt IgκBPI-huIgG1/Fc vergleichbar war. Analysiert wurden die beide Proteine wie im unter 2.2 bereits beschriebenen Versuchsaufbau, d.h. 293T-Zellen wurden neben dem LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD-2) und dem NF-κB-Luciferase–Reporter mit unterschiedlichen Konzentration der jeweiligen BPI-Konstrukte ko-transfiziert. Stimuliert wurden die Zellen mit einer konstanten LPS-Konzentration von 10 ng/ml. Hier zeigte sich, dass murines und humanes BPI eine ähnlich hohe Fähigkeit aufweisen, LPS zu neutralisieren (Abb. 29A). Zur Überprüfung der Proteinexpression der beiden Konstrukte wurden die Überstände der Transfektionen mit Protein A/G-Agarose Beads inkubiert und über eine SDS-PAGE auf die Expression im Immunoblot untersucht. Wie in Abbildung 29B zu erkennen, ist die in den Überstand sekretierte Menge an muBPI und huBPI in etwa vergleichbar. In dem untersuchten System sind beide BPI-Proteine, ob murinen oder humanen Ursprungs, sowohl in Bezug auf Expressionshöhe als auch in ihrer biologischen Wirkung gegen LPS vergleichbar. - 72 - ERGEBNISSE A X-fache Induktion von NF-κ κB 10 8 6 4 2 BPI 500 ng LPS - + + + + + TLR4 CD4/TLR4 B 95 kDa huBPI mBPI Abb.29 : Humanes und murines BPI haben vergleichbare LPS-neutralisierende Eigenschaften A) Mit NF-κB-Reporter und LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD-2) transfizierte 293T –Zellen ( ) wurden mit absteigenden Konzentrationen (500 ng, 400 ng, 200 ng und 100 ng) der Expressionskonstrukte des murinen ( ) bzw. humanen ( ) BPI-Proteins ko-transfiziert und 24 Sunden nach Transfektion mit 10 ng/ml LPS stimuliert. Die Luciferaseaktivität in den Zelllysaten wurde 16 Stunden nach Stimulation im Luminometer bestimmt. Als Kontrolle dienten Zellen, die mit dem konstitutiv aktiven CD4/TLR4 ( ) ko-transfiziert wurden. B) Die vergleichbare Sekretion des murinen und humanen BPI-Proteins in die Kulturüberstände wurde durch einen Immunoblot überprüft. 1 ml der Überstände der mit 500 ng, 400 ng bzw. 100 ng des jeweiligen Proteins transfizierten Zellen wurde mit Protein A/G-Agarose Beads aufgereinigt. Die Proben wurden über eine SDS-PAGE aufgetrennt und mit einem gegen den huIgG1/Fc-Anteil der Proteine gerichteten Antikörper detektiert. Als Kontrolle (-) dienten untransfizierte Zellen. 2.5) Vor allem extrazelluläres BPI neutralisiert LPS In diesem Versuch sollte die Frage geklärt werde, ob sich intrazelluläres und in den Überstand sekretiertes, extrazelluläres BPI in ihrer Fähigkeit, LPS zu neutralisieren, unterscheiden. - 73 - ERGEBNISSE RAW-Makrophagen, die kein endogenes BPI, aber fast alle TLR-Rezeptoren exprimieren und bereits den NF-κB-Luciferase–Reporter exprimieren (RAWκB), wurden mit den beiden unter 2.2 beschriebenen muBPI-Expressionskonstrukten stabil transfiziert. Nach zweiwöchiger Selektion mit Hygromycin-B wurden die Klone geerntet und über einen gegen den huIgG1/Fc –Anteil gerichteten Immunoblot auf die Expression von muBPI überprüft. Dabei entstanden zwei neue Zelllinien: 1) Der größte Anteil des BPI-Proteins verblieb durch den Erhalt der eigenen Leadersequenz intrazellulär (RAWκB-BPI-huIgG1/Fc) oder, 2.) durch das Ersetzen der Leadersequenz von BPI mit der Sequenz der schweren Kappakette von Immunglobulin wurde BPI in den Überstand sekretiert (RAWκB-IgκBPI-huIgG1/Fc). X-fache Induktion von NF-κ κB 24 18 12 6 LPS Abb. 30: Extrazelluläres BPI hat bessere LPS-neutralisierende Eigenschaften RAW 267.4 Zellen, die bereits den NF-κB-Reporter exprimierten ( ), wurden stabil mit BPIhuIgG1/Fc ( ) bzw. mit IgκBPI-huIgG1/Fc ( ) ko-transfiziert. Die Zellen wurden mit absteigenden LPS-Konzentrationen (1 µg/ml, 500 ng/nl, 1 ng/ml, 500 pg/ml) über einen Zeitraum von 16 Stunden stimuliert. Anschließend wurde die Luciferaseaktivität in den Zelllysaten durch Messung im Luminometer bestimmt. Die hier gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Sowohl die maternale