1_01.QXD NEU - Universität des Saarlandes

Enzyme an der Schnittstelle zwischen
Natur und Technik – Screening nach
neuen Biokatalysatoren
von
Andreas Tholey und Elmar Heinzle
Enzyme sind leistungsfähige Biokatalysatoren
Nahezu alle Eigenschaften, die
einen lebenden Organismus charakterisieren, werden von Proteinen beeinflusst. Diese – unabhängig von ihrer Funktion –
einheitlich aus einem Satz von
20 Aminosäuren aufgebauten
biologischen Makromoleküle
transportieren und speichern
Stoffe und Energie, dienen als
Gerüstsubstanzen beim Aufbau
biologischer Strukturen und sind
essentielle Bestandteile bei der
Steuerung der Replikation und
der Interaktion von Zellen. Eine
der wichtigsten Aufgaben von
Proteinen stellt die Katalyse biochemischer Prozesse dar. Diese
speziellen Proteine werden Enzyme genannt. Sämtliche Prozesse in lebenden Systemen beruhen auf der Abfolge chemischer Reaktionen. Viele dieser
Reaktionen könnten aber ohne
die Katalyse durch Enzyme gar
nicht ablaufen. Dabei senken
diese Biokatalysatoren – genauso wie klassische chemische Katalysatoren – nur die Aktivierungsenergie der Reaktion ab,
beeinflussen das Gleichgewicht
der Reaktion jedoch nicht. Die
Wirkung der Enzyme beruht
dabei auf verschiedenen Prinzipien. So bewirken sie beispielsweise, dass zwei Reaktionspartner in eine günstige räumliche
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Enzyme werden bereits heute in vielen Bereichen zur Synthese von
verschiedenen Chemikalien und pharmazeutisch aktiven Substanzen verwendet. Die Entwicklung und Modifikation geeigneter Biokatalysatoren ist daher ein wichtiger Zweig der Biotechnologie. In
der Arbeitsgruppe Technische Biochemie an der Universität des
Saarlandes werden Methoden ausgearbeitet, welche die Suche
nach den effektivsten Enzymen erleichtern sollen. Diese Methoden
stellen dabei gleichzeitig eine wichtige Erweiterung des Repertoirs
an Werkzeugen für die biomedizinische Forschung dar. In diesem
Artikel geben wir einen kurzen Überblick über aktuelle Entwicklungen und stellen eigene Änsatze auf diesem Gebiet kurz vor.
Nähe zueinander gebracht werden, oder dass chemische Übergangszustände bei der Reaktion
stabilisiert werden. Enzyme besitzen, wie alle Proteine, eine
definierte dreidimensionale Struktur, die auch ihre Aktivität beeinflusst. In dieser dreidimensionalen Struktur können in den
sogenannten aktiven Zentren
auch Zonen geschaffen werden,
in denen ein anderes Milieu vorherrscht als in der meist wässrigen Umgebung der Zelle. Dieses Schaffen einer speziellen
Mikroumgebung – zum Beispiel
einer hydrophoben Tasche –
führt dann dazu, dass auch solche chemische Reaktionen ablaufen können, die in der wässrigen Umgebung nicht möglich
wären.
Im Gegensatz zu klassischen
anorganischen Katalysatoren
vereinen Enzyme eine Reihe ein-
zigartiger Eigenschaften in sich.
Dies macht sie unter anderem
interessant für die Anwendung
im technischen Bereich, in der
pharmazeutischen Industrie, der
Medizin und im Umweltschutz.
Die Bedingungen enzymatisch
katalysierter Umsetzungen sind
in der Regel schonender als die
klassischer chemischer Reaktionen. Damit können solche biotechnisch geführten Prozesse oft
unter umweltfreundlicheren und
zugleich ökonomisch günstigeren Bedingungen durchgeführt
werden [1].
Im Laufe der Evolution entwickelten sich Enzyme für eine
große Anzahl unterschiedlichster
chemischer Reaktionen. Diese
Biokatalysatoren zeichnen sich
dabei durch eine hohe Selektivität und Spezifität aus. Für
die Anwendungen in der Chemie sind hierbei insbesondere
UniversitŠt des Saarlandes
die Regio- und die Enantioselektivität wichtig. Durch die
Regiospezifität – das heisst, die
Fähigkeit, Moleküle nur an bestimmten Stellen zu bearbeiten –
entfallen im Gegensatz zu chemischen Reaktionen oft zeitund materialaufwendige Schritte zum Schutz anderer Funktionalitäten in eben diesem Molekül. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Enzymen ist ihre Fähigkeit, Reaktionen enantioselektiv durchführen zu können, dass heißt, sie können gezielt eine stereochemisch reine,
chirale Verbindung darstellen.
Solche Verbindungen sind sehr
wichtig zum Beispiel bei der
Synthese von Pharmazeutika.
