Biologische Aktivität verschiedener Insulinderivate in

Hoppe-Seyler'S Z. Physiol. Chem.
Bd. 356, S. 647 - 651, Juni 1975
Biologische Aktivität verschiedener Insulinderivate in vivo und in vitro
Klaus Rager und Ulrike Buss
(Der Schriftleitung zugegangen am 9. Januar 1975)
Herrn Prof. Dr. Dr. G. Weitzel zum 60. Geburtstag gewidmet
Zusammenfassung: Die Aktivität von Des-octapeptid-insulin, Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin,
Des-GlyA1 -des-PheBMnsulin und Trimethionylinsulin wurde in vitro und in vivo untersucht. Gemessen wurde in vitro am isolierten Zwerchfell
der Ratte der Glucose-Schwund im Inkubationsmedium und der Glucose-Einbau in das Glykogen
des Zwerchfells sowie die antilipolytische Aktivität an der isolierten Fettzelle. In vivo wurde der
Einbau von [U-14C]Glucose nach intraperitonealer Injektion in das Glykogen des Zwerchfells
und des Nebenhodenfettgewebes sowie der Einbau von 14C aus [U-14C]Glucose in die Lipide
des Nebenhodenfettgewebes der Ratte gemessen.
Im Vergleich zu Rinderinsulin zeigte Des-octapeptid-insulin mit den angewandten Untersuchungsmethoden eine biologische Aktivität von
0.5 -1.0%, Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin von
1.4 - 3.5%, Des-GlyA1-des-PheB^insulin von
2.1 - 5.9% und Trimethionylinsulin von 14.0 31.5%. Die untersuchten Insulinderivate zeigten
in vitro und in vivo eine gute Übereinstimmung
der biologischen Aktivität. Zusammen mit früheren Untersuchungen ergibt sich eine umfassende
Charakterisierung der biologischen Aktivität für
diese Insulin derivate.
Biological Activity in vitro and in vivo of Different
Insulin Derivatives
Summary: The biological activities of des-octapeptide-insulin, des-AsnA21-des-AlaB30-insulin,
des-GlyA1-des-PheB ^insulin and trimethionylinsulin were studied in vitro and in vivo. In vitro
we measured, using the isolated diaphragm of
the rat, the disappearance rate of glucose in the
incubation medium, the incorporation of glucose into the glycogen of the diaphragm and the
antilipolytic activity in the isolated fat cell
model. The incorporation of [U-14C]glucose after
intraperitoneal injection into the glycogen of the
diaphragm and the fat pad tissue was studied in
vivo, as well as the incorporation of 14 C from
[U-14C]glucose into the lipids of the fat pad tissue of the rat.
In comparison to bovine insulin, des-octapeptideinsulin showed, with the methods used, a biological activity,of 0.5 - 1.0%, des-AsnA21-des-AlaB30-insulin 1.4 - 3.5%, des-GlyA1-des-PheB1-
Postanschrift: Dr. K. Rager, Abteilung für Endokrinologische Laboratoriumsdiagnostik der Univ.-Kinderklinik,
D-74 Tübingen, Rümelinstr. 23.
Enzym: Glucose-Oxidase, |3-D-Glucose:Sauerstoff-l-Oxidoreduktase (EC 1.1.3.4).
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insulin 2.1 - 5.9% and trimethionylinsulin
14.0-31.5%. The studied insulin derivatives compared well in their activities in vitro and in vivo.
Together with earlier studies, a good characterization of the biological activities of these four
insulin derivatives has now been achieved.
In einer früheren Untersuchung11 wurde die Aktivität von Des-octapeptidB23'
-insulin, Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin, Des-GlyA1-des-PheB1insulinund7VA1,7VB1,JVB29-Trimethionyl-insulin
in verschiedenen In-vitro-Testsund immunologisch.
untersucht. In der vorliegenden Arbeit werden
diese In-vitro-Ergebnisse ergänzt und ein Vergleich
zu der In-vivo-Aktivität dieser Insulinderivate
unternommen. Die Untersuchung chemisch abgewandelter Insulinderivate ergibt die Möglichkeit,
zwischen Struktur und Wirkung des Insulinmoleküls Beziehungen zu erkennen.