Zelllinie als auch die beiden neu entstandenen Linien wurden nun mit LPS stimuliert. Wie deutlich zu sehen ist (Abb. 30), neutralisierten die Zellen LPS am besten, die BPI verstärkt in den Zellüberstand sekretierten. In den Überstand sekretiertes BPI ist also fähig, LPS zu neutralisieren, bevor es mit dem LPS-Rezeptorkomplex (TLR4/ CD14/ MD-2) in Kontakt kommt. Vermutlich geschieht das durch Verdecken der Lipid A-Strukturen von LPS. - 74 - ERGEBNISSE 2.6) Murines BPI inhibiert selektiv die Aktivierung von NF-κB Nachdem gezeigt wurde, dass in den Zellüberstand sekretiertes BPI LPS besser neutralisierte, sollte nun die Selektivität dieses Prozesses untersucht werden. Dazu wurde die Zellinie, die BPI in den Überstand sekretierte (RAW-κB-muBPIpSecTag), im folgenden Experiment sowohl mit LPS als auch mit poly I:C, einem TLR3 Liganden, stimuliert. Die Analyse der NF-κB-Aktivierung mit Hilfe des durchgeführten Luciferase-Reportertests zeigte, dass nur die von LPS ausgelöste Aktivierung von NF-κB inhibiert werden konnte. Die poly I:C vermittelte NF-κBAktivierung wurde vom sekretierten BPI nicht beeinflusst (Ab. 31). X-fache Induktion von NF-κ κB A 8 6 4 2 LPS B X-fache Induktion von NF-κ κB 4 3 2 1 poly I:C Abb. 31: Spezifische Hemmung der LPS-vermittelten NFκ κB-Aktivierung durch BPI Sowohl die parentale ( ) als auch die mit BPI ko-transfizierte Zelllinie ( ) wurden mit absteigenden Mengen an A) LPS (200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml, 100 fg/ml, 50 fg/ml) und B) poly I:C (1 µg/ml, 0,5 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,125 µg/ml) stimuliert. Nach Lyse der Zellen wurde die Luciferaseaktivität im Luminometer bestimmt. - 75 - ERGEBNISSE 3) Murines BPI inhibiert das intrazelluläre Wachstum von Salmonella typhimurium Alle bisherigen Ergebnisse zeigen, dass murines BPI selektiv isoliertes LPS neutralisieren kann. In diesem experimentellen Ansatz sollte nun getestet werden, ob es auch gramnegative Bakterien in deren Wachstum oder Aktivität beeinflussen kann. Die Annahme, dass sich mit murinem BPI transfizierte RAW-Makrophagen gegen eine Infektion mit gramnegativen Bakterien als resistenter erweisen, wurde über einen Gentamycin-Schutz-Test untersucht. Dabei werden Makrophagen zunächst mit Salmonella typhimurium, einem intrazellulär replizierenden gramnegativen Bakterium, infiziert. Nach 25minütiger Infektion werden die extrazellulär verbliebenen Bakterien mit Gentamycin abgetötet und die Makrophagen für weitere 2 bzw. 16 Stunden inkubiert. Da es sich hier um intrazellulär replizierende Bakterien handelt, wurden für diesen Versuch Makrophagen gewählt, die mit dem BPIKonstrukt, welches den eigenen Leader trägt, stabil transfiziert wurden (RAW-κBmuBPI). Bei diesem Konstrukt verbleibt der größte Anteil des gebildeten BPIProteins im Zellinneren (Abb. 32A). Dies sollte die Möglichkeit der Interaktion zwischen dem intrazellulär replizierenden Salmonellen mit murinem BPI erhöhen. Sowohl die murines BPI exprimierenden, als auch die Elternzelllinie wurden mit Salmonella typhimurium infiziert und, nach Abtöten der extrazellulär verbliebenen Salmonellen, für 2 und 16 Stunden inkubiert. Nach Waschen und Lysieren der Makrophagen wurden die Zelllysate in verschiedenen Verdünnungsstufen auf Müller-Hinton (MH)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Auszählung der Platten aus drei verschiedenen Experimenten zeigte nach 2 Stunden keinen Unterschied in der Anzahl der gewachsenen Kolonien (Colony Forming Units, CFUs) (Abb. 32B). Das lässt darauf schließen, dass BPI keinen Einfluss auf die Infektionsrate durch Salmonella hat und auch deren Vitalität in den ersten Stunden der Infektion durch BPI nicht beeinflusst wird. Die Auswertung nach 16 Stunden hingegen zeigte starke Unterschiede in der Bakterienzahl. Offensichtlich waren die stabil murines BPI exprimierenden Zellen in der Lage, die intrazelluläre