Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von in

Inhaltsverzeichnis
I
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Inhaltsverzeichnis
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................V
TABELLENVERZEICHNIS......................................................................................VII
ABKÜRZUNGEN: .................................................................................................... VIII
1
EINLEITUNG .......................................................................................................... 1
1.1
AUFBAU DES IMMUNSYSTEMS .............................................................................. 1
1.1.1
Spezifische und unspezifische Abwehrmechanismen .................................. 1
1.1.2
Das Th1/ Th2-Paradigma.............................................................................. 2
1.2
DIE IMMUNMODULIERENDE WIRKUNG VON VIREN .............................................. 3
1.3
ANTIGEN- PRÄSENTIERENDE ZELLEN (APC) ALS MEDIATOREN DER
IMMUNANTWORT .................................................................................................. 4
1.4
IMMUNBIOLOGIE DER DENDRITISCHEN ZELLEN (DC) ........................................... 5
1.4.1
Geschichtlicher Hintergrund ......................................................................... 5
1.4.2
Stadien der DC-Reifung ............................................................................... 5
1.4.3
Morphologie und Phänotyp von DC ............................................................. 8
1.4.4
Funktionelle Eigenschaften von DC ............................................................. 8
1.5
GEWINNUNG VON DC........................................................................................... 9
1.6
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE DER HETEROGENEN DC ........................................ 9
2
FRAGESTELLUNG.............................................................................................. 10
3
MATERIAL UND METHODEN ......................................................................... 11
3.1
ISOLIERUNG VON MONONUKLEÄREN ZELLEN AUS NABELSCHNURBLUT ............. 11
3.2
AUFBEREITUNG VON MONONUKLEÄREN ZELLEN ............................................... 12
3.2.1
Isolierung von Stammzellen ....................................................................... 12
3.2.2
Isolierung von CD45 RA naiven T-Zellen ................................................. 13
3.3
KULTIVIERUNG DER STAMMZELLEN UND ANZUCHT VON DC............................. 14
Inhaltsverzeichnis
II
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3.3.1
Anzucht von gemischten, dendritischen Populationen............................... 14
3.3.2
Anzucht von Subpopulationen.................................................................... 14
3.4
SORTIERUNG DER SUBPOPULATIONEN IM AUTOMACS ........................................ 15
3.5
FUNKTIONSMESSUNGEN IM DURCHFLUSSZYTOMETER (FACSCAN) ................... 16
3.5.1
Stimulation und Fixierung der Zellen zur Messung von intrazellulären
Zytokinen und intrazellulrärem RSV.......................................................... 16
3.5.2
3.5.2.1
Färbung der Oberflächen-Antigene ..................................................... 17
3.5.2.2
Färbung von intrazellulären Zytokinen................................................ 18
3.5.2.3
Infektion – Bestimmung von intrazellulärem RSV ............................. 18
3.5.2.4
Apoptose – Bestimmung von Annexin V............................................ 19
3.5.2.5
Phagozytose – Bestimmung von inkorporiertem Dextran FITC ......... 19
3.5.2.6
Burst – Peroxidaseaktivität in den Lysosomen.................................... 20
3.5.3
4
Färbung ....................................................................................................... 17
Durchflusszytometrische Messung............................................................. 21
3.5.3.1
Arbeitsprinzip eines Durchflusszytometer........................................... 21
3.5.3.2
Durchführung der Messungen.............................................................. 22
3.6
PROLIFERATION DER ANGEZÜCHTETEN ZELLEN ................................................. 23
3.7
ELISA-NACHWEIS DER ZYTOKINPRODUKTION IM ÜBERSTAND ......................... 23
3.8
BESTIMMUNG VON VIRALEM EINFLUSS AUF DIE ANGEZÜCHTETEN ZELLEN ........ 24
3.9
HERSTELLERNACHWEIS ...................................................................................... 26
ERGEBNISSE ........................................................................................................ 32
4.1. EXPRESSION VON CD14 UND CD1 A NACH DER 14TÄGIGER KULTIVIERUNG VON
STAMMZELLEN ..................................................................................................... 32
4.1.1
Anzucht von drei Populationen .................................................................. 32
4.1.2
Sortierung der polarisierten Populationen.................................................. 33
4.2
PHÄNOTYP DER GEPRÜFTEN POPULATIONEN ...................................................... 35
4.2.1
Morphologie im Lichtmikroskop................................................................ 35
4.2.2.