2) In-vivo-Untersuchungen
Die Durchführung der Versuche erfolgte in Anlehnung
an Rafaelsenl 6 ' 7 'wie l.c.l8^ beschrieben.
Nach intraperitonealer Injektion von NaCl, Rinderinsulin
oder den untersuchten Insulinderivaten zusammen mit
[U-l4C]Glucose bei der Ratte wurde der Einbau von
[ l4C]Glucose in das Glykogen des Zwerchfells und des
Nebenhodenfettkörpers sowie der Einbau von 14C in die
Lipide des Nebenhodenfettkörpers bestimmt. Rinderinsulin steigerte den Einbau von [U-14C]Glucose in das
Glykogen des Zwerchfells in einer Dosierung von
400 ng/100 g Körpergewicht um das 3.2 bis 3.9fache,
in das Glykogen des Nebenhodenfettgewebes um das
2.1- bis 3.3fache und den Einbau von 14C in die Lipide
des Nebenhodenfettgewebes um das 9- bis 11 fache im
Vergleich zu den Kontrollen ohne Insulinzugabe. Durchschnittlich 64% des wiedergefundenen 14C fanden sich
im Glykogen des Zwerchfells, 12% im Glykogen des
Nebenhodenfettgewebes und 37% in den Lipiden des
Nebenhodenfettkörpers nach maximaler Insulinzugabe.
Material und Methoden
Rinderinsulin, kristallin, 27 /mg (Fa. Hoechst). Desoctapeptidinsulin, Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin, Des-GlyA1-des-PheBl-insulin und Trimethionylinsulin wurden von Prof. F. H. Carpenter, University of California,
Berkeley, zur Verfugung gestellt.
Bestimmung der Insulinaktivitäten
1) In-vitro-Untersuchungen
a) Glucose-Schwund aus dem Inkubationsmedium am
Diaphragma der Ratte. Gewinnung und Verwendung der
Diaphragmen sowie Pufferlösungen nach l.cJ2J. Bestimmung der Glucosekonzentration mit Glucose-Oxidase (Boehringer-Test). Rinderinsulin bewirkte in maximaler Dosierung eine 3.4 - S.Ofache Steigerung des Glucoseschwundes des Basiswertes ohne Insulinzugabe.
b) GlykogenbeStimmung: Aus dem gleichen Ansatz, in
dem der Glucoseschwund im Inkubationsmedium gemessen wurde (s. oben), wurde die Glykogenkonzentration im Zwerchfell gemessen. Durchführung des Tests
wie l.cJ3'4!, Messung des Glykogens nach der Anthronmethodel5!. Der Basiswert konnte durch Rinderinsulin
in der maximal verwendeten Konzentration von
/m/ Inkubationsmedium um das 2.8 - 4.6fache in verschiedenen Testansätzen gesteigert werden.
c) Antilipolytische Aktivität: Gemessen wurde die Hemmung der Adrenalin-induzierten Lipolyse an isolierten
Fettzellen durch Bestimmung der Konzentration der
freien Fettsäuren wie l.cJ1>2^ beschrieben. Die Adrenalin-induzierte Lipolyse ohne Rinderinsulinzugabe war
um das 10- bis 15fache höher als die Ergebnisse bei Zugabe von 50
Rinderinsulin/m/ Inkubationslösung.
Ergebnisse
In-vitro-Untersuchungen (Tab. 1)
Des-octapeptid-insulin zeigte eine Aktivität von
knapp l % in den hier angewandten biologischen
In-vitro-Tests. Es zeigte sich kein signifikanter
Unterschied in der Wirksamkeit am Zwerchfell
der Ratte bei der Messung der Glykogensynthese
im Zwerchfell und dem Glucoseschwund aus dem
Inkubationsmedium einerseits und der antilipolytischen Aktivität an isolierten Fettzellen andererseits. Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin zeigte eine
durchschnittliche biologische Aktivität von
2.0 - 3.5% in den angewandten In-vitro-Testverfahren. Des-GlyA1-des-PheB1-insulin zeigte eine
Aktivität von durchschnittlich 5%; Die biologische Aktivität von Trimethionylinsulin betrug am
Rattenzwerchfell 28 - 31 %, während die antilipolytische Aktivität 14% betrug.