Replikation von Salmonella typhimurium zu inhibieren oder zumindest stark zu verlangsamen (Abb. 32B). Da die aufgenommen Menge der Bakterien nach zwei Stunden vergleichbar war, ist dieser Effekt vermutlich nicht auf Unterschiede in der jeweiligen Phagozytoserate zurückzuführen. - 76 - ERGEBNISSE A B 6 Überstände 4 5 CFUs / 6x10 Zellen Lysate - + - + * 2 0 T [h] 2 16 Abb. 32: Intrazelluläres BPI verhindert das Wachstum intrazellulär replizierender Bakterien A) RAW 267.4 Zellen wurden stabil mit dem BPI-huIgG1/Fc transfiziert. Die Expression des Proteins wurde durch Analyse der Zelllysate und des mit Protein A/G-Agarose Beads inkubierten Überstands mittels Immunoblot dokumentiert. B) Die parentale ( ) und die BPI-exprimierende ( ) Zelllinie wurden jeweils mit Salmonella typhimurium (MOI 10) infiziert. Nachdem extrazelluläre Bakterien abgetötet wurden, erfolgte eine Inkubationsphase von 2 bzw. 16 Stunden. Danach wurden Zelllysate hergestellt und serielle Verdünnungen des Zelllysates auf MH-Platten ausgestrichen. Die intrazelluläre Replikation wurde als Anzahl koloniebildender Bakterien (Colony Forming Units, CFUs) 2 und 16 Stunden nach Infektion aufgetragen. Die Daten wurden in drei unabhängigen Experimenten ermittelt.*, p < 0,05. Durch den Nachweis der mitochondrialen Dehydrogenase-Aktivität wurde die Soffwechselleistung der beiden Zelllinien (BPI-Exprimierer und die parentale Zelllinie) und damit ihre Vitalität verglichen. Dies sollte veranschaulichen, dass die beobachteten Unterschiede der intrazellulären Replikation der Bakterien nicht auf die ektopische Expression von murinem BPI zurückzuführen sind. Zwischen beiden Zellen waren keine Unterschiede in ihrer Vitalität zu detektieren (Daten nicht gezeigt), die für den beobachteten Effekt verantwortlich sein könnten. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass murines BPI in der Lage ist, intrazellulär replizierende Bakterien wie Salmonella typhimurium in ihrem Wachstum zu hemmen. - 77 - ERGEBNISSE 4) Die Hemmung des intrazellulären Wachstums könnte auf eine direkte Interaktion zwischen BPI und Salmonella typhimurium zurückzuführen sein Die Annahme, dass murines BPI direkt mit den Bakterien interagiert, wurde über die konfokale Lasermikroskopie untersucht. Dafür wurden die beiden bereits im Gentamycin-Schutz-Test eingesetzten Makrophagenzelllinien mit Green- fluoerescent-protein (GFP)-markierten Salmonellen infiziert. Diese GFP-markierten Bakterien erscheinen im Fluoreszenzmikroskop grün. Nach Infektion wurden die Zellen gewaschen und BPI mit einem Cy3-gekoppelten Anti-huIg-Antikörper intrazellulär angefärbt, der eine rote Färbung verursachte. Bei einer Überlagerung von Salmonellen und dem BPI-Protein zeigte sich eine gelbe Färbung. Dies deutete auf eine Kolokalisation von Bakterien und dem BPI-Protein hin. Diese Experimente zeigen, dass BPI und Salmonellen in infizierten RAWMakrophagen kolokalisieren können (Ab. 33B). Dies ist ein Hinweis, dass murines BPI direkt mit der bakteriellen Zellwand in Kontakt treten kann. A B Abb. 33: BPI kolokalisiert mit Salmonella typhimurium: Nach 25minütiger Infektion der beiden Zelllinien mit GFP-markierten Salmonella typhimurium (grün) wurden die Zellen gewaschen, fixiert und mit einem gegen den huIgG1-Anteil des BPI-Proteins gerichteten Cy3-gekoppelten Anti-huIg-Antikörper (rot) intrazellulär angefärbt. Anschließend wurde sowohl die parentale (A) als auch die BPI-exprimierende Zelllinie (B) im Fluoreszenzmikroskop analysiert. Bei Kolokalisation zwischen Bakterien und BPI-Protein entsteht durch die Überlagerung eine Gelbfärbung (siehe vergrößerter Ausschnitte 33B). - 78 - DISKUSSION VI) DISKUSSION In Vorarbeiten war es unserer Arbeitsgruppe gelungen, Sequenzinformationen des murinen Homologs von humanem BPI zu gewinnen. Mit Hilfe dieser Information war es möglich, einen Northern Blot zum Nachweis von murinem BPI zu etablieren. Dadurch gelang es, die mRNA des BPI-Proteins in Geweben von Mäusen zu detektieren. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Analysen zur Expression, Regulation und Funktion von murinen BPI während der Immunantwort durchgeführt. Die Stimulation von Granulozyten und DCs mit dem LPS gramnegativer Bakterien führt zu einer starken Induktion der Maus-BPI-Transkription. Nach einer Infektion mit gramnegativen Bakterien hat das LPS aus der Zellwand dieser Bakterien zwei Effekte auf den Wirt. Zum einen erlaubt die Erkennung von LPS dem Wirt, durch spezifische Rezeptoren, eine Unterscheidung zwischen „Selbst“ und „Nicht-Selbst“ zu treffen (Aderem et al., 2000 & Akira et al., 2001). Das versetzt den Wirt in die Lage, die Immunantwort der angeborenen Immunität zu initiieren und eine erste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene zu bilden. Letztendlich führt die Initiierung der angeborenen Immunität auch zur Aktivierung der erworbenen Immunität und damit abschließend zur Kontrolle der Infektion bzw., im Idealfall, zur Beseitigung der Pathogene (Medzhitov, 2001). Im Kontrast zu dieser immun-aktivierenden Wirkung von LPS ist andererseits bekannt, dass eine hohe Menge von LPS im Organismus des Wirtes zu einem septischen Schock, also einer starken und tödlichen Entzündungsreaktion des Körpers, führen kann (Beutler and Rietschel, 2003). Diese Wirkung führte dazu, dass LPS auch unter dem Namen Endotoxin bekannt wurde. Obwohl also LPS eine sehr wichtige Rolle für die frühe Erkennung einer Infektion spielt, ist der Wirt gleichzeitig bestrebt, die entzündungsfördernden Eigenschaften von LPS zu neutralisieren. Neben Proteinen, welche die Signalwirkung von LPS auf das Immunsystem verstärken, wie z.B. LBP, existieren auch antimikrobielle Proteine wie BPI oder Alkyl-Oxyalkyl-Hydrolase, die das LPS gramnegativer Bakterien binden oder auch spalten und so dessen endotoxische Eigenschaften neutralisieren (Hailmann et al., - 79 - DISKUSSION 1994 & Gazzano-Santoro, Parent, Grinna et al., 1992 & Feulner et al., 2004 & Munford, 1992). BPI bindet sowohl das freie LPS als auch direkt an gramnegative Bakterien. Sowohl die BPI-LPS-Komplexe als auch die BPI-gekoppelten Bakterien resultieren in einer verstärkten Aufnahme dieser Strukturen durch Makrophagen (Elsbach and Weiss, 1998 & Iovine et al., 2003). Dadurch kommt es zur Neutralisation von freiem und zellständigem LPS. BPI weist also zwei verschiedene Charakteristika auf: Zum einen ist es in der Lage, die krankheitsverursachenden gramnegativen Bakterien direkt zu eliminieren und deren Vermehrung im Wirtsorganismus zu unterbinden; zum anderen kann es auch das von den Bakterien freigesetzte LPS neutralisieren und so dessen pyrogene Wirkung auf den Wirt einschränken. 1) BPI wird in Mäusen exprimiert und vor allem über die LPS–vermittelte TLR4-Aktivierung induziert Im humanen System wurde BPI als vorgefertigtes, gespeichertes Protein zuerst in den azurophilen Granula von Neutrophilen gefunden. Inzwischen wurde eine Expression von BPI ebenfalls in Eosinophilen (Lennartsson et al., 2003), aber auch in dermalen Fibroblasten und mucosalen Geweben (Reichel et al., 2003) nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass humanes BPI nicht nur als vorgefertigtes Protein in neutrophilen Granula vorliegt, sondern auch einer transkriptionellen Regulation unterliegen kann (Lennartson et al., 2003 & Reichel et al., 2003). In dieser Arbeit konnte ein murines Homolog des humanen Bactericidal/ Permeabiltiy Increasing Proteins identifiziert und dessen Expression bereits in ruhenden Granulozyten und DCs nachgewiesen werden. Analysen von Granulozyten, die mit verschiedenen TLR-Liganden stimuliert wurden, zeigten, dass die Expression von BPI auf Ebene der mRNA einer Regulation unterliegt. Der stärkste Induktor der BPI-Transkription war LPS. Diese Regulierung auf mRNA-Ebene erreicht erst nach 12-24 Stunden