Expression von spezifischen dendritischen Oberflächenantigenen............ 36
4.3 UNTERSCHIEDLICHER REIFUNGSGRAD DER POLA RISIERTEN ZELLEN GEGENÜBER
DER HETEROGENEN POPULATION ......................................................................... 38
4.3.1
Zellteilungsrate der Subpopulationen......................................................... 38
4.3.2
Phagozytoseverhalten der angezüchteten Zellen........................................ 39
4.4
VERGLEICH DER POLARISIERTEN POPULATIONEN UNTEREINANDER ................... 40
4.4.1
Bildung von Wasserstoffperoxid ................................................................ 40
Inhaltsverzeichnis
III
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4.4.2
4.5
Spontane Zytokinproduktion der Subpopulationen.................................... 41
UNTERSCHIEDE DER SUBPOPULATIONEN IN DER KOKULTUR MIT NAIVEN TZELLEN ............................................................................................................... 43
4.5.1
Clusterbildung mit naiven T-Zellen............................................................ 43
4.5.2
Aktivierung von naiven T-Zellen durch die angezüchteten Populationen . 44
4.5.3
Zytokinproduktion in der Kokultur ............................................................ 45
4.5.3.1
Untersuchungsergebnisse der intrazellulären Zytokinmessung........... 45
4.5.3.2 Untersuchungsergebnisse der Zytokinproduktion aus dem ELISA-Test 46
4.6
DER EINFLUSS VON VIRALEN STIMULI AUF DIE SUBPOPULATIONEN ................... 47
4.6.1
Infizierbarkeit der Subpopulationen ........................................................... 48
4.6.2
Expression spezifischer Oberflächenantigene ............................................ 48
4.6.2.1 Expression der Oberflächenantigene auf den CD14+ Zellen unter dem
Einfluss von Poly- I-C und RSV.............................................................. 49
4.6.2.2 Expression der Oberflächenantigene auf den heterogenen Zellen unter
dem Einfluss von Poly-I-C und RSV ...................................................... 50
4.6.2.3 Expression der Oberflächenantigene auf den CD1a+ Zellen unter dem
Einfluss von Poly- I-C und RSV.............................................................. 52
4.6.3
Spontane Zytokinfreisetzung der Subpopulationen unter viralem Einfluss53
4.6.4
Zellteilungsrate der Subpopulationen unter viralem Einfluss .................... 56
4.6.5
Induktion der T-Zellaktivierung durch die geprüften Populationen unter
viralem Einfluss .......................................................................................... 57
5
6
DISKUSSION ......................................................................................................... 59
5.1
HETEROGENE ZELLEN ALS VORSTUFEN DER „UNREIFEN DC“............................ 59
5.2
INDUKTION DER ZELLREIFUNG DURCH DIE ZYTOKINE IL-4 UND M-CSF ........... 61
5.3
DIE POLARISIERTEN POPULATIONEN ALS ZWEI UNTERSCHIEDLICHE ZELLTYPEN 63
5.4
DER EINFLUSS VON VIRALEN STIMULI AUF DIE SUBPOPULATIONEN ................... 67
5.5
METHODENDISKUSSION ...................................................................................... 69
ZUSAMMENFASSUNG: ...................................................................................... 71
LITERATURVERZEICHNIS..................................................................................... 73
DANKSAGUNG ........................................................................................................... 81
Inhaltsverzeichnis
IV
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LEBENSLAUF.............................................................................................................. 82