In-vivo-Untersuchungen (Tab. 2)
Die Wirkung der untersuchten Insulinderivate in
vivo nach intraperitonealer Injektion auf den Einbau von markierter Glucose in das Glykogen des
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Zwerchfells und das Glykogen des Rattennebenhodenfettgewebes sowie der Inkorporation von
14
C aus [U-14C]Glucose in die Lipide des Rattennebenhodenfettgewebes zeigte eine sehr gute
Übereinstimmung mit den In-vitro-Befunden. Die
biologische Aktivität von Des-octapeptid-insulin,
Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin und Des-GlyAl-des-PheBl-insulin fand sich im selben Bereich wie
bei den In-vitro-Befunden, während Trimethionylinsulin in vivo nur eine biologische Aktivität von
14 - 18% zeigte, im Vergleich zu Rinderinsulin.
Diskussion
1) Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die früher
festgestellten Ergebnisse für die In-vitro-Aktivität der untersuchten Insulin-Derivate^1'9' überraschend mit den Befunden der In-vivo-Aktivität
übereinstimmen. In verschiedenen Untersuchungen110"15' konnte gezeigt werden, daß die bio-
logische Wirksamkeit verschiedener Insulinderivate weitgehend mit der Konformation des Insulinmoleküls (gemessen mit Circulardichroismus)
parallel geht. Tritt eine deutliche Änderung in
der Konformation ein, wie bei Des-octapeptidinsulin, so geht dies mit einem weitgehenden
biologischen Wirkungsverlust einher. Ähnliche
Konformationsänderungen finden sich bei Entfernung der endständigen Aminosäure des Carboxylendes der -Kette und Entfernung der./Vterminalen Aminosäure der -Kette, während am
Af-terminalen Ende der B-Kette der Verlust einer
Aminosäure (Phe) keinen Effekt auf die biologische Wirksamkeit und den Circulardichroismus
hat. Lediglich Trimethionylinsulin hatte eine geringere Aktivität bei den hier angewandten biologischen In-vivo-Testverfahren. Die Unterschiede
waren jedoch nicht statistisch signifikant (p =
0.01). Auffallend ist auch, daß Trimethionylinsulin im Mäusefalltest1161 eine Aktivität von 34%
zeigte[1].
Tab. 1. In-vitro-Wirkung der Insulinderivate:
a) auf die Glykogenbüdung des Rattenzwerchfells;
b) auf den Glucose seh wund aus dem Inkubationsmedium bei Inkubation des Rattenzwerchfells.
c) Antilipolytische Wirkung; Messung der Konzentration an freien Fettsäuren im Inkubationsmedium nach Stimulierung der Lipolyse durch Adrenalin.
Die Wirkung des Rinderinsulins wurde gleich 100% gesetzt.
n
Insulinkonzentrat
[ng/m/ Inkub.]
Aktivität
[%]
± 1SD
Des-octapeptid-insulin
15
Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin
Des-GlyA1-des-PheB ^insulin
15
14
500
160
0.5 ± 0.09
3.5 ±0.19
Trimethionylinsulin
15
Des-octapeptid-insulin
Des-AsnA21-des-AlaB30-insuün
Des-GlyA ^des-Phe8 * -insulin
22
Insulinderivat
a)
b)
Trimethionylinsulin
c)
25
24
18
Des-octapep tid-insulin
Des-AsnA2 1-des-AlaB30-insulin
Des-GlyA1-des-PheB ^insulin
22
Trimethionylinsulin
24
23
21
100
20
28
5.1 ± 1.0
500
160
100
20
0.7 ± 0.14
2.0 ± 0.44
5.9 ± 1.17
31.5 ±5.5
500
160
200
2
0.9 ± 0.03
2.4 ± 0.18
3.2 ± 0.50
± 4.3
14.0 ± 0.90
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Tab. 2. Wirkung der Insulinderivate in vivo:
a) auf die Inkorporation von [U-14C]Glucose in das Glykogen des Rattenzwerchfells;
b) auf die Inkorporationvon 14C aus [U-14C]Glucose in die Lipide des Rattennebenhodenfettgevvebes;
c) auf die Inkorporation von [U-14C]Glucose in das Glykogen des Rattennebenhodenfettkörpers.