ihre maximale Induktion. Der Grund für die verzögerte Neuproduktion und vermehrte Sekretion - 80 - DISKUSSION von BPI könnte darin liegen, dass der Wirt sicherstellen will, dass LPS erst eine Aktivierung des Immunsystems auslösen kann. Nachdem das Immunsystem vollständig durch LPS aktiviert worden ist, ergreift der Wirt Maßnahmen, um das LPS im Körper zu neutralisieren (Poltorak et al., 1998 & Qureshi et al., 1999). Dadurch soll die überschiessende Immunreaktion und die damit assoziierte Entwicklung eines septischen Schocks vermieden werden (Beutler and Rietschel, 2003). Neben der Expression in Granulozyten konnte auch in DCs eine über LPS vermittelte Induzierbarkeit der BPI-mRNA gezeigt werden. Nach der Entdeckung, dass DCs mit Alkyl-Oxyalkyl-Hydrolase (AOAH) bereits ein LPS-detoxifizierendes, antibakterielles Protein exprimieren, könnte dies ein Hinweis auf eine weitere Funktion von DCs während der Immunantwort sein (Lu et al., 2003 & Feulner et al., 2004). Die Hauptaufgabe von DCs während einer Immunreaktion ist, nach der Identifizierung von Pathogenen, die Aktivierung der adaptiven Immunantwort über Antigenpräsentation und Zytokine (Akira et al., 2001). Dass DCs zusätzlich antimikrobielle und LPS-neutralisierende Proteine exprimieren, die aktiv in die initiale Pathogenabwehr eingreifen können, wäre eine neue Funktion für diese Zellen. Ob DCs neben AOAH und BPI noch weitere antimikrobielle Proteine exprimieren, sollte in folgenden Studien detailliert untersucht werden. Neben LPS waren auch andere TLR-Liganden wie z.B. unmethylierte CpG-DNAMotive, ein Ligand für TLR9, in der Lage, eine, wenn auch schwache, Hochregulation der BPI-mRNA in Granulozyten zu vermitteln. Die Aktivierung der Signaltransduktion und Transkription am TLR9 verläuft ausschließlich über MyD88, was darauf hinweist, dass der MyD88-abhängige Signalweg nach CpG-Stimulation eine Rolle bei der Regulierung der BPI-mRNA spielt (Schnare et al., 2000). In welchem Ausmaß der MyD88-abhängige und MyD88-unabhängige Signalweg interagieren und zur Aktivierung von BPI während einer Immunantwort nach Infektionen beitragen, muss allerdings weiter untersucht werden. - 81 - DISKUSSION 2) Die LPS-vermittelte Aktivierung der BPI-Transkription verläuft über den TRIF-abhängigen Signalweg von TLR4 Die bei weitem stärkste Induktion von BPI erfolgte über den TLR4-Signalweg. Dieser, durch LPS aktivierte, Signalweg ist der komplexeste unter den TLRs. Alle vier Adaptermoleküle (TIRAP, TRAM, TRIF und MyD88), die für die TLRSignalwege identifiziert wurden, sind in die Signaltransduktion durch TLR4 involviert. Der für fast alle TLRs, außer TLR3, beschriebene Signalweg über MyD88 wird ebenso genutzt wie der für TLR3 beschriebene Pfad über TRIF (Yamamoto et al., 2003). Dabei werden NF-κB und die MAP-Kinasen sowohl über den MyD88-abhängigen als auch über den MyD88-unabhängigen, aber TRIF-abhängigen Zweig des TLR4Signalwegs aktiviert (Kawai et al, 1999). Allerdings aktivieren Signale, die über MyD88 vermittelt werden sogenanntes Frühe-Phase-NF-κB und führen so zur Produktion proinflammatorischer Zytokine, wie z.B. IL-6 und TNF(Horng et al., 2001 & 2002). Das Adaptermolekül TRIF verbindet TLR3 nach Aktivierung über virale Liganden (dsRNA) mit nachgeschalteten Transkriptionsfaktoren und führt zur Aktivierung von IFN Regulatory Factor 3 (IRF3) und Späte-Phase-NF-κB. Dies mündet in der Produktion des antiviralen Zytokins IFN und der Expression IFN-induzierbarer Gene wie z.B. Regulated on Activation, Normal T-Cell Expressed and Secreted (RANTES) und Interferon-gamma-Inducible Protein 10 (IP-10) (Yamamoto et al., 2003 & Fitzgerald et al., 2003). Das TRIF über den TLR4-Rezeptor ebenfalls mehrere LPS-induzierbare Gene, z. B. Thymidylate Kinase Family LPS-inducible Member (Tyki), über IRF3 reguliert und auch so in die Immunabwehr eingreift, wurde später erkannt (Akira, 2004 & Kawai et al., 2001 & Hirotani