Dagegen stellt die chemische
Synthese solcher enantiomerenreiner Verbindungen auch heute
noch hohe Anforderungen an
die Chemie. Weitere günstige
Eigenschaften enzymatischer Umsetzungen sind die oft hohen
Ausbeuten und vor allem die
Vermeidung von Nebenprodukten.
nicht-natürlichen Oberflächen
zu optimieren [2]. Weiterhin
werden bei solchen Prozessen
oft nicht-natürliche Substrate
umgesetzt, was die Ausbeuten
solcher Reaktionen meist negativ beeinflusst.
Die Neuentwicklung oder Modifikation schon vorhandener Enzyme verläuft in mehreren
Schritten (vgl. Abbildung 1). Zunächst einmal muss die Fragestellung genau definiert werden,
das heisst, es muss klar sein, mit
welchen Bedingungen eine
neuer Katalysator im Produktionsprozess zurechtkommen
muss und welche Substanzklassen umgesetzt werden sollen.
Danach erfolgt die eigentliche
Modifikation, zumeist mit molekularbiologischen Methoden.
Dabei wird in den meisten Fällen
nicht ein einzelnes neues Enzym
geschaffen, sondern es werden
gleich ganze Bibliotheken neuer
Biokatalysatoren erzeugt. In einem letzten Schritt erfolgt dann
das Screening dieser Bibliotheken oder Enzymbänke nach dem
für die jeweilige Fragestellung
effektivsten Kandidaten [3]. Das
Screening kann aber auch in der
Weise erfolgen, dass ein bestimmtes Enzym auf seine Fähigkeit getestet werden soll,
welche Substrate es umsetzen
kann oder – und dies ist insbesondere in der Wirkstoffforschung wichtig – ob man aus einer Substanzbibliothek geeignete Inhibitoren für dieses Enzym
finden kann. Diese Substanzbibliotheken werden dabei zumeist mit Methoden der kombinatorischen Chemie hergestellt.
Im Folgenden sollen die drei
Hauptschritte der Entwicklung
und Modifikation von Enzymen
angesprochen werden, wobei
der Schwerpunkt auf der Besprechung neuer Screening-Me-
Abb. 1: Schritte bei der Entwicklung eines neuen Biokatalysators
Probleme
beim technischen Einsatz
von Enzymen
In der Natur wurden Enzyme so
selektioniert, dass sie in einer
definierten, zumeist wässrigen
Umgebung in einem Netzwerk
mit vielen anderen Enzymen
und biologischen Strukturen
und mit definierten Substraten
optimal arbeiten. Sie sind in der
Regel dabei nicht in Bezug auf
Stabilität, speziell unter den
anspruchsvollen Reaktionsbedingungen, wie sie in chemischtechnologischen Prozessen auftreten, selektioniert worden. Um
diese Biokatalysatoren also technisch nutzen zu können, ist es
notwendig, sie in Bezug auf
Temperaturstabilität, den Einsatz
in organischen Lösungsmitteln,
Reaktionen direkt in flüssigen
Substraten oder den Kontakt mit
magazin forschung 1/2001
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thoden liegt, die derzeit unter
anderem in der Arbeitsgruppe
Technische Biochemie an der
Universität des Saarlandes entwickelt werden.
Wie können neue oder
modifizierte Biokatalysatoren hergestellt werden?
Eine enzymkatalysierte Umsetzung stellt oft nur eine Stufe in
einer Sequenz von Syntheseschritten dar. Dies muss bereits
in der frühestmöglichen Entwicklungsphase für einen neuen
Biokatalysator beachtet werden.
Das Design neuer Enzyme kann
dabei auf rationalem oder evolutionärem Wege erfolgen. In jedem Fall bedeutet jedoch die
Kenntnis der dreidimensionalen
Struktur des jeweiligen Vorläuferenzmys eine deutliche Erleichterung auf dem Wege zum
effektiven, maßgeschneiderten
Biokatalysator. Dabei spielen in
zunehmende Maße auch Erkenntnisse aus der Untersuchung von Struktur-AktivitätsBeziehungen (structure-activity
relationships, SAR) in Kombination mit Methoden der Bioinformatik eine wichtige Rolle.
Quellen für neue Biokatalysatoren können bislang unentdeckte
oder wenig erforschte Enzyme
aus natürlichen Quellen, wie
zum Beispiel aus Mikroorganismen, sein [4].
Moderne Methoden zur Veränderung von Enzymstrukturen
durch Mutationen beginnen mit
der Identifizierung und Sequenzierung des entsprechenden codierenden Gens. Für eine wachsende Zahl von Mikroorganismen sind komplette Gensequenzen in Datenbanken gespeichert, während die Aufklärung der genetischen Informationen aus höheren Organismen wie zum Beispiel Pilzen
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meist viel aufwendiger ist. Die
Enzyme werden in Gastzellen
(host) wie B. subtilis, E. coli
oder Hefen kloniert und exprimiert. Um die Enzymaktivität
leichter bestimmen zu können
ist es dabei oft wünschenswert,
die entsprechenden Proteine an
der Zelloberfläche dieser Organismen zu präsentieren.