Die Wirkung des Rinderinsulins wurde gleich 100% gesetzt.
n
Insulinkonzentrat
[ng/Tier]
Aktivität
[%]
± 1 SD
Des-octapeptid-insulin
Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin
9
8
800
160
0.8 ± 0.19
1.5 ± 0.7
Des-GlyA 1 -des-PheB1 -insulin
9
160
Tr ime thio ny 1 in sulin
7
40
Des-octapeptid-insulin
Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin
Des-GlyA ^des-Phe8 * -insuhn
Trimethionylinsuh'n
9
14
12
10
800
160
160
40
3.4 ± 1.59
16.6 ± 2.70
Des-octapeptid-insulin
Des-AsnA21-des-AlaB30-insulin
Des-GlyA ^des-Phe8 ^insulin
Trimethionylinsulin
9
10
12
11
800
160
160
40
0.8 ± 0 . 3 2
1.8± 0.43
2.7 ± 0.67
18.0 ± 3.41
Insulinderivat
a)
b)
c)
2.1 ± 0.9
14.5 ± 5.4
1.0 ± 0.24
2.4 ± 1.32
4) Das Fehlen der W-terminalen Aminosäuren
GlyA1 und PheB1 führt zu einem weitgehenden
Wirkungsverlust dieses Insulin de rivats. Wie aus
den Untersuchungen an Hybridinsulinen hervorgeht1221, ist GlyA1 für die biologische Aktivität
wesentlich. Dieses ist in kristallinem Zustand an
der Oberfläche des Insulinmoleküls lokalisiert^231,
so daß die Bedeutung dieser Aminosäure mit
ihrer Lokalisation im Insulinmolekül parallel gehen könnte, da in der Literatur^101 Anzeichen
dafür vorliegen, daß die Konformation des Insulinmoleküls in Lösung ähnlich der Kristallkonfor3) Aus der Literatur1191 ist bekannt, daß AlaB3°
mation ist.
für die Aktivität des Insulins nicht essentiell ist.
Dagegen kann Phe31 ohne Wirkungsverlust entDes-AsnA21-des-AlaB30-insulin zeigt einen prakfernt werden^24'251.
tisch vollständigen Wirkungsverlust, wie aus un1
seren Befunden und dem Schrifttum hervorgeht^ . 5) Die Maskierung der freien Aminogruppen mit
Methionin in AI, B l und B29 fuhrt zu einem
Die Desamidierung von AsnA21 führt .nur zu geringem Wirkungsverlust120'211. Aus diesen BefunWirkungsverlust, der jedoch nicht so weitgehend
A21
den könnte man vermuten, daß Asp
für die
ist wie bei den anderen untersuchten InsulinderiInsulinaktivität notwendig ist. Nach Abtrennung
vaten. A^-Ac-insulin1261 und WA1-(3-Carboxyvon AsnA21 auftretende Konformationsänderunpropionyl)insulin (A^-Suc-insulin/121 zeigen
eine deutliche Minderung der biologischen Aktigen[121 gehen mit dieser Beobachtung parallel.
2) Die Abspaltung der letzten 8 Aminosäurereste
der B-Kette (B 23 - B 30) führt zu einem fast vollständigen Aktivitätsverlust. Wie aus der Literatur
hervorgeht, ist ArgB22 wesentlich für die Wirkung
des Insulins^ 17>18 Die Abspaltung der letzten
3 Aminosäuren bewirkt dagegen eine geringe Minderung der biologischen Aktivität141, während
die Entfernung der 5 endständigen Aminosäuren
der B-Kette mit einer Veränderung der biologischen Aktivität und des Circulardichroismus einhergeht110>121.
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Aktivität verschiedener Insulinderivate
vität, während die Einführung der Acetyl- oder
3-Carboxypropionyl-Gruppe in B l oder B 29 weniger stark die biologische Aktivität minderten.
So wäre es möglich, daß die Einführung der Methioningruppe in AI den Wirkungsverlust des
Trimethionylinsulins im Vergleich zu Rinderinsulin verursacht.
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