et al., 2005). Analysen verschiedener Gen-defizienter Mäuse zeigten uns, dass die durch LPS vermittelte transkriptionelle Aktivierung von BPI über den MyD88-unabhängigen, TRIF-vermittelten Zweig des TLR4-Signalweges erfolgt. Dass über diesen Weg aber die transkriptionelle Regulation antimikrobieller Proteine kontrolliert werden kann, wurde in dieser Weise noch nicht beschrieben. - 82 - DISKUSSION Durch den Einsatz spezifischer Inhibitoren für NF-κB und die MAP-Kinasen p38 und ERK1/2 konnten wir den, für die Induktion der BPI-Expression durch LPSStimulation, verantwortlichen Signalweg weiter aufschlüsseln. Wird eine Aktivierung von NF-κB oder dessen Translokation in den Nukleus durch den Einsatz der spezifischen Inhibitoren MG-132 und SN-50 verhindert (Lin et al., 1995), erfolgt auch keine Aktivierung der Transkription von BPI. Damit bestätigt sich die zentrale Rolle von NF-κB auch für den durch LPS ausgelösten BPI-aktivierenden Signalweg. Ähnlich wie bei NF-κB zeigt sich auch bei der Aktivierung der MAP-Kinasen, dass die Aktivierung über den TRIF-abhängigen Pfad, im Vergleich mit der über MyD88 laufenden Signaltransduktion, mit einer verzögerten Kinetik erfolgt (Kawai et al., 1999 & 2001). Die Familie der MAP-Kinasen unterteilt sich in drei Hauptgruppen, ERK1/2 MAPKs, JNK/SAPKs (c-Jun N-Terminal/ Kinase Stress-Activated Protein Kinases) und p38-Kinasen, die alle bei einer Stimulation durch LPS aktiviert werden (Downey and Han, 1998). Durch Einsatz spezifischer Inhibitoren kann die Phosphorylierung der Kinasen und damit deren Aktivierung durch LPS unterbunden werden (Alessi et al., 1995 & Lee et al., 1994). Die spezifische Inhibition der ERK1/2-Kinasen und p38-Kinasen nach LPSStimulation führt zu einer partiellen Reduktion der Aktivierung der BPI-Transkription (70% Reduktion bei Inhibition der ERK1/2 Kinasen bzw. etwa 50% bei Inhibition von p38). Damit spielen die untersuchten MAP-Kinasen zwar ebenfalls eine Rolle im BPI-aktivierenden Signalweg nach LPS-Stimulation, sind aber für sich alleine keine essentiellen Komponenten dieser Aktivierung. Inwieweit die hier untersuchten Kinasen eventuell zusammenwirken, oder ob auch die JNK/SAPKs einen Einfluss auf die Regulation der BPI-Transkription haben, muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Bis jetzt ist IRF3 der einzige bekannte TRIF-spezifische Transkriptionsfaktor. Daher ist es wahrscheinlich, dass auch die über den TRIF-abhängigen Zweig des LPSTLR4-Signalweges regulierte Expression von BPI den Transkriptionsfaktor IRF3 - 83 - DISKUSSION verwendet. Trotzdem sollte diese Annahme erst noch durch weitere Experimente bestätigt werden. 3) Ein de novo synthetisiertes Protein ist in die Aktivierung der BPITranskription nach LPS-Stimualtion involviert Experimente mit Cyclohexamid, einem Hemmer der Proteinbiosynthese, zeigten, dass ein neu zu bildendes Protein in die Aktivierung der BPI-Transkription über den LPS-TLR4-Signalweg involviert ist. Erste Analysen zur Identifikation dieses Moleküls wurden durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Neutralisation von sowohl TNF als auch Lymphotoxin-α (LT-α) durch einen löslichen TNF-Rezeptor II (Enbrel) zur Inhibition der LPS-vermittelten Regulation der BPI-Transkription führte. Darüber hinaus konnte die BPI-Transkription in Zellen von TNF-defizienten Mäusen nach LPS-Stimulation stark induziert werden. Diese Ergebnisse führen zur Hypothese, das LT-α nach LPS-Stimulation über den TRIF-abhängigen Signaltransduktionsweg von TLR4 neu synthetisiert wird und anschließend durch die Interaktion mit den LT-α-Rezeptoren zur transkriptionellen Aktivierung von BPI führt. Bisher wird angenommen, dass das von aktivierten Lymphozyten sekretierte LT-α in der Krebsabwehr und bei Entzündungen des Intestinaltrakts eine Rolle spielt (Niwa et al., 2006 & Seidemann et al., 2005 & Spahn et al., 2006). Auch eine mögliche Bedeutung von LT-α in der Ausbildung autoimmuner Erkrankungen wird diskutiert (McDevitt et al., 2002). Ob LT-α auch in die Aktivierung der Expression antimikrobieller Proteine involviert sein könnte, bleibt vorerst offen. 4) Sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterienspezies können eine BPI-Induktion auf transkriptioneller Ebene vermitteln Nach den bisherigen Studien, die mit isolierten TLR-Liganden durchgeführt wurden, erfolgten nun auch Experimente mit Bakterien. In zunächst mit UV-inaktivierten Bakterien durchgeführten Untersuchungen waren nur die gramnegativen Bakterienspezies in der Lage, eine Induktion der BPI-mRNA zu vermitteln. Diese - 84 - DISKUSSION Induktion war vergleichbar mit der bei LPS-Stimulation beobachteten Kinetik und Ausprägung. Nur bei Pseudomonas aeroguinosa konnte ebenso wie bei den grampositiven Bakterien keine Hochregulation der BPI-mRNA gefunden werden. Weitere Analysen von Granulozyten, die mit nicht UV-behandelten Bakterien stimuliert wurden, zeigten, dass alle getesteten gramnegativen Bakterien, außer Pseudomonas aeroguinosa, eine Induktion der BPI-mRNA nach Stimulation vermitteln konnten. Auch hier war die Ausprägung der BPI-Transkription in etwa vergleichbar mit der durch LPS hervorgerufenen Aktivierung. Dass auch bei nicht UV-behandelten Pseudomonas aeroguinosa keine Aktivierung der BPI-Transkription zu beobachten war, könnte an der speziellen, weniger immunstimulatorischen Lipid A-Struktur des Pseudomonas-LPS liegen (Ernst et al., 2003). Bei den untersuchten grampositiven Bakterien waren nur proliferierende BStreptococcen in der Lage, BPI-mRNA zu induzieren. Von Streptococcus pneumoniae ist beispielweise bekannt, dass es den Pathogenitätsfaktor Pneumolysin sekretiert, der die Porenbildung an der Wirtszelle auslöst. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass Pneumolysin von TLR4 erkannt wird und so eine Immunantwort auslöst (Malley et al., 1999 & 2003). Möglicherweise produzieren Gruppe B-Streptococcen einen Pathogenitätsfaktor, der die Transkription von BPI aktiviert. Dies soll in weiteren Experimenten geklärt werden. 5) BPI wirkt antibakteriell und LPS-neutralisierend Der N-terminalen Domäne von humanem BPI wird die bakterizide und LPSneutralisierende Funktion des Proteins zugeschrieben. Murines BPI war in der Lage, LPS-vermittelte Effekte sowohl auf Ebene der NF-κB-Aktivierung als auch auf Ebene der Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Obgleich der exakte molekulare Mechanismus der Interaktion zwischen BPI-Protein und LPS noch nicht geklärt werden konnte, geben Analysen der Kristallstruktur von humanem BPI erste Hinweise darauf. So zeigt die N-terminale Domäne von BPI hydrophobe Taschen (Beamer et al., 1997). Ähnliche Strukturen wurden bereits in dem ebenfalls stark LPS-affinen LBP gefunden. Vermutlich fängt sich in diesen Taschen das Lipid A des LPS-Moleküls. Eine weitere Möglichkeit für die Bindung von BPI an LPS - 85 - DISKUSSION könnten positiv geladene Reste an den N-terminalen Domänen sein, die sich an den negativ geladenen LPS-Strukturen anlagern. Allerdings variiert das Auftreten der positiv geladenen Reste an den N-terminalen Domänen innerhalb der BPIFamilie stark (Beamer et al., 1997 & Elsbach and Weiss, 1998). Aufgrund starker Ähnlichkeiten in der 3D-Struktur, die durch Computeranalysen errechnet wurden, werden nun auch BPIL- und PLUNC-Proteine der BPI-Familie zugeordnet. Jedoch zeigen sich gerade in der N-terminalen Region dieser Proteine die größten strukturellen Unterschiede zu BPI und LBP (Bingle and Craven, 2002). Dadurch fällt eine Voraussage der Funktion von BPIL und PLUNC äußerst schwer. In dieser Arbeit konnte eine antibakterielle Wirkung des murinen BPI-Proteins gegen sich intrazellulär replizierende Salmonellen nachgewiesen werden. Erste Versuche deuten darauf hin, dass diese Wirkung durch eine Anlagerung von BPI an das Bakterium und eine