Nachdem ein geeigneter Gastorganismus gefunden ist, können verschiedene Methoden
eingesetzt werden, um die eigentlichen Veränderungen am
Enzym vorzunehmen. Dabei stehen Methoden der Mutagenese
[4], des gene-shufflings [5], der
gerichteten Evolution [6, 7] oder
kombinatorische Methoden [8]
zur Verfügung.
Neben der direkten Veränderung der Primärstruktur – also
der Abfolge der einzelnen Aminosäuren – im Enzym gibt es
weitere Möglichkeiten, um Biokatalysatoren für den Einsatz
unter den oben beschriebenen
Bedingungen zu optimieren. So
führt zum Beispiel die Quervernetzung von Enzymen (crosslinked-enzyme crystals, (CLEC)
[9]) oder die Immobilisierung an
geeigneten Trägersubstanzen
[10] oft zu einer deutlichen Steigerung der Stabilität der Enzyme.
Bei derartigen Experimenten zur
Veränderung oder Neusynthese
von Enzymen wird meist eine
grosse Anzahl von Mutanten
erzeugt – eine sogenannte Enzymbank – aus deren Vielfalt
nun in einem Screening-Prozess
die effektivsten Katalysatoren
ausgewählt werden müssen. Die
Ergebnisse dieser Screening-Prozedur fließen dann wiederum in
das Design einer nächsten
Generation weiter verbesserter
Biokatalysatoren ein, bis nach
mehrmaligen Durchlaufen dieses iterativen Prozesses die ge-
wünschten Eigenschaften realisiert sind.
Das Screening
Der Screening-Prozess kann in
drei unterschiedliche Stufen unterteilt werden. In der ersten
Stufe wird eine schnelle und
qualitative Identifizierung katalytisch aktiver Enzyme für eine
bestimmte Umsetzung angestrebt. Diese Verbindungen werden dann in einer zweiten Stufe
in einem halb-quantitativen Test
weiter selektioniert, wobei die
effektivsten Kandidaten die dritte Stufe des quantitativen
Screenings erreichen. Hier werden dann im günstigsten Fall
gleich die kinetischen Konstanten mit bestimmt.
Im Prinzip gibt es zwei verschiedene Arten des Screenings. Die
erste betrifft das Screenen einer
Enzymbank nach dem effektivsten Biokatalysator. Die Zweite
ist das Screenen nach geeigneten Substraten oder Inhibitoren für ein bestimmtes Enzym.
Die Kenntnis geeigneter Substrate oder inhibierender Substanzen kann ihrerseits wichtige
Erkenntnisse über katalytische
Mechanismen von Enzymen liefern, zum Beispiel durch die
Kombination der bereits oben
erwähnten Struktur-AktivitätsBeziehungen und bioinformatischen Methoden und Studien im
Bereich des molecular modeling.
Die Optimierung von Enzymen
richtet sich nach den Erfordernissen der späteren Anwendung. Für industrielle Prozesse
sind beispielsweise schnelle Reaktionsabläufe, hohe Enzymstabilitäten und vor allem die Regio- und Enantiospezifität die
wichtigsten Kriterien, wohingegen die Affinität zu bestimmten
Substraten oder die Substratspezifität mehr im Hintergrund
stehen. Bei der Wahl der BedinUniversitŠt des Saarlandes
Prof. Dr.-Ing. ELMAR HEINZLE, geb. 1949 in
Götzis, Österreich, studierte an der Technischen
Universität in Graz Technische Chemie, Studienzweig Biochemie. Nach dem Diplom promovierte
er dort am Institut für Biotechnologie. Ab 1978
war er Assistent am Technisch Chemischen Labor
der ETH Zürich. Ab 1985 war er für zwei Jahre
Leiter des Labors für Biotechnologie und Biochemie der Forschungsgesellschaft Joanneum in
Graz, kam dann wieder an die ETH und habilitierte 1994 an der Abteilung Chemie im Lehrgebiet
Biochemische Reaktionstechnik. Seit Juni 1997 ist er Professor für
Technische Biochemie an der Universität des Saarlandes.
An der Universität des Saarlandes forscht er im Bereich der frühen Entwicklung biotechnologischer Prozesse an der Entwicklung neuer Biokatalysatoren. Neue Möglichkeiten der Detektion (Optik, Massenspektrometrie) kombiniert mit Modellierung und Simulation der ablaufenden Prozesse werden für Screeningverfahren eingesetzt. Dies geschieht
einerseits mit einstufigen enzymkatalysierten Reaktionen und andererseits mit ganzen Zellen, in denen komplexe metabolische Netzwerke
studiert werden.
gungen in einem Screening ist
auch zu berücksichtigen, in welchem Reaktionsumfeld die Enzyme später eingesetzt werden,
ob also beispielsweise mit isolierten, gereinigten Enzymen gearbeitet werden soll, oder ob die
Reaktionen in ungereinigten
Zelllysaten oder gar in ganzen
Zellen durchgeführt werden.
Aus Gründen des Effektivität,
des hohen Probendurchsatzes
(high throughput screening) und
des Umweltschutzes – hier sei
der möglichst gering zu haltende Einsatz organischer Lösungsmittel als Beispiel genannt
– ist es erstrebenswert, dass
Screeningprozeduren schnell ablaufen, sehr sensitiv und spezifisch, miniaturisierbar und automatisierbar sind. Oft sind jedoch
nicht alle dieser Anforderungen
in einem Prozess realisierbar.
Analytische Methoden
Analytische Methoden für das
Screening können in drei Klassen eingeteilt werden [3]: nichtinvasive Methoden, direkt-invasive Methoden und Methoden,
die mit Trennmethoden gekoppelt sind. Nicht-invasive Methomagazin forschung 1/2001
den beruhen auf der Wechselwirkung des Analyten mit elektromagnetischer Strahlung. In
diese Klasse lassen sich alle optischen Methoden wie die
Messung der Absorption von
Licht (UV/Vis-Spektroskopie)
sowie die kernmagnetische Resonanz (nuclear magnetic resonance, NMR) einordnen. Invasive Methoden wie die später zu
besprechende Massenspektrometrie, erfordern eine Probenahme. Chromatographische
und elektrophoretische Trennmethoden sind ihrerseits zur Detektion mit einer der Methoden
der nicht-invasiven beziehungsweise invasiven Detektion gekoppelt.
Optische Methoden
Die klassische Methode zur
Analyse von Enzymaktivitäten
ist die UV/Vis-Spektroskopie.
Sie beruht auf der Änderung des
Absorptionsverhaltens eines Substrates während des Reaktionsprozesses, was sowohl durch
die Veränderung oder die Freisetzung eines Chromophors –
einer Gruppierung, welche die
Fähigkeit besitzt, Licht in einem
bestimmten Wellenlängenbe-
reich zu absorbieren – verursacht werden kann. Eine Vielzahl von Enzymreaktionen kann
so durch die Messung des Absorptionsverhaltens eines Substrates oder eines essentiellen
Cofaktors spektrophotometrisch
analysiert werden. Klassische
Beispiele hierfür sind die Oxidoreduktasen, die NAD/NADH
als Cofaktor verwenden oder
Acetyltransferasen, bei denen
der Umsatz des Acetyl-Coenzym A direkt photometrisch
bestimmt werden kann.
Spektrophotometrische Tests
bieten eine Reihe von Vorteilen.
So können sie in Mikrotiterplatten oder als Filterpapier-Assays
durchgeführt werden. Beides erlaubt einen hohen Probendurchsatz bei gleichzeitig geringen
Proben- und Lösungsmittelmengen. Des Weiteren ist ihre
Durchführung einfach, der apparative Aufwand ist gering und
die Prozeduren lassen sich einfach automatisieren. Dennoch
sind diese Methoden nicht universell einsetzbar. So kann beispielsweise die biologische oder
chemische Matrix – also die Umgebung, in der die Reaktion abläuft – die Messergebnisse durch
Streuung oder zu starke Eigenabsorption stören oder eine
Messung gar unmöglich machen. Oft sind diese Test daher
nur mit aufgereinigten Enzymen
durchführbar, wohingegen bereits in Zelllysaten Probleme auftreten. Ein weiteres Problem
stellen Reaktionen dar, bei denen weder Cofaktoren, noch
Substrate oder Produkte eine
chromophore Gruppe besitzen.
In solchen Fällen wurden oft
künstliche Substratanaloga eingesetzt, um die Enzymreaktion
verfolgen zu können. Dabei besteht jedoch sehr leicht die Gefahr, dass ein solches Substratanalogon zu vollständig irreführenden Ergebnissen führt, oder
dass die Ergebnisse sich zumin49
dest nicht vollständig auf die realen Substrate übertragen lassen. So führte beispielsweise der
Einsatz von o-Nitrophenyl-β-DGalactopyranosid, einem oft benutzten Substratanalogon zur
Messung der Aktivität der β-Galactosidase, zur Bestimmung
vollständig anderer kinetischer
Konstanten als denjenigen, die
beim Umsatz des realen Substrates Lactose gemessen werden konnten [11]. Diese Probleme können unter anderem
durch unterschiedliche räumliche Ausdehnung von Substrat
und Substratanalogon oder unterschiedliche hydrophile/hydrophobe oder ladungsbasierte
Interaktionen zwischen Substratanalogon und Enzym beziehungsweise Substrat und Enzym
verursacht werden. Daher besteht in vielen Fällen ein Bedarf
an der Entwicklung neuer Screening-Techniken.