direkte Interaktion vermittelt wird. In einer kürzlich publizierten Studie konnte eine antibakterielle Wirkung von Maus-BPI gegen andere gramnegative Bakterienspezies wie z.B. Escherichia coli gefunden werden (Lennartson et al, 2005). Für detailliertere Studien zur biologischen Funktion von murinem BPI und zur Aufklärung der Interaktion zwischen dem Protein und LPS wird im Moment sowohl an der Expression des rekombinanten Proteins als auch an einem anti-muBPIAntikörper gearbeitet. - 86 - ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VII) Abkürzungsverzeichnis Abb. Ak APS APS Bp BSA cDNA cfu d DEPC DNA dNTP DTT EDTA ELISA EtBr FITC FKS GM-CSF h HEPES i.p. IFN Ig IL kDa LB MHC II min N OD PBS PCR PMSF RIPA RLU rpm RT RT-PCR SDS sec t Tab TBS TTBS Abbildung Antikörper Ammoniumpersulfat Ammoniumpersulfat Basenpaar Rinderserumalbumin komplementäre DNA Kolonie bildende Einheiten Tag Diethylpyorcarbonat Desoxyribonukleinsäure Desoxynuklotidtrophosphat Dithiothreitol Ethylendiamintetraacetat Enzyme-linked immunosorbent assay Ethidiumbromid Fluoreszeinisothiocyanat Fötales Kälberserum Granulocyten und Makrophagenkoloniestimulierender Faktor Stunde N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2Ethansulfronsäure intraperitoneal Interferon Immunglobulin Interleukin Kilodalton Luria-Broth Haupthistokompatibilitätskompelx Minute Normale Optische Dichte Phosophatgepufferte Salzlösung Polymerase-Kettenreaktion Phenylmethylsulfonlyfluorid Radioimmunopräzipitationspuffer Relative Lichteinheit Umdrehungen per Minute Raumtemperatur reverse Transkriptase PCR Natriumdodecylsulfat Sekunde Zeit Tabelle Tris-gepuffert Salzlösung TBS mit TWEEN - 87 - ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS UV V v/v w/v WT Ultraviolettlicht Volt Volumenprozent Gewichtsprozent Wildtyp - 88 - LITERATURVERZEICHNIS VIII) Literaturverzeichnis Aderem A, & Ulevitch RJ (2000): Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. 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Ebenso möchte ich Prof. Dr. Dr. A. Gessner für seine freundliche Bereitschaft danken, das Zweitgutachten für diese Arbeit zu übernehmen. Mein größter Dank geht an PD Dr. Markus Schnare für seine ausgezeichnete Betreuung und seine Geduld. Von ihm lernte ich, wie ich wissenschaftliche Fragestellungen und deren Bearbeitung anzugehen habe. Für eure Unterstützung, viele Tipps, Hilfen, Diskussion, DVD-Abende und vieles mehr: Ein großes DANKE an alle (mehr oder weniger verrückten) Laborkollegen in der AG Schnare für vier sehr schöne Jahre, speziell Irene Wittmann, Anne Portisch und Diana Aichele, an meine Mitdoktoranden Roman Gerlach, Ulrik Strobl, Tobias Strapatsas sowie an Daniela Jäckl und Claudia Feulner. Den Mitarbeitern des Instituts für Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene möchte ich dafür danken, dass sie immer Zeit hatten, meine Fragen zu beantworten. Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für ihre Hilfe, ihr Interesse, ihre Geduld und ihre fortwährende Unterstützung. Ohne euch wäre dies nie möglich gewesen. THANKS FOLKS. - 100 - Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Melanie Eckert Geburtsdatum: 29. April 1976 Geburtsort: Fürth/ Bayern Nationalität: deutsch Ausbildung: 1982 – 1986 Grundschule Zirndorf 1986 – 1995 Helene-Lange-Gymnasium Fürth Abschluss: Abitur 1995 – 2002 Studium der Biologie an der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg Hauptfach: Zoologie Nebenfächer: Mikrobiologie, Toxikologie und Rechtsmedizin Abschluss: Diplom Thema der Diplomarbeit: Sozialverhalten bei Petrogale mareeba: Kinderstube in der Granite Gorge 2002 – 2007 Promotion am Immunologie Institut und für klinische Hygiene, Mikrobiologie, Friedrich-Alexander- Universität Erlangen-Nürnberg Thema der Dissertationsarbeit: Untersuchungen zur Expression und Funktion von murinem bactericidal/ permeability increasing protein (BPI) - 101 -