Trotz dieser beschriebenen
Nachteile lassen sich mit spektrophotometrischen Methoden
des Screenings beeindruckende
Fortschritte erzielen. So war es
möglich, die Enantioselektivität
einer Lipase durch Mutation
mittels der sogenannten ep-PCR
(error prone-polymerase chain
reaction) in nur vier Generationen von einem Enantiomerenüberschuss (enantiomeric
excess, ee) von 2% auf über
88% zu steigern [12]. Das
Screening erfolgte dabei durch
die parallele Messung des Umsatzes der jeweils enantiomerenreinen Substrate in Mikrotiterplatten, wobei die Absorptionsänderung – und damit der Reaktionsfortschritt – für die beiden
Enantiomere direkt photometrisch miteinander verglichen
werden konnte.
Neben der UV/Vis-Spektroskopie stellen auf Messung der
Fluoreszenz basierende Tests
eine weitere Schlüsseltechno50
Abb.2: pH-stat- und pH-Dyn-Assay zum Screenen von Enzymreaktionen, bei denen
es zur Bildung oder dem Verbrauch von Säure kommt
logie zum Screenen von Enzymen dar. Die Messung der
Fluoreszenz ist etwa 1000 mal
empfindlicher als vergleichbare
Absorptionsmessungen, was diese Methode insbesondere zur
Lösung von Problemen interessant macht, bei denen nur minimale Probenmengen vorhanden
sind, so zum Beispiel im medizinisch-pharmazeutischen Bereich. Wegen des deutlich geringeren Substanzbedarfs kommt
es auch seltener zu Problemen,
die durch die geringe Löslichkeit
verschiedener Substanzen verursacht werden. Dennoch gibt
es auch bei fluoreszenz-basierten Messsystemen einige
Schwierigkeiten, welche die Einsatzmöglichkeiten einschränken.
So treten die bereits oben besprochenen Probleme beim Einsatz nicht-natürlicher, mit fluorophoren Gruppen markierter
Substrate auf. Weitere Probleme
ergeben sich aus der Anwesenheit von Gruppen, welche die
Fluoreszenzsignale abschwächen oder gar löschen können
(quenching) beziehungsweise
aus der Autofluoreszenz der
Matrix, welche die eigentlichen
Signale überdecken und maskieren kann. Aus diesen Gründen
ist es besser anstelle der Intensität der Fluoreszenz entweder die Lebensdauer eines Fluoreszenzsignals, die Energieübertragung auf ein geeigneteres
Fluorophor oder die Anisotropie
zu messen [13]. Unter Beachtung dieser Prämissen konnte eine Reihe verschiedenster Tech-
niken entwickelt werden, um
mittels fluorimetrischer Methoden die Aktivität von Enzymen
sowie die Interaktionen von Biomolekülen untereinander zu studieren [14].
Bei einer Reihe enzymatisch katalysierter Reaktionen wird Säure – in Form von Protonen – verbraucht oder gebildet. Die daraus resultierende Veränderung
des pH-Wertes kann daher als
sensitiver Monitor für den Fortschritt einer solchen Reaktion
verwendet werden. Bei der sogenannten pH-stat-Methode
wird Säure oder Base zum Reaktionsansatz zupipettiert, um
einen konstanten pH-Wert, gemessen mit konventionellen
Glaselektroden oder pH-Indikatoren, zu gewährleisten (vgl.
Abbildung 2 a) [15]. In der
Literatur wird beschrieben, dass
beim Einsatz von pH-Indikatoren mit ähnlichen pKaWerten wie die der Substrate
beziehungsweise der Produkte
lineare Abhängigkeiten zwischen Reaktionsfortschritt und
Absorptionsänderung der Indikatoren bestehen [16]. Diese
Methode besitzt jedoch den
Nachteil, das Indikatorsysteme
mit ähnlichen pKa-Werten verfügbar sein müssen. Daher arbeiten Gernot John und Svenja
Weiß in unserer Gruppe zur Zeit
an Alternativen zu dieser Methode [17]. Der genannte Nachteil kann dadurch umgangen
werden, dass die Dynamik des
gesamten analytischen Systems
UniversitŠt des Saarlandes
unter Verwendung aller Stoffbilanzgleichungen und eines kinetischen Modells vollständig
modelliert/simuliert wird (Abb.
2 b). Mit diesem sogenannten
pH-dyn-Assay ist es möglich,
durch Methoden der numerischen Simulation und der Parameterschätzung die kinetischen
Parameter einer Reaktion ohne
vorherige Linearisierung zu
bestimmen.
In Zusammenarbeit mit der
Gruppe von Prof. I. Klimant an
der Universität Regensburg sowie zwei kleineren mittelständischen Betrieben werden in einem von der Bundesstiftung
Umwelt geförderten Projekt
neuartige Mikrotiterplatten entwickelt, bei denen der Indikator
am Boden der Platte immobilisiert ist. Dazu wird ein fluoreszierender pH-Indikator in einer
dünnen Polymerschicht am Boden der Mikrotiterplatte immobilisiert (Abbildung 3). Änderungen der Fluoreszenzintensität
oder der Lebensdauer können
dann einfach in einem kommerziell erhältlichen Reader (Abbildung 4) gemessen und somit zur
Bestimmung der pH-Änderung
und damit zur Bestimmung des
Reaktionsverlaufs verwendet
werden. Durch den Einsatz von
Abb. 3: Mikrotiterplatte mit immobilisiertem Indikator. (Mit freundlicher Genehmigung der Presens GmbH, Regensburg)
Ruthenium-Diimin-Komplexen
als Indikatoren ist es bislang
möglich, dieses Prinzip auch zur
Bestimmung der Konzentration
von gelöstem Sauerstoff und
Kohlendioxid und zur Quantifizierung verschiedener Kationen
und von Zuckern einzusetzen
[18]. Ein Ziel dieser Entwicklungen ist unter anderem die Anzucht von Säugerzellen auf solchen Platten, die dann als Ersatz
für Tiermodelle dienen können.
Dabei können zum Beispiel nach
Gabe einer pharmazeutisch
wirksamen Substanz aus den mit
Sensoren gemessenen Änderungen des pH oder des gelösten
Sauerstoffs Veränderungen der
Aktivität der Zellen bestimmt
werden.
Massenspektrometrie als
neues Tool im Screening
Eine der aktuellsten Entwicklungen im Bereich des Screening
betrifft den Einsatz der Massenspektrometrie (MS). Bei dieser
Methode ist es notwendig, eine
Probe der zu screenenden Substanz zu entnehmen, weshalb
Abb. 4: a) Reader zum Auslesen von Mikrotiterplatten. b) Mikrotiterplatte im Reader. Abgebildet ist eine zusätzliche Piezopumpe
zum Zudosieren kleinster Mengen von Flüssigkeiten
magazin forschung 1/2001
51
Abb. 5: Prinzip der Elektrospray-Ionisation
sie zur Klasse der direkt-invasiven Screening-Methoden zu
zählen ist.
Die Entwicklung schonender Ionisationstechniken wie der Elektrospray-Ionisation (ESI) [19]
und der matrixunterstützten Laserdesorptions-Ionisation (matrix assisted laser desorption/
ionization, MALDI) [20] hat die
Massenspektrometrie in den
Blickpunkt des Interesses in fast
allen Bereichen der Biochemie
und der Biotechnologie gerückt.
Die Massenspektrometrie bietet
eine Reihe von Vorteilen, die sie
zu einer idealen Methode für ein
Screening von Biokatalysatoren
machen. Die Messungen sind
sehr schnell, benötigen nur
kleinste Probenmengen im
Nano- oder Picomolbereich und
können weitestgehend automatisiert werden. Desweiteren
bieten sie die Möglichkeit der
Kopplung mit vorgeschalteten
Trennprozeduren wie der Flüssigkeitschromatographie oder
elektrophoretischen Methoden.
Sowohl die ESI-MS als auch die
MALDI-MS bieten die Möglichkeit, nicht nur die Substrate und
Produkte einer Enzymreaktion
zu messen, sondern man kann
auch den Biokatalysator selbst
untersuchen. So können beispielsweise während der Reaktion auftretende kovalente Veränderungen an den Enzymen,
die zu einem Aktivititätsverlust
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oder gar der Zerstörung des
Katalysators führen können,
relativ schnell detektiert werden.
So wurden in unserer Gruppe
von Gerhard Treitz mittels
MALDI-Massenspektrometrie
oxidative Veränderungen von
Oxidasen während ihres Einsatzes als Biokatalysatoren untersucht.
Das Prinzip der ElektrosprayIonisation besteht darin, dass ein
Analyt in einem Lösungsmittel
aufgenommen und über eine
feine Kapillare in ein elektrisches
Feld unter Normaldruck gesprüht wird (vgl. Abbildung 5).
Dabei laden sich die Lösungsmitteltropfen elektrisch auf. Das
Lösungsmittel verdampft, die
Ladungsdichte auf den kleiner
werdenden Tropfen wird immer
größer, bis es schließlich durch
die elektrostatische Abstoßung
zur sogenannten Coulomb-Ex-
plosion kommt. Der Tropfen
„explodiert“ und bildet nun viele kleine Tropfen, die den beschrieben Vorgang mehrmals
wieder durchlaufen, bis schließlich die nackten, desolvatisierten
Analytionen vorliegen. Diese
werden ins Hochvakuum überführt, beschleunigt und mit einem geeigneten Massenanalysator nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis aufgetrennt.
Nach der Detektion dieser Ionen
kann an einem PC das Massenspektrum aufgezeichnet werden.
Die Methode der ESI-MS konnte mehrfach erfolgreich zur
Quantifizierung von Substraten
und Produkten von enzymatisch
katalysierten Reaktionen angewendet werden. Weiterhin ist es
auch gelungen, durch den Einsatz von isotopenmarkierten
Substanzen in der Form von
pseudo-Enantiomeren oder pseudo-prochiralen Verbindungen
die Enantioselektivität solcher
Biokonversionen zu bestimmen
[21]. Daneben wird die ESI-MS
auch in hohem Maße beim
Screening von kombinatorisch
erzeugten Substanzbibliotheken
in der Wirkstoffforschung eingesetzt.
Ein Forschungsschwerpunkt in
unserer Gruppe stellt die Entwicklung von Methoden des
Screenings mittels MALDI-MS
Dr. ANDREAS THOLEY, geb. 1968, studierte in
Saarbrücken Chemie und arbeitete während seiner Diplomarbeit an der Entwicklung von
Modellpeptiden zum Studium posttranslationaler
Proteinmodifikationen. Während der Promotion
am Deutschen Krebsforschungszentrum in
Heidelberg beschäftigte er sich mit den strukturellen Konsequenzen der Proteinphosphorylierung und der Entwicklung massenspektrometrischer Methoden zur Identifizierung von
Phosphorylierungsstellen in Proteinen. Zur Zeit
arbeitet er in der Arbeitsgruppe von Prof. Heinzle (Technische Biochemie) an der Entwicklung von massenspektrometrischen Methoden zum
Screenen von Biokatalysatoren und zur Proteomanalyse.
UniversitŠt des Saarlandes
vakuum mit einem Laser beschossen, wobei jeder Schuss
nur einige Nanosekunden dauert. Dadurch verdampfen Matrix
und Analyt und werden dabei
gleichzeitig schonend ionisiert.
Abb. 6: Prinzip der MALDI-MS. a) Matrixkristalle (2,5-Dihydroxybenzoesäure) in
einer Mikroskopaufnahme (100-fach). b) Prinzip der MALDI-Ionisation.
c) Target zur Aufnahme von 384 Proben. d) MALDI-Massenspektrometer in
der Abteilung Technische Biochemie
dar. Bei dieser Art der MS wird
der Analyt mit einem kleinen
organischen Molekül – der Matrix – auf einem Metalltarget co-
kristallisiert (vgl. Abbildung 6).
Das Matrix/Analyt-Gemisch wird
dann in der Probenkammer des
Massenspektrometers unter Hoch-
Diese Ionisation ist so schonend
(die meiste Energie wird von der
in großem Überschuss vorliegenden Matrix absorbiert und
dann auf den Analyten übertragen), dass selbst große Proteine
oder gar Antikörper ohne Fragmentierung, das heißt ohne
Aufbrechen von kovalenten Bindungen, mit dieser Methode
analysiert werden können. Es
können aber auch niedermolekulare Verbindungen ohne
Fragmentierung ionisiert werden, was die MALDI-MS zusammen mit der relativ großen
Toleranz gegenüber in der Probe
enthaltenen Salzen (zum Beispiel Puffersustanzen) zu einem
idealen Werkzeug für das Screening macht. Jedoch gilt es dabei
noch eine Reihe von Schwie-
Abb. 7: Quantifizierung mittels MALDI-MS. a) Modellreaktion: Lipasekatalysierte Umsetzung von racemischem
1-Phenylethylamin (rac-PEA) zum enantiomerenreinen 2-Methoxy-N-[(1R)-1-phenylethyl]-acetamid (MET). b) MALDIKalibrationsgerade zur Quantifizierung von PEA unter Verwendung eines deuterierten internen Standards. c) Vergleich
einer Enzymkinetik gemessen mittels Gaschromatographie und MALDI-MS.
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rigkeiten zu überwinden, die
insbesondere die Quantifizierung betreffen. Das Hauptproblem stellt die inhomogene Verteilung von Matrix und Analyt in
einem Probenspot dar. Dies
führt dazu, dass die Intensitäten
der Signale keine ausreichend
genaue Schuss-zu-Schuss-Reproduzierbarkeit aufweisen. Der
einfachste Weg, um dieses Problem zu umgehen, ist das Analysieren eines Probenspots an
mehreren Stellen mit anschließender Addition der Einzelsignale sowie der Einsatz geeigneter
interner Standards. Dabei werden bevorzugt Substanzen verwendet, die möglichst hohe molekulare Homologie zum Analyten aufweisen, wie zum Beispiel mit Deuterium markierte
Verbindungen [22]. Auf diese
Art und Weise war es uns möglich, eine lineare Korrelation zwischen den relativen Signalintensitäten und der relativen Konzentration des Analyten zu messen (vgl. Abbildung 7). Als Modellsystem untersuchte MinJung Kang in unserer Gruppe in
einem von der BASF finanziell
unterstützten Projekt eine Lipase-katalysierte Umsetzung von
racemischem 1-Phenylethylamin
(PEA) zum 2-Methoxy-N-[(1R)1-phenylethyl]-acetamid (MET).
Durch diese Messungen war es
weiterhin möglich, die kinetischen Konstanten der enzymkatalysierten Umsetzung zu bestimmen, wobei die Werte sehr
gut mit denen durch klassische
Messungen mittels Gaschromatographie übereinstimmten.
In einigen Fällen ist eine direkte
Messung niedermolekularer Verbindungen nur nach vorhergehender Derivatisierung der
Analyten möglich, da die Verbindungen entweder zu flüchtig
sind und im Hochvakuum verdampfen, bevor die eigentliche
Messung beginnt oder dass sie
sich wegen ihres molekularen
54
Das Screenen von Biokatalysatoren stellt auch ein Teilprojekt
des neuen von der Landesregierung geförderten Programms
„Enzyme – Tools, Targets, Therapheutics“ an der Universität des
Saarlandes dar.
In diesem interdisziplinären Forschungsverbund stehen die Entwicklung von leistungsfähigen Biokatalysatoren und von potenten Inhibitoren für therapeutische Zwecke im Zentrum des Interesses. Weitere Informationen sind im Internet unter der
Adresse:“http://www.uni-saarland.de/fak8/heinzle/research/
ETTT_Projekte.htm” verfügbar.
Aufbaus nicht direkt ionisieren
lassen. In den meisten Fällen
können für diese Derivatisierungen jedoch einfachste organische Reaktionen durchgeführt
werden, so zum Beispiel die Bildung von Oximen aus flüchtigen Aldehyden.
Umgekehrt gelang es Klaus Hollemeyer aus unserer Gruppe in
einer Kooperation mit Andreas
Speicher aus der Organischen
Chemie, mittels MALDI-MS ohne den Einsatz einer zusätzlichen
Matrix in Zelllysaten aus Moosen halogenierte Naturstoffe
nachzuweisen [23].
Damit konnte indirekt die Enzymaktivität von bis dato in diesen Organismen nicht bekannten Haloperoxidasen nachgewiesen werden.
Screening mit
Trennmethoden
Neben den oben erwähnten
Methoden des Screenings gibt
es noch eine Reihe weiterer Verfahren, so zum Beispiel chromatographische und elektrophoretische Methoden. Diese sind jedoch oft sehr zeitaufwendig und
verwenden in den meisten Fällen die oben genannten Methoden zur Detektion. Dennoch
sind sie, speziell zur Analyse der
Enantiomerenreinheit, von Interesse. Diese auf Trennoperationen beruhenden Methoden
sind insbesondere in der letzten,
quantitativen Stufe eines Screening-Prozesses
anwendbar,
wenn nur noch die effektivsten
Kandidaten der ersten Screening-Stufen miteinander verglichen werden sollen.
Ausblick
In Zukunft werden Enzyme eine
zunehmend wichtige Rolle bei
industriellen Prozessen spielen.
Daher ist die Entwicklung von
Methoden zum Screening dieser
Biokatalysatoren ein sehr wichtiges Gebiet in der Biotechnologie. Die wichtigsten Aufgaben
werden in den nächsten Jahren
die Automatisierung und die
Miniaturisierung der Methoden
sein. Ein Ziel dieser Bemühungen kann dabei das sogenannte
„Labor auf einem Chip“ sein.
Weiterhin wichtig ist die Verknüpfung des Screenings mit
der Bioinformatik. Dies betrifft
zum einen die intelligente Auswertung der enormen Datenmassen und zum anderen die
Umsetzung und Verwendung
der bei einem Screeningprozess
gewonnenen Erkenntnisse in der
Entwicklung neuer Generationen von Biokatalysatoren.
Literatur
[1] Faber, K. (2000). Biotransformations in organic chemistry,
4th edn. Springer, Berlin, Heidelberg, New York.
[2] Buchholz, K. & Kasche, V.
(1997). Biokatalysatoren und
UniversitŠt des Saarlandes
Enzymtechnologie, Wiley-VCH,
Weinheim.
326-334.
[3] Tholey, A. & Heinzle, E.
(2001). Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., im Druck.
[11] Wallenfels, K. & Weil, R.
(1972). In: Boyer, P.D. (ed) The
Enzymes, 3rd edn., Vol VII, Academic Press, New York, S. 617.
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